BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Bakteri dapat hidup di mana-mana, baik itu pada tubuh manusia misalnya
rongga mulut, dan juga dari lingkungan, misalnya dari udara. Bentuk dan struktur
tubuh dari tiap-tiap bakteri berbeda-beda demikian pula kemampuannya
membentuk kapsul dan spora.
Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat
diperiksa dalam keadaan mati atau di dalam keadaan hidup. Pemeriksaan
morfologi ini perlu mengenal nama bakteri.
Pada pengecatan mikroorganisme, digunakan zat-zat warna yang berbeda-
beda tergantung dari struktur bakteri yang akan diamati. Struktur tubuh bakteri
yang dapat diamati misalnya ada tidaknya kapsul dan spora pada bakteri.
Untuk mengamati struktur tubuh bakteri maka di dalam laboratorium
dilakukan pengecatan bakteri. Pengecatan ini bertujuan untuk mengamati ada
tidaknya kapsul dan spora pada bateri, kemampuan bakteri bertahan terhadap
asam, dan jenis-jenis pengecatan baik itu yang sederhana, pengecatan negative
dan pengecatan gram.
I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui dan memahami teknik pengecatan/pewarnaan
mikroorganisme.
I.2.2 Tujuan Percobaan
Menentukan penampilan morfologi dan differensiasi pada bakteri
dengan menggunakan metode pengecatan sederhana, pengecatan negative,
pengecatan tahan asam, pengecatan Gram, pengecatan kapsul, dan
pengecatan spora.
I.3 Prinsip Percobaan
1. Penentuan bentuk morfologi bakteri E. coli dan Bacillus subtilis berdasarkan
prosedur pewarnaan sederhana di mana suspensi bakteri ditetesi metilen blue
pada objek glass dan diamati bentuk morfologinya di bawah mikroskop serta
penentuan morfologi berdasarkan pewarnaan sederhana dengan cara mengambil
setetes nigrosin dan 1 tetes ose biakan dan diamati bentuk morfologinya.
2. Penentuan golongan bakteri berdasarkan prosedur pewarnaan gram dengan
menggunakan pereaksi kristal violet, larutan mordant, larutan etanol 95% dan
safranin, dan diamati warnanya.
3. Penentuan golongan baktei tahan asam dengan prosedur pengecatan dengan
menggunakan pereaksi carbol fucsin, etanol, dan metilen blue kemudian
warnanya diamati di bawah mikroskop.
4. Penentuan struktur bakteri berdasarkan prosedur pewarnaan kapsul dengan
menggunakan larutan kristal violet, larutan tembaga (II) sulfat lalu diamati di
bawah mikroskop.
5. Penentuan struktur bakteri berdasarkan prosedur pewarnaan spora dengan
menggunakan larutan malachite green dan larutan safranin dan diamati di
bawah mikroskop.
DAFTAR PUSTAKA
1. Djide, M. Natsir, Sartini, (2005), Mikrobiologi Farmasi Dasar, Universitas
Hasanuddin, Makassar.
2. Djide, M. Natsir, Sartini (2006), Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi
Dasar, Universitas Hasanuddin , Makassar
3. Dwidjoseputro, D., (1990), Dasar-Dasar Mikrobiologi, PT. Djambatan, Malang.
4. Fardiaz, Srikansi, (1993), Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Raja Grafindo
Resada, Jakarta.
5. Lay, Bibiana W., Sugyo Hastowo, ( ), Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor,
Bandung.
6. Pelczar, Michael, J., (1986), Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jilid 2, UI-Press, Jakarta
7. Suriawira, Unus, (1986), Pengantar Mikrobiologi Umum, Penerbit Angkasa,
Bandung.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Teori Umum
Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat
diperiksa di dalam keadaan hidup atau dalam keadaan mati. Pemeriksaan
morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri. Di samping itu diperlukan juga
pengenalan sifat-sifat fisiologinya, bahkan sifat-sifat fisiologi itu kebanyakan
merupakan factor penentu dalam mengenal nama species suatu bakteri. (3;11)
Morfologi bakteri dapat diamati dengan dua cara yaitu (5;21)
1. Pengamatan sel yangb hidup yang tidak diwarnai.
2. Pengamatan sel yang mati dan diwarnai.
Bakteri yang hidup tidak berwarna sehingga sulit dibedakan dengan
lingkungan sekelilingnya. Meskipun kontras bakteri dengnan lingkungan tidak
menyolok namun susunan kimianya sangat berbeda. Perbedaab kimia inilah yang
menguntungkan kita, sehingga bakteri dapat diwarnai tanpa mewarnai lingkungan
sekitarnya. (5;21)
Kecuali untuk mikroalge dan beberapa bakteri tertentu yang jumlahnya
sangat terbatas, pada umumnya sel bakteri bersifat tembus cahaya. Sehingga hal
ini mempersukar untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah alat perbesaran
yang sudah ada. Hal ini disebabkan, karena banyak mikroba yang tidak memiliki
butiran warna, seperti yang umum didapatkan pada bakteri, jamur dan ragi.
