BAB I

PENDAHULUAN

I.I Latar Belakang

Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus spesies

berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut,

saluran pencernaan, dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu

mikroorganisme. Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986).

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari

lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur

yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986).

Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus

dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut

pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril. Hal ini untuk

menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikkroorganisme yang tidak diinginkan (Budiarti,

2009).

Hasil inokulasi mikroba yang telah dilaksanakan dapat digunakan untuk

menggambarkan populasi mikroba yang ada di lingkungan dimana sampel digunakan.

Umumnya mikroba yang tumbuh dari proses inokulasi terdiri dari berbagai jenis mikroba.

Kondisi ini menyulitkan untuk mempelajari mikroba tersebut.

Upaya yang dapat dilakukan untuk mempelajari mikroba hasil inokulasi adalah

melakukan pemurnian terlebih dahulu sehingga hanya mikroba yang tumbuh hanya mikroba

yang diharapkan .

I.II Tujuan

Praktikum bertujuan untuk meningkatkan pengetahuan dan keterampilan praktikan dalam

melakukan proses pemurnian mikroba yang berasal dari kultur mikroba

BAB II

LANDASAN TEORI

Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri

dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan

serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda

yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Terhadap

bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat

tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan

membuka cawan Petri yang berisi media agar steril beberapa saat.

Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar

tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik

untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali. Mikroorganisme

dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan

terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung

maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat

sebagai pelikel (Lay, 1998).

Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas

metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada

bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga

memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau

lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan

agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay,1998).

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari

lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur

yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986).

Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk

menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural,

morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu

macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme dalam suatu biakan murni

dapat dipelajari dengan metode yang amat keras dengan hasil yang sangat akurat karena

pengaruh sel hidup yang lain dapat ditiadakan (Volk, 1993).

Terdapat beberapa cara untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak

diinginkan dan untuk menanam suatu species yaitu :

1. Penanaman dengan penggoresan : cara ini untuk mengasingkan kuman agar

didapatkan biakan murni.

2. Penanaman lapangan : berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakteriofage

dan uji kepekaan terhadap antibiotic.

3. Biakan agar tabung : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya

pertumbuhan murni mikro untuk aglutinasi gelas alas.

4. Biakan tusukan : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pencairan

gelatin dan mempertahankan biakan baru.

5. Biakan agar tuang : menunjukkan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat pada

suspensi.

6. Biakan cairan : kegunaannya untuk menunjukkan biakan yang banyak dan cepat.

Kerugiannya adalah tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung

berbagai mikroorganisme (Dwidjoseputro, 1994).

Cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan biakan murni terdapat beberapa, yaitu :

Pengenceran : Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-

macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian

diambil sampel 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga

ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium

tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal

yang demikian ini kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini

kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal

yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan

koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).

Penuangan : Robert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan

mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini

kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer.

Dengan demikian diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu

mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang

masing – masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas,

maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).

Penggesekan : Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan

waktu, hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika

ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah

disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka

beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang

letaknya tersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu

koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo,

2005).

Single cell isolatiom : Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari

sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada

tangan – tangan suatu mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan

bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif

mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan

lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke medium encer dengan maksud

supaya bakteri tersebut berkembang biak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh

piaraan murni. Meode ini sangat memerlukan kesabaran, lagipula mikromanipulator

sangat mahal (Waluyo, 2005).

Inokulasi hewan : Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua

bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari

seseorang yang disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh

tikus putih, maka bakteri – bakteri _aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan,

sehingga kemudian kita peroleh semata – mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus

murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam

tubuh tikus yang sakit atau mati akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang

sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah

kulit ( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau

lain-lain tempat lagi (Waluyo, 2005).

Teknik Aseptik : Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme,

pertama kali kita harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi.

Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka

mudah lepas dalam udara dan permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan

medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap

dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk

tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya mediun kultur harus tetap steril.

Demikian materi yang lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya

(Cappuccino, 1983). Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga

kultur manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu

dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar

dengan pendamping mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah

karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas

mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak

terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu

medium ke medium yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus

disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur dibutuhkan

tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar, dimana pertumbuhan

suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal (Cappuccino,

1983).

Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu:

1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi

2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut

3. Medium pertumbuhan yang sesuai

4. Cara menginokulasi mikroba

5. Cara menginkubasi mikroba

6. Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai

dengan yang dimaksud

7. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni

Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba,

tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan deferensiasi

biakan yang didapatkan. Artinya penggunaan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai

pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, banyak dilakukan dan

dipergunakan. Sehingga tiap-tiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan

maksudnya (Baker, 1986).

Pengertian kultur murni

Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari

lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur

yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Biakan murni diperlukan

karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi

mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultur, morfologis, fisiologis, maupun serologis

memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroba saja (Waluyo, 2005).

Di dalam mengisolasi mikroorganisme digunakan berbagai cara, antara lain

dengan cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate) (Lim, 1998). Cara sebar

(spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (the

micromanipulator method). Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan

tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu

mengencerkan organisme sedemikian rupa sehinga individu spesies individu spesies dapat

dipisahkan dari lainnya (Hadioetomo, 1993).

