Post on 27-Mar-2019
IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE
SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus
DI YOGYAKARTA:
SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA
WIDY TRIAPRILYANTI
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Molekuler
Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di
Yogyakarta: sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya adalah benar merupakan
hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2016
Widy Triaprilyanti
NIM C24120051
ABSTRAK
WIDY TRIAPRILYANTI. Identifikasi Molekuler Gen Cytochrome Oxidase
Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta: sebagai Dasar
Pengelolaan Sumberdaya. Dibimbing oleh NURLISA A BUTET dan
MAJARIANA KRISANTI.
Panulirus homarus (lobster pasir) dan Panulirus penicillatus (lobster batu)
adalah jenis dari crustase laut yang termasuk dalam genus Panulirus Penelitian
ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus berdasarkan marka
genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat membantu
pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi dasar dalam
pengelolaan sumberdaya yang akurat. Tahap isolasi dan ekstraksi DNA
menghasilkan dua DNA total yang baik untuk diamplifikasi dengan PCR hingga
tahap sekuensing gen COI. Gen COI P. homarus dan P. penicillatus disejajarkan
dengan beberapa gen COI spesies lain, yaitu genus Palinurus sebagai outgroup
yang didapatkan dari GenBank hingga menghasilkan pohon filogeni dan
membuktikan perbedaan yang jelas antara genus Panulirus dengan genus
Palinurus. Panulirus homarus and Panulirus penicillatus memiliki perbedaan
yang signifikan dari spesies Palinurus. Kedua spesies tersebut berbeda secara
signifikan berdasarkan gen COI.
Kata kunci: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gen COI, identifikasi
molekuler
ABSTRACT
WIDY TRIAPRILYANTI. Molecular Identification Gene Cytochrome Oxidase
Subunit I (COI) of Lobster Genus Panulirus in Yogyakarta: As The Basis of
Resources Management. Supervised by NURLISA A BUTET and MAJARIANA
KRISANTI.
Panulirus homarus and Panulirus penicillatus are species of marine
crustase included in the genus Panulirus. This research was aimed at identifying
Panulirus lobster based on Cytochrome Oxidase Subunit genetic I (COI) marker
to support for accurate the existence of the species cryptic phenomenon as basic
information in resource management accurately. Isolation and extraction DNA
steps produced two DNA total which was good for amplification using PCR
technique. P. homarus and P. penicillatus COI genes were aligned with some of
the other species, i.e., COI gene of the genus Palinurus as outgroup acquired from
GenBank and to produce a phylogeny tree distinction for genus Panulirus.
Panulirus homarus and Panulirus penicillatus were significantly different from
Palinurus species. The two former spesies were also significantly distinct due to
partial COI gene.
Keywords: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gene COI, molecular
identification
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan
pada
Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan
IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE
SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus
DI YOGYAKARTA:
SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA
WIDY TRIAPRILYANTI
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan hidayah-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan kegiatan penelitian serta
penyusunan karya ilmiah ini dengan judul Identifikasi Molekuler Gen
Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta:
sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya. Skripsi ini disusun sebagai salah satu
syarat untuk menyelesaikan studi di Departemen Manajemen Sumberdaya
Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis
menyampaikan terimakasih kepada:
1 Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya.
2 Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan kesempatan untuk studi.
3 Beasiswa BIDIK MISI yang telah memberikan dana pendidikan perkuliahan.
4 Beasiswa POKJA AMANAH yang telah memberikan dana pendidikan
perkuliahan.
5 Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan dan
Kebudayaan atas biaya penelitian melalui biaya Operasional Perguruan
Tinggi Negeri (BOPTN), Anggaran Pendapatan Belanja Negara (APBN),
DIPA IPB Tahun Ajaran 2015 no. 083/SP2H/PL/Dit.Litabmas/11/2015
Penelitian Dasar untuk Bagian, Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, IPB
dengan judul “Analisis Populasi Lobster Panulirus spp. di Perairan Selatan
Jawa dalam Menunjang Implementasi Pengelolaan Perikanan Lobster
Berbasis Ekosistem” yang dilaksanakan oleh Dr Ir Yusli Wardiatno, MSc
(sebagai ketua peneliti) dan Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc, Dr Ir Luky Adrianto,
MSc, Ali Mashar, SPi MSi (sebagai anggota peneliti).
6 Dr Ir Achmad Fahrudin, MSi sebagai Pembimbing Akademik.
7 Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr
Majariana Krisanti, SPi MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang telah
memberikan arahan, masukan serta bimbingan dalam penulisan skripsi ini.
