34

BAB IIIBAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan pre test dan post test. Penelitian ini dinilai dengan cara observasi pada pengaruh pemberian berbagai macam dosis ekstrak etanol kulit semangka terhadap penurunan kadar glukosa darah tikus putih jantan galur wistar yang diinduksi aloksan. Penelitian ini dilakukan dengan cara membandingkan hasil pemeriksaan kadar glukosa darah tikus saat sebelum dan setelah perlakuan.

3.2Objek Penelitian

Pada penelitian ini objek penelitian yang digunakan adalah tikus putih jantan galur wistar. Kriteria inklusi pada penelitian ini yaitu tikus putih jantan galur wistar, usia 2-3 bulan, berat badan 150-300 gr, sehat dengan gerak aktif, tikus dengan kadar glukosa darah puasanya lebih dari 126 mg/dl. kriteria eksklusi yaitu tikus yang mengalami cacat fisik, sakit seperti adanya luka dan mati selama dilakukan adaptasi dan masa perlakuan.3.3Jumlah Sampel

Jumlah sampel dihitung dengan menggunakan rumus Frederer, dengan perhitungan sebagai berikut:

Keterangan:

(r-1) (t-1) 15

r = jumlah sampel

t = jumlah perlakuan

pada penelitian ini diperlukan 11 kelompok hewan percobaan, dengan jumlah hewan pada masing-masing kelompok perlakuan minimal 3 ekor tikus dan menambahkan 1 ekor tikus untuk menghindari hewan yang masuk ke dalam kriteria eksklusi. Sehingga jumlah dalam 1 kelompok percobaan adalah 4 ekor dan total keseluruhan hewan yang digunakan yaitu sebanyak 44 ekor tikus.3.4Variabel Penelitian

Variabel-variabel dalam penelitian ini terdiri dari 2 kelompok variabel, yaitu:

1. Variabel dependent: Kadar glukosa darah tikus

2. Variabel independent: Dosis ekstrak etanol kulit semangka3.5Definisi Operasional

Terdapat beberapa definisi didalam penelitian ini, yaitu:

1. Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang diperoleh dari laboratorium hayati ITB, tikus dalam keadaan sehat, aktif bergerak dengan usia 2-3 bulan dan berat badan 150-300 gram.

2. Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit semangka buah kuning yang diekstraksi menggunakan etanol yang didapatkan dari laboratorium ilmu hayati ITB.

3. Dosis ekstrak etanol kulit semangka yang diberikan pada penelitian ini yaitu 62,5; 93,75; 125; 187,5; 250; 500; 750 dan 1000 mg/kgBB yang diberikan secara peroral.

4. Aloksan merupakan devirat pirimidin yang dapat merusak sel pankreas, diberikan secara subkutan sehingga dapat menurunkan sekresi insulin dan menyebabkan tikus menderita hiperglikemia pada penelitan ini. 5. Tikus hipeglikemia merupakan tikus yang memiliki kadar glukosa darah puasa 126 mg/dl.

6. Pengambilan darah puasa tikus diambil dari supraorbita dengan sebelumnya dipuasakan selama 8 jam dan diukur dengan menggunakan glukosa meter untuk mengetahui kadar glukosa darah tikus.

7. Dosis minimal adalah dosis terendah yang mulai menimbulkan efek.

8. Dosis optimal adalah dosis terendah yang memberikan efek terbesar.

9. Kelompok kontrol negatif adalah kelompok yang hanya diberikan makanan berupa pelet dan minum air putih.10. Kelompok kontrol positif adalah kelompok yang diberikan makanan pelet, minuman air putih, dan diinduksi aloksan sehingga tikus dalam keadaan hiperglikemia dan tidak diberikan perlakuan apapun dengan tujuan menurunkan kadar glukosa darah atau mengobati, kelompok ini digunakan sebagai pembanding untuk mengetahui ada atau tidaknya penurunan glukosa darah pada kelompok perlakuan.11. Kelompok perlakuan adalah kelompok yang diberikan makanan pelet, minuman air putih, diinduksi aloksan dan diberikan ekstrak etanol kulit semangka dengan berbagai dosis secara peroral.12. Kelompok pembanding adalah kelompok yang diberikan makanan pelet, minuman air putih, diinduksi aloksan dan diberikan glibenklamid dengan dosis 0.09 mg/ 200gBB tikus secara peroral, kelompok ini digunakan sebagai pembanding dari kelompok perlakuan yang dapat menurunkan kadar glukosa darah, sehingga dapat ditentukan efektifitas ekstrak etanol kulit semangka kuning dibandingkan dengan glibenklamid.

