AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ...digilib.unila.ac.id/27851/3/SKRPSI TANPA BAB...
70
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN ZEOLIT ( Skripsi ) Oleh FATHANIAH SEJATI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
Transcript of AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ...digilib.unila.ac.id/27851/3/SKRPSI TANPA BAB...
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148DENGAN MENGGUNAKAN ZEOLIT
( Skripsi )
Oleh
FATHANIAH SEJATI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2017
ABSTRAK
AMOBILISASI ENZIM α-AMILASE DARI Bacillus subtilisITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN ZEOLIT
Oleh
Fathaniah Sejati
Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat memutus ikatan α-1,4glikosida pada amilum. Enzim ini banyak dimanfaatkan dalam berbagai prosesindustri, baik industri pangan maupun non-pangan. Dalam proses industri enzimharus mampu bekerja pada kondisi pH ekstrim serta mempunyai stabilitas termalyang tinggi. Namun, umumnya enzim tidak stabil pada kondisi tersebut.
Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan stabilitas enzim α-amilase dariisolat bakteri lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan amobilisasimenggunakan zeolit. Untuk mencapai tujuan tersebut maka dilakukan prosesproduksi, isolasi, pemurnian, amobilisasi enzim, dan karakterisasi enzim α-amilase sebelum dan sesudah amobilisasi.
Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian diperoleh sebesar 24.735,715U/mg, meningkat 19 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim yaitu 1.285,867U/mg. Enzim hasil pemurnian bekerja optimum pada suhu 65ºC, sedangkan enzimamobil pada suhu 75ºC. Aktivitas sisa yang dihasilkan pada uji stabilitas termalpada suhu 65ºC selama 100 menit terhadap enzim hasil pemurnian adalah sebesar20%, sedangkan enzim amobil sebesar 40%. Data kinetika enzim hasilpemurnian diperoleh data KM = 7,543 mg mL 1, Vmaks = 147,058 μmol mL-1
menit-1, t1/2 = 30 menit, ki = 0,023 menit-1 dan ΔGi = 103,65 kJ mol-1, sedangkanenzim amobil adalah KM = 6,779 mg mL-1, Vmaks = 97,087 μmol mL-1 menit-1 , t1/2
= 49 menit, ki = 0,014 menit-1 dan ΔGi = 105,03 kJ mol-1. Amobilisasimenggunakan zeolit telah berhasil meningkatkan 1,64 kali stabilitas termal enzim,yang ditunjukkan oleh penurunan nilai ki.
Kata kunci : α-Amilase, Bacillus subtilis ITBCCB148, amobilisasi enzim, zeolit.
ABSTRACT
THE IMMOBILIZATION OF α-AMYLASE FROM Bacillus SubtilisITBCCB148 USING ZEOLITE
By
Fathaniah Sejati
α-amylase is an enzyme that breaks α-1-4 glycoside bond in amylum. It hasbeen widely used in a number of industrial processes such as food industry andnon food industry. In industrial process, this enzyme must be able to work in anextreme pH and temperature. However, an enzyme is not normally stable in theseconditions.
The objective of this research was to improve the stability of α-amylaseenzyme from local bacteria bacillus subtilis ITBCCB148 with immobilizationusing zeolite. A sequential processes were conducted, such as by production,isolation, purification, immobilization, and characterization the α-amylase beforeand after immobilization.
The specific activity of purified enzyme was obtained 24735.715 U/mg,increased 19 times higher than the crude extract enzyme (1285.867 U/mg). Thepurified enzyme worked well at 65ºC and the immobilized at 75ºC. From thermalstability test at 65ºC for 100 minutes, residual activity of the purified and theimmobilized enzyme were 20% and 40%, respectively. Kinetic data of thepurified enzyme were KM value = 7.543 mg mL 1, Vmaks = 147.058 μmol mL-1
minute-1, t1/2 = 30 minutes, ki = 0.023 minute-1, and ΔGi = 103.65 kJ mol-1, whilethe immobilized were KM = 6.779 mg mL-1, Vmaks = 97.087 μmol mL-1 minute-1,t1/2 = 49 minutes, ki = 0.014 minute-1 dan ΔGi = 105.03 kJ mol-1. Enzymeimmobilization using zeolite has succeeded in increasing the thermal stability ofthe enzyme as much as 1.64 times, which is indicated by decrease of ki value.
Keywords : α-amylase, Bacillus subtilis ITBCCB148, enzyme immobilization,zeolite.
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148DENGAN MENGGUNAKAN ZEOLIT
Oleh
FATHANIAH SEJATI
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh GelarSARJANA SAINS
Pada
Jurusan KimiaFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2017
Riwayat Hidup
Penulis dilahirkan di Bandar lampung pada tanggal 7
Desember 1995, sebagai anak ketiga dari tiga
bersaudara, yang merupakan buah hati dari pasangan
Bapak Hi. Mursid dan Ibu Hj. Endrawati,S.E.
Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-
Kanak di TK Dwi Tunggal di Bandar lampung pada
tahun 2001, dan Sekolah Dasar Negeri di SD Negeri 6 Sumberrejo Bandar
lampung pada tahun 2007, Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 14 Bandar
lampung pada tahun 2010, dan penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di
SMA Negeri 14 Bandar Lampung pada tahun 2013. Pada tahun yang sama,
penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui Seleksi Bersama Mahasiswa
Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN).
Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten dosen pada praktikum
Kimia Dasar untuk Fakultas Pertanian Universitas Lampung, serta menjadi
aasisten praktikum Biokimia untuk Fakultas Pertanian, Jurusan Kimia, dan
Jurusan Biologi Fakultas MIPA, serta menjadi asisten Teknik Penelitian Biokimia
untuk Jurusan Kimia Fakultas MIPA. Kemudian penulis menjadi salah satu
Beswan Perusahaan Gas Negara (PGN) sejak tahun 2014 sampai dengan 2017.
Pada tahun 2016 penulis melakukan Praktek Kerja Lapangan di laboratorium
Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Unila, dan pada tahun 2017, penulis memulai
penelitiannya di tempat yang sama. Selama di Universitas, penulis aktif sebagai
anggota Biro Usaha Mandiri (BUM) Himpunan Mahasiswa Kimia (Himaki)
Universitas Lampung.
Motto
“Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan”QS Al-Insyirah : 6
“Sesungguhnya jika kamu bersyukur, niscaya Aku akan menambah nikmatkepada mu”
QS Ibrahim : 14
“Try not to be a success human but try to be auseful human”(Einstein)
“ Dengan Menyebut nama Allah yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang”
Dengan segala rasa syukur, kupersembahkan karya ini kepada :
Mama dan PapaKupersembahkan karya kecilku ini untuk kalian, dua sosok malaikat ku didunia, yang
senantiasa memberikan semangat, dukungan, dan doa yang tiada henti untukkeberhasilan ku.
Keluarga besarkuKak Mukti Habibi, kak Yogi Rafiqi, Mbak Nabella Aulia, yang telah memberikan
keceriaan serta dukungan selama ini.
Atreyu AlfaridoDenganmu aku belajar bersyukur dan bersabar atas apa yang Allah berikan
kepada ku.
Almamater yang ku banggakan, Universitas Lampung.
SANWACANA
Assalamualaikum wr wb
Alhamdulillah puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah Subhanahu
wa.ta’ala, serta sholawat dan salam semoga selalu tercurah kepada suri tauladan
umat yaitu Nabi Muhammad Shallallahu’alaihi wasallam. Atas segala rahmat dan
hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul :
AMOBILISASI ENZIM α-AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148DENGAN MENGGUNAKAN ZEOLIT
Dalam menyelesaikan skripsi ini Penulis tidak luput dari bimbingan dan bantuan
dari berbagai pihak, Dalam kesempatan ini Penulis menyampaikan terima kasih
kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Ir. Yandri A.S., M.S., selaku Pembimbing penelitian yang
telah banyak memberikan ilmu pengetahuan, gagasan, bimbingan, bantuan,
dukungan, arahan, saran dan kritik kepada Penulis dalam proses perencanaan
dan pelaksanaan penelitian serta penulisan skripsi ini.
2. Bapak Mulyono, Ph.D dan Ibu Dr. Noviany, S.Si.,M.Si., selaku pembahas atas
kesediaan memberikan arahan, koreksi, saran dan kritik sehingga skripsi ini
terselesaikan dengan baik.
3. Ibu Dra. Aspita Laila, selaku Pembimbing akademik atas segala bimbingan,
dukungan, motivasi, informasi, saran dan kritik yang bermanfaat kepada
Penulis selama ini.
4. Bapak Prof. Warsito, S.Si., DEA., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
5. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku Ketua Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
6. Seluruh Staf Pengajar dan karyawan Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
7. Kedua orangtua yang sangat aku cintai, Mama ku tercinta, Hj. Endrawati,S.E
serta Ayah ku tersayang, Hi. Mursid yang selalu memberikan kasih sayang,
senantiasa mendukungku dalam keadaan apapun, sabar memberikanku
nasehat, tak henti memanjatkan do’a demi keberhasilan putra putrinya,
memberikan motivasi dan dukungan serta senyum tulus kepada Penulis.
Terima kasih dengan sangat tulus dan ikhlas ku ucapkan atas segala hal terbaik
yang telah diberikan kepadaku, yang takkan pernah tergantikan dengan
apapun.
