BAB I

PENDAHULUAN

1.1. TUJUAN

Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui analisis protein dengan menggunakan metode elektroforesa

1.2. TINJAUAN PUSTAKA

Elekroforesis merupakan teknik pemurnian suatu molekul dalam suatu campuran dibawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh setiap muatan dan massa. Elektroforesis melalui gel agrosa atau poliakriamid merupakan metode standar untuk , pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA. Selain elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya (Sudjadi, 2008) bioteknologi kesehatan. Penerbit kanisius, yogjakarta

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencega terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrikElektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu elektroda.

Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif.Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell.

Elektroforesis gel agarosa, agarosa yang disari merupakan polimer dengan struktur D-galaktosa dan 3,6 anhidro L-galaktosa. Gel agarosa memiliki daya pemisahan

lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrolamid, tetapi mempunyai rentang pemisahan yang lebih besar. DNA dari 200 basa sampai 50 kilobasa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap (Subadji,2008).

Elektroforesis poliakrilamid, akrilamid merupakan suatu monomer, yang jiak ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh ammonium persulfat dn distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerasi menjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi itu terdapat bisakrilamid, maka reaksi menjadi berkesinambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungannya silang. Panjang rantai ini ditentukan dengan konsentrasi poliakrilamid (3,5%-20%) dan satu molekul sambungan silang terjadi pada setiap 29 monomer akrilamid (

Gel poliakrilamid dibuat dengan menuangkan antar dua lempeng kaa yang dipisahkan oleh pembatas dengan ketebalan tetentu. Gel poliakrilamid dapat berukuran 5-50 cm tergantung keperluan dan cara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid memilki tiga keunggulan yaitu (1)kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa dalam jumlah 500 basa. (2) Dapat menampung jumlah sampel lebih bear daripada agarosa. (3) DNA diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi tikus (

Gambar 1. Pembentukan gel poliakrilamid. Jaringan tiga dimensi terbentuk kopolimerasi monomer tereksitasi dengan penghubung dari bis akrilamid

Berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu, protein dapat digolongkan menjadi dua golongan utama yaitu protein globular dan protein serabut. Pada protein globular, rantai polipeptida berlipat-lipat rapat membentuk globular atau bulat yang padat. Protein globular biasanya larut dalam system larutan (air) dan segera berifusi; hampir semua mempunyai fungsi gerak yang dinamik. Hampir semua enzim merupakan protein globular. Protein serabut bersifat tidak larut dalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu, dan tidak berlipat. Hampir semua protein serabut memiliki fungsi structural dan pelindung

Protein yang murni diperlukan untuk berbagai macam aplikasi dalam penelitian. Karena tidak stabil, khususnya protein globular, pemurnian dilakukan pada temperatur rendah (0-5 ° C) dan sangat hati-hati. Terdapat beberapa metoda pemurnian dan karakterisasi protein, yaitu pengendapan dengan menggunakan garam (salt precipitation), dialisis (dialysis), saringan gel (gel filtration),elektroforesis dengan menggunakan sodium dedocyl sulphat (SDS) (Koolman, 2005). Koolman, Jan, Roehm, Klaus-Heinrich, 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition, New York: Thieme

Protein dapat dipisahkan dengan menggunakan elektroforesis, berdasarkan tanda dan jumlah muatan listrik pada gugus R dan gugus terminal amino dan terminal karboksil yang bermuatan. Rantai polipeptida protein memiliki titik isoelektrik yang khas, yang akan mencerminkan jumlah relatif gugus R asam dan basa. Pada setiap pH tertentu, suatu campuran protein akan mengandung beberapa gugus yang bermuatan total negatif, beberapa yang bermuatan total positif, dan beberapa yang tidak bermuatan. Jika campuran ini ditempatkan di dalam medan listrik, protein bermuatan positif akan bermigrasi menuju elektroda bermuatan negatif, dan protein yang bermuatan total negatif akan bermigrasi menuju elekroda bermuatan positif. Sedangkan yang tidak bermuatan akan tinggal diam. Selain itu, protein dengan bobot molekul yang lebih besar akan bergerak dengan lebih cepat dibandingkan dengan protein dengan bobot molekul yang lebih rendah (Mickelson, 2004). Mickelson, R., Eduardo Corto´n, 2004. BIOANALYTICAL CHEMISTRY, Hoboken, New Jersey : John Wiley & Sons, Inc.

1.3. TINJAUAN BAHAN1.3.1.