Berbeda dengan mikroalge yang jelas mempunyai butir-butir ataupun serat warna
di dalam selnya, sehingga pembagiannya tergantung kepada kehadiran warna
tersebut.(7;41)
Sistem Pewarnaan
Pengenalan bentuk (morfologis) mikroba, kecuali untuk kelompok
mikroalge, harus dilakukan melalui pewarnaan terlebih dahulu. Karena tanpa
melalui pewarnaan, maka bentuk tersebut tidak akan dapat diamati secara jelas.
(7;41)
Keuntungan melakukan pewarnaan adalah: (5;21)
1. Meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya sehingga dapat
diamati berbagai bentuk dan susuna bakteri.
2. Memungkinkan pengamatan salah satu bagian dari sel bakteri, misalkan
spora, kapsel, atau flagella.
3. Memungkinkan penggunaan pembesaran.
Pewarnaan atau pengecatannterhadap mikroba, banyak dilakukan baik
secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung
(melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah untuk (7; 42)
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalan jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarnaan yang diberikan sehingga sifat-sifat
fisik dan kimia yang ada dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus
yang akan memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena
pewarna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative.(7;42)
Secara kimia zat warna dapat digolongkan ke dalam senyawa basa-dan
senyawa-asam. Jika warna terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut
dinakamakan zat warna basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan
negative, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna asam. (7;42)
Fiksasi yang dilakukan sebelum zat warna digunakan bertujuan untuk
(7;42-43)
a. Melekatkan sel pada gelas objek.
b. Membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
c. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif NH4+ yang akan bereaksi
dengan gugus OH- dari zat warna.
d. Mencegah terjadinya otolisis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan
enzim yang adan di dalamnya.
e. Mengubah daya ikat zat warna.
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun
pengeringan secara dingin, sedang yang paling umum dilakukan secara kimia
dengan penambahan sabun, formalin, fenol, dan sebagainya.(7;43)
Jenis Pewarnaan
1. Pewarnaan Sederhana (5;22)
Bila hanya digunakan 1 macam zat warna saja.
1. Pewarnaan differensial, (5;22)
Pewarnaan yang digunakan untuk memindahkan bakteri atau untuk melihat
struktur sel tertentu.
2. Pewarnaan gram (5;22-23)
Merupakan pewarnaan yang paling sering digunakan. Teknik ini ditemuka
oleh Christian Gram. Pada teknik pewarnaan ini digunakan:
a. Zat warna kristal violet
b. Mordan
c. Larutan pemucat
d. Zat warna kedua yang merupakan pembeda dengan zat warna yang pertama
Pewarnaan bakteri dengan pewarnaan ini memilahkan bakteri menjadi
gram positif dan gram negative. Gram positif terlihat ungu sedangkan gram,
negative terlihat merah.(5;23)
3. Pewarnaan negatif (5;25)
Pewarnaan negative bukan merupakan merupakan pewarnaan sel bakteri oleh
karena hanya latar belakang dari preparat yang diwarnai sedangkan bakteri
tetap jernih karena tidak menyerap zat warna. Pada pewarnaan ini preparat
tidak difiksasi dengan api melainkan dengan udara.