8. Kedua kakak ku, Mukti Habibi dan Yogi Rafiqi yang selalu memberikan kasih
sayang yang tulus, keceriaan serta dukungan untuk keberhasilanku.
9. Seseorang yang selalu menemani ku Atreyu Alfarido. Terimakasih atas
kebahagiaan, dukungan, nasehat, bantuan, canda, tawa, saran dan kritik yang
telah diberikan. Terimakasih sudah menjadi pendengar yang baik, yang selalu
mengingatkanku untuk selalu bersyukur.
10. Keluarga besar ku, Alm.Duladi, Wak Daryono, Wak Tholib, Wak Ali, Wak
Hamid, Wak Hasyim, Wak Sulaiman, Wak Maryam dan yang tak bisa
kusebutkan satu persatu, terimakasih untuk dukungan dan kasih sayang nya
selama ini.
11. Keluarga besar Atreyu Alfarido, Tante Diana, Om Sanian Gunaus, Aviv Alfito
dan yang tak bisa kusebutkan satu persatu, terimakasih atas perhatian dan
dukunganya selama ini.
12. Partner terbaikku, Ezra Rheinsky Tiarsa, S.Si., Maya Retna Sari, S.Si., dan
Khomsatun Khasanah, S.Si. terima kasih atas kerja sama yang sangat baik
serta bantuan, dukungan, arahan, saran, canda, tawa dan motivasinya selama
penelitian.
13. Yandri’s Research Group Ezra Rheinsky Tiarsa, S.Si., Maya Retna Sari, S.Si.,
Khomsatun Khasanah, S.Si., Sinta Dewi O, Sri Wahyuni, Fika Putri Aulia,
Mia Permatasari, Mbak Putri Amalia, Mbak Fifi, Mbak Putri, Mbak Syathira
dan Teh Didi. Terima kasih atas kerja sama, motivasi dan keceriaannya.
14. Teman-teman penghuni Lab Biokimia, Monica, Vyna, Tyas, Melia, Shelta,
Ryan, Mbak Meta, dan Mbak Aim.
15. Teman satu grup “we are not best friend”, Della Mita Andini S.Si., Kartika
Agus K, S.Si., Ezra Rheinsky Tiarsa, S.Si., Badiatul Niqmah, Vicka Andini,
Nurul Fatimah, dan Sri Wahyuni. Terimakasih atas perhatian, keceriaan dan
kebersamaan kita selama ini.
16. Saudari-saudari ku, Lindawati, Sinta Dewi O serta Nessia Kurnia, terimakasih
untuk kebersamaan, semangat dan bantuannya selama ini, semoga silaturahmi
kita tetap terjaga.
17. Teman-teman angkatan 2013, terima kasih atas kebersamaannya dalam
menuntut ilmu menggapai impian juga canda-tawa-bahagia yang selalu kita
hadirkan,
18. Kakak dan adik tingkat penulis: 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011,
2012 , 2014, 2015, dan 2016.
19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung Penulis dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi ini.
Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah mereka berikan
kepada penulis. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan, akan tetapi sedikit harapan semoga skripsi yang sederhana ini
dapat berguna dan bermanfaat. Amin.
Bandar Lampung, Juli 2017
Penulis,
Fathaniah Sejati
i
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI.................................................................................................... i
DAFTAR TABEL............................................................................................ iii
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... v
PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
A. Latar Belakang ............................................................................................ 1
B. Tujuan Penelitian......................................................................................... 3
C. Manfaat Penelitian....................................................................................... 4
TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 5
A. Enzim .......................................................................................................... 5
B. Kinetika Reaksi Enzim................................................................................ 13
C. Stabilitas Enzim........................................................................................... 14
D. Isolasi dan Pemurnian Enzim...................................................................... 16
E. Bacillus subtilis............................................................................................ 20
F. Zeolit ............................................................................................................ 21
G. Pola Pertumbuhan Bakteri........................................................................... 23
H. Amobilisasi ................................................................................................. 25
METODOLOGI PENELITIAN....................................................................... 32
A. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 32
B. Alat dan Bahan ............................................................................................ 32
C. Prosedur Penelitian...................................................................................... 33
ii
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................ 46
A. Produksi dan isolasi enzim α-amilase ......................................................... 46
B. Pemurnian enzim α-amilase ....................................................................... 47
1. Fraksinasi dengan ammonium sulfat....................................................... 47
2. Dialisis ................................................................................................... 49
3. Kromatografi kolom penukar ion CM-selulosa ..................................... 50
C. Karakterisasi enzim α-amilase hasil pemurnian dan amobilisasi ................ 54
1. Penentuan suhu optimum ....................................................................... 54
2. Penentuan stabilitas termal...................................................................... 55
3. Penentuan KM dan Vmaks ........................................................................ 56
4. Pemakaian berulang enzim hasil amobilisasi ......................................... 58
D. Konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t1/2), dan perubahan
energi akibat denaturasi (ΔGi) enzim hasil pemurnian dan amobilisasi ...... 60
KESIMPULAN DAN SARAN........................................................................ 62
Kesimpulan ...................................................................................................... 62
Saran................................................................................................................. 63
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 64
LAMPIRAN..................................................................................................... 67
iii
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Pemurnian enzim α-amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148............ 53
2. Nilai konstanta laju inaktivasi termal (nilai ki), waktu paruh (t1/2),
dan perubahan energi akibat denaturasi enzim hasil pemurnian dan
hasil amobilisasi ..................................................................................... 60
3. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat
dengan aktivitas spesifik enzim α-amilase............................................. 68
4. Hubungan antara tingkat kejenuhan ammonium sulfat fraksi
(0-20%) dan (20-90%) ........................................................................... 68
5. Pola protein (A280 nm) dan aktivitas (U/mL) enzim α-amilase
terhadap nomor fraksi pada hasil kromatografi kolom CM-selulosa..... 69
6. Hubungan antara suhu dengan aktivitas enzim α-amilase hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi ............................................................ 70
7. Hubungan antara aktivitas unit (U/mL) enzim hasil pemurnian dan
hasil amobilisasi selama inaktivasi termal 65oC .................................... 71
8. Data untuk penentuan KM dan Vmaks enzim hasil pemurnian
berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk.............................................. 72
9. Data untuk penentuan KM dan Vmaks enzim hasil amobilisasi
berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk.............................................. 72
iv
10. Absorbansi glukosa pada berbagai konsentrasi untuk penentuan
kurva standar glukosa........................................................................... 73
11. Hubungan antara pengulangan enzim hasil pemurnian dan hasil
amobilisasi dengan aktivitas unit (U/mL) ............................................ 74
12. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi pada suhu 65oC................................ 75
13. Absorbansi serum albumin sapi (BSA) pada berbagai konsentrasi
untuk penentuan kurva standar protein ................................................ 78
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur amilosa ...................................................................................... 7
2. Struktur amilopektin................................................................................ 7
3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH .................................................. 9
4. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu.................................................. 10
5. Hubungan antara laju reaksi dengan konsentrasi enzim ......................... 11
6. Hubungan konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim....................... 12
7. Diagram Lineweaver-Burk ...................................................................... 14
8. Bacillus subtilis ....................................................................................... 21
9. Kerangka utama zeolit............................................................................. 23
10. Penjebakan teknik kisi........................................................................... 27
11. Penjebakan teknik mikrokapsul............................................................. 28
12. Teknik ikatan non-kovalen.................................................................... 29
13. Teknik ikatan silang .............................................................................. 30
14. Proses fraksinasi enzim dengan ammonium sulfat................................ 38
15. Diagram alir penelitian .......................................................................... 45
vi
16. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat
Dengan aktivitas enzim α-amilase......................................................... 48
17. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat
Fraksi (0-20%) dan (20-90%) dengan aktivitas enzim α-amilase ......... 49
18. Hubungan antara absorbansi dengan aktivitas enzim α-amilase
pada kromatografi kolom ...................................................................... 51
19. Suhu optimum enzim hasil pemurnian dan enzim hasil amobilisasi..... 55
20. Hubungan antara stabilitas termal enzim hasil pemurnian dan hasil
amobilisasi pada suhu 65oC terhadap waktu ........................................ 56
21. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat
dengan aktivitas spesifik enzim α-amilase ............................................ 58
22. Pemakaian berulang enzim α-amilase ................................................... 59
23. Kurva standar glukosa ........................................................................... 73
24. Grafik ln (E1/E0) enzim α-amilase hasil pemurnian dan enzim
α-amilase hasil amobilisasi.................................................................... 76
25. Kurva standar BSA................................................................................ 78
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim merupakan biokatalisator yang mampu mempercepat reaksi biokimia
yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi, 2006). Enzim dapat
dihasilkan oleh semua makhluk hidup, baik tanaman, hewan dan
mikroorganisme. Tetapi untuk dikembangkan pada skala industri, enzim yang
berasal dari mikroorganisme lebih menguntungkan karena mikroorganisme
lebih mudah dikembangkan, tidak memerlukan tempat yang luas dan waktu
yang lama (Wang, 1979). Pada saat ini terdapat empat jenis enzim yang
diproduksi pada skala tinggi, yaitu protease, glukoamilase, α-amilase, dan
glukosa isomerase (Suhartono,1989).
