Rabu, 26 Januari 2011 MENGHITUNG / PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI TPC LANGSUNG Perhitungan Bakteri Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991). Metoda APM adalah metoda untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statisitik. Tabung positif ditunjukkan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut : a. Bakteri dalam contoh menyebar secara random; b. Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah; c. Organisma yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi; d. Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi. Di dalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran. (http://journal.discoveryindonesia.com/PDFInterstitial,perhitungan+jumlah+mikroba.i d) Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan

petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991). 2.3.1. Perhitungan Bakteri secara langsung Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber) (Sutedjo, 1991). Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang idup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat(Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008). 2.3.2. Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991). 1. Berdasarkan kekeruhan Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008). 2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count) Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masingmasing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat colony counter yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR KELOMPOK 5 ROMBONGAN 1 DI SUSUN OLEH: CINDY FAULIN . S A1M008027 DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN PURWOKERTO 2009 ACARA II PERHITUNGAN KOLONI BAKTERI I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Mikroorganisme adalah makhluk yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dibawah mikroskop. Salah satu jenis mikroorganisme adalah bakteri. Bakteri merupakan organisme uniselular yang tumbuh dengan cara pembelahan biner yaitu satu sel membelah secara simetris. Untuk mempermudah penghitungan koloni diperlukan pengetahuan mengenai morfologi bakteri tersebut sehingga media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri tersebut. Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan atau merugikan. Ada hasil metabolisme spesies mikrobia tertentu pada makanan dibutuhkan dan digemari oleh manusia. Akan tetapi ada beberapa species yang dapat merusak makanan dengan pembusukan atau menghasilkan toksin yang berbahaya bagi manusia. Setiap produk yang dihasilkan oleh mikrobia tergantung jumlah mikrobia yang terkandung dalam suatu bahan atau lingkungan. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan proses yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung mikrobia yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitungan mikroskopik, MPN (Most Probable Number), dan hitungan cawan (Fardiaz, 1989). Dari ketiga metode tersebut metode hitungan cawan paling banyak dan mudah digunakan. Oleh karena itulah, pada acara praktikum mikrobiologi dasar untuk perhitungan koloni kali ini menggunakan metode hitungan cawan. B. Tujuan Menghitung jumlah koloni bakteri menggunakan metode hitungan cawan. II. TINJAUAN PUSTAKA

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) (Penn, 1991). Fardiaz (1989) menyatakan ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu : A. Perhitungan jumlah sel 1. Hitungan mikroskopik 2. Hitungan cawan 3. MPN (Most Probable Number) B. Perhitungan massa sel secara langsung 1. Volumetrik 2. Gravimetrik 3. Kekeruhan (turbidimetri) C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung 1. Analisis komponen sel 2. Analisis produk katabolisme 3. Analisis konsumsi nutrien Dari metode-metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Hal ini disebabkan metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena: 1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung 2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus 3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikrobia yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1993). Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu : 1. Metode tuang (pour plate) 2. Metode permukaan (surface / spread plate) Pada perhitungan menggunakan metode cawan, diperlukan suatu pengenceran agar jumlah koloni mikrobia yang ada pada cawan dapat dihitung dan sesuai standar, yaitu berjumlah 30 300 per cawan. Pengenceran dilakukan secara decimal yntuk memudahkan perhitungan. Perhitungan metode cawan menggunakan rumus sebagai berikut :

Faktor pengenceran = pengenceran x jumlah yamg ditumbuhkan Jumlah koloni (SPC) = jumlah koloni x Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Count yang menjelaskan cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut : 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan sebagai berikut : 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dibelakang koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. 2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka lebih besar dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, yang digunakan adalaha rataratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil. 5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak memenuhi syarat diantara 30 dan 300. Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah (Dwidjoseputro, 1978) : 1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium. 2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya rata, ada yang tidak rata. 3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium. 4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang

permukaannya kasar dan tidak rata. 5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya suram. 6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan. 7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering. Pada praktikum ini, bakteri yang akan dihitung koloninya adalah Escherichia Coli yang merupakan bakteri gram negative berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif. Ukurannya berkisar pada 0,6 x 2,0-3,0 m (Pelczar, 1986). E. Coli secara normal terdapat didalam usus besar dan termasuk bakteri kolform. Bakteri koliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Hadioetomo, 1993). Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-produk susu. Ada beberapa jenis E. Coli yang bersifat invasif atau meracuni makanan, Contoh E. Coli ini yaitu E. Coli enteropatogenik (EPEC), EIEC (enteroinvasif E. Coli), dan ETEC (enterotoksigenik E. Coli). Selain itu bakteri yang akan dihitung koloninya adalah Lactobacillus acid. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sample bisa di katakan murni (Dilliello, 2002). Terkadang untuk menghitung kuantitas mikroorganisme pada sample dapat di uji dengan cara menghitung jumlah koloni pada agar. Agar lempengan yang telah ditetapkan, disingkat jumlah penjumlahan pada lempengan (Standart plate count) (Dwisaputro, 2002). Standart plate count (perhitunngan jumlah pada lempengan) sangat berguna dalam hal mengetahui kuantitas mikroorganisme pada suatu tempat atau sampel sehingga bisa di ketahui apakah sampel tersebut murni atau tidak murni (Stanier, 2001). Perhitungan koloni: Pour plate : 1 koloni Faktor pengencer Spread plate : 1 10 koloni Faktor pengencer Standart plate count : 30 300 koloni Syarat : Jika kurang dari 2 : Dipakai pengencer terbesar Jika lebih dari 2 : Dipakai rata-rata Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara decimal. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam sample, semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan (Fardius, 1992).

