UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ALLISON JOSÉ PIRES

VIAS DE SINALIZAÇÃO DE MAPK’s (Mitogen – ActivatedProtein Kinases) EM TECIDO NEURAL DE CAMUNDONGOS

VELHOS TRATADOS COM CAFEÍNA

CRICIÚMA

2013

ALLISON JOSÉ PIRES

VIAS DE SINALIZAÇÃO DE MAPK’s (Mitogen – ActivatedProtein Kinases) EM TECIDO NEURAL DE CAMUNDONGOS

VELHOS TRATADOS COM CAFEÍNA

Projeto de Dissertação deMestrado apresentada aoPrograma de Pós-Graduação emCiências da Saúde para o examede qualificação em Ciências daSaúde.

Orientadora: Prof. Drª CarinaRodrigues Boeck

Co-Orientadora: Prof. DrªVanessa Moraes de Andrade

CRICIÚMA

2013

1 INTRODUÇÃO

1.1 Envelhecimento

O envelhecimento é um processo biológico inevitável

e caracterizado por declínio geral das funções

fisiológicas, isto é contrabalançado por reparo e fatores

de manutenção que contribuem para a longevidade do

organismo. Assim, Beckman e Ames (1998) definiram o

envelhecimento como um fenômeno multifatorial associado

com a diminuição das funções fisiológicas e celulares, ao

aumento na incidência de numerosas doenças degenerativas

e à diminuição da capacidade para responder ao estresse.

Fatores biológicos, psicológicos e sociais são

alguns dos fenômenos relativos que compreendem o

envelhecimento e atingem ao homem e sua existência na

sociedade. Tais processos têm uma dimensão existencial

que se reveste de características biopsíquicas, sociais e

culturais.(Stoppe , 1994).

O processo de envelhecimento pode ser definido como

um declínio progressivo das funções fisiológicas de um

organismo depois da fase reprodutiva da vida (Valko et al.,

2007).

Arking (1991) propôs que o envelhecimento “é uma série

de mudanças estruturais e funcionais cumulativas, universais, progressivas e

deletérias que usualmente começam a se manifestar mais tarde na vida de

um indivíduo”. Dentre todas as definições, observa-se uma

tendência geral em caracterizar tal processo como

heterogêneo, complexo e multifatorial (Gueller e Zenik,

2005).

Em nível celular, o envelhecimento pode ser

descrito como mudanças graduais na fisiologia molecular

da célula, que provoca uma diminuição das suas funções

normais (Mansour et al., 2008). Várias hipóteses sobre os

mecanismos de envelhecimento têm sido desenvolvidas, e

estes podem não ser uniformes em todas as células e

órgãos. Comum à maioria dos modelos de envelhecimento é a

ideia de que mudança gradual na estrutura original de DNA

é uma causa básica importante. A teoria da mutação

somática do envelhecimento propõe que o envelhecimento é

devido ao acúmulo de mutações no DNA em células somáticas

ao longo do tempo (Mansour et al., 2008).

Apesar do avanço científico, o conhecimento sobre

as causas do envelhecimento ainda é muito limitado. Por

questões éticas, as pesquisas experimentais não podem ser

realizadas em seres humanos e têm sido desenvolvidas em

modelos animais, destacando-se os roedores. No entanto,

para que os resultados dos trabalhos experimentais

tornem-se relevantes para a compreensão do

envelhecimento, os mecanismos analisados precisam ser

comuns ao ser humano, o que nem sempre acontece

(Partridge, 2002).

Várias são as teorias propostas para explicar o

envelhecimento. Segundo Medvedev (1990), existem mais de

300 teorias, muitas das quais não se contradizem e até

mesmo se apoiam umas nas outras, muito provavelmente por

tratarem o assunto sob vários aspectos e de forma

diferente e independente.

Teixeira (2010) em seu artigo apresenta uma

revisão das teorias biológicas do envelhecimento e

discute os mecanismos relevantes para explicar o

processo. Weinert e Timiras (2003), propuseram a

classificação das teorias e mecanismos biológicos do

envelhecimento em três categorias: evolutiva, celular-

molecular e sistêmica. O quadro 01 resume a classificação

das teorias.

Nas ultimas duas décadas, diversas evidências

diretas e indiretas têm demonstrado uma relação positiva

entre o aumento do estresse oxidativo in vivo e o

envelhecimento. Os estudos demonstraram vários tipos de

danos no DNA acumulados durante a idade e as

possibilidades de ser o estresse oxidativo o grande

contribuinte deste processo, principalmente em roedores

(Bonassi et al., 1995; Iarmarcovai et al., 2007; Wojda et al.,

2007; Heuser et al, 2008).

Quadro 01. Classificação de algumas teorias biológicas do

envelhecimentoTEORIAS DESCRIÇÃO

EVOLUTIVAS Acúmulo de mutações

Pleiotropia antagonista

Soma descartável

A seleção natural torna-se“negligente” com as mutações queafetam a saúde em idade avançada.

Os genes benéficos na juventudetornam-se deletérios na fase pósreprodutiva.

As células somáticas são mantidassomente para assegurar o êxito nareprodução, tornando-sedescartáveis após este período.

CELULARES – MOLECULARES Erro catastrófico

Mutações somáticas

Senescênciacelular/telômeros

Radicais livres/DNA

Com o envelhecimento, há umdeclínio na fidelidade daexpressão genética, que resultana auto amplificação de erros nasíntese proteica. O acúmulodesses erros provoca o “errocatástrofe”.

Os danos moleculares acumulam-seprincipalmente no DNA.

O fenótipo do envelhecimento écausado pelo aumento nafrequência de célulassenescentes. A senescênciacelular pode ser decorrente doencurtamento dos telômeros(senescência replicativa) ou doestresse celular.

O metabolismo oxidativo produz

Glicosilação (AGEs)/ligaçõescruzadas

Morte Celular

radicais livres altamentereativos que, subsequentemente,causam danos nos lipídios, nasproteínas e no DNA.

O acúmulo de AGEs nas proteínasda matriz extracelular temconsequências deletérias econtribui para o envelhecimento.

A morte celular programada ocorrepor eventos genéticos ou emdecorrência de crise no genoma.

SISTÊMICAS Neuroendócrinas

Neuroendócrina/Imunológica

Ritmo/Velocidade de vida

Alterações no controleneuroendócrino da homeostaseresultam em mudanças fisiológicasrelacionadas à idade.

O declínio da função imuneassociado ao envelhecimentoresulta em incidência maior dedoenças autoimunes.

Há um potencial de energia para ometabolismo de cada organismovivo. “Viva rapidamente e morrajovem.”

AGEs: Advanced Glycosylation End-products (AGEs) (produtos finais deglicosilação avançada) Fonte: Teixeira, 2010; Weinert e Timiras2003.

O envelhecimento é acompanhado por mudanças na

função cognitiva e alterações na anatomia do cérebro,

fisiologia e neuroquímica. A taxa e a magnitude da

mudança, no entanto, varia substancialmente entre o

cérebro dos indivíduos, regiões e domínios funcionais

(Kosik et al., 2012).

O crescimento da população idosa é um fenômeno

mundial e, no Brasil, as modificações ocorrem de forma

radical e bastante acelerada (Carvalho, 2003). As

projeções mais conservadoras indicam que, em 2020, o

Brasil será o sexto país do mundo em número de idosos,

com um contingente superior a 30 milhões de pessoas

(Veras, 2009).

O número de idosos no Brasil passou de 3 milhões,

em 1960, para 7 milhões, em 1975, e 20 milhões em 2008 –

um aumento de quase 700% em menos de 50 anos. No ultimo

de censo de 2010 revelou que 10,78% da população

brasileira é composta por pessoas acima de 60 anos

(Brasil, 2010). Conseqüentemente, doenças próprias do

envelhecimento passaram a ganhar maior expressão no

conjunto da sociedade.