Enzim α-amilase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis pati menjadi
monomer yang lebih sederhana (Winarno, 1986). Enzim α-amilase
dimanfaatkan secara luas di bidang industri makanan dan minuman, industri
kertas, industri tekstil, industri detergen, bioetanol, serta pengolahan limbah
cair. Kebutuhan α-amilase sendiri sangat besar, yaitu sekitar 30% dari
produksi enzim dunia. Oleh karena itu meskipun telah banyak diisolasi dan
dikristalisasi, eksplorasi sumber α-amilase yang lebih efisien masih
dibutuhkan. Penggunaan enzim dalam industri harus memenuhi beberapa
2
kriteria khusus, antara lain memiliki kestabilan pada kondisi suhu yang tinggi
dan pH yang ekstrim (Goddette et al., 1993).
Enzim α-amilase dapat diproduksi dari beberapa mikroorganisme secara
ekstraseluler, misalnya Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus
awamon, Bacillus mecentricus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus,
dan Bacillus licheniformis. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk
batang. Mikroorganisme ini bersifat gram positif dan bersifat aerob (Schelege
and Schmidt, 1994). Pada penelitian ini digunakan Bacillus subtilis karena
sifatnya yang mudah ditumbuhkan pada media sederhana, tidak bersifat
patogen, dan dapat tumbuh pada suhu yang sedikit tinggi.
Enzim telah banyak dimanfaatkan secara komersil, karena sifatnya sebagai
biokatalis yang dapat bekerja secara spesifik dan efisien. Namun enzim
memiliki beberapa kelemahan di antaranya harganya yang mahal, ketersediaan
yang terbatas dan sifatnya yang hanya dapat digunakan sekali pakai sehingga
mengakibatkan penggunaan enzim pada industri sangat terbatas. Salah satu
cara mengatasi kelemahan dalam penggunaan enzim tersebut adalah melalui
amobilisasi. Pada saat digunakan, enzim amobil dapat berfungsi sebagai
katalis tanpa ikut terlarut dalam substrat. Setelah proses selesai, enzim amobil
dapat dipisahkan dari produk dan diperoleh kembali, sehingga enzim amobil
dapat digunakan berulang kali (Darwis dan Sukara, 1990).
Tiga cara untuk meningkatkan stabilitas enzim menurut Mozhaev dan Martinek
(1984), yaitu amobilisasi, modifikasi kimia, dan mutagenesis terarah.
Penggunaan amobilisasi enzim hingga saat ini masih banyak digunakan dalam
3
proses industri karena mempunyai keunggulan tertentu. Menurut Wang et al.,
(1979), selain dapat digunakan berulangkali, penggunaan enzim amobil dalam
industri mempunyai beberapa keuntungan lain, di antaranya adalah pemakaian
produknya tidak terkontaminasi oleh enzim, memudahkan proses pengendalian
reaksi, dapat digunakan untuk analisis, dan pada proses amobilisasi tertentu
dapat meningkatkan stabilitas enzim. Beberapa media pendukung yang dapat
digunakan pada proses amobilisasi enzim antara lain zeolit, bentonit, gelatin,
kitin dan kitosan.
Pada penelitian ini digunakan zeolit sebagai senyawa pengamobilisasi enzim
α-amilase. Zeolit digunakan sebagai senyawa pengamobilisasi enzim karena
sifat yang dimiliki oleh zeolit memungkinkan untuk dimodifikasi menjadi
katalis, adsorben, dan sebagai matrik pengamobil. (Sutarti dan Rachmawati,
1994). Sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan stabilitas enzim dan
mendapatkan kondisi optimum enzim α-amilase bebas dan amobil, yang
meliputi pH optimum, suhu optimum, dan stabilitas termal.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Mengisolasi enzim α-amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB 148
2. Melakukan pemurnian enzim α-amilase yang diperoleh dan
mengkarakterisasi enzim hasil pemurnian tersebut.
3. Melakukan amobilisasi enzim α-amilase hasil pemurnian dan
mengkarakterisasi hasil amobilisasi tersebut.
4
C. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kemampuan
zeolit sebagai zat pengamobil enzim α-amilase dalam meningkatkan kestabilan
enzim -amilase terhadap suhu dan pH.
5
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Enzim
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup,
dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator reaksi biokimia
(Wirahadikusumah, 1977) yang terjadi dalam sel maupun di luar sel. Suatu
enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat dari pada
reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis (Poedjiadi, 1994). Enzim memiliki
berat molekul mulai dari 12.000 sampai lebih dari 1 juta. Enzim bersifat
spesifik dalam kerja katalitiknya. Kespesifikan ini disebabkan oleh
bentuknya yang unik dan adanya gugus-gugus polar atau nonpolar dalam
struktur enzim (Fessenden dan Fessenden, 1992).
Kestabilan enzim sebagai katalis dibandingkan dengan katalis sintetik antara
lain : (1) enzim mempunyai spesifitas tinggi, (2) enzim bekerja secara
spesifik (hanya mengkatalisis substrat tertentu), (3) tidak berbentuk produk
samping yang tidak diinginkan, (4) mempunyai produktivitas tinggi, (5)
produk akhir pada umumnya tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya
purifikasi dan mengurangi efek kerusakan terhadap lingkungan (Chaplin dan
Bucke, 1990).
6
1. Enzim Amilase
Enzim amilase termasuk golongan enzim hidrolase. Enzim amilase
merupakan enzim yang mempunyai aktivitas memecah ikatan-ikatan pada
amilum hingga terbentuk maltosa (Poedjadi, 1994). Amilase dapat
dikelompokkan menjadi tiga yaitu α-amilase, β-amilase, dan glukoamilase
(Rahman, 1992).
a. α-Amilase
Enzim α-Amilase menghidrolisis ikatan α-1,4 glukosidik amilosa,
amilopektin dan glikogen. Struktur amilosa dan amilopektin pada pati
ditunjukkan pada Gambar 1 dan Gambar 2.Enzim ini bersifat sebagai
endoamilase, yaitu enzim yang memecah pati secara acak dari tengah
atau bagian dalam molekul. Berat molekul α-amilase rata-rata ± 50 kd.
Enzim ini mempunyai rantai peptida tunggal pada gugusan proteinnya
dan setiap molekul mengandung satu gram atom Ca. Adanya kalsium
yang berikatan dengan molekul protein enzim, membuat enzim α-amilase
bersifat relatif tahan terhadap suhu, pH, dan senyawa seperti urea
(Suhartono,1989). Secara umum α-amilase stabil pada pH 5,5 – 8,0 dan
aktivitas optimum secara normal berada pada pH 4,8 – 6,5. Amilase dari
Bacillus subtilis mempunyai pH optimum 6,0 dan suhu optimum 60oC
(Judoamidjojo,1989).
7
Gambar 1. Struktur amilosa ikatan α-1,4-glikosidik
Gambar 2. Struktur amilopektin pada pati (Fessenden danFessenden,1982).
Hidrolisis amilosa oleh α-amilase terjadi melalui dua tahap, pertama
adalah degradasi menjadi dekstrin yang terjadi secara acak. Degradasi
ini terjadi sangat cepat diikuti dengan menurunnya viskositas dengan
cepat. Tahap kedua relatif sangat lambat dengan pembentukan glukosa
dan maltosa sebagai hasil akhir (Suhartono, 1989).
Aktivitas α-amilase dapat diukur berdasarkan penurunan kadar pati yang
larut, kadar dekstrin yang terbentuk, dan pengukuran viskositas atau
jumlah gula pereduksi yang terbentuk (Judoamidjojo dkk., 1989). Pati
8
bereaksi secara kimiawi dengan iodium, reaksi ini terlihat sebagai warna
biru-kehitaman. Warna ini terjadi bila molekul iodium masuk ke dalam
bagian yang kosong pada molekul zat pati (amilosa) yang berbentuk
spiral. Bila zat pati ini telah diuraikan menjadi maltosa atau glukosa,
warna biru tidak terjadi karena tidak adanya bentuk spiral (Lay, 1994).
Aktivitas enzim α-amilase ditentukan dengan mengukur penurunan kadar
pati yang larut dengan menggunakan substrat jenuh. Kejenuhan pati
berpengaruh terhadap laju reaksi enzimatis. Apabila larutan pati terlalu
jenuh maka enzim sulit terdifusi ke dalam larutan sehingga kerja enzim
akan terhambat (Winarno, 1986).
b. β-Amilase
β-Amilase (β-1,4 glukan malthohidrolase), memecah pati dari luar
molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non pereduksi
pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan α-1,6 glukosida seperti
yang dijumpai pada amilopektin atau glikogen, aktivitas enzim ini akan
terhenti. Enzim ini bekerja pada ikatan α-1,4 glukosida dan memiliki pH
optimum antara 5 – 6.
c. Glukoamilase
Glukoamilase (α-1,4-D-glukan glukohidrolase) memecah ikatan α-1,4
dalam amilose, amilopektin, dan glikogen dari ujung gula non pereduksi.
Enzim ini dapat juga menghidrolisis ikatan α-1,6 dan α-1,3, meskipun
pemecahan ikatan tersebut sangat lambat. Enzim ini memiliki pH
optimum 4-5 (Judoamidjojo,1989).
