Post on 08-Feb-2016
description
BAB 3. METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah True Experimental Laboratories
(Pratiknya, 2008). Penelitian ini menggunakan desain Posttest-Only Control
Design. Jenis penelitian ini yaitu kelompok penelitian menggunakan pengambilan
sampel secara random, setelah kelompok perlakuan dilakukan intervensi dan
kelompok kontrol tidak, baru dilakukan post test atau pengukuran untuk
membandingkan setiap kelompok (Hidayat, 2010).
3.2 Rancangan Penelitian
Skema rancangan penelitian (Gambar 3.1)
Keterangan :
N : Populasi
S : Sampel
P1-6 : Kelompok Perlakuan 1-6
K1 : Kelompok Kontrol
X1-6 : Perlakuan disalut OMP konsentrasi a, b, c, d, e, f
X7 : Tanpa disalut hemaglutinin OMP
DP1-6 : Data Perlakuan Kelompok 1, 2, 3, 4, 5, 6
DK1 : Data Kelompok Kontrol
3.3 Populasi, Sampel dan Jumlah Sampel
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit galur xx,
berat badan antara 100-200 gram, umur antara 2 - 2,5 bulan yang diperoleh dari
Laboratorium Biomedik Fakultas Farmasi Universitas Jember. Sedangkan sampel
yang digunakan dalam penelitian ini adalah enterosit mencit galur xx sejumlah
300μl untuk setiap kelompok perlakuan dan kontrol.
3.4 Tempat dan Waktu Penelitian
3.4.1 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Jember.
3.4.2 Waktu Penelitian
Penelitian dimulai pada bulan Mei 2013sampai bulan ……………..
3.5 Variabel Penelitian
3.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah Outer Membrane Protein S.
pneumoniae y kDa
3.5.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah jumlah protein adhesin yang
melekat pada enterosit mencit galur xx.
3.5.3 Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah enterosit mencit galur xx.
3.6 Definisi Operasional
3.6.1 Outer Membrane Protein/ OMP
OMP adalah lapisan protein yang terletak pada outer membrane S.
pneumoniae. OMP berperan dalam proses adhesi perlekatan.
3.6.2 Protein Adhesin
Protein adhesin adalah protein yang terdapat pada OMP S. pneumoniae
yang terlibat proses perlekatan (adhesi) pada sel host. Protein adhesin diketahui
dengan menghitung indeks adhesi yaitu jumlah rata-rata perlekatan bakteri pada
100 enterosit mencit galur xx yang dihitung dengan tiga kali pengulangan.
3.7 Alat dan Bahan
3.7.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave,
incubator, micro pipet, vortex, tabung reaksi, tabung ependolf, shaking waterbath,
beaker glass, lemari es, omnimixer, plate, sentrifuge, botol kaca 250 cc, neraca
ohaus elektrik, alat elektroforesis untuk SDS-PAGE, spatula, object glass, deck
glass, mikroskop, alat elektroforesis frontal apparatus aliran 50 volt, mikroplate
V, pembakar Bunsen, penjepit, kompor listrik, dan ose bulat.
3.7.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri S.
pneumoniae, TCG Agar, Brain Heart Infusion (BHI) broth, SDS-PAGE
(Acrylamid gel 30%, main gel buffer, running buffer, reducing sample buffer,
Sodium Deodecyl Sulphate/ SDS (staining solution, destaining solution)), reagen
isolasi enterosit tikus yakni Phospat Buffer Saline (PBS) pH 7.4, larutan PBS
yang mengandung Dithiothretiol, dan larutan PBS yang mengandung
Dithiothretiol dan EDTA, aquadest, dan TCA.
3.8 Prosedur Penelitian
3.8.1 Subkultur Pneumococcus
Bakteri yang akan digunakan adalah Pneumococcus galur local yang
berasal dari sputum pasien pneumoniae. Metode yang digunakan menurut Ehara
(1992), yaitu media TCG yang memperkaya pertumbuhan pili Pneumococcus.
Media ini mengandung 0,02% thioproline, 0,3% NaHCO3, 0,15% bactotrytone,
0,2% yeast extract, 0,5% NaCl, 2% bacto agar dan 1 mm EDTA. Media agar
dibuat dalam botol kapasitas 250cc secara miring sebanyak 50 ml agar.
