Polimorfismos en el Promotor del Gen del Angiotensinógeno (AGT) y su relación con la...

Revista del Instituto Nacional de Higiene Rafael RangelISSN 0798-0477 versión impresa

INHRR v.35 n.2 Caracas jul. 2004

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Polimorfismos en el Promotor del Gen del Angiotensinógeno (AGT) y surelación con la miocardiopatía chagásica crónica en pacientes venezolanos

Karlena C Lara O1, Juan C Mendible2†, Carlos D Ramírez3, 4, *, Alida Hung3

1. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

2†. Instituto de Medicina Experimental. Facultad Medicina, Universidad Central de Venezuela.

3. Cátedra de Bioquímica, Escuela de Medicina J. M. Vargas. Facultad de Medicina,Universidad Central de Venezuela.

4. Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

* Autor para correspondencia: Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias,Universidad Central de Venezuela. Teléfono: (+ 58-212) 7510111/0377 Fax: (+ 58-212)7535897. Apartado Postal 47114. Caracas 1041A, Venezuela. E-mail: [email protected]

RESUMEN

La enfermedad de Chagas constituye un importante problema de salud pública en AméricaLatina por presentar elevados índices de prevalencia y por la gravedad de sus cuadros clínicos,tales como la Miocardiopatía Chagásica Crónica (MCC), en la cual los pacientes puedenpresentar diferentes grados de alteración cardíaca, siendo los pacientes chagásicos tipo 3 los quepresentan mayor compromiso. Por otra parte, se conoce que diversos polimorfismos en el gendel angiotensinógeno (AGT) están correlacionados con el desarrollo de ciertas miocardiopatíashipertróficas. En este trabajo se estudió la posible correlación entre el polimorfismo -6A/G delpromotor del gen del AGT con la susceptibilidad al desarrollo de una MCC en pacienteschagásicos tipo 3. Para esto, se estudió una población de 22 pacientes chagásicos tipo 3(confirmado por seguimientos y parámetros clínicos) y 19 voluntarios seronegativos aTrypanosoma cruzi y sin ningún tipo de alteraciones cardíacas. Los genotipos derivados delpolimorfismo -6A/G fueron determinados mediante la técnica de MS-PCR (MutagenicallySeparated PCR), utilizando dos iniciadores alelo-específicos para el promotor del gen del AGT.

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Los resultados obtenidos indican que la distribución de los genotipos GG, AA y AG derivadosdel polimorfismo -6A/G no difieren significativamente entre pacientes y controles (1, 3, 18 y 1,

2, 16; respectivamente) con un valor de c2 obtenido de 0,0983 (p<0,005), lo cual sugiere que elpolimorfismo –6A/G en el promotor del gen del AGT no está correlacionado con el desarrollo deMCC presente en estos pacientes.

Palabras clave: Miocardiopatía Chagásica, Trypanosoma cruzi, Angiotensinógeno, AGT,Promotor, -6 A/G, Polimorfismos.

ABSTRACT

Chagas´disease constitutes an important problem of public health in Latin America for its highprevalence indexes and for the severity of its clinical manifestations, such as thecardiomyopathy, in which the patients can present different grades of heart alteration, being theChagas’ patients type 3 those that present greater heart compromise. On the other hand, it isknown that diverse polymorphisms in the gene of the angiotensinogen (AGT), are correlatedwith the development of certain hypertrophic cardiomyopathies. In this work, we studied thecorrelation between the polymorphism –6A/G in the promoter of the gene AGT, with thesusceptibility to the development a hypertrophic cardiomyopathy in Chagas patients’ type 3. Forthis, a sample of 22 Chagasic patients type 3 was studied (confirmed by evaluations and clinicalparameters) and 19 seronegative controls to Trypanosoma cruzi without any type of heartalterations. The derivative genotypes of the polymorphism -6A/G were determined by thetechnique of MS-PCR (Mutagenically Separated PCR), using two allele-specific initiators(primers) for the promoter of the gene AGT. Our results indicate that the distribution of thegenotypes GG, AA and AG of the polymorphism -6A/G do not differ significantly among

patients and controls (1, 3, 18 and 1, 2, 16; respectively) with a value of c2 obtained of 0, 0983(p < 0,005), that which suggests that the polymorphism -6A/G in the promoter of the gene AGTis not correlated with the development of cardiomyopathy in these patients.

