LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Polymerase Chain Reaction, Purifikasi Hasil PCR,

dan SDS PAGE

Disusun oleh:

Kelompok 5

BayuHandika / 1206257595

FitriRahma Sari / 1206211165

FikryDwiAnjani / 1206211083

Rr. AprillaWulansari / 1206247032

Shinta Marlin / 1206240000

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2015

PENDAHULUAN

Bioteknologi telah banyak dimanfaatkan dalam mempertahankan kelangsungan

hidup manusia. Melalui bioteknologi telah diperoleh berbagai macam bahan makanan,

seperti tempe, keju dan yogurt. Seiring dengan kemajuan teknologi, semakin berkembang

pula berbagai macam produk bioteknologi, tidak hanya dalam bidang pangan, tetapi juga

dalam bidang farmasi dan kesehatan.

Penerapan bioteknologi di bidang kesehatan banyak sekali jumlahnya, beberapa

contoh diantaranya adalah enzim rekombinase hasil rekayasa genetik yang

menghilangkan DNA HIV dari sel induk, untuk terapi gen, mengatasi sel tumor, produksi

interferon, produksi vitamin dan asam amino, serta produksi protein darah.

Mengingat begitu besar manfaat bioteknologi dalam meningkatkan kesejahteraan

hidup manusia, maka diharapkan bidang bioteknologi dapat semakin berkembang dan

membawa dampak positif bagi kesejahteraan manusia. Oleh karena itu, penting untuk

kita mempelajari bioteknologi sehingga ilmu bioteknologi dapat semakin berkembang.

Pada percobaan kali ini, praktikan akan melakukan teknikn Polymerase Chain

Reaction yang bertujuan untuk mengamplifikasi fragmen DNA, proses PCR merupakan

proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing, dan elongasi oleh enzim

DNA polimerase. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali

jumlahnya. Pada setiap n siklus diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Selain

melakukan praktikum teknik PCR, praktikan juga melakukan purifikasi hasil PCR yang

bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR (DNA) amplikon yang murni.

POLYMERASE CHAIN REACTION

I. Tujuan

Polymerase Chain Reaction adalah teknik molekuler yang dilakukan bertujuan untuk

mengamplifikasi fragmen DNA dengan menggunakan suatu pasangan primer yang

dirancang dengan khas

II. Alat dan Bahan

Alat:

- Mesin Thermal Cycler

- Sentrifuge mikro

- Mixer (vortex)

Bahan:

- DNA template (DNA Genomik dalam 25μl TE)

- Pasangan primer oligonukleotida (primer 16s rDNA)

- Enzim DNA Taq polymerase

- Nukleotida bebas (dNTPs = dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

- Larutan dapar yang sudah mengandung Mg2+

III. Cara Kerja

1. Buat PCR master mix dengan volume akhir 25 mL dan kompisisi sebagai

berikut:

- Dapar 2.5μL

- Enzim DNA Taq polymerase 1 μl

- dNTP 0,5 μL

- Primer forward

- Primer reverse

- ddH2O 18 μl

Jika contoh yang akan diamplifikasi lebih dari satu, maka masing-masing jumlah

komponen tersebut dikalikan dengan jumlah contoh ditambah satu (n+1),

kemudian campur di dalam satu tabung mikro 1,5 ml (pembuatan master mix).

Jika volume akhir 50 μl, maka jumlah masing-masing komponen harus

disesuaikan.

2. Campurkan 1 μl hasil ekstraksi DNA kedalam master mix yang telah dialiquot

dalam tabung PCR 0,2 atau 0,5μl, kemudian dicampur dengan mixer (vortex).

3. Campuran disentrifugasi singkat (Spindown) dengan sentrifuge mikro, kemudian

siap ditempatkan pada mesin PCR.

4. Mesin PCR diatur sesuai kondisi yang sudah dirancang sebelumnya. Suhu

denaturasi, annealing, elongasi, dan terminasi maupun jumlah siklus diatur

sedemikian rupa sehingga tahapan dalam PCR adalah sebagai berikut*:

- Pre-denaturasi : 94oC; 5 menit

- Denaturasi : 94oC; 30 detik

- Annealing : 55oC; 30 detik

- Extension : 72oC; 1 menit

- Jumlah siklus : n = 25-30 (b-c-d)

- Post-extension : 72oC; 20 menit

- Hold : 16oC

*Kondisi PCR ini adalah untuk metode PCR konvensional. Kondisi dapat

dimodifikasi untuk metode-metode PCR lainnya sesuai kebutuhan.

5. Langkah selanjutnya adalah visualisasi hasil PCR dan purifikasi dengan

elektroforesis agarosa gel mini atau secara kuantitatif dengan spektrofotometer

nanodrop.

IV. Teori Dasar

Polymerase Chain Reaction adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA

secara in Vitro yang pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985.

