Penanganan Sickle-Cell Disease dengan Metode Deteksi Southern Blotting dan Terapi gen

PendahuluanKelainan menurun yang paling umum diantara keturunan Afrika adalah penyakit sel-sabit (sickle-cell disease), yang menyerang satu dari 400 orang Afrika-Amerika. Penyakit sel-sabit disebabkan oleh penggantian satu asam amino normal (asam glutamat) dengan asam amino lain (valin) pada posisi tertentu dalam struktur primer hemoglobin, protein yang mengangkut oksigen dalam sel darah merah. Sel darah merah normal berbentuk cakram, namun dalam penyakit sel sabit, molekul hemoglobin yang abnormal cenderung mengkristal, merusak bentuk sebagian sel menjadi seperti sabit.Sel yang berbentuk sabit dapat menggumpal dan menyumbat pembuluh darah kecil, seringkali menyebabkan gejala-gejala lain di sekujur tubuh, termasuk kelemahan fisik, nyeri, kerusakan organ dan bahkan paralisis (lumpuh). Oleh karena itu,dibutuhkan suatu penanganan khusus untuk kelainan genetik ini dimana dengan bantuan teknologi DNA seperti Southern blotting dan Terapi gen.Perkembangan Metode yang DipilihMetode yang dapat digunakan dalam mendeteksi penyakit sel-sabit adalah dengan uji Microarray terhadap tingkat ekspresi gen melalui berbagai tahap, yaitu :1) Isolasikan mRNA.2) Buatlah cDNA dengan transkripsi balik menggunakan nukleotida berlabel fluoresence.3) Tempelkan campuran cDNA ke microarray, kaca objek tempat salinan-salinan fragmen DNA beruntai tunggal dari gen organisme terfiksasi, gen yang berbeda pada masing-masing titik. cDNA berhibridisasi dengan DNA komplementer apapun pada microarray.4) Bilaslah cDNA berlebih. Pindahkan microarray untuk menemukan fluoresensi. Setiap titik fluoresence (kuning) merepresentasikan gen yang diekspresikan dalam sampel jaringan.

Dalam uji microarray ini, dapat dideteksi alel abnormal penyebab-penyakit dengan cara menguji penanda genetik (genetic marker). Salah satu penanda genetik yang paling bermanfaat adalah variasi pasangan-basa tunggal dalam genom populasi manusia. Situs pasangan basa tunggal tempat ditemukan variasi pada setidaknya 1% populasi disebut single nucleotide polymorphism (SNP). SNP rata-rata terjadi sekali setiap 100 sampai 300 pasangan basa dalam geno manusia, dan ditemukan dalam sekuens DNA pengkode maupun bukan pengkode. Sejumlah SNP mengubah sekuens yang dikenali oleh enzim restriksi, seperti yang terjadi pada perbedaan nukleotida tunggal antara alel -globin normal dan sel sabit. Diagram ini menggambarkan segmen-segmen homolog DNA dari keluarga dengan sebagian anggota keluarga yang mengidap suatu penyakit genetik. Dalam keluarga in, anggota keluarga yang tidak mengidap penyakit memiliki T pada sebuah lokes SNP tertentu. Jika anggota keluarga memiliki C pada lokus tersebut, kemungkinan besar orang itu juga mewarisi alel penyebab penyakit (di sini, hanya satu untai yang ditunjukkan untuk setiap molekul DNA).Adapun metode lain yang dapat dianjurkan dalam mendeteksi penyakit sel-sabit adalah dengan Southern Blotting. Dalam contoh ini, dilakukan perbandingan sampel DNA genom dari 3 orang : homozigot untuk alel -globin normal (I), homozigot untuk alel sel sabit mutan (II) dan heterozigot (III), dengan menggunakan kuar berlabel radioaktif. Tahap-tahap yang berlangsung antara lain :1) Preparasi fragmen restriksi.

Setiap sampel DNA dicampur dengan enzim restriksi yang sama, misal DdeI. Digesti dari setiap sampel menghasilkan campuran dari ribuan fragment restriksi.

2) 3) Elektroforesis gel.

Fragmen restriksi pada setiap sampel dipisahkan melalui elektroforesis, membentuk pola pita yang khas.

4) Transfer DNA (blotting).

Dengan gel yang telah disusun seperti gambar, daya kapilaritas menarik larutan alkalin ke atas ke arah gel, mentransfer DNA ke membran nitroselulosa, menghasilkan blot. DNA terdenaturasi dalam proses ini (versi lain dari metode ini menggunakan arus listrik untuk mempercepat transfer DNA). Untai tunggal DNA yang menempel ke nitroselulosa membentuk pita-pita yang sesuai dengan pita-pita pada gel.

5) 6) Hibridisasi dengan kuar radioaktif.

Blot nitroselulosa dipaparkan ke larutan yang mengandung kuar berlabel radioaktif. Dalam contoh ini, kuar merupakan DNA beruntai tunggal yang komplementer terhadap gen -globin. Molekul kuar melekat melalui perpasangan basa ke fragmen restriksi apa pun yang mengandung bagian gen -globin (pita-pita DNA belum tampak).

7) Deteksi kuar.

Selembar film fotografik diletakkan di atas blot. Radioaktivitas dalam kuar yang terikat akan terpapar ke film sehingga terbentuk gambaran yang sesuai dengan pita-pita yang mengandung DNA yang berpasangan basa dengan kuar.

