Polska Platforma Medyczna

Polish Platform of Medical Research

https://ppm.edu.pl

Repozytorium Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Repository of Wroclaw Medical University

https://ppm.umed.wroc.pl

Publikacja / Publication Ekspresja wybranych czynników molekularnych w chorobie Gravesa-Basedowa, Domosławski Paweł

Adres publikacji w Repozytorium URL / Publication address in Repository https://ppm.umed.wroc.pl/info/book/UMW00987c4dea604feda435d3546af7b1e8/

Data opublikowania w Repozytorium / Deposited in Repository on Nov 13, 2020

Rodzaj licencji / Type of licence Attribution CC BY

Cytuj tę wersję / Cite this versionEkspresja wybranych czynników molekularnych w Domosławski Paweł:

chorobie Gravesa-Basedowa, [Rozprawy Habilitacyjne Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu], no. 14/2013, 2013, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ISBN 978-83-7055-518-4, 97 p.

Paweł Domosławski

Ekspresja wybranych czynników molekularnych

w chorobie Gravesa-Basedowa

Wrocław 2013

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Endokrynologicznej

Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Recenzja wydawnicza dr hab. Piotr Dzięgiel, prof. nadzw.

Opracowanie redakcyjne Małgorzata Kuniewska-Kaucz

Opracowanie typograficzne i przygotowanie do druku Zofia Gacek

14/2013

ISBN 978-83-7055-518-4

© Copyright by Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu Wrocław 2013

Nakład: 80 egz. Druk: ARGI

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

Dedykuję Ojcu

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

Podziękowania

Składam serdeczne podziękowania za zaangażowanie w powstanie tej pracy i chęć współpracy,

kierownikowi Katedry i Zakładu Histologii i Embriologii UMW, dr. hab. Piotrowi Dzięgielowi, prof. nadzw.

oraz dr hab. Marzennie Podhorskiej-Okołów, prof. nadzw., lek. med. Bartoszowi Pule oraz całemu zespołowi Zakładu.

Bez ich współpracy praca nie powstałaby.

Badanie było współfinansowane z działalności statutowej Uczelni (zadanie ST-654).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

SPIS TREŚCI

1. WSTĘP ......................................................................................................................... 5 1.1. Czynniki wpływające na czynność gruczołu tarczowego............... 8

1.1.1. Receptor TSH........................................................................................ 8 1.1.2. TSH ........................................................................................................... 8 1.1.3. Przeciwciała .......................................................................................... 8

1.2. Etiologia ............................................................................................................. 9 1.2.1. Czynniki genetyczne ....................................................................... 10 1.2.2. Czynniki środowiskowe.................................................................. 13 1.2.3. Czynniki endogenne ....................................................................... 16

1.3. Rozpoznanie choroby Gravesa-Basedowa ......................................... 17 1.4. Leczenie choroby Gravesa-Basedowa.................................................. 18

1.4.1. Leczenie zachowawcze .................................................................. 18 1.4.2. Leczenie jodem radioaktywnym (131J)....................................... 19 1.4.3. Leczenie chirurgiczne ..................................................................... 20

1.5. Pozatarczycowe objawy choroby Gravesa-Basedowa................... 21 1.5.1. Orbitopatia.......................................................................................... 21 1.5.2. Dermatopatia i akropachia ........................................................... 23

1.6. Potencjalne markery molekularne w ch.GB ...................................... 23 1.6.1. Cyklooksygenaza-2 (COX-2) ......................................................... 23 1.6.2. Metalotioneiny .................................................................................. 24 1.6.3. Ki-67 ....................................................................................................... 27

2. ZAŁOŻENIA I CEL PRACY.................................................................................... 28 3. MATERIAŁ I METODY........................................................................................... 29

3.1. Materiał ............................................................................................................ 29 3.1.1. Grupa badana .................................................................................... 29

3.2. Metody ............................................................................................................. 30 3.2.1. Pobieranie i przygotowanie materiału do badań................. 30 3.2.2. Barwienie hematoksylina – eozyna (H+E) ............................... 31

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 4 –

3.2.3. Reakcje immunohistochemiczne (IHC) .................................... 32 3.2.4. Ocena reakcji IHC.............................................................................. 33 3.2.5. Izolacja całkowitego RNA .............................................................. 34 3.2.6. Reakcja odwrotnej transkrypcji................................................... 35 3.2.7. Reakcja Real-Time PCR.................................................................... 36 3.2.8. Analiza statystyczna ........................................................................ 37

4. WYNIKI ...................................................................................................................... 38 4.1. Ekspresja badanych markerów (COX-2, MT-I/II, ER, PR, Ki-67)

w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym ................ 38 4.2. Ekspresja badanych markerów (COX-2, MT-I/II, ER, PR, Ki-67)

w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym w zależności od płci oraz wieku pacjentów ....................................... 45

4.3. Korelacja nasilenia badanych markerów w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym ........................................ 47

4.4. Ekspresja mRNA funkcjonalnych izoform metalotionein w badanych zmianach tarczycy.............................................................. 52

4.5. Poziom ekspresji mRNA badanych izoform metalotionein w chorobie Gravesa-Basedowa, wolu guzowatym i niezmienionej tkance tarczycy w zależności od płci oraz wieku pacjentów ....................................... 59

4.6. Korelacja poziomu ekspresji poszczególnych mRNA izoform metalotionein w badanych zmianach tarczycy ............................... 61

5. DYSKUSJA................................................................................................................ 65 6. WNIOSKI................................................................................................................... 77 7. WYKAZ WAŻNIEJSZYCH SKRÓTÓW............................................................... 78 8. PIŚMIENNICTWO................................................................................................... 80 9. STRESZCZENIE ....................................................................................................... 96

10. SUMMARY................................................................................................................ 97

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

1. WSTĘP Choroba Gravesa-Basedowa (ch.GB), zwana w literaturze an-

glojęzycznej jako choroba Gravesa (GD), jest chorobą autoimmuno-logiczną (AITD – autoimmune thyroid disease). Przyczyną choroby są przeciwciała pobudzające komórkowy receptor tyreocytu. Jest to typowa choroba autoimmunologiczna, związana z limfocytami T i charakteryzuje się powiększeniem gruczołu tarczowego, wytrzesz-czem gałek ocznych, przyspieszoną akcją serca oraz zwiększoną po-budliwością nerwową [127]. Powstaje jako następstwo różnego ro-dzaju interakcji między licznymi czynnikami genetycznymi oraz czynnikami środowiskowymi [57].

Do autoimmunologicznych chorób tarczycy należą dwie jed-nostki chorobowe, choroba Gravesa-Basedowa i choroba Hashimoto (HD). W obu występuje naciek limfocytarny tkanki tarczycowej. W ch.GB naciek jest umiarkowany, jest indukowane wytwarzanie prze-ciwciał przeciwko receptorowi TSH tyreocytu, powodując stymulację komórek do wzrostu i nadmiernego wytwarzania hormonów tarczycy. W chorobie Hashimoto limfocytarny naciek zapalny tkanki ma większe nasilenie, powoduje niszczenie komórek pęcherzykowych tarczycy i prowadzi do rozwoju niedoczynności tarczycy [138].

Pierwsze wzmianki o chorobie Gravesa-Basedowa pojawiły się w pracach Arystotelesa i Xenofona w V wieku przed naszą erą [38]. Choroba ta po raz pierwszy została opisana przez Irlandczyka, Rober-ta Gravesa w 1835 r. i została nazwana jego imieniem. Graves opisał w swojej monografii przypadki 3 kobiet ze szpitala Meath w Dublinie z triadą objawów: tachykardi, wola szyjnego i wytrzeszczu gałek ocznych [38]. W tym samym czasie objawy te opisał również K. A. Ba-sedow (1799–1854), lekarz powiatowy w Merseburgu w Niemczech, a triada objawów tej choroby była nazywana również „traidą merse-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 6 –

burską”. W piśmiennictwie anglosaskim stosuje się określenie choro-ba Gravesa, w Polsce choroba Gravesa-Basedowa (ch.GB).

W 1956 r., niezależnie w 4 ośrodkach, ukazały się doniesienia o badaniach doświadczalnych nad ch.GB. Naukowcy z Uniwersytetu Buffalo w Nowym Jorku, z Oksfordu i Londynu oraz z Nowej Zelandii wykryli przeciwciała skierowane przeciwko tarczycy [138]. W 1958 r. McKenzie odkrył, że we krwi pacjentów z chorobą Grave-sa-Basedowa znajduje się tzw. długo działający czynnik pobudzający tarczycę – long acting thyroid stymulator (LATS), stąd na początku te przeciwciała nazywano czynnikiem LATS [38].

Skłonność do chorób autoimmunologicznych tarczycy zależy od czynników genetycznych i środowiskowych, epidemiologia tej choroby jest jednak różna w wielu miejscach i w różnych popula-cjach. Na choroby autoimmunologiczne tarczycy cierpi około 5% ogólnej populacji, a zapadalność wynosi 0,22–0,27/1000 osób [87, 175, 176]. Z badań ludności zamieszkującej Sztokholm (Szwecja), opublikowanych w 2008 r., wynika, że zapadalność na ch.GB wynosi 24,5/100 000 mieszkańców, z przewagą kobiet w stosunku do męż-czyzn 3,4 : 1 oraz szczytem zachorowalności w wieku 30–39 lat [3]. Wśród kobiet zapadalność na tę chorobę wynosi około 0,5–2% i jest u nich około 10 razy częstsza niż u mężczyzn, głównie na terenach, gdzie nie występuje niedobór jodu, tam bowiem jest to najczęstsza przyczyna nadczynności tarczycy [138].

Długoterminowe badania, prowadzone przez Mayo Clinic w latach 1935–1967, nie wykazały znaczącego zwiększenia zapadal-ności na chorobę Gravesa-Basedowa, natomiast zanotowano istotny wzrost zachorowalności na chorobę Hashimoto [71]. Badania po-równawcze z innego ośrodka w Szwecji (Malmö), wykazały wzrost zachorowalności na ch.GB w latach 1970–1974 w porównaniu do późniejszego okresu 1988–1990 [21]. W ocenie występowania cho-roby Gravesa-Basedowa bierze się pod uwagę czynniki zarówno środowiskowe, jak i nasilenie się tej choroby w niektórych popula-cjach ludzkich [138].

W Stanach Zjednoczonych obserwuje się obecność przeciw-ciał przeciwtarczycowych do 10% populacji i u około 25% kobiet powyżej 60. roku życia [87, 150]. Wśród różnych ras zamieszkujących USA, wysokie stężenie przeciwciał przeciwtarczycowych stwierdzo-no u 15,3% rasy białej, u 10,9% amerykańskich Meksykan, a tylko

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 7 –

u 5,3% rasy czarnej [87]. W populacji brytyjskiej wykazano występo-wanie przeciwciał tarczycowych u 10% kobiet w wieku po meno-pauzie, powodujących niedoczynność tarczycy oraz u 0,5% osób, u których wystąpiła nadczynność tego gruczołu. Wysokie stężenie przeciwciał tarczycowych powodowało progresję, do wystąpienia jawnej niedoczynności u 2–4% osób w skali roku [181].

Choroba Gravesa-Basedowa charakteryzuje się występowa-niem przeciwciał, które pobudzają gruczoł tarczowy do nadmierne-go wytwarzania hormonów tarczycy, do proliferacji komórek tego narządu i jego wzrostu. W ch.GB występuje wiele objawów, do któ-rych należy zaliczyć: stałe uczucie gorąca, utratę masy ciała, nietole-rancję ciepła, trudności w zasypianiu, uczucie drżenia, zwiększoną liczbę oddawanych stolców, osłabienie obwodowych mięśni, roz-drażnienie, nieregularne miesiączki u kobiet. U pacjentów stwierdza się: tachykardię, wytrzeszcz gałek ocznych, opóźnienie w ruchach powiek, wole szyjne, uczucie drżenia mięśni w spoczynku, nadpo-budliwość mięśni, stałe pocenie się i gładką jedwabistą skórę [77]. Do rzadszych objawów, występujących u mniej niż 1% chorych, na-leżą: dermopatia, obrzęk przedgoleniowy i akropachia, opisane w dalszej części pracy. U mężczyzn z ch.GB może występować gine-komastia, obniżone libido i zaburzenia erekcji. Następuje stała utrata masy ciała, mimo znacznego apetytu [77]. W porównaniu do młod-szych pacjentów z ch.GB, u starszych osób w mniejszym stopniu występuje tachykardia i drżenia, a dominującym objawem jest utra-ta masy ciała lub zaburzenia depresyjne. U osób powyżej 50. roku życia częstym objawem jest migotanie przedsionków [98].

Pozatarczycowe objawy ch.GB, takie jak orbitopatia, dermopa-tia, akropachia, będące jej częścią, nadają jej charakter układowy [138].

Histologicznie ch.GB charakteryzuje się naciekami limfocy-tarnymi z komórek T, nacieki te nie naruszają jednak struktury ko-mórek pęcherzykowych tarczycy, jak w chorobie Hashimoto, poza tym, że wykazują skłonność do hiperfunkcji [138].

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 8 –

1.1. Czynniki wpływające na czynność gruczołu tarczowego

1.1.1. Receptor TSH

Receptor TSH, umiejscowiony w podstawnobocznej części ty-

reocytu, jest odpowiedzialny za regulację syntezy hormonów tarczycy i wzrost komórki tarczycowej. Należy do grupy receptorów G – prote-inowych i składa się z 398 aminokwasów. Część zewnątrzwydzielnicza, N-terminal, składa się z 266 aminokwasów tworzących siedem pętli, a część wewnątrzkomórkową tworzą pozostałe aminokwasy [177]. Doj-rzały receptor TSH zawiera dwie podjednostki A (55 kDa) umiejscowio-ne zewnątrzkomórkowo oraz podjednostkę B w błonie komórkowej. Wszystkie są związane wiązaniami dwusiarczkowymi [94].

1.1.2. TSH

TSH (thyroid stimulating hormone) – hormon tyreotropowy, jest

wytwarzany przez przysadkę mózgową. Łączy się z receptorem TSH tyreocytu, pobudzając komórkę tarczycową do wydzielania hormonów tarczycy oraz jej wzrostu [177].

Mechanizm działania i pobudzania receptora TSH przez samo TSH i przeciwciała nie jest do końca wyjaśniony. Przypuszcza się, że zarówno przeciwciała stymulujące (TRAbs), jak i blokujące ten receptor (TSHB- TSH- binding) wiążą się z nim w różnych miejscach z tym, że przeciwciała blokujące mają do niego większe powinowactwo [154].

1.1.3. Przeciwciała

Przeciwciała są czasami opisywane jako stymulująco-blokujące

(thyroid stimulation blocking antibodies – TSBAbs); jest to związane z istnieniem zarówno przeciwciał pobudzających, jak i blokujących, a efekt w postaci blokowania lub stymulacji komórki tarczycowej zale-ży od wzajemnej przewagi jednych przeciwciał nad drugimi [144].

Przeciwciała przeciwko receptorowi TSH komórki tarczycowej mogą nie powodować żadnego efektu klinicznego, mogą również stymulować lub blokować receptor TSH. W zależności od poziomu po-szczególnych przeciwciał, stymulujących lub blokujących, objawy cho-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 9 –

roby mogą wystąpić w postaci nadczynności lub niedoczynności tar-czycy [144]. W ch.GB w przeważającej ilości występują przeciwciała stymulujące receptor TSH. Receptor tarczycowy może również wystę-pować w adipocytach, a dokładnie w preadipocytach, co obecnie jest częścią założeń w badaniu etiopatogenezy orbitopatii tarczycowej [138].

Przeciwciała TPO (TPO-Abs), zwane wcześniej przeciwciałami antymikrosomalnymi, są wyznacznikiem choroby autoimmunologicz-nej tarczycy i są spotykane w chorobie Gravesa-Basedowa [125]. Prze-ciwciała te występują przeciwko peroksydazie, (hTPO- human thyroid peroxidase), enzymu biorącego udział w syntezie hormonów tarczycy. TPO katalizuje utlenianie jodu i sprzęganie jodotyrozyn w mono-, di-, tri- i tetrajodotyroninę. Trijodotyronina (T3) i tetrajodotyronona (T4) są właściwymi hormonami tarczycy działającymi obwodowo [177].

Przeciwciała przeciw receptorom tarczycy TRAb są wyznacz-nikiem ch.GB, są obecne u ponad 90% chorych. U 5% pacjentów, mimo dodatnich stężeń przeciwciał TPO, nie stwierdza się obecności TRAb. Badania prospektywne wykazały, że osoby te mają biochemicznie mniejszą nadczynność, nie występuje tu orbitopatia i może to odpo-wiadać wczesnym objawom choroby Gravesa-Basedowa [185]. Innym wyjaśnieniem tego stanu może być zbyt mała czułość testów wykrywa-jących przeciwciała TRAb lub stan, kiedy przeciwciała te znajdują się jeszcze w gruczole tarczowym i przylegających węzłach chłonnych, a nie przedostały się tylko do układu krwionośnego [185].

1.2. Etiologia Obecnie przyjmuje się, że do wystąpienia choroby Grave-

sa-Basedowa niezbędny jest współudział czynników endogennych (genetycznych i wewnątrztarczycowych) oraz środowiskowych, czyli egzogennych [83]. Choroba częściej rozwija się wśród kobiet z często-ścią 5:1 do 10:1. Szczyt zachorowań występuje między 40 a 60 rokiem życia, ale choroba ta może pojawić się w każdym wieku [8]. Do czynni-ków wywołujących ch.GB należy zaliczyć: genetyczne predyspozycje, stres, czynniki infekcyjne oraz okres poporodowy [77]. Objawy choroby Gravesa-Basedowa pojawiają się szybciej niż w przebiegu choroby Hashimoto. Do rozwinięcia się nadczynności tarczycy wystarczą mie-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 10 –

siące, w przypadku autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, objawy mogą rozwijać się miesiącami, a nawet latami [64]. Choroba Grave-sa-Basedowa ma silną predyspozycję rodzinną, około 15% chorych ma bliskich krewnych chorych na tę chorobę, a u połowy z nich stwierdza się krążące przeciwciała przeciwtarczycowe [83]. Badania na bliźnię-tach dotkniętych tym schorzeniem wykazały współwystępowanie u 30–40% bliźniąt monozygotycznych i u około 7% bliźniąt dwuzygo-tycznych [29].

1.2.1. Czynniki genetyczne

Czynniki genetyczne zwiększają prawdopodobieństwo poja-

wienia się choroby Gravesa-Basedowa do 80%. Rozwój jest uwarunko-wany interakcją wielu genów o zmiennej penetracji. Do najlepiej po-znanych należą geny warunkujące odpowiedź immunologiczną i dzia-łania limfocytów. Wśród najbardziej istotnych polimorfizmów wymie-nia się te występujące w genach układu zgodności tkankowej, HLA (human leukocyte antigen) i ich allele DRB1*03 i DOQ1*0501. Czynniki te są powiązane z rozwojem ch.GB wśród populacji kaukaskiej [24].

Inne polimorfizmy to występujący w genie kodującym antygen 4, związany z limfocytem T (CTLA-4 – cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4, polimorfizm CT60) [24]. Jest to gen, nad którym obecnie jest prowadzonych najwięcej badań, a zlokalizowany jest na chromosomie 2q33 [57]. Polimorfizm genu CTLA-4 może mieć wpływ na ekspresję tyreocytu i odgrywać znaczącą rolę w etiopatogenezie choroby Grave-sa-Basedowa [101]. Wykazano w metaanalizie badań w populacji chiń-skiej, że trzy polimorfizmy w genie CTLA-4 (+49A/G, –318C/T i CT60) są związane z ryzykiem wystąpienia ch.GB [57]. Kolejny polimorfizm jest związany z genem kodującym cząsteczkę CD40, powierzchniowego receptora, który m.in. pobudza komórki układu odpornościowego (C-1T) [108]. Ponadto wymienia się jeszcze polimorfizm w genie kodu-jącym limfoidalną fosfatazę tyrozynową, w wyniku czego dochodzi do hamowania aktywacji limfocytów T PTPN22/LYP – lymphoid tyrosine phosphatase; polimorfizm C1858T) [162], a także polimorfizm genu kodującego receptor tyreotropiny (TSHR; polimorfizmy rs179247 i rs12101255) [166]. U osób leczonych interferonem znaczenie ma też gen kodujący tyreogloulinę, gdyż polimorfizm jednego nukleotydu

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 11 –

genu promotora tyreoglobuliny (1623A/G) również predysponuje do rozwinięcia się choroby Gravesa-Basedowa.

Rola stresu oksydacyjnego Proces autoimmunologiczny wyzwala reakcję zapalną, na sku-

tek której powstają reaktywne formy tlenu (reactive oxygen species – ROS). ROS powstają jako produkty metabolizmu komórek i są nie-zbędne do ich prawidłowego funkcjonowania. Wytwarzanie ROS może być zwiększone w pewnych sytuacjach patologicznych, doprowadza-jąc w konsekwencji do unicestwienia komórki [160, 180]. Z tego powo-du istnieją fizjologiczne mechanizmy antyoksydacyjne, mające na celu przeciwdziałanie tym zjawiskom. Wśród tych mechanizmów wymienia się system dysmutazy nadtlenkowej (SOD), katalizującej dysmutację anionorodnika nadtlenkowego. Enzym ten jest metaloproteiną. Innym mechanizmem antyoksydacyjnym jest system katalazy (CAT), katalizu-jący przemianę nadtlenku wodoru (H2O2) w wodę i tlen oraz system peroksydazy glutationu (GPX), który redukuje lipidową hydroksyperok-sydazę i jednocześnie powoduje oksydację glutationu [123]. Sytuacja, w której następuje przewaga układu oksydantów nad antyoksydanta-mi nosi nazwę stresu antyoksydacyjnego [160].

Podczas syntezy hormonów tarczycy wytwarza się m.in. nadtle-nek wodoru (hydrogen peroxide H2O2), będący bardzo czynnym wolnym rodnikiem tlenowym. Związek ten wraz z utlenionym jodem (oxidized iodine) jest natychmiast wykorzystywany w reakcji peroksydazy, katali-zowanym przez tarczycową peroksydazę [109].

W tyreocytach istnieje system obrony antyoksydacyjnej, mający na celu ich ochronę przed reaktywnymi formami tlenu (ROS). Do sys-temu tego należą peroksyreduktaza, peroksydaza glutationu, tioreduk-taza oraz katalaza [164]. Peroksydazy należą do antyoksydacyjnych białek enzymatycznych, wysoce konserwatywnych. Peroksydaza 5 (PRDX5) w tyreocytach występuje głównie w cytoplazmie. Jej ekspresja jest związana z czynnością komórki tarczycowej i jest wyższa w wolu wieloguzkowym, a najwyższa w nadczynnej tarczycy [75]. Ekspresja katalazy oraz nadtlenku glutationu (glutathione peroxidase), również jest zwiększona w nadczynnej tarczycy [131]. Niewielka ilość produk-tów oksydacji jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania ko-mórki tarczycowej, w tym także do procesu jej proliferacji. Nadtlenek

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 12 –

wodoru i jod są substratami w wydzielaniu hormonów tarczycy, nad-miar jodu spowalnia wytwarzanie nadtlenku wodoru [35].

Choroba Gravesa-Basedowa charakteryzuje się zwiększonym stresem oksydacyjnym [197]. Abalovich w swoich badaniach na erytro-cytach osób z ch.GB wykazał zwiększenie stężenia markerów stresu oksydacyjnego z jednoczesnym zmniejszeniem stężenia markerów obrony antyoksydacyjnej. Wszystkie markery ulegały normalizacji po uzyskaniu stanu eutyreozy w wyniku leczenia zachowawczego metizo-lem, po leczeniu radiojodem, natomiast nie normalizowało się stężenie dysmutazy nadtlenowej [1]. W innych badaniach wykazano, że nawet pomimo uzyskania stanu eutyreozy, stwierdzano podwyższone stęże-nia markerów stresu oksydacyjnego. Podwyższone stężenie markerów stresu oksydacyjnego oraz markerów obrony antyoksydacyjnej były obserwowane zarówno w surowicy krwi, jak i w tkance tarczycowej u osób, u których leczenie zachowawcze nadczynności tarczycy trwało krócej niż 6 miesięcy [4].

Stres oksydacyjny odgrywa znaczącą rolę w odpowiedzi auto-immunologicznej w nadczynności tarczycy, stąd uzupełnienie leczenia zachowawczego podaniem odpowiedniego antyoksydantu pozwalało na wcześniejsze uzyskanie stanu eutyreozy [186]. Należy podkreślić, że leczenie zachowawcze metizolem powoduje normalizację markerów stresu oksydacyjnego w surowicy krwi u pacjentów z ch.GB, nie stwier-dza się natomiast tego zjawiska u chorych ze współistniejącą orbitopa-tią [19].