Com o aumento progressivo da expectativa de vida

e conseqüentemente do envelhecimento populacional,

doenças crônicas degenerativas, em particular os quadros

demenciais como a Doença de Alzheimer (DA), se tornaram

cada vez mais prevalentes, ocasionando um sério problema

para os sistemas de Saúde (Wiltfang et al, 2009).

Um dos resultados dessa dinâmica é a maior

procura dos idosos por serviços de saúde. As internações

hospitalares são mais freqüentes e o tempo de ocupação do

leito é maior quando comparado a outras faixas etárias.

Desta forma, o envelhecimento populacional se traduz em

maior carga de doenças na população, mais incapacidades e

aumento do uso dos serviços de saúde (Veras, 2009).

1.2 Cafeína

A cafeína pertence à classe de compostos

conhecidos como metilxantinas (1,3,7-trimetilxantina),

(Costa et al., 2008), sendo considerada a

substância psicoativa mais utilizada em todo o mundo

(Glade, 2010). Após sua ingestão, é absorvida pelo trato

digestório, distribuindo-se para todos os tecidos,

principalmente para o cérebro, onde exerce suas pricipais

ações (Fredholm et al., 1999). Seus produtos metabólicos,

através da desmetilação da cafeína, resulta na formação

de três grupos metilxantina: a teofilina (4%), a

teobromina (12%) e a paraxantina (84%) que, se

diferenciam pela sua ação farmacológica sobre o SNC

(Davis et al., 2003).

A cafeína é encontrada em vários medicamentos,

alimentos e bebidas e tem sido descrita como a droga

psicoativa mais utilizada no mundo (Glade, 2010). Muitos

dos alimentos e medicamentos que contem cafeína têm

apenas quantidades moderadas que não produzem efeitos

psicoativos detectáveis (Heckman et al., 2010). Contudo, as

bebidas contendo cafeína, tais como café , chá e

refrigerantes têm níveis mais elevados, que podem

produzir efeitos subjetivos estimulantes (Heckman et ai.,

2010). Os recentes aumentos da popularidade dessas

bebidas, assim como bebidas energéticas e bebidas

alcoólicas com cafeína, têm estimulado o interesse nos

efeitos psicoativos de cafeína (Sheppard et al., 2012).

Os efeitos psicoativos da cafeína compartilham

muitas características com a nicotina. Ambas as drogas

produzem efeitos subjetivos que são característicos de

estimulantes psicomotores (Benwell e Balfour , 1992; Lau

e Falk, 1995), no entanto, estes efeitos são moderadas em

comparação com estimulantes mais potentes como a

anfetamina (Antoniou et ai., 1998; Boye et ai., 2001). Ambas

as drogas aumentam a atenção e vigilância (Brunye et al ,

2010; Caballero et al , 2011; Vangkilde et al , 2011).

A cafeína é um ingrediente  inodoro, incolor e

amargo, amplamente utilizado pela população mundial,

encontrando-se presente em mais de 60 espécies de plantas

no mundo, em uma grande quantidade de bebidas e

alimentos, incluindo o café, chá, mate, chimarrão, muitos

refrigerantes e chocolate. Pode ser encontrada em

medicamentos utilizados para resfriados e alergias, em

analgésicos (15 a 64mg/U), moderadores de apetite (50 a

200mg/U) e estimulantes (100 a 200mg/U) (Srisuphan &

Bracken, 1986).

A significativa magnitude dos efeitos do café

está relacionada com as ações da cafeína, o ativo

farmacológico mais conhecido, constituinte do café

(Lorist e Tops, 2003). O café é uma das bebidas mais

consumidas em todo o mundo, e milhões de seres humanos

bebem todos os dias (Bichler et al., 2007).

O café contém uma variedade de compostos

bioativos incluindo derivados de purinas, cafeína e

outros polifenóis, incluindo os derivados de ácidos

clorogênicos e o produto de sua degradação é o ácido

caféico (Bichler et al., 2007).

Além de ter um efeito estimulante sobre o coração

e sistema respiratório, a cafeína também apresenta

numerosos efeitos comportamentais e estimulantes

(Angelucci et al., 2002). A ingestão moderada de cafeína

não representa riscos para a saúde. Dews (1984) sugeriu

que quando a cafeína é administrada nas doses encontradas

em alimentos os seus efeitos são leves e sutis

concordando com Smith, 2002 e Tannahill (1989) que

consideram a cafeína um estimulante suave quando

consumida em doses moderadas. Alguns autores concluem que

a rotina do consumo diário de até 1000 mg de cafeína não

representa riscos para a saúde humana (Bonita et al., 2007;

Glade, 2010). Já outros autores afirmam que a cafeína,

mesmo em doses baixas, pode aumentar o tempo de vigília e

altas doses de cafeína podem levar a um aumento da

ansiedade (Arendash et al., 2006). Arendash et al. (2006) e

Angelucci (2002), afirmam que doses moderadas de cafeína

induzem comportamentos que sugerem efeitos estimulantes

do SNC e nas maiores doses podem suprir a atividade

comportamental e até mesmo performances associada ao

aprendizado e memória.

A cafeína é um componente importante de chás e o

chá é conhecido por conter um elevado nível de

antioxidante (Benzie & Szeto, 1999). De acordo com

Balansky (1992) o chá verde apresenta propriedades

antioxidantes devido a ação genotóxica da cafeína, sendo

que o mesmo também pode ser utilizado em cosméticos.

Dentre os diversos estudos realizados em humanos,

que procuraram verificar a atividade antioxidante do

café, apresentados em duas revisões (Bonita et al., 2007;

Dorea e Costa, 2005), destacam-se quatro. Um verificou a

presença do antioxidante ácido cafeico, em plasma, 2h

após a ingestão de café; outro observou um aumento de 7%

na capacidade antioxidante total, que resulta do conjunto

de antioxidantes disponíveis no plasma para atuarem como

tal; um terceiro verificou um aumento de 16% nos níveis

de glutationa, o maior antioxidante in vivo, fundamental para

os processos de óxido-redução das células, com a ingestão

de cinco xícaras/dia de café estilo moca; e, por fim, um

outro estudo observou uma diminuição em 30% da

oxidabilidade de LDL, com a ingestão de três xícaras/dia

da bebida, indicando uma maior estabilidade desta

partícula ao ataque de radicais livres. Estes dados

corroboram o efeito protetor do café (Lima, 2010).

O principal alvo molecular dos efeitos

psicoestimulantes da cafeína é o antagonismo não-seletivo

de adenosina. (Fredholm, 1980; Snyder et al., 1981). A

adenosina é um neuromodulador participante na sinalização

de muitos neurotransmissores no sistema nervoso central

(Cunha, 2001). Quatro subtipos de receptores de adenosina

tem sido caracterizados (A1, A2A, A2B e A3), os subtipos A1

e A2A são amplamente expressos no sistema nervoso central

e órgãos periféricos. Os receptores de adenosina A1 estão

amplamente distribuídos em todo o cérebro, enquanto os

receptores A2A estão altamente concentrados no estriado,,

núcleo acubens e bulbo olfatório (Fredholm et al., 2005).

No entanto, acredita-se que apenas os receptores A1 e A2A

têm afinidade suficiente para serem ativados por

concentrações fisiológicas de adenosina extracelular, e,

portanto, acredita-se que estes subtipos de receptores

são os grandes responsáveis pela função neurobiológica da

adenosina no cérebro.(Kalda et al 2006).

A cafeína, age nos receptores A1 inibindo os

efeitos da adenosina provocando efeitos estimulantes

(Hoexter et al., 2005). Nos receptpores A2A a cafeína tem

ação antagonista ocasionando aumento da atividade motora

pela interação destes receptores com os receptores de

dopamina (Fisone et al., 2004).

