Regulation of esophageal epithelial function in Eosinophilic Esophagitis

A dissertation submitted to the

Graduate School of the University of Cincinnati

In partial fulfillment of the requirement of the degree of

DOCTOR OF PHILOSOPHY

In the Department of Pharmacology & Systems Physiology

of the College of Medicine

2018

By

Chang Zeng

B.S. Sun Yat-sen University, 2012

Committee Chair: Anjaparavanda P. Naren, Ph.D.

Mentor: Simon P. Hogan, Ph.D.

ii  

Abstract

Eosinophilic Esophagitis (EoE) is an allergic inflammatory disorder with increasing prevalence in the 

western world. Patients with EoE demonstrate symptoms including vomiting, dysphagia and food 

impaction which decreased the quality of life.  

One of the histopathological features of EoE is esophageal tissue remodeling, including dilated 

intercellular spaces (DIS) and basal zone hyperplasia (BZH). However, the underlying molecular s that 

drive these features is largely unknown. Here, we investigate the 1) involvement of sodium‐hydrogen 

exchanger 3 (NHE3) in esophageal epithelium remodeling and 2) the role of the transcription factors, 

signal transducer and activator of transcription (STAT), in the regulation of gene networks that control 

esophageal epithelial proliferation and histopathological features of EoE. 

By analyzing RNA sequencing comparing transcriptome difference in esophageal biopsies from normal 

control (NL) and EoE patients, we identified NHE3 as the most upregulated transmembrane transporters 

in patients with active EoE. We found that the expression pattern of NHE3 closely correlated with the 

disease severity and DIS. Functional analyses demonstrated that NHE3 activity is upregulated in IL‐13 

treated primary esophageal epithelial cells derived from EoE patients, as well as in IL‐13‐induced 

stratified squamous epithelium generated by the air‐liquid interface (EPC2‐ALI). Pharmacological 

Inhibition of NHE3 activity protected from IL‐13 induced DIS in esophageal epithelium. Thus, we 

concluded that NHE3 plays a functional role in DIS formation and pharmacologic interventions targeting 

SLC9A3 function may suppress the histopathologic manifestations in EoE  

IL‐13 has previously been shown to activate STAT proteins, particularly STAT3 and STAT6 and regulate 

the transcriptome changes in EoE patients. Using transcription factor binding site (TFBS) analysis, we 

identified STAT protein binding motif is one of the most enriched transcription factor binding site (TFBS) 

in the dysregulated genes in both EoE biopsies and IL‐13 treated EPC2‐ALI cultures. In particular, we 

iii  

identified the STAT3 binding site as the most enriched TFBS in IL‐13 induced upregulated genes in EPC‐

ALI. By knocking down STAT3 in EPC2 cells, we revealed a role for STAT3 in the regulation of epithelium 

barrier function and IL‐13‐induced proliferation. In contrast, we show that STAT6 plays a pro‐

inflammatory role regulating cytokine and chemokine production in esophageal epithelium.  

Together, we identified several molecular targets in the esophageal epithelium that are important in 

modulating the esophageal epithelium remodeling in EoE. This dissertation, for the first time, uncovers 

the role of transmembrane transporters in the pathogenesis of EoE. Also, we provide valuable 

information on the two distinct divergent pathways regulated by STAT3 and STAT6 driving IL‐13‐

mediated transcriptome changes in EoE. Further investigations into the contribution of these 

mechanisms in the clinical manifestations of EoE will facilitate the evolvement of new therapeutic 

approaches in EoE treatment. 

   

iv  

 

   

v  

Acknowledgements

First, I would like to express my utmost gratitude to my mentor Dr. Simon Hogan. I had a tough 

beginning for my graduate study, but it all paid off when I ended up joined Simon’s laboratory. Simon is 

an excellent mentor. He showed me his enthusiasm and passion for science, guided me of how to do 

science correctly and efficiently, and told me to explore all the possibility of life in the future. These are 

all valuable assets and shaped me into who I am right now. 

Next, I would like to thank my thesis committee members. All of my committee members, Drs. 

Anjaparavanda Naren, Hong‐Sheng Wang, Gary Shull, Marshall Montrose and Robert Rapoport have 

provided me invaluable support and advice, which are essential for my completion of the dissertation. 

Primarily, I want to thank Dr. Naren for the guidance on experimental techniques and preparedness to 

assist with completion of my thesis dissertation. Also, I am grateful to Dr. Rapoport for being supportive 

not only as my committee member but also my graduate program director.  

I would like to offer my special thanks to Dr. Ronald Millard. He helped and guided me to get through 

the most terrible time of my graduate study. I would not be able to join Simon’s lab and achieve what I 

have made now without him. I would also like to thank Nancy for her endless help during both my 

graduate program transition and process towards graduation. 

During the past four years, I have met amazing people in Hogan Lab, and I would like to express my 

thankfulness individually. Taeko, thank you for sharing your experiences and stupid videos with me all 

the time, I always enjoyed the time we spent together. Simone, thank you for your guidance on 

experiments and your company to different places in Cincinnati. It is sort of sad that we are not going to 

drink KSFM when I graduate. Amna, we have been together to go through both foundation and 

numerous dreadful lab meetings, I think this would be enough to keep our friendship for a long time. 

Lisa, thank you for always being like a mom and take care of me, I wish I could bring you more exotic 

vi  

food to try. Now I’m starting to run out of spaces, but I still want to thank Jazib, Yanfen, Sunil, Varsha, 

Andy, Justin, Heather, Nianrong, David, Ania, and Marjan. We have shared amazing memories together, 

and thank you all for your friendship. 

I would also like to thank the great people in Division of Allergy and Immunology at Cincinnati Children’s 

Hospital Medical Center who offered me help and friendship during my training as a graduate student. 

Special thanks to Julie, Nurit and Mark Rochman, who have given me useful advice on both scientific 

problems and career development. 

Finally, I would like to thank my mom Zhi, my aunt Tun, my boyfriend Yongkun, my friend Yu and 

Jiuzhou, and all my other friends and families for their unconditional support and love. 

   

vii  

Table of Contents

Regulation of esophageal epithelial function in Eosinophilic Esophagitis ..................................................... i 

Abstract ......................................................................................................................................................... ii 

Acknowledgements ....................................................................................................................................... v 

Table of Contents ........................................................................................................................................ vii 

List of Abbreviations .................................................................................................................................... xi 

List of Figures and Tables ............................................................................................................................xiii 

1  Chapter I: Introduction ....................................................................................................................... 15 

1.1  Eosinophilic Esophagitis .............................................................................................................. 15 

1.1.1  Introduction ........................................................................................................................ 15 

1.1.2  Pathogenesis of EoE ............................................................................................................ 15 

1.1.3  Therapy ............................................................................................................................... 25 

1.1.4  Summary ............................................................................................................................. 28 

1.2  Interleukin‐13 (IL‐13) .................................................................................................................. 29 

1.2.1  Introduction ........................................................................................................................ 29 

1.2.2  Production of IL‐13 .............................................................................................................. 29 

1.2.3  IL‐13 signaling pathway ....................................................................................................... 29 

1.2.4  IL‐13 function under physiological and pathological conditions ........................................ 32 

1.2.5  IL‐13 in EoE .......................................................................................................................... 33 

1.2.6  IL‐13‐related treatment ...................................................................................................... 34 

viii  

1.2.7  Summary ............................................................................................................................. 34 

1.3  Ion transporters .......................................................................................................................... 36 

1.3.1  Introduction of Ion transporters ......................................................................................... 36 

1.3.2  Ion transporters in the esophagus ...................................................................................... 37 

1.3.3  Summary ............................................................................................................................. 38 

1.4  Sodium hydrogen exchangers (NHEs) ......................................................................................... 39 

1.4.1  Introduction ........................................................................................................................ 39 

1.4.2  NHE3 ................................................................................................................................... 39 

1.4.3  Summary ............................................................................................................................. 41 

1.5  Summary ..................................................................................................................................... 42 

2  Chapter II: SLC9A3/NHE3 dysregulation and dilated intercellular spaces in eosinophilic esophagitis

  43 

2.1  Copyright and Student Contribution ........................................................................................... 45 

2.2  Abstract ....................................................................................................................................... 45 

2.3  Introduction ................................................................................................................................ 47 

2.4  Material and Methods ................................................................................................................ 50 

2.5  Results ......................................................................................................................................... 58 

2.5.1  Transmembrane transporter SLC9A3/NHE3 specifically upregulated and correlated with 

eosinophil count and DIS in EoE ......................................................................................................... 58 

2.5.2  Increased NHE3 function in IL‐13–stimulated primary esophageal epithelial cells. ........... 59 

ix  

2.5.3  IL‐13 induces an EoE‐like transcriptome including increased transmembrane transporter 

activity and SLC9A3 overexpression in an in vitro, matured esophageal epithelium model system. 60 

2.5.4  IL‐13–induced NHE3 expression and function in differentiated esophageal epithelial cells.

  61 

2.5.5  Increased SLC9A3 expression and activity is linked with DIS formation............................. 62 

2.6  Discussion .................................................................................................................................... 64 

2.7  Figures ......................................................................................................................................... 69 

3  Chapter III: IL‐13 activated STAT3 and STAT6 pathways in Eosinophilic Esophagitis ....................... 104 

3.1  Copyright and Student Contribution ......................................................................................... 105 

3.2  Abstract ..................................................................................................................................... 105 

3.3  Introduction .............................................................................................................................. 107 

3.4  Materials and methods ............................................................................................................. 110 

3.5  Results ....................................................................................................................................... 115 

3.5.1  STAT binding site is one of the most enriched TFBS in EoE dysregulated genes .............. 115 

3.5.2  STAT binding site is the most enriched in both dysregulated genes and transcriptionally 

active genes following 4 hours incubation with IL‐13 in EPC2‐ALI ................................................... 115 

3.5.3  STAT3 is the most enriched TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes. ........................... 116 

3.5.4  STAT3 and STAT3‐related genes regulate barrier integrity of the esophageal epithelium

  117 

3.5.5  IL‐13 induced STAT3‐dependent genes are involved in IL‐13 induced cell proliferation . 118 

x  

3.5.6  IL‐13 induced STAT6‐dependent genes are involved in cytokine production but not IL‐13 

induced cell proliferation .................................................................................................................. 119 

3.6  Discussion .................................................................................................................................. 121 

3.7  Figures ....................................................................................................................................... 125 

4  Chapter IV: General Discussion and Summary ................................................................................. 144 

4.1  Alteration of transmembrane transporters expression in EoE ................................................. 145 

4.2  SLC9A3/NHE3 dysregulation in esophageal epithelium ........................................................... 149 

4.3  STAT involvement in EoE transcriptome ................................................................................... 153 

4.4  STAT3 regulates tissue remodeling in esophageal epithelium ................................................. 155 

4.5  STAT6 regulates cytokine production in esophageal epithelium ............................................. 157 

4.6  Summary ................................................................................................................................... 158 

4.7  Figures ....................................................................................................................................... 160 

5  References ........................................................................................................................................ 166 

 

   

xi  

List of Abbreviations

Abbreviation  Full Name 

AD‐HIES   Autosomal‐dominant hyper‐IgE syndrome  

ALI  air‐liquid interface 

AR  allergic rhinitis 

BE  Barrett’s esophagus  

BrdU  5‐Bromo‐2’‐deoxyuridine  

BZH  basal zone hyperplasia  

CAPN14  Calpain 14  

CCL26  Chemokine ligand 26  

CRAC  calcium release‐activated calcium  

CRLF2  Cytokine receptor‐like factor 2  

DIS  dilated intercellular spaces  

DSG1  Desmoglein‐1  

EA  Esophageal adenocarcinoma  

ECP  eosinophil cationic protein  

EDN  Eosinophil‐derived neurotoxin  

EDP  EoE diagnostic panel  

EMT  epithelial‐mesenchymal transition  

ENaC  epithelium sodium channel  

EoE  Eosinophilic Esophagitis 

ERK  Extracellular signal‐regulated kinase  

FLG  Filaggrin 

GERD  gastroesophageal reflux disease  

GO  gene ontology  

GWAS  genome‐wide association study 

H&E  hematoxylin and eosin  

H3K4me3  trimethylation of lysine 4 on histone H3  

IF  immunofluorescence 

ILC2  Group 2 Innate lymphoid cells  

iNKT   invariant natural killer T cell 

JAK  Janus kinase  

KD  knockdown 

KLK  kallikrein  

LRRC31  leucine‐rich repeat‐containing protein 31  

MBP  major basic protein  

NHE  sodium‐hydrogen exchanger  

NL   Normal healthy control 

pHi  intracellular pH  

PPI  Proton pump inhibitor  

PPI‐REE proton pump inhibitor‐ responsive eosinophilic esophagitis 

xii  

RNAseq  RNA sequencing 

SFED  Six‐food elimination diet  

SLC  Solute carrier family  

SNP   single nucleotide polymorphisms 

STAT  Signal transduction and activator of transcription  

TEER  Trans‐epithelial electrical resistance  

TFBS  transcription factors binding site 

TGFB1  Transforming growth factor, beta 1  

TSLP  Thymic stromal lymphopoietin   

   

xiii  

List of Figures and Tables

Figure 2‐1. SLC9A3 is the most upregulated transmembrane transporter activity gene in the EoE 

transcriptome, and levels correlate with EoE severity and DIS .................................................................. 69 

Figure 2‐2. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in primary esophageal epithelial cells derived 

from EoE biopsy in response to IL‐13. ........................................................................................................ 72 

Figure 2‐3. Mature stratified squamous esophageal epithelium model using EPC‐ALI culture system. .... 74 

Figure 2‐4. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in IL‐13–stimulated EPC2‐ALI. ..................... 76 

Figure 2‐5. Blockade of NHE3 protected EPC2‐ALI from IL‐13–induced dilated intercellular spaces (DIS).

 .................................................................................................................................................................... 78 

Figure 2‐6. Demographics of patient cohorts examined in RNAseq analysis or qPCR. .............................. 80 

Figure 2‐7. GO analysis of dysregulated genes in EoE patients .................................................................. 82 

Figure 2‐8. IL‐13–induced proliferation in EPC2‐ALI is attenuated by NHE3 inhibitor EIPA. ...................... 84 

Table 2‐1. Expression level of 572 genes dysregulated in mature EPC2‐ALI by IL‐13. ................................ 86 

Table 2‐2. GO analysis of IL‐13–induced dysregulated genes in mature EPC2‐ALI. ................................. 101 

Figure 3‐1. STAT binding site is one of the most enriched TFBS in EoE dysregulated genes .................... 125 

Figure 3‐2. STAT binding site is the most enriched in both dysregulated genes and transcriptionally active 

genes following 4hr incubation with IL‐13 in EPC2‐ALI ............................................................................ 128 

Figure 3‐3. STAT3 is the most upregulated STAT protein in 4hr IL‐13 treated EPC2‐ALI. And STAT3 binding 

site is the most enriched TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes. ....................................................... 130 

Figure 3‐4. STAT3 and STAT3‐related genes regulate barrier integrity of esophageal epithelium .......... 132 

Figure 3‐5. IL‐13 induced STAT3‐dependent genes are involved in IL‐13 induced cell proliferation ....... 135 

Figure 3‐6. IL‐13 induced STAT6‐dependent genes are involved in cytokine production but not IL‐13 

induced cell proliferation .......................................................................................................................... 138 

xiv  

Figure 3‐7. Proposed mechanism of IL‐13 driven STAT3 and STAT6 dependent transcriptome alteration in 

esophageal epithelium .............................................................................................................................. 142 

Figure 4‐1. Acid protection mechanism in esophagus .............................................................................. 160 

Figure 4‐2. JAK/STAT signaling pathway ................................................................................................... 162 

Figure 4‐3. Proposed Mechanism of IL‐13 induced NHE3‐dependent DIS formation in EoE ................... 164 

 

15  

1 Chapter I: Introduction

1.1 Eosinophilic Esophagitis 

1.1.1 Introduction 

In the past 20 years, Eosinophilic Esophagitis (EoE) has been increasing in prevalence worldwide. Its 

prevalence reached 0.5‐1 in 1000 in 20141, which is similar to diseases including the inflammatory bowel 

diseases, Ulcerative colitis and Crohn’s Disease. Observed in both pediatrics and adults, EoE is 

characterized by esophageal eosinophilia, leading to symptoms such as dysphagia, food impaction, and 

abdominal pain2. In 2015, patients with EoE cost an estimated $1.4 billion per year in United States3. 

However, with such high health‐care cost, the current therapeutic options for EoE is still not optimal. 

EoE patients who are on a food elimination diet still suffered from the low quality of life, with chances of 

disease remission. As a result, better therapeutic strategies need to be developed. The following section 

will focus on the current knowledge of the pathogenesis of EoE and the available therapeutic options.  

1.1.2 Pathogenesis of EoE 

1.1.2.1 Food allergens 

Food is considered as one of the major triggers for EoE4. Different than usual food allergy, EoE patients 

are usually hypersensitized with multiple food allergens5,6. However, a case study on 30 children 

identified close association with food allergies with EoE occurrences7. Also, direct food allergen extract 

injection in the esophagus in EoE patients caused acute EoE symptoms including luminal obstruction and 

mucosal blanching8. The causative role of food allergens in EoE is further supported by the success of 

food elimination diet in the treatment of EoE9. Multiple clinical studies showed that elimination of 

positive foods identified in skin prick or patch testing led to resolution or partial improvement of 

16  

symptom in confirmed in EoE patients while introducing these foods back to diet caused the re‐

emergence of esophageal eosinophilia10‐13. 

1.1.2.2 Environmental factors 

Multiple clinical investigations have reported that a high percentage of EoE patients are sensitized to 

both food allergens and aeroallergens5,14, suggesting the involvement of environmental factors like 

aeroallergen as risk factors to induce EoE. To further support for this argument, a case study reported an 

EoE patient hypersensitized to an aeroallergen but did not have food allergy15. In addition, three other 

patients reported the onset of EoE following exposure to a large volume of aeroallergen16, suggesting 

potential that environmental antigens can induce EoE. Consistent with this argument, repetitive 

challenge of mice with Aspergillus. Fumigatus intranasally17 or epicutaneously18 could prime pathological 

changes including eosinophils infiltration and epithelial hyperplasia in the esophagus, similar to the 

histological phenotype of EoE patients19.  

Aside from aeroallergens, other environmental factors including insects, season and early life exposure 

have also been shown to correlate with the incidence rate with EoE. Furthermore, epidemiology studies 

have reported that EoE occurrence is related to geographical regions20 and climate zone20, indicating EoE 

prevalence being significantly higher in urban and suburban areas within the cold climate zone.  

1.1.2.3 Genetic Predisposition 

Although a non‐Mendelian pattern of heritance in EoE patients, epidemiology studies have reported a 

high occurrence of EoE in European descent, male individuals suggesting a potential genetic 

predisposition21,22. A clinical study investigating five families of EoE patients found that 40% of patient’s 

first‐generation offspring showed EoE or EoE‐like symptoms23. Furthermore, twin and family analysis 

within 914 families with genetic risk showed the heritability of EoE within first‐degree relative is as high 

as 72%, and the recurrence risk ratios are higher in male relatives24. 

17  

One of the explanations for family inheritability of EoE is the genetic susceptibility. By performing 

genome‐wide association (GWAS) studies comparing EoE patients and healthy controls, genome 

associated single nucleotide polymorphisms (SNPs) have identified in several EoE‐related genes25. 

Variants of both inflammatory‐related genes (Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)26,27, Cytokine 

receptor‐like factor 2 (CRLF2)27, Chemokine ligand 26 (CCL26)28 and Transforming growth factor, beta 1 

(TGFB1)29) and barrier‐forming gene (Filaggrin (FLG)30 and Calpain 14 (CAPN14)31) are found genome‐

wide associated with EoE patient cohorts. Other studies such as Phenome‐wide association study 

identified more SNPs in EoE patients32. However, the involvement of these SNPs in EoE need further 

confirmation32. 

1.1.2.4 Immunological pathways 

Although being induced by food allergens, different from most common food allergic disorders, EoE is a 

Type‐2 T‐cell‐mediated, eosinophils‐predominant immunological disorder33. Also, one crucial histological 

observation in EoE is more than 15 eosinophils infiltration per high power field (Eos/HPF) in esophageal 

biopsies, suggesting the contribution of immunological responses in the pathogenesis of EoE34. 

Immunoglobulin 

Different than 80% of food allergic disorders, EoE is considered as a non‐IgE‐mediated hypersensitivity35. 

Experimental studies in mouse model systems have revealed that allergen‐induced EoE phenotypes such 

as esophageal eosinophilia do not require B cells36 and IgE37. Also, a clinical study reported no alteration 

of eosinophil counts on patients receiving anti‐IgE therapy, while discovered increased serum level of 

IgG4 against food allergen38. Furthermore, a recent study found increased IgG4 plasma cell density in 

pediatric EoE patients’ esophageal biopsies compared to normal healthy control39. Together with the 

finding that food‐specific IgG4 is decreased in EoE patients after receiving diet elimination therapy40, 

IgG4 is considered associated with the development of EoE. 

18  

Immune cells 

Eosinophils 

Under physiological condition, eosinophils are absent in esophagus. While in EoE patients, eosinophils 

present in both the proximal and distal esophagus41 and often associated with morphologic 

abnormalities42. Activation of eosinophils leads to the release of granule contents including major basic 

protein (MBP)， Eosinophil‐derived neurotoxin (EDN), and eosinophil cationic protein (ECP), which have 

proinflammatory and cytotoxic effects43. Increased EDN deposition is observed in adult EoE patients44, 

and its activation effect on dendritic cells may lead to the production of immunological mediators45. 

Also, activated eosinophils can generate inflammatory cytokines (including IL‐5, IL‐13, TGF‐beta 1)43, 

which modulate the polarization, recruitment, and homeostasis of lymphoid cells like T cells46. Also, 

eosinophils could act as antigen presenting cells and induce antigen‐specific T cell proliferation47. 

Overall, increased intraepithelial eosinophils could regulate both innate and adaptive immune responses 

in the esophagus, thus directly affect pathological development in EoE.  

T Cells (T helper cells, T regulatory cells) 

T cell involvement in EoE is derived from the observation of increased T cell number and Th2 cytokine 

secretion in patients’ esophageal epithelium48,49. It is further supported by T‐cell deficient murine model, 

which was protected from EoE phenotype, while B‐cell deficient mice developed EoE as wild‐type36. 

More specifically, CD8‐deficient mice are not protected from the induction of experimental EoE while 

CD4‐deficient mice showed less EoE phenotype36, indicating T helper cell involvement rather than 

cytotoxic T cell. A clinical evaluation comparing nonatopic children with pediatric EoE patients showed 

increased IL‐5 expressing CD4+ T cells, but not IFN‐γ CD4+ T cells, indicating a skewed immunological 

pathway toward Th2 immunity50. These increased Th2 cells in EoE patients then led to increased 

secretion of Th2 cytokines including IL‐5 and IL‐1351. IL‐5 regulates genes that are essential for 

19  

eosinophil growth, survival and effectors functions52, which is critical for the accumulation of 

intraepithelial eosinophils53 in the esophagus. IL‐13 contributes to increased expression of Eotaxin‐328, 

which is a chemokine that is important for eosinophils activation and recruitment, and alteration of 

esophageal epithelium transcriptome54. 

Regulatory T cells (Treg) are a subset of T cells that negatively regulate immune responses55. Previous 

studies indicated a protective role of Treg in allergic disorders56. Decreased Treg numbers have been 

observed in adult EoE patients57. Also, in an experimental murine model of EoE, Treg number were 

reported to be decreased in mice following allergen challenge58, suggesting a negative regulation of anti‐

inflammatory effect in EoE. However, increased Treg numbers were reported in pediatric EoE 

patients59,60. It is speculated that these Tregs in EoE patients are defective33. Also, previous study 

indicated Th2 cell sensitivity in responding to Treg regulatory effect in allergic patients61, which might 

explain the reason of increased Tregs in pediatric EoE. However, further studies to compare the 

difference of Tregs in pediatric and adult EoE patients are needed to characterize the role of Treg in EoE 

better.  

Basophils 

Basophils, as the least abundant granulocyte in peripheral blood, have been reported deeply involved in 

allergic disorders such as atopic dermatitis62, acute hypersensitivity63, and asthma64. In EoE patients, 

basophil numbers were increased in PPI‐non‐responsive EoE patients37,65 and positively correlated with 

severity of eosinophilia in esophageal biopsies37. Patients who underwent steroid treatment and 

showed relief of symptoms showed reduced basophil counts65. Basophils are known to generate Th2 

cytokines including IL‐4 and IL‐13, and basophil‐secreted IL‐4 is essential for T cell differentiation into 

Th2 cells66. Studies using experimental EoE mice model further validate the importance of basophils in 

Type‐2 inflammatory responses, as mice depleted of basophils showed decreased eosinophil population 

20  

and Th2‐cytokine skewed transcriptome compared to wild‐type mice37,67. Together, basophils may serve 

as a therapeutic target for EoE based on its effect on the development and progression of Th2 

inflammatory responses68. 

Mast cells 

Although EoE is an IgE‐independent allergic disorder, mast cells are still deeply involved in the 

immunological pathways of EoE69. Mast cell number and degranulation are significantly increased in 

esophageal mucosa in both EoE patients70 and experimental EoE murine models71 and could be reversed 

by steroid treatment69 and food elimination therapy72. Human mast cells are shown to produce IL‐13, 

which is an important cytokine for EoE pathogenesis, upon high‐affinity IgE‐crosslinking73. Mast cells 

could also form “allergic effector unit” together with eosinophils, which resulted in augment of activity 

of both cells, increase expression of soluble mediators like TNF‐α and promote allergic responses74,75. By 

comparing mast cell‐deficient and mast cell‐reconstituted mice, a recent study indicated that mast cells 

contribute to the pathogenesis of allergen‐induced EoE in mice by promoting smooth muscle 

hyperplasia and hypertrophy71. It is also suggested that the mast cells contribute to the pathogenesis of 

EoE by influencing KIT ligand expression69, secreting cytokine that leads to increasing esophageal 

contractility76. 

ILC2s  

In EoE patients, Group 2 Innate lymphoid cells (ILC2s) percentage is much higher than normal healthy 

control and is correlated with the level of esophageal eosinophilia77. ILC2s are linage‐negative cells that 

produce Type‐2 inflammatory cytokines and contribute to human allergic diseases78. Activated by 

epithelial secreted cytokines such as IL‐33 and TSLP79,80, ILC2 cells are considered to play a pathogenic 

role in EoE81 due to its ability to secrete type 2 cytokines IL‐5 and IL‐1382, which are previous 

characterized contribute to the progression of EoE.  

21  

iNKT Cells 

Another cellular source for Th2 cytokines is invariant natural killer T cells (iNKTs). In pediatric EoE 

patients, increased iNKTs are observed in esophageal biopsies, while decreased in peripheral blood83. 

CCL5 is a member of C‐C chemokine family, and previous studies showed that CCL5 important for 

eosinophil recruitment and activation84,85. Upon stimulation of food allergen, iNKTs isolated from EoE 

biopsies are activated and producing higher CCL5 compared to normal healthy control83. Consistent with 

other cells that contribute to EoE, patients received elimination diet therapy showed reduction of iNKTs 

in esophageal epithelium86. Moreover, the failure of inducing EoE phenotype in iNKT cell‐deficient mice 

further support the crucial effect of iNKTs in EoE pathogenesis87.  

Cytokines  

A variety of cytokines are elevated in EoE patients, especially Th2 cytokines including IL‐4, IL‐5, and IL‐

1349. In this section, we will focus on other cytokines, and discuss IL‐13 in the next section. 

IL‐4 

IL‐4 is known to activate naïve T cells and promote its proliferation and differentiation into Th2 cells88. In 

EoE patients, the blood level of IL‐4 is significantly higher than healthy controls51. However, multiple 

studies showed no significant increase of the mRNA level of IL‐4 in biopsy samples from EoE patients51,54. 

These different observations might be explained by the allergic status of EoE patients recruited. A study 

comparing EoE patients with or without allergic symptoms showed the increased IL‐4 level is attributed 

to the presence of allergy but not EoE51. Given the critical role of IL‐4 in CD4+ Th2 differentiation, it 

could mainly act to induce naïve T cells differentiation in EoE as in other allergic disorders89. 

IL‐5 

22  

Similar to IL‐4, IL‐5 levels are increased in EoE patients90 and significantly higher in EoE patients with 

allergic symptoms51. One of the main contributions of IL‐5 in the pathogenesis of EoE is its function of 

recruiting eosinophils into the esophageal epithelium, which is partially dependent on eotaxin 

expression53. Also, recent generated transgenic mice with specific epithelial IL‐5 overexpression 

successfully resembled an EoE phenotype that is not restricted to eosinophilia91, but also tissue 

remodeling. Comparison between T cell‐specific IL‐5 transgenic mice and eosinophil linage‐deficient 

mice suggested that IL‐5 induced eosinophilia is important for tissue remodeling including collagen 

deposition in lamina propria, basal layer thickening in epithelium90, while IL‐5 induces esophageal 

dysmotility92 is independent of eosinophilic inflammation in the esophagus. However, although clinical 

trial testing Anti‐IL‐5 antibody (mepolizumab) showed a significant decrease of esophageal eosinophilia, 

minimal symptomatic remission was observed in EoE patients93. Taken together, IL‐5 drives eosinophil 

recruitment and induces esophageal epithelium remodeling in EoE, but both IL‐5 and eosinophils are not 

the only key driver of the disease. 

IL‐33 

IL‐33 is a newly discovered cytokine that belongs to IL‐1 cytokine superfamily. It could be secreted by 

stromal cells like endothelial and epithelial cells94, as well as immune cells like macrophages95. After 

binding to its receptor ST2 (IL‐1RL1), IL‐33 could either act as a traditional cytokine that mediates 

intracellular signaling pathways like NF‐κB or serves as a nuclear factor that mediates transcription of 

downstream genes96. ST2 is ubiquitously expressed in all human tissue97 and was upregulated after 

allergen challenge98. The activation of the IL‐33/ST2 axis is known to induce Th2 cytokines secretion 

including IL‐4, IL‐5, and IL‐13, which are critical cytokines in EoE pathogenesis99.  

Not surprisingly, the expression level of IL‐33 and ST2, are upregulated in pediatric EoE patients67,100, and 

IL‐33 is primarily located in CD45‐ cells, mast cell, and epithelial cells101. Experimental murine EoE model 

23  

also showed elevated IL‐33 and ST2 level67, which is critical for basophil‐induced esophageal 

inflammation. Mice treated with rIL‐33 for a week developed early stage phenotype of EoE and showed 

elevated Th2 inflammatory response101. IL‐33‐deficient and ST2 deficient mice showed decreased 

eosinophil counts in peripheral blood compared to wild‐type mice, indicating the role of IL‐33 in the 

early development of eosinophils102. 

Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) 

TSLP is an IL‐7 like cytokine that functions through binding to its receptor TSLPR. It is expressed by 

epithelial cells and could prime dendritic cells to differentiate naïve T cells into Th2 cells103. It is also 

showed to target NKT cells, mast cells and basophils, thus contribute to the development of various 

allergic disorders104,105. In EoE patients, TSLP is upregulated and primarily expressed in the suprabasal 

layer of esophageal epithelium106, but not elevated in serum107. The level of TSLP is dependent on NF‐kB‐

inducing kinase (NIK), as NIK knockout model which mimics EoE phenotype showed elevated TSLP 

level108. Interestingly, TSLP polymorphism was identified in EoE patients109 and a recent study linked this 

risk polymorphism with food allergen susceptibility110 and increased basophil activation in EoE37. Also, 

employing experimental murine model investigators demonstrate that inhibition of TSLP and basophil 

interaction was protective against EoE‐phenotype37, suggesting the importance of TSLP‐basophil axis in 

EoE. Furthermore, TSLP is shown to induce the formation of eosinophil extracellular traps (EET)105. EET is 

a protective mechanism against bacteria and pathogens, a recent study indicated a possible contribution 

of increased EET numbers and impaired epithelial barrier in the esophagus in EoE111. 

Tumor Growth Factor‐beta 1 (TGF‐β1) 

TGF‐β1 secreted by eosinophils, mast cells, and epithelial cells can induce extracellular matrix secretion 

of fibronectin and collagen I in primary fibroblasts derived from biopsies from EoE patients112. TGF‐β1 is 

thought to promote subepithelial fibrosis and vascularity through phosphorylation of SMAD2/3113 and 

24  

p38 mitogen‐activated protein kinase (MAPK)112. TGF‐β1 is also thought to promote epithelial‐

mesenchymal transition (EMT) which contributes to fibrosis often observed in the EoE esophagus114. The 

lamina propria fibrosis occurring in both pediatric115 and adult116 EoE patients is thought to contribute to 

strictures and esophagus narrowing117.  

1.1.2.5 Epithelium Involvement 

Normal esophageal epithelium is composed of non‐keratinized stratified squamous epithelial cells. 

Under physiological conditions, esophageal epithelial cells form a functional barrier and protect the 

esophagus from injury118. Under allergic conditions such as EoE, epithelium formed barrier is disrupted 

by protease‐active allergens or altered intrinsic proteases119, lead to antigen penetration and initiate 

inflammatory responses through antigen presenting cells120. This disruption of epithelium also leads to 

activation of the immune response of esophageal epithelial cells. Esophageal epithelial cells are capable 

of producing inflammatory cytokines and chemokines including CCL5, CCL26, TSLP and IL‐33 upon 

allergen challenges28,101,121. These molecules are important in mediating pathogenesis of EoE, which are 

discussed in later sections. 

Transcriptome analysis comparing esophageal biopsies from EoE patients and normal healthy control 

using RNAseq showed 1607 dysregulated genes122 that might have related to EoE pathogenesis. Gene 

cluster and ontology analysis indicated that immune response and immune effector process are the two 

most enriched gene ontology (GO) nodes within these dysregulated genes122. Consistent with this 

analysis, multiple studies showed the inflammatory contribution by the esophageal epithelium123. The 

expression level of eotaxin‐3 is 53‐fold higher in EoE patients compared to normal health control28. 

Encoded by CCL26 gene, Eotaxin‐3 is a chemokine secreted by esophageal epithelium upon the 

activation of IL‐1354  The local secretion of CCL26 is known to promote the recruitment of 

eosinophils124,125, which is a hallmark characteristic of EoE. Mice deficient of the eotaxin‐3 receptor 

25  

(CCR3) are protected from aeroallergen induced eosinophilia in esophagus28, implicating the importance 

of CCR3/CCL26 axis in esophageal eosinophilia. Other immune response‐related genes, tumor necrosis 

factor alpha‐induced protein 6 (TNFAIP6) and arachidonate 15‐lipoxygenase (ALOX15), are also found 

highly expressed in the esophageal epithelium in EoE biopsies. The previous study in cancer research 

suggested a potential role of ALOX15 in suppressing inflammation126. Meanwhile, TNFAIP6 was also 

thought to play a protective role in inflammation in rheumatoid arthritis127. It is possible that they 

counteract with other immune responses in esophageal epithelium. However, their actual mechanism in 

inducing EoE phenotype are still unclear128. 

Another group of genes that are significantly altered are epithelial barrier related genes. Several genes 

encode for junctional proteins, adhesion molecules and structural barrier proteins are downregulated in 

EoE patients129. Two major components of the epithelial barrier, E‐cadherin and claudin‐1 are decreased 

in expression in EoE patients, while occludin is increased123. Interestingly, occludin is showed to regulate 

cytokine‐induced barrier permeability in epithelial cells130. Other molecules related to epithelium barrier 

functions such as filaggrin (FLG)128,131,132 and Desmoglein‐1 (DSG1)133 are also found decreased in 

expression in EoE patients. The downregulation of these barrier related genes contributes to the loss of 

barrier integrity and epithelium remodeling133,134. These alterations in epithelium may then lead to 

increased penetration of antigens in esophageal mucosa120, and lead to further immunological 

responses. However, either the epithelial barrier disruption in EoE is causative or consequential of 

immunological activation is still debatable.  

1.1.3 Therapy 

1.1.3.1 Steroids 

Corticosteroids are the first‐line medical therapies in EoE patients135. Administration of systemic 

corticosteroid therapy to 20 EoE patients Induced significant remission of esophageal eosinophilia and 

26  

improvement of clinical symptoms in 19 out 20 patients 136. The most common steroids used to treat 

EoE are fluticasone and budesonide137, all of which are topical administered steroids. A clinical study 

investigating the long‐term effect of steroids demonstrated that swallowed fluticasone is effective in 

maintaining histological, endoscopic and symptomatic improvement in pediatric EoE patients over two 

years, without significant adverse effect138. In the meantime, double‐blind, placebo‐controlled clinical 

trial suggested the effectiveness of budesonide in treating EoE in adolescent and adult EoE patients116. 

The systemic steroids are now not recommended for EoE treatment, as it has no advantage on 

treatment efficacy compared to the topical steroid while producing systemic adverse effects such as 

hyperphagia and weight gain139. While topical steroids are supported by 11 randomized clinical trials for 

its effectiveness on histological remission in EoE140, its efficacy on resolving EoE symptoms is still 

debatable. A Recent clinical study showed EoE patients receiving fluticasone treatment had no 

significant improvement in dysphagia compared to patients receiving placebo, however also developed 

esophageal candidiasis141. This lack of symptomatic resolution may be related to the lack of mucosal 

contact time and the formulation of steroid137,142. The other caveat of this treatment is that the 

cessation of taking topical steroid will lead to the recurrence of disease143. However, current clinical 

trials showed that long‐term use of topical steroids is relatively safe and could maintain EoE in 

remission140. 

1.1.3.2 Dietary Intervention 

Food allergen or aeroallergen are used in the experimental murine model to induce EoE17, and most EoE 

patients showed hypersensitivity to various foods, different dietary antigen removal methods to treat 

EoE are tested over last two decades. 

Use dietary intervention to treat EoE was described in 1995. Ten patients with esophageal eosinophilia 

receiving protein‐free, amino based elemental diet and demonstrated remission of EoE symptoms144. 

27  

Since then numerous clinical trials have supported the effectiveness of this elemental diet and 

demonstrated significant improvements in both histological and symptomatic scores in EoE in all age 

groups145‐147. Also, elemental diet sometimes requires the insertion of nasogastric (NG) tube in pediatric 

and adolescent patients, which negatively impact patients’ quality of life148. Together, elemental diets 

are not recommended for long‐term therapy of EoE140 until other treatment options were proven 

ineffective. 

Food elimination diet is an alternative to elemental diet for EoE therapy. Six‐food elimination diet (SFED) 

and food allergy testing‐directed diet are found effective to induce EoE remission149. Six foods, including 

dairy, wheat, egg, soy, nuts, and seafood, are known as the most common inducer for food allergy and 

esophageal mucosal injury10,12. A recent study indicated SFED is more cost‐efficient than steroids, 

combined with their similarity on efficacy, SFED might be a better option for treatment of EoE150. Food 

allergy testing‐directed diet is based on either skin prick tests (SPTs) or atopy patch tests (APT)10, which 

are based on IgE‐mediated skin response. Together with the relatively low specificity of these tests, 

testing‐based food elimination diet showed relatively less effectiveness compared to SFED147.  

1.1.3.3 Proton Pump Inhibitor 

Proton pump inhibitor (PPI) was first used as a diagnostic tool for EoE to distinguish the disease from 

gastroesophageal reflux disease (GERD), as earlier criteria for EoE is its unresponsiveness to PPI 

treatment151. In 2011, a clinical study in adults with high esophageal eosinophilia and EoE‐like symptoms 

reported that 50% of these patients had clinicopathologic remission152. This discovery, together with 

prior success cases using PPI to resolve EoE‐like symptoms153, define a new subtype of EoE, proton pump 

inhibitor‐ responsive eosinophilic esophagitis (PPI‐REE). PPI‐REE patients showed similar disease 

phenotypes immunological mechanisms and transcriptome154,155. Long‐term application of PPI in PPI‐REE 

showed sustained remission of EoE phenotype with no substantial side effect156. Analyses of 94 EoE 

28  

related genes based on EoE diagnostic panel (EDP), the patient cohort with PPI‐REE showed similar 

molecular overlap with patients with PPI‐unresponsive EoE155. Interestingly, comparing the 

transcriptional change before and after PPI‐treatment, PPI showed an effect on Th2‐inflammation‐

related gene expression157. The mechanism of how PPI influences inflammatory response is unclear. In 

vitro study using primary esophageal epithelial cells showed the inhibitory effect of PPI on IL‐13 induced, 

STAT6‐dependent eotaxin‐3 expression158. However, this does not explain the different responses to PPI 

between PPI‐REE and EoE patients. Interestingly, a recent study showed that EoE patients showed 

remission of disease after elimination diet therapy also respond to PPI treatment159. Together with its 

clinically proved safety profile and easy oral administration, PPI is now used as first‐line anti‐

inflammatory therapy for EoE, although the underlying mechanism still yet to be elucidated140. 

1.1.4 Summary 

To summarize, EoE is a chronic, Th2‐inflammatory response‐mediated, allergic disorder in the esophagus 

with increasing prevalence. Multiple factors are involved in the pathogenesis of this disease, so targeting 

only one component always lead to the unsatisfied therapeutic outcome. Further understanding of the 

underlying molecular pathways that drive disease development will help to create more specific and 

efficient therapeutic options for EoE. 

   

29  

1.2 Interleukin‐13 (IL‐13) 

1.2.1 Introduction 

IL‐13 is a pleiotropic cytokine that was first described as a protein secreted abundantly by Th2 cells and 

influences growth and inflammatory pathways160. IL‐13 is 132 amino acids long protein that contains a 

four α‐helical bundle “up‐up‐down‐down”, which is characteristic of type‐I cytokine161. Structural studies 

have found  25% homology in amino acid sequences between IL‐4 and IL‐13 which is likely to contribute 

to the similar tertiary structure162. These shared homologies also explain the functional resemblance 

between these two cytokines. For instance, both IL‐4 and IL‐13 could signal through Type II IL4 

receptor163. 

1.2.2 Production of IL‐13  

IL‐13 is secreted by activated Th2 cells, and later studies found additional sources of IL‐13. mRNA 

transcript analysis indicated that, under allergic conditions, IL‐13 could be released by mast cells, 

basophils, and eosinophils, and acted as an early source of Th2 cytokines164. ILC2 cells, which are 

recently identified as another major source for Th2 cytokine, are a prodigious source of Il‐13165. Other 

cell types also contribute to the production of IL‐13 during type‐2 inflammation. For example, in an 

oxazolone colitis model IL‐13 is produced by natural killer T (NKT) cells166 when stimulated by α‐

galactosylceramide (α‐GalCer).  

1.2.3 IL‐13 signaling pathway 

1.2.3.1 IL‐13 Receptors 

IL‐13 achieve its biological function through binding to an IL‐13 receptor on the surface of effector 

cells167. IL‐13 can bind to two receptors; Type II IL4 receptor which is composed of two subunits, IL‐4 

receptor α chain (IL‐4Rα)168 and IL‐13 receptor α1 chain (IL‐13Rα1)169. It can bind to both IL‐4 and IL‐13, 

30  

explaining the overlapping biological of IL‐4 and IL‐13161. Interestingly, the cross‐competition experiment 

showed that IL‐13Rα1 is specific to IL‐13 but not IL‐4, and IL‐13Rα1/IL‐4Rα receptor heterodimer 

showed higher affinity to IL‐13 than IL‐4170. Also, IL‐13Rα1 expression level could be regulated by 

microRNA‐31 and microRNA‐155, and downregulation of the receptor expression leads to an inhibitory 

effect on IL‐13 signaling171. 

