Pavle Jovanov OPTIMIZACIJA METODA EKSTRAKCIJE I ...

UNIVERZITETUNOVOMSADUPRIRODNO-MATEMATIČKIFAKULTETDEPARTMANZAHEMIJU,BIOHEMIJU

IZAŠTITUŽIVOTNESREDINE

PavleJovanov

OPTIMIZACIJA METODA EKSTRAKCIJE I ODREĐIVANJA

NEONIKOTINOIDA TEČNOM HROMATOGRAFIJOM

U ODABRANIM UZORCIMA

- d o k t o r s k a d i s e r t a c i j a -

NoviSad,2014

zahvalnica Ovom prilikom želim da se zahvalim svima koji su svojim zalaganjem, posredno ili neposredno, doprineli kvalitetu ove doktorske disertacije. Želeo bih da se zahvalim svom mentoru, prof. dr Valeriji Gužvanj, na ukazanom poverenju, znanju koje mi je prenela, korisnim savetima, primedbama tokom izrade i pisanja ove disertacije koje mi je nesebično pružala. Veliku zahvalnost dugujem i dr Marijani Sakač na stručnim i prijateljskim savetima, kao i na svesrdnoj podršci tokom svih godina naše saradnje. Prof. dr Mladenu Franku, prof. dr Sanji Lazić, prof. dr Biljani Abramović i doc. dr Dejanu Orčiću upućujem reči hvale na znanju, iskustvu, interesovanju i zalaganju koju su mi pružili pri izradi ove disertacije. Želeo bih da se zahvalim projektima OI172012 i TR31029, koji su doprineli da se ovo istraživanje realizuje. Pomoć u realizaciji dela eksperimentalnog rada pružili su mi prof. dr Goran Bošković i Sanja Ratković, kojima se zahvaljujem na ustupljenim nanomaterijalima, kao i Vladimiru Višackom, koji mi je pomogao u prikupljanju uzoraka meda. Mojim prijateljima i kolegama, Bojani, Nataši, Ljubiši, Ivanu, Voji, Jovani, Jaci, Tamari i Miroslavu, veliko hvala na podršci i bezrezervnoj pomoći koju su mi poklanjali tokom svih godina rada u FINS-u. Želeo bih, takođe, da se zahvalim i svojim drugovima, Gradimiru i Darku na grafičkoj podršci. Svojoj porodici dugujem neizmernu zahvalnost na ljubavi, podršci i razumevanju.

Pavle

CONCLUSION

ACN–Acetonitril

ANOVA–Analizavarijanse

APCI–Hemijskajonizacijapriatmosferskompritisku

APPI–Fotojonizacijapriatmosferskompritisku

c–Koncentracija

c0 – Početnakoncentracija

CHCl3–Hloroform

CNT–Ugljeničnenanocevi

D–Ukupnafunkcijapoželjnogodziva

DAD–Detektornabazinizadioda

DC–Jednosmernastruja

DDT–Dihlor-difenil-trihloretan

DHM –Dihlormetan

di–Pojedinačanodzivsistema

DLLME –Disperznatečno-tečnamikroekstrakcija

DPP–Diferencijalnapulsnapolarografija

DPV–Diferencijalnapulsnavoltametrija

DSPE –Disperzivnaekstrakcijanačvrstoj fazi

ECD –Elektrohemijskidetektor

EDS–MikroanalizaX-zracima

EFSA –AgencijazabezbednosthraneEU

EI–Jonizacijaelektronima

EPA–Agencijazazaštituživotnesredine

ESI–Elektrosprejjonizacija

EU–Evropskaunija

FAB –Jonizacijabombardovanjembrzimatomima/jonima

FAO–OrganizacijazahranuipoljoprivreduUjedinjenihnacija

Fe-MWCNT –Gvožđemdekorisanevišezidneugljeničnenanocevi

FIA–Protočnainjekcionaanaliza

FTIR–InfracrvenaspektrometrijasaFourierovomtransformacijom

GCB –Grafitiziraniugljeničnisorbent

GC-MS –Gasnahromatografijasamasenomspektrometrijom

GD–Granicadetekcije

GO–Granicaodređivanja

H–Ekvivalentvisineteoretskogpoda

H2O2 – Vodonik-peroksid

HED–Dinodavisokeenergije

HMDE–Adsorpcionastripingvoltametrijasapravougaonimtalasomnavisećojkapižive

HPLC –Tečnahromatografijavisokeefikasnosti

HPLC-MS –Tečnahromatografijasamasenomspektrometrijom

k’ –Faktorkapaciteta

L –Dužinahromatografskekolone

LD50 –Količinakojaizazivauginuće50%ispitivanihjedinki

LISTA SKRAĆENICA

LOD –Limitdetekcije

LOQ–Limitkvantifikacije

m/z –Odnosmaseinaelektrisanja

MALDI –Matriksompotpomognutalaserskadesorpcijaijonizacija

MDK–Maksimalnodozvoljenekoličineostatakapesticidaunamirnicama

MgSO4–Magnezijum-sulfat

MMC rastvor–Standardnirastvorkojikompenzujeuticajmatriksa

MRM –Režimradasapraćenjemvišestrukereakcije

MS/MS –Tandemskamasenadetekcija

MWCNT –Višezidneugljeničnenanocevi

N–Brojteoretskihpodova

NaCl –Natrijum-hlorid

NMR–Nuklearnamagnetnarezonanca

PAD–Fotodiodnidetektor

PIF –Fotohemijskiindukovanafluorimetrija

PSA–Primarno-sekundarniamin

QqQ–Trostrukikvadrupol

QuEChERS–Brza,laka,jeftina,efikasna,robustnaibezbednametodaekstrakcije

R –Prinos

r2 – Kvadratkoeficijentakorelacije

RF–Radiofrekventnastruja

RID –Refraktometrijskidetektor

RS –RepublikaSrbija

RSD –Relativnastandardnadevijacija

RSM–Metodologijapovršineodziva

S/N –Odnossignal/šum

SAD –SjedinjeneAmeričkeDržave

SEM–Skenirajućielektronskimikroskop

SIM–Režimradasapraćenjemodabranogjona

SPE–Ekstrakcijanačvrstojfazi

SPME–Mikroekstrakcijanačvrstojfazi

SWCNT –Jednoslojneugljeničnenanocevi

t –Vreme

TLS–Optotermičkidetektor

TOF–Masenianalizatorsavremenompreleta

tr –Retencionovreme

uHPLC–Ultratečnahromatografijavisokeefikasnosti

UV –Ultraljubičastaoblastspektra

w–Širinapika

wti–Relativniznačajkojijedodeljenodzivusistema

Yi –Odzivsistema

α–Faktorselektivnosti

Poglavlje 1

1. UVOD

3

Pavle Jovanov

Pesticidisuhemijskasredstvakojasekoristezazaštitubiljakaiživotinjaodraznihštetočina.Svakokorišćenjepesticidanosiriziknarušavanjaravnotežeekosistema,pogotovoukolikosekoristenestručnoupogledunačinaupotrebeivremenaprimene.Smanjenaupotrebapesticida,jedanjeodtemeljaodrživepoljoprivredeiidejaodrživograzvoja.Međutim,bezpesticidasenemože,jergotovodanemabiljnekultureuprimarnojpoljoprivrednojproizvodnjikojamožedaopstanebezzaštite.Upotrebapesticidapomažeupovećanjuproizvodnjehranebilouništavanjemštetočinaikorovailiprodužavanjemrokatrajanjahrane.

Novijiinsekticidi,neonikotinoidi,odlikujusespecifičnimnačinomdelovanjananervnisisteminsekata.U određenimuslovima neonikotinoidimogu da predstavljaju i prekursore za nastajanjejedinjenjasajošizraženijombiološkomaktivnošću.Komercijalnipreparatikojisadrženeonikotinoidekaoaktivnesupstancekoristesezatretiranjerazličitihusevakukuruza,suncokreta,pirinča,uljanerepice,šećernerepe,povrćaivoća.Međutim,korisniorganizmikojinisupredmetdelovanjaneonikoti-noida,kaoštosumedonosnepčele,mogubitiizloženeštetnomdejstvuovihinsekticida.

Zavisnoodnačinaupotrebeneonikotinoida,postojerazličitemogućnostidamedonosnepčeledođu u kontakt sa njima. Jedna odmogućnosti delovanja neonikotinoida jeste njihovo usvajanjeprekokorenabiljkeiprenošenjeunekebiljneorgane:cvet(gdeseakumulirajuunektaruipolenu),plod,listoveiseme.Iakovećinaovihneurotoksinaneizazivadirektnusmrtpčela,zajednosaostalimnepovoljnimčiniocima,kaoštosuvirusi,neminovnodovodidouginućapčela.Nakonštomedonosnepčeledođuukontaktsaneonikotinoidima,ostacineonikotinoidamogusepojavitiukošnicamaiupčelinjimproizvodimapoputmeda.Medkontaminiranna takavnačinodlikujenarušenkvalitet izdravstvenabezbednost,pogotovoakoseimauvidučinjenicadajemedjedanodretkihprirodnihproizvodakojisekoristiutehnološkineprerađenomstanju.

Radidobijanjaštobržeikvalitetnijeinformacijeoizloženostiživotnesredineoviminsekticidimaikoličinamanjihovihostatakauhrani,potrebnojeraspolagatiodgovarajućiminstrumentalnimmetodamazanjihovoodređivanje.

Predmetistraživanjaovedoktorskedisertacijejesteoptimizacijaanalitičkemetodezasnovanenatečnojhromatografijisarazličitimdetektorima,tj.detektoromnabazinizadioda(DAD)imasenimdetektorom(kvadrupolMS/MS)zaodređivanjesedaminsekticidaizgrupeneonikotinoida(imidak-loprida,tiametoksama,acetamiprida,tiakloprida,klotianidina,nitenpiramaidinotefurana)uodabra-nimuzorcima.

Optimizacija metoda sastojala se prvo u odabiru najpogodnije ekstrakcione tehnike zaekstrakcijuneonikotinoidaizuzorakamedailikeramedice,kojisuodabranikaomatriksiodinteresaprilikom ispitivanja. Korišćenjem eksperimentalnih podataka dobijenih variranjem ekstrakcionihparametara iprimenomodgovarajućihmodelsistema,došlosedooptimalnihparametaraekstrak-cionetehnike.Korišćenjemmetodologijepovršineodziva,definisanisuioptimalnihromatografskiuslovi,radidobijanjanajvećihodzivasignaladetektora,saciljemodređivanjaniskihkoncentracijaneonikotinoida.

4

Doktorska disertacija

S obzirom na atraktivnost i aktuelnost gorenavedene grupe jedinjenja, u istraživanje je uključeno i testiranje primenljivosti višezidnih ugljeničnih nanocevi za uklanjanje odabranih insekti-cida neonikotinoida iz vodenih rastvora.

Rad se sastoji iz sledećih delova: Teorijski deo, Eksperimentalni deo, Rezultati i diskusija, Zaključak, Conclusion, . Teorijski deo obuhvata kratak pregled iz liter-ature o ulozi i primeni pesticida, njihovoj neonikotinoidima kao posebnoj grupi insekti-cida, koja je detaljnije proučavana u ovoj disertaciji, osobinama odabranih neonikotinoida, njihovom načinu delovanja i primeni. Opisana je uloga i značaj pčela za životnu sredinu i okarakterisani su ispi-tivani pčelinji proizvodi – med i proizvod na bazi meda – liker medica. U nastavku je dat literaturni prikaz nekih primenjivanih tehnika za ekstrakciju neonikotinoida, poput tečno-tečne ekstrakcije, dis-perzivne tečno-tečne mikroekstrakcije (eng. dispersive liquid - liquid microextraction - DLLME), ekstrakcije na čvrstoj fazi primenom kolona za razdvajanje (Discovery) i QuEChERS tehnike za prečišćavanje i ekstrakciju pesticida, zatim prikaz instrumentalnih analitičkih tehnika za određivanje neonikotinoida, koji obuhvata molekulsku spektroskopiju, elektroanalitičke metode, imunohemijske metode i hromatografske metode. Tečna sa masenom spektrometrijom (eng. high per-formance liquid chromatography -mass spectrometry - HPLC-MS) detaljnije je opisana, jer je taj sistem odabran kao najpodesniji za određivanje neonikotinoida u odabranim uzorcima u ovoj disert-aciji.

U Eksperimentalnom delu su opisani: Hemikalije i rastvori, Pribor i aparature, Ispitivani uzor-ci, Procedure za pripremu uzoraka, Metodologija površine odziva, HPLC-DAD/MS/MS uslovi rada, i Validacija metoda za ispitivanje odabranih neonikotinoida.

Deo Rezultati i diskusija sastoji se iz 6 celina u kojima su predstavljeni i prodiskutovani dobi-jeni rezultati optimizacije metoda ekstrakcije i određivanja neonikotinoida. Predstavljeni su rezultati dobijeni primenom procedure za pripremu uzoraka, koja obuhvata tečno-tečnu ekstrakciju u kombi-naciji sa ekstrakcijom na čvrstoj fazi za određivanje odabranih neonikotinoida korišćenjem detektora na bazi niza dioda (eng. diode array detector - DAD). Potom je predstavljena optimizacija disper-zivne tečno-tečne mikroekstrakcije variranjem ekstrakcionih parametara i primenom model sistema korišćenjem metodologije površine odziva. Variranjem hromatografskih uslova dobijena je optimalna metoda za određivanje odabranih neonikotinoida zasnovana na DAD i tandemskoj masenoj (MS/MS) detekciji. Pored DLLME ekstrakcione tehnike ispitivana je i primena ekstrakcionog seta QuEChERS. Prikazani su parametri validacije optimizovane metode i njena primena na realnim uzorcima meda i likera od meda. Pored određivanja odabranih neonikotinoida iz uzoraka meda i likera od meda, ispi-tivana je i mogućnost uklanjanja neonikotinoida iz vodene sredine upotrebom višezidnih ugljeničnih nanocevi (eng. multiwalled carbon nanotube - MWCNT). Predstavljeni su rezultati razgradnje i/ili adsorpcije odabranih neonikotinoida primenom sistema koji su sadržali pored neonikotinoida i MWCNT i/ili hemijski reagens (H2O2). Radi ispitivanja pogodnijeg načina uklanjanja nanoma-terijala iz ispitivanih uzoraka, testirana je i primena gvožđem dekorisanih nanomaterija (Fe-MWCNT), kao potencijalnih adsorbenasa.

U delovima Zaključak i Conclusion predstavljena su najznačajnija saznanja koja su proistekla iz rezultata ispitivanja neonikotinoida u odabranim uzorcima na srpskom i engleskom jeziku. Spisak korišćene literature, kratka kandidata i ključna dokumentacija čine poslednje delove ove doktorske disertacije.

2.

Poglavlje 2

2. TEORIJSKI DEO

7

Pavle Jovanov

2.1 Pesticidi i njihova klasifikacija

Jošuantičkomdobuljudisupoznavaliikoristilisredstvakojimasuštitiliuseveodštetočina.

Topotvrđujuzapisioduvanukojijekorišćendabisenjimeoteralištetniinsekti.Međutim,teku19.

vekudolazidoprvihpokušajaproizvodnjesredstavazazaštitubiljaodštetočina.Postojepodacikoji

govoredasutadabiliuupotrebinikotin,piretrin,rotenoidi,aprimenjivanjeipetrolej,pačakiarse-

novipreparatiicijanovodičnakiselina.Prvinemetalni,organskiinsekticid,antinonin,upotrebljenje

uNemačkoj1892.godineprotivomorikovogprelca.Ovajinsekticidjezbogizrazitetoksičnostibiou

upotrebikratkovreme.

Početkom20.veka,uupotrebisufenotiazin,nitrokarbazoliitiocijanati.ŠvajcaracMüller ot-

kriojedihlor-difenil-trihloretan(DDT),zbogčegaje1948.godinedobioNobelovunagradu.Usledila

jemasovnaupotrebaovoghemijskogjedinjenjaucelomsvetuupoljoprivredi,ali iuborbiprotiv

tifusa,malarijeitd.

Pesticidi(latinskipestis-kuga,pošast,štetnik;occidere-ubiti)predstavljajusredstvanamenjenaza

sprečavanje,suzbijanjeilikontroluštetočinazoogenogporekla(insekti,pregljevi,puževi,nematode,glo-

dari),uključujućiivektorehumanihianimalnihbolesti,prouzrokovačebiljnihbolestigljivičnog,bakteri-

jskogivirusnogporekla,kaoineželjenevrstebiljaka(korova),kojiizazivajušteteuvremevegetacije,

proizvodnje,prerade,skladištenjailitransportapoljoprivrednihkulturaiživotnihnamirnica.Zapesticide

kojisekoristeupoljoprivrednojproizvodnjikoristisenazivsredstvozazaštitubilja,čijasuregis-

tracija,kontrola,promet,uvoziprimenaupoljoprivrediišumarstvu,kaoiposloviodjavnoginteresa

uovojoblastiuRepubliciSrbiji(RS)regulisaniZakonomosredstvimazazaštitubiljaobljavljenpod

brojem41uslužbenomglasnikuRS2009.godine.

Primenapesticida jenajznačajnijaupoljoprivredi iobuhvatapreko95%ukupnogprometa

ovihhemijskihproizvoda.Osnovnaklasifikacijapesticidasenajčešćezasnivananjihovojnameni

(tabela2.1).NatržištuEvropskeunije(EU)uovomtrenutkuregistrovanojevišeod1300pesticida

[1],dokjepremaizveštajuMinistarstvapoljoprivrede,šumarstvaivodoprivredeRSiz2013.godine

unašoj zemljiuprometu377pesticidnihaktivnihmaterija, sadržanihu924preparata.Pesticidi i

njihovimetabolitiulazeu ljudskiorganizamprekolanca ishrane ivode.Negativanuticajsredstva

zazaštitubiljanaljudskozdravljeuključujemnogeefekte:akutnuneurološkutoksičnost,hronično

oštećenjenervnogsistema,disfunkcijuimunog,reproduktivnogiendokrinogsistemailipojavuraka.

8


Tabela 2.1.Podelapesticidapremanameni

GRUPAPESTICIDA NAMENAAkaricidi suzbijajugrinjeAlgicidi suzbijajualgeArboricidi uništavajudrvenastebiljkeAtraktanti privlačeštetočineBaktericidi suzbijajubakterijskaoboljenja

Biološkiagensi živiorganizmikojisegajeikoristezasuzbijanještetnihorganizama

Desikanti izazivajusušenjebiljakapreberbeDefolijanti prvenstvenoizazivajuopadanjelišćaFumiganti delujuugasovitomstanjuFeromoni remetenormalnoponašanjeinsekataFungicidi suzbijajupatogenegljive

Hemosterilizanti suzbijajuštetočineizazivanjemsterilnosti

Herbicidi suzbijaju korovske biljkeInsekticidi suzbijajuinsekte

Moluskocidi(Limacidi) suzbijajuštetnepuževe

Regulatorirastabiljaka utičunarastirazvojbiljakanadrugačijinačinodđubriva

Regulatorirastainsekata remetenormalanrastinsekataRepelenti odbijajuštetočine

Rastućazabrinutostjavnostizazdravljeljudi,auvezijesaostacimapesticidauhrani,uve-liko jepromenila strategiju zaštiteuseva, saposebnimnaglaskomnakvalitet i bezbednosthrane.Zabrinutostzaopštezdravljepopulacijedovelajedopooštravanjaregulativekojasebavimaksimal-nodozvoljenimkoličinama(MDK)ostatakapesticidaunamirnicama.Višeod17000MDKvrednostipropisanesuuraznimnamirnicamaza526pesticida[1].RepublikaSrbijaje2010.godinedonelaPravilnikkojimsuvrednostiMDKusklađenesavrednostimauEvropskojuniji[2].Danasuživotnusredinudospevajuogromnekoličinerazličitihhemijskihjedinjenja.Mnogaodnjihsenerazlažunaprostija,manjeopasnajedinjenja,većsenagomilavajuuatmosferi,vodiilizemljištuitransformišuseujošopasnijeoblike.Zbograsprostranjeneupotrebebrojnihhemikalijauprocesimaproizvodnjeipreradenamirnica,kaoisvevećezagađenostiživotnesredine,dolazidoulaskavelikogbrojanenutri-tivnihkomponenataulanacishranečoveka.Iakoseovajedinjenjaunamirnicamanajčešćenalazeumalim,tzv.rezidualnimkoličinama,posledicenjihovogdelovanjanisuzanemarljive.Mnogisastojcinamirnicasuhemijskistabilnajedinjenja,doksudrugaveomanestabilna.Upostupcimaproizvodnjenamirnica,njihoveprerade,prometaičuvanjamogusepronaćineželjenestranesupstance,kaoštosutoksičnielementi,hormoniiostacipesticida.Zarazlikuodvećinezagađujućihsupstancikojeseuživotnusredinuunosebezodređenogcilja,pesticidiseunosesanameromdapomognučoveku–povećanjemprinosaupoljoprivrediisuzbijanjemštetnihorganizama.

9

Pavle Jovanov

Udeoinsekticidanatržištupesticidajepredstavljennaslici2.1.Insekticidisuraspoloživiusvatriagregatnastanja,aubijajuinsektedelujućinanjihovcentralninervnisistem.Jednaodsavremenijihgrupainsekticida,kojajepohemijskojstrukturisličnanikotinu,jestegrupaneonikotinoida,kojaseodlikujevelikomefikasnošćuuborbiprotivštetnihinsekata,amalomtoksičnošćuzaljudeiživotnusredinu.

Slika 2.1.Udeoinsekticidanatržištunaosnovuostvareneprodaje[3]

2.2 Neonikotinoidi

Nazivneonikotinoidizagrupuinsekticida izabranjenaosnovunačinanjihovogdelovanja istrukturnihsličnostisanikotinoidima.Uposlednjih20godina,neonikotinoidisupostalinajzastu-pljenijagrupainsekticidanasvetu.Njihovoprisustvopredstavljačetvrtinuodukupnogprisustvapesticidanasvetskomtržištu[3,4].Otkrićenitrometilenskihneonikotinoidatokomsedamdesetihgodinaproteklogveka,stvorilojebazuzadugoročnorazvijanjeinsekticidaneonikotinoidasaniti-azinomkaopolaznimjedinjenjem.Uspešnaistorijaneonikotinoidapočinje1991.godinesapojavomimidakloprida,kojijeproizveoBayer[5].Prvugeneracijuneonikotinoida,poredimidakloprida,činejoštrisupstance–nitenpiram,kojije1995.godineproizveoTakeda,acetamiprid,proizveden1996.godineod straneNipon Sode i tiakloprid,koji je2000.godineproizveoBayer.Drugugeneracijučinetiametoksam (Syngenta),proizveden1998.godine,iklotianidinrazvijenodstranekonzorcijumaTakeda i Bayer2002.godine.TrećugeneracijupredstavljadinotefuranproizvođačaMitsui Chemicals iz2002.godine.InsekticidflonikamidjerazvijenodstraneISK ukasnimdevedesetimgodinamapro-teklogvekaisamosezavisnoodindividualnihistraživanjairegistrovanjasvrstavauneonikotinoideiliupiridinkarboksiamide.Najnovijajedinjenjeizgrupeneonikotinoidajesupaichongding i cycloxa-prid [6,7].

Naosnovuhemijskihstrukturaneonikotinoidisedeleusledećegrupe:nitroguanidinskiinsek-ticidi(imidakloprid,tiametoksam,klotianidinidinotefuran),nitrometilenskiinsekticidi(nitenpiraminitiazin)ipiridilmetilaminskiinsekticidi(acetamiprid,imidakloprid,nitenpiramitiakloprid).Neo-nikotinoidi se, takođe,mogupodeliti i naosnovu funkcionalnihgrupananeonikotinoide sanitrogrupom(dinotefuran,nitenpiram, tiametoksam, imidakloprid,klotianidin ipaichongding) i cijanogrupom(acetamiprid,flonikamiditiakloprid)[8].

10


Prvageneracijaneonikotinoidasadržiheterocikličnu6-hlor-3-piridil-grupu,drugugeneracijuodlikuje2-hlor-5-tiazolil-grupa,doktrećugeneracijukarakteriše3-tetrahiodrofuranil-grupa.Flonika-midodlikujeheterociklična4-trifluor-metil-3-piridil-grupa.Neonikotinoideodlikujepolarnikarakterirazličitarastvorljivostuvodi,od185gL-1do840gL-1.

Neonikotinoididelujukaoagonisti(lažnitransmiteri)postsinaptičkihnikotinskihacetilholin-receptoracentralnognervnogsistemainsekata[9-13].Postsinaptičkihnikotinskihacetilholin-recep-torisureceptorikojisenalazenasinaptičnojmembrani ikojiprivezivanjumolekulaacetilholinapropuštaju joneNa+, K+ i Ca2+ i tako dovode do stvaranja električnog impulsa.Način na koji seacetilholinvezujezareceptoreidentičanjenačinuvezivanjaneonikotinoida.Suštinskarazlikaizmeđuvezivanjaacetilholinaineonikotinoidazareceptorjestedaacetilholinnapuštareceptor,dokneoni-kotinoidiostajuvezani.Natajnačin,neonikotinoidiuvelikimdozamaizazivajukonstantnudepo-larizaciju,štodovodidoprekidauprenosusignala.

Delovanjeneonikotinoidanainsektedovodidoekscitacijeneravaikrajnjeparalize,kojavodiuuginuće[9,14-16].Nikotinskiacetilholinskireceptoripostojeikodsisara,alijepripadajućaneuronskamrežazastupljenijakodinsekata[17].Mehanizamsinaptičketransmisijekodholinergičnihneurona,imetedelovanjainsekticidaprikazanisunaslici2.2.

Slika 2.2.Mehanizamsinaptičketransmisijekodholinergičnihneurona,imetedelovanjainsekticida[18]

Neonikotinoidipokazujuvelikuselektivnostkapodtipovimareceptora.Upravotajedinstvenaselektivnost[19]možedapredstavljaipotencijalnuopasnostzakorisneinsekte[20,21].Specifičan

11

Pavle Jovanov

načindelovanjaneonikotinoidarezultiraodsustvomunakrsneotpornostinaneonikotinoideuodno-su na druge insekticide poput karbamata, organofosfornih pesticida ili piretroida [22-24].Mnogeštetočinesutokomgodinarazvileotpornostkaovimgrupamainsekticida,dokneonikotinoidiuspešnoštitepoljoprivredneuseveodovakvihštetočina[23,25].Poredsuzbijanjaštetočina,tretmanneoni-kotinoidimamožedaimaidodatnikoristanuticajnabiljke.Naime,onimogudapospešujurastbiljakaičuvajubiljkeodrazličitihvrstastresa[26,27].

Danas su u upotrebi u više od 120 zemalja za preko 1000 različitih namena radi tretmanaširokog spektra biljaka, uključujući suncokret, kukuruz, pamuk, krompir, pirinač, šećernu trsku irepu,uljanurepicu,soju,ukrasnobilje,voćeidrugebiljnekulture[28].

Glavnirazloguspehaneonikotinoidanatržištuležiupravounjihovojefikasnosti,selektivnosti,dugotrajnomdejstvuiraznolikojnameni[29,30].UEUacetamiprid,klotianidin,imidakloprid,tiakloprid,flonikamiditiametoksamsuregistrovaniiuključeniuAneksIDirektive91/414/EEC[31],dokdinotefuraninitenpiramnisuregistrovanidodanas[1].SituacijajeistaiuRepubliciSrbijištosetičeregistrovanihaktivnihsupstanciusredstvimazazaštitubiljauprometu[32].

Klotianidin, imidakloprid i tiametoksamkoristesekaoaktivnematerijeusredstvimaza tre-tiranjesemena.Onidelujunasemepoputzaštitnogomotačaokosemenaodbijajućiinsekte,dokjesemeuzemlji.Neonikotinoidiputemkorenskogsistemadospevajuucelubiljku,štitećijeodugriza,sisanjaižvakanjainsekatatokomnjenograsta.Nasuprottome,tiaklopridiacetamipridsenajčešćeprimenjujuuvidusprejevaiomogućavajudirektnu,alikratkotrajnuzaštitubiljaka[30].

Visokauspešnostneonikotinoidauzaštitipoljoprivrednihusevaodštetnihinsekataodražavaseinakorisneinsektepoputpčela[33].Onemogudoćiukontaktsaneonikotinoidimanarazličitenačine.Zavisnoodtoksičnostiidužineizloženostimogućesusledećeposledicepopčele:oštećenjalegla,kontaminacijapčelinjihproizvodaostacimapesticida,gubicipčelailibezvidljivihuticaja.Jedanodglavnihrazlogaizloženostipčelaneonikotinoidimajeblizinakošnicaiobradivihoranicakojesetretirajupesticidima.Sobziromnavelikupovršinukojuzauzimajupoljoprivredniusevi,pčelesuprimoranedatragajuzahranomunjihovojneposrednojblizini,paimseikošnicenajčešćenalazeveomablizu[34].Izloženostneonikotinoidimamogućajeikaoposledicaneadekvatnogdelovanjaljudskogfaktora,kojedovodidokontaminacijevodaiflore[35].

Zavisnoodnačinakorišćenjaneonikotinoida,različitisuimogućiputevikontaminacijeljudi,pčelaipčelinjihproizvoda[36].Akoseneonikotinoidikoristeuviduspreja,možedoćidokontami-nacijepčelaprekocvetovatokomsakupljanjanektarailipolenailidodirektnogkontaktasaneoni-kotinoidimaukolikosetretiranjedešavadoksupčeleublizini.Korišćenjeneonikotinoidautretiranjusemenaznačajnosmanjujemogućnostzagađivanjavazduhaoviminsekticidima[37].Bezobzirananavedeno,kontaktsapčelamajemoguć iz razlogaštonovonastalabiljka iz tretiranogsemenare-sorbujeideoneonikotinoida.Ukolikotokomsejanjadođedoabrazijesemena,nastalaprašinakojasadržineonikotinoidemožedakontaminirabiljkeipriroduuokolini[38].Korišćenjesejalicakojeizbacujuvazduhnagoredovodidointenzivnijegstvaranjaprašineivećemogućnostiodzagađivanjaživotnesredineipčela.

12


Neonikotinoidikojisekoristeuzaštitisemenasusistemskiinsekticidi[39]idospevajuucelubiljkuputemksilemskihifloemskihtransportnihtkiva[40],pabiljnetečnostiicvetnipolenmogupredstavljatipotencijalneizvorekontaminacijeneonikotinoidimazapčele.Porednektaraipolena,potencijalniizvorkontaminacijeneonikotinoidimapredstavljaieksudacijakapi.

Ovajbotaničkifenomenjeaktivnoilipasivnoizbacivanjeksilemsketečnostiuformikapljicana određenimdelovima biljke. Izraz eksudacija kapi potiče od latinske rečigutta, što znači kap.Najčešćesepojavljujunaivicamališćabiljaka.Pojavaovetečnostijekarakterističnazamnogevasku-larnebiljke,poputkukuruza,ječmaipšenice,usledodređenihklimatskihpojava,kaoštojevisokavlažnostvazduha.Klimatskiuslovpoputovog,sprečavauobičajennačinoslobađanjaodviškavodezabiljku,pajejedininačinoslobađanjavodeputemeksudacijekapi.Sobziromnatodasmanjenjetemperature vazduha povećava relativnu vlažnost vazduha, eksudacija kapi se najčešće dešavanoćuiliranomzorom.

Eksudacionakapjevodenirastvorkojisadržisoli,aminokiseline,šećere,vitamineihormone.Ukolikoseaktivnesupstancesredstavazazaštitusemenanalazeudelukorenabiljke,onemogubititransportovanesavodomkrozcelubiljkudoeksudacionekapi,inatajnačinpredstavljatipotenci-jalniizvorkontaminacijepčelaneonikotinoidima.Ispitivanjusadržajaneonikotinoidaueksudacionojkapi posvećuje se sve više pažnje [41-43].Girolami et al. [42] je utvrdio prisustvo klotianidina,imidaklopridaitiametoksamaueksudacionojkapikukuruza,čijejesemebilotretiranoneonikotinoi-dima.Koncentracijenađenihneonikotinoidasusekretaleido200mgL-1.Sličnerezultatezasadržajklotianidina(do133mgL-1)ustanoviojeNikolakis et al.[43],čimejedokazanamogućnostprolaskaneonikotinoidaizsemenadoeksudacionekapibiljaka.Poštopčelemogudakoristeeksudacijukapikaoizvorvode,mogućajeinjihovaizloženostneonikotinoidima.

Daljaispitivanjasprovođenasuradiutvrđivanjamogućnostiakumuliranjaletalnihdozaovihinsekticidaukošnicamaiizloženostimladihpčelaistim[44].Takođe,postojiopasnostodkontamini-ranogpolena,kojijejediniizvorproteinazamladepčeleukošnici,pa,stoga,utičenarazvitakcelekolonije [45].Vršena su i istraživanjavezana zautvrđivanjenivoaopasnosti korišćenjemnitro- icijanosupstituisanih neonikotinoida, u kojima je utvrđeno da su nitrosupstituisani neonikotinoidiznatnootrovnijizapčele[20].Klotianidin,imidakloprid,tiametoksam,dinotefuraninitenpirampred-stavljajunajvećuopasnostzapčelesaLD50(količinakojaizazivauginuće50%ispitivanihjedinki)vrednostimamanjimod1µgpopčeli.

13

Pavle Jovanov

2.2.1 Imidakloprid

Imidaklopridje prvisintetskiproizvedenneonikotinoid.Prisutanjeuasortimanupreparatazazaštitubiljakanamenjentretiranjusemenakaozaštitaodštetočina.

Sintetizovan je1984. godineukompanijiBayer (Leverkuzen,Nemačka). Primenjuje seugranicama5,6-14,0mgm-2,štojemnogomanjeuodnosunatradicionalneinsekticide.Hemijskastruktura imidaklopridaprikazanajenaslici2.3,doksenekifizičko-hemijskiparametrinalazeutabeli2.2.

Slika 2.3.Strukturnaformulaimidakloprida

Tabela 2.2.Fizičko-hemijskeosobineimidakloprida

NazivpoIUPAC-u1-(6-hlor-3-piridilmetil)-2-nitroimino-

imidazolidinMolekulskaformula C9H10ClN5O2

Molekulskamasa 255,7gmol-1

Izgled bezbojnikristaliGustina 1,50–1,70gmL-1na20°C

Tačkatopljenjamodifikacija1:143,8°C

modifikacija2:136,8°CNaponpare 2·10-7Pana20°C

Rastvorljivostna20°C

voda

aceton

metanol

dihlormetan

n-heksan

0,61gL-1

55gL-1

1,2gL-1

0,68gL-1

<0,1gL-1

Rastvorljivost u mastima 0,55gkg-1

Koeficijentraspodeleoktanol-voda(Kow)

3,7

14


Imidakloprid je veoma slabo isparljivo jedinjenje, što potvrđuje njegov nizak napon pare.

Shodnotome,malajeiverovatnoćadisperzijeimidaklopridauvazduhunavećojpovršini.Sdruge

strane,postojimogućnostdaimidaklopriddospeupovršinskeipodzemnevode.Hemijskigledano,

najefikasnijiputdegradacijeimidaklopridajefotodegradacija[46,47].Zahvaljujućireakcijamafoto-

degradacije,premadosadašnjimpodacima,imidaklopridserazlažedo6-hlornikotinskekiseline, imi-

dakloprid uree, 6-hlor-nikotinaldehida, 6-hlor-N-metilnikotinamida, 6-hlor-3-piridil-metiletilendi-

aminaidrugihjedinjenja.Nadalje,imidaklopridimaniskutendencijuvezivanjazazemljište[48,49].

Imidaklopridjehidrolitičkirelativnostabilanipostojanuzemljištu[50].Dugperiodpolurazgradnje

imidaklopridauzemljištuukazujenarizikodbioakumulacije,alizahvaljujućifotodegradacijiido-

brojrastvorljivostiuvodi,donjegovebioakumulacijenedolazi.Poredsunčevesvetlosti,mikroorga-

nizmivodeizemljištaigrajuvažnuuloguudegradacijiimidakloprida[49,51].

Imidakloprid se koristi kao aktivna komponenta umnogim komercijalnim preparatima za

zaštitubilja.RegistrovanipreparatizazaštitubiljauprometuuRSu2013.godinisaimidaklopridom

kaoaktivnomsupstancomsuprikazaniutabeli2.3[32].

Agencijazazaštituživotnesredine(eng.Environmental Protection Agency-EPA)svrstava

gauEgrupukancerogena,tj.usupstancekojenisukancerogenezaljudskiorganizam[48,52,53].

Ekotoksičnostimidaklopridazavodeneorganizmejeniska,alipostojepodacidajeotrovanzaptice

[54].

Studije ispitivanjaakutne toksičnosti imidaklopridazamedonosnepčelesupokazaleda je

LD50oko60ngpopčeli(600μgkg-1)u48satii40ngpopčeli(400μgkg-1)u72satai96sati.

Međutim,BajerovestudijedošlesudonivoaLD50između0,14i1,57mgkg-1.Daljaproučavanja

utvrdilasudasumnogonižinivoiLD50izrazitootrovnizapčele,odnosnodasuotrovninivoiod3,7-

20,6ngpopčeli[55].

15

Pavle Jovanov

Tabela 2.3.SredstvazazaštitubiljauRSuprometu2013.godinesaimidaklopridomkaoaktivnomsupstancom

PREPARAT PROIZVOĐAČ BILJNAVRSTA ŠTETOČINA

Gaucho600 Bayer

ječam lisnevašisuncokret žičnjaci

kukuruzsivakukuruzovapipakukuruznazlatica

šećernarepa repinbuvačMacho600 Hemovet

kukuruzsivakukuruzovapipa

Imidor600 Stockton

žičnjaci

Pozitron Galenika šećernarepaSeedoprid

600 Celsius PropertykukuruzTabu August

Tamaris Agro-Care

Nuprid600 Nufarm uljanarepica repičinaosa

Confidor200 Bayer

krompir krompirovazlaticapaprika

lisnevašijabukašljiva

breskvaduvan tripisi

Savador 200 Agrosava

krompir krompirovazlaticapaprika lisnevaši

Kohinor200 Celsius Property

krompir krompirovazlaticajabuka lisnevašišljiva

breskva

Warrant200 Cheminova

krompir krompirovazlaticajabuka

lisnevašišljivabreskva

Macho200 Hemovet

krompir krompirovazlaticapaprika

lisnevašijabukašljiva

breskvaduvan tripisi

Nuprid200 Nufarm krompir krompirovazlatica

16


2.2.2 Tiakloprid

Tiakloprid((Z)-3-hlor-3-piridilmetil)-1,3-tiazolidin-2-ilidencijanamid(slika2.4)pripadaprvojgeneracijineonikotinoidnihinsekticida.PrvagajesintetizovalakompanijaBayer idrugijeunizunjihovihproizvodaizgrupeneonikotinoida.