Pneumococcus yang dipilih ditanam pada media Brain Heart Infusion (BHI) yang
diinduksi pada suhu 37ºC selama 4 jam. Kemudian suspense bakteri sebanyak 10
ml dimasukkan ke setiap botol yang mengandung media TCG. Selanjutnya
dilakukan inkubasi pada suhu 37ºC selama 2x24 jam.
3.8.2 Isolasi Outer Membrane Protein Pneumococcus
Sebelum mengisolasi OMP dilakukan pencukuran pili dari S.
pneumoniae. Hasil koleksi bakteri ditambahkan Tri Chlor Acetat (TCA) dan
Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai konsentrasi 3% dan dikocok rata, hasilnya
diletakkan pada suhu kamar selama 1 jam dan tiap 15 menit dikocok. Koleksi
bakteri tadi dimasukkan ke dalam 16 botol bervolume 14 ml disentrifugasi 6000
rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC.
Pelet diambil dan diresuspensi dengan cairan PBS pH 7,4 dengan
perbandingan 1:10. Bakteri dicukur dengan menggunakan mixer sendiri pada suhu
4ºC dengan kecepatan penuh selama 30 menit, diulang sampai 5 kali dengan
waktu istirahat 1 menit.
Hasilnya dilakukan sentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 6000
rpm, suhu 4ºC, pili yang terletak di bagian atas diambil dan diberi label pili 1.
Endapan diresuspensi dengan larutan PBS pH 7,4 menggunakan cara yang sama
seperti diatas dan dikumpulkan dengan cara mencukur ulang sampai beberapa
kali, hingga dihasilkan supernatan yang memiliki warna mendekati warna PBS
dan menunjukkan tes aglutinasi negatif.
Isolasi OMP S. pneumoniae dilakukan dengan modifikasi Evans
(Suswati, et al., 2010). Modifikasi pada bagian sampel yang digunakan yaitu
bagian endapan terakhir dari perlakuan pencukuran pili. Pelet diresuspensi dengan
PBS pH 7,4 sampai 15 kali, kemudian ditambahkan n-octyl B-D-glucopyramide
(NOG) konsentrasi mencapai 0,5%. Dilakukan homogenisasi dengan vortex
kecepatan penuh selama 1 menit.
Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm dengan
suhu 4 °C selama 30 menit. Cairan supernatan diambil dan dilakukan dialisis .
Cairan dialysis pada 24 jam pertama digunakan H2O dan pada 24 jam kedua
dipakai PBS pH 7,4, perlakuan dilakukan sampai 6 kali.
3.8.3 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE)
Monitoring berat molekul dikerjakan menggunakan SDS-PAGE (Smeds
et al, 2001). Sampel protein dipanaskan 100ºC selama 5 menit dalam larutan
penyangga yang mengandung 5mm Tris HCl pH 6,8, 2-mercapto ethanol 5%, w/v
sodium dodecyl sulfate 2,5%, v/v gliserol 10% dengan warna pelacak bromphenol
blue. Dipilih mini slab gel 12,5% dengan tracking gel 4%. Voltase yang
digunakan 125mV. Bahan yang digunakan adalah coomasive brilliant blue dan
molekul standar sigma low range marker.
3.8.4 Pemurnian Protein
Metode yang dilakukan seperti yang telah dikerjakan oleh Ehara dengan
modifikasi (Mufida, et al., 2009). Hasil SDS-PAGE, gelnya dipotong lurus pada
bobot molekul yang diinginkan dan potongan pita tersebut dikumpulkan dan
dimasukkan dalam membran dialisa memakai cairan penyangga elektroforesis
frontal apparatus, aliran 125 mV selama 25 menit. Hasil elektroforesis dilakukan
dialisis dengan cairan penyangga PBS pH 7,4 selama 2x24 jam masing-masing
sebanyak 1 liter dan diganti 2 kali. Cairan dialisat tersebut dilakukan uji
hemaglutinasi.
