ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI PLANLETCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) HASIL INDUCEDRESISTANCE DENGAN ASAM FUSARAT TERHADAP

Fusarium oxysporum SECARA IN VITRO

(Tesis)

Oleh

EVI YUNITA SARI

PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DANILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNGBANDAR LAMPUNG

2019

ABSTRAK

ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI CASSAVA(Manihot esculenta Crantz.) HASIL INDUCED

RESISTANCEDENGAN ASAM FUSARAT TERHADAPFusarium oxysporum SECARA IN VITRO

Oleh

EVI YUNITA SARI

Cassava (Manihot esculenta Crantz.) merupakan salah satu sumber karbohidrat,

dan banyak dimanfaatkan untuk bahan pangan, serta bahan baku industri. Di

Indonesia, cassava merupakan produksi hasil pertanian pangan terbesar kedua

setelah padi. Lampung merupakan provinsi penghasil cassava terbesar di

Indonesia. Jamur Fusarium oxysporum (Fo) menyebabkan penyakit layu pada

tanaman, salah satunya pada cassava, sehingga perlu adanya pengendalian

penyakit secara hayati dengan menggunakan varietas unggul yang tahan terhadap

Fo. Asam fusarat (AF) adalah toksin yang dihasilkan oleh jamur Fo dan banyak

digunakan pada seleksi in vitro pada tanaman. Ketahanan terhadap penyakit dapat

diperoleh dengan cara pengimbasan ketahanan. Tujuan penelitian ini adalah (1)

mengetahui konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava dengan

pertumbuhan optimum, (2) mengetahui dan menganalisis karakter ekspresi planlet

cassava hasil induced resistance terhadap Fusarium oxysporum, meliputi analisis

klorofil a, klorofil b, klorofil total, dan analisis karbohidrat terlarut total. (3)

menganalisis pola pita DNA planlet cassava hasil induced resistance terhadap

Fusarium oxysporum dibandingkan kontrol. Penelitian ini menggunakan

Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor,yaitu konsentrasi AF, terdiri dari 5

taraf: 0 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm pada medium Murashige and

Skoog (MS). Data penelitian ini berupa data kualitatif dan data kuantitatif. Data

kualitatif disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif, sedangkan data kuantitatif

dari setiap parameter dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance,

dengan taraf nyata 5%. Hasil penelitian menunjukkan (1) konsentrasi AF toleran

untuk pertumbuhan optimum planlet cassava adalah 80 ppm. (2) adanya

peningkatan kandungan klorofil a, klorofil b, dan klorofil total, serta karbohidrat

seiring dengan peningkatan konsentrasi AF (3) Adanya pita DNA baru (spesifik)

pada planlet cassava yang tahan terhadap Fo, dengan ukuran 550 bp (OPA_1),

dan 300 bp (OPA_10), dapat diprediksi sebagai kandidat marker Random

Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) untuk ketahanan planlet cassava

terhadap Fo.

Kata kunci: asam fusarat, cassava, Fusarium oxysporum, induced resistance,in vitro

ABSTRACT

ANALYSIS OF DNA PATTERNS AND CHARACTERIZATION OFCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) RESULTS OF INDUCEDRESISTANCE WITH FUSARIC ACID ON Fusarium oxysporum

BY IN VITRO SELECTION

By

EVI YUNITA SARI

Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Is one source of carbohydrates, and is

widely used for food, as well as industrial raw materials. In Indonesia, cassava is

the second largest food crop production after rice. Lampung is the largest cassava

producing province in Indonesia. Fusarium oxysporum (Fo) fungus causes wilt in

plants, one of which is cassava, so it is necessary to control biological disease by

using superior varieties that are resistant to Fo. Fusaric acid (AF) is a toxin

produced by Fo fungi and is widely used in in vitro selection of plants. Disease

resistance can be obtained by means of resistance resilience. The objectives of this

study were (1) knowing the concentration of tolerant fusaric acid for the selection

of cassava plantlets with optimum growth, (2) knowing and analyzing the

expression character of cassava plantlets from induced resistance to Fusarium

oxysporum, including analysis of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll,

and total dissolved carbohydrate analysis. (3) analyze the pattern of DNA bands

of plant cassava results of induced resistance to Fusarium oxysporum compared to

controls. This study used a Completely Randomized Design (CRD) of one factor,

namely the concentration of AF, consisting of 5 levels: 0 ppm, 20 ppm, 40 ppm,

60 ppm, and 80 ppm in the Murashige and Skoog (MS) medium. The research

data is in the form of qualitative data and quantitative data. Qualitative data is

presented in the form of comparative descriptions, while quantitative data from

each parameter are analyzed using Analysis of Variance, with a real level of 5%.

The results showed (1) the concentration of AF tolerant for optimum growth of

the planlet cassava was 80 ppm. (2) an increase in the content of chlorophyll a,

chlorophyll b, and total chlorophyll, and carbohydrates along with an increase in

AF concentration (3) The presence of a new (specific) DNA band in a cassava

plant that is resistant to Fo, with a size of 550 bp (OPA_1), and 300 bp (OPA_10),

can be predicted as a candidate for theRandom Amplification of Polymorphic

(RAPD) marker for the resistance of a cassava plant against Fo.

Keywords: cassava, fusaric acid, Fusarium oxysporum, induced resistance, invitro

ANALISIS POLA DNA DAN KARAKTERISASI PLANLETCASSAVA (Manihot esculenta Crantz.) HASIL

INDUCEDRESISTANCE DENGAN ASAM FUSARATTERHADAP Fusarium oxysporum SECARA IN VITRO

Oleh

EVI YUNITA SARI

TESIS

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai GelarMAGISTER SAINS

PadaProgram Studi Magister Biologi

Jurusan Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Lampung

PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNGBANDAR LAMPUNG

2019

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung, pada 02Juni

1994, yang merupakan anak pertama dari empat

bersaudara pasangan Bapak Irwansyah, S.H. dan Ibu

Ermayati. Riwayat pendidikan penulis yaitu menempuh

pendidikan tingkat dasar di SD Negeri 2 Labuhan Ratu

Bandar Lampung (1999-2005), SMP Negeri 22 Bandar

Lampung (2006-2009) dan SMA Gajah Mada Bandar Lampung (2009-2012).

Pada tahun 2012, penulis tercatat sebagai Mahasiswa Pendidikan Biologi Fakultas

Keguruan dan Ilmu Pendidikan,Universitas Lampung. Pada tahun 2016, penulis

lulus sebagai Sarjana Pendidikan. Pada tahun 2017, penulis melanjutkan

pendidikan S2 dan tercatat sebagai Mahasiswa Program Pascasarjana Magister

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung,

Bandar Lampung.

MOTTO

“Allah tidak akan membebani seseorangmelainkan sesuai kesanggupannya”

(QS. Al-Baqarah: 286)

“Maka sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan.Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan”.

(QS. Al-Insyirah: 5-6)

Dengan menyebut nama Allah yang Maha pengasih lagi Maha penyayang

PERSEMBAHAN

Segala puji hanya milik Allah SWT, atas rahmat dan nikmat yang selaludilimpahkan.

Sholawat serta salam selalu tercurah kepada Rasulullah SAW.

Ku persembahkan karya ini sebagai tanda bakti dan cinta kasihku yang tuluskepada:

Yang tercinta, ayah dan ibuku yang telah mendidikdan membesarkanku dengan segala doa terbaik mereka, kesabaran

dan limpahan cinta dan kasih sayang, selalu mendukung segala langkahkuuntuk mencapai kesuksesan dan kebahagiaan, yang takkan pernah bisa

terbalas sampai kapan pun.

Ketiga adikku tersayang yang selalu memberikan semangat, dukungan, do’a,serta kasih sayangnya untukku, selalu mengingatkanku ketika aku mulai

bosan dan mengeluh, serta selalu mendengarkan segala keluhanku.

Para pendidikku, atas ilmu, nasihat, arahan, dan motivasi yang membuat akumampu untuk melihat betapa indahnya ilmu pengetahuan.

Almamater tercinta, Universitas Lampung.

SANWACANA

Alhamdulillah Puji Syukur kehadirat ALLAH SWT yang Maha Pengasih lagi

Maha Penyanyang, karena atas segala Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulis

dapat menyelesaikan Tesis yang berjudul “Analisis Pola DNA dan

Karakterisasi Planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Hasil Induced

Resistance dengan Asam Fusarat Terhadap Fusarium oxysporum Secara In

Vitro”. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian dengan judul “Analisis

Pola DNA Dan Karakterisasi Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Hasil

Induced Resistance Terhadap Fusarium oxysporum”, yang didanai oleh Hibah

Penelitian Pascasarjana Universitas Lampung, berdasarkan Surat Penugasan

Penelitian Pascasarjana Nomor Kontrak: 1344/UN26.21/PN/2018 Tanggal 25 Juni

2018. Ucapan terimakasih dan penghargaan yang tinggi penulis tujukan kepada

semua pihak yang telah membantu sejak dimulainya kegiatan penelitian sampai

terselesaikannya tesis ini, ucapan terimakasih yang tulus penulis sampaikan

kepada:

1. Ibu Dr. Endang Nurcahyani, M.Si., selaku pembimbing I dan selaku

pembimbing akademik yang telah banyak meluangkan waktu untuk

memberikan bimbingan, semangat, motivasi, ilmu, arahan, ide, nasihat, saran,

dan kritik, dengan penuh kesabaran selama penulisan tesis ini.

2. Bapak Dr. Bambang Irawan, M.Sc., selaku pembimbing II yang telah

meluangkan waktu untuk memberikan bimbingan, semangat, ilmu, arahan,

ide, nasihat, saran, dan kritik, dengan penuh kesabaran selama penulisan tesis

ini.