Tujuan dari PCR adalah untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan

kali dalam waktu yang relatif singkat. Komponen yang diperlukan pada proses PCR

adalah template DNA (DNA Genomik dalam 25μl TE) ; sepasang primer, yaitu suatu

oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer

dengan urutan nukleotida DNA template (Pasangan primer oligonukleotida (primer

16s rDNA)); dNTPs atau Deoxynucleotide triphosphates; buffer PCR; magnesium

klorida (MgCl2) dan enzim Taq polimerase DNA.

Proses PCR terdiri dari beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA template;

(2) denaturasi DNA template; (3) penempelan primer pada templat(annealing); (4)

pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2)

sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus),di mana pada setiap siklus

terjadi duplikasi jumlah DNA.

Pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda

DNA template (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan

kemudian didinginkan hingga mencapai suhu tertentu untuk memberi waktu pada

primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase

DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai.

Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk

pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA

kromosom, DNA plasmid yang mengandung fragmen DNA yang dituju.

Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan, hal

yang diperlu diperhatikan dalam perancangan primer. Pertama panjang primer

berkisar 18-30 basa. Apabila panjang primer kurang dari 18 basa akan menjadikan

spesifitas primer rendah dan untuk panjang primer yang lebih dari 30 basa tidak akan

meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna. Kedua, kandungan (G+C)) (%

jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA

target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu

berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan

demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Ketiga, melting temperatur (Tm)

primer akan mempengaruhi dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Keempat,

interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari.

Kelima Buffer PCR dan MgCl2 berfungsi menjamin pH medium saat berlangsugnya

proses PCr. Mg2+ merupakan kofaktor yang berfungsi meningkatkan aktivitas DNA

polimerase. Keenam, Enzim taq polymerase DNA diperlukan untuk tahan elongasi

atau ekstensi DNA. Enzim ini diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus

aquaticus. Penggunaan taq polymerase dalam konsentrasi yang terlalu besar akan

mengakibatkan munculnya background produk non-spesifik. Sebaliknya, bila

konsentrasi taq polymerase terlalu rendah, maka proses amplifikasi tidak

berlangsung secara efisien, dan produk amplifikasi yang diperoleh akan mempunyai

konsentrasi yang relatif rendah

V. Daftar Pustaka

Handoyo, Darmo., Ari Rudiretna. (2001). Prinsip Umum dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Surabya: universitas Surabaya.

Malik, Amarila. (2015). Protokol Kerja (1) Ekstraksi DNA dan PCR Dasar. Depok:

Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.

PURIFIKASI HASIL PCR

I. Tujuan

Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil

PCR (DNA amplikon) yang murni.

II. Alat dan Bahan

Alat:

- Sentrifuge mikro

- Tabung mikro 1,5 ml baru dan steril

- Tabung penampung 2 ml, tersedia di dalam kit

- Pisau silet atau cutter yang baru dan steril

Bahan:

- Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit:

Dapar DF

Wash buffer + Etanol 95%

Kolom DF

- ddH2O

III. Cara Kerja

1. Sebanyak 20 μl DNA hasil amplifikasi PCR dan 5 μl loading buffer

dielektroforesis di gel agarosa 1%.

2. Potong pita yang diinginkan dengan menggunakan pisau silet atau cutter yang

baru dan steril. Irisan gel dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml baru dan

steril.

3. Tambahkan 300 μl dapar DF, vortex, dan inkubasi pada 55-60oC selama 10-15

menit hingga irisan gel terlarut sempurna. Selama inkubasi tabung mikro

dibolak-balik setiap 2-3 menit. Kemudian campuran tersebut didiamkan dingin

pada suhu kamar.

4. Pipet campuran tersebut dan masukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada

tabung penampung. Sentrifugasi pada kecepatan maksimum (13.000 rpm)

selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan kolom DF ditempatkan

kembali pada tabung penampung.

5. Tambahkan 600 μl dapar pencuci (wash buffer) yang telah ditambah etanol dan

sentrifugasi kembali pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Cairan yang

terkumpul dibuang kembali dan kolom DF ditempatkan kembali dalam tabung

penampung, sentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 3 menit sampai

membran kolom mengering.

6. Pindahkan kolom DF yang telah kering ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru

dan steril. Kemudian tambahkan 25 μl akuabides steril (ddH2O) ke dalam bagian

tengah dari membran kolom DF agar pengendapan pada dinding kolom dapat

dihindari. Biarkan akuabides terserap selama 2 menit kemudian sentrifugasi

pada kecepatan maksimum selama 1 menit untuk mendapatkan DNA murni.