9
2. Faktor yang mempengaruhi kerja enzim
Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain :
a) pH
(Derajat Keasaman) enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang
berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun
gugus basanya, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan gugus
terminal amino. Perubahan kereaktifan enzim diperkirakan merupakan
akibat dari perubahan pH lingkungan (Winarno, 2002). Perubahan pH
dapat mempengaruhi asam amino kunci pada sisi aktif, sehingga
menghalangi sisi aktif enzim membentuk kompleks dengan substratnya
(Page, 1997), ditunjukkan pada Gambar 3
Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Winarno,2002).
b) Suhu
Enzim mempercepat terjadinya reaksi kimia pada suatu sel hidup. Dalam
batas-batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim akan
naik bila suhunya naik. Reaksi yang paling cepat terjadi pada suhu
10
optimum (Rodwell, 2011). Suhu optimum merupakan suhu pada saat
enzim memiliki aktivitas maksimum. Suhu yang terlalu tinggi (jauh dari
suhu optimum suatu enzim) akan menyebabkan enzim terdenaturasi.
Bila enzim terdenaturasi, maka bagian aktifnya akan terganggu yang
menyebabkan konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang. Hal ini
menyebabkan laju reaksi enzimatik menurun (Poedjiadi dan Supriyatin,
2006). Pada suhu 0oC enzim menjadi tidak aktif dan dapat kembali aktif
pada suhu normal (Lay andSugyo, 1992). Hubungan antara aktivitas
enzim dengan suhu ditunjukkan dalam Gambar 4.
Gambar 4. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Rodwell,2011)
c) Konsentrasi enzim
Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju reaksi
enzimatik dimana laju reaksi meningkat dengan bertambahnya
konsentrasi enzim (Poedjiadi dan Supriyatin, 2006). Laju reaksi tersebut
meningkat secara linier selama konsentrasi enzim jauh lebih sedikit
daripada konsentrasi substrat. Hal ini biasanya terjadi pada kondisi
11
fisiologis (Page, 1997). Hubungan antara laju reaksi enzim dengan
konsentrasi enzim ditunjukkan dalam Gambar 5.
Gambar 5. Hubungan antara laju reaksi dengan konsentrasi enzim(Page, 1997).
d) Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi
substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat
meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga
tercapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi
substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger,
2005). Hubungan antara konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim
ditunjukkan pada Gambar 6.
12
Gambar 6. Hubungan konsentrasi substrat dengan laju reaksi enzim(Shahib, 2005)
e) Aktivator dan inhibitor
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator
adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis.
Komponen kimia yang membentuk enzim disebut juga kofaktor. Kofaktor
tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu, Mg atau
dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut koenzim
(Martoharsono, 2006).
Menurut Wirahadikusumah (2001), inhibitor merupakan suatu zat kimia
tertentu yang dapat menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara kerja
inhibitor adalah dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat
berikatan dengan substrat dan fungsi katalitik enzim tersebut akan terganggu
(Winarno, 2002).
13
B. Kinetika Reaksi Enzim
Parameter dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-Menten
(KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks). Berdasarkan postulat Michaelis dan
Menten pada suatu reaksi enzimatis terdiri dari beberapa fase yaitu
pembentukan kompleks enzim substrat (ES), dimana E adalah enzim dan S
adalah substrat, modifikasi dari substrat membentuk produk (P) yang masih
terikat dengan enzim (EP) dan pelepasan produk dari molekul enzim (Shahib,
2005). Setiap enzim memiliki sifat dan karakteristik yang spesifik seperti yang
ditunjukkan pada sifat spesifisitas interaksi enzim terhadap substrat yang
dinyatakan dengan nilai tetapan Michaelis-Menten (KM).
Nilai KM didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim
mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Setiap enzim memiliki
nilai KM dan Vmaks yang khas dengan substrat spesifik pada suhu dan pH
tertentu (Kamelia et al., 2005). Nilai KM yang kecil menunjukkan bahwa
kompleks enzim-substrat sangat mantap dengan afinitas tinggi terhadap
substrat, sedangkan jika nilai KM suatu enzim besar maka enzim tersebut
memiliki afinitas rendah terhadap substrat (Page, 1997). Nilai KM suatu enzim
dapat dihitung dengan persamaan Lineweaver-Burk yang diperoleh dari
persamaan Michaelis-Menten yang kemudian dihasilkan suatu diagram
Lineweaver-Burk yang ditunjukkan pada Gambar 7 (Page, 1997).
14
Gambar 7. Diagram Lineweaver-Burk ( Suhartono, 1989)
C. Stabilitas Enzim
Menurut Kazan et al (1996), stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan
aktivitas enzim selama penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta
kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu
(asam atau basa), oleh pengaruh suhu dan kondisi-kondisi non fisiologis
lainnya.
Ada beberapa cara yang digunakan untuk memperoleh stabilitas enzim yang
tinggi, yaitu menggunakan enzim yang memiliki stabilitas enzim alami dan
15
mengusahakan peningkatan stabilitas enzim yang secara alami tidak atau
kurang stabil.
1. Stabilitas Termal Enzim
Suhu yang tinggi akan menyebabkan laju reaksi meningkat. Demikian
halnya dengan reaksi enzimatik, kenaikan suhu akan mempercepat laju
reaksi, namun hanya batas tertentu. Suhu yang terlalu tinggi menyebabkan
enzim terdenaturasi. Hal ini menyebabkan laju enzimatik menurun. Proses
inaktivasi enzim pada suhu tinggi dapat berlangsung melalui dua tahap,
yaitu:
a. Adanya pembukaan parsial struktur sekunder, tersier dan kuartener
molekul enzim.
b. Perubahan struktur primer enzim karena adanya kerusakan asam amino
tertentu oleh panas (Ahern dan Klibanov, 1987). Biasanya industri
menginginkan penggunaan suhu reaksi yang tinggi pada reaksinya. Hal
ini bertujuan untuk mengurangi tingkat kontaminasi, masalah-masalah
viskositas dan meningkatkan laju reaksi.
2. Stabilitas pH Enzim
Enzim yang aktif pada pH netral menandakan enzim mempunyai konstanta
disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya, terutama pada gugus
residu terminal karboksil dan gugus terminal anionnya. Enzim memiliki
aktivitas maksimum pada kisaran pH optimum, yaitu antara pH 4,5-8,0. Di
sekitar pH optimum, enzim mempunyai stabilitas yang tinggi. Perubahan
pH lingkungan dapat mempengaruhi keaktifan enzim akibat terjadinya
16
perubahan ionisasi enzim, substrat, atau kompleks enzim substrat (Winarno,
1986).
D. Isolasi dan Pemurnian Enzim
Menurut Judoamidjojo dkk., (1989), tahapan proses pengisolasian dan
pemurnian enzim adalah sebagai berikut:
1. Lisis dinding sel
Melisis dinding sel dapat dilakukan dengan cara homogenisasi. Proses ini
bertujuan untuk mengeluarkan enzim dari sel. Homogenisasi dapat
dilakukan dengan alat homogenisator, contohnya lumpang dan waring
blender.
2. Sentrifugasi
Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan sel dari enzim ekstraseluler.
Hasil yang didapat dari sentrifugasi berupa supernatan dan endapan yang
berada di ujung dasar tabung. Pada proses sentrifugasi sebaiknya dilakukan
pada suhu 2-4oC. Hal ini dikarenakan pada prosesnya, sentifugasi akan
menimbulkan panas yang dapat menyebabkan denaturasi pada enzim
(Suhartono, 1989).
Prinsip sentrifugasi berdasarkan pada kenyataan bahwa setiap partikel yang
berputar pada laju sudut yang konstan akan memperoleh gaya keluar (F).
Besar gaya ini bergantung pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius
pertukarannya (sentimeter).
17
F = ω2 r
Gaya F dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, karena itu dinyatakan sebagai
gaya sentrifugal relatif (RCF dengan satuan g (gravitasi)).
Dalam praktiknya, alat sentrifugasi dioperasikan dengan laju rpm. Oleh
sebab itu, harga rpm dikonversikan kedalam bentuk radian menggunakan
persamaan:
3. Fraksinasi dengan ammonium sulfat
Fraksinasi merupakan proses pengendapan secara bertahap. Pengendapan
ini dapat dilakukan dengan penambahan garam seperti natrium klorida,
natrium sulfat, atau ammonium sulfat. Pada umumnya garam yang sering
digunakan adalah ammonium sulfat karena kebanyakan enzim tahan
terhadap garam ini (tidak terdenaturasi, memiliki kelarutan yang besar,
mempunyai daya pengendapan yang besar, dan mempunyai efek penstabil
terhadap kebanyakan enzim). Konsentrasi garam dapat mempengaruhi
kelarutan enzim. Semakin tinggi konsentrasi garam, maka kelarutan protein
enzim akan semakin rendah dalam air.
18
4. Dialisis
Dialisis adalah suatu metode yang digunakan untuk memisahkan garam dari
larutan protein enzim. Tahap awal proses dialisis ini, yaitu memasukkan
larutan enzim yang telah di fraksinasi ke dalam membrane (selofan). Jika
kantong yang berisi larutan enzim dimasukkan ke dalam buffer, maka
molekul kecil yang ada di dalam larutan enzim akan keluar melewati pori-
pori membran. Hal ini disebabkan distribusi ion-ion yang ada di dalam dan
di luar kantong dialisis tidak seimbang. Sedangkan molekul protein yang
berukuran besar akan tetap berada dalam kantong dialisis. Untuk mencapai
keseimbangan maka dapat dilakukan dengan cara mengganti larutan buffer
secara kontinu sampai ion-ion dalam kantong dialisis dapat diabaikan
(Lehninger, 1982).