3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., sebagai pembahas I dan Ketua Program Studi

Magister Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA)

Universitas Lampung yang telah banyak memberikan masukan, arahan,

nasihat, dan meluangkan waktu terhadap penulis dalam menyempurnakan

naskah tesis ini.

4. Ibu Dr. Sri Wahyuningsih, M.Si., sebagai pembahas II yang telah banyak

memberikan masukan, arahan, nasihat, serta meluangkan waktu terhadap

penulis dalam menyempurnakan naskah tesis ini.

5. Kepala Laboratorium Botani, yang telah memberikan izin kepada penulis

untuk dapat melaksanakan penelitian.

6. Ketua Jurusan Biologi, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam (FMIPA) dan Rektor Universitas Lampung atas semua fasilitas yang

telah diberikan.

7. Bapak dan Ibu Dosen yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu,

terimakasih karena telah memberikan banyak ilmu dan pengetahuan kepada

penulis.

8. Teman-teman seperjuangan Magister Biologi Angkatan 2017, Wulan Ayu

Nurfitri, S.Pd., Rizka Arifianti, S.Si., Tika Lidia Sari, S.Pd., Desfika Ardia

Putri, S.Pd., Yogi Kurnia, S.Pd., Novriadi, S.Si., dan Yoharnes, S.Si.,

terimakasih telah memberikan semangat, dukungan serta motivasi kepada

penulis.

Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada semua pihak yang tidak dapat

penulis sebutkan satu persatu atas semua bantuan selama berlangsungnya

penelitian hingga sampai terselesaikannya tesis ini. Semoga ALLAH SWT

memberikan Rahmat dan Karunia-Nya kepada kita semua.

Akhir kata, penulis berharap semoga tulisan ini dapat bermanfaat dan berguna

bagi semua pihak, berguna bagi penulis khususnya dan pembaca pada umumnya.

Bandar Lampung, Juni 2019

Penulis

Evi Yunita Sari

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN PENGESAHAN

ABSTRAK

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1B. Tujuan Penelitian ................................................................................. 4C. Manfaat Penelitian ............................................................................... 5D. Kerangka Pikir …........................... ...................................................... 5E. Hipotesis …............................................................................................. 6

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Cassava(Manihot esculenta Crantz.)..................................................... 7B. Penyakit Layu Fusarium ....................................................................... 8C. Asam Fusarat ......................................................................................... 10D. Ketahanan Terimbas (Induced Resistance) .......................................... 10E. Perbanyakan Tanaman Secara In Vitro ................................................. 12F. Biosintesis Klorofil ............................................................................... 13G. Karbohidrat ........................................................................................... 14H. Deteksi Mutan dengan PCR.................................................................. 15

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 18B. Alat dan Bahan ..................................................................................... 18C. Rancangan Percobaan .......................................................................... 19D. Pelaksanaan penelitian .......................................................................... 19E. Analisis Data ........................................................................................ 27

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Visualisasi dan Persentase Planlet Hidup Cassava .............................. 30B. Konsentrasi Asam Fusarat Toleran ...................................................... 32C. Karakterisasi Planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) ................ 34

1.Analisis Kandungan Klorofil ............................................................ 352.Analisis Kandungan Karbohidrat Terlarut Total .............................. 383.Analisis Pola DNA Cassava ............................................................. 41

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan ............................................................................................... 52B. Saran .................................................................................................... 53

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 54

LAMPIRAN .................................................................................................... 61

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Primer RAPD ....................................................................................... 26

2. Kondisi Reaksi PCR-RAPD................................................................. 26

3. Persentase Visualisasi Planlet Cassava Hasil Induced Resistancedengan Berabagai Konsentrasi Asam Fusarat (AF) ............................ 30

4. Persentase Jumlah Planlet Hidup Cassava Hasil Induced Resistancedengan Berbagai Konsentrasi Asam Fusarat (AF)............................... 32

5. Kandungan Klorofil Daun Cassava (Manihot esculenta Crantz.)Hasil Pengimbasan .............................................................................. 35

6. Rata-rata kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Cassava(mg/g Jaringan) ................................................................................... 38

7. Hasil pengukuran kemurnian DNA dan konsentrasi DNA 12 sampelplanlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dan diimbas asamfusarat (20,40, 60, dan 80 ppm) ........................................................... 42

8. Jumlah pita hasil amplifikasi PCR-RAPD pada planlet cassava yangtidak diimbas (kontrol) dan diimbas asam fusarat (20, 40, 60, dan 80ppm) ..................................................................................................... 43

9. Pola pita DNA planlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dandiimbas asam fusarat (20,40, 60, dan 80 ppm) dengan primerOPA_1.................................................................................................. 45

10. Pola pita DNA planlet cassava yang tidak diimbas (kontrol) dandiimbas asam fusarat (20, 40, 60, dan 80 ppm) denganprimer OPA_10 .................................................................................... 46

11. Analisis Ragam Single Faktor Kandungan Klorofil a, Klorofil b,Klorofil Total, dan Kandungan Karbohidrat Terlarut Total ................ 67

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur Klorofil................................................................................... 13

2. Bagan Alir Penelitian ........................................................................... 20

3. Planlet Cassava Dengan Berbagai Konsentrasi Asam Fusarat ............ 33

4. Pola Pita DNA Cassava ....................................................................... 47

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Cassava (Manihot esculenta Crantz.) adalah keamanan pangan, industri, dan

energi penting di dunia. Akarnya menyediakan makanan karbohidrat bagi

lebih dari 800 juta orang. Produksi Cassava global pada tahun 2012 adalah

282 juta ton, dengan 56% diproduksi oleh Afrika, 30% oleh Asia dan 14% di

Amerika Selatan (Bobobee, 2009).

Cassava merupakan komoditas pangan penting di Indonesia, dan ke depan

komoditas ini akan semakin strategis peranannya bagi kehidupan masyarakat

dan perekonomian negara. Berdasarkan areal panen komoditas pangan,

cassava (Manihot esculenta Crantz.) menduduki urutan ketiga setelah padi

dan jagung, yang ketiganya sebagai sumber karbohidrat utama masyarakat

(Fauzi, dkk., 2015).

Badan Pusat Statistik (BPS) mencatat bahwa produksi cassava (Manihot

esculenta Crantz.) sejak tahun 1993 sampai dengan tahun 2015 Provinsi

Lampung merupakan yang paling besar pada tiap tahunnya dibandingkan

dengan Provinsi lain di Indonesia. Tercatat bahwa produksi cassava (Manihot

2

esculenta Crantz.) di Provinsi Lampung pada tahun 2015 sebanyak 7.387.084

ton (BPS, 2015).

Kementerian Pertanian Republik Indonesia terus berupaya menurunkan

tingkat konsumsi beras masyarakat dengan mencari pengganti pangan

lainnya, seperti halnya cassava. Karenanya, Kementan terus menggulirkan

program Gengsi Cassava untuk memperkuat ketahanan pangan alternatif

(Fauzi, dkk., 2015).

Disamping itu terdapat kendala produksi dalam pembudidayaan cassava yang

sering dialami oleh petani, antara lain penyakit layu Fusarium. Layu

Fusarium disebabkan oleh jamur Fusarium oxysporum yang hingga saat ini

masih belum dapat diatasi secara efektif. Sejauh ini dalam pengendaliaannya

petani masih menggunakan fungisida, sedangkan fungisida itu sendiri

memiliki dampak negatif yaitu dapat merusak lingkungan. Sehingga perlu

adanya pengendalian secara hayati (Soelistijono, 2015).

Cara alternatif yang dapat dilakukan dalam pengendalian penyakit dan tidak

menimbulkan dampak negatif, seperti halnya dalam penggunaan fungisida

yaitu dengan menggunakan varietas unggul yang tahan terhadap Fusarium

oxysporum (Fo) (Nurcahyani, dkk., 2012). Penggunaan komponen

penyeleksi pada media kultur in vitro seperti asam fusarat dapat

menyebabkan tanaman memiliki sifat yang lebih terarah sesuai dengan yang

diinginkan, sehingga lebih efektif dan efisien dalam menangani penyakit,

3

contohnya penyakit yang diakibatkan oleh Fusarium oxysporum (Damayanti,

2010). Asam fusarat merupakan metabolit yang dihasilkan oleh beberapa

spesies jamur dari genus Fusarium (Landa et al., 2002).

Ketahanan terhadap penyakit dapat diperoleh dengan cara pengimbasan

ketahanan, yaitu perlakuan sebelum infeksi patogen dengan senyawa kimia

maupun dengan inokulasi mikroorganisme nonpatogenik. Perlakuan ini

dinamakan ketahanan terimbas atau induced resistance (Sumardiyono, dkk.,

2015).

Salah satu alternatif cara pengendalian penyakit yang efisien, efektif dan

aman terhadap lingkungan, antara lain menggunakan varietas yang resisten.

Penggunaan varietas unggul yang tahan terhadap Fo dan kekeringan dengan

daya hasil tinggi merupakan salah satu alternatif pengendalian penyakit dan

cekaman kekeringan yang penting dan tidak menimbulkan dampak negatif

(Nurcahyani et al., 2016a; Nurcahyani et al., 2016b; Nurcahyani et al., 2017;

Azhari et al., 2018; Rosyalina et al., 2018; Nurcahyani et al., 2019).