Keywords: Chagasic Cardiomyopathy, Trypanosoma cruzi, Angiotensinogen, AGT, Promoter,–6 A/G, Polymorphisms.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas constituye uno de los problemas de Salud Pública más importantes enAmérica Latina, y tiene un gran impacto social y laboral debido a su amplia distribucióngeográfica, los elevados índices de prevalencia que se presentan y a la gravedad de sus cuadrosclínicos, como la Miocardiopatía Chagásica Crónica (MCC). Por todo esto, el conocimiento desu proceso evolutivo es imperativo (1, 2). El agente causal de la afección es un protozoarioflagelado denominado Trypanosoma cruzi, cuyo ciclo de vida comprende una compleja serie deestadios (3). Se ha determinado que entre 18 y 20 millones de personas están sufriendo lainfección por T. cruzi, y que 120 millones de habitantes en Latinoamérica están en riesgo decontraer la enfermedad. En Venezuela se considera a la Tripanosomiasis como una enfermedadre-emergente, debida a su transmisión activa en la pasada década (4).

La infección por T. cruzi lleva al individuo a desarrollar la enfermedad en tres períodos: unperíodo agudo, un período indeterminado o indiferenciado, y un período crónico. Paralela a esta


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clasificación con respecto al estado de avance de la enfermedad, se han reportado clasificacionesclínicas de los pacientes con esta patología, dependiendo de las alteraciones que presenten a nivelcardíaco (5, 6).

Los pacientes que sobreviven al período agudo entran al período indeterminado o indiferenciadodel período crónico, el cual dura de 10 a 20 años y se caracteriza por la ausencia total demanifestaciones clínicas. Únicamente de un 20 a un 30% de estos individuos desarrollarán lossíntomas del tercer período y el resto de ellos nunca desarrollarán síntomas, a pesar de serportadores del parásito y de que su serología se mantenga positiva (1). Esto último sugiere queun componente genético podría estar participando en la progresión de la enfermedad.

Las manifestaciones clínicas de esta última fase pueden presentarse a nivel cardíacomanifestándose como miocardiopatías. De acuerdo al grado de alteración cardíaca, los pacienteschagásicos son clasificados como de tipo 2 o tipo 3, siendo estos últimos los que presentan elmayor compromiso cardíaco (1).

La MCC se presenta como consecuencia de una serie de eventos que se desarrollan durante laevolución de la enfermedad. En las formas fulminantes de la misma, los tripanosomas flageladossalen de la sangre e invaden las células reticuloendoteliales y las células de músculo liso, estriadoy cardíaco, siendo a este nivel donde ocurren los cambios morfológicos característicos de laMCC (6, 7). El desarrollo de una hipertrofia cardíaca puede responder a diversos factores entrelos que destaca la herencia de una variante genética que hace a una persona susceptible. Talproceso pudiera estar modulado por la activación programada de una amplia variedad de genesque interactúa entre sí y con factores ambientales. Ya que muchos genes pueden adoptardiferentes formas de acuerdo a mutaciones que ocurren en sus exones y/o secuenciasrelacionadas con su expresión (secuencias promotoras y reguladoras) lo que origina variantesgenéticas o polimorfismos, que conducen a que la función de dichos genes sea llevada a cabocon menor o mayor eficiencia, su herencia comúnmente influencia el fenotipo de la cardiopatía.El fenotipo final es la consecuencia de la interacción de la mutación responsable con su ambientegenético y con los factores ambientales (8, 9).

Uno de los genes en estudio y del cual se conoce su participación en la modulación delcrecimiento cardíaco y en la expresión fenotípica de hipertrofia cardíaca (14) es el gen delangiotensinógeno [AGT] (8). Dicho gen está ubicado en el cromosoma 1q42-q43, contiene 5exones y codifica para la producción de angiotensinógeno, glicoproteína con un peso molecularde 50 KDa, que contiene en su extremo amino el decapéptido angiotensina I (AI) el cual esliberado por la acción proteolítica de la enzima renina. A partir de la AI se produce, por acciónde la enzima convertidora de angiotensina (ECA), angiotensina II (AII), el péptidobiológicamente activo del Sistema Renina-Angiotensina (SRA) (15), el cual tiene diversosefectos incluyendo vasoconstricción, proliferación celular entre otros, eventos que representanun riesgo elevado para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (3). En tal sentido, elangiotensinógeno es una proteína que desempeña un papel determinante en el SRA, sistema queregula la presión arterial y la función cardiaca (16).

Conociendo la importancia que tiene el angiotensinógeno a nivel fisiológico gracias a su papel enel SRA, el cual regula la presión arterial y la función cardiaca, el estudio de diferentes variantesgenéticas derivadas del gen que lo codifica y la posibilidad de que dichas variantes pudiesen


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estar determinando cierta susceptibilidad al desarrollo de enfermedades cardíacas, en este casoparticular, en pacientes infectados con T. cruzi, resulta de gran importancia a la hora de encontrarfactores de riesgo a problemas de salud pública como la enfermedad de Chagas (8, 15).