5. Kromatografi
Pada proses isolasi dan pemurnian enzim dikenal tiga jenis kromatografi,
yaitu:
a. Kromatografi filtrasi gel
Kromatografi filtrasi gel digunakan untuk memisahkan protein yang
mempunyai berat molekul tinggi dengan molekul lain yang memiliki
berat yang rendah. Molekul kecil akan masuk ke pori-pori matriks
sedangkan molekul besar akan diteruskan. Matriks yang digunakan
adalah gel, merupakan media pemisah (Suhartono, 1989).
19
b. Kromatografi penukar ion
Prinsip dasar teknik penukar ion adalah memisahkan biomolekul
berdasarkan muatan ioniknya. Penukar ion terdiri atas matriks yang tidak
larut dan gugus bermuatan yang terikat secara kovalen pada matriks.
Gugus-gugus bermuatan berasosiasi dengan “counter ion”. Counter ion
dapat digantikan secara reversible oleh ion-ion lain yang bermuatan
sama. Penukar ion yang bermuatan positif mempunyai counter ion yang
bermuatan negatif, sehingga disebut penukar anion. Sedangkan penukar
bermuatan negatif dan mempunyai counter ion yang bermuatan positif.
Matriks yang digunakan dapat berupa senyawa organik, resin sintetik,
polisakarida, dan sebagainya. Protein yang terikat pada penukar ion
dapat dielusi dari kolom dengan mengubah pH atau konsentrasi garam
(Suhartono,1989).
c. Kromatografi afinitas
Pada metode ini, pemisahan terjadi karena adanya interaksi spesifik
diantara pasangan senyawa. Matriksnya dapat mengenali dan mengikat
protein target secara spesifik, protein target akan terikat secara kovalen
pada matriks kolom, yang sebenarnya inert. Protein yang terikat dapat
dilepaskan dengan menambahkan larutan mengandung molekul yang
telah dikenali dan dapat mengikat protein target. Molekul yang
ditambahkan bersaing untuk mencapai sisi pengikatan protein, sehingga
melepaskan protein dan matriks (Wolfe,1993).
20
Keuntungan menggunakan teknik ini adalah sifat interaksinya yang
spesifik. Jumlah adsorben yang dibutuhkan dapat disesuaikan dengan
jumlah zat yang akan diadsorpsi, partikel-partikel yang terserap dapat
dilepaskan dengan mudah dan adsorben dapat diregenerasi beberap kali
(Suhartono, 1989)
E. Bacillus subtilis
Bacillus merupakan salah satu mikroba golongan bakteri. Sebagian besar
bakteri genus Bacillus pada umumnya hidup di tanah, diantaranya adalah
Bacillus subtilis, Bacillus lincheniformis, Bacillus megatarium, Bacillus
pumilis, dan kelompok Bacillus spaericus. Selain di tanah, beberapa jenis
bacillus juga ditemukan di lumpur dan di muara yaitu Bacillus firmus dan
Bacillus lentus. Selain ditemukan di kedua habitat di atas, ada juga beberapa
jenis bacillus yang hidup di laut misalnya Bacillus marinus, Bacillus
cirroflagelosus, Bacillus epiphytes, dan Bacillus filicolonicus (Priest,1993).
Bacillus subtilis merupakan bakteri yang mempunyai spora. Sporanya
berbentuk oval atau silinder dan lebarnya tidak melebihi dari sel induknya.
Mikroorganisme ini bersifat gram positif dan bersifat aerob (Schelege dan
Schmidt, 1994). Bacillus subtilis berbentuk batang lurus gram positif
berukuran 1,5 x 4,5 μ, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai,
bergerak, dan tidak bersimpai (Gupte, 1990) yang ditunjukkan pada Gambar 8.
21
Gambar 8. Bacillus subtilis (Gupta, 1990).
F. Zeolit
Mineral zeolit banyak ditemukan di alam sebagai batuan sedimen vulkano.
Penyusunan utama zeolit adalah mordenit dan klipnotilonit dalam berbagai
variasi komposisi. Nama zeolit berasal dari dua kata dalam bahasa Yunani
yaitu zein yang berarti mendidih dan lithos yang berarti batuan. Disebut
demikian karena mineral ini mempunyai sifat mendidih atau mengembang
apabila dipanaskan. Dimana air dalam rongga-rongga zeolit akan mendidih
bila dipanaskan pada suhu 100°C (Sutarti dan Rachmawati, 1994).
Zeolit menurut proses pembentukannya dibagi 2, yaitu : zeolit alam (natural
zeolit) dan zeolit sintetis (synthetic zeolit). Zeolit alam biasanya mengandung
kation-kation K+ ,Na+, Ca2+ atau Mg2+ sedangkan zeolit sintetik biasanya
hanya mengandung kation-kation K+ atau Na+. Pada zeolit alam, adanya
molekul air dalam pori dan oksida bebas di permukaan seperti Al2O3, SiO2,
22
CaO, MgO, Na2O, K2O dapat menutupi pori-pori atau situs aktif dari zeolit
sehingga dapat menurunkan kapasitas adsorpsi maupun sifat katalisis dari
zeolit tersebut. Inilah alasan mengapa zeolit alam perlu diaktivasi terlebih
dahulu sebelum digunakan. Aktivasi zeolit alam dapat dilakukan secara
fisika maupun kimia. Secara fisika, aktivasi dapat dilakukan dengan
pemanasan pada suhu 300- 400ºC dengan udara panas atau dengan sistem
vakum untuk melepaskan molekul air. Sedangkan aktivasi secara kimia
dilakukan melalui pencucian zeolit dengan larutan Na2EDTA atau asam-asam
anorganik seperti HF, HCl dan H2SO4 untuk menghilangkan oksida-oksida
pengotor yang menutupi permukaan pori (Sutarti dan Rachmawati, 1994).
Zeolit didefenisikan sebagai senyawa aluminosilikat yang mempunyai
struktur kerangka tiga dimensi dengan rongga didalamnya. Struktur kerangka
zeolite tersusun atas unit-unit tetrahedral (AlO4)-5 dan (SiO4)
-4 yang saling
berikatan melalui atom oksigen membentuk pori-pori zeolit. Ion silikon
bervalensi 4, sedangkan aluminium bervalensi 3. Hal ini yang menyebabkan
struktur zeolit kelebihan muatan negatif yang diseimbangkan oleh kation-
kation logam alkali atau alkali tanah seperti Na+, K+, Ca+ atau Sr+ maupun
kation-kation lainnya. Kation-kation tersebut terletak diluar tetrahedral, dapat
bergerak bebas dalam rongga-rongga zeolit dan bertindak sebagai counter ion
yang dapat dipertukarkan dengan kation-kation lainnya, sifat-sifat inilah yang
mendasari zeolit sebagai penukar kation. Berdasarkan sifat fisika dan sifat
kimia zeolit tersebut zeolit dapat dimanfaatkan sebagai penukar ion,
penyaring molekuler, adsorben dan katalis (Senda, 2005).
23
Rumus umum zeolit adalah
Mx/n[(AlO2)x(SiO2)y].mH2O
Mx/n = kation bermuatan
[ ] = kerangka aluminosilika
X = jumlah AlO4
Y = jumlah SiO4, y>x
Z = jumlah H2O
Kerangka zeolit berupa rongga yang berisi kation M+ sebagai kation
penyumbang muatan AlO4 yang ditunjukkan pada Gambar 9.
Gambar 9. Kerangka utama zeolit (Lisley and Elain, 1992)
G. Pola Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan dapat diartikan sebagai penambahan semua komponen di
dalam sel hidup yang berlangsung secara teratur. Pertumbuhan bakteri
merupakan pertambahan jumlah sel dan berat sel (Purwoko, 2007:57).
Umumnya pertambahan dan pertumbuhan sel mikroba digambarkan dalam
bentuk kurva pertumbuhan berbentuk sigmoid. Kurva pertumbuhan
24
mikroba menggambarkan fase pertumbuhan secara bertahap sejak awal
pertumbuhan hingga kematian sel bakteri ( Suriawiria, 1990:80 ). Fase
pertumbuhan mikroba terdiri dari :
a. Fase Adaptasi
Fase ini merupakan fase penyesuaian bakteri terhadap lingkungan yang
baru ( Muslimin, 1996:61). Pada fase ini tidak terjadi pertambahan dan
kenaikan jumlah sel tetapi peningkatan ukuran atau volume sel,
peningkatan total protein seluruhnya, DNA ( Lay, 1992:87 ). Lamanya
fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya :
1. Umur inokulum
Bila mikroba dipindahkan pada fase log, maka akan berbeda bila
inokulum berasal dari fase stasioner.
2. Jumlah inokulum
Jumlah sel awal yang semakin tinggi maka mempercepat fase
adaptasi ( Muslimin,1996:61).
3. Medium dan lingkungan pertumbuhan
Jika medium dan lingkungan pertumbuhan sama dengan lingkungan
sebelumnya maka bakteri tidak memerlukan waktu adaptasi. Tetapi
jika berbeda, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis
enzim-enzim.