8 Dr Ali Mashar, SPi MSi selaku penguji luar komisi pembimbing dan Dr Ir
Niken Tunjung Murti Pratiwi, MSi selaku perwakilan Komisi Pendidikan
Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan.
9 Staf Tata Usaha Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan.
10 Agus A Hakim, SPi MSi dan Yuyun Qonita, SPi MSi sebagai pembimbing
laboratorium Biologi Molekuler yang telah memberikan arahan dan masukan.
11 Keluarga: Ibu Wardiah, Bapak Bardiarza, Dian A, Septian N yang telah
memberikan dukungan serta Doa.
12 Sahabat Terbaik: Muggy SM, Ditta AA, Fanisa M, Nurlia A, Budi N, Risna
RS, Nefi I, Agustiani PN, Rahmah S, Lisa M Br P, Yuli FN, Diah S, Endah
SR, Ulfanida R, MSP 49, MSP 50, dan MSP 48.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2016
Widy Triaprilyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix DAFTAR GAMBAR ix
DAFTAR TABEL x
PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Manfaat Penelitian 2
METODE 2 Waktu dan Lokasi 2
Prosedur penelitian 3 Analisis Data 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 5 Hasil 5 Pembahasan 8
KESIMPULAN DAN SARAN 10 Kesimpulan 10 Saran 10
DAFTAR PUSTAKA 10 RIWAYAT HIDUP 12
DAFTAR TABEL
Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada Panulirus homarus,
Panulirus penicillatus, Palinurus elephas (DQ062206.1), dan
Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise
distance 7
DAFTAR GAMBAR
1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus
(contoh 2) 5
2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan
P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2% 5
3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1%, marker 1
kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) 6 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan
dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap
1000 7
DAFTAR ISTILAH
BLASTn : (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pilihan
menu dari situs NCBI (National Center for Biotechnology
Information) yang digunakan untuk memastikan
kebenaran suatu spesies dan mengetahui kedekatan
dengan spesies lain.
Conserve : urutan basa nukleotida yang dipertahankan dalam jangka
waktu yang sangat panjang pada suatu spesies.
basa nukleotida yang bersifat tetap dari setiap spesies
dalam satu situs hasil pensejajaran.
DNA barcoding : sistem yang dirancang untuk melakukan identifikasi
secara cepat dan akurat berdasarkan urutan basa
nukleotida dari gen penanda pendek yang telah
terstandarisasi.
GenBank
:
situs NCBI yang memuat informasi dasar mengenai
bioteknologi (termasuk informasi dasar DNA).
Sekuensing
: Sebuah prosedur untuk menentukan urutan basa
nukleotida dalam contoh DNA yang berguna untuk
identifikasi.
Spesies kriptik
:
dua atau lebih spesies yang berbeda diklasifikasikan
dalam satu nama spesies akibat karakteristik morfologi
yang samar.
Singleton : satu basa nukleotida yang berbeda dari spesies lain dalam
satu situs hasil pensejajaran.
Variable : basa nukleotida yang berbeda dari setiap spesies dalam
satu situs dari hasil pensejajaran yang merupakan ciri
khusus spesies.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Udang barong (Spiny lobster) disebut juga udang karang karena hidup di
batu-batu karang dan dasar laut yang berpasir halus (Windyarto 2000). Udang
karang atau lobster merupakan salah satu komoditas yang memiliki nilai
ekonomis tinggi, baik untuk pasar dalam negeri maupun luar negeri. Daerah
penyebaran lobster meliputi daerah berbatu karang, pasir berbatu, karang halus,
dan tempat-tempat berbatu karang yang tidak jauh dari pantai, pulau, dan teluk
(Utami 1999). Lobster genus Panulirus yang terdapat di Indonesia ada tujuh
jenis, yaitu Panulirus versicolor (lobster bambu), Panulirus penicillatus (lobster
batu), Panulirus longipes (lobster batik), Panulirus homarus (lobster pasir),
Panulirus ornatus (lobster mutiara) (Windyarto 2000), Panulirus polyphagus
(lobster pakistan) (Moosa 1984), Panulirus femoristriga (lobster batik) (Chan dan
Ng 2001). Genus Panulirus memiliki keragaman paling besar dari famili
Palinuridae (Abdullah 2009).