Pewarnaan Gram
Hasil gram positif dan gram negative ini desebabkan oleh perbedaan
kandungan dinding sel bakteri, yaitu bahwa kandungan senyawa peptidoglikan
pada dinding sel gram positif lebih tebal kalau dibandingkan dengan dinding sel
gram negative.(7;45)
Ada kalanya suatu sadiaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang
pertama (ungu) terserap maka sediaan dicuci dengan alcohol, kemudian
ditumpangi dengan zat warna yang berlainan.(3;21)
Objek diperiksa di bawah mikroskop menggunakan lensa objektif minyak
imersi, dan dicatat warna sel yang menunjukkan sifat pewarnaan gram yaitu biru-
ungu (gram positif) atau merah-meraj muda (gram negative). Juga dilihat bentuk
dasar sel, dan cara pengelompokan (tunggal, berpasangan, rantai, bergerombol,
dan sebagainya).(4;194)
Pewarnaan Kapsul
Kapsul adalah bagian sel yang merupakan lapisan lendir yang
menyelubungi dinding sel. Adanya kapsul pada bakteri dapat dilihat dengan
pengecatan negative. Kapsul biasanya tersusun dari polisakarida, polipeptida atau
protein-polisakarida. Sedangkan lendir (slim) tidak merupakan bagian dari sel,
tetapi hanya bersifat eksresi sel dan tidak mempunyai bentuk yang teratur atau
tertentu.(1;117)
Kebanyakan bakteri mempunyai lapisan lendir yang menyelubungi dinding
sel seluruhnya. Jika lapisan lendir ini cukup tebal, maka bungkus itu disebut
kapsula. Lendir ini tidak mudah menghisap zat warna. Hanya dengan pewarnaan
yang khusus, lapisan lendir itu dapat diperlihatkan.(3;25)
Pewarnaan Endospora
Beberapa bakteri dapat membentuk spora (endospora). Endospora adalah
suatu bentukan yang berbentuk bulat atau lonnjong, bersifat sangat membias
cahaya, sukar dicat dan sangat resisten terhadap factor-faktor jelek. (1;123)
Bakteri dalam bentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, dan
terutama terhadap kekeringan, panas dan kedinginan. Hal ini disebabkan karena
dinding spora sedikit banyak impermeable, sedang banyaknya asam ribonukleat
di dalam protoplasma dapat menawar pengaruh buruk dari sinar, lebih-lebih dari
sinar ultra ungu.(3;31)
Adanya spora dapat diketahui dengan pengamatan secara morfologis dan
secara fisiologi. Bentuk spora dapat dilihat di bawah mikroskop biasa, apalagi
kalau spora itu diwarnai. Pewarnaan spora memerlukan pemanasan lebih dulu.
(3;32)
Objek diperiksa di bawah mikroskop menggunakan lensa objektif minyak
imersi. Endospora bakteri akan berwarna hijau-hijau muda, sedangkan sel
vegetatif berwarna merah-merah muda. Diamati bentuk dan besar spora, letak
spora di dalam sel, pembengkakan sel vegetatif, atau spora mungkin telah
dikeluarkan dari sel jika kultur yang diamati sudah terlalu tua.(4;194)
II.2 Uraian Mikroba
1. Bacillus subtilis
a) Klasifikasi
Kingdom : Procaryotae
Divisio : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Enterobacteriales
Genus : Bacillus
Species : Bacillus subtilis
b) Morfologi (6 ; 127-128)
Termasuk bakteri kelompok panjang aerobic, motil karena flagella. Cirri
pembeda yang menonjol dari bakteri adalah kemampuannya membentuk
endospora. Dapat menyebabkan penyakit meningitis endokarditis, infeksi
mata, dan lain-lain
2. Escherichia coli
a) Klasifikasi
Kingdom : Procaryotae
Divisio : Schizophyta
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Species : Escherichia coli
b) Morfologi (6;949)
Batang lurus , motil dengan flagellum peritrikus atau nonmotil. Gram negatif.
Tumbuh dengan mudah pada medium nutrient sederhana. Lactose
difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas.
3. Mycobacterium tubercolosis
a) Klasifikasi
Kingdom : Procaryotae
Divisio : Scotobacteria
Kelas : Bacteria
Ordo : Actynomycetales
Famili : Mycobacteriaceae
Genus : Mycobacterium
Species : Mycobacterium tubercolosis
b) Morfologi (6;951)
Batang agak melengkung atau lurus, 0,2-0,6 nm x 1,0-10 nm, pertumbuhan
filament. Tahan alkohol asam, nonmotil tidak terbentuk endospora, konidia
atau kapsul, tidak menampakkan hifa udara. Mycobacterium tuberculosis dan
Mycobacterium leprae dapat menyebabkab infeksi kronik.
4. Azetobacter sp.
a) Klasifikasi
Kingdom : Procaryotae
Divisio : Scotobacteria
Kelas : Bacteria
Ordo : Azetobacteriales
Famili : Acetobacteriaceae
Genus : Acetobacter
Species : Acetobacter sp.
b) Morfologi (6;946)
Sel bulat panjang sampai batang, lurus atau agak bengkok, 0,6-0,8 x 1,0-
3,0μm, terdapat tunggal, berpasangan atau dalam rantai. Terdapat bentuk-
benuk evolusi. Motil dengan flagellum peritrikus atau nonmotil. Tidak
mempunyai endospora. Sel-sel muda bersifat gram negative, beberapa sel tua
gram variable. Kemoorganotrof. Mengoksidasi etanol menjadi asam asetat.
asetat dan laktat dioksidasi menjadi CO2 +H2. tumbuh pada medium
sederhana dan kompleks. Aerobik sejati. Suhu optimum 30o C, berkisar dari
5-42o.
II.3 Prosedur Percobaan
A. Pengecatan Negatif (1;43)
1. Bersihkan gelas objek dengan alcohol sehingga bebas lemak, lalu difiksasi.
2. Setelah dingin, ambil suspensi biakan murni B. subtilis dengan ose secara
aseptis dan letakkan di atas gelas objek.
