Post on 17-Mar-2019
8
Prosedur Analisis Data
Analisis statisik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam
Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan ulangan 3 kali dengan model linier yang
digunakan (Matjik dan Sumertajaya 2002) adalah:
Yij = µ + πi + ßj + εij
µ = pengaruh rataan umum
πi = pengaruh hidrolisis laktosa β-galaktosidase pada jam ke-i;
ßj = pengaruh ulangan ke-j εij = pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh β -
galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j i= Jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,
dan 24, j = 1,2,3. Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada
tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dengan SPSS 10.0. Jika
hasil uji berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Optimasi Waktu Produksi Enzim Galaktosidase
Waktu produksi ditentukan berdasarkan aktivitas enzim β-galaktosidase
tertinggi, yaitu dari jam ke-24 sampai ke-36 dimana kurva pertumbuhan
mengalami peningkatan dengan aktivitas total sebesar 27.669 U dan mengalami
penurunan pada jam ke-42. Pemanenan dilakukan pada waktu produksi β-
galaktosidase optimum yaitu pada waktu jam ke-24 dimana pada waktu tersebut
aktivitasnya meningkat sebesar 26.605 U/ml. Dan bakteri tersebut menghasilkan
β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam ke-24 dengan nilai OD sebesar
1.984 atau setara dengan 1.81x10-8 sel/ml (Data Lampiran 6).
9
Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase
Berdasarkan hasil penelitian, aktivitas spesifik β-galaktosidase kasar yang
diperoleh adalah sebesar 138.396 U/ml (Tabel 1).
Purifikasi selanjutnya dilakukan pengendapan dengan amonium sulfat.
Pengendapan dilakukan pada konsentrasi optimum yaitu 10%, 20%, 30%, 40%,
50%, 60%, 70%. Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa pengendapan enzim
dengan ammonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 40-
50% (Data Lampiran 7). Aktivitas spesifik menurun pada fraksi lebih dari 50%
karena pada fraksi tersebut lebih banyak enzim yang terendap bukan enzim
β-galaktosidase. Aktivitas spesifik β-galaktosidase hasil semipurifikasi
ammonium sulfat pada fraksi 40-50% adalah sebesar 238.438 U/mg. Aktivitas
spesifik enzim kasar lebih rendah dibandingkan aktivitas spesifik enzim
pengendapan dengan ammonium sulfat karena konsentrasi protein yang diperoleh
pada enzim kasar lebih tinggi dibandingkan hasil pengendapan dengan ammonium
sulfat sebesar 0.365 mg (Tabel 1). Tingkat kemurnian pengendapan dengan
ammonium sulfat dan mengalami peningkatan dari 1 kali menjadi 2.97 kali dan
rendemen sebesar 62.88%.
Gambar 1 Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva
β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■)Kurva pertumbuhan
BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva β-galaktosidase
BAL indigenos strain D-210(■)
Gambar Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan
kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0
2E-09
4E-09
6E-09
8E-09
1E-08
1.2E-08
1.4E-08
1.6E-08
1.8E-08
2E-08
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Jam ke-
Akt
ivit
as(U
/ml)
Jum
lah
se
l/m
l
10
Purifikasi parsial β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-210 hasil
penngendapan selanjutkan dilakukan dialisis. Β-galaktosidase hasil dialisis
menunjukkan total aktivitas adalah sebesar 50.420 U, total protein sebesar 0.207
mg dan aktivitas spesifik sebesar 243.574 U/mg drngan tingkat kemurnian
meningkat sebesar 3.04 kali. Rendemen yang dihasilkan sekitar 36.43% (Tabel 1).
Karakterisasi β-galaktosidase
Suhu
Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim.
Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil optimum
pada suhu 45 oC dan 40 oC dengan aktivitas sebesar 180.093 U/ml dan
43.194 U/ml, Bila kenaikan suhu jauh di atas suhu optimum maka enzim akan
terdenaturasi. (Data Lampiran 8). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
10 20 30 40 50 60 70
Tota
l Pro
tein
(m
g)
Tota
l Akt
ivit
as (
U)
Fraksi Ammonium Sulfat %
Gambar 2 Hasil semipurifikasi dengan garam ammonium sulfat aktivitas
total (■)dan total protein(●)
Tabel 1 Purifikasi Parsial dari BAL indigenos strain D-210
Tahapan Total
Aktivitas
(U)
Total
Protein
(mg)
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
Rendemen
(%)
Kemurnian
(kali)
Enzim Kasar 138.396 1.729 80.043 100.00 1.00
Pengendapan
AmoniumSulfat
40%-50%
87.030
0.365
238.438
62.88
2.97
Dialisis 50.420 0.207 243.574 36.43 3.04
11
suhu 40 oC lebih rendah yaitu 7.85% dibandingkan aktivitas relatif
β-galaktosidase bebas dapat bertahan sampai 75.05%.
