Post on 16-Jan-2020
ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI PLANLETCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) HASIL INDUCEDRESISTANCE DENGAN ASAM FUSARAT TERHADAP
Fusarium oxysporum SECARA IN VITRO
(Tesis)
Oleh
EVI YUNITA SARI
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DANILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNGBANDAR LAMPUNG
2019
ABSTRAK
ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI CASSAVA(Manihot esculenta Crantz.) HASIL INDUCED
RESISTANCEDENGAN ASAM FUSARAT TERHADAPFusarium oxysporum SECARA IN VITRO
Oleh
EVI YUNITA SARI
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) merupakan salah satu sumber karbohidrat,
dan banyak dimanfaatkan untuk bahan pangan, serta bahan baku industri. Di
Indonesia, cassava merupakan produksi hasil pertanian pangan terbesar kedua
setelah padi. Lampung merupakan provinsi penghasil cassava terbesar di
Indonesia. Jamur Fusarium oxysporum (Fo) menyebabkan penyakit layu pada
tanaman, salah satunya pada cassava, sehingga perlu adanya pengendalian
penyakit secara hayati dengan menggunakan varietas unggul yang tahan terhadap
Fo. Asam fusarat (AF) adalah toksin yang dihasilkan oleh jamur Fo dan banyak
digunakan pada seleksi in vitro pada tanaman. Ketahanan terhadap penyakit dapat
diperoleh dengan cara pengimbasan ketahanan. Tujuan penelitian ini adalah (1)
mengetahui konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava dengan
pertumbuhan optimum, (2) mengetahui dan menganalisis karakter ekspresi planlet
cassava hasil induced resistance terhadap Fusarium oxysporum, meliputi analisis
klorofil a, klorofil b, klorofil total, dan analisis karbohidrat terlarut total. (3)
menganalisis pola pita DNA planlet cassava hasil induced resistance terhadap
Fusarium oxysporum dibandingkan kontrol. Penelitian ini menggunakan
Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor,yaitu konsentrasi AF, terdiri dari 5
taraf: 0 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm pada medium Murashige and
Skoog (MS). Data penelitian ini berupa data kualitatif dan data kuantitatif. Data
kualitatif disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif, sedangkan data kuantitatif
dari setiap parameter dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance,
dengan taraf nyata 5%. Hasil penelitian menunjukkan (1) konsentrasi AF toleran
untuk pertumbuhan optimum planlet cassava adalah 80 ppm. (2) adanya
peningkatan kandungan klorofil a, klorofil b, dan klorofil total, serta karbohidrat
seiring dengan peningkatan konsentrasi AF (3) Adanya pita DNA baru (spesifik)
pada planlet cassava yang tahan terhadap Fo, dengan ukuran 550 bp (OPA_1),
dan 300 bp (OPA_10), dapat diprediksi sebagai kandidat marker Random
Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) untuk ketahanan planlet cassava
terhadap Fo.
Kata kunci: asam fusarat, cassava, Fusarium oxysporum, induced resistance,in vitro
ABSTRACT
ANALYSIS OF DNA PATTERNS AND CHARACTERIZATION OFCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) RESULTS OF INDUCEDRESISTANCE WITH FUSARIC ACID ON Fusarium oxysporum
BY IN VITRO SELECTION
By
EVI YUNITA SARI
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Is one source of carbohydrates, and is
widely used for food, as well as industrial raw materials. In Indonesia, cassava is
the second largest food crop production after rice. Lampung is the largest cassava
producing province in Indonesia. Fusarium oxysporum (Fo) fungus causes wilt in
plants, one of which is cassava, so it is necessary to control biological disease by
using superior varieties that are resistant to Fo. Fusaric acid (AF) is a toxin
produced by Fo fungi and is widely used in in vitro selection of plants. Disease
resistance can be obtained by means of resistance resilience. The objectives of this
study were (1) knowing the concentration of tolerant fusaric acid for the selection
of cassava plantlets with optimum growth, (2) knowing and analyzing the
expression character of cassava plantlets from induced resistance to Fusarium
oxysporum, including analysis of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll,
and total dissolved carbohydrate analysis. (3) analyze the pattern of DNA bands
of plant cassava results of induced resistance to Fusarium oxysporum compared to
controls. This study used a Completely Randomized Design (CRD) of one factor,
namely the concentration of AF, consisting of 5 levels: 0 ppm, 20 ppm, 40 ppm,
60 ppm, and 80 ppm in the Murashige and Skoog (MS) medium. The research
data is in the form of qualitative data and quantitative data. Qualitative data is
presented in the form of comparative descriptions, while quantitative data from
each parameter are analyzed using Analysis of Variance, with a real level of 5%.
The results showed (1) the concentration of AF tolerant for optimum growth of
the planlet cassava was 80 ppm. (2) an increase in the content of chlorophyll a,
chlorophyll b, and total chlorophyll, and carbohydrates along with an increase in
AF concentration (3) The presence of a new (specific) DNA band in a cassava
plant that is resistant to Fo, with a size of 550 bp (OPA_1), and 300 bp (OPA_10),
can be predicted as a candidate for theRandom Amplification of Polymorphic
(RAPD) marker for the resistance of a cassava plant against Fo.
Keywords: cassava, fusaric acid, Fusarium oxysporum, induced resistance, invitro
ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI PLANLETCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) HASIL
INDUCEDRESISTANCE DENGAN ASAM FUSARATTERHADAP Fusarium oxysporum SECARA IN VITRO
Oleh
EVI YUNITA SARI
TESIS
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai GelarMAGISTER SAINS
PadaProgram Studi Magister Biologi
Jurusan Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Lampung
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNGBANDAR LAMPUNG
2019
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung, pada 02Juni
1994, yang merupakan anak pertama dari empat
bersaudara pasangan Bapak Irwansyah, S.H. dan Ibu
Ermayati. Riwayat pendidikan penulis yaitu menempuh
pendidikan tingkat dasar di SD Negeri 2 Labuhan Ratu
Bandar Lampung (1999-2005), SMP Negeri 22 Bandar
Lampung (2006-2009) dan SMA Gajah Mada Bandar Lampung (2009-2012).
Pada tahun 2012, penulis tercatat sebagai Mahasiswa Pendidikan Biologi Fakultas
Keguruan dan Ilmu Pendidikan,Universitas Lampung. Pada tahun 2016, penulis
lulus sebagai Sarjana Pendidikan. Pada tahun 2017, penulis melanjutkan
pendidikan S2 dan tercatat sebagai Mahasiswa Program Pascasarjana Magister
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung,
Bandar Lampung.
MOTTO
“Allah tidak akan membebani seseorangmelainkan sesuai kesanggupannya”
(QS. Al-Baqarah: 286)
“Maka sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan.Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan”.
(QS. Al-Insyirah: 5-6)
Dengan menyebut nama Allah yang Maha pengasih lagi Maha penyayang
PERSEMBAHAN
Segala puji hanya milik Allah SWT, atas rahmat dan nikmat yang selaludilimpahkan.
Sholawat serta salam selalu tercurah kepada Rasulullah SAW.
Ku persembahkan karya ini sebagai tanda bakti dan cinta kasihku yang tuluskepada:
Yang tercinta, ayah dan ibuku yang telah mendidikdan membesarkanku dengan segala doa terbaik mereka, kesabaran
dan limpahan cinta dan kasih sayang, selalu mendukung segala langkahkuuntuk mencapai kesuksesan dan kebahagiaan, yang takkan pernah bisa
terbalas sampai kapan pun.
Ketiga adikku tersayang yang selalu memberikan semangat, dukungan, do’a,serta kasih sayangnya untukku, selalu mengingatkanku ketika aku mulai
bosan dan mengeluh, serta selalu mendengarkan segala keluhanku.
Para pendidikku, atas ilmu, nasihat, arahan, dan motivasi yang membuat akumampu untuk melihat betapa indahnya ilmu pengetahuan.
Almamater tercinta, Universitas Lampung.
SANWACANA
Alhamdulillah Puji Syukur kehadirat ALLAH SWT yang Maha Pengasih lagi
Maha Penyanyang, karena atas segala Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulis
dapat menyelesaikan Tesis yang berjudul “Analisis Pola DNA dan
Karakterisasi Planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Hasil Induced
Resistance dengan Asam Fusarat Terhadap Fusarium oxysporum Secara In
Vitro”. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian dengan judul “Analisis
Pola DNA Dan Karakterisasi Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Hasil
Induced Resistance Terhadap Fusarium oxysporum”, yang didanai oleh Hibah
Penelitian Pascasarjana Universitas Lampung, berdasarkan Surat Penugasan
Penelitian Pascasarjana Nomor Kontrak: 1344/UN26.21/PN/2018 Tanggal 25 Juni
2018. Ucapan terimakasih dan penghargaan yang tinggi penulis tujukan kepada
semua pihak yang telah membantu sejak dimulainya kegiatan penelitian sampai
terselesaikannya tesis ini, ucapan terimakasih yang tulus penulis sampaikan
kepada:
1. Ibu Dr. Endang Nurcahyani, M.Si., selaku pembimbing I dan selaku
pembimbing akademik yang telah banyak meluangkan waktu untuk
memberikan bimbingan, semangat, motivasi, ilmu, arahan, ide, nasihat, saran,
dan kritik, dengan penuh kesabaran selama penulisan tesis ini.
2. Bapak Dr. Bambang Irawan, M.Sc., selaku pembimbing II yang telah
meluangkan waktu untuk memberikan bimbingan, semangat, ilmu, arahan,
ide, nasihat, saran, dan kritik, dengan penuh kesabaran selama penulisan tesis
ini.
3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., sebagai pembahas I dan Ketua Program Studi
Magister Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA)
Universitas Lampung yang telah banyak memberikan masukan, arahan,
nasihat, dan meluangkan waktu terhadap penulis dalam menyempurnakan
naskah tesis ini.
4. Ibu Dr. Sri Wahyuningsih, M.Si., sebagai pembahas II yang telah banyak
memberikan masukan, arahan, nasihat, serta meluangkan waktu terhadap
penulis dalam menyempurnakan naskah tesis ini.
5. Kepala Laboratorium Botani, yang telah memberikan izin kepada penulis
untuk dapat melaksanakan penelitian.
6. Ketua Jurusan Biologi, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam (FMIPA) dan Rektor Universitas Lampung atas semua fasilitas yang
telah diberikan.
7. Bapak dan Ibu Dosen yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu,
terimakasih karena telah memberikan banyak ilmu dan pengetahuan kepada
penulis.
8. Teman-teman seperjuangan Magister Biologi Angkatan 2017, Wulan Ayu
Nurfitri, S.Pd., Rizka Arifianti, S.Si., Tika Lidia Sari, S.Pd., Desfika Ardia
Putri, S.Pd., Yogi Kurnia, S.Pd., Novriadi, S.Si., dan Yoharnes, S.Si.,
terimakasih telah memberikan semangat, dukungan serta motivasi kepada
penulis.
Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada semua pihak yang tidak dapat
penulis sebutkan satu persatu atas semua bantuan selama berlangsungnya
penelitian hingga sampai terselesaikannya tesis ini. Semoga ALLAH SWT
memberikan Rahmat dan Karunia-Nya kepada kita semua.
Akhir kata, penulis berharap semoga tulisan ini dapat bermanfaat dan berguna
bagi semua pihak, berguna bagi penulis khususnya dan pembaca pada umumnya.
Bandar Lampung, Juni 2019
Penulis
Evi Yunita Sari
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN PENGESAHAN
ABSTRAK
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ..................................................................................... 1B. Tujuan Penelitian ................................................................................. 4C. Manfaat Penelitian ............................................................................... 5D. Kerangka Pikir …........................... ...................................................... 5E. Hipotesis …............................................................................................. 6
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Cassava(Manihot esculenta Crantz.)..................................................... 7B. Penyakit Layu Fusarium ....................................................................... 8C. Asam Fusarat ......................................................................................... 10D. Ketahanan Terimbas (Induced Resistance) .......................................... 10E. Perbanyakan Tanaman Secara In Vitro ................................................. 12F. Biosintesis Klorofil ............................................................................... 13G. Karbohidrat ........................................................................................... 14H. Deteksi Mutan dengan PCR.................................................................. 15
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 18B. Alat dan Bahan ..................................................................................... 18C. Rancangan Percobaan .......................................................................... 19D. Pelaksanaan penelitian .......................................................................... 19E. Analisis Data ........................................................................................ 27
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Visualisasi dan Persentase Planlet Hidup Cassava .............................. 30B. Konsentrasi Asam Fusarat Toleran ...................................................... 32C. Karakterisasi Planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) ................ 34
1.Analisis Kandungan Klorofil ............................................................ 352.Analisis Kandungan Karbohidrat Terlarut Total .............................. 383.Analisis Pola DNA Cassava ............................................................. 41
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan ............................................................................................... 52B. Saran .................................................................................................... 53
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 54
LAMPIRAN .................................................................................................... 61
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Primer RAPD ....................................................................................... 26
2. Kondisi Reaksi PCR-RAPD................................................................. 26
3. Persentase Visualisasi Planlet Cassava Hasil Induced Resistancedengan Berabagai Konsentrasi Asam Fusarat (AF) ............................ 30
4. Persentase Jumlah Planlet Hidup Cassava Hasil Induced Resistancedengan Berbagai Konsentrasi Asam Fusarat (AF)............................... 32
5. Kandungan Klorofil Daun Cassava (Manihot esculenta Crantz.)Hasil Pengimbasan .............................................................................. 35
6. Rata-rata kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Cassava(mg/g Jaringan) ................................................................................... 38
7. Hasil pengukuran kemurnian DNA dan konsentrasi DNA 12 sampelplanlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dan diimbas asamfusarat (20,40, 60, dan 80 ppm) ........................................................... 42
8. Jumlah pita hasil amplifikasi PCR-RAPD pada planlet cassava yangtidak diimbas (kontrol) dan diimbas asam fusarat (20, 40, 60, dan 80ppm) ..................................................................................................... 43
9. Pola pita DNA planlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dandiimbas asam fusarat (20,40, 60, dan 80 ppm) dengan primerOPA_1.................................................................................................. 45
10. Pola pita DNA planlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dandiimbas asam fusarat (20, 40, 60, dan 80 ppm) denganprimer OPA_10 .................................................................................... 46
11. Analisis Ragam Single Faktor Kandungan Klorofil a, Klorofil b,Klorofil Total, dan Kandungan Karbohidrat Terlarut Total ................ 67
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur Klorofil................................................................................... 13
2. Bagan Alir Penelitian ........................................................................... 20
3. Planlet Cassava Dengan Berbagai Konsentrasi Asam Fusarat ............ 33
4. Pola Pita DNA Cassava ....................................................................... 47
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) adalah keamanan pangan, industri, dan
energi penting di dunia. Akarnya menyediakan makanan karbohidrat bagi
lebih dari 800 juta orang. Produksi Cassava global pada tahun 2012 adalah
282 juta ton, dengan 56% diproduksi oleh Afrika, 30% oleh Asia dan 14% di
Amerika Selatan (Bobobee, 2009).
Cassava merupakan komoditas pangan penting di Indonesia, dan ke depan
komoditas ini akan semakin strategis peranannya bagi kehidupan masyarakat
dan perekonomian negara. Berdasarkan areal panen komoditas pangan,
cassava (Manihot esculenta Crantz.) menduduki urutan ketiga setelah padi
dan jagung, yang ketiganya sebagai sumber karbohidrat utama masyarakat
(Fauzi, dkk., 2015).
Badan Pusat Statistik (BPS) mencatat bahwa produksi cassava (Manihot
esculenta Crantz.) sejak tahun 1993 sampai dengan tahun 2015 Provinsi
Lampung merupakan yang paling besar pada tiap tahunnya dibandingkan
dengan Provinsi lain di Indonesia. Tercatat bahwa produksi cassava (Manihot
2
esculenta Crantz.) di Provinsi Lampung pada tahun 2015 sebanyak 7.387.084
ton (BPS, 2015).
Kementerian Pertanian Republik Indonesia terus berupaya menurunkan
tingkat konsumsi beras masyarakat dengan mencari pengganti pangan
lainnya, seperti halnya cassava. Karenanya, Kementan terus menggulirkan
program Gengsi Cassava untuk memperkuat ketahanan pangan alternatif
(Fauzi, dkk., 2015).
Disamping itu terdapat kendala produksi dalam pembudidayaan cassava yang
sering dialami oleh petani, antara lain penyakit layu Fusarium. Layu
Fusarium disebabkan oleh jamur Fusarium oxysporum yang hingga saat ini
masih belum dapat diatasi secara efektif. Sejauh ini dalam pengendaliaannya
petani masih menggunakan fungisida, sedangkan fungisida itu sendiri
memiliki dampak negatif yaitu dapat merusak lingkungan. Sehingga perlu
adanya pengendalian secara hayati (Soelistijono, 2015).
Cara alternatif yang dapat dilakukan dalam pengendalian penyakit dan tidak
menimbulkan dampak negatif, seperti halnya dalam penggunaan fungisida
yaitu dengan menggunakan varietas unggul yang tahan terhadap Fusarium
oxysporum (Fo) (Nurcahyani, dkk., 2012). Penggunaan komponen
penyeleksi pada media kultur in vitro seperti asam fusarat dapat
menyebabkan tanaman memiliki sifat yang lebih terarah sesuai dengan yang
diinginkan, sehingga lebih efektif dan efisien dalam menangani penyakit,
3
contohnya penyakit yang diakibatkan oleh Fusarium oxysporum (Damayanti,
2010). Asam fusarat merupakan metabolit yang dihasilkan oleh beberapa
spesies jamur dari genus Fusarium (Landa et al., 2002).
Ketahanan terhadap penyakit dapat diperoleh dengan cara pengimbasan
ketahanan, yaitu perlakuan sebelum infeksi patogen dengan senyawa kimia
maupun dengan inokulasi mikroorganisme nonpatogenik. Perlakuan ini
dinamakan ketahanan terimbas atau induced resistance (Sumardiyono, dkk.,
2015).
Salah satu alternatif cara pengendalian penyakit yang efisien, efektif dan
aman terhadap lingkungan, antara lain menggunakan varietas yang resisten.
Penggunaan varietas unggul yang tahan terhadap Fo dan kekeringan dengan
daya hasil tinggi merupakan salah satu alternatif pengendalian penyakit dan
cekaman kekeringan yang penting dan tidak menimbulkan dampak negatif
(Nurcahyani et al., 2016a; Nurcahyani et al., 2016b; Nurcahyani et al., 2017;
Azhari et al., 2018; Rosyalina et al., 2018; Nurcahyani et al., 2019).