\

BAB III

ALAT DAN BAHAN

III.I Alat

Peralatan utama yang dibutuhkan dalam proses pemurnian mikroba antara lain adalah :

a. Peralatan gelas, seperti tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, labu Erlenmeyer, gelas

beker.

b. Peralatan logam, seperti ose dan pinset

c. Kompor gas

III.II Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam proses pemurnian mikroba antara lain adalah :

a. Kultur mikroba

b. Media agar

c. Kertas sampul buku (coklat).

BAB IV

CARA KERJA

Adapun prosedur kerja pemurnian mikroba adalah sebagai berikut :

a. Siapkan sebuah cawan petri yang sudah disterilisasi. Buka bungkusnya.

b. Siapkan tabung reaksi dan masukkan ke dalamnya 1 ml air akuades.

c. Ambil kultur mikroba yang tumbuh pada media agar tegak, miring atau lempeng. Amati

dan tentukan mikroba mana yang akan dimurnikan.

d. Ambil ose yang ujungnya berbentuk bundar.

e. Hidupkan lampu Bunsen. Lakukan proses sterilisasi ose.

f. Ambil mikroba yang akan dimurnikan dengan menggunakan ose steril. Pengambilan

mikroba cukup dengan menyentuhkan ose ke mikroba yang akan dimurnikan.

g. Celupkan ose ke akuades yang terdapat pada tabung reaksi. Aduk beberapa kali agar

semua mikroba yang menempel pada ose menjadi terlepas.

h. Tuangkan secara aseptik seluruh cairan yang ada di tabung reaksi ke cawan petri.

Lakukan hal yang sama terhadap media agar yang telah disiapkan. Lakukan pengadukan

dengan cara menggerakkan cawan petri secara perlahan di atas permukaan meja

membentuk angka delapan.

i. Simpan cawan petri dalam incubator dan lakukan inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu

37oC.

j. Setelah diinkubasi, lakukan pengamatan terhadap mikroba yang tumbuh. Perhatikan

apakah mikroba yang tumbuh sudah murni atau belum.

BAB V

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengamatan

Pembahasan

Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni

ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

Ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk mengisolasi mikroba antara lain dengan

cara goresan (streak plate), cara tuang atau taburan (pour plate), cara pengenceran (dilution

method), serta micromanipulator.

Beberapa teknik ini memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Pada teknik

pengenceran, apabila kita hanya mengambil 1 ml, kemungkinan akan di dapat satu koloni saja,

tetapi apabila kita tidak yakin dengan koloni tersebut kita dapat melakukan pengenceran ulang.

Piaraan murni yang dihasilkan akan lebih terjamin apabila kita melakuka isolasi dengan

penuangan. Dimana metode ini yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang

sudah diencerkan dan sampel itu kemudian disebarkan di dalam suatu medium. Dulu digunakan

medium kaldu atau gelatin, sekarang digunakan dengan medium agar. Metode dengan

penggesekan, sekarang banyak digunakan karena hemat waktu, tetapi bakteri anaerob tidak dapat

tumbuh. Dengan metode micromanipulator, kita memerlukan kesabaran dalam pengerjaannya

selain itu harganya sangat mahal, tetapi dengan menggunakan alat micromanipulator ini kita

dapat dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain.

Pada praktikum kali ini, Setelah dilakukan pemilihan mikroba untuk dimurnikan dan di

inkubasi dalam incubator selama 2 x 24 jam, dilihat dengan bantuan kaca pembesar, maka di

dapatkan satu jenis mikroba yang sama, yang sebelumnya dipilih dari beberapa macam mikroba

pada satu sampel.

BAB VI

PENDALAMAN

a. Apa manfaat yang diperoleh dengan melakukan pemurnian mikroba?

Jawab

Manfaat dari pemurnian mikroba adalah kita akan mendapatkan satu jenis mikroba yang

kita pilih dan kita inginkan dari bermacam jenis mikroba dalam suatu komunitas

mikroba.

b. Mengapa pengambilan mikroba yang akan dimurnikan cukup dilakukan dengan

menyentuhkan ose ke permukaan populasi mikroba yang dan tidak disarankan

mencukilnya?

Jawab

Karena apabila kita menyentuh secara berlebih atau mencukil mikroba dari medianya,

ditakutkan akan terbawa lebih dari satu mikroba yang kita inginkan.

BAB VII

KESIMPULAN

Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni

ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut :

1. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari

lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.

2. Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah media Nutrient agar (NA)

3. Pemurnian dan isolasi mikroba penting dilakukan agar didapatkan kultur murni dan

sebagai stock mikroba, sehingga tidak perlu repot lagi ketika melakukan percobaan yang

menggunakan mikroba.

4. Didapatkan satu jenis mikroba setelah pemilihan dan pemurnian mikroba

DAFTAR PUSTAKA

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-

Wesley Publishing company: California

Baker Fj, Silverton RE, 1986. Microssopy and Microbiology. Saunder Collage Publishing,

London.

Buckle, K.A. 1987. Ilmu Pangan. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.

Budiarti, Lia Yulia. 2009. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Terintegrasi. Penerbit

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat,

Banjarbaru.