Slika 2.4. Strukturnaformulatiakloprida

TiaklopridjeprviputregistrovanuBrazilu1999.godine.Uglavnomsekoristizazaštituvoća,

ribizli,pamuka,šećernerepeipirinčaukoličinamaod48-216gha-1.Koristiseikaosredstvozakon-

troluinsekata,kaoštosumoljci,bubeileptiri(tabela2.4)[56].Odlikujegasličannačindelovanja

kaoiostalihinsekticidaizgrupeneonikotinoida.

UproizvodnjitiaklopridanajzastupljenijanatržištujekompanijaBayer[57].Utabeli2.5 pri-

kazanesunekefizičko-hemijskeosobinetiakloprida.

PripH5-9tiaklopridjestabilan,nehidrolizujeinerazgrađujesefotohemijski.Tiaklopridse

uvodiprimarnorazgrađujepoddejstvommikroorganizamasavremenompoluraspadaod12do20

dana.Metabolitikojinastajuuvodenojsrediniseneakumuliraju,jerkadadostignumaksimalnukon-

centraciju(između25-62dananakonupotrebeinsekticida),njihovakoncentracijapočinjedaopada.

Prinjegovojrazgradnjinastajeugljen-dioksid,štoukazujenamogućnostpotpunemineralizacije

nastalihmetabolita[58].

Tiaklopridimaniskutoksičnostzasisare.EPAgasvrstavauEgrupukancerogena.Toksičnost

tiaklopridazavodeneorganizmejeniska.Međutim,otrovanjezaptice.Smatraseveomaotrovnim

zakišneglisteipčele[59].Poluvremeraspadauzemljištupriaerobnimuslovimana20°Ckreće

seuintervalu12-78dana[58].

17

Pavle Jovanov

Tabela 2.4.SredstvazazaštitubiljauRSuprometu2013.godinesatiaklopridomkaoaktivnomsupstancom

PREPARAT PROIZVOĐAČ BILJNA VRSTA ŠTETOČINA

Calypso480Bayer

suncokret lisnevašikrompir krompirovazlatica

paprikalisnevaši

Proteus110(tiakloprid+deltametrin)

kupuskrompir krompirovazlatica

Tabela 2.5.Fizičko-hemijskeosobinetiakloprida

NazivpoIUPAC-uN-{(2Z)-3-[(6-hlor-3-piridinil)

metil]-1,3-tiazolan-2-iliden}cijanamidMolekulskaformula C10H9ClN4SMolekulskamasa 252,7gmol-1

Izgled beli kristaliGustina 1,46gmL-1na20°C

Tačkatopljenja 136°CNaponpare 3·10-8Pana20°C


n-heptan

ksilen

1-oktanol

2-propanol

etilacetat

voda

acetonitril

aceton

dihlormetan

dimetilsulfoksid

<0,1gL-1

0,30gL-1

1,4gL-1

3,0gL-1

9,4gL-1

0,18gL-1

52gL-1

64gL-1

160gL-1

150gL-1


18,2

18


2.2.3 Nitenpiram

Nitenpiramjesintetisan1988.godine.Pripadaprvojgeneracijineonikotinoida.Svrstavaseugrupunitrometilenskih,atakođeiugrupupiridil-metilaminskihneonikotinoida.Njegovastrukturnaformulaprikazanajenaslici2.5,anekefizičko-hemijskeosobineutabeli2.6.

Slika 2.5.Strukturnaformulanitenpirama

Tabela 2.6.Fizičko-hemijskeosobinenitenpirama

NazivpoIUPAC-u(E)-N-(6-hlor-3-piridimetil)-N-etil-N’-metil-

2-nitrovinilidenediaminMolekulskaformula C11H15ClN4O2


Izgled bledižućkastikristaliGustina 1,40gmL-1na26°C

Tačkatopljenja 72°C


voda

hloroform

aceton

ksilen

metanol

etanol

840gL-1

700gL-1

290gL-1

4,5gL-1

670gL-1

89gL-1


0,22

Veomasedobrorastvarauvodi(840gL-1),dobarjesistemikinijefitotoksičan.Koristisezakontrolulisnihvaši,belihmuvaidrugihštetočinaupirinčuibiljkamaustaklenicima.Relativnojeslabopostojanuzemljištusavremenompoluraspadaod1-15dana.Koristiseizaotklanjanjebuvakodmačakaipasa.Nakonoralneupotrebe,veomabrzoipotpunoseapsorbujeizgastrointestinalnogtraktaurokuod90minuta[60].

19

Pavle Jovanov

2.2.4 Tiametoksam

Tiametoksam pripada drugoj generaciji neonikotinoida. Tiametoksam i njegov metabolitklotianidin,takođepredstavnikneonikotinoida,delezajedničkikatabolitičkiput[61].Strukturnafor-mulatiametoksamajeprikazananaslici2.6,anekenjegovefizičko-hemijskeosobineprikazanesuutabeli2.7.

Slika 2.6.Strukturnaformulatiametoksama

Tiametoksamjehemijskinepostojanuzemljištu,avremepoluraspadamuje11dana.Uvodije,takođe,nepostojansavremenompoluraspadaod51dan.Tiametoksamimanizakpotencijalbioaku-mulacijeisrednjumobilnostuzemljištu.RegistrovanipreparatizazaštitubiljauprometuuRSu2013.godinisatiametoksamomkaoaktivnomsupstancom,prikazanisuutabeli2.8[32].StudijeispitivanjaakutnetoksičnostitiametoksamazamedonosnepčelesupokazaledajeoralnaLD500,024µgpopčeli,akontaktna0,005µgpopčeli[62].

Tabela 2.7.Fizičko-hemijskeosobinetiametoksama

NazivpoIUPAC-u3-(2-hlor-1,3-tiazol-5-ilmetil)-5-metil-1,3,5-oksadiazinan-4-

iliden(nitro)aminMolekulskaformula C8H10ClN5O3SMolekulskamasa 291,71gmol-1

Izgled belikristalniprahGustina 1,57gmL-1na20°C

Tačkatopljenja 139,1oCTemperaturaraspadanja 147oC

Naponpare 6,6·10-9Pana25°C


vodaacetontoluenn-heksanetilacetat

4,1gL-1

48,0gL-1

68,0gL-1

0,001gL-1

7,0gL-1


0,74

20


Tabela 2.8.SredstvazazaštitubiljauRSuprometu2013.godinesatiametoksamomkaoaktivnom supstancom

PREPARAT PROIZVOĐAČ BILJNA VRSTA ŠTETOČINA

Cruiser600

Syngenta

suncokretžičnjacigrčice

kukuruzžičnjacigrčice

šećernarepažičnjacigrčice

repinbuvač

Cruiser350

suncokretžičnjaci

šljivinavašsivakukuruznapipa

šećernareparepinbuvačžičnjaci

sivakukuruznapipa

uljanarepicažičnjacibuvačlisnaosa

kukuruzžičnjaci

sivakukuruznapipaCelestTop312,5

(tiametoksam+difenokonazol+fludioksonil)

ječam lisnevaši

pšenica glavnice

ForceZEA280 kukuruzžičnjacigrčice

CruiserOSR

(tiametoksam+metalaksil-M+fludioksonil)

uljanarepicatrulež

belatrulež

Actara240

krompir krompirovazlaticakupus

lisnevašipaprikagrašakjabukaduvan

21

Pavle Jovanov

2.2.5 Klotianidin

KlotianidinjeneonikotinoidkojijerazvijenusaradnjijapanskekompanijeSumitomo Chemical Takeda AgroinemačkekompanijeBayer Crop Scinceuperioduod2000-2003.godine[7].Njegovastrukturnaformulaprikazanajenaslici2.7.

Slika 2.7.Strukturnaformulaklotianidina

Klotianidin ima specifičan mehanizam delovanja, odlične sistemske osobine, relativno ni-

skutoksičnostza toplokrvneorganizmeidugperioddelovanja.Važnijifizičko-hemijskiparametri

klotianidinaprikazani suutabeli2.9 [57].

Kodljudi,klotianidindelujekaopotencijalnineurotoksin,izazivablaguiritacijuočiju,akod

životinjamožedovestidoendokrinihporemećaja.EPAgasvrstavauIIIgrupukancerogena,odnosno

usupstancekojesubezbednezaljudskiorganizam[57].Onjevisokotoksičanzamedonosnepčele.

ZapčeleoralnaLD50jeod3,7-102ngpopčeli,akontaktnaLD50je24ngpopčeli.Klotianidinima

niskutoksičnostzasisare.

Usvetu,aikodnas,svejevećaupotrebapreparataPoncho,kojikaoaktivnumaterijusadrži

klotianidin.Najčešćesekoristizatretiranjesemenakukuruza,uljanerepiceisuncokreta(tabela2.10).

Namenjenjezasuzbijanjezemljišnihštetočinaištetočinauprvimfazamavegetacije.Nanesenna

semestvarazaštitni„film“okonjega,delujućikontaktnonapodzemneštetneinsekte,aistovremeno,

ulazećiusprovodnisistemnovonastalebiljke–klijanca,štitijeodnadzemnihštetočina.Kodkukuru-

za,koristisezasuzbijanjelarvikukuruznezlaticeizasuzbijanjelisnevaši.Uzemljištuostajeveoma

dugo,vremepoluraspadanjamuje830danaipriličnojemobilan,pasemožepojavitiupodzemnim

ilipovršinskimvodama[63].

Klotianidin i tiametoksam dele zajednički katabolički put, jer se smatra da se tiametoksam

konvertujeuklotianidinubiljkamaiživotinjama[64].

22


Tabela 2.9.Fizičko-hemijskekarakteristikeklotianidina

NazivpoIUPAC-u(E)-1-(2-hlor-1,3-tiazol-5-ilmetil)-3-metil-

2-nitrogvanidinMolekulskaformula C6H8ClN5O2SMolekulskamasa 249,68gmol-1

Izgled bezbojnikristalibezmirisaGustina 1,61gmL-1na20°C

Tačkatopljenja 179°C

Perzistentnost6mesecina40ºC

1godinuna25ºC


voda

aceton

metanol

dihlormetan

0,327gL-1

15,22gL-1

6,62gL-1

1,32gL-1


7,94

Tabela 2.10.SredstvazazaštitubiljauRSuprometu2013.godinesaklotianidinomkaoaktivnom supstancom


Poncho600

Bayer

kukuruzlarve kukuruzove zlatice

žičnjacisuncokret

PonchoBeta

(klotianidin+beta-ciflutrin)šećernarepa repinbuvač

crnarepinavašModesto

(klotianidin+betaciflutrin)uljanarepica repičinaosa

Apache Sumitomo kruška običnakruškinabuva

23

Pavle Jovanov

2.2.6 Acetamiprid

Acetamipridjeinsekticidsasistemičnimdelovanjemkojiseprimenjujezalivanjem,pagabilj-kausvajakorenovimsistemomizzemljišta,ilifolijalno,odnosnoprekolišća.Koristisezakontroluštetočinanarazličitimusevima(tabela2.12).Relativnojestabilanprihidroliziifotodegradacijinasunčevojsvetlosti.Rastvorljivjeuvodi,umerenosevezujezaorganskematerijeuzemljištu,alisebrzoraspada(1-8dana)[65,66].

Prviputjeregistrovan1995.godineuJapanu,gdesedodanasnajintenzivnijeprimenjuje.NatržištegajeuvelafirmaNippon Soda Co.(Japan)1995.godine[57].

Acetamipridizazivaštetneposledicezapčeleuvisokimkoncentracijamaodnekolikomgpopčeli.Letalnadozazaacetamipridje7,1mgpopčeli(24satanakonprimeneinsekticida),štoznačidajeletalnadozaacetamipridaoko400putavećanegozaimidakloprid.Glavnidegradacioniproiz-vodiacetamipridaubiljkama(N-dimetilacetamiprid,6-hloropiridilmetil-alkohol i6-hlornikotinskakiselina)suveomaotrovnizapčele[59].Acetamipridimaniskutoksičnostzasisare.Toksičnostacet-amipridazavodeneorganizmejeniska,alijeotrovanzaptice.EPAgasvrstavauEgrupukancero-gena,tj.usupstancekojenisukancerogenezaljudskiorganizam.Strukturnaformulaacetamipridajeprikazananaslici2.8,anekefizičko-hemijskeosobinedatesuutabeli2.11.