Występujący w limfocytach T-supresorowych wrodzony defekt genetyczny powoduje, że brak działania supresyjnego ze strony limfo-cytów T-helper pobudza limfocyty B do nadmiernego wytwarzania przeciwciał przeciwtarczycowych. Przeciwciała te pobudzają komór-kowy receptor tyreocytu, stymulując go do nadmiernego wydzielania hormonów tarczycy [83]. Wrodzony defekt genetyczny limfocytów T-supresorowych związanych z tarczycą, polega na zmniejszaniu się ich liczby i aktywności pod wpływem pewnych czynników środowisko-wych oraz na genetycznie uwarunkowanej zdolności komórki tarczy-cowej do zachowania się jak komórka immunokompetentna i prezen-tacji antygenu, jakim jest receptor TSH (TSHR). Receptor ten może być rozpoznany jako obcy dla układu immunologicznego, co powoduje stymulację wydzielania przeciwciał [83].

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 13 –

1.2.2. Czynniki środowiskowe Czynniki środowiskowe są współodpowiedzialne za wystąpie-

nie objawów ch.GB w około 20%. Należą do nich: narażenie na pro-mieniowanie jonizujące, podaż jodu, palenie papierosów, infekcje, stres i niektóre leki, np. lit i interferon [28].

Promieniowanie jonizujące Zewnętrzne napromieniowanie szyi podczas leczenia, np. ziar-

nicy złośliwej, może wywołać w późniejszym okresie pojawienie się przeciwciał przeciwtarczycowych. Leczenie jodem radioaktywnym nadczynności tarczycy może wywołać pojawienie się ch.GB i orbitopa-tii [58]. Choroba ta może się rozwinąć po około 3–6 miesiącach od te-rapii jodem-131, a w 4–5% przypadków równolegle pojawiają się prze-ciwciała przeciwko TSHR (u genetycznie predysponowanych pacjen-tów). U pozostałych chorych terapia jodem radioaktywnym nie powo-duje zwiększania stężenia przeciwciał TSHR [137]. Po eksplozji elek-trowni atomowej w Czarnobylu zaobserwowano u dzieci narażonych na ekspozycję na promieniowanie zwiększenie stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych [5].

Nadmierna podaż jodu Choroby autoimmunologiczne tarczycy częściej występują

w rejonach zasobnych w jod w codziennej diecie. Suplementacja jodu w rejonach, gdzie wcześniej występował jego niedobór jest związana z okresowym wzrostem występowania autoimmunologicznej nad-czynności tarczycy, co zaobserwowano w populacji duńskiej [111]. Nadmierna podaż jodu, szczególnie w obszarach, gdzie występuje jego niedobór, jest czynnikiem predysponującym do powstania ch.GB. Czę-sto obserwuje się rozwój nadczynności tarczycy po podaniu kontra-stów zawierających jod lub po amniodaronie, co tłumaczy się poprzez tzw. efekt Jod – Basedow [25, 151]. Efekt ten jest również znany pod nazwą efektu Wolffa-Chaikoffa. Zwiększona podaż jodu powoduje za-hamowanie wytwarzania hormonów tarczycy. Jednak po pewnym cza-sie lub w warunkach patologicznych tarczyca jakby „omija” ten me-chanizm i po 48–72 godzinach zaczyna ponownie wytwarzać hormony. Z tego powodu nadmiar jodu może wywołać zarówno nadczynność, jak i niedoczynność tarczycy [25]. Mechanizm wpływu jodu na zapocząt-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 14 –

kowanie procesów immunologicznych w tarczycy nie jest do końca poznany. Jod może pobudzać limfocyty B do nadmiernego wytwarza-niai immunogobulin oraz zwiększać aktywność makrofagów [34]. Nad-mierna ilość jodu ma ponadto wpływ na jego zawartość w cząstecz-ce tyreoglobuliny, co zwiększa jej immunogenność [155]. Nadmier-na ilość jodu może również mieć wpływ na transformację genetycz-nie predysponowanych komórek pęcherzykowych tarczycy do peł-nienia funkcji komórek prezentujących antygen (APCs – antigen pre-senting cells) i w ten sposób indukować powstanie choroby Grave-sa-Basedowa [126].

Selen Selen działa ogólnoustrojowo, głównie przez właściwości anty-

oksydacyjne. Jest odpowiedzialny za nastrój, płodność organizmu oraz prawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego. Niedobór tego pierwiastka wydłuża i zaostrza przebieg choroby Gravesa-Basedowa. Podawanie selenu u pacjentów z ch.GB, zmniejszało objawy orbitopatii i poprawiało jakość życia leczonych osób [121].

Palenie papierosów Palenie papierosów jest czynnikiem ryzyka wystąpienia choroby

Gravesa-Basedowa, a zwłaszcza orbitopatii w jej przebiegu [15, 30, 81, 114, 145, 159, 173, 183]. Palenie tytoniu ma wieloraki wpływ na gruczoł tarczowy. Nie tylko sprzyja wystąpieniu ch.GB, ale w czasie leczenia zachowawczego tionamidami obserwuje się trudności w uzyskaniu re-misji. Również u palaczy przebieg orbitopatii jest znacząco cięższy [83].

Wśród teorii tłumaczących wpływ tytoniu na rozwój choroby Gravesa-Basdeowa, wymienia się zmianę struktury TSHR pod wpływem nikotyny i innych substancji zawartych w dymie papierosowym, co może zwiększać wrażliwość receptora na autoantygeny i stymulować wydzielanie przeciwciał [16, 143]. Bufalo i wsp. wykazali, że polimor-fizm genów detoksyfikacyjnych i genów szlaków naprawczych DNA mają istotny wpływ na zapadalność na ch.GB. Autorzy wykazali, że po-limorfizm genów GSTP1, CYP1A1 i TP53 może być związany ze zwięk-szoną zapadalnością na ch.GB, tworząc jednocześnie swoisty profil ry-zyka rozwoju tej choroby [32]. Zawarte w dymie papierosowym tiano-cyty blokują transport jodu do tyreocytu, powodują zwiększenie wy-dzielania nadtlenku wodoru (H2O2), nasilając stres oksydacyjny, co

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 15 –

w powiązaniu z pewnymi predyspozycjami, może pogorszyć przebieg choroby Gravesa-Basedowa [99, 167].

Infekcje Infekcje wirusowe oraz bakteryjne (enterowirusami herpeswiru-

sami, retrowirusami, wirusem grypy typu B, wirusem Epstein-Barr – EBV, Yersinia enterocolitica), przez modyfikację własnych elementów strukturalnych oraz ich molekularne podobieństwo do receptora TSH, a także indukcję ekspresji molekuł układu HLA na komórkach tarczycy, powodują wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej i aktywację lim-focytów T [103]. Przewlekła stymulacja układu immunologicznego wi-rusem EBV może inicjować reakcję autoimmunologiczną. Akahori i wsp. opisali 3 przypadki jednoczesnego występowania ostrej infekcji EBV i ch.GB, gdzie infekcja wirusowa mogła być docelowym czynni-kiem sprawczym [6]. Leite i wsp. donoszą, że zakażenie wirusem Herpes typu 7 (HHV-7) zwiększa ponad trzykrotnie ryzyko wystąpienia choroby Gravesa-Basedowa, oraz że infekcja ta jest bardziej rozpowszechniona wśród pacjentów z tą chorobą [114]. W niektórych przypadkach infek-cji Yersinia enterocolitica uważano, że może być przyczyną ch.GB, przez podobieństwo strukturalne przeciwciała do receptora TSH [44]. Wolf i wsp. wykazali w swoich badaniach, że po przebytej infekcji Yersinia Enterocolitica u chorych pojawiają się immunoglobuliny klasy IgG, któ-re reagują z receptorem tarczycowym [193]. Zauważono również, że większe narażenie na zakażenie w środowiskach mniej higienicznych, w przeciwieństwie do środowisk o wyższej kulturze higienicznej, jest czynnikiem ochronnym przed pojawianiem się chorób autoimmuno-logicznych tarczycy [100]. Mimo licznych badań, nie ma jednak prze-konywających dowodów, że infekcje mogą prowadzić do wystąpienia chorób autoimmunologicznych tarczycy u człowieka. Nie ma jedno-znacznych dowodów, że wirusy mogą mieć wpływ na AITD. Podostre, wirusowe zapalenie gruczołu tarczowego, spowodowane kilkoma ty-pami wirusów, w rzadkich wypadkach powodowało autoimmunolo-giczne zapalenie tarczycy [138].

Stres Stres jest uważany za czynnik wyzwalający chorobę Grave-

sa-Basedowa, mechanizm tego zjawiska nie jest do końca poznany [130]. Przeżycie dużego stresu jest czasami podawane jako jedna

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 16 –

z przyczym mogących zapoczątkować pojawienie się objawów ch.GB. Liczne badania przeprowadzone na ludziach i zwierzętach w ostatnich latach wykazały, że stres psychologiczny i fizjologiczny może zapocząt-kować zmiany w układzie immunologicznym. Oddziaływanie na układ immunologiczny może być bezpośrednie lub pośrednie przez układ nerwowy lub endokrynny, co u predysponowanych genetycznie osobni-ków może wywołać pojawienie się choroby autoimmunologicznej [130].

Leki Leczenie litem jest związane ze zwiększonym występowaniem

przeciwciał przeciwtarczycowych, niedoczynnością tarczycy, w mniej-szym stopniu z nadczynnością tarczycy. Leczenie dużymi dawkami litu jest jednym ze sposobów szybkiego przygotowania pacjenta do zabie-gu operacyjnego nadczynnej tarczycy, gdzie występuje oporność na tradycyjne leczenie zachowawcze. Lit wpływa na zahamowanie wy-dzielania hormonów tarczycy, poprzez powstrzymywanie łączenia jo-dotyrozyn, gromadząc się w tarczycy, utrudnia wychwyt jodu przez tyreocyty. Ogranicza ponadto uwalnianie T3 i T4 z tarczycy i po-wstrzymuje obwodową konwersję T4 do T3. [22, 112].

Jednym z działań ubocznych leczenia interferonem alfa prze-wlekłego zapalenia wirusowego zapalenia wątroby typu C jest zapale-nie tarczycy, które w rzadkich przypadkach może prowadzić do wyin-dukowania się ch.GB [174].

1.2.3. Czynniki endogenne

Czynniki hormonalne, jak np. estrogen, mają większy wpływ na

częstsze występowanie choroby Gravesa-Basedowa wśród kobiet [69]. Także nadmiar glikokortykoidów w przebiegu zespołu Cushinga może wywołać u predysponowanych pacjentów chorobę autoimmunolo-giczną tarczycy [135].

Ciąża Nadczynność tarczycy pojawia się u około 0,1–0,2% kobiet

w ciąży. Nieleczona nadczynność tarczycy jest związana ze zwiększo-nym ryzykiem poronienia, przedwczesnego porodu, niskiej masy uro-dzeniowej niemowlęcia oraz zwiększonym ryzykiem powikłań około-porodowych. U matki mogą pojawić się takie objawy, jak: zwiększone

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 17 –

ryzyko uszkodzenia mięśnia sercowego, rzucawka okołoporodowa i przełom tarczycowy [82]. Metizol oraz propylotiouracyl, szczególnie w dużych dawkach, przechodzą przez łożysko do płodu, co może być powodem zaburzeń w funkcjonowaniu tarczycy u płodu. Leki przeciw-tarczycowe nie są jednak przeciwwskazane w ciąży, a sama ciąża nie jest przeciwwskazaniem dla kobiet aktualnie chorujących na ch.GB i przyjmujących leki przeciwtarczycowe [82]. W Stanach Zjednoczo-nych propylotiouracyl jest zalecanym lekiem do stosowania w czasie ciąży [37, 47]. W czasie terapii metizolem obserwowano takie efekty uboczne, jak: aplazja skóry w postaci licznych ognisk wielkości 0,5–3 cm oraz niedorozwój przełyku [82]. Monitorowanie ciąży za po-mocą badania USG ma na celu określenie rozwoju płodu oraz ocenę czy nie rozwija się wole szyjne, co może być oznaką zbyt dużych dawek leków przeciwtarczycowych stosowanych przez matkę lub pojawie-niem się ch.GB u płodu [119]. Terapia lekami przeciwtarczycowymi powinna być tak prowadzona, aby utrzymywać stężenie tyroksyny we krwi w górnych granicach normy lub nieco wyżej, aby zapewnić od-powiednie stężenie hormonów tarczycy u płodu [37]. Zarówno meti-zol, jak i propylotiouracyl pojawiają się w niewielkim stężeniu w mleku matki. Leki te nie wpływają znacząco na późniejszą czynność tarczycy u dziecka oraz na jego rozwój intelektualny. Rutynowa kontrola czyn-ności tarczycy u noworodka nie jest konieczna [120].

1.3. Rozpoznanie choroby Gravesa-Basedowa Chorobę Gravesa-Basedowa rozpoznaje się na podstawie obja-

wów klinicznych oraz zwiększonego stężenia tyroksyny (T4) oraz trójjodotyroniny (T3). Obecnie w testach najbardziej miarodajne jest oznaczenie wolnej formy tych hormonów, niezwiązanej z białkami w postaci FT3 i FT4. Oznaczenie stężenia przeciwciał przeciwko recep-torowi TSH (TSHR) potwierdza rozpoznanie tej choroby. Oznaczenie przeciwciał służy do potwierdzenia diagnozy, nie jest natomiast po-trzebne do dalszego monitorowania przebiegu choroby [77].

Badanie ultrasonograficzne pozwala określić wielkość, echo-strukturę i stwierdzane zmiany morfologiczne gruczołu. Badanie dop-plerowskie w ch.GB wykazuje wzmożony przepływ krwi przez miąższ tarczycy. Guzki hipoechogenne, z małym przepływem krwi, mogą być

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 18 –

objawem choroby nowotworowej, w takich sytuacjach zaleca się wy-konanie biopsji cienkoigłowej (BAC – biopsja aspiracyjna cienkoigło-wa), zwanej też jako: FNB (fine needle biopsy), w celu ustalenia rozpoznania [77]. Biopsja ciekoigłowa w ch.GB nabiera coraz większe-go znaczenia, gdyż według niektórych badań przebieg raka brodaw-kowatego tarczycy w ch.GB jest bardziej agresywny niż w przebiegu wola wieloguzkowego. Ma to jeszcze o tyle duże znaczenie, że do nie-dawna uważano, że nadczynność tarczycy i ch.GB wykluczały obecność zmian nowotworowych tarczycy [142].

Badanie scyntygraficzne, po podaniu jodu radioaktywnego (131J) po 24 godzinach, lub Technetu (99Tc) już po 20 minutach od jego poda-nia pozwala określić jodochwytność gruczołu. Wysoka jodochwytność, powyżej 60%, pozwala określić stan ponadnormatywnej aktywności gruczołu tarczowego, czyli nadczynność tarczycy. Jest to badanie, któ-re obecnie rzadziej jest podstawą diagnostyki nadczynnej tarczycy, stosowane jest głównie w diagnostyce różnicowej w celu odróżnienia, np. bolesnego stanu zapalnego tarczycy oraz u pacjentów z tarczycą o nieregularnym zarysie lub wolu wieloguzkowym, a zwłaszcza w wolu zamostkowym i odszczepach tarczycy [77].

W diagnostyce wytrzeszczu gałek ocznych należy stosować określenie skali wysunięcia się gałek ocznych poza brzeg kostny oczo-dołu za pomocą egzoftalmometru. Badanie to służy do badania postę-pu aktywnej formy oftalmopatii i powinno być uzupełnione podsta-wowym badaniem okulistycznym oraz badaniem dna oka [92].

1.4. Leczenie choroby Gravesa-Basedowa Leczenie można podzielić na kilka rodzajów: zachowawcze,

jodem radioaktywnym oraz operacyjne.

1.4.1. Leczenie zachowawcze Leczenie zachowawcze choroby Gravesa-Basedowa ma na celu

normalizację stężeń hormonów tarczycy. Polega na stosowaniu najczę-ściej metizolu, karbimazolu lub propylotiouracylu, leków które blokują etapy syntezy hormonów tarczycy. Leki te również działają immuno-supresyjnie. Propylotiouracyl blokuje dodatkowo obwodową konwer-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 19 –

sję tyrozyny do trójjodotyroniny [2]. Metizol ma dłuższy okres półtrwa-nia w gruczole tarczowym, co pozwala na stosowanie jednej dawki dziennie, w porównaniu do propylotiouracylu, który należy stosować trzy razy dziennie. Metizol ponadto powoduje mniej działań ubocz-nych i charakteryzuje się większą skutecznością farmakologiczną [42,132]. Leczenie metizolem wpływa również na normalizację para-metrów stresu oksydacyjnego w erytrocytach krwi obwodowej, lecze-nie natomiast jodem radioaktywnym nie wywołuje tego efektu [1].

Leczenie zachowawcze jest leczeniem podstawowym, po kilku tygodniach leczenia dużymi dawkami leków przeciwtarczycowych, uzyskuje się stan względnej eutyreozy. Następnie leczenie to jest kon-tynuowane mniejszymi dawkami tych samych leków przez około 12–18 miesięcy i okres ten jest najbardziej optymalny dla tego rodzaju terapii [2].

Pacjenci stosujący leczenie zachowawcze lekami hamującymi czynność tarczycy powinni być poinformowani, że podczas leczenia może dojść do wystąpienia działań ubocznych w postaci wysypki, bó-lów stawów i agranulocytozy. Agranulocytoza pojawia się przy stoso-waniu większych dawek leków i występuje u około 0,1–03% leczonych pacjentów [42].

Z różnych powodów u około 50% chorych po leczeniu farmako-logicznym dochodzi do nawrotu nadczynności tarczycy. Nie ma obiek-tywnych przesłanek, aby przewidzieć u kogo nastąpi ten nawrót [138].

W leczeniu ch.GB stosuje się również antyoksydany, opierając się na przesłance o roli stresu oksydacyjnego w patogenezie tej choro-by. W badaniach na małej populacji stosowano allopurynol i nikoty-namid, uzyskując poprawę w leczeniu łagodnej i średnio nasilonej or-bitopatii [27].

1.4.2. Leczenie jodem radioaktywnym (131J)

Leczenie jodem radioaktywnym (131J) może być stosowane jako

leczenie pierwszego rzutu lub po farmakologicznym leczeniu zacho-wawczym, szczególnie w przypadku nawrotu nadczynności tarczycy [179, 188].

Leczenie to wprowadzono w połowie lat 1940 XX wieku i do dziś jest dość szeroko stosowane, najczęściej w Stanach Zjednoczo-nych. Jest uznawane jako bezpieczne, efektywne i stosunkowo niedro-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 20 –

gie [82]. Najczęściej stosuje się izotop jodu, 131J. Izotop ten podaje się doustnie w postaci kapsułki lub płynu, po czym szybko następuje jego wchłanianie w przewodzie pokarmowym, a następnie absorpcja przez komórki pę-cherzykowe tarczycy. Efekt leczniczy uzyskuje się poprzez promienio-wanie beta, które niszczy komórki tarczycy oraz wywołuje stan zapalny i obliterację naczyń krwionośnych [82].

Przed leczeniem 131J należy odstawić leki przeciwtarczycowe na 3–7 dni. Po podaniu dawki jodu radioaktywnego nie należy już konty-nuować podawania leków przciwtarczycowych. Przed leczeniem jo-dem radioaktywnym wykonuje się scyntygrafię tarczycy w celu okre-ślenia jej jodochwytności, co w połączeniu z określeniem objętości gruczołu w badaniu USG daje możliwość określenia odpowiedniej dawki izotopu [7]. Celem leczenia jest wywołanie stanu niedoczynności gruczołu tarczowego, aby zapobiec nawrotom choroby Grave-sa-Basedowa. Cel ten uzyskuje się u około 80% pacjentów poddanych tej terapii [115]. Efekt leczenia uzyskuje się po 6–8 tygodniach po podaniu dawki 131J. W przypadku braku wystarczającego efektu po podaniu pierwszej dawki jodu oraz mając na uwadze powolne działa-nie 131J, podanie drugiej dawki izotopu można rozważyć dopiero po okresie 6–12 miesięcy [82].

Przewlekły stan zapalny i zwłóknienie tarczycy, powstałe po podaniu 131J powodują zmniejszenie się objętości gruczołu tarczowego i spadek jego zdolności do wytwarzania hormonów tarczycy [136].

Leczenie jodem radioaktywnym może czasami prowadzić do zwiększenia wytrzeszczu gałek ocznych. Jest to związane z pozosta-wioną tkanką tarczycy i możliwością dalszych reakcji immunologicz-nych [18, 182].

1.4.3. Leczenie chirurgiczne

Leczenie chirurgiczne choroby Gravesa-Basedowa pozostaje

najbardziej optymalną metodą terapii dla wielu pacjentów. Zabieg całkowitego usunięcia gruczołu tarczowego daje pacjentom najwięk-szą szansę zapobiegnięcia nawrotowej nadczynności tarczycy [102].

Jest to metoda dająca pacjentowi najbardziej przewidywalny efekt terapii ch.GB w najkrótszym czasie [139]. Wskazaniami do lecze-nia operacyjnego choroby Gravesa-Basedowa jest każdy przypadek tej

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 21 –

choroby o ciężkim przebiegu, zwłaszcza z nasiloną orbitopatią, przy-padki z dużym wolem i objawami uciskowymi oraz choroba przebiega-jąca w młodym wieku, wskazująca w etiopatogenezie na wyraźne tło genetyczne. Zabieg całkowitego usunięcia gruczołu tarczowego jest preferowany, szczególnie dla chorych z narastającą oftalmopatią [14, 53, 106].

1.5. Pozatarczycowe objawy choroby Gravesa-Basedowa

1.5.1. Orbitopatia Orbitopatia w przebiegu ch.GB (Graves’ orbitopathy – GO), zwa-

na również jako thyroid associated opthalmopathy (TAO) jest wynikiem zaburzenia immunologicznego, reprezentującego jeden z najczęst-szych pozatarczycowych objawów choroby Gravesa-Basedowa. Orbi-topatia jest obecna u około 50% pacjentów z ch.GB. Może pojawić się u chorych w okresie poprzedzającym chorobę lub jeszcze przed obja-wami nadczynności tarczycy (euthyroid or ophthalmic Graves’ disease), jak również u osób z autoimmunologiczną niedoczynnością tarczycy (choroba Hashimoto) [12, 17, 138]. Etiopatogeneza orbitopatii nie jest do końca poznana. Znaczenie ma powiązanie antygenów występują-cych w tarczycy i oczodole. Ostatnio pod uwagę bierze się mechanizm stymulacji receptora preadipocytów występujących w oczodole, co powoduje nadmierne powiększanie się tkanki okołogałkowej [138]. Aktywny proces immunozapalnej reakcji rozwija się w tkance pozagał-kowej. W procesie tym biorą udział limfocyty T i B, makrofagi, fibrobla-sty i preadipocyty, w których następuje miejscowo zwiększone wytwa-rzanie cytokin i hydrofilnych glikozoaminoglikanów.

Orbitopatia w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa jest spo-wodowana stanem zapalnym w tkance pozagałkowej oka. Zwiększenie adipogenezy i nadprodukcja glikozoaminogikanów zwiększa objętość tkanki pozagałkowej oczodołu i zwłóknienie mięśni gałki ocznej [63].

W proliferacji fibroblastów oczodołu znaczącą rolę odgrywa stres oksydacyjny.

W fibroblastach, uzyskanych z oczodołów osób z nasiloną orbi-topatią, wolne rodniki tlenowe stymulują komórkową proliferację w stopniu zależnym od ich liczby [33]. Orbitopatia najczęściej przebie-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 22 –

ga łagodnie, jest samoograniczającym się procesem, ale około 3–5% pacjentów wymaga później leczenia wad wzroku [17].

Wśród czynników mających wpływ na nasilenie się orbitopatii należy wymienić palenie papierosów oraz zaburzenia czynności tarczycy [17].

W leczeniu wytrzeszczu gałek ocznych należy się posługiwać wyznacznikami podanymi przez Europejską Grupę ds. Leczenia Orbi-topatii w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa z 2008 r. (European Group on Graves’ Orbitopathy – EUGOGO)) [17]. Pacjenci powinni być leczeni w centrach specjalistycznych, leczenie musi obejmować regu-lację czynności tarczycy, chorzy powinni być zachęcani do porzucenia nałogu palenia papierosów.

