Ultrasensitive fluorescence protein detection in isoelectric focusing gels using a ruthenium metal...

11
Ultrasensitive fluorescence protein detection in isoelectric focusing gels using a ruthenium metal chelate stain SYPRO Ruby IEF Protein Gel Stain is an ultrasensitive, luminescent stain optimized for the analysis of protein in isoelectric focusing gels. Proteins are stained in a ruthe- nium-containing metal complex overnight and then rinsed in distilled water for 2 h. Stained proteins can be excited by ultraviolet light of about 302 nm (UV-B transillumi- nator) or with visible light of about 470 nm. Fluorescence emission of the dye is maxi- mal at approximately 610 nm. The sensitivity of the SYPRO Ruby IEF protein gel stain is superior to colloidal Coomassie blue stain and the highest sensitivity silver staining procedures available. The SYPRO Ruby IEF protein gel stain is suitable for staining proteins in nondenaturing or denaturing carrier ampholyte isoelectric focusing and immobilized pH gradient gel electrophoresis. The stain is compatible with N,N©-methyl- enebisacrylamide or piperazine diacylamide cross-linked polyacrylamide gels as well as with agarose gels and high tensile strength Duracryl gels. The stain does not con- tain extraneous chemicals (formaldehyde, glutaraldehyde, Tween-20) that frequently interfere with peptide identification in mass spectrometry. Successful identification of stained proteins by peptide mass profiling is demonstrated. Keywords: Protein stain / Noncovalent / Isoelectric focusing / Fluorescence / Ruthenium EL 3769 Thomas H. Steinberg 1 Elena Chernokalskaya 2 Kiera Berggren 1 Mary F. Lopez 2 Zhenjun Diwu 1 Richard P. Haugland 1 Wayne F. Patton 1 1 Molecular Probes, Eugene, OR, USA 2 Genomic Solutions, Chelmsford, MA, USA 1 Introduction Though initial attempts at isoelectric fractionation can be traced to work performed by Ikeda and Suzuki in 1912, present-day carrier ampholyte-mediated isoelectric focus- ing (IEF) evolved during the 1950s and 1960s primarily from Kolin©s concept of focusing ions in a continuous pH gradient, Svensson-Rilbe©s theoretical work that specified how to develop stable pH gradients in an electric field, and Vesterberg©s synthesis of the required polydisperse mixture of charged molecules that serve as good conduct- ing and buffering species (reviewed in [1, 2]). Early com- mercialization of the technology by LKB Producter assured its rapid propagation among researchers and IEF still remains a popular separation tool for one-dimensional electrophoresis and as a component of two-dimensional protein fractionation. It has been estimated that more than twenty thousand studies utilizing IEF have been pub- lished and a literature search of the PubMed database appears to confirm this number [2]. The technology is utilized extensively in basic research, clinical chemistry, forensics, and the agricultural/food industry [3±5]. Exam- ples of the latter include the analysis of hybrid purity in the seed industry, the identification of wheat samples of high baking quality, and the determination of animal species composition of processed meat products such as hotdogs [4, 6, 7). Recently, renewed interest in IEF as a basic research tool for proteomics has come about through the combination of thin-layer IEF for charge fractionation and matrix-assisted laser desorption mass spectrometry for weight fractionation to generate ªvirtual 2-D gelsº [8, 9]. Despite its popularity, conventional IEF does have sev- eral drawbacks, such as uneven conductivity and buffer- ing capacity along the separation path, a requirement for extremely low ionic strength, which can lead to isoelectric precipitation of samples, and susceptibility to pH gradient instability (cathode drift) [10]. Immobilized pH gradient (IPG) electrophoresis was devised to overcome these problems [11, 12]. While conventional IEF gels use thou- sands of low molecular weight molecules of differing iso- electric points to generate a pH gradient upon application of a voltage, the IPG technology uses a physically cast gradient of as many as a dozen acidic and basic acryla- mido derivatives covalently affixed to the polyacrylamide matrix during gel polymerization in order to form the pH gradient [13]. Though effectively dealing with many of the limitations encountered with conventional IEF, IPG tech- nology has generated new problems, particularly when combined with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to Correspondence: Wayne F. Patton, PhD, Bioanalytical Assay Development Group, Molecular Probes, Inc., 4849 Pitchford Ave- nue, Eugene, OR, 97402, USA E-mail: [email protected] Fax: +541-344-6504 486 Electrophoresis 2000, 21, 486±496 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/0303-0486 $17.50+.50/0

Transcript of Ultrasensitive fluorescence protein detection in isoelectric focusing gels using a ruthenium metal...

����������� ��� �������� �� ��� ������ � �� ������� � ����� ���� ���� � �������� ������������ ��������� ���� � �� ���� ��� ����� �� �� ��������������� ����������� ����� ��������� � ��� �������� � �� ���� �� �� �������� � ������ ���� �� ����� ��� ������� �� � �����!����!� �������� ����� � ����" �������� ��� ���� ������ �� ��������� #���� � � $ � ������� �� ����� ��� �� �"����� �� ������� ��� ����� � �� �� %&$ �� '()!* �����������!��� �+ � #��� ������� ����� � �� �� ,-& �� ��� �������� ������ � � ��� ��� �� ��"�!��� �� ���� "������� ./& �� 0�� ����������� � ��� ����� ���� � �� ���� ��� ������� ������ � � � �� ���� 1 ������ ���� ����� ��� ��� ������� ����������� ������ ���������� ������� ��������� 0�� ����� ���� � �� ���� ��� ����� �� �������� � � ���������� ����� �� � ����������� � ���������� ������� ���� ���� �� �������� � ������ ������ ������� �2 �������� ��� ������ �� ����� 0�� ����� �� � �������� #��� ����!������!���������������� � ���������� ����������� �� ��!���3�� � ������������ ���� �� #����� #��� ���� �� ���� ��� ���� ������� �������� 4������� ���� 0�� ����� � �� � � � �!���� �"����� �� ��������� '� ����������� ��������������� 0#���!$&+ ���� ���5��������������� #��� ������� ������������ � �� ���� ������ ����� ���������� ������������ � �������� �� ����� �� ������� ���� �� ������ �� ��� ��������

���� ���� �� ���� ����� 6 7 �� ������ 6 � �������� � ������ 6 ��� �������� 6 ���������

8 %-.9

�� ��� �� ���������

����� ����� ��� ���!

���� "��������

#��� $� % ��&!

'���(�� )���

*����� +� ���������

,���� $� +��� ��

/: ������� �� ���� ��������� (�;

$��� ��� � ���� ���1������ ��� :;� (�;

� -��� ���� �

0� ��� ������� �������� �� �� �������� ������ ���� � ��� �������� � # �3 ���� ���� �� 3��� ��� ����3� �� /9/$��������!��� ������� ���� ����!�������� �� �������� � ���!��� '�+ �� ���� ������ ��� /9<&� ��� /9.&� ����������� � = ���>� � ����� � � ������ � �� �� � � ����� �� �2��������� ������ �!�����>� ��� ������� # �3 ���� ���������� # � ����� � ������ �2 ��������� �� �� �������� ��������� )���������>� ��������� � ��� ��5����� � ������������"���� � ������� � ������� ���� ����� �� � � � �����!��� ��� ��������� ������� '�����#�� �� ?/� $@+ ���� � �!������������ � � ��� ����� � �� �� 8=* �� ������������� ��� ����� �� ������ � �� �� ����������� ��� ������ ������� � � ����� �������� � � � � � ��!������� ��������� �� ����� ��� �� � � �� ���� � �# !������� ����� ���� ������ ���� � � ��� ���� ��������� ���� � �� �����#���� �� ����� ������� ��������� � ���� ���� ���!������ ��� � ���������� ������ � ��� ���:�� ��������������� � � ����� ���� ������ ?$@ 0�� ����� � �� ���������� �"��������� �� ����� ��������� �������� ����������� �������� ��� ��� ������������6� � �������� ?%A<@ "��!