Slika 2.8.Strukturnaformulaacetamiprida

24


Tabela 2.11.Fizičko-hemijskeosobineacetamiprida

NazivpoIUPAC-u N1-((6-hlor-3-piridil)metil)-N2-cijano-N1-metil-acetamidinMolekulskaformula C10H11ClN4


Izgled čvrstbeliprahGustina 1,33gmL-1

Tačkatopljenja 98,9°CNaponpare 1·10-6 Pa na25°C

Rastvorljivost na25°C

voda

heksan

ksilen

benzen

dihlorometan

hloroform

metanol

etanol

aceton

acetonitril

tetrahidrofuran

etilacetat

4,25gL-1

6,54mgL-1

40,1gL-1

24,4gL-1

>200gL-1

>200gL-1

>200gL-1

>200g L-1

>200gL-1

>200gL-1

>200gL-1

37,8gL-1


6,27

25

Pavle Jovanov

Tabela 2.12.SredstvazazaštitubiljauRSuprometu2013.godinesaacetamipridomkao

aktivnomsupstancom


Tonus Galenika

kruška kruškinebuvejabuka

lisnevaši

breskvanektarina

šljivakupusduvanpaprikakrompir krompirovazlaticagrašak graškovžižak

Evespilan CNCCJCduvan lisnevašikrompir krompirovazlatica

Mospilan20 Nippon Soda

duvan tripsi

lisnevaši

krompir krompirovazlaticaparadajz leptirastabelavaškupus

lisnevaši

jabuka minerijabukinsmotavac

vinovaloza žutiipepeljastigrozdovmoljac

Afinex Sinochemkrompir krompirovazlaticajabuka lisnevaši

Volley20 Willowoodparadajz leptirastabelavaš

jabukalisnevaši

KestrelMakhteshim

Chemicalmineri

jabukinsmotavacvišnja trešnjinamuva

Gilan20 Luxemburg jabukalisnevaši

Wizzzaard Stockton jabukajabukinsmotavac

26


2.2.7 DinotefuranDinotefuran (slika2.9) je insekticid sistemičnogdelovanja izgrupeneonikotinoida,koji se

koristizakontroluširokogspektraštetočina,kaoštosulisnevaši,mravi,bubašvabe,buve,muve,zrikavciidrugeštetočine[67].Možeseprimenitinališće,zemljište,kutijerasadnikaipirinčanuvoduprskanjem,kvašenjem,emitovanjemibockanjemurupa-tretmanima[68].

Slika 2.9.Strukturnaformuladinotefurana

Dinotefuran je pod patentom u mnogim zemljama, uključujući SAD, Australiju, Kinu,Švajcarsku,EU,IndonezijuiJapan.Dobroserastvarauvodi,arastvaraseiuorganskimrastvaračimakaoštosu:dihlormetan,aceton,metanolietilacetat.StabilanjeuvodenimsistemimanasvimpHvrednostima[67].Utabeli2.13prikazanesunekefizičko-hemijskeosobinedinotefurana[68].

Tabela 2.13.Fizičko-hemijskeosobinedinotefurana

IUPAC-ovnaziv1-metil-2-nitro-3-[(tetrahidro-3-furanil)metil]

guanidinMolekulskaformula C7H14N4O3


Izgled čvrstbeliprahGustina 1,33gmL-1na20°C

Tačkatopljenja 107,5ºCTemperaturaraspadanja 208ºC

Naponpare <1,7·10-6Pana30ºC

Rastvorljivost na25°C

voda:heksan:heptan:ksilen:toluen:

dihlormetan:acetone:metanol:etanol:

etilacetat:

39,8gL-1

9,0·10-6gL-1

10,5·10-6gL-1

0,072gL-1

0,148gL-1

60,9gL-1

57,8gL-1

57,2gL-1

19,4gL-1

5,17gL-1

Koeficijentraspodeleoktanol-voda(Kow) 0,28

27

Pavle Jovanov

2.3 Uloga i značaj pčela

OrganizacijazahranuipoljoprivreduUjedinjenihnacija(eng.Food and Agriculture Organiza-tion–FAO)procenilajedaodusevakojiobezbeđuju90%hranenasvetu70%oprašujupčele.VećinausevauEvropizavisiodoprašivanjainsekata,tese,stoga,ifinansijskadobrobitodoprašivanjausevainsektimaprocenjujenavišehiljadamilijardievra.Imajućiuviduekonomskiiekološkiznačajpčela,razvilaseipotrebazapraćenjemiodržavanjemzdravljapčelinjihkolonija,nesamonalokalnom,većinaglobalnomnivou.Poslednjih10do15godinapčelarisupočelidaprijavljujumasovnauginućapčelaipčelinjihkolonija,naročitouzemljamaEvrope,uključujućiFrancusku,Belgiju,Švajcarsku,Nemačku,VelikuBritaniju,Holandiju,Italiju,Austriju,SlovenijuiŠpaniju[69].USevernojAmerici,gubicipčelinjihkolonijasuprimećeniod2005.godine.AmeričkistručnjacisuovajfenomennazvaliCCDsindrom(eng.Colony Collapse Disorder). Poredmnogihrazličitihfaktorakojimogudado-prinesunastankuovogfenomena,poputintenzivnepoljoprivrede,upotrebepesticida,gladovanja,virusaiklimatskihpromena,trovanjepčelapesticidimakorišćenimnapoljoprivrednimusevima,smatrasejednimodglavnihfaktoraodgovornimzastradanje60%pčelauSjedinjenimAmeričkimDržavama(SAD)prenekolikogodina[70].

Umaju2012.godine,kaodeostrategijezaotkrivanjeuzrokasmanjenjabrojapčelinjihkolonija,Evropskakomisijajeodvojila3,3milionaevra.Studijeispitivanjasusprovedeneu17državačlanicaEvropskeunijeifinalniizveštaj,podnazivom“StopasmrtnostipčelaipraćenjepčelauEvropi”[71],pokazaojedajesistempraćenjauEUslab,kaoidanemadovoljnopodatakakakobiserezultatinadržavnimnivoimamogliuporediti.

Sredinom 2013. godine EU je na osnovu izveštajaAgencije za bezbednost hraneEU (eng.European Food Safety Authority -EFSA)zabranilaupotrebu tripesticida izgrupeneonikotinoida(klotianidin,imidaklopridi tiametoksam)unarednedvegodinezbogsumnjedasuštetnipopčele[72-74].Ministarstvo polјoprivrede, šumarstva i vodoprivredeRS je, takođe, prihvatilo odluku ozabrani.IstraživanjaopesticidimaizgrupeneonikotinoidakojimajeEUograničilaupotrebuponu-dilasuraznovrsnedokaze,odkojihmnogiukazujunaštetanefekatnazajednicepčela.PravilaEUsudasesupstancazakojupostojedokaziuprilognjeneškodlјivosti,makarinebilipotpunopouzdani,suspendujeilidajojseograničiupotreba,dokseneprikupidovoljnodokazazadonošenjetrajneod-luke.Zaprivremenuzabranuimidakloprida,klotianidinaitiametoksamaglasaloje15članicaEU,8jebiloprotiv,a4suostaleuzdržane.Trajnezabranejošnema,štomeđunarodneekološkeorganizacijepoputGreenpeace kritikuju, smatrajući da bi samo takavpotez istinski pomogaou obnavlјanjupopulacijepčela,posebno,ukolikoseznadaneonikotinoidimidaklopridspadauprvihsedamodukupnopetnaestuzročnikasmrtipčela.

Medonosnapčela je jedanodnajpoznatijih insekata i imaznačajnuuloguuprirodi.PripadafamilijiApidae reda Hymenoptera,kojukarakterišemalibrojvrsta.Najpoznatijaod25vrstajeApis mellifera Carnica.Ovupodvrstukarakterišesmirenostivelikaprodukcijameda.

28


JednomprilikomAjnštajnjerekao:”AkopčelanestanesapovršineZemlje,čovekuostajejoščetirigodineživota.Akonemapčela,nemaoprašivanja,nemavišebiljaka,nemavišeživotinja,nemavišeljudi”[75].OvomrečenicomAjnštajnjenaglasioznačajpčelazaživotljudi.Nekeodulogapčelauključujuoprašivanjevelikogbrojabiljaka,stvaranjevelikogspektrapčelinjihproizvoda,kaoifunk-cijubioindikatora.Upotrazizahranompčeleskupljajunektaripolen,pritomoprašujućiznačajanbrojrazličitihbiljaka,zbogčegasemogusmatratiznačajnimfaktoromureproduktivnosti,raznošenjusemenaiukrštanjubiljaka.Poredmeda,pčelesuzaslužnezapostojanjeidrugihproizvodaodznačajazačoveka,poputpolena,voska,propolisaimatičnogmleča.PremapodacimaRepubličkogzavodazastatistikuiz2011.godine,uRSgodišnjeseproizvede4283tmedau306000košnica(uAutonomnojPokrajiniVojvodini 59000košnica) [76].Međutim,vrednost proizvodnjemeda je zanemarljivauodnosunavrednostkojojpčeledoprinoseprioprašivanjubiljaka.Ukupnaekonomskavrednostodoprašivanjajenajmanje10do20putavećauodnosunaproizvodnjumeda.

Pčeleimajuiulogubioindikatora.Sobziromnanjihovuosetljivostnapromenekojesedogađajuuživotnojsredini,njihovizostanakuistojnajčešćepredstavljaidokazzagađenjaživotnesredine[77].

Pitanjegubitkapčelinjihkolonija je idalje jeotvoreno.CCDsindromprviput jeopisanodstranepčelarakaonovifenomenvezanzagubitakpčelinjihkolonija2006.godine.Jednaododlikaovogsindromajestesmanjenjepčelinjihkolonija,što je naročitoizraženotokomzime.Smatrasedadolazidosmrtiodraslihpčelaradilica,kojepostajudezorijentisaneinevraćajuseukošnice.Između2006.i2011.godine,uobičajangubitakkolonijaod15%tokomzimskihmeseciseudvostručio.Mno-gaistraživanjauSADiEUsusprovedenakakobiseotkriouzroknastankaovogfenomena.Teorijeokouzrokanastankaovogsindromauključujunovepatogene,parazite,stresusledorganizacijasamihkolonija,klimatskepromene,nedostatakizvorahrane,bolesti,trovanja,lokalnazagađenjaokolineikorišćenjeinsekticidaupoljoprivredi.

NaosnovuistraživanjakojejesprovelaEFSA,EUjeodrediladvogodišnjuzabranukorišćenjaodređenihpesticida [72-74], jer senjihovaupotrebadovodiuvezusanastankomCCDsindroma.Nasuprottome,EPAjedošladozaključkadasuuzrocipojaveCCDsindomapojavaparazita,sla-baprehrana,pojavabolestiiiscrpljenepčeleradilice[78].EPAje,takođe,pooštrilakriterijumeprioznačavanjutoksičnostipesticidanaambalaži.

Pitanje pravog uzročnikaCCD sindroma i upotreba pesticida neonikotinoida, kaomogućeguzročnikanastankaovogfenomenaostajeotvorenodonekihnovihsaznanjauvezi sa izloženostipčelaovimpesticidima.Različita istraživanjauSADiEUsupokazaladaodređenekoličineneo-nikotinoida,kadasekoristesamiiliukombinacijisadrugimpesticidima,nekimfungicidima[59],uzrokuju dezorijentisanost, smanjenu komunikaciju, smanjenu sposobnost pamćenja i smanjenježivotnogvekapčela[79].Jednoodotvorenihpitanjajesteipravilnaupotrebaneonikotinoida,naročitoutretiranjukorovailiukrasnihbiljakautokucvetanjakadaseoninebismelikoristiti[80].

PoredmogućeguticajaneonikotinoidanaCCDsindrom,pesticidimogudaotrujuvelikibrojpčelausledslučajnihincidenatatokompostupakazaštitebiljailiupotrebepesticidakojisutoksičnizapčele.Tipičniznacitrovanjapesticidimasupčelenasamrtiiliuginulepčeleispredkošnica.

29

Pavle Jovanov

2.4 Ispitivani uzorci

Uovojdisertacijiispitivanisuuzorcimeda,likeraodmeda-mediceidunavskavoda.Najpoznati-jiinajvišekorišćeniprimarnipčelinjiproizvodjemed.Porednjega,primarnepčelinjeproizvodepred-stavljajuivosak,polen,propolis,matičnimlečidrugi.Većinaovihproizvodasekonzumirailikoristiuneobrađenomobliku.Medjeslatka,aromatična,gustamaterija,kojuproizvodemedonosnepčeleizcvetnognektara,mednerosesališćačetinarailistopadnogdrvećailiodslatkogsokaplodovanekihbiljaka[81].

Medonosnepčeleproizvodeprirodnipčelinjimedpretežnoizcvetnognektara.Nektarjeslat-katečnostkojuizlučujunektarije,posebnežlezdesmešteneucvetu.Pčeleotkrivajunektarjezikom,uvlačegauusta,paumedniželudac.Onenektardonoseukošnicuipredajugadrugimpčelama,kojegaprerađujuiodlažuućelijesaća.Utokunarednihnekolikodananektarseoslobađaviškavode,asaharozase,poduticajemenzimainvertaze,razlaženaprostešećereglukozuifruktozu.Konačno,prerađennektarpčelepokrivajubelimvoštanimpoklopcimaćelijasaćaukojimaseonskladišti[82,83].