3. Kemudian ambil tinta cina atau nigrosin dengan ose sedikit dan campurkan
dengan suspensi yang telah terletak di atas gelas objek. Campurkan sampai
homogen dan terlihat sangat tipis.
4. Selanjutnya preparat dibiarkan kering di udara.
5. Amati dengan mikroskop dengan pembesaran kuat dan menggunkan minyak
imersi.
6. Ulangi poin 1- 5 untuk biakan murni Escherichia coli.
B. Pengecatan Gram (1;46)
1. Siapkan preparat olesan bakteri
2. Keringkan di udara, setelah kering difiksasi di atas lampu spritus.
3. Setelah dingin, teteskan cat GRAM A sebanyak 2-3 tetes, biarkan 1 menit.
4. Cuci dengan air mengalir, keringkan di udara atau kertas isap.
5. Teteskan larutan GRAM B, biarkan selama 1 menit
6. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
7. Teteskan larutan GRAM C, biarkan selama 30 detik.
8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
9. Teteskan larutan GRAM D, biarkan selama 2 menit.
10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan.
11. Amati dengan mikroskop dengan perbesaran kuat dan menggunakan
minyak imersi.
12. Gambar hasil-hasil pengecatan tersebut.
C. Pengecatan Tahan Asam (1;48)
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tutup olesan dengan kertas isap (lebar kertas tidak boleh melebihi gelas
objek)
3. Tetesi kertas isap dengan larutan Ziehl’s Carbol Fucsin samapi jenuh.
4. Panaskan di atas api kecil atau hot place selama 3-5 menit.
5. Angkat kertas isap, cuci preparat dengan air mengalir.
6. Cuci dengan asam alcohol selama 10-30 detik dengan hati-hati dan jangan
sampai berlebihan.
7. Cuci dengan air mengalir.
8. Tetesi dengan larutan metal biru selama 30-45 detik, cuci kembali dan
keringkan dengan kertas isap.
9. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat dengan menggunakan
minyak imersi.
10. Catat dan gambar hasil pengamatan.
D. Pengecatan Spora (1;49)
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tutuplah preparat dengan olesan tersebut dengan sepotong kertas isap.
3. Tetesi larutan Malachite Green.
4. Letakkan preparat di atas pembakar spritus selama 5-10 menit dan jaga
sampai larutan kering.
5. Angkat kertas isap dan cuci preparat dengan air mengalir.
6. Tetesi dengan larutan safranin selama 30-45 detik.
7. Cuci kembali dengan air mengalir dan keringkan secara hati-hati dengan
memakai kertas isap.
8. Amati di bawah mikroskop memakai pembesaran kuat dengan menggunakan
minyak imersi.
9. Catat dan gambar letak, bentuk dan ukuran spora.
E. Pengecatan Kapsul (1;50)
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tetesi dengan larutan kristal violet dan panaskan di atas penangas air selama
1 menit.
3. Bilas dengan larutan CuSO4 dan keringkan dengan kertas isap.
4. Amati di bawah mikroskop memakai pembesaran kuat dengan menggunakan
minyak imersi.
BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
1. Botol larutan
2. Botol semprot
3. Gelas objek
4. Lampu spritus
5. Mikroskop
6. Ose bulat
7. Pipet tetes
8. Tabung reaksi
III.1.2 Bahan
1. Alkohol
2. Alkohol asam
3. Air steril
4. Biakan bakteri Bacillus subtilis
5. Biakan bakteri Escherichia coli
6. Biakan bakteri Mycobacterium tubercolosisi
7. Biakan bakteri Acetobacter sp.
8. Kertas saring
9. Larutan Carbol fucsin
10. Larutan CuSO4
11. Larutan GRAM A
12. Larutan GRAM B
13. Larutan GRAM C
14. Larutan GRAM D
15. Larutan Kristal violet
16. Larutan Malachite Green
17. Larutan nigrosin
18. Larutan Safranin
19. Metilen blue
20. Tissue roll
21. Spritus
III.2 Cara Kerja
A. Pengecatan Sederhana
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Diambil 1 ose biakan murni bakteri (E. coli dan B. subtilis) secara aseptis.
3. Diratakan di atas objek glass dan difiksasi.
4. Ditetesi dengan larutan metilen blue 1-2 tetes dan dibiarkan mongering
selama 1-2 menit.
5. Dicuci dengan air mengalir dan sisanya dikeringkan dengan kertas saring.
6. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 dan digambar
hasil pengamatannya.
B. Pengecatan Negatif
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Objek glass ditetesi dengan nigrosin pada bagian ujung objek glass.
3. Diambil inokulan bakteri (E. coli atau B. subtilis) dan dimasukkan ke
dalam larutan nigrosin secara aseptis.
4. Diambil objek glass lain dan diletakkan di sebelah luar nigrosin dengan
posisi miring dan digeser perlahan hingga membentuk suatu lapisan tipis.
5. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x10.
6. Digambar hasil pengamatan.
C. Pengecatan Tahan Asam
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Diambil satu tetes air steril kemudian diteteskan di atas objek glass secara
aseptis.
3. Diambil inokulan bakteri (Mycobacterium tubercolosa atau B. subtilis)
dengan ose bulat secara aseptis kemudian diletakkan di atas objek glass
yang sudah ditetesi dengan air steril.
4. Dikeringkan dan difiksasi.
5. Preparat ditutup dengan menggunakan kertas saring.
6. Ditambahkan 1 tetes larutan Carbol fucsin dan dipanaskan 3-5 menit,
setelah itu kertas saring dilepaskan.
7. Objek glass didinginkan dan dicuci dengan air mengalir.
8. Dicuci dengan alcohol asam dan dibiarkan 20 detik.
9. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan kertas saring.
10. Ditambahkan dengan metilen blue dan dibiarkan selama 1 menit.
11. Dicuci dengan air mengalir.
12. Diamati di bawah mikroskop dan digambar hasil pengamatan.
D. Pengecatan Gram
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Dioleskan biakan bakteri (B. subtilis atau E. coli) menggunakan secara
aseptis dan difiksasi.
3. Ditambahkan dengan 2 tetes larutan Gram A, dibiarkan 1 menit.
4. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan kertas saring.
5. Ditambahkan dengan 1 tetes larutan Gram B, dibiarkan selama 30 detik.
Setelah itu dicuci dan dikeringkan dengan kertas saring.
6. Ditambahkan dengan 1 tetes larutan Gram C dan dibiarkan selama 20 detik.
Setelah itu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan
menggunakan kertas saring.
7. Ditambahkan dengan 1 tetes larutan Gram D dan dibiarkan selama 1 menit.
Setelah itu, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
8. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x 10 dan digambar hasil
pengamatan.
E. Pengecatan Kapsul
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Diambil inokulan bakteri (Acetobacter) menggunakan ose bulat dan
dioleskan di atas objek glass. Difiksasi.
3. Ditambahkan larutan kristal violet hingga tergenang dan dibiarkan selama
1 menit.
4. Dibilas dengan larutan CuSO4 lalu dikeringkan dengan kertas saring.
5. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan digambar hasil
pengamatan.
F. Pengecatan Spora
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Diambil inokulasi bakteri (B. subtilis) dengan menggunakan ose bulat
secara aseptis dan ditambahkan sedikit air steril agar tersuspensi.
3. Ditutup dengan kertas saring.
4. Ditambahkan dengan larutan Malachite Green 1-2 tetes dan dipanaskan ± 5
menit, setelah itu kertas saring dibuka.
5. Objek glass didinginkandan dicuci dengan air mengalir.
6. Dikeringkan dengan menggunakan kertas saring setelah itu ditambahkan
larutan safranin 1-2 tetes.
7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan kertas saring.
8. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan digambar hasil
pengamatannya.
BAB IV
HASIL
IV.1 Tabel Pengamatan
1. Pengecatan Sederhana
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Bacillus subtilisMetilen
biru
+Bakteri berwarna biru dengan latar
transparan
Escherichia coli +Bakteri berwarna biru dengan latar
transparan
2. Pengecatan Negatif
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Bacillus subtilis
Nigrosin
+Bakteri transparan
dengan latar berwarna biru.
Escherichia coli +Bakteri transparan dengan latar berwarna biru
3. Pengecatan Tahan Asam
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Bacillus subtilis Carbol fucsin ,
Metilen blue
- Warna luntur
Mycobacterium + Berwarna merah
4. Pengecatan Gram
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Bacillus subtilis Zat warna Gram A,B,C,
dan D
Gram positif (+) Warna ungu
Escherichia coli Gram negatif (-) Warna merah
5. Pengecatan Kapsul
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Acetobacter Kristal violet Memiliki kapsul Warna biru biru pucat
6. Pengecatan Spora
Bakteri Zat warna Pengamatan Keterangan
Bacillus subtilisMalachite green dan safranin
Memiliki spora vegetatif
Warna merah
II.2 Gambar
1. Pengecatan Sederhana
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar Belakang
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar Belakang
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Eschericia coliZat warna : Metilen biru
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Bacillus subtilisZat warna : Metilen biru
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar belakang
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar belakang
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Bacillus subtilisZat warna : Nigrosin
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Escherichia coliZat warna : Nigrosin
3. Pengecatan Tahan asam
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Objek glass
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Objek glass
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Mycobacterium tuberculosisZat warna : Carbol fucsin, alcohol dan
metilen blue
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Bacillus subtilisZat warna : Carbol fucsin, alcohol dan
metilen blue
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar Belakang
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Latar belakang
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Bacillus subtilisZat warna : Zat warna GRAM
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Escherichia coliZat warna : Zat warna GRAM
5. Pengecatan Kapsul
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Kapsul
3. Latar belakang
6. Pengecatan spora
KETERANGAN:
1. Bakteri
2. Spora
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : AcetobacterZat warna : Kristal violet
LABORATORIUMMIKROBIOLOGI FARMASI DASAR
JURUSAN FARMASI UNHAS
Bakteri : Bacillus subtilisZat warna : Malacjite green dan safranin
BAB V
PEMBAHASAN
Untuk mengenal bentuk morfologi mikroba, maka harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu. Tanpa pewarnaan maka bentuk tersebut tidak akan dapat diamati
secara jelas. Fungsi utama pengecatan adalah untuk memberi warna pada sel atau
bagian-bagiannya, sehingga menambah kontras dan tampak lebih jelas. Selain itu,
pengecatan juga dapat menunjukkan distribusi zat kimia bagian-bagian (konstituen)
sel, membedakan mikroorganisme satu dengan yang lain, menentukan pH dan
potensial oksidasi-reduksi ekstra selluler dan intraseluler.