Pengembangan varietas planlet tahan Fo dapat dilakukan antara lain dengan
metode seleksi in vitro yaitu mengkulturkan eksplan berupa jaringan atau
organ pada medium yang mengandung asam fusarat konsentrasi selektif
(Nurcahyani et al., 2016a; Nurcahyani et al., 2016b; Nurcahyani et al., 2014;
Nurcahyani et al., 2017; Nurcahyani et al., 2019).
4
Keragaman genetik pada planlet cassava akibat perlakuan dengan asam
fusarat dapat dideteksi dengan penanda molekular, salah satunya adalah
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Metode RAPD adalah
penanda berbasis Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan
10 basa primer acak (Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990).
Penggunaan asam fusarat dalam konsentrasi yang toleran sejauh ini belum
pernah dilaporkan secara pasti dan tepat dalam pengimbasan ketahanan
(Induced Resistance) planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) terhadap
Fusarium oxysporum. Oleh karena itu, penelitian mengenai peranan asam
fusarat sebagai pengimbas ketahanan secara in vitro perlu untuk dilakukan.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Mengetahui konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava
dengan pertumbuhan optimum.
2. Mengetahui dan mengalisis karakter ekspresi planlet cassava hasil
induced resistance terhadap Fusarium oxysporum, meliputi analisis
klorofil a, klorofil b, klorofil total, dan karbohidrat terlarut total.
3. Menganalisis pola pita DNA planlet cassava hasil induced resistance
terhadap Fusarium oxysporum dibandingkan kontrol.
5
C. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang tahapan
untuk menghasilkan planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) yang tahan
terhadap Fusarium oxysporum (Fo), sehingga diharapkan dapat memberikan
kontribusi dalam pengembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang
pemuliaan dan penyakit tanaman.
D. Kerangka Pikir
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) merupakan tanaman yang sangat banyak
dibudidayakan di Indonesia, hal ini dikarenakan singkong merupakan salah
satu bahan makanan pokok, pengganti nasi. Akan tetapi dalam proses
penanamannya sering kali terkendala oleh adanya serangan jamur pathogen
penyebab penyakit layu Fusarium.
Penyakit layu pada cassava (Manihot esculenta Crantz.) disebabkan oleh
jamur Fusarium oxysporum. Tanaman Cassava yang terserang penyakit ini
akan menunjukkan gejala yaitu daunnya menguning dan mengeriput seperti
kekurangan air. Pada umumnya, pengendalian layu Fusarium dilakukan hanya
dengan menggunakan fungisida, tetapi penggunaan fungisida dapat
berdampak buruk bagi lingkungan dan kesehatan manusia. Untuk itu,
pengendalian yang aman dan tidak membahayakan sangat diperlukan. Salah
satu pengendalian yang aman terhadap lingkungan adalah pengendalian
hayati. Pengendalian tersebut dilakukan dengan cara mengimbas asam fusarat
6
pada planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) secara in vitro untuk
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap infeksi patogen.
Asam fusarat (AF) adalah toksin yang dihasilkan oleh Fusarium oxysporum
yang dapat menginduksi tanaman sehingga memberikan respon dalam
menghambat aktivitas patogen dengan memproduksi senyawa fitoaleksin.
Fitoaleksin adalah senyawa respons dari tanaman yang bersifat fungitoksik,
sehingga pemberian asam fusarat diharapkan mampu meningkatkan senyawa
fungitoksik di dalam tanaman yang pada akhirnya mampu menghambat
pertumbuhan jamur Fusarium oxysporum. Ketahanan terimbas (induced
resistance) merupakan ketahanan yang terekspresi setelah patogen menyerang.
Induced resistance dapat dijadikan sebagai cara alternatif untuk mendapatkan
tanaman tahan terhadap penyakit karena tanaman mampu menstimulasi
mekanisme resistensi alami.
E. Hipotesis
Hipotesis pada penelitian ini adalah, sebagai berikut:
1. Terdapat konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava
dengan pertumbuhan optimum.
2. Terdapat karakter ekspresi planlet cassava hasil induced resistence
terhadap Fusarium oxysporum berdasarkan, kandungan klorofil a, klorofil
b, klorofil total, kandungan karbohidrat terlarut total, dan pola DNA.
3. Terdapat pola pita DNA baru planlet cassava hasil induced resistance
dengan Fusarium oxysporum dibandingkan dengan kontrol.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Cassava (Manihot esculenta Crantz.)
Cassava (Manihot esculenta Crantz) yang termasuk dalam famili
Euphorbiaceae merupakan tanaman yang sudah lama dikenal dan
dibudidayakan oleh masyarakat Indonesia. Hal tersebut terlihat dari daerah
penyebaran komoditas tersebut di hampir seluruh provinsi di Indonesia.
Cassava sebagai sumber karbohidrat, dan banyak dimanfaatkan untuk bahan
pangan, pakan, serta bahan baku industri (Hafzah, 2003). Sebanyak 2,5 milyar
penduduk di Asia, Afrika, dan Amerika Latin menggunakan ubi kayu sebagai
bahan pangan, pakan, dan sumber pendapatan (CGIAR, 2000).
Di Indonesia, cassava merupakan produksi hasil pertanian pangan ke dua
terbesar setelah padi, sehingga cassava mempunyai potensi sebagai bahan
baku yang penting bagi berbagai produk pangan dan industri. Sebagai
makanan manusia, cassava mempunyai beberapa kekurangan diantaranya
kadar protein dan vitamin yang rendah serta nilai gizi yang tidak seimbang.
Disamping itu beberapa jenis cassava mengandung racun HCN yang terasa
pahit. Dari dasar itulah secara lokal singkong dibagi menjadi cassava pahit dan
cassava manis (Koswara, 2013). Cassava merupakan tanaman yang sangat
familiar dengan kondisi lingkungan, bahkan ada pernyataan bahwa selama
8
batang cassava menyentuh tanah maka dipastikan tunasnya akan tumbuh
(Sarjiah, dkk., 2016). Produksi cassava di Indonesia tercatat sebanyak
21.801.415 ton pada tahun 2015 (BPS, 2015). Sentra lahan cassava di
Indonesia dikuasai oleh Provinsi Lampung dengan luas lahan panen 342,100
ha pada tahun 2012. Tercatat bahwa produksi cassava di Provinsi Lampung
pada tahun 2015 sebanyak 7.387.084 ton (BPS, 2015).
2.2 Penyakit Layu Fusarium
Fusarium oxysporum adalah salah satu spesies dari genus Fusarium yang
merupakan patogen tular tanah. Berdasarkan tanaman inang yang
diinfeksinya, F. oxysporum dibagi kembali menjadi forma-forma spesialis
tertentu (Semangun, 2001). Adapun klasifikasi dari jamur Fusarium
oxysforum menurut Semangun (2001) adalah:
Kerajaan : Fungi
Filum : Ascomycota
Kelas : Sordariomycetes
Bangsa : Hypocreales
Suku : Nectriaceae
Marga : Fusarium
Jenis : Fusarium oxysporum
Jamur Fusarium oxysporum menyebabkan penyakit layu pada tanaman.
Penyakit tersebut dapat berkembang dengan didukung oleh kelembaban tanah
yang rendah serta suhu tanah yang hangat yaitu 80°F (Cahyono, 2008).
Perakaran menjadi busuk dan dapat meluas ke atas sampai ke pangkal batang.
9
Fo merupakan pathogen pada tanaman yang dapat bertahan secara alami di
dalam medium tumbuh dan pada akar-akar tanaman yang sakit, dan melalui
akar yang luka dapat menimbulkan infeksi. Jika akar rimpang dipotong akan
tampak bahwa epidermis dan hypodermis berwarna ungu, sedangkan floem
dan xylem berwarna merah muda, dan akhirnya seluruh akar rimpang menjadi
warna ungu (Semangun, 2001).
Jamur Fusarium oxysporum (Fo) adalah salah satu jenis patogen tular tanah
yang menyebar melalui tanah atau rimpang dari tanaman sakit, dan
menginfeksi tanaman melalui luka yang terjadi karena pengangkutan benih,
penyiangan, atau karena serangga dan nematoda. Di dalam jaringan tanaman
yang terinfeksi akan terbentuk miselium yang berkembang sampai mencapai
pembuluh xilem, sehingga menyebabkan terhalangnya trasportasi unsur hara
dan akhirnya tanaman layu (Putri dkk, 2014; Semangun, 1996).
Siklus hidup Fusarium oxysporum terdapat dua fase yaitu patogenesis dan
saprogenesis. Pada fase patogenesis, jamur hidup sebagai parasit pada
tanaman inang. Jika tidak ada tanaman inang, maka jamur fusarium akan
hidup di dalam tanah sebagai saprofit pada sisa tanaman dan masuk ke fase
saprogenesis, yang kemudian dapat menjadi sumber inokulum untuk
menimbulkan penyakit pada tanaman lain (Groenewald, 2006). Penyakit layu
Fusarium dapat meyerang bunga, pucuk daun, daun, dan pangkal daun, dan
hingga meluas sampai ke batang tanaman (Lestari, 2002).
10
2.3 Asam Fusarat
Asam fusarat adalah toksin yang dihasilkan oleh jamur Fusarium oxysporum,
banyak digunakan pada seleksi in vitro pada tanaman (Bacon et al., 1996).
Cara untuk mendapatkan tanaman yang tahan terhadap layu fusarium yaitu
dengan menginduksikan toksin yang dihasilkan oleh Fusarium oxysporum
pada tanaman (Sukmadjaja dkk., 2013).