Chorzy z dużym nasileniem orbitopatii zagrażającej utratą wzroku, powinni być leczeni dożylnymi dawkami kortykosteroidów. Jeśli po 2 tygodniach leczenia nie uzyska się znaczących wyników, cho-rych trzeba kierować do pilnej chirurgicznej dekompresji oczodołów.

W przypadkach orbitopatii o średnim nasileniu na początku sto-suje się leczenie kortykosteroidami. W orbitopatii nieaktywnej do roz-ważenia jest leczenie chirurgiczne zeza, jeżeli się pojawił lub operacje powiek.

W lekkich przypadkach orbitopatii stosuje się środki działające miejscowo. Leczenie innego rodzaju, w tym leczenie chirurgiczne, na-leży stosować w przypadku pogorszenia się jakości życia.

Leczenie jodem radioaktywnym może przyspieszyć rozwój orbi-topatii, bardziej niż leczenie zachowawcze lekami przeciwtarczycowy-mi lub leczenie chirurgiczne [138]. W mojej wcześniejszej pracy z 2007 r., stwierdziłem, że leczenie operacyjne w postaci całkowitego usunięcia gruczołu tarczowego spowodowało zahamowanie postępu wytrzeszczu gałek ocznych, a u części chorych stwierdzono jego cof-nięcie się o 2–3 mm [53]. W innym doniesieniu w hodowli komórkowej fibroblastów stwierdzono, że metizol zapobiegał proliferacji fibrobla-stów wywołanej nadtlenkami, podczas gdy efekt ten był znacznie mniejszy w czasie leczenia propylotiouracylem [33].

W literaturze są doniesienia o skutecznym leczeniu orbitopatii za pomocą leków cytotoksycznych dla limfocytów B (B-lymphocyte-depleting anti-CD20 – antibody – rituksimab – RTX), a także antycyto-kinami [65, 153, 140].

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 23 –

1.5.2. Dermatopatia i akropachia Dermatopatia i akropachia są zmianami występującymi niezwy-

kle rzadko w przebiegu ch.GB. Dermatopatia tarczycowa w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa, zwana jest też obrzękiem przedgolenio-wym (pretibial myxoedema). Dermatopatia tarczycowa zawsze współ-istnieje z orbitopatią, a w przypadkach ciężkiego przebiegu choroby Gravesa-Basedowa również z akropachią.

Akropachia dotyczy palców rąk i polega na występowaniu ich niebolesnego obrzęku, czasami z towarzyszącym podokostnowym zgrubieniem kości [138].

Prawdopodobną przyczyną tych zmian jest wspólny antygen dla tarczycy, tkanki pozagałkowej i skóry, powiązany z receptorem TSH. Obecność tych objawów pozatraczycowych jest wyznacznikiem cięż-kości przebiegu ch.GB.

Obrzęk przedgoleniowy pojawia się symetrycznie po obu stro-nach podudzi, jak dotychczas nie udało się wyjaśnić mechanizmu jego powstania [66]. Zwykle przebieg jest o umiarkowanym nasileniu, choć może sięgać palców stóp. Leczenie w takich przypadkach polega na stosowaniu kortykosteroidów; jest trudne w przypadkach o nasilonym przebiegu [66].

1.6. Potencjalne markery molekularne w ch.GB

1.6.1. Cyklooksygenaza-2 (COX-2) Cyklooksygenaza (COX) katalizuje proces powstania prosta-

glandyn z kwasu arachidonowego. Prostaglandyny odgrywają znaczą-cą rolę w rozwoju zmian nowotowrowych, przez ich wpływ na angio-genezę, proliferację komórek oraz proces powstawania [96].

COX-1 występuje prawie we wszystkich komórkach organizmu. Gen kodujący ten enzym znajduje się na chromosomie 9q. Ekspresja COX-1 nie była obiektem szerokiego zainteresowania w badaniu zmian tarczycy, oprócz badań nad rakiem rdzeniastym tego narządu [20, 148].

COX-2 jest przeciwieństwem COX-1 pojawia się głównie w tkance patologicznej. Powstanie jej jest indukowane przez czynniki wzrostu, onkogeny, cytokiny, karcinogeny czy mediatory stanu zapal-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 24 –

nego. Gen dla COX-2 jest zlokalizowany na chromosomie 1 i koduje białko o mianie 70 kDA, które w 61% jest homologiczne z COX-1 [86]. COX-2 w warunkach fizjologicznych występuje w minimalnych ilo-ściach, praktycznie jest niewykrywalna w prawidłowych tkankach [104]. Ekspresja COX-2 jest obserwowana w komórkach nowotworo-wych, np.: jelita grubego, trzustki, prostaty, przełyku, płuc, żołądka i skóry [96]. Ekspresja mRNA COX-2 w komórkach nowotworowych zmian tarczycy jest wyższa niż w komórkach tkanki tarczycy otaczają-cych zmianę [165].

Niesteroidowe leki przeciwzapalne oraz kortykosteroidy zmniejszają ekspresję COX-2 [110, 149].

Prostaglandyny, będące końcowymi produktami cyklu cyklook-sygenazy-2, są zaangażowane w proces karcinogenezy oraz progresji nowotworowej poprzez hamowanie procesu apoptozy, indukowanie proliferacji komórkowej, pobudzanie angiogenezy i zwiększanie inwazji komórkowej [104]. Mają ponadto wpływ na naczyniowy czynnik wzrostu (vascular endothelial growth factor – VEGF), który stymuluje angiogenezę i zmniejsza odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko komór-kom rakowym [161, 163]. W tym kontekście przyjmowanie niesteroido-wych leków przeciwzapalnych – pochodnych aspiryny, przez wpływ na obniżenie wydzielania prostaglandyn, obniża w około 50% ryzyko raka piersi oraz nowotworów jelita grubego [76, 124].

1.6.2. Metalotioneiny

Metalotioneiny (MT) są to małocząsteczkowe białka (6–7 kDa)

o dużej homolgii, występujące prawie we wszystkich żywych organi-zmach. Po raz pierwszy zostały odkryte przez Margoshes i Vallee w 1957 r., kiedy podczas badań nad korą nerki konia wyizolowali białko odpowiedzialne za akumulację kadmu [122]. Ich łańcuch polipeptydo-wy składa się z 61–68 aminokwasów, wśród których około 1/3 stanowią cysteiny. Geny kodujące metalotioneiny znajdują się u człowieka na chromosomie 16, w obrębie regionu 16q13. Ogólnie zidentyfikowano 13 genów dla MT-I, dwa geny dla MT-II oraz pojedyncze geny kodujące MT-III i MT-IV [172].

Metalotioneiny wyizolowane z różnych tkanek od różnych zwie-rząt różnią się nieznacznie zawartością aminokwasów. Grupy tiolowe tych białek (-SH) są odpowiedzialne za przyłączanie metali takich, jak:

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 25 –

Zn, Cd, Cu, Pb, Fe, Hg oraz transfer Cu i Zn do katalitycznych miejsc różnych enzymów [61, 134]. Cząsteczka metalotioneiny może związać do dwunastu jonów metali dwuwartościowych (Zn++, Hg++, Ni++, Fe++, Cd++, Pb++) oraz do dwunastu jonów metali jednowartościowych, np.: Ag+, Cu+ czy Au+. Metale przyłączone do cząsteczki MT tworzą wraz z nią strukturę przestrzenną i są dla niej elementem stabilizującym [79].

Metalotioneiny są niejednorodną grupą białek, a na podstawie ich struktury przestrzennej oraz składu aminokwasowego wyróżnio-no cztery podstawowe izoformy tego białka: MT-I, MT-II, MT-III i MT-IV. Izoformy MT-I i MT-II, które znajdują się w organizmie w naj-większej ilości i z tego powodu zostały najlepiej scharakteryzowane. Posiadają co najmniej osiem funkcjonalnych izoform (MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H, MT-1X MT-2A) i siedem izoform nie-funkcjonalnych (MT-1C, MT-1D, MT-1I, MT-1J, MT-1K, MT-1L, MT-2B) [172, 190]. Funkcjonalne izoformy oraz MT-III i MT-IV powstają w wy-niku ekspresji 10 genów, pozostałe izoformy niefunkcjonalne, zwane także niekodującymi izoformami, nie skutkują powstaniem produktu białkowego, stąd ich nazwa [68]. Izoformy MT-I i MT-II występują we wszystkich tkankach, podczas gdy pozostałe dwie izoformy są charak-terystyczne dla ośrodkowego układu nerwowego oraz niektórych typów nowotworów (MT-III) oraz nabłonka wielowarstwowego pła-skiego skóry oraz górnego odcinka przewodu pokarmowego (MT-IV) [68, 147, 178]. Metalotioneiny mogą również występować w komór-kach nowotworowych, zarówno w cytoplazmie jak i jądrze komórko-wym, będąc do pewnego stopnia markerami rokowniczymi procesu nowotworowego [48, 59, 73, 146, 157, 189].

Regulacja ekspresji genów metalotionein odbywa się na po-ziomie transkrypcji. Głównym czynnikiem indukującym syntezę są jony cynku (Zn++), przez wiązanie się do czynnika transkrypcyjnego MTF-1 (metal response element-binding transcription factor) (68]. Oprócz tego syntezę tych białek może stymulować wiele innych czynników, jak: hormony, metale ciężkie, czynniki wzrostu, cytokiny, glukagon, proge-steron, katecholaminy, interferon, IL-1, wolne rodniki, związki orga-niczne, a także wysiłek fizyczny, niedożywienie, infekcje oraz promie-niowanie jonizujące [68, 134].

Metale ciężkie, zwłaszcza gdy znajdują się w większej ilości, są wiązane przez MT preferencyjnie, wypierając cynk z połączeń z tym białkiem. W ten sposób metalotioneiny pełnią również funkcje detok-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 26 –

syfikacyjne w organizmie, tworząc nieaktywne związki z metalami cięż-kimi i wolnymi rodnikami [78, 107].

Podstawową funkcją MT jest ich wpływ na homeostazę metali, głównie przez wiązanie jonów Zn i Cu. Te i inne metale są niezbędne do utrzymania homeostazy ustroju przez dostarczanie ich do miejsc kofaktorowych różnych enzymów. Cynk jest niezbędnym składnikiem funkcjonalnym i strukturalnym wielu czynników transkrypcyjnych, cząsteczek sygnałowych i enzymów biorących udział w procesach replikacji, transkrypcji i biosyntezy białek. Ekspresję metalotionein stwierdza się w cytoplazmie, jądrze komórkowym oraz pozakomór-kowo [68]. Wzrost ekspresji MT jest związany z procesem proliferacji. W komórkach niedzielących się (faza G0), ekspresja MT występuje w cytoplazmie, natomiast w czasie podziałów komórkowych obser-wuje się translokację MT do jądra komórkowego, a ich największe nagromadzenie obserwuje się w fazie S i G2 [61]. MT mają również wpływ na aktywność czynników transkrypcyjnych, wpływając na eks-presję różnych genów w komórkach. Poprzez zwrotne wiązanie jo-nów cynku mają wpływ także na aktywność biologiczną cząsteczek białkowych [46].

Izoformy MT-I i MT-II są najlepiej poznanymi białkami z grupy MT, odgrywają rolę w procesach karcinogenezy i progresji nowotwo-rów [68]. MT mają również właściwości protekcyjne komórki podczas jej procesów zapalnych, regenerujących oraz procesów destrukcji ko-mórkowej [41, 141].

MT-I/II biorą udział również udział w procesie oporności na cy-tostatyki oraz radioterapię przez dezaktywację wolnych rodników czy wiązanie się z lekiem [68]. Wysoką ekspresję MT stwierdzono w niektó-rych nowotworach, takich jak: rak gruczołu piersiowego, pęcherza mo-czowego, nerki, krtani, co było uważane jako niekorzystny czynnik ro-kowniczy [61, 105, 169]. Izoforma MT-3, znana również pod nazwą czynnika hamującego wzrost (growth inhibitory factor – GIF), posiada 7 dodatkowych aminokwasów, różni się od pozostałych MT aktywnością biologiczną, może mieć znaczenie w procesie karcinogenezy, jej wysoka ekspresja wiąże się ze zwiększoną opornością na cytostatyki [68].

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 27 –

1.6.3. Ki-67 Ki-67 jest jednym z najczęściej używanych markerów służących

do oceny proliferacji w diagnostycznych badaniach na bloczkach para-finowych. Jest to niehistionowe białko, którego ekspresję oznacza się w jądrze komórkowym podczas proliferacji, jego funkcje biologiczne do tej pory nie są jednak w pełni poznane [191].

Białko Ki-67 składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych: 360 i 320 kDa. Pojawia się zarówno w zdrowych, jak i nowotworowych komórkach organizmu [62]. Zostało po raz pierwszy zidentyfikowane przez Gerdesa w 2000 r., który użył do jego oznaczenia przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko jądrowemu antygenowi, proliferujących komórek chłoniaka (non-Hodgkin lymphoma) [62]. Biał-ko to jest związane z okołojądrową chromatyną, jego największą eks-presję obserwuje się w późnej fazie G1 i S oraz w fazie G2 cyklu komór-kowego, stwierdzano też jego ekspresję w procesach inhibicji DNA i w przebiegu apoptozy [31, 192]. Ekspresja białka Ki-67 pozwala na określenie aktywności proliferacyjnej tkanek, ma również znaczenie prognostyczne w różnych procesach nowotworowych u człowieka [62]. W badaniach nad rakiem gruczołu piersiowego stwierdzono kore-lację Ki-67 z zaawansowaniem procesu nowotworowego, stopniami złośliwości nowotworu jak i innymi czynnikami prognostycznymi, jak receptory estrogenowe czy progesteronowe [62]. Podobne wyniki uzyskano też w badaniach nowotworów tkanek miękkich, raku płuca czy mózgu, natomiast w raku gruczołu krokowego, szyjki macicy, biał-ko to ma mniejsze znaczenie [62]. Guzy o dużej skłonności do prolife-racji, wykazujące wysoką ekspresję Ki-67, mają również większą wraż-liwość na chemio- czy radioterapię [62].

W piśmiennictwie często spotyka się dodatnie korelacje między Ki-67 a MT-I/II, co świadczy o proliferacyjnej roli tych dwóch czynników [168, 169, 189].

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

2. ZAŁOŻENIA I CEL PRACY Celem pracy jest:

1) określenie lokalizacji oraz nasilenia ekspresji cyklooksygenazy-2, antygenu Ki-67, receptorów estrogenowych (ER) i progesterono-wych (PR), a także białek z rodziny metalotionein (MT) w materiale pooperacyjnym zmian typu choroba Gravesa-Basedowa,

2) ocena ekspresji ww. markerów w zależności od płci i wieku pa-cjentów,

3) określenie wzajemnych korelacji nasilenia ekspresji ww. antyge-now w ch.GB oraz porównanie jej z ekspresją w prawidłowej tkance tarczycy oraz zmianach typu wola wieloguzkowego.

Uzyskane wyniki powinny być pomocne w określaniu roli bada-nych białek w szeroko pojętej etiopatogenezie choroby Gravesa-Basedowa.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

3. MATERIAŁ I METODY

3.1. Materiał

3.1.1. Grupa badana Do badań wykorzystano materiał archiwalny w postaci blocz-

ków parafinowych, tkanek pobranych w czasie zabiegów operacyjnych tarczycy wykonanych w latach 2003–2007. W tym czasie w Klinice wy-konano 5791 zabiegów operacyjnych, w tym 2221 zabiegów na gru-czole tarczowym. Wśród zabiegów na gruczole tarczycowym 128 osób chorowało na chorobę Gravesa-Basedowa.

Do badań wykorzystano 67 archiwalnych bloczków parafino-wych z wycinkami 67 tkanek pobranych od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (ch.GB) oraz 24 z wolem guzowatym (WG) opero-wanych w Katedrze i Klinice Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Endokrynologicznej w latach 2003–2007. Dane kliniczne obu bada-nych grup pacjentów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Dane kliniczne badanych grup pacjentów z użyciem metody immunohistochemicznej

Choroba Gravesa-Basedowa Wole guzowate Wszystkie przypadki Liczba

przypadków 67 24 91

Wiek w latach (średnia±SD)

39,1±13,1 40,7±12,2 39,6±12,8

Wiek w latach (mediana)

40,5 (16–68)

41 (21–61)

40,5 (16–68)

Płeć Mężczyźni

Kobiety

14 53

5

19

19 72

SD – odchylenie standardowe

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 30 –

We fragmentach tkanek zabezpieczonych w płynie RNAlater z wykorzystaniem metody Real-Time PCR określono ponadto ekspresję poszczególnych izoform metalotionein. Badaniami tymi objęto 30 przypadków ch.GB, 10 przypadków WG oraz 8 przypadków prawi-dłowej tkanki tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kon-trola) pobranych od pacjentów operowanych w Katedrze i Klinice Chi-rurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Endokrynologicznej w latach 2010–2013. Dane kliniczne pacjentów zostały zestawione w tabeli 2.

Tabela 2. Dane kliniczne pacjentów, których materiał analizowano z użyciem metody Real-Time PCR

Choroba

Gravesa-Basedowa Wole

guzowate Kontrola

Liczba przypadków 30 10 8

Wiek w latach (średnia±SD) 42,2±15,8 49,1±16,7 58,5±57,3

Wiek w latach (mediana)

38,5 (22–74)

46,5 (25–77)

58,5 (39–71)

Płeć Mężczyźni

Kobiety

6

24

1 9

0 8

SD – odchylenie standardowe

3.2. Metody

3.2.1. Pobieranie i przygotowanie materiału do badań Materiał do badań histopatologicznych oraz immunochisto-

chemicznych pobierano do roztworu 4% buforowanej formaliny (Chempur, Polska) na okres 24 godzin, a następnie próbkę płukano w wodzie bieżącej przez 24 godziny. Kolejnym krokiem było odwodnie-nie pobranych fragmentów tkanek przez przeprowadzenie przez szereg alkoholowy o wzrastającym stężeniu (70%, 96% oraz alkohol absolutny). Następnie tkanki płukano dwukrotnie w roztworze Clearene (Leica Microsystems, Niemcy). Ostatecznie pobrane fragmenty tkanek zatopia-no w parafinie wysokotopliwej Histosec (Merck Millipore, USA).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 31 –

Tak przygotowane bloczki parafinowe krojono na mikrotomie Leica RM2255 (Leica Microsystems) na skrawki grubości 7 μm do bar-wienia hematoksylina–eozyna lub 4 μm do reakcji immunohistoche-micznych. Następnie szkiełka ze skrawkami przenoszono na płytę grzejną ustawioną na 56°C w celu roztopienia i lepszego przywarcia parafiny do szkiełka. W kolejnym etapie preparaty wygrzewano przez 30 min w 65°C, a ostatecznie przez dobę w 37°C do czasu przeprowa-dzenia procedur histochemicznych i immunohistochemicznych.

Do badań molekularnych wykorzystano fragmenty niezmienio-nej makroskopowo tkanki tarczycy z okolicy wola guzowatego oraz ch.GB, które pobierano do 2 ml probówek typu Eppendorf zawierają-cych 1,3 ml płynu RNAlater (Sigma Aldrich, USA). Tak pobrane tkanki następnie zamrożono w –20°C do chwili rozpoczęcia badań moleku-larnych.

3.2.2. Barwienie hematoksylina–eozyna (H+E)

Skrawki parafiowe barwiono hematoksyliną–eozyną (H+E) w ce-

lu ustalenia rozpoznania oraz wybrania odpowiednich fragmentów tkanek do właściwych badań immunohistochemicznych. Z badań wy-kluczono materiał tkankowy wykazujący cechy uszkodzenia lub nie-prawidłowego utrwalenia. Barwienie H+E pobranych tkanek przepro-wadzono według niżej opisanej procedury.

1. Odparafinowanie przez 15 min inkubację w ksylenie (Chempur, Polska).

2. Uwodnienie przez przeprowadzenie przez szereg alkoholowy o malejącym stężeniu (alkohol absolutny, 96%, 70%) – po 5 min.

3. Przepłukanie w wodzie destylowanej. 4. Inkubacja z hematoksyliną – 1 min. 5. Ponowne przepłukanie w wodzie destylowanej. 6. Inkubacja z roztworem 0,5% eozyny – 10 min. 7. Odwodnienie przez przeprowadzenie przez szereg alkoholowy

o wzrastającym stężeniu (70%, 96%, alkohol absolutny) oraz ksy-len – po 5 min.

8. Zamknięcie preparatów szkiełkami nakrywkowymi (Menzler-Gläser, Niemcy) w medium zamykającym Euparal (Carl Roth, Niemcy).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 32 –

3.2.3. Reakcje immunohistochemiczne (IHC) Do przeprowadzenia reakcji IHC użyto mysich przeciwciał mo-

noklonalnych skierowanych przeciwko badanym antygenom (COX-2, MT-I/II, ER, PR, Ki-67). Użyte w badaniu przeciwciała oraz zastosowane warunki reakcji IHC dla poszczególnych antygenów zostały podsumo-wane w tabeli 3. Reakcje IHC zostały przeprowadzone z wykorzysta-niem systemu do wizualizacji EnVision™ (Dako, Dania) oraz urządzenia Autostainer Link48 (Dako, Dania) w celu zapewnienia stałych oraz powtarzalnych warunków reakcji IHC.

Procedura przeprowadzonych reakcji IHC została przedstawio-na poniżej.

1. Deparafinizacja i odsłonięcie determinant antygenowych poprzez gotowanie w buforze Target Retrieval Solution o pH 9 (dla prze-ciwciał anty-COX-2 oraz anty-MT-I/II) oraz pH 6 (dla przeciwciał anty-ER, anty-PR oraz anty-Ki-67) w urządzeniu PT Link (Dako, Da-nia) – 20 min.

2. Przepłukanie w buforze TBS z 0,05% Tween. 3. Blokowanie endogennej peroksydazy przez inkubację w roztwo-

rze zawierającym nadtlenek wodoru (EnVi-sion™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent) – 5 min.

4. Przepłukanie w buforze TBS z 0,05% Tween. 5. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-COX-2 oraz

anty-MT-I/II – 20 min; anty-ER, anty-PR oraz anty-Ki-67 – 45 min). 6. Przepłukanie w buforze TBS z 0,05% Tween. 7. Inkubacja z biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi

sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (EnVision™ FLEX/HRP) – 20 min.

8. Przepłukanie w buforze TBS z 0,05% Tween. 9. Inkubacja z substratem peroksydazy chrzanowej – diaminoben-

zydyną (EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen) w celu wizualizacji badanych antygenów – 10 min.

10. Przepłukanie w buforze TBS z 0,05% Tween. 11. Inkubacja w buforze TBS z 0,05% Tween – 5 min. 12. Barwienie kontrastujące z użyciem hematoksyliny (EnVision™ FLEX

Hematoxylin) – 5 min. 13. Przepłukanie skrawków w wodzie destylowanej oraz inkubacja

w wodzie destylowanej – 5 min.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 33 –

14. Odwodnienie przez przeprowadzenie przez szereg alkoholowy o wzrastającym stężeniu (70%, 96%, alkohol absolutny) i ksylen – po 5 min.

15. Zamknięcie preparatów szkiełkami nakrywkowymi (Dako, Dania) w SUB-X Mounting Medium (Dako, Dania) z użyciem aparatu Coverslipper (Dako, Dania).

Wszystkie reakcje IHC zostały przeprowadzone z użyciem od-powiednich kontroli pozytywnych (raki przewodowe gruczołu piersio-wego wykazujących ekspresję badanych antygenów z archiwum Kate-dry i Zakładu Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu) oraz negatywnych (przeprowadzenie reakcji z pominię-ciem przeciwciała pierwszorzędowego).

Tabela 3. Użyte przeciwciała oraz warunki reakcji IHC

Przeciwciało Klon Stężenie

(czas inkubacji) Odkrywanie antygenów Producent

anty-COX2 CX229 1:100

(20 min) pH 9 Cayman*

anty-MT-I/II E9 1:300

(20 min) pH 9 Dako

anty-ER 1D5 ready-to-use

(45 min)# pH 6 Dako

anty-PR PgR 636 ready-to-use

(45 min)# pH 6 Dako

anty-Ki-67 MIB1 ready-to-use

(45 min)# pH 6 Dako

*Cayman Chemicals, USA; #stężenie standaryzowane bezpośrednio przez producenta

3.2.4. Ocena reakcji IHC Do oceny reakcji IHC użyto dwóch skal w zależności od lokaliza-

cji ekspresji badanych antygenów (cytoplazmatyczna lub jądrowa). W przypadku ekspresji cytoplazmatycznej (COX-2, MT-I/II) zastosowa-nie znalazła skala IRS (ang. immuroeactive score) wg Remmele i Stegne-ra (Remmele i Stegner, 1987). Skala ta bierze pod uwagę odsetek tyre-ocytów wykazujących reakcję barwną w stosunku do wszystkich tyre-ocytów, jak również intensywność reakcji barwnej. Ostateczny wynik

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 34 –

w opisywanej skali to iloczyn dwóch wyżej ocenianych parametrów. Skala IRS przyjmuje wartości od 0 do 12 (tabela 5).

