8

Prosedur Analisis Data

Analisis statisik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam

Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan ulangan 3 kali dengan model linier yang

digunakan (Matjik dan Sumertajaya 2002) adalah:

Yij = µ + πi + ßj + εij

µ = pengaruh rataan umum

πi = pengaruh hidrolisis laktosa β-galaktosidase pada jam ke-i;

ßj = pengaruh ulangan ke-j εij = pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh β -

galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j i= Jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,

dan 24, j = 1,2,3. Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada

tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dengan SPSS 10.0. Jika

hasil uji berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Optimasi Waktu Produksi Enzim Galaktosidase

Waktu produksi ditentukan berdasarkan aktivitas enzim β-galaktosidase

tertinggi, yaitu dari jam ke-24 sampai ke-36 dimana kurva pertumbuhan

mengalami peningkatan dengan aktivitas total sebesar 27.669 U dan mengalami

penurunan pada jam ke-42. Pemanenan dilakukan pada waktu produksi β-

galaktosidase optimum yaitu pada waktu jam ke-24 dimana pada waktu tersebut

aktivitasnya meningkat sebesar 26.605 U/ml. Dan bakteri tersebut menghasilkan

β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam ke-24 dengan nilai OD sebesar

1.984 atau setara dengan 1.81x10-8 sel/ml (Data Lampiran 6).

9

Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase

Berdasarkan hasil penelitian, aktivitas spesifik β-galaktosidase kasar yang

diperoleh adalah sebesar 138.396 U/ml (Tabel 1).

Purifikasi selanjutnya dilakukan pengendapan dengan amonium sulfat.

Pengendapan dilakukan pada konsentrasi optimum yaitu 10%, 20%, 30%, 40%,

50%, 60%, 70%. Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa pengendapan enzim

dengan ammonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 40-

50% (Data Lampiran 7). Aktivitas spesifik menurun pada fraksi lebih dari 50%

karena pada fraksi tersebut lebih banyak enzim yang terendap bukan enzim

β-galaktosidase. Aktivitas spesifik β-galaktosidase hasil semipurifikasi

ammonium sulfat pada fraksi 40-50% adalah sebesar 238.438 U/mg. Aktivitas

spesifik enzim kasar lebih rendah dibandingkan aktivitas spesifik enzim

pengendapan dengan ammonium sulfat karena konsentrasi protein yang diperoleh

pada enzim kasar lebih tinggi dibandingkan hasil pengendapan dengan ammonium

sulfat sebesar 0.365 mg (Tabel 1). Tingkat kemurnian pengendapan dengan

ammonium sulfat dan mengalami peningkatan dari 1 kali menjadi 2.97 kali dan

rendemen sebesar 62.88%.

Gambar 1 Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva

β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■)Kurva pertumbuhan

BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva β-galaktosidase

BAL indigenos strain D-210(■)

Gambar Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan

kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■)

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0

2E-09

4E-09

6E-09

8E-09

1E-08

1.2E-08

1.4E-08

1.6E-08

1.8E-08

2E-08

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Jam ke-

Akt

ivit

as(U

/ml)

Jum

lah

se

l/m

l

10

Purifikasi parsial β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-210 hasil

penngendapan selanjutkan dilakukan dialisis. Β-galaktosidase hasil dialisis

menunjukkan total aktivitas adalah sebesar 50.420 U, total protein sebesar 0.207

mg dan aktivitas spesifik sebesar 243.574 U/mg drngan tingkat kemurnian

meningkat sebesar 3.04 kali. Rendemen yang dihasilkan sekitar 36.43% (Tabel 1).

Karakterisasi β-galaktosidase

Suhu

Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim.

Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil optimum

pada suhu 45 oC dan 40 oC dengan aktivitas sebesar 180.093 U/ml dan

43.194 U/ml, Bila kenaikan suhu jauh di atas suhu optimum maka enzim akan

terdenaturasi. (Data Lampiran 8). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

10 20 30 40 50 60 70

Tota

l Pro

tein

(m

g)

Tota

l Akt

ivit

as (

U)

Fraksi Ammonium Sulfat %

Gambar 2 Hasil semipurifikasi dengan garam ammonium sulfat aktivitas

total (■)dan total protein(●)

Tabel 1 Purifikasi Parsial dari BAL indigenos strain D-210

Tahapan Total

Aktivitas

(U)

Total

Protein

(mg)

Aktivitas

Spesifik

(U/mg)

Rendemen

(%)

Kemurnian

(kali)

Enzim Kasar 138.396 1.729 80.043 100.00 1.00

Pengendapan

AmoniumSulfat

40%-50%

87.030

0.365

238.438

62.88

2.97

Dialisis 50.420 0.207 243.574 36.43 3.04

11

suhu 40 oC lebih rendah yaitu 7.85% dibandingkan aktivitas relatif

β-galaktosidase bebas dapat bertahan sampai 75.05%.