Medonosnapčela jeekonomskivažan insektzaproizvodnjupolena,meda,matičnogmleča,voskaipropolisaimožedaoprašivelikibrojuseva.Proučavanjeuticajapesticidanamedonosnepčelejeodvelikogznačaja[84],sobziromnatodapčelemogudaintoksicirajucelukoloniju,donosećiukošnicukontaminiranipoleninektar.Takviuticajimogudaremetenjihovesposobnosti,kaoštosupamćenje,orijentacijaiprikupljanjehrane.Utakvimuslovima,pčelanemožedasevratiukolonijukojajepotrebnazanjenopstanak,pamožedaumreurokuodnekolikosati.Nekeodnajvažnijihoso-binamedaopisanesuudaljemtekstu[81-90]:

Higroskopnost –visokakoncentracijašećerauslovljavadajemedizuzetnohigroskopan.Onupijavlaguizvazduhapododređenimuslovimaipostajerazblaženipodložnijifermentaciji.Promenasadržajavodeumedukoji jeizloženvazduhuzavisiodtemperatureirelativnevlažnostivazduha.Visokviskozitetmedauslovljavadasevlagaadsorbovanananjegovojpovršinisporoprenosiumasuproizvoda,takodanapovršinimedamožedoćidorelativnobrzograzvodnjavanja.

Kristalizacija – je prirodniprocespromeneagregatnogstanjameda,kadaonprelaziiztečnogstanjaukristalnumasu.Dokristalizacijedolazijerjemedprezasićenrastvorglukoze,paspontanoočvršćavakristalizacijomsuvišneglukoze.Medbržeprelaziučvrstostanjeukolikojesadržajvodemanji,akoličinaglukozeveća.

Boja meda – sekrećeukontinuiranomrasponuodbledožutedotamnocrvene,pačakidoskorocrne.Zelenkastiodlivcisupriličnočesti.Medpoprimasvetlijubojuučvrstomstanjuuodnosukadajetečan.Veličinakristalautičenaintenzitetbojemeda,odnosnonajfinijikristalimedadajumunajs-vetlijunijansu[85,86].

Miris i ukus – zaviseodporekla i sastavameda. Intenzitetmirisazavisiodvrste ikoličineisparljivihmaterijaizcvetnognektara.Najslađijemedukomeodšećerapreovladavafruktoza.

30


Antibakterijska aktivnost–uslovljenajeprisustvomvodonik-peroksidanastalogdelovanjemenzimakojipčeledodajuputemnektara.Nekicvetniizvoridajudodatnekomponente,kaoštosufla-vonoidiiaromatičnekiseline,štodelimičnoobjašnjavapostojanjevelikihrazlikauantibakterijskojaktivnostimeda.Međutim,razlikeseuglavnommogupripisatirazlikamaukoličiniH2O2umedu,jernektarizrazličitihcvetnihizvorasadržikomponentekojerazlažuvodonik-peroksididestabilizujuenzimkojigaproizvodi.Zagrevanjemedaiznad37°Ctrebaizbegavati,jervodidenaturacijienzimakojikatalizujeproizvodnjuvodonik-peroksida,štosenegativnoodražavauprimenimedausvrhelečenjapacijenata.

Anti-inflamatorno delovanje–histološkestudije izvedenenaeksperimentalnimživotinjamapokazalesudamedposedujeantiinflamatornodejstvo,čakikadainfekcijanijeprisutna.Navedeniučinak se sagledavakroz smanjenjebroja inflamatornihćelija, štopotvrđujekliničkazapažanjaosmanjenjuedemaiumirujućiefekatkadasemedprimenjujenarane.Antiinflamatornodejstvomedapovezujesesasadržajemantioksidanataumedu.

Podsticanje rasta tkiva–poredvelikekoličinešećera,medsadržiširokspektaraminokiselina,vitaminaielemenatautragovima.Studijenaživotinjamailjudimapokazalesudaprimenahranljivihmaterijadovodidopovećanograstagranulacionogtkiva.Poredtoga,med,nanesennaranu,povlačitečnostizrane,paodlivlimfesarastvorenimhranljivimmaterijamaobezbeđujeregeneracijutkiva.

Klinička iskustva–medsekoristiulečenjurazličitihvrstarana,uključujućiihirurškerane,alijenajznačajnijiulečenjuranaodopekotina[87].Istraživanjasupokazaladajemedefikasnijiodostalihproizvodauoporavkuodopekotina, jeromogućavaublažavanjeakutnogzapaljenja ibržezarastanjarana,boljukontroluinfekcije,boljeublažavanjabolaimanjuiritacijarana [88,89].

Sastav meda–medjenajvećimdelomsmešaugljenihhidrataivode.Umanjimkoličinamasadržiorganskekiseline,minerale,vitamine,enzime,antioksidanseidrugematerije.

Šećeri – umedusuzastupljeniuprosekuod75%do80%ičinesmesuglukozeifruktozekaomonosaharidaidrugihsloženihšećera(disaharidaioligosaharida).Glukozaimasposobnostdalakokristalizujeinijehigroskopna,dokjefruktozamonosaharidkojinekristalizuje,veomajehigrosopnaiumeduzastupljenijaodglukoze.Saharozaimaltozasunajzastupljenijisloženišećeriumedu.

Voda – umeduvarirauopseguod15%do23%,štozavisiodizloženostimedavazduhu,kli-matskihuslova,relativnevlažnostivazduha,temperatureukošnici,kaoibiljnogporeklanektara.

Minerali – krećuseod 0,1%do0,2%.Preovladavajukalijum,natrijum,kalcijum,fosfor,hlor,mangan,gvožđe i aluminijum. Ispitivanjemrazličitihvrstamedanigerijskogporeklaotkriveno jedvanaestelemenata(K,Ca,Ti,Cr,Mn,Fe,Ni,Cu,Zn,Se,Br iRb),pričemusunajzastupljenijielementikalijum(1100-2700mgkg-1),kalcijum(152-362mgkg-1)igvožđe(136-407mgkg-1)[90].

Enzimi –Najznačajnijijeenziminvertaza,kojarazlažesaharozunaglukozuifruktozu.Enzimimedaaktivirajuprobavneproceseuorganizmu,stimulišuaktivnostželucaicrevaiolakšavajuunoshranljivihmaterija.

31

Pavle Jovanov

Vitamini –med sadrži tiamin (B1), riboflavin (B2),nikotinamid (B3),pantotenskukiselinu(B5),piridoksin(B6),tokoferole(E),naftohinon(K),askorbinskukiselinu(C)ikaroten(A),aliuveomamalimkoličinama.

Organske kiseline –najzastupljenijeumedusulimunska,vinska,mlečna,mravlja,oksalna,ćilibarna, jabučna,ali idrugekiseline,kojemedudajukiselostsapHvrednostimaod3,2do6,5.Sadržajovihkiselinasekrećeod1%do4%[82].

Umedusemogu,takođe,naćiiostacipesticida[91],teškihmetala(npr.Pb,CdiCr)[92],ni-trobenzenaipetroleuma[93],antibiotika(sulfonamida)[94]idrugihštetnihmaterija.

Medica-sagledavajućiširokupaletuproizvodaodmeda,nadomaćemtržištujedanodza-nimljivijihje tradicionalniproizvodtipalikera,medica,posebnosastanovištanačinanakojiseproizvodiikoji,ukolikopostojikontaminacijamedaneonikotinoidima,stvaraprostorzakontami-nacijuisamemedice.Naime,medicaseproizvodimešanjemodređenekoličinemeda(5-30%)sarakijomodređenogvoćnogsadržaja(kajsija,sljiva,grožđe,itd.),nakončegaseblagozagrevaradiboljegmešanjaiostavljadastojiodređeniperiodprekonzumiranja.OnajesličnaostalimalkoholnimpićimanabazimedapoputDrambuie-aizŠkotske,nastalogmešanjemviskijaimedaiBarenfag-a izNemačke,kojipredstavljamedenilikernabazivotke.Medicaserazlikujeoddrugihalkoholnihpićanabazimeda,jernefermentišetokomprocesadobijanja(medovina),nitisedestilišenakonfermentacije(medovača).Povoljnodelujenacirkulaciju,protivbakterijaivirusa,poboljšavaapetitivarenje.Idealnajezaaperitivikonzumiraserashlađena[95,96].Sobzromnanačindobijanjamedice,neophodnoje,poredkvalitetameda,pratitiizdravstvenubezbednost,fokusiranunaodređivanjeos-tatakapesticidaumedu,odnosnoiproveravatizdravstvenubezbednostfinalnogproizvoda,medice.

Dunavska vodajeodabranakaomatrikszaispitivanjemogućnostiuklanjanjaneonikotinoidaizvodenesredine. DunavjedrugapodužinirekauEvropiposleVolge.IzvireuŠvarcvalduinaputuodoko2850kmdoulivanjauCrnomorekrozdeltuDunavauRumunijiiUkrajiniprotičekrozde-setakzemalja.ZaDunav,glavnizagađivačisuhemijska,prehrambenaiindustrijacelulozeipapira.Ispuštanjaotpadnogilidrugogmaterijalaiztihindustrijapodižunivoneorganskih(Al,As,B,Ba,Cd,Co,Cr,Cu,Fe,Hg,Li,Mn,Mo,Ni,Pb,Se,Sr,V,Zn,TiO2,Fe2O3,MnOiCaCO3)[97,98]iorganskihzagađujućihmaterijapoputpolicikličniharomatičnihugljovodonika,polihlorovanihbifenila[99]isteroida[100]urečnojmreži. Količinanutritijenata,poreklomodđubriva,izdomaćinstavaikanali-zacionih sistema,koji svakodnevno ispuštajuvoduuDunav i dalje jeprevisoka.Osimdirektnoguticajanakoličinuraspoloživogvodenogresursaipotrošnjeusvrhunavodnjavanja,poljoprivrednadelatnostznatnoutičeinakvalitetpovršinskihipodzemnihvoda,imajućiuvidudejstvođubrivaipesticida[101]kojisurastvoreniunjima.Iztograzlogaodabranojedasesadržajodabranihneonikoti-noidaispitaumodeluzorcimavodeDunavazajednosaodabranimmogućnostimanjihovoguklanjana.

32


2.5 Metode pripreme uzoraka

Pripremauzorakazaanalizuključni jekorakuutvrđivanju identiteta iodređivanjukoncen-tracijenepoznatoguzorka.Analitiinterferirajućasupstancasemogurazdvojiti,ukolikomeđunjimapostoji najmanje jedna hemijska ili fizička razlika.Najvažnija tehnika izdvajanja koja se zasnivanaselektivnojpodelianalita i interferirajućesupstance izmeđudvefazekojesenemešajunazivaseekstrakcija[102,103].Mediproizvodinabazimedaspadajuusloženematriksezbogsvogsas-tava, pa je pogodna ekstrakcijaodabranihneonikotinoida iz ovakvogmatriksanajvažniji korakuodređivanjuneonikotinoida[104-106].

Postojivišetipovaekstrakcijakaoštosu:tečno-tečna,tečno-čvrsta,čvrsto-tečnaigasno-čvrstaekstrakcija[107].

Izborrastvaračauprocesuekstrakcijejeveomabitanipotrebnojedaispunjavasledećekriteri-jume:moradaimaniskutačkuključanja,kakobiselakoodstranioizekstraktaitakosprečiliznačajnigubiciisparljivihkomponenatauzorkailimaskiranjekomponenatatokomdaljegispitivanja.Takođe,rastvaračmorabitištoselektivnijipremaanalitu.Nekiodnajčešćekorišćenihrastvaračasu:dihlor-metan,pentan,dietil-etar,heksan,etanol,acetonislični.Osimpomenutih,svevišesekoristiinovaklasarastvarača,kaoštosusuperkritičnifluidi(ugljen-dioksidiazot).Ponekadjematerijalizkogasevršiekstrakcijapotrebnoprethodnopripremitihomogenizacijom,mlevenjem,degazacijom,inak-tivacijomenzima,itd.[103,108].

Nedostaci metoda ekstrakcije organskim rastvaračima su sledeći: pri uklanjanju rastvaračamožedoćidogubitakakomponenti;toksičnostilizapaljivostrastvaračaimogućnostkontaminacijeanalita;formiranjeemulzija;prekrivanjepikovaranoeluirajućihkomponenatapikomrastvaračaprihromatografskojanalizi[108,109].

Jedan od načina redukcije sadržaja neželjenih komponenata u ekstraktu (kao što sumasti,konzervansi) je pažljivo koncentrovanje ekstrakta, zamrzavanje i filtriranje. U cilju sprečavanjastvaranja emulzije tokom ekstrakcije, koja utiče na otežano razdvajanje faza, umesto destilovanevode koristi se zasićen rastvor soli (natrijum-hlorid) za razblaživanje uzorka [110].Za razbijanjeemulzija,možesekoristitiicentrifugiranje.Upotrebomkolonskeilidiskekstrakcijenačvrstojfazimožese,takođe,sprečitiformiranjeemulzija.Ovedvetehnikekorisnesuizapre-koncentrovanjeiprečišćavanjeuzorka[111].