Genus Panulirus telah lama menjadi objek menarik para peneliti dunia
disebabkan oleh tingginya keragaman spesies, daerah penyebaran yang luas, dan
juga nilai ekonominya yang tinggi (Junaidi et al. 2010). Penyebaran udang
karang di Indonesia banyak terdapat di perairan Selatan Pulau Jawa, Pulau
Sulawesi, Ambon dan Pulau Sumatera (Nawangwulan 2001). Daerah penghasil
lobster di Pulau Jawa yang potensial salah satunya adalah di perairan Selatan
Yogyakarta (Fauzi et al. 2013). Pada saat penangkapan dan pemanfaatan lobster
di daerah tersebut melibatkan nelayan setempat. Agar pemanfaatan sumberdaya
lobster di perairan ini tetap lestari maka perlu dilakukan pengelolaan yang rasional
dengan mempertimbangkan masukan dari aspek biologi.
Penelitian mengenai udang barong atau udang karang di Indonesia telah
banyak dilakukan meliputi hubungan panjang-berat (Fauzi et al. 2013), tingkat
pemanfaatan (Utami 1999), genetika molekuler (Abdullah 2009), dan ciri
morfologi (Yusnaini et al. 2009). Penelitian mengenai genus Panulirus belum
banyak dilakukan terutama mengenai keragaman genetik. Oleh karena itu
diperlukan metode yang akurat dalam mengidentifikasi spesies. Pengetahuan
dasar mengenai keragaman populasi genetik diperlukan sebagai acuan dalam
pengelolaan sumberdaya perikanan.
Salah satu teknik identifikasi molekuler yang populer yang dapat digunakan
adalah teknik DNA barcoding. Teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam
identifikasi suatu organisme mulai spesies hingga subspesies yang dilakukan
secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit untuk dibedakan secara
morfologi (Tudge 2000). DNA barcoding adalah suatu sistem yang dirancang
untuk identifikasi spesies secara cepat dan akurat sebagai penanda spesies (Hebert
et al. 2005). Sumber DNA pada hewan eukariot terbagi atas DNA inti dan DNA
mitokondria. Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) merupakan bagian dari
DNA mitokondria yang sering digunakan untuk barcoding spesies maupun
subspesies. Menurut Avise et al. (1987) menyatakan bahwa hubungan
kekerabatan dapat dianalisis secara filogenik menggunakan DNA mitokondria.
1
2
Perumusan Masalah
Indonesia memiliki potensi yang besar untuk mengembangkan udang
karang, namun pengembangan dan pemanfaatan genus Panulirus belum banyak
dilakukan di Indonesia. Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting
untuk kepastian taksonomi spesies. Kepastian taksonomi (taxonomy certainty)
sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan dan konservasi suatu
sumberdaya hayati. Pendekatan molekuler menjadi salah satu cara untuk
mengatasi masalah tersebut. DNA barcoding merupakan salah satu metode untuk
mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat, dengan menggunakan fragmen
sekuen nukleotida.
Salah satu habitat udang karang ditemukan di Yogyakarta yang terletak di
perairan Selatan Jawa. Penentuan klasifikasi genus Panulirus berdasarkan
karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena fenomena
spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh sebab itu,
teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan, diantaranya identifikasi
berdasarkan marka molekuler. Teknik identifikasi yang digunakan adalah teknik
DNA barcoding untuk mengetahui situs nukleotida spesifik yang menjadi
pembeda antarspesies di dalam genus Panulirus yang mendiami perairan Selatan
Yogyakarta. Penggunaan marka molekuler ini mampu mengungkap fenomena
spesies kriptik, sehingga pengelolaan sumberdaya genus Panulirus dapat
diterapkan dengan tepat.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus
berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat
membantu pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi
dasar dalam pengelolaan sumberdaya yang akurat.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kepastian
spesies dari genus Panulirus yang terdapat di perairan Selatan Yogyakarta
berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI).
METODE
Waktu dan Lokasi
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2015 hingga Februari 2016.
Pengambilan contoh dilakukan di perairan Selatan Yogyakarta dan analisis di
Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan
3
dan Laboratorium Terpadu Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut
Pertanian Bogor.
Prosedur Penelitian
Pengambilan contoh
Spesies contoh genus Panulirus adalah koleksi laboratorium yang diperoleh
dari pengumpul di perairan Selatan Yogyakarta. Spesies yang diperoleh sebanyak
lima spesies yaitu P. versicolor, P. penicillatus, P. longipes, P. homarus, dan P.
ornatus. Spesies tersebut telah diawetkan bagian daging atau otot kaki kemudian
dimasukkan ke dalam tabung koleksi berukuran 100 mL yang berisi alkohol 96%,
proses ini merupakan proses pengawetan dari lobster Panulirus spp. agar contoh
yang akan digunakan untuk proses selanjutnya tidak rusak.