Kisaran hitung Seperti yang sampai saat ini diketahui bahwa kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni/cawan atau 25-250 koloni/cawan. Permulaan penentuan kisaran ini berawal dari seorang mikrobiologiwan bernama Nersser (1895) yang menyimpulkan bahwa hitungan cawan yang paling baik adalah cawan yang memiliki 10.000 koloni/cawan yang perhitungannya dilakukan dengan mikroskop pada perbesaran rendah. Tiga tahun kemudian muncul pernyataan bahwa cawan yang mempunyai koloni lebih dari 100 koloni/cawan sebaiknya diabaikan. Selanjutnya pada tahun 1897, Hill menyarankan untuk tidak menghitung cawan yang terlalu banyak jumlah koloninya (overcrowded) karena tidak memberikan hasil yang sesuai dengan kenyataan. Kemudian tahun 1908, orang yang sama menyimpulkan tentang kisaran hitung 40-200 koloni/cawan yang digunakan sebagai landasan pelaporan. Kisaran ini diterima pada Comitee Standard Method of Bacteriology Water Analysis (1915) dan diubah menjadi 30-200 koloni/cawan. Pencetus kisaran hitung 25-250 koloni/cawan dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam seminarnya mengenai topik ini. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. Mereka juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni yang tumbuh pada cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya (seperti B. bulgaricus yang distimulus oleh adanya molds). Breed dan Dotterrer memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Pada analisa ini cawan yang memiliki jumlah koloni 400 dianggap tidak memenuhi syarat, sedangkan cawan yang memenuhi syarat itu sendiri berjumlah antara 50 dan 200 koloni/cawan. Pencetus lainnya adalah Tomasiewicz (1980) yang menyimpulkan bahwa kisaran hitung untuk plate count dengan ulangan 3 kali (triplicate) yaitu 25-250 koloni/cawan. Kesimpulan ini didapat dari data analisa susu (raw milk) pada tiga eksperimen yang berbeda. USP (United States Pharmacopoeial) merekomendasikan untuk menggunakan kisaran hitung antara 25 dan 250 koloni/cawan untuk bakteri pada umumnya dan Candida albicans. Sedangkan kisaran yang disarankan jika menganalisa jumlah Aspergillus niger adalah 8-80 koloni/cawan. ASTM (American Standard Testing and Methods) menyarankan untuk menggunakan kisaran hitung 20-80 koloni/membran jika menggunakan teknik filtrasi membran, 20-200 koloni/cawan untuk spread plate dan 30-300 koloni/cawan untuk pour plate. FDA BAM (Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual) merekomendasikan 25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan. Batas atas kisaran hitung. Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous To Count). ASTM menyarankan untuk melaporkan

TNTC sebagai lebih besar dari batas atas, misalnya >200 CFU pada cawan dari pengenceran 1/10, maka pelaporannya adalah >2000 CFU/ml(g). III. BAHAN DAN ALAT A. Bahan 1. Kultur bakteri dalam medium cair 2. Larutan 0,85% NaCl 3. Medium NA B. Alat 1. Tabung reaksi 2. Cawan petri 3. Pipet ukur 1 ml IV. PROSEDURE KERJA IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil pengamatan Perhitungan Koloni Bakteri (Kelompok 5) No. Pengenceran Jumlah Koloni E_Colli Lactobacillus Asidopillus 1. 10 - 2. 10 - 3. 10 241 464 4. 104 171 447 5. 105 152 292 Perhitungan : E.Colli = Pengenceran 10 241 x = 241.000 Pengenceran 104 171 x = 1.710.000 Pengenceran 105 152 x = 15.200.000 Lactobacillus Acid = Pengenceran 10 464 x = 464.000 Pengenceran 104 447 x = 4.470.000 Pengenceran 105 292 x = 29.200.000 Jumlah koloni (SPC) : Rata2 jumlah bakteri E_Colli pada pengenceran 10104 dan 105= 241+171+152 3 = 188 Jumlah koloni (SPC) E_Colli = 462,67 x 1/10104105 = 188 x 1012 Rata2 jumlah bakteri Lactobacillus Acid pada pengenceran 10104 dan 105 = 464+ 447+292 = 401 3 Jumlah koloni (SPC) E_Colli = 401 x 1/10104105 = 401 x 1012 B. Pembahasan Metode hitungan cawan dilaksanakan dengan mengencerkan sampel suspensi bakteri Escherichia Coli dan Lactobacillus Acid kedalam larutan garam fisiologi (NaCl) 0,85 %. Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk

pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm permukaan (Fardiaz, 1993). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah meikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada satu tabung (Waluyo, 2004). Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memilki sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikrobia untuk menghindari rusaknya sel, selain itu juga harus dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Selain menggunakan larutan garam fisiologi (NaCl) 0,85 %, pengenceran juga dapat dilakukan dengan menggunakan larutan fosfat buffer, larutan Ringer, atau akuades. Namun penggunaan akuades sebaiknya dihindari karena dapat mengakibatkan rusaknya sel akibat perbedaan tekanan osmotik, karenanya pelaksanaan pengencerannya harus cepat. Kedalam larutan pengencer juga dapat ditambahkan butir-butir gelas (glass beads) atau pasir putih yang disterilisasi bersama dengan larutan tersebut untuk melarutkan bahan yang sukar larut. Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran desimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5. Dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Hal ini karena diperkirakan koloni yang terbentuk oleh Escherichia Coli berada pada jumlah yang dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara desimal. Selanjutnya dari masing-masing tabung pengenceran diambil 1 ml untuk dilakukan penanaman atau plating pada media NA secara aseptik. Plating atau penanaman bakteri adalah proses pemindahan bakteri dari medium lama ke medium baru (Dwidjoseputro, 1978). Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptis atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikrobia yang tidak diinginkan. (Fardiaz, 1993). Media NA digunakan karena merupakan media yang paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 C dalam keadaan terbalik. Cawan petri diinkubasi dalam keadaan terbalik untuk menghindari kontaminasi dari air yang mengembun diatas cawan petri yang mungkin menetes jika cawan petri diletakan pada posisi normal. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata. Prinsip perhitungan koloni bakteri adalah semakin tinggi tingkat pengenceran semakin rendah jumlah koloni bakteri. Dengan kata lain tingkat pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah koloni bakteri. Berdasarkan hasil pengamatan perhitungan koloni bakteri Escherichia Coli dari kelompok 5 hasil perhitungannya menunjukkan bahwa semakin tinggi tingkat pengenceran semakin sedikit jumlah bakteri. Namun pada perhitungan koloni bakteri Lactobacillus Acid kelompok 5 mengalami kegagalan, karena jumlah bakteri berbanding lurus dengan tingkat pengenceran. Hal ini disebabkan terjadinya kontaminan yang berasal dari alat yang digunakan, praktikan ataupun udara. Selain itu bisa juga disebabkan oleh kurangnya

kecermatan dan ketelitian praktikan baik dalam proses praktikum ataupun perhitungan. Dari hasil didapat bahwa jumlah koloni bakteri yang terdapat dalam 1 ml kultur E. Coli sampel adalah 188 x 1012 koloni. Menurut Dwidjoseputro (1978), Escherichia Coli mengadakan divisio atau pembelahan biner sel setiap 20 menit. Berdasarkan hal itu, maka dapat diperkirakan jumlah E. Coli setelah 2 hari adalah 2 x 272. Sedangkan jumlah koloni bakteri Lactobacillus Acid dari hasil perhitungan adalah 401 x 1012. Metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan, yaitu (Fardiaz, 1993) : 1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. 2. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan niali yang berbeda 3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar 4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. VI. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Pengenceran merupakan salah satu faktor yang penting dalam penghitungan koloni. B. Saran Sebaiknya proses praktikum dilakukan dengan lebih aseptis untuk mengurangi kontaminan agar data yang didapat lebih akurat. VII. DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan; Jakarta. Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada; Jakarta. .1989. Mikrobiologi Pangan. PAU Pangan dan Gizi IPB; Bogor. Schlegel, H., G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press; Yogyakarta. Suriawiria, Unus. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit Angkasa; Bandung. Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press; Malang. Penanggung Jawab : Cindy Faulin .S A1M008027