Konsentrasi asam fusarat yang nontoksik (dibawah 10-6 M) dapat mengimbas
sintesis fitoaleksin, suatu bentuk tanggapan tanaman untuk menghambat
aktivitas pathogen (Bouizgarne et al., 2006). Induksi asam fusarat juga dapat
meningkatkan senyawa H2O2 pada medium kultur, dimana H2O2 besifat
toksik bagi patogen. Sebaliknya AF pada konsentrasi toksik akan
menyebabkan kematian pada tanaman (Bouizgarne et al., 2006). Penggunaan
asam fusarat sebagai agen penyeleksi dalam seleksi in vitro dapat
menghasilkan sel atau jaringan mutan yang insensitif terhadap asam fusarat,
sehingga setelah diregenerasi menjadi tanaman dapat menghasilkan galur
yang resisten terhadap infeksi patogen.
2.4 Ketahanan Terimbas (Induced Resistance)
Ketahanan terimbas merupakan proses pengaktifan ketahanan alami tanaman,
seperti penambahan sel lignin, produksi fitoaleksin, peningkatan enzim
peroksidase dan kandungan klorofil (Agrios, 2005), yang diaktifkan oleh
agensia biotik atau abiotik (Soesanto, 2008). Induced resistance merupakan
strategi pengendalian yang efektif, karena tanaman dapat meningkatkan
11
kemampuan dalam menahan serangan patogen seperti jamur, bakteri dan virus
(Quing and Hongwen, 2002).
Patogen yang menginfeksi tanaman akan dihambat pertumbuhannya oleh
senyawa toksin yang dihasilkan dari reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel
atau jaringan (Agrios, 2005). Tanaman akan melakukan respon pertahanan diri
terhadap serangan pathogen tertentu. Respon pertahanan tanaman terhadap
patogen menurut Campbell, et al. (2003) melalui beberapa tahapan yaitu
jaringan tumbuhan yang terinfeksi akan mengalami mekanisme resistensi
spesifik yang didasarkan pada pengikatan ligan patogen ke dalam reseptor sel
spesifik, pengikatan tersebut merupakan tahap identifikasi yang memicu jalur
transduksi sinyal, dan akan menghasilkan respon hipersensitif.
Tahapan pembentukan Induced resistance dalam tumbuhan menurut
Campbell et al (2008) sebagai berikut:
1. Pengenalan gen untuk gen
suatu bentuk resistensi terhadap penyakit yang dimiliki oleh tumbuhan
yang melibatkan pengenalan molekul-molekul yang berasal dari patogen
oleh produk-produk protein dari gen-gen resisten, sehingga mampu untuk
memacu jalur tranduksi sinyal yang menyebabkan aktivasi respon-respon
pertahanan yang mencakup respons hipersensitif.
2. Respons hipersensitif
respon pertahanan yang menyebabkan kematian sel dan jaringan daerah
yang terkena infeksi patogen, untuk membatasi penyebaran patogen.
12
Respons hipersensitif juga menginduksi produksi Pathogenesis Related-
protein (PR-protein), salah satu PR-protein adalah enzim peroksidase
yang berperan penting dalam proses lignifikasi, agar tumbuhan resisten
terhadap serangan patogen.
PR-protein merupakan protein spesifik yang terdapat pada tanaman dan
berfungsi untuk mempertahankan kelangsungan kehidupan tanaman,
khususnya dalam menangkal serangan dari patogen yang berbahaya bagi
tanaman tersebut. Setiap tanaman akan memberi respon yang spesifik
apabila terkena serangan patogen dari luar, dengan jalan meningkatkan
sintesis PR-protein (Soedjanaatmadja, 2008).
2.5 Perbanyakan Tanaman secara in vitro
Teknik kultur jaringan atau kultur in vitro merupakan salah satu cara
perbanyakan tanaman yang efektif karena dapat menghasilkan jumlah
tanaman yang banyak dan seragam dalam waktu yang relatif singkat.
Keberhasilan teknik kultur jaringan dipengaruhi oleh penggunaan media
buatan yang mengandung nutrisi yang lengkap, adanya zat pengatur tumbuh
(ZPT), kondisi ruang kultur yang steril, suhu dan pencahayaan yang
terkontrol (Yusnita, 2003). Faktor yang mendukung pertumbuhan dan
perkembangan tanaman secara in vitro yaitu faktor lingkungan seperti pH,
kelembapan, cahaya, dan temperatur (Nugroho, 2000).
Metode in vitro dapat digunakan untuk menciptakan varietas-varietas
13
tumbuhan baru dengan menumbuhkan tanaman utuh dari bagian-bagian
tanaman induknya seperti daun, mata tunas serta menumbuhkannya pada
medium buatan yang mengandung berbagai nutrient dan hormon (Campbell
et al., 2008). Perbanyakan tanaman secara in vitro mendatangkan banyak
keuntungan, yaitu lingkungan terkontrol dan kondisi yang aseptik pada
ruangan mengakibatkan bahan (medium) tanam yang akan digunakan
terbebas dari kontaminasi jamur dan bakteri (Andiyani, 2001).
2.6 Biosintesis Klorofil
Klorofil merupakan molekul kompleks yang berperan penting dalam proses
fotosintesis yaitu sebagai pengabsorbsi cahaya, transfer energi, transfer
elektron (Taiz and Zeiger, 1998) dan katalisator pada tumbuhan. Klorofil
bersama dengan CO2, air, dan cahaya matahari berperan dalam membentuk
karbohidrat pada proses fotosintesis (Jumin, 1989). Ketersediaan air dan unsur
hara dari dalam tanah berperan penting dalam sintesis klorofil (Syafi, 2008).
Adapun struktur klorofil a dan klorofil b, sebagai berikut:
Gambar 1. Struktur Klorofil a) Klorofil a, b) Klorofil b(Song dan Banyo, 2011)
a b
14
Klorofil adalah katalisator fotosintesis yang penting dan terdapat di
semesta sebagai pigmen hijau dalam semua jaringan tumbuhan hijau
(Dwijoseputro, 1985). Klorofil merupakan faktor utama yang
mempengaruhi fotosintesis. Fotosintesis merupakan proses perubahan
senyawa anorganik (CO2 dan H2O) menjadi senyawa organik (karbohidrat)
dan O2 dengan bantuan cahaya matahari (Bahri, 2010). Pada tumbuhan
tingkat tinggi, klorofil a dan klorofil b merupakan pigmen utama
fotosintetik, yang berperan menyerap cahaya violet, biru, merah dan
memantulkan cahaya hijau (Salaki 2000).
Fungsi utama klorofil dalam proses fotosintesis adalah memanfaatkan
energi matahari, memicu fiksasi CO untuk menghasilkan karbohidrat dan
menyediakan energi bagi ekosistem secara keseluruhan. Karbohidrat yang
dihasilkan dalam fotosintesis diubah menjadi protein, lemak, asam nukleat
dan molekul organik lainnya. Klorofil menyerap cahaya yang berupa
radiasi elektromagnetik pada spektrum kasat mata (visible). Klorofil dapat
menampung cahaya yang diserap oleh pigmen lainnya melalui fotosintesis,
sehingga klorofil disebut sebagai pigmen pusat reaksi fotosintesis (Bahri,
2010).
2.7 Karbohidrat
Karbohidrat merupakan senyawa organik yang mengandung karbon,
hydrogen, dan oksigen, baik dalam bentuk molekul sederhana maupun
kompleks (Christian, et al., 2003). Karbohidrat meliputi lebih dari 90% berat
15
kering tanaman. Penggunaannya sangat luas dan jumlah penggunaannya
cukup besar (Fennema, 1996). Baik untuk pemanis, pengental, penstabil,
gelling agents, dan fat replacer (Christian et al., 2003). Karbohidrat dapat
dimodifikasi baik secara kimia dan biokimia dan modifikasi itu digunakan
untuk memperbaiki sifat dan memperluas penggunaannya. Perubahan
karbohidrat menjadi bentuk tertentu sangat penting, karena ada hubungan
secara langsung dengan proses fisiologis seperti fotosintesis, translokasi, dan
respirasi. Terdapat beberapa macam karbohidrat terlarut, yaitu sukrosa,
glukosa, dan fruktan (Kerepesi, et al., 2000).
Protein dan karbohidrat dua komponen yang erat kaitannya dengan dalam
mengembangkan benih selama biosintesis lipid (Wang et al, 2007; Ekman et
al 2008.). Karbohidrat dalam fotosintesis merupakan bentuk asimilasi dari
jaringan hijau seperti siliques dan daun, dan memainkan peran ganda dalam
metabolisme sel. Pertama, karbohidrat seperti sukrosa yang dihasilkan oleh
fotosintesis di jaringan hijau adalah prekursor dan substrat penting untuk
biosintesis asam lemak (Focks and Benning, 1998). Kedua, konversi
karbohidrat menjadi lemak, protein, dan metabolit sekunder seperti serat
adalah sistem regulasi selama perkembangan benih (Ekman et al, 2008).
2.8 Deteksi Mutan dengan PCR
Penampilan suatu individu merupakan hasil kerja dari suatu trait atau sifat.
Trait ini dikendalikan atau ditentukan oleh molekul yang di dalamnya terdapat
gen. Sifat (trait) yang terwakili dari molekul tersebut mengikuti pola
16
pewarisan Mendel seperti kebebasan segregasi dan random assortment.
Karakter molekul yang membawa sifat inilah yang dapat dijadikan sebagai
suatu penanda atau marker. Karena satuan terkecil berbentuk molekul maka
penanda ini selanjutnya disebut sebagai penanda atau marka molekular
(Komar, 1999).
Seiring dengan semakin berkembangnya teknologi yang berbasis marka DNA,
maka saat ini telah ditemukan tiga tipe marka DNA dengan segala kelebihan
dan kekurangan masing-masing (Semagn et al., 2006). Ke tiga tipe marka
DNA adalah: (1) marka yang berdasarkan pada hibridisasi DNA seperti
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); (2) marka yang
berdasarkan pada reaksi rantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)
dengan menggunakan sekuen-sekuen nukleotida sebagai primer, seperti
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), dan Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP); dan (3) marka yang berdasarkan pada PCR
dengan menggunakan primer yang menggabungkan sekuen komplementer
spesifik dalam DNA sasaran, seperti Sequence Tagged Sites (STS), Sequence
Characterized Amplified Regions (SCARs), Simple Sequence Repets (SSRs)
atau mikrosatelit (microsatellites), dan Single Nucleotide Polymorphism
(SNPs) (Azrai, 2005; Semagun et al., 2006).
Prinsip kerja marka RAPD adalah berdasarkan perbedaan amplifikasi PCR
pada sampel DNA dari sekuen oligonukleotida pendek yang secara genetik
merupakan kelompok marka dominan (Williams et al. 1990; Welsh & Mc
17
Clelland, 1990). Primer RAPD bersifat random dengan ukuran panjang
biasanya 10 nukleotida. Jumlah produk amplifikasi PCR berhubungan
langsung dengan jumlah dan orientasi sekuen yang komplementer terhadap
primer di dalam genom tanaman (Bardakci, 2001; Semagun et al., 2006).
Keunggulan dari teknik analisis menggunakan marka RAPD antara lain adalah
(1) kuantitas DNA yang dibutuhkan sedikit, (2) hemat biaya, (3) mudah
dipelajari, dan (4) primer yang diperlukan sudah banyak dikomersialisasikan
sehingga mudah diperoleh. Kelemahan teknik ini antara lain: (1) tingkat
reproduksibilitas pola marka dari laboratorium ke laboratorium berbeda dan
antara hasil percobaan dalam laboratorium itu sendiri yang sama, (2) sangat
sensitif terhadap variasi dalam konsentrasi DNA, dan (3) memerlukan
konsentrasi primer dan kondisi siklus suhu yang optimal pada saat pengujian.
Selain itu, marka RAPD dominan dan tidak mampu menampilkan perbedaan
sekuen DNA yang homolog, di antara pita-pita yang ukurannya hampir sama
(Riedy et al. 1992; Bardakci, 2001; Semagun et al., 2006).
18
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli sampai Oktober 2018 di
Laboratorium Botani (ruang penelitian in vitro), Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Laminar Air Flow
Cabinet (LAF), cawan petri berdiameter 10 cm, botol kultur berukuran
250 ml, gelas ukur bervolume 100 ml dan 500 ml, pinset, alumunium foil,
autoclave, scalpel, mata pisau scalpel, mikropipet, pipet tip,
spektrofotometri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, timbangan analitik
Ohaus, waterbath, microwave, hot plate, petridish, microwave, kuvet, tube
berukuran 0,5 ml, tissue, kertas label, dan kamera.
2. Bahan-bahan Penelitian
Adapun bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah planlet
Cassava (Manihot esculenta Crantz.) kultivar adira-1 yang telah
disterilisasi, asam fusarat murni yang diproduksi oleh Sigma chemical Co.
{Fusaric acid (5-butylpicolinic acid) from Giberella fujikuroi}, alkohol
19
70%, sukrosa, Kalium Hidroksida (KOH), akuades, Benzine Amino Purine
(BAP), Indole-3-Acetic Acid (IAA), Plant Preservative Mixture (PPM),
Asam Chlorida (HCl), Asam Sulfat (H2SO4), Aseton, serta bahan kimia
medium Murashige & Skoog (MS) padat, buffer TBE, agarose, akuabides,
kloroform, buffer TE.
C. Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu
faktor, yaitu asam fusarat yang dibagi atas 5 taraf konsentrasi, yaitu 0 ppm, 20
ppm, 40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm. Masing-masing dari konsentrasi tersebut
dilakukan pengulangan sebanyak 5 kali, dan pada setiap ulangan terdiri atas 2
planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) dalam setiap botol kultur.
Parameter yang diuji yaitu kandungan klorofil total, klorofil a, klorofil b,
kandungan karbohidrat terlarut total, dan analisis pola DNA.
D. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu 1). Penanaman planlet
Manihot esculenta Crantz. yang berumur 1 minggu ke dalam medium MS
yang sebelumnya telah ditambahkan asam fusarat sesuai konsentrasi; 2).
Penentuan kisaran konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet
cassava (Manihot esculenta Crantz.) secara in vitro; 3). Analisis karakter
ekspresi yang spesifik pada planlet cassava yang meliputi analisis kandungan
klorofil total, klorofil a, klorofil b, dan, analisis karbohidrat terlarut total, dan
analisis pola DNA. Tahap penelitian ini, disajikan dalam bentuk bagan alir
pada Gambar 2.
20
Gambar 2. Bagan alir penelitian
Berikut ini merupakan uraian dari tahapan penelitian yang tertera pada bagan alir
(Gambar 2).
LuaranIndikatorPerlakuan
Planlet Manihotesculenta Crantz.berjumlah banyakuntuk stok pengujianberikutnya
Penanaman planletManihot esculentaCrantz. dalammedium MS yangtelah diberi AF
Terjadinyapertumbuhan akar,daun, dan juga tunas
Seleksi planletManihot esculentaCrantz. dengan AFpada berbagaikonsentrasi
Terbentuknyaketahanan padaplanlet Manihotesculenta Crantz.hasil pengimbasanAF
Planlet Manihotesculenta Crantz.yang tahan tidakmenunjukkan layudan tetap tumbuh
Karakterisasi planlet,analisis:
-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b
-kandungankarbohidrat
-pola DNA
Munculnya karakterekspresi Manihotesculenta Crantz.:
-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b yangberbeda dengankontrol
-kandungankarbohidrat terlaruttotal yang berbedadengan kontrol
-pita DNA baruyang berbeda dengankontrol
Terdapat karakterekspresi pada planletManihot esculentaCrantz. :
-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b yangberbeda dengankontrol
-kandungankarbohidrat yangberbeda dengankontrol
-pita DNA baruyang berbeda dengankontrol
21
1. Penanaman planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) dalam medium
MS yang sudah diberi Asam Fusarat
Medium Murashige & Skoog (MS) pada botol kultur yang telah disterilisasi
ditambahkan Asam Fusarat (AF) dengan konsentrasi 0 ppm (kontrol), 20 ppm,
40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm. Asam Fusarat sebelum dipergunakan, terlebih
dahulu dilarutkan dengan akuades, hingga diperoleh konsentrasi yang
ditentukan, kemudian disaring mengunakan kertas saring. Proses penyaringan
dilakukan dalam ruang steril, yaitu di dalam Laminar Air Flow (LAF)
Cabinet. Selanjutnya, Asam Fusarat (AF) ditambahkan ke dalam botol kultur
yang telah disterilisasi. Sebelum digunakan, medium terlebih dahulu
diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar 25ºC, untuk memastikan bahwa AF
telah tersaring dengan baik. Apabila dalam waktu 7 hari tidak terjadi
kontaminasi pada medium, maka medium dapat dipergunakan.
Penanaman planlet Manihot esculenta Crantz. dilakukan pada ruang steril
yaitu di dalam Laminar Air Flow (LAF) Cabinet. Eksplan yang digunakan
yaitu berupa planlet steril. Seluruh planlet yang ada pada botol kultur
dikeluarkan dengan scapel steril, kemudian satu persatu diletakkan di atas
cawan petri dengan diameter 10 cm, lalu setelah itu planlet ditanam pada
masing-masing botol kultur berisi medium dengan perlakuan yang telah
ditentukan. Masing-masing konsentrasi dilakukan dengan 5 kali pengulangan
dan setiap ulangan terdiri dari 2 planlet Manihot esculenta Crantz. pada setiap
botol kultur.
22
2. Seleksi planlet Manihot esculenta Crantz. dengan Asam Fusarat pada
berbagai konsentrasi
Seleksi planlet dilakukan selama 30 hari, pada akhir dari minggu ke-4
dilakukan evaluasi guna untuk mengetahui konsentrasi Asam Fusarat (AF)
yang toleran untuk seleksi planlet Manihot esculenta Crantz. secara in vitro,
data yang diperoleh merupakan data kuantitatif.
a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup
Rumus yang digunakan dalam menghitung jumlah planlet Manihot
esculenta Crantz. yang hidup, menurut Nurcahyani (2014) yaitu:Jumlah planlet hidupJumlah seluruh planlet x 100%3. Karakterisasi planlet Manihot esculenta Crantz.
Karakter dari planlet Manihot esculenta Crantz. yang berhubungan dengan
ketahanan Fusarium oxysporum (Fo) dapat ditinjau melalui visualisisasi dan
persentase planlet hidup, kandungan klorofil total, klorofil a, klorofil b,
kandungan karbohidrat, dan pola DNA.
a. Analisis Kandungan Klorofil
Analisis kandungan klorofil menggunakan daun planlet Manihot esculenta
Crantz. yang telah diimbas dengan asam fusarat, dengan menggunakan
metode Harbourne (1987) dengan spektrofotometer. Adapun langkah-
langkah kerjanya sebagai berikut:
Daun planlet Manihot esculenta Crantz. yang seragam sebanyak 0,1 g
dihilangkan ibu tulang daunnya, lalu digerus dengan mortar (pestle) serta
23
ditambahkan 10 mL aseton 80%. Kemudian, larutan disaring
menggunakan kertas Whatmann No.1, dan dimasukkan ke dalam flakon
lalu ditutup rapat. Larutan sampel serta larutan standar (aseton 80%)
diambil sebanyak 1 mL, lalu dimasukkan ke dalam kuvet. Selanjutnya,
dilakukan pembacaan serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang
gelombang (λ) 646 nm dan 663 nm, dengan ulangan tiap sampel sebanyak
3 kali. Rumus yang digunakan untuk menghitung kandungan klorofil
adalah, sebagai berikut:
Klorofil total = 17,3 λ646 + 7,18 λ663 mg/l
Klorofil a = 12,21 λ663 – 2,81 λ646 mg/l
Klorofil b = 20,13 λ646 – 5,03 λ663 mg/l
b. Kandungan Karbohidrat Terlarut Total
Analisis kandungan karbohidrat terlarut total dilakukan dengan
metode fenol-sulfur (Witham., et al., 1993). Daun planlet Cassava diambil
dan ditimbang sebanyak 0,1 gram dari masing-masing planlet. Daun
ditumbuk dengan mortar lalu diberi 10 ml akuades, lalu disaring dengan
kertas saring Whatman No. 1, setelah itu dimasukkan ke dalam tabung
reaksi. Selanjutnya filtrat diambil sebanyak 1 ml lalu ditambahkan 1 ml
H2SO4 lalu ditambahkan fenol sebanyak 2 ml. Selanjutnya filtrat
dimasukkan ke dalam kuvet dibaca pada panjang gelombang 490 nm.
Kandungan karbohidrat terlarut total dihitung dengan cara membuat
larutan standar glukosa yang terdiri dari beberapa konsentrasi lalu diukur
24
pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm. Data yang
dihasilkan berupa data kuantitatif.
c. Pola DNA planlet Cassava dengan metode RAPD
1. Isolasi DNA planlet cassava
Tahapan isolasi DNA meliputi penggerusan sampel, ekstraksi,
pengendapan, pencucian, dan pelarutan DNA. Jenis reagen yang
digunakan dengan kit tersebut terdiri dari Phytopure I (melisiskan
dinding sel dan membran), Phytopure II (melarutkan membran inti,
plasma dan organel sel serta melisiskan nukleus), dan resin Phytopure
(memisahkan debris dan supernatan dengan kloroform).
Daun planlet Cassava dipotong menjadi bagian-bagian kecil dengan
scalpel steril, lalu ditimbang seberat 0,1 g. Sampel daun kemudian
digerus dengan mortal dan pestle, ditambahkan 500 µL reagen
Phytopure I sambil digerus sampai lembut, kemudian dimasukkan di
dalam tube 1,5 mL. Setelah itu ditambahkan reagen phytopure II
sebanyak 150 µL ke dalam sampel dan dikocok perlahan-lahan
(digoyang dengan tangan). Sampel lalu diinkubasi pada suhu 65ºC di
atas waterbath selama 10 menit, selanjutnya diletakkan di dalam ice
box selama 20 menit, kemudian dimasukkan 400 µL kloroform dingin
dan 20 µL resin Phytopure ke dalam sampel. Sampel kemudian di
sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, supernatan
dipindah ke tube ukuran 1,5 mL. Isopropanol dingin ditambahkan
25
dengan volume yang sama dengan volume supernatan dan
dihomogenkan perlahan-lahan. Kemudian sampel di sentrifuge
kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, supernatan
dibuang dan pelet DNA yang berwarna putih selanjutnya dicuci
dengan menambahkan 50 µL alkohol 70% dan di sentrifuge dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pencucian dengan alkohol 70%
tersebut diulang 3 kali. Sisa-sisa alkohol 70% dibuang, kemudian pelet
DNA dibiarkan mengering. Pelet DNA setelah kering kemudian
ditambahkan buffer TE 50 µL sampai larut lalu disimpan dalam freezer
pada suhu -20oC.
2. Pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi
Sampel DNA sebelum digunakan dalam reaksi PCR, dilakukan
pengujian kualitas dan konsentrasinya dengan menggunakan
GeneQuant (Life Science, Ltd., UK). Sebanyak 2 µL sampel DNA
hasil isolasi, dimasukkan ke dalam kuvet berisi 1998 µL akuabides
steril dan dikocok dengan perlahan-lahan hingga homogen.
Konsentrasi DNA sampel dibaca pada spektrofotometer pada panjang
gelombang 260 dan 280 nm. Rasio konsentrasi DNA sampel pada
masing-masing panjang gelombang digunakan sebagai ukuran kualitas
DNA. Menurut Sambrook et al,. 1989, DNA berkualitas baik bila
memiliki nilai rasio A260/280 = 1,8 – 2,0.
26
d. Analisis pola DNA planlet Cassava dengan metode RAPD
(PCR-RAPD):
Untuk analisis PCR, disiapkan DNA template yang telah dilarutkan
dalam TE, ice box, dan primer yang digunakan (Tabel 1). Kemudian
dibuat premix PCR dengan komposisi: kit KAPPA2G Fast ReadyMix
sebanyak 12,5 µL, primer 2,5 µL pada konsentrasi 100 µM, DNA
template 1,0 µL pada konsentrasi 40 ng/µL, dan dH2O sebanyak 9,0 µL,
sehingga volume totalnya adalah 25,00 µL.
Tabel 1 . Primer RAPD
No Primer Urutan Basa Nukleotida(5’—3’)
Referensi
1 OPA_1 GCT CTG TCC G Minoo et al., 20082 OPA_10 TTA CCC GGA C Minoo et al., 2008
Selanjutnya premix diamplifikasi dengan mesin PCR (GeneAmp 2400).
Kondisi reaksi untuk pelaksanaan proses PCR-RAPD mengikuti metode
Williams et al. (1990) yang dimodifikasi (Tabel 2).
Tabel 2. Kondisi Reaksi PCR-RAPD
Reaksi Temperatur (oC) Waktu (detik)Predenaturasi 95 180
Denaturasi 95 15Annealing 36 15Elongasi 72 30
Post-elongasi 72 420
Siklus :45 x
27
Elektroforesis
Elektroforesis dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut. Dibuat
500 mL buffer TBE1x dengan cara diambil 50 mL larutan buffer
TBE10x, kemudian diencerkan pada gelas ukur 500 mL dengan
ditambahkan akuades sampai tanda 500 mL lalu dihomogenkan. Minigel
agarose 1,5 % (g/v) dibuat dengan cara 1,5 g agarose dimasukkan ke
dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 100 mL TBE1x lalu dihomogenkan.
Kemudian dipanaskan menggunakan microwave (t= 100 ºC; ± 2 menit)
sampai semua larut, ditandai dengan larutan tampak jernih. Larutan
selanjutnya didinginkan sampai suhu lebih kurang 50-55 ºC, lalu
ditambahkan good view sebanyak 5 µL. Agarose cair tersebut dituangkan
ke dalam glassplate dengan sisir tegak lurus. Gel ditunggu sampai
menjendal selama ± 30 menit dan setelah dingin sisir diangkat.
Selanjutnya, sampel DNA sebanyak 25 µL (hasil running PCR) dipipet
dan dimasukkan ke dalam sumuran yang terdapat dalam gel tersebut
dengan menggunakan mikropipet. Sebanyak 10 µL DNA marker
selanjutnya dimasukkan pada sumuran di ujung kiri gel. Gel kemudian
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE
1% (v/v). Selanjutnya dirunning pada tegangan 100 volt selama kurang
lebih 30 menit.
E. Analisis Data
Data penelitian ini berupa data kualitatif dan kuantitatif. Data kualitatif
disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif yang didukung oleh foto.
28
Sedangkan, data kuantitatif ditabulasi dengan faktor konsentrasi yang berbeda.
Analisis data dalam penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap
(RAL), data kuantitatif dari setiap parameter dianalisis dengan menggunakan
Analisis Ragam (Analysis of Variance) atau Anova. Analisis ragam (Anova)
dilakukan pada taraf nyata 5% dan uji lanjut dengan uji BNT (Beda Nyata
Terkecil) pada taraf nyata 5%.
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan, maka dapat disimpulkan
sebagai berikut:
1. Konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava pada
pertumbuhan optimum adalah 80 ppm.
2. Planlet cassava yang tahan terhadap penyakit layu Fusarium menunjukkan
adanya karakter ekspresi yang berbeda dengan planlet cassava yang tidak
tahan terhadap Fusarium oxysporum, yaitu terjadi peningkatan kandungan
klorofil a, klorofil b, klorofil total, serta karbohidrat terlarut total pada
planlet cassava yang tahan terhadap Fusarium oxysporum, seiring dengan
meningkatnya konsentrasi asam fusarat yang diberikan.
3. Pita DNA baru (spesifik) mempunyai ukuran yang bervariasi, tergantung
dari primer yang digunakan. Pita DNA spesifik dengan ukuran 550 bp
(OPA_1), dan 300 bp (OPA_10), dapat diprediksi sebagai kandidat marker
RAPD untuk ketahanan planlet cassava terhadap Fusarium oxysporum.
53
B. Saran
Penggunaan asam fusarat pada konsentrasi 80 ppm dapat dianjurkan untuk
mendapatkan planlet cassava yang tahan terhadap Fusarium oxysporum
dalam jangka waktu yang relatif cepat.
54
DAFTAR PUSTAKA
Agrios, G.N. 2005. Plant Pathology. 5thed. Elsevuer Academic Press, California.