7. Simpan DNA pada suhu -20oC.

8. Untuk mengamati DNA hasil purifikasi secara visual, DNA dianalisis kembali

dengan elektroforesis agarosa gel mini. Jika informasi sequence DNA amplikon

diperlukan, maka dapat dilakukan sequencing DNA.

IV. Teori Dasar

Purifikasi hasil PCR dilakukan untuk memastikan bahwa DNA yang diperoleh

murni dari berbagai pengotor. DNA yang tidak murni sering menyebabkan masalah

reproduksibilitas. Purifikasi DNA hasil PCR (DNA amplikon) ini dimaksudkan

untuk memperoleh DNA yang murni dari sisa primer pendek, nukleotida (sisa

dNTPs), enzim-enzim, garam-garam, pewarna (ethidium bromida), dan gel agarosa

dengan menggunakan membran kolom dan sentrifugasi.

Setelah dilakukan PCR, purifikasi amplikon DNA dapat dilakukan dengan

metode Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit menggunakan protokol seperti yang

telah dijelaskan di atas. Namun, dapat juga dilakukan purifikasi fragmen DNA

dengan protokol QIA Quick Purification Kits (QIAGEN). Prinsipnya hampir sama

dengan metode Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit hanya saja bahan dan alat

yang digunakan berbeda. Genom DNA hasil ekstraksi diambil sebanyak 100 µl

dimasukkan ke dalam eppendrof tube ditambah 500 µl binding buffer (PBI). Dengan

finger vortex, larutan akan tercampur dan di-flushing, selanjutnya dibiarkan selama 5

menit pada suhu ruang. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam column QIA quick

purification dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

Larutan yang terfilter dibuang dan ke dalam kolom ditambahkan larutan wash buffer

(PE) sebanyak 750 µl, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm.

Larutan yang terfilter dibuang dan disentrifugasi kembali dengan waktu dan

kecepatan yang sama. Angkat column yang berisi filter QIA quick dan dimasukkan

ke dalam eppendorf tube yang telah steril. Tahap selanjutnya menambahkan elution

buffer (EB) sebanyak 30 µl yang diteteskan pada bagian tengah filter column dan

disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Larutan yang telah

terfilter merupakan DNA murni hasil purifikasi.

DNA murni yang diperoleh tersebut dapat diamati hasil purifikasinya secara

visual dengan dianalisis kembali pada elektroforesis agarosa gel mini. Pengamatan

tersebut merupakan pengamatan kualitatif karena dengan elektroforesis agarosa gel

mini dapat dibandingkan antara hasil elektroforesis DNA amplikon murni dengan

penanda ukuran molekul. Apabila DNA tersebut murni akan diperoleh bercak

tunggal (1 band) yang menandakan tidak ada komponen atau genom lain. Jika

informasi sekuens DNA amplikon tersebut diperlukan, dapat dilakukan proses

sekuensing DNA.

Untuk memperoleh data purifikasi DNA secara kuantitatif dapat digunakan

spektrofotometer nanodrop. Nanodrop merupakan cara analisis asam nukleat, DNA,

RNA, atau protein yang dapat digunakan untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.

Penggunaan Nanodrop ini lebih praktis dibandingkan dengan alat analisis

spektrofotometer UV-Vis sederhana. Alat Nanodrop ini menggunakan sistem retensi

sampel yang menggunakan 0,5-2,0 µl sampel tanpa harus menggunakan kuvet atau

kapiler. Dengan menggunakan fiber optik dan tekanan permukaan, sampel

ditempatkan dalam tempat di antara dua permukaan optikal yang menerjemahkan

panjang jalur secara vertikal. Salah satu contoh alat Nanodrop ini adalah

spektrofotometer Nanodrop ND-1000. Spektrofotometer Nanodrop ND-1000

memiliki kemampuan untuk mengukur sampel yang terkonsentrasi tanpa

pengenceran (konsentrasi 75 kali lebih tinggi dari sampel yang diukur dengan

spektrofotometer kuvet standar).

V. Daftar Pustaka

Invitrogen. http:// www.lifetechnologies.com /id/en/home/references/an-introduction-

to-cloning-a-researchers-guide-to-cloning-dna/purifying-your-pcr-

product.html

Malik, Amarila. (2015). Protokol Kerja (1) Ekstraksi DNA dan PCR Dasar. Depok:

Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.

Qiagen. https://www.qiagen.com/id/products/catalog/sample-technologies/dna-

sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit

SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polycrylamine Gel Electrophoresis)

I. Tujuan

SDS PAGE digunakan untuk memisahkan protein dengan cara elektroforesis

discontinous polyacrylamide gel yang terdiri dari stacking gel dan resolving/

separating gel.