A cafeína mostra as afinidades para vários tipos

de receptores presentes nas membranas sinápticas, e

também para fosfodiesterases citoplasmáticos, permitindo

a modificação dos mecanismos sinápticos (Yoshimura,

2005). Atua como um antagonista dos receptores da

adenosina não seletivo, com o bloqueio dos receptores A2A

foi recentemente demonstrado para limitar o efeito

sinaptotóxico do precurssor beta amiloide, envolvido na

fisiopatologia da doença de Alheimer (Canas et al., 2009)

Estudos experimentais em modelos animais demonstraram que

os receptores de adenosina A2A e mGlu5R glutamato são co-

localizado, e que os efeitos desempenham um papel

permissivo na mGlu5R potenciação mediada pelo receptor de

N-metil-D-aspartato (NMDA), no hipocampo (Santos et al.,

2010).

1.3 Cafeína e envelhecimento

Em humanos, a administração de doses elevadas de

cafeína conduz a um aumento dos níveis de ansiedade

(Clementz and Dailey, 1988). Do mesmo modo, a

administração aguda de altas doses de cafeína promove um

comportamento ansioso em diferentes modelos animais, tais

como o teste de interação social (Baldwin and File, 1989)

ou teste de labirinto em cruz elevado (El Yacoubi et al.,

2000). Outros estudos realizados em animais também

mostraram que a administração de cafeína provoca

frequentemente uma melhoria sobre o desempenho cognitivo,

incluindo animais idosos (Higgins et al., 2007; Prediger

et al., 2005).

O consumo de café em humanos está associada com

uma redução significativa no risco de desenvolvimento de

certas doenças crônicas. No entanto, a capacidade de

suplementação de café para melhorar a função cognitiva em

indivíduos idosos e o efeito dos componentes individuais

de café, tais como a cafeína, não têm sido completamente

avaliado (Shukitt-Hale et al., 2013).

Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado

uma associação negativa entre o consumo de café e doença

de Parkinson, outra condição neurodegenerativa

importante, particularmente em homens (Ascherio e Chen,

2003). Os mecanismos biológicos plausíveis evocados

sugerem que a cafeína pode atenuar a perda de dopamina no

estriado e sítios de ligação do transportador de dopamina

(Santos et al., 2010). Sonsalla et al., (2012) demonstraram que

o tratamento com cafeína protege contra a perda de

neurônios da substância nigra em modelos animais com esta

doença, mostrando ainda que o tratamento com cafeína foi

neuroprotetor, mesmo quando introduzido após o início do

processo neurodegenerativo, sugerindo que a cafeína pode

ser capaz de retardar a neurodegeneração.

Nos últimos anos, pesquisas sobre o consumo

habitual de cafeína têm merecido muita atenção,

principalmente em relação aos seus efeitos na melhoria do

desempenho cognitivo (Daly, 2007; Ferré, 2008).

Poucos estudos têm testado uma possível

associação entre a ingestão de cafeína regular e o risco

para a DA. Um pequeno estudo de caso-controle sugeriu que

a exposição a cafeína foi significativamente inversamente

associado com o risco de Doença de Alzheimer (Maia e

Mendonça, 2002). Um estudo prospectivo mostrou também que

o consumo regular de café foi associado com um risco

reduzido de Alzheimer depois de 5 anos de seguimento.

Este estudo avaliou o consumo de café e do chá, mas não

foi considerada a quantidade total de ingestão de

cafeína, e a associação encontrada pode ter sido parcial

devido à exclusão de um grande número de descendentes

(Lindsay et al., 2002).

Outros estudos epidemiológicos usaram uma

abordagem diferente, avaliar se o consumo de cafeína

podem influenciar no declínio cognitivo, com resultados

conflitantes (Johnson-Kozlow, et al, 2002; van Gelder et al.,

2007). Recentemente, um grande estudo prospectivo

epidemiológico com cerca de 7.000 participantes com

idades acima de 65 anos, mostrou que as mulheres com

altas taxas de consumo de cafeína (mais de três unidades

por dia, o que equivale a cerca de 300 mg de cafeína)

tiveram menor declínio no desempenho de memória do que as

mulheres que consumiram 100mg de cafeína ou menos por dia

(Ritchie et al., 2007). O efeito protetor da cafeína

aumenta com a idade e não foi observado em homens. No

entanto, a incidência da doença de Alzheimer

aparentemente não foi diminuída em consumidores de

cafeína (Santos et al., 2010).

Porém Espinosa et al., (2013) testaram o impacto da

cafeína na demência induzida por Streptozotocina (STZ) e

a neurodegeneração do hipocampo bem como sobre a

expressão e a densidade de receptores de adenosina em

modelo animal. O consumo de cafeína (1 g / L na água de

beber, 2 semanas antes de iniciar o desafio STZ) impediu

a perda de memória induzida por STZ e a neurodegeneração,

assim como a sobre-regulação dos receptores A2A. Estas

descobertas fornecem a primeira demonstração de que a

cafeína impede a demência esporádica e implicam o

controle dos receptores centrais de A2A como o seu

mecanismo de ação provável.

1.3.1 As MAPKs (Mitogen activated protein kinase)

O primeiro relato da existência de uma proteína de

42 kDa em diferentes tipos celulares, predominantemente

fosforilada no resíduo de tirosina em resposta ao

estímulo de fatores de crescimento, se deu em 1983, em um

trabalho realizado por Cooper e Hunter. Ao mesmo tempo,

serina-treonina quinases ativadas pelo receptor de

insulina (IRK), que possui atividade tirosina quinase,

estavam sendo caracterizadas, sob a hipótese de que a

fosforilação do resíduo de tirosina iria regular a

atividade dessas quinases (Ray e Sturgill, 1988; Anderson

et al., 1990).

Ray e Sturgill (1988) também demonstraram que a

serina-treonina quinase de 42 kDa isolada de células 3T3-

L1 estimuladas com insulina, chamada de proteína quinase

ativada por mitógeno (MAPK), sofria fosforilação nos

resíduos de treonina e tirosina. Logo se percebeu que

esta proteína era a mesma que respondia aos fatores de

crescimento e que a fosforilação de ambos os resíduos era

necessária para a ativação de MAPKs (Rossomando et al.,

1989).

Boulton e colaboradores (1990) isolaram o cDNA desta

proteína e a renomearam ERK1 (quinase regulada por sinal

extracelular 1) devido à variedade de fatores

extracelulares capazes de estimularem-na. O isolamento do

cDNA das proteínas ERK2 e ERK3 se deu logo em seguida por

Boulton e colaboradores (1991) e permitiu concluir que a

seqüência destas proteínas era muito próxima àquela

observada nas proteínas Kss1p e Fus3p da Saccharomyces

cerevisiae, demonstrando uma estreita homologia entre as

MAPKs de mamíferos e de leveduras.

O conceito de que havia múltiplas MAPKs com

distintas funções e regulação surgiu com a descrição de

outras vias encontradas inicialmente em leveduras, como a

das proteínas HOG1 e MPK1, seguida pela descoberta em

metazoários da proteína quinase c-jun-N-terminal /

proteína quinase ativada por estresse (JNK/SAPK), enzimas

p38 e outras (Brewster et al., 1993; Han et al., 1994;

Kyriakis et al., 1994; Dérijard et al., 1994).

Seis grupos principais de MAPKs foram caracterizados

em mamíferos: a proteína quinase regulada por sinal

extracelular (extracellular signal-regulated kinase)

ERK1/2, ERK7/8, ERK3/4 e ERK5 (também conhecida como big

map kinase1, BMK1); a JNK (c- Jun N-terminal kinase)

JNK1/2/3 e a p38 (p38α/β/γ/δ). As proteínas mais

estudadas são ERK1/2, ERK5, JNK e p38, sendo que há pouca

informação disponível na literatura sobre as ERKs 7/8 e

3/4 (Krishna e Narang, 2008).

Estas proteínas sinalizadoras são responsáveis pelo

recrutamento de outras proteínas sinalizadoras que, em

conjunto, permitem a transmissão de informações acerca do

meio extracelular para o núcleo da célula, onde

determinam alterações na taxa de transcrição de genes

específicos e a ativação de fatores de transcrição

(Johnson e Lapadat, 2002).

