Time-of-flight optophoresis analysis of live whole cells in microfluidic channels

11
Biomedical Microdevices 6:1, 11±21, 2004 # 2004 Kluwer Academic Publishers. Manufactured in The Netherlands. Microarrays and Biochips: Section Editor: Dr. Mihrimah Ozkan Time-of-Flight Optophoresis Analysis of Live Whole Cells in Micro¯uidic Channels Haichuan Zhang,* Eugene Tu, Norbert D. Hagen, Catherine A. Schnabel, Michael J. Paliotti, William Soo Hoo, Phan M. Nguyen, Josh R. Kohrumel, William F. Butler, Mirianas Chachisvillis, and Philippe J. Marchand Genoptix, Inc., 3398 Carmel Mountain Road, San Diego, CA 92121 USA E-mail: [email protected] Abstract. Optophoresis is a non-invasive cell analysis technique that is based on the interaction of live whole cells with optical gradient ®elds, typically generated by a near-infrared laser. The magnitude of the interaction depends upon the intrinsic physical properties of the cells, such as their refractive index, composition, size, and morphology. Time-of-¯ight (TOF) optophoresis is an implementation of this technique in a micro¯uidic environment. It measures cell travel times through a ®xed distance with and without irradiation from a laser beam. The magnitude of the optical force from the laser, and therefore the change in transit time introduced by the presence of the infrared laser provides a signature for the cell. By accumulating such measurements for a population of cells (typically 200±300 cells per population), different cell types, drug treatments, or biological states can be compared quantitatively without the need for external labels or markers. An integrated TOF system has been constructed and characterized. The system typically uses square capillaries with 50±100 mm internal diameter and uses a syringe-pump-based ¯ow system that generates initial bulk ¯ow velocities between 200 and 600 mm/sec. Using this TOF technique, we have been able to consistently detect signi®cant differences between normal skin and melanoma cell lines, CCD- 1037 and A375, respectively. We have also been able to measure consistent differences in a cell differentiation model (HL60 cell line with DMSO treatment). These early results indicate the potential biological sensitivity of the TOF measurement technique for cellular analysis and cancer diagnostic applications. Key Words. optophoresis, micro¯uidics, live cell analysis 1. Introduction The optical force generated on dielectric particles when irradiated by a laser beam has been extensively studied (Ashkin, 1970; Ashkin et al., 1987) and has been used to trap, transport or manipulate live cells (Ashkin et al., 1987; Berns, 1998). The magnitude of the optical force depends upon the physical properties (e.g., refractive index, composition, morphology, and size) of the particles or cells. Our technology, which we call Optophoresis, provides a quantitative approach to cell analysis by measuring the motion or change in motion of a cell through exposure to an optical gradient ®eld, e.g., a laser beam. Several optophoretic measurement methods have been developed and implemented for cellular analysis in a traditional glass slide-based platform (Soo Hoo et al., 2004; Wang et al., 2003). This paper describes a micro¯uidic-based method, time-of-¯ight (TOF) Optophoresis, to analyze cell populations. TOF is performed in a micro¯uidic channel as shown in Figure 1(a). Three equally spaced locations, P1, P2 and P3 are imaged onto photodetectors to detect the presence and position of the particles ¯owing in the channel (cells or particles ¯ow through the microchannel from left to right as shown in Figure 1). An optical gradient ®eld generated from a focused, near-infrared (NIR) laser beam is projected between the second (P2) and third (P3) positions. This NIR laser beam is focused into the microchannel along the z-axis as shown in Figure 1(b). The time for a particle or cell to travel from the ®rst position (P1) to the second (P2) is de®ned as t 1 , and the time from the second position (P2) to the third (P3) is de®ned as t 2 . In the absence of an optical gradient, t 2 will be equal to t 1 , if the ¯ow is steady. When the optical gradient is present, the induced optical forces on the particle will generally cause an increase in t 2 . Accumulation of the ratio t 2 =t 1 for a population of cells provides a characteristic signature for that population. A low power illumination laser beam is also generated near *Corresponding author. 11

Transcript of Time-of-flight optophoresis analysis of live whole cells in microfluidic channels

��������� ���������� ���� ������ ����� ���� ����� �������� ���� ��� � ������ ���� �� !�� "� ������ �

����������� � ������ ��#�� ��� $�� ��� %�� ������� &'(��

������������ ����������� ������� �� ���� ���� ��� ������������� �������

�������� ���� ! "���� �� #��$��� %& ���� ��������� �& '����$� ������ (& )������ ����� '����� )��� �& #���� (��� *& +������ ����� �&,���� �������� ����������� ��� )������ (&��������-������. /��& 0012 ����� �������� *��� '�� %��� �� 13434

5'�

"����6 �7���8������.&���

�$������& &) �)���� � � � ���*���� ��� �� ���+ � �����,�� �� � �� �� �� �� �� ���� ��� �� ��� ���� �� �� � �) ���-������ .�� � +)���+ -����� �� �+ � ����*�������� � ��� !����-�� ��� �� �� �� ���� ��� ��)��� �)�� �� �� ��� �� )�+ ���)��)�� �� �� �� �� � ��� � ���� ������ ��� ����/� ���)� � ���� �'�� ��� ���)���-+� !���*��*0�-� 1!&23 �) �)���� � � ����)���� � ��� �� �� �����,�� �� � �����0����� ���������� � 4 ��� ��� �� ���� ��� ����-� � ./�� �� ���� �� � ��� �� ��� ������� ��� ���� � � �� ����� !�� ��-�� ��� �� �� �) ��� ��������� �� � ��� ��� �������� �� ����-� �� ��� � ��� �� ��������+ �� )�� ���� �� �� �������� � �� )������ � �-�� ��� ��� ����� �+ ������� ��- ��� ��� ������ ��� � )�)�� ��� �� �� 1 +)���+ ����5�� �� )�� )�)�� ���3� �������� �� +)� � ���- ��� ��� � �� ����-��� � � ��� �� ���)���� ,��� � � ���+�� ��� �� ���� ��� �/ ���� ��� �� ���(�� � �� �� �-�� �� !&2 + �� �� ���� ��� ��� �� ��� ������ ���'��� !�� + �� +)���+ � � ,���� ��)����� �� � 6������� �� ���� ����� ����� � � � +���-�*)��)*�� �� 0�� + �� �� -����� � ��� ����( 0�� ����� �� �� ���� ��� ��� �����7 ��� 8 ��- �� !&2 �����,��� �� ���� ���� ��� � ��� � �� + �� �� �-��.��� ���������� �� ���� ����� (�� ��� ������� �� ��� � 99%*��5: ��� �5:6� �� )�� ���+� ;� ���� � � ���� ��� � ��� ������ � �� ���������� �� � �� �������� �� ��� ���� 1<=�� �� ����� � %#& ��� ��� 3� !�� � ���+ �� � ������ � �� )� �� ������-��� �� � ��� + �� �� !&2 ��� ������ �����,�� �������� ���+ � ��� ������ ���-�� �� �))��� ��� �

+�� �����& �) �)���� � � �����0����� � ��� �� ���+ �

4& /�����������

��� ����� ����� ������� �� ��������� ������� ����

�������� �� ��� ��� �� ���� ���������� �������

�������� ���� ������ �� !� ��"�# �� �� ���� ���� ��

���� �������� �� ������� ��� ��� ������� �� !�

��"� $����� ���"#! ��� � ������ �� ��� ����� �����

������� ���� ��� ������ ���������� ��! !� ���������

������ ������������ ������� �� �� ��%�# �� ���

������� �� ���! &�� ������� �� ����� �� �

&������������ �������� '��������� ������ �� ��

����� �� ������� ��� ������ �� ��� � �� ������ ��

�� ����� � �������� �� � ����� ������ (��� �! !�

��� ���! )���� ������������ ���������� �������

��� ���� �������� �� ���������� ��� ����

����� �� �������� �� ����*���� ������ �)��

+�� �� !� ,��- .� �� !� ,��/#! ���� ���� ���������

�����0�����*���� ������� ����*��*0� �� ��&1#

&������������ �� ��%� �� ���������!

�&1 �� ��������� �� �����0����� ����� � �����

�� 1� ��� ��#! ����� �'�� ����� �������� 2�� 2,

�� 2/ �� �� �� ���� �������������� �� ������ ���

�������� �� �������� �� ��� ������� 0���� �� ���

����� ���� �� ������� 0�� ����� � ��� ����������

���� ��� �� �� �� � ����� �� 1� ��� �#! �� �����

������ (�� ������� ���� �������� ���*�������

�345# ��� ��� �� ���6����� ������� ��� ������ �2,#

�� ����� �2/# ���������! ���� 345 ��� ��� �� �������

���� ��� ���������� �� ��� �*��� � ����� �� 1� ���

���#! ��� ���� ��� ������ �� �� �� ���� ���� ��� (���

�������� �2�# �� ��� ������ �2,# �� ��(��� � ��� �� ���

���� ���� ��� ������ �������� �2,# �� ��� ����� �2/# ��

��(��� � �,! 4� ��� ������ �� � ����� ������� �, ��

�� �'� �� ��� �� ��� 0�� �� �����! .��� ��� �����

������ �� �������� ��� ������� ����� ������ �� ���

������ �� ����� ���� � ������� �� �,!���������� �� ��� ���� �,��� ��� �������� �� ���

�������� ������������ �� ����� ��� ��� ��������! �

�� ����� ��������� ��� ��� �� �� ������� ���

78����������� �����!

44

��� ������ �� ��� ���������� �� ��� 0�� ����������

�� ��� ��� ��� ������� 0���� �� ��� ������ �� ���

����� �� ���� ��� ��� �� �� ��������! 4� ���

��� �������� �� 1� ��� ��#� ��� �� � �� �������� ����

�� , �� �� � �����! 3��� ��� ��� ��������� ���

���� ��� ������ �� �� ��(��� ����� ������ �� ���

������ �� �� ������� �� ��� 345 ��� ��� ���� �.

��! . �� ��� �����#! 1� ��� ���# ����� ��� ������ �����

��� ����� ����� ������ ���� �� �� ��� �����*

�����# ������� �� �� 0���� ������ ��� �����0�����

����� � �� �������� �� 1� ��� ��#!

)���� ��� ����� ������ (�� �� ������� �� ���

��� ���� ��� ����� � ��� ����� ���� ��� ���

������ �� ��� �*���� �� ��� ��� ������ ������*

���� ������� ��� ������ ������ ��� �9� ���:

��,�

��,� ������ ������ � �� � ���

��

��� � �� ��

� ��

���

����� � �� ��� �� ������ �������� �� ��� 0��

���������� � �� ��� ��� �� ��� �� ����� �� ��� �������

�� ��� �� �,����, �� ��� ��������� �� ��� �� � ��� ��

��� 0�� ������� � ����� � ������ ��� �� ��� �����

����� �� ��� �� �� ��� ��� ��� ��� ��� �� ���

�� ����� ����� �� ��� �'���! ��� ����� ������ ��

������� ��������� ������ �������� �� ;����� ���

��� �� �� ������ ���� ��� ;�����%�� <����%*

=�� ������ �;<=�# �;������ �� !� ���,#! 1� ��� ,

����� ��� ;<=� ������ ����� ������ �� �� ����

�� ����� ����� � ��� ��� ������ �������� �� 1� ���

��# �� ��#! ��� �������� ������ ��� ����� �� ���

��� ��� �� ��� � �� ���������� �� ��� �� �� �� ���

�� �� 0���� �� ��� �*��� ���� �� �� ����������

��� ��! ��� �� �� ���������� �� �� �������� �� ��

�������� ���� ������ ���� ��������� ������ � � ��

�!/" ���������� �� ���� ���� ��������� ������ ���

�� �!//! ��� ����� ����� �� ���� ���������� ����

������ ������ � �� � � �� �� ������ ����� � ��� � ��! ��� ��� ��� � ��� ������ �� ����������

�� � ������ ;����� ��������� ���� � ����� ��

�� "�" ��! �� ��� ��� ������ ��� �����6�� ��� �� ��

��& 4& ������������ � ��� ������������ ��� ��� ����������� ���������� �� �! ��� �" ��� �#���� ��������� �� ���� �� ������� ���������� ������� �� � ������� �� ���� �� ������ ��� ��� $��� ������� ���� �� ��� ������ ��!� �� ��� ��� ��� ���� ��� �! �� �" �� �,! %� � ����� &������� $���&�������� ��� � ������ ����'������� ����� (��� �� ��)����� (��*��� ��� ������ ��!� ��� ����� ��"� ��������� %� ������������ ����� (��� ������ &�������� ( � ��* �*�� ����� (��� �� ������ ��� ��� �������� +�*��& ����& ��� ������ � ��� ������������� �(� �������� ����� �*��� ���� ����� ���� (��,�� ���� ����� ��� ������� ��� ������� �� ���� �!

43 -���& �� ���

��� *��� ���� ���� �� ,- �� �� ���,#! ��� ���������

��� �� �� ��� �*��� ���� ���� �� >!> �� �� ���,#!

$��� �� ���� ��������� ��� � ������ �� ��� ����� ��

����� �� �� ��������� �� ��� ����� �� ���������

���������� ������� ��� ������ �� ��� ����������

����! 4� �� ������� �� ��� ��� ����� �� ��� ������

�������� �� ��� �� ���� ��� ������ �� ��� ;����� ���!

.��� ��� �� �� �������� ��� ��� ���� ���� ���

�� �� ������ ���� �� �������! ��� � ������� �� ���

��� �� �� ������ �� � ����� � ��� ���� ��

��� � � �������� �� 1� ��� ,!

4� �� ���� ���(��� �� ���� ������ ��� �'����� ��

������ ��# ��� ��� ������ ���� �,� ������ ������ �������� ������� ������� ����! +������� �� ��� �����

����� ������� ���(������ � �� ��� ������ �� ��

������ �� �, �� �� ��(����� � �� ��� ��!����������� ���� ��� ����� ������ ������ �� � ���

��� �, ����� ��������� ��! 1� ��� / ����� ���

������ �� ������� �������� �� ��� ��� ���� ��,������! ��� �����! )���� ��� � ������ �� ��� ����� �����

�� ���������� �� ��� ����� �� ��� ������ �� ��� ���

����� �� ����� �� � �� ��� ���� ��,���� �

��������!

4� ��� ���������� ���������� �� ��������

�������� ��� ��� ���� ��,���� �� ������� ���� ���

� ������ �� ��� ����� ����� �� ��� ��! ���������� ���

������� ��� ���� �,��� �� �� � ��������� �� ���

��?� ��������� ���������� �������� ��������� ������

������������ ������� �� �� ��%�#� ����� ��� ����

���� �� �� ����� �� ��� ���� �� ���������� ��

���� ��������� � ��� ���� �� ��� ����������! ��

����� ����� �� ��� ����������� �������� ������ ��

������ ����� ����� �� ��� �� ��������� �����

������� ���� ���� �88@*��/�# �� �����

��/�>� .=��>� �� .=,AA# ���� +<A� ����

�������� �� ������ ���� @=)&� �� ����������

�2)# �� ����������������� �2==�# ����! ���

������ ���������� ��� ������� ������ �� ��� �&1

���������� ������'�� � ���*���� � ����*��

����� ������!

3& �������� ��� �������

�� ���� ����� ������ ������� ��������� �&1

���������� �� ���� ����������� � ����� �� 1� ���

-�#! ���� ��������� ����������� ��� ��'�����

���������� ��� ��� ����������� ������� ��������

��� �������� ������� �� �'��������� �� ��

��������� �������!

3&4& ����������� ������ ��� � �.� ��� ���� ���� �����0����� �� ������ ������ ��*

������ �� �'���� ����� ���� ������� �2��������

4��!# � 0����� ������ �� �&1! ��� ������ ��

�����0����� ����� ������ �� >� �� ���� �� ,�9

,> �� ����� ���� ��� �'���� ����� ���� �������

��� >�� �>� �� ��� �� ������ ���������� �4@#! �

���� �� ������ ����������� � ������������ ��

� � ,���A �������B�� ���� ��������� ��� �� ���*

������ �� ��� ����������! � ������ ����� � ���� ��

���� �� ��� �� ���� �������� ���� ��� �������� ��� ��

��� ����������� ���� ���������� ��� ��� ���� ���

���������� �� � ������� 0�� ���! ��� ��

��& 0& .�������� ���������� (���� �� �#������ � �� ��� �,��� ���������� ������� ������ � ����� �*��� ��� ����� �*�� �� ������������ ��� ������� ����� �*�� ���� ��� ��� ��� �������!

��& 3& � ����� ����� ������ ������ � �� � � �� ��������� ����� � �� � � �� �� � ���� ���������� ( /01� ��������&��� ���� �� (� � ������ �2�� �������� ����� � ���� *��� ���������� ������ � � � ��"3 ���������� ( ����� *��� � ��������������� ��� � ��""�� ��� � ����� ���� �� ������� ( �� ���� �����/������� ����� (��� *��� 323 �� *������&��! �� ��� � ��� ��� ������� ��� ��������� ��� ������)�� *���� � ��� /�������(��� �� ��� ���, ���� ����& ��� � ��� ����� 4��� ���� ������������ �� ��&��� �!

����'�'���&�� � �� ������� %������ � 0��� 5���� 6���� 40

��������� ����� ��� �&1 ���������� �� ����

������� ,�� �� A�� ��B� ������������ �� ��� 0��

��������� �� �!,> �� /!� �B�! ��� ��� ������� ��

���������� �� ��� �� ���� �� ���������� �����*

�����! C��� ��������� �� ����������� ��� ����

�� �6����� �� ���� ��������! ��� ������ �� ����

0����� �� ��*������ �� ������ ��� �����'����

�����������!

3&3& ����� ������1�� ��� �&1 ��������� ������ �� 1� ��� -�##� ��� �����

������ �� ������� ���� ��� ��� ���� ��� � ������

������������� ��� ����� ��!A .� "�" �� ����� ���

���� 8�������� 4��!#� ������ ��� ��� ������ ��%�! ���

��� ����� �� �� ������� �� ���� �� � �� ����

��� �<�� �� !� ���>� ���A <�� �� !� ���A#!

)���� �������� ������ 0�� ����� �� ������

��& 9& ��� %� ����&����� ����(�� ��(������ ����� � ��� ����������� �(� � ����� ����� ��������� � ��� ����(�� ��(������ ����� � �������������� ����� ��� �*� �����&���� ����� ���� ���� ��� �����&� ��� �#���� �� ������ 4��� ���� ������� 667 ������� �� ������ �������������� ������� ���������� ���&������ ��� ����������� ���� ������ ��� �� ����� �� ���&�� ���� � ���, ���� �� �� ���� � 7������� �!

49 -���& �� ���

���(� �� ������������ ��� ����� �� 0���� ��

����� ���� ��� ��������� �������� �� ��� �� �� ���

����������� ���� ������ ����� � ��� ������ ��

���� �� ����� ��� ��� �! ��� ����� ������ (��

�� �� ��� ������� ����� ��� �����! ���������� �� ��

�������� �� ������ ��� ����� ��� ��� ��� ������*

���� ��� ��� ��������� ��������� �!�!� ��� ��� ������

�� ��� �����0����� �����! �� ������ ����� �� ���

���� ��� ��� �&1 ������ ��������� ������ ���� ��

����� ������ ��� �A/> ��# ���� ������ ��� ������

����� ��������� ��� ���� ��� ������ �� ���

���������� �� ����� �� 1� ��� �#! 8�� ������

������� ��� ��������� �� �� ��� �� ��������! ����

��������� ��� �� ���� ��� �� ��'�������� ��� ���

������������� �� �������� ��� �� �*��*����� ����

�)35# ��� ������ ���������!

� �������� �� ��� ����� ������ �� ���� �&1

���������� �� ����� �� 1� ��� -�! ����� �� ���

����� �� ��� ���� ��� ��� ����� � ��� �'���

�����! &�� ��� ������� ��� �!A .� "�" �� ��� �

����� ������������� ��� �� A/> �� ����� ��� ��� ���

���������! ��� ����� ��� ������� ������ ��� ��

������ ��?� ��������� �������� �� ��� �*���! $���

���� ������ 88@ ����� ��� ���� ��������� ��

����� ���������� � �����! D�� ���� ������ ��

-�� ��� /�� �� (��*��*����! ��� ���������� ��

������ ��� ����� �� �� �� ���� �>�� ��(�����

���� ��� ��� �� �� ����� �� @������� �! ��� ��� ��

��� ���� ������ ��� ���� ����� �'�� ����� �A�9

�> �� ������9������ ����� # ����������� �������!

��� �� � �� ��� ����� ���� ��� ��� �� ��0�����

��� �� ���� � �� ����� �� 1� ��� >! @������� � ��

�� � �� �������������� ���� � ������ ��������

����� �2@�>>� ������� 4��!#! .��� �� �����

��� (��� �������� �2�#� �� �������� ��� ����� ��

��������� � �� ������ @������� � �� ����� ���

������ �� � �� �������! ��� ��� ����� ����������� ��

��� ������ ���� ��� ������ �� ���� ������ �� �

������ ���� ��� ����������� ������?� ������ �� ���

���! ��� ��� ���� �� �� � �� ����� ���� ���� ��

����� ��� ������ �2,# �� ��� ����� �������� �2/#!

���������� ���� ������ �� �� ����� ����� � ���

���������� ��� @������� � �� ������ �������

��� ������� ��� �� �� �, ���������� � ����� �� 1� ���

>�! 3��� ��� @������� � �� �� �� �������� �����

������ �������� ����� ��� �� ��� ����� �������

�������� � �� ���� ��� �� ��� ����� �����������

������� �� ��� ������ ���!

3&0& %��� ��:�������� ��� ���������� ������ �&1 ������ �������� �� ��� ���� �1� ���

-# �� �������� ��� ������� ��� ����� ����������

����� ����� � ����� ���� ���!#� �'����� ��� ��������

�� ��� �� ��%�� ��� ���������� ��! � ��

�'�������� ��� �3���� 4���������� 4��!� @�E*A�,-D#

�� ���� �� ���� ��� �������� �� �� � ���� ,�� F

�����B� ���� �, ��� ���������! ���� �� ���(����� ��� ���

�&1 ������������ ���� ��� �� 0�� ��������� ��

,��� A�� ��B�! ����� �� �� ������ ����������

�������� ��� ������� ��� �������� ������� ��� ���

����� �� ���������� ������! 4� �������� ������

���������� ������� ����������� �� ��� �������� �� ��

������ ��� �� �'�������� ���!

� ������� ��� �� �� ���� ��������� ����

<�G4D.� ��� �� �'�������� �� �����! &���

������ �� �� ����� ����� � ��� ���������� ��� ���

��� �� �� ��� ���� �� ������ ��� ������ ������� ����

��� ��������! � ���B��� ��������� ������ �� ���� ��

���� ��� ����� ��� ��������� � ����� �� 1� ��� >� ���

@������� �� ���� ��� �� �� �, �� �� ������

�������� �� ��� �������! � ����� �&1 ����������

������� ,��9/�� ��� ��� ��� ���� ��������! ���

��� �� ��������� ������� ������ �� ��������

�������� ����� ��� ��� ����������!

��� ����� ������ �� ������ �������

���������� ���� ��� ���������� ��! 1�� ������

��� ����� �� ��� ���*����� ������� ������� ��

��� ��%� �� ��� �� � �� � ��� ����� �� ��� ��������

������ �����! C��� ��� 0�� ����� ���������� �����

��# �� ��� ����� �������� ������ ������ ������ ��%�

���������� �� �� �������! $� �������� �� ��

������� ���������� ��� ��� �� �� �� ��������

����������� ������ �� ����� ���� ��� ��� �� ���

����� � ��� ���������� �� ���� �����(����� ������

������� ����! ����� ����������� ������ �� ��6�����

����� ��� ����������! ���������� ��� �&1 ������

��� ��� ���� �� ��6��� ������� ������ ���� ��

��%�� ��������� ������� ������� �6���� ������� ���

���# �� ������ ��� ������� ��������� �������

���������!

0& *�����

0&4& /��������� ���$��������� �&1 ���������� �� ���� ��� �� '����������

��������%� ��� �� �������! .� ��� ���� ���

��������� ����� �� ����� 2) �� 2==�� ���� $� �

<�������� 4��! �� ������ ��� ����������! $��� ����� ��

���� ��� � ��� � ������� �� > �� ���� ������

��������� �� ��%� �� �!�� �� ���� 2) ����# �� �!� ��

���� 2==� ����#! ��� 2) ���� ��� ��������� �����

�� �!>�� ���� ��� 2==� ���� ��� ��������� �����

�� �!-"! ��� ���� ��� ��������� ����� ���� ��

������%�� ���� ���������� ����� �� �!//#! ��� �����

����� �� ��� 2) ���� �� � �� ��� �� ��� �����

���������� �� ��������� ����� ������� 2) �� ����! ���

������������ �� ��� ���� �� �,��� ����������� ��

����'�'���&�� � �� ������� %������ � 0��� 5���� 6���� 4;

����� �� 1� ��� A �� �� �����������! ��� ����������

������� ��� ��� ����� �� ���� �������� ���� ��� �����

����� � ������ ���������� � 2) ���� ���� � ��

�,��� ��� ��� �1� ��� A�#! �� ������� ������� ���

�,��� ���� �� ������� �� ����� ����� ��� ��� ��

��� ��������� �&1 ����������� ���� > �� 2) ����

����� ��������� ��� ������� ��� ������! 1� ��� �

����� ��� �������� ��� ����� ����� � ������� ��

�,���� ����� �� ���������� ���� ��� �������� ��������

�1� ��� /#!

0&3& ��������� ��� ������������� �� ����4� ����� �� ��������� ������� �&1 ����������� ��

������ ���� �� ����������� �� ���� ���� ���� �� ���

������� ����� �������� �� ���*�������� ���

����� ���� � ����� �� ����� �������! 1� ��� "

����� ��� �&1 ���������� ������ ���� ����

����� �� ���� �;��� �� !� ���/ 8������ �� !�

���"# ������� �/�>� .=��>� .=,AA �� ����

���� �� ���� 88@*��/�� ������� ���� ���� ������

������! ��� �/�> �� ��� �� ������� ���� ������� ����

��& ;& ��� ���&� � ��� �� ����� ���� ��� ���,� ��� ������� ��� ������ ��&�� � ��� 89 �� �#���� �� ����� ��� (� ���� �� ���������� ��� ���,���� �� �� ���� � 7������� � �� ���� ��� � ������ ���� *��� ����� �#���� � ���� ������������ *����*�� % ���� ���� )��� ����� ����� *����*���� (� ���� �� ��� ��*�� ��� � ��� ������� ����� �(� � ���� *������� ��� ���(���� 7������� � ��� �� *��� � ���� ����� ��� ����� �������� �� �! ��� �" ������������� ��� ������� � � ���� ���� ����� �������� ���������� ��� ������ � ������������ ��&�� �������& 7������� � ��������� ��� ��� �� ��&��� �� ��������� ��� ����� ���� ������ ���� �� ��� ������ *��� ��� ������ � ���� ������� ���&� ������ � *��� ��������������� *����*� �� ��� ���,� 4 ��������& ��� *������ ��� ��������& ��� ����� �������� ��� �� ��� �, ���������� ��� (� �(������!

4< -���& �� ���

�� ��� �����! .=��> �� .=,AA �� �������

���� ��� � ������ �� ��������� ������ ��

�������� ����� ���! ����� �� ���� ����

������� ���� ��� ������� ���� 8����� 8�������

�=���� G�# �� �������� �� D � �������

������� ������ �=���� G�# ����������� ����

��H ��� ������ �����! ��� ��%�� �� ����� �� ����

�� � ���� �> �� ,, ��! .� �� ��� ������� �����

����� �� ���� ������� +�>��!= � +�A��!= � =@�*

=$*,/�� =@�*=$*-/>) �� =81*�! 8� ���

+�>��!= �� +�A��!= �� ������� ���� �6����

���� ������ �� ����� ����� �������! ����� �� ����

�� �������� �� ��� �� ������ ��� �� ���� ������ ��

��� ������ �� ������*����������� ���� �� �� ����

������� �� ���� �! =@�*=$*,/�� =@�*=$*-/>)

�� =81*� �� �� ���� ������� ���� ������� ����

������������ �� ��� ����� �)��� �� !� ���A#!

����� ����� �� ���� �� �� ������� ���� ���

������� ���� 8����� 8������� �� ������ ��

@������?� ����(�� D �?� ����������� ���� ��H

��� ������ ����� �� �!�� � B� �� ������! ��� ��%��

�� ����� ����� �� ���� �� � ���� ,� �� /� ��! ���

������ �� ��� �&1 ���������� �� ����� ����� �� ����

�� ������%�� �� 1� ��� "�! $��� ����������� ���

��& <& ��� ����������� ������ �� �*� � �� � (���� �: ��� �11% (��� 9�� ��������� ��� �,��� ������(������ � (��� � �� � (����� �(�1��� ������ � �,���! ��� ����� (��� ��� ��� ������ � ��� ����� ��� ���(��� �(��� ��� ����� (��� ��� ��� ���� ������ � �,���! %(��� "22 (����� ���� ,��� *��� ��������� ��� �: (���� ���� � ��������� ����� � ��9; *���� �11% (���� ���� � ��������� ����� � ��<3� ��� ����� ������������� ����� (���� �� ��'������� *���� ���������� ����� � ��""�!

����'�'���&�� � �� ������� %������ � 0��� 5���� 6���� 4=

���� ������� �� ���� ���������� ������: ��� ��������

�� ���� ��� ��� �� ��� �,��� ���� ��� ��� ���*

�������� �� ����!

0&0& ���<> ��������������� ?��� %�' ���������+<*A� �� �� ��� ��� �� ������� ���� �������

���� 8����� 8������� �=���� G�#! 4� ��

������������ �� ��� ������� ���� /A*���*��

8����� ���� ���� ���� ������������ ������!

+<*A� ��� �� �� �������� �� ������������ �� ���

��������� ����� ���� �������� �� � �� �!>H

��������������� �@=)&#! &��� -� ���� ��������

������ ���� �H @=)&� ����� ��� ����������

������� �� ��%� ���� ���� �/ �� �� �� ��� ��

������� �� ��� ���� �� ����� �� �� ��� �������!

����� � ������� �������������� ���� ��� ����� ����

���� (�� �� ����� ��� ����*��������� �8���� �� !�

���"#� �&1 ���������� �� ����������� ���� �� ��

������ ���� ���� �� ����������� � ��� -� ����� ����*

��������� ������� �� ����� �� 1� ��� "�#! 4� ��������

��� ���������� ���� 0�� ��������� �� -� ����

@=)& ������ +<*A� ��� ����� � ������� �� ���

��������� �� ������� ������ 8@��� ��������

��� �������� ������ ��������������! ����� ������

������� ��� ���� ��������� ����� ��� �&1 ������*

���� �� �� ��������!

9& %���������

1��� ��� ���������� ������ ��������� ����� �� ���

���� �� ��� ��� �� �� �&1 ����������� ��

��������� �� ��� �� �� ��������� �� ���� ����

���! ��� �������� ���������� ���� 2) �� 2==�

���� �� ������ ��� ��������! ��� ������ ����

����� �� ����� ������� ��� ��� �&1 ����������

������'�� �� ��������� �� ��� ���� ��� �� ��������

���� ����� ���� �� �� �� ����� ���� ��������� ��

���������! 4� ����� ������������ ��� �� ��� ���

������� �� ��� �� ���� �� ��'����� �� ������ ���

���� �� ����������� ��� ��� �� ��������!

��� ���������� ������� �,��� ����������� �� ���

����� ����� �� �������� �� �� ������� ��!�!� � �

���� � ����� ����� �� ������� ��� ��� ������ ��

���� �,��� ������� ��(����#! ���� ������� ����������

�� �� �� ���� �� ��� �������� �1� ��� /#! ����� �� ��

�������� �� ������ ��� 0�� ����� ������ ����� ���

����������! ��� ��������� �&1 ���������� �1� ��� -#

�� ������� �� ���������� ����� ����! 4� ��

������� ������ �� ��� ��� ����� �� ��� �������

��������� �� ��� ����� ������! 4� ��� �������

����������� ������� ��B�� ��� ���� 0�� � ��

����� �� ��������� ��� �� ����� ����� ����

�������� ������� �,���! ��� �� � �� ��'�����

������ ��������� �� �� �������� �� �� ��� �����

��� ��!�!� /� > .# �� ����!

� �� ��� ����� ��� ���� �� ���� �� �&1 � �� ����

��� ���� �� ����� ��� ��� �������! ����� ��� ����

������ ������� �������� �� ������ ��� ������ �� �� �

����� ���� �� ���� ���! &�� ������ ����� �� ����

���� ����� �� ���� ����0� ��������� �� �������� ����

�.� �� !� ,��/#! .� �������� ��� ����� ���

�������� �� ������ ���� ��� ��! ��� ��� �� �����

���������� ����������� ��� ��� �� ��� ��� ����� ���

�&1! �� ���� �� ��� ��� �������� �� ������� �� ���

������� � �� ��� ��� ��� ��� ����� �������

���� ���� ������ ��� �������� �� ��� ���! )������

���� ����� ���������� �<�� �� !� ���A <�� �� !�

���>� ���A �� ���� ��� ��� ������ �� �� � ����� ���

���� �� ��� ���� � �� ��� ������� �� ��� ����� ���

����� ������� �� ��� ���� � ��������! ��� �����

�� ����� ��(������ �� 8������ ������ ���� �8+&#

��� �� <�� �� ! ����A# ����� ��� ���H �����

��(������ �� �������� ���� �*������ �������� ��

����� ������� �� ,!A� ��� .B��, ��� ��� �

����� �� �� ",� ��! 4� �&1� ��� ��� ����� ������� ��

���� /!�� ��> .B��, �� ��� �������� ���� �� ���

������� �� ������! ����� ��� ��� �������� �� �� ����

��� �� ��� ����� �� � �� ��� ��� �� ���� ��������!

���������� ��� �&1 ���������� ������'�� ����� ��

��� ��� ��� �� ����� ���� ���� �� �� �� ��� �����

��� �� ���� �� ��� ������!

� �� ��� ����� ��� �� ��� ��� ���� ���������� ��

��� ��������� ����������� ���� ��� �� ��� �� ���

�������� ����! ������� ��� ������ ����� ���

����� ���� �� ��� ��� ��� ��� ��� ��� 0�� ����� �

��� ������ �� ��� �����0����� �����! )��� �� ������

��& =& ��� ����������� ������� �� 9 �� �: (���� ����� �������.�= ����� �*���� ��� ����� (��� ��� ��� ������ � ��� ����� >������� ���� ������� �(��� !22 (����!

42 -���& �� ���

��& 2& ��� ��� ����������� ������ �� ����� �������� ���� ����� �%"89 51��9 ��� 51!??� ��� � ������ �,�� ���� ���� �667'�2"8�� ��������� ���� �� �� ����$���� ��������� ���� �(��� *���� �� �� ���������� � ����(�� �,�� �������� ������� �(� ��� ����������� ������ �� (����������� ���� ����� @�98;�1& @�?�8�1& 17%'14'!"� 17%'14'<"9: ��� 16�'8� ��� ������ ���� �� �� ����$���� ��������� ���� �(��� *���� ���� ���������� � ����(�� (����� ������� ��� ��� ����������� ������ �� � �������� � ��������� @0?2 ��� @0?2 ������� *��� 71:� �� <2������ �� ��� ����� ������������ ��� ����� (��� ��� ��� ������ � ��� ����� ��� ���(��� �(��� ��� ����� (��� ��� ��� ���� ������ � �,���! >������� ���� ������� �(��� !22� "22 �����!

����'�'���&�� � �� ������� %������ � 0��� 5���� 6���� 41

�� ��� �� �������� ������ �� ��� �������� �� ���

��������� ��� �� ����� �� 1� ��� ��##! .� ��

�������� ������ ����� ����������� �� ����� �����

�� ���� ������� ������� �� ������ ��������

�������� 0�� ����� ��� ��� ���� ������� �� ���!

���� �� ���� ����� ��� �������� ������� ��� �� ����

��� ����������� ������ ����� ����� ��� ����������

�� ����� ���������� ������ �� ��6�����! 8�������� ��

��� ������%�� ���� ������ �� ���� ���(������ ��

�� ������������! 1����������� �� ����� �� ������

��������� �� ��� ��� �� � ����� ��������� ���������� ��

�� ��6����� ������ ����� �� �� �������� �� ��� (���

�������� �2� �� 1� ��� �# ���� �������� �� �� ���

������ ��� ����� �������� �2/ �� 1� ��� �#! ����� ���

������ ��� ������ ��� �� ��� �� ������� �� ���� �

������� ���� ��� ������ �� �������� ���! � �� ����

�������� ������ �� ���� ���� ���� ����� ����

��� ���������� �������! ��� �� ���� ����� ��

����� ���� �� �� ������%�� �� ������ �������� ���

�� �������� �� �� ��������� �� ������ !

4���������� �� �� ���� ���� ���� ���� ���������

�� @������� � ������ ������ �� 1� ��� -��## �� ���

���������� �����! 4� ���� ���� ���� ��(�����

������ ��� �� ��������� ������� ��� ����� ��������

��������� �� �� ������ �� ��� ��� ��'����� ��������

������� ��� �� �� ���������!

��� ��%� �� ��� � ��� �� ��� ������ ��������� ���

��� �&1 ���������� �� ��������� ��� �� � ����� ��

��� ������� �,���! 4� ����� ��� ����� ����� ��

������� ��� � �� �������� ����� �������� ����

�'�! 1�� ���� ���� ���� ���� ��� ��� ���������

����� ������ �������� ���� ��������� ����� ��

������� �# �� �� �� �� ��������� �� ���� ��%�

����������! +������� � �� ������ �� �� ������*

���� � �� �� �����! ����� � ���� ��%� ����������

�� �,��� �� ���� ���(��� �� ������ ��� ���� ��

��������! $� ������� ��� �,��� ��� ��! ��%� ���

���� �� ����� �� ��� ��� ����� �� ��������� �,������������� ���� ��� ��%� �� � �� �� ��������!

����� �� ����� ��� ����������� �������� �������

��������� �� ����� �� ��������� �� �������

��������� �� ����������� ����� ��� ��%�!

;& ���������

4� ���� ����� �� ��� ����������� ���� ������'�� ���

��� ���� �� ����� �� �����0����� �����! ���

����� ������ ���� �� ��� �&1 ���������� �����*

�� ��� ��� ������ ���������� �� �� �� ������ ��

0��� �! !� ��� ��������� ������ ������������ ������� �

�� ��%�� �� ������� ��� � �� ��� ��� ������ ����

����� � �����0����� �����! @���������� �� ��� ������

����� �� �� �� ������ ��������� ���������� ��

������ ����������� � ��� ���� �� ����������! 1���

��� ���������� �������� �� �� ��� ������������

�� ��� �������� ��� ����� ����������� �� ��������

���� ���� �� ���������� ���� ��� ������ ����

������� �� ���� ��! 1������� ��� ���������� ��

��������� ���� � �� ������ ���� ������� ����� �����

�� ���������� ���� � �������� ��! ���*��������

�� ��� ������ ��! ��������!

8������ �� ����� ���� ����� �������� �&1

���� ��� ��'���� ���� �� ���� ���� ��� ���! ����

���*����������� ���������� �� ��������� ��������

��������� ����� � ������ ���� ���� (�� �����

������� ��������# ��� ������� �����! ��� �����*

0����� ������ �� ����� ������ �� �� ����

���������� ���� � � ����������� �� ��� ������ �&1

����������! ��� �����*0����� ������ ���� �� ��

���������� �� ��� ������ ��� �� ��� ����� ����

�� ��� ������! 4� �������� �� �� ������� ��� ���������

����� ������� �� ������� ��� ���� ����������

����� ���� ����� � ��� ��� �� ��������� ���� �� ������!

.��� ������� ���������� ������� �� ������� �� ����

���� �� ����� �� ����� ���� ������ ������������ ��

��� ���������� ����� � ���� ����� �� ��� ����� ���

������� ���#� ��� ���������� �� ��� �&1 ����������

���� �� ������� �������� �� ����� ��� ��� �� �������

�������� ���������!

��@��?�������

.� ���� �� ������� � ��� �������� �� ����� 5�����

�� @�� � )� �� ������� ���������� ��!

*���������

�! �! ������� 2����� 5����� <������ ��� �>A �����#!

,! �! ������� I!=! @%���%��� I!D! $6������� �� )! 8��� &�����

<������ ��� ,"" ���"A#!

/! �! ������� I!=! @%���%��� �� �! J���� 3���� 55�� �A� ���"�#!

-! =!.! $����� )������(� ������� �:>� A, ����"#!

>! )!I! 8����� 1!.! 5�������� 5!D! ; ���� �� 5!8! ;��

2�������� � �� 3���� ������ �� )������� �� C)� :6� ,->"

����"#!

A! I!3! 8������� J!=! +�6%�� �! ����� 2! 1������ =! $���������� )!=!

)������� � )!�! 5������� � �� 1!=! =������ 4���������

I���� �� 8���� :6� >�� ����"#!

�! @!I! ;���� )!�! �������� ;!I! ������ 2! ��������� I!+! F������ +!

@����� �� .!2! 2���� I���� �� 3���� 8���� 4���! 6�� �-��

����/#!

"! 1! ;������� ;! ;��K��� �� ;! ;�������� ������ &����� 5��

,�-, ����,#!

�! +! <�� � F!�! G�� 2! F�������� �!8! ��� � @! )���� )! F���� ��

=!.! $����� $�������� I���� :�� �>,�9�>// ����A#!

��! .! )�� +��� =!=! .� � I!5! F������� �� I! +� 8��������

,��-� �� �����!

3> -���& �� ���

��! J! <��� @!F! 8��� � ;!I! )����� =!.! $����� 8!1! 8����� ��

$!I! ������� � $�������� I���� �>� ,�/� ����>#!

�,! J! <��� ;!I! )����� =!.! $����� �� $!I! ������� � $��������

I���� :�� ,�>" ����A#!

�/! )! )��� � I! 8���� D!�! )������ <! @��� =!I!8! +������� �� 5!

) ��� 2�������� � �� 3���� ������ �� )������� �� C)��

��AA� ����A#!

�-! =!=! .� �� !� ������ &����� ��� ,"� ,�A>9>��/ �&��! ��

,��/#!

����'�'���&�� � �� ������� %������ � 0��� 5���� 6���� 34