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991). Beratus-ratus spesies dapat menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit (Pelczar & Chan, 1986). Koliform merupakan kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan dan produkproduk susu. Bakteri koliform dapat dibedakan atas dua kelompok yaitu koliform fekal (Escherchia coli) dan koliform non fekal (Enterobacter aerogenes) (Fardiaz, 1996). Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar praktikan mampu menghitung jumlah bakteri.Bakteri koliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Hadioetomo, 1993). E. coli adalah bakteri koliform yang ada pada kotoran manusia, maka E. coli sering disebut sebagai koliform fekal. Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung.

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991). Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991). Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Sutedjo, 1991). **see more in ur library : Fardiaz, S. 1990. Fisiologi Fermentasi. IPB, Bogor. Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Penn, C. 1991. Handling Laboratory Microorganism. Open University, Milton Keynes. Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.

PERHITUNGAN BAKTERI PADA MEDIA NA (Nutrien Agar) A. ACARA Praktikum perhitungan bakteri dengan media NA (Nutrien Agar). B. PRINSIP Metode ALT (Angka Lempeng Total) yang menyatakan bahwa satu sel bakteri akan menghasilkan satu koloni dan berdasarkan pada dugaan bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada agar dalam cawan sesuai dengan jumlah bakteri semula. C. TUJUAN Mengetahui jumlah bakteri yang terkandung dalam sample dengan metode perhitungan ALT. D. DASAR TEORI Bakteri berasal dari bahasa latin bacterium (jamak : bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, berukuran sangat kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relative sederhana tanpa nucleus atau inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Bakteri adalah yang paling berlimpah dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri, kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 mm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi yang berbeda (peptidogligan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella kelompok lain. Berbagai bentuk tubuh bakteri 1. kokus (coccus) Adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut : o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal. o Diplococcus, jika berganda dua-dua o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujusangkar. o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus o Staphylococcus, jika bergerombol o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai 2. Basil (Bacillus) Adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut : o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

3. spiril (spirilum) Adalah bakteri yang berbentuk langkung dan mempunyai variasi sebagai berikut : o Vibrio (berbentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran Kondisi lingkungan yang mendukung dapat memacu pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Factor-faktor lingkungan yang dapat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi bakteri adalah : o Suhu o Kelembaban o Cahaya Berikut beberapa jenis bakteri yang menguntungkan dalam proses pembuatan beberapa produk pangan : NO Nama Produk atau Makanan Bahan Baku Bakteri yang Berperan 1 Yoghurt Susu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus 2 Mentega Susu Streptococcus lactis 3 Terasi Ikan Lactobacillus sp. 4 Asinan buah-buahan Buah-buahan Lactobacillus sp. 5 Sosis Daging Pediococcus cerevisiae 6 Kefin Susu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus lactis

E. ALAT DAN BAHAN Alat o Cawan petri steril o Erlenmeyer o Hot plate o Lampu spirtus atau Bunsen o Autoclave o Incubator o Micropipette dan tip (tip steril) o Botol Bahan o Media NA (Nutrien Agar) o Aquadest o Sample air o Sample baso F. PROSEDUR PERSIAPAN ALAT o Menyiapkan cawan Petri, tip, botol sample bertutup, tabung reaksi bertutup. o Membersihkan cawan Petri yang akan dipergunakan dan membungkusnya dengan kertas koran atau perkamen o Memipet larutan garam fisiologis (LGF) sebanyak 9 mL dan masukan dalam

tabung reaksi, menutupnya dengan tutup tabung reaksi atau sumbat dengan kapas. o Memipet aquadest sebanyak 9 mL dan masukan dalam tabung reaksi, menutupnya dengan tutup tabung reaksi atau sumbat dengan kapas. o Memipet aquadest sebanyak 225 mL dan masukan dalam botol bertutup. o Memasukan tip yang merupakan pasangan micropipette ke dalam botol yang dialasi tisu dan diberi tutup. o Mensterilisasi alat-alat diatas menggunakan autoclave dengan suhu 121oC PERSIAPAN LARUTAN PENGENCER o Untuk membuat LGF 0,85% diperlukan NaCl tekhnis sebanyak 0,85 g dan dilarutkan dalam 100 mL aquadest. PERSIAPAN MEDIA NA (Nutrient Agar) o Menimbang media NA sebanyak 23 gram o Melarutkan media dalam aquadest sebanyak 1 liter o Mengaduk sampai larut dan panaskan sampai tidak larutan bening o Menutup dengan kapas dan sterilkan dengan autoclave 121oC selama 15 menit PERSIAPAN SAMPLE o Untuk sample air, pipet sebanyak 25 mL dan masukan dalam botol yang berisi aquadest steril sebanyak 225 mL, kocok selama 25 kali. o Untuk sample baso, dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan blender dan timbang sebanyak 25 mL dan masukan dalam botol yang berisi aquadest steril. Kocok selama 25 kali. o Melakukan semua perlakuan diatas secara aseptis INOKULASI o Memipet larutan sample sebanyak 1 mL, dan memasukannya dalam tabung reaksi yang berisi larutan steril beri label 10-2 o Kemudian mengocok tabung tersebut dengan menggunakan vortex selama beberapa detik. o Setelah dikocok pipet larutan dalam tabung tersebut sebanyak 1 mL dan masukan dalam tabung reaksi berisi larutan steril yang lain dan beri label 10-3 o Pipet kembali larutan dalam tabung 10-2 dan masukan dalam cawan Petri steril beri label 10-2 pada cawan o Melakukan hal yang sama sampai tabung reaksi ke 10-7. o Menuangkan media hangat ke dalam setiap cawan Petri yang sudah berisi larutan sample. o Menggoyangkan Petri dengan cara memutarnya sehingga diperkirakan sample dan media dapat bercampur. o Biarkan sampai media membeku o Melakukan semua perlakuan diatas secara aseptis

INKUBASI o Setelah media membeku, masukan dalam incubator dengan posisi terbalik (bagian tutup berada di bawah). o Suhu selama inkubasi adalah 40oC selama 48 jam. G. DATA PENGAMATAN SAMPLE AIR I METODE ALT PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA KEL 1 KEL 2 KEL 3 KEL 4 10-3 17 3 1 2 10-4 11 - - 10-5 4 - 3 (terkontaminasi jamur) 1 10-6 2 - - Kelompok 1 : 17 x 10-3 = 1,7 x 104 11 x 10-4 = 11 x 104 4 x 10-5 = 40 x 104 2 x 10-6 = 200 x 104 Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 1,7 x 104 koloni bakteri/mL Kelompok 2 : 3 x 10-3 = 3 x 103 Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 3 x 103 koloni bakteri/mL.