1.3.2 Vias de sinalização das MAPKs

As vias de sinalização envolvendo MAPKs são ativadas

em resposta a uma ampla variedade de estímulos, incluindo

hormônios (por exemplo, insulina e melatonina), fatores

de crescimento (por exemplo, PDGF, EGF e neurotrofinas),

diversas citocinas inflamatórias e outros estímulos

físicos ou químicos (por exemplo, radiação, choque

osmótico, isquemia e trauma). Estes estímulos atuam

através de diferentes famílias de receptores, como

receptores acoplados a proteínas G (GPCR), receptores

tirosina quinase, receptores de citocinas e receptores

serina- treonina quinase. As MAPKs coordenam diversas

funções, como transcrição de genes, síntese protéica,

ciclo celular, proliferação, diferenciação e morte

celular. Seus alvos podem incluir outras proteínas

quinases, fosfolipases, fatores de transcrição ou

proteínas do citoesqueleto (Johnson e Lapadat, 2002;

Krishna e Narang, 2008).

As MAPKs são reguladas por cascatas de fosforilação,

estabelecendo uma via de ativação seqüencial composta de,

no mínimo, três proteínas. A transmissão de sinais

através destas cascatas é normalmente iniciada pela

ativação de uma pequena proteína G, como a Ras, ou pela

interação e ativação de componentes superiores da cascata

com proteínas adaptadoras. Então, os sinais são passados

ao longo da via, por proteínas quinases citosólicas,

organizadas em três a cinco níveis. As quinases de cada

nível fosforilam e ativam quinases localizadas abaixo,

permitindo uma transmissão controlada e rápida dos sinais

para vários alvos nas cascatas. Três dessas proteínas,

MAPK quinase quinase (MKKK, também chamada MAP3K ou

MEKK), MAPK quinase (MKK ou MAP2K) e MAPKs, são

consideradas principais. Já a proteína superior, MAPK

quinase quinase quinase (MKKKK ou MAP4K), e a inferior,

proteína quinase ativada por MAPKs (MKs ou MAPKAPK), não

são indispensáveis para essa cascata de sinalização. Uma

vez ativadas, as MAPKs fosforilam resíduos de serina e

treonina em seus alvos específicos, nos casos em que

estes aminoácidos forem seguidos por uma prolina (Johnson

e Lapadat, 2002; Krishna e Narang, 2008).

Cabe ressaltar que cada um dos níveis das diferentes

cascatas é constituído por diversos componentes formados

por produtos de genes distintos, e são frequentemente

traduzidos para várias isoformas alternativas. Cerca de

70 genes são conhecidos atualmente como codificadores

para, aproximadamente, 200 componentes que formam toda a

via das MAPKs. Esta multiplicidade de componentes permite

uma regulação e especificidade rigorosas, características

importantes dessa via de sinalização (Keshet e Seger,

2010).

1.3.3 Proteína quinase ativada por sinal extracelular –

ERK1/2

As duas isoformas ERK1 e ERK2, também chamadas p42 e

p44, possuem 83% de identidade entre os seus aminoácidos

e são amplamente expressas em todos os tecidos, incluindo

em células diferenciadas. Ambas isoformas estão

envolvidas na regulação da meiose e mitose, além de

exercerem funções pós-mitóticas em células diferenciadas,

e são ativadas por fatores de crescimento, citocinas,

infecções virais, carcinógenos, estresse osmótico, entre

outros (Rubinfeld e Seger, 2005).

A via das ERKs é constituída pelas proteínas MAPKKKs

A-Raf, B-Raf e Raf-1, as MAPKKs MEK1 e MEK2, além das

ERKs 1 e 2 (Roux e Blenis, 2004). A ativação desta via

ocorre quando estímulos extracelulares provocam um

aumento na forma ativa da Ras, uma proteína ligante de

GTP. O complexo Ras- GTP ativa então a próxima proteína,

Raf, que acaba por fosforilar as proteínas MEKs, cujo

papel é ativar ERK1 e ERK2. Depois de ativadas, essas

proteínas fosforilam diversos substratos em todos os

compartimentos celulares, incluindo proteínas na

membrana, substratos nucleares e proteínas do

citoesqueleto, além de outras quinases (Thomas e Huganir,

2004).

A sinalização pelas proteínas ERK está envolvida com

vários mecanismos, como a proliferação celular, dessa

maneira implicando sua ação na carcinogênese, além de

exercer papel na apoptose, ciclo celular, desenvolvimento

e diferenciação celular (Krishna e Narang, 2008).

Além disso, sabe-se que a ERK também pode ser

ativada nos neurônios em resposta à sinalização

glutamatérgica excitatória, sendo capaz de controlar

diversas formas de plasticidade sináptica cerebrais

envolvidas em processos de aprendizado e memória (Adams e

Sweatt, 2002).

1.3.4. Proteína quinase p38 MAPK

Existem quatro isoformas das proteínas p38 MAPKs: α,

β, γ e δ. Estímulos químicos e físicos, como estresse

oxidativo, radiação, hipóxia e citocinas inflamatórias

desencadeiam a ativação de várias MAPKKKs dando início à

via de sinalização das proteínas p38. Essas MAPKKKs

ativam as proteínas MEK 3 e MEK 6 que ativam apenas p38,

sem influenciar a ERK ou a JNK. Enquanto a MEK 6 é capaz

de ativar todas as isoformas de p38, a MEK 3 fosforila

preferencialmente as isoformas α e β (Enslen et al., 2000).

O papel da p38 no processo inflamatório tem sido

amplamente estudado, uma vez que esta via está envolvida

em respostas funcionais de macrófagos e neutrófilos, como

quimiotaxia, exocitose granular, aderência e apoptose,

bem como na diferenciação de células T (Dong et al., 2002;

Cook et al., 2007). Seus alvos principais incluem fatores

de transcrição, MKs e proteínas citosólicas (Krishna e

Narang, 2008).

1.3.5 Proteína quinase c-jun-NH2-terminal – JNK

As proteínas JNK foram originalmente descritas como

proteínas quinases ativadas por estresse (SAPKs), sendo

renomeadas para enfatizar seu papel na fosforilação e

ativação do fator de transcrição c- jun. As isoformas

JNK1 e JNK2 são expressas em todos os tecidos, enquanto a

JNK3 é restrita ao cérebro, coração e testículos. Essas

isoformas podem ser ativadas em resposta aos mais

variados estímulos, como citocinas, radiação UV, fatores

de crescimento e trauma (Johnson e Lapadat, 2002; Krishna

e Narang, 2008).

A regulação da via destas proteínas é complexa, uma

vez que envolve 13 MAPKKKs. A sinalização inicia com as

proteínas MAPKK4 e MAPKK7, que podem ser ativadas por uma

grande variedade de fatores, incluindo as MAPKKKs, MEKK1-

4, MLK2 e 3, ASK1/2, entre outras. Diferentes MAPKKKs são

específicas para diferentes estímulos, como a TAK1 que

parece responder a algumas citocinas inflamatórias como

IL- 1β e TNF-α (Kyriakis e Avruch, 2001). Dessa forma, a

ativação prolongada da JNK pode influenciar mecanismos

celulares importantes como a morte celular e a

proliferação celular alterada (Liu e Lin, 2005), enquanto

que a sua ativação transitória parece promover a

sobrevivência celular (Ventura et al., 2006).

Os alvos da proteína JNK incluem fatores de

transcrição e receptores hormonais nucleares, embora o

seu alvo nuclear mais conhecido seja o fator c-jun.

Proteínas adaptadoras não nucleares e mitocondriais, como

aquelas envolvidas na apoptose, também servem de

substrato para essas proteínas (Balbi et al., 2009).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a sinalização de MAPKs em tecido neural de

camundongos velhos tratados com cafeína.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1. Avaliar a sinalização neural de ERK 1/2; JNK, P38

em camundongos velhos tratados com cafeína e grupo

controle.