Isolasi dan ekstraksi DNA
Isolasi dan ekstraksi DNA dilakukan terhadap daging dan otot kaki lobster
Panulirus spp. yang telah diawetkan dalam alkohol 96%. Spesies contoh yang
telah diawetkan tersebut ditimbang dengan berat otot 30 mg, dicuci menggunakan
akuades, dan divortex sebanyak 10 kali. Kemudian contoh dikeringkan dan
dimasukkan ke dalam microtube untuk selanjutnya dilakukan proses isolasi dan
ekstraksi DNA. Bahan isolasi dan ekstraksi DNA ini menggunakan kit komersil
(Gene Aid). Prosedur isolasi dan ekstraksi mengikuti instruksi dari manual pabrik
dengan beberapa modifikasi.
Uji kualitas DNA
Pengujian kualitas DNA dilakukan dengan metode elektroforesis
menggunakan gel agarosa 1,2% yang telah diwarnai dengan ethidium bromide
(EtBr), direndam dalam larutan buffer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA)
kemudian dialiri listrik 100 volt selama 30 menit. Penggunaan EtBr bertujuan
untuk memberikan warna pada DNA, sehingga pita DNA dapat terlihat saat
dilakukan visualisasi dibawah sinar UV. Volume DNA total yang digunakan
adalah sebanyak 2,5 μl. Gel agarosa kemudian diamati dibawah sinar UV. DNA
total dengan kualitas baik akan memiliki pita DNA yang tebal saat
divisualisasikan di bawah sinar UV.
Amplifikasi DNA dengan metode PCR
Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode PCR (Polymerase Chain
Reaction) menggunakan kit komersial Kapa Extra Hot Start. Fragmen DNA yang
diamplifikasi adalah gen COI. Primer yang digunakan adalah primer universal
yang didesain oleh Butet (2013, unpublish data) untuk beberapa biota akuatik.
Amplifikasi DNA dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu predenaturasi pada suhu
95 oC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 95
oC selama 1 menit, annealing pada
suhu 52 oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72
oC selama 1 menit, post-
elongasi pada suhu 72 oC selama 5 menit, dan penyimpanan pada suhu 15
oC
selama 10 menit.
4
Sekuensing DNA gen marka genetik COI Produk PCR yang memiliki kualitas DNA yang baik dapat dilanjutkan ke
tahap sekuensing atau pembacaan sekuens DNA untuk selanjutnya ditentukan
sekuen basa nukleotida. Proses produk PCR dilakukan dengan menggunakan
metode Sanger (1977) dengan mengirimkan produk PCR tersebut ke perusahaan
jasa pelayanan sekuensing.
Analisis Data
Validasi spesies
Hasil sekuensing data kromatogram berupa urutan basa nukleotida gen COI
pada genus Panulirus divalidasi menggunakan BLASTn (National Center for
Biotechnology Information) dan disejajarkan dengan spesies lain dari GenBank.
Identifikasi molekuler dari genus Panulirus dengan menggunakan sekuen gen
COI telah dipastikan kebenaran dan kedekatannya antarspesies berdasarkan
BLASTn.
Pensejajaran genus Panulirus gen COI lobster genus Panulirus
Hasil sekuensing diedit secara manual untuk mendapatkan urutan basa
nukleotida gen COI dari genus Panulirus. Urutan basa nukleotida genus
Panulirus kemudian akan disejajarkan dengan spesies lainnya menggunakan
metode Clustal W pada software MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Hasil sekuen
nukleotida gen COI genus Panulirus diedit dan dianalisis untuk mendapatkan
sekuen DNA dari gen COI tersebut.
Jarak genetik
Jarak genetik sekuen gen COI antarspesies Panulirus spp. dihitung
menggunakan metode pairwise distance yang terdapat pada program MEGA 5.2
(Tamura et al. 2011). Hasil Penghitungan jarak genetik disajikan dalam bentuk
matriks data yang digunakan untuk melakukan analisis hubungan kekerabatan
antarspesies berdasarkan pohon filogeni.
Analisis filogeni Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik antarspesies.
Konstruksi pohon filogeni berfungsi untuk mengetahui hubungan kekerabatan
antarspesies. Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode bootstrapped
Neighbour Joining Tree dengan 1000 kali pengulangan pada software MEGA 5.2
(Tamura et al. 2011).
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
DNA total
Isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus (Gambar 1)
merupakan contoh koleksi laboratorium yang berasal dari perairan Selatan
Yogyakarta. Hasil isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus
menghasilkan kualitas DNA yang cukup baik.