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y Controles. La fuente de ADN genómico humano estuvo representada por sangreperiférica extraída de 22 pacientes (14 hombres y 8 mujeres) provenientes de diferentes regionesdel país (Estados Táchira, Miranda, Trujillo y Área Metropolitana) que asistieron a la Unidad deCardiomiopatías del Hospital Universitario de Caracas y a la Unidad de Cardiología del Institutode Medicina Tropical, UCV. Dichos pacientes presentaron serología positiva para la enfermedadde Chagas y fueron clasificados como tipo 3, con edades comprendidas entre 41 y 76 años conuna media de 53,7 + 0,67. Éstos fueron comparados con 19 individuos controles (9 hombres y10 mujeres) Chagas negativos comprobados como tal en la Sección de Inmunología del Institutoantes mencionado. Tanto los pacientes como los individuos controles accedieron de maneravoluntaria a la toma de la muestra de sangre luego de haber sido informados del estudio. Lasmuestras de sangre fueron refrigeradas y transportadas al Laboratorio de Biología Molecular,Cátedra de Bioquímica de la Escuela de Medicina José María Vargas de la UCV, donde fueronprocesadas antes de 24 horas.

Amplificación del gen AGT mediante MS-PCR. El aislamiento del ADN a partir de sangreperiférica se realizó por un método salino estándar (10). Para la detección del polimorfismo enestudio, el promotor del gen del AGT fue amplificado mediante la técnica conocida comoMSPCR (Mutagenically Separated PCR), en la cual tanto el alelo mutante como el normal sonamplificados en la misma reacción, usando iniciadores alelo-específicos de diferentes longitudes(11, 12). Los iniciadores empleados fueron los siguientes: P1:5'-TACCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCACT- 3'. P2:5'-CCGGTTACCTTCTGCTGTACAGCCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCATC- 3'. P3:5'-GTGTCGCTTCTGGCATCTGTCCTTCTGG-3' (11). La mezcla de reacción de un volumenfinal de 25µl contenía 1 unidad de la enzima polimerasa ATE (polimerasa de ADNTermoestable) de FUNDAIM, 1.5mM de MgCl2, 250µM de dNTP, amortiguador de PCR 1X(50mM KCL, 10mM tris-HCl pH 9.25-9.75, 1% Tritón X-100), 1M de Solución E (según elprotocolo de la polimerasa ATE), 10pmoles de cada iniciador y entre 20-100ng de ADN. Laamplificación se llevó a cabo empleando el siguiente programa: 94º C por 5 min., 35 ciclos con94º C por 45 seg., 62º C por 45 seg., 72º C por 45 seg., y finalmente 72º C por 7 minutos (13).Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 3% enamortiguador TBE 0.5X. Luego de la corrida fueron teñidos con bromuro de etidio (5,0 µg/mL),visualizados en un transiluminador (FisherBiotech) y fotografiados para su análisis y registro.

RESULTADOS

Una vez comprobada la integridad del ADN extraído se realizó la MS-PCR a cada una de lasmuestras con el fin de detectar los diferentes polimorfismos derivados de la mutación –6A/G enel promotor del gen AGT. La longitud de los iniciadores alelo específicos difiere en 20nucleótidos, por lo tanto, el tamaño de los productos de amplificación de los alelos A y Gfueron: de 171 pb y 191 pb, respectivamente. En este sentido, para aquellos pacienteshomocigotos para el alelo A (AA) se obtuvo una banda de 171 pb, para los pacientes


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homocigotos para el alelo G (GG) una banda de 191 pb y finalmente para los pacientesheterocigotos (AG) se obtuvieron dos bandas de los tamaños correspondientes (Figura 1). Lamisma asignación de genotipos se realizó con los individuos controles (Figura 2).

Análisis estadístico. Para la evaluación de la relación que pudiese presentar alguno de losgenotipos derivados del polimorfismo -6 A/G del gen bajo estudio con la progresión de la

MCC, se desarrolló una prueba de c2 con 2 grados de libertad y un nivel de significancia de0,005.


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Para la elaboración de este estadístico se planteó como Hipótesis nula (Ho) que la MCC eraindependiente de cualquiera de los genotipos derivados del polimorfismom bajo estudio y el

criterio para aceptar dicha hipótesis consistió en que el valor de c2 que se obtuviese debía ser

menor o igual al valor de c2 0.995 para 2 grados de libertad, el cual corresponde a 10,5965. En latabla 1 se muestran las frecuencias obtenidas y esperadas de los diferentes genotipos derivadosdel polimorfismo -6 A/G para pacientes y controles, observándose que la distribución de losgenotipos GG, AA y AG no difieren significativamente entre los dos grupos (1, 3, y 18

respectivamente en pacientes y 1, 2, 16 en controles) con un valor de c2 obtenido de 0,0983, conlo cual se acepta la Ho lo que sugiere que la MCC es independiente de cualquiera de losgenotipos derivados del polimorfismo -6 A/G para los efectos de este estudio.

