Reactivo lab 4 copia

Universidad Autónoma de Chiriquí (UNACHI)Escuela de Biología

Curso de Bioquímica general (QM 332)Determinación de la temperatura y pH la alfa – amilasa

Marieth Quintero & Carol Gantes

Resumen

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en lasaliva humana y cataliza la degradación del almidón, que esun polisacárido de reserva vegetal.En determinación del efecto de la temperatura, se midió laactividad enzimática incubando la reacción a temperaturasdiferentes de 37 °C a 50 °C, a temperatura ambiente, bajo 0°C y a 80 °C. Se alcanza la máxima actividad y, por tanto,corresponde a la temperatura óptima de reacción, 80 °C lacual dejo de reaccionar pasado los 35 minutos, en cuanto alpH realizamos medidas de actividad en un rango de pH entre4.9 ,6.8 y 8.9 a una temperatura de 37 °C donde seobservó una mayor actividad enzimática en la muestra con pH8.9 la cual dejo de reaccionar a los 4 minutos.

Palabras clave: amilasa, temperatura, pH, enzimas.

Objetivos:

Determinar la temperatura óptima para la reacción

entre el almidón y la alfa - amilasa.

Determinar el pH óptimo para la acción de la alfa -

amilasa sobre el almidón.

Aplicar un método calorimétrico a la determinación de

parámetros enzimáticos.

Marco Teórico

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en lasaliva humana y cataliza la degradación del almidón, que esun polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formadopor dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina,




ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma porcadenas lineales de glucosas unidas por enlaces α- C1-C4,mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimosenlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas.La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa comoen la amilopectina, dejando dextrinas lineales yramificadas (oligosacáridos) como productos. (Conn y Stumpf1992)

Para comprender los principios y las ventajas de lasuplementación de enzimas, es necesario observarestrechamente los factores envueltos: el substrato, lostipos y acciones de las enzimas y las propiedades que daráeste agregado enzimático a los productos finales. La enzimaalfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo yabunda más en aquel que ha sido parcialmente germinado. La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal(amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón,rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formaruna mezcla de dextrinas; por ello se la conoce comoenzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina,eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con pocaproducción de maltosa.

Por su acción, el alfa-amilasa provee de fragmentos menoresque pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. Laenzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej.,cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y sevuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0 Â°C por 15 min.El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de6,5 para el alfa-amilasa bacteriana y pancreática. Laenzima es resistente al calor, pues a 70 Â°C conserva un70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos ygelatinizados.

Materiales y reactivos




Materiales

Materiales Capacidad CantidadSistema baño maría ----- 2Tubos de ensayo ----- 3

Vasos químico 250 ml y 100 mL 2Balanza ----- 1Probeta 10 mL 1Policial ----- 1Plancha ----- 1Termometro ----- 1

Reactivos

Reactivo Propiedades físicas, químicas y toxicidad.Amortiguador deFosfato desodio

No tóxico, anticorrosivo. No presenta ningunapeligrosidad para la salud significativa. Áreas dela colada del contacto con agua.

Solución de almidón

Fórmula química: (C6H10O5)nNo se considera que represente un riesgosignificativo en las condiciones previstas deuso normal.

Alfa amilasa diluida

Puede formar concentraciones de polvocombustible en el aire. Puede provocar síntomasde alergia o asma o dificultades respiratoriasen caso de inhalación. Puede provocar unareacción alérgica en la piel.

Hidróxido de Sodio 2M

FORMULA: NaOH.El NaOH es extremadamente corrosivo a los ojospor lo que las salpicaduras son muy peligrosas,pueden provocar desde una gran irritación en lacórnea, ulceración, nubosidades y, finalmente,su desintegración. En casos más severos puedehaber ceguera permanente, por lo que losprimeros auxilios inmediatos son vitales.




Procedimiento

1. Determinación de la temperatura óptima:

2. Determinación del pH optimo:

Prep

are

los

sigu

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co

n la

s so

luci

ones

in

dica

da

Almidon 2.5 mL+ amortiguador pH: 6.8 / 1.0 mL + NaCL0.5 mL + 10 gotas de la enzima.

Deje en reposo los tubos por 10 minutos a 37 °C. Cuando agrega la enzima.

Incubar Tubo: 1. 1.37 °C . 2. 50 °C. 3. 80°C 4. Ambiente 5. Baño maria (hielo).. Disolución salival 1:9, Ensayar Rx. Una gota de lugol por excuvadora. Seguir la reacción hasta la coloración.

Analice los resultados obtenidos




Resultados

Cuadro 1. Determinación de la temperatura óptima.