IL‐13 can also bind Type II IL‐13 receptor which is encoded by IL13RA2 gene. IL‐13Rα2 is 380 amino acid 

long and share some homology with IL‐5 receptor172. Different than ubiquitously expressed IL‐13Rα1, its 

transcript was observed in human liver, lung, thymus, placenta, brain, and heart173. Research studying 

murine IL‐13Rα2 (mIL‐13Rα2), which shared 59% amino acid identity with human version, showed an 

inhibitory effect of mIL‐13Rα2 on IL‐13 induced splenocyte activation173. The fact that injection of 

soluble IL‐13Rα2‐Fc fusion protein failed to expulse parasite N. brasiliensis from mice further supported 

the neutralizing effect of IL‐13Rα2 on IL‐13, as this parasite expulsion is dependent on IL‐13 activation174. 

Human IL‐13Rα2 is proved to be an IL‐13 decoy receptor, which internalized after binding to its ligand175.  

1.2.3.2 JAK/STAT pathway 

When IL‐13 is secreted, it first binds to IL‐13Rα1 and leads to heterodimerization with IL‐4Rα chain, 

which forms Type II IL4 receptor complex. After the formation of Type II IL4 receptor, IL‐13 could signal 

through activating Janus kinase (JAK)/ Signal transduction and activator of transcription (STAT) 

pathway176. 

JAKs are a group of tyrosine kinases which consists of 4 family members, JAK1‐3, and Tyk2177. IL‐13 

signaling through Type II IL4 receptor activates JAK1 and Tyk2178, which results in phosphorylation in the 

cytoplasmic domain of IL‐4Rα chain provide docking sites for signaling molecules such as STATs179. STAT 

proteins are transcription factors that are presented in cytoplasmic compartments. When recruited by 

activated JAKs, STAT proteins are phosphorylated and form homodimers180. This activated form of STAT 

31  

complex will then recruited into the nucleus, binding to conserved gamma‐activated sites (GAS) motif in 

the promoter area of cytokine‐inducible genes and activate gene transcription181. 

In 1996, IL‐13 was shown that not able to increase MHCII expression and decrease Nitro Oxide (NO) 

production in macrophages derived from STAT6 knockout mice, suggesting its signaling dependency on 

STAT6182. When STAT6 gets recruited to IL‐4Rα chain, it will be phosphorylated and activated. The 

activated STAT6 monomers will then dimerized and translocate to nuclei, where it will bind to promoter 

areas of genes that have pro‐inflammatory functions161.  

Close investigation on the cytoplasmic domain of IL‐13Rα1 chain identified tyrosine residue that had a 

consensus sequence for binding of STAT3 docking domain. IL‐13 treatment of myeloid cells showed an 

increase of STAT3 phosphorylation and activation, that was dependent on the presence of IL13Rα183,184. 

IL‐13 induced STAT3 activation is thought to be dependent on p38 MAPK phosphorylation, as 

pharmacological inhibition of p38 MAPK leads to significant decrease of STAT3 phosphorylation and DNA 

binding185. The importance of IL‐13 dependent STAT3 activation remains unclear. One of its potential 

roles is the regulation of keratinocyte differentiation, as demonstrated by a study using JAK inhibitor 

that blocks STAT3 activation186. 

Other stat proteins, including STA1α, 5A, 5B, are also showed increased phosphorylation in human 

monocytes upon IL‐13 treatment187. IL‐13‐induced STAT1 α activation is related to 15‐lipoxygenase 

expression, which is essential for inflammatory mediator generation in atherosclerosis185. The role of 

STAT5a/b in IL‐13 signaling pathway is unclear, but the activation of STAT5 contribute to B cell 

proliferation and gene regulation when induced by IL‐4188. 

Extracellular signal‐regulated kinase (ERK)  

ERK1 and ERK2 are two protein kinases that belong to MAPK family. These two proteins share 84% 

sequence homology and have similar functions, thus generally referred to as ERK1/2. As most MAP 

32  

kinases, ERK1/2 catalyzes phosphorylation of different substrates and initiates activation of downstream 

pathways189. In pancreatic and ovarian cancer cells, IL‐13 promotes cancer metastasis in a STAT6‐

independent pathway, through its interactions with IL‐13Rα2 and activation of ERK1/2 pathway190,191. 

Furthermore, the similar signaling pathway is observed in IL‐13 induced lung inflammation192. 

1.2.3.3 Other regulators of IL‐13 signaling 

IL‐13 could induce NF‐κB activation in different types of cells. In human bronchial smooth muscle cells, 

IL‐13 induces NF‐κB p65 translocation in IκB kinase (IKK)‐dependent pathway193. In the meantime, in 

pancreatic stellate cells, IL‐13 is shown to regulate TGF‐β1 expression by suppressing NF‐κB transcription 

activity194. 

IL‐13 can induce increased IL‐13Rα2 expression in human keratinocytes. This process is dependent on 

ERK, p38 MAPK, JAK2 and STAT6 activation, which is an IL‐13Rα1‐dependent pathway195. As a result, it is 

fair to speculate this pathway acts as a negative feedback pathway that controls the level of IL‐13 

activation. This statement is further supported by TGF‐β1’s augment effect on IL‐13, which is achieved 

through decreasing IL‐13Rα2 expression196. 

1.2.4 IL‐13 function under physiological and pathological conditions 

The primary function of IL‐13 is to promote inflammatory responses197. Under physiological conditions, 

IL‐13 and other Th2 cytokines are essential for parasite expulsion198. By employing experimental murine 

model, a study showed IL‐13’s protective role against a variety of intestinal nematode parasite through 

activating both bone marrow‐derived and non‐bone marrow‐derived cells199. 

Under pathological conditions, in most immunological disorders, the IL‐13 level is significantly elevated. 

The increased circulating IL‐13 can promote B cell activation, induce immunoglobulin isotype switching 

and synthesis, and contribute to IgE‐mediate allergic diseases200 like asthma. It could also activate non‐

33  

hematopoietic cells like airway epithelial cells, and lead to increased mucus secretion and airways 

hyperresponsiveness201. 

Different than its function in promoting immune responses, IL‐13 serves as a suppressor for tumor 

immunosurveillance. Mouse tumor models identified IL‐13’s inhibitory role in cytotoxic T cells‐mediated 

tumor clearance. Also, IL‐13 is also showed to decrease E‐cadherin expression in colon cancer cell line, 

which decreases cell adhesion and contribute to tumor metastasis202.  

Not only altered IL‐13 level leads to disease progression, but altered expression of IL‐13 receptor also 

causes diseases. In glioblastoma, IL‐13Rα2 is highly expressed and associated with increased malignancy 

grade and poor patient prognosis203. Recently, immunotherapeutic approaches targeting IL‐13Rα2 have 

been widely developed, and clinical trials showed positive outcomes in improving patients’ survival rate 

and quality of life204. 

1.2.5 IL‐13 in EoE 

The potential pathogenic role of IL‐13 in EoE is first suggested by the increased IL‐13 production T cells 

and eosinophils in EoE patients compared to normal healthy controls48,205. It is further supported by 

experimental mice experiments, as intratracheal IL‐13 treatment led to increased eosinophil infiltration 

and epithelial hyperplasia in a STAT6‐dependent manner206. In addition, transcriptome analysis 

comparing EoE‐specific dysregulated genes and IL‐13 induced genes in primary cells derived from EoE 

patients established IL‐13’s role in EoE pathogenesis54. This study not only demonstrated that IL‐13 

directly regulates EoE‐associated genes, but it also explained the previous established eotaxin‐3 

overexpression in EoE28. A study using EoE mice model showed that the deletion of decoy receptor IL‐

13Rα2 exacerbated collagen deposition and circumference in the esophageal epithelium, supporting the 

role of IL‐13 in epithelium remodeling in EoE207. 

34  

Over the last decade, more genes induced by IL‐13 have established their contribution in the 

pathogenesis of EoE. Increased IL‐13 in EoE patients lead to the upregulation of Leucine‐rich repeat‐

containing protein 31 (LRRC31)208 and CAPN14209. Also, Adherent proteins such as DSG‐1133, FLG131 and 

SPRR330 were all decreased in EoE and downregulated by IL‐13. Together, these genes, altered by IL‐13, 

that contribute to barrier disruption and formation suggested the direct role of IL‐13 in influencing 

esophageal epithelium barrier in EoE. 

1.2.6 IL‐13‐related treatment 

Over last decades, different drugs have been developed to target IL‐13 in IL‐13 mediated diseases. IL‐13 

IgG4 monoclonal antibody established its ability to decrease eosinophilia in both airway and esophageal 

epithelium210. In 2015, clinical trial using intravenous anti‐IL‐13 antibody QAX576 indeed showed 

improvement in esophageal eosinophilia and change in disease‐related transcriptome change211. 

However, the primary endpoint for this therapy was not met. In 2017, RPC4046, a new antibody against 

IL‐13 receptors, established its ability to reduce esophageal eosinophil counts in EoE patients in its phase 

II clinical trial212. Also, treatment using antibody Dupilumab, that blocks IL‐4Rα subunit, also showed 

relief of intraepithelial eosinophilia, improved symptoms and quality of life compared to the placebo 

group in EoE patients213. A small number of clinical trials have been conducted and indicated its safety 

and potential ability to relieve symptoms like dysphagia212. More information like the clinical trial result 

from larger cohorts is needed, but this new antibody showed a promising result in anti‐IL‐13 therapy in 

EoE. 

1.2.7 Summary 

IL‐13 is a Th2 cytokine that is elevated in EoE patients. It leads to transcriptome changes in EoE, which 

contribute to pathological phenotypes such as esophageal eosinophilia and epithelium remodeling. 

Targeting IL‐13 in clinical trials showed some positive outcomes in treating EoE. As a result, further 

35  

understanding IL‐13 signaling pathways in EoE will be beneficial in discovering accurate treatment 

options. 

   

36  

1.3 Ion transporters 

1.3.1 Introduction of Ion transporters 

Ion channels and transporters are essential for almost all types of cells due to their functions in 

regulating electrolyte concentration inside and outside cells. The concentration of ions is important for 

generating electric potential, mediating fluid transport, adjusting cell volume and activating signaling 

pathways214,215. Dysregulation of ion transporter activities is pathogenic in many diseases especially in 

the lung, gastrointestinal tract, and kidney216‐218. 

One of the critical functions of ion transporters is regulating fluid movement through changing ion 

concentrations219. Mucociliary clearance (MCC) plays an important role in maintaining lung functions. 

Impaired MCC in juvenile mice showed increased Th2 inflammation in the airway, which contributes to 

the development of diseases such as asthma220. Efficient MCC requires the right volume of airway 

surface liquid (ASL), which is regulated by the concentration of different electrolytes221. Alteration in 

transportation proteins for Na+, K+, Cl‐ or Ca2+ could lead to volume changes of ASL. For instance, 

epithelium sodium channel (ENaC) is one of the primary mediators for sodium reabsorption in lung 

epithelium. In patients with cystic fibrosis, ENaC is hyper‐activated which lead to depletion of sodium 

and then ASL in the surface of airway epithelium, thus cause a decrease of MCC and contribute to the 

progression of disease222.  

Ion transporters are also known to regulate intracellular signaling pathway. Calcium concentration is 

essential for lymphocyte functions, including mast cell degranulation, T cell proliferation and cytokine 

production and B cell differentiation223. One of the important calcium concentration regulators in 

lymphocytes is calcium release‐activated calcium (CRAC) channel. Patients with CRAC channels mutation 

fail to maintain sustained calcium level in lymphocytes, thus unable to induce T cell activation. This yield 

to immunodeficiency in patients which lead to life‐threatening infections224.  

37  

1.3.2 Ion transporters in the esophagus 

Unlike other parts of the gastrointestinal tract, the esophagus does not undergo significant secretion 

and absorption which requires the deep involvement of multiple ion transportation pathways, as it 

mainly acts as conduct for food to pass to the lower GI tract225. However, one of the major functions of 

esophageal epithelium is to prevent gastric acids damage the outer esophageal epithelium. As a result, a 

set of ion transporters that provides buffering capacity is expressed in esophageal epithelium226,227. 

Postprandial acid reflux occasionally happens in esophageal epithelium of normal individuals under 

physiological conditions228‐230. To prevent the acid from causing tissue injury, esophageal submucosal 

glands and acid‐base transporters in esophageal epithelial cells are activated, which neutralize or 

remove acid in the lumen by HCO3‐ delivery or H+ uptake231,232. When esophageal epithelium is exposed 

with prolonged episodes of acid refluxate due to dysregulation of the lower esophageal sphincter (LES), 

the acid amount might exceed the acid clearance capacity of the esophagus and lead to diseases like 

gastroesophageal reflux disease (GERD) and Barrett’s esophagus (BE)233. 

BE is a medical condition caused by repeated exposure to gastric acids234, it usually presents with long‐

term GERD symptoms and may progress into esophageal cancer235. The esophageal epithelial cells of BE 

patients changed from normal stratified squamous epithelium (ESSE) to specialized columnar epithelium 

(BSCE). These two different forms of esophageal epithelium have different electrical parameters, as 

BSCE has lower transmembrane electrical resistance and higher secretory capacity236. Further 

investigation found decrease activity of sodium‐hydrogen exchanger 1 (NHE1)237,238. The inhibition of 

NHE1 leads to increased intracellular acidity, which causes DNA damage that could contribute to cancer 

progression239. 

Esophageal adenocarcinoma (EA) is one of the most prevalent cancers worldwide with low five‐year 

survival rate. Under physiological condition, the apoptosis pathway in esophageal epithelial cells will be 

38  

activated after long‐term exposure to bile acid240. In cancerous esophageal epithelium, the resistance of 

bile acid‐induced apoptosis is dependent on its inhibitory effect on NHE activity241. It is suggested that 

NHE‐mediated intracellular sodium increase induce the caspase 3/9 activation, which leads to cell 

apoptosis under physiological condition242. 

1.3.3  Summary 

Ion channels and transporters are expressed in the esophageal epithelium and are predominantly 

involved in the regulation of luminal acid. Dysregulation of ion transporters is involved in multiple 

diseases including esophagus related diseases. As a result, it is important and necessary to understand 

the involvement of ion transporters in the disease context, so they could potentially serve as therapeutic 

targets in esophageal diseases.  

   

39  

1.4 Sodium hydrogen exchangers (NHEs) 

1.4.1 Introduction 

NHEs are a group of sodium‐proton exchangers encoded by SLC9 (Solute carrier family 9) gene 

families243. Currently, the SLC9 family consists of 9 different isoforms, NHE1 – NHE9. These exchangers 

are known for their roles in regulating intracellular pH, and osmotic force mediates by sodium, as they 

function through exchanging extracellular Na+ with intracellular H+244.  

NHE1, encoded by SLC9A1 gene, is the most widely studied isoform within the SLC9 family. NHE1 

consists of 815 amino acids with 12 transmembrane domains245. In humans, it is ubiquitously expressed 

and important for pHi regulation246. It is also shown to regulate cell volume by altering osmotic force 

through influence sodium concentration247. In myocardial cells, NHE1 is activated by ischemia‐induced 

acidosis, which leads to accumulation of intracellular sodium248. This increased sodium concentration 

activates the Na+/Ca2+ exchanger NCX, led to cell death due to increased intracellular calcium249. 

Consistent with this observation, deletion of NHE1 protects mice from ischemia/reperfusion (I/R) injury, 

indicating the pathogenic role of NHE1 in this process250. NHE1 is also involved in cancer progression and 

metastasis due to its role in regulating pH of cancer microenvironment251. In light of this, NHE1 inhibitors 

including Cariporide are thought to be potent anti‐cancer drugs252. However, no clinical trials have 

established this use of NHE1 inhibitors yet. 

Other isoforms of NHEs are all restricted expressed in specific tissue types. NHE2‐5 are cytoplasmic 

binding proteins, while NHE6‐ NHE9 are specifically expressed on the membranes of organelles. Since 

most NHEs shared certain homology with NHE1, although regulated by different molecules, NHE2‐9 

proteins all contribute to pH regulation in either cytoplasm or organelle compartments253. 

1.4.2 NHE3 

40  

NHE3 is isoform 3 of SLC9 family, encoded by SLC9A3 gene. It was discovered in 1992 and shared 39% 

amino acid sequence to NHE1254. Different than NHE1, NHE3 is majorly expressed in the gastrointestinal 

tract and renal tissue255, with some expression in human ovary and testes256.  

To distinguish the contribution of NHE3 from other NHEs in disease phenotypes, mice with functional 

ablation of NHE3 were generated257. Global NHE3 knockout mice showed slight diarrhea, acidotic blood 

and decreased blood pressure, suggesting the role of NHE3 in regulating fluid absorption and acid‐base 

homeostasis especially in kidney and gastrointestinal tract257,258.  

Located in luminal side of the cellular membrane, NHE3 is responsible for Na+‐mediated fluid 

reabsorption in the proximal tubule of kidney259. Also, the NHE3‐dependent H+ secretion is important for 

bicarbonate reabsorption in the proximal tubule260. Increased NHE3 expression and activity lead to 

increased Na+‐reabsorption, which promotes extracellular fluid volume expansion, thus ended up 

causing increased blood flow261. This constant increased blood flow then leads to a supply‐demand 

mismatch of blood flow, causing vascular remodeling and resulted in hypertension262. As a result, the 

increased NHE3 expression is observed during hypertension in rat models263. Moreover, a study 

suggested an elevated NHE3 function in rat with heart failure, suggesting the role of NHE3 in mediating 

cardiac dysfuction264. In contrast, mice lacking NHE3 exhibited phenotypes such as urinary salt wasting, 

acidosis, reduced blood pressure and hypervolemic shock, indicating the importance of NHE3 in renal 

fluid volume homeostasis265. 

NHE3 is also shown to be essential for the intestinal Na+ absorption and fluid volume regulation266. 

Different than patients with hypertension, patients with diarrhea showed decreased NHE3 expression 

and activity267. This could be induced by bacteria secreted enterotoxin, which inhibited NHE3 activity in 

cAMP‐dependent pathway261. This decrease in NHE3 activity leads to disrupted osmolarity between 

intestinal epithelium, causing the fluid move to intestinal lumen268.  

41  

Recently, microbiota has been identified to influence the immune and metabolic homeostasis in 

gastrointestinal tract269. Previous studies suggested that luminal pH and altered ion transport influence 

the composition of gut microbiota270,271. Interestingly, recent studies indicated that altered Na+ and H+ 

concentration caused by inhibition of NHE3 function not only changes fluid homeostasis but also alters 

microbiota composition in GI tract272. This suggests the regulation of NHE3 activity could serve as a 

target for alteration of gut microbiota. 

NHE3 expression and functions could be regulated by several factors such as hormones and growth 

factors273. Parathyroid hormone is shown to inhibit NHE3 activity through phosphorylation and 

endocytosis of the protein274, while dopamine can inhibit NHE3 expression and activity via a PKA‐

mediated pathway275,276. In contrast, Angiotensin II, glucocorticoids, and insulin are able to activate 

NHE3 activity277. 

1.4.3 Summary 

In summary, sodium‐proton exchangers are involved in multiple physiological and pathological 

conditions. However, the study of their involvement in tissue aside from kidney and intestine are 

limited. Considering their role in regulating fluid movement and pH, NHEs could be related to 

pathogenesis and histological changes in other diseases, especially in the gastrointestinal tract. 

   

42  

1.5 Summary 

EoE is a chronic allergic inflammatory disorder with unknown etiology. Esophageal epithelium 

remodeling including DIS and BZH is prominent in EoE patients. Clinical studies suggested these changes 

could contribute to disease pathogenesis and correlate with symptomatic remission in EoE. However, 

the molecular mechanisms underlie the formation of esophageal epithelium remodeling are unclear.  

The Type‐2 inflammatory cytokine IL‐13 expression is elevated in EoE and is thought to drive the 

transcriptome changes and contributes to histopathological alterations in EoE patients. However, the 

molecular mechanisms of how IL‐13 regulates these histopathological changes in esophageal epithelium 

remains poorly understood. 

The central hypothesis of this dissertation is that IL‐13 causes alteration of the transcriptome in 

esophageal epithelial cells and regulates esophageal epithelium remodeling in EoE. The specific aims of 

this dissertation are: 

1. To examine the expression of SLC9A3 in EoE and the relationship between expression and onset 

histopathological features of disease. 

2. To determine the functional impact of IL‐13 induced SLC9A3 expression in esophageal epithelial 

cells. 

3. To determine the requirement of SLC9A3 in the formation of DIS in the esophageal epithelium.  

4. To define the divergent roles of IL‐13‐induced STAT3 and STAT6 signaling pathways in 

modulation of EoE transcriptome gene expression. 

5. To determine the involvement of STAT3 and STAT6‐dependent genes in regulating IL‐13 induced 

esophageal epithelium remodeling.   

43  

2 Chapter II: SLC9A3/NHE3 dysregulation and dilated intercellular spaces

in eosinophilic esophagitis

Chang Zeng B Sc1, Simone Vanoni PhD1, 5, David Wu PhD 1, Julie M. Caldwell PhD 1, Justin C. Wheeler MD3, 

Kavisha Arora PhD2, Taeko K. Noah PhD1, Lisa Waggoner B Sc1, John A. Besse B Sc1, Amnah N. Yamani B 

Sc1, Jazib Uddin B Sc1, Mark Rochman PhD1, Ting Wen PhD1, Mirna Chehade MD6, Margaret Collins MD3, 

Vincent Mukkada MD4, Philip Putnam MD4, Anjaparavanda P. Naren PhD2, Marc E. Rothenberg MD PhD1 

and Simon P. Hogan PhD1,7 

1Division of Allergy and Immunology, 2Division of Pulmonary Medicine, 3Division of Pathology and 

Laboratory Medicine, 4Division of Gastroenterology, Nutrition and Hepatology, Cincinnati Children’s 

Hospital Medical Center, 3333 Burnet Ave, Cincinnati, OH, 45229; 5Institute of Pharmacology and 

Toxicology, Paracelsus Medical University, Salzburg, Austria. 6Mount Sinai Center for Eosinophilic 

Disorders, Jaffe Food Allergy Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY. 

7Department of Pathology, Mary H Weiser Food Allergy Center, Michigan Medicine, University of 

Michigan, 109 Zina Pitcher Place, Ann Arbor, MI 48109‐2200. 

Correspondence: Simon P. Hogan, Ph.D., Department of Pathology, Mary H Weiser Food Allergy Center, 

Michigan Medicine, University of Michigan, 109 Zina Pitcher Place 

Ann Arbor, MI 48109‐2200; Email: sihogan@med.umich.edu; Phone: 734‐647‐9923. 

 

Disclosures: M.E.R. is a consultant for Immune Pharmaceuticals, NKT Therapeutics, Pulm One, Celgene, 

Shire, GlaxoSmith Kline, Astra Zeneca and Novartis and has an equity interest in the first three companies 

listed  and  royalties  from  reslizumab  (Teva  Pharmaceuticals). M.E.R.  is  an  inventor  of  several  patents, 

owned by Cincinnati Children’s,  and a  set of  these patents  relates  to molecular diagnostics. M.C.  is  a 

44  

consultant for Shire and Actelion and has received research grant support from Shire, Regeneron, and 

Nutricia. The other authors have declared that they have no conflict of interest.  

   

45  

2.1 Copyright and Student Contribution 

This chapter is from a publication accepted by the Journal of Allergy Immunology, which is an Elsevier 

Journal. Elsevier states “Authors can include their articles in full or in part in a thesis or dissertation for 

non‐commercial purposes.” 

Authorship is listed on the title page. I designed and performed most of the experiments and analyzed 

all the datasets used in this manuscript. TKN performed immunofluorescent staining of human 

esophageal biopsy samples, and JCW performed electron microscopy of EPC2‐ALI culture. Also, I wrote 

the manuscript and modified it under the guidance of other co‐authors. 

2.2 Abstract 

Background: Eosinophilic esophagitis (EoE) is characterized by histopathologic modifications of 

esophageal tissue including eosinophil‐rich inflammation, basal zone hyperplasia (BZH) and dilated 

intercellular spaces (DIS). The underlying molecular processes that drive the histopathologic features of 

EoE remain largely unexplored.  

Objective: To investigate the involvement of SLC9A3 in esophageal epithelial [pH]i and DIS formation and 

the histopathological features of EoE. 

Methods: We examined the expression of esophageal epithelial gene networks associated with 

regulation of intracellular pH ([pH]i) in the EoE transcriptome of primary esophageal epithelial cells and 

an in vitro esophageal epithelial 3D model system (EPC2‐ALI). Molecular and cellular analyses and ion 

transport assays were employed to evaluate expression and function of SLC9A3.  

Results: We identified altered expression of gene networks associated with regulation of intracellular pH 

([pH]i) and acid protective mechanisms in esophageal biopsies from pediatric patients with EoE (normal 

n = 6, EoE n = 10). The most dysregulated gene central to regulating [pH]i was SLC9A3. SLC9A3 

46  

expression was increased within the basal layer of esophageal biopsies from patients with EoE and that 

expression positively correlated with disease severity (eosinophils/HPF) and DIS (normal n = 10, EoE n = 

10). Analyses of esophageal epithelial cells revealed IL‐13–induced, STAT6‐dependent SLC9A3 expression 

and Na+‐dependent proton secretion and that SLC9A3 activity positively correlated with DIS formation. 

Finally, we showed that IL‐13–mediated Na+‐dependent proton secretion was the primary intracellular 

acid protective mechanism within the esophageal epithelium and that blockade of SLC9A3 transport 

abrogated IL‐13–induced DIS formation.  

Conclusions: SLC9A3 plays a functional role in DIS formation, and pharmacologic interventions targeting 

SLC9A3 function may suppress the histopathologic manifestations in EoE.  

   

47  

2.3 Introduction 

 

Eosinophilic  esophagitis  (EoE)  is  a  food  allergen‐induced  inflammatory  disease  that  is  increasing  in 

incidence (5 – 10 cases per 100,000) and prevalence (0.5 to 1 case per 1000)278‐281. Common symptoms of 

EoE include vomiting, dysphagia, chest pain, food impaction and upper abdominal pain282 and decrease 

the health‐related quality of life283.  

 

Corroborative clinical and experimental studies indicate that an underlying allergic sensitization to dietary 

food antigens and development of a CD4+ Th2 and ILC2 inflammatory response in the esophageal mucosa 

drive  the  eosinophilic  inflammation  and  esophageal  remodeling  in  EoE,  which  includes  basal  zone 

hyperplasia (BZH) and dilated intercellular spaces (DIS)19,77,284,285. Dietary modification (i.e., complete or 

targeted  food  antigen  avoidance)  and  swallowed  glucocorticoids  alleviate  much  of  the  disease 

pathology116,286,  suggesting  a  food‐induced  CD4+  Type‐2  allergic  inflammatory  response54,136,144,287‐289. 

Consistent with this, animal‐based studies have revealed important roles for CD4+ Th2 cells, pro‐allergic 

cytokines  [interleukin  5  (IL‐5),  IL‐13]  and  eosinophils  in  the  histopathologic  manifestations  of 

disease17,53,206. One cytokine that seems to be central in orchestrating the EoE phenotype is IL‐1330,51,122. 

IL‐13 is highly upregulated in the esophageal tissue of patients with EoE and is sufficient to alter gene 

expression  in  esophageal  epithelial  cells  in  vitro  and  in  vivo,  and  the  IL‐13–induced  transcriptome 

significantly overlaps with the transcriptional changes observed in esophageal biopsies of patients with 

EoE30,51,122.  Importantly,  treating  patients  with  EoE  with  a  humanized  antibody  against  IL‐13  led  to  a 

significant decrease  in esophageal  eosinophil  count and had a normalizing effect on  the dysregulated 

transcriptome observed in patients with EoE211. IL‐13 has been shown to dysregulate the expression of 

several  key  epithelial  barrier  regulatory  genes  including desmosomal  cadherin,  desmoglein‐1  (DSG‐1), 

48  

Leucine‐rich  repeat‐containing  protein  31  (LRRC31),  kallikrein  (KLK)  serine  proteases  and  calpain  14 

(CAPN14), which have been linked with EoE133,208,209.  

 

Though there have been significant advances in our understanding of a link between allergic inflammation 

and EoE, there is a paucity of data revealing the underlying pathways that regulate epithelial BZH and DIS 

in EoE. DIS, also described as spongiosis,  is a morphologic  feature that has been  identified  in multiple 

forms of esophagitis including lymphocytic esophagitis290, gastroesophageal reflux disease (GERD)291 and 

EoE19,292. Histologic comparison between GERD and EoE suggested that DIS is significantly more intense in 

EoE than GERD293. Steroid therapy or elimination diet significantly decreases DIS in patients with EoE, and 

this decrease is associated with improvement of patients’ symptoms292, indicating an association between 

DIS and the etiology of EoE. The underlying molecular pathways that drive DIS formation are currently 

unknown. 

 

We recently performed RNA sequencing (RNAseq) on esophageal mucosal biopsies from normal healthy 

control patients (NL) and patients with active, proton pump inhibitor (PPI)–confirmed EoE. We identified 

a total of 1607 significantly dysregulated transcripts (1096 upregulated, 511 downregulated), with 66% of 

the gene signature being similar to the EoE transcript signature identified by microarray‐based expression 

profiling122. We have  performed  gene ontology  enrichment network  analysis  of  the  1607  significantly 

dysregulated  transcripts  and  identified  dysregulation  of  transmembrane  transporter  activity  genes 

associated  with  regulation  of  [pH]i  and  acid  protective  mechanisms.  The  most  dysregulated 

transmembrane  transporter  activity  gene  in  the  EoE  transcriptome  was  the  solute  carrier  family  9, 

subfamily A, member 3 (SLC9A3), which encodes sodium‐hydrogen exchanger member 3 (NHE3)294 (33‐

fold  increase). We  demonstrate  a  significant  increase  of  SLC9A3  in  the  esophageal  epithelium  in  two 

independent, confirmatory patient cohorts with PPI‐confirmed EoE. We show that the expression level of 

49  

NHE3  positively  correlated  with  the  level  of  inflammation  and  the  area  of  DIS.  IL‐13  treatment  of 

esophageal  epithelial  primary  cells  derived  from  patients with  EoE  and  in  a  differentiated  squamous 

esophageal  epithelium  model  (EPC2‐ALI)  increased  NHE3  expression  and  ion  transport  activity. 

Pharmacologic inhibition of NHE3 function substantially decreased the area of IL‐13–induced DIS. These 

collective data suggest that increased expression and activity of NHE3 contribute to the formation of DIS 

in the esophageal epithelium in EoE. 

   

50  

2.4 Material and Methods 

 

Human  subjects.  NL  (healthy  control  patients) were  defined  as  having  no  history  of  EoE  diagnosis,  0 

esophageal eosinophils per high‐power field (HPF) and no evidence of esophagitis within distal esophageal 

biopsies obtained during the same endoscopy procedure as the analyzed samples. EoE was defined as 

described in the recent consensus guidelines. Specifically, patients needed to have ≥15 eosinophils in at 

least  1  high‐power  field  (Eos/HPF)  in  a  distal  esophageal  biopsy  with  other  causes  of  esophageal 

eosinophilia excluded, and without a response to acid suppression. Normal control patient cohort consists 

of patients with a variety of non‐specific upper GI complaints including vomiting, loose stools, abdominal 

pain,  nausea  who  underwent  endoscopy  were  biopsied  and  demonstrated  to  have  no  histological 

evidence of esophageal disease. RNAseq and validation qRT‐PCR analyses and histology (Eos/hpf and DIS 

quantification) studies were performed on the esophageal biopsies. RNAseq and qRT‐PCR analyses and 

histology (Eos/hpf and DIS) were performed on human esophageal biopsy samples (normal, n = 6; EoE, n 

=  10)  as  previously  described  (NCBI  Gene  Expression  Omnibus  (GEO)  database  under  accession 

GSE58640)122 (Cohort 1). The demographics of the normal control and EoE patients are described in Fig. 

2‐6. The qRT‐PCR and histopathology (Eos/hpf) analyses was performed on a second independent cohort 

(normal, n = 10; EoE, n = 10) (Cohort 2). The demographics of the patients and controls are described in 

Fig. 2‐6. 

RNA‐sequencing of human Biopsy Samples: Esophageal biopsy RNA was isolated from controls and EoE 

patients  with  active  disease  using  the  RNeasy  kit  (QIAGEN  Incorporated,  Germantown, MD)  per  the 

manufacturer's protocol. RNA libraries were prepared using standard Illumina protocols (TrueSeq RNA LS 

Sample Prep V2) at the CCHMC Genetic Variation and Gene Discovery Core. RNA sequencing acquiring 

100bp reads from paired‐end libraries was performed at the Genetic Variation and Gene Discovery Core 

Facility at CCHMC using Illumina HiSeq 2500. The paired‐end sequencing reads were aligned against the 

51  

GRCh37 genome model using TopHat 2.04 with Bowtie 2.03295,296. The separate alignments were  then 

merged using Cuffmerge297 with UCSC gene models as a reference. Raw data were assessed for statistical 

significance using a Welch t‐test with Benjamini‐Hochberg false discovery rate and a threshold of P < 0.05 

and a 2.0‐fold cut‐off filter in GeneSpring® GX (Agilent Technologies Incorporated, Clara, CA). 

RNA‐sequencing  of  mature  EPC2‐ALI:  RNA  was  isolated  using  the  RNeasy  kit  (QIAgen  Incorporated, 

Germantown, MD, USA) per manufacturer instructions. Assessment of RNA quality was performed using 

the Agilent 2100 Expert bioanalyzer (Agilent Technologies Incorporated, Clara, CA, USA) and only those 

samples getting an RNA Integrity Number (RIN) above 8 were chosen for sequencing. Next‐generation 

sequencing analyses were performed by  the CCHMC Genetic Variation and Gene Discovery Core with 

Illumina  HiSeq  2500.  Raw  data  was  uploaded  on  Biowardrobe298  and  RPKM  values  were  calculated. 

Differentially expressed genes were assessed using DEseq2.  

Gene  Ontology  Analysis:  Gene  list  enrichment  analysis  and  candidate  gene  prioritization  based  on 

molecular  function using ToppGene299 with FDR B&H correction and p‐Value cutoff at 0.05. Heatmaps 

were generated using RStudio.  

Pathology analysis.  

Biopsy preparation. Formalin‐fixed, paraffin‐embedded esophageal biopsies were sectioned into 5‐mm 

slides. After removal of paraffin and serial hydration, sections were stained with hematoxylin and eosin 

(H&E). H&E‐stained slides were then imaged using an Olympus DP‐72 microscope (Olympus Corporation, 

Semrock, New York, NY, USA). 

Quantification  of  intercellular  space.  Intercellular  space  was  quantified  as  the  percentage  of  the 

intercellular area of the total area of the biopsy sample using Image‐Pro Plus software (Media Cybernetics, 

Rockville, MD, USA) automated space measurement function and calculated by the ratio of intercellular 

area / total tissue area.  

52  

qPCR analysis. RNA samples were extracted from esophageal biopsy, cultured primary cells or EPC2‐ALI 

cultures using the RNeasy kit (QIAGEN Sciences Incorporated, Germantown, MD, USA) according to the 

manufacturer’s protocol. Purified RNA  (300 – 500 ng) was DNase treated and  reversed  transcribed  to 

cDNA using Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific Incorporated, Rockford, 

IL, USA) per the manufacturer’s instructions. cDNA for SLC9A3 and 18S were quantified by real‐time PCR 

using TaqMan Universal supermix with the CFX96 Real‐Time PCR Detection System. qPCR analysis was 

performed  using  the  Bio‐Rad  CFX  Manager  Software  version  3.1.  Primers  for  SLC9A3  and  18S  were 

purchased from TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). 

Immunofluorescence  (IF)  staining.  For  IF  staining,  formalin‐  or  paraformaldehyde‐fixed,  paraffin‐

embedded  esophageal  biopsies  or  EPC2‐ALI  cultures  were  sectioned,  mounted  on  slides  and  de‐

paraffinized using standard histological procedures. Slides were then permeabilized in Tris‐EDTA (1 mM, 

pH 9.0) with  0.1% Tween‐20,  and  antigen exposure was performed  at  125°C  for  30  s  in  a  decloaking 

chamber using a pressure cooker. Slides were then blocked by 10% normal donkey serum for 1 h followed 

by  overnight  incubation  of  primary  antibodies  diluted  in  10%  normal  donkey  serum:  NHE3  (Novus, 

Littleton, CO) and CK13 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Slides were then washed and incubated with secondary 

antibody  at  room  temperature  for  1  h.  Slides  were mounted  with  Fluoromount‐G  (SouthernBiotech, 

Birmingham,  AL)  mounting  solution.  Fluorescent  imaging  was  performed  using  the  Zeiss  Apotome 

fluorescent microscope using NIKON elements software.  

Primary cell preparation. Distal esophageal biopsy was obtained from NL or EoE patients who underwent 

routine endoscopy, suspended in 1 mL keratinocyte serum‐free media (KSFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) 

containing supplements  [human epidermal growth factor  (EGF)  (1 ng/mL), bovine pituitary extract  (50 

mg/mL), and 1X penicillin/streptomycin  (Invitrogen, Carlsbad, CA)] and subsequently placed  in 60‐mm 

dish in 3 mL of filter‐sterilized (0.2 mm) Leibovitz’s L‐15 media (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 115 

U/mL collagenase, 1.2 U/mL dispase and 1.25 mg/mL BSA. The biopsy was mechanically dispersed using 

53  

scissors  to pieces  less  than 1 mm  in size and  then  incubated at 37ºC  for 1 h. The cell  suspension was 

centrifuged at 500 g for 5 min at 4ºC and the pellet washed twice with 5 mL of supplemented KSFM media. 

Cells were suspended in 1 mL of 0.05% trypsin/EDTA for 10 min at 37ºC and agitated every 2 min. Trypsin 

activity was inhibited with soybean trypsin inhibitor (STI) (250 mg/L in 1X DPBS; 5 mL). Cells were pelleted 

by  centrifugation,  suspended  in  1  mL  KSFM  containing  supplements,  transferred  to  a  35‐mm  dish 

containing irradiated NIH 3T3 J2 fibroblasts (162,500 cells) and cultured at 37ºC and 5% CO2. Media was 

changed at day 5 and every other day thereafter using KSFM containing supplements. After epithelial cells 

became 60‐70% confluent, they were dispersed from the plate using 0.05% trypsin/EDTA for 10 min at 

37ºC and agitated every 2 min. Trypsin digestion was inactivated by STI, and cells were then passaged in 

KSFM containing supplements at 1‐2 x 105 cells per 3 mL in a 60‐mm dish.  

pHi assay. Primary esophageal epithelial cells were cultured on Ibidi ‐Slide 4 well (ibidi GmbH, Germany) 

with a concentration of 25,000 cells/well. After 24 h of equilibration period, cells were stimulated with or 

without 100 ng/mL recombinant human IL‐13 (PeproTech, Rocky Hill, NJ) for another 48 h. pHi changes in 

these  primary  cells  were  measured  with  the  pH‐sensitive  fluorescent  dye  BCECF  AM  (2',7'‐bis‐(2‐

carboxyethyl)‐5‐(and‐6)‐carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester) or SNARF‐5F AM (SNARF‐5F 5‐(and‐6)‐

carboxylic acid, acetoxymethyl ester) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cells were loaded with 10 M BCECF AM 

or SNARF‐5F AM in HCO3‐‐free Ringer’s solution [mM, 110 NaCl, 25 Na‐Gluconate, 5 KCl, 0.5 MgSO4.7H2O, 

1 CaCl2.2H2O, 10 HEPES, 4 Glucose; to pH 7.4] at 37°C for 30 min prior to the experiment. To remove the 

extracellular  dye,  cells  were  washed  two  times  with  HCO3‐‐free  Ringer’s  solution  at  the  end  of  the 

incubation  period.  To  acidify  the  intracellular  compartment  of  cells  and  generate  the  necessary  H+ 

gradient (high [H+]  inside vs.  low [H+] outside cell) to measure pHi recovery rate, 20 mM of NH4Cl was 

added to the chamber after the first 5‐min recording of the baseline pHi (Fig. 2‐2C. Stage II). To measure 

the Na+‐dependent pHi recovery rate, Na+ was first removed from the cells by replacing the buffer with 

Na+‐free Ringer’s solution [mM, 135 NMDG‐Cl, 5 KCl, 0.5 MgSO4.7H2O, 1 CaCl2.2H2O, 10 HEPES, 4 Glucose; 

54  

to pH 7.4] for 5 min (Fig. 2‐2C. Stage III). Na+‐dependent pHi recovery rate was measured by replacing 

extracellular  solution  to HCO3‐‐free Ringer’s  solution  containing  135 mM Na+  (Fig.  2‐2C.  Stage  IV)  and 

determination  of  the  slope  of  the  Na+‐dependent  pHi  change.  The  pHi  values  are  derived  from  the 

calibration  curves  described  below.  The  statistical  significance  of  Na+‐dependent  pHi  change  was 

determined using a Students t‐test (two‐tailed). To record the BCECF AM fluorescence change, cells were 

imaged by a Nikon Spectra X inverted fluorescent microscope with the excitation wavelength of 512 nm / 

440 nm and emission at 535 nm. To record the SNARF‐5F AM fluorescence change, cells were imaged by 

Zeiss  LSM710 LIVE DUO confocal microscope with excitation wavelength at  488 nm and  the emission 

wavelength of 640 nm / 580 nm. To inhibit NHE3 activity, 30 M of S3226 or 0.01% DMSO (vehicle) was 

applied throughout the experiment. % S3226‐sensitive Na+‐dependent pHi recovery rate was calculated 

as  Recovery  rate  of  (DMSO‐treated  ‐  S3226‐treated)  *100/DMSO‐treated  %.  Quantification  was 

performed on 10‐20 cells randomly picked in each sample, and the fluorescence intensity was measured 

using Nikon  Elements microscope  imaging  software  or  ImageJ  software.  These  fluorescence  intensity 

values were then converted into pH values per calibration curves. A calibration curve was generated at 

the end of each experiment; BCECF AM or SNARF‐5F AM intensity was calibrated against pHi when cells 

were exposed to the K+/H+ ionophore nigericin (10 mM) and valinomycin (10 mM) (Invitrogen, Carlsbad, 

CA)  in high‐K+ solution at  four different pH values. High‐K+ solution [mM, 20 NaCl, 130 KCl, 1 MgCl2, 1 

CaCl2.2H2O, 5 HEPES] was prepared and titrated to a pH ranging from 6.5 to 7.9. Fitting was performed 

with GraphPad Prism software.   

EPC2‐ALI culture. The hTERT‐EPC2 cells  (hTERT‐immortalized human esophageal keratinocytes) were a 

kind gift from Dr. Anil Rustgi (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA) as previously described300. 

