TUGAS BIOLOGI MOLEKULER

22
BIOLOGI MOLEKULER ISOLASI DNA MEGA YULIA KURNIASARI 09700168 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS WIJAYA KUSUMA

description

tes

Transcript of TUGAS BIOLOGI MOLEKULER

BIOLOGI MOLEKULER

ISOLASI DNA

MEGA YULIA KURNIASARI 09700168FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS WIJAYA KUSUMA

Tahun Akademik 2010 - 2011

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur saya persembahakan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah yang diberikan sehingga kami dapat menyusun sebuah makalah yang berjudul ISOLASI DNAIsi dari makalah ini ditulis dengan menggunakan bahasa yang mudah dimengerti oleh pembaca dan lebih menekankan pada permasalahan-permasalahan yang terjadi dalam kehidupan sehari-hari. Dan juga makalah ini disusun secara sistematis sehingga tidak membingungkan.Untuk itu, saya mengucapkan terima kasih kepada H M Loegito sebagai dosen biologi molekuler yang telah membimbing saya dalam menyelesaikan makalah ini. Tak lupa juga saya mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang membantu saya selama menyelesaikannya.Ibarat, tiada gading yang tak retak maka, makalah ini pun masih jauh dari kesempurnaan. Untuk, saya mengharapkan saran dan kritik yang membangun demi penyempurnaan makalah ini selanjutnya.Akhir kata saya ucapkan selamat membaca dan semoga makalah ini akan menambah pengetahuan para pembaca.Surabaya, 21 Maret 2011 PenyusunBAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Biologi molekuler adalah bidang ilmu yang mempelajari tentang semua proses kehidupan didalam sel pada tingkat molekul serta fungsinya dalam kehidupan. Perkembangan dalam bidang biologi molekuler sangat berkembang pesat, termasuk dalam tekhnologi dasar. Beberapa contoh dari perkembangan teknologi dasar biologi molekuler antara lain : DNA sequencing, pendeteksian fragmen DNA dengan PCR, dan termasuk isolasi DNA.

Isolasi DNA merupakan tahap penting dalam melakukan berbagai penelitian. Metode isolasi DNA ini perlu memperhatikan jenis organisme yang akan diisolasi DNA-nya, sebab komposisi dan struktur sel dari setiap organism berbeda beda. Pada dasarnya metode isolasi DNA adalah memecahkan sel, kemudian memisahkan DNA dari komponen komponen protein, RNAs, lemak, karbohidrat, dan fragmen fragmen lain dari sel yang telah rusak.1.2. Tujuan

Tujuan dari makalah ini antara lain :

1. Untuk mengetahui pengertian dari isolasi DNA.2. Untuk mengetahui cara cara melakukan isolasi DNA.3. Untuk mengetahui beberapa macam kit untuk isolasi DNA.4. Untuk mengetahui kesesuaian antara teori dengan penelitian tentang isolasi DNA pada contoh jurnal yang diambil.1.3. Rumusan Masalah

1. Apakah pengertian dari isolasi DNA ?2. Bagaimana cara cara atau metode dalam isolasi DNA ?

3. Apa saja macam macam kit untuk isolasi DNA ?4. Bagaimana kesimpulan dari pembahasan contoh jurnal isolasi DNA?BAB IIPEMBAHASAN

2.1. DNA dan Protein

DNA (deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribosa nukleat (ADN) merupakan tempat penyimpanan informasi genetic. Menurut Klug dan Cummings 1994, DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetic dan berfungsi sebagai pengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat dalam nucleus, mitokondria dan kloroplas. DNA juga dapat diartikan sebagai material khas kromosom yang tidak terdapat pada bagian lain atau pada bagian lain yang tidak terdapat konsentarsi yang cukup untuk dapat memperlihatkan warna (Robert Feulgen). DNA juga merupakan serangkaian molekul tersusun dari basa purin (adenine dan guanine) dan pirimidin (timine dan cytosine) serta gula dan phosphate sebagai bahan dasar penyusun gen.

Struktur DNA Pada tahun 1953, Frances Crick dan James Watson menemukan model molekul DNA sebagai suatu struktur heliks beruntai ganda atau yang lebih dikenal dengan heliks ganda Watson Crick. DNA merupakan makromolekul polinukleotida yang tersusun atas polimer nukleotida yang berulang ulang, tersusun rangkap, membentuk DNA haliks ganda dan berpilin ke kanan. Setiap nukleotida terdiri atas tiga gugus molekul yaitu: 1. Gula 5 karbon (2-deoksiribosa).

2. Basa nitrogen yang terdiri golongan purin yaitu adenin (Adenin = A) dan guanin (guanini = G),serta golongan pirimidin, yaitu sitosin (cytosine = C) dan timin (thymine = T).