Kelompok 3 : 1 x 10-3 = 1 x 103 3 x 10-4 = 30 x 103 Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 30 x 103 koloni bakteri/mL. Kelompok 4 : 2 x 10-3 = 2 x 103 1 x 10-5 = 100 x 105 Sehingga daapt diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 2 x 103 koloni bakteri/mL. SAMPLE AIR II PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA KEL 1 KEL 2 10-3 3 2 10-4 1 1 10-5 - 2 10-6 2 7 10-7 - 2 10-8 2 5

Kelompok 1 : 3 x 10-3 = 0,3 x 104 1 x 10-4 = 1 x 104 2 x 10-6 = 200 x 104 2 x 10-8 = 20000 x 104 Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri perkiraan adalah 1 x 104 koloni bakteri/mL Kelompok 2 : 2 x 10-3 = 0,2 x 104 1 x 10-4 = 1 x 104 2 x 10-5 = 20 x 104 7 x 10-6 = 700 x 104 2 x 10-7 = 2000 x 104 5 x 10-8 = 20000 x 104 Sehingga dapat diketahui Jumlah bakteri perkiraan adalah 1 x 104 koloni bakteri/mL SAMPLE BASO PENGENCERAN JUMLAH MIKROBA KEL 3 KEL 4 10-3 507 400 10-4 290 12 10-5 38 55 10-6 6 7 10-7 6 6 10-8 4 4 Kelompok 3 : 507 x 10-3 = 5,07 x 105 290 x 10-4 = 29,0 x 105 38 x 10-5 = 38 x 105 6 x 10-6 = 60 x 105 6 x 10-7 = 600 x 105 4 x 10-8 = 4000 x 105 Sehingga dapat diketahui jumlah bakteri adalah 38 x 105 koloni bakteri/mL Kelompok 4 : 400 x 10-3 = 4,00 x 105 12 x 10-4 = 1,2 x 105 55 x 10-5 = 55 x 105 7 x 10-6 = 70 x 105 6 x 10-7 = 600 x 105 4 x 10-8 = 4000 x 105 Sehingga daapt diketahui jumlah bakteri adalah 55 x 105 koloni bakteri/mL H. PEMBAHASAN Praktikum pengujian mikrobiologi ini dibedakan berdasarkan sample yang dianalisa. Terdapat 2 sample yang dianalisa, yaitu air dan baso. Pada raktikum yang pertama, semua kelompok menganalisa jumlah mikroba yang terdapat dalam air. Dan untuk analisa yang kedua kelompok 1 dan 2 menganalisa mikroba dalam air sedangkan baso dianalisa olah kelompok 3 dan 4.

Sebelum praktikum dilakukan, perlakuan sterilisasi tidak hanya dilakukan pada alat dan media, meja kerja serta tangan praktikan disemprot dengan alcohol 70% unutk menghindarai kontaminasi mikroba yang tidak diinginkan. SAMPLE AIR Sample air yang dipergunakan saat praktikum diambil dari air yang kran yang ada di laboratorium, dengan melakukan pengujian mikroba maka dapat diketahui berapa jumlah atau kandungan mikroba dalam sample. Setelah sample disiapkan, maka langkah selanjutnya adalah memasukan sample ke dalam botol yang berisi aquadest steril 225 mL, hal ini dilakukan secara aseptis (steril). Untuk mendapatkan suasana steril maka setiap langkah kerja dilakukan di dekat api Bunsen atau spirtus. Kemudian botol dikocok secara manual dengan tangan sebanyak 25 kali. Setelah sample sudah dilarutkan dalam aquadest steril, maka langkah selanjutnya adalah memipet larutan sample dalam botol sebanyak 1 mL dan masukan dalam tabung reaksi yang berisi aquadest steril sebanyak 9 mL, kemudian kocok dengan menggunakan vortex, pengocokan dengan menggunakan vortex ini bertujuan untuk mengencerkan larutan sample dengan aquadest steril dalam tabung, sehingga tabung reaksi tersebut diberi label pengenceran 10-2. Pengenceran dari 10-2 tersebut diambil lagi sebanyak 2 mL. 1 mL dimasukan dalam tabung reaksi yang lain (yang kemudian diberi label 10-3), dan 1 mL yang lain dimasukan dalam cawan Petri steril. Kemudian media NA (Nutrien Agar) dituangkan pada cawan petri yang berisi sample dari pengenceran 10-2, setelah itu kocok petri dengan cara menggoyangkannya sehingga diperkirakan sample dan media telah bercampur. Pengenceran serta penambahan media terus dilakukan sampai pengenceran 10-6, prosedur serta cara pengenceran dilakukan seperti diatas. Setelah media mengeras, kemudian diinkubasikan dalam incubator dengan suhu 45oC selama 2 hari (48 jam). Cawan petri yang berisi campuran media NA dan sample dalam incubator diletakan secara terbalik, posisi terbalik ini dimaksudkan untuk menghindari tercampurnya uap yang dihasilkan dengan media. Karena apabila cawan Petri diletakan secara terbalik maka uap yang dihasilkan dari media akan tertampung pada tutupnya dan menetes ke bawah (media). Perlakuan blanko juga dilakukan pada pengujian mikrobiologi ini, blanko adalah perlakuan yang sama dengan proses serta prosedur yang sama, hanya saja tanpa sample. media blanko juga diinkubasikan selama 2 hari. Berdasarkan teori, blanko seharusnya tidak tercemar oleh mikroba jika dilakukan dengan baik secara aseptis dan berdasarkan hasil pengamatan maka dapat diketahui pada hasil blanko kelompok 3 tercemar oleh mikroba sebanyak 1 koloni. Terjadinya cemaran ini dapat disebabkan karena selama praktikum meja kerja serta tangan praktikan tidak disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau karena saat menuangkan media tidak dilakukan secara aseptis. Selain blanko yang terkontaminasi, cawan petri ysng berisi sample pun terkontaminasi oleh jamur, hal ini dialami oleh kelompok 3 pada cawan yang berisi