25
b. Fase Pertumbuhan Logaritmik
Fase ini merupakan fase dimana mikroba membelah dengan cepat dan
konstan mengikuti kurva linier. Pada fase ini bakteri sudah beradaptasi
secara baik dengan lingkungan pertumbuhannya sehingga mempunyai
waktu penggandaan yang lebih cepat dibandingkan fase sebelumnya
(Yuwon, 2002:88 ).
c. Fase Pertumbuhan Tetap
Fase ini jumlah populasi sel bakteri tetap karena jumlah sel yang
tumbuh sama dengan sel yang mati (Muslimin, 1996:62). Menurut Lay
dan Hastowo (1992) hal ini terjadi karena berkurangnya jumlah nutrien
serta faktor-faktor yang terkandung di dalam jasad mikroba, sehingga
membuat aktivitas pertumbuhan sampai pada titik maksimum.
d. Fase Kematian
Fase ini merupakan akhir dari pertumbuhan bakteri, dimana jumlah
bakteri menurun drastis sehingga grafik akan menuju kembali ketitik
awal (Suriawiria,1990 : 81). Penurunan populasi mikroba disebabkan
karena autolisis sel dan penurunan energi seluler ( Purwoko, 2007:57 ).
H. Amobilisasi
Enzim bebas mempunyai sifat tidak stabil terhadap lingkungan, sehingga
secara teknik perolehan kembali enzim yang sangat aktif dari campuran
reaksi sulit dilakukan sehingga stabilitas enzim perlu ditingkatkan.
26
Terdapat tiga cara untuk meningkatkan stabilitas enzim yaitu amobilisasi,
modifikasi kimia dan mutagenesis langsung (Mozhaev, 1988).
Keunggulan penggunaan enzim amobil dalam industri menurut Payne et al
(1992) dan Wang et al (1979) antara lain:
1. Dapat digunakan berulang
2. Dapat mengurangi biaya
3. Produk tidak dipengaruhi oleh enzim
4. Memudahkan pengendalian enzim
5. Tahan kondisi ekstrim
6. Dapat digunakan untuk uji analisis
7. Meningkatkan daya guna
8. Memungkinkan proses sinambung.
Enzim dapat di amobilisasi dengan berbagai cara antara lain : 1. Cara fisik
yang meliputi teknik penjebakan mikro kapsul, 2. Cara kimia yang
meliputi teknik pengikatan (absorpsi) pada bahan pendukung atau dengan
teknik ikatan silang (Wirahadikusumah, 1981).
Metode amobilisasi secara fisik memiliki kelebihan yaitu aktivitas dari
enzim tetap tinggi (tidak terjadi perubahan konformasi enzim) dan media
dapat diregenerasi (Susanto, 2003).
27
1. Cara fisik (penjebakan)
a. Teknik matriks
Enzim dapat terperangkap dalam gel matriks dengan membentuk gel
dalam larutan encer yang mengandung satu macam enzim (Gambar
10). Matriks yang banyak digunakan adalah kalsium alginat, kappa-
karagenan, resin sintetis dan poliakrilamida. Poliakrilamida terbuat
dari akrilamida. Sedangkan serat yang digunakan yaitu selulosa
triasetat dan polimerpolimer lainnya. Keuntungan menggunakan
teknik ini adalah secara relatif struktur alami enzim tidak mengalami
gangguan fisik. Hal ini karena enzim tidak terikat dengan bahan
pendukung, sehingga tidak terjadi perubahan konformasi enzim atau
inaktifasi enzim. Akibatnya untuk membentuk kompleks enzim
substrat sangat kecil kemungkinannya, karena enzim tidak berada
pada permukaan bahan pendukung.
Gambar 10. Penjebakan teknik kisi (Crueger, 1984)Teknik
28
Teknik ini merugikan karena (1) terjadi kebocoran yang kontinue
karena ukuran pori-pori terlalu besar, (2) interaksi antara substrat dan
enzim kurang karena jeratan gel dan (3) kehilangan aktivitas enzim
karena terbentuknya zat-zat radikal bebas pada reaksi polimerisas
(Judoamidjojo, 1990).
b. Teknik mikrokapsul
Enzim juga dapat diperangkap dalam mikrokapsul (Gambar 11) yang
terbuat dari nilon semipermeabel butiran yang tipis atau membran
koloidon. Teknik ini merugikan karena (1) terjadi inaktif enzim
selama pembentukan mikrokapsul, (2) mikrokapsul membutuhkan
konsentrasi yang besar dan (3) enzim dapat bergabung dengan dinding
membran (Crueger, 1984).
Gambar 11. Penjebakan teknik mikrokapsul (Crueger, 1984)
29
2. Metode kimia
a. Teknik ikatan non-kovalen
Enzim dapat diadsorpsi pada bahan pendukung seperti alumina, karbon
aktif, silika gel dan lainnya. Teknik ini dapat menyebabkan kehilangan
enzim oleh desorpsi, maka adsorben yang baik adalah yang dapat
mengikat enzim cukup kuat dengan akibat denaturasi yang cukup kecil.
Cara ini sukar dilakukan, tetapi enzim amobil yang terbentuk stabil
terhadap konsentrasi substrat dan ion yang tinggi (Wirahadikusumah,
1989). Gambar 12.
Gambar 12. Teknik ikatan non-kovalen (Wirahadikusumah, 1989)
b. Teknik ikatan silang
Dimana enzim terikat secara kovalen satu dengan lainnya oleh
pengikatan yang mempunyai gugus aktif NH3, CNBr dan lainnya, yang
membentuk struktur tiga dimensi yang tidak larut dalam air.
Pembentukan ikatan intramolekuler antar molekul sering terjadi dengan
dua atau lebih pereaksi seperti glutaraldehida, turunan isosianat,
bisdiazobenzidina, N,N-etilen bismaleimida dan N,N-polimetil
30
bisoodoaseomida. Kerugian cara ini ketika terjadi inaktivasi enzim
akibat pembentukan ikatan antara pusat aktif enzim dengan zat pengikat
silang (Wiseman, 1985). Gambar 13
Gambar 13. Teknik ikatan silang (Wiseman, 1985)
c. Teknik ikatan ion
Enzim terikat dengan bahan pendukung yang mengandung residu
penukar kation maupun anion dan ikatan yang terbentuk lebih kuat
disbanding ikatan non-kovalen. Bahan pendukung yang dapat digunakan
adalah dietilaminoetil-selulosa (DEAE-selulosa) dan karboksimetil-
selulosa (CM-selulosa). Pada proses amobilisasi, jumlah enzim yang
teradsorpsi dipengaruhi oleh lama perubahan sifat enzim akibat proses
amobilisasi antara lain adalah:
1. Perubahan konformasi molekul enzim, karena adanya reaksi asam
amino pada molekul enzim dengan senyawa pengikat atau polimer
penyangga.
31
2. Perubahan stereo kimia dan muatan total pada kisi aktif enzim yang
mengakibatkan berubahnya daya gabung enzim dengan substrat.
3. Perubahan nilai KM karena kemungkinan adanya interaksi antara
substrat dengan molekul penyangga.
4. Perubahan pH optimum dan kurva aktivitas pH, yang bergantung pada
muatan polimer penyangga.
5. Perubahan suhu optimum, karena polimer penyangga yang dapat
melindungi pengaruh dari luar (Trevan,1980).
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung pada bulan
Januari – Mei 2017.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain alat-alat gelas, jarum
ose, mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar
spirtus, sentrifuga, tabung sentrifuga, autoclave model S-90N, oven, laminar
air flow CRUMA model 9005-FL, shaker incubator, shaker waterbath
incubator, Penangas air, vakum filtrasi dan spektrofotometer UV-VIS Cary
Win UV 32.
Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri Bacillus
subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan
Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung. Bahan-bahan yang digunakan
adalah: ekstrak ragi, pati, NA (Nutrient Agar), KH2PO4, HCl 1N, FeSO4,
CaCl2, , (NH4)2SO4, Na2CO3, NaOH, CuSO45H2O, I2, KI, NaH2PO4,
33
Na2HPO4, Na2SO3, fenol, Na-K tartrat, reagen Folin Ciocalteu, NaHCO3,
asam dinitrosalisilat dan bahan kimia lain dengan derajat proanalisis. Untuk
pemisahan dan pemurnian enzim digunakan kromatografi penukar kation
CM-selulosa, diperoleh dari E. Merck. Untuk amobilisasi digunakan zeolite
diperoleh dari Sigma. Protein standar untuk penentuan kadar protein
digunakan bovin serum albumin diperoleh dari E. Merck.
C. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan medium Inokulum, Fermentasi dan Larutan Pereaksi
a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi
Medium inokulum digunakan sebagai medium adaptasi awal
pertumbuhan dan medium perkembangbiakan bakteri pada medium cair.
Media inokulum dibuat dengan cara menimbang bahan-bahan yang
terdiri dari 0,5 gr pati, 0,5 gr yeast ekstrak, 0,02 gr MgSO4.7H2O, 0,01 gr
CaCl2.5H2O, dan 0,05 gr KH2PO4 yang dilarutkan dalam 100 ml akuades
dalam labu erlenmeyer 250 mL dan disterilisasi menggunakan autoclave
pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit kemudian dishaker
selama 24 jam (Sternberg, 1976).
Sedangkan media fermentasi yang digunakan terdiri dari dari 1,25 gr pati
sagu, 1,25 gr yeast ekstrak, 0,05 gr MgSO4.7H2O, 0,025 gr CaCl2.5H2O,
dan 0,125 gr KH2PO4 yang dilarutkan dalam 250 mL larutan buffer fosfat
pada pH 6,5 dalam labu erlemmeyer 500 mL dan disterilisasi
34
menggunakan autoclave pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 15
menit kemudian dishaker selama 68 jam.
b. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas α-amilase metodeFuwa
Pereaksi Iodin : Kedalam labu takar 100 mL, 2 gram KI dilarutkan
dalam 10 ml akuades. Lalu di tambahkan 0,2 gr I2.