Contoh 1 Contoh 2
Gambar 1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus
(contoh 2)
Kualitas DNA yang baik dapat ditentukan melalui pengujian terhadap DNA
total pada agarosa 1,2%. Adanya pita DNA yang tebal dan terang merupakan
hasil kualitas DNA total yang baik (Gambar 2). Kualitas DNA total tersebut
diperoleh dari hasil isolasi dan ekstraksi DNA. DNA total yang memiliki kualitas
yang baik layak dijadikan sebagai cetakan amplifikasi gen COI dengan
menggunakan teknik PCR.
Gambar 2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan
P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2%
6
Amplifikasi DNA gen COI genus Panulirus Amplifikasi DNA gen COI dilakukan dengan menggunakan teknik PCR
dengan penempelan primer pada suhu optimum 54oC dan 53
oC. Panjang urutan
basa nukleotida gen COI dari hasil amplifikasi kedua contoh Panulirus tersebut
berukuran antara 500-750 pb (pasang basa) (Gambar 3). Produk PCR yang baik
dari ke 2 contoh DNA tersebut dimurnikan sehingga diperoleh kualitas yang baik
dan layak dijadikan sebagai cetakan dalam proses sekuensing untuk memperoleh
fragmen gen COI dari lobster genus Panulirus.
Gambar 3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1,2%, marker 1
kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2)
Sekuensing dan validasi DNA gen marka genetik COI genus Panulirus
Data urutan nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus dari hasil
sekuensing, dianalisis menggunakan program BLASTn (Basic Local Alignment
Search Tool-nucleotide) yang tersedia di GenBank. Sekuen nukleotida gen COI
P. homarus dan P. penicillatus diunggah pada BLASTn pada situs NCBI (National
Center for Biotechnology Information) untuk validasi dari kedua spesies tersebut
serta mengetahui kekerabatan kedua spesies tersebut dengan spesies lain.
Berdasarkan hasil sekuensing dalam fragmen gen COI, basa-basa nukleotida
gen COI tersebut disejajarkan dengan primer forward dan reverse menggunakan
program MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Diperoleh hasil panjang nukelotida
dari P. homarus dan P. penicillatus, yaitu masing-masing sebesar 658 pb dan 667
pb. Kedua sekuen nukleotida contoh tersebut disejajarkan dan didapatkan hasil
sepanjang 660 pb nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus.
Hasil analisis dari komposisi basa P. homarus dan P. penicillatus,
selanjutnya dilakukan pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies
dari famili Palinuridae pada genus yang berlainan, yaitu genus Palinurus. Urutan
basa gen COI Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus
(DQ062207.1) yang diperoleh dari GenBank, kemudian dijadikan sebagai
outgroup untuk analisis kekerabatan. Berdasarkan hasil analisis dari pensejajaran
basa nukleotida menghasilkan nilai conserve sebesar 35,58% (185/520), variabel
sebesar 64,43% (335/520), dan singleton sebesar 22,08% (120/520). Dari
informasi tersebut dapat diketahui bahwa nilai variabel terdapat variasi basa
nukleotida antara spesies ingroup, yaitu P. homarus dan P. penicillatus dengan
spesies outgroup, yaitu Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus
mauritanicus (DQ062207.1) yang merupakan pembeda dari masing-masing
spesies.
7
Jarak genetik dan analisis filogeni gen COI genus Panulirus
Penghitungan jarak genetik antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp.
menghasilkan nilai antara 0,759 dan 0,782. Nilai jarak genetik yang tinggi ini
menunjukkan kepastian pemisahan genus. Penghitungan jarak genetik
interspesies Panulirus spp. yang berasal dari perairan Selatan Yogyakarta
menunjukkan kekerabatan yang rendah dengan nilai jarak genetik sebesar 0,132
(13,2%) (Tabel 1). Menurut Hebert et al. (2003), jarak genetik melebihi 3%
menunjukkan spesies yang berbeda. Kemiripan morfologi berhasil dibuktikan
perbedaan spesies antara P. homarus dan P. penicillatus.
Tabel 1 Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada P. homarus (contoh 1), P.
penicillatus (contoh 2), Palinurus elephas (DQ062206.1), dan Palinurus
mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise distance
Panulirus
homarus
1
Panulirus
penicillatus
2
Palinurus
elephas
Palinurus
mauritanicus
Panulirus homarus 1 Panulirus penicillatus 2 0.132
Palinurus elephas 0.760 0.759
Palinurus mauritanicus 0.782 0.769 0.051
Hasil Penghitungan jarak genetik pada matriks tersebut kemudian dapat
dijadikan sebagai data untuk analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon
filogeni. Hasil analisis tersebut menunjukkan tingkat kekerabatan ingroup. Nilai
jarak genetik menjadi dasar untuk merekonstruksi pohon filogeni famili
Palinuridae (Gambar 4). Konstruksi pohon filogeni famili Palinuridae
menghasilkan DNA kelompok berbeda yang masing-masing mewakili genus
Panulirus dan Palinurus.