Por su parte, en la tabla 2 se muestran las frecuencias observadas y esperadas de los alelos A yG del gen AGT para pacientes y controles. El equilibrio Hardy-Weinberg fue confirmado

mediante c2, y el valor obtenido para este estadístico (c2= 2,01 < c2 0.995= 7.8794; p<0,005)indica que las frecuencias de los diferentes alelos son virtualmente idénticas a las esperadas parauna población que está en equilibrio de Hardy-Weinberg.


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(Frecuencias Esperadas)

(Frecuencias Esperadas)

DISCUSIÓN

En los últimos años se ha explorado la posibilidad que diferentes genes modificadores, puedanestar obrando sobre la expresión fenotípica de la hipertrofia cardiaca en pacientes concardiomiopatía. Dentro de este grupo de genes, el del angiotensinógeno pareciera estar jugandoun papel importante en la expresión fenotípica de la miocardiopatía. En estudios más recientes(13) se demostró la existencia, con mayor frecuencia en hipertensos, de una variante en elpromotor del gen, en la cual una guanina en la posición –6 (variante -6G) desde el sitio deiniciación (+1), ha sido sustituida por una adenina (variante -6A). Dado que tambiéndemostraron que el gen con adenina en posición -6 es transcrito con más eficiencia in vitro quela variante encontrada con más frecuencia en normotensos, estos autores sugieren que ésta es laforma original del gen y proponen que dicha variante predispone genéticamente a la HTA. Másrecientemente, Liu y col., (17) reportan el papel que desempeñan los polimorfismos –6 A/G yM235T en el desarrollo de hipertensión esencial en la población china.

Diversos trabajos han aportado evidencias de la predisposición genética a desarrollar la MCC.En Venezuela se han realizado estudios con pacientes crónicamente infectados con T. cruzi,


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reportando que polimorfismos en genes que codifican para diferentes elementos del sistemainmune del paciente, específicamente del sistema HLA, parecen jugar un importante papel en laevolución de la enfermedad de Chagas (18-20). El presente estudio intenta explicar lasdiferencias encontradas entre pacientes chagásicos con respecto a la progresión de la MCC,basándonos en la suposición de que estas diferencias podrían estar siendo determinadas porcaracterísticas genéticas de cada individuo (8). De aquí nuestro interés en encontrar unaasociación entre los genotipos derivados del polimorfismo -6 A/G en el promotor del gen delangiotensinógeno con el desarrollo de la MCC. Los resultados obtenidos sugieren queposiblemente no existen diferencias estadísticamente significativas entre pacientes Chagásicostipo 3 e individuos controles Chagas negativos, con respecto a la presencia de los diferentesgenotipos derivados del polimorfismo –6 A/G del gen estudiado y el desarrollo de MCC. Unestudio similar al presente es el de Brugada y col., (8) quienes estudiaron el papel que la variante-6 A/G pudiese estar desempeñando en la expresión fenotípica de la hipertrofia ventricularizquierda en pacientes con Miocardiopatía Hipertrófica (MCH), y en el cual no se encontróefecto significativo del gen del angiotensinógeno sobre los índices de MCH, al igual que en estaoportunidad en pacientes con MCC. Por otra parte, los estudios de Arzola y Chacón (14) yMendible (16), quienes estudiaron la relación en polimorfismos del gen AGT con el desarrollode infarto al miocardio, encontraron que la variante -6A se encuentra en total desequilibrio deenlace con otra variante en el mismo gen (235T) y que la primera variante mencionada esresponsable del desarrollo de infarto al miocardio en pacientes venezolanos. En este sentido, sedebe considerar el estudio, en trabajos posteriores, tanto de este haplotipo (-6A/235T) como deotros, considerando que estos podrían tener un mayor valor pronóstico en pacientes chagásicosque el estudio de un sólo polimorfismo (8, 13, 14, 15, 19, 21, 22).

AGRADECIMIENTOS

Este artículo está dedicado a la memoria del Dr. Juan Carlos Mendible. Los autores expresan suagradecimiento al personal de la Unidad de Cardiomiopatías del Hospital Universitario deCaracas, así como también a la Unidad de Cardiología del Instituto de Medicina Tropical de laUniversidad Central de Venezuela, y a los pacientes

y controles que participaron en este estudio. Este trabajo fue presentado parcialmente en la 54Convención Anual de la ASOVAC, Valencia (Venezuela), 2004.

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