BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan

rancangan true experimental-post test only control group design yang bertujuan

untuk mengetahui efek susu kedelai yang mengandung isoflavon terhadap

peningkatan apoptosis sel epitel pada struktur histopatologi vesika seminalis

tikus putih jantan strain wistar yang diberikan dari usia 6 minggu hingga 4,5

bulan .

4.2 Populasi dan Sampel Penelitian

4.2.1 Populasi

Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan strain Wistar yang

memenuhi kriteria sehat, dimana kondisi tikus yang aktif dan agresif dengan

umur yang sama satu bulan dan berat sekitar 100 gram, setiap tikus diberi

tempat yang cukup untuk menghindari kematian maupun sakit.

4.2.2 Sampel

Tikus strain Wistar dibagi menjadi empat grup. Dengan satu sebagai

kontrol negatif dan ketiga lainnya diberi susu kedelai dengan dosis yang berbeda

4.2.3 Perkiraan Banyak Sampel

Total banyak sampel yang dipakai dihitung dengan rumus:

(t-1) (n-1) ≥ 15

dimana, t = banyaknya intervensi, dan n = banyaknya sampel yang

dipakai. Eksperimen ini memiliki empat grup, jadi sampel yang diperlukan

berjumlah dua puluh empat. Berarti setiap grupnya memerlukan sedikitnya enam

tikus.

25

26

4.2.4 Karakteristik Sampel

Karakteristik sampel berupa tikus (wistar rats), kelamin jantan, berumur

satu bulan, berat tubuh 100 gram, sehat dengan indikasi bergerak aktif, bulu

bersih dan mata jernih, belum mendapatkan obat-obatan.

4.3 Identifikasi Variabel

4.3.1 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada studi ini adalah histopatologi vesika seminalis

tikus Wistar yang diberi diet susu kedelai.

4.3.2 Variabel Bebas

Variabel bebas pada peneltian ini adalah susu kedelai dengan berbagai

konsentrasi/dosis

.

4.4 Lokasi Dan Waktu Penelitian

4.4.1 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dikerjakan di laboratorium Farmakologi Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya.

4.4.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2013 sampai Januari 2014.

4.5 Alat dan Bahan

4.5.1 Susu Kedelai

Alat yang dibutuhkan membuat susu kedelai yaitu alat timbangan,

tabung erlenmeyer, corong, dan batang pengaduk. Dan bahan yang dibutuhkan

yaitu bubuk susu kedelai, dan air aquades. Pemberian susu kedelai

menggunakan alat sonde.

27

4.5.2 Persiapan Diet Normal

Alat yang dibutuhkan yaitu alat timbangan, analytic weights

measurement device, wadah/tempat makanan. Bahan yang dibutuhkan yaitu

tepung terigu, dedak jagung, dan air secukupnya. Kemudian kita takar sesuai

petunjuk perbandingan antara terigu, dedak jagung dan air secukupnya.

4.5.3 Pembedahan dan Persiapan Slide Histopatologis

Alat yang dibutuhkan yaitu wadah plastik dengan penutupnya, pisau

operasi, kapas, gunting, pinset, mikroskop, mikrotom, dan kamera. Dan bahan

yang diperlukan yaitu kloroform, balok parafin, formalin 10%.

4.5.4 Pemeliharaan Tikus

Alat pengukur berat Sartorius, kandang tikus, penutup kandang,

sekam/serbuk kayu, botol minuman.

4.6 Definisi Operational

1. Fitoestrogen merupakan substansi dari tumbuhan yang memiliki sifat

mimikri estrogen.

2. Susu kedelai yang digunakan pada pada penelitian ini adalah susu

kedelai bubuk.

3. Ciri – ciri gambaran histopatologi sel yang mengalami apoptosis

adalah warna sel lebih gelap, ukuran sel lebih kecil/mengkerut, dapat

juga sel tersebut yang warnanya lebih gelap dan mengkerut di

selubungi oleh vakuola dan sel mengalami perubahan struktur dengan

posisi terpisah-pisah

28

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Persiapan Susu Kedelai

Susu kedelai dibuat dengan menggunakan mencampur susu kedelai

bubuk dengan air secukupnya. Perbandingan antara susu kedelai dan air yaitu 1

gram berbanding 2 ml air aquades.

4.7.2 Persiapan Tikus Wistar

Selama proses adaptasi, semua kelompok tikus diberi diet normal.

Masing-masing tikus mendapatkan 40 gram dari campuran bahan dedak jagung

dan dan diberikan secara ad libitum. Semua tikus mendapatkan sinar matahari

yang cukup selama 12 jam dan berada pada kegelapan selama 12 jam. Mereka

dipertahankan dalam kondisi ini pada laboratorium selama 7 hari sebelum

percobaan dilakukan.

4.7.3 Pemberian Susu Kedelai

Pemberian susu kedelai dilakukan per oral. 3 dosis berbeda diberikan

kepada 3 kelompok tikus. Awalnya tikus akan diberi diet standar sehingga

beratnya bertambah, selama masa adaptasi yang dilakukan selama satu minggu.

Kemudian pengambilan sampel akan dilakukan dengan teknik randomisasi,

sehingga setiap tikus akan mempunyai kesempatan yang sama dalam

mendapatkan dosis susu kedelai. Setelah itu, tikus akan dibagi menjadi 4

kelompok.

Kelompok 1 – Akan diberikan diet normal.

Kelompok 2 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 7,1

mg/kgBB.

Kelompok 3 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 14,2

mg/kgBB.

29

Kelompok 4 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 21,3

mg/kgBB.

4.7.4 Pembedahan Tikus Wistar

Prosedur ini dikerjakan dengan bantuan dari analis lab. Farmakologi.

Tikus yang akan dibedah diberikan anestesi terlebih dahulu dengan

menggunakan eter. Pemberian eter dilakukan secara inhalasi pada tangki

tertutup. Tikus yang telah di anastesi kemudian ditempatkan pada meja bedah

dan di fiksasi. Sebelum pembedahan, dilakukan pemeriksaan bagian luar terlebih

dahulu. Pada pemeriksaan sampel darah tikus, sampel darah diambil dari bilik

jantung dengan menggunakan spuit 5cc. Pengambilan sampel darah ini

diperlukan pembedahan pada bagian thorax. Tulang rusuk tikus dipotong dari

bagian lateral dengan sedikit mengangkat ke atas dengan gunting bedah supaya

tidak merusak organ internal dari thorax. Jantung terletak di antara paru-paru

kanan dan kiri. Sampel darah diambil pada bilik jantung sebanyak 5cc dengan

menggunakan spuit. Kemudian spuit diberi label dan siap untuk dikirim ke

laboratorium. Setelah itu kita mengidentifikasi bagian vesika seminalis. Vesika

seminalis kemudian di insisi secara hati-hati hingga terlihat testis. Kemudian

bagian vesika seminalis diambil dan dipisahkan dengan prostat dan vas deferen.

Setelah itu berat vesika seminalis dihitung dan disimpan pada tabung yang berisi

formalin 10%. Vas deferen dipisahkan secara hati-hati dari testis dan prostat

dengan menggunakan pinset dan gunting bedah. Setelah itu dimasukkan pada

tabung yang berisi formalin 10%. Prosedur pembedahan ini memberikan rasa

yang tidak nyaman pada tikus, oleh karena itu prosedur ini dilakukan di bawah

pengaruh anestesi.

4.7.5 Persiapan Slide Histopatologi Tikus

Vesika seminalis diambil melalui pembedahan kemudian difiksasi dengan

merendam jaringan vesika seminalis tikus dalam formalin 10% selama sehari

30

semalam (24 jam) kemudian dilanjutkan dengan tahap pencucian menggunakan

air minimal 1,5 jam. Jaringan dimasukkan dalam alkohol 70% selama 1 jam,

alkohol 80% selama 1 jam, alkohol 99 % selama 1 jam dan alkohol absolut

selama 2x1 jam lalu dalam campuran xylol : alkohol absolut = 1:1 selama 0,5

jam, dan xylol PA selama 2x30 menit. Jaringan dipotong setipis mungkin dan

dimasukkan ke dalam melted paraffin : xylen = 1:1 sekana 1 jam, paraffin (54-58)

selama 2x1 jam. Kemudian dipotong dengan ketebalan 6μm. Hasil pemotongan

diletakkan di gelas objek dilapisi dengan lapisan putih telur : gliserol = 1:1 . Gelas

objek diletakkan di atas steamer hangat (agar pita mengembang dan lurus tanpa

lekukan) kemudian dibiarkan kering dan sediaan melekat erat (1 hari). Jaringan

yang berada di gelas objek dimasukkan ke dalam xylol selama 3x5 menit. Lalu

dikeringkan. Hasil diamati pada mikroskop untuk mengetahui progresivitas

kelainan vesika seminalis.

4.7.6 Penilaian Slide Histopatologis Vesika Seminalis

Slide histopatologis diamati menggunakan miksroskop cahaya dengan

pembesaran 400x. Setiap slide histopatologis diamati sebanyak 10 lapang

pandang yang kemudian dinilai menggunakan menghitung secara manual sel

nukleus pada epitel yang normal dan sel yang apoptosis yang terdapat pada

slide. Dan setelah di hitung semua ( 10 lapang pandang per tikus dalam setiap

kandang ) kemudian data di masukan dan di bedakan antara jumlah sel nukleus

yang normal dan sel nukleus yang mengalami apoptosis. Setelah itu langsung

memulai perhitungan analisis data.

4.8 Pengolahan Dan Analisis Data

Spesimen dibuat dalam bentuk sediaan preparat histo – PA dari vesica

seminalis, yang dilakukan pengecatan HE, dan dilakukan pemeriksaan

abnormalitas kelenjar vesika seminalis, sel Leydig, germ cell dan sperma. Data

31

yang didapatkan pada penelitian akan dianalisis dengan berbagai cara. Pertama,

tes homogenitas varian dilakukan untuk mengetahui apakah data ini homogen

atau tidak. Kedua, untuk mengetahui perbedaan di setiap intervensi, dilakukan

tes one way ANOVA digunakan dengan menggunakan software SPSS

(Statistical Product and Service Solution). Dalam hubungannya dengan ANOVA,

post-hoc analysis (Turkey’s range test) dilakukan untuk melihat perbandingan

dari setiap intervensi. Langkah ketiga menggunakan uji korelasi untuk

mengetahui apakah ada kekuatan yang signifikan dari hubungan antara

peningkatan konsentrasi dari susu kedelai dengan kondisi abnormalitas

histopatologi vesika seminalis dan sperma pada tikus Wistar. Dan yang terakhir

simple linear regression dihitung untuk memprediksi nilai variabel tergantung dari

variabel bebas. Selain itu, pengujian hipotesis dilakukan dengan cara mencari

nilai confidence level dan p value.

32

4.9 Alur Penelitian

Random Sampling

Kelompok 2

Diet Normal + Susu

Kedelai 7,1 mg/kgBB/ha

ri

Kelompok 4

Diet Normal + Susu Kedelai

21,3 mg/kgBB/hari

Kelompok 3

Diet Normal + Susu

Kedelai 14,2 mg/kgBB/har

i

Kelompok 1

Diet Normal

Observasi setelah 3 bulan

Histopatologi Vesika Seminalis

Analisis data

24 Tikus Wistar

Dissection Vesika seminalis

Pembedahan

Apoptosis Sel Epitel