Dok se za ekstrakciju analita iz tečnih uzoraka, pored klasične ekstrakcije organskimrastvaračem,koristeikolonskeilidiskekstrakcijenačvrstojfazi,zaekstrakcijuizčvrstihuzorakako-risteseSoxhlet-ovaekstrakcija[112-114],ekstrakcijaorganskimrastvaračempotpomognutamikro-talasima[115,116],ekstrakcijasuperkritičnimfluidima[117,118],kaoiekstrakcijakorišćenjemjon-skihtečnosti[119].Različitetehnikepripremesekoristeuekstrakcijipesticidaizmeda,uključujućiklasičnutečno-tečnu[120]iekstrakcijunačvrstojfazi[121],ekstrakcijusuperkritičnimtečnostima[122,123],čvrsto-faznumikroekstrakciju[124]iQuEChERSekstrakciju[125].UpripremiuzorakamedasukorišćenjerazličitetehnikepoputmodifikovaneQuEChERSmetodeekstrakcije[126,127]idrugihtehnikakojeobuhvatajuekstrakcijusadihlormetanom[128]ilicikloheksanom[129].Malijebrojistraživanjakojasebaveekstrakcijomneonikotinoidaizmedaivode[126,128,130].

33

Pavle Jovanov

2.5.1 Tečno-tečna ekstrakcija

Principtečno-tečneekstrakcijesebaziranarazdvajanjukomponentizasnovanenarazličitojras-tvorljivostikomponentiudvetečnostikojesenemešaju,najčešćevodeinekogorganskograstvarača.Poovomprincipudolazidoekstrakcijeanalitaizjednetečnefazeudrugu.Razdvajanjesupstanciizsmesepočinjerastvaranjemsupstanceupogodnomrastvaraču,nakončegadolazidoizdvajanjaonihkomponentismesekojesurastvorljiveuodabranomrastvaračuodonihnerastvorljivihuistom[131,132].Uanalizineonikotinoida,tečno-tečnaekstrakcijasekoristizapripremumnogihuzorakapoputmleka,povrća,medaitd.[133-135].

2.5.1.1 Disperzna tečno-tečna mikroekstrakcija

Uposlednjoj deceniji razvila se nova tečno-tečna ekstrakcija [136] pod nazivom disperznatečno-tečnamikroekstrakcija[137-139].DLLMEsezasnivanatrokomponentnojsmeširastvarača,apostupakpodrazumevabrzoubrizgavanjemešavineekstrakcionog(najčešćesavodomnemešivior-ganiskirastvarač[140])idisperznogsredstva(savodommešljiviorganskirastvaračpoputmetanola,acetona iacetonitrila)uvodeni rastvor ispitivanoguzorka,nakončegasestvarazamućenasmesa(mikrokapi).Zbogvelikedodirnepovršineizmeđunemešljivihrastvarača,stanjeravnotežepostižeseveomabrzo,asamimtimiekstrakcija(slika2.10).OvojeujednoiglavnaprednostDLLMEekstrak-cije.Nakonekstrakcijeirazdvajanjafaza[141,142],organskislojsedaljeodvajaianalizira.Pred-nostiDLLMEsulakorukovanje,brzinaekstrakcije,niskacena,visoknivokoncentrovanjaanalitaidovoljnaselektivnost.FaktorikojiutičunaefikasnostDLLMEekstrakcijesu[139,143]:

• Odabir odgovarajućeg ekstrakcionog sredstva - organski rastvarači koji se odabiraju kaoekstrakcionasredstvamorajuimativećugustinuodvodeimogućnostekstrakcijeciljanihanalita.Halogeniugljovodonicipoputhloro-benzena,hloroforma,ugljen-tetrahloiridaitetra-hloroetilena,najčešćesekoristekaoekstrakcionasredstvazbognjihovevelikegustine.

• Odgovarajuće disperzno sredstvo-rastvorljivostdisperznogsredstvauekstrakcionomsredstvuivodenomrastvoruuzorkajeonoštogačinipogodnimizvorom.Aceton,metanoliacetonitrilsunajčešćekorišćenadisperznasredstva.

• Zapremina ekstrakcionog sredstva-povećanjemzapremineekstrakcionogsredstvapovećavase i zapremina sedimentacionogostatkakoji nastajenakoncentrifugiranja radiodvajanja faza.Sa porastom sedimentacione zapremine smanjuje semogućnost koncentrovanja analita. Stoga,optimalnazapreminaekstrakcionogsredstvatrebadaobezbedimogućnostkoncentrovanjaanalitaiuistovremedovoljnuzapreminusedimentacionogostatkazadaljuanalizu.Takođe,manjazapr-eminaekstragensamožedovestidonepotpuneekstrakcije,zbognepovoljnogpoložajaravnotežeizbogzasićenjarastvora.

• Zapremina disperznog sredstva-ovazapreminadirektnodelujenaformiranjezamućenograst-vora(voda/disperznosredstvo/ekstrakcionisredstvo),nadisperzijuekstrakcionogsredstvauvode-nufazuinaefikasnostsameekstrakcije.Variranjemzapreminedisperznogsredstvamenjaseizapreminasedimentacionogostatka,paje,stoga,neophodnoistovremenomenjatizapreminuekstrakcionogsredstva,kakobiseobezbedilakonstantnazapreminasedimentacionogdela.

34


NedostaciDLLMEseogledajuunepostojanjudovoljnogbrojaekstrakcionihsredstavakojazadovoljavaju gorenavedene uslove.Upotreba disperznog sredstvamože da komplikuje procesrazdvajanja faza, pa se, samim tim, centrifugiranje smatra obaveznim delom ove ekstrakcije.Takođe,centrifugiranjevelikihzapreminamožebititeško.Rukovodećisepotrebomdasenedostaciprevaziđu,istraživačimodifikujuprvobitniprincipDLLME,uključujućiekstrakcionasredstvakojasulakšaodvodekaonaprimerjonsketečnosti[144],kaoiizostavljanjedisperznihsredstava,odnos-nopotrebezacentrifugiranjem[145,146].

OdsvognastankaDLLMEsekoristiuanalizimnogihjedinjenjapoputfenola[147],trihalo-metana[148],karbamata[149,150],organohlornih[104]iorganofosfornihpesticida[151,152],neo-nikotinoida[153-156]iantibiotika[157].PostojirelativnomalibrojliteraturnihpodatakaokorišćenjuDLLMEzapripremuuzorakameda[104,123,140,151,158].

Slika 2.10.ShematskiprikazDLLME

2.5.2 Ekstrakcija na čvrstoj fazi

Primenaekstrakcijenačvrstojfazi(eng.solid phase extraction-SPE)jevišestruka.Koristiseuanalizihrane,vode,zemljištaivazduha[159].UzorcipripremljeniSPEdaljesemoguanaliziratihromatografskimimnogimdrugimtehnikama.Uovojekstrakcijiuzorakprolazikrozkolonukojasadržičvrstusupstancukojaimasposobnostdaadsorbujeanalit[160].Zatečneuzorkečvrstinosač adsorbensasenalaziiliukoloniilinadisku.Izboradsorbensajeodređenvrstomanalitaimatriksa.Kodovevrsteekstrakcijakoristisemanjazapreminauzorkairastvarača(potrebnesamozaelu-iranje),manjisuigubicijerjeanalitsvevremefiksirannačvrstojfaziukoloni,lakšejeizvođenjeparalelneiautomatskeekstrakcije,štosvezajednoičiniprednostovevrsteekstrakcijenadtečno-tečnomekstrakcijom.Adsorbensjesmeštenupolietilenskucevsapolietilenskimiličeličnimkrajevi-ma,takodačitavakolonapodsećanašpricučijemsedonjemdelunalaziodređenakoličinaadsorbensa.Postojekolonerazličitihzapreminaikapaciteta,kojisemoguprimenjivatiuzavisnostiodkoličineuzorkakojiseanalizira.Većakoličinaadsorbentaomogućavavećikapacitet,definisankaokoličinasupstancekojamožebitiadsorbovananakoloni.Većamasaadsorbensazahtevaivećuzapreminu

35

Pavle Jovanov

rastvaračazaeluiranjeanalita sakolone.Maksimalnikapacitetzapolarne inepolarneadsorbensejeoko5%odmasesorbensa.Naprimer,5mgsupstancemožeseadsorbovatina100mgpunjenjakolone.Međutim,uukupnumasusupstanceulazeikomponentematriksa,štoznačidajeefektivnikapacitetzaispitivanusupstancumnogomanjizadatukolonu.Minimalnazapreminazaeluiranjetrebadabudenajmanjedvaputavećaodzapreminepunjenjakolone[161,162].

Ekstrakcijana čvrstoj fazi skraćujevreme trajanja analize, a poseduje i veliki potencijal zaautomatizacijučitavogprocesaekstrakcije.SPEpružavelikidijapazonadsorbenasazapolarne,nepo-larneijonskeinterakcije.Postojivišeopštihmehanizmaretencijekojiseprimenjujuučvrsto-faznojekstrakciji:hidrofobni,polarni,jonoizmenjivački,ekskluzioniiafinitetni.Izbormehanizmaekstrak-cijeprvenstvenojezasnovannaprisutnimfunkcionalnimgrupamauodnosunaanalitisastavmatrik-sa.VezivanjeanalitazaadsorbensmožebitislabimVanderWaalsovimsilama,interakcijamajon-jon,dipol-dipol,jon-dipolidipolarnimprivlačenjemprekovodoničnihveza.UpotrebaSPEomogućavaosetljivijudetekcijuanalitauodnosunaostaletipoveekstrakcije.Ekstrakcijanačvrstojfaziseizvodiučetiriosnovnakoraka[159,163,164]:

Kondicioniranje jeprocespripremekolonezaekstrakcijuuzorka.Ovimprocesomseaktiviraslojsorbensaukolonipropuštanjemodređenezapreminerastvarača.Ukolikojeuzorakvodenirast-vor,ondaseaktivacijavršinajpreorganskimrastvaračem,naprimermetanolom.

Nanošenje uzorka se vrši neposredno posle aktivacije kolone. Propuštanjem uzorka krozkolonudolazidovezivanjaanalitazaslojadsorbensa,dokvećinasupstanciizmatriksaprolazibezzadržavanja.Druginačinjevezivanjeinterferirajućihsupstancizaslojadsorbensa,dokianalitpro-lazibezzadržavanja.

Ispiranje sevršidabisedodatnoodstranileinterferirajućekomponentematriksa,ostavljajućianalitnaadsorbensu.

Eluiranje se vrši specifičnimorganskim rastvaračemda bi se desorbovao analit.Rastvaračraskidavezeanalit/sorbentinatajnačinanalitostajeslobodanuorganskomrastvaraču.

Zaispitivanjeneonikotinoidaurazličitimuzorcima,poputpovrća,medaimleka,zapripremuuzorakanajčešćesekoristeekstrakcijanačvrstojfazi[165-167]ilikombinacijaekstrakcijenačvrstojfaziitečno-tečneekstrakcije[129,165,168,169].

2.5.2.1 QuEChERS ekstrakcija

Anastassiades et al. [127]publikovali suveoma efikasan način upotrebeSPE sorbenata zauklanjanje koekstrahovanih supstanci izmatriksa - QuEChERS(akronimkojioznačavabrzu-laku-jeftinu-efikasnu-robustnu-bezbednumetodu,eng.Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe).Nakontečno-tečneekstrakcije,različitisorbentiseizmućkajusajednimdelomsirovogekstrakta.Ovajpostupaksenazivadisperzivnaekstrakcijanačvrstojfazi(eng.dispersive solid phase extraction-DSPE).Zaodređivanjesadržajakoekstrahovanihsupstancikorišćenajegravimetrija,agasnahromatografi-jasamasenomspektrometrijom(GC-MS)zaodređivanjesupstanciuekstraktukojesuzadržali

36


različitisorbenti-grafitiziraniugljeničnisorbent(GCB),primarnosekundarniamin(PSA),ami-nopropil (-NH2) i alumina-N sorbenti.Gravimetrijskaanaliza jepokazaladaPSAuvećojmeri uklanjakoekstrahovanesupstancenegoaminopropilialumina-N,jerPSAimaznatnovećikapacitetzahvaljujući prisustvu primarnih i sekundarnih amino funkcionalnih grupa. PSA je slab anjonskiizmenjivač,sposobandauklonimasnekiseline,šećere,kaoidrugekoekstrahovanesupstance,kojesusposobnedagradevodoničneveze.Zauzorkesavisokimsadržajemkarotenoida(spanać,zelenasalataidr.)DSPEseizvodiukombinacijisaPSAiGCB.Grafitiziraniugljeničnisorbentzadržava pesticideplanarnestrukture,kaoštosutiabendazol,ciprodinilihlorotalonil,štodovodidosniženjaanalitičkogprinosa.PrinoszavisiiodtipamatriksaiodkoličinedodatogGCB.QuEChERSmulti-rezidualnametodaukombinacijisaC18iPSAsorbentimajeuspešno primenjena za određivanjemnogih ostataka pesticida u različitim matriksima. Mnoge laboratorije i danas modifikujuQuEChERS metoduuciljuprilagođavanjasopstvenimspecifičnimpotrebama. Među njima je iholandskiinspektoratzazdravstvenuzaštituuAmsterdamu,kojikoristiQuEChERSzaodređivanjepreko400pesticidauhrani[170].QuEChERSekstrakcijaimaširokuprimenuuodređivanjupesti-cida[171-173],izmeđuostalihineonikotinoida[174-177].