Gambar 4a menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase

Enzim bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam dengan suhu

25 sampai 40 oC dengan aktivitas tersisa masing-masing sebesar 0.22% dan

0.14% dari aktivitasnya. Gambar 4b menunjukkan pengaruh suhu terhadap

stabilitas β-galaktosidase teramobil yang relatif stabil setelah diinkubasi selama

1 jam dengan aktivitas tersisa sebesar 7.75% dan 2.01%.

(b)

(a)

Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase

Gambar 1 1Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-

galaktosidase

bebas (▲) dan teramobil (■)

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

25 30 35 40 45 50 55

Akt

ivit

as R

ela

tif(

%)

Suhu

(a)

')

79.94 82.78

50.67 49.98

16.32

0.22 0.140.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

25 30 35 40 45 50 55

Akt

ivit

as T

ers

isa(

%)

Suhu

12

pH

Beberapa keadaan yang mempengaruhi kinerja enzim salah satu

diantaranya adalah pH dimana β-galaktosidase bebas mencapai optimum pada

pH 6.5 dengan aktivitas tertinggi sebesar 252.341 U/ml, sedangkan

β-galaktosidase amobil pada pH 6 dengan aktivitas sebesar 40.428 U/ml.

Gambar 5 menunjukkan optimasi pH β-galaktosidase bebas cenderung

lebih rendah yaitu pH 6.5 dengan aktivitas sebesar 252.341 U/ml sedangkan

β-galaktosidase teramobil optimasi tertinggi dikisaran pH 6 dengan aktivitas

sebesar 40.428 U/ml. Aktivitas relatif enzim amobil tercapai sampai 100%.

(b)

64.82 69.49

88.1576.66

31.08

7.752.01

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

25 30 35 40 45 50 55

Akt

ivit

as T

ers

isa(

%)

suhu

Gambar 4 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas

β- galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b)

Gambar 5 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas

β-galaktosidase bebas(▲) dan teramobil(■)

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

Akt

ivit

as R

ela

tif(

%)

pH

13

Enzim β-galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam

pada pH 5.0 sampai 8.0 karena masih menyisakan aktivitas 40% (Data Lampiran

9). Gambar 6a dan 6b aktivitas β-galaktosidase masih relatif stabil dengan

aktivitas tersisa pada β-galaktosidase bebas sebesar 40.83% dan β-galaktosidase

teramobil sebesar 43.37%.

(a)

31.1235.11

39.42 40.83

17.36

34.75

41.32

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

Akt

ivit

as T

ers

isa(

%)

pH

(b)

67.64 65.7169.18

60.7

43.37

9.47 10.63

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

Akt

ivit

as T

ers

isa(

%)

pH

Gambar 6 Profil hasil pengujian pH terhadap stabilitas β-galaktosidase

bebas (a) dan teramobil (b)

14

Aktivator dan Inhibitor

Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari BAL

Indigenos strain D-210 karena dapat menurunkan aktivitas sebesar 26.35% dan

53.97% dari kontrol (yaitu enzim yang tidak mendapatkan penambahan kation).

Kation Ca2+, Co2+, Zn2+ dalam penelitian ini juga meningkatkan aktivitas

β-galaktosidase dari kontrolnya sebesar 76.56%, 73.64% dan 61.5% (Data

Lampiran 10). Beda halnya dengan Mn2+ dan Mg2+ memiliki masing – masing

aktivitas dari kontrol sebesar 102 % dan 114 %.

Parameter Kinetik

. Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan pemetaan data dengan

persamaan Lineweaver Burk (gambar 9). Persamaan Lineweaver Burk adalah

y = 5.286x + 10.75 dengan nilai R2 sebesar 0.971 sehingga kecepatan maksimum

aktivitas β-galaktosidase sebesar 0.093 µmol/menit dan nilai KM sebesar

0,491 mM.

Pada β-galaktosidase teramobil terjadi peningkatan konsentrasi substrat dan

peningkatan kecepatan reaksi. Untuk persamaan reaksi Lineweaver Burk untuk

β-galaktosidase teramobil adalah y= 3.74x+2.106 diperoleh nilai

1/Vmaks = 2.106 dan nilai KM/Vmaks = 32.74. Maka nilai Vmaks = 0.474

µmol/menit dengan nilai KM sebesar 15.54 mM (Data Lampiran 12).