Gambar 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan
dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap
1000
Nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI genus Panulirus
Situs nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI P. homarus, P.
penicillatus dari genus Panulirus dilakukan melalui pensejajaran sekuen
nukleotida gen COI dengan spesies dari genus Palinurus. Setelah dilakukan
pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI antargenus dari famili Palinuridae,
didapatkan hasil sebesar 120 situs nukleotida spesifik yang menunjukkan adanya
perubahan spesifik pada genus Panulirus tersebut. Situs spesifik menunjukkan
Panulirus homarus
Panulirus penicillatus
Palinurus elephas (DQ062206.1)
Palinurus mauritanicus (DQ062207.1)
8
bahwa basa nukleotida dari genus Panulirus sebagai penciri yang dapat
membedakan dengan spesies dari genus Palinurus.
Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI P. homarus dan P. penicillatus dari
genus Panulirus didapatkan hasil dari situs mutasi sebesar 22 situs nukleotida.
Situs mutasi tersebut merupakan basa nukleotida dari spesies P. homarus dan P.
penicillatus yang mengalami perubahan delesi dan insersi. Situs mutasi yang
mengalami perubahan delesi terdiri dari 15 situs nukleotida, sedangkan situs yang
mengalami perubahan insersi terdiri dari 7 situs nukleotida.
Pembahasan
Identifikasi molekuler dari genus Panulirus, yaitu P. homarus dan P.
penicillatus menggunakan fragmen gen COI memberikan informasi mengenai
kepastian spesies dari genus Panulirus khususnya yang terdapat di perairan
Selatan Yogyakarta. Menurut FAO (1998), P. homarus memiliki panjang baku
maksimum 31 cm, panjang karapas 12 cm serta panjang total rata-rata antara 20-
25 cm, sedangkan P. penicillatus memiliki panjang baku maksimum 40 cm dan
panjang total rata-rata 30 cm. Spesies P. homarus dan P. penicillatus termasuk
dalam filum Arthropoda, kelas Malacostraca, ordo Decapoda, famili Palinuridae
dan genus Panulirus (Lovett 1881). Penentuan klasifikasi genus Panulirus
berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena
fenomena spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh
sebab itu, teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan.
Menurut Tudge (2000), teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam
identifikasi suatu organisme secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit
dibedakan secara morfologi. Kepastian kedua spesies ini diidentifikasi
berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) dengan spesies
P. homarus dan P. penicillatus menggunakan BLASTn pada situs NCBI dengan
masing-masing nilai sebesar 97% dan 99% yang terbukti sangat akurat bahwa
hasil identifikasi kedua contoh tersebut termasuk dalam satu genus, yaitu genus
Panulirus dalam famili Palinuridae (Hajibabaei et al. 2006). Hasil tersebut
menunjukkan bahwa lobster genus Panulirus khususnya P. homarus dan P.
penicillatus berbeda dengan spesies lobster lainnya.
Hubungan kekerabatan antarspesies di dalam famili Palinuridae dapat
dianalisis melalui pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI, menggunakan
program MEGA 5.2 melalui metode pairwise distance (Tamura et al. 2011).
Urutan basa nukleotida pada kedua spesies dari genus Panulirus disejajarkan
dengan spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus
(DQ062207.1) sebagai outgroup yang didapat dari GenBank. Menurut Maddison
(1984), adanya penggunaan outgroup bertujuan sebagai faktor koreksi dalam
penentuan suatu karakter diantara ingroup yang ada.
Hasil jarak genetik terbesar antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp.
adalah 0,782. Jarak genetik tersebut diperoleh antara P. homarus dengan
Palinurus mauritanicus (DQ062207.1). Menurut Hebert et al. (2003), perbedaan
jarak genetik antara P. homarus dengan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1)
dengan spesies lainnya yang dapat diperoleh dari GenBank sebesar 3% atau lebih
maka secara molekuler dipastikan bahwa P. homarus dan P. penicillatus berbeda
9
dari spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus
(DQ062207.1). Hal ini menunjukkan bahwa teknik molekuler mampu
mengidentifikasi perbedaan antara kedua spesies tersebut dengan spesies outgroup
diwakili oleh jarak genetik antara kedua spesies tersebut.
Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik. Konstruksi pohon
filogeni fragmen COI menunjukkan adanya pemisahan yang jelas antara genus
Panulirus dengan genus Palinurus. Rekonstruksi pohon filogeni digambarkan
berdasarkan adanya hubungan kekerabatan analisis filogeni dengan menggunakan
metode Neighborjoining. Pemisahan yang terjadi disebabkan masing-masing
spesies mempunyai situs nukleotida spesifik. Perbedaan urutan basa nukleotida
antarspesies yang menyebabkan jarak genetik antarspesies semakin besar,
sehingga hubungan kekerabatan antarkeduanya semakin jauh.
Situs nukleotida spesifik merupakan penciri yang membedakan spesies pada
genus Panulirus dengan spesies lainnya pada genus Palinurus. Situs nukleotida
spesifik menandakan adanya pembeda dari kedua contoh yang diteliti, yaitu P.
homarus dan P. penicillatus dengan spesies yang dibandingkan, yaitu Palinurus
elephas dan Palinurus mauritanicus. Situs nukleotida spesifik tersebut dapat
ditemukan sebanyak 120 situs spesifik yang berarti bahwa dengan adanya situs
tersebut juga terjadi mutasi yang spesifik terhadap genus Panulirus, sehingga
mampu membedakan antara genus Panulirus dengan genus Palinurus.
Situs nuklotida spesifik sebanyak 120 situs menjadi penciri pada kedua
spesies genus Panulirus tersebut. Pada level spesies, sekuen nukleotida pada gen
COI P. homarus dan P. penicillatus menunjukkan adanya urutan nukleotida yang
bersifat conserve. Sekuen nukleotida gen COI genus Panulirus mengalami delesi
dan insersi. Situs mutasi insersi adalah mutasi yang terjadi karena adanya
penambahan satu atau lebih basa nukleotida ke dalam urutan DNA, sedangkan
mutasi delesi adalah mutasi yang menjadi karena kehilangan satu atau lebih basa
nukleotida di dalam DNA. Mutasi menjadi penyebab utama perbedaan variasi
nukleotida pada gen COI, sehingga menyebabkan variasi pada susunan
nukleotida, variasi yang kecil dapat mempengaruhi keidentikan suatu spesies
(Sala dan Knowlton 2006). Hasil situs nukleotida mutasi terdapat 22 situs
nukleotida mutasi gen COI genus Panulirus. Terdapat 15 situs nukleotida delesi
dan 7 situs nukleotida insersi.
Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting untuk kepastian
taksonomi suatu spesies yang sangat diperlukan dalam pengelolaan dan
konservasi sumberdaya hayati. Penentuan klasifikasi genus Panulirus
berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena
fenomena spesies kriptik yang sering terjadi pada biota perairan (Bickford et al.
2006). DNA barcoding merupakan salah satu metode yang akurat dan cepat
untuk mengidentifikasi spesies dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida.
Penelitian ini berhasil mengidentifikasi spesies P. homarus dan P.
penicillatus dengan akurat, diharapkan permasalahan pengelolaan yang kurang
tepat (mismanagement) yang bersumber dari kesalahan identifikasi spesies dari
genus Panulirus dapat dihindarkan. Pada umumnya kesalahan dalam pengelolaan
suatu stok atau spesies bersumber dari ketidakpastian spesies, karena fenomena
spesies kriptik dan kompleks menjadi permasalahan utama dalam identifikasi
biota perairan.
10
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Marka gen COI mampu membedakan spesies P.homarus dan P. penicillatus
secara akurat, sehingga permasalahan fenomena spesies kriptik dapat diatasi
secara molekuler. Adanya kepastian status taksonomi ini, maka pengelolaan
kedua spesies dari genus Panulirus dapat dibedakan.
Saran
Informasi molekuler dari marka gen selain COI dapat diperoleh lebih lanjut
untuk mendukung pengelolaan sumberdaya lobster, selain itu perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut mengenai kajian aspek biologi lobster seperti reproduksi,
dinamika populasi, dan lain-lain di perairan Selatan Yogyakarta sehingga
diperoleh informasi lebih lengkap mengenai kepastian lobster genus Panulirus.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah MF. 2009. Molecular Genetic Relationship of The Spiny Lobster
Genus Panulirus In Pacific And Indian Oceans Using RAPD Method.
[skripsi]. Bogor (ID): Bogor Agricultural University.
Avise JC, Arnold J, Ball AM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA,
Saunders NC. 1987. Intraspecific Phylogeography: The Mitochondrial
DNA Bridges I Between Population Genetics and Systematics. Ann. Rev.
Ecol. Syst. 18:489-522.
Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, Ng PKL, Meier R, Winker K, Ingram KK,
Das I. 2006. Cryptic species as a window on diversity and conservation.
Ecology and Evolution. 22(3):148-155.