���� � ��� ������ ������� ��� �������� � ������ ������ �� ������� ��������� ��� ������������ � � #���� ������� � ������3��� 5������� ��� ��� ����������� � � ������ �������� �� ���� � � �� ������ ���� �� ����� ���� �� � �� ��?,� .� -+ ��������� ����#�� �������� �� � �� � ������������� � � � � �� �� ���� ��� � �� �� �� ��� ��� ���� ������� � � ����!����� � � � ������ ������ ���� � ��������"!�������� ����� ��� ���� � ���� ������ ����� � �#����� ������ ���� � � �������� B������� $!4 ����C ?D� 9@

4������ ��� � ��������� � ������ ��� � � �� ���� ���!���� ���#���3�� ���� �� ������ � ���������� ��� ������!��� �������� �� �� ��� �������� � ����� � ��5�������� � ��"������� � # � ��� ��������� #���� ��� ���� � �� ������������������� � � �������� ��� �������������� � �2 ������������������� '���� �� �����+ ?/&@ �� ������� �2 ��������'��+ ������ �� ����� #�� ������� � ���� �� ������� ����� ?//� /$@ E���� � ������ ��� � ���� ��� �� �!����� � � # � ������� #����� � ������� � ��������� �� !�������� � ���� � �������� � �2 �������� �� � ��������� � � � � ������ ��� �� ����� � �� ���� � ���������� ������������ � �� ���� �� � � ��� ������ ��� ����� ������!��� ����������� � �������� ����"�� � ��� � �����������������" ������ ��� � ���������� � �� ���� � � �� ��� �2�������� ?/%@ 0� ��� ����������� ������� #��� ���� � ����������� �� ��� ������� #��� � ������ ��� �� �� ����!� � �� ��� ��������� ��# �� ������ ������������ #���� ������ #��� �4�!� ������������ ��� ������ �� ����� �

� ����� ������� E���� � ���� �� ��4� *� ���������� ;����4���� ����� �� ��� : ������� �� ���� �� � ,D,9 ������ �� ;��!���� ������ ��� 9-,&$� (�;�.���� #�������� �F�� ��� � �$�/� G<,/!%,,!.<&,

,D. �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.

H E8�!)12 )����� ���2� .9,</ E�������� $&&& &/-%!&D%<6&&6&%&%!&,D. I/- <&G <&6&

�� ���� �# !������� ��� ��� �� ����� 0���� �� ��� �!���� ������� ����������� ��� ���� � � ����� �� ����� ��� � ����� ������������ ��� ���� � � ������� ������� ����� �� ����� ��� �����" ��� ����������� �� ��� ���������� � � �� !����� ���#��� ��� ����� ��� ��� �� ������� � � �# !������� ��� ���� ��� � ���� �� ���� � ��������� �� ��� ����� � ��� ?/,� /<@ � � �� ��!����� �2 ,AD �����!����� � ��� �� ������ �� ����� ��� ����������� �5����!���� #��� ������� � ���� ���������� ���#��� ��� ��� ������� ��� ���� � � �� ���� ?/.� /-@ � �� ���� ��3��� ���� ���� �� ������ �� ����� #��� � �"��� �� � �����������������5��� � ������ ���� �� ����� �� ������ � � ��������� � � ��

)���������� � � �� ����� � �� #��� � ��5����� ������������ ��� � ��� ������� ���� ����� �� � � ���� ��� � � �������� �� �������������� ���� ��� ������� � ������� � ��� � �������� #��� ��� ������� ���� ����� �� � ���� � #������ �������� ������ ��� ���� "�� ������ �������� � ���������� � ������� �������� �� ��� �� ��� �����" ?/� /&@ 7���� �� � � �������� ���� �� � � �������� �� ����� ����������� �� �� �������� � ������ ���� ���� ���� ������� ��� ��� ������ ��������� 1 ������ *�������� *��� '1**�!$<&� 1** �!$<&+� � �� ���� 1**� 1**61� ���� ������������ ������ � �� ���� ;��� )� ��� /-� ��� ������ ��������?/DA$,@ 1** ��� ������ �������� ��� � �� � ������� ���!����� � � �� ���� ����������� � �� � �� � ��� �� ������ !�� ����� ?<� $<� $.@ ��� ������� ������� � � �� ����� ��� ���� ��� ��� ���� ��� �������� ����� 7��� ��� ?$-@ E� ���� ���� ��� ����� ��� ��� ����� ������ ������� ����� � ���� �� � ������� ������ �� 7��� ��� '�����!������ �������� ��+ � ���� ���� �� ��������� �� �4���� � � �������� ����� ��� ����� � ����� ��� ������ ���� ����� �� ����� ���������� ��� ��� ��� ��� ��� ��������� 0��������������� � ����� ����� ��� ������� ���� � ������ ���� ��� ���� ������� � ����������� �� ���� � ��� ������������ 1** �������� ��� ��� �������� � ���� �� �4� ����3��� � ���� � � �� � �� � �� ���� 0�� �J������ � ��������� #�� � ����� � � � ��� ����������� ����� � � ����� ���� �� �� ���� � ��� �� � �� ���� 1** ��� � �� ���!������ ���� ��� ���� ��������� ������ �������� ���� �� 0������� ���� � �� ���� ��� ����� ��� #� ��������� ��� !�������� ������� � � �� ����� �� � �� � ��� �� ���� � �� ���� � �� ������ � � �� ���� 1** ��������� �� ��������� ��� ����������� ������� #���� ��� � �����������������" ������� ��������� ;���� ��������� ���� ��� �������� #���� � ��� �� �"���� ��� �� � ��� �����" ��� �������������� ����� � �������� () ����� � "� ���� ��� ������������ � ����� � �����!����� ��� ������� ; � �������!���� � ������ � � ��� ���� ������ � 1**� � �� ����1**� ������ ��� ����� ���� � �� ���� ��� ����� ������!��� ��� ��������� ���������� � � ���������� �� ����� ��� �!������� ���� ��� ��� ������� ����� �� � �� ��������� � � ����!������� � � �� ����� �� � ��� �� ����

! #������� ��� ���� ��

!�� #�������*� �� �� ��������� � 3�� �� ���� ��������� '�2 %A/&+�;��� ���� �;������� '�2 % <A9 <+� ������ � ������������� ����������� '�2 %A/&+ ��� �� ������ 4�� ������'�2 , &A- &+ #��� �� � ;�������!��������� *� �����'(������� �#����+ 0�� ���������� ��� �� �������� � ���� � ��� �������� �� ����� ��� ��������� �� 0���� / ������!���� ������������� 1** ����� � ���� �� ��� ��� ��3����� ���!��� ������� ����� '������ ����� ���� =��+ #��� �� � *� !��� 8�� ��� ���� '2�������� 1;+ � ���� ���� "��� ����� ��� ��� ���� #��� �� � ������ ���������� '������������7K+ ���1 �� *��� #�� �� � ������ 1������� 1 �����'� �3� ��� 8+ �������� '�2 %A/&+ ���� ����� #��� �� �7 ��" '��� 4��� � 1;+ 0�� ������6������ ������� ����� '���!��� ����� =��+� �2 %A/&6$4 ���� ������ �2 ,AD ���� !������ ��� ���� ����������� 0:4� 0��� � L!/&&� ���������� ������ �� �� � ���� � ����� ��� ���� ����� ���� ��������� 4������� #��� �� � ��� ��� � ���� �� '1������ ���:;+ � ��� ���� �� � ������ '�2 %A/&+ ��� ��� �������������� � ���3�� �� ����� ����� ��� ������ �� #��3� #��� ������� �� � �:1 *� �� ����� '� �3����� :+ ;��� ���� � � � ������ ��� ����� � ������ #��� ��������� � ����� '�� 8 ���� :�+ ����� ���� � �� ������� ����� '�!/$&&%+ #�� �� � : ������� �� ��� '��������+

!�! $�� �������� ������ �� ��"������ �6������ � �� ����� � ����� ���� � �� ������� ����� #��� ������� ����� � ��� �������� ���� ����������� ��� ��������� '/�+ ��� � ���� � :�����������#��� ���� �� � ����!� �� �� 9.!#��� � ��������� �����'1 ����� �� �� ������ 1 ������ 7�+ ����� � : �������4������ �������!:�" ������ :��� ����� ������ '�����!����� 1;+ � � ��� �"������ � �� ����� ������ � #���������#�� ��� � ./& �� ��� ��� �"������ � �������� #�� � �!������ �� � $<& � ,&& �� � � ��� ������ � �� ����� ����"������ � #��������� #�� ��� � ,-& �� ��� ������ ��������� #�� � ������� �� � <<& � -<& ��

!�0 -�$� #�� ���� ���� ��������� � ������� � � ������������������� ������� ��� ��� ��� ��!���� ���� ���� ���� ������������ �� ��!���3��� �����"� ��� ���� ���� ����������� �� ���� ������� #��� ������� � / ��$ ������ � ������ �������� ����� � ���� ��� $ < �� �� � ��� �� �� ������ �� 0��������� ���� "������� $< �� � � ��� �� ���� #���� ���� �� ��� ����� ���� � ��� ���� '����� �� � ��� ����!��������>� �������� ����������� ��+ ��� ���������� �����#��� �������� ������� ������ �� ;��� ���� �;�������#��� ��� � ��� ������ � � /.&& )� ����� � :������ � ������ �� ����� ���� ';�������!��������� *� ����+� ��� � /& 1 ��� ����� � ��� ������������>� �������!

�������� � $&&&� ��� ,D.A,9. 8���������� �� ���� ����� � � � ,D-

1��

����

�� �� �� ������ 4������� ���� #��� ���������� ��� ��!��� � ��� ������������>� ��������� �� #��� � /M$& ������ � � ���������� �2 %A/& ���� ���� � ���� � ���� #������ � � D&&& )� �� /& 1 ��� ������������>� ��������� �� �������� ���� ������ ��� ��� � ���� �� ���� ��������� ����������� #��� ���� ���#��� ����� ������ � ���!���� ������� �� �� ��� ;��� ���� �;������� '$$ �� �/$ �� � / ��+ ��������� � .N0� $ .N1 ������������������� � ������������!����� ��� �����" '4�������O��� ��� � ���� ��+ ������������ #��� ���������� ����������� ����� � �������� � ����� ���� ���� � ��������� � � $N �� ��� ��� 0�� N0 �� � ��� � � ��� � ��������� ���"������� �� ����� ��� /&& �8 ��� N1 �� ��� �������!��� �� ��!���3�� 0��������� ��� ��� ��!���� � ���� #������ � � ,&&&A<&&& )� �:1 � ��� ;��� �� � ������#��� ��� ����� & < : ������ ����� �2 $ .� �� �� ���� ���/ : � ���� ���� "��� �� ���� ���� ��� ����� � ��� ����!��������>� ��������� �� '�:1 *� �� �����+ �� ����� #���������� � ��� ��� ������� ����� �� �������� � ���3� ������ #�� ���� ����� �� / E � ������ � #�� � � /& ���� ��������� �������� � ���3 #�� ��� ��� �� � ��� ��� ���!����� ��� ������ �� ����� #�� � ������� �� $< E � ������� #�� '� ����� ������ /<&& )+ � � -< ��� � � ������������ ��� ���������� � ���� � #�� ���� �� $N 0��� �L!/&& ��� �� 9 : ���� 4��������� � ���� ���� #��� ����� ��� ���� ������ �� � ����������� ���� �"���� �������������� #�� ���������� �� $& 1 ������� � /& 1 � ������� ���� ������������� � � ���� ���� #��� ���� ������������� $& �� � % �� '������ ��������+ � ����������$& �� � / �� '������ ��������+ ����� ����� ��������� �,N0� $ .N1 ������������ ������� � ������������!�������� �����" '4�������+� 9 : ����� $N 0��� � L!/&&� ��� $N������� ���� ����� ?$D@ � ���� ���� #��� ��� ����������� � /D &&& )� �� ����� ���� ��������� ?$9@

!�2 ������ ���� ��1** �������� � � ���� #�� ���� ���� ����� *� !���1 ������ ����� � ���� � ������ �������� � ����� ���� ���� �"������� ��� ��������� � ��� ����������� � � ��� ���!���� � ��� ��� ; � ������ �������� �� � � � ����� ��� � �� ���� �� ����� ��������� �� �������� � #���� ?/@ *������� ���� #��� ��������� � � /& ��� �� $&N ������ � !������ ���� 0�� ���� #��� ��� ��� �� � ��� ��"����� � ��!�� � ��� ��� ��� ������� #�� ������ #��� #���� 0�� ����#��� ���� ��������� �� ��������� #���� � � /< ��� ����� ���� ���� � #� �� 1** ����� � � %&A.& ��� �� �������� ��� ���� � #� ������� ��� �� ��� � ����������������� ���� ������� � ��� ��� ������� 0�� ��� #�� ��� ����� � ��� ����� ��� ���� ��� ���3�� ��� #�� ���������#��� -N ������ ����� <N ������ � 1 �� ���� 1** �������� � � ���� #�� ���� ���� ����� ������ ���1 �� *���������� ��� ����� � ��� ������������>� ��������� �� *������� ���� #��� ��������� �� ����� ������� � ���������#���� � � < ��� ���� ��� ���� �� ���1 �� *��� � � /< �

' ��������+ ���� #��� ���� ������ �� #���� � � / � ;����������� ������� �������� #�� ���� ���� ��� ����� � ���������������>� ��������� �� ����� ��� ��������� � ����������� =��� #���� �� ������� � ��������� �� ������ �� /$<A%&& ��6��$ � �� ���� '��� ��� � ���� ��+ ;�3����� ���!��� ������� �������� #�� ���� ���� ����� ��� �5�������������� ������ ����� ���� =�� ��� ����� � ��� ����������������� �� '*� !��� 8�� ��� ����+ ��� ������� �������� � ���� #�� ���� ���� �� �������� � �� ��� ����� ����� �� ���� ��� ����� � � /< � ' ��������+ ���� ��� �� ������ ��� ��� � ���� � ������������ #��� �� ����������� :���!��� �������� � ����� ��� <& �8 � � . �� � 9 �� � / ����������� � /<& �8 � � $$ �� � /$ �� � / �� :������ �!� ���� ���� 0��� � ����� ��� � � � ���� � � ���� ������ <A/& ����� ��� � ���� � ��� ���� ����� � ��� �����!��� � ���� � ������� �� ����������� � �� � ����������� � � ������ �������� ��� �������� �� �� ��� �� ���� ���� ��� ���� ������ �������� ������ ���� �� ����������P � ��� ���� � �������� '1 �� ������� �������� 0#���������2+ ;�� �������� ��� #������ ����� #��� ���� ���� #���� ����� ��� ������ ������� � '����� � �� ������ ���3�� ��<& ���+ ;���� ��������� ���� #��� ������ �� %A, ������� � #���� ��� ��� � ���� � $ � � #��� �������� ��� �� ���� ��� �����" ;������������� ���� #��� #����� �� /&N������ �� -N ������ ���� � ����� ���� � #�� �������������" ���3�� ��� �������� � � ;��� ���� �;��������� ���� ���� ���� ������� ���3����� ��� ��� ����������� � ��� ���3��� ������ ��� � ��!����� #��� � � ��� ����!��� ����������� ������� � � �� ������ �� �� ��� ����� ���� ������3��� �� ��� ��� �� � ��� ���� �� �� ��� ���� ������������ ��� �������� ���� ��� �� ��������� �� �������������� �� $N ������ � � � %& ��� ��� ������ ���� ���#���� � �� ���� ����� ������ ����� � � �������� ��� �����'*� !��� : ��� <D% ��� 4����+ �������� � �� ����� ���:1 ���� �� � ���� #�� ���� ���� �� �� ��������� ���!��� �� ��������� � � � ������������ � ���� ;������!������� ���� #��� ������� #��� ��� ����� ���� � �� !���� ��� ����� �� ��� �� ������ ��� ������� �� ��������������� � � �������� ���� �� ���� �� 1** ����� ;������� �� ������ ��� ��� �� � ��� �� ��� ���������� ������!���� '?/@� ���� /.9+ *������� ��� �� ������ ��� ������� ���� ������� ���� ����� �� �������� ��� ��� ����!� #� ������� ������ ����� � � ����3 � ����� � #��� ������ $ 3� #������ 5���3�� ��#������ ��� ��� ������� � ��� ����� ������ ������ ���!������ �� <& 1 ��� �� ����� ��� �������!� #� �� ��� �������� � ���� � � � %& ���

!�3 4����&�� � � �����1**!� � �� ���� 1**! ��� ������!������� ���� #��� ������!���� � � �������� #���� ����� � " ����� � .&& �� ����!�� � ������ ;������������� #��� ��� � ��� : ������� *� !��������� '������� ���� 7+ 8���!����� �/ ' � �����������������+� � �������� %&$ �� () ����� � " #�� �������#��� ��� ������� ������� '1��� ;������� ��!�8 $/,9!,O

,DD 0 2 ��������� �� ��� �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.

7 ���#��� ��������� ��������� � ������� ��+ ��� ����#��� ������� � ��� ������� ; .&& �� ������ � ������ #������ � ��5���� ������ 0�� ������� ������� ��� ������ ���� �� .&& �� #���� ������� ����� ������ ���3� J��� �� �� �������� #���� ����� � " 0��������� �"� ���� ����� #���/<&A%<& �� ����� ��� ������� ������� 0� ��� ��������� � �� ���� ��� ����� �� ������� ���������� �� ��� �� �������� () ����� � "� � � ���������� 114 ������! ������ �������!����� ����� �������� ������ �� ��� ���������� � � ���� ��5������ � � ������� ��� ���� � ������������� ��� �������� ��������� ��� �� ���������� ��� 5�����!������ ��� ����� � ��� �� ������� ����� ����� �� ����!��� ��� �������� � ��#��� 0�� ��� � � �� � �������������� 114 ������� � ����� ������� �� ��������� � ����� ��� �������� ����������� 0�� ����������>� ��������!��� ���������� ��� ��3� ����� ������� ���� ��� � � ���������� �� ��� ����� �� ��� �� ������� ��������� �� ��� 114 ������ �� ��������� �� �� �� /&$, � /&$,������� �������� '��"���+ ��� ���� � #��� /$!� /, � /.!�������!����� ������ �������� ��� ��"�� 0��������� �������5������ � ��� �������� #��� ���� ���� � � ��� �!�:����!����� '*� !���+� 8���!����� �/ '� ��� : ����!��� *� ���������+ � *� ���� '��� ��� � ���� ��� ;��;�� �� :+ ������ ����� ���� � �� ���� ��� ����� ������������ #��� ������� � �������� �������� �� ���������� � ������� ��� � ��� ������ � ��"���� �� ���� "�!������ ./& �� ��� ��� ��� ����������� ��� ���� � �� ���() ���� � � ��� �������� ��3��� �� � �������� #��� �����!��� () �������������� �� �������� �� %&$ �� '()!*+����� �� ��� � � 6() ,<& �������������� � '� � ����� 2���!� ��� E+ � ��� ()� �������������� � '()� 8�� ��� ���� ������ (������ 1;+ ����� ���� �� ���� ��� �������� ��� �� ���������� ����� � ,9& �� � �� ���� ���������� �� = ��3 E������ ������� ������ 7 9 '�!..<.O : !������� �� ���+ 0�� ��� ��� ��� ,-& �� ��� ���������3� ��� #��� �"������ � �� ���� ����� 0�� ��� ��� ������ ���������� � � ��� ������� ���� ����� � " '4��3�������O 1���� 1������� ��������� 4������ 1�+ E������� ����������� ���� #��� ���#�� �� � ���3���� � � 0�� ������� ��� #�� ������ � ��� 4��3 ������ ��� ������� ����� � ������� '�������� #��� ��� ������+ #�������� � � � � ��� ��� ; E������ Q $$ ���� ����� ������#�� ���� �� � �J����� � #��� ��� ����� ����� � ������� � ������ ���3�� ��� ���� #��� �� � ������� �� �!�� �, < #��� � ��� �� ..- ����3!���!#���� ����� ���� "� ��������� #��� ��������� %AD � ����� ��� ����� ����� ��� -A/$ � ����� ��� ����� ����� �� � ������� � #��� ��� E���!��� ������

!�5 #������� � �6+*7 *��� ��� ������2 � � ������ � � ��!8!��������� ����������� ����������������� ���������� ���������� �������� �������� �� ���������������� ����� ����� ������� ���� ����� ����� ����� ��� !���� ��� �� ���� #��� � � ��������� ��� /<N0� $ .N1

� ������������ ���� �� � � ��������� � � / ��6�8 0������ ���� ����� � ������� � ��'���������� �������� ��� !����+� � ��'���������� ��� ����+� � ��'������� ��� ����+�� ��'���������� ������� ��� ����+� ��� � ��'��������� ��� !����+ #��� � � ��������� ��� � ������������ ���� �� ����������� ������ �� ��� � � � ������ 0�� ���� ����� ����� � �������� � ������������ ���� #�� ������� ����������� � � ��� � ���� ��� � ������ � ���� ���� ���� ���� ���� � ����� ��� �� ����� ��� ���� � ���� � �������� �� ��!���������� � ����� ���� � �� ���� �������� #��� ������� ������ �# � �� ������ ������ �� � ��������$& �� � ,& �� �L/-,�� 47; #��� �������� �� � ���!���� � ����� ������� ����!��������� �� 9< 1� 5���3!� ��� � ���� � ���� �� & -< �� ����3 <N0� <N1 � ��!���������� ���� � �������� - : ���� ��� ��������� �������� �� ����� � � %A, � �� D9 �: 0���!� ����� $ �:

40;� �2 D % '0* ������+ �� .& ) �������� #�� ���!� ���� �� ��������� � � � ����

!�8 #��� ������ �����;���� �������� � ���� #��� ����� ���� � �� ���� ��������� �� ����� #��� ���J����� � �� ����� ������� � ������� ������ ����� �� ��������� ?%&@ *������� �� ��������� #��� �"����� �� � ��� � ������������ ���� #������#��� #��� <&N ���� �������6$< �: ��� ���� ������ �!���� #����� ��� #��� /&&N ���� ������� ��� ����� ������ �����)�� ������ � ��������� � ������ '����������������� 2 ��� 3� 7�+ ;��� "������� $& �8 �$& ��6�8 ������� '��5������� ����� � ������O �� �����:���� �� E+ #�� ����� � ��� ����� ������� ��� ��������� #�� ��������� �������� �� %- 1 �������� #��������5������ �"������� #��� <& �8 � <&N ���� �������6<N������ � ������ ����� ��� ����� ��� ����� ����� � �����!)�� � �������� � 0�� �������� #��� ���� ������������� $ �8 � <&N ���� �������6<N ������ � ������ ���� ���& < �8 #��� �� ���� �� ��� ����� � � ���������� *� !������� ) ����� 4!�� :;84!0�� ���� ������ �����'���������� *� �������� ����������� :;+ ��������& < �8 � /& ��6�8 �!���� �������� ���� #�� ������� � ��� �� � ��� ��� �� � #�� ���!����� �� � � �������������� � � ��5������ ���� ������� :��� ������ ����� #������ ���� ����� �� ������������ � ����� � $& 3) ������� ��5������ � #�� ��� �� � ��������� ��� ��������� ���� ������� ���3� �� D,$ <&99 ��� $�$// /&,. ����������� �������������� ���� #��� ��������� ����� ��� �� ������ ����� � :� �������� ���3���� ��������� � ��� �����!��� �� ����M66�� ����� � ���� ���6

0 *������

0�� �������� �� ������ � �6+*7 *��� -�$+� ��� 1�� ����

��� �������� �"������ �6������ � ������� � ��������� � �� ���� ��� ����� ��� ������� ���� ��� ��� �� �������� �"����� #��� %&$ �� � ,-& �� ����� '��� /+

�������� � $&&&� ��� ,D.A,9. 8���������� �� ���� ����� � � � ,D9

0��� �"������ � �� ���� �� ������� ������ � � ����������� � ���� ����� ����� � %&$ �� ()!* �������������� � � � ���!��� � �����!����� ��� �������� #��� ,<&� ,-%� � ,DD ��� ����� '��� $;� 1+ � ������ �� #� ���� ���� � � ���!������������!��������!������ '�;�+ ����� � ���� � ��� ������ ��� �������� � '�2�+ ����� #��� ������ � ��"���� � <%$ ��� ���� �� ��� ����� �� ��� �:*� ��� �������'2������ ������� �������� ��� �������� � 1;+� �8;!%&&&� ��� ������� ���� ;������� '��J� �� � ����1 ������ 0 3� � K����+ � ��� : ������� ����� �L'*� !��� 8�� ��� ����+ �� �������� � � �"������ � ������ ���� ��� '��� $4+ ����� ���� ��� ��� ��� �� ���������� #��� � ������ ��� ������� ���� ����� � " ��������� �� �� �� ,9& �� '4��3 �������O 1���� 1���������������+ '��� $*+ ����� ���� ��� ��� � ������������ �� ������ � ��"���� �������� �� ./& �� 1 ���!5������� � ,9& �� � �� ���� � .&& �� ���� ���� �������� ��� �� ���� ��� � � � �������� ��� �������� ������ �������

0�! � ����� � ��� ����9 �"" ��� � �� ����"" ����

��� ���� ����� ���� ������ �� ������ ��������� �� ����������� ����!�������� �� �������� � ������� �� ������������ �� ����� ��� ��������� ���� ������ ������ ������������ ��� ����� ���� � �� ���� ��� ����� ���� ������� #��� ����� � �� ����� #��� ������� ������ �����������'��� % ;� *+ ���!������� ��� ��������� �� ����� � ������������ ��� �������� ���� ��� �# ������� � ���� �� ���!����� � �������� �� ���� �� ������ �� ��� ��� ����������� � ���������� ����� ���� ���3���� ���#��� ��� �# �����!��� �� ������� � ���� �"��������� ����� �L/-,��47; ��������� �� <N0� <N1� - : ���� � ����������������� � �� �������� ���� �� #��� � ��� � � � ���������������� ����� '���� � � �� #�+ ���������� #� ���� ��� ���������� ���� �7;� ��� � ������������ ������ ��� �������� �� ��� ���� ������� ��� � � ����������� ���������� �������� ����� 0���� ��� ����������� �� ��� �������� �������!���� � ���������� ����� ������� ���#��� ��� �# ����!

,9& 0 2 ��������� �� ��� �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.

$���� �� ��� �������� �"����!�� �6������ � ������� � ��������� � �� ���� ��� ����� ';+ "������ � ��"��� �� %&$��� ,-& �� #��� ������ � ��� ��./& �� '*+ ����� � ��"������ ./& �� #��� �"������ � ��� ��,-& �� ����� ���� � �� !���� ��� ����� �� ������� ������!���� � � %&$ �� () �����������!��� � � � ������� � �����!�������� ��������

$���� !� 1 ����������� � ����� ���� � �� ���� �������� #��� ��������� ������� ������� 0�� � ���� �� ����� �������� � ���� � ��� �� ���� ��������� ��� ��������� 0���� ���������� ��� ������ �� 0���� / 8���� /A. ��� �����!� �� ������ ������ �� � ��� �� ���� ���������� �������� #������� "������� $< �� � � ��� �� ���� ;�� ���� ���� � �!������� �� �� �� ��������� � ��������� �� ���� ��������� ���� ��������� #��� ������� ��� �������� � ��� �� ���� � ��!��� ';+ �� ���� ������� � ����� � () �������������� ��,9& �� � �� ���� ������� ��� � ��� �� ������� ������'()� �� ����� ��� � ��������� � ������+ ;�� # ����!����� � ������� ���� ���� � �� �� ;��� ����� ���� ������#��� � ������ ��������� '*+ �� ���� ������� � ����� �,9& �� ���� ����� � "� .&& �� ���� ���� ������� ��� � ���! �� ������� ������ '4��3 ������O 1���� 1���������������+ '1+ �� ���� ������� � ����� � ,DD �� ������.,& �� ���� ���� ������ ��� �:0 ': ������� ����� �LO*� !��� 8�� ��� ����+ '4+ �� ���� ������� � ����� � <%$�� ������ .,& �� ���� ���� ������� ��� �:0 ': ������������ �LO *� !��� 8�� ��� ����+

��5��� ��� ��3��� ��� � ����������� �� ��� ������� � ��������� � ������ ���������� �� ����� �� ��� � ����" �� � �����������

�����5���� ������� #��� ���� ���� #��� � ������� ��"!���� � ������ �� �� �� ��������� � �� ���� ��������� '�2% <A9 <+ � ������ ��� � �� ���������� � ����������� ���������� ��������� �� �� ���� �� �� ���� �������� ���� ������ � � � ������ �� ����� 0�� ����� ���� � �� !���� ��� ����� #�� � ������ #��� 1**� � �� ���� 1**���3����� ������ �������� ��� ������ ������ ������� ���������� ������� ����� ������� � ������������ � ����

'��� ,+ 0# ������� ���� �� � ������ ��������� ��3����������� ������� ��� ������ ������ �������� ��� � �� � �!� ��� ���� � � ��������� �� ����� ����� ��� ������ �� ��!��� ?%/@ ������������� ��� ��3����� ������ ������� 3������ ��� �� ����� ������� #�� ������ � ������ �� ������� ������� ;��� ���� �;������ ���� '���� � � �� #�+ �����5���� ������� #��� ��� ��� ��!���� ���� � ��������������� ���� ����� ����������� ����� � ��������� ����!����� '�2 %A/& ���� ����� �� � ��� ��� � ���� ��+����������� ���� ��� ����� �� ��������� ���������� � � �� !���� ������� � �� � ���� ;� ����������� ���� � � ��3�!���� ������ ������� ��������� #���� ���� ����� �������� ���!��� ���� ��� 3��� ��� �� ��� ����������� �� � � �������������������� � � ��� �� ����� '?%/@� �� � � � /+ 0��������� ��� < � ��� // �������� �� ����� #��� ����������� #���������� � ����������� � /.&&A,$&& �� 0�� ������ ������������� �������� 3�� ������������ �������� �� ����� �� �

�������� � $&&&� ��� ,D.A,9. 8���������� �� ���� ����� � � � ,9/

$���� 0� 4������ � � ��� ���� ����� ���� ������ �� ���������� ������ ������ ������� ��� ����� ���� � �� ������� ������ 4��������� .N0� $ .N1 4������� ���� � �����!��� $N ��� ��� � ���� �� �2 %A/& ������� ���� ������$N 0��� � L!/&&� 9 : ���� #��� ���� �� ��� �������� �� ;��� "������� < �� � �� ���� #�� ������� � ���� ������� ���� ��� ������� #��� ����� ���� � #���� ��� � � ';+ ��� ���� ��� � ����� ����� ��������� �� ���� � ������� ����� ������ �� ����� ������� #��� �� ������ ������������� ����� '*+ ��� ���� ��� � ����� ����� ��������� �� !���� � ��� ���� ������ ������� #��� ����� ���� ��� ���� ��� ����� ���� ������ � ��� ��� ������� ��� #����������� ��� � � �������� ��� ����� � ���������� � �����!� � #��� ��� ������ ����� ��������� �� ���� 0�� �� ����� #������������ ����� � � ��� : ������� *� ��������� 8���!����� �/ ��� ������� ������� ������

$���� 2� 1 ������ � � ��� �� ���� ������� � ����������� � ��������� ��� ������ �� � *� �� �� ��������� � �����!���� #��� ��������� � � :������ � ���� ����� ;��� !���� �2 %A/& ������� ���� ����� �� ��������� �� ����� �$ % ';+ ��� ������� #��� 1** ����� '*+ ��� ������� #���� �� ���� 1** ����� '1+ ��� ������� #��� ������ ������������� ����� '4+ ��� ������� #��� ����� ���� � �� !���� ��� ����� ;�3����� ������ ������� ������ ����� #��� ��� � �� ���������� � � � ��� �� � � �� #� ;�� #��������� � ������� ���� ���� � �� �� ;��� ����� ���������� ������� #��� ����� ���� � �� ���� ��� �����

���� #��� ���� ����������� ��� #�� ���� � � �����5����� ������ �� � ����� ���� � �� ���� ��� �����

;� �� #� �� 0���� /� ����� ���� � �� ���� ��� ������������ �� ����� #��� ������ ����������� ���� ��� ������������ �� ������� ������������ 1 �� ���� 1** ������������ ��� ����� ���� � � ��� �� �� ��� #��� D&!� �������� ����������� ���� ��� ������ ������ ������� ������ �������� ���� � �� ���� ��� ����� ������� ���� �����!�� � ����������� 0�� ����� ���� � �� ���� ��� ������������ � ����� ������� ������� � #��� /&!� �� ������ ���!�������� ���� ��� ������ ������ ������� ������ %&!� �� ����������������� ���� 1** ������ ��� D&!� �� ������ ��������������� � �� ���� 1** ����� 0�� ��� ������� ����� ������� ��������� ���� � ������ ������ #��� 9!� �� ������ ��������������� ��� ������ ������ ������� ����� � 1** ����� ��� #���%&!� �� ������ ����������� ���� � �� ���� 1** ����� 0�������� ������ ������� �� ������ ������� ��� ���� ���������� ���� ������ '1 % $ / %+ #��� %&!� �� ������ �����!������ ���� � �� ���� 1** ������ ��� ��� ����� ��� ��������� � �� ���� ��� ����� ������� ���� ������� � ��������!��� ;��� ���� ������ �� � � ������� �� ��� ����� ��������1** ����� ��� ����� �"���������� � ����� �� � ���������"���������� �� ���� ������ ���� ������� �� ����� �������#�� ���������� ����� ������� � �� ���� 1**� ��� ��������� � �� ���� ��� ����� 0�� ����� ���� � �� !���� ��� ����� #�� � ����� <A/& ����� � �� ��������� ���������� ����� � � �� ���� 1** ����� #��� ������� � ���������� � � � ���� ������ �� � ���� '���� � � �� #�+ 0�� ������ ������� � ������ � � ���������� �� ����� �� ������������ � �������� ������ ��� � 9!� �� ����� � � 1**'�"������� ���� ���� ������+� �� D&!� �� ����� � � � �� �!��� 1**� ��� � $,&!� �� ����� � � ��� ������ ������ �������

������ ��� ��� �� D!� �� ����� � � ����� ���� � �� !���� ��� ����� "������� � � ��� ������ ���3�� �� �������������� ���� ��� �� ���� ������� � ����������� � ��������� � �� ���� ��� ����� �� ��������� %A%& ����� ���������� ������ ������ ������� �������� ��� � �� ���� 1** �����!���

*������ � ���� �� ������ � � � � ������ � ��� � �� ����� ����� #�� ��� ��������� '0���� $+ � ��� ������������� �������� �� ��������� �� � ������ ��� � �������������� �� ��������� �� �������� � �� ������ �������� #����������� ����� ����� �� ��� �� �� � ������ �������� 0�������� ������ ������� ����� ��������� ��������� #��� ������ ���!����� #���� 1** ����� ����������� ��������� #��� ������ ����������� �������� 1 �� ���� 1** ����� �������� ��� ��

,9$ 0 2 ��������� �� ��� �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.

����� �� 4������ � ����������� � ����� ���� � �� ���� ��� ����� � ������ #��� 1**�� �� ���� 1** ��� ������ ����� �� � ����������� � ����

:��3�� �� ���� � �������� 1** 1 �� ���� 1** ������ ������ ��� ����� ����� ����� ���� �����'��+ '�� �� ����+ '�� �� ����+ '�� �� ����+ '�� �� ����+

;��� ���� ������ % <& R/.&& /9&A ,.& -A /- -A /-� ����� ������� ������� � , << <.&A/%9& /.-&A,/.& /9&A ,.& $&A <&�!8��� �� ����� ; < $& <.&A/%9& /9&A ,.& /9&A ,.& .&A/<&* ���� ���� ��� ��������� * < D< /9&A ,.& .&A /<& .&A /<& $&A <&2���� ���� ��� ��������� * . << <.&A/%9& .&A /<& .&A /<& $&A <&2 ��� �� �� ���� ������ ���� . D< <.&A/%9& .&A /<& <.&A/%9& .&A/<&2 ��� �� �� ���� ����� ���� - %< .&A /<& $&A <& /.-&A,/.& $&A <&8����� ������� ������ ���� D /< .&A /<& /9&A ,.& .&A /<& -A /-8����� ������� ������ ���� D ,< .&A /<& /9&A ,.& .&A /<& .&A/<&8����� ������� ����� ���� D .< .&A /<& /9&A ,.& .&A /<& $&A <&0������ ��� 9 %& /9&A ,.& <.&A/%9& .&A /<& $&A <&

7 ��M E���� �� ������� ���� ���� ���� �� ;�������!��������� ;��� ����� ������ ���������� ���� � ��� ������ ;�������!��������� ������������ 7 ��" �������� ���� !������ ��� ��� � ���� �� ���� ������ *� !��� *� ����� ��� ;�������!��������� �� !������� ��� � � �������

����� !� ;������� � ��� ��������� � #��� ���� ����� � !��� ����� � ������

;����� ������ 1** 1 �� ���� 1** ������������ ����� ���� ���

%�� %�� %�� %����� ��� ���

8�� 8�� 8��:�� :�� :��2�� �� ��0�� ��� 0��0�� 0�� 0��

%������ %������ %������ %������1���%������ 1���%������ 1���%������ 1���%������

:������ :������ :������1������

1���:������

�������� � � ������� ��������� ��������� ��� ��� ���� �������� ����� ���� ��� ��������� ��� ���� #��� ������� ������������ ��������� �������� �������� �� #��� ���� ���� �����! � ������ �������� ���� ��� ������� � ����� ���� ��� ���� ��� ����� � �� �� ���� ��������� 1** �������� *���� ���� ���� ���� ������ ������ � ���� � ������������ �� �� ����� ���� ��� �������� � �� ������ �� ��� ���!���� ���3� ���� �� ��� ���� ����� ��� ��� � ��������� ��#��� � �������

0�0 � �������� ��� �������� ���������� ���� ��� ��� ���������

;� ��� �������� �� ��� $� �� ������� ���� ���� � �� ��;��� ����� ������ #��� ����� ���� � �� ���� �������� 0�� ������� ���� ���� � �� ��� �� ��������� ������� � D ,AD .� �� ���������� �� ��� ������� � � ��������� ������ ������ �� ���� �� ��� � ��������� �������!� ��� �� #�� � ��� ���� ��� ������ � �������� � ���� ������ ;��� ����� ������ ��������� �� � ��� � � � ����������� ������� �� � ��� ������������ 0��� �� ������� ��!������ �� � ������� ��� $; #��� ��� ,4 ; ����� � ���� ������� ���� ����� #��� ��������� � ���������#������ ���� �������� �������� �� �������� � ��� ����������� ���� ��������� �������� �� �;������� ����� ����� �� ���� ��� ����� �� ��� �������� � �� � ��������#��� � #��� ����� � ������� ���� ���� ����������� '��� <;!4+ �� #��� �� #��� ��� ������� �� ��� � ��� ��������2 ��� ������ �� ����� '��O ��� <+ :������ ����������� ���� �������� #�� ������� ����� ������� ���� !����� �� ����� �� ���� ������������� �������� ������ ���!���� ���3�� ��� �������� #�� � ��� #��� ������������ ������ � ��� ���� ������� ���� ����� ���������� � #!���� ������ � � ���� ���6 � 0��� � L!/&& �� � ������������� � �� ���� � � ��� ����� ���� � �� ������� ����� '��� <�+ 0�� ����� �� �������� � � ��������� �� !����� �� ���� ���� �� #��� �� ���� ���� '��� <�+

0�� �������� � ���� �� ��� ����������� � ��� ���3�� �� !����� ���� � ��#��� ����� ��� ����� ��������� ��� ������!����� ����������� �� ��� < 0��� �� ��� �� ���� � ��� ����������2 ��������� ��������� �� ��� ������� ���� ������ ������!�� �� �� �������� �� ����� ��� � ��� �������� � ������� � ���� �� ��� ����� ����������� �� ������� �� ������� ������!��� �� � ��� ��� � ��������� ��� ��������� ��� ������������� �������� � �� ����� ��������� �� � #������ � � � ���� �0��� � L!/&& #�� ���� ��� �� ��� �������� �� ���������"��������� #��� ���� ���� #��� � �� ���� 1** ��� ����������� ����� ��������� � ����� �� �� #� �� ��� < �������������� �� ��� � ���� �� ��� ����������� � ��� ���3�� �� !����� #��� ������� #��� ����� ������ ��� ����� ����� �� ���� ��� ����� �� ����� �5�������� � ������ �������� � ����������� �������� � ������ ��� � �� ���� 1** ����� � ����� ��������� '���� � � �� #�+

1 ������ �� � ��� �# � �� � ���������� �� ��!���3!��� ���� � � �������� � ������������ ����� ����!������!���������������� ��� ���������� ������������ ��� �!������ ���� ����� ���� � �� ���� ��� ����� �� ������ �������� #��� � �� ����������� '���� � � �� #�+ ���!����� ��� ��� ��� � 4������� � ������������ �������� ������������!����� ��� �����"� � �� � � ��������� #����� ���� �������� ����� ����� ���� �� ���� ��� �����'��� <;!4� �� �+ �������� �������� � ���� �� � ���� ����� �������� ����� ��� ��� ������� ����� '��� <2+ �:1���� �� � ���� ��� �� ������� �� �� ��������� �� ��!���� �� ��������� � � � ������������ ���� ;� ��������������� � � �������� �� ����� �� ���� �� ���� �� ������ ���

�������� � $&&&� ��� ,D.A,9. 8���������� �� ���� ����� � � � ,9%

$���� 3� 1 ����������� � ��������� ������� ���� ���� ������ �����" ����������� #��� ����� ���� � �� ���� �������� ';+ 4������� ��� � �������� $N ��� ��� � ���� ���2 ,AD ������� ���� ����� '*+ 4������� ��� � ��������$N �2 %A/& 7 ��" �������� ���� ����� '1+ 4���������� � �������� $N �2 %A/& *� !��� *� ���� ���� ����� '4+ 4������� ��� � �������� $N �2 %A/& ;�������!����!����� ����������� '+ �� ������ ��� ���������� #���$N �2 %A/& ����������� '�+ 4��������� 4������� ���� �������� $N ��� ��� � ���� �� �2 %A/& ����������� ������ $N 0��� � L!/&&� 9 : ���� '�+ ���� � �� !���� � �� '�+ ��� ���� �� % �� �������� ���� ���� '2+ �:1 *� �� ����� �2 %A/& ���� �� � ���

���� ��� �� ����� ���� ���� � #� � ��� ������� � �������� � ���� � � � %& ��� �� ��� ���� ������ 4������ ������������ ����� ������ �������� �� � � � �� �������

;��� ���� �;������� �� ������ 4������� ��� � ������� �� � ����� ���� ��� �������� �������� � � � ��!����� ���3��� 0�� �� ������ ��� � ��� ���� �� ��������� ������ ������ �������� � ���� ���3��� ����� ��������#��� ����� ���� � �� ���� ��� ����� ��� ����� �����!5���� #���� �������� � � ��� �� ��� ��� ���� ��� ���;��� ���� �;������ ���� ��� �������� �� � ��� ���3��������� ��� #���� #����� 0�� � ������� ���3��� ������������������� � � # ���������� � ������������ ����� ��� ���

���3��� ��� �"������ ������� ���� ��� ��������� #����� ��� ����� ��� ������� �� ���� ������� � 0��������� #������� ������� ���� #��� ��� ������������ ������� � ��!����������!����� �����" 4������� ��� � � ����� � � ��!����� ���3��� � � ������� ������� � ����������� � � ()����� � " �� �� ���������� ���� ��� � ������� ���3��� ����� ��� �� � ��� ��� 2 #����� �������� � � ;��� �����;� ������ �� � ������ $&N ������ � #��� � ���� � ������������� ������� ��� ���3��� � ������ ����"�� � ��� ��� E� ���� ���� � �������!���3�� ���� �� ��� �� ������ ��������" ����!� #� � ��� () �������������� � � � ������������� � � ��� ��������� ������� �� ����� ; .&& ������ ���� ������ �� � �� �������� � � ������� #��� � 114������� #���� � E������ Q9 � ������ #��� � E������ Q$<���� ����� ������ ��� #� ����� ����������� � #��� � � ��� �������� ������ 4�� � �������� ��� �������� � ��� E���!��� Q$< ������� �� �� ��� �� ������ �� ���� � ��� ���������� #���� ��� E������ Q9 ������ �� ������ �� ��� � ��� ���

0�2 �������� � � ������ ���� �����������

0 �������� � ����������� #��� ���� ������ ������ �� ���������� ������� � #�� ������� �� � �� ����� ������� #�������� ���� � �� ���� ��� ����� ������� ������� #������J����� � :;84!:� �� ��������� �� ����� � $ - ;�������������� ������� ���� ����������� �������� �� �� #��� ��� . 2��� 5������ ������� #��� ������� #��� � ����!������� � �������� �� � �������� �������� '��� .;+ ;�������� ������ � ��� ��� ���� ������� ��������� � �!������ ���������� ��� �� ���� �� � ����� ������� ������� �

,9, 0 2 ��������� �� ��� �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.

$���� 5� ����������� � ��������� � �� ���� ��� ����� � ��� ���� ������������ � �� :;84!:� �� ����� #��� ��� ���� �� �.N0� $ .N1 4������� �����" ';+ ������� �� ���� � � ������������ ������� � ������� ������������ ���� ���� � ��� ����!�� �� ����� ��� ����������� �#��� ����� ���� � �� ������� ����� '*+ �� ���� ����������!�� �� ����� �� � ������� ������ ����� ��������� � � ����� ���!������ �� ����� 7 ���� ����� �������� �� #��� �������� � �� ����� ������� ������� � � ���!� ��� ��������� ; ������ "�!����� ����� ���� �������� ����!����� �� � ������� #�� � ��� �� �� ������� �� � �� �� ���

'��� .*+ ������� ������� #��� ������� #��� ���� �������� ����M ���� ��� ��������� ��� �� �� ��� ' ���� ����!����� ����� ��� .*+ 0�� ��� �� ���� � �������� � �!������ �� ���� ����� #�� "����� � � � ����� ���� �������� ����� ���� ���� "��� �� �� � ��� �������� ���������� ���� �� ��� '��� .*� � ������ :+ 0��� � �������� � �� � �!� ��� ������� �� ���!��������� �� ����� ��� ��� ������� � �������� ���������� �� ��� ��� ��� � ��� � ��������!�� � ������ � � �"� ���� � ������� � ��� ������ �� �����!���� � ��� � � �������� �� ���� ������ ����� 0����� �������� ���� � �� ���� ��� ����� �� ����� � ��������#��� ������� �� � � �� � � �� ���� ������������ � �� ������ ������ ����� :;84!:�

2 )����� �

0�� ������� ���� ����� �������� �� � ������ �� ����� �������� ���� �� ��"����� � �� ������ � � ������ ���� !����� ������ ����� ?/@ 4�������� ������������� ���3������������ �������� ������ � � ������� �� ��� ���� ������ ����������� ������� � �� B������� ���� �����C ���������� ����� � � �������� ��� �������� ��� �������� �� ���!���� � ������� ���� ����� ��� �� ��������� ��� � �����# ��������� ������� ��� ��������� �� ������� ����� �����!�������� � ��� ��������� � ������� �� E���� ;�������!��������� *� ���� ;��� ����� ��� *� !��� *� ����� ���� ������ ���� "���� ����� ������� �� � ������ � � � ��!������ ���� �� ������������� ��"����� #��� ���!������!����� ����� ���� �� �������� � ����� ��������� 7 ��" ���!����� ;��� ������ ��� ��� ��� � ���� �� �2 %A/&;��� ����� � ����� � ������ �� ��� ��� ����� ��� � ��!���� ���� ��� ����� 0��� ��� ������� �� � ��������������������� #��� �� ������������� � �� #�� �� ������ �#��� �� �������� ��� � ���� ��������� ���� ��� � ������� � ������ �� ��� ���� ?%$A%,@ ;�������!������!��� *� ���� ����������� ������ �� � ��� ���� ����������� ����� �� ���� ���� � ����� ������� � ��� ?/&@ ����!������� ��� ����������� �� � � ���������� � � ���� ��������� ���� ����� ��� ���������� #��� ������ � ������?%<� %.@ ;�������!��������� *� ���� �� �������� *� !��� ���������� �� ������� ��� ��� � ���� �� ���!1����2 %A/& �� ������� ;��������� ���� ��� ���3� ;�����!��� ������� '���3� 1�������� *����� �#���������+� ���!����� �� �� ������ �� ������ � ����� � � ������� #������������ �������� �� �� ��� ��� ������ #��3 ���� "���� ��� '������ �� � �� �����+ � �������� ���� �� ���'����� �� � �� �����+ �� ��� ���� ��� ?/&@ "������ ������ � ������� ������� %!��������� �� ��� �� ���� ������!������������ ��������������� ?/&@

� � � ��� ������� ����� � ���� ������� ������� �� ��� �� ��!��� ����� � � ��������� ��� ��� ������� �� ��� �� � �!������� #��� ���� � ��� � �� ��� �������� ���� ����� ����������� ��� ����������� ���� ��� � � ���������� �2

