BAB 3. METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah True Experimental Laboratories

(Pratiknya, 2008). Penelitian ini menggunakan desain Posttest-Only Control

Design. Jenis penelitian ini yaitu kelompok penelitian menggunakan pengambilan

sampel secara random, setelah kelompok perlakuan dilakukan intervensi dan

kelompok kontrol tidak, baru dilakukan post test atau pengukuran untuk

membandingkan setiap kelompok (Hidayat, 2010).

3.2 Rancangan Penelitian

Skema rancangan penelitian (Gambar 3.1)

Keterangan :

N : Populasi

S : Sampel

P1-6 : Kelompok Perlakuan 1-6

K1 : Kelompok Kontrol

X1-6 : Perlakuan disalut OMP konsentrasi a, b, c, d, e, f

X7 : Tanpa disalut hemaglutinin OMP

DP1-6 : Data Perlakuan Kelompok 1, 2, 3, 4, 5, 6

DK1 : Data Kelompok Kontrol

3.3 Populasi, Sampel dan Jumlah Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit galur xx,

berat badan antara 100-200 gram, umur antara 2 - 2,5 bulan yang diperoleh dari

Laboratorium Biomedik Fakultas Farmasi Universitas Jember. Sedangkan sampel

yang digunakan dalam penelitian ini adalah enterosit mencit galur xx sejumlah

300μl untuk setiap kelompok perlakuan dan kontrol.

3.4 Tempat dan Waktu Penelitian

3.4.1 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Jember.

3.4.2 Waktu Penelitian

Penelitian dimulai pada bulan Mei 2013sampai bulan ……………..

3.5 Variabel Penelitian

3.5.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah Outer Membrane Protein S.

pneumoniae y kDa

3.5.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah jumlah protein adhesin yang

melekat pada enterosit mencit galur xx.

3.5.3 Variabel Terkendali

Variabel terkendali pada penelitian ini adalah enterosit mencit galur xx.

3.6 Definisi Operasional

3.6.1 Outer Membrane Protein/ OMP

OMP adalah lapisan protein yang terletak pada outer membrane S.

pneumoniae. OMP berperan dalam proses adhesi perlekatan.

3.6.2 Protein Adhesin

Protein adhesin adalah protein yang terdapat pada OMP S. pneumoniae

yang terlibat proses perlekatan (adhesi) pada sel host. Protein adhesin diketahui

dengan menghitung indeks adhesi yaitu jumlah rata-rata perlekatan bakteri pada

100 enterosit mencit galur xx yang dihitung dengan tiga kali pengulangan.

3.7 Alat dan Bahan

3.7.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave,

incubator, micro pipet, vortex, tabung reaksi, tabung ependolf, shaking waterbath,

beaker glass, lemari es, omnimixer, plate, sentrifuge, botol kaca 250 cc, neraca

ohaus elektrik, alat elektroforesis untuk SDS-PAGE, spatula, object glass, deck

glass, mikroskop, alat elektroforesis frontal apparatus aliran 50 volt, mikroplate

V, pembakar Bunsen, penjepit, kompor listrik, dan ose bulat.

3.7.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri S.

pneumoniae, TCG Agar, Brain Heart Infusion (BHI) broth, SDS-PAGE

(Acrylamid gel 30%, main gel buffer, running buffer, reducing sample buffer,

Sodium Deodecyl Sulphate/ SDS (staining solution, destaining solution)), reagen

isolasi enterosit tikus yakni Phospat Buffer Saline (PBS) pH 7.4, larutan PBS

yang mengandung Dithiothretiol, dan larutan PBS yang mengandung

Dithiothretiol dan EDTA, aquadest, dan TCA.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Subkultur Pneumococcus

Bakteri yang akan digunakan adalah Pneumococcus galur local yang

berasal dari sputum pasien pneumoniae. Metode yang digunakan menurut Ehara

(1992), yaitu media TCG yang memperkaya pertumbuhan pili Pneumococcus.

Media ini mengandung 0,02% thioproline, 0,3% NaHCO3, 0,15% bactotrytone,

0,2% yeast extract, 0,5% NaCl, 2% bacto agar dan 1 mm EDTA. Media agar

dibuat dalam botol kapasitas 250cc secara miring sebanyak 50 ml agar.

Pneumococcus yang dipilih ditanam pada media Brain Heart Infusion (BHI) yang

diinduksi pada suhu 37ºC selama 4 jam. Kemudian suspense bakteri sebanyak 10

ml dimasukkan ke setiap botol yang mengandung media TCG. Selanjutnya

dilakukan inkubasi pada suhu 37ºC selama 2x24 jam.

3.8.2 Isolasi Outer Membrane Protein Pneumococcus

Sebelum mengisolasi OMP dilakukan pencukuran pili dari S.

pneumoniae. Hasil koleksi bakteri ditambahkan Tri Chlor Acetat (TCA) dan

Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai konsentrasi 3% dan dikocok rata, hasilnya

diletakkan pada suhu kamar selama 1 jam dan tiap 15 menit dikocok. Koleksi

bakteri tadi dimasukkan ke dalam 16 botol bervolume 14 ml disentrifugasi 6000

rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC.

Pelet diambil dan diresuspensi dengan cairan PBS pH 7,4 dengan

perbandingan 1:10. Bakteri dicukur dengan menggunakan mixer sendiri pada suhu

4ºC dengan kecepatan penuh selama 30 menit, diulang sampai 5 kali dengan

waktu istirahat 1 menit.

Hasilnya dilakukan sentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 6000

rpm, suhu 4ºC, pili yang terletak di bagian atas diambil dan diberi label pili 1.

Endapan diresuspensi dengan larutan PBS pH 7,4 menggunakan cara yang sama

seperti diatas dan dikumpulkan dengan cara mencukur ulang sampai beberapa

kali, hingga dihasilkan supernatan yang memiliki warna mendekati warna PBS

dan menunjukkan tes aglutinasi negatif.

Isolasi OMP S. pneumoniae dilakukan dengan modifikasi Evans

(Suswati, et al., 2010). Modifikasi pada bagian sampel yang digunakan yaitu

bagian endapan terakhir dari perlakuan pencukuran pili. Pelet diresuspensi dengan

PBS pH 7,4 sampai 15 kali, kemudian ditambahkan n-octyl B-D-glucopyramide

(NOG) konsentrasi mencapai 0,5%. Dilakukan homogenisasi dengan vortex

kecepatan penuh selama 1 menit.

Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm dengan

suhu 4 °C selama 30 menit. Cairan supernatan diambil dan dilakukan dialisis .

Cairan dialysis pada 24 jam pertama digunakan H2O dan pada 24 jam kedua

dipakai PBS pH 7,4, perlakuan dilakukan sampai 6 kali.

3.8.3 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE)

Monitoring berat molekul dikerjakan menggunakan SDS-PAGE (Smeds

et al, 2001). Sampel protein dipanaskan 100ºC selama 5 menit dalam larutan

penyangga yang mengandung 5mm Tris HCl pH 6,8, 2-mercapto ethanol 5%, w/v

sodium dodecyl sulfate 2,5%, v/v gliserol 10% dengan warna pelacak bromphenol

blue. Dipilih mini slab gel 12,5% dengan tracking gel 4%. Voltase yang

digunakan 125mV. Bahan yang digunakan adalah coomasive brilliant blue dan

molekul standar sigma low range marker.

3.8.4 Pemurnian Protein

Metode yang dilakukan seperti yang telah dikerjakan oleh Ehara dengan

modifikasi (Mufida, et al., 2009). Hasil SDS-PAGE, gelnya dipotong lurus pada

bobot molekul yang diinginkan dan potongan pita tersebut dikumpulkan dan

dimasukkan dalam membran dialisa memakai cairan penyangga elektroforesis

frontal apparatus, aliran 125 mV selama 25 menit. Hasil elektroforesis dilakukan

dialisis dengan cairan penyangga PBS pH 7,4 selama 2x24 jam masing-masing

sebanyak 1 liter dan diganti 2 kali. Cairan dialisat tersebut dilakukan uji

hemaglutinasi.

3.8.5 Uji Hambat Hemaglutinasi

Uji hemaglutinasi dikerjakan menurut petunjuk dari Li (Suswati, et al.,

2010). Pengenceran sampel dibuat konsentrasi ½ pada microplate V, dimana tiap

sumur diberi cairan PBS bervolume 50 µl. Kolom yang digunakan yaitu kolom 1-

10 dan 12 (kolom 11 dikosongi) sementara baris yang digunakan yaitu baris A

(hanya 1 baris). Pada kolom 1 baris A diisi dengan hasil pemurnian fraksi protein

OMP sebanyak 50 µl, dihomogenkan dengan pipet sebanyak 17 kali, lalu 50 µl

dipindahkan ke kolom 2 baris A. Cairan dihomogenkan dengan pipet lagi, dan

seterusnya proses diulang sampai kolom 10 baris A, hingga terkahir diambil

cairan sebanyak 50 µl dari kolom 10 baris A untuk dibuang. Tiap sumur

ditambahkan suspensi darah merah mencit konsentrasi 0,5% volume sama dan

diletakkan dalam suhu kamar selama 1 jam. Besarnya titer ditentukan dengan

pengamatan adanya aglutinasi darah merah pada pengenceran yang terendah.

3.8.6 Isolasi Sel Enterosit Mencit

Isolasi enterosit dilakukan menurut metode Weisser (Suswati, et al.,

2010). Mencit galur balb/c dianastesi dengan menggunakan kloroform, kemudian

bagiandiambil bagian ususnya untuk dipotong secara longitudinal dengan panjang

5 cm. Usus halus dicuci dengan PBS pH 7,4 yang mengandung 1 mM

dithiothretiol pada suhu 4 oC sampai tampak bersih. Usus mencit galur balb/c

dimasukkan dalam cairan yang mengandung 1,5 mM KCl, 9,6 mM NaCl, 27 mM

Na Citrat, 8 mM KH2SO4 dan 5,6 mM Na2SO4 dengan pH 7,4, selanjutnya

jaringan dinkubasi pada shaking incubator selama 15 menit, dengan suhu 37oC.

Supernatan dibuang dan jaringan dipindahkan dalam cairan yang mengandung 1.5

mM EDTA dan 0.5 mM dithiothretiol.

Jaringan yang berada dalam cairan yang mengandung EDTA dan

dithiothretiol disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan penuh, kemudian

supernatant dibuang. Jaringan dicuci dengan menggunakan PBS dan

disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 1000 rpm, dan diulang selama 3

kali. Enterosit diisolasi

3.8.7 Uji Adhesi

Uji adhesi dilakukan menurut modifikasi Nagayama (Mufida et al.,

2009). Proses uji adhesi dimulai dengan membiakkan bakteri S. pneumoniae

dalam nutrient broth pada suhu 37 oC pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi

selama 4 jam. Bakteri dipanen melalui proses sentrifugasi 6000 rpm selama 10

menit pada suhu 4ºC. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan cairan PBS 1

ml lalu proses sentrifugasi diulang sampai 3 kali. Pelet diresuspensi dengan cairan

PBS sampai warnanya setara standar Mc Farland (108 bakteri/mm3).

Pembuatan kelompok kontrol, suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ml,

lalu dihomogenkan dengan 1 ml enterosit mencit galur balb/c, dan diinkubasi

shaking waterbath dengan goyangan pelan selama 30 menit pada suhu 37 ºC.

Campuran bakteri dan enterosit mencit tersebut disentrifugasi 1000 rpm selama 5

menit.

Supernatan dibuang, pelet ditambah cairan PBS 200 µl, lalu proses

sentrifugasi diulang sampai 2 kali. Pelet diambil dan diresuspensikan dengan 50

µl cairan PBS. Suspensi diambil dengan mikropipet sebanyak 10 µl, diletakkan di

atas obyek glass, difiksasi di atas api bunsen. Preparat dicat menggunakan

pengecatan gram lalu diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui indeks

adhesi S. pneumoniae pada enterosit mencit galur balb/c (Suswati dan Mufida,

2010).

Kelompok perlakuan dibuat dengan pengenceran protein OMP S.

pneumoniae. Tahap pertama dilakukan preparasi konsentrasi protein pada tabung

ependof untuk membuat protein OMP dengan konsentrasi 1, ½, ¼, 1/8, 1/16, dan

1/32. Selanjutnya setiap dosis ditambahkan suspensi enterosit sebanyak 300 µl

kemudian digoyang pada shaking inkubator pada suhu 37 ºC selama 30 menit.

