Post on 15-Oct-2019
26
IV. METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitan ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan,
Laboratorium Keteknikan Pengolahan Pangan, Laboratorium Kimia Pangan dan
Laboratorium Teknologi Pengolahan Pangan Jurusan Teknologi Industri Pangan,
Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran. Waktu penelitian
dilaksanakan pada bulan Januari - Mei 2019.
4.2 Bahan dan Alat Percobaan
4.2.1 Bahan
Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah daun kemangi (O.
sanctum L.) yang diperoleh dari Kampung Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan
Parongpong, Kabupaten Bandung Barat dan bahan pembuatan mi basah yakni
terigu, garam, minyak, dan air. Media pertumbuhan mikroba menggunakan NA
(Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PCA ( Plate Count Agar), LBSS
(Lactose Broth Single Strenght), LBDS (Lactose Broth Double Strenght), EMB
(Eosin Methylene Blue), dan NaCl fis 0,85%. Bahan-bahan kimia yang digunakan
adalah formalin 0,05%, etanol 70%, alkohol 95%, metylene blue, lugol, netral red,
dan safranin. Kultur mikroba uji, yaitu E. coli dan A. niger. Bahan-bahan lain yang
digunakan yaitu akuades, alumunium foil, clingwrap, kertas saring, kertas cakram,
object glass, cover glass, kapas, kasa, dan spirtus.
27
4.2.2 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain beaker glass, gelas
ukur, pipet ukur, bulb, labu erlenmeyer, cawan petri, spatula, panci, saringan, pasta
maker, tabung durham, tabung reaksi, inkubator, pisau, vacuum filter, serangkaian
alat rotary evaporator, spektrofotometer, autoklaf, neraca analitik, jarum ose,
cawan alumunium, oven, mikropipet, desikator, mikroskop, bunsen, fin tip, botol
semprot, refrigerator, Laminar Air Flow, kuvet, dan botol kaca gelap.
4.3 Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode
eksperimental yang dianalisis secara deskriptif dengan ulangan sebanyak 2 kali.
Tahap pertama adalah melakukan determinasi bahan uji yaitu daun kemangi,
pembuatan ekstrak daun kemangi dengan metode maserasi menggunakan pelarut
etanol 70%, serta pemeriksaan parameter non spesifik dan spesifik ekstrak uji.
Kemudian dilakukan pengujian aktivitas antimikroba terhadap E. coli dan A. niger
menggunakan metode difusi agar dengan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan
100%. Konsentrasi terbaik kemudian diaplikasikan pada mi basah dengan
pembanding formalin 0,05% sebagai kontrol positif.
4.4 Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan percobaan terdiri dari dua tahap yakni uji aktivitas antimikroba
dengan pembuatan ekstrak daun kemangi, pemeriksaan parameter ekstrak uji, serta
pengujian aktivitas antimikroba pada bakteri E. coli dan jamur A. niger. Tahap
28
kedua adalah uji aplikasi pada mi basah menggunakan konsentrasi terbaik ekstrak
etanol daun kemangi hasil uji aktivitas antimikroba.
4.4.1 Pembuatan Simplisia Daun Kemangi
Daun kemangi (O. sanctum L) yang digunakan pada penelitian ini diperoleh
dari Kp. Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan Parongpong Kabupaten Bandung
Barat. Bahan uji daun kemangi dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium
Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. Hasil determinasi dapat dilihat di
Lampiran 2.
Daun kemangi segar disortasi dan dicuci dengan air mengalir yang
bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang mungkin menempel pada daun
kemangi. Pengeringan daun kemangi dilakukan dengan cara di angin-anginkan dan
terlindung dari matahari langsung untuk mempertahankan kandungan volatil dalam
daun kemangi (Soemari, 2017). Selanjutnya dilakukan sortasi kering yang
bertujuan untuk memisahkan benda asing seperti benang, rambut, dan pengotor lain
yang mungkin menempel selama proses pengeringan.
Daun kemangi yang telah kering kemudian dilakukan pengecilan ukuran
untuk memperbesar luas permukaan sehingga kontak dengan pelarut menjadi lebih
optimal. Pengecilan ukuran dilakukan menggunakan grinder atau blender dengan
waktu yang sangat singkat agar simplisia daun kemangi tidak sampai halus,
sehingga saat dilakukan proses penyaringan bubuk daun kemangi dapat tersaring
secara optimum dan meminimalisir kemungkinan adanya bubuk daun kemangi
yang terbawa saat evaporasi (Depkes RI, 2000). Selanjutnya penyimpanan
29
simplisia daun kemangi dalam wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari
matahari langsung pada suhu kamar (Soemari, 2017). Diagram proses pembuatan
simplisia daun kemangi dapat dilihat pada Gambar 6.