��������� 0����� ��� ����� ���� � �� ���� ��� �����#�� ��������� ��������� ��� � �� � ��� � ������� ���������� �� � 0� ��� ��� ��� ������� ��� #�� � ��� � ����� �� �������� � �� � ;��� ������ ���� ����������� ���� ����������� � � � �������� ���� �������� ����� ����� � ��� ����������� � ����� ���� � �� ������� ����� � � ����� ���� ����� '0���� $+ �� #��� �� ����� �������� � ��� � ��� �������� ������� ���� ���� ����� ���� ��3��� ���� ��� � �� ���� ���� ������ �� ;��� ����� �� �� ����� � �������� � ����� ������ � ���� ������������� ������� � � ;��� ���� �;������ ���� �� /&N������ �� -N ������ ���� � � %& ��� ��� � � �������� #�������� ���� � �� ���� ��� ����� � �� � � ��������������� � ��� ������� ���� ���� ����� ���������� ���� ����������� ������� � �� � � ������� ������� �� � ��� ��������" ����� ���� � �� ���� ��� ����� �� ����� � �!������� #��� ��� � �� � ���������� �� ��!���3���� ����!���������������������� ��� ���������� ������������� ��#��� �� #��� ���� �� ��� ��� ������������ ������� � ��!���������� �����"� 4������� '��� ��� � ���� ��+ 4��!����� �� � �����" ����� �� � ����������6����!���������!������������� ��� ��� � ������ ��������� � ������ ����� ���� ��� ������� �������� � ��� ��� �������� � � ����!�� ��� ���� ?$D@ 0��� �� ����������� ��������� �� � � �#���� ��������� ���� �� ���� � # ���������� ����

;� �� �� ���� ����� �� ��� � ����!��� ������ ���� ���� � ��� ����� � �� ��� �� ���� �������� �� ��# ���������� � ��������� ����� ������ �� � �� ���� ����������� ����� �� 1���� �� �� ����� ��� ��������� ������� ������������� �� �� ������ ������� ����� ��� � �����������#��� � ���� ���� �������� �������� ���� �� ������5������� ��� ���� ������ ����� 0�� �������� �� �� ������ ��� �� ���� �������� ������5��� ��� ����������������� ��� ������� �� ���� ����������� ������ �� ��������� �� ��� ���������� #��� �� ���� ������������ � ����� �! ���� ���� �� ���� ������ ����� ����� ���� � �� !���� ��� ����� �� ����� � �������� #��� � �� �� ����� � ���� � ����� ��� ����� ��� ��5������ ���� ������ �����!����� ����� � � �J����� � #��� �# ���� ��# ������ ������ �� ���� ��� ����� ��� ����� ���� �� ���� *� ������ � ��������� ������� � � �� ����� �� � #��� ����� �� �� � ������ �� ����� ����� � ���� ��� ������ ����������

��� ���� �� ������� � �� �������� ���� ������� ���� ���� !���� � "������ #$� � ������������ ��%��$���� � ��� �&���� ���� ����� '� ������� � ��� ��%�� � ��� � ����� (� �� ������� � )����� *��������� �� ������ �+���� � �� ��� �� ������ � ��� ���%�� � )����� � ���� � ��� '� �� ��� �$&��� � ���%��� ���������� �

�������� K��� <� /999

�������� � $&&&� ��� ,D.A,9. 8���������� �� ���� ����� � � � ,9<

3 *���������

?/@ ��������� � � � ������� ,�� ���- ���.� "������.��� /��������� � �������� 7�# � �3� 7� /9D%

?$@ )���������� � � �������� � /99D� �0� /<$/A/<$,

?%@ =�� � ; � =������ � ���� : � �������� � /99<� �1�/&$,A/&$.

?,@ ��� ��� *���� * � �������� � /99D� �0� /-D&A/-D-

?<@ :�������� 0 � E�������� = � �������� � /99D� �0�/-<$A/--&

?.@ � ���������� � K������ = � =����� * � �������� � /99,� �2� <D,A<DD

?-@ �3������� 2 � =����� = � 2������� = � �������� � /99D��0� %/&%A%/&9

?D@ �� �����3 8 � � � 8 � K � ;����#�� � � �M 8��3� ; K '� +�"���� �� "������ ����.� 2����� ������ 0 � #�� 7K/999� �� ,-%A,D<

?9@ �� �����3 8 � � � :�������� 1 � ������� �� 0 � :������ � �2����� E � K������ � � ������� �� 4 � �������� K � 8 � K �;����#� � � �������� � /99-� �3� %D$A%9&

?/&@ ��������� � � � ���$���4�� �� ������� - ���. ��� ����%���.� �������� 7�# � �3� 7� /99&

?//@ *J���5����� * � 3� = � ��������� � � ��������� � �S��� ; �� ����� E � E����������� � � �� ������� ����. � "���� /9D$� 1� %/-A%%9

?/$@ �S��� ; � � ����� E � �T������ � � �������� � /9DD� 0�<%/A<,.

?/%@ ��������� � � � * ���� ; � �� )������ � /99-� 100�--AD9

?/,@ ��#����� K � 1��������� ; � �������� � /9DD� 0�,.%A,.9

?/<@ 2��������!������ 1 ��#���� � � *���3�� �3� E � �����%��� � /99-� �3� /$/-A/$,$

?/.@ *� ������ ; � *� ������ 8 � 7 ����3� K � ���� � � : ��!8������ � � 8������ : � � ���� ���� � � 4������ 2 � * �����: � � ���� ; � �S��� ; � �������� � /99<� �3�/9%<A/9,<

?/-@ 8 ��� : � ���� �� E � �������� � /99-� �3� %%DA%,%

?/D@ ������ � � 1 ������� : �� 5�$� )���� "��� /9.D� 6��-/,A-$&

?/9@ 2����� : � E������� 4 � �� ���� )���� /9.9� �77�..%.A..,,

?$&@ 4������ E � = ��������U���� � � 2 ������ � /���� ��%����� /9-$� 73� ./-A.$&

?$/@ ;����� � � :���3� = � :�;�������� � � /��� ������� /9D&��87� ,9,A,9D

?$$@ � �� � � 8������� : � �� ��� ��� "���� /9D%� 3�%-<A%D&

?$%@ 7��� ��� ) � ;� ��� 7 � 0����� 4 � �������� E � �����%��� � /9DD� 0� $<<A$.$

?$,@ ������� �� 7 � ������ : � ��� ��� * K � �������� � /9DD� 0� ,DDA,9.

?$<@ E����� � � � ��� � ; �� )������ / /99<� 103�/$%A/,%

?$.@ *����� : � ��� !������ � /99D� ��� /.A$$

?$-@ *�������� ; � 4����� K � ������� K � :������ � ������%��9�� /99,� �1� .$/A.$,

?$D@ ���� �� E � 8 ���� : � *����� �� �3��� E � ��������9�� /99$� ��� <D&A<D<

?$9@ ���� �� E � ����3��� : � �3��� E � *���3��� K � 8 ���� : �V���������� � � *�������� 8 � 2����� � � ��������9�� �/99&� 3� </DA<$-

?%&@ ���3��� = � �������� K � 2����� E � *������ � :�=��� ; �������� �� 4 � :������ � � �������� � /99D� �0�/9$&A/9%$

?%/@ ������ ��� 0 � ��M 8��3� ; K '� +� "���� "�� ����� 2����������� 0 � #�� 7�# K������ /999� �� $9-A%&<

?%$@ )���������� � � /��� )���� !����� /9.9� �:� $.<%A$...

?%%@ � ������ � � K����3�� � � ��M ;����� � � :������ 2 '� +��������� � ��� � ������� ,�� ��� �� #�.��.������*�� � E����� �� ������� *����� /9-,� �� /<%A/<D

?%,@ ����� ���� 7 � * �J�� 1 � ��M ��� ��� * K � ���������� 4 '�� +� �������� ��� ��� � ������ � � E����� ���������� *����� /9--� �� ///A/$&

?%<@ � �������� K *��3���� 4 � 2����� �� � � *������ �� K �#�� ���� ,���� /9D&� �6� .D-A.9/

?%.@ � �������� K � (� ������ ,�%%,�9-$� /9D$

,9. 0 2 ��������� �� ��� �������� � $&&&� ��� ,D.A,9.