Gambar 4a menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase
Enzim bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam dengan suhu
25 sampai 40 oC dengan aktivitas tersisa masing-masing sebesar 0.22% dan
0.14% dari aktivitasnya. Gambar 4b menunjukkan pengaruh suhu terhadap
stabilitas β-galaktosidase teramobil yang relatif stabil setelah diinkubasi selama
1 jam dengan aktivitas tersisa sebesar 7.75% dan 2.01%.
(b)
(a)
Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase
Gambar 1 1Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-
galaktosidase
bebas (▲) dan teramobil (■)
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
25 30 35 40 45 50 55
Akt
ivit
as R
ela
tif(
%)
Suhu
(a)
')
79.94 82.78
50.67 49.98
16.32
0.22 0.140.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
25 30 35 40 45 50 55
Akt
ivit
as T
ers
isa(
%)
Suhu
12
pH
Beberapa keadaan yang mempengaruhi kinerja enzim salah satu
diantaranya adalah pH dimana β-galaktosidase bebas mencapai optimum pada
pH 6.5 dengan aktivitas tertinggi sebesar 252.341 U/ml, sedangkan
β-galaktosidase amobil pada pH 6 dengan aktivitas sebesar 40.428 U/ml.
Gambar 5 menunjukkan optimasi pH β-galaktosidase bebas cenderung
lebih rendah yaitu pH 6.5 dengan aktivitas sebesar 252.341 U/ml sedangkan
β-galaktosidase teramobil optimasi tertinggi dikisaran pH 6 dengan aktivitas
sebesar 40.428 U/ml. Aktivitas relatif enzim amobil tercapai sampai 100%.
(b)
64.82 69.49
88.1576.66
31.08
7.752.01
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
25 30 35 40 45 50 55
Akt
ivit
as T
ers
isa(
%)
suhu
Gambar 4 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas
β- galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b)
Gambar 5 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas
β-galaktosidase bebas(▲) dan teramobil(■)
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Akt
ivit
as R
ela
tif(
%)
pH
13
Enzim β-galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam
pada pH 5.0 sampai 8.0 karena masih menyisakan aktivitas 40% (Data Lampiran
9). Gambar 6a dan 6b aktivitas β-galaktosidase masih relatif stabil dengan
aktivitas tersisa pada β-galaktosidase bebas sebesar 40.83% dan β-galaktosidase
teramobil sebesar 43.37%.
(a)
31.1235.11
39.42 40.83
17.36
34.75
41.32
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Akt
ivit
as T
ers
isa(
%)
pH
(b)
67.64 65.7169.18
60.7
43.37
9.47 10.63
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Akt
ivit
as T
ers
isa(
%)
pH
Gambar 6 Profil hasil pengujian pH terhadap stabilitas β-galaktosidase
bebas (a) dan teramobil (b)
14
Aktivator dan Inhibitor
Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari BAL
Indigenos strain D-210 karena dapat menurunkan aktivitas sebesar 26.35% dan
53.97% dari kontrol (yaitu enzim yang tidak mendapatkan penambahan kation).
Kation Ca2+, Co2+, Zn2+ dalam penelitian ini juga meningkatkan aktivitas
β-galaktosidase dari kontrolnya sebesar 76.56%, 73.64% dan 61.5% (Data
Lampiran 10). Beda halnya dengan Mn2+ dan Mg2+ memiliki masing – masing
aktivitas dari kontrol sebesar 102 % dan 114 %.
Parameter Kinetik
. Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan pemetaan data dengan
persamaan Lineweaver Burk (gambar 9). Persamaan Lineweaver Burk adalah
y = 5.286x + 10.75 dengan nilai R2 sebesar 0.971 sehingga kecepatan maksimum
aktivitas β-galaktosidase sebesar 0.093 µmol/menit dan nilai KM sebesar
0,491 mM.
Pada β-galaktosidase teramobil terjadi peningkatan konsentrasi substrat dan
peningkatan kecepatan reaksi. Untuk persamaan reaksi Lineweaver Burk untuk
β-galaktosidase teramobil adalah y= 3.74x+2.106 diperoleh nilai
1/Vmaks = 2.106 dan nilai KM/Vmaks = 32.74. Maka nilai Vmaks = 0.474
µmol/menit dengan nilai KM sebesar 15.54 mM (Data Lampiran 12).