Ada beberapa teknik pengecatan mikroorganisme yaitu: pengecatan
sederhana, pengecatan negatif, pengecatan tahan asam, pengecatan Gram, pengecatan
kapsul, dan pengecatan spora.
1. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana adalah pengecatan yang paling sederhana dari semua
metode pengecatan bakteri karena pada pewarnaan ini hanya digunakan satu
macam zat warna yaitu Metilen Blue. Pada pengecatan sederhana digunakan dua
jenis bakteri yaitu Bacillus subtilis dan Escherichia coli. Metilen biru adalah zat
warna yang bermuatan positif dan akan terikat pada bakteri yang bermuatan negatif.
Dalam hal ini yang bermuatan negatif adalah cairan tubuh bakteri. Jika ada
mikroorganisme yang bermuatan negatif dan diuji dengan zat warna Metilen blue
maka metilen blue akan terikat ke dalam tubuh bakteri sehingga hasilnya bakteri
akan berwarna biru karena telah menyerap zat warna metilen blue. Dari hasil
pengecatan sederhana ini diperoleh bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli
yang berwarna biru yang berari bahwa kedua bakteri ini memiliki cairan tubuh yang
bermuatan negative.
2. Pengecatan Negatif
Pada pengecatan negatif, digunakan zat warna nigrosin. Zat warna nigrosin
adalah zat warna negative. Seperti halnya pada pengecatan sederhana, pada
pengecatan negative juga digunakan bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli.
Pada pengecatan negative, kedua bakteri di atas terlihat transparan jika dilihat di
bawah mikroskop. Hal ini disebabkan karena nigrosain merupakan zat warna
negative sehingga tidak dapat terikat pada bakteri dengan cairan tubuh yang
bermuatan negative pula sehingga yang berwarna pada pewarnaan negative adalah
latar belakangnya sedangkan bakteri tampak trasparan.
3. Pengecatan Tahan Asam
Pengecatan tahan asam adalah suatu metode pengecatan untuk menguji
apakah suatu bakteri memiliki kemampuan bertahan terhadap asam. Pada
pengecatan tahan asam digunakan dua macam bakteri yaitu Bacillus subtilis dan
Mycobacterium tuberculosis. Zat warna yang digunakan pada pengecatan tahan
asam ini adalah larutan carbol fucsin dan metilen blue ditambah dengan larutan
peluntur yaitu alkohol asam. Pada pengecatan tahan asam, mula-mula diambil
aquadest steril kemudian diteteskan di atas objek glass dan ditambahkan dengan
inokulen bakteri dan dibiarkan mengering dan difiksasi. Setelah itu ditambahkan zat
warna Carbol fucsin lalu ditutup dengan kertas saring dan difiksasi. Kemudian
dicuci dengan air mengalir lalu dicuci lagi dengan alcohol asam. Setelah itu
ditambahkan dengan metilen blue dan dicuci lagi dengan air. Dari hasil pengamatan
diperoleh bahwa Bacillus subtilis adalah bateri yang tidak tahan asam sedangkan
Mycobacterium adalah bakteri yang tahan asam di mana bakterinya akan berwarna
merah. Mycobacterium tuberculosis memiliki dinding sel terdiri dari lapisan lipid
yang tebal dan lapisan lilin di sebelah luar sel yang bersifat impermeable.
Warna merah ini berasal dari zat warna Carbol fucsin. Pada bakteri tahan
asam, tubuhnya mengandung asam mikolat sehingga yang terikat pada tubuhnya
adalah zat warna yang pertama diberikan kepadanya. Mekanismenya adalah pada
saat bakteri ditetesi dengan Carbol fucsin, bakteri akan meyerap zat warna tersebut.
dengan adanya fikasasi maka pengikatan zat warna menjadi kuat. Tujuan pencucian
dengan air adalah untuk membersihkan lindkungan yang mengandung zat warna.