Tabela 5. Zestawienie punktów odcięcia skali IRS wg Remmele i Stegnera wykorzy-stanej do oceny preparatów immunohistochemicznych (Remmele i Ste-gner, 1987); ∑ = A × B

Liczba punktów

Procent komórek wykazujących reakcję (A)

Intensywność reakcji barwnej (B)

0 0 brak reakcji

1 < 10 słaba reakcja

2 10–50 średnia reakcja

3 51–80 silna reakcja

4 81–100 –

Ekspresję ER, PR oraz antygenu Ki-67 oceniano, zliczając liczbę

tyreocytów wykazujących jądrową lokalizację w stosunku do wszyst-kich tyreocytów w całym preparacie IHC. Skala ta przyjmuje następują-ce zakresy oraz wartości: 0% – 0 pkt, 1–5% – 1 pkt, 6–10% – 2 pkt, 11– –20% – 3 pkt, 21–100% – 4 pkt. W związku z obserwowaną również jądrową (obok cytoplazmatycznej) ekspresji MT-I/II skala ta znalazła zastosowanie również do oceny nasilenia ekspresji tego antygenu w tej strukturze komórkowej.

Wszystkie preparaty oceniano w mikroskopie świetlnym OLYM-PUS BX-41 (Olympus, Japonia) sprzężonym z torem wizyjnym oraz sys-temem do komputerowej analizy obrazu Cell^D, który został wykorzy-stany do archiwizacji wyników badania.

3.2.5. Izolacja całkowitego RNA

Do izolacji całkowitego RNA z fragmentów tkanek zmian tarczy-

cy zabezpieczonych w RNAlater użyto zestawu RNeasy Mini Kit (Qia-gen, Niemcy) zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta. Procedura izolacji całkowitego RNA została przedstawiona poniżej.

1. Umieszczenie około 30 mg pobranego fragmentu tkankowego w 600 μl buforu RLT z dodatkiem 1 μl ‐merkaptoetanolu. 

2. Homogenizacja tkanki z użyciem QIAschredder homogenizer (Qiagen, Niemcy).

3. Wirowanie – 3 min, 13 400 obr./min.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 35 –

4. Przeniesienie supernatantu do nowych probówek typu Eppendorf. 5. Dodanie jednej objętości 70% etanolu. 6. Mieszanie próbki. 7. Naniesienie roztworu w porcjach 700 μl na kolumienki ze złożem

do oczyszczania kwasów nukleinowych umieszczonych w pro-bówkach o pojemności 2 ml.

8. Wirowanie – 15 s,10 000 obr./min. 9. Naniesienie na kolumienki 700 μl buforu RW1.

10. Wirowanie – 15 s,10 000 obr./min. 11. Naniesienie na kolumienki 500 μl buforu RPE. 12. Wirowanie – 15 s,10 000 obr./min. 13. Umieszczenie kolumienek w nowych probówkach o pojemności 2 ml. 14. Wirowanie – 1 min, 13 400 obr./min. 15. Naniesienie 30 μl wody wolnej od RNaz w celu elucji RNA – inku-

bacja 4 min. 16. Wirowanie – 1 min,10 000 obr./min.

Po zakończeniu ostatniego etapu izolacji oznaczano stężenie oraz czystość wyizolowanego całkowitego RNA. W tym celu wykorzy-stano spektrofotometr NanoDrop1000 (NanoDrop Technologies, USA), za pomocą którego określono stosunek absorbancji próbek przy dłu-gości fali 260 nm oraz 280 nm. Stosunek absorbancji A260/280 większy niż 1,8 świadczył o dobrej jakości wyizolowanego całkowitego RNA. Próbki przechowywano następnie w temperaturze –80°C do czasu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji.

3.2.6. Reakcja odwrotnej transkrypcji

Reakcje odwrotnej transkrypcji przeprowadzono na matrycy wcześniej wyizolowanego całkowitego RNA. Do tego celu posłużył zestaw High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosy-tems). Do stworzenia mieszaniny reakcyjnej o końcowej objętości 20 μl wchodziły następujące składniki:

1. Matryca RNA (100 ng) 10 μl 2. Bufor reakcyjny (10x stężony) 2 μl 3. Mieszanina nukleotydów, dNTP (5 mM) 0,8 μl 4. Mieszanina primerów (10 μM) 2 μl 5. Inhibitor RNaz (10 U/μl) 1 μl 6. Odwrotna transkryptaza 1 μl 7. Woda wolna od RNaz 3,2 μl

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 36 –

Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono w termocykle-rze DNA Engine® Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, USA) przez 120 min. w temperaturze 37°C. Następnie odwrotną transkryptazę inaktywowa-no termicznie poprzez ogrzewanie próbek przez 5 min w temperaturze 85°C. Otrzymane cDNA przechowywano w temperaturze –20°C do cza-su przeprowadzenia badań Real-Time PCR.

3.2.7. Reakcja Real-Time PCR

Badanie poziomu ekspresji poszczególnych izoform funkcjo-

nalnych metalotionein (MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H, MT-1X, MT-2A, MT-3, MT-4) przeprowadzono z wykorzystaniem apara-tu 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Do reakcji wykorzystano sondy typu TaqMan® MGB Probe (Applied Biosys-tems, USA) wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym FAM oraz następujące primery firmy Applied Biosystems:

a. MT-1A, nr kat. Hs00831826_s1; b. MT-1B, nr kat. Hs01875377_s1; c. MT-1E, nr kat. Hs01938284_g1; d. MT-1F, nr kat. Hs00744661_sH; e. MT-1G, nr kat. Hs02578922_gH; f. MT-1H, nr kat. Hs00823168_g1; g. MT-1X, nr kat. Hs04194245_g1; h. MT-2A, nr kat. Hs01591333_g1; i. MT-3, nr kat. Hs00359394_g1; j. MT-4, nr kat. Hs00262914_m1; k. ACTB, nr kat. Hs99999903_m1.

Procedura reakcji Real-Time PCR składała się z następujących części: wstępna aktywacja polimerazy (50°C, 2 min), wstępna denatu-racja (94°C, 10 min), po której przeprowadzono 40 cykli denaturacji (94°C, 15 s) oraz przyłączania starterów i sond oraz syntezy (60°C, 1 min).

Względną ekspresję (RQ – relative qauntification) badanych izo-form metalotionein obliczano metodą ΔΔCt (Livak i Schmittgen, 2001). Wyniki normalizowano na podstawie ekspresji genu referencyjnego ACTB. Jako kalibrator posłużył średni poziom ekspresji izoform metalo-tionein w prawidłowej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 37 –

3.2.8. Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem pro-

gramu Prism 5.0 (GraphPad, USA). Rozkład zmiennych badano wyko-rzystując test Shapiro-Wilka. Do porównania dwóch grup zmiennych niezależnych zastosowano nieparametryczny odpowiednik testu t-Studenta – test Manna-Whitneya. Różnice w poziomie nasilenia ba-danych izoform metalotionein analizowano z użyciem testu Kru-skal-Wallisa z następową analizą post hoc (test wielokrotnych porów-nań Dunna). Do analizy korelacji badanych markerów IHC oraz pozio-mu ekspresji mRNA izoform metalotionein użyto testu korelacji rang Spearmana, a związek nasilenia ekspresji badanych markerów z wie-kiem pacjentów analizowano z wykorzystaniem testu korelacji Pearso-na. Wszystkie wyniki uznano za istotne statystycznie dla p < 0,05.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

4. WYNIKI

4.1. Ekspresja badanych markerów (COX-2, MT-I/II, ER, PR, Ki-67)

w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym W badanych przypadkach preparatów immunohistochemicz-

nych zarówno w tyreocytach w chorobie Gravesa-Basedowa (ch.GB), jak i wola guzowatego (WG) zaobserwowano cytoplazmatyczną eks-presję COX-2 (rycina 1). Metalotioneina-I/II charakteryzowała się cyto-plazmatyczno-jądrową ekspresją MT-I/II w tyreocytach obu badanych zmian. Jej lokalizację cytoplazmatyczną określono jako cMT-I/II, nato-miast jądrową jako jMT-I/II (rycina 2). Ekspresję ER (rycina 3), PR (rycina 4) oraz antygenu Ki-67 (rycina 5) stwierdzono w jądrach komórkowych tyreocytów w przypadkach ch.GB oraz WG

A B

Rycina 1. Ekspresja cytoplazmatyczna COX-2 w tyreocytach ch.GB (A) oraz WG (B). Powiększenie 200. Metoda immunohistochemiczna

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 39 –

A B

C D

Rycina 2. Ekspresja MT-I/II w ch.GB (A, B) oraz WG (C, D). Ekspresja jądrowa i cytoplazma-tyczna współwystępowały w tyreocytach ch.GB (A, B) oraz WG (C, D). Widoczna jest silniejsza intensywność reakcji jądrowo-cytoplazmatycznej MT-I/II w tyreocytach ch.GB (A, B), w porównaniu do WG (C, D). Powiększe-nie 200. Metoda immunohistochemiczna

A B

Rycina 3. Ekspresja jądrowa ER w tyreocytach w przypadku ch.GB (A) oraz WG (B). Powiększenie 200. Metoda immunohistochemiczna

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 40 –

A B

Rycina 4. Ekspresja jądrowa PR w tyreocytach w przypadku ch.GB (A) oraz WG (B). Powiększenie 200. Metoda immunohistochemiczna

A B

Rycina 5. Ekspresja jądrowa antygenu Ki-67 w tyreocytach w przypadku ch.GB (A) oraz WG (B). Powiększenie 200. Metoda immunohistochemiczna

Rozkład ekspresji cytoplazmatycznej COX-2 ocenianej w dwu-

nastostopniowej skali IRS w ch.GB oraz WG został podsumowany w tabeli 6. Spośród analizowanych przypadków, wszystkie przypadki z ch.GB charakteryzowały się ekspresją COX-2, natomiast w WG obser-wowano jego ekspresję w 23 (95,8%) przypadkach.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 41 –

Tabela 6. Rozkład immunohistochemicznej, cytoplazmatycznej ekspresji COX-2 w ch.GB oraz WG

Punktacja IRS

Choroba Gravesa-Basedowa N (%)

Wole guzowate N (%)

0 0 (0) 1 (4,2)

1 2 (3,0) 8 (33,3)

2 6 (9,0) 6 (25,0)

3 6 (9,0) 1 (4,2)

4 16 (23,9) 7 (29,1)

6 16 (23,9) 1 (4,2)

8 12 (17,8) 0 (0)

9 6 (9,0) 0 (0)

12 3 (4,4) 0 (0)

W związku z cytoplazmatyczno-jądrową ekspresją antygenu

MT-I/II, oceniano oddzielnie nasilenie dla lokalizacji cytoplazmatycznej (cMT-I/II; tabela 7) oraz jądrowej (jMT-I/II; tabela 8). Wszystkie badane przypadki (ch.GB oraz WG) charakteryzowały się ekspresją cMT-I/II, na-tomiast ekspresja jMT-I/II była zróżnicowana. W ch.GB zaobserwowano jMT-I/II w 31 (46,3%) przypadkach, natomiast w WG w 16 (66,6%).

Tabela 7. Rozkład immunohistochemicznej, cytoplazmatycznej ekspresji MT-I/II (cMT-I/II) w ch.GB oraz WG

Punktacja IRS

Choroba Gravesa-Basedowa N (%)

Wole guzowate N (%)

0 0 (0) 0 (0)

1 0 (0) 0 (0)

2 1 (1,5) 1 (4,2)

3 0 (0) 1 (4,2)

4 1 (1,5) 2 (8,3)

6 10 (14,9) 8 (33,3)

8 10 (14,9) 4 (16,7)

9 23 (34,4) 6 (25,0)

12 22 (32,8) 2 (8,3)

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 42 –

Tabela 8. Rozkład immunohistochemicznej, jądrowej ekspresji MT-I/II (jMT-I/II) w ch.GB oraz WG

Punktacja jądrowa

Choroba Gravesa-Basedowa N (%)

Wole guzowate N (%)

0 (0%) 36 (46,7) 8 (32,0) 1 (1–5%) 19 (24,7) 12 (48,0)

2 (6–10%) 12 (15,6) 4 (16,0) 3 (11–20%) 6 (7,8) 1 (4,0)

4 (21–100%) 4 (5,2) 0 (0,0)

Rozkład ekspresji jądrowej ER, PR oraz antygenu Ki-67 w ch.GB

oraz WG został podsumowany w tabeli 9. Ekspresję ER zaobserwowano w 35 (52,3%) przypadków ch.GB oraz 17 (70,8%) przypadkach WG Dla PR, 39 (58,2%) przypadków ch.GB charakteryzowało się ekspresją tego białka, natomiast dla WG jego ekspresję stwierdzono w 10 (41,6%) przypadkach. Ekspresję, jądrową antygenu Ki-67 zaobserwowano w tyreocytach ch.GB i WG w odpowiednio 49 (73,1%) oraz 6 (25,0%) przypadkach.

Tabela 9. Rozkład immunohistochemicznej, jądrowej ekspresji markerów ER, PR oraz Ki-67 w ch.GB oraz WG

Skala oceny ekspresji jądrowej

Choroba Gravesa-Basedowa N (%)

Wole guzowate N (%)

0 (0%) 32 (47,8) 7 (29,1) 1 (1–5%) 18 (26,9) 12 (50,0)

2 (6–10%) 11 (16,3) 4 (16,7) 3 (11–20%) 4 (6,0) 1 (4,2)

ER

4 (21–100%) 2 (3,0) 0 (0,0) 0 (0%) 28 (41,9) 14 (58,3)

1 (1–5%) 14 (20,8) 7 (29,2) 2 (6–10%) 11 (16,4) 2 (8,3)

3 (11–20%) 9 (13,4) 1 (4,2)

PR

4 (21–100%) 5 (7,7) 0 (0,0) 0 (0%) 18 (26,9) 18 (75,0)

1 (1–5%) 36 (53,7) 5 (20,8) 2 (6–10%) 10 (14,9) 0 (0,0)

3 (11–20%) 2 (3,0) 1 (4,2) Ki-67

4 (21–100%) 1 (1,5) 0 (0,0)

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 43 –

Analiza statystyczna ekspresji badanych markerów z użyciem testu Mann-Whitneya wykazała, iż ekspresja COX-2 (p < 0,0001; rycina 6), cMT-I/II (p = 0,0008; rycina 7), jMT-I/II (p = 0,0019; rycina 7), PR (p = 0,0444; rycina 8) oraz antygenu Ki-67 (p = 0,0001; rycina 9) były istotnie statystycznie wyższe w ch.GB w porównaniu do WG Nie zaob-serwowano istotnych statystycznie różnic w ekspresji ER pomiędzy badanymi zmianami tarczycy (p = 0,4174). Wyniki analizy statystycznej oraz wartości ekspresji poszczególnych markerów zostały przedsta-wione w tabeli 10.

Rycina 6. Zależność cytoplazmatycznej ekspresji COX-2 mierzonej z użyciem skali IRS w ch.GB oraz WG ****p < 0,0001; test Mann-Whitneya

Rycina 7. Zależność cytoplazmatycznej ekspresji MT-I/II (cMT-I/II; A) mierzonej z uży-ciem skali IRS oraz jądrowej MT-I/II (jMT-I/II; B) w ch.GB oraz WG **p < 0,005, ***p < 0,0005; test Mann-Whitneya

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 44 –

Rycina 8. Zależność jądrowej ekspresji PR w ch.GB oraz WG *p < 0,05; test Mann-Whitneya

Rycina 9. Zależność jądrowej ekspresji antygenu Ki-67 w ch.GB oraz WG ***p < 0,0005; test Mann-Whitneya

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 45 –

Tabela 10. Podsumowanie analizy statystycznej z wykorzystaniem testu Mann-Whitneya ekspresji badanych markerów w ch.GB oraz WG Istotne statystycznie zależności zostały pogrubione

Marker Zmiana Średnia±SD Mediana (25%; 75%) Wartość p

ch.GB 5,66±2,65 6 (4; 8) COX-2

WG 2,38±1,53 2 (1; 4) p < 0,0001

ch.GB 9,21±2,37 9 (8; 12) cMT-I/II

WG 7,13±2,51 7 (6; 9) p = 0,0008

ch.GB 3,58±0,72 4 (3; 4) jMT-I/II

WG 2,96±0,86 3 (2; 4) p = 0,0019

ch.GB 0,89±1,08 1 (0; 2) ER

WG 0,96±0,81 1 (0; 1) p = 0,4174

ch.GB 1,23±1,33 1 (0; 2) PR

WG 0,58±0,83 0 (0; 3) p = 0,0444

ch.GB 0,99±0,82 1 (0; 1) Ki-67

WG 0,33±0,70 0 (0; 0,75) p = 0,0001

SD – odchylenie standardowe; (25%; 75%) – wartości dla 25 i 75 percentyla

4.2. Ekspresja badanych markerów (COX-2, MT-I/II, ER, PR, Ki-67)

w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym w zależności od płci oraz wieku pacjentów

Analiza statystyczna z wykorzystaniem testu Mann-Whitneya

nie wykazała istotnych statystycznie różnic w ekspresji badanych mar-kerów w zależności od płci pacjentów z ch.GB oraz WG Wyniki analizy zostały przedstawione w tabeli 11 (dla ch.GB) oraz tabeli 12 (dla WG).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 46 –

Tabela 11. Podsumowanie analizy statystycznej z wykorzystaniem testu Mann-Whitneya ekspresji badanych markerów w ch.GB w zależności od płci pacjentów

Marker Zmiana Średnia±SD Mediana (25%; 75%) Wartość p

Mężczyźni 5,57±2,28 6 (3,75; 8) COX-2

Kobiety 5,70±2,76 6 (4; 8) p = 0,9812

Mężczyźni 9,86±2,38 10,5 (8; 12) cMT-I/II

Kobiety 9,04±2,35 9 (8; 12) p = 0,3803

Mężczyźni 3,57±0,65 4 (3; 4) jMT-I/II

Kobiety 3,69±0,75 4 (3; 4) p = 0,9926

Mężczyźni 0,86±1,16 0 (0; 2) ER

Kobiety 0,91±1,06 1 (0; 1,5) p = 0,7218

Mężczyźni 1,36±1,39 1 (0; 2,5) PR

Kobiety 1,21±1,32 1 (0; 2) p = 0,6221

Mężczyźni 1,27±0,99 1 (1; 2) Ki-67

Kobiety 0,91±0,77 0 (0; 1) p = 0,1737

SD – odchylenie standardowe; (25%; 75%) – wartości dla 25 i 75 percentyla

Tabela 12. Podsumowanie analizy statystycznej z wykorzystaniem testu Mann-Whitneya ekspresji badanych markerów w WG w zależności od płci pacjentów

Marker Zmiana Średnia±SD Mediana (25%; 75%) Wartość p

Mężczyźni 2,20±1,79 2 (0,5; 4) COX-2

Kobiety 2,42±1,50 2 (1; 4) p = 0,8244

Mężczyźni 6,60±1,95 6 (5; 8,5) cMT-I/II

Kobiety 7,26±2,66 8 (6; 8) p = 0,5830

Mężczyźni 2,60±0,89 2 (2; 3,5) jMT-I/II

Kobiety 3,05±0,85 3 (2; 4) p = 0,3082

Mężczyźni 0,80±0,45 0,5 (0; 1) ER

Kobiety 1,00±0,88 1 (0; 2) p = 0,7574

Mężczyźni 0,40±0,55 0 (0; 1) PR

Kobiety 0,63±0,89 0 (0; 1) p = 0,7778

Mężczyźni 0,00±0,00 0 (0; 0) Ki-67

Kobiety 0,42±0,77 0 (0; 1) p = 0,1722

SD – odchylenie standardowe; (25%; 75%) – wartości dla 25 i 75 percentyla

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 47 –

Analiza statystyczna nie wykazała również istotnych statystycz-nie zależności nasilenia ekspresji badanych markerów z wiekiem pa-cjentów zarówno w przypadku ch.GB, jak i WG Analiza z wykorzysta-niem testu korelacji Pearsona została przedstawiona w tabeli 13.

Tabela 13. Zależność nasilenia ekspresji markerów mierzonej z wykorzystaniem metody immunohistochemicznej od wieku pacjentów z ch.GB oraz WG Zależności między zmiennymi analizowano z wykorzystaniem testu korelacji Pearsona

Marker Choroba Gravesa-Basedowa

[wiek] Wole guzowate

[wiek]

COX-2 r = 0,169 p = 0,786

r = 0,482 p = 0,411

cMT-I/II r = 0,440 p = 0,459

r = –0,025 p = 0,968

jMT-I/II r = –0,082 p = 0,895

r = 0,212 p = 0,482

ER r = 0,472 p = 0,422

r = –0,433 p = 0,466

PR r = 0,340 p = 0,575

r = 0,665 p = 0,220

Ki-67 r = –0,178 p = 0,775

r = 0,572 p = 0,314

4.3. Korelacja nasilenia badanych markerów w chorobie Gravesa-Basedowa oraz wolu guzowatym

Test korelacji rang Spearmana wykazał istotne statystycznie

dodatnie korelacje pomiędzy nasileniem ekspresji niektórych z bada-nych markerów. W chorobie Gravesa-Basedowa wykazano średnią, dodatnią korelację pomiędzy ekspresją jądrową oraz cytoplazmatycz-ną MT-I/II (r = 0,499, p < 0,0001; rycina 10). Podobną zależność między oboma ww. markerami zaobserwowano w analizowanych przypad-kach wola guzowatego (r = 0,496, p = 0,014; rycina 11).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 48 –

cMT-I/II [0-12]

jMT

-I/II

[0-

4]

0 4 8 120

1

2

3

4

Rycina 10. Korelacja ekspresji cytoplazmatycznej z ekspresją jądrową MT-I/II (r = 0,499, p < 0,0001) w ch.GB. Test korelacji rang Spearmana

cMT-I/II [0-12]

jMT

-I/II

[0-

4]

0 4 8 120

1

2

3

4

Rycina 11. Korelacja ekspresji cytoplazmatycznej z ekspresją jądrową MT-I/II (r = 0,496, p = 0,014) w WG Test korelacji rang Spearmana

W przypadkach ch.GB stwierdzono średnie dodatnie korelacje nasilenia ekspresji antygenu Ki-67 z nasileniem ekspresji cMT-I/II (r = 0,331, p = 0,0066; rycina 12) oraz COX-2 (r = 0,24; p = 0,05; rycina 13).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 49 –

cMT-I/II [0-12]

Ki-

67 [

0-4]

0 4 8 120

1

2

3

4

Rycina 12. Korelacja ekspresji cytoplazmatycznej MT-I/II z ekspresją antygenu Ki-67 (r = 0,331, p = 0,0066) w ch.GB. Test korelacji rang Spearmana

COX2 [0-12]

Ki-

67 [

0-4]

0 5 100

1

2

3

4

Rycina 13. Korelacja ekspresji COX-2 z ekspresją antygenu Ki-67 (r = 0,24; p = 0,05) w WG Test korelacji rang Spearmana

W badanych przypadkach wola guzowatego zaobserwowano ponadto średnią, dodatnią korelacje ekspresji COX-2 z nasileniem eks-presji cMT-I/II (r = 0,467, p = 0,021; rycina 14) oraz jMT-I/II (r = 0,435,

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 50 –

p = 0,034; rycina 15.) Wykazano również średnia korelację nasilenia ekspresji PR z ekspresją cMT-I/II (r = 0,448, p = 0,028; rycina 16).

cMT-I/II [0-12]

CO

X-2

[0-

12]

0 4 8 120

2

4

6

8

Rycina 14. Korelacja ekspresji COX-2 z ekspresją cMT-I/II (r = 0,467, p = 0,021) w WG Test korelacji rang Spearmana

jMT-I/II [0-4]

CO

X-2

[0-

12]

0 1 2 3 4 50

2

4

6

8

Rycina 15. Korelacja ekspresji COX-2 z ekspresją jMT-I/II (r = 0,435, p = 0,034) w WG Test korelacji rang Spearmana

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 51 –

PR [0-4]

cMT

-I/II

[0-

12]

0 1 2 3 40

4

8

12

Rycina 16. Korelacja ekspresji cMT-I/II z nasileniem ekspresji PR (r = 0,448, p = 0,028) w WG Test korelacji rang Spearmana

Wyniki analizy statystycznej z wykorzystaniem testu korelacji rang Spearmana dotyczące wzajemnych korelacji ekspresji badanych markerów immunohistochemicznych zostały zebrane w tabeli 14 (cho-roba Gravesa-Basedowa) oraz tabeli 15 (wole guzowate).