2.2.2. Correlacionar os resultados obtidos através de

dois testes, de forma a fornecer maior segurança em

relação aos resultados e da indicação dos efeitos da

cafeína sobre o envelhecimento.

3 MÉTODOS

3.1 Animais

Serão utilizados 40 camundongos albinos Swiss

machos (30 - 40g), divididos em adultos-jovens (3-4

meses de idade) e adultos-velhos (10-14 meses de idade),

os animais serão obtidos do biotério da Universidade do

Extremo Sul Catarinense. Os camundongos serão alojados em

caixas de polietileno, com comida e água ad libitum.e

serão mantidos em um ciclo de 12 horas luz-escuro (a luz

é ligada às 7h da manhã), com temperatura controlada de

22±1ºC. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética

no Uso de Animais da UNESC com o protocolo número

103/2012 e os experimentos serão conduzidos de acordo com

os princípios éticos do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal – COBEA.,

3.2 Amostra

Os animais serão divididos em 4 grupos:

Grupo 1: controle: adultos -jovens que receberão água (n=

10)

Grupo 2: adultos jovens que receberão cafeína (n=10)

Grupo 3: controle: adultos velhos que receberão água

(n=10)

Grupo 4: adultos velhos que receberão cafeína.(n=10)

O número total de animais foi previsto de acordo

com a possibilidade de morte natural destes animais

devido a idade.

3.3 Tratamento com cafeína

Durante quatro semanas os camundongos tratados

receberão solução de cafeína (0,3 g/L) na garrafa de água

como única bebida disponível. A solução de cafeína será

trocada a cada 48 horas para uma solução fresca. A dose

de cafeína utilizada é considerada proporcional a 1

xícara de chá de café/dia para homens (Da Silva et al.,

2005). O volume de água ou cafeína consumido será

quantificado e dividido por quatro (número de animais na

gaiola).

Após o tratamento os animais sofrerão eutanásia

por deslocamento cervical para a retirada do hipocampo,

para a realização do Wetern blotting.

3.4 Testes utilizados

Será realizado o Western blotting utilizando

parte do hipocampo, ao final do tratamento.

3.4.1 Western blotting

3.4.1.1 Separação de Proteínas por Eletroforese (SDS-

PAGE)

Após os procedimentos experimentais os hipocampos

dos animais serão armazenados em freezer -80 para

conservação do material para posterior procedimento.

As amostras serão solubilizadas em tampão de

amostra composto por duodecil sulfato de sódio (SDS) 4%,

Tris-HCl 50 mM, EDTA 5mM e β-mercaptoetanol 8 %, pH 6,8;

e diluídas em solução de diluição: 40 % de glicerol, 25

mM de Tris-HCl e azul de bromofenol pH 6,8. As proteínas

serão preparadas por SDS (30 µg/poço) usando gel de

separação com gradiente de acrilamida. A concentração da

acrilamida no gel de separação será de 7,5%. O gel de

entrada de concentração 4% de acrilamida (Laemmli, 1970).

A eletroforese será realizada com corrente fixa de 40 mA

e voltagem máxima de 140 mV (para 2 géis), por

aproximadamente 2 horas. Após a corrida os géis serão

submetidos a eletrotransferência em tampão Tris-HCl mM,

glicina 140 mM e metanol 10 % por 1 hora, em corrente de

no máximo 100mA e voltagem de 350 mV a 4°C, para

transferência das proteínas do gel para a membrana de

nitrocelulose de 0,4 µm de porosidade.

3.4.1.2 Imunodetecção de proteínas

Após a eletrotransferência, as membranas serão

bloqueadas (15 minutos) com gelatina de peixe 0,5% em

TBS-T (Tween-20 0,05%, Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e

a seguir lavadas com TBS-T (Collins e Sim, 1998). As

membranas serão incubadas com anticorpos primários contra

as proteínas JNK, ERK e p53, todas nas forma total e

fosforilada, em concentrações testadas previamente, por

12 -14 horas (overnight). Para detecção dos complexos

imunes, as membranas serão novamente lavadas com TBS-T e

os respectivos anticorpos secundários (ligados a

peroxidase) serão incubados. Após lavagens com TBS-T a

imunodetecção será revelada por emissão de

quimioluminescência com reagentes luminescentes (Pierce)

seguindo as recomendações do fabricante, e impressão de

imagem em filme auto-radiográfico. As imagens serão

visualizadas em software para quantificação

densitométrica das bandas protéicas (Scion Image, Beta

4.0.2; Scion Corporation).

3.4.1.3 Dosagem de proteína

As proteínas serão dosadas através do método de

Peterson, descrito brevemente a seguir. Sobre alíquotas

de 2 μl das amostras serão adicionados 398 mL de água e

400 mL do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH; 2,5% de SDS;

5% de Na2CO3; 0,2% de CuSO4 e 0,1% de tartarato duplo de

Na+/K+). As amostras serão homogeneizadas imediatamente e

deixadas para reagir por dez minutos. Em seguida será

adicionado 200 mL do reagente de Folin 0,4 N seguido de

homogeinização e incubação por 30 minutos. A leitura do

complexo de cor será realizada em espectrofotômetro

(comprimento de onda de 750 nm) e as concentrações

proteicas serão obtidas a partir uma curva padrão

utilizando albumina de soro bovino (BSA; 0,1 mg/mL).

3.5 Análise estatística

A normalidade das variáveis será avaliada pelo

teste Kolmogorov-Smirnov. As análises estatísticas para

Índice de Dano, Frequência de Dano e imunoconteúdo de

proteínas serão feitas através de análise de variância de

uma via (ANOVA) e quando o teste apresentar diferença

entre os grupos será aplicado o teste post-hoc de Tukey.

Em caso de dados não-paramétricos será utilizado o teste

Kruskal-Wallis usando o teste Dunn como post hoc. Uma

diferença de P < 0.05 será considerada estatisticamente

significante. O pacote estatístico utilizado será o

BioEstat 5.0.

3.6 Critérios de suspensão ou encerramento de pesquisa:

Todos os equipamentos, reagentes e drogas

necessárias para a realização deste projeto estão

disponíveis ao proponente, corroborando com isto, não há

riscos de vida para os animais, com isso, não há

critérios aparentes para suspensão ou encerramento da

pesquisa. Ainda assim, os animais serão monitorados

diariamente quanto ao seu estado de saúde. A suspensão ou

encerramento da pesquisa serão realizados quando o

pesquisador responsável julgar necessário após observar

alterações significativas dos parâmetros abaixo desde que

tais alterações ponham em risco a vida do animal:

comportamento motor e alimentar, cor, quantidade e

consistência do bolo fecal, estado geral de conservação

da pele e dos pêlos bem como suas colorações, padrão da

freqüência respiratória, peso e temperatura corporais.

3.7 Critérios de inclusão e exclusão:

Serão incluídos apenas camundongos Swiss machos

com totais condições físicas. Serão excluídos os animais

que morrerem durante o experimento de quaisquer que sejam

os grupos de tratamento. A presença de animais nos grupos

que receberão dieta cafeteira abaixo do peso corporal da

média do grupo serão consideradas para a exclusão do

projeto de pesquisa. Neste caso, será realizada a

eutanásia dos animais por deslocamento cervical.

3.8 Local de realização da pesquisa:

A pesquisa será realizada na Universidade do

Extremo Sul Catarinense (UNESC), no Laboratório de

Biologia Celular e Molecular (LABIM), localizado no Bloco

S, sala 22, um dos laboratórios do Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde. Dispõe de infra-estrutura

e de equipamentos necessários para as atividades

de ,biologia molecular e análises toxicogenéticas.