Gambar 7 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari BAL Indigenos
strain D-210
294.946
225.488216.186
180.217
3.532
301.147
19.008
337.116
0.000
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
300.000
350.000
400.000
Kontrol Ca Co Zn Cu Mn Hg Mg
Akti
vit
as (
U/m
L)
Ion - ion Logam
15
(a)
Optimasi Konsentrasi Alginat dan CaCl2 untuk Amobilisasi sel
dan amobilisasi β-galaktosidase Bakteri Asam Laktat Indigenos
Strain D-210
Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat
menghasilkan produk ONP yang berbeda nyata, dengan 4 variasi konsentrasi
alginat yang berbeda yaitu 2%, 3%, 4% dan 5% (b/v) dengan inkubasi selama 1
jam konsentrasi alginat untuk sel amobilisasi yang diperoleh adalah sebesar 2%
dengan jumlah beads 57 Konsentrasi alginat 2%, 3%, 4% dan 5% dengan variasi
konsentrasi CaCl2 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M terlihat bahwa untuk sel konsentrasi CaCl2
optimum pada konsentrasi 0.1 M untuk natrium alginat 2% sedangkan enzim
untuk konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi 0.1 M dan natrium alginat 3%.
(a)
(a)
y = 5.286x + 10.75R² = 0.971
0.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
160.000
180.000
0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000
1/V
1/S
(b)
Gambar 8 Kurva lineweaverBurk dari beta-galaktosidase bebas (a) dan
teramobil (b)
y = 32.74x + 2.106R² = 0.962
0.000
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70
1/V
1/S
16
Gambar 9a menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada
enzim adalah 2% dengan konsentrasi CaCl2 0.1 M dengan jumlah produk yang
dihasilkan sebesar 47.56 µmol ONP, CaCl2 0.3 M sebesar 20.74 µmol ONP dan
CaCl2. 0.5 M sebesar 29.58 µmol ONP. Gambar 9b menunjukkan bahwa
konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada sel adalah 3% dengan konsentrasi
CaCl2 0.1 dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 49.42 µmol ONP,
CaCl2 0.3 M dan CaCl2 0.5 M jumlah produk ONP yang dihasilkan masing-
masing sebesar 41.98 µmol dan 8.8 µmol.
(a)
47.56 46.63
20.12 21.6720.74
33.3
14.54 15.62
29.58 32.06
5.075
11.91
0
10
20
30
40
50
2 3 4 5
Pro
du
k o
NP
(µ
mo
l)
Konsentrasi alginat
Calsium klorida 0,1M Calsium klorida 0,3M Calsium klorida 0,5M
(b)
Gambar 9 Variasi konsentrasi alginat dan CaCl2 untuk penggunaan
enzim amobil (a) dan sel amobil (b)
49.42 51.59
44.31
33.4533.45
41.98
20.58 22.1415.93
8.1814.23 11.59
0
10
20
30
40
50
60
2 3 4 5
Pro
du
k o
NP
(µm
ol)
Variasi konsentrasi alginat (%)
Calsium klorida 0,1M Calsium klorida 0,3 M Calsium klorida 0,5 M
17
Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat
Optimasi Konsentrasi Enzim β-galaktosidase dan Sel Untuk Amobilisasi
Pada Hidrolisis Laktosa
Variasi penggunaan konsentrasi alginat pada β-galaktosidase dapat dilihat
pada gambar 11 terdapat 3 variasi bobot yaitu 5%, 10% dan 20% . Pada bobot
konsentrasi alginat 5 % cenderung lebih kecil produk yang dihasilkan yaitu
sebesar 40.202 µmol sedangkan untuk bobot konsentrasi alginat 10% diperoleh
produk sebesar 55.626 µmol. .
Hasil penelitian menyatakan semakin banyak konsentrasi alginat pada enzim
β-galaktosidase untuk amobilisasi pada hidrolisis laktosa maka semakin banyak
0
20
40
60
80
100
5% 10% 20%
40.202
55.626
91.752
Pro
du
k (μ
mo
l)
Konsentrasi Alginat
Gambar 10 Optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel (♦)dan
amobilisasi enzim(■)
49.42 51.59
44.31 33.45
47.56 46.63
20.1221.67
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5
Pro
du
k O
NP
(µm
ol)
Konsentrasi alginat (%)
Gambar 11 Variasi Penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi
β-galaktosidase pada hidrolisis laktosa
18
0
20
40
60
4% 8% 12%
37.25
53.02 58.884P
rod
uk
(μ
mol)
Konsentrasi Alginat
produk yang dihasilkan yaitu pada konsentrasi alginat 20% jumlah produk ONP
sebesar 91.752 µmol.