(Modifikasi Soemari, 2017)
4.4.2 Pembuatan Ekstrak Daun Kemangi
Simplisia kering daun kemangi yang telah jadi kemudian dimaserasi
menggunakan etanol 70% sampai semua serbuk kemangi terendam dengan
perbandingan berat sampel dan etanol 70% adalah 1:5 (b/v). Perendaman dilakukan
selama 2-3 hari dengan pengadukan setiap hari atau sesering mungkin. Setelah
dimaserasi, disaring menggunakan vacuum filter, sehingga diperoleh filtrat dan
ampas.. Filtrat kemudian dikentalkan menggunakan rotary evaporator dengan
Gambar 6. Diagram Proses Pembuatan Simplisia Daun Kemangi
Daun
Kemangi Determinasi Tanaman
Sortasi dan Pencucian
Pengeringan
T : 6-7 hari
l
Sortasi Kering
Pengecilan Ukuran
Simplisia Daun
Kemangi
30
suhu heating bath sebesar 400C dan suhu chiller + 30C, selama + 1,5 jam atau
tergantung banyaknya larutan sehingga diperoleh ekstrak kental (Yulianingtyas dan
Bambang, 2016). Diagram proses pembuatan ekstrak daun kemangi dapat dilihat
pada Gambar 7.
(Modifikasi Atikah, 2013)
4.4.3 Parameter Ekstrak Uji
Ekstrak daun kemangi kemudian diuji berdasarkan parameter spesifik
berupa uji kadar air dan parameter non spesifik berupa uji organoleptik sebagai
berikut:
1) Uji Kadar Air (AOAC, 2006)
Gambar 7. Diagram Proses Ekstrak Daun Kemangi
Maserasi dengan
etanol 70%
T : 2-3 hari
Simplisia
daun kemangi
Penyaringan filtrat
Evaporasi
T : 400C ; t : + 1,5 jam
Ekstrak kental
daun kemangi
Ampas
31
a. Disiapkan cawan kosong dan dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada
suhu 105oC.
b. Cawan didinginkan dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang hingga
berat yang dihasilkan konstan.
c. Sampel ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam cawan.
d. Cawan berisi sampel dimasukkan ke dalam oven selama + 3 jam pada suhu
105oC + 2oC.
e. Cawan yang berisi sampel dikeluarkan dari oven lalu dimasukkan ke dalam
desikator selama + 15 menit dan ditimbang.
f. Pengeringan dilakukan sampai didapatkan berat yang konstan dengan
selisih 0,2% dari berat sampel kering sebelumnya.
g. Perhitungan kadar air dilakukan menggunakan rumus berikut:
Kadar air (%bb) = 𝑎−𝑏
𝑎 x 100%
Keterangan:
- a = berat awal sampel (g)
- b = berat sampel setelah dikeringkan (g)
2) Uji organoleptik yang dilakukan menggunakan panca indera meliputi bentuk,
warna, dan bau (Depkes RI, 2000).
4.4.4 Pengujian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Kemangi
4.4.4.1 Persiapan Kultur Mikroba Uji
Persiapan kultur mikroba uji dilakukan untuk menumbuhkan bakteri
maupun jamur uji agar dapat berkembang saat dicampurkan dengan media padat
dalam uji aktivitas antimikroba.
32
1) Pembuatan Suspensi E.coli
Bakteri disuspensikan dalam 9 mL larutan NaCl fis 0,85% lalu dibandingkan
dengan McFarland 0,5. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi suspensi
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm sampai
diperoleh absorbansi 0,08 - 0,13 (setara dengan 1,5x108 CFU/mL). Diagram proses
pembuatan suspensi E. coli dapat dilihat pada Gambar 8.
(Biologicals, 2014)
2) Pembuatan Suspensi A. niger
Jamur yang telah diinkubasi selama 3-5 hari kemudian diluruhkan
menggunakan NaCl fis 0,85% lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril untuk
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 530 nm dan distandarisasi
9 mL NaCl fis
0,85%
Pencampuran sampai kekeruhan
menyerupai McFarland 0,5
Sterilisasi dalam autoklaf
T = 1210C, t = 15 menit
Uji absorbansi menggunakan
spektrofotometer pada panjang
gelombang 600 nm
Suspensi E. coli
Kultur murni E.
coli
Gambar 8. Diagram Proses Pembuatan Suspensi E. coli
33
menggunakan larutan McFarland untuk memperoleh inokulum sebanyak 1 x 108
CFU/mL menggunakan spektrofotometer dengan larutan NaCl fis 0,85% sebagai
blanko. Diagram proses pembuatan suspensi A. niger dapat dilihat pada Gambar 9.
(Modifikasi Cappuccino dan Sherman, 2001)
4.4.4.2 Penentuan Aktivitas Antimikroba
Aktivitas antibakteri dan antijamur dapat ditentukan dengan metode difusi
agar. Sebanyak 0,1 mL suspensi bakteri dan jamur uji dimasukkan ke dalam cawan
petri yang telah berisi medium NA steril untuk bakteri dan PDA untuk jamur.
Kemudian letakkan cakram kertas dan tetesi larutan uji konsentrasi 0%, 25%, 50%,
75% dan 100% sebanyak 40 µL pada permukaan agar. Pengenceran dilakukan
menggunakan aquades karena konsentrasi terbaik akan diaplikasikan pada mi
basah, sehingga larutan pengencer harus aman untuk dikonsumsi. Diinkubasi
selama 1 – 2 hari pada suhu 37oC untuk bakteri dan 3 – 5 hari pada suhu 25oC –
Kultur murni A.
niger
Peluruhan
Uji absorbansi menggunakan
spektrofotometer pada panjang
gelombang 530 nm
Suspensi A. niger
NaCl fis
0,85%
Standarisasi
McFarland 0,5
Gambar 9. Diagram Proses Pembuatan Suspensi A. niger
34
28oC untuk jamur. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan zona bening yang
terbentuk disekeliling kertas cakram. Diagram proses dapat dilihat pada Gambar
10.
(Modifikasi Atikah, 2013)
Penuangan ke cawan
petri dan dibiarkan
membeku
0.1 mL suspensi bakteri yang
telah diukur absorbansinya,
diinokulasi pada medium NA
Peletakkan dan penetesan cakram
kertas dengan konsentrasi 0%,
25%, 50%, 75%, dan 100% pada
permukaan medium NA
Inkubasi selama 3-5 hari, suhu
25-280C (jamur) Inkubasi selama 1-2 hari,
suhu 370C (bakteri)
0.1 mL suspensi jamur yang
telah diukur absorbansinya,
diinokulasi pada media PDA
Peletakkan dan penetesan cakram
kertas dengan konsentrasi 0%,
25%, 50%, 75%, dan 100% pada
permukaan medium PDA
Pengukuran diameter zona
hambat yang terbentuk
Medium Nutrient Agar (NA)
dan Potato Dextrose Agar
(PDA)
Data diameter
zona hambat / mm
Gambar 10. Diagram Proses Uji Aktivitas Antimikroba
35
4.4.4.3 Penentuan Aktivitas Antimikroba pada Mi Basah
Pembuatan mi basah matang dilakukan berdasarkan Pahrudin (2006),
dengan melakukan penimbangan tepung terigu (100%), garam (1%), Na2CO3
(0,6%), dan air (34%) untuk 1 adonan. Kemudian dilakukan pengadukan bahan-
bahan kering selama + 1 menit lalu ditambahkan air sedikit demi sedikit dan
ditambahkan berbagai perlakuan yakni ekstrak daun kemangi konsentrasi terbaik,
formalin 0,05% (Pransiska & Taty, 2016) sebagai kontrol positif, dan tanpa
pemberian apapun sebagai kontrol negatif. Masing-masing adonan diaduk kembali
selama + 4-5 menit lalu digiling hingga membentuk lembaran dan dilakukan
pemotongan menggunakan pasta maker hingga didapatkan bentuk mi yang
diinginkan. Selanjutnya dilakukan perebusan menggunakan air sebanyak 4 kali
lipat dari jumlah mi yang telah diberi minyak kelapa (10% dari air rebusan)
(Sihombing, 2007).
Mi basah dengan berbagai perlakuan kemudian ditutup dengan cling wrap
dan disimpan pada suhu kamar (+ 25oC). Kemudian dilakukan pengamatan dengan
uji mikrobiologi, uji mutu kimia, dan uji organoleptik mi basah dengan waktu
interval adalah setiap hari selama 4 hari. Diagram alir aplikasi ekstrak daun
kemangi dapat dilihat pada Gambar 11.
36
Gambar 11. Diagram Proses Aplikasi Ekstrak Daun Kemangi
(Modifikasi Sihombing, 2007)
Bahan baku mi basah
Pengadukan bahan-bahan kering
(t : 1 menit)
Tanpa perlakuan
(kontrol -)
Penambahan
ekstrak daun
kemangi
konsentrasi terbaik
Penambahan
formalin 0,05%
(kontrol +)
Pembentukan lembaran
Perebusan
(t : + 2 menit)
Mi basah
matang
Pencampuran air sedikit demi sedikit
Pengadukan adonan
(t : 4-5 menit)
(
Pemotongan mi menggunakan pasta maker
37
4.5 Kriteria Pengamatan
Kriteria pengamatan yang dilakukan terbagi menjadi dua pengamatan yakni
pengamatan terhadap uji aktivitas antimikroba dan uji kualitas mi basah sebagai
berikut:
1) Uji Aktivitas Antimikroba (Modifikasi Atikah, 2013)
a. Perhitungan diameter zona hambat antimikroba
2) Uji Kualitas Mi Basah
a. Uji mikrobiologi meliputi uji Total Mikroba (Badan Standarisasi Nasional,
2014), total coliform (Badan Standarisasi Nasional, 2008), dan total kapang
(Badan Standarisasi Nasional, 2015).
b. Mutu kimia mi basah yang meliputi uji kadar air (AOAC, 2006).
c. Uji organoleptik mi basah berdasarkan panca indera yang meliputi warna,
aroma, dan tekstur yang dilakukan setiap hari selama 4 hari (Depkes
RI,2000). Metode yang akan digunakan adalah uji mutu hedonik dengan
panelis semi terlatih sebanyak 15 orang (Soekarto, 1985).