3. Gugus fosfat.

Gambar 2 Struktur doubel helix DNA (Watson and Cricks, 1953) DNA Sebagai Materi Genetik .

DNA mempunyai peran penting dalam transformasi materi genetik, istilahtransformasi awalnya digunakan untuk menjelaskan kejadian perubahan genetik darisel bakteri akibat adanya benda asing yang masuk atau diambil oleh bakteri tersebut.Namum dengan ditemukannya bahwa benda asing tersebut adalah DNA pengertiantransformasi disini adalah proses pengambilan DNA asing oleh suatu sel yangmengambilnya melalui proses rekombinasi. Beberapa pembuktian yang menjelaskanmasalah tersebut adalah sebagai berikut :

1. F. Griffith (1928):

2. Noncapsulated pneumococci (non pathogen).

3. Capsulated pneumococci: pathogen, mematikan mencit.

4. Noncapsulated pneumococci (hidup) + capsulated pneumococci yang telah mati mematikan mencit.

5. Ada transforming factor.

DNA merupakan Senyawa Khas Kromosom

Pembuktian pertama dilakukan dengan cara pewarnaan kromosom dalam studi mikroskopik. Seorang ahli kimia dari Jerman Robert Feulgen, telah menunjukan bahwa bila DNA dipanaskan dengan asam fuchsin akan timbul warna merah tua yang mengikat. Percobaan tersebut dilaksanankan di dalam tabung reaksi dan sepuluh tahun kemudian hasil penemuan Feulgen diterapkan pada sel hidup. Ternyata perlakuan itu tidak merusak sel atau jaringan, kromosom muncul dengan warna yang jelas dan bagian selnya tidak berwarna. Kekhasan DNA pada kromosom yang sebelumnya telah diakui sebagai organel. Mendorong orang untuk menyimpulkan bahwa DNA merupakan bahan dasar penyusun gen.

Replikasi DNA

Replikasi adalah peristiwa sintesis DNA.Saat suatu sel membelah secara mitosis, tiap-tiap sel hasila pembelahan mengandung DNA penuh dan identik seperti induknya.Dengan demikian, DNA harus secara tepat direplikasi sebelum pembelahan dimulai.Replikasi DNA dapat terjadi dengan adanya sintesis rantai nukleotida baru dari rantai nukleotida 1. Model konservatif yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai yang berfungsi sebagai cetakan untuk dua rantai DNA baru.

2. Model semikonservatif yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai baru disintesis dengan prinsip komplementasi pada masing masing rantai DNA lama tersebut.

3. Model dispertif yaitu beberapa bagian dari kedua rantai DNA lama digunakan sebagai cetakan untuk sintesis rantai DNA baru.

Proses komplementasi pasangan basa menghasilkan suatu molekul DNA baru yang sama dengan molekul DNA lama sebagai cetakan.Kemungkinan terjadinya replikasi dapat melalui tiga model.

Dari ketiga model replikasi tersebut, model semikonservatif merupakan model yang tepat untuk proses replikasi DNA.Replikasi DNA semikonservatif ini berlaku bagi organisme prokariot maupun eukariot.Perbedaan replikasi antara organisme prokariot dengan eukariot adalah dalam hal jenis dan jumlah enzim yang terlibat, serta kecepatan dan kompleksitas replkasi DNA.Pada organisme eukariot, peristiwa replikasi terjadi sebelum pembelahan mitosis, tepatnya pada fase sintsis dalam siklus pembelahan sel.

2.2. Isolasi DNA

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.) (Kimball 2005: 8; Kent & Carr 2001: 317)

Fungsi dan peranan DNA adalah untuk menentukan sifat sifat organisme. Timbul pertanyaan bagaimana caranya DNA dapat berperan dalam proses kehidupan?. Dalam sel DNA berperan dengan cara mengandilkan proses pembentukan rantai protein. Protein merupakan salah satu senyawa penting dalam kehidupan organisme. Protein terdapat dalam berbagai bentuk seperti enzim, protein pengangkut, protein cadangan, antibody, hormone dan sebagainya.

Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Ada sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain: Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern

Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.

Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,

Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut: Kemurnian

Panjang DNA

Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim

Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung 2.3. Prosedure isolasi DNA

Berikut prosedur dalam isolasi DNA pada sel eukariotik :

1. Melarutkan membrane plasma dan membrane nucleus dengan menggunakan detergen (sodium dodecyl sulfate (SDS), triton X-100, dan tween).2. Setelah membrane dilarutkan akan dihasilkan cell lysate (yang berupa bahan bahan dari sitoplasma dan bahan dari nucleus, bahan bahan dari organela, dan kromosom). Untuk menghilangkan protein, ditambahkan enzim protease (Protease K).