3.9 Infra-estrutura:

Todos os envolvidos no projeto utilizarão todos

os equipamentos de proteção individual (EPI) que sejam

necessários para cada procedimento. Os procedimentos

experimentais serão realizados de acordo com as

recomendações internacionais para o cuidado e o uso de

animais de laboratório. Este estudo foi aprovado pela

Comissão de Ética no Uso de Animais da UNESC com o

protocolo número 103/2012 e os experimentos serão

conduzidos de acordo com os princípios éticos do Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA

3.10 Procedimentos para minimizar sofrimento/risco do

animal:

Será evitado qualquer procedimento que possa

colocar o animal em risco ou sofrimento. Sendo assim,

todos estes serão de acordo com as normas do comitê de

ética. Destino dos animais pós-experimentação: O descarte

dos animais utilizados neste experimento será o

acondicionamento em saco branco leitoso e encaminhados

para freezer (conservação) na universidade. Após

conservação, serão coletados e transportados por empresa

terceirizada. Os resíduos são tratados fisicamente e

posteriormente encaminhados para disposição final em

aterro sanitário. Todos os procedimentos são conforme RDC

nº 306/2004 da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância

Sanitária).

4 CRONOGRAMA

Períodos

/Atividad

esF M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D

Revisão

da

literatur

a

X X X X X X X X X X X X X X X X X

Avaliação

pelo ceua

da unesc

X

Tratament

o dos

animais e

coleta de

material

X X X X

Western

blottingX X X X

Análise

estatísti

ca dos

resultado

s

X X

2012 2013

Redação

de artigo

científic

o

X X X X X X X X X

Entrega

do

trabalho

X

5 ORÇAMENTO Discriminação Quantidade Valor

Unitário R$

Valor Total

R$1. Material de Consumoanticorpos primários contra as proteínas

JNK (total e fosforilada).

1 1.100,00 1.100,00

anticorpos primários contra as proteínas

ERK (total e fosforilada).

1 1.100,00 1.100,00

anticorpos primários contra as proteínas

P38 (total e fosforilada).

1 1.100,00 1.100,00

Blotting Membranes Hybond ECL (Amersham

Bio)

1 1.400,00 1.400,00

Lâmina lapidada p/ microscopia ponta fosca

26x76mm

20 5,80 116,00

Ácido Acético Glacial- Nuclear 1 13,00 26,00

Ácido clorídrico –Merck 1 248,70 248,70Ácido Tricloroacético 500g- Nuclear 1 75,00 75,00Ácido Tungstosilicico 50g -Sigma Aldrich 1 407,00 407,00Carbonato de Sódio 1kg –Quimex 2 15,50 31,00Cloreto de Potássio 1kg- Nuclear 2 14,00 28,00Cloreto de Sódio 1kg – Quimex 4 8,30 33,20Dimetilsulfoxido 1L – Nuclear 3 34,00 102,00EDTA Sal Dissodico 1L – Nuclear 4 43,70 174,80Etanol 1L – Nuclear 1 9,50 9,50Formaldeído 1L – Quimex 2 11,97 23,74Fosfato de Sódio Dibásico 1kg- Nuclear 2 16,60 33,20Fosfato de Sódio Monobásico 1kg- Nuclear 1 32,00 32,00Glicerina Bidestilada (Glicerol) 1L –

Nuclear

2 22,00 44,00

Hidróxido de Sódio 500g – Quimex 6 8,30 49,80Metil Metano sulfonato (MMS) Sigma 1 554,00 554,00Nitrato de Amônia 1kg – Quimex 2 44,50 89,00Nitrato de Prata 100g – Quimex 1 261,40 261,40Sulfato de Zinco – heptaidratado 1kg –

Invitrogen

2 23,04 46,08

Tris Hidroximetil 1kg – Invitrogen 2 280,00 560,00Triton X-100 1L – Nuclear 2 108,50 217,00Cafeína 500 gramas 1 550,00 550,00

Camundongos Swiss 40 12,00 480

Total 7.791,42

7. FONTE FINANCIADORA

Todas as despesas necessárias para o

desenvolvimento do projeto serão subsidiadas pelo

Laboratório de Biologia Celular e Molecular com

financiamento do CNPq e UNESC.

8. REFERÊNCIAS

Adams JP, Sweatt JD. J. Molecular Psychology: Roles for

the ERK MAP kinase cascade in memory. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol., 42:135–6, 2002.

Anderson NG, Maller JL, Tonks NK, Sturgill TW.Requirement for integration of signals from two distinctphosphorylation pathways for activation of MAP kinase.Nature, 343: 651–653, 1990.

Angelucci MEM, Cesário C, Hiroi RH, Rosalen PL, CunhaCDA. Effects of caffeine on learning and memory in ratstested in the Morris water maze. Braz J Med Biol Res.2002;35(10):1201-8.

Antoniou K, Kafetzopoulos E, Papadopoulou-Daifoti Z,Hyphantis T, Marselos M. D-amphetamine, cocaine andcaffeine: a comparative study of acute effects onlocomotor activity and behavioural patterns in rats.Neurosci Biobehav Rev. 1998; 23:189–196. [PubMed:9884112].

Arking R. Aging: Psisiology, comparative. Biology ofaging: Observations and principles. 1991. Prentice Hall(Englewood Cliffs, N.J.)

Arendash GW, Schleif W, Rezaizadeh K, Acksone KJ,ZachariA LC, Cracchiolo JR, Shippy D, Tan J. Caffeineprotects alzheimer’s mice against cognitive impairmentand reduces brain amyloid production. Neuroscience. 2006;142: 941–952.

Ascherio A, Chen H (2003) Caffeinated clues from epidemi-ology of Parkinson’s disease. Neurology 61, S51-54.

Balansky R. Effects of sodium selenite and caffeine onmutagenesis induced by N-methyl-N-nitrosourea, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and aflatoxin B1 in S.typhimurium. Mutat Res. 1992 ;269(2): 301–317.

Balbi APC, Francescato HDC, Marin ECS, Costa RS, CoimbraTM. Roles of mitogen-activated protein kinases andangiotensin II in renal development. Brazilian Journal ofMedical and Biological Research (2009) 42: 38-43.

Beckman, K. B. and Ames, B. N. (1998) The Free RadicalTheory of Aging Matures. Physiol. Rev. 78, 547-581.

Benzie IFF, Szeto YT. Total antioxidant capacity of teasby the ferric reducing/antioxidant power assay. J AgricFood Chem. 1999; 47(2): 633–636.

Benwell ME, Balfour DJ. The effects of acute and repeatednicotine treatment on nucleus accumbens dopamine andlocomotor activity. Br J Pharmacol. 1992; 105:849–856.[PubMed: 1504716].

Bichler J, Cavin C, Simic T, Chakraborty A, Ferk F,Hoelzl C, Schulte-hermann R, Kundi M, Haidinger G,Angelis K, Knasmuller S. Coffee consumption protectshuman lymphocytes against oxidative and 3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-bíndole acetate (Trp-P-2) induced DNA-damage: Results of na experimental study with humanvolunteers. Food and Chemical Toxicology. 2007; (45):1428–1436.

Bonassi S, Bolognesi C, Abbondandolo A, Barale R, BigattiP, Camurri L,et al. Influence of sex on cytogenetic endpoints: evidence from a large human sample and review ofthe literature. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1995;4:671-9.

Bonita JF, Mandarano M, Shuta D, Vinson J. Coffee andcardiovascular disease: in vitro, cellular, animal, andhuman studies. Pharmacol Res. 2007; 55: 187-98.

Boulton TG, Yancopoulos GD, Gregory JS, Slughter C,Moomaw C, Hsu J, Cobb MH. An insulin- stimulated proteinkinase similar to yeast kinases involved in cell cyclecontrol, Science, 249:64–67, 1990.

Boulton TG, Nye SH, Robbins DJ, Ip NY, Radzlejewska E,Morgenbesserc SD, Depinho RA, Panayotatos N, Cobb MH,Yancopoulosb GD. ERKs: A family ofprotein-serine/threonine kinases that are activated andtyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF.Cell, 65:663– 675, 1991.