Setelah proses deteksi penyakit sel-sabit, penanganan yang biasa digunakan adalah dengan pemberian antibiotik yang hanya berfungsi untuk mengurangi sakit. Kemudian metode penanganan lain yang dapat dianjurkan adalah dengan terapi gen. Terapi gen dilakukan untuk mengintroduksi gen ke dalam pengidap penyakit demi tujuan terapetik dan menyimpan potensi yang besar untuk menangani kelainan-kelainan yang disebabkan oleh satu gen cacat. Dalam teori, alel normal dari gen cacat dapat disisipkan ke dalam sel-sel somatik dari jaringan yang diserang oleh penyakit tersebut.Agar terapi gen dari sel-sel somatik menjadi permanen, sel-sel yang menerima alel normal harus dapat memperbanyak diri sepanjang usia pasien. Sel-sel sumsum tulang, yang mencakup sel-sel punca yang menghasilkan semua sel darah dan sistem kekebalan merupakan kandidat utama.Terapi gen untuk penanganan penyakit sel-sabit adalah terapi gen dengan menggunakan vektor retrovirus. Retrovirus yang telah dibuat tak berbahaya digunakan sebagai vektor dalam prosedur ini, yang megeksploitasi kemampuan retrovirus menyisipkan transkrip DNA dari genom RNA-nya ke dalam kromosom DNA sel inang. Jika gen asing yang dibawa oleh vektor retrovirus ini diekspresikan, sel dan keturunannya akan memiliki produk gen tersebut, dan pasien dapat sembuh. Sel yang berproduksi seumur hidup, misalnya sel sumsum tulang, merupakan kandidat ideal untuk terapi gen.PembahasanDalam metode penangangan penyakit sel sabit dapat dilakukan dalam 2 tahap, yaitu pendeteksian (penegasan) dan pemulihan melalui terapi. Dapat diketahui bahwa sel sabit merupakan mutasi titik (point mutation), dimana dalam DNA, untai cetakan mutant (atas) memiliki A sedangkan cetakan wild-type memiliki T. mRNA mutant memiliki U sebagai pengganti A pada salah satu kodon sehingga hemoglobin mutant (sel sabit) memiliki valin (val) sebagai ganti asam glutamat (glu). Jadi alel penyebab penyakit sel sabit berbeda dari alel normal oleh satu pasangan basa DNA. Oleh karena itu metode yang dapat digunakan dalam mendeteksi adalah uji microarray atau southern blotting. Sebaiknya southern blotting yang merupakan metode kualitatif digunakan dalam kasus ini, karena target DNA yang ingin dideteksi sudah diketahui sehingga dapat langsung mengetahui adanya mutasi atau tidak (jika terjadi mutasi, maka pasien mengidap penyakit sel sabit). Dengan southern blotting pada sampel, maka alel dipisahkan dipisahkan dari vektor DNA namun mencakup sejumlah DNA yang bersebelahan dengan sekuens pengkode. Sekuens alel normal mengandung 2 situs yang dikenali oleh enzim restriksi DdeI. Alel sel sabit tidak memiliki salah satu dari situs ini. Kemudian sampel dari masing-masing alel yang telah dipurifikasi dipotong dengan enzim DdeI dan kemudian diberi perlakuan elektroforesis gel, menghasilkan 3 pita untuk alel normal dan 2 pita untuk alel sel sabit. Berbeda dengan microarray, yang merupakan metode kuantifikasi dimana melihat ekspresi mRNA.Kemudian dalam proses pemulihan, sebaiknya digunakan metode terapi gen selain hanya menggunakan antibiotik. Pada metode terapi gen, dapat dilakukan dengan menggunakan vektor retrovirus yang disisipkan versi RNA dari alel normal. Kemudian, retrovirus dibiarkan menginfeksi sel-sel sumsum tulang yang telah diangkat dari pasien dan dikultur sehingga DNA virus yang membawa alel normal menyisip ke dalam kromosom. Barulah sel hasil rekayasa diinjeksikan ke dalam sumsum tulang pasien. Oleh karena itu jika gen asing yang dibawa oleh vektor retrovirus diekspresikan, maka sel dan keturunannya akan memiliki produk gen tersebut dan pasien dapat sembuh.

KesimpulanPenanganan penyakit sel sabit dapat dilakukan dengan mendeteksi gen terlebih dahulu, kemudian dilakukan pemulihan. Pendeteksian dapat dilakukan dengan southern blotting dan pemulihan dapat dilakukan dengan terapi gen.

Saran Penyakit sel sabit sebaiknya dicegah sejak dini dengan menjaga pola makan dan lingkungan. Sebaiknya digunakan metode teknologi DNA seperti southern blottig dan terapi gen dalam penanganannya daripada menggunakan antibiotik, obat-obatan karena selain penyakit dapat terdeteksi terlebih dahulu, kelainan genetik dapat disembuhkan dan dicegah untuk keturunan selanjutnya.

Daftar Pustaka

Campbell, dkk. 2008. Biologi edisi kedelapan : jilid 1. Jakarta : Erlangga.Connor JM, Ferguson SMA, 1994: Textbook Essential Medical Genetics, 142-145, 165- 167.Thompson MW, dkk. Textbook Genetics in Medicine,66-81.

Genetika II

Hari / Tanggal: Rabu, 4 Juni 2014Nama Kelompok : 1. Raissa Ivena / 7121020 2. Celine Christsandy / 7121026 3. L. Ronald T / 7121034 4. Derdy Janli / 7121039

Fakultas TeknobiologiUniversitas Surabaya2014