Alexopoulos, C.J. and C.W. Mims. 1979. Introductory Mycology. Champman andHall, London.
Andari, G. 2016. Karakterisasi Planlet Anggrek Tanah (Spathoglottis plicata BI)Hasil Induced Resistance Dengan Asam Fusarat Terhadap Fusariumoxysporum Secara In Vitro. Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Andiyani, Y. 2001. Usaha Pembibitan Anggrek Dalam Botol. Pustaka Baru Press.Yogyakarta. 217p.
Arai, M., and Takeuchi, M. 1993. Influence of Fusarium Wit toxin(s) on camationcell. Plant Cells, Tisuue, and Organ Culture. (34): 287-293.
Azrai M. 2005. Pemanfaatan Markah Molekular dalam Proses Seleksi PemuliaanTanaman. Agro Biogen 1 (1): 26-37.
Azhari A, Nurcahyani E, Qudus HI, dan Zulkifli. 2018. Analisis KandunganProlin Planlet Jeruk Keprok Batu 55 (Citrus reticulata Blanco var.crenatifolia) Setelah Diinduksi Larutan Atonik Dalam Kondisi CekamanKekeringan Secara In Vitro.Analit: Analytical and EnvironmentalChemistry, 3 (01). ISSN E-ISSN 2540-8267.pp. 69-78.
Bacon, C.W, Porter, J.K, Norred W.P, and Leslie, J.F. 1996. Production of FusaricAcid by Fusarium Sp. Applied and Enviromental Microbiologi. 62 (11):4039-4043.
Badan Pusat Statistik (BPS). 2015. Produksi Ubi Kayu. Tersedia Onlinehttps://www.bps.go.id/ , Diakses pada 15 Mei 2018.
Bahri, S. 2010. Klorofil.Diktat Kuliah Kapita Selekta Kimia Organik. UniversitasLampung.
Bardakci F. 2001. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Turk.J Biol. 25: 185-196.
55
Bhatia CR, Nichterlein K, and Maluszynski M. 1999. Oilseed CultivarsDeveloped from Induced Mutations and Mutations Altering Fatty AcidComposition. Mutation Breeding Review (11). IAEA. Vienna. 36 p.
Bobobee, E. 2004. Potential for Mechanised Cassava Production in South Africa.Agricultural Research Council. Institute for Agricultural Engineering(ARC-IAE).
Borrero, C., M.I. Trillas, J. Ordovás, J.C. Tello and M. Aviles. 2004. Predictivefactors for the suppression of Fusarium wilt of tomato in plant growthmedium. Phytopathology 94 (10): 1094- 1101.
Bouizgarne, B, Bouteau HEM, Frankart C, Reboutier D, Madiona K, PennarunAM, Monestiez M, Trouverie J, Amiar Z, Briand J, Brault M, Rona JP,Ouhdouch Y, and Hadrami EI. 2006. Early Physiological Responses ofArabidopsis thaliana Cells to Fusaric Acid: Toxic and Signallling Effects.New Phytologist 169: 209 – 218.
Cahyono, B. 2008. Tomat Usaha Tani & Penanganan Pasca Panen. Kanisius.Yogyakarta.
Campbell, N.A, J.B. Reece and L.G. Mitchell. 2003. Biologi. Alih Bahasa : L.Rahayu, E.I.M Adil, N Anita, Andri, W.F Wibowo, W. Manalu. Erlangga.Jakarta.
Campbell, N.A,and J.B. Reece. 2008. Biologi Edisi Delapan Jilid 2. Erlangga.Jakarta
CGIAR. 2000. Root and tubers in the global food system. A vision statement tothe year 2020.
Chen L and Yamaguchi S. 2005. RAPD Markers for Discriminating TeaGermplasms at The Inter-Specific Level in China. Plant Breeding 124: 404-409.
Christian, V.A., and Vaclavik. 2003. Essential of Food Science Second Edition.Kluwer Academic. London.
Damayanti, F. 2010. Peningkatan Ketahanan Pisang Kepok (Musa ParadisiacaL)Hasil Kultur Jaringan Terhadap Penyakit Layu Fusarium Melalui SeleksiAsam Fusarat. Jurnal Ilmiah Fakor Exacta. 3 (4): 310-319.
Demeke T and Adams RP. 1994. The Use of PCR-RAPD Analysis in PlantTaxonomy and evolution. p. 179-191. In Griffin HG & Griffin AM (Ed.)PCR Technology Current Innovations. CRC. Press. Inc. London.
Dwidjoseputro. 1985. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. PT. Gramedia. Jakarta,Indonesia.
56
Ekman A, Hayden DM, Dehesh K, Bulow L, Stymne S. 2008. Carbon partitioningbetween oil and carbohydrates in developing oat (Avena sativa L.) seeds. JExp Bot 59:4247–4257.
Esmaiel NM, Al-Doss AA, and Barakat MN. 2012. In vitro selection forresistance to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi and detection of geneticpolymorphism via RAPD analysis in carnation. Journal of Medicinal PlantsResearch 6 (23): 3997-4004.
Fauzi, M., Kardhinata, E.H., Putri, L.A. 2015. Identifikasi dan InventarisasiGenotip Tanaman Ubi kayu (Manihot esculenta Crantz) di KabupatenSerdang Bedagai Sumatera Utara. Jurnal Online Agroteknologi. 3 (3): 1082– 1088. ISSN No. 2337- 6597.
Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry Third Edition.Marcel Dekker Inc. NewYork.
Focks N, Benning C. 1998. Wrinkled 1: A novle, low-seed-oil mutant ofArabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation ofcarbohydrate metabolism. Plant Physiol. 118:91–101.
Frankard V. 1992. Lysine and Threonine Enhancement in Crop Plant. Ph.D.Disertasion. Vrije Universiteit Brussel. Belssel. Belgium.
Frankard V., Ghitain M., Jacob M. 1992. Two Feedback-Insensitive Enzymes ofThe Aspartate Pathway in Nicotiana sylvestris. Plant Physiol. 99: 1285-1293.
Groenewald, S. 2006. Biology, Pathogenicity and Diversity of Fusariumoxysporum f.sp. cubense. University of Pretoria etd.
Hafzah MJ. 2003. Bisnis Ubi Kayu. Pustaka Sinar Harapan. Jakarta.
Handayani T, Sastrosumarjo S, Sopandie D, Suharsono, and Setiawan A. 2006.Analisis Marka Morfologi Dan Molekular Sifat Ketahanan Kedelai terhadapIntensitas Cahaya Rendah. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia 8 (1): 43-50.
Harbourne JB. 1987. Metode Fitokimia. Terjemahan: Padmawinata K & Sudiro I.Penerbit ITB Bandung. pp: 259-261.
Hartati D, Rimbawanto A., Taryono, Sulistyaningsih E, and WidyatmokoAYPBC. 2007. Pendugaan Keragaman Genetik di Dalam dan AntarProvenan Pulai (Alstonia scholaris (L.) R. Br. ) Menggunakan penandaRAPD. Jurnal Pemuliaan tanaman Hutan 1(2): 1-9.
Ishak 1998. Identifikasi Keragaman DNA Genom Mutan Padi Atomita-2 danTetuanya Menggunakan RAPD Marker. Zuriat 9 (2): 91-99.
57
Isharnani, E. C., Nurcahyani, E., and Lande, M. L. 2015. Chlorophyll Content ofLeaves of Planlet Ground Orchid (Spathoglottis plicata Blume.) Result ofInduced Resistance of the In Vitro Fusaric Acid. Prosiding SeminarNasional Swasembada Pangan. Politeknik Negeri Lampung. ISBN 978-602-70530-21. Hal. 86-92.
Jumin, H. B. 1989. Ekologi Tumbuhan. Rajawali Press. Jakarta.
Karsinah, Sudarsono, Setyobudi L, and Aswidinnor H. 2002. Keragaman GenetikPlasma Nutfah Jeruk berdasarkan Analisis Penanda RAPD. JurnalBioteknologi Pertanian 7: 8-16.
Kerepesi, I. dan G. Galiba. 2000. Osmotic and Salt Stress-Induced Alteration inSoluble Carbohydrate Content in Wheat Seedlings. Crop Science, 40: 482 –487.
Komar TE. 1999. Marka Genetika dan Aplikasi Dalam Bidang Kehutanan. Lab.Genetika Molekuler. Dep. Kehutanan dan Perkebunan. 25 p.
Koswara, S. 2013. Teknologi Pengolahan Umbi-Umbian. USAID.
Landa BB, Cachinero-Diaz J.M, Lemanceu P, Jimenez-Diaz RM, and AlabouvetteC, 2002. Effect of Fusaric Acid and Phytoanticipins on Growth ofRhizobacteria and Fusarium oxysporum. Canadian Journal of Microbiology48: 971-985.
Lestari, G.E., Sukmadjaja D., dan Mariska I. 2006. Perbaikan KetahananTanaman Vanili Terhadap Penyakit Layu Fusarium Melalui Kultur In Vitro.Jurnal Litbang Pertanian 25 (4) 153.
Minoo D, Jayakumar VN, Veena SS, Vimala J, Basha A, Saji KV, Babu KN, &Peter KV. 2008. Genetic Variations and Interrelationships in Vanillaplanifolia and Few Related Species as Expressed by RAPD Polymorphism.Genet. Resour Crop. 55: 459-470.
Nugroho A. 2000. Pedoman Pelaksanaan Kultur Jaringan. Penebar Swadaya.Jakarta.