Tabela 14. Korelacje nasilenia ekspresji badanych markerów w chorobie Grave-sa-Basedowa. Test korelacji rang Spearmana. Istotne statystycznie zależności zostały pogrubione

COX-2 cMT-I/II jMT-I/II ER PR Ki-67

COX-2 r = 0,172p = 0,164

r = 0,094p = 0,451

r = 0,055p = 0,658

r = 0,130p = 0,295

r = 0,240 p = 0,050

cMT-I/II r = 0,499

p < 0,0001r = –0,040p = 0,748

r = 0,127p = 0,305

r = 0,331 p = 0,006

jMT-I/II r = –0,124p = 0,319

r = 0,100p = 0,421

r = 0,226 p = 0,066

ER r = 0,091p = 0,465

r = –0,085 p = 0,495

PR r = –0,011 p = 0,930

Ki-67

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 52 –

Tabela 15. Korelacje nasilenia ekspresji badanych markerów w wolu guzowatym. Test korelacji rang Spearmana. Istotne statystycznie zależności zostały pogrubione

COX-2 cMT-I/II jMT-I/II ER PR Ki-67

COX-2 r = 0,467p = 0,021

r = 0,435p = 0,034

r = –0,120p = 0,578

r = 0,178p = 0,406

r = 0,292 p = 0,167

cMT-I/II r = 0,496p = 0,014

r = 0,162p = 0,449

r = 0,448 p = 0,028

r = 0,143 p = 0,504

jMT-I/II r = –0,066p = 0,759

r = 0,346p = 0,097

r = 0,219 p = 0,305

ER r = –0,018 p = 0,935

r = –0,104 p = 0,629

PR r = 0,386 p = 0,062

Ki-67

4.4. Ekspresja mRNA funkcjonalnych izoform metalotionein w badanych zmianach tarczycy

W związku z brakiem możliwości wykonania reakcji IHC (brak

swoistych przeciwciał zarówno mono-, jak i poliklonalnych), pozwala-jącej na rozróżnienie nasilenia ekspresji poszczególnych izoform meta-lotionein, w celu weryfikacji oraz dokładniejszego zbadania ich ekspre-sji, postanowiono określić poziom względnej ekspresji mRNA genów funkcjonalnych izoform metalotionein (MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H, MT-1X, MT-2A, MT-3, MT-4).

Analiza statystyczna z użyciem testu Kruskal-Wallisa wykazała, iż istotne statystycznie różnice między ch.GB, WG oraz niezmienioną tkanką tarczycy pobraną z okolicy wola guzowatego (Kontrola) zaob-serwowano w poziomie ekspresji mRNA MT-1A (p < 0,0001), MT-1B (p < 0,0001), MT-1E (p < 0,0001), MT-1F (p < 0,0379), MT-1G (p = 0,0469), MT-1H (p = 0,0467), MT-1X (p = 0,0101), MT-3 (p < 0,0001). Nie stwierdzono istotnie statystycznie zróżnicowanej ekspresji pozio-mu mRNA MT-2A (p = 0,0524) pomiędzy wyżej wymienionymi zmia-nami tarczycy. W badanych przypadkach nie zaobserwowano ekspresji

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 53 –

mRNA MT-4. Poziomy ekspresji badanych izoform metalotionein zosta-ły podsumowane w tabeli 16.

Tabela 16. Względne poziomy (RQ) ekspresji mRNA badanych izoform metalotionein

Izoforma metalotioneiny

Choroba Gravesa-Basedowa

Wole guzowate Kontrola

Średnia±SD 34,16±43,67 1,58±1,59 1,78±0,75

Mediana 19,29 1,07 1,14 MT-1A

25 i 75 percentyl 4,92; 40,18 0,37; 2,06 0,58; 1,26

Średnia±SD 752,6±1059 91,34±246,4 4,43±9,2

Mediana 434,3 1,03 0,72 MT-1B

25 i 75 percentyl 99,80; 939,7 0,18; 33,39 0,31; 6,84

Średnia±SD 8,32±7,64 1,61±1,76 1,26±1,08

Mediana 6,41 1,07 1,00 MT-1E

25 i 75 percentyl 2,82; 9,47 0,25; 2,51 0,63; 1,29

Średnia±SD 2,17±1,32 1,43±1,32 1,25±0,92

Mediana 2,13 0,99 0,85 MT-1F

25 i 75 percentyl 1,87; 2,70 0,48; 2,23 0,58; 1,78

Średnia±SD 0,85±0,58 2,79±3,57 1,29±1,17

Mediana 0,75 1,64 0,82 MT-1G

25 i 75 percentyl 0,35; 1,12 0,72; 3,45 0,59; 1,52

Średnia±SD 1,04±1,18 12,03±20,50 1,63±1,77

Mediana 0,88 3,99 0,63 MT-1H

25 i 75 percentyl 0,41; 1,22 0,85; 15,85 0,44; 2,93

Średnia±SD 0,63±0,55 1,12±1,12 1,07±0,39

Mediana 0,49 0,71 1,06 MT-1X

25 i 75 percentyl 0,29; 0,73 0,46; 1,53 0,66; 1,46

Średnia±SD 0,83±0,42 1,52±1,04 1,10±0,49

Mediana 0,74 1,33 1,00 MT-2A

25 i 75 percentyl 0,52; 1,01 0,77; 1,83 0,63; 1,59

Średnia±SD 18,47±21,13 13,26±25,70 1,63±1,64

Mediana 11,23 1,67 0,92 MT-3

25 i 75 percentyl 5,97; 25,18 0,28; 15,48 0,54; 3,07

SD – odchylenie standardowe

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 54 –

Analiza post hoc z użyciem testu wielokrotnych porównań Dun-na dla większości badanych izoform metalotionein potwierdziła ob-serwowane różnice w poziomie ekspresji mRNA badanych izoform pomiędzy badanymi zmianami tarczycy. Izoforma MT-1A charaktery-zowała się wzrostem (w przybliżeniu około 19-krotnym) ekspresji mRNA spośród badanych zmian tarczycy. Poziom ekspresji mRNA tej izoformy był istotnie statystycznie wyższy w ch.GB w porównaniu do WG oraz Kontroli (odpowiednio p < 0,0005 oraz p < 0,0005; rycina 17).

Rycina 17. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1A w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). ***p < 0,0005; test wielokrotnych porównań Dunna

Najwyższy wzrost ekspresji zaobserwowano w przypadku mRNA MT-1B, której poziom był ponad 434-krotnie wyższy w porów-naniu do WG (p < 0,0005) oraz Kontroli (p < 0,0005; rycina 18).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 55 –

Rycina 18. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1B w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). ***p < 0,0005; test wielokrotnych porównań Dunna

Również istotny statystycznie wzrost (około 6-krotny) zaobser-wowano w poziomie ekspresji mRNA MT-1E w ch.GB w odniesieniu do względnego poziomu mRNA tej izoformy w WG oraz Kontroli (odpo-wiednio p < 0,0005 oraz p < 0,0005; rycina 19).

Rycina 19. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1E w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). ***p < 0,0005; test wielokrotnych porównań Dunna

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 56 –

Kolejną izoformą, w wypadku której stwierdzono istotny sta-tystycznie wzrost względnego poziomu ekspresji mRNA, była izo-forma MT-3 w ch.GB (około 11-krotny wzrost). Zmiany te były istotne statystycznie w odniesieniu do WG (p < 0,005) oraz Kontroli (p < 0,0005; rycina 20).

Rycina 20. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-3 w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontro-la). **p < 0,005, ***p < 0,0005; test wielokrotnych porównań Dunna

W przypadku izoform MT-1G oraz MT-1H, ich najwyższy poziom względnej ekspresji mRNA występował w WG Test wielokrotnych po-równań Dunna wykazał, iż poziom ekspresji mRNA MT-1G był istotnie statystycznie wyższy w ch.GB w porównaniu do WG (p < 0,05; rycina 21). Podobną zależność wykazano dla ekspresji mRNA MT-1H (p < 0,05; rycina 22).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 57 –

Rycina 21. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1G w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). *p < 0,05; test wielokrotnych porównań Dunna

Rycina 22. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1H w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). *p < 0,05; test wielokrotnych porównań Dunna

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 58 –

Istotne statystycznie różnice wykazano również w wypadku względnej ekspresji mRNA MT-1X, która była najwyższa w Kontroli, nato-miast najniższa w badanych przypadkach ch.GB. Analiza statystyczna wy-kazała, iż ekspresja mRNA tej izoformy była istotnie statystycznie wyższa w Kontroli w porównaniu do ch.GB (p < 0,05; rycina 23).

Rycina 23. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1X w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola). *p < 0,05; test wielokrotnych porównań Dunna

Mimo że test Kruskal-Wallisa wskazywał na istotnie statystycz-nie różnice we względnej ekspresji poziomu mRNA MT-1F, analiza post hoc z uwzględnieniem hipotezy wielokrotnych testowań (test wielo-krotnych porównań Dunna) nie potwierdził tych obserwacji. Ekspresja mRNA MT-1F nie różniła się w sposób znaczący pomiędzy ch.GB, WG oraz Kontrolą (rycina 24).

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 59 –

Rycina 24. Względny poziom (RQ) ekspresji mRNA MT-1F w ch.GB, WG oraz w nie-zmienionej tkance tarczycy pobranej z sąsiedztwa wola guzowatego (Kontrola)

4.5. Poziom ekspresji mRNA badanych izoform metalotioenin w chorobie Gravesa-Basedowa, wolu guzowatym oraz niezmienionej tkance tarczycy

w zależności od płci i wieku pacjentów W celu określenia zależności między poziomem ekspresji mRNA

badanych izoform metalotionein w ch.GB od płci pacjentów dokonano analizy statystycznej z użyciem testu Mann-Whitneya. Ananliza statystyczna nie wykazała jednakże żadnych istotnych statystycznie zależności pomiędzy nasileniem ekspresji mRNA poszczególnych izo-form metalotionein a płcią pacjentów z ch.GB. Wyniki tej analizy zestawiono w tabeli 17. W związku z małą liczebnością pacjentów płci męskiej w grupie WG oraz Kontroli nie przeprowadzono w nich analizy statystycznej.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 60 –

Tabela 17. Podsumowanie analizy statystycznej z wykorzystaniem testu Mann-Whitneya ekspresji poszczególnych mRNA izoform metalotionein w zależności od płci pacjentów z ch.GB

Marker zmiana Średnia±SD Mediana (25%; 75%) Wartość p

Mężczyźni 36,45±39,5 26,79 (6,33; 62,81) MT-1A

Kobiety 33,59±45,43 19,29 (4,40; 36,87) p = 0,8155

Mężczyźni 633,70±684,4 434,9 (77,87; 1212) MT-1B

Kobiety 782,30±1143 434,3 (100,2; 902,7) p = 0,9793

Mężczyźni 8,91±6,36 7,34 (4,47; 13,25) MT-1E

Kobiety 8,17±8,05 6,14 (2,43; 8,78) p = 0,4216

Mężczyźni 2,15±0,65 2,32 (1,37; 2,63) MT-1F

Kobiety 2,17±1,45 2,02 (0,99; 2,91) p = 0,7361

Mężczyźni 0,82±0,38 0,75 (0,53; 1,19) MT-1G

Kobiety 0,85±0,63 0,72 (0,33; 1,11) p = 0,8155

Mężczyźni 0,83±0,37 0,88 (0,47; 1,13) MT-1H

Kobiety 1,09±1,31 0,89 (0,37; 1,27) p = 0,9380

Mężczyźni 0,54±0,29 0,42 (0,31; 0,90) MT-1X

Kobiety 0,64±0,60 0,51 (0,25; 0,71) p = 0,9793

Mężczyźni 0,89±0,57 0,65 (0,51; 1,29) MT-2A

Kobiety 0,81±0,39 0,83 (0,53; 0,99) p = 0,9380

Mężczyźni 11,14±9,65 7,90 (3,79; 19,90) MT-3

Kobiety 20,47±23,08 12,28 (6,96; 28,06) p = 0,2511

Analiza poziomu mRNA badanych izoforom metalotionein

w zależności od wieku badanych pacjentów nie wykazała żadnych istotnych statystycznie zależności w poszczególnych grupach, tj. ch.GB, WG oraz Kontroli (test korelacji Pearsona). Wyniki analizy statystycznej zostały podsuowane w tabeli 18.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 61 –

Tabela 18. Zależność nasilenia ekspresji markerów mierzonej z wykorzystaniem metody immunohistochemicznej od wieku pacjentów z ch.GB oraz WG Zależności pomiędzy zmiennymi analizowano z wykorzystaniem testu korelacji Pearsona

Izoforma metalotioneiny

Choroba Gravesa-Basedowa

[wiek]

Wole guzowate [wiek]

Kontrola [wiek]

MT-1A r = –0,117 p = 0,783

r = –0,078 p = 0,853

r = –0,082 p = 0,846

MT-1B r = –0,022 p = 0,959

r = –0,031; p = 0,943

r = –0,212 p = 0,614

MT-1E r = –0,069 p = 0,872

r = 0,056 p = 0,895

r = –0,392 p = 0,336

MT-1F r = 0,322 p = 0,437

r = 0,269 p = 0,520

r = 0,219 p = 0,602

MT-1G r = 0,248 p = 0,554

r = 0,468 p = 0,243

r = 0,083 p = 0,844

MT-1H r = 0,186 p = 0,658

r = 0,164 p = 0,697

r = 0,267 p = 0,522

MT-1X r = 0,595 p = 0,120

r = –0,0,49 p = 0,908

r = 0,180 p = 0,669

MT-2A r = 0,341 p = 0,408

r = 0,191 p = 0,651

r = 0,293 p = 0,481

MT-3 r = 0,510 p = 0,196

r = 0,584 p = 0,128

r = 0,126 p = 0,767

4.6. Korelacja poziomu ekspresji poszczególnych mRNA izoform metalotionein w badanych zmianach tarczycy

Analiza statystyczna wykazała istotne statystycznie dodatnie

korelacje pomiędzy względnymi poziomami ekspresji mRNA badanych izoform metalotionein we wszystkich trzech typach badanych zmian tarczycy. Największą liczbę istotnych zależności stwierdzono w ch.GB (tabela 19). W przypadku WG oraz Kontroli również występowały kore-lacje między ekspresją badanych przypadków, które zostały przedsta-wione odpowiednio w tabelach 20 oraz 21.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 62 –

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 63 –

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 64 –

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

5. DYSKUSJA Do badania włączono 67 przypadków ch.GB, wyodrębnionych

na podstawie wywiadu, badań diagnostycznych oraz rozpoznania hi-stopatologicznego. Były to przypadki z nasilonymi objawami choroby Gravesa-Basedowa, przebiegające najczęściej z wolem oraz pozatar-czycowymi objawami w postaci orbitopatii. Wszyscy pacjenci włączeni do badania byli przeze mnie operowani i byli poddani zabiegowi cał-kowitego usunięcia gruczołu tarczowego.

Jest to jedna z najliczniejszych grup operowanych pacjentów, z ch.GB poddanych badaniu w poszukiwaniu czynników molekular-nych, takich jak: COX-2, metalotioneiny, KI-67, receptory estrogenowe i progesteronowe, w porównaniu z dostępnym piśmiennictwem. Gru-pę kontrolną stanowiło 25 pacjentów operowanych z powodu wola wieloguzkowego. Badania te były wykonane z użyciem metody immu-nohistochemicznej (IHC).

W drugiej części badań, za pomocą metody RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction), oznaczono funkcjonalne izoformy MT-I/II w materiale od operowanych osób z powodu ch.GB, WG i grupy z prawidłową tkanką tarczycy pobraną z okolic wola guzkowego.

Komisja Bioetyczna przy Uniwersytecie Medycznym we Wro-cławiu zaopiniowała projekt i wyraziła zgodę na realizację.

W 2013 r. autor niniejszej pracy opublikował artykuł na temat receptorów estrogenowych, progesteronowych i antygenu Ki-67 w chorobie Gravesa-Basedowa [55]. Praca ta była oparta na większym materiale. W pracy habilitacyjnej wykorzystano mniej przypadków, gdyż zaostrzono kryteria kliniczne pacjentów.

Zainteresowanie autora chorobą Gravesa-Basedowa trwa od wielu lat. W 1995 r. pierwsze doświadczenia zostały uwieńczone pracą

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 66 –

doktorską: „Ocena objętości i czynności gruczołu tarczowego u ope-rowanych z powodu choroby Gravesa-Basedowa”.

W pracy tej stwierdziłem, że ryzyko nawrotu nadczynności tar-czycy po operacji wola Gravesa-Basedowa rośnie wraz z ilością pozo-stawionej tkanki tarczycowej, co wskazuje na potrzebę zwiększenia radykalności zabiegu. Dalsze badania autora dotyczyły oceny ryzyka wystąpienia nadczynności tarczycy po operacyjnym leczeniu tej cho-roby [51]. Badanie różnych czynników mających wpływ na nawrót nad-czynności tarczycy w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa oraz do-świadczenia zdobyte na zagranicznych stażach sprawiły, że jako pierw-szy w Klinice, w której pracuję, wprowadziłem zabieg całkowitego usu-nięcia gruczołu tarczowego w chorobie Gravesa-Basedowa, początko-wo w przypadkach nasilającej się oftalmopatii, a później w każdym przypadku tej choroby. Do chwili wprowadzenia tej metody operacyj-nej w Klinice były wykonywane zabiegi subtotalnego usunięcia gruczo-łu tarczowego. Obecnie zabieg całkowitego usunięcia tarczycy w cho-robie Gravesa-Basedowa jest uznawany za złoty standard leczenia ope-racyjnego tej choroby. Moje badania nad wpływem całkowitego usu-nięcia tarczycy na zahamowanie postępującego wytrzeszczu gałek ocznych ukazały się w Polskim Przeglądzie Chirurgicznym w 2007 r. [53], inne problemy dotyczące ch.GB były tematem doniesień zjazdo-wych autora (49, 50, 52, 54).

Obecna praca jest kontynuacją zainteresowań chorobą Grave-sa-Basedowa, mającą na celu pogłębienie wiedzy na temat molekular-nych czynników prognostycznych i etiopatogenetycznych występują-cych w tej chorobie.

Do badań molekularnych zostały wybrane czynniki odpowie-dzialne za proces zapalny tkanki i proliferację, jak: COX-2, metalotione-iny i Ki-67. Oznaczenie receptorów estrogenowych i progesterono-wych miało na celu próbę wyjaśnienia częstszego występowania ch.GB wśród kobiet.

W pracy stwierdziłem wysoką ekspresję COX-2 u wszystkich pa-cjentów z ch.GB i prawie u wszystkich osób z grupy kontrolnej wola guzkowego (24/25). Wykazano bardzo wysoką korelację pomiędzy grupą główną a kontrolną w zakresie tego czynnika.

Cyklooksygenaza (COX) katalizuje proces powstania prosta-glandyn z kwasu arachidonowego. Końcowe produkty cyklu cyklook-sygenazy-2, jak już wspomniano we wstępie, są zaangażowane

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 67 –

w procesy patologiczne ustroju, takie jak: karcinogeneza, pobudzanie angiogenezy komórki nowotworowej, hamowanie apoptozy, zwięk-szanie inwazji komórkowej, indukcję proliferacji komórki oraz udział w procesie zmniejszania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko komórkom rakowym (104, 161, 163).

W badaniach nad COX-2 w dostępnej literaturze dotyczącej choroby Gravesa-Basedowa, spotyka się oznaczanie jej ekspresji w tkance tarczycyowej oraz pozagałkowej oczodołu w orbitopatii to-warzyszącej ch.GB, w chorobie Hashimoto oraz w nowotworach tar-czycy. Kim oznaczał ekspresję COX-2 u 3 pacjentów z ch.GB, nie stwier-dzając obecności tego enzymu [96]. W dostępnej literaturze nie znala-złem więcej doniesień, gdzie oznaczano COX-2 w tkance tarczycowej u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. Brak oznaczenia COX-2 u 3 pacjentów niewiele wnosi do dyskusji, ze względu na małą liczbę pacjen-tów oraz brak informacji na temat stopnia zaawansowania tej choroby.

Kolejne prace dotyczą ekspresji COX-2 w tkance pozagałkowej. Bloise i wsp. badali ekspresję COX-2 w tkance pozagałkowej oczodo-łów u pacjentów z ch.GB. Uważają oni, że leczenie orbitopatii w prze-biegu choroby Gravesa za pomocą diklofenaku spowodowało ustąpie-nie bólu gałek ocznych i podwójnego widzenia u 12 z 13 badanych pacjentów [23]. Lek ten jest silnym inhibitorem PPAR-gamma (peroxi-some proliferator-activated receptor) oraz COX-2, których ekspresję stwierdzono w tkance tłuszczowej oczodołów u pacjentów z nasiloną orbitopatią [128]. PPAR-gamma jest jednym z induktorów procesu zwiększania się objętości tkanki tłuszczowej w tkance pozagałkowej oczodołu. Podobne wyniki otrzymali również Vondrichova i wsp. [184].

W badaniach Yoon i wsp. również stwierdzili ekspresję COX-2 w fibroblastach z tkanki okołogałkowej pacjentów z ch.GB. Zastosowa-nie przez nich kwercetyny (Quercetin – flawonowany glikozyd) w ko-mórkowej hodowli tych fibroblastów, oprócz innych czynników zapal-nych, osłabiało efekt działania COX-2 [196].

W badaniach nad COX-2 w przewlekłym zapaleniu i raku tarczy-cy Cornetta i wsp. stwierdzili ekspresję COX-2 w raku tarczycy oraz u pacjentów z chorobą Hashimoto, nie wykazali natomiast jej obecno-ści w prawidłowej tkance tarczycy, wnioskując na podstawie przepro-wadzonych badań, że obecność COX-2 jest wspólna dla procesów no-wotworowych i autoimmunologicznych tarczycy [43]. Lee i wsp. w ba-daniach immunohistochemicznych nad ekspresją COX-2 nie stwierdzili

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 68 –

jej obecności w prawidłowej tkance tarczycowej, a jej ekspresja w ła-godnych i złośliwych guzach tarczycy oraz w przewlekłym zapaleniu tarczycy nie stanowiła podstawy, aby uznać jej znaczącą wartość kli-niczną [113]. Ekspresja COX-2 w przewlekłym zapaleniu tarczycy (cho-robie Hashimoto) może predysponować tyreocyty do wytwarzania prozapalnych cytokin, jak IL-6, które zwiększają odpowiedź zapalną i ryzyko rozwoju raka tarczycy [43]. Dalsze doniesienia, warte przyto-czenia, dotyczą roli COX-2 w raku tarczycy. Garcia-Gonzales i wsp. na podstawie swoich badań uważają, że COX-2 odgrywa pewną rolę we wszystkich rakach tarczycy, a w raku brodawkowatym jej rola wydaje się istotna tylko w początkowym jego stadium [72]. Kajita i wsp. w badaniach stwierdzili zwiększoną ekspresję COX-2 w raku brodaw-kowatym tarczycy w porównaniu do prawidłowej tkanki tarczycowej, jednak poziomy ekspresji były o różnym nasileniu [93]. Lo i wsp. uważają, że COX-2 jest znaczącym molekularnym markerem raka bro-dawkowatego tarczycy, w przypadkach trudnych diagnostycznie. Nie stwierdzili oni występowania COX-2 w prawidłowej tkance tarczycy oraz w 6 badanych przypadkach limfocytarnego zapalenia tarczycy [118]. W innym doniesieniu Specht i wsp. wykazali ekspresję COX-2 w 8 z 10 przypadków raka tarczycy, nie stwierdzili jej w łagodnych guz-kach tarczycy oraz otaczającej guz prawidłowej tkance tarczycy [165].