Chan TY dan Ng PKL. 2001. On The Momenculture of The Commercially
Important Spiny Lobster Panulirus longipes femoristriga (Von Martens,
1872), P. bispinosus Borradaile, 1899, and P. albiflagellum Chan & Chu,
1996 (Decapoda, Palinuridae). Koninklijke Bril NV Leiden. Crustaceana
74(1): 123-127.
FAO. 1998. The Living Marine Resources of The Western Central Pacific
:Volume 2. Cephalopods, Crustaceans, Holothurians And Sharks.
Carpenter KE, Niem VH, editor. Rome (IT): FAO.
Fauzi M, Prasetyo AP, Hargiyatno IT, Satria F, Utama AA. 2013. Hubungan
Panjang-Berat Dan Faktor Kondisi Lobster Batu (Panulirus Penicillatus)
Di Perairan Selatan Gunung Kidul Dan Pacitan. Bawal. 5(2): 97-102.
Hajibabaei M, Smith MA, Janzen DH, Rodriguez JJ, Whitfield JB, Hebert PDN.
2006. A Minimalist Barcode Can Identify A Specimen Whose DNA Is
Degraded. J Compilation Blackwell Publishing. 6: 959-964.
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, DeWaard JR. 2003. Biological
Identifications Through DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society
of London Series B, Biological Sciences. 270: 313- 321.
11
Hebert PDN dan Gregory TR. 2005. The Promise of DNA Barcoding for
Taxonomy. Syst. Biol. 54(5): 852-859.
Junaidi M, Cokrowati N, Abidin Z. 2010. Aspek Reproduksi Lobster (Panulirus
sp.) di Perairan Teluk Ekas Pulau Lombok. Kelautan. 3(1):29-36.
Lovett DL. 1981. A Guide to The Shrimps, Prawns, Lobster and Crabs of
Malaysia And Singapore, Faculty of Fisheries And Marine Science.
Universiti Pertanian Malaysia. Malaysia.
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup Analysis And
Parsimony. Syst Zool. 33:83-103.
Moosa MK. 1984. Udang karang (Panulirus Spp.) Dari Perairan Indonesia.
Lembaga Oseanologi Nasional, LIPI, Jakarta : 40 p.
Nawangwulan S. 2001. Analisis Sistem Penangkapan Lobster (Panulirus Sp.) Di
Perairan Pengandaran Kabupaten Ciamis Jawa Barat [Skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Sala E dan Knowlton N. 2006. Global Marine Biodiversity Trends. Annu Review
of Environment and Resources. 31:93-122.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA Sequencing with
Chainterminating Inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 74: 5463-5467.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2011. Mega 5: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,
and Maximum Parsimony Methods. J Mol Biol Evol. 28(10):2731–2739.
Tudge C. 2000. The Variety of Life. New York (US): Oxford University Press.
Utami DDY. 1999. Analisis Sumberdaya dan Tingkat Pemanfaatan Lobster
(Panulirus Sp.) yang didaratkan di Pangandaran, Ciamis, Jawa Barat.
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Windyarto A. 2000. Studi Tentang Perikanan Udang Karang (Spiny Lobster,
Panulirus Spp) di Daerah Pameungpeuk Kabupaten Garut, Jawa Barat.
[skipsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Yusnaini, Nessa MN, Djawad MI, Trijuno DD. 2009. Ciri Morfologi Jenis
Kelamin dan Kedewasaanlobster Mutiara (Panulirus ornatus) Sex
Morphologycal Characteristics and Maturity of The Ornated Lobster
Panulirus ornatus. Torani. 19 (3): 166– 174.
12
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Widy Triaprilyanti, lahir di
Lampung Barat, 17 April 1994, merupakan anak ketiga dari
tiga bersaudara dari ibu bernama Wardiah dan ayah
Bardiarza. Penulis mulai mengikuti pendidikan sekolah
dasar di SDN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2006.
Melanjutkan di SMPN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2009
serta dilanjutkan di SMAN 1 Liwa dan lulus pada tahun
2012. Penulis lulus seleksi menjadi mahasiswa di Institut
Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Nasional Masuk
Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Undangan pada tahun 2012 sebagai
mahasiswa Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Kegiatan di luar akademik, Penulis
aktif dalam organisasi seni khususnya dalam bidang seni Tari Kreasi Tradisional
dan dalam bidang Olahraga. Selain mengikuti perkuliahan, Penulis
berkesempatan menjadi asisten mata Kuliah Biologi Populasi Ikan (2014/2015).
Penulis juga aktif berpartisipasi dalam berbagai kepanitiaan di lingkungan kampus
IPB.