Pengembangan varietas planlet tahan Fo dapat dilakukan antara lain dengan

metode seleksi in vitro yaitu mengkulturkan eksplan berupa jaringan atau

organ pada medium yang mengandung asam fusarat konsentrasi selektif

(Nurcahyani et al., 2016a; Nurcahyani et al., 2016b; Nurcahyani et al., 2014;

Nurcahyani et al., 2017; Nurcahyani et al., 2019).

4

Keragaman genetik pada planlet cassava akibat perlakuan dengan asam

fusarat dapat dideteksi dengan penanda molekular, salah satunya adalah

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Metode RAPD adalah

penanda berbasis Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan

10 basa primer acak (Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990).

Penggunaan asam fusarat dalam konsentrasi yang toleran sejauh ini belum

pernah dilaporkan secara pasti dan tepat dalam pengimbasan ketahanan

(Induced Resistance) planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) terhadap

Fusarium oxysporum. Oleh karena itu, penelitian mengenai peranan asam

fusarat sebagai pengimbas ketahanan secara in vitro perlu untuk dilakukan.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut.

1. Mengetahui konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava

dengan pertumbuhan optimum.

2. Mengetahui dan mengalisis karakter ekspresi planlet cassava hasil

induced resistance terhadap Fusarium oxysporum, meliputi analisis

klorofil a, klorofil b, klorofil total, dan karbohidrat terlarut total.

3. Menganalisis pola pita DNA planlet cassava hasil induced resistance

terhadap Fusarium oxysporum dibandingkan kontrol.

5

C. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang tahapan

untuk menghasilkan planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) yang tahan

terhadap Fusarium oxysporum (Fo), sehingga diharapkan dapat memberikan

kontribusi dalam pengembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang

pemuliaan dan penyakit tanaman.

D. Kerangka Pikir

Cassava (Manihot esculenta Crantz.) merupakan tanaman yang sangat banyak

dibudidayakan di Indonesia, hal ini dikarenakan singkong merupakan salah

satu bahan makanan pokok, pengganti nasi. Akan tetapi dalam proses

penanamannya sering kali terkendala oleh adanya serangan jamur pathogen

penyebab penyakit layu Fusarium.

Penyakit layu pada cassava (Manihot esculenta Crantz.) disebabkan oleh

jamur Fusarium oxysporum. Tanaman Cassava yang terserang penyakit ini

akan menunjukkan gejala yaitu daunnya menguning dan mengeriput seperti

kekurangan air. Pada umumnya, pengendalian layu Fusarium dilakukan hanya

dengan menggunakan fungisida, tetapi penggunaan fungisida dapat

berdampak buruk bagi lingkungan dan kesehatan manusia. Untuk itu,

pengendalian yang aman dan tidak membahayakan sangat diperlukan. Salah

satu pengendalian yang aman terhadap lingkungan adalah pengendalian

hayati. Pengendalian tersebut dilakukan dengan cara mengimbas asam fusarat

6

pada planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) secara in vitro untuk

meningkatkan ketahanan tanaman terhadap infeksi patogen.

Asam fusarat (AF) adalah toksin yang dihasilkan oleh Fusarium oxysporum

yang dapat menginduksi tanaman sehingga memberikan respon dalam

menghambat aktivitas patogen dengan memproduksi senyawa fitoaleksin.

Fitoaleksin adalah senyawa respons dari tanaman yang bersifat fungitoksik,

sehingga pemberian asam fusarat diharapkan mampu meningkatkan senyawa

fungitoksik di dalam tanaman yang pada akhirnya mampu menghambat

pertumbuhan jamur Fusarium oxysporum. Ketahanan terimbas (induced

resistance) merupakan ketahanan yang terekspresi setelah patogen menyerang.

Induced resistance dapat dijadikan sebagai cara alternatif untuk mendapatkan

tanaman tahan terhadap penyakit karena tanaman mampu menstimulasi

mekanisme resistensi alami.

E. Hipotesis

Hipotesis pada penelitian ini adalah, sebagai berikut:

1. Terdapat konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava

dengan pertumbuhan optimum.

2. Terdapat karakter ekspresi planlet cassava hasil induced resistence

terhadap Fusarium oxysporum berdasarkan, kandungan klorofil a, klorofil

b, klorofil total, kandungan karbohidrat terlarut total, dan pola DNA.

3. Terdapat pola pita DNA baru planlet cassava hasil induced resistance

dengan Fusarium oxysporum dibandingkan dengan kontrol.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Cassava (Manihot esculenta Crantz.)

Cassava (Manihot esculenta Crantz) yang termasuk dalam famili

Euphorbiaceae merupakan tanaman yang sudah lama dikenal dan

dibudidayakan oleh masyarakat Indonesia. Hal tersebut terlihat dari daerah

penyebaran komoditas tersebut di hampir seluruh provinsi di Indonesia.

Cassava sebagai sumber karbohidrat, dan banyak dimanfaatkan untuk bahan

pangan, pakan, serta bahan baku industri (Hafzah, 2003). Sebanyak 2,5 milyar

penduduk di Asia, Afrika, dan Amerika Latin menggunakan ubi kayu sebagai

bahan pangan, pakan, dan sumber pendapatan (CGIAR, 2000).

Di Indonesia, cassava merupakan produksi hasil pertanian pangan ke dua

terbesar setelah padi, sehingga cassava mempunyai potensi sebagai bahan

baku yang penting bagi berbagai produk pangan dan industri. Sebagai

makanan manusia, cassava mempunyai beberapa kekurangan diantaranya

kadar protein dan vitamin yang rendah serta nilai gizi yang tidak seimbang.

Disamping itu beberapa jenis cassava mengandung racun HCN yang terasa

pahit. Dari dasar itulah secara lokal singkong dibagi menjadi cassava pahit dan

cassava manis (Koswara, 2013). Cassava merupakan tanaman yang sangat

familiar dengan kondisi lingkungan, bahkan ada pernyataan bahwa selama

8

batang cassava menyentuh tanah maka dipastikan tunasnya akan tumbuh

(Sarjiah, dkk., 2016). Produksi cassava di Indonesia tercatat sebanyak

21.801.415 ton pada tahun 2015 (BPS, 2015). Sentra lahan cassava di

Indonesia dikuasai oleh Provinsi Lampung dengan luas lahan panen 342,100

ha pada tahun 2012. Tercatat bahwa produksi cassava di Provinsi Lampung

pada tahun 2015 sebanyak 7.387.084 ton (BPS, 2015).

2.2 Penyakit Layu Fusarium

Fusarium oxysporum adalah salah satu spesies dari genus Fusarium yang

merupakan patogen tular tanah. Berdasarkan tanaman inang yang

diinfeksinya, F. oxysporum dibagi kembali menjadi forma-forma spesialis

tertentu (Semangun, 2001). Adapun klasifikasi dari jamur Fusarium

oxysforum menurut Semangun (2001) adalah:

Kerajaan : Fungi

Filum : Ascomycota

Kelas : Sordariomycetes

Bangsa : Hypocreales

Suku : Nectriaceae

Marga : Fusarium

Jenis : Fusarium oxysporum

Jamur Fusarium oxysporum menyebabkan penyakit layu pada tanaman.

Penyakit tersebut dapat berkembang dengan didukung oleh kelembaban tanah

yang rendah serta suhu tanah yang hangat yaitu 80°F (Cahyono, 2008).

Perakaran menjadi busuk dan dapat meluas ke atas sampai ke pangkal batang.

9

Fo merupakan pathogen pada tanaman yang dapat bertahan secara alami di

dalam medium tumbuh dan pada akar-akar tanaman yang sakit, dan melalui

akar yang luka dapat menimbulkan infeksi. Jika akar rimpang dipotong akan

tampak bahwa epidermis dan hypodermis berwarna ungu, sedangkan floem

dan xylem berwarna merah muda, dan akhirnya seluruh akar rimpang menjadi

warna ungu (Semangun, 2001).

Jamur Fusarium oxysporum (Fo) adalah salah satu jenis patogen tular tanah

yang menyebar melalui tanah atau rimpang dari tanaman sakit, dan

menginfeksi tanaman melalui luka yang terjadi karena pengangkutan benih,

penyiangan, atau karena serangga dan nematoda. Di dalam jaringan tanaman

yang terinfeksi akan terbentuk miselium yang berkembang sampai mencapai

pembuluh xilem, sehingga menyebabkan terhalangnya trasportasi unsur hara

dan akhirnya tanaman layu (Putri dkk, 2014; Semangun, 1996).

Siklus hidup Fusarium oxysporum terdapat dua fase yaitu patogenesis dan

saprogenesis. Pada fase patogenesis, jamur hidup sebagai parasit pada

tanaman inang. Jika tidak ada tanaman inang, maka jamur fusarium akan

hidup di dalam tanah sebagai saprofit pada sisa tanaman dan masuk ke fase

saprogenesis, yang kemudian dapat menjadi sumber inokulum untuk

menimbulkan penyakit pada tanaman lain (Groenewald, 2006). Penyakit layu

Fusarium dapat meyerang bunga, pucuk daun, daun, dan pangkal daun, dan

hingga meluas sampai ke batang tanaman (Lestari, 2002).

10

2.3 Asam Fusarat

Asam fusarat adalah toksin yang dihasilkan oleh jamur Fusarium oxysporum,

banyak digunakan pada seleksi in vitro pada tanaman (Bacon et al., 1996).

Cara untuk mendapatkan tanaman yang tahan terhadap layu fusarium yaitu

dengan menginduksikan toksin yang dihasilkan oleh Fusarium oxysporum

pada tanaman (Sukmadjaja dkk., 2013).

Konsentrasi asam fusarat yang nontoksik (dibawah 10-6 M) dapat mengimbas

sintesis fitoaleksin, suatu bentuk tanggapan tanaman untuk menghambat

aktivitas pathogen (Bouizgarne et al., 2006). Induksi asam fusarat juga dapat

meningkatkan senyawa H2O2 pada medium kultur, dimana H2O2 besifat

toksik bagi patogen. Sebaliknya AF pada konsentrasi toksik akan

menyebabkan kematian pada tanaman (Bouizgarne et al., 2006). Penggunaan

asam fusarat sebagai agen penyeleksi dalam seleksi in vitro dapat

menghasilkan sel atau jaringan mutan yang insensitif terhadap asam fusarat,

sehingga setelah diregenerasi menjadi tanaman dapat menghasilkan galur

yang resisten terhadap infeksi patogen.

2.4 Ketahanan Terimbas (Induced Resistance)

Ketahanan terimbas merupakan proses pengaktifan ketahanan alami tanaman,

seperti penambahan sel lignin, produksi fitoaleksin, peningkatan enzim

peroksidase dan kandungan klorofil (Agrios, 2005), yang diaktifkan oleh

agensia biotik atau abiotik (Soesanto, 2008). Induced resistance merupakan

strategi pengendalian yang efektif, karena tanaman dapat meningkatkan

11

kemampuan dalam menahan serangan patogen seperti jamur, bakteri dan virus

(Quing and Hongwen, 2002).

Patogen yang menginfeksi tanaman akan dihambat pertumbuhannya oleh

senyawa toksin yang dihasilkan dari reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel

atau jaringan (Agrios, 2005). Tanaman akan melakukan respon pertahanan diri

terhadap serangan pathogen tertentu. Respon pertahanan tanaman terhadap

patogen menurut Campbell, et al. (2003) melalui beberapa tahapan yaitu

jaringan tumbuhan yang terinfeksi akan mengalami mekanisme resistensi

spesifik yang didasarkan pada pengikatan ligan patogen ke dalam reseptor sel

spesifik, pengikatan tersebut merupakan tahap identifikasi yang memicu jalur

transduksi sinyal, dan akan menghasilkan respon hipersensitif.

Tahapan pembentukan Induced resistance dalam tumbuhan menurut

Campbell et al (2008) sebagai berikut:

1. Pengenalan gen untuk gen

suatu bentuk resistensi terhadap penyakit yang dimiliki oleh tumbuhan

yang melibatkan pengenalan molekul-molekul yang berasal dari patogen

oleh produk-produk protein dari gen-gen resisten, sehingga mampu untuk

memacu jalur tranduksi sinyal yang menyebabkan aktivasi respon-respon

pertahanan yang mencakup respons hipersensitif.

2. Respons hipersensitif

respon pertahanan yang menyebabkan kematian sel dan jaringan daerah

yang terkena infeksi patogen, untuk membatasi penyebaran patogen.

12

Respons hipersensitif juga menginduksi produksi Pathogenesis Related-

protein (PR-protein), salah satu PR-protein adalah enzim peroksidase

yang berperan penting dalam proses lignifikasi, agar tumbuhan resisten

terhadap serangan patogen.

PR-protein merupakan protein spesifik yang terdapat pada tanaman dan

berfungsi untuk mempertahankan kelangsungan kehidupan tanaman,

khususnya dalam menangkal serangan dari patogen yang berbahaya bagi

tanaman tersebut. Setiap tanaman akan memberi respon yang spesifik

apabila terkena serangan patogen dari luar, dengan jalan meningkatkan

sintesis PR-protein (Soedjanaatmadja, 2008).

2.5 Perbanyakan Tanaman secara in vitro

Teknik kultur jaringan atau kultur in vitro merupakan salah satu cara

perbanyakan tanaman yang efektif karena dapat menghasilkan jumlah

tanaman yang banyak dan seragam dalam waktu yang relatif singkat.

Keberhasilan teknik kultur jaringan dipengaruhi oleh penggunaan media

buatan yang mengandung nutrisi yang lengkap, adanya zat pengatur tumbuh

(ZPT), kondisi ruang kultur yang steril, suhu dan pencahayaan yang

terkontrol (Yusnita, 2003). Faktor yang mendukung pertumbuhan dan

perkembangan tanaman secara in vitro yaitu faktor lingkungan seperti pH,

kelembapan, cahaya, dan temperatur (Nugroho, 2000).

Metode in vitro dapat digunakan untuk menciptakan varietas-varietas

13

tumbuhan baru dengan menumbuhkan tanaman utuh dari bagian-bagian

tanaman induknya seperti daun, mata tunas serta menumbuhkannya pada

medium buatan yang mengandung berbagai nutrient dan hormon (Campbell

et al., 2008). Perbanyakan tanaman secara in vitro mendatangkan banyak

keuntungan, yaitu lingkungan terkontrol dan kondisi yang aseptik pada

ruangan mengakibatkan bahan (medium) tanam yang akan digunakan

terbebas dari kontaminasi jamur dan bakteri (Andiyani, 2001).

2.6 Biosintesis Klorofil

Klorofil merupakan molekul kompleks yang berperan penting dalam proses

fotosintesis yaitu sebagai pengabsorbsi cahaya, transfer energi, transfer

elektron (Taiz and Zeiger, 1998) dan katalisator pada tumbuhan. Klorofil

bersama dengan CO2, air, dan cahaya matahari berperan dalam membentuk

karbohidrat pada proses fotosintesis (Jumin, 1989). Ketersediaan air dan unsur

hara dari dalam tanah berperan penting dalam sintesis klorofil (Syafi, 2008).

Adapun struktur klorofil a dan klorofil b, sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur Klorofil a) Klorofil a, b) Klorofil b(Song dan Banyo, 2011)

a b

14

Klorofil adalah katalisator fotosintesis yang penting dan terdapat di

semesta sebagai pigmen hijau dalam semua jaringan tumbuhan hijau

(Dwijoseputro, 1985). Klorofil merupakan faktor utama yang

mempengaruhi fotosintesis. Fotosintesis merupakan proses perubahan

senyawa anorganik (CO2 dan H2O) menjadi senyawa organik (karbohidrat)

dan O2 dengan bantuan cahaya matahari (Bahri, 2010). Pada tumbuhan

tingkat tinggi, klorofil a dan klorofil b merupakan pigmen utama

fotosintetik, yang berperan menyerap cahaya violet, biru, merah dan

memantulkan cahaya hijau (Salaki 2000).

Fungsi utama klorofil dalam proses fotosintesis adalah memanfaatkan

energi matahari, memicu fiksasi CO untuk menghasilkan karbohidrat dan

menyediakan energi bagi ekosistem secara keseluruhan. Karbohidrat yang

dihasilkan dalam fotosintesis diubah menjadi protein, lemak, asam nukleat

dan molekul organik lainnya. Klorofil menyerap cahaya yang berupa

radiasi elektromagnetik pada spektrum kasat mata (visible). Klorofil dapat

menampung cahaya yang diserap oleh pigmen lainnya melalui fotosintesis,

sehingga klorofil disebut sebagai pigmen pusat reaksi fotosintesis (Bahri,

2010).

2.7 Karbohidrat

Karbohidrat merupakan senyawa organik yang mengandung karbon,

hydrogen, dan oksigen, baik dalam bentuk molekul sederhana maupun

kompleks (Christian, et al., 2003). Karbohidrat meliputi lebih dari 90% berat

15

kering tanaman. Penggunaannya sangat luas dan jumlah penggunaannya

cukup besar (Fennema, 1996). Baik untuk pemanis, pengental, penstabil,

gelling agents, dan fat replacer (Christian et al., 2003). Karbohidrat dapat

dimodifikasi baik secara kimia dan biokimia dan modifikasi itu digunakan

untuk memperbaiki sifat dan memperluas penggunaannya. Perubahan

karbohidrat menjadi bentuk tertentu sangat penting, karena ada hubungan

secara langsung dengan proses fisiologis seperti fotosintesis, translokasi, dan

respirasi. Terdapat beberapa macam karbohidrat terlarut, yaitu sukrosa,

glukosa, dan fruktan (Kerepesi, et al., 2000).

Protein dan karbohidrat dua komponen yang erat kaitannya dengan dalam

mengembangkan benih selama biosintesis lipid (Wang et al, 2007; Ekman et

al 2008.). Karbohidrat dalam fotosintesis merupakan bentuk asimilasi dari

jaringan hijau seperti siliques dan daun, dan memainkan peran ganda dalam

metabolisme sel. Pertama, karbohidrat seperti sukrosa yang dihasilkan oleh

fotosintesis di jaringan hijau adalah prekursor dan substrat penting untuk

biosintesis asam lemak (Focks and Benning, 1998). Kedua, konversi

karbohidrat menjadi lemak, protein, dan metabolit sekunder seperti serat

adalah sistem regulasi selama perkembangan benih (Ekman et al, 2008).

2.8 Deteksi Mutan dengan PCR

Penampilan suatu individu merupakan hasil kerja dari suatu trait atau sifat.

Trait ini dikendalikan atau ditentukan oleh molekul yang di dalamnya terdapat

gen. Sifat (trait) yang terwakili dari molekul tersebut mengikuti pola

16

pewarisan Mendel seperti kebebasan segregasi dan random assortment.

Karakter molekul yang membawa sifat inilah yang dapat dijadikan sebagai

suatu penanda atau marker. Karena satuan terkecil berbentuk molekul maka

penanda ini selanjutnya disebut sebagai penanda atau marka molekular

(Komar, 1999).

Seiring dengan semakin berkembangnya teknologi yang berbasis marka DNA,

maka saat ini telah ditemukan tiga tipe marka DNA dengan segala kelebihan

dan kekurangan masing-masing (Semagn et al., 2006). Ke tiga tipe marka

DNA adalah: (1) marka yang berdasarkan pada hibridisasi DNA seperti

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); (2) marka yang

berdasarkan pada reaksi rantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)

dengan menggunakan sekuen-sekuen nukleotida sebagai primer, seperti

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), dan Amplified Fragment

Length Polymorphism (AFLP); dan (3) marka yang berdasarkan pada PCR

dengan menggunakan primer yang menggabungkan sekuen komplementer

spesifik dalam DNA sasaran, seperti Sequence Tagged Sites (STS), Sequence

Characterized Amplified Regions (SCARs), Simple Sequence Repets (SSRs)

atau mikrosatelit (microsatellites), dan Single Nucleotide Polymorphism

(SNPs) (Azrai, 2005; Semagun et al., 2006).

Prinsip kerja marka RAPD adalah berdasarkan perbedaan amplifikasi PCR

pada sampel DNA dari sekuen oligonukleotida pendek yang secara genetik

merupakan kelompok marka dominan (Williams et al. 1990; Welsh & Mc

17

Clelland, 1990). Primer RAPD bersifat random dengan ukuran panjang

biasanya 10 nukleotida. Jumlah produk amplifikasi PCR berhubungan

langsung dengan jumlah dan orientasi sekuen yang komplementer terhadap

primer di dalam genom tanaman (Bardakci, 2001; Semagun et al., 2006).

Keunggulan dari teknik analisis menggunakan marka RAPD antara lain adalah

(1) kuantitas DNA yang dibutuhkan sedikit, (2) hemat biaya, (3) mudah

dipelajari, dan (4) primer yang diperlukan sudah banyak dikomersialisasikan

sehingga mudah diperoleh. Kelemahan teknik ini antara lain: (1) tingkat

reproduksibilitas pola marka dari laboratorium ke laboratorium berbeda dan

antara hasil percobaan dalam laboratorium itu sendiri yang sama, (2) sangat

sensitif terhadap variasi dalam konsentrasi DNA, dan (3) memerlukan

konsentrasi primer dan kondisi siklus suhu yang optimal pada saat pengujian.

Selain itu, marka RAPD dominan dan tidak mampu menampilkan perbedaan

sekuen DNA yang homolog, di antara pita-pita yang ukurannya hampir sama

(Riedy et al. 1992; Bardakci, 2001; Semagun et al., 2006).

18

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli sampai Oktober 2018 di

Laboratorium Botani (ruang penelitian in vitro), Jurusan Biologi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat-alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Laminar Air Flow

Cabinet (LAF), cawan petri berdiameter 10 cm, botol kultur berukuran

250 ml, gelas ukur bervolume 100 ml dan 500 ml, pinset, alumunium foil,

autoclave, scalpel, mata pisau scalpel, mikropipet, pipet tip,

spektrofotometri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, timbangan analitik

Ohaus, waterbath, microwave, hot plate, petridish, microwave, kuvet, tube

berukuran 0,5 ml, tissue, kertas label, dan kamera.

2. Bahan-bahan Penelitian

Adapun bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah planlet

Cassava (Manihot esculenta Crantz.) kultivar adira-1 yang telah

disterilisasi, asam fusarat murni yang diproduksi oleh Sigma chemical Co.

{Fusaric acid (5-butylpicolinic acid) from Giberella fujikuroi}, alkohol

19

70%, sukrosa, Kalium Hidroksida (KOH), akuades, Benzine Amino Purine

(BAP), Indole-3-Acetic Acid (IAA), Plant Preservative Mixture (PPM),

Asam Chlorida (HCl), Asam Sulfat (H2SO4), Aseton, serta bahan kimia

medium Murashige & Skoog (MS) padat, buffer TBE, agarose, akuabides,

kloroform, buffer TE.

C. Rancangan Percobaan

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu

faktor, yaitu asam fusarat yang dibagi atas 5 taraf konsentrasi, yaitu 0 ppm, 20

ppm, 40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm. Masing-masing dari konsentrasi tersebut

dilakukan pengulangan sebanyak 5 kali, dan pada setiap ulangan terdiri atas 2

planlet cassava (Manihot esculenta Crantz.) dalam setiap botol kultur.

Parameter yang diuji yaitu kandungan klorofil total, klorofil a, klorofil b,

kandungan karbohidrat terlarut total, dan analisis pola DNA.

D. Pelaksanaan Penelitian

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu 1). Penanaman planlet

Manihot esculenta Crantz. yang berumur 1 minggu ke dalam medium MS

yang sebelumnya telah ditambahkan asam fusarat sesuai konsentrasi; 2).

Penentuan kisaran konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet

cassava (Manihot esculenta Crantz.) secara in vitro; 3). Analisis karakter

ekspresi yang spesifik pada planlet cassava yang meliputi analisis kandungan

klorofil total, klorofil a, klorofil b, dan, analisis karbohidrat terlarut total, dan

analisis pola DNA. Tahap penelitian ini, disajikan dalam bentuk bagan alir

pada Gambar 2.

20

Gambar 2. Bagan alir penelitian

Berikut ini merupakan uraian dari tahapan penelitian yang tertera pada bagan alir

(Gambar 2).

LuaranIndikatorPerlakuan

Planlet Manihotesculenta Crantz.berjumlah banyakuntuk stok pengujianberikutnya

Penanaman planletManihot esculentaCrantz. dalammedium MS yangtelah diberi AF

Terjadinyapertumbuhan akar,daun, dan juga tunas

Seleksi planletManihot esculentaCrantz. dengan AFpada berbagaikonsentrasi

Terbentuknyaketahanan padaplanlet Manihotesculenta Crantz.hasil pengimbasanAF

Planlet Manihotesculenta Crantz.yang tahan tidakmenunjukkan layudan tetap tumbuh

Karakterisasi planlet,analisis:

-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b

-kandungankarbohidrat

-pola DNA

Munculnya karakterekspresi Manihotesculenta Crantz.:

-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b yangberbeda dengankontrol

-kandungankarbohidrat terlaruttotal yang berbedadengan kontrol

-pita DNA baruyang berbeda dengankontrol

Terdapat karakterekspresi pada planletManihot esculentaCrantz. :

-kandungan klorofiltotal, klorofil a,klorofil b yangberbeda dengankontrol

-kandungankarbohidrat yangberbeda dengankontrol

-pita DNA baruyang berbeda dengankontrol

21

1. Penanaman planlet Cassava (Manihot esculenta Crantz.) dalam medium

MS yang sudah diberi Asam Fusarat

Medium Murashige & Skoog (MS) pada botol kultur yang telah disterilisasi

ditambahkan Asam Fusarat (AF) dengan konsentrasi 0 ppm (kontrol), 20 ppm,

40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm. Asam Fusarat sebelum dipergunakan, terlebih

dahulu dilarutkan dengan akuades, hingga diperoleh konsentrasi yang

ditentukan, kemudian disaring mengunakan kertas saring. Proses penyaringan

dilakukan dalam ruang steril, yaitu di dalam Laminar Air Flow (LAF)

Cabinet. Selanjutnya, Asam Fusarat (AF) ditambahkan ke dalam botol kultur

yang telah disterilisasi. Sebelum digunakan, medium terlebih dahulu

diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar 25ºC, untuk memastikan bahwa AF

telah tersaring dengan baik. Apabila dalam waktu 7 hari tidak terjadi

kontaminasi pada medium, maka medium dapat dipergunakan.

Penanaman planlet Manihot esculenta Crantz. dilakukan pada ruang steril

yaitu di dalam Laminar Air Flow (LAF) Cabinet. Eksplan yang digunakan

yaitu berupa planlet steril. Seluruh planlet yang ada pada botol kultur

dikeluarkan dengan scapel steril, kemudian satu persatu diletakkan di atas

cawan petri dengan diameter 10 cm, lalu setelah itu planlet ditanam pada

masing-masing botol kultur berisi medium dengan perlakuan yang telah

ditentukan. Masing-masing konsentrasi dilakukan dengan 5 kali pengulangan

dan setiap ulangan terdiri dari 2 planlet Manihot esculenta Crantz. pada setiap

botol kultur.

22

2. Seleksi planlet Manihot esculenta Crantz. dengan Asam Fusarat pada

berbagai konsentrasi

Seleksi planlet dilakukan selama 30 hari, pada akhir dari minggu ke-4

dilakukan evaluasi guna untuk mengetahui konsentrasi Asam Fusarat (AF)

yang toleran untuk seleksi planlet Manihot esculenta Crantz. secara in vitro,

data yang diperoleh merupakan data kuantitatif.

a. Persentase Jumlah Planlet yang Hidup

Rumus yang digunakan dalam menghitung jumlah planlet Manihot

esculenta Crantz. yang hidup, menurut Nurcahyani (2014) yaitu:Jumlah planlet hidupJumlah seluruh planlet x 100%3. Karakterisasi planlet Manihot esculenta Crantz.