sample dari pengenceran 10-4. Kontaminasi ini dapat disebabkan saat menuangkan media atau memasukan sample perlakuan aseptis tidak dilakukan secara maksimal. Pengamatan dan perhitungan dilakukan setelah 2 hari dinkubasikan, koloni-koloni bakteri akan terlihat pada dasar cawan Petri tersebut, koloni bakteri berbentuk bulatan-bulatan kecil yang ukurannya bervariasi. Berdasarkan pengamatan dan perhitungan maka dapat diketahui bahwa untuk kelompok 1 jumlah bakteri perkiraannya adalah 1,7 x 104 koloni bakteri/mL, kelompok 2 jumlah bakteri perkiraannya adalah 3 x 103 kononi bakteri/mL, kelompok 3 jumlah bakteri perkiraannya adalah 30 x 103 koloni bakteri/mL, dan kelompok 4 adalah 2 x 103 koloni bakteri/mL. Karena setiap cawan tidak ada yang berjumlah antara 25-250 koloni bakteri, maka perhitungan diatas berdasarkan pada peraturan perhitungan Jika rata-rata jumlah koloni masing-masing cawan tidak terletak antara 25 dan 250 koloni, hitung jumlah koloni dari masing-masing koloni san nyatakan sebagai jumlah bbakteri perkiraan per milliliter atau gram. SAMPLE AIR II Pada praktikum yang kedua, sample yang dipergunakan masih air yang diambil dari sumber yang sama, yaitu dari kran di laboratorium pengujian. Pengujian dengan sample ini tidak dilakukan oleh semua kelompok, pengujian untuk sample air dilakukan oleh kelompok 1 dan 2, selain itu yang berbeda adalah jumlah pengenceran yang dilakukan, yaitu dari pengenceran 10-3 sampai pada 10-8. Untuk pengencer yang dipergunakan saat pengujian yang kedua ini tidak lagi aqudest steril tetapi larutan garam fisiologis 0,85% (LGF) yang steril. Jumlah LGF sebagai pengencer masih sama yaitu 9 mL untuk masing-masing tabung reaksi. Pengencer dalam botol untuk sample juga masih berjumlah sama yaitu 225 mL LGF steril. Semua pengujian dilakukan seperti saat praktikum yang pertama. Baik langkah kerja, persiapan alat, pesiapan media, persiapan sample, dll. Hanya saja karena pengencer yang diipergunakan adalah LGF 0,85% maka terlebih dahulu membuat LGF 0,85% tersebut. LGF 0,85% adalah larutan garam tekhnis yang dipergunakan untuk membantu mengembangbiakan bakteri, apabila konsentrasi LGF lebih tinggi dari ini maka bakteri tidak dapat tumbuh, karena garam memiliki sifa antibakteri. Media yang dipergunakan masih sama yaitu media NA (Nutrient Agar), hal ini dikarenakan yang akan dikembangkan adalah bakteri, dan media NA adalah media yang diipergunakan untuk mengembangkan bakteri. Perlakuan blanko juga dilakukan untuk pengujian yang kedua ini, masing-masing kelompok mengerjakan 1 cawan yang hanya berisi media saja. Setelah diinkubasikan selama 2 hari dalam incubator maka dapat diketahui bahwa cawan blanko terkontaminasi. Kontaminasi pada blanko terjadi pada kedua kelompok. Untuk kelompok 1, blanko terkontaminasi oleh 11 koloni mikroba. Sedangkan untuk kelompok 2 blanko terkontaminasi oleh 15 koloni mikroba. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan aseptis

tidak dilakukan dengan baik oleh masing-masing kelompok. Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan, maka dapat diketahui bahwa pada kelompok 1 jumlah bakteri perkiraannya adalah 1 x 104, dan untuk kelompok 2 adalah 1 x 104. Hasil yang sama ini menunjukan bahwa presisi dan akurasi pengujian sangat tinggi SAMPLE BASO Masih ada praktikum yang kedua, sample yang dipergunakan adalah baso dlama kemasan yang banyak beredar di pasaran, sample baso yang dipakai pada saat praktikum akan mencapai masa kadaluarsa. Sample ini dipergunakan oleh kelompok 3 dan 4, jumlah pengenceran yang dilakukan sama dengan kelompok lain yang mengerjakan sample air, yaitu dari pengenceran 10-3 sampai pada 10-8. Untuk pengencer yang dipergunakan saat pengujian yang kedua ini pun sama dengan pengujian sample air yang kedua yaitu dengan larutan garam fisiologis 0,85% (LGF) yang steril. Jumlah LGF sebagai pengencer masih sama yaitu 9 mL untuk masing-masing tabung reaksi. Pengencer dalam botol untuk sample juga masih berjumlah sama yaitu 225 mL LGF steril. Karena sample yang dipergunakan adalah baso yang bersifat padat, maka sebelum dipergunakan harus dihaluskan terlebih dahulu. Proses penghalusan dilakukan dengan menggunakan blender. Setelah dihaluskan baru kemudian sample ditimbang sebanyah 25 gram. Dan kemudian dimasukan dalam botol berisi LGF steril 225 mL. Media yang dipergunakan masih sama yaitu media NA (Nutrient Agar), hal ini dikarenakan yang akan dikembangkan adalah bakteri, dan media NA adalah media yang diipergunakan untuk mengembangkan bakteri. Perlakuan blanko juga dilakukan untuk pengujian dengan sample baso, perlakuan balnko untuk kelompok 3 dilakukan sebanyak 2 cawan (duplo) dan kelompok 4 sebanyak 1 cawan. Setelah diinkubasikan selama 2 hari dalam incubator maka dapat diketahui bahwa cawan blanko terkontaminasi seperti halnya pada kelompok 1 dan 2 . Kontaminasi pada blanko terjadi pada kedua kelompok. Untuk kelompok 3 blanko pertama terkontaminasi oleh 53 koloni mikroba dan yang yang kedua terkontaminasi oleh 84 koloni mikroba. Sedangkan untuk kelompok 4 blanko terkontaminasi oleh 3 koloni mikroba. Hal ini dapat terjadi karena perlakuan aseptis tidak dilakukan dengan baik oleh masing-masing kelompok. karena terdapat koloni yang berjumlah antara 25-250 koloni maka dapat diketahui bahwa jumlah bakteri untuk sample baso pada kelompok 3 jumlah bakteri adalah 38 x 105, dan untuk kelompok 4 adalah 55 x 105.

I. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum, pengamatan dan perhitungan, maka dapat diketahui bahwa jumlah bakteri dengan menggunakan metode Angka Lempeng Total (ALT) pada sampel air yang pertama tidak didapatkan hasil koloni bakteri yang sesuai dengan angka pengenceran. Karena jumlah koloni yang ada tidak termasuk dalam rentan 25-250 koloni bakteri sehingga hasilnya dinyatakan dalam jumlah bakteri perkiraan. Sedangkan untuk sampel baso didapat rata-rata jumlah bakteri sebanyak 4,6 x 106 bakteri/mL. hal ini mengindikasikan bahwa sample bakso yang dipergunakan sudah tercemar dan mutu produknya sudah turun. J. DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro. 2005. DASAR-DASAR MIKROBIOLOGI. Jakarta : Penerbit Djambatan. Supardi, Imam. 1999. MIKROBIOLOGI DALAM PENGOLAHAN DAN KEAMANAN PANGAN. Bandung : Yayasan Adikarya Ikapi Jennie, Betty Sri Laksmi. 1978. MIKROBIOLOGI HASIL PERTANIAN. Jakarta : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Muctadi, Deddy. 1980. PETUNJUK PRAKTIK MIKROBIOLOGI. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.

Tujuan : untuk membebaskan alat-alat dari kontaminasi mikroba 1. Kajian Materi Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan mikroba. Alas an utama pengendalian mikroorganisme adalah : Mencegah penyebaran penyakit-penyakit dan infeksi Membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi Mencegah pembusukan dan perusakan bahan oleh mikroorganisme Sterilisasi dengan pemijaran dipakai untuk sterilisasi jarum ose dan sebagainya yang terbuat dari platina atau mikhrom, caranya ialah dengan membakar alat-alat tersebu diatas api lampu spiritus sampai pijar. Sterilisasi dengan udara kering dipakai menggunakan alat yang disebut hot air sterilizer (oven), oven digunakan untuk alat-alat glass seperti Erlenmeyer, petridish, tabung reaksi, dan alat-alat gelas lainnya. Bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas juga dapat disterilisasikan dengan alat ini, sebelum disterilisasi alat-alat glass harus dibungkus terlebih dahulu dengan kertas HVS dan kertas perkamen/kopi. Makin tebal kertas yang digunakan maka makin lama waktu sterilisasi. 1. Alat dan Bahan : Kertas putih HVS Petridish yang belum disterilikan Pipet ukur yang belum disterilkan Kapas Alkohol Oven Lap Tangan 1. Cara kerja : Siapkan alat dan bahan Alat-alat yang akan disterilkan (petridish dan pipet ukur) dibungkus atau dipacking dengan menggunakan kertas HVS sesuai dengan petunjuk yang telah diajarkan oleh dosen. Masukkan alat-alat yang akan disterilkan tadi kedalam oven dengan susunan yang rapi. Hidupkan oven atur suhu ke 150C dan putar timernya dalam waktu 2 jam. Setelah 2 jam oven akan mati dengan sendirinya, kemudian buka blowernya dan biarkan suhunya turun sampai suhu kamar. 1. Hasil praktikum Alat yang telah disterilkan dapat digunakan sesuai dengan fungsinya masingmasing. 1. Kesimpulan Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan, bahwa alat dan media yang telah disterilkan akan terbebas dari segala macam bentuk kehidupan mikroba dan alat tersebut dapat digunakan sesuai dengan fungsinya masing-masing. LEMBAR PENGESAHAN

Judul Praktek : Pembuatan Media Agar Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Senin/11 Oktober 2010 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc NIP. 19762032000121001 196305241989032003 Pembimbing 2 Zunidra, S.KM, MKes NIP. 2010

Judul Praktikum Hari/tanggal Tujuan agar 1. Kajian Materi Media dapat dianggap sebagai kumpulan zat-zat organik maupun anorganik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dengan syarat-syarat tertentu. Dalam pemeriksaan laboratorium mikrobiologi, menggunakan media sangat penting, baik untuk isolasi, identifikasi maupun differensiasi. Media agar yang dipakai adalah : NA (Nutrient Agar) PCA (Plate Count Agar) Blood Agar MC (Mac Concey) 1. Alat dan Bahan : Media Agar MC Pipet polimetrik Karet penghisap Lampu Bunsen Aluminium Foil Spatula Tungku kaki tiga Kapas 2 Petridish yang telah disterilkan 1. Cara Kerja: Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Sebelumnya alat-alat tersebut harus dalam keadaan steril. Keluarkan larutan MC dari kulkas Panaskan diatas lampu spritus sampai mencair.

PRAKTIKUM 2 : Pembuatan Media Agar : Senin/11 Oktober 2010 : untuk mengetahui cara pembuatan dan fungsi dari media

Setelah mencair masukkan larutan MC kedalam 2 buah Petridish yang telah disterilkan dengan menggunakan pipet polimetrik dan karet penghisap sebanyak 10 ml pada setiap petridish, dan ratakan dengan menggoyangkan petridish. Setelah media agar mengeras, bungkus kembali petridish dengan rapid an simpan kedalam kulkas. 1. Hasil Praktikum Dapat mengetahui cara pembuatan media agar untuk pembiakan bakteri. 1. Kesimpulan Dari hasil praktikum yang telah dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan bahwa Media agar berfungsi sebagai tempat pembiakan bakteri. LEMBAR PENGESAHAN Judul Praktek : Isolasi Kuman Diudara Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Sabtu/16 Oktober 2010 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, 2010 Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Pembimbing 2 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc Zunidra, S.KM, MKes NIP. 19762032000121001 NIP. 196305241989032003 PRAKTIKUM 3 Judul Praktikum : Isolasi Kuman Diudara Hari/tanggal : Sabtu/16 Oktober 2010 Tujuan : untuk menghitung jumlah koloni kuman yang ada diudara 1. Kajian Materi Media pembiakan adalah media yang digunakan dalam suatu material adanya kuman yang dicari dalam jumlah yang sangat sedikit atau disamping jumlah yang dicari sangat sedikit, juga terdapat kuman-kuman lain dalam jumlah besar. Untuk hal tersebut, material perlu dimasukkan dalam media pembiakan, dimana kuman yang dicari akan tumbuh subur, sedangkan kuman yang lain akan dihambat pertumbuhannya. 1. Alat dan Bahan 2 Petridish yang telah diberi media agar MC 1. Cara Kerja Keluarkan larutan MC dari kulkas. Letakkan media pada posisi yang mewakili (Ruang Pendidikan). Kemudian buka petridish selama 10 menit, dan biarkan media kontak dengan udara. Setelah itu, tutup dan bungkus kembali petridish tersebut.