Kemudian ditambahkan akuades hingga tanda
batas.
Larutan Pati : 0,1 gr pati dilarutkan dalam 100 ml akuades dan
dipanaskan hingga larut.
Larutan HCl 1N : Dihitung pengenceran HCl pekat 12 N menjadi
1 N. Sehingga diperoleh 8,3 ml HCl pekat yang
ditambah akuades hingga batas miniskus pada labu
ukur 100 ml.
Larutan Buffer phosfat : Larutan buffer phosfat pH 6,5 dibuat dengan
mencampurkan stok A dan stok B pada volume
tertentu. Stok A dibuat dengan cara menimbang
NaH2PO4 sebanyak 31,970 g kemudian
dilarutkan dalam 1000 mL akuades. Stok B
dibuat dengan cara menimbang Na2HPO4
sebanyak 14,211 g kemudian dilarutkan dalam
500 mL akuades hingga homogen. Larutan
buffer fosfat pH 6,5 dibuat dengan
mencampurkan stok A dan stok B dengan
35
perbandingan volume 342,5 mL stok A dan
157,5 mL stok B.
c. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas -amilase metodeMandels
Dalam labu ukur 100 mL dimasukkan w/v 1% NaOH, 1 mL Na(K)
tartarat 40%, 1% DNS (Dinnitrosalisilic acid), 0,2% fenol dan 0,05%
Na2SO3 kemudian dilarutkan dengan 100 mL akuades hingga tanda
batas (Mandels et al.,1976).
d. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein metode Lowry
Pereaksi A : 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N.
Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan ke dalam
5 mL larutan Na(K) tartarat 1%.
Pereaksi C : 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A
Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.
Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0,
20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.
2. Produksi dan Isolasi Enzim -amilase
a. Produksi Enzim -amilase
Enzim -Amilase diproduksi pada media fermentasi yang mengandung:
pati 0,5%; ekstrak ragi 0,5%; KH2PO4 0,05%; dan CaCl2 2H2O 0,01%
dengan pH 6,5. Suhu fermentasi 32C; dan lama waktu fermentasi 68
jam (Yandri et al., 2010).
36
b. Isolasi -amilase
Enzim -Amilase dalam media fermentasi dipisahkan dari sel bakteri
lokal Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan sentrifuga dingin pada laju
6000 rpm selama 30 menit sehingga diperoleh ekstrak kasar enzim
(Yandri et al., 2010).
3. Uji aktivitas -amilase dan penentuan kadar protein
a. Metode Fuwa
Aktivitas -amilase ditentukan dengan metode iodin (Fuwa, 1954).
Metode ini berdasarkan pada pengurangan jumlah substrat (pati).
Sebanyak 0,25 ml enzim ditambahkan kedalam 0,25 ml larutan pati
0,1% lalu diinkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit. Kemudian
reaksi dihentikan dengan penambahan 0,25 ml HCl 1 N dan kemudian
ditambahkan 0,25 ml pereaksi iodin dan 4 ml akuades. Setelah
campuran diaduk rata, serapannya diukur menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada λ 600 nm. Kontrol dibuat dengan cara
yang sama hanya menggunakan 0,25 ml enzim yang telah diinaktifkan.
b. Metode Mandels
Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk (Mandels et al.,1976).
Sebanyak 0,5 mL enzim, 0,5 mL larutan pati 0,1% dalam buffer sitrat pH
6,0 dicampur, lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60C. Setelah itu
ditambahkan 2 mL pereaksi asam dinitrosalisilat (DNS), dididihkan
selama 10 menit pada penangas air dan didinginkan. Setelah dingin
serapannya diukur pada panjang gelombang 510 nm menggunakan
37
spektrofotometer UV-VIS. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan
dengan menggunakan kurva standar glukosa. Uji ini dilakukan pada tahap
penentuan KM dan Vmaks. Pereaksi asam dinitrosalisilat (Mandels et al.,
1976) terdiri dari: asam dinitrosalisilat 1%, fenol 0,2%, Na2SO3 0,05%,
NaOH 1%, garam Rochel (NaK-tartrat) 40% 1mL. Campurkan semua zat
dan cukupkan volume hingga 100 mL.
c. Penentuan kadar protein metode Lowry
Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry et al. (1951).
Penentuan kadar protein dilakukan sebagai berikut: sebanyak 0,1 mL
larutan enzim ditambah 0,9 mL air dan 5 mL pereaksi C, dikocok dan
didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 0,5
mL pereaksi D, dikocok dan didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit.
Serapan dibaca pada 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein
enzim digunakan digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).
3. Fraksinasi dengan ammonium sulfat [(NH4)2SO4)]
Ekstrak kasar enzim yang diproleh dimurnikan dengan cara fraksinasi
menggunakan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan
yaitu w/v (0-20)%; (20-40)%; (40-60)%, (60-80)%, dan (80-100)%.
Skema proses pengendapan protein enzim dengan penambahan amonium
sulfat ditunjukkan pada Gambar 14. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang
diperoleh ditambahkan garam amonium sulfat yang telah dihaluskan
secara perlahan sambil diaduk dengan magnetik stirrer pada suhu 4oC.
Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan
38
amonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada
kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh
dilarutkan dengan bufer fosfat 0,1 M pH 6,5 dan diuji aktivitasnya dengan
metode Mandels, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Selanjutnya, filtrat yang didapat dari fraksi 0-20% digunakan untuk
diendapkan kembali dengan fraksi kejenuhan 20-40% dengan prosedur
yang sama hingga fraksi kejenuhan 80-100% (Yandri et al., 2010).
Gambar 14. Skema proses fraksinasi enzim dengan ammoniumsulfat
4. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat
dengan aktivitas spesifik yang tinggi, dimasukkan ke dalam kantong selofan
dan didialisis dengan buffer fosfat 0,05 M pH 6,0 selama 24 jam pada suhu
dingin. Selama didialisis, dilakukan pergantian buffer selama 4-6 jam agar
39
konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi. Proses ini
dilakukan secara kontinyu sampai ion-ion di dalam kantong dialisis dapat
diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam
dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau
BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk
endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka
semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan
uji aktivitas dengan metode Fuwa dan diukur kadar proteinnya dengan
metode Lowry.
5. Kromatografi kolom
Pada penelitian ini, pemurnian dilakukan dengan kromatografi penukar ion
menggunakan CM-selulosa sebagai matriks. Adapun proses yang dilakukan
adalah:
a. Pengembangan gel dan pencucian CM-selulosa
CM-selulosa di suspensikan dalam akuades dan dibiarkan mengembang
pada suhu kamar. Partikel halus dibuang dengan cara dekantasi. Setelah
itu ditambahkan NaOH 0,5 M dan HCl 0,5 M kemudian distabilkan
dengan buffer awal.
b. Penentuan buffer awal
CM-selulosa yang sudah siap distabilkan menggunakan buffer fosfat 0,1
M dengan variasi pH yaitu 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Kemudian ke
40
dalam matriks ditambahkan 0,5 mL enzim hasil dialisis dan dielusi
dengan buffer yang sesuai, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut
selanjutnya, dibiarkan hingga CM-selulosa mengendap. Supernatant
selanjutnya didekantasi dan diuji aktivitas enzimnya. Buffer awal yang
digunakan adalah buffer fosfat pH 5.
c. Penentuan buffer elusi
Penentuan buffer elusi dilakukan sama seperti di atas, setelah CM-
selulosa distabilkan menggunakan buffer fosfat 0,1 M dan kemudian ke
dalam masing-masing tabung dielusi dengan buffer fosfat dengan pH
yang divariasikan, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut selanjutnya
dibiarkan hingga CM-selulosa mengendap. Supernatant selanjutnya
didekantasi dan diuji aktivitas enzimnya. Buffer elusi yang digunakan
adalah buffer fosfat pH 7+NaCl.
d. Penyiapan kolom gel
Kolom berukuran 1,5 x 50 cm dibubuhi wol gelas atau kapas di ujung
bawah. Kolom dipasang tegak lurus. Bubur gel yang telah mengembang
selanjutnya dimasukkan ke dalam kolom dengan kondisi tidak terlalu
kental. Untuk mnghindari timbul gelombang udara dalam kolom gel,
karena pengatur dibiarkan terbuka.
e. Penstabil gel
Gel dalam kolom distabilkan dengan mengalirkan akuades sebanyak 2
kali volume matriks, dilanjutkan dengan mengalirkan buffer fosfat pH
pengikatan enzim (hasil pemeriksaan) sebanyak 2 kali volume matriks
41
atau sampai kondisi pH pengikatan tercapai. Karena pengatur dibuka
sedemikian rupa sehingga kecepatan tetesan 1-2 mL/menit.
f. Penempatan cuplikan enzim ke dalam kolom
Menggunakan buffer elusi. Elusi ditampung dengan volume 15-30 mL
enzim hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi
CM-selulosa. Enzim dielusi dengan buffer awal dan elusi ditampung.