Tubo

Lugol

1 2 3 4 5

Temperatur

a37°C 50 °C 80°C Ambiente Baño maría

(hielo)

segundos 3 1 35 1 4

En 3 tubos de ensayo

A l m i d ó n 2 . 5 m La m o r t i g u a d o r p HN a C l 0 . 5 m LE n z i m a 1 m L s a l i v a + 9 m L a g u a

Reposo los tubos por 10 minutos a 37 °C

t u b o # 1 , 1 0 g o t a s d e N a O H 2 M R E P E T I R a m o r t i g u a d o r a p H 5 . 8 , 6 . 8 y 7 . 8




Cuadro 2. Determinación del pH optimo:

Tubo 1 2 3

pH 4.9 6.8 8.9

Segundo 2 1 4




Discusión

1. Determinación de la temperatura óptima.

Una enzima posee lo que se conoce como temperatura óptimaque es donde se observa la máxima actividad enzimática,Para la Amilasa es de 37 ºC (porque en la boca y en lasglándulas salivales están a esa temperatura). Por sobreesta temperatura la enzima se desnaturaliza.

La temperatura a la cual se alcanza la máxima actividad y,por tanto, corresponde a la temperatura óptima de reacción,es 80 °C. Cuando se sobrepasa este valor, la actividaddisminuye rápidamente porque la enzima se vadesnaturalizando observamos en el tubo 3 a temperatura 80°C y que a los 35 minutos deja de reaccionar.

Al disminuir demasiado la temperatura como en el caso deltubo 5, los choques entre las moléculas disminuyen también,

Fig. 1. Resultados: Determinación de la temperatura y pH optimo en segundos de reacción. A - D. Temperatura. E – F. pH.




por lo que la actividad enzimática baja hasta el punto deno reaccionar. Por el contrario, al aumentar la temperaturade incubación a 80 °C (tubo 3), los choques entre lasmoléculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima seva a desnaturalizar.

En el caso de la temperatura 37 °C dejo de reaccionar a los3 segundos se observa la máxima actividad enzimática quepara esta enzima es de 37ºC (tubo1). Además podemosobservar que en la temperatura de 50 °C decreciórápidamente ya que arriba de los 45 ºC la desnaturalizaciónpredomina sobre la activación y a más de 55 ºC se destruyela función catalítica dejando de reaccionar a 1 minuto(tubo 2). De igual manera esto sucede en la temperaturaambiente (4)

Determinación del pH optimo

El pH óptimo de la enzima se determinado realizando medidasde actividad en un rango de pH entre 4.9 ,6.8 y 8.9 a unatemperatura de 37 °C. Para establecer el efecto del pHsobre la estabilidad de dicha enzima donde observamos quemostró máxima actividad en el pH 8.9, esto se debe a queel pH óptimo del alfa-amilasa (la enzima presente en lasaliva que hidroliza el almidón), es pH 7 y presenta sumayor actividad.

El alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden serutilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como cloruro de sodio. Essensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH3,3.




Conclusión

A mayor temperatura, se acelera la reacción catabólicade degradación del almidón por la amilasa saliva.(tubo 3)

La amilasa al ser una enzima posee lo que se conocecomo temperatura óptima que es donde se observa lamáxima actividad enzimática.

La enzima amilasa funcionará de manera óptima a latemperatura normal de su portador y su actividaddisminuirá a medida que su temperatura se aleje de eseparámetro. (tubo 4)

Todas las enzimas tienen un pH óptimo, en donde tienenmayor actividad, y a medida que se alejan de ese pH(para ambos lados) disminuyen su actividad. (tubo 3)

En el tratamiento del efecto de la temperatura, semidió la actividad enzimática incubando la reacción atemperaturas diferentes de 37° C: a 50° C, atemperatura ambiente, bajo 0° C y a 80° C.

Cuando la actividad de la enzima fue ensayada condiferentes valores de pH, la máxima actividad seobtuvo con pH 8.9.

La amilasa son proteínas y bajo las condicionesinadecuadas pueden desnaturalizarse o desactivarse.Ante un pH bajo la alfa-amilasa se desnaturaliza




(pierde su conformación donde esto se observa a pH4.9), mientras que con un pH alcalino se inactiva.

Bibliografía

El efecto de la temperatura sobre la actividad de laamilasa. Disponible en:http://www.ehowenespanol.com/efecto-temperatura-actividad-amilasa-info_490898/. Consultado el: 5 de mayo de 2015.

Purificación y caracterización de α-amilasa. Disponible en:http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/rcolquim/article/view/13396/36547 .Consultado el: 5 de mayo de 2015.

CONN. EE y STUMPF. Bioquímica Fundamental. Segunda Edición.Editorial Limusa- Wiley S.A. 1992.

http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/rcolquim/article/view/13396/36547

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