Kemudian dalam setiap campuran tersebut ditambahkan suspensi bakteri

sebanyak 300 µl yang diperoleh dari kultur S. pneumoniae. Campuran diinkubasi

dengan shaking inkubator selama 30 menit pada suhu 37ºC. Selanjutnya

disentrifugasi 1500 rpm pada suhu 4ºC selama 3 menit, kemudian supernatan

dibuang dan diganti dengan PBS kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi

dengan kecepatan yang sama. Kemudian sentrifugasi diulang sekali lagi dengan

mengganti supernatan dengan larutan PBS.

Setelah itu endapan diambil dan dibuat hapusan pada gelas objek dan

dilakukan pewarnaan gram. Preparat siap diamati dengan menggunakan

mikroskop pembesaran 1000 kali.

3.8.8 Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram dilakukan dengan cara mengambil endapan sejumlah 20

µl dari setiap tabung ependof kelompok kontrol dan perlakuan kemudian

membuat hapusan. Endapan yang diambil dibuat hapusan pada obyek glass dan

difiksasi dengan api bunsen. Setelah dibuat hapusan, preparat siap diberi

pewarnaan gram.

Awalnya preparat digenangi cat gram A yang berisi Kristal violet selama

1 menit. Setelah 1 menit, genangan dibuang dan dibilas dengan air. Preparat

kemudian diberi cat gram B yang berisi lugol dengan cara meneteskan lugol diatas

preparat hinggatergenang dan diamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, genangan

lugol dibuang dan preparat dibilas dengan air. Preparat selanjutnya ditetesi cat

gram C yang berisi alkohol 96% selama 5-10 detik hingga cat yang masih

menempel pada preparat terlihat luntur. Setelah luntur, teteskan cat gram D yang

berisi safranin dan diamkan selama setengah menit, setelah itu genangan cat D

dibuang dan dibilas dengan air. Preparat dikeringkan dengan tisu (Suswati, 2010).

3.8.9 Pengamatan Indeks

Preparat yang telah diberi pewarnaan gram selanjutnya diamati dengan

mikroskop. Pengamatan dilakukan dengan meletakkan preparat di mikroskop,

pembesaran mikroskop diatur dengan pembesaran 1000 kali, kemudian di atas

preparat ditetesi minyak emersi sebanyak 1 tetes, selanjutnya dilakukan

penghitungan indeks adhesi dengan menghitung jumlah perlekatan bakteri S.

pneumoniae pada enterosit mencit galur balb/c sejumlah 100 sel yang dihitung

dengan tiga kali pengulangan.

3.9 Analisis Penelitian

Analisis data yang digunakan adalah analisis data statistik menggunakan

Analysis of Variance (ANOVA). Analisis data ini untuk menentukan masing-

masing perlakuan memberikan pengaruh berbeda secara nyata pada indeks adhesi

dan dilanjutkan dengan uji regresi linier sederhan. Analisa regresi digunakan

untuk menentukan adanya kecenderungan peningkatan pemberian protein OMP y

kDa terhadap indeks adhesi S. pneumoniae.

Isolasi dan identifikasi S. pneumoniae

Isolasi elektroforesis, pemurnian OMP

Uji HA

OMP dengan berat molekul y kDa

Biakan S. penumoniaeIsolasi Enterosit mencit

Kontrol (K) Uji HA

Perlakuan (P)

P1Konsentrasi protein OMP

1(100μl)

P2Konsentrasi protein OMP

½ konsentrasi awal

P3Konsentrasi protein

OMP¼

konsentrasi awal

P3Konsentrasi protein

OMP1/8

konsentrasi awal

P3Konsentrasi protein

OMP1/16

konsentrasi awal

P3Konsentrasi protein

OMP1/32

konsentrasi awal

Pengenceran serial

Buat hapusan pada object glass, periksa menggunakan mikroskop

Hitung indeks pada 100 enterosit, 3x pengulangan

Analisis Data

3.10 Alur Penelitian