BAB III ISI

Sebagian besar penelitian mengenai protein apoptin, dalam pemisahan atau purifikasi apoptinnya

menggunakan metode immunoprecipitation. Selain itu, metode yang digunakan adalah affinity

chromatography dan knockdown. Berikut akan dijelaskan menganai ketiga metode tersebut

berdasarkan prinsip atau teori yang telah ada. Selanjutnya, masing-masing metode akan dijelaskan

protokol dan bahan yang digunakan pada aplikasi dalam penelitian-penelitian yang telah dilakukan.

Immunopresipitation

Sebagai gambaran prinsip dari immunopresipitation, berikut merupakan ilustrasi yang akan

dijelaskan. Misalkan ada campuran protein, protein a dan b. Immunoprecipitation menggunakan

antibody melawan protein a. Maka akan didapatkan protein b, yang kemudian di analisis

menggunakan gel elektroporesis.

Protein a dan b akan bereaksi membentuk komlplek protein dan ditambahkan antibody yang melawan

protein a. Kemudian menambahkan protein A atau protein G sepharose untuk menangkap semua

kompleks (protein a+protein b+antibody). Kemudian, menghilangkan impuriti dengan larutan.

Kemudian mengelusi interaksi komplek, ikatan protein a dan protein b. Menganalisis protein yang

telah terelusi menggunakan gel elektroporesis. Protein b dideteksi dengan analisis western blot.

Penjelasan diatas meerupakan proses immunopresipitation secara sederhana. Pada penelitian, prinsip

pemisahan tersebut biasanya dilakukan dengan tahap-tahap yang umum seperti:

1. Melisis cell yang didalamnya mengandung protein yang akan dipisahkan menggunakan buffer

2. Men-sentrifuge lysate dan memisahkan supernatant

3. Mengambil supernatant yang kemudian ditambah dengan antibody

4. Melakukan immunopresipitation

Immunopresipitation dilakukan dengan mereaksikan protein yang kita inginkan dengan

protein lain, kemudian menambahkan antibody, menambahkan protein A/G dengan

segharose, membasuh dengan buffer lain.

5. Setelah di-immunopresipitation, kemudian dilakukan SDS-PAGE

6. Analisis terkahir menggunakan western blot

Ada lima jenis immunoprecipitation yaitu: Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein

complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (Chip), RNA

immunoprecipitation (RIP), dan Tagged protein. Pada makalah ini, penulis hanya akan menjelaskan

tiga diantaranya yaitu IP, Co-IP dan Tagged protein.

Individual protein immunoprecipitation (IP) secara tradisional mengisolasi protein tunggal.

Menggunakan satu antibody yang spesifik terhadap satu protein yang telah diketahui. IP dilakukan

untuk memisahkan protein dari sel yang telah dilisis (cell lysate) sehingga dapat diketahui identitas,

struktur, ekspresi, aktivitas atau modifikasi dari sebuah protein. IP juga digunakan untuk mempelajari

interaksi protein yang diinginkan dengan protein lain atau asam nukleat.

Co-immunoprecipitation (Co-IP), cara kerja dari metode ini hampir sama dengan IP, namun protein

yang terpisahkan adalah protein kompleks. Pada sebuah larutan yang terdapat protein yang ingin kita

pisahkan, kedalamnya kita beri antibody yang mengenali salah satu protein yang telah diketahui.

Protein tersebut merupakan protein yang berikatan dengan protein-protein lain pada suatu kompleks

protein. Ketika sebuah antibody mengenali salah satu dari protein tersebut, maka atibody akan

menarik semua protein kompleks sehingga protein-protein yang belum diketahui yang terikat bersama

protein yang dikenali antibody juga akan ikut tertarik dan terpisah.

Hal diatas akan dapat terjadi jika protein kompleks saling berikatan dengan kuat. Co-IP ini selain

digunakan untuk pemisahan protein juga digunakan untuk mempelajari interaksi protein dengan

protein.

Pada gambar 1. Larutan berisi protein kompleks dan protein-protein lain atau molekul-molekul lain

sebagai kontaminan. Kemudian ditambahkan antibody yang mengenali salah satu protein (warna biru

muda) dalam protein kompleks. Larutan selanjutnya ditambahkan protein A atau G atau dapat pula

berupa magnetic beads yang ukuran molekulnya lebih besar untuk menangkap antibody beserta

protein kompleks sehingga terbawa ke bawah ketika dilakukan sentrifugasi (presipitasi). Setelah

terendap, endapan yang ternyata merupakan campuran protein yang diinginkan diambil dan kemudian

dianalisis dengan SDS-PAGE dan western blot.