Stwierdzona wysoka ekspresja COX-2 w moich badaniach u pa-cjentów z ch.GB była związana z wysokim zaawansowaniem zmian chorobowych, gdzie postawiono już wskazania do leczenia operacyj-nego. Tak wysoka ekspresja COX-2 może być czynnikiem rokowniczym co do decyzji o leczeniu operacyjnym chorych na ch.GB. Duży związek COX-2 z procesem zapalnym i przemianą nowotworową może być czynnikiem rokowniczym w postępowaniu z pacjentami z ch.GB. Stwierdzenie wysokiej ekspresji COX-2 w ch.GB świadczy o dużym wo-lu, nasilonej proliferacji i dużym prawdopodobieństwie nasilonej oftal-mopatii, gdyż tylko takich pacjentów kwalifikowałem do ww. badania. Biorąc pod uwagę również udział COX-2 w procesie karcinogenezy, wysoka jej ekspresja w wolu Gravesa-Basedowa, może dodatkowo sta-nowić wskazanie do leczenia operacyjnego tarczycy w celu uniknięcia transformacji nowotworowej. Potwierdzają to najnowsze badania Chena i wsp. [39], którzy stwierdzili, że zapadalność na raka tarczycy u pacjentów z ch.GB wynosi 4,92 na 1000 osób na rok i jest znamiennie 1,37 raza wyższa od porównywanej grupy osób z wolem guzowatym.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 69 –

Należy również podkreślić działanie leków przeciwzapalnych, które poprzez wpływ na COX-2 zmniejszają ryzyko przemiany nowotworo-wej [43].

Rola COX-2 w prognozowaniu przebiegu choroby Gravesa- -Basedowa i przemiany nowotworowej nie jest jednak na obecnym etapie wiedzy dostatecznie określona. Wymaga to dalszych pogłębio-nych badań.

W badaniu autora oceniana była następnie ekspresja MT-I i MT-II w 67 przypadkach ch.GB i 24 przypadkach wola wieloguzkowe-go. MT były oceniane zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórko-wym. Ekspresję MT stwierdzono we wszystkich przypadkach ch.GB i wola wieloguzkowego. Zauważono istotną statystycznie różnicę w ekspresji MT cytoplazmatycznej i MT jądrowej w porównaniu do grupy wola wieloguzkowego. Stwierdzono ponadto bardzo wysoką korelację pomiędzy ekspresją cytoplazmatyczną a jądrową w ch.GB, nieco mniejszą korelację między tymi czynnikami w WG

Metalotioneiny są białkami zapewniającymi ochronę komórki przed reaktywnymi formami tlenu (ROS) oraz przed szkodliwym wpły-wem jonów metali ciężkich. Ekspresję tych białek spotyka się w komór-kach nowotworowych tarczycy, są również uznawane jako marker stre-su oksydacyjnego w chorobie Gravesa-Basedowa [11].

Ekspresja MT w komórce pojawia się w wyniku zadziałania ta-kich czynników, jak: ROS, cAMP, wapń, kinaza białkowa C (protein kina-se C – PKC), jony metali ciężkich, cytokiny, czy ludzki antygen leukocy-tarny HLA klasy II (human leukocyte antygen – HLA class II) [11, 152].

W dostępnej literaturze znalazłem 2 prace na temat ekspresji MT w chorobie Gravesa-Basedowa. W swoich badaniach Schmid stwierdził ekspresję MT-I/II we wszystkich analizowanych 32 wycinkach u pacjentów z ch.GB. Intensywność reakcji barwnej jak i lokalizacja ekspresji MT-I/II różniły się pomiędzy badanymi przypadkami. Ekspre-sja była większa w tkance z nasilonymi zmianami naciekowymi [156].

Ruiz-Riol i wsp. oceniali MT w 14 gruczołach tarczowych z ch.GB, porównując je z innymi chorobami tarczycy: wolem Hashimo-to [5], wolem wieloguzkowym (12), rakiem tarczycy (3) i prawidłową tkanką tarczycy (5) (152). Badali również stężenie antygenu HLA klasy II i stopnia nacieków limfocytarnych w porównaniu do MT. Nie stwierdzi-li ekspresji MT w wolu wieloguzkowym, wykazali natomiast, że MT mo-gą być przydatnym markerem stresu komórkowego w chorobach au-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 70 –

toimmunologicznych. Ekspresję MT wykazali u 9 z 14 badanych tarczyc z ch.GB, która była podobna do ekspresji antygenu HLA klasy II. Ponad-to zauważyli korelację między ekspresją MT a stopniem nacieków lim-focytarnych tkanki tarczycy w ch.GB. Nie stwierdzili zależności między ekspresją MT a stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych, wielkością wola czy obecnością orbitopatii. Ekspresja MT i antygenu HLA klasy II były podobne w ch.GB i raku tarczycy. Na podstawie swoich badań Ruiz-Riol i wsp. stwierdzili, że w komórkach tarczycy z ch.GB z wysoką ekspresją MT są uruchomione mechanizmy naprawcze i zmniejszające stan zapalny tkanki [152]. W innym doniesieniu traktującym o roli MT w nowotworach tarczycy Królicka i wsp. stwierdzili najwyższą ekspresję MT w raku pęcherzykowym tarczycy a najmniejszą w raku rdzeniastym tego gruczołu. Wykazano ponadto znacznie wyższą ekspresję MT w raku pęcherzykowym niż gruczolaku pęcherzykowym tarczycy. Nie stwierdzono natomiast korelacji pomiędzy ekspresją MT i Ki-67 między rakiem a gruczolakiem pęcherzykowym. Autorzy ci uznali, że oznacza-nie MT w zmianach pęcherzykowych tarczycy może być pomocne w różnicowaniu raka od gruczolaka pęcherzykowego [105].

W badaniach oceniałem również ekspresję izoform metalotio-nein w tkance tarczycy z ch.GB, WG i w prawidłowej tkance tarczycy. Za pomocą techniki RT-PCR oceniono izoformy MT-I/II w 30 wycinkach pobranych od pacjentów z ch.GB, 10 przypadkach WG i 8 prawidło-wych tkankach tarczycy, pobranych z sąsiedztwa wola guzkowego. Badano poziom ekspresji poszczególnych izoform funkcjonalnych me-talotionein, jak: MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H, MT-1X, MT-2A, MT-3, MT-4. W pracy, wykazałem istotne statystycznie różnice pomiędzy ch.GB, WG oraz niezmienioną tkanką tarczycy pobraną z sąsiedztwa wola guzowatego. Zaobserwowałem wysokie korelacje w poziomie ekspresji mRNA MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H, MT-1X i MT-3. Nie zanotowałem istotnie statystycznie zróżnicowa-nej ekspresji poziomu mRNA MT-2A. W badanych przypadkach nie zaob-serwowałem ekspresji mRNA MT-4. Wysoka ekspresja izoform MT potwier-dza wcześniej uzyskane wyniki na poziomie ekspresji białka MT-I/II.

W dostępnym piśmiennictwie nie znalazłem pracy, w której by-łyby oznaczane izoformy MT w chorobie Gravesa-Basedowa, jedynie prace, w których izoformy były oznaczane w nowotworach tarczycy.

Ferario i wsp. badając MT w guzach nowotworowych tarczycy, stwierdzili, że powodują one zahamowanie rozwoju raka pęcherzyko-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 71 –

wego i brodawkowatego, bardziej widoczne w tym ostatnim nowo-tworze [67]. W nowotworach tarczycy opisują MT-1G jako czynnik su-presorowy w raku brodawkowatym tarczycy [67]. Liu i wsp. badali eks-presję ośmiu izoform MT-I i MT-II w raku brodawkowatym tarczycy (KAT5-cells) [117]. Wzbudzenie tych izoform powodowało zwiększony podział komórkowy w cyklu G0/G1 do G2-M, wolniejszy w fazie G0/G1 i szybszy w fazie G2-M. Blokowanie izoform MT powodowało hamowanie cyklu podziału komórkowego. Badając izoformy MT w tym raku tarczycy, stwierdzili, że w patogenezie tego nowotworu u człowieka biorą udział wszystkie funkcjonalne izoformy MT-I/II, w liczbie 8, które uczestniczą w cyklu podziału komórki, zależnym od dostarczonych jonów wapnia [117].

Ci sami autorzy w kolejnych badaniach nad rakiem anapla-stycznym wykazali, że głównymi izoformami MT-I/II w tej jednostce są: MT-1A, -1F, -1G, -1H , -1X i -2A, wzbudzane, kiedy do komórki rakowej jest dostarczony kadm. Wzbudzanie tych izoform przez obecność kadmu jest swoiste tylko dla tych komórek. Obecność kadmu zapocząt-kowuje również cykl podziałów komórkowych od G1 do fazy S [116].

W badaniach Bäck i wsp. sugerują, że skoro niektóre z czynni-ków wyzwalających wytwarzanie MT są regulowane przez stymulację receptora komórki tarczycowej (TSHR), oraz że stymulacja TSHR powo-duje ekspresję izoformy MT-1X w komórkach nowotworowych raka tarczycy przez TSH, proponują oni uznać TSH jako kluczowy czynnik regulujący ekspresję MT w nowotworowej komórce tarczycy [11].

W związku z tym, że uprzednio wykazałem wysoką ekspresję COX-2 w ch.GB i ich związek z procesem nowotworowym tkanki, mając na uwadze również wysokie korelacje ekspresji izoform MT w ch.GB, poniżej chciałbym przedstawić w dyskusji, jak zachowują się izoformy MT w innych nowotworach. Jest to związane również z niewielką liczbą publikacji na temat izoform MT w chorobach tarczycy.

Hishikava i wsp. oznaczyli izoformy MT-1A i MT-2A w jądrze i cy-toplazmie komórek u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przeły-ku. Guzy wykazujące ekspresję tych izoform charakteryzowały się gor-szym rokowaniem, częstszymi przerzutami odległymi i do regional-nych węzłów chłonnych [85]. W raku żołądka MT mogą pełnić funkcję ochronną w komórkach błony śluzowej żołądka [68]. Mitani i wsp. stwierdzili, że zakażenie Helicobacter pylori powoduje spadek ekspresji MT-I/II. Obecność tej bakterii może być jednym z czynników prowa-dzących do przemiany nowotworowej. Skoro zakażenie Helicobacter

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 72 –

pylori zmniejsza ekspresję MT-I/II, ogranicza to funkcje ochronne MT. Eradykacja tej bakterii powodowała, że po 2 latach poziom ekspresji MT-I/II wracał do poziomu, jaki stwierdzano u osób bez cech takiego zakażenia [129]. Chun i wsp. stwierdzili, że wyższa ekspresja izoform MT: MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1L i MT-1X, w raku żołądka charaktery-zowała się zwiększoną opornością na leczenie cytostatykiem irinoteka-nem [40]. Yan i wsp. w swoich badaniach zauważyli, że wraz ze wzro-stem złośliwości raka jelita grubego zmniejsza się ekspresja mRNA MT-1F, MT-1G, MT-1X i MT-2A, w szczególności zmniejszała się ekspre-sja MT-1F [195]. W badaniach Arriaga i wsp. również zauważyli podob-ne zmiany. W gruczolakoraku jelita grubego stwierdzili oni utratę eks-presji izoform MT: MT-1G, MT-1E, MT-1F, MT-1H i MT-1M oraz istotny spadek izoform MT 1X i MT-2A [10]. Inni autorzy stwierdzili, że izoforma MT-1G działa supresyjnie na guzy nowotworowe wątroby, gruczołu piersiowego i tarczycy, ale ekspresja większości izoform MT-I/II wpływa na progresję zmian nowotworowych [67, 95]. Jin i wsp. uważają, że MT-1F koreluje ze stopniem histologicznej złośliwości i inwazyjności raka gruczołu piersiowego, a MT-2A w tym samym raku inicjuje prolife-rację i ma wpływ na chemooporność na doksorubicynę [90, 91]. Frie-dline i wsp. uważają że, izoformy MT-1E i MT-1F pośredniczą w po-wstawaniu raka gruczołu piersiowego [70]. Werynska i wsp. w swoim badaniu dotyczącym niedrobnokomórkowego raka płuca, stwierdzili że MT-1F jest związana z większym stopniem złośliwości guza (G3) oraz większymi rozmiarami nowotworu, natomiast izoforma MT-2A nie ko-relowała z badanymi parametrami klinicznymi, a jej ekspresja nie była znacząca w tym nowotworze [190]. Tai i wsp. uważają, że MT-2A jest związana bardziej z zaawansowanym procesem nowotworowym i zwiększonym stopniem inwazyjności nowotworu [170]. W raku pro-staty zahamowanie ekspresji MT-2A powodowało indukcję apoptozy i śmierć komórek nowotworowych (194). Izoforma MT-1B wykazywała korelację z podtypami histologicznymi raka niedrobnokomórkowego płuca [190]. W tym samym badaniu izoforma MT-1H wykazywała wyż-szą ekspresją w badanym nowotworze, w raku gruczołu piersiowego natomiast nie stwierdzono jej znaczącej ekspresji [170, 190]. Izoforma MT-1E miała niższą ekspresję w raku niedrobnokomórkowym płuca, może być ona związana z różnicowaniem się linii komórkowych [190]. Izoforma MT-1G miała zwiększoną ekspresję w raku niedrobnokomór-kowym płuca, natomiast nie stwierdzono jej znaczącej ekspresji w raku

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 73 –

wątroby, tarczycy i gruczołu piersiowego, stąd przyjmuje się że może mieć znacznie ograniczające wzrost guza [67, 95, 190, 170].

Ekspresja izoformy MT-1X jest różnie opisywana w piśmiennic-twie. W raku wątroby stwierdzono jej niską ekspresję, ale w raku pro-staty, gruczołu piersiowego i raku płuc ekspresję zwiększoną [74, 171, 190, 194]. Izoforma MT-1A miała nieznaczącą niską ekspresję w raku płuc i raku gruczołu piersiowego [170, 190]. Izoforma ta jest wzbudza-na obecnością jonów metali ciężkich, pełni funkcje ochronne komórki poprzez usuwanie wolnych rodników tlenowych i zmniejszenie proce-su apoptozy [190].

Zwiększona ekspresja izoformy MT-3 niekorzystnie prognozuje u pacjentek chorych na raka gruczołu piersiowego [158]. Autorzy suge-rują że nadmiar tej izoformy zwiększa ilość MT niezwiązanych z meta-lami, wywołując obniżenie ilości cynku w komórce, co powoduje dere-gulację procesów komórkowych i wywołuje genetyczną niestabilność, sprzyjającą powstaniu nowotworu [158]. Jednakże MT niezwiązana z metalem jest szybko rozkładana przez proteazy, co powoduje, że powyższa teoria jest tylko hipotezą.

Na podstawie przedstawionych badań i danych z literatury można stwierdzić, że metalotioneiny biorą udział w procesie zapalnym komórki, a ich obecność ma znaczenie ochronne.

W dalszej części moich badań oznaczałem korelacje białka Ki-67. Stwierdzono znamienną istotność statystyczną między ekspresją KI-67 w ch.GB w porównaniu do grupy WG W ch.GB stwierdziłem po-nadto wysoką korelację pomiędzy Ki-67 a COX-2 oraz statystycznie istotną korelację pomiędzy ekspresją antygenenu Ki-67 a cytoplazma-tyczną MT-I/II, w porównaniu do grupy wola obojętnego.

Ki-67 jest znanym czynnikiem charakteryzującym proliferację komórkową. Jego obecność świadczy o dużej zdolności proliferacyjnej komórki [191].

Biorąc pod uwagę również wysokie korelacje ekspresji między Ki-67 i COX-2 i MT, pomiędzy grupą z ch.GB i wolem wieloguzkowym, można przypuszczać, że czynniki te są zaangażowane w proces zapal-ny w komórce tarczycy w chorobie Gravesa-Basedowa.

W badaniu dokonałem szczególnej weryfikacji pacjentów. Wszyscy chorzy na ch.GB byli operowani z powodu nasilonych obja-wów choroby Gravesa-Basedowa w postaci dużego wola oraz nasilają-cej się orbitopatii, po wyrównaniu czynności tarczycy w wyniku lecze-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 74 –

nia zachowawczego. Wysokie korelacje powyższych czynników wska-zują na zaawansowany proces chorobowy, dużą aktywność zmian za-palnych, proliferacyjnych i włączenia procesów naprawczych w ch.GB.

Od wielu lat istnieje nierozwiązany problem częstszego wystę-powania chorób autoimmunologicznych wśród kobiet. W chorobie Gravesa-Basedowa zapadalność na tę chorobę jest do około 10 razy częstsza wśród osób płci żeńskej, szczególnie tam, gdzie nie występuje niedobór jodu [138]. Stało się to podstawą do poszukiwania ewentual-nych przyczyn takiego stanu rzeczy.

W badaniach postanowiłem oznaczyć ekspresję receptorów progesteronowych i estrogenowych w tkance pacjentów z ch.GB i po-równać je z wynikami badań w grupie WG.

Nie stwierdziłem istotnej statystycznie korelacji pomiędzy nasi-leniem ekspresji receptorów estrogenowych i progesteronowych w grupie badanych pacjentów z ch.GB a płcią tych osób. Ponadto nie stwierdziłem istotnej statystycznie różnicy pomiędzy występowaniem ekspresji receptorów estrogenowych u pacjentów z ch.GB, w porów-naniu do grupy pacjentów z WG Wykazałem istotną statystycznie, ale słabą zależność pomiędzy ekspresją receptorów progesteronowych w ch.GB w porównaniu do grupy WG W badaniu opartym na większej liczbie pacjentów z ch.GB uzyskałem podobne wyniki [55].

W dostępnym piśmiennictwie, Wang i wsp. oznaczali ekspresję receptorów estrogenowych w tkance tarczycowej osób z ch.GB [187]. W badaniach immunohistochemicznych stwierdzili ekspresję ER u 28 osób z badanej grupy 40 pacjentów z ch.GB. Ponadto stwierdził istotną korelację (p < 0,05) między występowaniem ER u kobiet i męż-czyzn z ch.GB. Na podstawie badań stwierdzili, że ekspresja ER jest związana z rozwojem ch.GB i że może być czynnikiem wywołującym ch.GB [187]. Do końca nie można porównać wyników badań i wyników Wanga i wsp., gdyż w moich badaniach grupę kontrolną stanowili pa-cjenci z WG, Wang i wsp. porównywali natomiast swoje wyniki osób z ch.GB do grupy osób z prawidłową tarczycą.

W innych chorobach tarczycy, Ceresini i wsp. badali ekspresję ERα i ERβ w tkankach z wola wieloguzkowego i raka brodawkowatego tarczycy, nie stwierdzając ekspresji ERα, wykazali natomiast wysoką ekspresję ERβ w ww. tkankach [36].

Arain i wsp. badając ekspresję ER u 50 pacjentów z różnymi chorobami tarczycy (wole wieloguzkowe – 8, gruczolaki – 9, rak bro-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 75 –

dawkowaty – 19, rak pęcherzykowy – 10, rak rdzeniasty – 4, nie stwier-dzili ekspresji ER w żadnym przypadku – 9. Hiasa i wsp. badając ekspre-sję receptorów estrogenowych w 313 preparatach parafinowych po-chodzących od pacjentów z różnymi chorobami tarczycy stwierdzili ekspresję ER w 59% przypadkach wola wieloguzkowego, 33% przy-padków gruczolaków tarczycy, 18% przypadków raka tarczycy [84].

Badania nad genem ESR2, kodującym estrogenowy receptor β (ERβ), wykazały, że gen ten nie jest związany z występowaniem ch.GB w populacji japońskiej [13]. Polscy badacze stwierdzili natomiast istot-ną zależność pomiędzy tym genem a zapadalnością na chorobę Grave-sa-Basedowa. Gen ten o lokalizacji14q23, znajduje się blisko genu związanego z ch.GB o lokalizacji 14q31 [97].

Progesteron pełni znaczące funkcje w organizmie kobiety. W ciąży podniesione stężenie tego hormonu hamuje czynność skur-czową macicy, działając przez jądrowe receptory, będąc również anta-gonistą COX-2 [80]. Progesteron działa poprzez receptor progestero-nowy (PR), indukując czynnik PIBF (progesterone induced blocking fac-tor), który ma modulujący wpływ na limfocyty B, działając immunosu-presyjnie [56].

W dostępnym piśmiennictwie dotyczącym ch.GB i występowa-nia ekspresji PR, Hori i wsp. badając 257 przypadków mikroraka bro-dawkowatego, powstałego na skutek ch.GB, nie stwierdzili w żadnym przypadku ekspresji PR i ER [88]. Poza tym w dostępnym piśmiennic-twie nie znalazłem pracy opisującej ekspresję PR w ch.GB. Można tu jeszcze przytoczyć inną chorobę autoimmunologiczną, reumatoidalne zapalenie stawów, gdzie Ishizuka i wsp. stwierdził zwiększoną ekspre-sję PR w tkance maziowej [89].

Obecność zwiększonej ekspresji receptorów progesteronowych w komórce pęcherzykowej tarczycy osób z ch.GB, może mieć pewne ochronne funkcje, ograniczając proces zapalny i reakcję limfocytów B. Na podstawie przytoczonych badań nie można jednoznacznie określić wpływu progesteronu i estrogenów na tkankę tarczycową i ewentual-ne częstsze występowanie ch.GB u kobiet. Arain i wsp. sugerują, że wpływ hormonów płciowych na częstsze występowanie chorób auto-immunologicznych u kobiet może być pośredni [9]. Problem częstsze-go występowania chorób autoimmunologicznych, w tym ch.GB, może być związany ze swoistym efektem oddziaływania żeńskich hormonów płciowych na układ immunologiczny [45]. Choroby autoimmunolo-

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 76 –

giczne częściej występują u kobiet. Niektóre z nich, jak np. choroba Sjögrena czy toczeń rumieniowaty układowy (lupus erythematous), pojawiają się 2–3 razy częściej u kobiet [45]. Hormony płciowe mogą oddziaływać na układ immunologiczny immunosupresyjnie oraz wpływać na pobudzenie układu immunologicznego, a ostateczny wy-nik może zależeć od stężenia poszczególnych hormonów i poziomów ekspresji PR i ER na niektórych typach komórek immunologicznych [45, 60, 133]. Ponadto odpowiedzi immunologiczne zarówno komór-kowe, jak i humoralne są większe u kobiet [26]. Przyjmuje się, że estro-geny pobudzają układ immunologiczny, podczas gdy androgeny i progesteron mają wpływ immunosupresyjny [45]. Stąd badania nad częstszym występowaniem chorób autoimmunologicznych u kobiet powinny być dalej prowadzone ze szczególnym uwzględnieniem roli układu immunologicznego.

Podsumowując, chciałbym zaznaczyć, że do tej pory badania dotyczące oznaczenia ekspresji COX-2, MT, Ki-67, receptorów ER i PR nie były prowadzone na tak dużym materiale u pacjentów z ch.GB. Ist-nieją pojedyncze doniesienia na temat COX-2, MT i Ki-67, w dostępnej literaturze nie znalazłem natomiast piśmiennictwa na temat oznacza-nia ekspresji aktywnych izoform mRNA MT w ch.GB.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

6. WNIOSKI

1. W tkance tarczycowej w chorobie Gravesa-Basedowa stwierdzono wysoką ekspresję cyklooksygenazy-2, w porównaniu do grupy kon-trolnej wola. Wysoka ekspresja COX-2 może o świadczyć udziale szlaku arachidonowego w patogenezie tej choroby.

2. Wysoka ekspresja izoform MT zarówno na poziomie białka, jak i eks-presji genów je kodujących może być związana z nasilonym proce-sem proliferacji komórkowej oraz stanu zapalnego będących podło-żem ch.GB.

3. Wysoka ekspresja Ki-67 potwierdza proliferacyjny charakter choroby Gravesa-Basedowa. Wysoka korelacja COX-2 i MT z KI-67 potwierdza udział tych czynników w procesie proliferacji w ch.GB.

4. Korelacja ekspresji mRNA poszczególnych funkcjonalnych izoform MT, głównie grupy MT-I/II potwierdza uzyskane wyniki na poziomie białka za pomocą metody IHC.