3. Larutkan diencerkan, cell lysate dilarutkan dengan pelarut organic (misalnya campuran antara phenol dan chloroform) untuk menghilangkan protein dan komponen sel yang telah rusak, sehingga DNA didalam larutan encer phenol dan kloroform.

4. Ditambahkan ethanol absolute, sehingga DNA akan terlarut didalamnya dan akan berada didaerah supernatant larutan.

5. DNA dalam benang panjang, tipis, dan putih, dapat dipisahkan dari larutan dalam bentuk kumparan dengan menggunakan stik dari kaca.

6. Kumparan benang DNA pada stik kaca dikeringkan, kemudian dimasukkan dalam larutan encer, yang dapat digunakan untuk berbagai perlakuan.

2.4. Beberapa macam kit pada isolasi DNA

GeneMAG-RNA / DNA

The geneMAG-RNA / DNA kit is a novel, simple and highly efficient tool for the isolation of total RNA / DNA with magnetic silica beads.

Simple washing steps with two different buffers remove salts, metabolites and macromolecular cellular components. Pure RNA / DNA is finally eluted under low ionic strength conditions with RNase-free water.

KitsNumber ofisolationsPriceEURO/US$

geneMAG-RNA/DNA 15(Cat. No.: 3401-15)

geneMAG-RNA/DNA 100(Cat. No.: 3401-100)

geneMAG-RNA/DNA 500(Cat. No.: 3401-500)15 preps from1.5 ml of E. coli

100 preps from1.5 ml of E. coli

500 preps from1.5 ml of E. coli40 / 52

220 / 286

900 / 1170

Total RNA/DNA was isolated from 1.5ml E. coli LB culture using geneMAG-RNA/DNA.(Data kindly provided by Cengiz ztrk, Charit, University Hospital of Humboldt-University to Berlin, Germany)

SPECIAL OFFER:Cat. No.:PriceEURO/US$

MagnetoPUREgeneMAG-RNA/DNA 15 3401-SO65 / 85

BAB III

RINGKASAN JURNALEkstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses lisis (Subandiyah 2006). Penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukkan oleh pita DNA genom (Gambar2). Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman jeruk dan pepaya. Produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan image gel elektroforesis. Setelah proses elektroforesis DNA genom dan dihasilkan pita DNA yang berkualitas dilanjutkan proses PCR, yaitu metode in vitro yang secara cepat dapat melipatgandakan sekuen-sekuen DNA target yang ada di dalam DNA sumber.

Produk-produk PCR akan menjadi DNA awal. Sekitar 105 kopi dari sekuen DNA target dengan mudah dapat divisualisasikan sebagai pita diskret dengan ukuran spesifik ketika diseparasi pada elektroforesis gel agarose (Tridjatmiko 2006). Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan

secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Tabel 1, Subandiyah 2006). Penggunaan primer RAPD1 dan RAPD6 dengan kandungan G+C 70% menghasilkan pita DNA yang baik. Hal ini karena suhu pada saat denaturasi sudah sesuai, yaitu 95C selama 1 menit. Menurut Subandiyah (2006), PCR sering gagal karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95C selama 30 detik atau 97C selama 15 detik. Namun untuk DNA yang mengandung G+C tinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi diperpanjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak terlalu tinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang umumnya mempunyai waktu paruh 40 menit pada 95C. Pola pita DNA tanaman jeruk yang dihasilkan dari ekstraksi menggunakan nitrogen cair disajikan pada Gambar 3, sedangkan hasil ekstraksi DNA tanaman jeruk dan papaya dengan menggunakan bufer yang berisi 2% CTAB, 1 M NaCl, 1% -mercaptoetanol, dan 1% PVP 10 masing-masing disajikan pada Gambar 4 dan 5. Bila ketiga gambar tersebut dibandingkan maka pola pita DNA yang dihasilkan memiliki ketebalan yang sama. Dengan demikian, bufer CTAB cukup memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA dari tanaman yang mengandung karbohidrat dan fenol tinggi karena tidak merusak DNA. Bufer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel (Porebski et al. 1997; Surzycki 2000), sedangkan PVP dapat mengurangi broning akibat kandungan fenol pada daun muda (Porebski et al. 1997).KESIMPULAN

Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan nitrogen cair lebih memudahkan proses ekstraksi, namun ekstraksi dengan bufer CTAB ditambah 0,2% -mercaptoetanol dan PVP mampu mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer ini tidak memerlukan nitrogen cair dan menghasilkan DNA genom yang cukup baik. Ekstraksi tanpa nitrogen cair lebih efisien, terutama bagi laboratorium yang sulit mendapatkan nitrogen cair.