Boye SM, Grant RJ, Clarke PB. Disruption of dopaminergicneurotransmission in nucleus accumbens core inhibits thelocomotor stimulant effects of nicotine and D-amphetaminein rats. Neuropharmacology. 2001; 40:792–805. [PubMed:11369033].

BRASIL, 2010. Censo do IBGE – Instituto brasileiro degeografia e estadística.http://censo2010.ibge.gov.br/noticias-censo?view=noticia&id=1&idnoticia=1866&t=primeiros-resultados-definitivos-censo-2010-populacao-brasil-190-755-799-pessoas

Brewster JL, Valoir T, Dwyer ND, Winter E, Gustin MC. Anosmosensing signal transduction pathway in yeast.Science, 259:1760–1763, 1993.

Brunye TT, Mahoney CR, Lieberman HR, Giles GE, Taylor HA.Acute caffeine consumption enhances the executive controlof visual attention in habitual consumers. Brain Cogn.2010; 74:186–192. [PubMed: 20832925].

Caballero M, Nunez F, Ahern S, Cuffi ML, Carbonell L,Sanchez S, Fernandez-Duenas V, Ciruela F. Caffeineimproves attention deficit in neonatal 6-OHDA lesionedrats, an animal model of attention deficit hyperactivitydisorder (ADHD). Neurosci Lett. 2011; 494:44–48. [PubMed:21362462].

Canas PM, Porciuncula LO, Cunha GM, Silva CG, Machado NJ,Oliveira JM, Oliveira CR, Cunha RA (2009) Adenosine A2Areceptor blockade prevents synaptotoxicity and memorydysfunction caused by beta-amyloid peptides via p38mitogen- activated protein kinase pathway. J Neurosci 29,14741-14751.

Carvalho JAM, Garcia RA. O envelhecimento da populaçãobrasileira: um enfoque demográfico. Cad Saude Publica.2003;19(3):725-33. DOI: 10.1590/ S0102-311X2003000300005

Collins E, Sim ATR. Regulation of neuronal PP1 and PP2during development. Meth Mol Biol. 1998; 38: 21-43.

Cook R, Wu CC, Kang YJ, Han J. The role of the p38pathway in adaptive immunity. Cell Mol Immunol.,4(4):253-9, 2007.

Costa MS, Botton P, Mioranzza HS, Souza DO, PorciúnculaLO. Caffeine prevents age-associated recognition memorydecline and changes brain-derived neurotrophic factor andtirosine kinase receptor (trkb) content in mice.Neuroscience. 2008; 153: 1071–1078.

Cunha RA .Adenosine as a neuromodulator and as ahomeostatic regulator in the nervous system: differentroles, different sources and different receptors.Neurochem Int. 2001; 38:107–125.

DA Silva RS, Hoffman A, De Souza Do, Lara DR, Bonan CD.Maternal caffeine intake impairs MK-801-inducedhyperlocomotion in young rats. Eur J Pharmacol.2005;509(2-3):155-9.

Davis JM, Zhao Z, Stock HS, Mehl KA, Buggy J, Hand GA.Central nervous system effects of caffeine and adenosineon fatigue. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2003; 284(2):R399-404.

Daly JW. Caffeine analogs: biomedical impact. Cellularand Molecular Life Sciences. 2007; 64:2153–2169.

Dérijard B, Hibi M, Wu I-H, Barrett T, Su B, Deng T,Karin M, Davis RJ. JNK1: a protein kinase stimulated byUV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell, 76:1025–1037, 1994.

Dews, P.B.,. Behavioral effects of caffeine. In: Dews,P.B. (Ed.),Caffeine. Springer. 1984;New York.

Dong C, Davis RJ, Flavell RA. MAP kinases in the immuneresponse. Annu Rev Immunol., 20:55-72, 2002.

Dórea JG, Costa THM. Is coffee a functional food? Br JNutr. 2005; 93:773-82.

Enslen H, Brancho DM, Davis RJ. Molecular determinantsthat mediate selective activation of p38 MAP kinaseisoforms. EMBO Journal, 15;19(6):1301-11, 2000

Espinosa J, Rocha A, Nunes F, Costa MS, Schein V,Kazlauckas V, Kalinine E, Souza DO, Cunha RA, PorciúnculaLO. Caffeine consumption prevents memory impairment,neuronal damage, and adenosine A2A receptors upregulationin the hippocampus of a rat model of sporadic dementia. JAlzheimers Dis. 2013 Jan 1;34(2):509-18. doi:10.3233/JAD-111982.

Ferré S . An update on the mechanisms of thepsychostimulant effects of caffeine. J Neurochem. 2008;105 (4): 1067-79.

Fredholm B. B.Are methylxanthine effects due toantagonism of endogenous adenosine? Trends inPharmacological Sciences. 1980; 1:129–132..

Fredholm BB, Bättig K, Holmén J, Nehlig A, Zvartau EE.Actions of caffeine in the brain with special referenceto factors that contribute to its widespread use.Pharmacol Rev. 1999; 51(1):83-133.

Fredholm BB, Chen JF, Cunha RA, Svenningsson P, VaugeoisJM. Adenosine and brain function. Int Rev Neurobiol.2005;63: 191–270.

Fisone G, Borgkvist A, Usiello A. Caffeine as apsychomotor stimulant: mechanism of action. Cell Mol LifeSci. 2004; 61(7-8):857-72.

Geller AM, Zenick H. Aging and the environmental: Aresearch framework. Environmental Health Perspectives •VOLUME 113 | NUMBER 9 | September 2005.

Glade M. Caffeine-not just a stimulant. Nutrition. 2010;26:932–938. [PubMed: 20888549].

Han J, Lee J-D, Bibbs L, Ulevitch RJ. A MAP kinasetargeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammaliancells. Science, 265:808–811, 1994

Heckman M, Weil J, Gonzalez de Mejia E. Caffeine (1, 3,7-trimethylxanthine) in foods: a comprehensive review onconsumption, functionality, safety, and regulatorymatters. J Food Sci. 2010; 75:R77–87. [PubMed: 20492310].

Heuser VD, da Silva J, Moriske HJ, Dias JF, Yoneama ML,de Freitas TR. Genotoxicity biomonitoring in regionsexposed to vehicle emissions using the Comet assay andthe Micronucleus test in native rodent Ctenomys minutus.Environ Mol Mutagen. 2002; 40:227-35.

Heuser VD, Andrade VM, Peres A, Braga LMGM, Chies JAB.Influence of age and sex on the spontaneous DNA damagedetected by Micronucleus test and Comet assay in miceperipheral blood cells. Cell Biology International. 2008;32: 1223-1229.

Hoexter MQ, Rosa PS, Tufik S, Mello LE. Consequences ofprolonged caffeine administration and its withdrawal onpilocarpine- and kainate-induced seizures in rats.Epilepsia. 2005; 46(9):1401-6.

Iarmarcovai G, Bonassi S, Sari-Minodier I, Baciuchka-Palmaro M, Botta A,Orsie`re T. Exposure to genotoxicagents, host factors, and lifestyle influence the numberof centromeric signals in micronuclei: a pooled re-analysis.Mutat Res. 2007; 615:18-27.

Johnson GL, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinasepathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases.Science, 298: 1911-2, 2002.

Johnson-Kozlow M, Kritz-Silverstein D, Barrett-Connor E,Morton D (2002) Coffee consumption and cognitive functionamong older adults. Am J Epidemiol 156, 842-850.

Kalda A, Yu L, Oztas E, Chen JF. Novel neuroprotection bycaffeine and adenosine A2A receptor antagonists in animalmodels of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 2006; 25:248:9-15

Keshe Y, Seger R. The MAP kinase signaling cascades: asystem of hundreds of components regulates a diverse

array of physiological functions. Methods Mol Biol.661:3-38, 2010.