The air‐liquid  interface  (ALI)  culture system was previously described and characterized  together with 

EPC2 cells133. EPC2 cells were grown to fully submerge on 0.4‐mM pore size, permeable transwell inserts 

(Corning Incorporated, Corning, NY)) in KSFM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). As depicted in Fig. 2‐

55  

3A, (i) Day 0, cells were seeded on permeable membrane support and grown to single submerged layer 

after  three days.  (ii) Cells were then shifted to medium containing high  [Ca2+]  to  induce tight  junction 

formation ([Ca2+] = 1.8mM). (iii) On Day 7, media were removed from the top chamber in order to induce 

differentiation and epithelial stratification in ALI. (iv) Day 12 (5 days post‐ALI), cells were then treated with 

vehicle or cytokine  (IL‐13)  in  the presence and absence of SLC9A3  inhibitor  (30mM)301 as described  in 

figure legends.   

Lentiviral  Transduction.  EPC2  cells  at  60‐70%  confluence  were  transduced  with  lentiviral  particles 

containing Mission®  STAT6  shRNA TRC 0000019409  shRNA, Mission®  STAT3  (TRCN0000329887)  shRNA 

(Sigma; St. Louis, MO, USA) or Mission® non‐target control shRNA (Sigma; St. Louis, MO, USA). All the three 

shRNA lentivirus were generated by the Cincinnati Children’s Hospital Medical Center Viral Core using a 

4‐plasmid  packaging  system.  Lentiviral  particles  were  incubated  with  EPC2  cells  for  6  hours  with  a 

Multiplicity of Infection (MOI) from 0.5 to 10 for STAT3 or CTRL shRNA. For STAT6 shRNA, 10µL to 50µL 

viral  particles  were  added  to  the  cells.  All  the  viral  particles  were  added  in  the  presence  of  5µg/mL 

Hexadimethrine Bromide (Polybrene®) (Sigma; St. Louis, MO, USA). During the first hour of  incubation, 

cells were spun down at 1000*g for 1 hour at room temperature. 6 hours following transduction cells 

were put in fresh KSFM media, and 24 hours later media containing 1µg/mL of Puromycin (Thermo Fisher 

Scientific  Incorporated;  Rockford,  IL,  USA)  was  used  for  selection.  Cells  were  grown  under  selective 

pressure and cultured as regular EPC2 cells. Stable knockdown of STAT6 and STAT3 in EPC2‐ALI cultures 

were evaluated by Western blot. The results indicated an 80% reduction of STAT6 and 90% reduction of 

STAT3, relatively, compared to empty control transduced cells.  

 

Western blot. EPC2‐ALI cultures were lysed using protein lysis buffer (10% Glycerol, 20 mM Tris HCl pH 7, 

137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40 in H2O) supplemented with Halt protease inhibitor cocktail (Thermo 

Fisher Scientific Incorporated, Rockford, IL, USA). Proteins were then quantified with BCA assay, and 20 

56  

g of protein extracted together with protein‐reducing buffer was loaded and separated on a 4%‐12% 

Bis‐Tris gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Life Technologies, Carlsbad, CA). Antibody of 

NHE3 and ‐actin were used for protein detection. The IRDye 800 CW goat anti‐rabbit IgG (H+L) (Li‐Cor, 

Lincoln, NE) was used as the secondary antibody for detection. Western Blot quantification was performed 

using Image Studio Lite (Li‐Cor, Lincoln, NE).   

pH‐STAT  assay.  Acid  secretion  by  confluent  epithelium  was  quantitated  using  pH‐STAT  (TIM856, 

Radiometer Analytical, Loveland, CO) connected to an Ussing chamber system as previously described302. 

EPC2‐ALI cultures were mounted into an Ussing chamber containing unbuffered Ringer’s solution [mM, 

145 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 5 Glucose] while gassed with 99.5% oxygen. Both the pH electrode and 

the titrating burette are placed in the apical side chamber. To measure the equilibrium extracellular pH, 

without any titration, the extracellular pH was measured for 10 min or until a stable pH was achieved 

(<0.002  pH  unit  change/min).  After  the  equilibrium  period  and  extracellular  pH measurements  were 

obtained, the mucosal pH was adjusted by titration to a set pH (pH 7.6) to keep the extracellular pH slightly 

alkalized. Titration rate (amount of alkaline injected by the machine to neutralize the acid secreted by 

EPC2‐ALI culture to maintain the set pH) was used to measure the acid secretion rate. 

Histologic analysis  for EPC2‐ALI. EPC2‐ALI cultures were treated as  indicated  in experiments and then 

fixed on transwell supports with 4% paraformaldehyde for 1 h at room temperature. Fixed membranes 

underwent  a  series  of  dehydration  steps,  cleared  in  Histoclear  solution,  embedded  in  paraffin  and 

sectioned into 5‐mm slides. The slides were stained using H&E staining and imaged using an Olympus DP‐

72 microscope (Olympus Corporation, Semrock, New York, NY, USA).   

Electron  microscopy.  EPC2‐ALI  cultures  were  treated  as  indicated  in  experiments,  fixed  with  3% 

glutaraldehyde  and  submitted  to  CCHMC  Pathology  Research  Core  for  processing,  sectioning,  and 

57  

transmission electron microscopy using a Hitachi model H‐7650 electron microscope, at 80 kV, using the 

AMT‐600 image capture engine software.  

BrdU assay. After EPC2‐ALI cultures were treated as indicated in the experiment, BrdU reagents dissolved 

in DMSO (final concentration 10 µM) were added to both the upper and lower chambers of transwells for 

2 h. EPC2‐ALI cultures were then washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for another 2 h. 

Statistical analysis. The statistical significance of EPC2‐ALI samples was established using an unpaired t‐

test (two‐tailed), or two‐way ANOVA if there were more than one variable. For non‐normally distributed 

data from patient biopsies and primary cells derived from patient biopsies, the Mann‐Whitney test was 

used, and the correlation analyses were assessed with a Spearman correlation test. Graphs and statistical 

analyses were performed using GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software Incorporated, La Jolla, CA, USA). 

   

58  

2.5 Results 

2.5.1 Transmembrane transporter SLC9A3/NHE3 specifically upregulated and correlated with 

eosinophil count and DIS in EoE  

To  begin  to  determine  the  potential  involvement  of  transmembrane  transporter  activity  in  the 

histopathologic  alterations  of  the  esophageal  epithelium  in  EoE,  we  applied  gene  ontology  (GO) 

enrichment analysis of the 1607 differentially expressed RNA transcripts identified by RNAseq analyses of 

pediatric  NL  and  EoE  biopsy  samples122.  GO  analysis  revealed  50  individual  GO  nodes  significantly 

dysregulated in the EoE transcriptome based on functional annotations and protein interaction networks 

(FDR‐corrected p <  0.05,  Fig.  2‐7). Of  these GO nodes,  5 were  related  to  transmembrane  transporter 

activity (Fig. 2‐1A). A combinatory comparison of all 62 genes within these 5 GO nodes revealed that the 

most upregulated transmembrane transporter activity gene was SLC9A3, which encodes for the sodium‐

hydrogen exchanger family member 3 (NHE3) (Fig. 2‐1B). SLC9A3 was induced 33‐fold in patients with EoE 

compared to NL (Fig. 2‐1C). In contrast, expression of other members of the SLC9 family, including the 

ubiquitously expressed sodium‐proton exchanger SLC9A1, also referred to as sodium‐hydrogen exchanger 

family member 1 (NHE1), were not dramatically different in expression between EoE and NL (Fig. 2‐1D). 

Correlation  analyses  revealed  a  positive  correlation  between  the  level  of  peak  distal  esophageal 

eosinophils and SLC9A3 expression (Fig. 2‐1E, r = 0.7167, p < 0.05. Notably, this was specific to SLC9A3, as 

we did not observe any correlation with SLC9A1 (Fig. 2‐1E, r = 0.3201, p > 0.05), revealing a specific link 

between SLC9A3 expression and disease severity in EoE. To confirm these observations, we examined a 

second independent pediatric cohort [NL n = 10, active EoE n = 10] for which we had paired RNA and 

histologic biopsy samples from the same day of endoscopy. Consistent with our RNAseq analyses, qPCR 

analyses revealed significant SLC9A3 overexpression in the pediatric EoE cohort (Fig. 2‐1F). Furthermore, 

we observed a positive Pearson correlation between SLC9A3 expression level and distal peak esophageal 

eosinophil numbers (Fig. 2‐1G, r = 0.9172, p < 0.0001). 

59  

We next performed immunofluorescence (IF) analyses to determine the cellular and spatial expression of 

NHE3  in  NL  and  EoE  esophageal  biopsy  samples.  Consistent  with  our  RNAseq  and  PCR  analyses,  we 

observed very little expression of NHE3 in the healthy esophageal epithelium (Fig. 2‐1H, upper panel). The 

positive staining observed was restricted to the CK13‐ single‐cell basal esophageal epithelial layer (Fig. 2‐

1H, upper panel). In EoE, NHE3 protein expression was remarkably increased, localized to the esophageal 

basal cell layer and also expanded into the CK13+ suprabasal layer (Fig. 2‐1H, lower panel). The localization 

of NHE3 to the suprabasal zone, an area associated with DIS formation, lead us to examine the relationship 

between  SLC9A3  expression  and  DIS  in  EoE  esophageal  biopsies.  Notably,  SLC9A3,  but  not  SLC9A1, 

expression positively correlated with the percentage of DIS area in EoE individuals (r = 0.8095, p < 0.05) 

(Fig. 2‐1I). These cumulative data indicate a specific upregulation of SLC9A3/NHE3 in the suprabasal layer 

of  esophageal  epithelium  in  patients  with  EoE  and  that  SLC9A3  levels  correlate  with  esophageal 

eosinophilic inflammation and DIS. 

2.5.2 Increased NHE3 function in IL‐13–stimulated primary esophageal epithelial cells. 

The epithelial sodium‐proton exchanger, NHE3,  is predominantly expressed in the apical membrane of 

epithelial and is the principal mechanism for the electroneutral exchange of (Apical  Baso) Na+ and (Baso 

 Apical) H+ and plays an important role in the maintenance of intracellular pH (pHi) and regulation of 

cell volume303. Given IL‐13’s known role in upregulating the EoE transcriptome54 and that humanized anti–

IL‐13 monoclonal  antibody  (QAX576)  has  been  shown  to modulate  expression  of  an  anion  transport 

activity node211, we examined the impact of IL‐13 exposure on SLC9A3 expression in primary esophageal 

epithelial cells. We demonstrate upregulation of SLC9A3 expression in primary esophageal epithelial cells 

following IL‐13 stimulation (Fig. 2‐2A). To determine whether increased SLC9A3 expression was associated 

with altered NHE3 activity, we examined the effect of IL‐13 exposure on intracellular pH ([pH]i) in primary 

esophageal epithelial cells. Notably, increased SLC9A3 expression coincided with a significant increase in 

60  

baseline pHi (Fig. 2‐2B) and Na+‐dependent pHi recovery rate (Fig. 2‐2C‐D), supporting an overall increase 

of Na+/H+ exchange activity. Notably, the recovery rate positively correlated with SLC9A3 expression in 

primary esophageal epithelial  cells  (r = 0.9503 p < 0.01; Fig. 2‐2E),  suggesting that  the  increase of pHi 

recovery rate in IL‐13–treated primary esophageal epithelial cells is predominantly due to increased NHE3 

expression.  Addition  of  the NHE3‐specific  inhibitor  S3226  (30 mM)  confirmed  that  the  IL‐13–induced 

increase in Na+‐dependent pHi recovery rate was predominantly mediated by NHE3 (Fig. 2‐2F). 

2.5.3 IL‐13 induces an EoE‐like transcriptome including increased transmembrane transporter 

activity and SLC9A3 overexpression in an in vitro, matured esophageal epithelium model 

system. 

In order  to define  the  involvement of SLC9A3/NHE3  in  the  regulation of  [pH]i  and DIS  formation  in  a 

mature esophageal epithelial model system, we adapted an in vitro model developed from keratinocyte 

esophageal  epithelial  cells  (EPC2)  grown  in  air‐liquid  interface  (ALI)133.  EPC2  cells  were  grown  under 

submerged conditions  in  low‐calcium media  (0.09 mM; days 0‐3),  changed  to high‐calcium media  (1.8 

mM, days 3‐7) and then exposed to the ALI for 5 days in the presence of high calcium (1.8 mM, days 7‐12) 

to  induce  differentiation  and  formation  of  a  mature,  stratified  epithelium  (Fig.  2‐3A).  Following 

maturation, EPC2‐ALI cells were stimulated with vehicle or IL‐13 and RNAseq analyses performed (Fig. 2‐

3A, days 12‐14). We show that IL‐13 significantly dysregulated a total of 572 genes (p < 0.05, fold change 

> 2.0); notably, many of the most highly dysregulated genes included inflammatory genes associated with 

EoE, including CCL26 (7‐fold), TNFAIP6 (9‐fold), CDH26 (3‐fold) and CAPN14 (5‐fold), and also gene families 

located  in  the  epidermal  differentiation  cluster  (EDC)  on  chromosome  1q21  (e.g.,  IVL,  LOR,  S100A4, 

S100A6) (Fig. 2‐3B and Fig. 2‐6). Consistent with these findings, comparative analyses of the IL‐13–induced 

transcriptome changes in EPC2‐ALI cells with that of the EoE‐specific transcriptome revealed significant 

overlap with the EoE‐specific transcriptome (Fig. 2‐3B, p < 0.0001). GO analysis based on the biological 

process on  IL‐13–dysregulated genes revealed the most significant 15  individual GO biological process 

61  

nodes  were  associated  with  keratinization,  epidermis  development,  skin  development,  keratinocyte 

differentiation, epidermal cell differentiation and  inflammatory response and GO Pathways associated 

with formation of the cornified envelope, keratinization and interleukin‐4 and 13 signaling (Table 2‐2, FDR‐

corrected p < 0.05). To examine the effect of IL‐13 on transmembrane transporter activity, we performed 

GO  analysis  based  on  the  molecular  function  of  the  572  genes  and  identified  6  nodes  significantly 

dysregulated related to transmembrane transport activity (Fig. 2‐3C, FDR‐corrected p < 0.05). Of the 28 

differentially expressed transmembrane transport activity genes in these 6 GO nodes, SLC9A3 was one of 

the most highly upregulated genes (Fig. 2‐3D).  

IL‐13  is  known  to  signal  through  the  JAK/STAT  pathway,  in  particular  through  a  STAT3‐  and  STAT6‐

dependent  signaling  pathway304.  To  determine  the  involvement  of  STAT‐3  and  STAT‐6  in  the  IL‐13 

induction  of  SLC9A3, we  examined  SLC9A3 mRNA  expression  in  STAT3  and  STAT6  shRNA–transduced 

EPC2‐ALI  cells  following  IL‐13  stimulation.  Notably,  STAT‐3  knockdown  in  EPC2‐ALI  cells  caused  no 

significant reduction in IL‐13–induced SLC9A3 expression compared to control shRNA–transduced EPC2‐

ALI cells  (Fig. 2‐3E).  In contrast, STAT6 knockdown in EPC2‐ALI cells significantly ablated IL‐13–induced 

SLC9A3  expression  (50%  reduction),  suggesting  that  IL‐13–induced  STAT6  signaling  is  important  for 

SLC9A3  expression  in  EPC2‐ALI  cells  (Fig.  2‐3E).  These  studies  demonstrate  that  IL‐13  induces SLC9A3 

expression in EPC2‐ALI cells in part by the STAT6‐dependent mechanism. 

  

2.5.4 IL‐13–induced NHE3 expression and function in differentiated esophageal epithelial cells.   

Employing this mature EPC2‐ALI model system, we show that IL‐13 stimulation of EPC2‐ALI cells induced 

an increase in SLC9A3 mRNA (Fig. 2‐4A) and NHE3 protein (Fig. 2‐4B‐C) expression. Immunofluorescence 

analyses revealed that NHE3 was barely expressed in vehicle‐treated EPC2‐ALI cells (Fig. 2‐4D, top panel). 

In  contrast,  we  observed  a  significant  increase  in  NHE3  expression  in  EPC2‐ALI  cells  following  IL‐13 

62  

exposure; comparable to what we observed in EoE biopsy samples, NHE3 was predominantly localized to 

the basal and suprabasal layer of epithelium in IL‐13–treated EPC2‐ALI cultures (Fig. 2‐4D, lower panel). 

To examine NHE3 function in the mature EPC2‐ALI cultures, we measured proton secretion rates in an 

Ussing  chamber  system  fitted with  pH‐STAT  (Fig.  2‐4E). We  show  that  IL‐13  stimulation  reduced  the 

extracellular pH (pHe) compared with vehicle‐treated control (pHe 6.82 vs. 6.97, respectively, p < 0.05), 

indicating altered acid‐base transport. Notably, the reduction in pHe was abrogated with exposure to the 

specific NHE3 inhibitor S3226 (Fig. 2‐4F), indicating NHE3‐dependent proton extrusion. To measure the 

rate of acid extrusion by the mature EPC2‐ALI, the apical side buffer was adjusted to an alkaline pH [pH 

7.6; Ba(OH)2] to generate an ion concentration gradient and the amount of alkali [Ba(OH)2] required to 

maintain this condition (pH 7.6) was continuously monitored using a pH‐STAT (Fig. 2‐4G). We show that 

IL‐13 stimulation of the mature EPC2‐ALI cells  led to  increased Ba(OH)2  injection to counterbalance H+ 

secretion from the tissue and maintain pH 7.6 (Fig. 2‐4G). To determine the involvement of NHE3 in apical 

acid secretion function in the mature EPC2‐ALI, S3226 was added to the apical side of the buffer to identify 

the NHE3‐mediated fraction of acid secretion. Notably, the acid‐secretion rate in IL‐13–stimulated mature 

EPC2‐ALI cells was significantly abrogated with S3226, indicating NHE3‐dependent secretion (Fig. 2‐4H). 

These  observations  indicate  an  IL‐13–induced  increase  in NHE3‐dependent  acid  secretion  in  EPC2‐ALI 

cells.  

2.5.5 Increased SLC9A3 expression and activity is linked with DIS formation. 

Given the observed association between NHE3 and acid secretion in EPC2‐ALI cells and the correlation 

between SLC9A3 expression and DIS formation in esophageal biopsy samples from patients with EoE (Fig. 

2‐4H and 2‐1I, respectively), we examined the relationship between NHE3 function and DIS formation in 

the mature EPC2‐ALI cells. IL‐13 stimulation of EPC2‐ALI cells induced DIS formation within the basal and 

suprabasal layer of EPC2‐ALI cells as evidenced by spaces between cells (Fig. 2‐5A). Electron microscopy 

analyses  revealed  alteration  to  the  intercellular  junctional  structures  of  esophageal  cells,  with  the 

63  

appearance of expanded or dilated  intercellular areas  (Fig. 2‐5B). Notably,  the DIS  is  sealed by  lateral 

membranes  that  are  of  close  apposition  and  tethered  by  intercellular  junctional  proteins  such  as 

desmosomes (Fig. 2‐5B). To determine the requirement of NHE3 activity in DIS formation, we stimulated 

EPC‐ALI cells with IL‐13 in the presence of the NHE3 inhibitor S3226 (Fig. 2‐5C‐D). Notably, we show that 

the IL‐13–induced DIS within the suprabasal  layer in EPC2‐ALI cells were diminished in the presence of 

S3226  (Fig. 2‐5C‐D). Collectively, we  concluded  that NHE3 has  an  important  role  in  IL‐13–induced DIS 

formation in esophageal cells.   

   

64  

2.6 Discussion 

EoE is characterized by histopathologic manifestations including BZH and DIS. The underlying molecular 

processes that drive these pathologic manifestations remain largely unexplored. Herein, we demonstrate 

1)  dysregulation  of  transmembrane  transporter  activity  gene  networks  in  esophageal  biopsies  from 

patients  with  EoE;  2)  increased  expression  of  the  Na+‐H+  exchanger  SLC9A3/NHE3  in  EoE  esophageal 

biopsies and positive correlation of this increased expression with DIS area and eosinophil infiltration; 3) 

increased SLC9A3 expression and NHE3 activity in primary esophageal epithelial cells and in response to 

IL‐13 stimulation in a mature EPC2‐ALI model system; and 4) reduction of IL‐13–induced DIS formation in 

EPC2‐ALI cells by pharmacological antagonism of NHE3 activity. Collectively, we have identified a role for 

SLC9A3/NHE3 in IL‐13–induced DIS formation in the esophageal epithelium and provide evidence for the 

involvement of this pathway in EoE. 

 

The cytokine IL‐13 has an important role in driving the underlying allergic inflammatory cascade and the 

histopathologic  features  of  EoE30,51,122.  This  notion  is  supported  by  the  observations  that  stimulating 

esophageal  cells with  IL‐13  leads  to  a  transcript  signature  that  partially  overlaps  the  esophageal  EoE 

transcriptome54.  Furthermore,  while  the  primary  outcome  of  greater  than  75%  decrease  in  peak 

eosinophil counts at week 12 was not met, treating patients with EoE with anti–IL‐13 (QAX576) reduced 

intraepithelial esophageal eosinophil counts and  led to an  improvement  in  the EoE transcriptome and 

clinical symptom such as dysphagia in adults with EoE211. Our observation of elevated SLC9A3 and NHE3 

expression  in  EoE  tissue  samples  and  in  both  primary  esophageal  epithelial  and  EPC2‐ALI  cultures 

following  IL‐13  stimulation  was  surprising  given  that  SLC9A3/NHE3  expression  and  function  is 

predominantly associated with induction of Th1 proinflammatory cytokines, including IFN‐ and TNF305. 

IFN‐ and TNF are thought to modulate SLC9A3 expression by PKA‐mediated phosphorylation of Sp1 and 

Sp3  transcription  factors305.  TNF  has  also  been  shown  to  alter  NHE3  activity  by  stimulating  PKCa‐

65  

dependent internalization of NHE3306. Stimulation of EPC2‐ALI cultures with other pro‐Type 2 cytokines 

such as IL‐25 and IL‐33 did not  lead to  induction of SLC9A3/NHE3 mRNA expression. Notably, a recent 

study  in kidney and  intestinal epithelial cells  (Caco‐2) reported a STAT3‐dependent  increase  in SLC9A3 

expression  through  the  recruitment  of  transcriptional  factor  Sp1  and  Sp3307.  IL‐13  is  known  to  signal 

through  the  JAK/STAT  pathway,  in  particular  through  a  STAT3‐  and  STAT6‐dependent  signaling 

pathway304. We reveal that STAT6 signaling plays a significant role in IL‐13–induced SLC9A3 expression in 

EPC2‐ALI cells. Examining the SLC9A3 promoter did not reveal the presence of STAT6 gamma‐interferon‐

activation  site  (GAS)  elements,  suggesting  that  STAT6  may  indirectly  modulate  SLC9A3  expression. 

Notably,  there  are  recent  reports  of  IL‐13–induced,  STAT6‐dependent  activation  of  EGR1  signaling 

pathways in EoE308,309, and previous studies in intestinal epithelial cells have revealed that overexpression 

of  EGR1  promotes  SLC9A3/NHE3  expression  and  activity310.  We  are  currently  further  pursuing  the 

molecular basis of IL‐13 transcriptional regulation of SLC9A3 expression. 

 

SLC9A3,  as  a  member  of  the  Na+/H+  exchanger  family,  drives  Na+‐dependent  extrusion  of  H+  and  is 

primarily involved in the regulation of [pH]i and acid protective mechanisms256,257,311,312. A consequence of 

Na+‐dependent acid extrusion in a multilayered stratified epithelium such as the esophageal epithelium is 

acidification  of  the  intercellular  spaces313.  In  well‐perfused  tissues  where  there  are  short  diffusion 

distances and good cell‐to‐capillary diffusive coupling, the acid is rapidly buffered by phosphates, proteins, 

and  HCO3‐314.  However,  in  the  stratified  epithelium  that  is  undergoing  rapid  and  sustained  cellular 

proliferation, the diffusion distances are increased leading to often‐inadequate capillary perfusion, which 

limits  the  capacity  of  the  intercellular  acid‐protective mechanisms  and  neutralization  of  the  acidified 

intercellular spaces. The accumulation of acid [H+] in the intercellular spaces permits the formation of an 

electrochemical gradient and Cl‐ diffusion, creating an osmotic  force for water  flux and dilation of the 

intercellular spaces315,316. In EoE, there is significant esophageal epithelial basal zone (BZ) expansion, and 

66  

the basal cell layer can exceed 15% of the total epithelial thickness317. We speculate that the esophageal 

proliferative  response and  the  thickening of  the suprabasal  layer of  the esophageal epithelium  in EoE 

increase the diffusion distances, thus causing a loss in the intercellular acid‐protective mechanisms and 

leading to DIS. Consistent with the concept of esophageal epithelial intercellular acid as a primary driver 

for DIS in EoE, luminal acid has been shown to drive acidification of the intercellular spaces and DIS in non‐

erosive reflux disease314‐316,318. Further, support for this concept, a recent study reports a strong positive 

correlation between BZH and DIS  (r2 ≥ 0.67)  in both proximal and distal biopsy samples  from pediatric 

patients  with  EoE319.  Interestingly,  the  increased  esophageal  intercellular  acid  in  non‐erosive  reflux 

disease is thought to activate afferent neurons (nociceptors) within the esophageal epithelium leading to 

the development of heartburn318,320.  Intriguingly,  though not common, EoE  is also associated with  the 

development of heartburn4.  

 

SLC9A3’s role in the regulation of [pH]i may not simply in response to dysregulation of [pH]i but also in 

part fulfilling a larger role in the regulation of esophageal epithelial proliferation. Moreover,  intracellular 

pH plays an important role in many cellular functions including proliferation321 and apoptosis322. In tumor 

cells,  the  [pH]i  is often elevated as  compared  to normal  cells,  and  it  is  thought  that  the alkaline  [pH]i 

provides an optimal environment for DNA synthesis relative to enzyme function323. Consistent with this, 

growth factors such as EGF and PDGF stimulate a rapid rise in [pH]i that is a critical requirement for entry 

of mitogen‐stimulated quiescent cells into the S phase of the cell cycle324,325. Experimental studies have 

identified an important role for NHE family members in the growth factor‐induced increase in [pH]i and 

cellular  proliferation326,327.  The  pharmacologic  abrogation  of  mitogen‐stimulated,  Na+‐dependent 

extrusion  of  H+  and  increase  in  [pH]i‐inhibited  growth  factor‐induced  mouse  bone  marrow‐derived 

macrophage DNA  synthesis  and prevents progression  into  the  S phase326.  Furthermore,  the  rapid and 

transient mitogen‐induced increase in NHE1 activity and [pH]i during G2/M entry and transition is ablated 

67  

in NHE1 mutant fibroblasts327. Notably, increasing the [pH]i in the absence of NHE1 activity was sufficient 

to restore CDC2 activity and cyclin B1 expression and to promote G2/M entry and transition and cellular 

proliferation, indicating that the NHE1‐driven increase in [pH]i at the completion of S phase is an important 

checkpoint for progression to G2 and mitosis327. We speculate that IL‐13 induction of SLC9A3/NHE3 may 

be a critical requirement for esophageal epithelial cell proliferation via regulating [pH]i. Notably, we have 

previously demonstrated that overexpression of  IL‐13  in mice  leads to esophageal cell proliferation207. 

Herein, we show co‐localization of NHE3 expression within the esophageal basal proliferative zone in EoE 

esophageal biopsy samples and IL‐13–treated EPC2‐ALI cultures. Furthermore, we show that stimulating 

EPC2‐ALI cells with IL‐13 induces SLC9A3, but not SLC9A1, expression and that treating mature EPC2‐ALI 

cells with the pan NHE inhibitor ethylisopropyl amiloride (EIPA) attenuated IL‐13–induced proliferation 

(Fig. 2‐8). These findings support the necessity of an NHE in IL‐13–induced proliferation in an esophageal 

epithelial model  system  in  vitro and given  the overexpression,  localization,  and  function of NHE3, we 

conjecture that [pH]i balance and regulation is a critical component of the observed proliferative effect 

that is induced by IL‐13 and mediated by an NHE in esophageal epithelial cells.  

 

Multiple compensatory mechanisms regulate [pH]i  in mammalian cells and  involve Na+/H+ exchangers, 

HCO3‐  transporters,  lactate‐H+  transporters  and  vacuolar  H+‐ATPase328,329.  Our  gene  ontology  analysis 

supports dysregulation of these mechanisms in EoE, identifying that 5 out of the 50 individual GO nodes 

generated from genes significantly dysregulated in EoE are tightly correlated with the transmembrane ion 

transport  activity.  Notably,  several  of  the most  dysregulated  genes were  part  of  the  [pH]i  regulatory 

circuit, including Cl‐/HCO3‐ exchangers (SLC26A4, SLC4A2, SLC4A8) and carbonic anhydrases (CA2). These 

functional  analyses  support  the  concept  of  [pH]i  pathways  being  active  in  the  primary  esophageal 

epithelial cells in EoE.  

 

68  

The  significant  decrease  in  DIS  with  steroid  therapy  or  elimination  diet  in  patients  with  EoE  being 

associated with symptom improvement292 indicates an association between DIS and the etiology of EoE. 

We  demonstrate  a  role  for  SLC9A3/NHE3  and  Na+/H+  exchange  in  DIS  formation,  one  of  the 

histopathologic manifestations  of  EoE.  Given  our  observations,  one would  predict  that  utilizing NHE3 

antagonists (systemically or topically) may be a therapeutic approach for reducing DIS and thus normalize 

associated esophageal  caliber dimensions  in EoE. Notably,  an NHE3‐specific  inhibitor,  tenapanor,  is  in 

phase 3 clinical trials for the treatment of cardiorenal and gastrointestinal disease330. Tenapanor has been 

shown  to  reduce  sodium uptake,  resulting  in  a  reduction  in  [pH]i330. Given  the  contribution of DIS  to 

esophageal barrier dysfunction and facilitating food allergen exposure, considering the potential usage of 

NHE3 inhibitors for EoE is warranted.  

 

In summary, we identified a relationship between SLC9A3/NHE3 expression and activity with DIS in EoE. 

Mechanistically, we show that IL‐13 stimulates SLC9A3 expression and NHE3 activity (via [pH]i) and that 

these  were  associated  with  esophageal  epithelial  DIS.  Inhibiting  NHE  activity  attenuated  esophageal 

epithelial  DIS  formation,  providing  a  rationale  for  the  therapeutic  utilization  of  NHE3  antagonists  for 

reducing DIS and DIS‐associated esophageal pathophysiologic manifestations in EoE. 

   

69  

2.7 Figures 

Figure 2‐1. SLC9A3 is the most upregulated transmembrane transporter activity gene in the EoE 

transcriptome, and levels correlate with EoE severity and DIS 

 

 

70  

 

 

   

71  

Figure 2‐1. SLC9A3 is the most upregulated transmembrane transporter activity gene in the EoE 

transcriptome, and levels correlate with EoE severity and DIS. A) GO nodes associated with 

transmembrane transporter activity‐related genes identified by Gene Ontology (GO) enrichment 

analysis of 1610 dysregulated genes from RNA sequencing.  B) Heatmap depicting the expression level of 

62 individual genes within the transmembrane transporter activity GO nodes. C) Individual FPKM values 

of SLC9A3 and D) Heatmap depicting expression level of SLC9A1‐9, E) Correlation analysis of SLC9A3 or 

SLC9A1 expression and matched peak distal eosinophil counts/HPF in esophageal biopsies (NL = 6; EoE = 

10). F) qPCR analysis of SLC9A3 expression and G) Spearman correlation relating SLC9A3 expression and 

eosinophil count/HPF in an independent validation cohort (NL = 10; EoE = 10). H) Immunofluorescence 

staining of esophageal biopsy sections from NL (top panel) and patients with EoE (lower panel). NHE3 

(red), CK13 (green) and nuclei (DAPI, blue) are shown. Images are representative of 7 patients per group. 

Magnification x40. I) Spearman correlation between SLC9A3 or SLC9A1 expression and percentage of 

dilated intercellular spaces (DIS) in esophageal biopsies from patients with active EoE (n = 8). (C, F) Data 

are represented as the average ± S.E.M. (E, G, I) Data are presented as relative expression over 18S. (C, 

E‐G, I) Individual symbols represent an individual patient **p < 0.01, ***p < 0.001. 

   

72  

Figure 2‐2. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in primary esophageal epithelial cells 

derived from EoE biopsy in response to IL‐13. 

 

   

73  

Figure 2‐2. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in primary esophageal epithelial cells 

derived from EoE biopsy in response to IL‐13. A) qPCR analysis of SLC9A3, B) Baseline intercellular pH 

(pHi), C) Representative curves of pHi change over time and D) Na+‐dependent pHi recovery rate of cells 

derived from biopsies of patients with active EoE (n = 6) treated with vehicle (Veh) or IL‐13. E) Spearman 

correlation analysis comparing the SLC9A3 expression level and Na+‐dependent pHi recovery rate (n = 5 

individual patients stimulated with vehicle and IL‐13). F) Percentage of S3226‐sensitive Na+‐dependent 

intracellular recovery rate in cells treated with vehicle or IL‐13. See Material and Methods for a detailed 

protocol.  B) Data represent the average pHi ± S.E.M of cells from patients with active EoE (n = 8). C) 

Each data point represents the average value of 40 individual cells from 2 individual experiments.  Data 

points for D) represent the average value of 120 individual cells from 6 different patients with active EoE 

and F) 50 individual cells from 5 different patients with active EoE. (A‐B, D, F) Data are represented as 

the average ± S.E.M. *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001.  

    

74  

Figure 2‐3. Mature stratified squamous esophageal epithelium model using EPC‐ALI culture system. 

 

 

   

75  

Figure 2‐3. Mature stratified squamous esophageal epithelium model using EPC‐ALI culture system. A) 

Schematic diagram of the esophageal epithelium (EPC2) air‐liquid interface (ALI) (EPC2‐ALI) 

differentiation protocol (See Material and Methods).  B) Gene expression change of IL‐13–stimulated 

EPC2‐ALI versus non‐treated EPC2‐ALI compared to that of patients with active EoE versus normal 

control (NL) patients. Fold changes were calculated from RNA sequencing of EPC2‐ALI and patient 

samples. Spearman correlation analysis was applied to analyze these 23660 genes. C) Gene ontology 

analysis of 572 genes that were significantly dysregulated by IL‐13 treatment of EPC2‐ALI cells (Fold 

change > 2, p < 0.05) identified 6 GO nodes related to transmembrane transporter activity. D) Heatmap 

depicting expression level of 46 individual genes within the transmembrane transporter activity GO 

nodes that are significantly dysregulated in EPC2‐ALI cells following IL‐13 stimulation. E) RPKM value is 

indicating SLC9A3 expression level in empty control (CTRL), STAT3 lentiviral knockdown (STAT3KD) and 

STAT6 lentiviral knockdown (STAT6KD) EPC2‐ALI cultures treated with vehicle (Veh) or IL‐13; n = 3 per 

treatment. **padj < 0.01, ***padj < 0.001. 

    

76  

Figure 2‐4. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in IL‐13–stimulated EPC2‐ALI. 

 

77  

Figure 2‐4. Increased SLC9A3/NHE3 expression and activity in IL‐13–stimulated EPC2‐ALI. A) qPCR, B) 

Western blot analysis and C) Western blot quantification of SLC9A3/NHE3 expression in EPC2‐ALI 

following a 72 h–treatment with vehicle (Veh) or IL‐13 (100 ng/mL). D) Immunofluorescence staining of 

the vehicle (top panel) or 100 ng/mL of IL‐13 (lower panel) stimulated EPC2‐ALI cultures. NHE3 (red) and 

nuclei (blue) are shown. Images are presentative of 3 samples per group. Magnification X400 E) 

Schematic view of the pH‐STAT assay. See Material and Methods for a detailed protocol. F) Baseline 

extracellular pH (pHe) of EPC2‐ALI cells treated with vehicle or IL‐13 for 72 h. DMSO (0.1%) or S3226 (30 

mM) was added to both sides of the solution during the experiment (n = 6‐11 samples per group from 5 

individual experiments). G) Amount of Ba(OH)2 injection over time and H) Ba(OH)2 injection rate 

measured for EPC2‐ALI cells treated with vehicle or IL‐13 (100 ng/mL) for 72 h. DMSO (0.1%) or S3226 

(30 mM) is added to both sides of the solution during the experiment (n = 6‐11 samples per group from 

5 individual experiments). (A, C, F, H) Data are represented as the average ± S.E.M. *p < 0.05; n.s. not 

significant 

    

78  

Figure 2‐5. Blockade of NHE3 protected EPC2‐ALI from IL‐13–induced dilated intercellular spaces (DIS). 

 

 

   

79  

Figure 2‐5. Blockade of NHE3 protected EPC2‐ALI from IL‐13–induced dilated intercellular spaces (DIS). 

A) H&E staining and B) electron microscopy of EPC2‐ALI cultures stimulated with vehicle or IL‐13 (100 

ng/mL) for 72 h and showing DIS (black arrows) in only IL‐13–treated cells. C) H&E staining of EPC2‐ALI 

cultures stimulated with vehicle or IL‐13 (100 ng/mL) in the presence and absence of S3226 (30 mM) for 

72 h. D) DIS formation (% of total area) was quantitated by morphometric analyses and expressed as the 

mean ± S.E.M; n = 3 independent experiments; ****p < 0.0001. Magnification A) X200, B) X5000 and C) 

X300. 

   

80  

Figure 2‐6. Demographics of patient cohorts examined in RNAseq analysis or qPCR. 

Biopsy set 1 (Cohort 1): RNAseq cohort (NL=6, EoE=10) 

 

 

 

 

 

Biopsy set 2 (Cohort 2): qPCR cohort (NL=10, EoE=10) 

       

   

 Age Male Female Max Eosinophils per

high powered field (hpf)

NL 12.7 ± 6.0 50% 50% 0 ± 0

EoE 15.1 ± 12.4 60% 40% 163.6 ± 92.4

 Age Male Female Max Eosinophils per

high powered field (hpf)

NL 9.7 ± 3.1 50% 50% 0 ± 0 EoE 10.7 ± 5.3 80% 20% 124. 4 ± 73.5

81  

Figure 2‐6. Patient characteristics of EoE and control patients in cohort 1 and cohort 2. Description of 

the age of biopsy collected, gender percentage and maximum eosinophils per high power field of the 

patient in cohort 1 (Biopsy set 1) and 2 (Biopsy set 2).  

   

82  

Figure 2‐7. GO analysis of dysregulated genes in EoE patients 

 

   

83  

Figure 2‐7. The 1610 genes that were identified to be specifically dysregulated by RNA sequencing of 

esophageal biopsies from patients with eosinophilic esophagitis (EoE) (n = 10) and normal controls (NL) 

(n = 6) underwent gene ontology (GO) enrichment analysis and were clustered into 50 individual GO 

nodes per their molecular function (with FDR‐corrected p < 0.05). GO enrichment based on molecular 

function is shown, 50 individual GO nodes are identified with FDR B&H p < 0.05. Blue indicates the total 

number of genes as part of the GO annotation; red indicates number of genes common between EoE 

transcriptome and GO node. Red line indicates FDR B and H p‐value cutoff; orange dotted line indicates 

FDR B and Y p‐value; light green dotted line indicates FDR B and H p‐value. Figure is generated by 

Toppgene.  

   

84  

Figure 2‐8. IL‐13–induced proliferation in EPC2‐ALI is attenuated by NHE3 inhibitor EIPA. 

 

   

85  

Figure 2‐8. IL‐13–induced proliferation in EPC2‐ALI is attenuated by NHE3 inhibitor EIPA. A) EPC2‐ALI 

cultures treated with the four combinations of vehicle (Veh) or IL‐13 (100 ng/mL) with DMSO or EIPA (20 

　M) for 72 h and stained for BrdU incorporation and DAPI (nuclei). B) Quantification of BrdU‐positive 

cells in EPC2‐ALI cultures. Data are presented as mean ± SEM; n = 6 per treatment. ****p < 0.0001. 

Magnification X300. 