3.6Prosedur Penelitian3.6.1Persiapan Hewan Percobaan

Tikus diadaptasikan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Achmad Yani selama 1 minggu, diberi makanan pelet dan minuman air putih. Setelah 1 minggu tikus yang masuk kriteria eksklusi disingkirkan.3.6.2Pembuatan Ekstrak Kulit Semangka

Kulit semangka dioven dan dihaluskan menggunakan alat penghancur, lalu dimasukkan ke dalam maserator yang telah diberi kapas alasnya, didiamkan selama 24 jam, kemudian dikeluarkan dari outlet dibawah maserator apabila masih ada serbuk yang terbawa saring menggunakan kerta saring, larutan ini disebut ekstrak encer. Lalu ditambahkan pelarut baru ke dalam ampas yang ada didalam maserator begitu seterusnya sampai pelarut yang keluar dari outlet maserator tidak berwarna lagi. Pekatkan ekstrak encer yang didapat menggunakan alat rotary evaporator sampai pekat atau sampai tidak ada lagi pelarut yang menetes dikondensor rotary evaporator.3.6.3Penentuan Dosis Ekstrak Etanol Kulit Semangka dan Aloksan

Dosis ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah 62.5, 93.75, 125, 187.5, 250, 500, 750 dan 1000 mg/kgBB. Dosis ini didapatkan dari hasil uji penelitian pendahuluan dan bersumber dari penelitian sebelumnya dan ditambah dosis titrasi. Dosis aloksan yang digunakan 125 mg/kgBB, dosis aloksan ini diambil dari uji pendahuluan dan dari referensi yang menyatakan bahwa penggunaan aloksan yang diberikan secara subkutan dapat memberikan hasil meningkatnya kadar gula darah dengan dosis 120-150 mg/kgBB.273.6.4Penentuan Dosis Glibenklamid

Dosis glibenklamid ditentukan dengan konversi dosis lazim pada manusia ke tikus dengan dosis 0,09 mg/ 200grBB.3.6.5Perlakuan Hewan Coba

Setelah dilakukan pengadaptasian selama 7 hari lalu pada hari ke 8 tikus dipuasakan selama 8 jam dan diambil darah sebanyak 1-2 tetes melalui intraorbita dan diukur kadar gula darahnya dengan menggunakan glukosa meter. Lalu kadar glukosa darah tikus ditingkatkan dengan induksi aloksan dengan dosis 125 mg/kgBB, setelah 3 hari dilakukan pengukuran kadar glukosa darah ulang, jika hasil kadar glukosa darah puasa meningkat > 126 mg/dl maka mulai diberikan ekstrak kulit semangka dan glibenklamid secara oral satu kali sehari selama 8 hariMasing-masing kelompok diberi perlakuan sebagai berikut:

1. Kelompok 1 : kelompok kontrol negatif diberikan makanan pelet dan minuman air putih.

2. Kelompok 2 : kelompok kontrol positif diberikan makanan pelet, minum air putih dan diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB

3. Kelompok 3 :diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 62,5 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

4. Kelompok 4 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 93,75 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

5. Kelompok 5 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 125 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

6. Kelompok 6 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 187,5 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

7. Kelompok 7 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 250 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

8. Kelompok 8 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 500 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

9. Kelompok 9 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 750 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

10. Kelompok 10 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan ekstrak etanol kulit semangka buah kuning dengan dosis 1000 mg/kgBB secara oral selama 8 hari

11. Kelompok 11 : diinduksi aloksan secara subkutan dengan dosis 125 mg/kgBB diberikan glibenklamid dengan dosis 0,09 mg/ 200grBB secara oral selama 8 hari

3.7Analisis Data

Data yang diperoleh akan dianalisis secara statistik. Jika data yang didapatkan memiliki distribusi data normal dan varians data sama maka dianalisis dengan menggunakan uji parametrik One Way Anova. Uji One Way Anova digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan yang signifikan dari kadar glukosa darah pada masing-masing kelompok perlakuan. Apabila hasil menunjukan perbedaan yang nyata, maka analisis statistik dilanjutkan dengan Uji Post Hoc Tukey. Uji Post Hoc Tukey digunakan untuk mencari dosis efektif pada kelompok perlakuan dan antara kelompok perlakuan dengan glibenklamid. Namun jika data yang didapatkan tidak memiliki distribusi data normal dan varians data tidak sama maka data yang diperoleh akan dianalisis dengan menggunakan uji nonparametrik, Shapiro Wilks Test digunakan untuk uji normalitas data, Kruskal-Wallis dan akan dilanjutkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney.3.8Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran UNJANI dimulai dari bulan Juni tahun 2014 sampai bulan Februari tahun 20153.9Jadwal Penelitian

Tabel 3.1 Jadwal Penelitian

NoKegiatanBulan

MeiJuniJuliAgustSeptOktNovDesJanFebMar

1Penentuan judul

2Uji Pendahuluan

3Penyusunan uji proposal

4Sidang uji proposal

5Penelitian skripsi dan pengambilan data

6Penyusunan skripsi dan pengolahan data

7Sidang skripsi

8Perbaikan makalah skripsi

9Pengumpulan naskah skripsi akhir

3.10Alur Penelitian

Keterangan : EEKS = Ekstrak Etanol Kulit Semangka

Gambar 3.1 Alur Penelitian3.11Aspek Etika Penelitian

Dalam World Medical Association tercantum 3 prinsip etika penelitian kesehatan yaitu respect, beneficiary, dan justice. Respect yaitu menghormati segala bentuk kehidupan. Beneficiary yaitu semua penelitian yang dilakukan harus memiliki manfaat bagi makhluk hidup. Dan justice yaitu sikap adil dalam penelitian sehingga memenuhi rasa keadilan.

