LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Materi Isolasi DNA“

Nama : Nurul Lailiyatul F

NIM : 125040201111157

Kelompok : Senin, 11.00 – 12.40

Asisten : Layli

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2013

BAB 1PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung

materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem kehidupan. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA didalamnya.

1.2 Tujuan - Mengetahui definisi isolasi DNA- Mengetahui metode dan tahapan dalam isolasi DNA- Mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 Manfaat

Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian isolasi DNA

- Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. (Arsis, 2010)

- Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. (Yuwono, 2006)

- DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. ( Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya.) (Doyle, 1990)

2.2 Macam metode Isolasi DNA

a. Kitchen Preparationada 4 hal penting yang harus kita lakukan untuk melakukan isolasi DNA yaitu:

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.2. pemecahan dinding sel.3. pemecahan membran sel.4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti strowberry cukup hanya diremas-remas saja.

Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)bisa keluar.

Jika perlu kita dapat menambahkan proteinase (enzim pengurai protein) untuk menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya, atau bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas.

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan. (Tohib, 2012)

b. CTAB

CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.

Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel.

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.

Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk

melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease . Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi.

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Purwantara, 2001).

2.3 Tahap Isolasi DNAa. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

b. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan  larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

c. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

d. PurifikasiTahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil

ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

e.  PresipitasiTahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk

mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan

larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas ( Yuwono, 2006 )

2.4 Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi pertanian)

Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan. (Purwantara, 2001).

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan Fungsi

3.1.1 Alat Isolasi DNA- Timbangan analitik, untuk menimbang bahan- Incubator, sebagai tempat untuk menginkubasi

dan untuk mengaktifkan CTAB- Sentrifuge, untuk memisahkan antara

supernatant,fase organic dan fenol- Mikropipet dan tip-nya , digunakan untuk

membantu memasukkan larutan- Beaker glass, sebagai tempat bahan- Tabung reaksi, tempat mereaksikan larutan- Mortar dan penumbuknya, untuk menumbuk

daun kubis supaya lebih halus- Labu Erlenmeyer, sebagai tempat larutan- Vortex , untuk menghomogenkan larutan- Freezer, untuk menginkubasi larutan- TUB, sebagai tempat larutan

3.1.2 Bahan Isolasi DNA- Daun kubis, sebagai bahan praktikum- Alkohol, untuk mensterilkan- Nitrogen cair, untuk membantu penggerusan dan

penghalusan tumbukan daun dan merusak dinding sel

- CTAB & Merchapbethanol, untuk memecah dinding sel dan menjaga DNA agar tidak rusak

- CIA (Chloroform Isoamile Alcohol), untuk mengeluarkan isi sel dan untuk mengurangi kontaminasi protein dan polisakarida

-  Isoprophanol dingin, untuk membantu dalam proses penggumpalan DNA menjadi benang-benang DNA

- Buffer pencuci, untuk mencuci larutan- Tris EDTA, untuk meresistensi

3.2 Langkah Kerja + dokumentasi

Campur buffer ekstraksi Timbang 0,1 (1 ml) dengan karbon (0,5 w/u) gr sampel daundan mercaptoethanoll

Masukkan dalam4 µl (kocok sebelum digunakan) mortar,tambahkan

Sedikit pvp,Tambahkan N2 cairSegera digerus Sampai halus (jangan sampaiMencair)

Masukkan 1 ml kedalam tubeUkuran 1,5 ml dan tutup tube(beri label pada tube)

Tube berisi buffer ekstraksi

Segera vortex sampai rata

Inkubasi dalam oven (650C 10 menit) bolak balik ketube setiap 5 menit

Segera masukkan

Keluarkan tube dari oven dan didinginkan sebentar

Setelah dingin,sentrifuge (13.000 rpm selama 5 menit)

Ambil supernatant dan dipindahkan ke tube baru (tube 2 ml / 1,5 ml)

Tambahkan 500 µl chiasm pada supernatant dan vortex

Sentrifuge (13.000 rpm selama 5 menit)

Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml, dan tambahkan chiasm 500 µl dan vortex

Sentrifuge 13.000 rpm selama 5 menit

Pindahkan supernatant ke tube baru 1,5 ml dan tambahkan 300 µl isopropanol dingin secara perlahan

Bolak balik tube secara perlahan (jangan sampai terguncang keras dan inkubasi dalam freezer selama 10 menit)

Keluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin, sentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit

Buang supernatant , tambahkan buffer pencuci 500 µl pada pellet dalam tube vortex

Sentrifuge (10.000 rpm selama 5 menit)

Buang supernatant dan kering anginkan pellet sampai kering

Tambahkan buffer TE 50-100 µl dan larutan pellet DNA dengan cara mengetuk-ketuk tube secara perlahan