    

86  

Table 2‐1. Expression level of 572 genes dysregulated in mature EPC2‐ALI by IL‐13. 

gene_id  48hr Veh  48hr IL‐13  LOGFC  pvalue 

NTRK1  0  12.8962  12.0048  7.72E‐25 

ATP5J2‐PTCD1  0  2.89614  10.92178  4.59E‐15 

TREML2  0  1.59001  9.500339  1.66E‐07 

FGF19  0  2.40941  9.285919  9.07E‐07 

DYX1C1‐CCPG1  0  0.996634  9.175073  2.04E‐06 

PPT2‐EGFL8  0  1.44493  8.900974  1.26E‐05 

TNFAIP6  0.417235  183.29  8.662212  2.90E‐45 

ARPC4‐TTLL3  0  0.708783  8.407443  0.000188 

ZNF20  0  0.923428  8.407443  0.000188 

CSF3  0  1.32101  7.949604  0.001337 

SHC4  0  0.446474  7.949604  0.001337 C17orf61‐PLSCR3  0  0.896016  7.757792  0.002667 

FAM26D  0  1.11879  7.65139  0.003799 

C8orf44‐SGK3  0  0.348911  7.595093  0.004545 

NELL2  0  0.479493  7.475448  0.006542 

SERPINB4  1.15211  214.884  7.426299  6.27E‐40 

SLC5A5  0  0.337742  7.201519  0.013904 

MAOB  0  0.391933  6.955428  0.025126 

CCDC103  0  0.597608  6.863093  0.030786 

LRRC31  0  0.386815  6.863093  0.030786 

CADM2  0  0.10635  6.764443  0.037847 

CCL26  0.37199  21.8657  6.751451  7.30E‐11 

ALOX15  0  0.307886  6.658548  0.046698 

TMEM191A  0  0.422046  6.658548  0.046698 

FAM26E  0.111923  8.87311  6.192024  1.08E‐19 

ANO1  0.233214  10.1932  5.662446  8.53E‐23 

CAPN14  11.5813  546.537  5.443614  5.67E‐15 

LBH  0.337045  13.5442  5.211747  1.96E‐19 

DPP4  0.964848  23.7153  4.502532  9.19E‐22 

BCL2L15  0.0199123  0.48573  4.491584  0.002442 

FCGBP  0.0120834  0.259852  4.309746  0.000157 

OSR1  0.104566  2.08085  4.197853  0.000294 

C1QTNF1  0.457086  7.90129  4.14251  9.17E‐12 

SOCS1  0.488605  8.46859  3.998544  3.81E‐07 

EML5  0.0828536  1.35625  3.916082  8.80E‐07 

SLCO2A1  0.0937948  1.35472  3.735509  8.01E‐05 

GLDC  0.0519947  0.734296  3.703088  0.003112 

NFE2  0.17579  1.58641  3.601208  0.004677 

LMO2  0.1237  0.836398  3.565584  0.04179 

87  

TMEM176A  0.0953987  1.16355  3.491584  0.049478 

PSMC3IP  0.257843  1.37932  3.197853  0.018798 

CDH26  2.91177  25.124  3.134618  4.55E‐13 

CISH  4.78419  44.7131  3.125573  2.49E‐13 

EDNRA  0.400461  3.44915  3.098317  1.49E‐06 

TMPRSS2  0.184351  1.71595  3.084959  0.000545 

S100A7A  0.0694255  0.638786  3.084959  0.008248 

ATP13A5  0.108312  0.973403  3.051011  0.003533 

EDAR  0.140993  1.22186  2.998544  0.000899 

ROR1  0.0496481  0.490605  2.944096  0.038502 

KRT27  0.184288  1.49847  2.906621  0.015563 

KAL1  0.0940993  0.745001  2.868147  0.00182 

C16orf59  0.182476  1.36661  2.787977  0.02287 

PDE6A  0.0526536  0.371801  2.703088  0.02961 

TNC  16.9492  119.52  2.701126  3.33E‐07 

LYPD6B  2.51809  17.6597  2.693218  7.44E‐08 

CYP1B1  3.28606  22.9077  2.684562  7.77E‐11 

FAM115C  0.222967  1.49912  2.663195  0.000713 

SUSD2  0.404433  2.73598  2.641249  0.000245 

NBL1  2.58312  17.0047  2.63068  2.78E‐08 

FETUB  4.44299  29.8103  2.629371  3.67E‐09 

UGT2B17  0.143098  0.918593  2.565584  0.043728 

SECTM1  1.82253  11.5601  2.548306  3.63E‐07 

IL32  0.438112  2.78624  2.529059  0.025765 

LURAP1L  5.66902  34.0519  2.469724  2.17E‐09 

RASGRP1  1.29847  7.50046  2.45311  9.42E‐08 

PRICKLE4  1.92513  11.1222  2.413581  1.09E‐05 

MB  0.874594  4.3936  2.395659  0.004687 

MKX  0.27223  1.55531  2.38116  0.003579 

GLI1  0.125642  0.631713  2.372939  0.041457 

UNC93A  0.281245  1.32395  2.347993  0.027743 

ST6GAL1  2.75556  14.4354  2.287356  4.93E‐08 

ANKRD33B  0.604775  3.16028  2.268747  1.91E‐06 

RNF122  0.424085  2.2119  2.266024  0.01191 

TGM3  5.88151  30.6317  2.263929  3.70E‐08 

IL2RG  0.322764  1.65754  2.243656  0.038637 

SERPINB3  177.206  904.027  2.234098  0.000169 

ABLIM2  0.583637  2.64277  2.209441  0.001872 

GPC6  0.292805  1.44999  2.191189  0.000726 

NPNT  0.438648  2.14552  2.188515  0.000906 

SLC7A4  0.256871  1.26419  2.182256  0.032189 

SLC26A2  2.39129  11.1783  2.108001  2.06E‐07 

LOC645638  23.5999  110.244  2.107006  3.56E‐07 

88  

PPYR1  0.405006  1.8849  2.101637  0.022824 

CTSC  86.6005  389.937  2.090948  5.58E‐05 

DNER  0.423696  1.92332  2.065658  0.006451 

HECW2  0.157272  0.67917  1.993678  0.01682 

LINC00476  0.562423  2.07078  1.959863  0.048518 

MAP3K14  2.10046  8.56304  1.920289  1.37E‐05 

AKAP2  3.79869  15.4173  1.90406  1.94E‐06 

CHI3L2  1.64993  6.31169  1.900004  0.003662 

LOX  0.400767  1.55909  1.899008  0.005648 

GCNT3  19.0739  76.0969  1.8794  2.98E‐06 

PTCHD4  1.25931  4.84785  1.85371  0.000866 

HS3ST1  3.88032  14.8807  1.82236  7.76E‐05 

DPYD  1.37435  4.88437  1.815443  0.00029 

PRR9  3.30348  12.4651  1.798994  0.001009 

SEMA3A  0.22748  0.853696  1.791144  0.026732 

NMI  3.21376  12.0343  1.787977  0.000618 

ALDH9A1  18.1412  67.8892  1.787077  8.53E‐06 

LAMP3  1.24484  4.60435  1.770202  0.00116 

CFB  0.678504  2.49234  1.760232  0.015186 

PDCD1LG2  0.73715  2.70776  1.760232  0.015186 

TGM2  1.99162  7.11691  1.751657  0.000158 

DIO2  2.24815  8.1191  1.724783  3.73E‐05 

SFRP1  7.29323  25.9703  1.715393  1.57E‐05 

SLC16A14  0.382766  1.34418  1.695352  0.023025 

RPTN  130.765  456.312  1.686209  0.005013 

ZNF860  0.432419  1.48748  1.66512  0.037828 

C1S  0.619963  1.97069  1.653047  0.03097 

SLC9A3  3.1023  10.3236  1.617697  0.000391 

PKD2  4.13331  13.1789  1.556026  0.000116 

CLGN  0.831392  2.55356  1.552409  0.025808 

SCLY  1.12276  3.49355  1.544826  0.016068 

ADAM8  3.94848  12.3019  1.529059  0.000355 

PPP1R3C  2.694  8.4245  1.528001  0.001579 

SLC45A4  3.43181  10.5442  1.502575  0.00055 

ID3  22.8578  69.6206  1.48999  0.000173 

PHF17  1.05748  3.16967  1.48615  0.004017 

PAPSS2  0.927162  2.72897  1.471925  0.014292 

CDC45  1.45115  4.32246  1.466049  0.025636 

EHD3  5.62808  16.7135  1.453461  0.000308 

CDC6  0.746004  2.20703  1.448015  0.037464 

MUTED‐TXNDC5  2.10105  6.20834  1.447056  0.002885 

PPP1R3D  12.3208  36.1941  1.438288  0.000267 

SLC16A9  0.620917  1.78567  1.407155  0.038559 

89  

NUDT3  1.61044  4.5133  1.396608  0.01802 

BTBD3  6.46411  18.8548  1.395777  0.000416 

SDSL  1.84296  5.18726  1.376107  0.041176 

PGBD5  1.62383  4.56755  1.375186  0.008955 

MME  9.26011  25.6182  1.355959  0.000607 

ST8SIA1  0.417951  1.15826  1.35371  0.019406 

TNFRSF19  0.992628  2.7798  1.345536  0.020287 

TRIM16L  3.04766  8.33872  1.335287  0.009187 

PDZK1IP1  30.0173  81.8403  1.330179  0.000825 

NCF1  4.03745  11.0037  1.32963  0.011062 

MAOA  11.7049  31.5023  1.311863  0.000988 

PPARGC1B  1.25664  3.36902  1.309424  0.002308 

CA2  345.751  919.198  1.293803  0.03045 

IRF1  2.47978  6.4926  1.271749  0.006422 

BARD1  1.48879  3.89634  1.271137  0.032774 

PP7080  8.46504  21.9548  1.258108  0.002991 

CALCRL  0.753184  1.9467  1.253117  0.037427 

NNMT  4.89472  12.5683  1.243656  0.010111 

CAT  22.1727  56.8231  1.240852  0.001614 

EEF1E1‐MUTED  2.22758  5.6761  1.238263  0.01409 

LTA4H  75.9864  193.943  1.235562  0.00523 

ITPRIPL2  5.03939  12.7608  1.217592  0.001929 

CANT1  23.4506  59.2563  1.214236  0.002587 

SAA1  15.5576  39.0059  1.212913  0.011045 

FAM217B  7.83605  19.6528  1.21259  0.001995 

SGK1  24.1875  60.2575  1.20568  0.002264 

DDX58  1.31171  3.27457  1.203014  0.019629 

PIK3R3  1.39546  3.36954  1.196038  0.014162 

MSRB1  7.53364  18.6003  1.187073  0.008886 

ORAI1  7.44987  18.2405  1.175021  0.008484 

CDCA5  1.61452  3.94824  1.173267  0.046253 

NINJ1  12.9094  31.4112  1.166014  0.005354 

SPSB1  5.59134  13.6025  1.165768  0.005048 

ENTPD2  5.09431  12.1684  1.161602  0.010615 

NPDC1  3.36992  8.11224  1.150547  0.036634 

GPRIN2  4.34553  10.391  1.140897  0.018744 

BIRC3  0.931928  2.36181  1.122155  0.02956 

PARP12  3.29122  7.76348  1.121245  0.010631 

CD14  5.92275  13.752  1.119566  0.01736 

DUOX2  1.93491  4.53761  1.112827  0.011514 

GJA9‐MYCBP  2.64351  6.47864  1.111019  0.025506 

MFHAS1  2.92078  6.82238  1.107083  0.009092 

RUNX2  1.15696  2.67917  1.106153  0.031511 

90  

ASB1  6.79675  15.787  1.098983  0.004983 

NANOS1  2.05453  4.57482  1.038072  0.026567 

LRP12  6.96458  15.3995  1.035181  0.009178 

TMTC3  6.61259  14.676  1.033336  0.008207 

RAB27A  3.6526  8.01938  1.027928  0.01993 

VWF  2.3094  5.08792  1.022722  0.012611 

ALOX15B  6.9515  14.6907  1.021935  0.014344 

CST3  193.576  423.969  1.014224  0.01734 

TXN  124.236  269.499  1.001292  0.014368 

SLC22A23  33.8029  18.2844  ‐1.0035  0.013808 

ID1  69.9144  37.4873  ‐1.00924  0.010038 

WNT7A  15.2522  8.19617  ‐1.01284  0.020001 

TNS1  1.35874  0.72994  ‐1.01325  0.044735 

ANXA9  50.8149  27.2877  ‐1.01384  0.009358 

ITGB6  15.0787  8.08837  ‐1.01543  0.014282 

NLRX1  22.6021  12.1086  ‐1.01668  0.009196 

WWC1  12.1696  6.52788  ‐1.01798  0.009139 

C6orf15  56.5726  30.2725  ‐1.01893  0.009637 

LDLR  93.8748  49.8872  ‐1.01944  0.026684 

PLEKHA6  1.74968  0.934552  ‐1.02158  0.047762 

CLIC3  132.641  70.8381  ‐1.02176  0.008955 

GBA  35.577  18.5995  ‐1.022  0.008824 

MANSC1  18.9684  10.1286  ‐1.022  0.011745 

POF1B  67.1948  35.7603  ‐1.02683  0.014242 

S100A10  407.64  216.368  ‐1.03065  0.022404 

PPP1R12B  3.05278  1.72252  ‐1.03402  0.015542 

PIM1  77.64  41.1106  ‐1.03412  0.011265 

KLK13  18.4194  9.75228  ‐1.03425  0.020384 

AKR1C2  9.38037  5.25946  ‐1.0344  0.018703 

RNF222  6.36259  3.35871  ‐1.03855  0.024965 

CTGF  6.55088  3.44557  ‐1.04378  0.034145 

LCE3E  493.985  259.781  ‐1.04401  0.014283 

LPIN1  19.0839  9.85132  ‐1.0449  0.007464 

PPARD  43.0156  22.4969  ‐1.04655  0.008629 

IRS1  10.6324  5.581  ‐1.0467  0.007332 

KIAA1239  1.58926  0.833159  ‐1.04852  0.048315 

TP53INP2  36.9779  19.3598  ‐1.05044  0.008195 

ARHGEF4  72.9352  38.0041  ‐1.05271  0.012202 

WNT10A  8.63071  4.49651  ‐1.05751  0.021095 

TUFT1  24.4823  12.7784  ‐1.05765  0.006907 

NFASC  3.93257  2.17929  ‐1.0605  0.045469 

LRP1  10.7551  5.58044  ‐1.0634  0.007641 

GRB7  26.5239  13.6355  ‐1.06389  0.007208 

91  

AIM1L  28.2062  14.6282  ‐1.0641  0.007288 

TIMP3  6.37175  3.30232  ‐1.06505  0.010695 

TCP11L2  16.251  8.39722  ‐1.06938  0.010085 

SPIN4  5.27389  2.72075  ‐1.0717  0.018055 

C9orf169  56.4704  29.1204  ‐1.0723  0.00863 

TPRG1  8.4483  4.33235  ‐1.07711  0.011312 

SYT8  58.2452  29.7508  ‐1.08605  0.005476 

WFDC5  102.818  52.3894  ‐1.08958  0.005332 

UGCG  29.0211  14.7322  ‐1.09497  0.006647 

ARID5B  8.17082  3.89986  ‐1.10212  0.00538 

SRPX2  6.14943  3.10577  ‐1.10234  0.031874 

DUSP1  28.67  14.4784  ‐1.10248  0.005485 

IGFBP3  4.24878  2.15771  ‐1.10427  0.042708 

NCCRP1  96.0627  48.3596  ‐1.10701  0.006143 

KAT2B  20.1373  10.0805  ‐1.11514  0.004334 

CPA4  21.3155  10.6498  ‐1.11755  0.00481 

PLEKHM1P  5.35447  2.6758  ‐1.11761  0.023359 

KRT2  5.53779  2.76491  ‐1.11891  0.029953 

SLC39A2  15.204  7.5445  ‐1.11891  0.01414 

SERPINB1  67.5999  33.7513  ‐1.11891  0.004216 

PLK3  28.2309  14.0973  ‐1.12076  0.004459 

MYOM1  1.74526  0.868805  ‐1.12744  0.048521 

GLRX  33.8623  17.0859  ‐1.12831  0.006211 

AADACL2  7.19573  3.55973  ‐1.13221  0.03983 

CCDC88B  3.32092  1.64085  ‐1.13398  0.02007 

RORA  3.55452  1.75489  ‐1.1341  0.006191 

KLK5  118.993  58.9909  ‐1.13451  0.00456 

CAMK2N1  31.8426  15.7092  ‐1.13619  0.003789 

HS3ST6  15.2918  7.54181  ‐1.13662  0.020009 

HMOX1  53.996  26.626  ‐1.13685  0.003664 

KIFC3  25.733  12.6092  ‐1.14554  0.003418 

KIAA1199  3.66444  1.79567  ‐1.14591  0.009087 

MYLK  2.73077  1.06278  ‐1.14919  0.017331 

OTUB2  3.42608  1.6741  ‐1.15001  0.026372 

ASPRV1  27.1928  13.2455  ‐1.15456  0.003652 

SLC37A2  57.6277  28.055  ‐1.15551  0.005243 

OSBP2  6.79934  3.29551  ‐1.16173  0.006903 

SH3D21  4.31603  2.08801  ‐1.16198  0.039352 

PADI3  3.88268  1.8743  ‐1.16754  0.027452 

FBXO32  4.16856  2.02648  ‐1.16969  0.006959 

IFITM1  20.4401  9.84087  ‐1.17138  0.020119 

TRIB2  5.63118  2.47007  ‐1.17138  0.00959 

LRRC20  26.212  12.6197  ‐1.17196  0.002779 

92  

LGALSL  60.4183  28.9347  ‐1.17902  0.004201 

MAP3K9  7.74508  3.68914  ‐1.18683  0.003677 

INHBA  11.2455  5.34837  ‐1.18901  0.007588 

GDPD3  26.4244  12.5628  ‐1.18955  0.005881 

GLTP  345.911  163.935  ‐1.19411  0.021022 

IMPA2  60.4967  28.6608  ‐1.19461  0.002277 

TNFAIP8L3  10.3497  4.89841  ‐1.19604  0.007817 

PADI1  26.8216  12.6902  ‐1.19652  0.002251 

CALML5  116.432  54.9315  ‐1.20062  0.002173 

DUSP16  27.5642  12.9913  ‐1.20209  0.002739 

SLC6A6  2.30587  1.27922  ‐1.2038  0.016779 

SCNN1B  26.2716  12.2874  ‐1.21316  0.002117 

PTPRH  2.52051  1.18113  ‐1.21578  0.033522 

SRPX  4.87309  2.2492  ‐1.21578  0.040778 

SASH1  17.2383  8.03138  ‐1.21873  0.002016 

FOSL1  13.5356  6.28807  ‐1.22291  0.007033 

DUSP6  46.8348  21.7271  ‐1.22541  0.0019 

GJB4  4.39331  2.03682  ‐1.22583  0.020898 

PCSK5  3.59228  1.37804  ‐1.22697  0.009194 

SPARC  35.0307  16.1307  ‐1.23565  0.001705 

NFATC2  2.56734  1.15494  ‐1.23715  0.009305 

KRT79  5.7037  2.61528  ‐1.24177  0.021659 

TMPRSS13  19.267  9.35643  ‐1.24444  0.001936 

SH3TC2  0.648238  0.296549  ‐1.24509  0.010234 

LIPN  18.1171  8.28438  ‐1.24573  0.006581 

TINAGL1  50.7916  23.1182  ‐1.25105  0.001422 

UCA1  5.30638  2.4174  ‐1.25111  0.019222 

KRT78  223.834  101.964  ‐1.25121  0.004783 

NDRG1  447.095  203.287  ‐1.25432  0.03493 

LIPG  8.05869  3.65343  ‐1.25813  0.003009 

FLG2  90.5457  41.0166  ‐1.25928  0.01509 

C10orf116  70.1305  31.7259  ‐1.26011  0.001932 

MALL  21.6099  9.78108  ‐1.26046  0.001456 

TNFSF9  8.20738  3.70328  ‐1.26496  0.014626 

LYNX1  1381.19  620.621  ‐1.26535  0.014294 

MBOAT2  38.2663  17.2118  ‐1.26952  0.001376 

SPRR2G  1148.07  515.868  ‐1.27097  0.011861 

IL6R  8.33919  3.67472  ‐1.27134  0.001737 

MATN2  2.96072  1.33777  ‐1.28289  0.017476 

PNPLA1  3.27661  1.49227  ‐1.28884  0.035963 

SLURP1  306.661  135.656  ‐1.29352  0.001219 

KIF13B  16.4814  7.27326  ‐1.297  0.001078 

IL18  43.2525  19.0087  ‐1.30428  0.001285 

93  

S100A12  164.048  72.024  ‐1.30441  0.000931 

ADSSL1  6.82477  2.959  ‐1.30568  0.016037 

HSPA2  8.0106  3.51235  ‐1.30631  0.00434 

H19  153.395  67.2493  ‐1.30681  0.002661 

GLUL  195.441  86.4826  ‐1.3122  0.011754 

EEPD1  1.58455  0.691679  ‐1.31274  0.03769 

GABRE  14.8599  6.4333  ‐1.32463  0.001158 

CRCT1  846.618  364.754  ‐1.33163  0.005276 

RASAL1  2.18686  0.96451  ‐1.33254  0.030061 

PEG10  5.88086  2.51982  ‐1.34131  0.001307 

SPON2  6.26296  2.67543  ‐1.34131  0.014396 

IL22RA1  13.2388  5.62271  ‐1.35228  0.001173 

ARHGAP29  9.01501  3.82781  ‐1.35265  0.000591 

FGFBP1  243.257  102.98  ‐1.35696  0.001617 

TRPV3  3.71045  1.56017  ‐1.36041  0.002965 

GLA  26.3971  11.1174  ‐1.36439  0.001144 

GNAO1  1.86537  0.805934  ‐1.3664  0.013094 

FAM49A  2.44451  1.02811  ‐1.3664  0.013094 

B4GALNT3  27.6506  11.5929  ‐1.37091  0.000487 

DNAJB5  8.80537  3.71198  ‐1.37432  0.0029 

SPNS2  70.9613  29.6095  ‐1.37812  0.001225 

PNLIPRP3  75.8125  31.6181  ‐1.37852  0.000605 

DSG1  75.8771  31.5732  ‐1.3818  0.001931 

SMAD3  19.8634  8.22074  ‐1.38942  0.000429 

CDSN  85.951  35.5609  ‐1.39006  0.000703 

PRSS22  16.7898  6.92537  ‐1.39446  0.002221 

GRAMD1C  6.75636  2.82685  ‐1.39575  0.002047 

CLCA4  28.7374  11.7299  ‐1.4042  0.000359 

RUSC2  7.6773  3.09819  ‐1.4065  0.000671 

IL37  8.52204  3.3792  ‐1.4117  0.036442 

ARRB1  0.765803  0.313581  ‐1.41931  0.041956 

BHLHE41  1.41463  0.571764  ‐1.42377  0.045085 

SLC15A1  7.34683  2.96794  ‐1.4245  0.001871 

THEM5  13.0476  5.26949  ‐1.42489  0.005312 

MUC20  3.88438  1.56977  ‐1.42728  0.001667 

SLC16A5  6.22436  2.50965  ‐1.42728  0.00898 

CRLF1  2.79946  1.12757  ‐1.42877  0.048549 

CDA  24.7818  9.87636  ‐1.44407  0.001515 

OVOL2  5.79497  2.28922  ‐1.45678  0.015159 

CSGALNACT1  3.14939  1.32582  ‐1.46089  0.006164 

NOS3  1.46849  0.581862  ‐1.47094  0.029232 

SPTSSB  16.5755  6.47796  ‐1.47228  0.000464 

FOS  6.79126  2.65107  ‐1.47394  0.004294 

94  

FHDC1  7.86995  3.07043  ‐1.47475  0.00029 

C1QTNF6  5.80248  2.26082  ‐1.48217  0.002758 

MYCT1  3.02636  1.16981  ‐1.48815  0.012706 

KLK9  16.5958  6.40971  ‐1.48932  0.001097 

FAM43A  21.1272  8.12521  ‐1.49546  0.000179 

ARNT2  1.08718  0.416799  ‐1.5  0.021107 

MUC21  27.0311  10.3626  ‐1.50007  0.000142 

SERPINA12  10.0417  3.82449  ‐1.50951  0.001381 

CCBP2  1.63925  0.622782  ‐1.51307  0.040646 

RAPGEF3  1.14625  0.439459  ‐1.51377  0.020679 

CEACAM6  94.2063  35.6128  ‐1.52027  0.000251 

SEMA7A  4.99729  1.96415  ‐1.52188  0.002253 

SHF  9.78356  3.68687  ‐1.5248  0.000803 

CEACAM7  13.8434  5.19308  ‐1.53138  0.000416 

LGALS1  180.302  67.5538  ‐1.53314  0.000102 

CTSL2  66.0985  24.758  ‐1.53416  0.000302 

KRT80  157.066  58.3824  ‐1.54012  0.0013 

CLEC2B  3.0125  1.12287  ‐1.54061  0.024653 

ECM1  256.631  94.7383  ‐1.54175  0.00093 

MLPH  1.80645  0.674938  ‐1.55281  0.020929 

KLK14  4.71958  1.73925  ‐1.55703  0.030191 

MIR210HG  4.42877  1.6285  ‐1.5602  0.007271 

ESYT3  2.80571  1.02919  ‐1.5637  0.004155 

3‐Mar  2.94486  1.07584  ‐1.56958  0.004315 

RNF39  19.5417  7.22099  ‐1.57091  0.000187 

GPR111  2.62724  0.954864  ‐1.57702  0.003123 

SPTBN5  0.44769  0.162672  ‐1.57737  0.029351 

ZNF555  2.06264  0.75378  ‐1.58822  0.00132 

SLC6A14  20.5034  7.38176  ‐1.59067  5.75E‐05 

SERPINB9  4.84382  1.73085  ‐1.6015  0.000816 

SLC26A9  4.24966  1.55532  ‐1.6015  0.000816 

SPRR2F  27.4731  9.78694  ‐1.60593  0.001105 

EMP3  13.6173  4.83076  ‐1.61195  0.004343 

SLC5A1  19.0366  6.73827  ‐1.61628  4.39E‐05 

SDR9C7  21.8245  7.70723  ‐1.6185  0.000132 

SLC13A4  1.64241  0.57109  ‐1.64087  0.029154 

PSAPL1  8.71749  3.02892  ‐1.64194  9.47E‐05 

NPR2  2.20855  0.769098  ‐1.64672  0.010917 

HCG22  3.35319  1.15474  ‐1.65481  0.000682 

CST6  46.1786  15.8656  ‐1.65816  0.000202 

LINC00319  1.91319  0.656418  ‐1.66013  0.019003 

ADRB2  6.93458  2.36585  ‐1.66829  0.001631 

KRT15  325.81  110.793  ‐1.67301  0.000452 

95  

PGLYRP4  79.4136  26.8069  ‐1.68362  2.48E‐05 

VSIG10L  46.2237  15.4332  ‐1.69944  2.46E‐05 

FAM25A  67.8396  22.4766  ‐1.71054  0.000201 

C21orf7  1.63799  0.541671  ‐1.71327  0.046707 

HSPB8  9.24948  3.04815  ‐1.71828  0.00049 

LCE2A  59.0463  19.4351  ‐1.72002  6.77E‐05 

AGAP11  2.52904  0.828227  ‐1.72072  0.007186 

HYAL1  5.38962  1.68809  ‐1.73081  0.00257 

CNFN  721.862  235.606  ‐1.73218  8.08E‐05 

LGALS9B  3.34594  1.07393  ‐1.75634  0.027117 

C7orf57  3.04559  1.0273  ‐1.75634  0.011893 

IFI6  8.68132  2.84889  ‐1.75634  0.008246 

BDKRB1  6.01298  1.90553  ‐1.77472  0.005993 

TCN1  4.48672  1.4198  ‐1.77681  0.007916 

FCHSD1  21.9994  6.9484  ‐1.77909  7.66E‐06 

SMPD3  24.6573  7.74526  ‐1.78747  7.27E‐06 

FGD2  1.39837  0.438391  ‐1.79029  0.023567 

CRISP3  5.88265  1.83092  ‐1.80074  0.001026 

XKRX  7.95386  2.47489  ‐1.80113  0.000133 

ATG9B  23.2719  7.24138  ‐1.80132  5.86E‐06 

CSPG4  0.716699  0.222368  ‐1.80525  0.010854 

PTCD1  3.72798  1.15905  ‐1.80597  0.000186 

IL36RN  34.2847  10.6961  ‐1.81317  5.30E‐06 

SPRR2C  35.6369  10.9695  ‐1.81672  9.38E‐05 

MMP2  5.50197  1.69338  ‐1.82452  0.000205 

RNASE7  124.077  37.8939  ‐1.82804  6.79E‐06 

KLK6  11.6747  3.60692  ‐1.83077  0.000273 

C18orf26  1.85639  0.56448  ‐1.83435  0.02679 

ZNF365  4.17548  1.24415  ‐1.84488  0.000319 

TGM5  9.61207  2.80098  ‐1.84871  5.95E‐05 

SERPINE1  38.9626  11.7549  ‐1.85007  3.46E‐06 

LIPM  29.2906  8.81263  ‐1.85165  1.14E‐05 

RNF223  8.20786  2.43616  ‐1.86924  0.002448 

GDA  5.94488  2.17955  ‐1.87109  2.20E‐05 

IL23A  2.47085  0.732054  ‐1.87182  0.049354 

FN1  27.64  8.17514  ‐1.88108  5.43E‐06 

NKPD1  7.52134  2.21066  ‐1.88335  1.51E‐05 

DLX2  2.53577  0.744922  ‐1.8841  0.008628 

CXCR7  8.3463  2.45186  ‐1.8841  0.0002 

IL1R2  3.08575  0.920779  ‐1.89385  0.016743 

TMEM132B  0.378951  0.109048  ‐1.91388  0.037156 

LCE2B  156.558  44.944  ‐1.91734  1.58E‐06 

RHBG  1.49563  0.466034  ‐1.92627  0.041236 

96  

GPSM1  12.1397  3.21886  ‐1.92714  6.38E‐06 

FLG  47.8845  13.589  ‐1.93395  5.26E‐05 

SCNN1D  1.17016  0.343151  ‐1.93692  0.025845 

LCE1A  198.523  56.1421  ‐1.93899  1.23E‐06 

LCE1C  117.831  33.0181  ‐1.95223  1.18E‐06 

LCE1B  68.3343  19.1426  ‐1.95266  1.24E‐06 

S100A6  567.321  158.126  ‐1.95993  8.86E‐06 

GSDMA  67.9073  18.5941  ‐1.98556  7.94E‐07 

LOXL2  2.57306  0.700711  ‐2.0135  0.001041 

EGFL8  3.67043  1.06475  ‐2.01938  0.009366 

ST6GALNAC1  3.46428  0.924515  ‐2.02262  0.001429 

KCTD4  5.18719  1.37993  ‐2.0272  0.000595 

COX6B2  1.72681  0.458689  ‐2.02936  0.028748 

ABCG4  2.162  0.598133  ‐2.04392  0.001671 

ELMOD1  4.00286  1.0624  ‐2.04852  0.000383 

FGF5  0.513723  0.144004  ‐2.0518  0.031587 

CASP14  16.315  4.24587  ‐2.05891  8.41E‐07 

ALDH3A1  16.1135  4.18195  ‐2.06589  5.90E‐06 

LCE2D  93.3328  24.0071  ‐2.07576  5.34E‐07 

IGLON5  0.79858  0.205054  ‐2.07827  0.034776 

SLC47A2  6.67977  1.75362  ‐2.08299  0.000104 

KIAA1644  0.998906  0.254606  ‐2.08892  0.002732 

SULT1B1  3.63113  0.922664  ‐2.09338  0.007449 

CHRNA9  2.65398  0.670299  ‐2.10212  0.003647 

USP2  5.23575  1.45218  ‐2.10568  3.45E‐05 

DHRS9  27.3434  6.86805  ‐2.11069  7.34E‐07 

ACSBG1  1.23198  0.320613  ‐2.11891  0.014395 

CXCL14  105.699  26.3868  ‐2.11891  2.73E‐07 

DSC1  9.08248  2.29473  ‐2.12157  1.09E‐06 

IGFBP6  14.5563  3.61922  ‐2.12473  0.000115 

TMEM86A  21.1973  5.26239  ‐2.12809  1.60E‐07 

MSH5‐SAPCD1  0.972757  0.235653  ‐2.13486  0.011337 

PSG2  1.29001  0.315467  ‐2.14866  0.042388 

LCE6A  84.9878  20.3968  ‐2.17575  1.91E‐07 

ENDOU  18.9507  4.59805  ‐2.17999  3.53E‐07 

MT2A  203.72  48.699  ‐2.18146  7.05E‐08 

CYP4F22  12.3353  2.94809  ‐2.18178  1.23E‐06 

DNASE1L2  2.01632  0.479387  ‐2.1893  0.023534 

CHI3L1  5.98348  1.41874  ‐2.19321  0.000249 

HYAL4  2.0167  0.475561  ‐2.20113  0.005011 

NDUFA4L2  5.91809  1.39119  ‐2.20565  0.001491 

NPR3  0.607935  0.144264  ‐2.21578  0.006529 

CCL24  6.05146  1.41259  ‐2.21578  0.034239 

97  

CFTR  0.403784  0.0933127  ‐2.23027  0.025522 

LCE2C  101.124  23.2283  ‐2.23901  6.38E‐08 

KCNE1  0.877545  0.209704  ‐2.24177  0.019355 

LCE1F  146.714  32.8463  ‐2.27604  2.05E‐08 

EGR3  8.70421  1.94984  ‐2.28181  2.28E‐07 

DKK1  1.42638  0.316953  ‐2.28686  0.020813 

ENO2  1.30779  0.288582  ‐2.29691  0.012338 

ADAMTS1  10.2196  2.25511  ‐2.29691  7.51E‐08 

IGFL1  138.427  30.1714  ‐2.31471  1.05E‐08 

TREX2  7.57473  1.57017  ‐2.38711  0.000185 

LCE1D  65.8624  13.6003  ‐2.39265  3.07E‐07 

PLA2G4B  40.2165  8.30458  ‐2.39291  3.65E‐09 

FRY  0.323396  0.0652453  ‐2.4262  0.007011 

PLA2G4D  2.98398  0.585296  ‐2.46684  6.65E‐05 

MXRA5  6.40136  1.2529  ‐2.46995  3.56E‐09 

KCNMA1  1.7114  0.337059  ‐2.47059  7.61E‐05 

TNFRSF6B  2.01445  0.402936  ‐2.47255  0.019084 

BPIFC  11.3027  2.1831  ‐2.48906  5.53E‐07 

HAL  4.9103  0.960323  ‐2.49082  1.56E‐06 

KIF26A  0.2931  0.0564452  ‐2.49331  0.025404 

ZNF662  4.5797  0.861328  ‐2.51964  1.76E‐07 

RTN1  1.04577  0.223707  ‐2.52188  0.034496 

IGFL3  11.3683  2.11249  ‐2.54484  0.000275 

MMP1  5.088  0.967246  ‐2.5637  6.87E‐05 

S100A4  4.25436  0.868585  ‐2.5637  0.020033 

MMP9  1.78039  0.326541  ‐2.5637  0.00271 

PCDHGA5  0.307647  0.0608375  ‐2.5637  0.048024 

LCE5A  3.38543  0.62092  ‐2.5637  0.009517 

MPP2  0.493773  0.0864461  ‐2.63081  0.015806 

NGEF  0.563221  0.11282  ‐2.66323  0.036488 

SLC16A6  0.516864  0.0989214  ‐2.68234  0.020781 

FCHO1  0.908266  0.166263  ‐2.70388  0.007798 

TIAF1  1.36314  0.220365  ‐2.75634  0.006241 

PRB2  1.10951  0.178058  ‐2.75634  0.02776 

RGCC  2.14492  0.344224  ‐2.75634  0.009855 

AQP9  0.524456  0.0841664  ‐2.75634  0.02776 

PTGER3  1.98846  0.36334  ‐2.77804  2.74E‐06 

LCE1E  33.5119  5.17591  ‐2.81163  4.98E‐10 

MEF2B  1.19178  0.208542  ‐2.84381  0.021148 

KLHL6  0.203688  0.0301741  ‐2.87182  0.037763 

LOR  80.7339  11.741  ‐2.89846  3.00E‐12 

CCL22  1.66284  0.239628  ‐2.91162  0.000509 

CYP26B1  0.787292  0.112309  ‐2.92627  0.001752 

98  

IGSF22  0.433619  0.0617884  ‐2.92627  0.016133 

MMP10  2.81478  0.397518  ‐2.94077  0.000423 

IVL  71.659  9.91461  ‐2.97036  9.68E‐13 

NR4A1  0.586822  0.100288  ‐2.97874  0.02802 

KCNN4  0.839935  0.113512  ‐3.00427  0.012324 

PSG7  5.98116  0.836074  ‐3.00788  6.18E‐06 

KRT37  3.91945  0.518005  ‐3.03645  6.30E‐05 

KPRP  124.81  16.2759  ‐3.05576  3.66E‐12 

PSG5  1.00735  0.161457  ‐3.07827  0.02084 

MMP3  2.7627  0.347739  ‐3.10684  0.000224 

PAPL  20.6342  2.55469  ‐3.13065  6.05E‐13 

EPHA8  2.98593  0.322206  ‐3.15489  9.70E‐05 

CYP4F2  1.59445  0.188545  ‐3.19692  0.000693 

FRMPD1  2.41718  0.284472  ‐3.2038  4.98E‐07 

KLHL30  0.295594  0.0345002  ‐3.21578  0.037528 

HLA‐F‐AS1  0.675554  0.0667367  ‐3.34131  0.026904 

LOC100507564  1.01634  0.116087  ‐3.34131  0.026904 

STEAP1B  1.06805  0.0979456  ‐3.45678  0.019374 

APOD  2.80422  0.225015  ‐3.75634  0.00042 

SCNN1G  0.735816  0.0545013  ‐3.87182  0.00092 

C1orf68  11.451  0.840088  ‐3.88563  4.39E‐08 

GPBAR1  0.603274  0.0915109  ‐3.92627  0.034093 

MYO1H  0.209304  0.0149288  ‐3.92627  0.034093 

POU5F1  0.622654  0.0730543  ‐3.92627  0.034093 

ARC  0.302825  0.0215993  ‐3.92627  0.034093 

FAM65C  0.855848  0.0593942  ‐3.9658  0.000121 

GP1BB  2.08565  0.136895  ‐4.07827  0.002148 

FOSB  0.296567  0.0340534  ‐4.07827  0.023276 

MYPN  0.204422  0.0221812  ‐4.07827  0.023276 

LOC149086  0.847807  0.0544235  ‐4.07827  0.023276 

HNRNPH2  8.45215  0.542771  ‐4.10684  1.90E‐12 

GYS2  0.347785  0.0202959  ‐4.21578  0.016015 

ARG1  5.60549  0.257025  ‐4.5637  2.61E‐08 

SYNPO2L  0.623297  0.0387408  ‐4.66323  0.000116 

FSBP  0.355492  0.0171707  ‐5.00427  0.000995 

AQP5  3.15397  0.104723  ‐5.02936  3.05E‐07 

CAPN8  0.989767  0.0302554  ‐5.14866  0.000518 

C4orf26  0.374112  0  ‐6.30345  0.038212 

LY75  0.0989903  0  ‐6.30345  0.038212 

RELN  0.0513609  0  ‐6.30345  0.038212 

IFNK  0.521178  0  ‐6.30345  0.038212 

SYT14L  0.263222  0  ‐6.30345  0.038212 

MYCBPAP  0.217294  0  ‐6.52323  0.023764 

99  

CACNA1D  0.116176  0  ‐6.71391  0.015043 

CCL20  0.942526  0  ‐6.71391  0.015043 

NPPA‐AS1  0.497653  0  ‐6.71391  0.015043 

C1orf177  0.557644  0  ‐6.88231  0.009667 

NWD1  0.129528  0  ‐7.03309  0.006294 

KRTAP5‐4  0.838475  0  ‐7.03309  0.006294 

XCR1  1.02833  0  ‐7.29428  0.002758 

CA9  0.764663  0  ‐7.29428  0.002758 

SENP3‐EIF4A1  0.293999  0  ‐7.29428  0.002758 

C9orf131  0.489218  0  ‐7.51536  0.001255 

ZNF321P  0.678821  0  ‐7.61437  0.000856 

PTPN5  0.54883  0  ‐7.70702  0.000589 

SLC6A2  0.649817  0  ‐7.95386  0.000198 

UBE2F‐SCLY  1.60147  0  ‐9.28737  2.64E‐08 

MUTED  2.36062  0  ‐9.63266  8.66E‐10 

PALM2‐AKAP2  0.984738  0  ‐9.91105  3.59E‐11 

TMX2‐CTNND1  1.51256  0  ‐10.2711  2.87E‐13  

   

100  

Table 2‐1. Expression level of 572 genes dysregulated in mature EPC2‐ALI by IL‐13. RPKM value of gene 

expression level in mature EPC2‐ALI treated with vehicle (Veh) or IL‐13 (100 ng/mL) for 48 h. Log2 fold 

change (LOGFC) indicates the gene expression fold change induced by IL‐13. n = 3 per treatment; 572 

genes were selected with |LOGFC| > 1 and p < 0.05. 

   

101  

Table 2‐2. GO analysis of IL‐13–induced dysregulated genes in mature EPC2‐ALI. 

 

GO: Molecular Function 

 

GO: Biological Process 

ID Name pValue Genes from Input Genes in Annotation

1 GO:0018149 peptide cross-linking 3.322E-21 23 57

2 GO:0031424 keratinization 1.154E-20 22 53

3 GO:0008544 epidermis development 2.465E-20 48 340

4 GO:0043588 skin development 7.283E-20 43 278

5 GO:0030216 keratinocyte differentiation 1.824E-18 30 138

6 GO:0009913 epidermal cell differentiation 1.631E-15 32 200

7 GO:0016477 cell migration 4.759E-12 82 1300

8 GO:0040011 locomotion 7.712E-12 99 1735

9 GO:0060429 epithelium development 1.047E-11 81 1296

10 GO:1901700 response to oxygen-containing compound 2.252E-11 93 1614

11 GO:0006954 inflammatory response 3.784E-10 52 711

12 GO:0051674 localization of cell 5.066E-10 82 1428

13 GO:0048870 cell motility 5.066E-10 82 1428 14 GO:0030334 regulation of cell migration 5.906E-10 53 742

15 GO:1902533 positive regulation of intracellular signal transduction 9.700E-10 62 958

 

GO: Pathway 

ID Name P Value Genes from Input

Genes in Annotation

1 1457791 Formation of the cornified envelope 1.343E-22 27 71

2 M5889 Ensemble of genes encoding extracellular matrix and extracellular matrix-associated proteins

9.224E-18 87 1028

3 1457790 Keratinization 1.006E-15 35 214

4 M5885 Ensemble of genes encoding ECM-associated proteins including ECM-affiliated proteins, ECM regulators and secreted factors

2.839E-15 68 753

5 1470923 Interleukin-4 and 13 signaling 1.916E-8 18 114

ID Name pValue Genes from Input

Genes in Annotation

1 GO:0005509 calcium ion binding 5.388E-7 45 708

2 GO:0038024 cargo receptor activity 7.485E-7 12 71

3 GO:0008236 serine-type peptidase activity 1.986E-6 22 242

4 GO:0017171 serine hydrolase activity 2.435E-6 22 245

5 GO:0004252 serine-type endopeptidase activity 4.074E-6 20 215

6 GO:0005044 scavenger receptor activity 6.312E-6 9 47

7 GO:0004175 endopeptidase activity 2.395E-5 30 457

8 GO:0015291 secondary active transmembrane transporter activity 5.357E-5 19 236

9 GO:0042802 identical protein binding 5.841E-5 64 1359

10 GO:0005125 cytokine activity 7.640E-5 18 222

11 GO:0002020 protease binding 1.151E-4 12 115

12 GO:0016638 oxidoreductase activity, acting on the CH-NH2 group of donors

1.584E-4 5 19

13 GO:0019955 cytokine binding 1.790E-4 11 103

14 GO:0005518 collagen binding 2.090E-4 9 72

15 GO:0015075 ion transmembrane transporter activity 2.108E-4 44 873

102  

6 M3468 Genes encoding enzymes and their regulators involved in the remodeling of the extracellular matrix

4.142E-8 26 238

7 1270302 Developmental Biology 1.709E-6 63 1081

8 M5883 Genes encoding secreted soluble factors 1.786E-6 29 344

9 1269310 Cytokine Signaling in Immune system 4.550E-6 48 763

10 1269318 Signaling by Interleukins 6.491E-6 37 531

11 169349 Validated transcriptional targets of AP1 family members Fra1 and Fra2

8.732E-6 8 34

12 M3008 Genes encoding structural ECM glycoproteins 1.623E-5 19 196

13 PW:0000051 histidine metabolic 4.113E-4 4 12

14 83051 Cytokine-cytokine receptor interaction 4.145E-4 20 270

15 1268755 Regulation of Insulin-like Growth Factor (IGF) transport and uptake by Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs)

4.287E-4 5 21

 

   

103  

Table 2‐2. GO analysis of IL‐13–induced dysregulated genes in mature EPC2‐ALI. GO enrichment 

based on molecular function, biological pathway and pathway are shown. The p‐value was calculated on 

the basis of probability density function 

   

104  

3 Chapter III: IL-13 activated STAT3 and STAT6 pathways in Eosinophilic

Esophagitis

 

Chang Zeng B Sc1, Simone Vanoni PhD1, 2, Simon P. Hogan PhD1,3 

1Division of Allergy and Immunology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3333 Burnet Ave, 

Cincinnati, OH, 45229; 2Institute of Pharmacology and Toxicology, Paracelsus Medical University, 

Salzburg, Austria. 3Department of Pathology, Mary H Weiser Food Allergy Center, Michigan Medicine, 

University of Michigan, 109 Zina Pitcher Place, Ann Arbor, MI 48109‐2200. 

Correspondence: Simon P. Hogan, Ph.D., Department of Pathology, Mary H Weiser Food Allergy Center, 

Michigan Medicine, University of Michigan, 109 Zina Pitcher Place 

Ann Arbor, MI 48109‐2200; Email: sihogan@med.umich.edu; Phone: 734‐647‐9923. 