Karakter dari planlet Manihot esculenta Crantz. yang berhubungan dengan

ketahanan Fusarium oxysporum (Fo) dapat ditinjau melalui visualisisasi dan

persentase planlet hidup, kandungan klorofil total, klorofil a, klorofil b,

kandungan karbohidrat, dan pola DNA.

a. Analisis Kandungan Klorofil

Analisis kandungan klorofil menggunakan daun planlet Manihot esculenta

Crantz. yang telah diimbas dengan asam fusarat, dengan menggunakan

metode Harbourne (1987) dengan spektrofotometer. Adapun langkah-

langkah kerjanya sebagai berikut:

Daun planlet Manihot esculenta Crantz. yang seragam sebanyak 0,1 g

dihilangkan ibu tulang daunnya, lalu digerus dengan mortar (pestle) serta

23

ditambahkan 10 mL aseton 80%. Kemudian, larutan disaring

menggunakan kertas Whatmann No.1, dan dimasukkan ke dalam flakon

lalu ditutup rapat. Larutan sampel serta larutan standar (aseton 80%)

diambil sebanyak 1 mL, lalu dimasukkan ke dalam kuvet. Selanjutnya,

dilakukan pembacaan serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang

gelombang (λ) 646 nm dan 663 nm, dengan ulangan tiap sampel sebanyak

3 kali. Rumus yang digunakan untuk menghitung kandungan klorofil

adalah, sebagai berikut:

Klorofil total = 17,3 λ646 + 7,18 λ663 mg/l

Klorofil a = 12,21 λ663 – 2,81 λ646 mg/l

Klorofil b = 20,13 λ646 – 5,03 λ663 mg/l

b. Kandungan Karbohidrat Terlarut Total

Analisis kandungan karbohidrat terlarut total dilakukan dengan

metode fenol-sulfur (Witham., et al., 1993). Daun planlet Cassava diambil

dan ditimbang sebanyak 0,1 gram dari masing-masing planlet. Daun

ditumbuk dengan mortar lalu diberi 10 ml akuades, lalu disaring dengan

kertas saring Whatman No. 1, setelah itu dimasukkan ke dalam tabung

reaksi. Selanjutnya filtrat diambil sebanyak 1 ml lalu ditambahkan 1 ml

H2SO4 lalu ditambahkan fenol sebanyak 2 ml. Selanjutnya filtrat

dimasukkan ke dalam kuvet dibaca pada panjang gelombang 490 nm.

Kandungan karbohidrat terlarut total dihitung dengan cara membuat

larutan standar glukosa yang terdiri dari beberapa konsentrasi lalu diukur

24

pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm. Data yang

dihasilkan berupa data kuantitatif.

c. Pola DNA planlet Cassava dengan metode RAPD

1. Isolasi DNA planlet cassava

Tahapan isolasi DNA meliputi penggerusan sampel, ekstraksi,

pengendapan, pencucian, dan pelarutan DNA. Jenis reagen yang

digunakan dengan kit tersebut terdiri dari Phytopure I (melisiskan

dinding sel dan membran), Phytopure II (melarutkan membran inti,

plasma dan organel sel serta melisiskan nukleus), dan resin Phytopure

(memisahkan debris dan supernatan dengan kloroform).

Daun planlet Cassava dipotong menjadi bagian-bagian kecil dengan

scalpel steril, lalu ditimbang seberat 0,1 g. Sampel daun kemudian

digerus dengan mortal dan pestle, ditambahkan 500 µL reagen

Phytopure I sambil digerus sampai lembut, kemudian dimasukkan di

dalam tube 1,5 mL. Setelah itu ditambahkan reagen phytopure II

sebanyak 150 µL ke dalam sampel dan dikocok perlahan-lahan

(digoyang dengan tangan). Sampel lalu diinkubasi pada suhu 65ºC di

atas waterbath selama 10 menit, selanjutnya diletakkan di dalam ice

box selama 20 menit, kemudian dimasukkan 400 µL kloroform dingin

dan 20 µL resin Phytopure ke dalam sampel. Sampel kemudian di

sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, supernatan

dipindah ke tube ukuran 1,5 mL. Isopropanol dingin ditambahkan

25

dengan volume yang sama dengan volume supernatan dan

dihomogenkan perlahan-lahan. Kemudian sampel di sentrifuge

kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, supernatan

dibuang dan pelet DNA yang berwarna putih selanjutnya dicuci

dengan menambahkan 50 µL alkohol 70% dan di sentrifuge dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pencucian dengan alkohol 70%

tersebut diulang 3 kali. Sisa-sisa alkohol 70% dibuang, kemudian pelet

DNA dibiarkan mengering. Pelet DNA setelah kering kemudian

ditambahkan buffer TE 50 µL sampai larut lalu disimpan dalam freezer

pada suhu -20oC.

2. Pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi

Sampel DNA sebelum digunakan dalam reaksi PCR, dilakukan

pengujian kualitas dan konsentrasinya dengan menggunakan

GeneQuant (Life Science, Ltd., UK). Sebanyak 2 µL sampel DNA

hasil isolasi, dimasukkan ke dalam kuvet berisi 1998 µL akuabides

steril dan dikocok dengan perlahan-lahan hingga homogen.

Konsentrasi DNA sampel dibaca pada spektrofotometer pada panjang

gelombang 260 dan 280 nm. Rasio konsentrasi DNA sampel pada

masing-masing panjang gelombang digunakan sebagai ukuran kualitas

DNA. Menurut Sambrook et al,. 1989, DNA berkualitas baik bila

memiliki nilai rasio A260/280 = 1,8 – 2,0.

26

d. Analisis pola DNA planlet Cassava dengan metode RAPD

(PCR-RAPD):

Untuk analisis PCR, disiapkan DNA template yang telah dilarutkan

dalam TE, ice box, dan primer yang digunakan (Tabel 1). Kemudian

dibuat premix PCR dengan komposisi: kit KAPPA2G Fast ReadyMix

sebanyak 12,5 µL, primer 2,5 µL pada konsentrasi 100 µM, DNA

template 1,0 µL pada konsentrasi 40 ng/µL, dan dH2O sebanyak 9,0 µL,

sehingga volume totalnya adalah 25,00 µL.

Tabel 1 . Primer RAPD

No Primer Urutan Basa Nukleotida(5’—3’)

Referensi

1 OPA_1 GCT CTG TCC G Minoo et al., 20082 OPA_10 TTA CCC GGA C Minoo et al., 2008

Selanjutnya premix diamplifikasi dengan mesin PCR (GeneAmp 2400).

Kondisi reaksi untuk pelaksanaan proses PCR-RAPD mengikuti metode

Williams et al. (1990) yang dimodifikasi (Tabel 2).

Tabel 2. Kondisi Reaksi PCR-RAPD

Reaksi Temperatur (oC) Waktu (detik)Predenaturasi 95 180

Denaturasi 95 15Annealing 36 15Elongasi 72 30

Post-elongasi 72 420

Siklus :45 x

27

Elektroforesis

Elektroforesis dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut. Dibuat

500 mL buffer TBE1x dengan cara diambil 50 mL larutan buffer

TBE10x, kemudian diencerkan pada gelas ukur 500 mL dengan

ditambahkan akuades sampai tanda 500 mL lalu dihomogenkan. Minigel

agarose 1,5 % (g/v) dibuat dengan cara 1,5 g agarose dimasukkan ke

dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 100 mL TBE1x lalu dihomogenkan.

Kemudian dipanaskan menggunakan microwave (t= 100 ºC; ± 2 menit)

sampai semua larut, ditandai dengan larutan tampak jernih. Larutan

selanjutnya didinginkan sampai suhu lebih kurang 50-55 ºC, lalu

ditambahkan good view sebanyak 5 µL. Agarose cair tersebut dituangkan

ke dalam glassplate dengan sisir tegak lurus. Gel ditunggu sampai

menjendal selama ± 30 menit dan setelah dingin sisir diangkat.

Selanjutnya, sampel DNA sebanyak 25 µL (hasil running PCR) dipipet

dan dimasukkan ke dalam sumuran yang terdapat dalam gel tersebut

dengan menggunakan mikropipet. Sebanyak 10 µL DNA marker

selanjutnya dimasukkan pada sumuran di ujung kiri gel. Gel kemudian

dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE

1% (v/v). Selanjutnya dirunning pada tegangan 100 volt selama kurang

lebih 30 menit.

E. Analisis Data

Data penelitian ini berupa data kualitatif dan kuantitatif. Data kualitatif

disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif yang didukung oleh foto.

28

Sedangkan, data kuantitatif ditabulasi dengan faktor konsentrasi yang berbeda.

Analisis data dalam penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap

(RAL), data kuantitatif dari setiap parameter dianalisis dengan menggunakan

Analisis Ragam (Analysis of Variance) atau Anova. Analisis ragam (Anova)

dilakukan pada taraf nyata 5% dan uji lanjut dengan uji BNT (Beda Nyata

Terkecil) pada taraf nyata 5%.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan, maka dapat disimpulkan

sebagai berikut:

1. Konsentrasi asam fusarat toleran untuk seleksi planlet cassava pada

pertumbuhan optimum adalah 80 ppm.

2. Planlet cassava yang tahan terhadap penyakit layu Fusarium menunjukkan

adanya karakter ekspresi yang berbeda dengan planlet cassava yang tidak

tahan terhadap Fusarium oxysporum, yaitu terjadi peningkatan kandungan

klorofil a, klorofil b, klorofil total, serta karbohidrat terlarut total pada

planlet cassava yang tahan terhadap Fusarium oxysporum, seiring dengan

meningkatnya konsentrasi asam fusarat yang diberikan.

3. Pita DNA baru (spesifik) mempunyai ukuran yang bervariasi, tergantung

dari primer yang digunakan. Pita DNA spesifik dengan ukuran 550 bp

(OPA_1), dan 300 bp (OPA_10), dapat diprediksi sebagai kandidat marker

RAPD untuk ketahanan planlet cassava terhadap Fusarium oxysporum.

53

B. Saran

Penggunaan asam fusarat pada konsentrasi 80 ppm dapat dianjurkan untuk

mendapatkan planlet cassava yang tahan terhadap Fusarium oxysporum

dalam jangka waktu yang relatif cepat.

54

DAFTAR PUSTAKA

Agrios, G.N. 2005. Plant Pathology. 5thed. Elsevuer Academic Press, California.

Alexopoulos, C.J. and C.W. Mims. 1979. Introductory Mycology. Champman andHall, London.

Andari, G. 2016. Karakterisasi Planlet Anggrek Tanah (Spathoglottis plicata BI)Hasil Induced Resistance Dengan Asam Fusarat Terhadap Fusariumoxysporum Secara In Vitro. Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Andiyani, Y. 2001. Usaha Pembibitan Anggrek Dalam Botol. Pustaka Baru Press.Yogyakarta. 217p.

Arai, M., and Takeuchi, M. 1993. Influence of Fusarium Wit toxin(s) on camationcell. Plant Cells, Tisuue, and Organ Culture. (34): 287-293.

Azrai M. 2005. Pemanfaatan Markah Molekular dalam Proses Seleksi PemuliaanTanaman. Agro Biogen 1 (1): 26-37.

Azhari A, Nurcahyani E, Qudus HI, dan Zulkifli. 2018. Analisis KandunganProlin Planlet Jeruk Keprok Batu 55 (Citrus reticulata Blanco var.crenatifolia) Setelah Diinduksi Larutan Atonik Dalam Kondisi CekamanKekeringan Secara In Vitro.Analit: Analytical and EnvironmentalChemistry, 3 (01). ISSN E-ISSN 2540-8267.pp. 69-78.

Bacon, C.W, Porter, J.K, Norred W.P, and Leslie, J.F. 1996. Production of FusaricAcid by Fusarium Sp. Applied and Enviromental Microbiologi. 62 (11):4039-4043.

Badan Pusat Statistik (BPS). 2015. Produksi Ubi Kayu. Tersedia Onlinehttps://www.bps.go.id/ , Diakses pada 15 Mei 2018.

Bahri, S. 2010. Klorofil.Diktat Kuliah Kapita Selekta Kimia Organik. UniversitasLampung.

Bardakci F. 2001. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Turk.J Biol. 25: 185-196.

55

Bhatia CR, Nichterlein K, and Maluszynski M. 1999. Oilseed CultivarsDeveloped from Induced Mutations and Mutations Altering Fatty AcidComposition. Mutation Breeding Review (11). IAEA. Vienna. 36 p.

Bobobee, E. 2004. Potential for Mechanised Cassava Production in South Africa.Agricultural Research Council. Institute for Agricultural Engineering(ARC-IAE).

Borrero, C., M.I. Trillas, J. Ordovás, J.C. Tello and M. Aviles. 2004. Predictivefactors for the suppression of Fusarium wilt of tomato in plant growthmedium. Phytopathology 94 (10): 1094- 1101.

Bouizgarne, B, Bouteau HEM, Frankart C, Reboutier D, Madiona K, PennarunAM, Monestiez M, Trouverie J, Amiar Z, Briand J, Brault M, Rona JP,Ouhdouch Y, and Hadrami EI. 2006. Early Physiological Responses ofArabidopsis thaliana Cells to Fusaric Acid: Toxic and Signallling Effects.New Phytologist 169: 209 – 218.

Cahyono, B. 2008. Tomat Usaha Tani & Penanganan Pasca Panen. Kanisius.Yogyakarta.

Campbell, N.A, J.B. Reece and L.G. Mitchell. 2003. Biologi. Alih Bahasa : L.Rahayu, E.I.M Adil, N Anita, Andri, W.F Wibowo, W. Manalu. Erlangga.Jakarta.

Campbell, N.A,and J.B. Reece. 2008. Biologi Edisi Delapan Jilid 2. Erlangga.Jakarta

CGIAR. 2000. Root and tubers in the global food system. A vision statement tothe year 2020.

Chen L and Yamaguchi S. 2005. RAPD Markers for Discriminating TeaGermplasms at The Inter-Specific Level in China. Plant Breeding 124: 404-409.

Christian, V.A., and Vaclavik. 2003. Essential of Food Science Second Edition.Kluwer Academic. London.

Damayanti, F. 2010. Peningkatan Ketahanan Pisang Kepok (Musa ParadisiacaL)Hasil Kultur Jaringan Terhadap Penyakit Layu Fusarium Melalui SeleksiAsam Fusarat. Jurnal Ilmiah Fakor Exacta. 3 (4): 310-319.

Demeke T and Adams RP. 1994. The Use of PCR-RAPD Analysis in PlantTaxonomy and evolution. p. 179-191. In Griffin HG & Griffin AM (Ed.)PCR Technology Current Innovations. CRC. Press. Inc. London.

Dwidjoseputro. 1985. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. PT. Gramedia. Jakarta,Indonesia.

56

Ekman A, Hayden DM, Dehesh K, Bulow L, Stymne S. 2008. Carbon partitioningbetween oil and carbohydrates in developing oat (Avena sativa L.) seeds. JExp Bot 59:4247–4257.

Esmaiel NM, Al-Doss AA, and Barakat MN. 2012. In vitro selection forresistance to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi and detection of geneticpolymorphism via RAPD analysis in carnation. Journal of Medicinal PlantsResearch 6 (23): 3997-4004.

Fauzi, M., Kardhinata, E.H., Putri, L.A. 2015. Identifikasi dan InventarisasiGenotip Tanaman Ubi kayu (Manihot esculenta Crantz) di KabupatenSerdang Bedagai Sumatera Utara. Jurnal Online Agroteknologi. 3 (3): 1082– 1088. ISSN No. 2337- 6597.

Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry Third Edition.Marcel Dekker Inc. NewYork.

Focks N, Benning C. 1998. Wrinkled 1: A novle, low-seed-oil mutant ofArabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation ofcarbohydrate metabolism. Plant Physiol. 118:91–101.

Frankard V. 1992. Lysine and Threonine Enhancement in Crop Plant. Ph.D.Disertasion. Vrije Universiteit Brussel. Belssel. Belgium.

Frankard V., Ghitain M., Jacob M. 1992. Two Feedback-Insensitive Enzymes ofThe Aspartate Pathway in Nicotiana sylvestris. Plant Physiol. 99: 1285-1293.

Groenewald, S. 2006. Biology, Pathogenicity and Diversity of Fusariumoxysporum f.sp. cubense. University of Pretoria etd.

Hafzah MJ. 2003. Bisnis Ubi Kayu. Pustaka Sinar Harapan. Jakarta.

Handayani T, Sastrosumarjo S, Sopandie D, Suharsono, and Setiawan A. 2006.Analisis Marka Morfologi Dan Molekular Sifat Ketahanan Kedelai terhadapIntensitas Cahaya Rendah. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia 8 (1): 43-50.

Harbourne JB. 1987. Metode Fitokimia. Terjemahan: Padmawinata K & Sudiro I.Penerbit ITB Bandung. pp: 259-261.

Hartati D, Rimbawanto A., Taryono, Sulistyaningsih E, and WidyatmokoAYPBC. 2007. Pendugaan Keragaman Genetik di Dalam dan AntarProvenan Pulai (Alstonia scholaris (L.) R. Br. ) Menggunakan penandaRAPD. Jurnal Pemuliaan tanaman Hutan 1(2): 1-9.

Ishak 1998. Identifikasi Keragaman DNA Genom Mutan Padi Atomita-2 danTetuanya Menggunakan RAPD Marker. Zuriat 9 (2): 91-99.

57

Isharnani, E. C., Nurcahyani, E., and Lande, M. L. 2015. Chlorophyll Content ofLeaves of Planlet Ground Orchid (Spathoglottis plicata Blume.) Result ofInduced Resistance of the In Vitro Fusaric Acid. Prosiding SeminarNasional Swasembada Pangan. Politeknik Negeri Lampung. ISBN 978-602-70530-21. Hal. 86-92.

Jumin, H. B. 1989. Ekologi Tumbuhan. Rajawali Press. Jakarta.

Karsinah, Sudarsono, Setyobudi L, and Aswidinnor H. 2002. Keragaman GenetikPlasma Nutfah Jeruk berdasarkan Analisis Penanda RAPD. JurnalBioteknologi Pertanian 7: 8-16.

Kerepesi, I. dan G. Galiba. 2000. Osmotic and Salt Stress-Induced Alteration inSoluble Carbohydrate Content in Wheat Seedlings. Crop Science, 40: 482 –487.

Komar TE. 1999. Marka Genetika dan Aplikasi Dalam Bidang Kehutanan. Lab.Genetika Molekuler. Dep. Kehutanan dan Perkebunan. 25 p.

Koswara, S. 2013. Teknologi Pengolahan Umbi-Umbian. USAID.

Landa BB, Cachinero-Diaz J.M, Lemanceu P, Jimenez-Diaz RM, and AlabouvetteC, 2002. Effect of Fusaric Acid and Phytoanticipins on Growth ofRhizobacteria and Fusarium oxysporum. Canadian Journal of Microbiology48: 971-985.

Lestari, G.E., Sukmadjaja D., dan Mariska I. 2006. Perbaikan KetahananTanaman Vanili Terhadap Penyakit Layu Fusarium Melalui Kultur In Vitro.Jurnal Litbang Pertanian 25 (4) 153.

Minoo D, Jayakumar VN, Veena SS, Vimala J, Basha A, Saji KV, Babu KN, &Peter KV. 2008. Genetic Variations and Interrelationships in Vanillaplanifolia and Few Related Species as Expressed by RAPD Polymorphism.Genet. Resour Crop. 55: 459-470.

Nugroho A. 2000. Pedoman Pelaksanaan Kultur Jaringan. Penebar Swadaya.Jakarta.

Nurcahyani E, Sumardi I, Hadisutrisno B, & Suharyanto E. 2012. PenekananPerkembangan Penyakit Busuk Batang Vanili (Fusarium oxysporum f. sp.vanillae) Melalui Seleksi Asam Fusarat Secara In Vitro. Jurnal Hama danPenyakit Tumbuhan Tropika. Terakreditasi SK No. 110/DIKTI/Kep/2009.ISSN: 1411-7525. Vol. 12 /No. 1: 12-22

Nurcahyani E. 2013. Karakterisasi Planlet Vanili (Vanilla planifolia Andrews)Hasil Seleksi Asam Fusarat Secara In Vitro Terhadap Fusarium oxysporumf. sp. vanillae. Disertasi. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta. 201 p. Tidak Dipublikasikan.

Nurcahyani, E., Hadisutrisno, B., Sumardi, I., & Suharyanto, E. 2014. Identifikasigalur planlet vanili (Vanilla planifolia Andrews) Resisten terhadap infeksi

58

Fusarium oxysporum f. sp. vanillae hasil seleksi in vitro dengan asamfusarat. Prosiding Seminar Nasional: “Pengendalian Penyakit PadaTanaman Pertanian Ramah Lingkungan”. Perhimpunan FitopatologiIndonesia Komda Joglosemar-Fakultas Pertanian UGM. ISBN 978- 602-71784-0-3./2014 Hal. 272- 279.

Nurcahyani E., R. Agustrina, & T.T. Handayani. 2016a. The Protein Profile of thePlantlets of Spathoglottis plicata Bl. Induced Resistance to Fusariumoxysporum. Journal of Plant Science 4(5): 102-105.

Nurcahyani E., Rochmah Agustrina, Erdi Suroso, & Gardis Andari. 2016b.Analysis of Peroxidase Enzyme and Total Phenol from Ground Orchid(Spathoglottis plicata Bl) as Result of the In Vitro Fusaric Acid SelectionToward To Fusarium oxysporum. International Journal of AplliedAgricultural Science 2(6): 79-82.

Nurcahyani E., Sumardi I., Hadisutrisno B., & Suharyanto E., 2017. DNA PatternAnalysis of Vanilla planifolia Andrews Plantlet which Resistant toFussarium oxysporum f. sp.vanillae. WJPLS 3(4): 27-34.

Nurcahyani E, Sumardi, Irawan B, Sari EY, Sari TL. 2019. In Vitro Study:Induced Resistance Of Cassava (Manihot esculenta Crantz.) PlantletAgainst Fusarium oxysporum Based on Analysis of Phenol Content.WJPLS, Vol. 5, Issue 2, 195-198.

Parida R, Mohanty S, Kuanar A, & Nayak S. 2010. Rapid multiplication and invitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissueculture. Electronic Journal of Biotechnology 13 (4): 0717-3458.

Penner GA. 1996. RAPD Analysis of Plant genomes. pp: 251-267. In: Jauhar PP(Ed). Methodes of Genome Analysis in Plant (1). CFC Press. Tokyo.

Poerba YS. 2005 Penampilan Genetik Mutan Talinum paniculatum Jacq. (Gaertn.)Berdasarkan Marka RAPD. In: Perbaikan Genetik Tumbuhan Obat. LaporanTeknik. Bidang Botani. Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Bogor. pp: 316-324.

Putri, Oktavia S.D., Ika, R.S., dan Syamsudin D. 2014. Pengaruh MetodeInokulasi Jamur Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici(sacc.) TerhadapKejadian Penyakit Layu Fusarium Pada Tanaman Tomat (Lycopersiconesculentum Mill. Jurnal HPT (2) 3 ISSN: 2338-4336.

Quing and Hongwen C. 2002. Application of Induced Resistance in CucumberDisease Control. Cucurbit Genetics Cooperative. 25: 11-13.

Rana MK & Bhat KV. 2005. RAPD Markers for Genetic Diversity Study AmongIndian Cotton Cultivars. Current Science 88 (12): 1956 – 1961.

Resmi, S. 2017. Efek Kalium dan Mikoriza Terhadap Planlet Buncis (Phaseolusvulgaris L.) Selama Cekaman Kekeringan Secara In Vitro. UniversitasLampung. Lampung.

59

Riedy MF, Hamilton WJ, and Aquadro JF. 1992. Excess of Non Parental Bandsin Offspring from Know Pedigress Assayed Using RAPD PCR. Nucl. Acids.Res. 20: 918.

Rosyalina N, Nurcahyani E, Qudus HI, Zulkifli. 2018. Pengaruh Larutan AtonikTerhadap Kandungan Karbohidrat Terlarut Total Planlet Jeruk SiamPontianak (Citrus Nobilis Lour. var. Microcarpa Hassk.) Secara In Vitro.Analit: Analytical and Environmental Chemistry 3 (01). pp. 61-68.

Runtunuwu, SD. 2000. Penanda Molekular Ketahanan Tanaman Kelapa TerhadapPenyakit Phytophthora. Disertasi. Program Pascasarjana IPB. Bogor.

Ruzin, S.E. 1999. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford UniversityPress, New York.

Salaki, M. 2000. Biologi sel. Proyek Pengembangan Perguruan Tinggi IndonesiaTimur Kerjasama Universitas Sam Ratulangi Canadian InternasionalDevelopment Agency Simon Fraser University.

Sambrook J, Fritsh JEF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A LaboratoryManual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. pp. 568-500.

Sarjiah., Hariyono., Supangkat, G. 2016. Identifikasi Singkong Varietas LokalKabupaten Gunung Kidul Daerah Istimewa Yogyakarta. Laporan PenelitianUnggulan Prodi. UM Yogyakarta.

Semangun, H. 2001. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. UGM Press.Yogyakarta.754 p.

Semagun K, Bjornstad A, and Ndjiondjop MN. 2006. An Overview of MolecularMarker Methods for Plants. African Journal of Biotechnology 5: 2540-2568.

Setia, J. A. 2016. Kajian efek Asam Salisilat Terhadap Kandungan KarbohidratTerlarut Total dan Klorofil Planlet Pisang Kepok Kuning (Musaparadisisca L. Var. Bluggoe) dalam Kondisi Cekaman Kekeringan SecaraIn Vitro. Universitas Lampung. Lampung.

Soedjanaatmadja. 2008. Peranan Pathogenesis Related (PR)-Protein danFitohormon dalam Menjaga Kelangsungan Kehidupan Tanaman sertaMeningkatkan Produktivitas Hasil Pertanian. Universitas Padjajaran.Bandung.

Soesanto, L. 2008. Pengantar Pengendalian Hayati Penyakit Tanaman. PT. RajaGrafindo Persada. Jakarta.

Soliman HIA. 2012. In vitro Propagation of Apricot (Prunus armeniaca L.) andAssessment of Genetic Stability of Micropropagated Plants Using RAPDAnalysis. World Applied Sciences Journal 19 (5): 674-687.

60

Song dan Banyo, Y. 2011.Konsentrasi Klorofil Daun sebagai IndikatorKekurangan Air pada Tanaman. Jurnal Ilmiah Sains. 11 (2).

Soelistijono. 2015. Kajian Efektifitas Rhizoctonia sp Mikoriza Dataran Rendahdan Sedang pada Tingkat Keparahan Penyakit (Dsi) Anggrek Phalaenopsisamabilis terhadap Fusarium sp. Biosaintifika. 7 (2).

Sukmadjaja D, Purnamaningsih R dan Priyatno, T. P. 2013. Seleksi In Vitro danPengujian Mutan Tanaman Pisang Ambon Kuning untuk Ketahananterhadap Penyakit Layu Fusarium. Jurnal AgroBiogen 9(2):66-76.

Sumardiyono, C., Suharyanto, Suryanti, Rositasari, Chinta. 2015. DeteksiPengimbasan Ketahanan Pisang Terhadap Penyakit Layu Fusarium DenganAsam Fusarat. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia. 19(1): 40–44.

Sriyadi B, Setiamihardja R, Baihaki A, and Astika W. 2001. Identifikasi PembedaRAPD Yang Berpautan dengan Gen Ketahanan Tanaman Teh TerhadapPenyakit Cacar. Zuriat 12(2): 49-57.

Syafi, S. 2008. Respon Morfologis dan Fisiologis Bibit Berbagai Genotip JarakPagar (Jatropha curcas L.)Terhadap Cekaman Kekeringan. IPB. Bogor.

Taiz, L. and Zeiger, E. 1998. Plant Physiology. Second Edition. Sunderland :Sinauer Associates, Inc., Publisher.

Tingey SV, Rafalski JA, and Hanafey MK. 1994. Genetic Analysis with RAPDMarkers. In: Coruzzi C & Puidormenech P (Eds.) Plant Molecular Biologypp: 491-498.

Velasco L, Perz-Vich B, and Fernadez-Martines JM. 1999. The Role ofMutagenesis in The Modification of The Fatty Acid Profile of OilseedCrops. Journal of Applied Genetics 40: 185-209.

Wang R, Ripley VL, Rakow G. 2007. Pod shatter resistance evaluation incultivars and breeding lines of Brassica napus, B. juncea and Sinapis alba.Plant Breed 126:588–595.

Welsh J and McClelland M. 1990. Fingerprinting Genomes Using PCR withArbitrary Primers. Nucl. Acids. Res. 18: 7213-7218.

Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, and Tingey SV. 1990. DNAPolymorphism Amplified by Arbitrary Primers Useful as Genetic Markers.Nucl. Acids. Res. 18: 6531-6535.

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.Jakarta. Agromedia Pustaka.