PEMURNIAN ENZIM

CHAPTER 4

TUJUAN PEMURNIAN ENZIM

Mempelajari enzim dan segala sifatnya

Untuk memproduksi antibodi spesifik

terhadap enzim tersebut

PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (1)

Tetapkan tujuan (langkah setelah mendapatkan enzim murni)

Tetapkan kemurnian enzim yang diperlukan

menentukan langkah dan teknik seleksi

Segera singkirkan bahan lain yang merusak enzim Misalnya protease

Kembangkan metoda analisis

Deteksi cepat aktivitas enzim untuk pemilihan

MENYINGKIRKAN BAHAN PERUSAK ENZIM

Metoda adsorpsi

Paling umum menggunakan kromatografi penukar ion

Kropmatografi afinitas (lebih mahal dan rumit) menghasilkan

penyingkiran bahan perusak dan pemurnian sekaligus

KROMATOGRAFI PENUKAR ION

KROMATOGRAFI AFINITAS

Menggunakan ligan berupa molekul

kecil (logam atau antibodi) yang

terikat pada matriks

Protein akan berikatan secara

spesifik dengan ligan

Elusi melepaskan protein dari ligan

DETEKSI PROTEIN

Spektroskopi

A280 untuk protein

Assay Protein

Bradford (pewarna coomassie)

Biuret (tembaga)

Lowry (modifikasi biuret campuran fosfomolibdotungstatdireduksi oleh Cu2+ dan asam amino F,Y,W membentukheteropolimolibdenum yang berwarna biru (A750)

A550

ASSAY ENZIM

Amilum (berwarna biru dengan penambahan KI) dihidrolisismenjadi glukosa (berwarna kecoklatan dengan penambahan KI)

PNPP dihidrolisis menjadi PNP dan Pi Assay waktu tetap

Enzim dan substrat dicampur, direaksikan selamawaktu tertentu,

Reaksi dihentikan dengan basa kuat,

Konsentrasi PNP ditentukan pada pH>10 Assay berkelanjutan

Produksi PNP diikuti menggunakan spektrofotometripada ph 8

PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (2)

Gunakan teknik yang berbeda untuk setiap

langkah

Memanfaatkan watak sample yang dapat

digunakan untuk pemisahan (ukuran,

muatan, hidrofobisitas, spesifisitas terhadap

ligan)

SKEMA LANGKAH PEMURNIAN ENZIM

PRINSIP PEMURNIAN ENZIM (3)

Minimalkan penanganan terhadap sample di setiap tahap Untuk mencegah prosedur berkepanjangan yang

dapat mengakibatkan hilangnya/menurunnya aktivitas

Minimalkan penggunaan bahan tambahan Bahan tambahan mungkin perlu dihilangkan

sehingga memerlukan tahap tambahan untuk menghilangkannya

Minimalkan jumlah tahap - SEDERHANAKAN Tambahan langkah mengurangi hasil dan

menambah waktu

PEMURNIAN PROTEIN

Strategi

Bahan awal,

Perolehan enzim, Purifikasi tengahan, Pemolesan

Metode deteksi, kuantifikasi dan dokumentasi

TEKNIK DASAR

Pemekatan (berdasar ukuran)

pengendapan

ultrafiltrasi

dialisis

sentrifugasi

Kromatografi (berdasar ukuran/muatan/kimia)

ion exchange

size exclusion

affinity

Elektroforesis

(berdasar ukuran/muatan)

"native"

denaturing

isoelectric focusing

2-dimensional

Imunologis

(berdasar ukuran/muatan/kimia)

kromatografi

in situ imaging

immunoblotting

PENGENDAPAN PROTEIN

"Salting Out" jika sejumlah garam ditambahkan, maka protein akan

mengendap

Suhu rendah mengurangi kemungkinan denaturasi

Dikumpulkan dengan filtrasi dan sentrifugasi

Disuspensikan kembali dalam larutan berkadar garam rendah.

Bekerja terbaik dengan anion divalen, seperti sulfat, amonium sulfat

berkelarutan tinggi sekalipun dalam es.

METODA MENINGKATKAN KONSENTRASI

Ultra Filtrasi: Suspensi protein dilewatkan

saringan ultra halus. Air dan garam dapat lewat,

protein tertinggal

PERTUKARAN LARUTAN PENYANGGA

Seluruh langkah pemurnian menggunakan larutan

penyangga dengan pH tertentu dan kekuatan

garam tertentu

Larutan penyangga yang digunakan

mempengaruhi sifat biofisika protein

Kenapa perlu ditukar? Contoh, jika protein diendapkan menggunakan amonium sulfat,

jelas lingkungan protein itu penuh/jenuh garam.

METODA MENGHILANGKAN GARAM

Dialisis: Suspensi protein yang mengandung garam

dimasukkan kantong dialisis yang memiliki pori ultra

halus. Air (yang melarutkan garam) bebas melalui pori,

sedangkan protein tertinggal

BAHAN AWAL

Sumber alami atau hasil rekayasa

Inang,

Bakteri, khamir, tumbuhan, hewan transgenik

Konsentrasi (jumlah), senyawa ikutan

BAHAN AWAL

Prosedur lisis dan klarifikasi

Kondisi alami atau terdenaturasi

Lokasi subseluler

Pengendapan selektif

PEI, Streptomicin Sulfat, CTAB untuk RNA/DNA

Amonium Sulfat untuk Protein

PEROLEHAN ENZIM

Segera hilangkan kontaminan yang sifatnya sangat merusak enzim

Metoda pemekatan dan penyerapan Paling umum menggunakan Ion Exchange Kromatografi afinitas merupakan kombinasi langkah-

langkah perolehan enzim, pemurnian tengahan, danpemolesan

Pada tahap ini kontaminan paling merusak dihilangkan

PREPARASI ENZIM

Untuk kepentingan riset, enzim mungkin perludimurnikan berkali-kali dengan resiko terjadikehilangan yang cukup besar (hingga 90 %).

Enzim untuk kepentingan industri sedapat mungkindicegah dari kehilangan, sehingga sesedikitmungkin dilakukan pemurnian hanya untukmenghilangkan senyawa yang mengganggu proses.

Selain dapat menghilangkan enzim, langkahpurifikasi juga terkait dengan beaya (alat dantenaga).

Fraksi Volume (ml)

Total

protein (mg)

Aktivitas

Total

Aktivitas Spesifik

Perolehan kembali (%)

Tingkat Pemurnian

Extrak kasar

3,800 22,800 2460 0.108 100 0

Garam ppt.

165 2,800 1190 0.425 48 3.9

IEC 65 100 720 7.2 29 66

SEC 40 14.5 555 38.3 23 355

Afinitas 6 1.8 275 152 11 1407

Pengaruh jumlah langkah pemurnian enzim terhadap hasil dan beaya

SEE U NEXT.........