Disclosures: The authors have declared that they have no conflict of interest 

   

105  

3.1 Copyright and Student Contribution 

Authorship is listed on the title page. I performed all the bioinformatic analysis used in this manuscript 

and experiments related to EPC2‐ALIΔSTAT6 cultures. SV generated knockout cell lines, performed western 

blot analysis and BrdU assay in EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures. Also, I generated figures, wrote the manuscript 

and modified it under the guidance of SPH. 

3.2 Abstract 

Eosinophilic Esophagitis (EoE) is a food allergen‐related disorder driven by Type‐2 inflammatory 

responses characterized by esophageal eosinophilia and epithelial remodeling. Previous studies have 

demonstrated that increased Interleukin‐13 (IL‐13) level in EoE patients contributes to transcriptome 

changes and led to histological changes. While anti‐IL‐13 therapy has demonstrated significant 

improvement in treating EoE, the molecular mechanism of IL‐13‐driven dysregulation in EoE remains 

unclear. 

Janus kinases (JAK) /Signaling transducer and activator of transcription (STAT) pathways are the most 

well‐known interleukin signaling pathways, and IL‐13 mainly signals through binding to IL‐4Rα/IL‐13Rα1 

complex and activate JAK/STAT3 or STAT6 pathways. Herein, we identified STAT protein binding motif is 

one of the most enriched transcription factors binding site (TFBS) in the dysregulated genes in both EoE 

biopsies and IL‐13 treated in vitro esophageal epithelium (EPC2‐ALI). In particular, we identified the 

STAT3 binding site as the most enriched TFBS in IL‐13 induced upregulated genes in EPC2‐ALI. 

To study the involvement of STAT signaling in IL‐13 induced esophageal epithelial remodeling, we 

employed shRNA technique to knockdown STAT3 and STAT6. Using RNA sequencing and gene ontology 

(GO) analysis, we identified the involvement of STAT3‐dependent genes in regulating epithelial 

development and proliferation. Experimental analysis showed that STAT3 knockdown in EPC2‐ALI led to 

increased filaggrin expression and epithelial barrier resistance, suggesting the important role of STAT3 in 

106  

epithelial integrity. Further analysis showed that IL‐13 induced increased proliferation is abrogated in 

STAT3KD cells, we thus conclude that STAT3 is essential for IL‐13 induced basal cell hyperplasia in EoE. In 

contrast, we found that IL‐13‐induced STAT6‐dependent genes are related to cytokine and chemokine 

production in esophageal epithelium.  

Taken together, these data suggested an essential role of STAT proteins in EoE pathogenesis and defines 

the distinct role of STAT3 and STAT6 in IL‐13 induced epithelium dysregulation in EoE. 

   

107  

3.3 Introduction 

Eosinophilic esophagitis (EoE) is a chronic inflammatory disease of the esophagus, characterized by 

upper gastrointestinal symptoms such as food impaction and dysphagia in both adults and children140,331. 

Analysis of both patient biopsies and experimental murine model indicated EoE is driven by Th2‐

mediated inflammatory responses48,50,332,333.  

One of the Th2 cytokines that is elevated in EoE patients is IL‐1348,51,54. Interestingly, intratracheal 

delivery of IL‐13 led to eosinophils accumulation and esophageal epithelial hyperplasia in a murine 

model of EoE206. Moreover, inducible, lung‐specific IL‐13 transgenic mice model showed EoE phenotypes 

including esophageal eosinophilia and epithelium remodeling207.Conversely, IL‐13‐deficient mice fail to 

develop histological EoE phenotypes upon repetitive epicutaneous antigen challenges to induce 

experimental EoE18. Together, these experimental models have demonstrated a pathogenic role of IL‐13 

in EoE. Furthermore, IL‐13 is shown to induce EoE‐like transcriptome changes in vitro54, leading to 

dysregulation of inflammatory and epithelial barrier regulatory genes including Chemokine (C‐C motif) 

ligand 26 (CCL26)54, cadherin‐26 (CDH26)334 desmoglein‐1 (DSG‐1)133, Leucine‐rich repeat‐containing 

protein 31 (LRRC31)208, calpain‐14 (CAPN14)209 and synaptopodin (SYNPO)335. 

Given the importance of IL‐13 in EoE pathogenesis, several clinical trials were performed to examine the 

efficacy of anti‐IL‐13 therapy in treating EoE. In clinical trial studying anti‐IL‐13 mAb QAX576, inhibition 

of IL‐13 in EoE patients showed decreased esophageal eosinophilia, together with the improvement of 

EoE‐relevant transcriptome211. Aside from direct inhibition of IL‐13, antibodies against IL‐13 receptor 

subunits also showed promising outcome in treating EoE. RPC4046, an antibody against both IL13Rα1 

and IL13Rα2, recently established its ability to reduce esophageal eosinophil counts in EoE patients in its 

phase II clinical trial212. In addition, in a recent clinical trial, treatment using antibody Dupilumab, that 

108  

blocks IL‐4Rα subunit, also showed relief of intraepithelial eosinophilia, improved symptoms and quality 

of life compared to the placebo group in EoE patients213. 

Considering the critical role of IL‐13 in the exacerbation of esophageal inflammation and remodeling, we 

began to define the involvement of signaling pathways in IL‐13 effects on esophageal cells. IL‐13 mainly 

signals upon binding to IL4Rα/IL13Rα1 complex. It is known to activate Janus kinase (JAK)/Signaling 

transducer and activator of transcription 6 (STAT6) pathway and regulate transcription of STAT6‐

dependent genes176. In the meantime, recent studies also identified that IL‐13 could also signal through 

JAK2/STAT3 pathway336,337. 

Although all being STAT6 family members, STAT3 and STAT6 seem to have a distinct influence on cell 

homeostasis. STAT6‐dependent signaling is critical for various allergic inflammatory disorders on both 

hematopoietic and non‐hematopoietic compartments338. Mice with STAT6 knockout in eosinophils are 

protected from allergic airway inflammation339. Also, epithelial STAT6 activation is essential for airway 

hyperreactivity and mucus production in asthma340. Meanwhile, STAT3 signaling is proven important for 

regulating barrier permeability341, epithelium differentiation342, and proliferation343. Together, both 

signaling pathways could either regulate inflammatory responses or epithelial changes, which are 

important pathogenic mechanisms and phenotypes in EoE. Given this, we examined the involvement of 

STAT6 and STAT3 pathways in IL‐13‐mediated responses in esophageal epithelial cells.  

We show that established that STAT binding site is one of the most enriched transcription factors 

binding sites (TFBS) in EoE transcriptome and that STAT3 binding motif is the most significantly enriched 

TFBS in IL‐13‐mediated upregulated genes. Bioinformatic and network analyses identified an enrichment 

of genes that contain the STAT‐3 binding site that is involved in epithelium barrier regulation (e.g., LOR 

and EMP1) and proliferation (e.g., WNT7A and IRS1). Using EPC2‐ALIΔSTAT3, we further proved the 

influence of STAT3 on barrier function and IL‐13 induced proliferation in esophageal epithelium. In 

109  

contrast, we show that IL‐13‐induced STAT6‐dependent genes (e.g., POSTN and CCL26) are related pro‐

inflammatory esophageal function promoting cytokine production. 

   

110  

3.4 Materials and methods 

RNAseq analysis of Human subjects ‐ NL (healthy control patients) were defined as having no history of 

EoE diagnosis, 0 esophageal eosinophils per high‐power field (HPF) and no evidence of esophagitis 

within distal esophageal biopsies obtained during the same endoscopy procedure as the analyzed 

samples. EoE was defined as described in the recent consensus guidelines. Specifically, patients needed 

to have ≥15 eosinophils in at least 1 high‐power field (Eos/hpf) in a distal esophageal biopsy with other 

causes of esophageal eosinophilia excluded, and without a response to acid suppression. RNAseq 

analyses were performed on human esophageal biopsy samples (normal, n = 6; EoE, n = 10) as 

previously described (NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database under accession GSE58640)122. 

Transcription factor binding site (TFBS) analysis – TFBS analyses were performed using the University of 

California Santa Cruz transcription factor binding sites (UCSC_TFBS) database which belongs to Database 

of Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) (https://david.ncifcrf.gov/)344,345. 

EPC2‐ALI culture ‐ The cells used were immortalized human esophageal epithelial cell line (EPC2‐hTERT), 

a kind gift from Dr. Anil Rustgi (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA), and were cultured as 

previously described346. Air‐liquid interface (ALI) culture system was previously described and 

characterized together with EPC2 cells133. EPC2‐hTERT cells were seeded onto permeable (0.4 µm) 

transwell support (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) and grown to confluence while fully 

submerged in low‐calcium ([Ca2+] = 0.09 mM) keratinocyte serum‐free media (K‐SFM) (Life Technologies; 

Carlsbad, CA). Epithelial differentiation was induced by culturing submerged cell monolayers in high‐

calcium K‐SFM ([Ca2+] = 1.8 mM) for 4 days (day 3 to 7). Cells were then exposed for 5 days (day 7 to 12) 

at ALI by removing cell media from the top chamber, in order to induce stratification. Stimulation with 

IL‐13 (100ng/mL) in the lower chamber occurred when the epithelial differentiation was complete. Cells 

111  

were collected for RNA or fixed for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) at different IL‐13 exposure 

times as indicated. 

H3K4me3 Histone Mark Chromatin Immunoprecipitation‐sequencing (ChIP‐seq) ‐ EPC2 cells were 

stimulated at day 5 of ALI culture with IL‐13 (100 ng/mL) for 4 hours. Following exposure to IL‐13, cells 

were cross‐linked with 0.8% formaldehyde for 10 minutes at RT. After lysis, cells were sonicated for 10 

minutes (Peak power 175W, Duty factor 10%, Cycles/burst 200 count) at 4 °C using Covaris S series 

Sonicator (Covaris; Woburn, MA, USA), yielding chromatin fragments of 200‐300 base pairs in size. To 

avoid the presence of unspecific binding, pre‐clearing with 10µL Dynabeads® Protein G magnetic beads 

(Life Technologies; Carlsbad, CA) was performed on each chromatin sample for 45 minutes at 4 °C on 

rotating wheel. 20µL of Dynabeads® Protein G magnetic beads (Life Technologies; Carlsbad, CA, USA) 

were combined for 1 hour at RT on a rotating wheel with 1 µL of anti‐H3K4me3 (cat#17‐614, Millipore 

corporation; Temecula, CA, USA) per sample. Beads coated with antibody were then incubated for 14‐16 

hours at 4 °C on a rotating wheel with 5µg of chromatin complexes to perform immunoprecipitation. 

Chromatin‐antibody‐beads complexes were washed with 500µL of each of the following buffers in 

succession: low salt wash buffer (10 mM Tris‐HCl pH7.6, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.1% sodium 

Deoxycholate, 1% Triton X‐100, 150 mM NaCl), high salt wash buffer (10 mM Tris‐HCl pH7.6, 1 mM 

EDTA, 0.1% SDS, 0.1% sodium deoxycholate, 1% Triton X‐100, 400 mM NaCl), LiCl wash buffer (10 mM 

Tris‐HCl pH7.6, 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% Nonidet P‐40) and Triton X‐

100 buffer (10 mM Tris‐HCl pH7.6, 1 mM EDTA, 0.2% Triton X‐100). Elution of the immunoprecipitated 

chromatin was obtained following 1‐hour incubation at 37 °C with shaking using 100 uL elution buffer 

(10 mM Tris‐HCl pH7.6, 1 mM EDTA, 250 mM NaCl, 0.3% SDS). 5 µL of Proteinase K solution (Life 

Technologies; Carlsbad, CA, USA) was added to the eluates and incubated at 37°C for 1 hour for protein 

degradation. Incubation at 65 °C for 6 hours was then performed for reversing the cross‐link. DNA was 

purified with QIAquick® PCR purification kit (Qiagen; Valencia, CA, USA) and eluted in 30 µL molecular 

112  

biology grade water (Sigma; St. Louis, MO, USA) and processed for qPCR prior to sequencing. Libraries 

were created as described previously347 and sequenced by CCHMC Gene Discovery and Genetic 

Variation Core. Raw data was uploaded on Biowardrobe298, and peak values were calculated. 

Differentially enrichment of binding sequences was assessed using MAnorm method348. Alteration of 

H3K4me3 enrichment is identified by unique peaks in a certain group, with the criteria that log10 [p 

value] > 1.3. 

Lentiviral Transduction ‐ EPC2 cells were transduced at 60‐70% confluency with lentiviral particles 

containing Mission® STAT6 shRNA (TRC0000019409, Sigma; St. Louis, MO, USA), Mission® STAT3 shRNA 

(TRCN0000329887, Sigma; St. Louis, MO, USA) or Mission® non‐target control shRNA (Sigma; St. Louis, 

MO, USA). All the shRNA lentiviruses were generated by the Cincinnati Children’s Hospital Medical 

Center Viral Core using a 4‐plasmid packaging system. Lentiviral particles were incubated with EPC2 cells 

for 6 hours. All the viral particles were added in the presence of 5 µg/mL Hexadimethrine Bromide 

(Polybrene®) (Sigma; St. Louis, MO, USA). During the first hour of incubation, cells were spun down at 

1000*g for 1 hour at room temperature. 6 hours following transduction cells were put in fresh KSFM 

media, and 24 hours later media containing 1 µg/mL of Puromycin (Thermo Fisher Scientific 

Incorporated; Rockford, IL, USA) was used for selection. Cells were grown under selective pressure and 

cultured as regular EPC2 cells. Stable knockdown for STAT6 and STAT3 was demonstrated by western 

blot and RNAseq analyses. 

Western Blot ‐ EPC2 ALI cells were lysed following stimulation, using a protein extraction reagent (10% 

Glycerol, 20 mM Tris HCl pH7, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP‐40 in H2O) with Halt™ protease 

inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific Incorporated; Rockford, IL, USA). Approximately 40 μg of 

protein extract were separated on a 4%‐12% Bis‐Tris gel and transferred to a nitrocellulose membrane 

(Life Technologies; Carlsbad, CA). The following antibodies were used: anti‐STAT3 (1:1000, #9132, Cell 

Signaling Technology; Danvers, MA), anti‐STAT6 (1:1000, sc‐621, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, 

113  

CA, USA), anti‐α‐actin (1:2000, A2066, Sigma; St. Louis, MO, USA) or anti‐GAPDH (1:2000, clone 2D9, 

TA802519, Origene; Rockville, MD). The IRDye® 800 CW goat anti‐rabbit or goat anti‐mouse IgG (H+L) 

(Li‐Cor; Lincoln, NE) were used as secondary antibody for detection. 

RNAseq analyses and Gene ontology (GO) analysis ‐ RNAseq analysis was performed as previously 

described. Briefly, RNA was isolated using the RNeasy kit (QIAgen Incorporated, Germantown, MD, USA) 

according to manufacturer instructions. Assessment of RNA quality was performed using the Agilent 

2100 Expert bioanalyzer (Agilent Technologies Incorporated, Clara, CA, USA) and only those samples 

getting an RNA Integrity Number (RIN) above 8 were chosen for sequencing. Next‐generation 

sequencing analyses were performed by the CCHMC Genetic Variation and Gene Discovery Core. Raw 

data was uploaded on Biowardrobe298, and RPKM values were calculated. Differentially expressed genes 

were assessed using DEseq2 under p<0.05 cut‐off conditions. Criteria of DEseq2 analysis for 

identification of IL‐13‐induced STAT3 dependent genes: (1) RPKM>2 in any of the 4 groups (vehicle and 

IL‐13 treated EPC2‐ALIctrl, vehicle and IL‐13 treated EPC2‐ALIΔSTAT3); (2) compare EPC2‐ALIctrl treated with 

or without IL‐13, |Fold Change (FC)|>2, p<0.05; (3) compare EPC2‐ALIΔSTAT3 treated with or without IL‐13, 

|Fold Change (FC)|<2, p>0.05. Similar criteria were applied for IL‐13‐induced STAT6 dependent genes. 

Gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization based on molecular function using 

ToppGene299 with FDR B&H correction and p‐Value cutoff at 0.05. 

5‐Bromo‐2’‐deoxyuridine (BrdU) assay and Immunofluorescent (IF) staining ‐ After EPC2‐ALI cultures 

were treated as indicated in the experiment, BrdU reagents dissolved in DMSO (final concentration 10 

µM) were added to both the upper and lower chambers of transwells for 2 hours. EPC2‐ALI cultures 

were then washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for another 2 hours. To examine BrdU 

incorporation, IF staining was performed as previously described349. In brief, formalin or 

paraformaldehyde fixed, paraffin‐embedded EPC2‐ALI cultures were sectioned, mounted on slides and 

de‐paraffinized using xylene followed by serial hydration using graded ethanol and water. Slides were 

114  

then permeabilized in Tris‐EDTA (1 mM, pH 9.0) with 0.1% Tween‐20, and antigen exposure performed 

at 125°C for 30 seconds in a decloaking chamber using pressure cooker. Slides were then blocked by 4% 

Normal Donkey serum for 1 hour followed by overnight incubation of primary antibody (mouse anti‐

BrdU (2.5 µg/mL)) diluted in 10% normal donkey serum. Slides were then washed and incubated with 

secondary antibody (1:200, Donkey anti‐Mouse IgG (H+L) Secondary antibody, Alexa Fluor 488, Thermo 

Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, USA) at RT for 1hr. Slides were mounted with Fluoromount‐G 

(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) mounting solution. Fluorescent imaging was performed using 

the Zeiss Apotome fluorescent microscope with consistent exposure time under the same excitation 

wavelength. 

Trans‐epithelial electrical resistance (TEER) measurement – TEER measurements were performed on 

EPC2‐ALI cultures using epithelial volt/ohm meter (EVOM, World Precision Instrument, Sarasota, FL, 

USA) together with chopstick electrode set (#STX2, World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA). 

Before the measurement, media was removed from the lower chamber of the transwell insert and the 

inserts were washed with 1x PBS on both top and lower chamber. Fresh 1x PBS was added to both top 

and lower chamber for measurement. TEER readings were recorded immediately, and three 

measurements were performed for each culture insert. The TEER values were reported as ohms per 

square centimeter (Ω/cm2). 

Statistical Analysis ‐ Statistical significance of EPC2‐ALI samples were established using unpaired t‐test 

(two‐tailed), or two‐way ANOVA when there was more than one variable. For non‐normally distributed 

data from patient biopsies, Mann‐Whitney test was used. Graphs and statistical analyses were 

performed using GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software Incorporated, La Jolla, CA, USA). 

   

115  

3.5 Results 

3.5.1 STAT binding site is one of the most enriched TFBS in EoE dysregulated genes 

To begin to define the Il‐13‐induced signaling pathways involved in esophageal inflammation and 

remodeling in EoE, we analyzed the enrichment of transcription factor binding motifs (TFBM) in the 

1607 dysregulated genes identified by RNAseq analyses comparing biopsy samples from normal healthy 

controls and pediatric EoE patients122. We identified the significant enrichment of genes that possess 

nuclear factor kappa‐light‐chain‐enhancer of activated B cells (NF‐κB), nuclear factor of activated T‐cells 

(NFAT), peroxisome proliferator‐activated receptor gamma (PPARG), CCAAT‐enhancer‐binding proteins 

(CEBP), STAT and interferon regulatory factor 1 (IRF‐1) binding motifs (Fig. 3‐1A). Notably, STAT family 

binding site was one of the most enriched binding motifs (Fig. 3‐1A) within all the dysregulated genes in 

EoE patients (448 genes, 27.9% of the total, p = 0.038). As the STAT family consists of seven family 

members, we examined the expression of STAT proteins (STAT‐1‐STAT‐6) between NL and EoE patients, 

and demonstrate significant differential expression in STAT1, STAT3 and STAT6 expression in EoE 

patients (Fig. 3‐1B). Notably, we observed ~ 2‐fold increase in interferon‐induced STAT1 and IL‐4 and IL‐

13‐induced STAT3 and STAT6 mRNA in esophageal biopsy samples in patients with active EoE (Fig. 3‐1C, 

D, E respectively). These studies show that IL‐13‐induced transcription factor STAT3 and STAT6 are 

significantly elevated in EoE and that genes that possess STAT‐binding motifs are enriched in the EoE 

transcriptome. 

 

3.5.2 STAT binding site is the most enriched in both dysregulated genes and transcriptionally active 

genes following 4 hours incubation with IL‐13 in EPC2‐ALI 

In order to better understand the involvement of STAT proteins in regulating esophageal epithelium 

remodeling, we employed the previously established in vitro stratified squamous epithelium model 

116  

(EPC2‐ALI). We have previously demonstrated that stimulation of EPC2‐ALI with IL‐13 induces an EoE like 

transcriptome similar to what is observed in primary cells derived from EoE patients’ biopsies54,350. 

RNAseq analysis of EPC2‐ALI showed that 4 hours treatment of IL‐13 led to significant dysregulation of 

712 genes, with 39.04% upregulated and 60.96% downregulated genes (Fig. 3‐2A). TFBS analysis 

indicated that STAT binding motif is the most significantly enriched binding site after short‐term IL‐13 

exposure (Fig. 3‐2B, 220 genes, 30.1% of the total, p‐value 5.6e‐4). In order to better understand the cell 

signaling network involved in the IL‐13 mediated transcriptome dysregulation, we also analyzed 

trimethylation of lysine 4 on histone H3 (H3K4me3) modification on the chromatin of EPC2 ALI cultures. 

The H3K4me3 modification is highly enriched in open chromatin regions, normally correlated with 

transcriptionally active genes351. Using ChIP‐seq analysis, we identified 858 genes showing active 

transcription following 4 hours IL‐13 treatment. TFBS analysis of these genes showing unique H3K4me3 

modification revealed significant enrichment of genes that possess binding motifs of only STAT, ETS 

domain‐containing protein (ELK1) and AP1FJ. Indeed, STAT binding motifs are the most significantly 

enriched binding motif within the genes with at least one transcriptionally active region (Fig. 3‐2B, 310 

genes, 36.1% of the total, p‐value 1.5e‐13). 

 

3.5.3 STAT3 is the most enriched TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes. 

As STAT family binding motif is the most significantly enriched binding sites in both dysregulated and 

transcriptionally activated genes in EPC2‐ALI cells after 4hr IL‐13 treatment, we’re interested in 

identifying the specific STAT protein next involved in IL‐13‐induced dysregulation in EoE. We first 

compared the expression level of STAT family members upon 4hr IL‐13 treatment. RNAseq analysis 

indicated that STAT3 is the most upregulated STAT protein and also the only significantly upregulated 

STAT within the family (Fig. 3‐3A, p=0.049 for STAT3). Interestingly, when analyzing subsets of IL‐13 

117  

dysregulated genes, we also found that STAT3 binding motif is the most significantly enriched binding 

site in IL‐13 mediated upregulated genes (Fig. 3‐3B, 52% of the total, p‐value 5.9e‐9). Based on the 

studies, we concluded that IL‐13 ‐induced STAT3 in esophageal epithelial cells and that IL‐13 induced the 

enrichment of genes that possess STAT3 binding motifs.  

 

3.5.4 STAT3 and STAT3‐related genes regulate barrier integrity of the esophageal epithelium 

In order to better understand the role of STAT3 in esophageal epithelium, we employed the lentiviral 

shRNA gene silencing system and generated stable knockdown (KD) EPC2 cell line with diminished STAT3 

expression level. Western blot (Fig. 3‐4A) and RNAseq (Fig. 3‐4B) analyses indicated an 80% reduction in 

both protein and mRNA level of STAT3 in STAT3 shRNA lentiviral transduced EPC2‐ALI cells (EPC2‐

ALIΔSTAT3) compared to empty control transduced group (EPC2‐ALICTRL).  

We’re first examined the impact of STAT3 on EPC2‐ALI steady state function. RNAseq analysis comparing 

transcriptome differences between EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures identified 493 genes that are 

altered following STAT3 knockdown. GO analysis based on biological process annotation on these 

dysregulated genes showed that within the top 5 GO nodes that were significantly dysregulated, 2 of 

them are related to epidermal or skin development (Fig. 3‐4C), indicating a potential role of STAT3‐

dependent genes in the regulation of squamous epithelial differentiation maturation and barrier 

integrity. Several junctional proteins, including epithelial membrane protein 1 (EMP1) and loricrin (LOR), 

are significantly upregulated in EPC2‐ALIΔSTAT3 cells (Fig. 3‐4D). 

To validate the altered expression of barrier integrity genes in EPC2‐ALIΔSTAT3 cells, we examined the 

alteration of filaggrin (FLG) expression in EPC2‐ALI cultures. The FLG expression is significantly decreased 

in EoE according to RNAseq analysis in our patient cohort (Fig. 3‐4E) and also been established in other 

cohorts131. We showed that FLG expression in both mRNA and protein level are increased in EPC2‐

118  

ALIΔSTAT3 cells (Fig. 3‐4F and 4G, mRNA and protein respectively), suggesting the role of STAT3 in 

regulating the expression of barrier integrity genes such as filaggrin under steady state. 

Given the role of STAT3 in regulating junctional proteins, we speculated that STAT3 could influence the 

barrier function in esophageal epithelium. To verify this hypothesis, we compared the TEER between 

EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures, as TEER is one of the important parameters that are used to 

indicate epithelial barrier integrity. Consistent with our hypothesis, EPC2‐ALIΔSTAT3 cells showed 

significantly higher TEER than the EPC2‐ALICTRL group (Fig. 3‐4H).  

 

3.5.5 IL‐13 induced STAT3‐dependent genes are involved in IL‐13 induced cell proliferation 

We next examined the contribution of STAT3 in IL‐13 induced esophageal epithelial dysregulation. By 

performing DeSeq2 analysis on RNAseq results, we identified 129 genes that are regulated in an IL‐13‐

induced and STAT3‐dependent manner. 

To further understand these genes, we performed GO analysis to determine gene clustering based on 

biological processes. Within the top 10 individual GO nodes, there’s three GO nodes that are directly 

related to proliferation, together with one node related to DNA replication, which is an essential 

requirement of cellular proliferation (Fig. 3‐5A). Of the 27 IL‐13‐induced STAT3‐dependent, cell 

proliferation regulation related genes included WNT7A and IRS1(Fig. 3‐5B).  

To define the requirement of STAT3 in IL‐13 induced proliferation in EPC to ALI cells we performed a 

BrdU assay. Consistent with previous studies IL‐13 stimulation of EPC2‐ALICTRL cells increased 

proliferation rate (Fig. 3‐5C, top panel). We did not observe the IL‐13 ‐induced increase in proliferation 

rate in EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures (Fig. 3‐5C, lower panel). In the meantime, the level of EPC2‐ALI cell 

proliferation at steady state was comparable between EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures, 

119  

suggesting STAT3 alteration doesn’t influence baseline proliferation rate (Fig. 3‐5D). Collectively, we 

conclude that STAT3 activated gene transcription is essential for the IL‐13 induced esophageal 

epithelium proliferation. 

 

3.5.6 IL‐13 induced STAT6‐dependent genes are involved in cytokine production but not IL‐13 

induced cell proliferation 

We and others have previously reported a role for IL‐13‐induced STAT6 activation in allergic 

inflammatory disorders206,352,353. To examine the IL‐13‐induced STAT6‐driven transcriptome in the 

esophageal epithelium, we generated EPC2‐ALIΔSTAT6 cultures using lentiviral particles containing STAT6 

shRNA. The efficiency of knockdown is verified by Western blot and RNAseq, showing a 70% knockdown 

rate compared to EPC2‐ALICTRL (Fig. 3‐6A & 6B). RNAseq analyses were also performed to compare EPC2‐

ALIΔSTAT6 with EPC2‐ALICTRL, resulting in 166 genes that are IL‐13‐induced and STAT6‐dependent. In 

contrast to the STAT3 bioinformatics analysis, GO analysis identified the top node for this group of genes 

is positive regulation of cytokine production (Fig. 3‐6C), including periostin (POSTN) (Fig. 3‐6D). As 

POSTN is previously showed to induced in IL‐13 JAK/STAT6 pathway in airway epithelium354, this 

supported our criteria for the IL‐13‐induced STAT6 pathway. In addition, we checked several 

inflammatory and cytokine‐related genes listed on EDP panels129, including CCL26 and TNFAIP6, and 

found them also being induced by IL‐13 and showed repressed expression when STAT6 is knocked down 

in EPC2‐ALI (Fig. 3‐6E).  

Similar as STAT3, we were also interested in examining the contribution of STAT6 to the proliferation. To 

understand if STAT6 contributes to IL‐13‐dependent proliferative response, we also performed 

proliferation assay in EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT6. Different from the STAT3 knockdown, knocking 

down STAT6 did not prevent IL‐13 from inducing increase proliferation (Fig. 3‐6F & 6G). However, 

120  

interestingly, STAT6KD EPC2‐ALI showed an overall decrease of proliferation rate in absence or presence 

of IL‐13. Based on these studies, we concluded that IL‐13 induced STAT6‐dependent transcriptome 

changes are important for cytokine and chemokine production in esophageal epithelium. 

   

121  

3.6 Discussion 

In this study, by analyzing the conserved binding motifs in both dysregulated genes in EoE transcriptome 

and altered genes induced by IL‐13 in vitro model of esophageal epithelium, we identified the 

involvement of STAT proteins in the regulation of EoE transcriptome and esophageal epithelial function. 

Specifically, we demonstrated the role of STAT3 in modifying genes related to barrier integrity and cell 

proliferation. Using genetic modification, we reveal that STAT3 negatively regulates barrier integrity 

gene expression such as LOR and FLG, and suppression of STAT3 expression showed altered epithelial 

barrier function. In addition, knocking down STAT3 protects against IL‐13 induced basal zone hyperplasia 

(BZH) in esophageal epithelial cells. In contrast, we showed that STAT6 regulates IL‐13 dependent 

cytokine and chemokine producing genes. Collectively, we showed the divergent function of IL‐13‐

induced STAT3 and STAT6 signaling pathways in influencing esophageal epithelium functions, suggesting 

new potential therapeutic targets for EoE. 

STAT3, a 92kDa transcription factor and a member of STAT family, is found important for regulating 

intercellular permeability. STAT3 activated retinal endothelial cells have been associated with increased 

endothelial permeability and decreased expression of junctional protein like Zonulin‐1 (ZO‐1) and 

Occludin (OCLN)341. In lung carcinoma cells, downregulation of STAT3 led to decreased junctional 

permeability, causing suppressed ability for intercellular communication355. Consistent with previous 

observations, we demonstrated that, under steady state, knocking down STAT3 in esophageal epithelial 

cells led to elevated expression of junctional proteins such as LOR, EMP1, and FLG. Previous studies 

suggested that expressional alteration of these proteins was related to dysregulation of barrier 

function356‐358. Specifically, FLG expression was decreased in the esophageal biopsies from patients with 

active EoE131. We showed that downregulation of STAT3 in esophageal epithelial cells leads to increased 

expression of FLG on both mRNA and protein level, as well as increased epithelial barrier function, 

suggesting an important role of STAT3 in regulating barrier integrity in esophageal epithelium. 

122  

Interestingly, a recent study in atopic dermatitis showed that IL‐33 could also activate STAT3 and lead to 

decrease expression of FLG359. IL‐33 is a cytokine that is found elevated in EoE patients101, mediating EoE 

pathogenesis in experimental mice model67,101. Together with our observations, we speculated that IL‐33 

could signal through STAT3 and mediate impaired barrier function in EoE. However, further experiments 

are needed for further validation. 

Aside from its involvement in regulating barrier function, STAT3 is widely studied in anti‐cancer 

therapies360,361. Increased expression and activation of STAT3 is observed in various cancers including 

colitis‐associated cancer362, neuroblastoma363and gastric carcinoma364. Upon IL‐6 activation, STAT3 is 

known to promote cancer inflammation and inflammation‐induced carcinogenesis in coordination with 

NF‐κB365. Clinical and experimental studies suggested that STAT3 targets a variety of genes, including 

Cyclin D1 (CCND1), Vascular endothelial growth factor (VEGF) and B‐cell lymphoma‐extra large (Bcl‐xL), 

which contribute to tumor proliferation, angiogenesis, and metastasis366. Specifically, in esophageal 

carcinoma cell line, down‐regulation of STAT3 induced increased Caspase‐3 and promote apoptosis367. 

Together, these studies suggested that activation of STAT3 pathways is tightly related to cell 

proliferation. In esophageal epithelial cells, we showed that IL‐13‐mediated decrease expression of 

genes like WNT7A and IRS1, which are previously showed to increase cell proliferation rate368,369. 

Knockdown STAT3 in esophageal epithelial cells prevents these genes from decreasing, which contribute 

to the abrogation of IL‐13 induced proliferation we observed in EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures. 

One other characteristic of esophageal remodeling in EoE is epithelial‐mesenchymal transition (EMT). 

EMT occurs more frequently in patients with EoE compared to NL and is correlated with subepithelial 

fibrosis in esophagus114. In esophageal epithelial cells, EMT could be induced by exposure to 

transforming growth factor – beta 1 (TGF‐β1), a profibrotic factor that is increased in EoE patients113. 

Interestingly, in lung cancer cells, the TGF‐β1 induced EMT is dependent on JAK/STAT3 pathway370. 

123  

Overall, these observations further support the role of STAT3 in regulating epithelium remodeling 

induced by various cytokines involved in EoE. 

Our work primarily demonstrated that STAT3’s involvement in esophageal epithelium remodeling and 

other previous studies had suggested its activating role in modulating allergic inflammatory pathways in 

hematopoietic cells. Autosomal‐dominant hyper‐IgE syndrome (AD‐HIES) is a disease caused by 

dominant negative STAT3 mutation. Patients with AD‐HIES are characterized by skin and lung infections 

and always showed increased IgE level371. A recent study comparing patients with AD‐HIES and patients 

with atopic dermatitis showed that AD‐HIES patients have a significant lower rate of food allergies and 

anaphylaxis372. This is proved to be related to decreased mast cell degranulation and basophil activation 

caused by STAT3 deficiency372. In malignant T cells that secreted a high level of IL‐5, knockdown of STAT3 

using siRNA led to decrease of IL‐5 production373, which could further decrease eosinophil infiltration in 

situ. In eosinophils, STAT3 could be activated by IL‐5 and induced increased Pim‐1 and Cyclin D3 

expression, which are important for eosinophil viability374. Interestingly, mast cells70, basophils65, and 

eosinophils are all important effector cells in EoE with an increased level of activation and infiltration. In 

light of this, further investigation of the involvement of STAT3 in hematopoietic cells would be beneficial 

in understanding the pathogenesis of EoE. 

Considering the role of STAT3 in modulating tissue remodeling and immunological pathways in EoE, it is 

a potential target for EoE therapy. Pharmacological inhibition of STAT3 has been widely studied given its 

involvement in cancer pathogenesis. A variety of natural and synthetic blockers has been established 

and tested in targeting STAT3 in cancer375. A potent STAT3 specific inhibitor, C188‐9376, is currently under 

clinical trial. Toxicity tests in murine models indicated that C188‐9 was well‐tolerated with good oral 

bioavailability377. Importantly, a recent study using C188‐9 in mice showed significant reduction of cell 

proliferation378. These extensive selections of STAT3 inhibitors, together with a proven effect on cell 

proliferation, will easier allow the exploration of targeting STAT3 in esophageal epithelium. 

124  

In addition, we also identified the role of STAT6 in IL‐13 mediated transcriptome changes in esophageal 

epithelium. JAK/STAT6 pathway is characterized as the canonical signaling pathway of IL‐13176. Previous 

studies in animal models showed that STAT6 is important for inflammatory responses, as OVA‐induced 

airway eosinophilia was abrogated in STAT6 KO mice, together with decreased peri‐bronchial 

inflammation379‐381. Mice experiment transferring STAT6+/+ antigen‐specific Th2 cells to STAT6‐/‐ mice 

failed to develop experimental allergic asthma, suggesting the importance of STAT6 in inducing 

inflammatory responses in resident cells382. Consistent with it, by analyzing IL‐13‐induced STAT6‐

dependent genes in EPC2‐ALI, we showed that, in the esophageal epithelium, STAT6 is regulating the 

expression of genes that are related to cytokine and chemokine production, such as CCL26, POSTN and 

TNFAIP6. Collectively, our observations indicated that STAT6 is the key regulator for the production of 

cytokines and chemokines in esophageal epithelium. 

In conclusion, we described the transcriptome and phenotypical change of mature EPC2 ALI cells 

following IL‐13 stimulation, showing correlation with some of the signatures of EoE. In particular, we 

identified that barrier disruption and epithelial remodeling are driven by divergent pathways starting 

with IL‐13 signaling and leading to the activation of STAT3 and STAT6, which control proliferation rate 

and inflammatory chemokines production, respectively (Fig.7). 

   

125  

3.7 Figures 

Figure 3‐1. STAT binding site is one of the most enriched TFBS in EoE dysregulated genes 

 

126  

 

   

127  

Figure 3‐1. STAT binding site is one of the most enriched TFBS in EoE dysregulated genes. A) 

Transcription factor binding site (TFBS) analysis of 1607 dysregulated genes from RNA sequencing. 

Number of genes enriched with specific TFBS (grey bar) and p‐value (blue dot) is presented. B) Heatmap 

depicting expression level of all family members of STAT proteins. C) Individual RPKM value of STAT1, D) 

STAT3 and E) STAT6 in esophageal biopsies (NL = 6; EoE = 10). (C‐E) Data are represented as the average 

± S.E.M. Individual symbols represent an individual patient ***p < 0.001 

   

128  

Figure 3‐2. STAT binding site is the most enriched in both dysregulated genes and transcriptionally 

active genes following 4hr incubation with IL‐13 in EPC2‐ALI 

 

   

129  

Figure 3‐2. STAT binding site is the most enriched in both dysregulated genes and transcriptionally 

active genes following 4hr incubation with IL‐13 in EPC2‐ALI. A) 712 genes are dysregulated in 4hr IL‐13 

(100ng/mL) treated in EPC2‐ALI culture. TFBS analysis of B) these 712 significantly altered genes by RNA 

sequencing and C) 858 genes highly enriched with H3K4me3 chromatin modification specific in 4hr IL‐13 

(100ng/mL) treated in EPC2‐ALI culture identified by Chromatin Immunoprecipitation sequencing. 

Number of genes enriched with specific TFBS (grey bar) and p‐value (blue dot) are presented in each 

graph. 

   

130  

Figure 3‐3. STAT3 is the most upregulated STAT protein in 4hr IL‐13 treated EPC2‐ALI. And STAT3 

binding site is the most enriched TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes. 

 

   

131  

Figure 3‐3. STAT3 is the most upregulated STAT protein in 4hr IL‐13 treated EPC2‐ALI. And the STAT3 

binding site is the most enriched TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes. A) Heatmap depicting 

expression level of all family members of STAT proteins in EPC2‐ALI cultures treated with vehicle (Veh) 

and IL‐13 (100ng/mL) for 4 h. B) TFBS analysis of 278 upregulated genes in EPC2‐ALI treated with IL‐13 

(100ng/mL) for 4 h from RNA sequencing. Number of genes enriched with specific TFBS (grey bar) and p‐

value (blue dot) are presented.  

   

132  

Figure 3‐4. STAT3 and STAT3‐related genes regulate barrier integrity of esophageal epithelium 

 

 

133  

 

 

134  

Figure 3‐4. STAT3 and STAT3‐related genes regulate barrier integrity of esophageal epithelium. A) 

Western Blot analysis and B) RNA sequencing analysis of EPC2‐ALI cultures transduced with empty 

control vector (EPC2‐ALICTRL) and vector with STAT3 shRNA (EPC2‐ALIΔSTAT3). C) Gene ontology (GO) 

enrichment analysis of 493 STAT3‐dependent genes from RNA sequencing. D) Heatmap depicting STAT3‐

dependent genes that are related to epidermal development. E) Filaggrin (FLG) expression level 

identified by RNA sequencing in esophageal biopsies (NL = 6; EoE = 10) and F) EPC2‐ALI. G) Expression 

level of filaggrin and pro‐filaggrin identified by western blot analysis in EPC2‐ALI. H) Trans‐epithelial 

electrical resistance (TEER) in EPC2‐ALI. (E, H) Data are represented as the average ± S.E.M. ***p < 

0.001, ****p < 0.0001. 

   

135  

Figure 3‐5. IL‐13 induced STAT3‐dependent genes are involved in IL‐13 induced cell proliferation 

 

136  

 

 

 

   

137  

Figure 3‐5. IL‐13 induced STAT3‐dependent genes are involved in IL‐13 induced cell proliferation. A) 

Gene ontology (GO) enrichment analysis of 129 IL‐13 induced STAT3 dependent genes identified by RNA 

sequencing analysis. B) Heatmap depicting 27 IL‐13‐induced STAT3‐dependent, cell proliferation 

regulation related genes in EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures treated with or without IL‐13 (100 

ng/mL) for 48 hours. C) EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT3 cultures treated with vehicle (Veh) or IL‐13 (100 

ng/mL) for 48 hours and stained for BrdU incorporation and DAPI (nuclei). D) Quantification of BrdU‐

positive cells in EPC2‐ALI cultures. Data are presented as mean ± SEM; n = 3 per treatment. **p < 0.01, 

n.s. not significant. Magnification X300. 

   

138  

Figure 3‐6. IL‐13 induced STAT6‐dependent genes are involved in cytokine production but not IL‐13 

induced cell proliferation 

 

 

139  

 

 

140  

 

   

141  

Figure 3‐6. IL‐13 induced STAT6‐dependent genes are involved in cytokine production but not IL‐13 

induced cell proliferation. A) Western Blot analysis and B) RNA sequencing analysis of EPC2‐ALI cultures 

transduced with empty control vector (EPC2‐ALICTRL) and vector with STAT6 shRNA (EPC2‐ALIΔSTAT6). C) 

Gene ontology (GO) enrichment analysis of 166 genes that are IL‐13‐induced STAT6‐dependent 

identified by RNA sequencing analysis. D) Heatmap depicting 27 IL‐13‐induced STAT6‐dependent, 

cytokine production related genes and E) 5 representative inflammatory and cytokine‐related genes in 

EPC2‐ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT6 cultures treated with or without IL‐13 (100 ng/mL) for 48 hours. F) EPC2‐

ALICTRL and EPC2‐ALIΔSTAT6 cultures treated with vehicle (Veh) or IL‐13 (100 ng/mL) for 48 hours and 

stained for BrdU incorporation and DAPI (nuclei). G) Quantification of BrdU‐positive cells in EPC2‐ALI 

cultures. Data are presented as mean ± SEM; n = 3 per treatment. **p < 0.01. Magnification X300 

   

142  

Figure 3‐7. Proposed mechanism of IL‐13 driven STAT3 and STAT6 dependent transcriptome alteration 

in esophageal epithelium 

 

   

143  

Figure 3‐7. Proposed mechanism of IL‐13 driven STAT3 and STAT6 dependent transcriptome alteration 

in esophageal epithelium 

IL‐13 signals through binding to IL4Rα/IL13Rα1 complex, which lead to the activation of Janus kinases. 

Phosphorylation of JAKs lead to the phosphorylation of STAT3 and STAT6, which form homodimers, 

translocated to the nuclear compartments, bind to protein‐specific DNA elements and activate 

downstream gene transcription. Activation of STAT3 leads to alteration of genes related to proliferation 

including WTN7A and IRS1, while STAT6 activation leads to dysregulation of genes regulating 

inflammatory chemokines production. 