Nurcahyani E, Sumardi I, Hadisutrisno B, & Suharyanto E. 2012. PenekananPerkembangan Penyakit Busuk Batang Vanili (Fusarium oxysporum f. sp.vanillae) Melalui Seleksi Asam Fusarat Secara In Vitro. Jurnal Hama danPenyakit Tumbuhan Tropika. Terakreditasi SK No. 110/DIKTI/Kep/2009.ISSN: 1411-7525. Vol. 12 /No. 1: 12-22
Nurcahyani E. 2013. Karakterisasi Planlet Vanili (Vanilla planifolia Andrews)Hasil Seleksi Asam Fusarat Secara In Vitro Terhadap Fusarium oxysporumf. sp. vanillae. Disertasi. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta. 201 p. Tidak Dipublikasikan.
Nurcahyani, E., Hadisutrisno, B., Sumardi, I., & Suharyanto, E. 2014. Identifikasigalur planlet vanili (Vanilla planifolia Andrews) Resisten terhadap infeksi
58
Fusarium oxysporum f. sp. vanillae hasil seleksi in vitro dengan asamfusarat. Prosiding Seminar Nasional: “Pengendalian Penyakit PadaTanaman Pertanian Ramah Lingkungan”. Perhimpunan FitopatologiIndonesia Komda Joglosemar-Fakultas Pertanian UGM. ISBN 978- 602-71784-0-3./2014 Hal. 272- 279.
Nurcahyani E., R. Agustrina, & T.T. Handayani. 2016a. The Protein Profile of thePlantlets of Spathoglottis plicata Bl. Induced Resistance to Fusariumoxysporum. Journal of Plant Science 4(5): 102-105.
Nurcahyani E., Rochmah Agustrina, Erdi Suroso, & Gardis Andari. 2016b.Analysis of Peroxidase Enzyme and Total Phenol from Ground Orchid(Spathoglottis plicata Bl) as Result of the In Vitro Fusaric Acid SelectionToward To Fusarium oxysporum. International Journal of AplliedAgricultural Science 2(6): 79-82.
Nurcahyani E., Sumardi I., Hadisutrisno B., & Suharyanto E., 2017. DNA PatternAnalysis of Vanilla planifolia Andrews Plantlet which Resistant toFussarium oxysporum f. sp.vanillae. WJPLS 3(4): 27-34.
Nurcahyani E, Sumardi, Irawan B, Sari EY, Sari TL. 2019. In Vitro Study:Induced Resistance Of Cassava (Manihot esculenta Crantz.) PlantletAgainst Fusarium oxysporum Based on Analysis of Phenol Content.WJPLS, Vol. 5, Issue 2, 195-198.
Parida R, Mohanty S, Kuanar A, & Nayak S. 2010. Rapid multiplication and invitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissueculture. Electronic Journal of Biotechnology 13 (4): 0717-3458.
Penner GA. 1996. RAPD Analysis of Plant genomes. pp: 251-267. In: Jauhar PP(Ed). Methodes of Genome Analysis in Plant (1). CFC Press. Tokyo.
Poerba YS. 2005 Penampilan Genetik Mutan Talinum paniculatum Jacq. (Gaertn.)Berdasarkan Marka RAPD. In: Perbaikan Genetik Tumbuhan Obat. LaporanTeknik. Bidang Botani. Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Bogor. pp: 316-324.
Putri, Oktavia S.D., Ika, R.S., dan Syamsudin D. 2014. Pengaruh MetodeInokulasi Jamur Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici(sacc.) TerhadapKejadian Penyakit Layu Fusarium Pada Tanaman Tomat (Lycopersiconesculentum Mill. Jurnal HPT (2) 3 ISSN: 2338-4336.
Quing and Hongwen C. 2002. Application of Induced Resistance in CucumberDisease Control. Cucurbit Genetics Cooperative. 25: 11-13.
Rana MK & Bhat KV. 2005. RAPD Markers for Genetic Diversity Study AmongIndian Cotton Cultivars. Current Science 88 (12): 1956 – 1961.
Resmi, S. 2017. Efek Kalium dan Mikoriza Terhadap Planlet Buncis (Phaseolusvulgaris L.) Selama Cekaman Kekeringan Secara In Vitro. UniversitasLampung. Lampung.
59
Riedy MF, Hamilton WJ, and Aquadro JF. 1992. Excess of Non Parental Bandsin Offspring from Know Pedigress Assayed Using RAPD PCR. Nucl. Acids.Res. 20: 918.
Rosyalina N, Nurcahyani E, Qudus HI, Zulkifli. 2018. Pengaruh Larutan AtonikTerhadap Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Jeruk SiamPontianak (Citrus Nobilis Lour. var. Microcarpa Hassk.) Secara In Vitro.Analit: Analytical and Environmental Chemistry 3 (01). pp. 61-68.
Runtunuwu, SD. 2000. Penanda Molekular Ketahanan Tanaman Kelapa TerhadapPenyakit Phytophthora. Disertasi. Program Pascasarjana IPB. Bogor.
Ruzin, S.E. 1999. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford UniversityPress, New York.
Salaki, M. 2000. Biologi sel. Proyek Pengembangan Perguruan Tinggi IndonesiaTimur Kerjasama Universitas Sam Ratulangi Canadian InternasionalDevelopment Agency Simon Fraser University.
Sambrook J, Fritsh JEF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A LaboratoryManual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. pp. 568-500.
Sarjiah., Hariyono., Supangkat, G. 2016. Identifikasi Singkong Varietas LokalKabupaten Gunung Kidul Daerah Istimewa Yogyakarta. Laporan PenelitianUnggulan Prodi. UM Yogyakarta.
Semangun, H. 2001. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. UGM Press.Yogyakarta.754 p.
Semagun K, Bjornstad A, and Ndjiondjop MN. 2006. An Overview of MolecularMarker Methods for Plants. African Journal of Biotechnology 5: 2540-2568.
Setia, J. A. 2016. Kajian efek Asam Salisilat Terhadap Kandungan KarbohidratTerlarut Total dan Klorofil Planlet Pisang Kepok Kuning (Musaparadisisca L. Var. Bluggoe) dalam Kondisi Cekaman Kekeringan SecaraIn Vitro. Universitas Lampung. Lampung.
Soedjanaatmadja. 2008. Peranan Pathogenesis Related (PR)-Protein danFitohormon dalam Menjaga Kelangsungan Kehidupan Tanaman sertaMeningkatkan Produktivitas Hasil Pertanian. Universitas Padjajaran.Bandung.
Soesanto, L. 2008. Pengantar Pengendalian Hayati Penyakit Tanaman. PT. RajaGrafindo Persada. Jakarta.
Soliman HIA. 2012. In vitro Propagation of Apricot (Prunus armeniaca L.) andAssessment of Genetic Stability of Micropropagated Plants Using RAPDAnalysis. World Applied Sciences Journal 19 (5): 674-687.
60
Song dan Banyo, Y. 2011.Konsentrasi Klorofil Daun sebagai IndikatorKekurangan Air pada Tanaman. Jurnal Ilmiah Sains. 11 (2).
Soelistijono. 2015. Kajian Efektifitas Rhizoctonia sp Mikoriza Dataran Rendahdan Sedang pada Tingkat Keparahan Penyakit (Dsi) Anggrek Phalaenopsisamabilis terhadap Fusarium sp. Biosaintifika. 7 (2).
Sukmadjaja D, Purnamaningsih R dan Priyatno, T. P. 2013. Seleksi In Vitro danPengujian Mutan Tanaman Pisang Ambon Kuning untuk Ketahananterhadap Penyakit Layu Fusarium. Jurnal AgroBiogen 9(2):66-76.
Sumardiyono, C., Suharyanto, Suryanti, Rositasari, Chinta. 2015. DeteksiPengimbasan Ketahanan Pisang Terhadap Penyakit Layu Fusarium DenganAsam Fusarat. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia. 19(1): 40–44.
Sriyadi B, Setiamihardja R, Baihaki A, and Astika W. 2001. Identifikasi PembedaRAPD Yang Berpautan dengan Gen Ketahanan Tanaman Teh TerhadapPenyakit Cacar. Zuriat 12(2): 49-57.
Syafi, S. 2008. Respon Morfologis dan Fisiologis Bibit Berbagai Genotip JarakPagar (Jatropha curcas L.)Terhadap Cekaman Kekeringan. IPB. Bogor.
Taiz, L. and Zeiger, E. 1998. Plant Physiology. Second Edition. Sunderland :Sinauer Associates, Inc., Publisher.
Tingey SV, Rafalski JA, and Hanafey MK. 1994. Genetic Analysis with RAPDMarkers. In: Coruzzi C & Puidormenech P (Eds.) Plant Molecular Biologypp: 491-498.
Velasco L, Perz-Vich B, and Fernadez-Martines JM. 1999. The Role ofMutagenesis in The Modification of The Fatty Acid Profile of OilseedCrops. Journal of Applied Genetics 40: 185-209.
Wang R, Ripley VL, Rakow G. 2007. Pod shatter resistance evaluation incultivars and breeding lines of Brassica napus, B. juncea and Sinapis alba.Plant Breed 126:588–595.
Welsh J and McClelland M. 1990. Fingerprinting Genomes Using PCR withArbitrary Primers. Nucl. Acids. Res. 18: 7213-7218.
Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, and Tingey SV. 1990. DNAPolymorphism Amplified by Arbitrary Primers Useful as Genetic Markers.Nucl. Acids. Res. 18: 6531-6535.
Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.Jakarta. Agromedia Pustaka.