Masukkan petridish kedalam incubator dengan posisi terbalik agar tetap pada kondisi kering selama 224 jam. 1. Hasil Praktikum Telah dilakukan isolasi kuman diudara dan dibiakkan selama 224 jam. 1. Kesimpulan Dari praktikum yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan bahwa material perlu dimasukkan dalam media pembiakan dimana kuman yang dicari akan tumbuh subur, sedangkan kuman yang lain akan dihambat pertumbuhannya. LEMBAR PENGESAHAN Judul Praktek : Menghitung Koloni Kuman Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Kamis/21 Oktober 2010 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, 2010 Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Pembimbing 2 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc Zunidra, S.KM, MKes NIP. 19762032000121001 NIP. 196305241989032003 PRAKTIKUM 4 Judul Praktikum : Menghitung Koloni Kuman Hari/tanggal : Kamis/21 Oktober 2010 Tujuan : untuk mengetahui jumlah kuman yang terdapat pada media agar yang telah dibiakkan. 1. Alat dan bahan Pena Pensil Spidol Media MC yang sudah jadi 1. Cara Kerja Ambil media didalam incubator yang telah ditumbuhi kuman. Amati berapa banyak bakteri yang terdapat pada media tersebut, hitung dan catatlah pada kertas HVS. Gambar bentuk bakteri yang terdapat pada media, dan warnai gambar sesuai dengan warnanya. Gambar 1 : Ruang Pendidikan Gambar 2 : Ruang Pendidikan Kumpulkan hasil pengamatan pada dosen pembimbing. Tutup kembali dan bungkus media dengan kertas HVS. Masukkan media kedalam inkubator dengan posisi terbalik. 1. Hasil Praktikum -Pada gambar 1 terdapat jumlah kuman sebanyak 1 koloni/10 menit :

1/10= 0,1 koloni/menit -Pada gambar 2 terdapat jumlah kuman sebanyak 1 koloni/10 menit : 1/10=0,1 koloni/menit Jadi pada media MC yang diletakkan pada Ruang Pendidikan hanya sedikit koloni kuman, yaitu : 0,1 koloni/menit + 0,1 koloni/menit = 0,2 koloni/menit Hal ini disebabkan karena media yang digunakan (media MC) hanya dapat ditumbuhi oleh kuman-kuman tertentu. 1. Kesimpulan Dari praktikum yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan bahwa kuman-kuman yang terdapat pada media agar yang telah diletakkan pada Ruang Pendidikan berjumlah sedikit, bahkan bisa dikatakan tidak ada. Hal itu disebabkan karena media yang digunakan (MC) hanya dapat ditumbuhi oleh kuman-kuman tertentu. LEMBAR PENGESAHAN Judul Praktek : Pewarnaan Bakteri Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Senin/15 November 2010 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, 2010 Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Pembimbing 2 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc Zunidra, S.KM, MKes NIP. 19762032000121001 NIP. 196305241989032003 PRAKTIKUM 5 Judul Praktikum : Pewarnaan Bakteri Hari/tanggal : Senin/15 November 2010 Tujuan : untuk mengetahui bentuk dari bakteri dan mengetahui apakah bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif atau bakteri gram negative. 1. Kajian Materi Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial (untuk membedakan), karena dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan. Pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna biruungu (violet). Bakteri gram negative adalah bakteri yang dapat mengikat cat utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dengan peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Pada penggunaan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah 1. Alat dan Bahan Objek glass

Tangkrus Lampu Bunsen Jarum Ose Tissue Spidol Berwarna Pipet Tetes Biakan bakteri pada media agar Larutan Kristal Violet (gram A)/genti violet Larutan Lugol (gram B) Larutan Pencuci/alkohol (Gram C) Larutan Fuchsin/safranin (Gram D) Air Bersih 1. Cara Kerja Objek glass dijepit/dipegang dengan tangkrus, kemudian bersihkan objek glass dengan menggunakan alkohol hingga bebas dari lemak, kemudian lakukan fiksasi diatas nyala lampu spritus. Sebelumnya objek glass ditandai dengan spidol dengan berbentuk lingkaran Ambil secara aseptic 1 ose suspensi bakteri dan letakkan pada objek glass yang sudah ditandai tadi, pengambilan sedikit saja (tipis) lalu ratakan. Kering anginkan, kemudian selanjutnya lakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus. Setelah dingin, bubuhkan cat utama yaitu crystal violet (gram A) sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kemudian kering anginkan Selanjutnya tetesi dengan larutan lugol (gram B) sebanyak 1-2 tetes dan diamkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air mengalir, lalu kering anginkan. Kemudian cuci dengan alcohol 95% (gram C) sebanyak 1-2 tetes dan diamkan selama 30 detik, selanjutnya cuci dengan air mengalir dan kering anginkan Beri larutan fuchsin atau safranin (gram D) sebanyak 1-2 tetes dan diamkan selama 2 menit. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering anginkan. Setelah kering bungkus objek glass dengan tissue. Kemudian satukan semua objek glass yang telah dibungkus dengan tissue, lalu simpan dalam lemari yang aman dan dalam kondisi yang bersih dan kering. 1. Hasil Praktikum Hasil yang didapat dari pewarnaan bakteri ini yaitu objek glass berwarna ungu. 1. Kesimpulan Dari praktikum ini dapat ditarik kesimpulan bahwa pewarnaan bakteri berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negative dan gram positif. Dan pewarnaan bakteri pada media ini didapatkan objek glass nya berwarna ungu, jadi bakteri ini bersifat gram positif (+). LEMBAR PENGESAHAN

Judul Praktek : Pengamatan Bakteri dengan Mikroskop Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Senin/22 November 2010 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, 2010 Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Pembimbing 2 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc Zunidra, S.KM, MKes NIP. 19762032000121001 NIP. 196305241989032003 PRAKTIKUM 6 Judul Praktikum : Pengamatan Bakteri dengan Mikroskop Hari/tanggal : Senin/22 November 2010 Tujuan : untuk mengetahui bentuk dari bakteri dan mengetahui apakah bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif atau bakteri gram negative melalui mikroskop. 1. Kajian Materi Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial (untuk membedakan), karena dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat cat utama dengan kuat, sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan. Pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna biruungu (violet). Bakteri gram negative adalah bakteri yang dapat mengikat cat utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dengan peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Pada penggunaan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah 1. Alat dan Bahan Mikroskop Lembar Kerja Pena Objek glass yang telah terdapat mikroba Larutan Anisol 1. Cara Kerja Ambil biakan bakteri. Sebelum diamati dibawah mikroskop, objek glass yang terdapat mikroba ditetesi dengan larutan anisol sebanyak 1-2 tetes yang bertujuan untuk memperjelas bentuk bakteri. Amati bentuk, dan warna. Kemudian tentukan apakah bakteri tersebut termasuk gram positif atau gram negative. Lakukan pengamatan pada objek glass dibawah mikroskop. Gambarkan hasil pengamatan pada lembar kerja.

