Capacidad de la Tetrahymena para eliminar el 90 % del colesterolde la leche y huevos, y convertir un 5 % en pro-vitamina D

Janine Brigitte Peralta GuevaraUniversidad de las Fueras Armadas

bperalta@espe.edu.ec

Resumen:

Este trabajo describe la configuración y operación de un sistemade biorreactor especialmente diseñado para el cultivo deTetrahymena y su uso para la mejora de la leche, eliminando deesta el colesterol. Una ventaja del método propuesto es el reusodel medio de crecimiento; es decir el medio se utiliza dos vecespara proporcionar dos lotes de la biomasa la Tetrahymena, sininoculación. Esto hace que el procedimiento de la producción dela biomasa celular sea más rápido y más económico. Las célulasse concentran en los recipientes de cultivo por sedimentación atemperatura ambiente y luego se transfiere a las suspensiones deleche, donde pueden crecer aún más, al menos una generación, conel beneficio de reducir abruptamente el nivel de colesterol. Laleche tratada de acuerdo con este proceso se separa de labiomasa por centrifugación. En estas condiciones, menos del 5 %de las células permanecen en la leche, y el colesterol eliminadoasciende a 75 ± 10 % de lo que inicialmente estaba presente. Loque se observó como resultado de este tratamiento fue que no haycambios en las propiedades sensoriales de la leche, tales comola coagulación y el olor butírico. Además, el biorreactorpermite la recuperación aséptica del medio de crecimientogastado, que contiene diversas enzimas de interés y célulaspellets, para explotar particulares lípidos como fosfonolípidosy los abundantes poliinsaturados ácidos grasos y coenzima Q8.

Introducción

El colesterol en los alimentos de origen animal es unapreocupación para la salud pública. Esta es una cuestión ya quese cree que este esterol está implicado en el desarrollo deenfermedades cardiovasculares, la principal causa de muerte paralos seres humanos de todo el mundo. (Artaud -Wild et al 1993;Paradis y Fodor 1999).

Por lo tanto, es deseable llegar a los alimentos funcionales,que son aceptables para los consumidores y comercialmenteviable. Un número determinado de enfoques, incluyendoseparaciones físico-químicas, modificaciones enzimáticas y

biotransformación microbiológica, han sido propuestas para estepropósito, pero ninguno ha alcanzado el nivel de producciónindustrial. Es evidente que sería deseable producir leche yhuevos esencialmente libres de colesterol. Los protozoosciliados como la Tetrahymena thermophila pueden metabolizar elcolesterol de la leche y el huevo en componentes útiles, comoprovitaminas D (Valcarce et al 2001, 2002; Florin-Christensen etal. 2004).

El microorganismo tiene una enzima, llamada Delta-7 desaturasa,que hace que el 5% del colesterol que se encuentra en la leche oen el huevo se reconvirtiera en provitamina D. Mientras que otraenzima del protozoo de nombre acil—transferasa, cumple con lamisión de convertir al 90% del colesterol en ésteres decolesterol. De esta forma, la Tetrahymena almacena lo ingeridodentro sí. Como resultado de aplicar esta estrategia ingeniosa,las muestras experimentales de huevo y leche retuvieron sólo el5% del colesterol original. Esto significa que el pequeñísimomicroorganismo puede captar selectivamente al colesterol yademás puede añadir un valor agregado al alimento, al sumarle laprovitamina D.  (Valcarce et al. 2000 ; Nusblat et al. 2005).

Técnicas Biotecnológicas

Cultivo de células

Tetrahymena thermophila MS-1 se mantuvo en crecimiento enmatraces Erlenmeyer de 250ml que contenían 50 ml de triptona-extracto de levadura-glucosa (TYG) y se incubaron durante 24hagitándolo constantemente a 32°C. La composición del medio TYGconsta de 1% de triptona, 0,1% extracto de levadura, 0,5% deglucosa y 0,003% de citrato de hierro (pH 6,8). Para elcrecimiento en el biorreactor, se utilizó el mismo medio. Seutilizaron muestras de leche (UHT) diluida con agua estéril (1:1 v/v) ya que las células de Tetrahymena no toleran bien la altaosmolaridad de la leche sin diluir (observaciones nopublicadas).

Recuento de células

Las células fueron fijadas mediante la adición de 1:10 (v / v)de un 4% de formaldehído solución en solución salina, lascélulas inmovilizadas se contaron en un Cámara de Neubauer1.Para cada muestra, ocho cuadrados grandes se contaron paraestimar la concentración de células. (Biorad, Richmond, CA,USA).