5. Brak ekspresji receptorów estrogenowych i niska ekspresja recepto-rów progesteronowych w tyreocytach chorych na ch.GB sugeruje o braku udziału żeńskich hormonów płciowych w patogenezie cho-roby na poziomie komórki tarczycowej.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

7. WYKAZ WAŻNIEJSZYCH SKRÓTÓW

AITD – autoimmune thyroid disease, choroba autoimmunologiczna tarczycy

APC – antigen presenting cells, komórki prezentujące antygen aTPO – antibody thyroid peroxidase, przeciwciała

peroksydazy tarczycy BAC – biopsja aspiracyjna cienkoigłowa CAT – catalase, katalaza ch.GB – choroba Gravesa-Basedowa cMT – cytoplazmatyczna metalotioneina COX-2 – cyklooksygenaza-2 CTLA4 – cytotoxic lymphocyte associated antigen 4, cyto-

toksyczny, związany z limfocytami antygen 4 EBV – Ebstein-Bar Virus, wirus Ebstein-Bara ER – estrogen receptor, receptor estrogenowy EUGOGO – European Group on Graves’ Orbitopathy, Europejska

grupa ds. orbitopatii FNB – fine needle biopsy, biopsja cienkoigłowa GIF – growth inhibitory factor, czynnik hamujący wzrost GPX – glutathione peroxidase, peroksydaza glutationu GO – Graves orbitopathy, orbitopatia Gravesa-Basedowa HD – Hashimoto disease, choroba Hashimoto HLA – human leukocyte antigen, ludzki antygen leukocytarny HP – Helicobacter pylori, hTPO – human thyroid peroxidase, ludzka peroksydaza

tarczycy IHC – immunohistochemical (method), metoda immuno-

histochemiczna jCT – jądrowa metalotioneina

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 79 –

MT – metalotioneiny MTF-1 – metal response element- binding transcription factor,

czynnik transkrypcyjny wiążący metal NG – nodular Goitre, wwole wieloguzkowe PIBF – progesterone induced blocking factor,

progesteronowy czynnik blokujący PKC – protein kinase C, kinaza białkowa C PPAR- gamma – peroxisome proliferator activated receptor,

aktywowany proliferacyjny receptor peroksysomu PRDX5 – peroksydaza 5 PR – progesterone receptor, receptor progesteronowy RT- PCR – real time polymerase chain reaction, reakcja

łańcuchowa polimerazy ROS – reactive oxigen species, reaktywne formy tlenu RTX – rituximab, rituksymab SOD – superoxide dismutase, dysmutaza nadtlenkowa TAO – thyroid associated opthalmopathy, orbitopatia

tarczycowa TSBABs – thyroid stimulation blocking antibodies, przeciwciała

stymulująco-blokujące tarczycy TSH – thyroid stimulating hormone, hormon tyreotropowy TSHR – THS Receptor, receptor THS na komórce tarczycy WG – wole guzowate VEGF – vascular endothelial growth factor,

wewnątrznaczyniowy czynnik wzrostowy

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

8. PIŚMIENNICTWO

1. Abalovich M, Llesuy S, Gutierrez S, Repetto M: Peripheral parameters of oxidative stress in Graves’ disease: the effects of methimazole and 131 iodine treatments. Clin Endocrinol 2003;59:321–327.

2. Abraham P, Avenell A, Park CM, Watson WA, Bevan JS: A systematic review of drug therapy for Graves' hyperthyroidism. Eur J Endocrinol 2005;153:489–498.

3. Abraham-Nordling M, Torring O, Lantz M, Hallengren B, Ohrling H, Lundell G: Incidence of hyperthyroidism in Stockholm, Sweden, 2003–2005. Eur J Endocrinol 2008;158:823–827.

4. Ademogˇ lu E, O ̈ zbey N, Erbil Y: Determination of oxidative stress in thyroid tissue and plasma of patients with Graves’ disease. Europ J In-tern Med 2006;17:545–550.

5. Agate L, Mariotti S, Elisei R, Mossa P, Pacini F, Molinaro E: Thyroid autoantibodies and thyroid function in subjects exposed to Chernobyl fallout during childhood: evidence for a transient radiation-induced elevation of serum thyroid antibodies without an increase in thyroid autoimmune disease. J Clin Endocrinol Metab 2008;93:2729–2736.

6. Akahori H, Takeshita Y, Saito R: Graves' disease associated with infec-tious mononucleosis due to primary Epstein-Barr virus infection: re-port of 3 cases. Intern Med 2010;49:2599.

7. Alexander EK, Larsen PR: High dose of (131)I therapy for the treat-ment of hyperthyroidism caused by Graves' disease. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:1073–1077.

8. Anthony P Weetman, MD, DSc: Graves' Disease. N Engl J Med 2000;343:1236–1248.

9. Arain SA, Shah MH, Meo SA, Jamal Q: Estrogen receptors in human thyroid gland. An immunohistochemical study. Saudi Med J 2003;24:174–178.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 81 –

10. Arriaga JM, Levy EM, Bravo AI, Bayo SM, Amat M, Aris M, Hannois A, Bruno L, Roberti MP, Loria FS, Pairola A, Huertas E, Mordoh J, Bianchini M: Metallothionein expression in colorectal cancer: relevance of different isoforms for tumor progression and patient survival. Hum Pathol 2012;43:197–208.

11. Bäck CM, Stohr S, Schäfer EA, Biebermann H, Boekhoff I, Breit A, Gudermann T, Büch TR: TSH induces metallothionein 1 in thyrocytes via Gq/11- and PKC-dependent signaling. J Mol Endocrinol 2013;51:79–90.

12. Bahn RS: Graves’ ophthalmopathy, mechanism of disease. Review. N Engl J Med 2010;362:726–738.

13. Ban Y, Tozaki T, Taniyama M: Lack of association between estrogen receptor beta dinucleotide repeat polymorphism and autoimmune thyroid diseases in Japanese patients. BMC Med Genet 2001;2:1.

14. Barakate MS, Agarwal G, Reeve TS, Barraclough B, Robinson B, Delbridge LW: Total thyroidectomy is now the preferred option for the surgical management of Graves' disease. ANZ J Surg 2002;72:321–324.

15. Bartalena L, Marcocci C, Tanda ML, Manetti L, Dell’unto E, Bartolomei M: Cigarette smoking and treatment outcomes in Graves ophthalmopathy. Ann Intern Med 1998;129:632–635.

16. Bartalena L, Bogazzi F, Tanda ML: Cigarette smoking and the thyroid. Eur J Endocrinol 1995;133:507.

17. Bartalena L, Baldeschi L, Dickinson AJ, Eckstein A, Kendall-Taylor P, Marcocci C, Mourits MP, Perros P, Boboridis K, Boschi A, Currò N, Daumerie C, Kahaly GJ, Krassas G, Lane CM, Lazarus JH, Marinò M, Nardi M, Neoh C, Orgiazzi J, Pearce S, Pinchera A, Pitz S, Salvi M, Sivelli P, Stahl M, von Arx G, Wiersinga WM: Consensus statement of the Euro-pean group on Graves' orbitopathy (EUGOGO) on management of Graves' orbitopathy. Thyroid 2008;18:333–346.

18. Bartalena L, Marcocci C, Bogazzi F, Manetti L, Tanda ML, Dell'Unto E, Bruno-Bossio G, Nardi M, Bartolomei MP, Lepri A, Rossi G, Martino E, Pinchera A: Relation between therapy for hyperthyroidism and the course of Graves' ophthalmopathy. N Engl J Med 1998;338:73–78.

19. Bednarek J, Wysocki H, Sowiński J: Oxidative stress peripheral pa-rameters in Graves’ disease: the effect of methimazole treatment in patients with and without infiltrative ophthalmopathy. Clin Bioch 2005;38:13–18.

20. Bell CD, Vidal S, Kovacs K, Horvath E, Rotondo F: An immunohisto-chemical survey of nine cases of medullary carcinoma of thyroid in-cluding reactivity for COX-1 and COX-2 enzymes. Endocr Pathol 2002;13:331–340.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 82 –

21. Berglund J, Ericsson UB, Hallengren B: Increased incidence of thyrotoxicosis in Malmö during the years 1988–1990 as compared to the years 1970–1974. J Intern Med 1996;239:57–62.

22. Bielicki F, Krawczyk Z, Żukowski W, Łukieńczuk T: Ocena przydatności węglanu litu w przygotowaniu chorych z tyreotoksykozą do strumec-tomii. Człowiek, Populacja, Środowisko. Prace Dolnośląskiego Cen-trum Diagnostyki Medycznej „Dolmed” we Wrocławiu 1985;8/9:30–33.

23. Bloise W, Mimura LY, Moura J, Nicolau W: Treatment of mild to mod-erate Graves' ophthalmopathy with sodium diclofenac: a pilot study. Arq Bras Endocrinol Metabol 2011;55:692–695.

24. Boehm BO, Kühnl P, Manfras BJ: HLA- DRB3 gene alleles in Caucasian patients with Graves' disease. Clin Investig 1992;70:956–960.

25. Bogazzi F, Tomisti L, Bartalena L: Amiodarone and the thyroid: A 2012 update. J Endocrinol Invest 2012;35:340–348.

26. Bouman A, Heineman MJ, Faas MM: Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 2005;11:411–423.

27. Bouzas EA, Karadimas P, Mastorakos G, Koutras DA: Antioxidant agents in the treatment of Graves’ ophthalmopathy. Am J Ophth 2000;129:618–622.

28. Brent GA: Environmental exposures and autoimmune thyroid disease. Thyroid 2010;20:755–761.

29. Brix TH, Kyvik KO, Hegedus L: What is the evidence of genetic factors in the etiology of Graves’ disease? A brief review. Thyroid 1998;8:627.

30. Brix TH, Hansen PS, Kyvik KO: Cigarette smoking and risk of clinically overt thyroid disease: a population-based twin case-control study. Arch Intern Med 2000;160:661–666.

31. Brown DC, Gatter KC: Ki67 protein: the immaculate deception? Histo-pathology 2002;40:2–11.

32. Bufalo NE, Santos RB, Cury AN: Genetic polymorphisms associated with cigarette smoking and the risk of Graves' disease. Clin Endocrinol 2008;68:982–987.

33. Burch H, Lahiri BS, Bahn RS, Barnes S: Superoxide radical production stimulates retroocular fibroblast proliferation in Graves’ ophthalmo-pathy. Exp Eye Res 1997;65:311–316.

34. Carayanniotis G, Rao VP: Searching for pathogenic epitopes in thy-roglobulin: parameters and caveats. Immunol Today 1997;18:83–88.

35. Cardoso LC, Martins DCL, Figueiredo MDL. et al: Ca2+ /nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent H2O2 generation is in-hibited by iodide in human thyroids. J Clinin Endocrinol Metab 2001;86:4339–4343.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 83 –

36. Ceresini G, Morganti S, Graiani V et al: Estrogen receptor (ER)-beta, but not ER-alpha, is present in thyroid vessels: immunohistochemical evaluations in multinodular goiter and papillary thyroid carcinoma. Thyroid 2006;16:1215–1220.

37. Chan GW, Mandel SJ: Therapy insight: management of Graves' disease during pregnancy. Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007;3:470–478.

38. Chen H: Pre-operative management of patients with Graves' disease. Surgery 2008;143:292–293.

39. Chen YK, Lin CL, Chang YJ, Cheng FT, Peng CL, Sung FC, Cheng YH, Kao CH: Cancer risk in patients with graves' disease: a nationwide co-hort study. Thyroid 2013;23:879–884.

40. Chun JH, Kim HK, Kim E, Kim IH, Kim JH, Chang HJ, Choi IJ, Lim HS, Kim IJ, Kang HC, Park JH, Bae JM, Park JG: Increased expression of metallothionein is associated with irinotecan resistance in gastric cancer. Cancer Res 2004;64:4703–4706.

41. Chung RS, Hidalgo J, West AK: New insight into the molecular pathways of metallothionein-mediated neuroprotection and regeneration. J Neurochem 2008;104:14–20.

42. Cooper DS: Antithyroid drugs. N Engl J Med 2005;352:905–917. 43. Cornetta AJ, Russell JP, Cunnane M, Keane WM, Rothstein JL: Cyclo-

oxygenase-2 expression in human thyroid carcinoma and Hashi-moto's thyroiditis. Laryngoscope 2002;112:238–242.

44. Cover TL, Aber RC: Yersinia enterocolitica. N Engl J Med 1989;321:16–24. 45. Darnall BD, Suarez EC: Sex and gender in psychoneuroimmunology re-

search: Past, present and future. Brain Behav Immun 2009;23:595–604. 46. Davis SR, Cousins RJ: Metallothionein expression in animals:

a physiological perspective on function. J Nutr 2000;130:1085–1088. 47. De Groot L, Abalovich M, Alexander EK, Amino N, Barbour L,

Cobin RH, Eastman CJ, Lazarus JH, Luton D, Mandel SJ, Mestman J, Rovet J, Sullivan S: Management of thyroid dysfunction during preg-nancy and postpartum: an Endocrine Society clinical practice guide-line. J Clin Endocrinol Metab 2012;97:2543–2565.

48. Deng D, El-Rifai W, Ji J: Hypermethylation of metallothionein-3 CpG island in gastric carcinoma. Carcinogenesis 2003;24:25–29.

49. Domosławski P, Łukieńczuk T, Forkasiewicz Z, Balcerzak W, Wojtczak B: Całkowita tyroidektomia w oftalmopatii naciekowej w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa. W: 62 Zjazd Towarzystwa Chirurgów Pol-skich. Białystok, [14–17 września] 2005. Streszczenia; Białystok: Dom Wydawniczy „Benkowski” sp. z o.o. 2005; s. 260.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 84 –

50. Domosławski P, Łukieńczuk T, Stolarska B, Sajewicz Z: The correlations between the size of thyroid gland, its activity and the levels of an-tithyroid antibodies in the patients operated on for Graves-Basedow disease. Endokrynol Pol 1993;44:46 poz.T-40. Abstr of the XIV Con-gress of the Polish Endocrine SocietyWrocław, Sept 22–25, 1993.

51. Domosławski P, Łukieńczuk T: Ocena czynników ryzyka wystąpienia nawrotu nadczynności tarczycy po leczeniu operacyjnym choroby Gravesa-Basedowa. Post Med Klin Dośw 1996;5:435–442.

52. Domosławski P, Łukieńczuk T: Zachowanie się przeciwciał przeciwtar-czycowych i objętości gruczołu tarczycowego u chorych po strumec-tomii z powodu choroby Gravesa-Basedowa. Pozn Rocz Med 1993 supl.; s. 30. VI Sympozjum Sekcji Chirurgii Endokrynologicznej Pol-skiego Towarzystwa Endokrynologicznego (27–28 maja 1993) oraz Konferencja Naukowa Kliniki Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicz-nej (28–29 maja 1993). Materiały spotkania naukowego.

53. Domosławski P, Łukieńczuk T, Forkasiewicz Z, Balcerzak W, Bednarz W, Dawiskiba J, Krawczyk Z, Wojtczak B, Olewiński R, Podhorska-Okołów M: Wpływ całkowitego wycięcia gruczołu tarczowego na oftalmopa-tię naciekową oraz na zachowanie się poziomów przeciwciał tarczy-cowych w przebiegu choroby Gravesa i Basedowa = Influence of total thyroidectomy on orbital opthalmopathy and levels of antithyroid anti-bodies in patients with Graves' disease. Pol Przegl Chir 2007;79:303–312.

54. Domosławski P: Nawroty nadczynności tarczycy po leczeniu opera-cyjnym choroby Gravesa-Basedowa, na podstawie materiału własne-go. Endokrynol Pol 1995;46:86. VII Sympozjum Sekcji Chirurgii Endo-krynologicznej Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego. Łódź, 7–9 czerwiec 1995 r.

55. Domoslawski P, Podhorska-Okolow M, Pula B, Lukienczuk T, Dziegiel P.: Expression of estrogen and progesterone receptors and Ki-67 antigen in Graves' disease and nodular goiter. Folia Histochem Cytobiol 2013;51:135–140.

56. Druckmann R, Druckman MA: Progesterone and the immunology of pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol 2005;97:389–396.

57. Du L, Yang J, Huang J, Ma Y, Wang H, Xiong T, Xiang Z, Zhang Y, Huang J: The associations between the polymorphisms in the CTLA-4 gene and the risk of Graves' disease in the Chinese population. BMC Med Genet 2013;14:46.

58. Dunkelmann S, Wolf R, Koch A, Kittner C, Groth P, Schuemichen C: Incidence of radiation-induced Graves’ disease in pa- tients treated with radioiodine for thyroid autonomy before and after introduction of a high-sensitivity TSH receptor antibody assay. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2004;31:1428–1434.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 85 –

59. Dutta R, Sens DA, Somji S: Metallothionein isoform 3 expression inhibits cell growth and increases drug resistance of PC-3 prostate cancer cells. Prostate 2002;52:89–97.

60. Dziedziejko V, Kurzawski M, Safranow K: Oestrogen receptor poly-morphisms in female patients with rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2011;40:329–333.

61. Dziegiel P: Expression of metallothioneins in tumor cells. Pol J Pathol 2004;55:3–12.

62. Dziegiel P Zabel M: Role of immunohistochemical expression of Ki-67 in Adenocarcinoma of large intestine. Handbook of Immunonohisto-chemistry and in situ Hybridization of Human Carcionomas. Edited by MA Hayat, Elsvier Inc 2006:127–134.

63. Eckstein AK, Johnson KT, Thanos M, Esser J, Ludgate M: Current in-sights into the pathogenesis of Graves’ orbitopathy, Horm Metab Res 2009;41:456–464.

64. Effraimidis G, Strieder TGA, Tijssen JGP, Wiersinga WM: Natural history of the transition from euthyroidism to overt auto- immune hypoor hyperthyroidism: a prospective study. Eur J Endocrinol 2011;164:107–113.

65. El Fassi D, Nielsen CH, Hasselbach HC, Hegedus L: Treatment –resistant severe, active Graves’ ophthalmopathy successfully treated with B lymphocyte depletion. Thyroid 2006;16:709–710.

66. Fatourechi V: Thyroid dermopathy and acropachy. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2012;26:553–565.

67. Ferrario C, Lavagni P, Gariboldi M, Miranda C, Losa M, Cleris L, Formelli F, Pilotti S, Pierotti MA, Greco A: Metallothionein 1G acts as an oncosu-pressor in papillary thyroid carcinoma. Lab Invest 2008;88:474–481.

68. Fic M, Puła B, Rogala K, Dzięgiel P: Rola ekspresji metalotionein w ra-kach przewodu pokarmowego. Post Biol Kom 2013;40:5–20.

69. Fish EN: The X-files in immunity: sex-based differences predispose immune responses. Nat Rev Immunol 2008;8:737–744.

70. Friedline JA, Garrett SH, Somji S, Todd JH, Sens DA: Differential ex-pression of the MT-1E gene in estrogen-receptor-positive and nega-tive human breast cancer cell lines. Am J Pathol 1998;152:23–27.

71. Furszyfer J, Kurland LT, McConahey WM, Woolner LB, Elveback LR: Epidemiologic aspects of Hashimoto’s thyroiditis and Graves’ disease in Rochester, Minnesota (1935–1967), with special reference to temporal trends. Metabolism 1972;21:197–204.

72. Garcia-Gonzales M, Abdulkader I, Vazquez Boquete A, Neo X M, For-teza J, Cameselle-Teijeiro J: Cyclooxygenase-2 in normal, hyperplastic and neoplastic follicular cells of the human thyroid gland. Virch Arch 2005; 447:12–17.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 86 –

73. Garrett SH, Sens MA, Shukla D: Metallothionein isoform 3 expression in the human prostate and cancer-derived cell lines. Prostate 1999;41:196–202.

74. Garrett SH, Sens MA, Shukla D, Flores L, Somji S, Todd JH, Sens DA: Metallothionein isoform 1 and 2 gene expression in the human pros-tate: downregulation of MT-1X in advanced prostate cancer. Prostate 2000;43:125–135.

75. Ge ́rard AC, Many MC, Daumerie C, Knoops B, Colin I.M: Peroxiredoxin 5 expression in the human thyroid gland. Thyroid 2005;15:205–209.

76. Giovannucci E, Egan KM, Hunter DJ: Aspirin and the risk of colorectal cancer in women. N Engl J Med 1995;333:609–614.

77. Gregory A Brent, MD: Graves' Disease. N Engl J Med 2008;358:2594–2605. 78. Gwinner W, Grone HJ: Role of reactive oxygen species in

glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant 2000;15:1127–1132. 79. Hahn SH, Yoo OJ, Gahl WA: Effect of metal ions on the stability of me-

tallothionein in the degradation by cellular fractions in vitro. Exp Mol Med 2001;33:32–36.

80. Hardy DB, Janowski BA, Corey DR: Progesterone receptor plays a ma-jor antiinflammatory role in human myometrial cells by antagonism of nuclear factor-kappaB activation of cyclooxygenase 2 expression. Mol Endocrinol 2006;20:2724–2733.

81. Hegedus L, Brix TH & Vestergaard P: Relationship between cigarette smoking and Graves' ophthalmopathy. J Endocrinol Invest 2004:27; 265–271.

82. Hegedüs L: Treatment of Graves' hyperthyroidism: evidence-based and emerging modalities. Endocrinol Metab Clin North Am 2009;38:355–371.

83. Hen K, Czarnywojtek A, Florek E, Warmuz-Stangierska I, Ruchała M: The etiology of Graves' disease- current state of knowledge. Przegl Lek 2012;69:1132–1134.

84. Hiasa Y, Nishioka H, Kitahori Y et al: Immunohistochemical analysis of estrogen receptors in 313 paraffin section cases of human thyroid tis-sue. Oncology 1993;50:132–136.

85. Hishikawa Y, Koji T, Dhar DK, Kinugasa S, Yamaguchi M, Nagasue N: Metallothionein expression correlates with metastatic and prolifera-tive potential in squamous cell carcinoma of the oesophagus. Br J Cancer 1999;81:712–720.

86. Hla T, Neilson K: Human cyclooxygenase-2 cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:7384–7388.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 87 –

87. Hollowell JG, Staehling NW, Flanders WD, Hannon WH, Gunter EW, Spencer CA: Serum TSH, T(4), and thyroid antibodies in the United States population (1988 to 1994): National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III). J Clin Endocrinol Metab 2002;87:489–499.

88. Hori Y, Kashima K, Daa T, Yokoyama S, Nakayama I, Noguchi S: Rela-tionship between cell proliferation activity and morphological char-acteristics of papillary microcarcinoma in the thyroid of Graves' dis-ease. Pathol Int 1995;45:846–453.

89. Ishizuka M, Hatori M, Suzuki T et al: Sex steroid receptors in rheuma-toid arthritis. Clin Sci (Lond) 2004;106:293–300.

90. Jin R, Bay BH, Chow VT, Tan PH: Metallothionein 1F mRNA expression correlates with histological grade in breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat 2001;66:265–272.

91. Jin R, Chow VT, Tan PH, Dheen ST, Duan W, Bay BH: Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer. Carcinogenesis 2002;23:81–86.

92. Kahaly GJ: Imaging in thyroid-associated orbitopathy. Eur J Endocri-nol 2001;145:107–118.

93. Kajita S, Ruebel KH, Casey MB, Nakamura N, Lloyd RV: Role of COX-2, thromboxane A2 synthase, and prostaglandin I2 synthase in papillary thyroid carcinoma growth. Mod Pathol 2005;18:221–227.

94. Kajita Y, Rickards CR, Buckland PR, Howells RD, Rees Smith B: Analysis of thyrotropin receptors by photoaffinity labelling. Orientation of receptor subunits in the cell membrane. Biochem J 1985;227:413–420.

95. Kanda M, Nomoto S, Okamura Y, Nishikawa Y, Sugimoto H, Kanazumi N, Takeda S, Nakao A: Detection of metallothionein 1G as a methylated tumor suppressor gene in human hepatocellular carcinoma using a novel method of double combination array analysis. Int J Oncol 2009;35:477–483.

96. Kim SJ, Lee JH, Yoon JS, Mok JO, Kim YJ, Park HK, Kim CH, Byun DW, Suh KI, Yoo MH: Immunohistochemical expression of COX-2 in thyroid nodules. Korean J Intern Med 2003;18:225–229.

97. Kisiel B, Bednarczuk T, Kostrzewa G, Kosińska J, Miśkiewicz P, Płazińska MT, Bar-Andziak E, Królicki L, Krajewski P, Płoski R: Polymorphism of the oestrogen receptor beta gene (ESR2) is associated with susceptibility to Graves' disease. Clin Endocrinol (Oxf) 2008;68:429–434.

98. Klein I, Ojamaa K: Thyroid hormone and the cardiovascular system. N Engl J Med 2001 Feb;344:501–509.

99. Knudsen N, Bulow I, Laurberg P, Ovesen L, Perrild H, Jørgensen T: Association of tobacco smoking with goiter in a low-iodine-intake area. Arch Int Med 2002;162:439–443.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 88 –

100. Kondrashova A, Viskari H, Haapala AM, Seiskari T, Kulmala P, Ilonen J: Serological evidence of thyroid autoimmunity among schoolchildren in two different socioeconomic environments. J Clin Endocrinol Metab 2008;93:729–734.