   

144  

4 Chapter IV: General Discussion and Summary

The aim of this dissertation was 1) to define the molecular mechanism of IL‐13‐induced epithelium 

remodeling in esophageal epithelial cells; 2) to identify the underlying molecular processes that control 

these cellular functions; 3) to determine the significance of these molecular processes in the histological 

manifestations of EoE; and 3) to illustrate if specific targeting of these molecular pathways and functions 

could serve as therapeutic target for EoE treatment. Herein, our studies demonstrated that: 

1. A group of genes which are part of the transmembrane transporter function group protein 

expression and function is dysregulated in EoE. 

2. SLC9A3 (NHE3) is the most upregulated transmembrane transporter in esophageal biopsies from 

EoE patients and is primarily expressed in the basal and suprabasal layer of esophageal 

epithelium. 

3. NHE3 expression level positively correlated with severity of EoE including esophageal eosinophil 

numbers and histopathological features such as esophageal DIS. 

4. In both primary cells derived from EoE patients and in vitro stratified squamous esophageal 

epithelium model, EPC2‐ALI, IL‐13 stimulation induced an increase in NHE3 mRNA and protein 

expression and function. 

5. Increased expression and activity of NHE3 led to changes in intracellular pH and elevated acid‐

secretion capacity in esophageal epithelial cells. 

6. IL‐13 induced DIS was abrogated by pharmacological inhibition of NHE3 function. 

7. STAT binding motif is one of the most enriched TFBS within the dysregulated genes in the EoE 

biopsies, and IL‐13 stimulated mature stratified squamous esophageal epithelium.  

8. The STAT3 binding motif is the most enriched STAT TFBS in IL‐13‐induced upregulated genes in 

the esophageal epithelium. 

145  

9. STAT3 plays an important role in IL‐13‐mediated dysregulation of esophageal barrier function 

and esophageal epithelial proliferation. 

10. IL‐13 induced STAT6 dependent genes contribute to cytokine and chemokine production by 

esophageal epithelial cells. 

The significances of these collective findings are further discussed below. 

4.1 Alteration of transmembrane transporters expression in EoE 

Performing gene ontology analysis on genes that were identified to be dysregulated in EoE patients, we 

identified 5 individual GO clusters of genes that were functional related to transmembrane transporter 

activities (Chapter 2). Active transmembrane transporter activities are commonly described in gastric 

and intestinal epithelial cells, as they are critical for the physiological functions for the lower GI 

tract383,384. However, the importance of transmembrane transporters in the esophagus is not fully 

understood.  

Unlike other segments of the GI tract, the esophagus is not actively involved in fluid absorption and 

secretion, as the main function of the esophagus is to act as conduct for food to pass from the external 

environment to the stomach385. The esophageal epithelium possesses defensive mechanisms including 

luminal acid clearance that protects against toxic factors  from causing esophageal tissue injury118. 

Under physiological conditions, the esophageal epithelium of normal individuals is occasionally exposed 

to acidic contents from the stomach especially following meals228,229. The luminal acid is neutralized by 

HCO3‐ secretion or H+ uptake by esophageal submucosal glands and esophageal epithelial cells, which 

protects against acid injury231,232. When the esophageal epithelium is exposed to prolonged episodes of 

acid refluxate due to dysregulation of the lower esophageal sphincter (LES), the acid may exceed the 

acid clearance capacity of esophagus leading to esophageal acid injury and development of esophageal 

diseases including gastroesophageal reflux disease (GERD)386. In response to this acid overload, a group 

146  

of acid‐base transporters, including Na+/H+ exchanger isotype 1 (NHE1), Na+/HCO3‐ cotransporter (NBC) 

and sodium‐dependent chloride‐bicarbonate exchanger (e.g. SLC4A8), are induced to maintain a neutral 

pH in both intercellular spaces and cytosolic compartments227,237,268,387,388 (Fig. 4‐1).  

Unlike GERD, an altered esophageal luminal pH is rarely observed in EoE patients389, as most EoE 

patients have normal LES tone390. Also, EoE patients have much less acid reflux events compared to 

GERD patients391. Somewhat paradoxically, our RNAseq analysis comparing EoE and NL transcriptome 

identified that a large number of the transmembrane transporter genes that are dysregulated in EoE, 

that are tightly related to acid‐base transport circuit. For example, the SLC4 family which consists of a 

group of HCO3‐ transporters are involved in HCO3

‐ secretion to neutralize extracellular acid392. 

Furthermore, SLC26A4 is anion transporter that is known to facilitate chloride and bicarbonate transport 

and alter the acid‐base balance in kidney393,394. Given the lack of evidence to support altered esophageal 

lumen acidity in EoE, we speculated that dysregulation of the acid‐base transporters is associated with 

an esophageal epithelial response independent of luminal acidity. 

Esophageal epithelial dilated intercellular spaces, basal zone hyperplasia, subepithelial fibrosis, and 

angiogenesis, together with smooth muscle hypertrophy are some of the most representative 

histopathological features related to tissue remodeling in EoE patients113,395. Previous studies suggest 

that altered activities of ion transporters are tightly connected with tissue remodeling396. For example, 

cytoplasmic Cl‐ concentration regulated by calcium‐activated chloride channel TMEM16A is required for 

tissue architecture and junctional remodeling396, while alteration of sodium hydrogen exchanger 

influences tissue proliferation and apoptosis397. 

Previous study has reported that IL‐13 is able to induce EoE‐like transcriptome changes in primary 

esophageal epithelial cells54, and we also identified a similar group of ion transporters that are 

important for maintaining acid‐base homeostasis. Using this ex vivo model, we demonstrated that 

147  

intracellular pH is significantly increased in IL‐13‐treated primary esophageal cells derived from EoE 

patients. The alteration of intracellular pH has been shown to initiate a variety of signaling pathways and 

crucial for cell survival, function, and proliferation398. Since basal zone hyperplasia is an important 

histopathological feature in EoE399, one speculation is that the altered ion transporter gene network is 

related to the induction of  intracellular pH change and  increased esophageal epithelium proliferation . 

Previous research suggested that elevated intracellular pH mediated by sodium‐proton exchanger 

contributes to the initiation of DNA synthesis321, which is directly related to increased cell proliferation. 

Furthermore, Na+/H+ exchanger and Na+/HCO3‐ exchanger have been shown to be important in affecting 

alkalized pHi which is essential for cancer cell proliferation400. Alternatively, the alteration of acid‐base 

regulating ion transporters could be a consequence of the increased proliferation of esophageal 

epithelium. Cellular proliferation is energetically expensive, and in some fast proliferating cells, 

anaerobic glycolytic metabolic pathways are utilized to maintain cellular proliferation which often leads 

to the accumulation of lactate and H+ inside the cells401. While the accumulation of acid can cause 

cellular apoptosis402,403, intracellular pH regulation is essential for continuous proliferation. As a result, 

increased expression of proton pumps, HCO3‐ transporter family, Na+/H+ exchanger family and 

monocarboxylate transporter (MCT) family are all observed in response to altered pH in cancer 

cells404,405. Given our observations that most of these transporters are also altered in EoE transcriptome, 

it is difficult to determine if these alterations are causative or consequential of basal zone hyperplasia. 

To address this question, genetic overexpression or deletion of specific ion transporters and 

examination of the cell proliferation rate could be examined. In addition, assessment of the cell cycle to 

determine whether cells become trapped prior to proliferation or apoptosis could be performed. 

Together, our findings suggested pHi mediated by these altered acid‐base transporters could play a role 

in modulating esophageal epithelium remodeling in EoE. 

148  

Interestingly, within all the dysregulated transmembrane transporters in EoE patients, we identified 

several genes in the SLC16 family that encodes proteins responsible for transporting monocarboxylic 

acid. MCTs transport lactate and pyruvates across cellular membrane thus are important for energy 

metabolism406. At steady state, they are highly expressed in the epithelial cells both in the small and 

large intestine407, but not previously reported in the esophagus. Interestingly, SLC16A1 and SLC16A3 are 

observed increased in patients with Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma (EAC) and are 

thought to contribute to tumor metabolism408. Studies in other cancer cells demonstrated that the 

suppression of SLC16A1 and SLC16A3 led to decreased cell proliferation due to the accumulation of 

lactate inside cells which induces cell apoptosis409,410. Considering with some of EoE features especially 

esophageal epithelial hyperplasia, we speculated that increased proliferation in esophageal epithelium 

leads to elevated expression of these lactate transporters, which efflux lactate as a consequence of 

glycolysis to maintain pHi and cellular proliferation411. However, future studies are still needed to 

understand the contribution of MCTs in EoE pathogenesis. 

Given the importance of pH in regulating cell physiology, one of the limitations of our research is we did 

not measure the intercellular pH alteration in the esophageal epithelium in EoE. In GERD studies, the 

diffusion of acid from the lumen to intercellular spaces is considered as one of the mechanisms of the 

disruption of epithelial barrier and formation of dilated intercellular spaces412. Also, a previous study 

indicated that increased paracellular permeability, leading to decreased pH promotes to increased tight 

junction permeability413. Intraluminal impedance measurement in EoE patients showed a much lower 

impedance compared to both NL and GERD patients, suggesting an increased permeability in the 

esophageal epithlium412. We demonstrated that IL‐13 stimulation of esophageal epithelium resulted in 

elevated intracellular pH and led to increased acid secretion. This supports the hypothesis that IL‐13 

altered acid‐base transporters in esophagus could counteract the intracellular acid accumulation and 

increased pHi, as a consequence led to extracellular pH changes. However, further studies are needed to 

149  

confirm the intercellular pH changes between esophageal epithelial cells before we could speculate the 

contribution of altered pH in changing barrier permeability. 

4.2 SLC9A3/NHE3 dysregulation in esophageal epithelium 

Within all the dysregulated transmembrane transporters, we identified sodium hydrogen exchanger 3 

(NHE3), encoded by SLC9A3 gene, as the most upregulated transporter in the esophageal biopsies 

derived from EoE patients. NHE3 is widely studied in the intestinal epithelium and proximal renal tubule 

due to its function in regulating ion homeostasis414. When coupled with Cl‐/HCO3‐ exchangers, NHE3 can 

effectively regulate NaCl absorption which drives the water movement across the epithelium415. 

However, NHE3 expression and function have never been established in esophageal epithelium. Our 

study, for the first time, identified the expression pattern of NHE3 in the esophagus. 

Using immunofluorescent staining, we identified that NHE3 is located primarily in the basal layer of 

esophageal epithelium in normal individuals, however expression expanded to the suprabasal layers in 

EoE patients. This expressional expansion of NHE3 is mirroring the thickened basal layer in esophageal 

epithelium of EoE patients19. Also, we observed that the other histopathological change, dilated 

intercellular spaces (DIS), is also primarily localized in the suprabasal layer of esophageal epithelium. In 

light of these observations, we speculated that NHE3 is related to DIS formation and basal zone 

hyperplasia in EoE.  

Correlation analysis first supported that NHE3 expression positively correlated with the severity of DIS 

spaces in EoE. To understand if elevated NHE3 expression directly contributes to the DIS formation, 

primary esophageal epithelial cells derived from EoE patients and EPC2‐ALI were treated with IL‐13. 

Surprisingly, we observed an increase of NHE3 expression in both models upon IL‐13 treatment. 

Previous studies showed that NHE3 expression are usually altered by Th1 cytokines including interferon‐

gamma (IFN‐γ) and tumor necrosis factor‐alpha (TNF‐α)305. This new finding of the ability of IL‐13 

150  

inducing NHE3 expression might explain the differential expression pattern of NHE3 between ulcerative 

colitis (UC) and Crohn’s disease (CD), two subtypes of inflammatory bowel diseases (IBD). Previous 

studies have reported that NHE3 activity decreased in UC and CD. However, the NHE3 mRNA level was 

only decreased in CD patients but not UC patients267,416,417. Interestingly, previous cytokine profiling 

indicated that IL‐13 is only increased in biopsy samples from UC patients but not CD patients418, 

potentially due to the Th2 predominance in the pathogenesis of UC419. In combination with our findings, 

the elevated IL‐13 level, which counterbalances the IFN‐γ effect in decreasing NHE3 expression, might 

explain the consistent NHE3 level in UC patients. Together, our observation showed an alternative 

pathway for NHE3 induction, which might be important to understand NHE3‐related disordered 

associated with Type‐2 inflammation. 

As indicated in IBD patients, the alteration of NHE3 expression doesn’t seem necessarily correlate with 

dysregulation of NHE3 activity267. The NHE3 function can be post‐translationally modified through 

translocation between cytoplasmic compartments and plasma membrane as recycling endosome 

compartment, thus regulating activity in the absence of protein or mRNA regulation420. NHE3 only 

achieves its function of Na+ uptake and H+ secretion when binds to the plasma membrane. Previous 

study showed that Ezrin, a cytoskeletal linker protein, is essential for NHE3 translocation and 

activation421. Inhibition of Ezrin phosphorylation directly decreases NHE3 activity422. Also, NHE3 activity 

could be directly regulated by direct kinase phosphorylation423. As a result, simple observation of 

increased NHE3 expression could not conclude the functional involvement of NHE3 in EoE. 

However, we also observed that NHE3 activity is increased upon IL‐13 treatment in esophageal epithelial 

cells. As NHE3 is responsible for Na+ absorption, dysregulation of NHE3 activity led to the disruption of 

Na+ homeostasis417,424. Previous studies examining ion transport of the esophagus have revealed that 

Na+ transport accounts for the majority of potential differences in esophageal epithelium predominantly 

151  

through epithelial sodium channel (ENaC)425. Dysregulation of Na+ concentration leads to changes in 

osmotic forces and altered fluid movement 426. Moreover, an increase of intracellular Na+ concentration, 

which facilitates Cl‐ influx will cause increased water movement from outside of the cell, which lead to 

fluid absorption 427. A consequence of fluid absorption and this hypertonicity causes increased cell 

volume. Fluid movement and increased cell volume, possible together with the disruption of junctional 

protein, will lead to the change of epithelium structure, for example, the formation of DIS. Currently, the 

mechanism of DIS formation is unclear. The previous study exposing esophageal epithelium in 

hypertonic NaCl solution on rabbit esophagus led to increased DIS area, suggesting that altered Na+ 

concentration in esophagus contributes to the DIS formation428,429. Aside from its role in regulating 

water r movement, sodium concentration is also related to uptake of other ions and substance430,431. 

Together, we speculated that increase NHE3 activity led to increased intracellular Na+ concentration, 

which directly contributes to the increased presence of DIS in EoE patients. Indeed, we showed that IL‐

13 induction of DIS formation was NHE3‐dependent in EPC2‐ALI cells. To further validate this theory, 

intracellular Na+ concentration should be measured in esophageal biopsies in NL and EoE patients. Also, 

we showed that increased NHE3 activity is related to alteration of pH changes and acid‐secretion in 

esophageal epithelium. In previous studies in GERD, esophageal acid perfusion is considered as one of 

the drivers for DIS432. However, instead of being acidic, the pH in the esophageal lumen of EoE patients 

tends to be slightly alkalined433. We speculated, together with increase NHE3 activity and its localization 

in the basal and suprabasal layer of esophageal epithelium in EoE, consistent with the observation of 

increased intracellular pH, there’s acidification in the intercellular spaces in the esophageal epithelium in 

EoE. The decrease of intercellular pH can then contribute to the disruption of tight junction protein and 

also initiate water movement caused by the change of osmotic gradient388. Together, the mechanism of 

NHE3 in inducing DIS formation could be a combination of increased extracellular water accumulation 

and acidification in intercellular spaces (Fig. 4‐3). 

152  

DIS is observed in the esophageal epithelium in both pediatric and adult EoE patients292, is associated 

intraepithelial antigen exposure434. Successful treatment of EoE using corticosteroids showed a 

reduction of DIS292, indicating DIS as a therapeutic marker. Our study showed that pharmacological 

inhibition of NHE3 protected esophageal epithelium from IL‐13 induced DIS, suggesting NHE3 could 

serve as a therapeutic target in EoE.  

Basal cell hyperplasia was observed in EoE patients along the esophagus, characterized by more than 

25% thickness of epithelial compared to NL19,435. Previous studies employing murine model of EoE 

revealed that IL‐13 induces esophageal epithelium hyperplasia206,207. We showed that inhibition of NHE3 

activity prevents the IL‐13 induced proliferation in EPC2‐ALI. We speculated that IL‐13‐induced increased 

NHE3 activity could either act as a protective mechanism to neutralize proliferation generated 

intracellular acid, or an initiator to generate an alkalinized intracellular environment to promote 

proliferation. Previous studies on esophageal NHE1 suggest that NHE1 can contribute to the 

hyperproliferation of esophageal tissue in both Barrett’s disorders and esophageal adenocarcinoma 

through the regulation of intracellular pH239,436. Also, intracellular pH is essential for cell proliferation 

and apoptosis437,438. As NHE3 can regulate intracellular pH, and we did show an elevated intracellular pH 

in IL‐13 treated esophageal epithelial cells with overexpressed NHE3, one hypothesis could be NHE3 is 

required for IL‐13 mediated proliferation in esophageal epithelium. Alternatively, the increased 

expression of NHE3 could be merely a consequence of increased proliferation. Fast proliferating cells 

like cancer cells have a preference towards lactic acid‐generating energy consuming pathways401. The 

conversion of lactic acid will lead to accumulation of proton inside cells, which decreased the glycolytic 

rate439 and induce cell apoptosis403. As a result, proton regulators that exporting intracellular H+ to 

prevent intracellular acidosis play a protective role in cells, and inhibition of these proton regulators 

could prevent increased cell proliferation440. Together, we conclude that IL‐13 upregulation of NHE3 is 

part of the cellular proliferative response, which is related to esophageal epithelium hyperplasia. 

153  

However, further investigations are needed to elucidate whether this observation is causative or 

consequential of increased proliferation rate. 

Interestingly, previous works indicated that NHE3‐deficient mice showed alteration of inflammatory‐

related pathways. Increased IFN‐γ was observed in small intestine441, while elevated expression of TNF‐

alpha and IL‐18 were shown in distal colon442. Also, inflammatory cells including NK cells and CD8+ T cells 

were elevated in NHE3KO mice443. It is still unclear how did the alteration of NHE3 expression contribute 

to changes of the inflammatory response. Previous study suggested that disruption of barrier integrity 

could result in the onset of inflammatory in gut444. It is possible that NHE3 alteration led to barrier 

disruption, which causes inflammatory responses. However, it would be still interesting to see if the 

increase of NHE3 would also cause any inflammatory changes and if it would have related to EoE 

pathogenesis. 

4.3 STAT involvement in EoE transcriptome 

Several cytokines have been shown to be involved in EoE pathogenesis, as increased level of cytokines 

including IL‐5, IL‐13, IL‐33, TNF‐α, IFN‐γ, and TSLP were observed in EoE patients48,332,445. After binding to 

their receptors on effector cells, these cytokines contribute to the progression of EoE through 

influencing downstream gene transcription including CCL26, CAPN14 and SLC9A3 (Chapter 2), which 

contribute to different aspects of EoE pathophysiology28,209. However, the molecular pathways involved 

in the regulation of the proinflammatory cytokines signaling remains unclear. 

Janus kinase (JAK)‐ signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway is a well‐

characterized pathway that plays a crucial role in a wide range of cytokines signaling, especially in 

interferons and interleukins446. After phosphorylated by JAKs, STAT monomers dimerize, translocate to 

nucleus and bind to conserved binding motif to activate gene transcriptions447. EoE related cytokines, 

154  

especially IL‐5, IL‐13 and IFN‐γ, all signaling through JAK/STAT pathway. (Fig. 4‐2) As a result, we were 

interested in the contribution of JAK/STAT pathway to the dysregulation of in EoE pathogenesis. 

Since conserved sequences of STAT binding motifs has been identified448, we employed transcription 

factor binding site analysis among the dysregulated genes in EoE patients. Similar to what we expected, 

we identified STAT binding motif as one of the most significantly enriched binding motifs (Chapter 3). 

STAT pathways are involved in multiple inflammatory responses, contributing to immune cell 

proliferation and differentiation, also related to the development of autoimmune and allergic 

disorders449. Mice models and cell lines with genetic modification on STAT expression suggest that 

alteration of STAT proteins leads to dysregulated cytokine functions and immune responses. For 

example, STAT1KO mice showed severe bacterial infection in multiple organs while WT mice remain 

healthy450. On the other hand, constitutively active STAT6 promoted T cell hyperproliferation451. With 

the increased enrichment of STAT regulating genes in EoE patients, we speculated an increased 

expression of STAT at least in mRNA level. 

Further examination of RNAseq data supported our hypothesis, that increased level of STAT1 STAT3 and 

STAT6 were observed in EoE patients compared to NL. Interestingly, all these three STAT proteins have 

previously been showed to relate to allergic disorders452‐454. STAT1KO mice showed decreased nasal 

eosinophilia compared to WT mice when sensitized with aeroallergen, and they were protected against 

experimental induction of allergic rhinitis452. Also, both STAT3KO and STAT6KO mice showed decreased 

airway eosinophilia and suppressed Th2 responses compared to WT mice upon antigen challenges453,455. 

As IL‐13 has been previously identified as one the major driver for EoE phenotypes and transcriptome 

changes54, we’re more interested in the contribution of STAT3 and STAT6 in EoE pathogenesis due to 

their involvement in IL‐13 signaling pathways185,456. However, since IFN‐γ is also elevated in EoE332, 

future studies on IFN/STAT1 pathway should be conducted to understand the etiology of EoE. 

155  

Aside from STAT proteins, the binding motifs of other transcription factors are found significantly 

enriched in our analysis in dysregulated genes in EoE patients. Some of these transcription factors were 

previously characterized and closely related to Th2 allergic disorders. For example, NF‐κB binding motif 

is the second most significantly enriched TFBS, and its activation has been widely established in various 

inflammatory disorders457. A recent study showed that the deletion of NF‐κB ‐inducing kinase (NIK), an 

essential molecular for the non‐canonical NF‐κB pathway, drives spontaneous EoE in the experimental 

murine model, suggesting an important role of NF‐κB in the pathogenesis of EoE108. Interestingly, NF‐κB 

has previously shown to coordinate with STAT proteins to regulate cancer immunology458. In this sense, 

aside from STAT proteins, it would be beneficial to explore the molecular mechanism of other enriched 

transcription factors we observed in the pathogenesis of EoE. 

4.4 STAT3 regulates tissue remodeling in esophageal epithelium 

To better understand how STAT proteins regulated EoE‐related gene dysfunction and histopathological 

changes, we employed IL‐13 induced EPC2‐ALI model, which is previously established to mimic EoE 

dysregulation in transcriptome level. By applying TFBS analysis of genes that are transcriptionally active 

or altered by IL‐13, we identified STAT as an important regulator in IL‐13‐induced genes. Previous GO 

analysis identified these genes were important for epithelium development and inflammatory responses 

(Chapter 2). As a result, we speculated that STAT signaling pathways are involved in these processes.  

Closer examination of IL‐13 regulated subsets of genes, we identified the STAT3 binding site as the most 

enriched TFBS in IL‐13 induced upregulated genes. Studies using tissue‐specific STAT3 knockout mice 

suggested that STAT3 is important in mediating various biological process including cell survival, 

apoptosis, and motility459. Specifically, previous studies indicated that STAT3 is involved in various 

allergic pathways. For example, patients with the autosomal‐dominant hyper‐IgE syndrome (AD‐HIES) 

with the dominant negative STAT3 mutation have a significant lower rate of food allergies and 

156  

anaphylaxis371,372. This is consistent with the essential role of STAT3 in mediating mast cell 

degranulation460,461. STAT3 has also been shown to activate Th2 cell development and is required for Th2 

cytokines expression462. Thus mice with STAT3 deficiency in T cells fail to develop allergic inflammation 

in OVA‐induced mice model462. Moreover, Conditional knockout of STAT3 in mice airway epithelium led 

to decrease of house dust mite‐induced airway eosinophilia, suggesting the role of STAT3 in mediating 

eosinophils recruitment453. However, the role of STAT3 has never been identified in EoE. Comparing the 

transcriptome differences between STAT3 knockdown and non‐transduced EPC2‐ALI cultures, we 

identified a group of genes that are functionally related to the epidermis and skin development being 

STAT3‐dependent. Previous studies have revealed that activation of STAT3 in endothelial cells leads to 

downregulation of tight junction proteins such as zonulin‐1 (ZO‐1) and occludin together with elevated 

paracellular leakage341. Also, STAT3 mediates epidermal growth factor (EGF)‐induced downregulation of 

claudin‐2 and claudin‐4, which emphasized the importance of STAT3 in modulating junctional 

proteins463.  

One of the clinical features of EoE is the impaired barrier function of esophageal epithelium indicated by 

decreased impedance412. Earlier studies have established the role of IL‐13 in decreasing epithelium 

barrier functions through regulating junctional proteins like DSG‐1 and FLG133,464. The DSG‐1 expression 

is previously established regulated in a STAT6‐dependent manner465, while FLG could be induced by IL‐

33 in a STAT3‐dependent manner359. As a result, we speculated that STAT3 might influence esophageal 

barrier function by affecting filaggrin expression. Consistent with our hypothesis, the FLG expression is 

increased upon STAT3 knocking down. In addition, STAT3KD EPC2‐ALI cultures also showed higher trans‐

epithelial electrical resistance compared to WT group. Overall, we established that STAT3 inhibition 

could increase filaggrin expression contribute to epithelial barrier integrity. However, given our study is 

limited due to the presence of residual STAT3 caused by the incomplete knockdown, we could not 

conclude the necessity of STAT3 in epithelial function. Also, STAT3 must alter the epithelial resistance by 

157  

changing proteins other than filaggrin. Thus future studies should check on other STAT3‐dependent 

junctional proteins. 

In addition, by examine IL‐13 induced STAT3‐dependent genes in EPC2‐ALI model, we speculated that 

STAT3 might contribute to IL‐13‐mediated basal cell proliferation in esophageal epithelium. A previous 

study in limbal epithelial cells indicated that STAT3 is crucial for keratinocyte proliferation466. Studies on 

human and mouse epithelial cells further supported the role of IL‐13 in epithelial differentiation and 

proliferation342,467. In EPC2‐ALI, we showed that IL‐13/STAT3 pathway regulates oncogenes like IRS1 and 

WNT7A, which are widely known to promote DNA replication and cell proliferation368,369. Our results in 

IL‐13 treated STAT3KD EPC2‐ALI models further supported the role of STAT3 in regulating cell 

proliferation. We showed that deletion of STAT3 in EPC2‐ALI prevented IL‐13‐induced proliferation, 

suggesting a potential role of STAT3 in basal cell hyperplasia in EoE. 

Furthermore, a recent investigation identified the presence epithelial‐mesenchymal transition (EMT) of 

in pediatric EoE patients114, and they also suggested the contribution of EMT to tissue remodeling in 

EoE. Further work indicated the development of EMT in EoE is mediated by the CXCR4/SDF‐1 axis in 

experimental murine model468. Previous studies have demonstrated the role of STAT3 in promoting EMT 

in different cancer cells469. Interestingly, the CXCR4/SDF‐1 pathway is tightly related to STAT3 

activation470‐472. We speculated that IL‐13 induced STAT3 is contributing to EMT in EoE. However, future 

experiments and analysis are required to prove this hypothesis. 

4.5 STAT6 regulates cytokine production in esophageal epithelium 

JAK/STAT6 pathway has long been characterized as the canonical IL‐13 signaling pathway176. Studies 

showed that knocking down STAT6 resulted in significant impairment of IL‐13 effect on cells including 

macrophage182 and epithelial cells473. Previous animal studies showed the alteration of inflammatory 

responses in mice with STAT6 deficiency. OVA‐induced airway eosinophilia was abrogated in STAT6 KO 

158  

mice, together with decreased peri‐bronchial inflammation379‐381. In addition, STAT6 is also essential in 

Th2 cell differentiation474. Deficiency of STAT6 that fails to induce Th2 cell differentiation led to the 

development of severe experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice475. Together, these 

suggested a critical role of STAT6 in modulating inflammatory responses. In both EoE patients and IL‐13 

induced EPC2‐ALI, we observed increased expression of STAT6 (Chapter 3). We speculated that this 

increase of STAT6 contributes to changes in inflammatory genes.  

Previous studies have suggested that esophageal epithelium secretion of CCL26, a chemokine induced 

by IL‐13 that is important for eosinophil activation and recruitment in EoE28, is dependent on STAT6476. 

By analyzing IL‐13‐induced STAT6‐dependent genes in EPC2‐ALI, we showed that, in the esophageal 

epithelium, STAT6 is regulating CCL26 expression, as well as genes including POSTN and TNFAIP6 that 

contribute to the regulation of cytokine production. Mice experiment transferring STAT6+/+ antigen‐

specific Th2 cells to STAT6‐/‐ mice failed to develop experimental allergic asthma, suggesting the 

importance of STAT6 in inducing inflammatory responses in resident cells382. Consistent with it, we also 

showed that the impairment of STAT6 leads to decreased expression of several IL‐13‐induced cytokine 

and chemokine in esophageal epithelium.  

Moreover, previous works demonstrated the primary effector cells of STAT6 functions on inflammatory 

responses are hematopoietic cells such as B cell, Th2 cells, and mast cells477. Limited by our current 

model, we’re not able to fully demonstrate the importance of IL‐13/STAT6 pathway in inflammatory 

responses in EoE. Future works are required in a model containing hematopoietic cells to prove our 

hypothesis.  

4.6 Summary 

In this dissertation, we identified the importance of both transmembrane transporter SLC9A3 and 

transcription factor STAT3 in the pathogenesis of EoE. Comprehensive analysis of SLC9A3 in three 

159  

different models relevant to EoE suggests that increased SLC9A3 expression and activity induced by IL‐

13 is important for the formation of dilated intercellular spaces in EoE patients. While the SLC9A3 

expression in the esophageal epithelium is dependent on STAT6, IL‐13 induced STAT3 activation is also 

important for tissue remodeling in EoE, as STAT3 deletion esophageal epithelium showed increased 

barrier function and is protected against IL‐13 induced esophageal hyperplasia. Together, the studies in 

this dissertation provide rationales to targeting SLC9A3 and IL‐13/STAT3 pathways for the treatment of 

EoE, especially in the effort to address esophageal epithelium remodeling. 

   

160  

4.7 Figures 

Figure 4‐1. Acid protection mechanism in esophagus 

 

   

161  

Figure 4‐1. Acid protection mechanism in esophagus.  

In esophageal epithelium, when exposed to excessive acidic contents, ion transporters related to H+ and 

HCO3‐ transportation are activated. Some of the major transporters are Na+/H+ exchangers, Na+/HCO3‐ 

cotransporters, Cl‐/ HCO3‐ exchangers and sodium‐dependent chloride‐bicarbonate exchangers. 

   

162  

Figure 4‐2. JAK/STAT signaling pathway 

 

   

163  

Figure 4‐2. JAK/STAT signaling pathway.  

After binding to their receptors on the transmembrane domain, cytokines such as IL‐13, IL‐5, and IFN‐γ 

led to the phosphorylation of Janus kinases (JAKs). Phosphorylated JAKs then phosphorylate STAT 

proteins, which then dimerized and translocated to the promoter area of their downstream genes. The 

binding of STAT dimers will then activate or suppress gene transcription.  

   

164  

Figure 4‐3. Proposed Mechanism of IL‐13 induced NHE3‐dependent DIS formation in EoE 

 

 

   

165  

Figure 4‐3. Proposed Mechanism of IL‐13 induced NHE3‐dependent DIS formation in EoE 

(Left) In normal stratified squamous epithelium cells, transmembrane transporters are not dysregulated 

intracellular pH remains normal. (Right) Elevated IL‐13 secretion in EoE patients drives increased NHE3 

transcription. This increased expression and activity of NHE3 on the plasma membrane, together with 

other acid‐base regulating transporters, contribute to the altered concentration of H+ and Cl‐ both 

intracellularly and intercellularly, which led to the changed equilibrium of osmotic balance. Alteration in 

osmotic force drove water influx into intercellular spaces and formed DIS in the esophageal epithelium 

in EoE. 

   

166  

5 References

 

1.  Dellon ES, Hirano I. Epidemiology and Natural History of Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 2018;154(2):319‐332 e313. 

2.  Bystrom J, O'Shea NR. Eosinophilic oesophagitis: clinical presentation and pathogenesis. Postgrad Med J. 2014;90(1063):282‐289. 

3.  Jensen ET, Kappelman MD, Martin CF, Dellon ES. Health‐care utilization, costs, and the burden of disease related to eosinophilic esophagitis in the United States. Am J Gastroenterol. 2015;110(5):626‐632. 

4.  Philpott H, Kweh B, Thien F. Eosinophilic esophagitis: current understanding and evolving concepts. Asia Pac Allergy. 2017;7(1):3‐9. 

5.  Plaza‐Martin AM, Jimenez‐Feijoo R, Andaluz C, et al. Polysensitization to aeroallergens and food in eosinophilic esophagitis in a pediatric population. Allergol Immunopathol (Madr). 2007;35(1):35‐37. 

6.  Olson AA, Evans MD, Johansson MW, et al. Role of food and aeroallergen sensitization in eosinophilic esophagitis in adults. Ann Allergy Asthma Immunol. 2016;117(4):387‐393 e382. 

7.  Orenstein SR, Shalaby TM, Di Lorenzo C, et al. The spectrum of pediatric eosinophilic esophagitis beyond infancy: a clinical series of 30 children. Am J Gastroenterol. 2000;95(6):1422‐1430. 

8.  Warners MJ, Terreehorst I, van den Wijngaard RM, et al. Abnormal Responses to Local Esophageal Food Allergen Injections in Adult Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 2018;154(1):57‐60 e52. 

9.  Reed CC, Fan C, Koutlas NT, Shaheen NJ, Dellon ES. Food elimination diets are effective for long‐term treatment of adults with eosinophilic oesophagitis. Aliment Pharmacol Ther. 2017;46(9):836‐844. 

10.  Spergel JM, Beausoleil JL, Mascarenhas M, Liacouras CA. The use of skin prick tests and patch tests to identify causative foods in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2002;109(2):363‐368. 

11.  Liacouras CA, Spergel JM, Ruchelli E, et al. Eosinophilic esophagitis: a 10‐year experience in 381 children. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005;3(12):1198‐1206. 

12.  Kagalwalla AF, Sentongo TA, Ritz S, et al. Effect of six‐food elimination diet on clinical and histologic outcomes in eosinophilic esophagitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006;4(9):1097‐1102. 

13.  Gonsalves N, Yang GY, Doerfler B, Ritz S, Ditto AM, Hirano I. Elimination diet effectively treats eosinophilic esophagitis in adults; food reintroduction identifies causative factors. Gastroenterology. 2012;142(7):1451‐1459 e1451; quiz e1414‐1455. 

14.  Simon D, Marti H, Heer P, Simon HU, Braathen LR, Straumann A. Eosinophilic esophagitis is frequently associated with IgE‐mediated allergic airway diseases. J Allergy Clin Immunol. 2005;115(5):1090‐1092. 

15.  Fogg MI, Ruchelli E, Spergel JM. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2003;112(4):796‐797. 

16.  Wolf WA, Jerath MR, Dellon ES. De‐novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 2013;22(2):205‐208. 

17.  Mishra A, Hogan SP, Brandt EB, Rothenberg ME. An etiological role for aeroallergens and eosinophils in experimental esophagitis. J Clin Invest. 2001;107(1):83‐90. 

167  

18.  Akei HS, Mishra A, Blanchard C, Rothenberg ME. Epicutaneous antigen exposure primes for experimental eosinophilic esophagitis in mice. Gastroenterology. 2005;129(3):985‐994. 

19.  Collins MH. Histopathology of eosinophilic esophagitis. Dig Dis. 2014;32(1‐2):68‐73. 20.  Spergel JM, Book WM, Mays E, et al. Variation in prevalence, diagnostic criteria, and initial 

management options for eosinophilic gastrointestinal diseases in the United States. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;52(3):300‐306. 

21.  Franciosi JP, Tam V, Liacouras CA, Spergel JM. A case‐control study of sociodemographic and geographic characteristics of 335 children with eosinophilic esophagitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7(4):415‐419. 

22.  Spergel JM, Brown‐Whitehorn TF, Beausoleil JL, et al. 14 years of eosinophilic esophagitis: clinical features and prognosis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2009;48(1):30‐36. 

23.  Straumann A, Blanchard C, Radonjic‐Hoesli S, et al. A new eosinophilic esophagitis (EoE)‐like disease without tissue eosinophilia found in EoE families. Allergy. 2016;71(6):889‐900. 

24.  Alexander ES, Martin LJ, Collins MH, et al. Twin and family studies reveal strong environmental and weaker genetic cues explaining heritability of eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2014;134(5):1084‐1092 e1081. 

25.  Sleiman PM, Wang ML, Cianferoni A, et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 2014;5:5593. 

26.  Rothenberg ME, Spergel JM, Sherrill JD, et al. Common variants at 5q22 associate with pediatric eosinophilic esophagitis. Nat Genet. 2010;42(4):289‐291. 

27.  Sherrill JD, Gao PS, Stucke EM, et al. Variants of thymic stromal lymphopoietin and its receptor associate with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2010;126(1):160‐165 e163. 

28.  Blanchard C, Wang N, Stringer KF, et al. Eotaxin‐3 and a uniquely conserved gene‐expression profile in eosinophilic esophagitis. J Clin Invest. 2006;116(2):536‐547. 

29.  Aceves SS, Newbury RO, Chen D, et al. Resolution of remodeling in eosinophilic esophagitis correlates with epithelial response to topical corticosteroids. Allergy. 2010;65(1):109‐116. 

30.  Blanchard C, Stucke EM, Burwinkel K, et al. Coordinate interaction between IL‐13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2010;184(7):4033‐4041. 

31.  Kottyan LC, Davis BP, Sherrill JD, et al. Genome‐wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 2014;46(8):895‐900. 

32.  Namjou B, Marsolo K, Caroll RJ, et al. Phenome‐wide association study (PheWAS) in EMR‐linked pediatric cohorts, genetically links PLCL1 to speech language development and IL5‐IL13 to Eosinophilic Esophagitis. Front Genet. 2014;5:401. 

33.  Hill DA, Spergel JM. The Immunologic Mechanisms of Eosinophilic Esophagitis. Curr Allergy Asthma Rep. 2016;16(2):9. 

34.  Dellon ES, Gonsalves N, Hirano I, et al. ACG clinical guideline: Evidenced based approach to the diagnosis and management of esophageal eosinophilia and eosinophilic esophagitis (EoE). Am J Gastroenterol. 2013;108(5):679‐692; quiz 693. 

35.  Simon D, Cianferoni A, Spergel JM, et al. Eosinophilic esophagitis is characterized by a non‐IgE‐mediated food hypersensitivity. Allergy. 2016;71(5):611‐620. 

36.  Mishra A, Schlotman J, Wang M, Rothenberg ME. Critical role for adaptive T cell immunity in experimental eosinophilic esophagitis in mice. J Leukoc Biol. 2007;81(4):916‐924. 

37.  Noti M, Wojno ED, Kim BS, et al. Thymic stromal lymphopoietin‐elicited basophil responses promote eosinophilic esophagitis. Nat Med. 2013;19(8):1005‐1013. 

38.  Clayton F, Fang JC, Gleich GJ, et al. Eosinophilic esophagitis in adults is associated with IgG4 and not mediated by IgE. Gastroenterology. 2014;147(3):602‐609. 

168  

39.  Mohammad N, Avinashi V, Chan E, Vallance BA, Portales‐Casamar E, Bush JW. Pediatric Eosinophilic Esophagitis Is Associated With Increased Lamina Propria Immunoglobulin G4‐Positive Plasma Cells. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2018. 

40.  Wright BL, Kulis M, Guo R, et al. Food‐specific IgG4 is associated with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2016;138(4):1190‐1192 e1193. 

41.  Hogan SP, Rothenberg ME. Eosinophil Function in Eosinophil‐associated Gastrointestinal Disorders. Curr Allergy Asthma Rep. 2006;6(1):65‐71. 

42.  Saffari H, Hoffman LH, Peterson KA, et al. Electron microscopy elucidates eosinophil degranulation patterns in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2014;133(6):1728‐1734 e1721. 

43.  Abonia JP, Rothenberg ME. Eosinophilic esophagitis: rapidly advancing insights. Annu Rev Med. 2012;63:421‐434. 

44.  Kephart GM, Alexander JA, Arora AS, et al. Marked deposition of eosinophil‐derived neurotoxin in adult patients with eosinophilic esophagitis. Am J Gastroenterol. 2010;105(2):298‐307. 

45.  Yang D, Chen Q, Rosenberg HF, et al. Human ribonuclease A superfamily members, eosinophil‐derived neurotoxin and pancreatic ribonuclease, induce dendritic cell maturation and activation. J Immunol. 2004;173(10):6134‐6142. 

46.  Wen T, Rothenberg ME. The Regulatory Function of Eosinophils. Microbiol Spectr. 2016;4(5). 47.  Le‐Carlson M, Seki S, Abarbanel D, Quiros A, Cox K, Nadeau KC. Markers of antigen presentation 

and activation on eosinophils and T cells in the esophageal tissue of patients with eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2013;56(3):257‐262. 

48.  Straumann A, Bauer M, Fischer B, Blaser K, Simon HU. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2‐type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 2001;108(6):954‐961. 

49.  Cianferoni A, Ruffner MA, Guzek R, et al. Elevated expression of activated TH2 cells and milk‐specific TH2 cells in milk‐induced eosinophilic esophagitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 2018;120(2):177‐183 e172. 

50.  Bullock JZ, Villanueva JM, Blanchard C, et al. Interplay of adaptive th2 immunity with eotaxin‐3/c‐C chemokine receptor 3 in eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;45(1):22‐31. 

51.  Blanchard C, Stucke EM, Rodriguez‐Jimenez B, et al. A striking local esophageal cytokine expression profile in eosinophilic esophagitis. The Journal of allergy and clinical immunology. 2011;127(1):208‐217, 217 e201‐207. 

52.  Takatsu K, Nakajima H. IL‐5 and eosinophilia. Curr Opin Immunol. 2008;20(3):288‐294. 53.  Mishra A, Hogan SP, Brandt EB, Rothenberg ME. IL‐5 promotes eosinophil trafficking to the 

esophagus. J Immunol. 2002;168(5):2464‐2469. 54.  Blanchard C, Mingler MK, Vicario M, et al. IL‐13 involvement in eosinophilic esophagitis: 

transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. The Journal of allergy and clinical immunology. 2007;120(6):1292‐1300. 

55.  Taams LS, Palmer DB, Akbar AN, Robinson DS, Brown Z, Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in human disease and their potential for therapeutic manipulation. Immunology. 2006;118(1):1‐9. 

56.  Hawrylowicz CM. Regulatory T cells and IL‐10 in allergic inflammation. J Exp Med. 2005;202(11):1459‐1463. 

57.  Stuck MC, Straumann A, Simon HU. Relative lack of T regulatory cells in adult eosinophilic esophagitis ‐ no normalization after corticosteroid therapy. Allergy. 2011;66(5):705‐707. 

58.  Zhu X, Wang M, Crump CH, Mishra A. An imbalance of esophageal effector and regulatory T cell subsets in experimental eosinophilic esophagitis in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009;297(3):G550‐558. 