Selanjutnya dielusi 20 mL, fraksi pertama dimulai pada saat cuplikan
enzim telah dimasukkan.
g. Pengukuran protein enzim hasil kromatografi kolom
Untuk mengetahui pola protein enzim hasil kromatografi kolom, maka
setiap fraksi diukur pada λ 280 nm menggunakan spektrofotometer UV-
VIS.
h. Pengukuran aktivitas enzim
Setiap fraksi pada puncak protein yang diperoleh dari pengukuran eluen
yang ditentukan aktivitasnya. Pada fraksi yang menunjukkan aktivitas
unit tertinggi ditentukan kadar proteinnya untuk mengetahui aktifitas
spesifiknya.
6. Amobilisasi enzim hasil pemurnian dengan zeolit
a. Penetapan pH untuk proses pengikatan enzim α-amilase pada zeolit
Enzim α-amilase diikatkan pada matriks dengan variasi pH 5 ; 5,5 ; 6 ;
6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8 dengan menggunakan buffer posfat 0,1 M. Kemudian
42
matriks diisi dengan 0,5 mL larutan enzim dan dielusi dengan 2mL buffer
yang sesuai, diaduk kemudian disentrifugasi selama 20 menit.
Selanjutnya supernatan didekantasi dan diuji aktivitas enzim.
b. Amobilisasi enzim α-amilase
Sebanyak 0,5 mL larutan enzim α-amilase diamobil dengan zeolit pada
pH optimum pengikatan. 0,5 mL enzim α-amilase diikatkan pada 0,25
gram zeolit dan 2mL buffer yang sesuai. Kemudian campuran diaduk
hingga rata dan simpan dalam fryzer selama 10 menit. Selanjutnya
disentrifugasi selama 20 menit. Selanjutnya supernatan didekantasi
sebagai kontrol untuk diuji aktivitas enzimnya. Kemudian endapan yang
diperoleh ditambahkan dengan 0,5 mL substrat pati 0,1% kemudian
diaduk selanjutnya diinkubasi dan diuji aktivitasnya dengan metode
mandels.
c. Pemakaian berulang enzim amobilisasi
Enzim amobil yang telah dipakai (direaksikan dengan substrat), dipakai
kembali untuk direaksikan kembali dengan substrat dengan uji metode
mandels. Pemakaian berulang ini dilakukan hingga 7 kali.
d. Karakterisasi enzim hasil amobilisasi
Karakterisasi enzim hasil amobilisasi meliputi: penentuan pH dan suhu
optimum, penentuan data kinetika, dan penentuan kestabilan terhadap
suhu dan pH.
43
7. Penentuan suhu optimum enzim hasil amobilisasi
Penentuan suhu optimum enzim α-amilase ditentukan dengan memvariasikan
suhu, yaitu 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85 dan 90oC. Selanjutnya dilakukan
pengukuran aktivitas enzim dengan metode mandels.
8. Penentuan data kinetika enzim hasil amobilisasi
Nilai Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks) enzim
α-amilase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat (larutan pati)
yaitu 0,1;0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1,0 %. Kemudian dilakukan pengukuran dengan
metode mandels. Selanjutnya data aktivitas enzim dengan konsentrasi substrat
diplotkan ke dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan KM dan Vmaks.
9. Uji kestabilan enzim hasil amobilisasi terhadap pH dan suhu (Yang et al.,1996)
Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan variasi waktu inkubasi.
Waktu inkubasi dibutuhkan enzim untuk bereaksi dengan substrat secara
optimum. Pada penelitian ini, uji stabilitas termal enzim dilakukan dengan
variasi waktu inkubasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 menit.
Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode mandels.
44
10. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), danperubahan energi akibat denaturasi (∆Gi)
Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim α-amilase hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan
kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan:
ln (Ei/E0) = - ki t (1)
Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi kimia dilakukan dengan menggunakan
persamaan (Kazan et al., 1997):
∆Gi = - RT ln (ki h/kB T) (2)
Keterangan :
R = konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1 )T = suhu absolut (K)
ki = konstanta laju inaktivasi termal
h = konstanta Planck (6,63 x 10-34J det)
kB= konstanta Boltzmann (1,381-23 x 10-1JK )
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian
yang ditunjukkan dalam Gambar 15.
Gambar 15.. Diagram alir penelitian
Amobilisasi
Enzim hasil amobilisasi
Karakterisasi enzim
Penentuan suhu
optimum
Penentuan stabilitas
termal
Penentuan Km dan
Vmaks
Produksi Enzim α-amilase
Ekstrak Kasar Enzim α-amilase
Uji aktivitas enzim
α-amilase (metode fuwa)danpenentuankadar protein
(metode lowry)
Pemurnian Enzim :
1. Fraksinasi dengan
ammonium sulfat
2. Dialisis
Isolasi Enzim α-amilase
amilase
Pembuatan Media Inokulum
Pembuatan Media Fermentasi
45
1. Fraksinasi dengan ammoniumsulfat
2. Dialisis3. Kromatografi kolom CM-selulose
62
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
1. Aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil pemurnian meningkat sebesar
19 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim yaitu sebesar 1.285,867 U/mg
menjadi 24.735,715 U/mg.
2. Enzim α-amilase hasil pemurnian memiliki suhu optimum 65ºC dan enzim
α-amilase hasil amobilisasi memiliki suhu optimum 75ºC.
3. Uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 65ºC selama 100 menit
masih memiliki aktivitas 20% sedangkan uji stabilitas enzim hasil
amobilisasi pada suhu 65ºC selama 100 menit memiliki aktivitas 40%.
4. Enzim α-amilase hasil pemurnian memiliki KM = 7,543 mg mL 1, Vmaks =
147,058 μmol mL-1 menit-1, t1/2 = 30 menit, ki = 0,023 menit-1 dan ΔGi =
103,65 kJ mol-1, sedangkan enzim hasil amobilisasi memiliki , KM = 6,779
mg mL-1, Vmaks = 97,087 μmol mL-1 menit-1. dan t1/2 = 49,5 menit, ki = 0,014
menit-1 dan ΔGi = 105,03 kJ mol-1.
63
5. Pada penelitian yang telah dilakukan, berdasarkan nilai ki, t1/2 dan ΔGi
enzim hasil amobilisasi menggunakan zeolit lebih stabil dibandingkan
dengan enzim hasil pemurnian.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka disarankan untuk
dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai optimasi pengikatan enzim
α-amilase dengan menggunakan CM-Selulosa secara kromatografi penukar
ion.
64
DAFTAR PUSTAKA
Ahern, T.J. and A.M. Klibanov. 1987. Why do enzyme irreversibly inactive at hightemperature. Biotec 1. Microbial Genetic Engineering and Enzyme Technology.Gustav Fischer. Stuttgart. New York.
Chaplin, M.F and Bucke. 1990. Enzim Technology. Cambridge University Press.Cambridge. Great Britain.
Chibata I. 1978. Immobilized Enzyme. Research and Development. Halsted PressBook. New York.pp 298.
Fessenden,R.J. and Fessenden, J.S. 1992. Kimia Organik Jilid II. Erlangga. Jakarta.395-396.
Goddettee, D.W., C. Terri, F.L. Beth, L. Maria , R.M. Jonathan, P. Christian, B.R.Robert, S.Y. Shiow, and C.R. Wilson (1993), Strategy and implementation of asystem for protein engineering, J. Biotechnol., 28, 41-54
Gupte, S.1990. Mikrobiologi Dasar. Alih bahasa oleh Dr. Julius E.S. BinarupaAksara. Jakarta.
Judoamidjojo,R.M., Gumbira S.E., dan Hartoto L. 1989. Biokonversi. DepdikbudDirjen Dikti. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.
65
Kazan, D, H. Ertan, A. Erarslan. 1996. Stabilization of Penicillin G Acylase AgainstpH by Chemical Cross-Linking. Process Biochemistry. Vol 31 (2):135-140.
Lay, B. W. and Sugyo,H. 1994. Mikrobiologi. Rajawali Pers. Jakarta. 107-112.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.369 halaman.
Mandels, M., A. Raymond., and R. Charles. 1976. Measurement of saccharifyingCellulase. Biotech and Bioeng. Sym. No. 6. John Willey and Sons. New York.
Mozhaev, V. V., K. Martinek (1984), Structure-stability relationship in proteins: Newapproaches to stabilizing enzymes, Enzyme Microb. Technol., 6, 50-59
Mulyono, H. 2001. Kamus Kimia. Ganesindo. Bandung. 96 hlm.
Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. 465 halaman.
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI-Press. Jakarta.
Poedjiadi, A. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.
Pohl, T. 1990. Concentration of Protein Removal of Salute Dalam M.P. Deutscher,Methods of Enzymology : Guide to Protein Purification. Vol 182. AcademicPress. New York.
Priest, F.G. 1993. Biotechnology. VCH Verlag Sgesel Shaft mbH. New York.
Schelegel, H.G. and K. Schmidt. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM. Yogyakarta.
66
Scopes, R.K. 1982. Protein Purification 3rd ed. Springer Verlag. New York. 308-309.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU IPB. Bogor.
Walsh, G., dan D.R. Headon. 1994. Protein Biotechnology. John Willey and Sony.New York.
Wang, D.I.C, C.L. Conney, A.L. Demain, P. Dunhill, A.E, Humprey and Lily M.D.,1979, Fermentation and Enzyme Technology, John Willey and Sons, NewYork, pp: 46.
Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.155 halaman.
Wirahadikusumah, M. 1977. Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat. ITB.Press. Bandung. 91 halaman.
Wiseman, A. 1985. Handbook of Enzymes Biotechnology 2nd ed. Ellis Harwood Lim.Chicester.
Wolfe, Stephen L.1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth PublishingCompany. California.