Bahan

Stacking gel:

3,05 ml ddH2O

1,25 ml 4X 0,5 M TrisHCl pH 6,8

0,67 ml Akrilamid 30%

25 µl APS10%

5 µl TEMED

Resolving gel:

ddH2O

4X 1,5 M TrisHCl pH 8,8

Akrilamid 30%

APS 10%

TEMED

30% acrylamide solution:

30 gr acrylamide: bis-acrylamide (29:1)

Dilarutkan dalam 100 ml aquabidest

1,5 M TrisHCl buffer (4X) pH 8,8:

18,17 gram Tris base

4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 8,8 dengan HCl

Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest

0,5 Tris-HCl buffer (4X) pH 6,8:

6,06 gram Tris base

4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 6,8 dengan HCl

Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest

(4X) Tris-Glycine Reservoir Buffer:

12 gram Tris base

57,6 gram Glycine

Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest

(5X) Sample buffer:

3,9 ml Aquabidest

1,0 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

0,8 ml Glycerol

1,6 ml 10% SDS

0,4 ml 2-mercaptoethanol

0,4 ml 1% bromophenolblue

10% SDS

50 gram SDS ad dengan aquabidest hingga 500 ml, aduk hingga homogen.

10% APS

Larutkan 0,1 ml APS dalam 1 ml aquabidest, dibuat fresh.

Running buffer

370 ml Aquabidest

125ml (4X) reservoir buffer

5 ml 10% SDS

Staining/destaining solution

400 ml Methanol

100 ml Asamasetatglasial

500ml Aquabidest

1 gram Coomassie Brilliant Blue (untuk staining solution)

II. Cara Kerja

1. Persiapan Gel

a. Gel yang telah memadat siap digunakan untuk elektroforesis. Pasang gel

pada alat, dan keluarkan sisir dari gel.

b. Gel yang telah siap tetapi tidak segera digunakan untuk elektroforesis

dapat disimpan direndam dalam buffer (running buffer) atau aquadest.

c. Gel tidak boleh disimpan terlalu lama.

2. Persiapan Sampel

a. Sampel protein didenaturasi dengan menambahkan sampel buffer, lalu

dipanaskan dengan menggunakan thermoblock, pada suhu 85°C selama 5

menit.

3. Elektroforesis

a. Setelah protein marker (5-8 µl) dan sampel (10-15 µl) dimasukkan ke

dalam sumuran (well), alat elektroforesis di set (semakin kecil arus,

pemisahan akan semakin baik, namun waktu akan semakin lama). Untuk

running 1 gel biasanya diperlukan waktu ±120 menit dan ±180 menit

untuk 2 gel.

b. Elektroforesis dihentikan ketika semua sampel dan protein maker

mencapai dasar resolving gel.

4. Staining Gel

a. Gel hasil elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran protein serta

menganalisa bentuk pita proteinnya.

b. Gel yang telah selesai dielektroforesis difiksasi dengan merendam gel

hasil elektroforesis di dalam larutan fiksasi (10% asam asetat; 25%

isopropanol; 65% aquadest) selama 15 menit. Larutan fiksasi kemudian

dibuang lalu potongan gel ini direndam didalam larutan staining Coomasie

Brilliant Blue.

c. Setelah gel direndam, wadah yang berisi gel kemudian digoyangkan

perlahan dan dibiarkan selama satu malam dalam temperature kamar.

5. Destaining Gel

a. Gel kemudian dibilas beberapa kali dengan menggunakan aquadest steril

atau direndam dalam wadah plastic berisi aquadest. Gel kemudian

disimpan didalam wadah plastic dalam keadaan terendam oleh air. Hasil

staining tersebut kemudian dibandingkan dengan penanda protein untuk

mengetahui perkiraan ukuran protein yang berhasil diperoleh.

III. Teori Dasar

Elektroforesis merupakan suatu migrasi molekul bermuatan di dalam

suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung

pada muatan, ukuran, dan bentuk dari setiap molekul yang terlibat.

Saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui nedia, molekul

yang lebih kecil akan mengalami migrasi yang lebih cepat daripada yang besar.

PAGE digunakan untuk memisahkan protein dengan cara elektroforesis

discontinous polyacrylamide gel yang terdiri dari stacking gel dan resolving/

separating gel serta menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) untuk

mendenaturasi protein. Stacking gel berfungsi untuk mengumpulkan protein

yang telah diload menjadi pita atau band yang tajam sebelum gel terpisah pada

resolving gel. Resolving gel berfungsi memisahkan protein berdasarkan ukuran

molekul.

Pemilihan penggunaan poliakrilamida didasarkan pada poliakrilamida

tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan sampel

sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan

pemisahan protein secara sempurna. Komponen penyusun gel poliakrilamida

dalah akrilamida, bis akrilamida, ammonium persulfate dan TEMED.

Akrilamida merupakan senyawa karsinogenik. Ammonium persulfate

berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan

molekul akrilamida lainnya membentuk polimer yang panjang. TEMED

berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel

poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein