UE2-CH8(GASTALDI)

Système endomembranaireA- Introduction :

C’est un système présent uniquement chez les eucaryotes.Ses éléments constitutifs sont : un ensemble de cavités, vésicules, tubules, canalicules.. Simplifié sous le terme de « compartiments intracellulaires délimités par une membrane, sauf les mitochondries et peroxysomes »

Il est spécialisé, entre autres, dans les échanges avec le cytosol, la MP, le milieu extracellulaire.

Figure 1 :

Les éléments constitutifs du système endomembranaire comprennent tous une membrane d’enveloppe, et une lumière. Dans la membrane d’enveloppe, on retrouve des protéines TMR, aux niveaux des versants luminal et périphérique et des perméases qui assurent le transport du cytosol au système endomembranaire.

Dans la lumière : protéine soluble, représentée aussi dans la vésicule d’endocytose et dans le milieu extracellulaire : La LUMIERE du SYSTÈME ENDOMEMBRANAIRE interagit avec le MILIEU EXTRACELLULAIREPartie haute du schéma : relations du système endomembranaire avec le cytosol (via des cavités ou par des constituants membranaires). Le contenu des cavités interagit avec le milieu extracellulaire.Le contenant (vésicules,...) interagit avec la MP.

Figure 2 :

- Étapes 1 & 2 : Bourgeonnement et détachement de la vésicule, à partir d’un compartiment donneur + facteurs cytosoliques (+ protéines spécialisées).

- Étape 3 : La vésicule recouverte d’un revêtement protéique, pour le transport, doit perdre son revêtement (indispensable, sinon le transport ne se fait pas), influence de facteurs cytosoliques + recyclage des protéines.

- Étape 4 : Transport avec énergie + intervention du cytosquelette

- Étape 5 : Fusion des membranes de la vésicule et de la membrane du receveur : nécessite des facteurs cytosoliques.

Vésicules recouvertes de clathrine, COP ou FAPP puis déshabillage pour l’interaction avec le cytosquelette

Les 5 étapes se font pour tous les transports vésiculaires sauf pour celui avec revêtement de cavéoline qui ne subit pas l'étape 3. (car elle n'interagit pas de façon gênante avec le cytosquelette).

Remarque les cavéolines n'ont pas besoin d'être déshabillées.

Si une molécule n'est pas déshabillée, il n'y aura pas de relation avec S.E. Car ces molécules vont gêner le contact.

� sur�1 23

UE2-CH8(GASTALDI)Les compartiments du système endomembranaire :

- RE : constitué de REG et REL, constitue l’enveloppe nucléaire - Golgi- Endosomes (phagosomes) - Lysosomes + vésicules, canalicules, tubules, vacuoles... Spécialisés dans le transit entre les compartiments, transit entre les compartiments et la membrane plasmique.

Le transport se fait selon les flux (Le principal est le flux membranaire vectoriel permanent ainsi que flux de retour vers Golgi et RE).Il faudra bloquer le flux membranaire permanent pour voir les autres flux.

Il faut des signaux d'adressage ou de rétention pour guider les protéines. Elles peuvent en avoir plusieurs.

En fonction de l'endroit où se situe la protéine, le signal pourra être masqué ou démasqué par le pH (mais il existe aussi d’autre moyens).B. Le Reticulum Endoplasmique (RE) :

I- Définition :

RE : Réseau de canalicules et de vésicules, en continuité avec l’enveloppe nucléaire. Il existe sous 2 formes :

→ Réticulum endoplasmique granulaire (REG) : Avec ribosomes sur face cytosolique → Réticulum endoplasmique lisse (REL) : Sans ribosome

Pour une cellule donnée, la proportion REG/REL est variable :

- Selon la cellule : une cellule avec beaucoup de synthèse protéique aura beaucoup de REG

- Selon le moment de la vie cellulaire (Si synthèse protéique importante, plus(+) de REG ; si détoxification, plus(+) de REL).

II - Les fonctions du RE communes aux cellules eucaryotes :

1- Translocation des protéines solubles (pendant leur synthèse)

Destination des protéines solubles : → Membrane plasmique (protéines périphériques externes)→ Milieu extra cellulaire (sécrétion)→ Autres compartiments du SEM

� sur�2 23

UE2-CH8(GASTALDI)Chapitre 4 Figure 2 :

Début de synthèse de protéine : cytosol, puis éventuellement signal d’adressage au RE.On s'intéresse aux protéines qui ont un signal d’adressage au réticulum : poursuivent dans le système endomembranaire.

Entrée dans le RE par le translocon puis adressage au reste du SEM.

Figure 4 : Le signal d’adressage (ou signal d’entrée dans le RE) = signal de traversée de la membrane d’enveloppe du RE = peptide signal.

Il comprend une séquence consensus de 15-20 AA hydrophobe située sur l’extrémité N- terminale. Ils vont constituer le Peptide Signal.Cette séquence est reconnue dès le début de la synthèse protéique : - Essentiellement par la SRP (particule cytosolique de reconnaissance du signal), (RNP qui fixe GTP) - Autres facteurs cytosoliques (Hsp).

SRP: ribonucléoprotéine qui fixe le GTP et a une activité GTPasiquePeptidases de signal et SPP qui clivent le signal aux sites de coupures.

Figure 3 : le début de la synthèse d’une protéine destinée à entrer dans le RE

Figure 5 :

- SRP (fixé au GTP) reconnait la séquence consensus, et se fixe : fixation de SRP au RE.

- Interaction SRP avec le récepteur de la SRP (qui a aussi une activité GTPasique) :

- Rapprochement de la grosse sous-unité du ribosome 

- Interaction du ribosome avec le translocon (qui a 2 orifices dont un bouché par BiP puis l'autre qui sera obturé par la grosse sous-unité du ribosome au bout d’un certain nombre d’AA synthétisés : - Ouverture au niveau cytosolique du translocon, Bip- Entrée de la protéine en cours de synthèse dans le transloconBiP va partir, permettant à la protéine de s’engager dans la membrane jusqu’à ce que l’on ait la totalité du peptide dans la membrane.

- Détachement de la SRP avec hydrolyse GTPQuand la protéine arrive dans le RE : glycosylation, formation de ponts disulfures (au fil de l’eau : pas définitifs), repliement (structure)Finalement, les ribosomes se détachent de la membrane du RE. La partie N-term de la protéine sera cytosolique (enchâssé dans la membrane du RE) et le reste de la protéine sera à l'intérieur du RE

� sur�3 23

UE2-CH8(GASTALDI)Figure 4: 2 clivages à la fin de la synthèse :

• Clivage du signal par la peptidase du signal- La protéine est soluble dans la lumière du RE, elle poursuit sa glycosylation et son repliement- La protéine a une nouvelle extrémité N terminale (en ayant perdu environ 20 AA)

• Le peptide signal sera coupé dans la membrane du RE par une signal peptide peptidase.Les fragments du peptide signal peuvent passer dans la lumière du RE (former liaisons avec CMH I) ou dans le cytosol (destruction dans le protéasome ou liaison à la calmoduline et inhibition).

2- Insertion des protéines transmembranaires (pendant la synthèse de la protéine) :

Figure 6 : Les différents modes d’insertion : HC

Les modes d’insertion varient selon :

- Le nombre de domaines TMR- La localisation cytosolique/luminale des extrémités N et C terminales➔ Une même protéine peut présenter plusieurs modes d’insertion (dont on ne connait pas le mécanisme)

Toutes les protéines TM, à 1 ou n segments TM, sont destinées à la membrane plasmique ou au SEM.

2 types de signaux d’adressage au RE pour les protéines transmembranaires :

• Le 1er : Le peptide signal (idem que pour des protéines solubles)• Courte séquence AA hydrophobes sur l’extrémité N terminale, reconnue par la SRP• Il est clivé en fin de synthèse (différents segments transmembranaire)→ Pour des protéines avec plusieurs domaines transmembranaire, il est facultatif !

• le 2ème type : ce n’est pas un peptide signal mais un futur domaine transmembranaire.

• C’est une courte séquence d’AA hydrophobes (N terminale ou non).

• Reconnue par SRP• Mais non clivée après la synthèse : segments transmembranaire

Si la protéine n’a qu’un domaine TMR : pas de situation B possible !

Entrés dans le RE : soit grâce au peptide signal, soit grâce à un domaine transmembranaire.

� sur�4 23

UE2-CH8(GASTALDI)Figure 7 : HC

La protéine à 3 domaines TMR, dépourvue de peptide signal. Extrémité N terminale cytosolique2 différences avec protéines ayant 1 TMR :→ Possibilité d’échappement d’un des éléments TMR inséré peut s’échapper du translocon→ Le translocon peut se refermer temporairement (conséquence: apparition d’une boucle cytosolique)

3- N-glycosylation des protéines solubles ou TM (pendant la synthèse)Figure 8 :

- Construction de l’arborisation sucrée sur la face cytosolique de la membrane d’enveloppe du RE (non montré sur figure). - Arborisation sucrée constituée par un lipide complexe : le dolichol, phosphorylé, et par des précurseurs de sucres.

→ Flip flop du dolichol + 14 résidus sucrées accrochés dessus: arborisation endoluminale.→ Accrochage de l’arborisation sucrée à la protéine sur l’azote de l’Asn (située dans la séquence consensus de la N-glycosylation) par la N-glycosyl-transférase.

→ Accrochage à la protéine puis raccourcissement (14 à 10 résidus) pendant la synthèse.

→ On enlève un certain nombre de résidus sucrés pour avoir plus que 10 résidus (action de la glycosidase)

C-glycosylation :

- Plus rare que la N-glycosylation- Fixation de résidus mannose sur le dolichol- Flip-flop- Transfert sur C du tryptophane n°1 de la séquence consensus (Trp-X-X-Trp)

� sur�5 23

UE2-CH8(GASTALDI)4- Synthèse des protéines liées à la membrane par un GPI :

Schéma est HC :

➔ Les glycoprotéines adressées aux radeaux lipidiques de la MPGPI : 2 AG ancrés dans la bicouche, 1 oligosaccharide (inositol + autres sucres), éthanolamine, lié à l’extrémité C-terminale de la protéine.

Le groupement GPI est construit sur la face cytosolique du RE, ancré dans la membrane par 2 acides gras, il subit une bascule pour être transloqué dans la lumière du RE par flip flop puis lié à l’extrémité C-term de la protéine.

Non HC : Les glycoprotéines adressées aux radeaux lipidiques de la membrane plasmique (microdomaines riches en sphingolipides, cholestérol, cavéoline).

5- Repliement des protéines solubles:

Figure 9 :

Mêmes mécanismes pour domaine luminal des protéines TM

- PDI (en présence de Ca++) ➔ établissement des ponts S-S définitifs

- BIP (en présence de Ca++ et d'ATP) + chaperons du RE (calnexine = TMR) ➔ permet acquisition de conformation définitive de la protéine.

Ce sont des chaperons cytosoliques qui participent au repliement du domaine cytosolique des protéines TM.

6- contrôle de qualité des protéines néo-synthétisées avant l’exportation au Golgi

Maturation de la protéine: glycosylation, pont SS, repliement.. (Intervention enzymes et chaperons solubles et membranaires du RE et cytosol)

Chapitre 4, Figure 6 : Mécanisme de contrôle de qualité :

Phénomène général : même mécanisme pour le renouvellement des protéines membranaires et solubles du RE (normales et anormales).

➔ Si la protéine est mal glycosylée ou mal configurée, elle ne sera pas exportée au Golgi

Exemple de la protéine CFTR (CF: Chapitre Cytosol.)

La protéine est ubiquituinilée sur son niveau trans-membranaire cytosolique. il va y avoir une reconnaissance de la protéine à dégrader.

Elle va être rétro-transloquée dans le translocon. On va lui enlever ses sucres et ensuite elle est envoyée dans le protéasome.

� sur�6 23

UE2-CH8(GASTALDI)7- Le RE envoie des signaux au noyau et au cytosol :

Figure 10 :

Types de signal :RE vers cytosol → Fragments du peptide signal peuvent repasser dans le cytosol (liaison calmoduline/dégradation protéasome)RE vers noyau → Libération de Calcium : Lorsqu’il y a une accumulation de protéine (solubles ou membranaires), anormales (ou normales) dans RE

Calcium dans le cytosol = activation de FRT (NF-KB) qui va pouvoir aller dans noyau (transcription…)

2 types de signaux :

- RE vers cytosol: fragments du peptide signal repassent dans le cytosol

- RE vers noyau: libération de Ca++: quand accumulation de protéines (solubles ou membranaires), anormales (ou normales) dans le RE

Figure 11 :

Le signal émis par le RE entraine une diminution du cholestérol dans la membrane du RE.Ce signal va activer SCAP qui va permettre transport des 2 protéines du RE vers Golgi. Dans la membrane du Golgi : coupure du SREBP (protéases). Fragment de SREBP = FRT ! SCAP et SREBP: protéines de la membrane d'enveloppe du RE

SCAP et SCREB : protéines de la membrane d’enveloppe du RE retenues dans la membrane du RE par des protéines INSIG.

La diminution de concentration en cholestérol dans la membrane du RE inhibe la liaison avec INSIG et active/libère SCAP qui permet le transport de SREBP dans le Golgi (transport de protéases inactives dans le RE qui deviennent actives dans le Golgi) où clivage avec libération du fragment cytosolique de SREBP.

8- Translocation de peptides antigéniques :

Figure 12 :

Les peptides antigéniques sont produit dans la plupart des cellules eucaryotes, par hydrolyse cytosolique de protéines (normales ou non) ou de longs peptides en peptides de 16 à 20 AA.Peptide de 16-20 AA → entrée dans le RE par perméase spécifiques : TAP (protéines ABC) Réduction par peptidase ERAP des petits peptides (8-10 AA) : pris en charge par CMH I. (TAP: Transporter associated with Antigen Processing)

Chapitre 4, Figure 8 :

Certains virus peuvent inhiber la synthèse de TAP / agir au niveau d’ERAP / au niveau du CHM I ...

� sur�7 23

UE2-CH8(GASTALDI)9- Synthèse de phospho-glycérides membranaires ou cytosoliques et du cholestérol :

Figures 13 :

Synthèse de phospholipides sur le feuillet cytosolique du RE avec participation de la mitochondrie puis :

- Soit par le flip flop va passer au niveau luminal du RE, - Soit il va être transporté par des liaison à protéines cytosolique

Chapitre 4 Figure 1

Chapitre 6 Figure 4

Le RE fournit au peroxysome la bicouche lipidiqueBourgeonnement du RE, grâce à l'apport de protéine du cytosol. Il y a également une importation des phospholipides du réticulum. Ils participent à la fabrication des inclusions lipidiques.

Le RE participe, aussi, à la synthèse du cholestérol.

10- Stockage du calcium :

Figure 21 chapitre 4:

Le RE et le Golgi ont 3 sites de spécialisation pour les ions Ca :

- Calcium ATPase (entrée Ca)- Protéines qui fixent Ca (fixation Ca)- Canaux de libération de Ca (sortie Ca) ex : BiP

III- Les fonctions du RE dans les cellules spécialisées :

1- Synthèse de lipides à exporter (dans le REL) :

Elle se fait à partir des Cytochrome P450, dans la matrice mitochondriale et du REL, À partir du cholestérol, dans la matrice mitochondriale et du REL (coopération) : synthèse des hormones stéroïdes dans les cellules spécialisées.

Figure 9 chapitre 5Le cholestérol est pris en charge par P450, il va être modifié en Hormone Stéroïde. Ces hormones peuvent sortir via des perméases.

2- Détoxification (dans le REL) : par hépatocyte :

2 étapes : • Hydroxylation• Solubilisation

Elle permet de rendre une drogue lipophile plus soluble (plus hydrophile).

� sur�8 23

UE2-CH8(GASTALDI)Figure 14 :

Le Cytochrome P450 utilise NADPH + O2 pour la détoxification de drogues exogènes ou de métabolites endogènes. Possible car cytochromes ont leur site actif sur la face cytosolique1ère étape : hydroxylation de la drogue (endogène ou exogène) : peu éliminable car peu soluble.Par P450 :

Soit elle rentre dans la lumière de reticulum. Il faut aussi ajouter un acide glucuronique qui provient du cytosol. Puis elle sera exportée par les flux membranaires vectoriels permanents pour être exocytée au niveau de la membrane.

Soit elle reste dans cytosol et elle sera sulfater et éliminée par des perméases de type ABC)

2ème étape : solubilisation

- Soit sulfatation (grâce aux cytochromes p450 au niveau cytosolique) : sortie par une perméase ABC

- Soit elle sera glucurono-conjuguée dans la lumière du RE (acide glucuronique) : sortie par exocytose (flux membranaire vectoriel).

/ ! \ Ces 2 mécanismes n’aboutissent pas à la même façon de sortir. Exemple :

Éthanol (avec peroxysomes)

intoxication de phénobarbital (= barbyturique) : augmentation surface REL

� sur�9 23

UE2-CH8(GASTALDI)

C- L’appareil de Golgi :I- Définition :

Localisations : à proximité du noyau et du centre cellulaire.

C’est un ensemble de vésicules et saccules aplatis (pile d’assiettes).Chaque pile de saccules s’appelle un dictyosome.

Selon l’état fonctionnel de la cellule, on aura un ou plusieurs dictyosomes.

Figure 15 :

Entrée dans le Golgi par le saccule CIS en regard du RE.

Dans le sens du flux membranaire vectoriel et permanent: RE, saccule CIS, saccules médians, saccule trans, réseau transgolglien (TGN).

→ Chaque saccule a son marqueur spécifique :

Saccules CIS → métaux lourdsSaccules médians et trans → Nucléoside di-phosphataseRéseau transgolgien → phosphatase acide (marqueur commun avec les lysosomes).

Le dictyosome porte des marqueur spécifique:

Plus on s’éloigne du réticulum plus son pH diminue (pH est donc variable)

II- Fonctions :

1- O-glycosylation des protéines :

Figure 16 :

- Sur l’azote d’un résidu asparagine: N glycosylation (REG)→ Ajout de sucre via N-glycosyl-transférase pendant la synthèse de la protéine

- Sur un résidu tryptophane : C-glycosylation (REG)→ Ajout de sucre via C-glycosyl-transférase

- Sur un résidu sérine ou thréonine : O-glycosylation (Golgi médian et trans, cytosol)ajout de sucre via O-glycosyl-transférase → pas de séquence consensus : directement sur l’oxygène de thréonine ou sérine !

� sur�10 23

UE2-CH8(GASTALDI)2- Les modifications des sucres :

Figure 17 :

La diminution du pH permet une spécialisation fonctionnelle des citernes golgiennes/- La modification de l’arborisation sucrée vient de la N et de la O glycosylation, différente selon les enzymes (phosphorylation des mannoses dans le Golgi CIS).→ Chaque citerne a ses enzymes spécifiques et le pH diminue de CIS vers TGNPathologie : CDG (congenital disorder of glycosylation). Atteint toutes les modifications qui se font dans le Golgi.

3- La synthèse des sphingolipides :

Synthèse des sphingolipides dans le feuillet luminal du Golgi CIS et médian

4- Protéases du Golgi :

Elles permettent le clivages des molécules qui sont en transit : - Protéases à pH neutre : Dans les citernes proximales (CIS et début du médian)- Protéases à pH acide : Dans les citernes distales: trans et TGN + fin du médian

5- Stockage Calcium :cf + haut

6- TGN : sous compartiment à pH acide :

7- TGN : face de sortie et de tri du matériel :

Figure 18 :

TGN = face de sortie et de tri du GolgiTGN ont protéases (solubles ou TM), phosphatase acide, pompe à protons, ATPase à Cuivre.

- La sécrétion constitutive assure le renouvellement des constituants de la membrane plasmique et exporte le matériel destiné à la MEC.

- Les protéases du TGN membranaires ou solubles participent à la sécrétion régulée et constitutive.

- Les protéines membranaires du TGN qui décrivent des cycles entre TGN, membrane plasmique, endosomes (exocytose/endocytose).

Matériel qui bourgeonne : - On aura une vésicule à coatomère (qui perd son revêtement) → seulement dans le flux de retour !

- Dans le flux membranaire vectoriel et permanent : -Vésicules recouvertes de clathrine (perdent leur revêtement), qui vont aller soit vers MP/vers

endosomes, lysosomes.- Canalicules recouvertes de FAPP (perdent leur revêtement), vont vers la MP (sécrétion

constitutive = Sécrétion qui permet de renouveler la membrane.) - Vésicules recouvertes de cavéoline (ne perdent pas leur revêtement) : sécrétion constitutive : MP- Constitution de la vacuole autophagique

- La sécrétion régulé fait appel a des vésicules a clathrine uniquement (départ du Golgi)

- La sécrétion constitutive au départ du Golgi, fait appel à 2 types de vésicules : celle recouvertes de FAPP et celle recouverte de cavéoline

� sur�11 23

UE2-CH8(GASTALDI) - Coatomère uniquement pour le flux de retour Brefeldine A : Inhibe le revêtement et la GEF de certaines ARF, elle inhibe revêtement à clathrine, à FAPP, et coatomère. Par contre, elle n'inhibe pas à la cavéoline.

8- Maturation du matériel exporté du TGN :

La maturation intéresse 2 types de matériaux :

- Matériel de la sécrétion régulée Exemple : maturation hormonale → sécrétion d’un précurseur inactif qui sera maturé et coupé au cours de son transport

- Matériel de la sécrétion constitutive Exemple : protéines membranaires à destination de la MP, seront coupées pendant leur transport

FIN DU COURS 15/10

D- Les endosomes, les phagosomesDéfinitions :- Morphologie hétérogène - Critères fonctionnels = c’est un compartiment carrefour

Figure 1 : endosome: carrefour entre la MP, le Golgi trans, les lysosomes et le cytosol

L’endosome reçoit : - Vésicules d’endocytose en provenance de la MP (cavéoles non déshabillées ou vésicules à clathrine déshabillées) : nutrition - Vésicules de transport provenant du TGN et Golgi trans : vésicules à clathrines déshabillées et apportent aussi des enzymes (hydrolases acides) et une pompe H+ ATpase

L’endosome exporte : - Matériel vers lysosomes (fusion) - Vésicules de recyclage (vers MP) de protéines endocytées - Vésicules de retour vers Golgi (trans et TGN) (clathrine) - Matériel vers le cytosol

2 catégories dans ce compartiment :→ Endosomes précoces : rapport ++ avec MP : endocytose/exocytose ; pH proche de neutralité possède des marqueurs (ex : rab5) pour maturation du matériel → Endosomes tardifs : corps multivésiculaire: MVB (pH plus acide) pH plus acide (intermédiaire entre lysosome et endosomes précoces) possède des marqueurs (ex: rab7), hydrolases acides (du TGN), protéases membranaires, maturation du matériel, contiennent des vésicules: exosomes qui peuvent être exocytés et libérés en extra cellulaire.

Hydrolases issues du Golgi (ex vésicules à clathrine): réactions d’hydrolyse dans endosome puis lysosome

� sur�12 23

UE2-CH8(GASTALDI)I- Les endosomes exportent du matériel vers la MP, vers le milieu extracellulaire→ Recyclage des protéines membranaire endocytées

Chapitre 4 - Figure 15 Chapitre 2 - Figure 30 (dissociation complexe LDL récepteur dans les endosomes tardifs car pompe à protons)

II- Rôle dans la présentation de l’antigène et l’activation des LT :Figure 20: Présentation des antigènes aux LT CD8+ par le CMH de type I dans tous les types cellulaires

Protéines/peptides peuvent être dégradés dans le protéasome. Entrée par TAP. Dégradation en peptide + petit par ERAP, petits peptides pris en charge par CMH I → dans tous les types cellulaires.Le CMH I pris en charge par flux membranaire vectoriel permanent, passe dans le Golgi et compartiment endosomal, puis est exocyté à la MP. CMH I (protéine TMR) va s’intégrer à la MP et les peptides antigéniques seront présentés aux lymphocytes T CD8+

Fixation des peptides antigéniques produits dans toutes les cellules (protéasome dans le cytosol puis peptidases ERAP dans le REG) par CMHI dans le REG puis transport Golgi,…

III- Les endosomes et lysosomes délivrent du matériel au cytosol :Métabolites via des protéases : ex du cholestérol

Chapitre 2 Figure 30 : l’hydrolyse des LDL se fait dans les endosomes/ lysosomes ➔ Sortie du cholestérol par les perméases spécifiques

IV- Les endosomes échangent du matériel avec le TGNFigure 19 :

- Le TGN fournit des vésicules aux endosomes : ex-vésicules à clathrine apportant des hydrolases acides et H+ ATPase l’endosome tardif peut se transformer en lysosomes

- Les endosomes fournissent des vésicules au TGN qui transportent des glycoprotéines TMR résidentes du Golgi trans et TGN (→ flux de retour). Elles effectuent les cycles endocytose/exocytose (ex: récepteur du mannose-6-P, endoperméase, perméase du Cu++).

V. APPORT DE MATERIEL ENDOCYTÉ AUX LYSOSOMES

� sur�13 23

UE2-CH8(GASTALDI)

E- Les lysosomes

I- Définition :→ Morphologie hétérogène ++ → Détection cytoenzymologique de la phosphatase acide (elle se trouve aussi dans le Glogi trans et TGN) en MO ou ME.Lysosome = fusion de vésicules ou vacuole qui renferment des matériaux à dégrader avec une ou plusieurs vésicules de transport. ➔ Phosphatase acide est un marqueur du Golgi trans et du TGN.

Chapitre 1 Figure 5 :Etude en MO : production d’un précipité coloré Etude en ME : produit opaque aux électrons

II- Composants caractéristiques :Les lysosomes sont comportent :- 4 types de glycoprotéines TMR, - Des glycoprotéines enzymatiques solubles qui fonctionnent à pH acide.

- Dégradation de toutes les molécules biologiques: nucléases, protéases, glycosidases, phosphatases, lipases,…

- Elles sont adressées au lysosome grâce à leur mannose-6-P (M6P) et au récepteur du M6P

Mannose-6-P de la protéine soluble synthétisé dans le Golgi CIS (phosphorylation des résidus mannose), interaction avec le récepteur dans le TGN, adressage aux endosomes-lysosomes où dissociation du complexe enzyme-récepteur.

Schéma HC.

Figure 21 : 1er type de glycoprotéine transmembranaire : La pompe a proton qui permet l’entrée d’ions H+ qui acidifie le compartiment2 : Perméases: 2 types : celles qui permettent l’entrée de molécules, et 2ème : sortie des molécules3 : glycoprotéines enzymatiques (phosphatase acide) (soluble ➔ majoritaire) 4- glycoprotéines non enzymatiques (de structure)

Exemple : Lamp (Lysosome associated membrane protein) 1 et 2 ➔ marqueur spécifique de la membrane du lysosome + glycoprotéines enzymatiques solubles sont caractérisées par leur adressage au lysosome grâce à leur groupement mannose-6-P.

� sur�14 23

UE2-CH8(GASTALDI)Protéine lysosomale vient d’être synthétisée dans le RE, puis dans le Golgi CIS : elle reçoit le groupement de Mannose-6-P. Le M6P est synthétisé dans le Golgi CIS. La protéine suit flux membranaire vectoriel et permanent jusque dans le Golgi trans. Interaction M6P avec son récepteur. L’ensemble sera transporté dans un endosome tardif et un lysosome (via le flux membranaire vectoriel permanent). On aura ensuite, à cause (en partie) du pH : dissociation récepteur-hydrolase acide lysosomale. Récepteurs pris en charge par vésicules de recyclage (récepteur recyclé au niveau du TGN). Mannose-6-P de la protéine soluble est synthétisé dans le Golgi CIS. Il y a une interaction avec le récepteur qui va reconnaitre le mannose 6 P dans le TGN ce qui va entrainer l’adressage aux endosomes/lysosomes où se déroule une dissociation du complexe enzyme-récepteur.

Figure 22 : Le bourgeonnement se fait au niveau du TGN par des vésicules à clathrine + protéines d’adaptation. Vésicule déshabillée pour le transport. Adressage se fait au lysosome/endosome. pH ➔ dissociation. Recyclage du récepteurs au TGN. ➔ L’adressage aux lysosomes n’est pas efficace a 100% Erreur possible : adressage incorrect vers la MP.

III- Les voies d’entrée des matériaux à dégrader :Figure 23 :

4 voies d’entrée dans les lysosomes pour les matériaux à dégrader:

• 1ère voie d’entrée : l’endocytose Vésicule à cavéole vont vers cavéosomes : pas concernées par notre blabla → Vésicules à clathrine ou sans revêtement → compartiment endosomal précoce puis tardif : peuvent alors rejoindre lysosome

• 2ème voie: La phagocytose Pour des particules à endocyter + grosses : mise dans le phagosome (vacuole) qui rejoint lysosome après apport de matériel provenant d’une vésicule qui vient du Golgi cis et du TGN (→ apport enzymes et pompe à H+)

➔ Ces 2 voies sont inhibées pendant la mitose !

• 3ème voie : entrée directe du le cytosol via perméasesNécessite l’intervention de Lamp2A et chaperons : Hsp70, et puis partenaires cytosoliques

Fig 18 (!!) : Vacuole formée par citerne spécialisée du TGN entoure l’organite avec du cytosol qui contient des hydrolases acides (digestion de la membrane interne de la vacuole, puis digestion de la mitochondrie).

• 4ème voie: L’autophagie Autophagie : mécanisme de la cellule pour dégrader ses propres organites et molécules (dans le cadre du renouvellement / dans les phénomènes pathologiques ➔ exemple : intoxication et élimination du REL en excès,dans le cas de l'intoxication au phénobarbital par exemple

� sur�15 23

UE2-CH8(GASTALDI)IV- Les voies de sortie des matériaux après l’hydrolyse3 destinées pour le matériel, via :- Perméases : dans le cytosol (Ex : Cholestérol)

- Vésicules de retour vers le compartiment en amont dans le flux vectoriel permanent- Vésicules qui vont fusionner avec la MP

V- Biogénèse et fonctions des lysosomes :

1 – Biogénèse :Lysosomes proviennent de la fusion de vésicule(s) de transport(qui vient du TGN, contient hydrolases acides, pompe à protons + protéines membranaire et protéines luminales venant du TGN) avec une vésicule ou vacuole (endosome, phagosome) contenant des matériaux à dégrader.

2- Fonction de dégradation (de toutes les familles de molécules) en métabolites élémentaires qui pourront faire l’objet d’une réutilisation par la cellule après la sortie via des perméases spécifiques : nutrition

Figure 24 :

Remarque : peptides ubiquitinylés partiellement dégradés dans le protéasomes ont une séquence d’adressage au lysosome : ils peuvent rentrer directement dans lysosomes (entrée via perméase + Lanp2A + Hsp 70).

3- Le Devenir des lysosomes :

• Corps résiduels : lysosomes âgées, fonction de stockage, Ils ont perdu leur fonction d’hydrolyse.• Exocytose du contenu des lysosomes (presque tous les types cellulaires peuvent exocyter contenu de leurs lysosomes) après stimulation (nombreuses cellules épithéliales et fibroblastes), apport à la membrane.• Sécrétion du contenu lysosomal en extracellulaire par phagocytose frustrée (fonction spécifique des phagocytes professionnels) qui décrit une fonction de défense (cf fig 25)

Phagocytose frustrée : (uniquement pour phagocytes professionnels) si matériel trop volumineux, exocytose du contenu enzymatique lysosomal : fonction de défense. En conclusion : La fonction principale reste la fonction de nutrition; mais ils assure aussi des fonctions de défense et d'exocytose.

Figure 25 :

Un exemple d’exocytose du contenu enzymatique lysosomal par les cellules macrophagiques responsables du remodelage des tissus osseux et cartilagineux

Phagocytes professionnels : macrophages et dérivés (ostéoclastes, chondroclastes), polynucléaires

� sur�16 23

UE2-CH8(GASTALDI)V- Lysosome et pathologie humaine :2exemples:

• Accumulation de molécules non dégradées ou du produit de dégradation : maladies de surcharge (maladies de stockage des phospholipides). LSD ➔ Lysosomal Storage Disorder : augmentation du nombre de lysosome

Exemple : maladies héréditaires, atteinte des hydrolases des phospholipides: surcharge de phospholipides.

Le lysosome ne dégradera pas certains types de molécules ou bien elles seront dégradées mais ne sortent pas du lysosome

• Hydrolyse impossible pour les macrophages : dû au matériel lui-même - Matériel non biologiques (ex : pneumoconioses : atteinte/surcharge pneumo) - Matériel biologique mais d’organisation quasi minérale (cf fig)--> Inatteignable par le macrophage --> Pas Digéré

Figure 26: La phagocytose par des macrophages alvéolaires, de particules minérales, a pour conséquence la mort des cellules .Émission des voiles, phagocytose de la particule, apport d’enzymes acides, mais impossibilité car le matériel est non biologique. Conséquence: rupture de la membrane d’enveloppe ➔ libération d’acides dans les cellules ➔ Destruction macrophage →Destruction progressive du tissu pulmonaire →insuffisance respiratoire pour le patient.

Autres exemples de pathologies pulmonaires :- Asbestose (inhalation de fibres d’amiante) - Silicose (inhalation de particules de silice)Matériel biologique d’organisation quasi minérale : cristaux d’acide urique (organisation proche du minéral : impossibilité de phagocytose pour les macrophages) et goutte (phagocytose frustrée, manifestations douloureuse).

� sur�17 23

UE2-CH8(GASTALDI)

F- Les Flux Membranaires :

I- Les étapes : Bourgeonnement, détachement de la vésicule, perte du revêtement.

1- Revêtement de coatomère: Il s’agit des protéines cytosoliques COP qui se polymérisent.

Figure 27 :

ne concerne que le bourgeonnement de COP 1 à partir du Golgi trans ou TGN avec ARF 1 (protéine G monomérique), vers Golgi médian, CIS et RE (cf figure 18 → flux de retour)

L’association des composants cytosoliques (ARF 1 et COP 1) suffit à induire l’organisation du revêtement, le bourgeonnement et le détachement de la vésicule.

Bréfeldine A inhibe seulement le GEF de ARF 1 (d’où la limite posée pour cette figure).

Si on n’hydrolyse pas le GTP, pas de déshabillage = pas de transport. (Inhibition GTPgammaS)

Compartiment receveur : Golgi médian, cis ou RE.

/!\ Cas restrictif sur cette figure :

La protéine est, ici, ARF 1.

C'est une protéine G dont la GEF peut être inhibée par la brefeldine A. → Ce modèle ne concerne que le Golgi trans et TGN (PAS LE GOLGI CIS ET MEDIAN --> Ils n'ont pas d'inhibition par la brefeldine car ce n'est pas la même GEF et ARF qui sont impliquées !) car il y a une implication de ARF1.

→ ARF 1 va s'accrocher sur site spécifique d'accrochage de COP 1.

C'est l'association entre COP 1 et ARF 1 qui entraine l'organisation du revêtement, le bourgeonnement et le détachement de la vésicule.

2- Revêtement de clathrine Figure 28 : Valable que pour le Golgi trans ou TGN, pas valable pour la MP (intervention de ARF 1 : pas sensible à la bréfeldine A)

➔ Revêtement de clathrine (triskélion de clathrine) = clathrine + protéines d'adaptation

Pour qu’il y ait bourgeonnement, ce réseau doit se déformer : mailles héxagonales devient hexa- et pentagonales.Pour le détachement : hydrolyse GTP par dynamine, Protéine G qui provient de la sécrétion régulée.Pour le déshabillage : Hsp 70 et ATP

GOLGI trans ou TGN (pas membrane plasmique)

Remarque : on est dans le Golgi trans ou TGN : ARF 1 fait partie du revêtement à coatomère, mais pas du revêtement à clathrine, mais ARF 1 est indispensable pour la constitution des deux revêtements. Bréfeldine A inhibe les 2 revêtements.

� sur�18 23

UE2-CH8(GASTALDI)Chapitre 4 Figure 20 : si pas d’activité GTPasique : élongation de la dynamine ms pas de détachement (valable pour la MP et pour dans le TGN).Si mutée, il n'y pas de détachement de la vésicule car l'hydrolyse du GTP ne ce fait pas. Il y aura seulement une élongation de la dynamine

II- Transport & adressage du matériel :

1- Transport :

→ Vésicules déshabillées avec intervention cytosquelette :- Longues distances : MAP motrices (kinésine ou dynéine, selon le sens du transport) et microtubules - Au niveau de la MP : participation du cytosquelette cortical d’actine

2- Mécanismes d’adressages et de rétention au compartiment receveur On ne parle pas ici du signal d'adressage au RE pour la synthèse protéique (peptide signal)…

- Ces signaux permettent maintient de la composition spécifique de chaque compartiment.

Les signaux sont différents pour les protéines TMR et les protéines solubles :

Figure 29 : Les différents types de signaux d’adressage et de rétention

- Glycoprotéines TMR : 1 seul signal d’adressage Ce signal est situé dans la séquence peptidique. Il peut s’agir du dom cytosolique (les protéines vont aller au RE ou au cytosol), ou bien du 1er segment TMR (protéines allant au niveau du Golgi). - Glycoprotéines solubles : 2 signaux d’adressage : 1 porté par la glycoprotéine soit dans sa séquence peptidique ou dans arborisation sucrée (hydrolases lysosomes, M6P...), et l’autre porté par récepteur TMR (ayant lui-même un signal d’adressage TMR...)

Si mutation de ces signaux: exocytose de la protéine avec : - Sécrétion dans le milieu extracellulaire (protéine soluble)- Insertion à la membrane plasmique (protéine TMR)

� sur�19 23

UE2-CH8(GASTALDI) Mécanismes d’adressage pour le RE :

Figure 30: Protéine TMR : séquence KKXX (2 lysine et 2 acides aminés autres) au niveau de sa séquence cytosolique , proche de l’extrémité C-terminale.Séquence reconnue par COP 1, et permet le retour du Golgi au RE

Protéines solubles: exemples : protéine résidentes du cytosol : BIP et PDI : séquence KDEL au niveau de C terminale il faut 2 signaux d’adressage : celui dans la séquence peptidique et un autre contenu dans le récepteur

TMR golgien (appartient à la famille des protéines ERD). Ce récepteur va lui aussi porter un signal.Figure 34 :

Adressage/ rétention au Golgi :→ Protéines famille ERD (protéines golgiennes) : 2 signaux d’adressage : 1 : signal adressage au Golgi est porté par TM1 (premier domaine TM) 2 : signal adressage au RE (KKXX du domaine cytosolique)

Remarque : complexité avec la spécialisation des citernes du Golgi

Adressage aux lysosomes :Exemple du M6P et des récepteurs du M6P pour les protéines solubles Le récepteur du M6P a 2 signaux d’adressage : un signal pour aller dans lysosomes, et un pour aller dans le Golgi trans / TGN

En fait : 1 signal pour la mol qu’il transporte, et 1 autre pour lui (son retour dans le Golgi)

Signal d’adressage au lysosome est dans le domaine cytosolique, pour le récepteur du M6P et pour les protéines lysosomales membranaire.