Pada saat ditambahkan alcohol, bakteri tidak mampu mengambil zat warna yang
sudah terikat dalam bakteri. Pada saat ditambahkan dengan metilen blue, bakteri
tidak menyerap warna tersebut karena zat warna yang diserap adalah zat warna
yang pertama sehingga bakteri yang tahan asam akan berwarna merah.
4. Pengecatan Gram
Pengecatan gram merupakan pengecatan bakteri yang paling banyak
digunakan untuk pewarnaan bakteri. Prinsip dari pengecatan Gram adalah
penentuan jenis bakteri yang termasuk gram positif dan gram negative berdasarkan
perbedaan kandungan lipid dan peptidoglikan pada dinding selnya. Bakteri yang
digunakan Bacillus subtilis dan Eschericia coli. Pada pengecatan Gram digunakan
zat warna yaitu Gram A, Gram B, Gram C, dan Gram D.
- Komposisi Gram A adalah larutan kristal violet. Kristal violet merupakan zat
berwarna ungu yang bermuatan positif.
- Komposisi Gram B adalah larutan Mordant lugol iodin yang berwarna cokelat.
Fungsi dari larutan mordant ini adalah memperkuat ikatan zat warna yang
pertama yaitu kristal violet.
- Komposisi Gram C adalah etanol asam yang berfungsi untuk melunturkan lemak
yang terkandung dalam dinding sel bakteri sekaligus dengan zat warna yang telah
diserap.
- Komposisi gram D adalah larutan safranin yaitu larutan berwarna merah yang
berfungsi sebagai cat kontras yang memperjelas fungsi cat-cat sebelumnya.
Pada pengecatan bakteri, bakteri Gram positif akan berwarna ungu
saedangkan bakteri Gram negative akan berwarna merah. Perbedaan warna yang
ditujukkan ini terjadi karena perbedaan kandungan dinding sel bakteri, di mana
pada bakteri Gram positif dinding selnya mengandung peptidoglikan yang tebal
dan lapisan lemak yang tipis sedangkan dinding sel bakteri Gram negative terdiri
dari peptidoglikan yang tipis dan lapisan lemak yang tebal.
Pada saat penambahan kristal violet, larutan warna akan terserap ke dalam
dinding sel sedangkan penambahan larutan mordant lugol iodium akan
memperkuat daya ikat zat warna dalam dinding sel. Penambahan larutan Gram C
yaitu alcohol asam akan melarutkan lemak yang ada dalam dinding sel termasuk
zat warna yang telah diserapnya. Pada bakteri Gram postif yang memiliki lapisan
lemak yang tipis, zat warna kristal violet yang terlepas hanya sedikit, dan pada
saat penambahan larutan safranin maka zat warn aini tidak akan terikat lagi pada
dinding sel bakteri karena ikatan kristal violet pada dinding sel bakteri sangat
kuat. Hal inilah yang menyebabkan bakteri Gram positif berwarna ungu yang
berasal dari larutan kristal violet.
Pada bakteri gram negative, penambahan larutan Gram C akan melunturkan
lemak yang terkandung dalam dinding sel sehingga lapisann lemak yang tebal
yang dimiliki oleh bakteri akan terlarut demikian juga dengan kristal violet yang
telah diserap. Pada penambahan larutan safranin yang berwarna merah, zat warna
akan diserap sehingga bakteri gram negative akan berwarna merah.
Dari hasil pengecatan Gram diperoleh hasil Bacillus subtilis berwarna ungu
(gram positif) dan Escherichia coli berwarna merah (gram negative).
5. Pengecatan Kapsul
Pengecatan kapsul dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat
membentuk kapsul atau tidak. Kapsul dibentuk oleh bakteri untuk melindungi
dirinya dari lingkungan yang tidak menguntungkan. Untuk melakukan pengecatan
kapsul, mula-mula disiapkan preparat olesan bakteri Acetobacter, setelah itu
difiksasi. Setelah difiksasi, preparat ditambahkan dengan kristal violet sebagai zat
warna untuk memperjelas struktur bakteri. Setelah itu, ditambahkan dengan larutan
CuSO4 sebagai zat peluntur warna yang telah terikat pada tubuh bakteri. Pada
pengamatan di bawah mikroskop pada bakteri terlihat warna biru pucat yang
menandakan bahwa Acetobacter merupakan bakteri yang dapat membentuk kapsul.