3.8.5 Uji Hambat Hemaglutinasi
Uji hemaglutinasi dikerjakan menurut petunjuk dari Li (Suswati, et al.,
2010). Pengenceran sampel dibuat konsentrasi ½ pada microplate V, dimana tiap
sumur diberi cairan PBS bervolume 50 µl. Kolom yang digunakan yaitu kolom 1-
10 dan 12 (kolom 11 dikosongi) sementara baris yang digunakan yaitu baris A
(hanya 1 baris). Pada kolom 1 baris A diisi dengan hasil pemurnian fraksi protein
OMP sebanyak 50 µl, dihomogenkan dengan pipet sebanyak 17 kali, lalu 50 µl
dipindahkan ke kolom 2 baris A. Cairan dihomogenkan dengan pipet lagi, dan
seterusnya proses diulang sampai kolom 10 baris A, hingga terkahir diambil
cairan sebanyak 50 µl dari kolom 10 baris A untuk dibuang. Tiap sumur
ditambahkan suspensi darah merah mencit konsentrasi 0,5% volume sama dan
diletakkan dalam suhu kamar selama 1 jam. Besarnya titer ditentukan dengan
pengamatan adanya aglutinasi darah merah pada pengenceran yang terendah.
3.8.6 Isolasi Sel Enterosit Mencit
Isolasi enterosit dilakukan menurut metode Weisser (Suswati, et al.,
2010). Mencit galur balb/c dianastesi dengan menggunakan kloroform, kemudian
bagiandiambil bagian ususnya untuk dipotong secara longitudinal dengan panjang
5 cm. Usus halus dicuci dengan PBS pH 7,4 yang mengandung 1 mM
dithiothretiol pada suhu 4 oC sampai tampak bersih. Usus mencit galur balb/c
dimasukkan dalam cairan yang mengandung 1,5 mM KCl, 9,6 mM NaCl, 27 mM
Na Citrat, 8 mM KH2SO4 dan 5,6 mM Na2SO4 dengan pH 7,4, selanjutnya
jaringan dinkubasi pada shaking incubator selama 15 menit, dengan suhu 37oC.
Supernatan dibuang dan jaringan dipindahkan dalam cairan yang mengandung 1.5
mM EDTA dan 0.5 mM dithiothretiol.
Jaringan yang berada dalam cairan yang mengandung EDTA dan
dithiothretiol disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan penuh, kemudian
supernatant dibuang. Jaringan dicuci dengan menggunakan PBS dan
disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 1000 rpm, dan diulang selama 3
kali. Enterosit diisolasi
3.8.7 Uji Adhesi
Uji adhesi dilakukan menurut modifikasi Nagayama (Mufida et al.,
2009). Proses uji adhesi dimulai dengan membiakkan bakteri S. pneumoniae
dalam nutrient broth pada suhu 37 oC pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi
selama 4 jam. Bakteri dipanen melalui proses sentrifugasi 6000 rpm selama 10
menit pada suhu 4ºC. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan cairan PBS 1
ml lalu proses sentrifugasi diulang sampai 3 kali. Pelet diresuspensi dengan cairan
PBS sampai warnanya setara standar Mc Farland (108 bakteri/mm3).
Pembuatan kelompok kontrol, suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ml,
lalu dihomogenkan dengan 1 ml enterosit mencit galur balb/c, dan diinkubasi
shaking waterbath dengan goyangan pelan selama 30 menit pada suhu 37 ºC.
Campuran bakteri dan enterosit mencit tersebut disentrifugasi 1000 rpm selama 5
menit.
Supernatan dibuang, pelet ditambah cairan PBS 200 µl, lalu proses
sentrifugasi diulang sampai 2 kali. Pelet diambil dan diresuspensikan dengan 50
µl cairan PBS. Suspensi diambil dengan mikropipet sebanyak 10 µl, diletakkan di
atas obyek glass, difiksasi di atas api bunsen. Preparat dicat menggunakan
pengecatan gram lalu diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui indeks
adhesi S. pneumoniae pada enterosit mencit galur balb/c (Suswati dan Mufida,
2010).
Kelompok perlakuan dibuat dengan pengenceran protein OMP S.
pneumoniae. Tahap pertama dilakukan preparasi konsentrasi protein pada tabung
ependof untuk membuat protein OMP dengan konsentrasi 1, ½, ¼, 1/8, 1/16, dan
1/32. Selanjutnya setiap dosis ditambahkan suspensi enterosit sebanyak 300 µl
kemudian digoyang pada shaking inkubator pada suhu 37 ºC selama 30 menit.