Kosik K S, Rapp PR, Raz N, Small SA, Sweatt JD, TsaiLH. Mechanisms of Age-Related Cognitive Change andTargets for Intervention: Epigenetics. J Gerontol. BiolSci Med Sci. 2012; 67 (7) 741-6.

Krishna M, Narang H. The complexity of mitogen- activatedprotein kinases (MAPKs) made simple. Cell. Mol. LifeSci., 65, 3525 – 3544, 2008.

Kyriakis JM, Banerjee P, Nikolakaki E, Dai T, Rubie EA,Ahmad MF, Avruch J, Woodgett JR. The stress-activatedprotein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature,369:156–160, 1994.

Kyriakis JM, Avruch J. Mammalian mitogen-activatedprotein kinase signal transduction pathways activated bystress and inflammation. Physiol. Rev., 81(2): 807-69,2001.

Lau CE, Falk JL. Dose-dependent surmountability oflocomotor activity in caffeine tolerance. PharmacolBiochem Behav. 1995; 52:139–143. [PubMed: 7501656].

Lima FA, Sant’ana AEG, Ataíde TR, Omena CMB, Menezes MES,Vasconcelos SML. Café e saúde humana: um enfoque nassubstâncias presentes na bebida relacionadas às doençascardiovasculares. Rev. Nutr., Campinas, 23(6):1063-1073,nov./dez., 2010.

Lindsay J, Laurin D, Verreault R, Hebert R, Helliwell B,Hill GB, McDowell I (2002) Risk factors for Alzheimer’sdisease: a prospective analysis from the Canadian Studyof Health and Aging. Am J Epidemiol 156, 445-453.

Liu J, Lin A. Role of JNK activation in apoptosis: adouble- edged sword. Cell Res., 15(1):36-42, 2005.

Lorist MM, Tops M. Caffeine, fatigue, and cognition.Brain Cogn. 2003; 53 (1):82-94.

Maia L, de Mendonca A (2002) Does caffeine intake protectfrom Alzheimer’s disease? Eur J Neurol 9, 377-382.

Mansour A, Hans EK. Cytotoxicity and mutagenicity ofendogenous DNA base lesions as potential cause of humanaging. Mech Dev Aging. 2008; 129 (7-8) :353-65.

McLean, I. G.; Abel, M.; Challies, C. N.; Heppelthwaite,S.; Lyall, J.; Russ, R. B. 1997. The Fiordland CrestedPenguin (Eudyptes pachyrhynchus) survey, stage V: mainlandcoastline, Bruce Bay to Yates Point. Notornis 44: 37-47

Medvedev Z. An attempt at a rational classification oftheories of ageing. Biol Rev Camb Philos Soc 1990; 65(3):375-398.

Partridge L, Gems D. Mechanisms of ageing: public orprivate? Nature Rev Gen 2002; 3:165-175.

Ray LB, Sturgill TW. Insulin-stimulated microtubule-associated protein kinase is phosphorylated on tyrosineand threonine in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 3753-3757, 1988.

Ritchie K, Carriere I, de Mendonca A, Portet F, DartiguesJF, Rouaud O, Barberger-Gateau P, Ancelin ML (2007) Theneuroprotective effects of caffeine: a prospectivepopulation study (the Three City Study). Neurology 69, 536-545.

Rossomando AJ, Payne DM, Weber MJ, Sturgill TW. Evidencethat pp42, a major tyrosine kinase target protein, is amitogen-activated serine/threonine protein kinase. Proc.Natl. Acad. Sci., 86: 6940-6943, 1989.

Roux PP, Blenis J. ERK and p38 MAPK-activated proteinkinases: a family of protein kinases with diversebiological functions. Microbiol Mol Biol Rev., 68(2):320–344, 2004

Rubinfeld H, Seger R. The ERK cascade: A prototype ofMAPK signaling. Mol Biotechnol., 31(2): 151-174, 2005.

Santos C, Costa J, Santos J, Vaz-Carneiro A, Nunet N.Caffeine Intake and Dementia: Systematic Review and Meta-Analysis. Journal of Alzheimer’s Disease 20 (2010) S187–S204 S187 DOI 10.3233/JAD-2010-091387.

Sheppard AB, Gross SC, Pavelka SA, Hall MJ, Palmatier MI.Caffeine increases the motivation to obtain non-drugreinforcers in rats. Drug Alcohol Depend. 2012 August 1;124(3): 216–222.

Shikitt-Hale B. Miller MG, Chu Y, Lyle BJ, Joseph JA.Coffee, but not caffeine, has positive effects oncognition and psychomotor behavior in aging. Age (Dordr).2013 Jan 24 PMID: 23344884 [PubMed - as supplied bypublisher].

Smith A. Effects of caffeine on human behavior. Food ChemToxicol. 2002; 40 (9):1243-55.

Snyder SH, Katims JJ, Annau Z, Bruns RF, Daly JW.Adenosine receptors and behavioral actions ofmethylxanthines. Proc Natl Acad Sci EUA. 1981; 78(5):3260-4.

Sonsalla PK, Wong LY. Harris SL, Richardson JR, KhobahyI, Li W, Gadad BS, German DC. Delayed caffeine treatmentprevents nigral dopamine neuron loss in a progressive ratmodel of Parkinson's disease. Exp. Neurol. 2012; 234:482–487.

Srisuphan W, Bracken MB. Caffeine consumption duringpregnancy and association with late spontaneous abortion.Am J Obstet Gynecol. 1986;154(1):14-20.

Stoppe JA. Aspectos clínicos da depressão em idosos.Psiquiatria Clinica. 1994. 21: 121-128.

Tannahill R. 1989. Food in History. Crown Publishers, NewYork.APUD IN Smith, A. Effects of caffeine on humanbehavior. Food Chem Toxicol. 2002; 40(9):1243-55.

Thomas GM, Huganir RL. MAPK cascade signaling andsynaptic plasticity. Nat Rev Neurosci., 5: 173 – 183,2004.

van Gelder BM, Buijsse B, Tijhuis M, Kalmijn S, GiampaoliS, Nissinen A, Kromhout D (2007) Coffee consumption isinversely associated with cognitive decline in elderlyEuropean men: the FINE Study. Eur J Clin Nutr 61, 226-232.

Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M,Telser J. Free radicals and antioxidants in normalphysiological functions and human disease.Int J BiochemCell Biol. 2007;39(1):44-84. Epub 2006 Aug 4.

Vangkilde S, Bundesen C, Coull JT. Prompt butinefficient: nicotine differentially modulates discretecomponents of attention. Psychopharmacology (Berl). 2011;218:667–680. [PubMed: 21629997].

Ventura JJ, Hübne A, Zhang C, Flavell RA, Shokat KM,Davis RJ. Chemical genetic analysis of the time course ofsignal transduction by JNK. Mol Cell., 3;21(5):701-10,2006.

Veras R. Envelhecimento populacional comtemporâneo:demadas, desafios e inovações. Rev Saúde Pública2009;43(3):548-54

Weinert B, Timiras P. Invited review: theories of aging. JAppl Physiol 2003; 95:1706-1716.

Wiltfang J, Lewczuk P, Rieder P, Grunblatt E, Hock C,Scheltens P, Hampel H, Vanderstichele H, Iqbal K, GalaskoD, Lannfelt L, Otto M, Esselman H, Henkel AW, KornhumbergJ, Blennow K. Consensus paper of the WFSBP Task Force onbiological markers of dementia: The role of CSF and bloodanalysis in the early and differential diagnosis ofdementia. Rev Psiq Clin. 2009;36(1):1-16.

Wojda A, Zietkiewicz E, Witt M. Effects of age and genderon micronucleusand chromosome nondisjunction frequenciesin centenarians and younger subjects. Mutagenesis. 2007;22:195-200.

Yoshimura H (2005) The potential of caffeine forfunctional modification from cortical synapses to neuronnetworks in the brain. Curr Neuropharmacol 3, 309-316.