I. Judul Percobaan: II. Tanggal Percobaan: Kamis, 18 Desember 2014III. Selesai Percobaan: Kamis, 18 Desember 2014IV. Tujuan:V. Dasar Teori:High Performance Liquid Chromatography HPLCHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang sering disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Kegunaan HPLC antara lain: Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis Analisis ketidakmurnian (impurities) Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile) Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion Isolasi dan pemurnian senyawa Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.(Gandjar dan Rohman, 2007)

Parameter HPLCParameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (), Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N). Resolusi (Rs)Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya: Selectivity, Effieciency, dan Retention.

Faktor Retensi (k)Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum. Faktor selektifitas ()Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau nilai = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen EfisiensiEfisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom. Lempeng teoritis (N)Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien.(Crawford, 2011)

Instrumen

Gambar 1. Skema Alat HPLC

a. Pompa (Pump)Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

b. Injektor (Injector) Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan: 1) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.2) Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. 3) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 L dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).

c. Kolom (Column) Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu : 1) Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. 2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).

d. DetektorDetektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut: 1) Detektor spektrofotometri UV-VisDetektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi UV dan sinar tampak pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur. 2) Detektor Indeks BiasDetektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahan utamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat dilakukan pada kepekaan tinggi.3) Detektor ElektrokimiaBanyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus yang dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk menghasilkan tenaga yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia cukup peka, namun ada pula kelemahannya. Adanya timbrungan listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.4) Detektor Photodiode-Array (PDA)Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan banyak lebih banyak informasi komposisi sampel disbanding dengan detector UV-Vis. Dengan detektor ini, juga diperoleh spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara spectra analit dengan spectra senyawa yang sudah diketahui.Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA ini dapat ditampilkan sebagai plot 3 dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu sehingga data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada layar (monitor) lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari perpustakaan data yang ada di sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Metode ValidasiValidasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman,2007).Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi ketika:a.Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.b.Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi.c.Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu.d.Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.e.Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar dua metode, seperti antara metode baru dan metode baku.(Gandjar dan Rohman, 2007)

Kelebihan dan Kekurangan Metode Analisis dengan HPLC1. Kelebihan Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data. Volume sampel kecil. Daya pisah tinggi. Merupakan metode analitis cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, dan preparatif. Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas2. Kekurangan Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu. Hanya bisa digunakan untuk asam organik. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

Asam AsetatAsam asetat atau acetic acid atau ethanoic acid adalah senyawa organik yang termasuk dalam golongan carboxylic acid dengan gugus fungsinya adalah:

Sedangkan rumus kimia dari asam asetat sendiri adalah:

Acetic acid adalah monoprotic acid yang lemah, sehingga hanya hanya sebagian kecil ion saja yang dapat terdisosiasi dalam air dan reaksi ini ada kesetimbangannya dapat bergeser ke kiri atau ke kanan tergantung pada kondisi dari reaksi. Proses terdisosiasinya asam asetat dalam air dapat digambarkan seperti berikut:

Gambar 1. Reaksi disosiasi asam asetat dalam airKarakteristik dari carboxylic acid dapat dilihat pada tabel 1 di bawah. Bau dari carboxylic acid sangat tidak enak dan gugus OH- pada carboxylic acid tidak berperilaku seperti basa ion hidroksida OH-. Hal ini terjadi karena Oksigen memiliki sifat keelektronegatifan yang tinggi sehingga dengan adanya dua atom

Tabel 1. Karakteristik Carboxylic acid

Daftar PustakaAnonim. 2001. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. http://upi.edu/direktori/fpmipa/jur_ pend._kimia.Hokcu_suhanda/kuliah_kimia_instrumen/kckt.pdf. (Diakses pada tanggal 21 Desember 2014).Anonim. Skripsi. (online) http://lontar.ui.ac.id/file?file=digital/131646-T%2027510-Studi%20ketahanan-Tinjauan%20literatur.pdf. (Diakses pada tanggal 20 Desember 2014).Efendy D.L.P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. http://epository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf. (Diakses pada tanggal 21 Desember 2014).Surya, Kharismala, et al. 2011. Metode Pemisahan Kimia HPLC. http://webcache. googleusercontent.com/pdf. (Diakses pada tanggal 21 Desember 2014).