1. Hasil Praktikum Gambar 1 : Gambar 2 : Jenis Bakteri : Gram positif karena berwarna Ungu. Berbentuk Basil. LEMBAR PENGESAHAN Judul Praktek : Pembuatan Lidi Steril Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Senin / 3 Januari 2011 Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, Januari 2011 Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Pembimbing 2 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc Zunidra, S.KM, MKes NIP. 19762032000121001 NIP. 196305241989032003 PRAKTIKUM 7 Judul Praktikum : Pembuatan Lidi Steril Hari/tanggal : Senin/3 Januari 2011 Tujuan : untuk mempermudah pengambilan bakteri 1. Alat dan Bahan Lidi 15-20 cm Kapas Kertas HVS Oven 1. Cara Kerja Siapkan alat dan bahan Gulung kapas keujung lidi dengan padat sebesar jari kelingking sepanjang 3 cm, buatlah sebanyak 20 buah. Bungkus kapas lidi dengan menggunakan kertas HVS satu persatu dan ujungnya dilipat, kemudian lem dengan menggunakan lem kertas. Satukan semua kapas lidi, kemudian bungkus kembali dengan kertas HVS agar tidak tercecer. Lakukan sterilisasi dengan menggunakan oven. Masukkan kapas lidi kedalam oven dengan suhu 121C, dengan tekanan 1,5 atm selama 2 jam. 1. Hasil Praktikum Dapat mengetahui cara pembuatan kapas lidi steril. LEMBAR PENGESAHAN Judul Praktek : Pemeriksaan E.Coli Mata Kuliah : Mikrobiologi Hari/tanggal : Senin / 17 Januari 2011

Lokasi : Laboratorium Mikrobiologi Tingkat/semester : Satu (1)/satu (1) Tahun : 2010/2011 Laporan ini telah diteliti dan disetujui oleh : Jambi, Pembimbing Praktek Pembimbing 1 Gustomo Yamistada, S.Pd, M.Sc NIP. 19762032000121001 196305241989032003 Pembimbing 2 Zunidra, S.KM, MKes NIP. Januari 2011

Judul Praktikum Hari/tanggal Tujuan pada Air. 1. Alat Inkubator Autoclave Oven Timbangan Beaker glass Pengaduk (spatula) Pipet volume 10 ml, 5ml, 0,5 ml Bunsen Tabung reaksi Rak tabung Ose Tabung Durham 1. Bahan Aquades Kapas Spiritus Kertas Packing Lactose Broth (LB) Billiant Green Lactose Broth (BGLB) Alkohol 1. Cara Kerja 2. Persiapan Siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Melakukan sterilisasi terhadap alat yaitu pipet volume dengan menggunakan oven (170-180C selama 20-30 menit). Bersihkan dan sterilisasikan meja kerja dengan alkohol. Membuat media LB dan BGLB yang diperlukan dengan cara : 1. Media LB

PRAKTIKUM 8 : Pemeriksaan E.Coli : Senin/17 Januari 2011 : Untuk mengetahui cara pemeriksaan E.Coli yang terdapat

Siapkan tabung reaksi dengan ragam tiga-tiga atau Lima-lima (310, 31, 30,1). Untuk ragam 310, media LB dibuat dengan kepekatan 3x (triple strength). Masing-masing tabung reaksi diisi dengan media LB sebanyak 5ml dan diberi tabung durham terbalik dan diusahakan tidak ada gelembung udara. Untuk ragam 31 dan 30,1 media lactose broth dibuat dengan kepekatan 1x (single strength) masing-masing diisi 10 ml media LB dan diberi tabung durham terbalik dan diusahakan tidak ada gelembung udara. Tabung reaksi diberi penutup tabung atau kapas, selanjutnya disterilkan dengan autoclave dengan suhu 121C selama 15 menit. 1. Media BGLB Siapkan tabung reaksi dengan jumlah yang cukup. Media BGLB dibuat dengan kepekatan 1x (single strength). Masing-masing tabung reaksi diisi dengan media BGLB sebanyak 5 ml dan diberi tabung durham terbalik dan diusahakan tidak ada gelembung udara. Tabung reaksi diberi penutup tabung atau kapas, selanjutnya disterilkan dengan Autoclave dengan suhu 121C selama 15 menit. 1. Perlakuan Pemeriksaan Sampel Air 1. Tes perkiraan Siapkan tabung reaksi yang berisi media LB dengan ragam 310, 31, 30,1 yang sudah steril. Siapkan pipet volume yang sudah disterilkan dengan lampu Bunsen. Ambil sampel air dengan pipet volume yang sudah steril sebanyak 10 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi dengan media LB kepekatan Triple Strength (310), untuk sampel sebanyak 1 dan 0,1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dengan media LB kepekatan single strength. Eramkan kedalam incubator selama 224 jam pada temperature 35-37C. Selanjutnya lihat hasil pengeraman, tabung positif jika terdapat gas dalam tabung media LB. jika terbentuk gas dalam tabung durham maka hasilnya negative. Untuk memastikan bakteri coliform dilanjutkan pemeriksaan Confirmatif test (test penegasan). 1. Tes Penegasan Dari masing-masing tabung yang positif diambil 2 ose secara steril dimasukkan kedalam tabung yang berisi BGLB dengan urutan sesuai tabung LB positif yang telah disusun pada rak tabung. Eramkan kedalam incubator selama 224 jam pada temperature 35-37C. Selanjutnya lihat hasil pengeraman, tabung positif bakteri coliform jika terdapat gas dalam tabung media BGLB. Jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham maka hasilnya negative. Untuk menghitung jumlah coliform bandingkan jumlah tabung yang positif dengan tabel MPN. Sedangkan untuk pemeriksaan E.Coli (Fecal Coliform) dilakukan sebagai berikut : Sampel dari tabung BGLB yang menghasilkan gas atau tabung yang positif diambil 2 ose secara steril dimasukkan kedalam tabung yang berisi BGLB

(media yang baru) kembali dengan urutan sesuai tabung BGLB positif yang telah disusun pada rak tabung. Eramkan kedalam incubator selama 224 jam pada temperature 43-44C. Selanjutnya lihat hasil pengeraman, tabung positif bakteri E.Coli jika terdapat gas dalam tabung media B

GLB. Jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham, maka hasilnya negative. Untuk menghitung jumlah E.Coli bandingkan jumlah tabung yang positif dengan tabel MPN.