Dalam penelitan kesehatan yang menggunakan hewan coba harus menerapkan juga prinsip 3R dalam protocol penelitiannya, yaitu Replacement, Reduction, dan Refinement. Replacement atau menggantikan, pada penelitian ini menggunakan tikus jatan galur wistar sebagai pengganti manusia dan hewan coba lainnya. Reduction yaitu meminimalisir jumlah hewan yang digunakan namun tetap mendapatkan hasil yang optimal, pada penelitian ini penghitungan jumlah hewan coba dengan menggunakan rumus federer dan didapatkan jumlah minimal hewan coba dalam 1 kelompok perlakuan yaitu 3 ekor tikus, namun untuk mencegah kriteria eksklusi maka peneliti menambahkan 1 hewan coba pada setiap kelompok perlakuan. Refinement yaitu memperlakukan hewan coba secara halus, baik dan manusiawi, serta meminimalisir pelakuan yang dapat menyakitkan hewan coba. Menyediakan tempat tinggal, dan makanan yang memadai serta perlakuan pemberian obat dengan 2 cara yaitu melalui oral dengan sonde oral yang memiliki ujung tumpul dan dengan cara mencampurkan ekstrak ke dalam minumannya.Ketiga prinsip di atas haruslah dikombinasikan dengan 5 prinsip freedom dalam kesejahteraan hewan, yaitu freedom from hunger and thirst (bebas dari rasa lapar dan haus) dengan cara para hewan percobaan diberikan pakan standar dan minum yang ad libitum, penempatan pakan dan minum diletakkan didalam kandang dengan posisi yang mudah untuk dijangkau oleh hewan. Freedom from discomfort (bebas dari rasa tidak nyaman) dapat dipenuhi dengan pemberian tempat tinggal yang baik dan sesuai, seperti ukuran kandang yang sesuai dengan mengikuti the guide for the care and use of laboratory animals, ventilasi yang baik, pencahayaan yang dibuat sealami mungkin sesuai dengan kondisi alamiah hewan. Freedom from pain, injury and diseases (bebas dari rasa sakit, luka dan penyakit) melakukan tindakan pencegahan terhadap penyakit, jika sudah terkena makan terapi dengan tepat dan pisahkan dari hewan lainnya agar tidak menular, selama penelitian sebisa mungkin melakukan tindakan non-invasif jika memang harus dengan teknik invasif minimalisir sakit dengan cara perkecil luas perlukaan dan menggunakan obat anastesi, dan saat setelah penelitian lakukan euthanasia sesuai dengan metode yang disetujui dan dianjurkan komisi etik. Freedom from fear and distress (bebas dari rasa takut dan stress) menghindari prosedur atau teknik yang dapat menyebabkan rasa takut dan stress pada hewan dengan cara pada saat akan perlakuan hewan dipisahkan ke ruangan lain berbeda dengan ruangan tempat perlakuan, dan hewan diberikan masa tramsisi dan adaptasi sebelum penelitian berlangsung (adaptasi terhadap lingkungan baru, pakan baru, atau prosedur baru). Freedom to express natural behavior (bebas untuk mengekspresikan tingkah laku alamiah) dapat diupayakan melalui penyediaan luas kandang yang cukup, dengan kualitas yang baik dan teman sekandang yang sejenis dengan memeperhatikan sosialisasi dan tingkah laku spesifik, serta program pengayaan, contohnya yaitu adanya serutan kayu yang dapat mengekspresikan tingkahlakunya yaitu menggali dan mengubur makanan maupun tubuhnya.

40 ekor tikus diadaptasikan selama 7 hari, diberi makan pelet dan minum air putih

Pengukuran kadar glukosa darah tikus

Pembagian menjadi 11 kelompok

Kel 1

Kontrol negatif

Kel 2

Kontrol positif

Kel 3

EEKS 62,5mg/kgBB

Kel 11

Glibenklamid 0,09mg/200grBB

Kel 10

EEKS 1000mg/kgBB

Kel 9

EEKS 750mg/kgBB

Kel 8

EEKS 500mg/kgBB

Induksi aloksan 125 mg/kgBB

Setelah 14 hari perlakuan dilakukan pemeriksaan glukosa darah tikus

Pengukuran kadar glukosa darah tikus setelah 3 hari diinduksi

Kel 7

EEKS 250mg/kgBB

Kel 6

EEKS 187,5mg/kgBB

Kel 5

EEKS 125 mg/kgBB

Kel 4

EEKS 93,75mg/kgBB

Setelah 8 hari perlakuan dilakukan pemeriksaan glukosa darah tikus

Analisis Data

Kesimpulan

25