III- Fusion : vésicule - compartiment receveur :Figure 31 :

1) Vésicule (déshabillée) + protéine G monomérique Rab(GTP : activée) qui va recruter un complexe cytosolique d’approche qui va permettre étape 2 2) Rapprochement de la vésicule

3) Amarrage par interaction entre les protéines membranaire des 2 compartiments (vésicule : v-SNARE, et t-SNARE : protéine membranaire du compartiment receveur). Nécessite présence d’ions Calcium. REMARQUE : V = Vesicular et T = Target

4) Fusion des membranes d'enveloppes et des protéines. , hydrolyse GTP par Rab, libération, recyclage.

Exemple : si compartiments receveur = MP : sécrétion du contenu de la vésicule dans le milieu extracellulaire A chaque fusion de membrane, il y aura une 'augmentation de surface de la MP, Celle-ci sera compensée par l'endocytose, qui entraînera une perte de membrane.

� sur�20 23

UE2-CH8(GASTALDI)➔ Spécificité de l'interaction vésicule-compartiment receveur dépend de la nature des complexes d’approche, des SNARES, et des Rab impliqués, qui diffèrent selon les compartiments.

IV- Le flux membranaire vectoriel et permanent Mise en évidence expérimentale :

Figure 32 : marquage dans le pancréas exocrine, après l’incorporation de leucine expérience d’autoradiographie par l’équipe de G. Palade (prix Nobel Médecine en 1974): « pulse chase »

- Incubation de coupes de tissu pancréatiques exocrine avec un mélange d’AA (dont 1 marqué : leucine tritiée = H3(tritium) + Leu) pendant 3 min → « pulse » = marquage - puis incubation avec de la Leu non marquée : « chase » = la chasse.

Observation du marquage de chaque compartiment. Aux différents temps :

3 min: début de la synthèse protéique dans le REG

20 min: Suite de la synthèse dans le Golgi

90 min: Suite de la synthèse dans grains de sécrétion

Cinétique observée : REG puis Golgi puis grains de sécrétion → flux membranaire vectoriel permanent.

NB : grains d’argent ont la même place que la radioactivité.

Figure 33 :

- RE au Golgi : bourgeonnement de vésicules à COP II, puis ERGIC (compartiment intermédiaire, vésiculo-tubulaire qui se déplace vers le Golgi CIS et qui fusionne avec lui).- Déplacement entre les citernes Golgiennes, 2 mécanismes: transport par tubules/vésicules du Golgi (vésicules par trop grosses) ou maturation des citernes/saccules (pour les molécules plus grosses comme le collagène).- À partir du Golgi trans et TGN : vésicules (clathrine et cavéoline) et tubules/canalicules à FAPP

V- Le flux de retour du Golgi vers le RE

→ Permet le retour du Golgi au RE → revêtement : toujours des vésicules à COP 1 → Permanent mais très minoritaire, donc visible seulement quand le flux membranaire vectoriel permanent est bloqué

Blocage expérimental transitoire du flux membranaire vectoriel permanent par Bréfeldine A (inhibe la GEF de certaines ARF 1)

Figure 33 ( ! )

Action de la Bréfeldine A (drogue issue de certains champignons) :

� sur�21 23

UE2-CH8(GASTALDI)Bloque (GEF de ARF 1) :

• Tubules à FAPP à partir du Golgi trans et TGN• Vésicules à clathrine à partir du Golgi trans et du TGN • Vésicules recouvertes de COP 1 à partir du Golgi trans et TGN• Fusion de ERGIC et Golgi cis

Ne bloque pas :

• Vésicules recouvertes de COP II à partir du RE (flux membranaire vectoriel et permanent)• Tubules ou vésicules recouvertes de COP I à partir du Golgi cis/médian vers le RE (flux de retour)• Vésicules recouvertes de COP I à partir du ERGIC vers le RE (flux de retour)

NB : la Bréfeldine A ne bloque pas TOUT le flux membranaire vectoriel et permanent, mais suffisamment pour que l’on puisse voir le flux de retour.

Figure 34: Le mécanisme de retour des protéines solubles du Golgi au RE

BiP a sa séquence d’adressage qui n’est reconnue que dans le Golgi trans, par le récepteur ERD. ERD a lui-même un signal d’adressage et de rétention pour le RE (au niveau du domaine cytosolique) et le signal d’adressage au Golgi est au niveau du segment TMR.

La dissociation (PH) inactive le signal d’adressage au RE des récepteurs ERD qui repartent vers le Golgi

La séquence d’adressage et de rétention des protéines ERD pour le RE n’est active qu’après la fixation de la protéine soluble résidente du RE L'association se fait à pH Acide. Quand il est basique, le pH inactive le signal d'adressage au RE des récepteurs ERD qui repartent vers le Golgi.

Prix Nobel de Médecine 2013 : régulation du trafic vésiculaire

� sur�22 23

UE2-CH8(GASTALDI)Exemple QCM :L’endocytose des LDL et de leurs récepteurs :

A Le détachement de la vésicule d’endocytose nécessite le remaniement des mailles de son réseau de revêtement.

B- Le récepteur libre n’est pas recyclé.

C - Le récepteur libre est transporté par le flux membranaire vectoriel permanent.

D- Le récepteur libre traverse la membrane plasmique par une perméase.

E - C’est l’acidification du compartiment qui provoque la désagrégation des LDL.

QCM1: C, E

A: faux, c’est la dynamine

B: faux

D: faux, exocytose

Lamp 2 :

A- Est une hydrolase acide

B - Est une glycoprotéine de la membrane d’enveloppe du lysosome.

C- Est présente dans le TGN et le lysosome.

D - Possède une séquence d’adressage au lysosome dans son domaine transmembranaire.

E - A été transporté à partir du TGN par des vésicules recouvertes de coatomère COP 1.

QCM2 : Réponse juste : B

� sur�23 23