169  

59.  Fuentebella J, Patel A, Nguyen T, et al. Increased number of regulatory T cells in children with eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010;51(3):283‐289. 

60.  Tantibhaedhyangkul U, Tatevian N, Gilger MA, Major AM, Davis CM. Increased esophageal regulatory T cells and eosinophil characteristics in children with eosinophilic esophagitis and gastroesophageal reflux disease. Ann Clin Lab Sci. 2009;39(2):99‐107. 

61.  Ling EM, Smith T, Nguyen XD, et al. Relation of CD4+CD25+ regulatory T‐cell suppression of allergen‐driven T‐cell activation to atopic status and expression of allergic disease. Lancet. 2004;363(9409):608‐615. 

62.  Ito Y, Satoh T, Takayama K, Miyagishi C, Walls AF, Yokozeki H. Basophil recruitment and activation in inflammatory skin diseases. Allergy. 2011;66(8):1107‐1113. 

63.  Siracusa MC, Kim BS, Spergel JM, Artis D. Basophils and allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2013;132(4):789‐801; quiz 788. 

64.  Macfarlane AJ, Kon OM, Smith SJ, et al. Basophils, eosinophils, and mast cells in atopic and nonatopic asthma and in late‐phase allergic reactions in the lung and skin. J Allergy Clin Immunol. 2000;105(1 Pt 1):99‐107. 

65.  Iwakura N, Fujiwara Y, Tanaka F, et al. Basophil infiltration in eosinophilic oesophagitis and proton pump inhibitor‐responsive oesophageal eosinophilia. Aliment Pharmacol Ther. 2015;41(8):776‐784. 

66.  Obata K, Mukai K, Tsujimura Y, et al. Basophils are essential initiators of a novel type of chronic allergic inflammation. Blood. 2007;110(3):913‐920. 

67.  Venturelli N, Lexmond WS, Ohsaki A, et al. Allergic skin sensitization promotes eosinophilic esophagitis through the IL‐33‐basophil axis in mice. J Allergy Clin Immunol. 2016;138(5):1367‐1380 e1365. 

68.  Perrigoue JG, Saenz SA, Siracusa MC, et al. MHC class II‐dependent basophil‐CD4+ T cell interactions promote T(H)2 cytokine‐dependent immunity. Nat Immunol. 2009;10(7):697‐705. 

69.  Abonia JP, Blanchard C, Butz BB, et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2010;126(1):140‐149. 

70.  Lomazi EA, Brandalise NA, Servidoni M, Cardoso SR, Meirelles LR. Mast Cells Distinguish Eosinophilic Esophagitis in Pediatric Patients. Arq Gastroenterol. 2017;54(3):192‐196. 

71.  Niranjan R, Mavi P, Rayapudi M, Dynda S, Mishra A. Pathogenic role of mast cells in experimental eosinophilic esophagitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013;304(12):G1087‐1094. 

72.  Arias A, Lucendo AJ, Martinez‐Fernandez P, et al. Dietary treatment modulates mast cell phenotype, density, and activity in adult eosinophilic oesophagitis. Clin Exp Allergy. 2016;46(1):78‐91. 

73.  Toru H, Pawankar R, Ra C, Yata J, Nakahata T. Human mast cells produce IL‐13 by high‐affinity IgE receptor cross‐linking: enhanced IL‐13 production by IL‐4‐primed human mast cells. J Allergy Clin Immunol. 1998;102(3):491‐502. 

74.  Elishmereni M, Bachelet I, Nissim Ben‐Efraim AH, Mankuta D, Levi‐Schaffer F. Interacting mast cells and eosinophils acquire an enhanced activation state in vitro. Allergy. 2013;68(2):171‐179. 

75.  Galdiero MR, Varricchi G, Seaf M, Marone G, Levi‐Schaffer F, Marone G. Bidirectional Mast Cell‐Eosinophil Interactions in Inflammatory Disorders and Cancer. Front Med (Lausanne). 2017;4:103. 

76.  Aceves SS, Chen D, Newbury RO, Dohil R, Bastian JF, Broide DH. Mast cells infiltrate the esophageal smooth muscle in patients with eosinophilic esophagitis, express TGF‐beta1, and increase esophageal smooth muscle contraction. J Allergy Clin Immunol. 2010;126(6):1198‐1204 e1194. 

170  

77.  Doherty TA, Baum R, Newbury RO, et al. Group 2 innate lymphocytes (ILC2) are enriched in active eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(3):792‐794 e793. 

78.  Doherty TA, Broide DH. Group 2 innate lymphoid cells: new players in human allergic diseases. J Investig Allergol Clin Immunol. 2015;25(1):1‐11; quiz 12p following 11. 

79.  Doherty TA. At the bench: understanding group 2 innate lymphoid cells in disease. J Leukoc Biol. 2015;97(3):455‐467. 

80.  Christianson CA, Goplen NP, Zafar I, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL‐33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59‐68 e14. 

81.  Morita H, Moro K, Koyasu S. Innate lymphoid cells in allergic and nonallergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2016;138(5):1253‐1264. 

82.  Geremia A, Arancibia‐Carcamo CV. Innate Lymphoid Cells in Intestinal Inflammation. Front Immunol. 2017;8:1296. 

83.  Jyonouchi S, Smith CL, Saretta F, et al. Invariant natural killer T cells in children with eosinophilic esophagitis. Clin Exp Allergy. 2014;44(1):58‐68. 

84.  Alam R, Stafford S, Forsythe P, et al. RANTES is a chemotactic and activating factor for human eosinophils. J Immunol. 1993;150(8 Pt 1):3442‐3448. 

85.  Emad A, Emad Y. Relationship between eosinophilia and levels of chemokines (CCL5 and CCL11) and IL‐5 in bronchoalveolar lavage fluid of patients with mustard gas‐induced pulmonary fibrosis. J Clin Immunol. 2007;27(6):605‐612. 

86.  Lexmond WS, Neves JF, Nurko S, et al. Involvement of the iNKT cell pathway is associated with early‐onset eosinophilic esophagitis and response to allergen avoidance therapy. Am J Gastroenterol. 2014;109(5):646‐657. 

87.  Rajavelu P, Rayapudi M, Moffitt M, Mishra A, Mishra A. Significance of para‐esophageal lymph nodes in food or aeroallergen‐induced iNKT cell‐mediated experimental eosinophilic esophagitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012;302(7):G645‐654. 

88.  Choi P, Reiser H. IL‐4: role in disease and regulation of production. Clin Exp Immunol. 1998;113(3):317‐319. 

89.  Cheng E. Translating new developments in eosinophilic esophagitis pathogenesis into clinical practice. Curr Treat Options Gastroenterol. 2015;13(1):30‐46. 

90.  Mishra A, Wang M, Pemmaraju VR, et al. Esophageal remodeling develops as a consequence of tissue specific IL‐5‐induced eosinophilia. Gastroenterology. 2008;134(1):204‐214. 

91.  Masterson JC, McNamee EN, Hosford L, et al. Local hypersensitivity reaction in transgenic mice with squamous epithelial IL‐5 overexpression provides a novel model of eosinophilic oesophagitis. Gut. 2014;63(1):43‐53. 

92.  Mavi P, Rajavelu P, Rayapudi M, Paul RJ, Mishra A. Esophageal functional impairments in experimental eosinophilic esophagitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012;302(11):G1347‐1355. 

93.  Straumann A, Conus S, Grzonka P, et al. Anti‐interleukin‐5 antibody treatment (mepolizumab) in active eosinophilic oesophagitis: a randomised, placebo‐controlled, double‐blind trial. Gut. 2010;59(1):21‐30. 

94.  Miller AM. Role of IL‐33 in inflammation and disease. J Inflamm (Lond). 2011;8(1):22. 95.  Furukawa S, Moriyama M, Miyake K, et al. Interleukin‐33 produced by M2 macrophages and 

other immune cells contributes to Th2 immune reaction of IgG4‐related disease. Sci Rep. 2017;7:42413. 

96.  Ali S, Mohs A, Thomas M, et al. The dual function cytokine IL‐33 interacts with the transcription factor NF‐kappaB to dampen NF‐kappaB‐stimulated gene transcription. J Immunol. 2011;187(4):1609‐1616. 

171  

97.  Kumar S, Tzimas MN, Griswold DE, Young PR. Expression of ST2, an interleukin‐1 receptor homologue, is induced by proinflammatory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 1997;235(3):474‐478. 

98.  Oshikawa K, Yanagisawa K, Tominaga S, Sugiyama Y. Expression and function of the ST2 gene in a murine model of allergic airway inflammation. Clin Exp Allergy. 2002;32(10):1520‐1526. 

99.  Schmitz J, Owyang A, Oldham E, et al. IL‐33, an interleukin‐1‐like cytokine that signals via the IL‐1 receptor‐related protein ST2 and induces T helper type 2‐associated cytokines. Immunity. 2005;23(5):479‐490. 

100.  Travers J, Rochman M, Caldwell JM, Besse JA, Miracle CE, Rothenberg ME. IL‐33 is induced in undifferentiated, non‐dividing esophageal epithelial cells in eosinophilic esophagitis. Sci Rep. 2017;7(1):17563. 

101.  Judd LM, Heine RG, Menheniott TR, et al. Elevated IL‐33 expression is associated with pediatric eosinophilic esophagitis, and exogenous IL‐33 promotes eosinophilic esophagitis development in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2016;310(1):G13‐25. 

102.  Johnston LK, Hsu CL, Krier‐Burris RA, et al. IL‐33 Precedes IL‐5 in Regulating Eosinophil Commitment and Is Required for Eosinophil Homeostasis. J Immunol. 2016;197(9):3445‐3453. 

103.  Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, et al. Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol. 2002;3(7):673‐680. 

104.  Ziegler SF. The role of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) in allergic disorders. Curr Opin Immunol. 2010;22(6):795‐799. 

105.  Morshed M, Yousefi S, Stockle C, Simon HU, Simon D. Thymic stromal lymphopoietin stimulates the formation of eosinophil extracellular traps. Allergy. 2012;67(9):1127‐1137. 

106.  Chandramouleeswaran PM, Shen D, Lee AJ, et al. Preferential Secretion of Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) by Terminally Differentiated Esophageal Epithelial Cells: Relevance to Eosinophilic Esophagitis (EoE). PLoS One. 2016;11(3):e0150968. 

107.  Ishihara S, Shoda T, Ishimura N, et al. Serum Biomarkers for the Diagnosis of Eosinophilic Esophagitis and Eosinophilic Gastroenteritis. Intern Med. 2017;56(21):2819‐2825. 

108.  Eden K, Rothschild DE, McDaniel DK, Heid B, Allen IC. Noncanonical NF‐kappaB signaling and the essential kinase NIK modulate crucial features associated with eosinophilic esophagitis pathogenesis. Dis Model Mech. 2017;10(12):1517‐1527. 

109.  Martin LJ, He H, Collins MH, et al. Eosinophilic esophagitis (EoE) genetic susceptibility is mediated by synergistic interactions between EoE‐specific and general atopic disease loci. J Allergy Clin Immunol. 2017. 

110.  Fahey LM, Chandramouleeswaran PM, Guan S, et al. Food allergen triggers are increased in children with the TSLP risk allele and eosinophilic esophagitis. Clin Transl Gastroenterol. 2018;9(3):139. 

111.  Simon D, Radonjic‐Hosli S, Straumann A, Yousefi S, Simon HU. Active eosinophilic esophagitis is characterized by epithelial barrier defects and eosinophil extracellular trap formation. Allergy. 2015;70(4):443‐452. 

112.  Rieder F, Nonevski I, Ma J, et al. T‐helper 2 cytokines, transforming growth factor beta1, and eosinophil products induce fibrogenesis and alter muscle motility in patients with eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 2014;146(5):1266‐1277 e1261‐1269. 

113.  Aceves SS, Newbury RO, Dohil R, Bastian JF, Broide DH. Esophageal remodeling in pediatric eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2007;119(1):206‐212. 

114.  Kagalwalla AF, Akhtar N, Woodruff SA, et al. Eosinophilic esophagitis: epithelial mesenchymal transition contributes to esophageal remodeling and reverses with treatment. J Allergy Clin Immunol. 2012;129(5):1387‐1396 e1387. 

172  

115.  Chehade M, Sampson HA, Morotti RA, Magid MS. Esophageal subepithelial fibrosis in children with eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;45(3):319‐328. 

116.  Straumann A, Conus S, Degen L, et al. Budesonide is effective in adolescent and adult patients with active eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 2010;139(5):1526‐1537, 1537 e1521. 

117.  Lucendo AJ. Eosinophilic esophagitis: current evidence‐based diagnosis and treatment in children and adults. Minerva Gastroenterol Dietol. 2018;64(1):62‐74. 

118.  Gunther C, Neumann H, Vieth M. Esophageal epithelial resistance. Dig Dis. 2014;32(1‐2):6‐10. 119.  Warners MJ, van Rhijn BD, Verheij J, Smout A, Bredenoord AJ. Disease activity in eosinophilic 

esophagitis is associated with impaired esophageal barrier integrity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2017;313(3):G230‐G238. 

120.  Kubo A, Nagao K, Amagai M. Epidermal barrier dysfunction and cutaneous sensitization in atopic diseases. J Clin Invest. 2012;122(2):440‐447. 

121.  Davis BP. Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis. Clin Rev Allergy Immunol. 2018. 122.  Sherrill JD, Kiran KC, Blanchard C, et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis 

transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 2014;15(6):361‐369. 123.  Abdulnour‐Nakhoul SM, Al‐Tawil Y, Gyftopoulos AA, et al. Alterations in junctional proteins, 

inflammatory mediators and extracellular matrix molecules in eosinophilic esophagitis. Clin Immunol. 2013;148(2):265‐278. 

124.  Rankin SM, Conroy DM, Williams TJ. Eotaxin and eosinophil recruitment: implications for human disease. Mol Med Today. 2000;6(1):20‐27. 

125.  Zimmermann N, Hershey GK, Foster PS, Rothenberg ME. Chemokines in asthma: cooperative interaction between chemokines and IL‐13. J Allergy Clin Immunol. 2003;111(2):227‐242; quiz 243. 

126.  Tian R, Zuo X, Jaoude J, Mao F, Colby J, Shureiqi I. ALOX15 as a suppressor of inflammation and cancer: Lost in the link. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2017;132:77‐83. 

127.  Bayliss MT, Howat SL, Dudhia J, et al. Up‐regulation and differential expression of the hyaluronan‐binding protein TSG‐6 in cartilage and synovium in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9(1):42‐48. 

128.  Matoso A, Mukkada VA, Lu S, et al. Expression microarray analysis identifies novel epithelial‐derived protein markers in eosinophilic esophagitis. Mod Pathol. 2013;26(5):665‐676. 

129.  Wen T, Stucke EM, Grotjan TM, et al. Molecular diagnosis of eosinophilic esophagitis by gene expression profiling. Gastroenterology. 2013;145(6):1289‐1299. 

130.  Van Itallie CM, Fanning AS, Holmes J, Anderson JM. Occludin is required for cytokine‐induced regulation of tight junction barriers. J Cell Sci. 2010;123(Pt 16):2844‐2852. 

131.  Politi E, Angelakopoulou A, Grapsa D, et al. Filaggrin and Periostin Expression Is Altered in Eosinophilic Esophagitis and Normalized With Treatment. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2017;65(1):47‐52. 

132.  Simon D, Page B, Vogel M, et al. Evidence of an abnormal epithelial barrier in active, untreated and corticosteroid‐treated eosinophilic esophagitis. Allergy. 2018;73(1):239‐247. 

133.  Sherrill JD, Kc K, Wu D, et al. Desmoglein‐1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 2014;7(3):718‐729. 

134.  Warners MJ, Vlieg‐Boerstra BJ, Verheij J, et al. Esophageal and Small Intestinal Mucosal Integrity in Eosinophilic Esophagitis and Response to an Elemental Diet. Am J Gastroenterol. 2017;112(7):1061‐1071. 

135.  Chuang MY, Chinnaratha MA, Hancock DG, et al. Topical Steroid Therapy for the Treatment of Eosinophilic Esophagitis (EoE): A Systematic Review and Meta‐Analysis. Clin Transl Gastroenterol. 2015;6:e82. 

173  

136.  Liacouras CA, Wenner WJ, Brown K, Ruchelli E. Primary eosinophilic esophagitis in children: successful treatment with oral corticosteroids. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1998;26(4):380‐385. 

137.  Gonsalves N. Steroids versus dietary therapy for the treatment of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 2014;30(4):396‐401. 

138.  Andreae DA, Hanna MG, Magid MS, et al. Swallowed Fluticasone Propionate Is an Effective Long‐Term Maintenance Therapy for Children With Eosinophilic Esophagitis. Am J Gastroenterol. 2016;111(8):1187‐1197. 

139.  Schaefer ET, Fitzgerald JF, Molleston JP, et al. Comparison of oral prednisone and topical fluticasone in the treatment of eosinophilic esophagitis: a randomized trial in children. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6(2):165‐173. 

140.  Lucendo AJ, Molina‐Infante J, Arias A, et al. Guidelines on eosinophilic esophagitis: evidence‐based statements and recommendations for diagnosis and management in children and adults. United European Gastroenterol J. 2017;5(3):335‐358. 

141.  Alexander JA, Jung KW, Arora AS, et al. Swallowed fluticasone improves histologic but not symptomatic response of adults with eosinophilic esophagitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2012;10(7):742‐749 e741. 

142.  Dellon ES, Sheikh A, Speck O, et al. Viscous topical is more effective than nebulized steroid therapy for patients with eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 2012;143(2):321‐324 e321. 

143.  Gonsalves N. Dietary Therapy in Eosinophilic Esophagitis. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2018;28(1):89‐96. 

144.  Kelly KJ, Lazenby AJ, Rowe PC, Yardley JH, Perman JA, Sampson HA. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid‐based formula. Gastroenterology. 1995;109(5):1503‐1512. 

145.  Markowitz JE, Spergel JM, Ruchelli E, Liacouras CA. Elemental diet is an effective treatment for eosinophilic esophagitis in children and adolescents. Am J Gastroenterol. 2003;98(4):777‐782. 

146.  Peterson KA, Byrne KR, Vinson LA, et al. Elemental diet induces histologic response in adult eosinophilic esophagitis. Am J Gastroenterol. 2013;108(5):759‐766. 

147.  Henderson CJ, Abonia JP, King EC, et al. Comparative dietary therapy effectiveness in remission of pediatric eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2012;129(6):1570‐1578. 

148.  Taft TH, Kern E, Kwiatek MA, Hirano I, Gonsalves N, Keefer L. The adult eosinophilic oesophagitis quality of life questionnaire: a new measure of health‐related quality of life. Aliment Pharmacol Ther. 2011;34(7):790‐798. 

149.  Cotton CC, Eluri S, Wolf WA, Dellon ES. Six‐Food Elimination Diet and Topical Steroids are Effective for Eosinophilic Esophagitis: A Meta‐Regression. Dig Dis Sci. 2017;62(9):2408‐2420. 

150.  Cotton CC, Erim D, Eluri S, et al. Cost Utility Analysis of Topical Steroids Compared With Dietary Elimination for Treatment of Eosinophilic Esophagitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2017;15(6):841‐849 e841. 

151.  Furuta GT, Liacouras CA, Collins MH, et al. Eosinophilic esophagitis in children and adults: a systematic review and consensus recommendations for diagnosis and treatment. Gastroenterology. 2007;133(4):1342‐1363. 

152.  Molina‐Infante J, Ferrando‐Lamana L, Ripoll C, et al. Esophageal eosinophilic infiltration responds to proton pump inhibition in most adults. Clin Gastroenterol Hepatol. 2011;9(2):110‐117. 

153.  Ngo P, Furuta GT, Antonioli DA, Fox VL. Eosinophils in the esophagus‐‐peptic or allergic eosinophilic esophagitis? Case series of three patients with esophageal eosinophilia. Am J Gastroenterol. 2006;101(7):1666‐1670. 

174  

154.  Molina‐Infante J, Bredenoord AJ, Cheng E, et al. Proton pump inhibitor‐responsive oesophageal eosinophilia: an entity challenging current diagnostic criteria for eosinophilic oesophagitis. Gut. 2016;65(3):524‐531. 

155.  Wen T, Dellon ES, Moawad FJ, Furuta GT, Aceves SS, Rothenberg ME. Transcriptome analysis of proton pump inhibitor‐responsive esophageal eosinophilia reveals proton pump inhibitor‐reversible allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2015;135(1):187‐197. 

156.  Gutierrez‐Junquera C, Fernandez‐Fernandez S, Cilleruelo ML, et al. Long‐term Treatment With Proton Pump Inhibitors Is Effective in Children With Eosinophilic Esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2018. 

157.  Molina‐Infante J, Rivas MD, Hernandez‐Alonso M, et al. Proton pump inhibitor‐responsive oesophageal eosinophilia correlates with downregulation of eotaxin‐3 and Th2 cytokines overexpression. Aliment Pharmacol Ther. 2014;40(8):955‐965. 

158.  Cheng E, Zhang X, Huo X, et al. Omeprazole blocks eotaxin‐3 expression by oesophageal squamous cells from patients with eosinophilic oesophagitis and GORD. Gut. 2013;62(6):824‐832. 

159.  Lucendo AJ, Arias A, Gonzalez‐Cervera J, Olalla JM, Molina‐Infante J. Dual response to dietary/topical steroid and proton pump inhibitor therapy in adult patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(3):931‐934 e932. 

160.  Brown KD, Zurawski SM, Mosmann TR, Zurawski G. A family of small inducible proteins secreted by leukocytes are members of a new superfamily that includes leukocyte and fibroblast‐derived inflammatory agents, growth factors, and indicators of various activation processes. J Immunol. 1989;142(2):679‐687. 

161.  Leonard WJ, Lin JX. Cytokine receptor signaling pathways. J Allergy Clin Immunol. 2000;105(5):877‐888. 

162.  Tsarbopoulos A, Varnerin J, Cannon‐Carlson S, et al. Mass spectrometric mapping of disulfide bonds in recombinant human interleukin‐13. J Mass Spectrom. 2000;35(3):446‐453. 

163.  LaPorte SL, Juo ZS, Vaclavikova J, et al. Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin‐4/13 system. Cell. 2008;132(2):259‐272. 

164.  Gessner A, Mohrs K, Mohrs M. Mast cells, basophils, and eosinophils acquire constitutive IL‐4 and IL‐13 transcripts during lineage differentiation that are sufficient for rapid cytokine production. J Immunol. 2005;174(2):1063‐1072. 

165.  Klein Wolterink RG, Kleinjan A, van Nimwegen M, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL‐5 and IL‐13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106‐1116. 

166.  Heller F, Fuss IJ, Nieuwenhuis EE, Blumberg RS, Strober W. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL‐13‐producing NK‐T cells. Immunity. 2002;17(5):629‐638. 

167.  Mueller TD, Zhang JL, Sebald W, Duschl A. Structure, binding, and antagonists in the IL‐4/IL‐13 receptor system. Biochim Biophys Acta. 2002;1592(3):237‐250. 

168.  Zurawski SM, Chomarat P, Djossou O, et al. The primary binding subunit of the human interleukin‐4 receptor is also a component of the interleukin‐13 receptor. J Biol Chem. 1995;270(23):13869‐13878. 

169.  Aman MJ, Tayebi N, Obiri NI, Puri RK, Modi WS, Leonard WJ. cDNA cloning and characterization of the human interleukin 13 receptor alpha chain. J Biol Chem. 1996;271(46):29265‐29270. 

170.  Miloux B, Laurent P, Bonnin O, et al. Cloning of the human IL‐13R alpha1 chain and reconstitution with the IL4R alpha of a functional IL‐4/IL‐13 receptor complex. FEBS Lett. 1997;401(2‐3):163‐166. 

175  

171.  Gwiggner M, Martinez‐Nunez RT, Whiteoak SR, et al. MicroRNA‐31 and MicroRNA‐155 Are Overexpressed in Ulcerative Colitis and Regulate IL‐13 Signaling by Targeting Interleukin 13 Receptor alpha‐1. Genes (Basel). 2018;9(2). 

172.  Caput D, Laurent P, Kaghad M, et al. Cloning and characterization of a specific interleukin (IL)‐13 binding protein structurally related to the IL‐5 receptor alpha chain. J Biol Chem. 1996;271(28):16921‐16926. 

173.  Donaldson DD, Whitters MJ, Fitz LJ, et al. The murine IL‐13 receptor alpha 2: molecular cloning, characterization, and comparison with murine IL‐13 receptor alpha 1. J Immunol. 1998;161(5):2317‐2324. 

174.  Urban JF, Jr., Noben‐Trauth N, Donaldson DD, et al. IL‐13, IL‐4Ralpha, and Stat6 are required for the expulsion of the gastrointestinal nematode parasite Nippostrongylus brasiliensis. Immunity. 1998;8(2):255‐264. 

175.  Kawakami K, Taguchi J, Murata T, Puri RK. The interleukin‐13 receptor alpha2 chain: an essential component for binding and internalization but not for interleukin‐13‐induced signal transduction through the STAT6 pathway. Blood. 2001;97(9):2673‐2679. 

176.  Hershey GK. IL‐13 receptors and signaling pathways: an evolving web. J Allergy Clin Immunol. 2003;111(4):677‐690; quiz 691. 

177.  Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M, Holt VE, 3rd, Silvennoinen O, O'Shea JJ. The Janus kinases (Jaks). Genome Biol. 2004;5(12):253. 

178.  Keegan AD, Johnston JA, Tortolani PJ, et al. Similarities and differences in signal transduction by interleukin 4 and interleukin 13: analysis of Janus kinase activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(17):7681‐7685. 

179.  Kelly‐Welch AE, Hanson EM, Boothby MR, Keegan AD. Interleukin‐4 and interleukin‐13 signaling connections maps. Science. 2003;300(5625):1527‐1528. 

180.  Darnell JE, Jr., Kerr IM, Stark GR. Jak‐STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science. 1994;264(5164):1415‐1421. 

181.  Mitchell TJ, John S. Signal transducer and activator of transcription (STAT) signalling and T‐cell lymphomas. Immunology. 2005;114(3):301‐312. 

182.  Takeda K, Kamanaka M, Tanaka T, Kishimoto T, Akira S. Impaired IL‐13‐mediated functions of macrophages in STAT6‐deficient mice. J Immunol. 1996;157(8):3220‐3222. 

183.  Orchansky PL, Kwan R, Lee F, Schrader JW. Characterization of the cytoplasmic domain of interleukin‐13 receptor‐alpha. J Biol Chem. 1999;274(30):20818‐20825. 

184.  Umeshita‐Suyama R, Sugimoto R, Akaiwa M, et al. Characterization of IL‐4 and IL‐13 signals dependent on the human IL‐13 receptor alpha chain 1: redundancy of requirement of tyrosine residue for STAT3 activation. Int Immunol. 2000;12(11):1499‐1509. 

185.  Xu B, Bhattacharjee A, Roy B, et al. Interleukin‐13 induction of 15‐lipoxygenase gene expression requires p38 mitogen‐activated protein kinase‐mediated serine 727 phosphorylation of Stat1 and Stat3. Mol Cell Biol. 2003;23(11):3918‐3928. 

186.  Amano W, Nakajima S, Kunugi H, et al. The Janus kinase inhibitor JTE‐052 improves skin barrier function through suppressing signal transducer and activator of transcription 3 signaling. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(3):667‐677 e667. 

187.  Roy B, Bhattacharjee A, Xu B, Ford D, Maizel AL, Cathcart MK. IL‐13 signal transduction in human monocytes: phosphorylation of receptor components, association with Jaks, and phosphorylation/activation of Stats. J Leukoc Biol. 2002;72(3):580‐589. 

188.  Friedrich K, Kammer W, Erhardt I, Brandlein S, Sebald W, Moriggl R. Activation of STAT5 by IL‐4 relies on Janus kinase function but not on receptor tyrosine phosphorylation, and can contribute to both cell proliferation and gene regulation. Int Immunol. 1999;11(8):1283‐1294. 

176  

189.  Roskoski R, Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66(2):105‐143. 

190.  Fujisawa T, Joshi B, Nakajima A, Puri RK. A novel role of interleukin‐13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis. Cancer Res. 2009;69(22):8678‐8685. 

191.  Fujisawa T, Joshi BH, Puri RK. IL‐13 regulates cancer invasion and metastasis through IL‐13Ralpha2 via ERK/AP‐1 pathway in mouse model of human ovarian cancer. Int J Cancer. 2012;131(2):344‐356. 

192.  Lee PJ, Zhang X, Shan P, et al. ERK1/2 mitogen‐activated protein kinase selectively mediates IL‐13‐induced lung inflammation and remodeling in vivo. J Clin Invest. 2006;116(1):163‐173. 

193.  Goto K, Chiba Y, Misawa M. IL‐13 induces translocation of NF‐kappaB in cultured human bronchial smooth muscle cells. Cytokine. 2009;46(1):96‐99. 

194.  Shinozaki S, Mashima H, Ohnishi H, Sugano K. IL‐13 promotes the proliferation of rat pancreatic stellate cells through the suppression of NF‐kappaB/TGF‐beta1 pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2010;393(1):61‐65. 

195.  David M, Ford D, Bertoglio J, Maizel AL, Pierre J. Induction of the IL‐13 receptor alpha2‐chain by IL‐4 and IL‐13 in human keratinocytes: involvement of STAT6, ERK and p38 MAPK pathways. Oncogene. 2001;20(46):6660‐6668. 

196.  Zhou X, Hu H, Balzar S, Trudeau JB, Wenzel SE. MAPK regulation of IL‐4/IL‐13 receptors contributes to the synergistic increase in CCL11/eotaxin‐1 in response to TGF‐beta1 and IL‐13 in human airway fibroblasts. J Immunol. 2012;188(12):6046‐6054. 

197.  Bao K, Reinhardt RL. The differential expression of IL‐4 and IL‐13 and its impact on type‐2 immunity. Cytokine. 2015;75(1):25‐37. 

198.  Maizels RM, Holland MJ. Parasite immunology: pathways for expelling intestinal helminths. Curr Biol. 1998;8(20):R711‐714. 

199.  Finkelman FD, Shea‐Donohue T, Morris SC, et al. Interleukin‐4‐ and interleukin‐13‐mediated host protection against intestinal nematode parasites. Immunol Rev. 2004;201:139‐155. 

200.  Punnonen J, de Vries JE. IL‐13 induces proliferation, Ig isotype switching, and Ig synthesis by immature human fetal B cells. J Immunol. 1994;152(3):1094‐1102. 

201.  Zhu Z, Homer RJ, Wang Z, et al. Pulmonary expression of interleukin‐13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production. J Clin Invest. 1999;103(6):779‐788. 

202.  Terabe M, Park JM, Berzofsky JA. Role of IL‐13 in regulation of anti‐tumor immunity and tumor growth. Cancer Immunol Immunother. 2004;53(2):79‐85. 

203.  Brown CE, Warden CD, Starr R, et al. Glioma IL13Ralpha2 is associated with mesenchymal signature gene expression and poor patient prognosis. PLoS One. 2013;8(10):e77769. 

204.  Sengupta S, Thaci B, Crawford AC, Sampath P. Interleukin‐13 receptor alpha 2‐targeted glioblastoma immunotherapy. Biomed Res Int. 2014;2014:952128. 

205.  Schmid‐Grendelmeier P, Altznauer F, Fischer B, et al. Eosinophils express functional IL‐13 in eosinophilic inflammatory diseases. J Immunol. 2002;169(2):1021‐1027. 

206.  Mishra A, Rothenberg ME. Intratracheal IL‐13 induces eosinophilic esophagitis by an IL‐5, eotaxin‐1, and STAT6‐dependent mechanism. Gastroenterology. 2003;125(5):1419‐1427. 

207.  Zuo L, Fulkerson PC, Finkelman FD, et al. IL‐13 induces esophageal remodeling and gene expression by an eosinophil‐independent, IL‐13R alpha 2‐inhibited pathway. J Immunol. 2010;185(1):660‐669. 

208.  D'Mello RJ, Caldwell JM, Azouz NP, et al. LRRC31 is induced by IL‐13 and regulates kallikrein expression and barrier function in the esophageal epithelium. Mucosal Immunol. 2016;9(3):744‐756. 

177  

209.  Davis BP, Stucke EM, Khorki ME, et al. Eosinophilic esophagitis‐linked calpain 14 is an IL‐13‐induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 2016;1(4):e86355. 

210.  Blanchard C, Mishra A, Saito‐Akei H, Monk P, Anderson I, Rothenberg ME. Inhibition of human interleukin‐13‐induced respiratory and oesophageal inflammation by anti‐human‐interleukin‐13 antibody (CAT‐354). Clin Exp Allergy. 2005;35(8):1096‐1103. 

211.  Rothenberg ME, Wen T, Greenberg A, et al. Intravenous anti‐IL‐13 mAb QAX576 for the treatment of eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 2015;135(2):500‐507. 

212.  Tripp CS, Cuff C, Campbell AL, et al. RPC4046, A Novel Anti‐interleukin‐13 Antibody, Blocks IL‐13 Binding to IL‐13 alpha1 and alpha2 Receptors: A Randomized, Double‐Blind, Placebo‐Controlled, Dose‐Escalation First‐in‐Human Study. Adv Ther. 2017;34(6):1364‐1381. 

213.  Goyal A, Cheng E. Recent discoveries and emerging therapeutics in eosinophilic esophagitis. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 2016;7(1):21‐32. 

214.  Seifter JL, Chang HY. Extracellular Acid‐Base Balance and Ion Transport Between Body Fluid Compartments. Physiology (Bethesda). 2017;32(5):367‐379. 

215.  Stock C, Ludwig FT, Hanley PJ, Schwab A. Roles of ion transport in control of cell motility. Compr Physiol. 2013;3(1):59‐119. 

216.  Matalon S, Bartoszewski R, Collawn JF. Role of epithelial sodium channels in the regulation of lung fluid homeostasis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2015;309(11):L1229‐1238. 

217.  Field M. Intestinal ion transport and the pathophysiology of diarrhea. J Clin Invest. 2003;111(7):931‐943. 

218.  Fromter E. Mechanisms and regulation of ion transport in the renal collecting duct. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 1988;90(4):701‐707. 

219.  Bland RD. Lung epithelial ion transport and fluid movement during the perinatal period. Am J Physiol. 1990;259(2 Pt 1):L30‐37. 

220.  Fritzsching B, Hagner M, Dai L, et al. Impaired mucus clearance exacerbates allergen‐induced type 2 airway inflammation in juvenile mice. J Allergy Clin Immunol. 2017;140(1):190‐203 e195. 

221.  Bartoszewski R, Matalon S, Collawn JF. Ion channels of the lung and their role in disease pathogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017;313(5):L859‐L872. 

222.  Hobbs CA, Blanchard MG, Alijevic O, et al. Identification of the SPLUNC1 ENaC‐inhibitory domain yields novel strategies to treat sodium hyperabsorption in cystic fibrosis airway epithelial cultures. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2013;305(12):L990‐L1001. 

223.  Hogan PG, Lewis RS, Rao A. Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes: STIM and ORAI. Annu Rev Immunol. 2010;28:491‐533. 

224.  Feske S. ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store‐operated Ca2+ entry in the immune system and beyond. Immunol Rev. 2009;231(1):189‐209. 

225.  Mittal RK. Motor Function of the Pharynx, Esophagus, and its Sphincters. San Rafael (CA)2011. 226.  Orlando RC. Current understanding of the mechanisms of gastro‐oesophageal reflux disease. 

Drugs. 2006;66 Suppl 1:1‐5; discussion 29‐33. 227.  Tobey NA, Reddy SP, Khalbuss WE, Silvers SM, Cragoe EJ, Jr., Orlando RC. Na(+)‐dependent and ‐

independent Cl‐/HCO3‐ exchangers in cultured rabbit esophageal epithelial cells. Gastroenterology. 1993;104(1):185‐195. 

228.  Avidan B, Sonnenberg A, Schnell TG, Sontag SJ. Walking and chewing reduce postprandial acid reflux. Aliment Pharmacol Ther. 2001;15(2):151‐155. 

229.  Herbella FA, Sweet MP, Tedesco P, Nipomnick I, Patti MG. Gastroesophageal reflux disease and obesity. Pathophysiology and implications for treatment. J Gastrointest Surg. 2007;11(3):286‐290. 

178  

230.  Mason RJ, Oberg S, Bremner CG, et al. Postprandial gastroesophageal reflux in normal volunteers and symptomatic patients. J Gastrointest Surg. 1998;2(4):342‐349. 

231.  Orlando RC. Gastroesophageal Reflux Disease. New York: CRC Press; 2000. 232.  Abdulnour‐Nakhoul S, Nakhoul NL, Wheeler SA, Wang P, Swenson ER, Orlando RC. HCO3‐ 

secretion in the esophageal submucosal glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005;288(4):G736‐744. 

233.  Shaheen N, Ransohoff DF. Gastroesophageal reflux, barrett esophagus, and esophageal cancer: scientific review. JAMA. 2002;287(15):1972‐1981. 

234.  Martinucci I, de Bortoli N, Russo S, et al. Barrett's esophagus in 2016: From pathophysiology to treatment. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 2016;7(2):190‐206. 

235.  Spechler SJ. Barrett esophagus and risk of esophageal cancer: a clinical review. JAMA. 2013;310(6):627‐636. 

236.  Tobey NA, Argote CM, Vanegas XC, Barlow W, Orlando RC. Electrical parameters and ion species for active transport in human esophageal stratified squamous epithelium and Barrett's specialized columnar epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007;293(1):G264‐270. 

237.  Laczko D, Rosztoczy A, Birkas K, et al. Role of ion transporters in the bile acid‐induced esophageal injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2016;311(1):G16‐31. 

238.  Goldman A, Shahidullah M, Goldman D, et al. A novel mechanism of acid and bile acid‐induced DNA damage involving Na+/H+ exchanger: implication for Barrett's oesophagus. Gut. 2010;59(12):1606‐1616. 

239.  Guan B, Hoque A, Xu X. Amiloride and guggulsterone suppression of esophageal cancer cell growth in vitro and in nude mouse xenografts. Front Biol (Beijing). 2014;9(1):75‐81. 

240.  Zhang R, Gong J, Wang H, Wang L. Bile salts inhibit growth and induce apoptosis of human esophageal cancer cell line. World J Gastroenterol. 2005;11(33):5109‐5116. 

241.  Goldman A, Chen H, Khan MR, et al. The Na+/H+ exchanger controls deoxycholic acid‐induced apoptosis by a H+‐activated, Na+‐dependent ionic shift in esophageal cells. PLoS One. 2011;6(8):e23835. 

242.  Valles PG, Bocanegra V, Gil Lorenzo A, Costantino VV. Physiological Functions and Regulation of the Na+/H+ Exchanger [NHE1] in Renal Tubule Epithelial Cells. Kidney Blood Press Res. 2015;40(5):452‐466. 

243.  Donowitz M, Ming Tse C, Fuster D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 2013;34(2‐3):236‐251. 

244.  Slepkov E, Fliegel L. Regulation of expression of the Na+/H+ exchanger by thyroid hormone. Vitam Horm. 2004;69:249‐269. 

245.  Slepkov ER, Rainey JK, Sykes BD, Fliegel L. Structural and functional analysis of the Na+/H+ exchanger. Biochem J. 2007;401(3):623‐633. 

246.  Slepkov E, Fliegel L. Structure and function of the NHE1 isoform of the Na+/H+ exchanger. Biochem Cell Biol. 2002;80(5):499‐508. 

247.  Rotin D, Grinstein S. Impaired cell volume regulation in Na(+)‐H+ exchange‐deficient mutants. Am J Physiol. 1989;257(6 Pt 1):C1158‐1165. 

248.  Wu D, Kraut JA. Role of NHE1 in the cellular dysfunction of acute metabolic acidosis. Am J Nephrol. 2014;40(1):36‐42. 

249.  Odunewu‐Aderibigbe A, Fliegel L. The Na(+) /H(+) exchanger and pH regulation in the heart. IUBMB Life. 2014;66(10):679‐685. 

250.  Wang Y, Meyer JW, Ashraf M, Shull GE. Mice with a null mutation in the NHE1 Na+‐H+ exchanger are resistant to cardiac ischemia‐reperfusion injury. Circ Res. 2003;93(8):776‐782. 

251.  Amith SR, Fliegel L. Regulation of the Na+/H+ Exchanger (NHE1) in Breast Cancer Metastasis. Cancer Res. 2013;73(4):1259‐1264. 

179  

252.  Harguindey S, Arranz JL, Polo Orozco JD, et al. Cariporide and other new and powerful NHE1 inhibitors as potentially selective anticancer drugs‐‐an integral molecular/biochemical/metabolic/clinical approach after one hundred years of cancer research. J Transl Med. 2013;11:282. 

253.  Nakamura N, Tanaka S, Teko Y, Mitsui K, Kanazawa H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post‐Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 2005;280(2):1561‐1572. 

254.  Orlowski J, Kandasamy RA, Shull GE. Molecular cloning of putative members of the Na/H exchanger gene family. cDNA cloning, deduced amino acid sequence, and mRNA tissue expression of the rat Na/H exchanger NHE‐1 and two structurally related proteins. J Biol Chem. 1992;267(13):9331‐9339. 

255.  Malo ME, Fliegel L. Physiological role and regulation of the Na+/H+ exchanger. Can J Physiol Pharmacol. 2006;84(11):1081‐1095. 

256.  Brant SR, Yun CH, Donowitz M, Tse CM. Cloning, tissue distribution, and functional analysis of the human Na+/N+ exchanger isoform, NHE3. Am J Physiol. 1995;269(1 Pt 1):C198‐206. 

257.  Schultheis PJ, Clarke LL, Meneton P, et al. Renal and intestinal absorptive defects in mice lacking the NHE3 Na+/H+ exchanger. Nat Genet. 1998;19(3):282‐285. 

258.  Pan W, Borovac J, Spicer Z, et al. The epithelial sodium/proton exchanger, NHE3, is necessary for renal and intestinal calcium (re)absorption. Am J Physiol Renal Physiol. 2012;302(8):F943‐956. 

259.  Vallon V, Schwark JR, Richter K, Hropot M. Role of Na(+)/H(+) exchanger NHE3 in nephron function: micropuncture studies with S3226, an inhibitor of NHE3. Am J Physiol Renal Physiol. 2000;278(3):F375‐379. 

260.  Wang T, Hropot M, Aronson PS, Giebisch G. Role of NHE isoforms in mediating bicarbonate reabsorption along the nephron. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(6):F1117‐1122. 

261.  Girardi AC, Di Sole F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger‐3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 2012;302(11):C1569‐1587. 

262.  Koeners MP, Lewis KE, Ford AP, Paton JF. Hypertension: a problem of organ blood flow supply‐demand mismatch. Future Cardiol. 2016;12(3):339‐349. 

263.  LaPointe MS, Sodhi C, Sahai A, Batlle D. Na+/H+ exchange activity and NHE‐3 expression in renal tubules from the spontaneously hypertensive rat. Kidney Int. 2002;62(1):157‐165. 

264.  Inoue BH, dos Santos L, Pessoa TD, et al. Increased NHE3 abundance and transport activity in renal proximal tubule of rats with heart failure. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2012;302(1):R166‐174. 

265.  Ledoussal C, Lorenz JN, Nieman ML, Soleimani M, Schultheis PJ, Shull GE. Renal salt wasting in mice lacking NHE3 Na+/H+ exchanger but not in mice lacking NHE2. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(4):F718‐727. 

266.  Linz B, Hohl M, Reil JC, Bohm M, Linz D. Inhibition of NHE3‐mediated Sodium Absorption in the Gut Reduced Cardiac End‐organ Damage Without Deteriorating Renal Function in Obese Spontaneously Hypertensive Rats. J Cardiovasc Pharmacol. 2016;67(3):225‐231. 

267.  Yeruva S, Farkas K, Hubricht J, et al. Preserved Na(+)/H(+) exchanger isoform 3 expression and localization, but decreased NHE3 function indicate regulatory sodium transport defect in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2010;16(7):1149‐1161. 

268.  Gurney MA, Laubitz D, Ghishan FK, Kiela PR. Pathophysiology of Intestinal Na(+)/H(+) exchange. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2017;3(1):27‐40. 

269.  Thursby E, Juge N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 2017;474(11):1823‐1836. 

270.  O'May GA, Reynolds N, Macfarlane GT. Effect of pH on an in vitro model of gastric microbiota in enteral nutrition patients. Appl Environ Microbiol. 2005;71(8):4777‐4783. 

180  

271.  Lomasney KW, Houston A, Shanahan F, Dinan TG, Cryan JF, Hyland NP. Selective influence of host microbiota on cAMP‐mediated ion transport in mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 2014;26(6):887‐890. 

272.  Engevik MA, Aihara E, Montrose MH, Shull GE, Hassett DJ, Worrell RT. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013;305(10):G697‐711. 

273.  Queiroz‐Leite GD, Peruzzetto MC, Neri EA, Reboucas NA. Transcriptional regulation of the Na(+)/H(+) exchanger NHE3 by chronic exposure to angiotensin II in renal epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011;409(3):470‐476. 

274.  Collazo R, Fan L, Hu MC, Zhao H, Wiederkehr MR, Moe OW. Acute regulation of Na+/H+ exchanger NHE3 by parathyroid hormone via NHE3 phosphorylation and dynamin‐dependent endocytosis. J Biol Chem. 2000;275(41):31601‐31608. 

275.  Bacic D, Kaissling B, McLeroy P, Zou L, Baum M, Moe OW. Dopamine acutely decreases apical membrane Na/H exchanger NHE3 protein in mouse renal proximal tubule. Kidney Int. 2003;64(6):2133‐2141. 

276.  Hu MC, Fan L, Crowder LA, Karim‐Jimenez Z, Murer H, Moe OW. Dopamine acutely stimulates Na+/H+ exchanger (NHE3) endocytosis via clathrin‐coated vesicles: dependence on protein kinase A‐mediated NHE3 phosphorylation. J Biol Chem. 2001;276(29):26906‐26915. 

277.  Alexander RT, Grinstein S. Tethering, recycling and activation of the epithelial sodium‐proton exchanger, NHE3. J Exp Biol. 2009;212(Pt 11):1630‐1637. 

278.  Dellon ES, Hirano I. Epidemiology and Natural History of Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 2017. 

279.  Dellon ES. Epidemiology of eosinophilic esophagitis. Gastroenterol Clin North Am. 2014;43(2):201‐218. 

280.  Prasad GA, Alexander JA, Schleck CD, et al. Epidemiology of eosinophilic esophagitis over three decades in Olmsted County, Minnesota. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7(10):1055‐1061. 

281.  Arias A, Perez‐Martinez I, Tenias JM, Lucendo AJ. Systematic review with meta‐analysis: the incidence and prevalence of eosinophilic oesophagitis in children and adults in population‐based studies. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2016;43(1):3‐15. 

282.  Liacouras CA, Furuta GT, Hirano I, et al. Eosinophilic esophagitis: updated consensus recommendations for children and adults. The Journal of allergy and clinical immunology. 2011;128(1):3‐20 e26; quiz 21‐22. 

283.  Klinnert MD, Silveira L, Harris R, et al. Health‐Related Quality of Life Over Time in Children With Eosinophilic Esophagitis and Their Families. J Pediatr Gastr Nutr. 2014;59(3):308‐316. 

284.  Akei HS, Mishra A, Blanchard C, Rothenberg ME. Epicutaneous Antigen Exposure Primes for Experimental Eosinophilic Esophagitis in Mice. Gastroenterology. 2005;129(3):985‐994. 

285.  Collins MH. Histopathologic features of eosinophilic esophagitis. Gastrointestinal endoscopy clinics of North America. 2008;18(1):59‐71; viii‐ix. 

286.  Abu‐Sultaneh SM, Durst P, Maynard V, Elitsur Y. Fluticasone and food allergen elimination reverse sub‐epithelial fibrosis in children with eosinophilic esophagitis. Dig Dis Sci. 2011;56(1):97‐102. 

287.  Arora AS, Perrault J, Smyrk TC. Topical corticosteroid treatment of dysphagia due to eosinophilic esophagitis in adults. Mayo Clin Proc. 2003;78(7):830‐835. 

288.  Faubion WA, Jr., Perrault J, Burgart LJ, Zein NN, Clawson M, Freese DK. Treatment of eosinophilic esophagitis with inhaled corticosteroids. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 1998;27(1):90‐93. 

289.  Liacouras CA, Ruchelli E. Eosinophilic esophagitis. Current opinion in pediatrics. 2004;16(5):560‐566. 

181  

290.  Purdy JK, Appelman HD, Golembeski CP, McKenna BJ. Lymphocytic esophagitis: a chronic or recurring pattern of esophagitis resembling allergic contact dermatitis. Am J Clin Pathol. 2008;130(4):508‐513. 

291.  Caviglia R, Ribolsi M, Maggiano N, et al. Dilated intercellular spaces of esophageal epithelium in nonerosive reflux disease patients with physiological esophageal acid exposure. The American journal of gastroenterology. 2005;100(3):543‐548. 

292.  Ravelli A, Villanacci V, Cadei M, Fuoti M, Gennati G, Salemme M. Dilated intercellular spaces in eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2014;59(5):589‐593. 

293.  Mueller S, Neureiter D, Aigner T, Stolte M. Comparison of histological parameters for the diagnosis of eosinophilic oesophagitis versus gastro‐oesophageal reflux disease on oesophageal biopsy material. Histopathology. 2008;53(6):676‐684. 

294.  Orlowski J, Grinstein S. Emerging roles of alkali cation/proton exchangers in organellar homeostasis. Curr Opin Cell Biol. 2007;19(4):483‐492. 

295.  Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA‐seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 2012;7(3):562‐578. 

296.  Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory‐efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 2009;10(3):R25. 

297.  Garber M, Grabherr MG, Guttman M, Trapnell C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA‐seq. Nat Methods. 2011;8(6):469‐477. 

298.  Kartashov AV, Barski A. BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data. Genome Biol. 2015;16:158. 

299.  Chen J, Bardes EE, Aronow BJ, Jegga AG. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Res. 2009;37(Web Server issue):W305‐311. 

300.  Harada H, Nakagawa H, Oyama K, et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16(INK4a) inactivation. Molecular Cancer Research. 2003;1(10):729‐738. 

301.  Schwark JR, Jansen HW, Lang HJ, Krick W, Burckhardt G, Hropot M. S3226, a novel inhibitor of Na+/H+ exchanger subtype 3 in various cell types. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 1998;436(5):797‐800. 

302.  Iovannisci D, Illek B, Fischer H. Function of the HVCN1 proton channel in airway epithelia and a naturally occurring mutation, M91T. J Gen Physiol. 2010;136(1):35‐46. 

303.  Wakabayashi S, Shigekawa M, Pouyssegur J. Molecular physiology of vertebrate Na+/H+ exchangers. Physiol Rev. 1997;77(1):51‐74. 

304.  Liu Y, Munker S, Mullenbach R, Weng HL. IL‐13 Signaling in Liver Fibrogenesis. Front Immunol. 2012;3:116. 

305.  Amin MR, Malakooti J, Sandoval R, Dudeja PK, Ramaswamy K. IFN‐gamma and TNF‐alpha regulate human NHE3 gene expression by modulating the Sp family transcription factors in human intestinal epithelial cell line C2BBe1. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;291(5):C887‐896. 

306.  Clayburgh DR, Musch MW, Leitges M, Fu YX, Turner JR. Coordinated epithelial NHE3 inhibition and barrier dysfunction are required for TNF‐mediated diarrhea in vivo. The Journal of clinical investigation. 2006;116(10):2682‐2694. 

307.  Su HW, Wang SW, Ghishan FK, Kiela PR, Tang MJ. Cell confluency‐induced Stat3 activation regulates NHE3 expression by recruiting Sp1 and Sp3 to the proximal NHE3 promoter region during epithelial dome formation. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;296(1):C13‐24. 

308.  Rochman M, Kartashov AV, Caldwell JM, et al. Neurotrophic tyrosine kinase receptor 1 is a direct transcriptional and epigenetic target of IL‐13 involved in allergic inflammation. Mucosal Immunol. 2015;8(4):785‐798. 

182  

309.  Cho SJ, Kang MJ, Homer RJ, et al. Role of early growth response‐1 (Egr‐1) in interleukin‐13‐induced inflammation and remodeling. J Biol Chem. 2006;281(12):8161‐8168. 

310.  Malakooti J, Sandoval R, Amin MR, Clark J, Dudeja PK, Ramaswamy K. Transcriptional stimulation of the human NHE3 promoter activity by PMA: PKC independence and involvement of the transcription factor EGR‐1. Biochem J. 2006;396(2):327‐336. 

311.  Praetorius J, Andreasen D, Jensen BL, Ainsworth MA, Friis UG, Johansen T. NHE1, NHE2, and NHE3 contribute to regulation of intracellular pH in murine duodenal epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000;278(2):G197‐206. 

312.  Wang Z, Orlowski J, Shull GE. Primary structure and functional expression of a novel gastrointestinal isoform of the rat Na/H exchanger. J Biol Chem. 1993;268(16):11925‐11928. 

313.  Swietach P, Vaughan‐Jones RD, Harris AL, Hulikova A. The chemistry, physiology and pathology of pH in cancer. Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B, Biological sciences. 2014;369(1638):20130099. 

314.  Orlando RC. Esophageal mucosal defense mechanisms. GI Motility online. 2006. 315.  Tobey NA, Gambling TM, Vanegas XC, Carson JL, Orlando RC. Physicochemical basis for dilated 

intercellular spaces in non‐erosive acid‐damaged rabbit esophageal epithelium. Dis Esophagus. 2008;21(8):757‐764. 

316.  Orlando LA, Orlando RC. Dilated intercellular spaces as a marker of GERD. Current gastroenterology reports. 2009;11(3):190‐194. 

317.  Noffsinger AE. Update on esophagitis: controversial and underdiagnosed causes. Arch Pathol Lab Med. 2009;133(7):1087‐1095. 

318.  Barlow WJ, Orlando RC. The pathogenesis of heartburn in nonerosive reflux disease: a unifying hypothesis. Gastroenterology. 2005;128(3):771‐778. 

319.  Collins MH, Martin LJ, Alexander ES, et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Diseases of the esophagus : official journal of the International Society for Diseases of the Esophagus / ISDE. 2017;30(3):1‐8. 

320.  Rodrigo J, Hernandez DJ, Vidal MA, Pedrosa JA. Vegetative innervation of the esophagus III. Intraepithelial endings. Acta Anat. 1975;92:242. 

321.  Pouyssegur J, Franchi A, L'Allemain G, Paris S. Cytoplasmic pH, a key determinant of growth factor‐induced DNA synthesis in quiescent fibroblasts. FEBS Lett. 1985;190(1):115‐119. 

322.  Schelling JR, Abu Jawdeh BG. Regulation of cell survival by Na+/H+ exchanger‐1. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295(3):F625‐632. 

323.  Moolenaar WH, Defize LH, De Laat SW. Ionic signalling by growth factor receptors. J Exp Biol. 1986;124:359‐373. 

324.  Di Sario A, Svegliati Baroni G, Bendia E, et al. Intracellular pH regulation and Na+/H+ exchange activity in human hepatic stellate cells: effect of platelet‐derived growth factor, insulin‐like growth factor 1 and insulin. J Hepatol. 2001;34(3):378‐385. 

325.  Li M, Morley P, Asem EK, Tsang BK. Epidermal growth factor elevates intracellular pH in chicken granulosa cells. Endocrinology. 1991;129(2):656‐662. 

326.  Vairo G, Cocks BG, Cragoe EJ, Jr., Hamilton JA. Selective suppression of growth factor‐induced cell cycle gene expression by Na+/H+ antiport inhibitors. J Biol Chem. 1992;267(27):19043‐19046. 

327.  Putney LK, Barber DL. Na‐H exchange‐dependent increase in intracellular pH times G2/M entry and transition. J Biol Chem. 2003;278(45):44645‐44649. 

328.  Schreiber R. Ca2+ signaling, intracellular pH and cell volume in cell proliferation. J Membr Biol. 2005;205(3):129‐137. 

183  

329.  Shrode LD, Tapper H, Grinstein S. Role of intracellular pH in proliferation, transformation, and apoptosis. J Bioenerg Biomembr. 1997;29(4):393‐399. 

330.  Spencer AG, Labonte ED, Rosenbaum DP, et al. Intestinal inhibition of the Na+/H+ exchanger 3 prevents cardiorenal damage in rats and inhibits Na+ uptake in humans. Sci Transl Med. 2014;6(227):227ra236. 

331.  Papadopoulou A, Koletzko S, Heuschkel R, et al. Management guidelines of eosinophilic esophagitis in childhood. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2014;58(1):107‐118. 

332.  Gupta SK, Fitzgerald JF, Kondratyuk T, HogenEsch H. Cytokine expression in normal and inflamed esophageal mucosa: a study into the pathogenesis of allergic eosinophilic esophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;42(1):22‐26. 

333.  Milner JD, Ward JM, Keane‐Myers A, Paul WE. Lymphopenic mice reconstituted with limited repertoire T cells develop severe, multiorgan, Th2‐associated inflammatory disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(2):576‐581. 

334.  Caldwell JM, Collins MH, Kemme KA, et al. Cadherin 26 is an alpha integrin‐binding epithelial receptor regulated during allergic inflammation. Mucosal Immunol. 2017;10(5):1190‐1201. 

335.  Rochman M, Travers J, Abonia JP, Caldwell JM, Rothenberg ME. Synaptopodin is upregulated by IL‐13 in eosinophilic esophagitis and regulates esophageal epithelial cell motility and barrier integrity. JCI Insight. 2017;2(20). 

336.  Bhattacharjee A, Shukla M, Yakubenko VP, Mulya A, Kundu S, Cathcart MK. IL‐4 and IL‐13 employ discrete signaling pathways for target gene expression in alternatively activated monocytes/macrophages. Free Radic Biol Med. 2013;54:1‐16. 

337.  Bhattacharjee A, Pal S, Feldman GM, Cathcart MK. Hck is a key regulator of gene expression in alternatively activated human monocytes. J Biol Chem. 2011;286(42):36709‐36723. 

338.  Tomkinson A, Duez C, Lahn M, Gelfand EW. Adoptive transfer of T cells induces airway hyperresponsiveness independently of airway eosinophilia but in a signal transducer and activator of transcription 6‐dependent manner. J Allergy Clin Immunol. 2002;109(5):810‐816. 

339.  Stokes K, LaMarche NM, Islam N, Wood A, Huang W, August A. Cutting edge: STAT6 signaling in eosinophils is necessary for development of allergic airway inflammation. J Immunol. 2015;194(6):2477‐2481. 

340.  Kuperman DA, Huang X, Koth LL, et al. Direct effects of interleukin‐13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 2002;8(8):885‐889. 

341.  Yun JH, Park SW, Kim KJ, et al. Endothelial STAT3 Activation Increases Vascular Leakage Through Downregulating Tight Junction Proteins: Implications for Diabetic Retinopathy. J Cell Physiol. 2017;232(5):1123‐1134. 

342.  Wu R, Sun S, Steinberg BM. Requirement of STAT3 activation for differentiation of mucosal stratified squamous epithelium. Mol Med. 2003;9(3‐4):77‐84. 

343.  Sherry MM, Reeves A, Wu JK, Cochran BH. STAT3 is required for proliferation and maintenance of multipotency in glioblastoma stem cells. Stem Cells. 2009;27(10):2383‐2392. 

344.  Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 2009;37(1):1‐13. 

345.  Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 2009;4(1):44‐57. 

346.  Harada H, Nakagawa H, Oyama K, et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol Cancer Res. 2003;1(10):729‐738. 

347.  Barski A, Cuddapah S, Cui K, et al. High‐resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 2007;129(4):823‐837. 

348.  Shao Z, Zhang Y, Yuan GC, Orkin SH, Waxman DJ. MAnorm: a robust model for quantitative comparison of ChIP‐Seq data sets. Genome Biol. 2012;13(3):R16. 

184  

349.  Noah TK, Kazanjian A, Whitsett J, Shroyer NF. SAM pointed domain ETS factor (SPDEF) regulates terminal differentiation and maturation of intestinal goblet cells. Exp Cell Res. 2010;316(3):452‐465. 

350.  Kc K, Rothenberg ME, Sherrill JD. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 2015;10(6):e0127755. 

351.  Calo E, Wysocka J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol Cell. 2013;49(5):825‐837. 

352.  Yang M, Hogan SP, Henry PJ, et al. Interleukin‐13 mediates airways hyperreactivity through the IL‐4 receptor‐alpha chain and STAT‐6 independently of IL‐5 and eotaxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 2001;25(4):522‐530. 

353.  Neilsen CV, Bryce PJ. Interleukin‐13 directly promotes oesophagus production of CCL11 and CCL24 and the migration of eosinophils. Clin Exp Allergy. 2010;40(3):427‐434. 

354.  Suzaki I, Kawano S, Komiya K, et al. Inhibition of IL‐13‐induced periostin in airway epithelium attenuates cellular protein expression of MUC5AC. Respirology. 2017;22(1):93‐100. 

355.  Geletu M, Arulanandam R, Greer S, Trotman‐Grant A, Tomai E, Raptis L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 2012;12:605. 

356.  Nithya S, Radhika T, Jeddy N. Loricrin ‐ an overview. J Oral Maxillofac Pathol. 2015;19(1):64‐68. 357.  Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WH. Filaggrin in the frontline: role in skin barrier 

function and disease. J Cell Sci. 2009;122(Pt 9):1285‐1294. 358.  Bangsow T, Baumann E, Bangsow C, et al. The epithelial membrane protein 1 is a novel tight 

junction protein of the blood‐brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 2008;28(6):1249‐1260. 359.  Ryu WI, Lee H, Bae HC, Ryu HJ, Son SW. IL‐33 down‐regulates filaggrin expression by inducing 

STAT3 and ERK phosphorylation in human keratinocytes. J Dermatol Sci. 2016;82(2):131‐134. 360.  Zhao M, Jiang B, Gao FH. Small molecule inhibitors of STAT3 for cancer therapy. Curr Med Chem. 

2011;18(26):4012‐4018. 361.  Wong ALA, Hirpara JL, Pervaiz S, Eu JQ, Sethi G, Goh BC. Do STAT3 inhibitors have potential in 

the future for cancer therapy? Expert Opin Investig Drugs. 2017;26(8):883‐887. 362.  Grivennikov S, Karin E, Terzic J, et al. IL‐6 and Stat3 are required for survival of intestinal 

epithelial cells and development of colitis‐associated cancer. Cancer Cell. 2009;15(2):103‐113. 363.  Ara T, Song L, Shimada H, et al. Interleukin‐6 in the bone marrow microenvironment promotes 

the growth and survival of neuroblastoma cells. Cancer Res. 2009;69(1):329‐337. 364.  Kanda N, Seno H, Konda Y, et al. STAT3 is constitutively activated and supports cell survival in 

association with survivin expression in gastric cancer cells. Oncogene. 2004;23(28):4921‐4929. 365.  Yu H, Pardoll D, Jove R. STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3. 

Nat Rev Cancer. 2009;9(11):798‐809. 366.  Avalle L, Regis G, Poli V. Universal and Specific Functions of STAT3 in Solid Tumours. In: Decker T, 

Müller M, eds. Jak‐Stat Signaling : From Basics to Disease. Vienna: Springer Vienna; 2012:305‐333. 

367.  Zhou C, Ma J, Su M, et al. Down‐regulation of STAT3 induces the apoptosis and G1 cell cycle arrest in esophageal carcinoma ECA109 cells. Cancer Cell Int. 2018;18:53. 

368.  Ramos‐Solano M, Meza‐Canales ID, Torres‐Reyes LA, et al. Expression of WNT genes in cervical cancer‐derived cells: Implication of WNT7A in cell proliferation and migration. Exp Cell Res. 2015;335(1):39‐50. 

369.  Machado‐Neto JA, Favaro P, Lazarini M, Costa FF, Olalla Saad ST, Traina F. Knockdown of insulin receptor substrate 1 reduces proliferation and downregulates Akt/mTOR and MAPK pathways in K562 cells. Biochim Biophys Acta. 2011;1813(8):1404‐1411. 

185  

370.  Liu RY, Zeng Y, Lei Z, et al. JAK/STAT3 signaling is required for TGF‐beta‐induced epithelial‐mesenchymal transition in lung cancer cells. Int J Oncol. 2014;44(5):1643‐1651. 

371.  Yong PF, Freeman AF, Engelhardt KR, Holland S, Puck JM, Grimbacher B. An update on the hyper‐IgE syndromes. Arthritis Res Ther. 2012;14(6):228. 

372.  Siegel AM, Stone KD, Cruse G, et al. Diminished allergic disease in patients with STAT3 mutations reveals a role for STAT3 signaling in mast cell degranulation. J Allergy Clin Immunol. 2013;132(6):1388‐1396. 

373.  Fredholm S, Gjerdrum LM, Willerslev‐Olsen A, et al. STAT3 activation and infiltration of eosinophil granulocytes in mycosis fungoides. Anticancer Res. 2014;34(10):5277‐5286. 

374.  Stout BA, Bates ME, Liu LY, Farrington NN, Bertics PJ. IL‐5 and granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor activate STAT3 and STAT5 and promote Pim‐1 and cyclin D3 protein expression in human eosinophils. J Immunol. 2004;173(10):6409‐6417. 

375.  Siveen KS, Sikka S, Surana R, et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochim Biophys Acta. 2014;1845(2):136‐154. 

376.  Redell MS, Ruiz MJ, Alonzo TA, Gerbing RB, Tweardy DJ. Stat3 signaling in acute myeloid leukemia: ligand‐dependent and ‐independent activation and induction of apoptosis by a novel small‐molecule Stat3 inhibitor. Blood. 2011;117(21):5701‐5709. 

377.  Bharadwaj U, Eckols TK, Xu X, et al. Small‐molecule inhibition of STAT3 in radioresistant head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(18):26307‐26330. 

378.  Jung KH, Yoo W, Stevenson HL, et al. Multifunctional Effects of a Small‐Molecule STAT3 Inhibitor on NASH and Hepatocellular Carcinoma in Mice. Clin Cancer Res. 2017;23(18):5537‐5546. 

379.  Akimoto T, Numata F, Tamura M, et al. Abrogation of bronchial eosinophilic inflammation and airway hyperreactivity in signal transducers and activators of transcription (STAT)6‐deficient mice. J Exp Med. 1998;187(9):1537‐1542. 

380.  Tomkinson A, Kanehiro A, Rabinovitch N, Joetham A, Cieslewicz G, Gelfand EW. The failure of STAT6‐deficient mice to develop airway eosinophilia and airway hyperresponsiveness is overcome by interleukin‐5. Am J Respir Crit Care Med. 1999;160(4):1283‐1291. 

381.  Miyata S, Matsuyama T, Kodama T, et al. STAT6 deficiency in a mouse model of allergen‐induced airways inflammation abolishes eosinophilia but induces infiltration of CD8+ T cells. Clin Exp Allergy. 1999;29(1):114‐123. 

382.  Mathew A, MacLean JA, DeHaan E, Tager AM, Green FH, Luster AD. Signal transducer and activator of transcription 6 controls chemokine production and T helper cell type 2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. J Exp Med. 2001;193(9):1087‐1096. 

383.  Gleeson D. Acid‐base transport systems in gastrointestinal epithelia. Gut. 1992;33(8):1134‐1145. 384.  Shull GE, Miller ML, Schultheis PJ. Lessons from genetically engineered animal models VIII. 

Absorption and secretion of ions in the gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000;278(2):G185‐190. 

385.  Matsuo K, Palmer JB. Anatomy and physiology of feeding and swallowing: normal and abnormal. Phys Med Rehabil Clin N Am. 2008;19(4):691‐707, vii. 

386.  E. Diamant N. Pathophysiology of gastroesophageal reflux disease. 2006. 387.  Siddique I, Khan I. Regulation of Na/H exchanger‐1 in gastroesophageal reflux disease: possible 

interaction of histamine receptor. Dig Dis Sci. 2003;48(9):1832‐1838. 388.  Orlando RC. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive 

mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2010;24(6):873‐882. 389.  Dalby K, Nielsen RG, Kruse‐Andersen S, Fenger C, Durup J, Husby S. Gastroesophageal reflux 

disease and eosinophilic esophagitis in infants and children. A study of esophageal pH, multiple intraluminal impedance and endoscopic ultrasound. Scand J Gastroenterol. 2010;45(9):1029‐1035. 

186  

390.  Nurko S, Rosen R. Esophageal dysmotility in patients who have eosinophilic esophagitis. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2008;18(1):73‐89; ix. 

391.  Rosen R, Furuta G, Fritz J, Donovan K, Nurko S. Role of acid and nonacid reflux in children with eosinophilic esophagitis compared with patients with gastroesophageal reflux and control patients. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008;46(5):520‐523. 

392.  Romero MF, Chen AP, Parker MD, Boron WF. The SLC4 family of bicarbonate (HCO(3)(‐)) transporters. Mol Aspects Med. 2013;34(2‐3):159‐182. 

393.  Royaux IE, Wall SM, Karniski LP, et al. Pendrin, encoded by the Pendred syndrome gene, resides in the apical region of renal intercalated cells and mediates bicarbonate secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(7):4221‐4226. 

394.  Dossena S, Rodighiero S, Vezzoli V, et al. Functional characterization of wild‐type and mutated pendrin (SLC26A4), the anion transporter involved in Pendred syndrome. J Mol Endocrinol. 2009;43(3):93‐103. 

395.  Rajan J, Newbury RO, Anilkumar A, Dohil R, Broide DH, Aceves SS. Long‐term assessment of esophageal remodeling in patients with pediatric eosinophilic esophagitis treated with topical corticosteroids. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):147‐156 e148. 

396.  He M, Ye W, Wang WJ, Sison ES, Jan YN, Jan LY. Cytoplasmic Cl(‐) couples membrane remodeling to epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(52):E11161‐E11169. 

397.  Pedersen SF. The Na+/H+ exchanger NHE1 in stress‐induced signal transduction: implications for cell proliferation and cell death. Pflugers Arch. 2006;452(3):249‐259. 

398.  Casey JR, Grinstein S, Orlowski J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(1):50‐61. 

399.  Parfitt JR, Gregor JC, Suskin NG, Jawa HA, Driman DK. Eosinophilic esophagitis in adults: distinguishing features from gastroesophageal reflux disease: a study of 41 patients. Mod Pathol. 2006;19(1):90‐96. 

400.  Bischof G, Cosentini E, Hamilton G, et al. Effects of extracellular pH on intracellular pH‐regulation and growth in a human colon carcinoma cell‐line. Biochim Biophys Acta. 1996;1282(1):131‐139. 

401.  Choi SY, Collins CC, Gout PW, Wang Y. Cancer‐generated lactic acid: a regulatory, immunosuppressive metabolite? J Pathol. 2013;230(4):350‐355. 

402.  Zhang ZX, Gan I, Pavlosky A, Huang X, Fuhrmann B, Jevnikar AM. Intracellular pH Regulates TRAIL‐Induced Apoptosis and Necroptosis in Endothelial Cells. J Immunol Res. 2017;2017:1503960. 

403.  Lagadic‐Gossmann D, Huc L, Lecureur V. Alterations of intracellular pH homeostasis in apoptosis: origins and roles. Cell Death Differ. 2004;11(9):953‐961. 

404.  Izumi H, Torigoe T, Ishiguchi H, et al. Cellular pH regulators: potentially promising molecular targets for cancer chemotherapy. Cancer Treat Rev. 2003;29(6):541‐549. 

405.  Spugnini EP, Sonveaux P, Stock C, et al. Proton channels and exchangers in cancer. Biochim Biophys Acta. 2015;1848(10 Pt B):2715‐2726. 

406.  Garcia CK, Goldstein JL, Pathak RK, Anderson RG, Brown MS. Molecular characterization of a membrane transporter for lactate, pyruvate, and other monocarboxylates: implications for the Cori cycle. Cell. 1994;76(5):865‐873. 

407.  Iwanaga T, Takebe K, Kato I, Karaki S, Kuwahara A. Cellular expression of monocarboxylate transporters (MCT) in the digestive tract of the mouse, rat, and humans, with special reference to slc5a8. Biomed Res. 2006;27(5):243‐254. 

408.  Huhta H, Helminen O, Palomaki S, et al. Intratumoral lactate metabolism in Barrett's esophagus and adenocarcinoma. Oncotarget. 2017;8(14):22894‐22902. 

187  

409.  Zhu J, Wu YN, Zhang W, et al. Monocarboxylate transporter 4 facilitates cell proliferation and migration and is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. PLoS One. 2014;9(1):e87904. 

410.  Takada T, Takata K, Ashihara E. Inhibition of monocarboxylate transporter 1 suppresses the proliferation of glioblastoma stem cells. J Physiol Sci. 2016;66(5):387‐396. 

411.  Pinheiro C, Longatto‐Filho A, Azevedo‐Silva J, Casal M, Schmitt FC, Baltazar F. Role of monocarboxylate transporters in human cancers: state of the art. J Bioenerg Biomembr. 2012;44(1):127‐139. 

412.  Ates F, Yuksel ES, Higginbotham T, et al. Mucosal impedance discriminates GERD from non‐GERD conditions. Gastroenterology. 2015;148(2):334‐343. 

413.  Hsu LW, Ho YC, Chuang EY, et al. Effects of pH on molecular mechanisms of chitosan‐integrin interactions and resulting tight‐junction disruptions. Biomaterials. 2013;34(3):784‐793. 

414.  Donowitz M, Mohan S, Zhu CX, et al. NHE3 regulatory complexes. J Exp Biol. 2009;212(Pt 11):1638‐1646. 

415.  Fenton RA, Poulsen SB, de la Mora Chavez S, Soleimani M, Dominguez Rieg JA, Rieg T. Renal tubular NHE3 is required in the maintenance of water and sodium chloride homeostasis. Kidney Int. 2017;92(2):397‐414. 

416.  Siddique I, Hasan F, Khan I. Suppression of Na+/H+ exchanger isoform‐3 in human inflammatory bowel disease: lack of reversal by 5'‐aminosalicylate treatment. Scand J Gastroenterol. 2009;44(1):56‐64. 

417.  Janecke AR, Heinz‐Erian P, Yin J, et al. Reduced sodium/proton exchanger NHE3 activity causes congenital sodium diarrhea. Hum Mol Genet. 2015;24(23):6614‐6623. 

418.  Nemeth ZH, Bogdanovski DA, Barratt‐Stopper P, Paglinco SR, Antonioli L, Rolandelli RH. Crohn's Disease and Ulcerative Colitis Show Unique Cytokine Profiles. Cureus. 2017;9(4):e1177. 

419.  Shah SA. Aberrant mucosal cytokines: the key to the pathogenesis of IBD? Inflamm Bowel Dis. 1999;5(2):146‐147. 

420.  Gens JS, Du H, Tackett L, Kong SS, Chu S, Montrose MH. Different ionic conditions prompt NHE2 and NHE3 translocation to the plasma membrane. Biochim Biophys Acta. 2007;1768(5):1023‐1035. 

421.  Zhao H, Shiue H, Palkon S, et al. Ezrin regulates NHE3 translocation and activation after Na+‐glucose cotransport. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(25):9485‐9490. 

422.  Babich V, Di Sole F. The Na+/H+ Exchanger‐3 (NHE3) Activity Requires Ezrin Binding to Phosphoinositide and Its Phosphorylation. PLoS One. 2015;10(6):e0129306. 

423.  No YR, He P, Yoo BK, Yun CC. Regulation of NHE3 by lysophosphatidic acid is mediated by phosphorylation of NHE3 by RSK2. Am J Physiol Cell Physiol. 2015;309(1):C14‐21. 

424.  Panchapakesan U, Pollock C, Saad S. Renal epidermal growth factor receptor: its role in sodium and water homeostasis in diabetic nephropathy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011;38(2):84‐88. 

425.  Powell DW, Morris SM, Boyd DD. Water and electrolyte transport by rabbit esophagus. The American journal of physiology. 1975;229(2):438‐443. 

426.  Myerburg MM, Harvey PR, Heidrich EM, Pilewski JM, Butterworth MB. Acute regulation of the epithelial sodium channel in airway epithelia by proteases and trafficking. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6):712‐719. 

427.  Kato A, Romero MF. Regulation of electroneutral NaCl absorption by the small intestine. Annu Rev Physiol. 2011;73:261‐281. 

428.  Orlando RC, Powell DW, Carney CN. Pathophysiology of acute acid injury in rabbit esophageal epithelium. The Journal of clinical investigation. 1981;68(1):286‐293. 

429.  Long JD, Marten E, Tobey NA, Orlando RC. Effects of luminal hypertonicity on rabbit esophageal epithelium. The American journal of physiology. 1997;273(3 Pt 1):G647‐654. 

188  

430.  Ellison DH, Velazquez H, Wright FS. Mechanisms of sodium, potassium and chloride transport by the renal distal tubule. Miner Electrolyte Metab. 1987;13(6):422‐432. 

431.  Zhao Y, Gao P, Sun F, et al. Sodium Intake Regulates Glucose Homeostasis through the PPARdelta/Adiponectin‐Mediated SGLT2 Pathway. Cell Metab. 2016;23(4):699‐711. 

432.  Bove M, Vieth M, Dombrowski F, Ny L, Ruth M, Lundell L. Acid challenge to the human esophageal mucosa: effects on epithelial architecture in health and disease. Dig Dis Sci. 2005;50(8):1488‐1496. 

433.  Sant'Anna AM, Rolland S, Fournet JC, Yazbeck S, Drouin E. Eosinophilic Esophagitis in Children: Symptoms, Histology and pH Probe Results. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition. 2004;39(4):373‐377. 

434.  Marietta EV, Geno DM, Smyrk TC, et al. Presence of intraepithelial food antigen in patients with active eosinophilic oesophagitis. Aliment Pharmacol Ther. 2017;45(3):427‐433. 

435.  Carrasco A, Machado RS, Patricio F, Kawakami E. Histological Features of Eosinophilic Esophagitis in Children and Adolescents. Arq Gastroenterol. 2017;54(4):281‐285. 

436.  Fitzgerald RC, Omary MB, Triadafilopoulos G. Altered sodium‐hydrogen exchange activity is a mechanism for acid‐induced hyperproliferation in Barrett's esophagus. Am J Physiol. 1998;275(1 Pt 1):G47‐55. 

437.  Bose U, Rauch C, Allegrucci C, Tufarelli C, Khan RN. Evaluation of the role of pH in cancer cell proliferation. Frontiers in Pharmacology. 

438.  Shirmanova MV, Druzhkova IN, Lukina MM, et al. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Sci Rep. 2017;7(1):8911. 

439.  Hu X, Chao M, Wu H. Central role of lactate and proton in cancer cell resistance to glucose deprivation and its clinical translation. Signal Transduct Target Ther. 2017;2:16047. 

440.  Feng S, Zheng Z, Feng L, et al. Proton pump inhibitor pantoprazole inhibits the proliferation, selfrenewal and chemoresistance of gastric cancer stem cells via the EMT/betacatenin pathways. Oncol Rep. 2016;36(6):3207‐3214. 

441.  Woo AL, Gildea LA, Tack LM, et al. In vivo evidence for interferon‐gamma‐mediated homeostatic mechanisms in small intestine of the NHE3 Na+/H+ exchanger knockout model of congenital diarrhea. J Biol Chem. 2002;277(50):49036‐49046. 

442.  Laubitz D, Larmonier CB, Bai A, et al. Colonic gene expression profile in NHE3‐deficient mice: evidence for spontaneous distal colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2008;295(1):G63‐G77. 

443.  Kiela PR, Laubitz D, Larmonier CB, et al. Changes in mucosal homeostasis predispose NHE3 knockout mice to increased susceptibility to DSS‐induced epithelial injury. Gastroenterology. 2009;137(3):965‐975, 975 e961‐910. 

444.  Pastorelli L, De Salvo C, Mercado JR, Vecchi M, Pizarro TT. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 2013;4:280. 

445.  Guarino MP, Cicala M, Behar J. Eosinophilic esophagitis: New insights in pathogenesis and therapy. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 2016;7(1):66‐77. 

446.  Schindler C, Levy DE, Decker T. JAK‐STAT signaling: from interferons to cytokines. J Biol Chem. 2007;282(28):20059‐20063. 

447.  Rawlings JS, Rosler KM, Harrison DA. The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci. 2004;117(Pt 8):1281‐1283. 

448.  Ehret GB, Reichenbach P, Schindler U, et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J Biol Chem. 2001;276(9):6675‐6688. 

189  

449.  Pfitzner E, Kliem S, Baus D, Litterst CM. The role of STATs in inflammation and inflammatory diseases. Curr Pharm Des. 2004;10(23):2839‐2850. 

450.  Lodige I, Marg A, Wiesner B, Malecova B, Oelgeschlager T, Vinkemeier U. Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors. J Biol Chem. 2005;280(52):43087‐43099. 

451.  Kaplan MH, Sehra S, Chang HC, O'Malley JT, Mathur AN, Bruns HA. Constitutively active STAT6 predisposes toward a lymphoproliferative disorder. Blood. 2007;110(13):4367‐4369. 

452.  Hattori H, Rosas LE, Okano M, Durbin JE, Nishizaki K, Satoskar AR. STAT1 is involved in the pathogenesis of murine allergic rhinitis. Am J Rhinol. 2007;21(2):241‐247. 

453.  Simeone‐Penney MC, Severgnini M, Tu P, et al. Airway epithelial STAT3 is required for allergic inflammation in a murine model of asthma. J Immunol. 2007;178(10):6191‐6199. 

454.  Chapoval SP, Dasgupta P, Smith EP, et al. STAT6 expression in multiple cell types mediates the cooperative development of allergic airway disease. J Immunol. 2011;186(4):2571‐2583. 

455.  Kuperman D, Schofield B, Wills‐Karp M, Grusby MJ. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6)‐deficient mice are protected from antigen‐induced airway hyperresponsiveness and mucus production. J Exp Med. 1998;187(6):939‐948. 

456.  Rosen MJ, Frey MR, Washington MK, et al. STAT6 activation in ulcerative colitis: a new target for prevention of IL‐13‐induced colon epithelial cell dysfunction. Inflamm Bowel Dis. 2011;17(11):2224‐2234. 

457.  Tak PP, Firestein GS. NF‐kappaB: a key role in inflammatory diseases. J Clin Invest. 2001;107(1):7‐11. 

458.  Grivennikov SI, Karin M. Dangerous liaisons: STAT3 and NF‐kappaB collaboration and crosstalk in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(1):11‐19. 

459.  Akira S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 1999;17(3):138‐146. 

460.  Erlich TH, Yagil Z, Kay G, et al. Mitochondrial STAT3 plays a major role in IgE‐antigen‐mediated mast cell exocytosis. J Allergy Clin Immunol. 2014;134(2):460‐469. 

461.  Qin S, Wang X, Wu H, et al. Cell‐based phenotypic screening of mast cell degranulation unveils kinetic perturbations of agents targeting phosphorylation. Sci Rep. 2016;6:31320. 

462.  Stritesky GL, Muthukrishnan R, Sehra S, et al. The transcription factor STAT3 is required for T helper 2 cell development. Immunity. 2011;34(1):39‐49. 

463.  Garcia‐Hernandez V, Flores‐Maldonado C, Rincon‐Heredia R, et al. EGF regulates claudin‐2 and ‐4 expression through Src and STAT3 in MDCK cells. J Cell Physiol. 2015;230(1):105‐115. 

464.  Howell MD, Kim BE, Gao P, et al. Cytokine modulation of atopic dermatitis filaggrin skin expression. J Allergy Clin Immunol. 2009;124(3 Suppl 2):R7‐R12. 

465.  Omori‐Miyake M, Yamashita M, Tsunemi Y, Kawashima M, Yagi J. In vitro assessment of IL‐4‐ or IL‐13‐mediated changes in the structural components of keratinocytes in mice and humans. J Invest Dermatol. 2014;134(5):1342‐1350. 

466.  Hsueh YJ, Chen HC, Chu WK, et al. STAT3 regulates the proliferation and differentiation of rabbit limbal epithelial cells via a DeltaNp63‐dependent mechanism. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52(7):4685‐4693. 

467.  Bollrath J, Phesse TJ, von Burstin VA, et al. gp130‐mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell‐cycle progression during colitis‐associated tumorigenesis. Cancer Cell. 2009;15(2):91‐102. 

468.  Mahadevappa CP, Venkateshaiah SU, Manohar M, Mishra A. CXCR4/SDF‐1 Axis Promotes EMT Mediated Fibrosis in Eosinophilic Esophagitis (EoE). Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2016;137(2):AB228. 

190  

469.  Li B, Huang C. Regulation of EMT by STAT3 in gastrointestinal cancer (Review). Int J Oncol. 2017;50(3):753‐767. 

470.  Pfeiffer M, Hartmann TN, Leick M, Catusse J, Schmitt‐Graeff A, Burger M. Alternative implication of CXCR4 in JAK2/STAT3 activation in small cell lung cancer. Br J Cancer. 2009;100(12):1949‐1956. 

471.  Li YY, Li H, Liu ZL, et al. Activation of STAT3‐mediated CXCL12 up‐regulation in the dorsal root ganglion contributes to oxaliplatin‐induced chronic pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917747425. 

472.  Liu X, Xiao Q, Bai X, et al. Activation of STAT3 is involved in malignancy mediated by CXCL12‐CXCR4 signaling in human breast cancer. Oncol Rep. 2014;32(6):2760‐2768. 

473.  Khaled WT, Read EK, Nicholson SE, et al. The IL‐4/IL‐13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development. Development. 2007;134(15):2739‐2750. 

474.  Zhu J, Guo L, Watson CJ, Hu‐Li J, Paul WE. Stat6 is necessary and sufficient for IL‐4's role in Th2 differentiation and cell expansion. J Immunol. 2001;166(12):7276‐7281. 

475.  Wang Y, Evans JT, Rodriguez F, et al. A tale of two STAT6 knock out mice in the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2009;206(1‐2):76‐85. 

476.  Zhang X, Cheng E, Huo X, et al. Omeprazole blocks STAT6 binding to the eotaxin‐3 promoter in eosinophilic esophagitis cells. PLoS One. 2012;7(11):e50037. 

477.  Goenka S, Kaplan MH. Transcriptional regulation by STAT6. Immunol Res. 2011;50(1):87‐96.