3.3 Analisis Perlakuan

Dalam praktikum isolasi DNA pertama yang dilakukan siapkan alat dan bahan yang akan dipergunakan. Campur buffer ekstraksi 1ml dengan karbon (0,5% w/u) dan mercaptoethanol 4 µl (kocok sebelum digunakan). Lalu masukkan 1 ml ke dalam tube ukuran 1,5 ml dan tutup tube dengan diberikan label pada tube tersebut. Timbang 0,1 gram sampel daun lalu masukkan dalam mortar dan tambahkan sedikit pvp guna untuk melisiskan dinding sel lalu tambahkan nitrogen cair lalu segera digerus sampai halus (jangan sampai mencair) , setelah d gerus masukkan ke dalam tube yang berisi buffer ekstraksi. Setelah di vortex

sampai rata guna untuk menghomogenkan, diinkubasi dalam oven dengan suhu 650C selama 10 menit bolak balik tube setiap 5 menit.

Keluarkan tube dari oven dan dinginkan sebentar, setelah dingin di sentrifuge selama 5 menit. Ambil supernatant dan di pindahkan ke tube baru 2 atau 1,5 ml. Tambahkan 500 µl chiasm pada supernatant dan di vortex. Di sentrifuge kembali selama 5 menit, pindahkan supernatant ke tube lalu tambahkan chiasm 500µl dan di vortex. Lalu di sentrifuge lagi selama 5 menit, setelah itu dipindahkan ke tube baru, tambahkan 300µl isopropanol dingin secara perlahan. Bolak balik tube secara perlahan jangan sampai terguncang keras dan diinkubsi dalam freezer selama 10 menit. Keluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin, sentrifuge selama 5 menit. Buang supernatant dan tambahkan buffer pencuci 500µl pada pellet dalam tube vortex. Setelah itu di sentrifuge selama 5 menit. Buang supernatant dan kering anginkan pellet sampai kering. Lalu Tambahkan TE 50-100µl dan larutan pellet DNA dengan cara mengetuk-ketuk tube secara perlahan

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)4.2 pembahasan

Variasi pada modifikasi masingmasing metode memberikan hasil yang terbaik, yaitu menghasilkan pita DNA yang tebal dan sedikit kontaminan. Variasi modifikasi pada metode Doyle & Doyle (1990) dengan nitrogen cair memiliki variasi terbaik, yaitu variasi menggunakan Proteinase K setelah pencucian pelet DNA dengan ethanol 76%. Variasi modifikasi pada metode Doyle & Doyle (1990) tanpa nitrogen cair juga memiliki variasi terbaik, yaitu menggunakan Proteinase K setelah inkubasi bufer dan RNAse pada tahap akhir isolasi. Variasi modifikasi metode Zheng et al. (1995) memiliki variasi terbaik, yaitu menggunakan Proteinase K setelah inkubasi bufer dan RNAse pada tahap akhir isolasi. (

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa.

Dalam praktikum ini, diguanakan daun kubis untuk proses pengisolasian DNA. Alat yang digunakan antara lain mikropipet, mortar, fortex, sentrifuse, elektroforesis, dan lainnya. Bahan yang digunakan diantaranya nitrogen cair, Buffer CTAB, PVP, Chisam, Isopropanol, dan lainnya.

Pada praktikum isolasi DNA ini saat disentrifuse pertama kali didapati hasil adanya 3 larutan yang terpisah satu sama lain yaitu, lapisan atas disebut supernatant (Chisam+DNA), lapisan tengah yaitu fase organic, dan lapisan bawah yang disebut fenol. Sedangkan sentrifuse yang kedua yaitu hanya larutan supernatant yang digunakan sehingga ada 2 material yang terpisah yaitu lapisan atas (DNA) berwarna putih dan lapisan bawah (Chisam) berwarna bening.

5.2 Kritik dan Saran5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun

Depan- Untuk sistematika praktikum lebih

dipersiapkan,agar tidak menyusahkan praktikan

5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten- Asisten agar tidak seenaknnya sendiri dalam

mengganti dan menentukan jadwal.

DAFTAR PUSTAKA

Asris. 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/.diakses pada 1 Desember 2013

Doyle. J. J and Doyle J. L. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue Focus. Moscow. 12 (1): 13.

Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant Pathogens Detection by Moleculae Tehniques. 24-26 Januari 2001.

Tohib. 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id/2012/09/isolasi-dna metode-kitchen-preparation.html diakses pada 1 Desember 2013

Yuwono, Triwibowo. 2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjah Mada University Press. : Yogyakarta