Gambar 1.Proses Co-IP dalam campuran yang mngandung protein yang diinginkanSumber: www.leinco.com/immunoprecipitation

Tagged Protein digunakan jika antibody untuk mengikat protein yang ingin dipisahkan tidak tersedia.

Para enggineer membuat tag untuk digunakan sebagai umpan yang digunakan untuk menggantikan

fungsi dari antibody. Tag-ta ini akan mengikat protein yang diingikan pada C-terminal dan N-

terminal. Keuntungan menggunakan tag adalah dapat diguakan pada banyak jenis protein dan dapat

digunakan bersama antibody untuk menambah afinitas pengikatan protein. Namun, kekurangannya

adalah harga dari tag yang digunakan biasanya lebih mahal daripada menggunakan antibody hasil

ekspressi makhluk hidup.

Tag-tag tersebut dapat berupa sekuens pendek peptida atau protein fluorescent, seperti:

Flag; peptide sequence DYKDDDDK

c-Myc; peptide seqence EQKLISEEDL

Hemagglutinin (HA); peptide sequence YPYDVPDYA

Green fluorescent protein (GFP)

Glutathione-S-transferase (GST)

Poly-His

V5

Beberapa tag tersebut dapat membantu kelarutan protein.

Berdasarkan survey yang diakukan oleh Labome, dari 1957, 271 diantaranya menggunakan tag

sebagai metode purifikasi dan pendeteksian protein. Berikut penggunakan tag pada penelitian yang

telah dipublikasikan:

Tabel 1. Penggunaan tag dalam penilitian protein yang telah dipublikasikan

tag numFLAG 88GFP 60GST 60HA 43HIS 41C-Myc 69V5 20

Pada tabel hasil survei ditunjukkan bahwa FLAG tag paling banyak digunakan. Anaslisis penulis

terkait hasil tersebut adalah dikarenakan FLAG tag memiliki kelebihan dari tag yang lain seperti lebih

hidrofilik sehingga tidak mengakibatkan denaturasi protein atau mengakibatkan protein tidak aktif.

Jika pada tag lain antibody monoklonal harus diisolasi terlebih dahulu terhadap protein yang ada

kemudian epitope (peptida protein) dikarakterisasi untuk digunakan sebagai tag, pada FLAG tag,

FLAG didesain terlebih dahulu sehingga antibody monoklonal akan dikenali. Selain itu alasan lain

mengapa FLAG tag paling digunakan adalah karena tag ini merupaan tag pertama kali yang telah

dipatenkan dan lebih dulu dikomersialkan dari pada tag-tag yang lain.

Terlepas dari alasan-alasan itu, penggunaan tag juga dipengaruhi oleh protein yang akan kita

pisahkan, keadaan larutan dan sel yang digunakan serta biaya yang akan dikeluarkan.

Metode Immunoprecipitation Langsung dan tidak langsung

Immunoprecipiation yang dilakukan secara langsung adalah ketika antibody yang digunakan

telah dipasangkan dengan beads (substrat berbentuk padat). Kemudian, campuran protein

yang akan dipisahkan ditambahkan ke beads tersebut sehingga protein yang diinginkan akan

tertangkap oleh antibody. Immunoprecipitation secara tidak langsung dilakukan dengan

menambahkan antibody ke campuran protein. Antibody akan mengikat protein yang sesuai

seiring berjalannya waktu. Kemudian kedalam campuran, ditambahkan protein A/G . Protein

A/G adalah protein gabungan (fusion proteins) dari IgG dari protein A dan protein G, dari

gabungan ini terbentuk protein yang berukuran 50,4 kilo dalton. Dengan adanya protin A/G

yang mengikat antibody dan protein yang dinginkan akan menjadikan bentukan yang besar

sehingga dapat menuju ke beads dan tertempel.

Kedua metode tersebut sebenarnya sama disisi bahan-bahan yang digunakan dan hasil akhir

yang didapat. Namun metode secara tidak langsunglebih dipilih ketika konsentrasi protein

target rendah dan afinitas antibody yang digunakan lemah. Selain dua alasan tersebut,

kinetika pengikatan yang lambat juga menyebabkan metode tidak langsung lebih dipilih.