6. Pengecatan Spora
Pengecatan spora bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat
membentuk spora. Spora merupakan suatu bentukan yang berbentuk bulat atau
lonjong dan sukar dicat. Bakteri yang digunakan pada pengecatan spora kali ini
adalah Bacillus subtilis. Pada pengecatan spora, suspensi bakteri Acetobacter
ditutup dengan kertas saring setelah itu, ditambahkan dengan larutan Malachite
Green lalu dipanaskan agar zat warn adapat masuk ke dalam sel bakteri yang
mengandung spora. Setelah itu, kertas saring dilepas dan preparat dicuci dengan air
mengalir untuk membersihkan lingkungan sekitarnya dari zat warna. Setelah itu,
preparat ditambahkan dengan larutan safranin yang berwarna merah yang dapat
memberikan warna pada spora vegetatif jika bakteri tersebut memiliki spora
vegetatif. Dari hasil pengamatn di bawah mikroskop,pada bagian tubuh bakteri
Acetobacter terdapat warna hijau yang menunjukkan endospora. Warna hijau ini
berasal dari zat warna Malachite Green.
Dari semua teknik pewarnaan bakteri yang telah dijelaskan di atas, setiap
pewarnaan memerlukan pemanasan/fiksasi sebelum zat warna diberikan pada
preparat bakteri. Fiksasi ini bertujuan untuk :
a. Melekatkan sel pada gelas objek.
b. Membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
c. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif NH4+ yang akan bereaksi
dengan gugus OH- dari zat warna.
d. Mencegah terjadinya otolisis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan
enzim yang adan di dalamnya.
e. Mengubah daya ikat zat warna.
BAB VI
PENUTUP
VI.1 Kesimpulan
Dari hasil pewarnaan bakteri, dapat disimpulkan :
1. Bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli menampakkan warna biru
pada pengecatan sederhana.
2. Bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli tampak transparan pada
pewarnaan negative.
3. Mycobacterium tuberculosis termasuk bakteri tahan asam sedangkan
Bacillus subtilis termasuk golongan bakteri tidak tahan asam.
4. Bacillus subtilis tergolong bakteri Gram positif sedangkan Escherichia coli
merupakan bakteri gram negative.
5. Acetobacter merupakan bakteri yang dapat membentuk kapsul.
6. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang dapat membentuk endospora.
VI.2 Saran
Kesabaran asisten membimbing praktikan tetap dipertahankan.
LAMPIRAN
SKEMA CARA KERJA
A. Pengecatan Sederhana
1 ose suspensi biakan bakteri
Ratakan di atas objek glass
Fiksasi
Tetesi Metilen Biru, 1-2 tetes
Biarkan 1-2 menit
Cuci dengan air mengalirKeringkan dengan tissue
Amati di bawah mikroskop (10 x 10)
Amati dan gambar hasil pengamatan
B. Pengecatan Negatif
Teteskan nigrosin di ujung objek glass
Masukkan inokulan dari ose
Objek glass lain diletakkan di sebelahLuar nigrosin dengan posisi miring (30o)
Geser perlahan hingga membentuk lapisan tipis
Amati di bawah mikroskop (10 x 10)
Hasil pengamatan digambar
C. Pengecatan Tahan Asam
Teteskan air steril pada objek glass
Teteskan suspensi biakan bakteri
Keringkan dan fiksasi
Tutup preparat dengan kertas saring
+ 1 tetes Carbol Fucsin
Panaskan 3 – 5 menit
Lepaskan kertas saring
Dinginkan dan cuci dengan air mengalir
Cuci dengan alkohol asam
20 detik
Cuci dengan air mengalir dan keringkan
+ Metilen Biru
1 menit
Cuci dengan air mengalir
Amati di mikroskop (10 x 10)
Gambar hasil pengamatan
D. Pengecatan Gram
Preparat olesan bakteri
Fiksasi
+ 2 tetes Gram A
1 menit
+ 2 tetes Gram B
30 detik
Cuci dengan air mengalir, keringkan
+ Gram C, 1 tetes
20 detik
Cuci dengan air mengalir dan keringkan
+ 1 tetes Gram D
1 menit
Cuci dengan air mengalir, keringkan
Amati di bawah mikroskop (10 x 10)
Gambar hasil pengamatan
E. Pengecatan Kapsul
Preparat olesan bakteri
Fiksasi
+ kristal violet (sampai tergenang)
Biarkan semenit
Bilas dengan larutan CuSO4
Keringkan dengan kertas saring
Amati di bawah mikroskop
Gambarkan hasil pengamatan
F. Pengecatan Spora
1 ose suspensi bakteri
Tutup dengan kertas saring
+ larutan Malachite green 1-2 tetes
Buka kertas saring
Dinginkan, cuci dengan air mengalir
Keringkan dengan tisu
+ larutan safranin 1-2 tetes
Cuci dan keringkan dengan kertas saring
Amati di mikroskop (10 x10)
Gambarkan hasil pengamatan
Top Related