Konsentrasi alginat yang dipergunakan pada sel amobil untuk hidrolisis
laktosa adalah sebesar 4%, 8% dan 12% (b/v).
Gambar 12 menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amoblisasi pada
hidrolisis laktosa untuk bobot konsentrasi alginat 4% paling rendah
dibandingkan bobot alginat 8%. Untuk konsentrasi alginat 4% yaitu sebesar
37.25 µmol dan kosentrasi 8% sebesar 53.02 µmol. Konsentrasi alginat 12%
adalah konsentrasi dengan jumlah produk yang tertinggi sebesar 58.884 µmol.
Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT
Potensi hidrolisis sel bebas dan amobil dilakukan dengan sistem batch
selama 24 jam pada suhu 45 oC selama 24 jam dan sampling dilakukan tiap 3 jam
serta analisis laktosa terhidrolisis Pada gambar 14a hasil hidrolisis laktosa oleh
sel BAL Indigenos strain D-210 pada sel teramobil meningkat yaitu pada jam
ke-6 dengan aktivitas relatif sebesar 76.72% dengan jumlah laktosa terhidrolisis
sebesar 0.366 g. Aktivitas relatif enzim teramobil tertinggi mencapai 62.68% dan
mencapai optimum pada jam ke-18 dengan laktosa terhidrolisis sebesar 0.299 g
(Data Lampiran 13).
Gambar 12 Variasi penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel
pada hidrolisis laktosa
Gambar 13 Potensi hidrolisis laktosa sel teramobil (a)
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Akti
vit
as
rela
tif(
%)
jam ke-
19
Gambar 14 Potensi hidrolisis laktosa enzim teramobil (b)
Pada gambar 15 menunjukkan bahwa potensi hidrolisis laktosa pada sel bebas
dan enzim bebas mencapai aktivitas relatif masing-masing sebesar 73.37% dan
89.93% dengan jumlah laktosa terhidrolisis masing-masing sebesar 0.350 g dan
0.429 g.
Analisis statistik terlihat bahwa aktivitas relatif sel teramobil dengan enzim
teramobil terdapat perbedaan nyata (α=0.05) terhadap lamanya waktu aktivitas relatif
dan tidak ada perbedaan nyata terhadap aktivitas hidrolisis relatif untuk sel bebas dan
enzim bebas.
Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil
Pemilihan amobilisasi dengan natrium alginat dipandang lebih aman dan
murah Penggunaan berulang sel dan enzim setelah diamobilisasi adalah untuk
memisahkan antara enzim dan produk yang dihasilkan. Sehingga enzim dapat
dipakai berulang kali dan aktivitas tetap stabil. Sel amobil dan enzim amobil
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Akt
ivit
as h
idro
lisis
re
lati
f(%
)
Jam ke
Gambar 15 Potensi hidrolisis laktosa sel bebas (■) dan enzim bebas(♦)
0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00
100.00
0 3 6 9 12 15 18 21 24Akt
ivit
as h
idro
lisis
Re
lati
f(%
)
Jam Ke-
20
dimasukkan kedalam susu UHT lalu diinkubasi goyang untuk sel amobil pada
suhu 40 oC dan enzim amobil pada suhu 45 oC kemudian dianalisis dengan
menggunakan kit enzimatik GOD-POD. Penggunaan berulang butiran gel
dilakukan sebanyak 6 kali dan terlihat penurunan aktivitasnya untuk sel dan enzim
teramobil masing-masing sebanyak 42.35% dan 53.68%.
Pada gambar 16a menunjukkan aktivitas hidrolisis relatif sel teramobil
untuk pemakaian ulangan ke-6 masih menyisakan aktivitas sebesar 39.53% .Pada
gambar 16b pemakaian ulangan ke-6 menyisakan aktivitas hidrolisis relatif
sebesar 57.65% dari aktivitas awalnya sebesar 100%.
(a)
(a)
100.00
76.19
52.86 47.71 46.66
39.52
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
1 2 3 4 5 6
Akt
ivit
tas
Hid
rolis
is R
ela
tif(
%)
Ulangan ke-
(b)
Gambar 16 Penggunaan berulang sel teramobil (a) dan enzim teramobil (b)
100.00
64.01 62.83 60.76 54.86 53.68
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
1 2 3 4 5 6
Akt
ivit
as h
idro
lisis
Re
lati
f(%
)
Ulangan ke-