Batch dan Kolom

Pada metode Batch, campuran protein yang biasanya berupa buffer yang didalamnya telah

diberi sel lysate dan antibody pengikat protein target, dicampur cemua dalam tabung reaksi

(biasanya tabung sentrifuge). Setelah didiamkan beberapa waktu agar terjadi pengikatan

antara antibody dengan protein, campuran disentrifuge. Komponen yang menjadi kontaminan

yang biasanya berada di fase atas, secara perlahan dipisahkan dengan mengambilnya secara

manual dengan pipet.

Pada metode Kolom, resin beads disusun pada kolom plastik atau kaca. Campuran dialirkan

ke dalam kolom dan diinkubasi beberapa waktu sehingga antibody dapat bereaksi dengan

protein. Campuran akan terpisah akibat gaya grafitasi (jika menggunanakan gravity flow) atau

pengendapan (jika menggunakan sentrifugasi).

Pemilihan metode ini didasarkan pada banyak sedikitnya larutan yang akan dipisahkan. Pada

skala yang besar, metode yang dipilih adalah menggunakan kolom. Penggunaan metode batch

masih dapat dilakukan untuk pemisahan skala besar, tetapi perlu pegulangan pekerjaan

sehinga memakan waktu. Selain itu, pemisahan supernatant yang dilakukan secara manula

terkadang tidak akurat sehingga kontaminant masih ikut terbawa sehingga yield yang didapat

tidak maksimal.

Tabung microsentrifuge untuk metode batchSumber: http://www.extragene-web.com

Kolom yang digunakan dalam ImmunoprecipitationSumber: http://www.activemotif.com/catalog/19.html

Material yang terlibat

Buffer

Buffer yang digunakan dalam immunoprecipitation ada tiga jenis. Masing-masing buffer ini

memiliki fungsi yang berbeda.

a. Lysis Buffer

Merupakan larutan yang digunakan untuk melisis sel. Lysis buffer untuk

immunoprecipitation berbeda dengan lysis buffer untuk perlakuan separasi dengan

metode lain atau percobaan lainnya. Hal tersebut dikarenakan lysate dari sel yang

dibutuhkan akan berbeda hasilnya bergantung dengan buffer yang digunakan. Larutan ini

juga akan mempengaruhi kualitas dari sel lysate seperti konformasi bentuk natif protein, ,

kemampuan menginhibisi aktivitas enzimatik, sisi ikat antibody, denaturasi dan

kemampuan protein keluar dari jaringan sel. Komposisi lysis buffer akan berbeda sesuai

dengan protein yang akan kita pisahkan menggunakan immunoprecipitation. Hal ini

disebabkan oleh lokasi dari protein di dalam sel,seperti di membran, sitosol atau nukleus,

yang menyebabkan kemudahan protein terambil ketika terjadinya lysis.

Buffer yang tidak mendenaturasi (non-denaturing buffer) digunakan ketika antigen

yang digunakan berupa detergent yang larut dan antibody dapat mengebali bentuk

native. Buffer ini mengandung detergent non-ionik seperti NP-40 atau Triton X-100.

Buffer yang mendenaturasi (denaturing buffer) digunakan ketika protein yang akan

kita pisahkan sulit untuk diambil dari jaringan sel dan antibody tidak dapat mengenali

protein dalam bentuk asli atau natifnya. Oleh karena itu perlu larutan untuk mengubah

bentuk protein atau dengan kata lain mendenaturasi. Contoh buffer ini adalah

Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA). Buffer ini lebih keras dibandingkan dengan

buffer non-denaturinng karena mengandung detergen ionik seperti SDS atau sodium

deoxycholate. Buffer ini juga dapat merilis protein nuclear (protein yang berasal dari

inti sel). Biasanya buffer iniberupa NaCl dan Tris-HCl dan memiliki pH (7.4 to 8).

Selain itu buffer ini bisa hanya terdiri dari EDTA dalam phosphate buffered saline

(PBS). Berikut merupakan tabel mengenai kisaran komposisi dari masing-masing

komponen untuk mendapatkan buffer yang optimal untuk melisis sel yang akan

digunakan untuk immunoprecipitation.