Gambar 7 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari BAL Indigenos

strain D-210

294.946

225.488216.186

180.217

3.532

301.147

19.008

337.116

0.000

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

400.000

Kontrol Ca Co Zn Cu Mn Hg Mg

Akti

vit

as (

U/m

L)

Ion - ion Logam

15

(a)

Optimasi Konsentrasi Alginat dan CaCl2 untuk Amobilisasi sel

dan amobilisasi β-galaktosidase Bakteri Asam Laktat Indigenos

Strain D-210

Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat

menghasilkan produk ONP yang berbeda nyata, dengan 4 variasi konsentrasi

alginat yang berbeda yaitu 2%, 3%, 4% dan 5% (b/v) dengan inkubasi selama 1

jam konsentrasi alginat untuk sel amobilisasi yang diperoleh adalah sebesar 2%

dengan jumlah beads 57 Konsentrasi alginat 2%, 3%, 4% dan 5% dengan variasi

konsentrasi CaCl2 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M terlihat bahwa untuk sel konsentrasi CaCl2

optimum pada konsentrasi 0.1 M untuk natrium alginat 2% sedangkan enzim

untuk konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi 0.1 M dan natrium alginat 3%.

(a)

(a)

y = 5.286x + 10.75R² = 0.971

0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

180.000

0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000

1/V

1/S

(b)

Gambar 8 Kurva lineweaverBurk dari beta-galaktosidase bebas (a) dan

teramobil (b)

y = 32.74x + 2.106R² = 0.962

0.000

5.000

10.000

15.000

20.000

25.000

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

1/V

1/S

16

Gambar 9a menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada

enzim adalah 2% dengan konsentrasi CaCl2 0.1 M dengan jumlah produk yang

dihasilkan sebesar 47.56 µmol ONP, CaCl2 0.3 M sebesar 20.74 µmol ONP dan

CaCl2. 0.5 M sebesar 29.58 µmol ONP. Gambar 9b menunjukkan bahwa

konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada sel adalah 3% dengan konsentrasi

CaCl2 0.1 dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 49.42 µmol ONP,

CaCl2 0.3 M dan CaCl2 0.5 M jumlah produk ONP yang dihasilkan masing-

masing sebesar 41.98 µmol dan 8.8 µmol.

(a)

47.56 46.63

20.12 21.6720.74

33.3

14.54 15.62

29.58 32.06

5.075

11.91

0

10

20

30

40

50

2 3 4 5

Pro

du

k o

NP

(µ

mo

l)

Konsentrasi alginat

Calsium klorida 0,1M Calsium klorida 0,3M Calsium klorida 0,5M

(b)

Gambar 9 Variasi konsentrasi alginat dan CaCl2 untuk penggunaan

enzim amobil (a) dan sel amobil (b)

49.42 51.59

44.31

33.4533.45

41.98

20.58 22.1415.93

8.1814.23 11.59

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5

Pro

du

k o

NP

(µm

ol)

Variasi konsentrasi alginat (%)

Calsium klorida 0,1M Calsium klorida 0,3 M Calsium klorida 0,5 M

17

Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat

Optimasi Konsentrasi Enzim β-galaktosidase dan Sel Untuk Amobilisasi

Pada Hidrolisis Laktosa

Variasi penggunaan konsentrasi alginat pada β-galaktosidase dapat dilihat

pada gambar 11 terdapat 3 variasi bobot yaitu 5%, 10% dan 20% . Pada bobot

konsentrasi alginat 5 % cenderung lebih kecil produk yang dihasilkan yaitu

sebesar 40.202 µmol sedangkan untuk bobot konsentrasi alginat 10% diperoleh

produk sebesar 55.626 µmol. .

Hasil penelitian menyatakan semakin banyak konsentrasi alginat pada enzim

β-galaktosidase untuk amobilisasi pada hidrolisis laktosa maka semakin banyak

0

20

40

60

80

100

5% 10% 20%

40.202

55.626

91.752

Pro

du

k (μ

mo

l)

Konsentrasi Alginat

Gambar 10 Optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel (♦)dan

amobilisasi enzim(■)

49.42 51.59

44.31 33.45

47.56 46.63

20.1221.67

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5

Pro

du

k O

NP

(µm

ol)

Konsentrasi alginat (%)

Gambar 11 Variasi Penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi

β-galaktosidase pada hidrolisis laktosa

18

0

20

40

60

4% 8% 12%

37.25

53.02 58.884P

rod

uk

(μ

mol)

Konsentrasi Alginat

produk yang dihasilkan yaitu pada konsentrasi alginat 20% jumlah produk ONP

sebesar 91.752 µmol.