Kemudian dalam setiap campuran tersebut ditambahkan suspensi bakteri
sebanyak 300 µl yang diperoleh dari kultur S. pneumoniae. Campuran diinkubasi
dengan shaking inkubator selama 30 menit pada suhu 37ºC. Selanjutnya
disentrifugasi 1500 rpm pada suhu 4ºC selama 3 menit, kemudian supernatan
dibuang dan diganti dengan PBS kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi
dengan kecepatan yang sama. Kemudian sentrifugasi diulang sekali lagi dengan
mengganti supernatan dengan larutan PBS.
Setelah itu endapan diambil dan dibuat hapusan pada gelas objek dan
dilakukan pewarnaan gram. Preparat siap diamati dengan menggunakan
mikroskop pembesaran 1000 kali.
3.8.8 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram dilakukan dengan cara mengambil endapan sejumlah 20
µl dari setiap tabung ependof kelompok kontrol dan perlakuan kemudian
membuat hapusan. Endapan yang diambil dibuat hapusan pada obyek glass dan
difiksasi dengan api bunsen. Setelah dibuat hapusan, preparat siap diberi
pewarnaan gram.
Awalnya preparat digenangi cat gram A yang berisi Kristal violet selama
1 menit. Setelah 1 menit, genangan dibuang dan dibilas dengan air. Preparat
kemudian diberi cat gram B yang berisi lugol dengan cara meneteskan lugol diatas
preparat hinggatergenang dan diamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, genangan
lugol dibuang dan preparat dibilas dengan air. Preparat selanjutnya ditetesi cat
gram C yang berisi alkohol 96% selama 5-10 detik hingga cat yang masih
menempel pada preparat terlihat luntur. Setelah luntur, teteskan cat gram D yang
berisi safranin dan diamkan selama setengah menit, setelah itu genangan cat D
dibuang dan dibilas dengan air. Preparat dikeringkan dengan tisu (Suswati, 2010).
3.8.9 Pengamatan Indeks
Preparat yang telah diberi pewarnaan gram selanjutnya diamati dengan
mikroskop. Pengamatan dilakukan dengan meletakkan preparat di mikroskop,
pembesaran mikroskop diatur dengan pembesaran 1000 kali, kemudian di atas
preparat ditetesi minyak emersi sebanyak 1 tetes, selanjutnya dilakukan
penghitungan indeks adhesi dengan menghitung jumlah perlekatan bakteri S.
pneumoniae pada enterosit mencit galur balb/c sejumlah 100 sel yang dihitung
dengan tiga kali pengulangan.
3.9 Analisis Penelitian
Analisis data yang digunakan adalah analisis data statistik menggunakan
Analysis of Variance (ANOVA). Analisis data ini untuk menentukan masing-
masing perlakuan memberikan pengaruh berbeda secara nyata pada indeks adhesi
dan dilanjutkan dengan uji regresi linier sederhan. Analisa regresi digunakan
untuk menentukan adanya kecenderungan peningkatan pemberian protein OMP y
kDa terhadap indeks adhesi S. pneumoniae.
Isolasi dan identifikasi S. pneumoniae
Isolasi elektroforesis, pemurnian OMP
Uji HA
OMP dengan berat molekul y kDa
Biakan S. penumoniaeIsolasi Enterosit mencit
Kontrol (K) Uji HA
Perlakuan (P)
P1Konsentrasi protein OMP
1(100μl)
P2Konsentrasi protein OMP
½ konsentrasi awal
P3Konsentrasi protein
OMP¼
konsentrasi awal
P3Konsentrasi protein
OMP1/8
konsentrasi awal
P3Konsentrasi protein
OMP1/16
konsentrasi awal
P3Konsentrasi protein
OMP1/32
konsentrasi awal
Pengenceran serial
Buat hapusan pada object glass, periksa menggunakan mikroskop
Hitung indeks pada 100 enterosit, 3x pengulangan
Analisis Data
3.10 Alur Penelitian