Tabel 2. Komponen masing-masing

Komponen Kisaran komposisiDetergen non-ionik (NP-40, Triton X-100) 0.1 - 2% Detergen Ionik (SDS, sodium deoxycholate) 0,01- 0,5 %NaCl (sodium chloride, garam) 0 - 1MKation divalent 0 - 10mMpH 6 - 9EDTA 0 - 5mM

Sel lysate mengandung protease dan fosfat yang dapat mengubah atau mendegradasi

protein yanng kita inginkan. Oleh karena itu, immunoprecipitation banyak dilakukan pada

suhu 4oCdan ditambahkan inhibitor protease dan fosfat PMSF, aprotinin and leupeptin

sodium orthovanadate atau sodium fluoride.

Gambar. Lysis buffer untuk immunoprecipitation

Sumber: http://www.piercenet.com/product/pierce-ip-lysis-buffer

b. Buffer pengikat dan pencuci (binding and wash buffer)

Binding buffer digunakan untuk menstabilkan keadaan dimana antibody dan protein yang

akan diikat melakukan interaksi hingga terjadinya pengikatan. Interaksi antibody-antigen

akan terjadi ketika pH mendekati netral. Buffer yang mengandung kekuatan ion standart

seperti PBS dapat mempermudah pengikatan antara antibody dan protein.

Setelah terjadi pengikatan, seiring waktu berjalan, pengendapan pada

immunoprecipitation masih tetap berlanjut. Komponen yang tidak diinginkan dan ikut

mengendaptersebut harus segera dihilangkan. Penghilangan tersebut dilakukan dengan

pemberian buffer seperti dapat dengan PBS itu sendiri atau dengan detergen dengan

konsentrasi rendah atau dengan garam dengan konsentrasi moderat.

c. Buffer pengelusi

Pada prinsipnya, buffer pengelusi ini mendisosiasi interaksi protein-protein atau antibody-

antigen agar dapat terelusi. Buffer ini membantu sisa protein yang tertinggal dalam wadah

(kolom atau tabung microsentrifuge) sehingga dapat terelusi secara sempurna. Selain itu,

bahan kimia yang terdapat dalam buffer ini juga dapat mengatur pH larutan sehingga pH

tetap pada range yang diiginkan sehingga struktur molekul yang kita perlukan tidak rusak.

Buffer pengelusi yang paling banyak digunakan untuk pemurnian protein menggunakan

prinsip interaksi antibody-antigen adalah 0.1 M glycine•HCl dengan pH 2.5-3.0. Namun,

beberapa antibody dan protein akan rusak pada pH rendah, sehingga sangat dianjurkan

untuk menetralisir larutan dengan 1/10th volume buffer alkali seperti 1 M Tris•HC pada

pH 8.5.

Tabel... Macam-macam buffer pengelusi (elution buffer) untuk purifikasi protein

menggunakan immunoaffinity

Agarose Beads

Resin yang lazim digunakan dalam immunopprecipitation. Bentuk dari beads ini adalah

seperti spons. Berukuran 20-150 µm. Karena ukurannya yang menjadikannya memiliki

permukaan yang luas dan terdapatnya poros, mengakibatkan beads ini memiliki kapasitas

pengikatan terhadap antibody lebih besar. Kelebihannya adalah tahan lama dan kuat sehingga

dapat tahan terhadap sentrfugasi hingga 5000 x g. Tidak rusak pada tekanan 100 psi, suhu

120 oC dan pH larutan yang ekstrim.

Gambar Bead AgaroseSumber: http://course1.winona.edu/sberg

Superparamagnetic Beads

Tidak seperti agarose, beads ini memiliki bentuk bulat padat (tidak berporos) dan ukurannya

lebih kecil (1-4 µm). Maka dari itu kapasitas penempelan antibody lebih kecil. Diperlukan

rasio yang tepat antara volume larutan yang isinya ingin dipisahkan dengan volume beads ini.

Pada aplikasinya, penggunaan beads ini digunakan pula magnet berkekuatan tinggi sehingga

dapat menarik magnetic beads ini ke sisi yang diinginkan. Maka dari itu, dalam

penggunaannya tidak diperlukan sentrifugasi yang dapat merusak komponen. Pemisahannya

pun lebih efisien. Namun, karena diperlukan peralatan yang lebih canggih, percobaan tidak

terlalu sering menggunakan alternatif ini dikarenakan keterbatasan biaya.

Gambar Superparamagnetic (PVA) BeadsSumber: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pola.v46:1/issuetoc

Antibody

Antibody Sekunder

Strategi Optimasi Complex binding

High Background from Nonspecific Interactions Antibody Contamination

Contoh AplikasiDari jurnal: 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.

Affinity Chromatography