101. Kotsa K, Watson PF, Weetman AP: A CTLA‐4 gene polymorphism is as-sociated with both Graves’ disease and autoimmune hypothyroidism. Clin Endocrinol (Oxf ) 1997;46:551–554.

102. Koyuncu A, Aydin C, Topçu O, Gökçe ON, Elagöz S, Dökmetaş HS: Could total thyroidectomy become the standard treatment for Graves' disease? Surg Today 2010;40:22–25.

103. Kraemer MH, Donadi EA, Tambascia MA et al: Relationship between HLA antigens and infectious agents in contributing towards the development of Graves' disease. Immunol Invest 1998;27:17–29.

104. Krawczyk-Rusiecka K, Lewiński A: Cyclooxygenase-2 expression and its association with thyroid lesions. Arch Med Sci 2010;6:653–657.

105. Królicka A, Kobierzycki C, Puła B, Podhorska-Okołów M, Piotrowska A, Rzeszutko M, Rzeszutko W, Rabczyński J, Domosławski P, Wojtczak B, Dawiskiba J, Dzięgiel P: Comparison of metallothionein (MT) and Ki-67 antigen expression in benign and malignant thyroid tumours. Anticancer Res 2010;30:4945–4949.

106. Ku CF, Lo CY, Chan WF, Kung AW, Lam KS: Total thyroidectomy re-places subtotal thyroidectomy as the preferred surgical treatment for Graves' disease. ANZ J Surg 2005;75:528–531.

107. Kumari MV, Hiramatsu M, Ebadi M: Free radical scavenging actions of hippocampal metallothionein isoforms and of antimetallothioneins: an electron spin resonance spectroscopic study. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 2000;46:627–636.

108. Kuryłowicz A, Kula D, Płoski R Skorka A, Jurecka-Lubieniecka B, Zebracka J, Steinhof-Radwanska K, Hasse-Lazar K, Hiromatsu Y, Jarzab B, Bednarczuk T: Association of CD40 gene polymorphism (C-1T) with susceptibility and phenotype of Graves' disease. Thyroid 2005;15:1119–1124.

109. Larsen PR, Davies TF, Schlumberger M, Hay ID: “10,” in Williams Text-book of Endocrinology, HM Kronenberg, S Melmed, KS Polonsky, and PR Larsen, Eds. Saunders Elsevier 2008:299–332.

110. Lasa M, Brook M, Saklatvala J, Clark AR: Dexamethasone destabilizes cyclooxygenase 2 mRNA by inhibiting mitogen-activated protein ki-nase p38. Mol Cell Biol 2001;21:771–780.

111. Laurberg P, Jrgensen T, Perrild H, Ovesen L, Knudsen N, Bülow Pedersen I: The Danish investigation on iodine intake and thyroid disease, DanThyr: status and perspectives. Eur J Endocrinol 2006;155:219–228.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 89 –

112. Lazarus JH: Lithium and thyroid. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2009;23:723–733.

113. Lee KJ, Jung YS, Kim WH, Yoon TI, Joo HJ, Soh EY: Cyclooxygenase-2 expression in human thyroid disease. J Endocrinol Invest 2008;31:111–118.

114. Leite JL, Bufalo NE, Santos RB: Herpes virus type 7 infection may play an important role in individuals with a genetic profile of susceptibility to Graves' disease. Eur J Endocrinol 2010;162: 315–321.

115. Leslie WD, Ward L, Salamon EA, Ludwig S, Rowe RC, Cowden EA: A randomized comparison of radioiodine doses in Graves' hyperthy-roidism. J Clin Endocrinol Metab 2003;88:978–983.

116. Liu ZM, Chen GG, Shum CK, Vlantis AC, Cherian MG, Koropatnick J, van Hasselt CA: Induction of functional MT1 and MT2 isoforms by cal-cium in anaplastic thyroid carcinoma cells. FEBS Lett 2007;581:2465–2472.

117. Liu ZM, Hasselt CA, Song FZ, Vlantis AC, Cherian MG, Koropatnick J, Chen GG: Expression of functional metallothionein isoforms in papil-lary thyroid cancer. Mol Cell Endocrinol 2009;302:92–98.

118. Lo CY, Lam KY, Leung PP, Luk JM: High prevalence of cyclooxygenase 2 expression in papillary thyroid carcinoma. Eur J Endocrinol 2005;152:545–550.

119. Luton D, Le Gac I, Vuillard E, Castanet M, Guibourdenche J, Noel M, Toubert ME, Léger J, Boissinot C, Schlageter MH, Garel C, Tébeka B, Oury JF, Czernichow P, Polak M: Management of Graves' disease dur-ing pregnancy: the key role of fetal thyroid gland monitoring. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:6093–6098.

120. Mandel SJ, Cooper DS: The use of antithyroid drugs in pregnancy and lactation. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:2354–2359.

121. Marcocci C, Kahaly GJ, Krassas GE, Bartalena L, Prummel M, Stahl M, Altea MA, Nardi M, Pitz S, Boboridis K, Sivelli P, von Arx G, Mourits MP, Baldeschi L, Bencivelli W, Wiersinga W: European Group on Graves' Orbitopathy. Selenium and the course of mild Graves' orbitopathy. N. Engl J Med 2011;364:1920–1031.

122. Margoshes M, Vallee B L: J Am Chem Soc 1957;79:4813–4814. 123. Mate ́s M, Pe ́rez-Go ́mez C, deCastro IN: Antioxidant enzymes and

human diseases. Clin Bioch 1999;32:595–603. 124. Mazhar D, Gillmore R, Waxmann J: COX and cancer. Q J Med 2005; 98:

711–718. 125. McLachlan SM, Rapoport B: Thyroid peroxidase as an autoantigen.

Thyroid 2007;17:939–948. 126. Menconi F, Hasham A, Tomer Y: Environmental triggers of thyroiditis:

hepatitis C and interferon-α. J Endocrinol Invest 2011;34:78–84.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 90 –

127. Michels AW, Eisenbarth GS: Immunologic endocrine disorders. J Allergy Clin Immunol 2010;125:226–237.

128. Mimura LY, Villares SMF, Monteiro MLR, Guazzelli IC, Bloise W: Perox-isome proliferator-activated receptor-gamma gene expression in or-bital adipose/connective tissues is increased during the active stage of Graves’ ophthalmopathy. Thyroid 2003;13:845–850.

129. Mitani T, Shirasaka D, Aoyama N, Miki I, Morita Y, Ikehara N, Matsumoto Y, Okuno T, Toyoda M, Miyachi H, Yoshida S, Chayahara N, Hori J, Tamura T, Azuma T, Kasuga M: Role of metallothionein in Heli-cobacter pylori-positive gastric mucosa with or without early gastric cancer and the effect on its expression after eradication therapy. J Ga-stroenterol Hepatol 2008;23:334–339.

130. Mizokami T, Wu Li A, El-Kaissi S, Wall JR: Stress and thyroid autoimmunity. Thyroid 2004;14:1047–1055.

131. Mono T, Shinohara R, Iwase K: Changes in free radical scavengers and lipid peroxide in thyroid glands of various thyroid disorders. Hormone and Metabolic Research 1997;29:351–354.

132. Nakamura H, Noh JY, Itoh K, Fukata S, Miyauchi A, Hamada N: Com-parison of methimazole and propylthiouracil in patients with hyper-thyroidism caused by Graves' disease. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:2157–2162.

133. Nancy P, Berrih-Aknin S: Differential estrogen receptor expression in autoimmune myasthenia gravis. Endocrinology 2005;146,2345–2353.

134. Nielsen AE, Bohr A, Penkowa M: The Balance between Life and Death of Cells: Roles of Metallothioneins. Biomark Insights 2007;1: 99–111.

135. Niepomniszcze H, Pitoia F, Katz SB, Chervin R, Bruno OD: Primary thyroid disorders in endogenous Cushing’s syndrome. Eur J Endocrinol 2002;147:305–311.

136. Nygaard B, Hegedüs L, Gervil M, Hjalgrim H, Hansen BM, Søe-Jensen P, Hansen JM: Influence of compensated radioiodine therapy on thyroid volume and incidence of hypothyroidism in Graves' disease. J Intern Med 1995;238:491–497.

137. Nygaard B, Knudsen JH, Hegedus L: Thyrotropin receptor antibodies and Graves’ disease, a sideeffect of 131I treatment in patients with nontoxic goiter. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 2926–2930.

138. Orgiazzi J: Thyroid autoimmunity. Presse Med 2012;41:611–625. 139. Palit TK, Miller CC 3rd, Miltenburg DM: The efficacy of thyroidectomy

for Graves' disease: A meta-analysis. J Surg Res 2000;90:161–165. 140. Paridaens D, van den Bosch WA, van den Loos TL, Krenning EP, van

Hagen PM: The effect of etarnecept on Graves’ ophthalmopathy: a pi-lot study. Eye 2005;19:1286–1289.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 91 –

141. Pedersen MO, Larsen A, Stoltenberg M: Cell death in the injured brain: roles of metallothioneins. Prog Histochem Cytochem 2009;44:1–27.

142. Pellegriti G, Belfiore A, Giuffrida D, Lupo L, Vigneri R: Outcome of dif-ferentiated thyroid cancer in Graves' patients. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:2805–2809.

143. Pontikides N, Krassas GE: Influence of cigarette smoking on thyroid function, goiter formation and autoimmune thyroid disorders. Hor-mones (Athens) 2002;1:91–98.

144. Prabhakar BS, Bahn RS, Smith TJ: Current perspective on the patho-genesis of Graves' disease and ophthalmopathy. Endocr Rev 2003;24:802–835.

145. Prummel MF, Wiersinga WM: Smoking and risk of Graves’ disease. JAMA 1993;269:479–482.

146. Pula B, Domoslawski P, Podhorska-Okolow M, Dziegiel P: Role of metallothioneins in benign and malignant thyroid lesions. Thyroid Res 2012;5:5–26.

147. Quaife CJ, Findley SD, Erickson JC: Induction of a new metallothionein isoform (MT-IV) occurs during differentiation of stratified squamous epithelia. Biochemistry 1994;33:7250–7259.

148. Quidville V, Segond N, Lausson S, Frenkian M, Cohen R, Jullienne A: 15-Hydroxyprostaglandin-dehydrogenase is involved in anti-proliferative effect of non-steroidal antiinflammatory drugs COX-1 in-hibitors on a human medullary thyroid carcinoma cell line. Pros-taglandins Other Lipid Mediat 2006;81:14–30.

149. Ristimäki A, Narko K, Hla T: Down-regulation of cytokine-induced cyc-lo-oxygenase-2 transcript isoforms by dexamethasone: evidence for post-transcriptional regulation. Biochem J 1996;318:325–331.

150. Rosenthal MJ, Hunt WC, Garry PJ, Goodwin JS: Thyroid failure in the elderly: microsomal antibodies as discriminant for therapy. JAMA 1987;258:209–213.

151. Roti E, Uberti ED: Iodine excess and hyperthyroidism. Thyroid 2001;11:493–500.

152. Ruiz-Riol M, Martínez-Arconada MJ, Alonso N, Soldevila B, Marchena D, Armengol MP, Sanmartí A, Pujol-Borrell R, Martínez-Cáceres EM: Overexpression of metallothionein I/II: a new feature of thyroid follicular cells in Graves' disease. J Clin Endocrinol Metab 2012;97:446–454.

153. Salvi M, Vannucchi G, Campi I, Curro N, Dazzi D, Simonetta S: Treat-ment of Graves’ disease and associated ophthalmopathy with the an-ti-CD20 monoclonal antibody rituximab. An open study. Eur J Endo-crinol 2007;156:33–40.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 92 –

154. Sanders P, Young S, Sanders J, Kabelis K, Baker S, Sullivan A: Crystal structure of the TSH receptor (TSHR) bound to a block-ing-type TSHR autoantibody. J Mol Endocrinol 2011;46:81–99.

155. Saranac L, Zivanovic S, Bjelakovic B, Stamenkovic H, Novak M, Kamenov B: Why is the thyroid so prone to autoimmune disease? Horm Res Paediatr 2011;75:157–165.

156. Schmid K, Greef M, Hittmair A: Metallothionein Expression in Normal, Hyperplastic, and Neoplastic Thyroid Follicular and Parafollicular C Cells Using Monoclonal Anitmetallothionein Antibody E9. Endocr Pathol 1994;5:114–122.

157. Sens MA, Somji S, Lamm DL, Garrett SH, Slovinsky F, Todd JH, Sens DA: Metallothionein isoform 3 as a potential biomarker for human bladder cancer. Environ Health Perspect 2000;108:413–418.

158. Sens MA, Somji S, Garrett SH, Beall CL, Sens DA: Metallothionein iso-form 3 overexpression is associated with breast cancers having a poor prognosis. Am J Pathol 2001;159:21–26.

159. Shine B, Fells P, Edwards OM, Weetman AP: Association between Graves' ophthalmopathy and smoking. Lancet 1990;335:1261–1263.

160. Sies H: Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Phy-siology 1997;82:291–295.

161. Siironen P, Ristimäki A, Narko K: VEGF-C and COX-2 expression in pap-illary thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2006;13:465–473.

162. Skórka A, Bednarczuk T, Bar-Andziak E, Nauman J, Ploski R: Lymphoid tyrosine phosphatase (PTPN22/LYP) variant and Graves' disease in a Polish population: association and gene dose-dependent correlation with age of onset. Clin Endocrinol (Oxf) 2005;62:679–682.

163. Soh EY, Duh QY, Sobhi SA: Vascular endothelial growth factor expres-sion is higher in differentiated thyroid cancer than in normal or be-nign thyroid. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:3741–3747.

164. Song Y, Driessens N, Costa M: Roles of hydrogen peroxide in thyroid physiology and disease. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:3764–3773.

165. Specht MC, Tucker ON, Hocever M, Gonzalez D, Teng L, Fahey TJ 3rd: Cyclooxygenase-2 expression in thyroid nodules. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:358–363.

166. Stefan M, Jacobson EM, Huber AK: Novel variant of thyroglobulin promoter triggers thyroid autoimmunity through an epigenetic interferon alpha-modulated mechanism. J Biol Chem 2011;286:31168– 31179.

167. Steinmaus C, Miller MD, Howd R: Impact of smoking and thiocyanate on perchlorate and thyroid hormone associations in the 2001–2002 National Health and Nutrition Examination Survey. Environ Health Perspect 2007;115:1333–1338.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 93 –

168. Szajerka A, Dziegiel P, Szajerka T, Zabel M, Winowski J, Grzebieniak Z: Immunohistochemical evaluation of metallothionein, Mcm-2 and Ki-67 antigen expression in tumors of the adrenal cortex. Anticancer Res 2008;28:2959–2965.

169. Szelachowska J, Dziegiel P, Jelen-Krzeszewska J, Jelen M, Tarkowski R, Wlodarska I, Spytkowska B, Gisterek I, Matkowski R, Kornafel J: Prognostic significance of nuclear and cytoplasmic expression of metallothioneins as related to proliferative activity in squamous cell carcinomas of oral cavity. Histol Histopathol 2008;23;843–851.

170. Tai SK, Tan OJ, Chow VT, Jin R, Jones JL, Tan PH, Jayasurya A, Bay BH: Differential expression of metallothionein 1 and 2 isoforms in breast cancer lines with different invasive potential: identification of a novel nonsilent metallothionein-1H mutant variant. Am J Pathol 2003;163:2009–2019.

171. Tao X, Zheng JM, Xu AM, Chen XF, Zhang SH: Downregulated expres-sion of metallothionein and its clinicopathological significance in he-patocellular carcinoma. Hepatol Res 2007;37:820–827.

172. Thirumoorthy N, Shyam Sunder A, Manisenthil Kumar K, Senthil Ku-mar M, Ganesh G, Chatterjee M: A review of metallothionein isoforms and their role in pathophysiology. World J Surg Oncol 2011;9:54.

173. Thornton J, Kelly SP, Harrison RA, Edwards R: Cigarette smoking and thyroid eye disease: a systematic review. Eye 2007;21:1135–1145.

174. Tomer YF: Interferon induced thyroiditis. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2009;23:703–712.

175. Tomer Y, Huber A: The etiology of autoimmune thyroid disease: a story of genes and environment. J Autoimmun. 2009;32:231–239.

176. Tomer Y, Davies TF: Searching for the autoimmune thyroid disease susceptibility genes: from gene mapping to gene function. Endocr Rev 2003;24:694–717.

177. Tonacchera M, Van Sande J, Parma J, Duprez L, Cetani F, Costagliola S: TSH receptor and disease. Clin Endocrinol (Oxf) 1996;44:621–633.

178. Uchida Y, Takio K, Titani K: The growth inhibitory factor that is deficient in the Alzheimer's disease brain is a 68 amino acid metallothionein-like protein. Neuron 1991;7:337–347.

179. Vaidya B, Williams GR, Abraham P, Pearce SH: Radioiodine treatment for benign thyroid disorders: results of a nationwide survey of UK en-docrinologists. Clin Endocrinol (Oxf) 2008;68:814–820.

180. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, and Telser J: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39:44–84.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 94 –

181. Vanderpump MP, Tunbridge WM, French JM, Appleton D, Bates D, Clark F: The incidence of thyroid disorders in the community: a twenty-year follow-up of the Whickham Survey. Clin Endocrinol (Oxf) 1995;43:55–68.

182. Vestergaard H, Laurberg P: Radioiodine and aggravation of Graves' ophthalmopathy. Lancet 1989;2(8653):47.

183. Vestergaard P: Smoking and thyroid disorders – a meta-analysis. Eur J Endocrinol 2002;146:153–161.

184. Vondrichova T, de Capretz A, Parikh H, Frenander C, Asman P, Aberg M, Groop L, Hallengren B, Lantz M: COX-2 and SCD, markers of inflamma-tion and adipogenesis, are related to disease activity in Graves' ophthalmopathy. Thyroid 2007;17:511–517.

185. Vos XG, Smit N, Endert E, Tijssen JGP, Wiersinga WM: Frequency and characteristics of TBII-seronegative patients in a population with untreated Graves’ hyperthyroidism: a prospective study. Clin Endocrinol 2008;69:311–317.

186. Vrca VB, Skreb F, Cepelak I, Romic Z, Mayer L: Supplementation with antioxidants in the treatment of Graves’ disease; the effect on glu-tathione peroxidase activity and concentration of selenium. Clinica Chimica Acta 2004;341:55–63.

187. Wang S, Mao S, Zhao G, Wu H: Relationship between estrogen recep-tor and Graves' disease. Zhonghua Wai Ke Za Zhi 2000;38:619–621.

188. Weetman AP: Radioiodine treatment for benign thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf) 2007;66:757–764.

189. Werynska B, Pula B, Muszczynska-Bernhard B, Gomulkiewicz A, Jethon A, Podhorska-Okolow M, Jankowska R, Dziegiel P: Expression of metallothionein-III in patients with non-small cell lung cancer. Anticancer Res 2013;33:965–974.

190. Werynska B, Pula B, Muszczynska-Bernhard B, Gomulkiewicz A, Piotrowska A, Prus R, Podhorska-Okolow M, Jankowska R, Dziegiel P: Metallothionein 1F and 2A overexpression predicts poor outcome of non-small cell lung cancer patients. Exp Mol Pathol 2013;94:301–308.

191. Wojnar A, Pula B, Piotrowska A, Jethon A, Kujawa K, Kobierzycki C, Rys J, Podhorska-Okolow M, Dziegiel P: Correlation of intensity of MT-I/II expression with Ki-67 and MCM-2 proteins in invasive ductal breast carcinoma. Anticancer Res 2011;31:3027–3033.

192. Wojnar A, Kobierzycki C, Krolicka A, Pula B, Podhorska-Okolow M, Dziegiel P: Correlation of Ki-67 and MCM-2 proliferative marker ex-pression with grade of histological malignancy (G) in ductal breast cancers. Folia Histochem Cytobiol 2010;48:442–446.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

– 95 –

193. Wolf MW, Misaki T, Bech K, Tvede M, Silva JE, Ingbar SH: Immu-noglobulins of patients recovering from Yersinia enterocolitica infec-tions exhibit Graves' disease-like activity in human thyroid mem-branes. Thyroid 1991;1:315–320.

194. Yamasaki M, Nomura T, Sato F, Mimata H: Metallothionein is up-regulated under hypoxia and promotes the survival of human pros-tate cancer cells. Oncol Rep 2007;18:1145–1153.

195. Yan DW, Fan JW, Yu ZH, Li MX, Wen YG, Li DW, Zhou CZ, Wang XL, Wang Q, Tang HM, Peng ZH: Downregulation of metallothionein 1F, a putative oncosuppressor, by loss of heterozygosity in colon cancer tissue. Biochim Biophys Acta 2012;1822:918–926.

196. Yoon JS, Lee HJ, Choi SH, Chang EJ, Lee SY, Lee EJ: Quercetin inhibits IL-1β-induced inflammation, hyaluronan production and adipogene-sis in orbital fibroblasts from Graves' orbitopathy. PLoS One 2011;6:e26261.

197. Zarković M: The role of oxidative stress on the pathogenesis of Graves' disease. J Thyroid Res 2012;2012:302–537.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

9. STRESZCZENIE Choroba Gravesa-Basedowa (ch.GB) jest jedną z chorób tarczy-

cy o podłożu autoimmunologicznym, która częściej występuje wśród kobiet. Etiopatogeneza tej choroby nie jest do końca poznana i wyja-śniona. Zmiany w komórce tarczycy są o podłożu zapalnym i prolifera-cyjnym.

Celem pracy było określenie ekspresji wybranych czynników mo-lekularnych, odpowiedzialnych za proces zapalny i proliferację. Zbadano ekspresję cyklooksygenazy-2 (COX-2), izoform metalotionein (MT), Ki-67. Badając ekspresję receptorów estrogenowych i progesteronowych podję-to próbę wyjaśnienia częstszego występowania ch.GB wśród kobiet.

Badania immunohistochemiczne (IHC) przeprowadzono na ar-chiwalnych bloczkach parafinowych z wycinkami 67 tkanek pobranych od pacjentów z ch.GB. Grupę kontrolną stanowiło 24 pacjentów ope-rowanych z powodu wola guzkowego.

Za pomocą metody RT-PCR określono ekspresję poszczegól-nych izoform metalotionein (MT) w wycinkach tkanek pacjentów ope-rowanych z powodu ch.GB.

Stwierdzono wysoką ekspresję COX-2 w grupie pacjentów z ch.GB, która może świadczyć o udziale szlaku arachidonowego w patogenezie tej choroby. Wysoka ekspresja Ki-67 potwierdza prolifera-cyjny charakter tej choroby.

Wysoka ekspresja izoform MT zarówno na poziomie białka, jak i genów je kodujących może być związana z nasilonym procesem proli-feracji komórkowej oraz stanu zapalnego, będącego podłożem ch.GB. Brak ekspresji receptorów estrogenowych i mała ekspresja receptorów progesteronowych w tyreocytach z ch.GB, sugeruje o braku udziału żeńskich hormonów płciowych w częstszym występowaniu choroby u kobiet.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30

10. SUMMARY

Expression of selected molecular factors in Graves Disease Graves Disease (GD) is one of the autoimmonological thyroid

diseases (AITD- autoimmune thyroid disease). The course and etiology of the disease are not well elucidated

and explained. The proliferative and inflammatory changes in thyrocytes are

also not well explained. The aim of the study was to estimate the expression of the se-

lected molecular factors, responsible for chronic inflammation and proliferation. The expression of cyclooxygenase-2 (COX-2), isoforms of metallothioneines (MT), Ki-67 and estrogen and progesterone recep-tors was estimated.

The immunohistochemical (IHC) was performed on archival po-stoperative sections taken form 67 patients with GD. The results were compared to the control group of 24 patients operated on nodular goitre (NG). The TR-PCR method was also used to estimate expression of the isoforms of MT in 30 postoperative specimens taken from patients with GD. High expression of COX-2 may suggest the pathway of arachidonic acid in patogenesis of GD. High expression of Ki-67 explains a proliferative process among thyrocytes. The proliferative and inflammation proceses are also connected with high expression of MT, on the protein and gene level. Lack of expression of estrogen receptors and weak expression of progesterone receptors, do not explain more frequent occurrence of GD in women.

Pobr

ano

z R

epoz

ytor

ium

Uni

wer

syte

tu M

edyc

zneg

o im

. Pia

stów

Ślą

skic

h w

e W

rocł

awiu

/ D

ownl

oade

d fr

om R

epos

itory

of W

rocl

aw M

edic

al U

nive

rsity

202

2-01

-30