Konsentrasi alginat yang dipergunakan pada sel amobil untuk hidrolisis

laktosa adalah sebesar 4%, 8% dan 12% (b/v).

Gambar 12 menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amoblisasi pada

hidrolisis laktosa untuk bobot konsentrasi alginat 4% paling rendah

dibandingkan bobot alginat 8%. Untuk konsentrasi alginat 4% yaitu sebesar

37.25 µmol dan kosentrasi 8% sebesar 53.02 µmol. Konsentrasi alginat 12%

adalah konsentrasi dengan jumlah produk yang tertinggi sebesar 58.884 µmol.

Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT

Potensi hidrolisis sel bebas dan amobil dilakukan dengan sistem batch

selama 24 jam pada suhu 45 oC selama 24 jam dan sampling dilakukan tiap 3 jam

serta analisis laktosa terhidrolisis Pada gambar 14a hasil hidrolisis laktosa oleh

sel BAL Indigenos strain D-210 pada sel teramobil meningkat yaitu pada jam

ke-6 dengan aktivitas relatif sebesar 76.72% dengan jumlah laktosa terhidrolisis

sebesar 0.366 g. Aktivitas relatif enzim teramobil tertinggi mencapai 62.68% dan

mencapai optimum pada jam ke-18 dengan laktosa terhidrolisis sebesar 0.299 g

(Data Lampiran 13).

Gambar 12 Variasi penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel

pada hidrolisis laktosa

Gambar 13 Potensi hidrolisis laktosa sel teramobil (a)

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Akti

vit

as

rela

tif(

%)

jam ke-

19

Gambar 14 Potensi hidrolisis laktosa enzim teramobil (b)

Pada gambar 15 menunjukkan bahwa potensi hidrolisis laktosa pada sel bebas

dan enzim bebas mencapai aktivitas relatif masing-masing sebesar 73.37% dan

89.93% dengan jumlah laktosa terhidrolisis masing-masing sebesar 0.350 g dan

0.429 g.

Analisis statistik terlihat bahwa aktivitas relatif sel teramobil dengan enzim

teramobil terdapat perbedaan nyata (α=0.05) terhadap lamanya waktu aktivitas relatif

dan tidak ada perbedaan nyata terhadap aktivitas hidrolisis relatif untuk sel bebas dan

enzim bebas.

Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil

Pemilihan amobilisasi dengan natrium alginat dipandang lebih aman dan

murah Penggunaan berulang sel dan enzim setelah diamobilisasi adalah untuk

memisahkan antara enzim dan produk yang dihasilkan. Sehingga enzim dapat

dipakai berulang kali dan aktivitas tetap stabil. Sel amobil dan enzim amobil

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Akt

ivit

as h

idro

lisis

re

lati

f(%

)

Jam ke

Gambar 15 Potensi hidrolisis laktosa sel bebas (■) dan enzim bebas(♦)

0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00

100.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24Akt

ivit

as h

idro

lisis

Re

lati

f(%

)

Jam Ke-

20

dimasukkan kedalam susu UHT lalu diinkubasi goyang untuk sel amobil pada

suhu 40 oC dan enzim amobil pada suhu 45 oC kemudian dianalisis dengan

menggunakan kit enzimatik GOD-POD. Penggunaan berulang butiran gel

dilakukan sebanyak 6 kali dan terlihat penurunan aktivitasnya untuk sel dan enzim

teramobil masing-masing sebanyak 42.35% dan 53.68%.

Pada gambar 16a menunjukkan aktivitas hidrolisis relatif sel teramobil

untuk pemakaian ulangan ke-6 masih menyisakan aktivitas sebesar 39.53% .Pada

gambar 16b pemakaian ulangan ke-6 menyisakan aktivitas hidrolisis relatif

sebesar 57.65% dari aktivitas awalnya sebesar 100%.

(a)

(a)

100.00

76.19

52.86 47.71 46.66

39.52

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

1 2 3 4 5 6

Akt

ivit

tas

Hid

rolis

is R

ela

tif(

%)

Ulangan ke-

(b)

Gambar 16 Penggunaan berulang sel teramobil (a) dan enzim teramobil (b)

100.00

64.01 62.83 60.76 54.86 53.68

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

1 2 3 4 5 6

Akt

ivit

as h

idro

lisis

Re

lati

f(%

)

Ulangan ke-