Transferencia de células a la leche

Tetrahymena células fueron cosechadas por centrifugación de loscultivos, y los sedimentos celulares se lavaron una vez en 3%glucosa antes de la transferencia a la leche y se resuspendieronen este solución. Seis volúmenes de leche entera eran entoncespoco a poco añadidos y las suspensiones se incubaron conagitación para un máximo de 48 horas a 30 ° C. (Valcarce et al.2000).

Configuración biorreactor

La configuración del sistema modelo de biorreactor diseñado secompone de dos vasos de 1 l cada uno (A, B) con fondo cónico,adecuado para el cultivo y fácil colección de celulas porsedimentación. El volumen de trabajo es 0,8 l. El medio frescose suministra a través de un tubo, y la misma conexión seutiliza para la inoculación. Los recipientes de cultivo A y B

1 La cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizarel recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre,orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc.

están conectados entre sí en sus extremos superiores por unsistema de tubos, estos tubos están unidos a una bombaperistáltica que puede propulsar el medio desde el recipiente deA a B y también sirve como una salida para el medio gastadodesde el recipiente B. Las puntas de estos tubos son de forma degancho para evitar la turbulencia a medida que se remueve elmedio. La embarcación B está conectada a un receptor (D) quesalva el medio gastado para la recuperación de enzimas. Losvasos son conectados a un recipiente cilíndrico (C), situado enun menor nivel, a través de tubos equipados con válvulas. Elcontenedor C es usado para el tratamiento de alimentos y tieneseparados entrada/salida para el producto alimenticio y sucolección. Una bomba de aire con un filtro estéril proporcionalo requerido para mezclar y la aireación para recipientes decultivo y el contenedor de alimentos tratados. La tasa de bombeode aire se mantuvo a 2 vvm. Los recipientes A, B y elcontenedor C tienen tubos de ventilación para la eliminación deCO2. Todo el sistema se ejecuta bajo condiciones estériles.(Florin-Christensen et al. 2004)

Resultados

1. Datos obtenidos del biorreactor

2. Leche cultivada con ciliados

Discusión y conclusiones

Los métodos que se han utilizado en estos estudios sondiferentes, sin embargo poseen algo en común; que es lautilización del mismo medio de cultivo que es la triptona-extracto de levadura-glucosa (TYG). Tambien se utiliza un tipode leche (UHT) que significa ultrapasteurizada.

Uno difiere del otro en cuestión de control de variables, unestudio se basó en la manipulación del biorreactor para poderprovocar el efecto esperando mientras que el otro métodocontrolaba en cultivo con leche el tiempo que transcurría, esasí que cada uno de los resultados dependía uno del instrumentoy el otro del tiempo.

Otra diferencia que se ha podido denotar es la colocación de lalecha en el cultivo, ya que en la experimentación con elbiorreactor primero se realizó el cultivo del protozooTretrahymena controlando que crezca adecuadamente para que almomento de ser colocada en la lecha esta no muera, mientras queen el otro experimento se agregó la leche a varias muestras decultivo.

Finalmente a pesar de las diferencias que tienen los dos métodosestudiados, el fin es el mismo; el 5% del colesterol que seencuentra en la leche o en el huevo se reconvirtió enprovitamina D, se convirtieron al 90% del colesterol en ésteresde colesterol dando a aplicar esta estrategia ingeniosa, lasmuestras experimentales de huevo y leche retuvieron sólo el 5%del colesterol original. Esto significa que el pequeñísimomicroorganismo puede captar selectivamente al colesterol yademás puede añadir un valor agregado al alimento.

Referencias

Florin-Christensen J, Florin-Christensen M, Rasmussen L, Knudsen J (1986a) An acid

phospholipase C from Tetrahymena culture medium. CompBiochem Physiol.

Florin-Christensen J, Florin-Christensen M, Rasmussen L, Knudsen J, Hansen HO

(1986b) Phospholipase A1 and triacylglycerol lipase: two novel enzymes from Tetrahymena culture medium. Comp Biochem Physiol.

Florin-Christensen J, Florin-Christensen M, Knudsen J, Rasmussen L (1986c)

Phospholipases and phosphonolipids in a ciliate: an attack and defense system? Trends Biochem Sci 11(9):354–355

Florin-Christensen M, Florin-Christensen J, Tiedtke A, Rasmussen L (1989)

Minireview: New aspects of extracellular hydrolytic enzymes in lower eukaryotes. Eur J Cell Biol 48:1–2

Nusblat A, Muñoz L, Valcarce G, Nudel C (2005) Characterization and properties of

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Valcarce G, Florin-Christensen J, Nudel C (2000) Isolation of Δ7- cholesterol

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Valcarce G, Muñoz L, Nusblat A, Nudel C, Florin-ChristensenJ (2001) The

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Valcarce G, Nusblat A, Florin-Christensen J, Nudel C (2002)Bioconversion of egg

cholesterol to provitamin D sterols with Tetrahymena thermophila. J Food Sci