2.5.3 Ostale odabrane tehnike ekstrakcije neonikotinoida

Mikroekstrakcijanačvrstojfazi(eng.solid phase microextraction-SPME)jetehnikakojajenašlaprimenuiupripremiuzorakamedazaispitivanjepesticida[124].Uovojtehnici,zapri-kupljanjeisparljivihjedinjenjaizuzorkakoristisevlaknoodkvarcnogstakla(1ili2cmdužine)obloženopolimernimfilmom.Vlakno je smešteno unutar igle. Postupak podrazumevaubrizga-vanjevlaknapomoćuigleuprostoriznadčvrstoguzorkailipotapanjedirektnoutečniuzorakkojijesmeštenuSPMEbočiciizatvorenseptumom.Nakontačnoodređenogvremena,potrebnogdaseciljnekomponenteapsorbujunavlakno,vlaknoseizvlačiikomponentesedesorbujudirektnouGC-MS.SPMEvlaknoserekondicionirazagrevanjemuinjekcionomdeluGCutrajanjuod5-15min.PrednostiSPMEtehnike:brzailakazaizvođenje,izvodisebezupotreberastvarača,pogod-najezabrzopoređenjeuzorakailiidentifikacijuodređenekomponenteuuzorku.Nedostaciovetehnikesu:profilsakupljenihisparljivihjedinjenjazavisiodtipa,debljineidužineupotrebljenogvlakna,kaoiodvremenauzorkovanjaitemperature,pajeuslučajukadaseželivršitipoređenjenajboljekoristitiistovlaknozasveuzorkekojiseporede[118,178].

Jednaodnajnovijihmetodaekstrakcijejeekstrakcijasuperkritičnimfluidima(eng.super-critical fluid extraction-SFE)[179].Promenompritiskatokomekstrakcije,modifikujeseekstrak-cionamoćsuperkritičnogfluida(npr.ugljen-dioksid)inatajnačinpostižeželjeniprofilekstrakta.SFEseprimenjujenačvrstimiliviskoznimmatriksima.Selektivnostsemožepostićipodešavanjemuslovaekstrakcije:pritiska(povećanjempritiskapovećavasegustinaCO2,atimeinjegovaekstrak-ciona moć), temperature (povećanjem temperature povećava se isparljivost najisparljivijih kom-ponenata, ali i smanjuje gustinaCO2), kao i dodatkommodifikatora, kao što sumetanol i etanol(poboljšavaseekstrakcijapolarnihkomponenata).PrednostiSFEsu:upotrebanetoksičnograstvaračakojinezaostajeuekstraktu,većaselektivnostekstrakcije,kraćevremeekstrakcije,sprečenenega-

37

Pavle Jovanov

tivnedegradacionereakcijetermolabilnihkomponentiikomponentiosetljivihnaprisustvokiseonika.Nedostatakovetehnikejeutomešto je potrebnoodreditioptimalneuslovetemperature,pritiskaiprotokazasvakipojedinačniuzorak,štočinirazvojmetodevremenskizahtevnim.Ovatehnikajenašlasvojuprimenuiupripremiuzorakamedazaodređivanjepesticida[122,123].

2.5.4 Nanomaterijali kao mogući adsorbensi

Nanotehnologijasemožedefinisatikaonaukaiinženjeringuključeniuprojektovanje,sintezu,karakterizacijuiprimenumaterijalaiuređaja,čijanajmanjafunkcionalnaorganizacijaubarjednojdimenzijijenanometarskaskala.Rečnanopotičeodgrčkerečinanos,štoznačipatuljak.Radiseovrlomalimveličinama.Rasponunanosvetubeležisenaskaliod1nmdo100nm[180].Materijalinanometarskihdimenzijamogusenaćiuprirodi,atmosferi,proteinima,enzimima iDNK.Širokeoblastiprimenenanotehnologijeobuhvatajuosnovnefenomeneiprocesenanoskale,nanomaterijale,nanouređajeisisteme,instrumentaciju,meteorologiju,standardezananotehnologiju,nanomanufak-turuidruštvenestudijeprednostiirizikananotehnologije[181,182].

Ciljnanotehnologijejestedaseiskoristeosobinenanostrukturanaatomskomimolekularnomnivou,kakobisesanjimastvaralinovimaterijaliinovestrukturekojebisemoglekoristitiuraznimoblastimanaukeitehnologijekaoštosu:medicina,hemija,fizika,biologija,mašinstvoielektronika[183-185].

Materijali u nanoskali zadržavaju sve fizičko-hemijske karakteristike materijala na makronivou.Prednostinanomaterijalaogledajuseuboljojotpornostinahemikalije,poboljšanojčvrstoći,boljojbiokompatibilnosti,boljojotpornostinasmicanjeivećojhidrofobnosti[186].

Postojivišepodelananomaterijala,anekeodnjihsupremaporeklu(prirodniiantropogeni),hemijskomsastavu(organskiineorganski)iveličini(nulto-,jedno-,dvo-itrodimenzionalne).Ujed-nodimenzionalnenanomaterijalespadaju:nanovlakna(eng.nanofibers),nanožice(eng. nanowires),nanotrake(eng. nanobelts),nanošipke(eng. nanorods)inanocevi(eng. nanotubes).

Najpoznatijastrukturananocevi izgrađena jeodatomaugljenika.Ugljeničnenanocevi (eng. carbon nanotube–CNT)sudugi,tankicilindriugljenika,kojisemoguposmatratikaolistgrafitakojisenazivagrafen(šestougaonarešetkaugljenika)savijenucilindar[187].Uzavisnostiodosepokojojjesavijenamreža,razlikujemodvatipananocevi:jednoslojneugljeničnenanocevi(eng. single wall carbon nanotube–SWCNT)ivišezidneugljeničkenanocevi(slika2.11)[188-190].

SWCNTpredstavljajucilindričnestrukturekoje se sastojeod jednoguvijenoggrafitnog lis-tačijinačinuvijanjaodređuje iosnovnekarakteristike tecevi.MWCNTpredstavljajucilindričneugljeničkestrukturekojesesastojeodvišeslojevauvijenihgrafitnihlistova.Oveceviimajurazličiteosobine,jernjihovprečnikidužinanisuistikaokodSWCNT[192-196].

38


Slika 2.11.Izgledvišezidnihugljeničnihnanocevi-MWCNT[191]

Imajući u vidu aktuelnost razvoja i primenenanomaterijala, s jedne strane, kao i značajodređivanjasadržajaneonikotionoidasdruge,došlosenaidejudaseispitamogućnostprimeneMWCNTkaomogućegadsorbensapriuklanjanjuodabranihneonikotinoidaizmatriksavodekojijeveštačkikontaminiranodabranimneonikotinoidima.

2.6 Određivanje neonikotinoida

Zaodređivanjeneonikotinoida,poredodgovarajućetehnikezapripremuuzoraka,neophodnoje odabrati i odgovarajuću tehniku ispitivanja, kako bi se primenomodgovarajućemetodemogliodreditinjihoviostaciurazličitimuzorcima.Unarednomdeludatjeliteraturniprikaznekihodabra-nihmetodazaispitivanjeneonikotinoida.

2.6.1 Spektrofotometrijske metode

Guzsvány et al. [197] razvili su spektrofotometrijskumetoduza istovremenoodređivanjeimidaklopridai6-hloronikotinskekiseline.Imidaklopridjeodređenna249nm,a6-hlornikotinskakiselinana236nm,sagranicamadetekcije (GD)0,32µgmL-1 i0,17µgmL-1, respektivno i sapreciznošćuiskazanomkrozrelativnustandardnudevijaciju(RSD)manjomod1,2%.Metodajerazvijenaradiispitivanjakomercijalnihformulacijanabaziimidakloprida.

2.6.2 Nuklearna magnetna rezonanca i infracrvena spektrometrija

Guillermo et al.[198]suprimeniliinfracrvenuspektrometrijusaFourierovomtransformacijom(FTIR)zaodređivanjaimidaklopridaiznjegovihkomercijalnih formulacija.Metodasezasnivanamerenju površine pika između 1577 i1567cm-1ili merenju visine pikana1572cm-1.DobijenaGD iznosilaje 9µgg-1zakomercijalneformulacijeimidakloprida.

39

Pavle Jovanov

Guzsvány et al. [199]razvilisudvespektroskopskemetode1H(nuklearnamagnetnarezonan-ca)NMRiFTIRzapraćenjedegradacijeacetamiprida.1HNMRmetodajeomogućilaidentifikacijuintermedijera6-hlornikotinskekiseline imravljekiseline.FTIRproceduraomogućila jepraćenjekinetikedegradacijecijanogrupejedinjenja.Dobijenirezultatisupokazalidobroslaganjesakom-parativnimHPLC-MS/MSiHPLC-DADmetodama.

2.6.3 Fluorimetrijske metode

Fluorimetrijskemetodesuveomaselektivneiosetljivezbogvisokogsignal/šum(eng.signal to noise-S/N)odnosasametehnike.

Vílchez et al. [200]predlažufotohemijskiindukovanufluorimetrijsku(PIF)metoduzaosetljivoi brzo određivanjeimidaklopridauuzorcimavode,baziranunahemijskojmodifikacijiimidakloprida(ubaznojsredinipoddejstvomUVzračenjaživinelampe)ufluoroforu,jedinjenjukojeuvodenojsre-dinipokazujefluorescencijusaekscitacionimmaksimumomna334nmiemisionimmaksimumomna337nm.

Vílchez et al. [201]suza određivanje imidakloprida razvili iprotočnu injekcionuanalizu(eng. flow injection analysis–FIA)saPIF-om,pričemusupostiglilinearnikoncentracioniopsegod1,0–60,0ngmL-1 imidakloprida,saRSDod2,1%iGDod0,3 ngmL-1.

2.6.4 Voltametrijske metode

Elektroanalitičke metode se sve češćekoristeuanalizitragovazbogvisokeosetljivostiisele-ktivnostisametehnike.Impulsnetehnike,presvega,diferencijalnapulsnapolarografija(DPP),dife-rencijalnapulsnavoltametrija(DPV)ipravougaonavoltametrija,kojasemožekombinovatiisastrip-inganalizom,dajuniskegranicedetekcije,širokdinamičkiopseg,dobrupreciznost,uzniže troškove sameanalize.Njihovaosetljivostiselektivnostsemogupoboljšatiprimenomprotočnihsistemailiuključivanjemfotoreaktora.

Navalón et al. [202] ispituju uticaj pH vrednosti na polarografsko ponašanje imidaklopri-daprimenjujućiDPPmetodu,kojukoristezaodređivanjesadržajaimidaklopridaukomercijalnomproizvoduGaucho.Granicadetekcijemetodeiznosi4ngmL-1 pripH8,0.

Blanc et al. [203] opisuju DPV metodu za određivanje imidakloprida. Granica detekcijemetodeiznosi4,54·10-10molL-1.

Guiberteau et al. [204]surazradilielektroanalitičku metodu za detekciju i određivanjeimida-klopridaurečnojvodipomoćuadsorpcionestripingvoltametrijesapravougaonimtalasomnavisećojkapi žive (eng. hanging mercury drop electrode–HMDE)uvodenomrastvoru Britton-Robinsonpufera kao pomoćnog elektrolita. Granicadetekcije iznosi1,6·10-8molL-1,agranicaodređivanja(GO)4,1·10-8molL-1.

40


Guzsvány et al. [205] razvili subrzu iosetljivuvoltametrijskumetoduzakarakterizaciju iodređivanje imidakloprida upotrebomvoltametrije sa pravougaonim talasom sa bizmutovomfilmelektrodomuvodenomrastvoruBritton-Robinsonpuferakaopomoćnogelektrolita.Imidaklopridjeodređenukoncentracijskomopseguod0,91–47,48μgmL-1,saGD0,27μgmL-1iGO0,91μgmL-1.RazvijenametodajetestiranatokomsolarnefotolitičkeifotokatalitičkedegradacijeimidaklopridauprisustvuheterogenihkatalizatoranabaziTiO2.SvidobijenirezultatisubilikomparativnisaHPLC-DADmetodom.

2.6.5 Imunohemijske metode

Imunoadsorpcionitestovisavezanimenzimom(ELISAtest)koristesezaodređivanjeneoni-kotinoidaurazličitimuzorcima.ELISAtestjeosetljivaispecifičnatehnika,jednostavnazaizvođenjeipogodnazabrzaterenskaodređivanja.Zasnivasenamikrotitracijama,pričemusepratiobojenosttest-rastvora,usledprisustvaciljnogjedinjenja.Zahvaljujućispecifičnostiiosetljivostisametehnike,velikapažnjaseposvećujerazradiimunohemijskihmetodaanalize.

Wanatabe et al. [206]razvijajuELISAmetodubaziranunamonoklonalnimantitelima(MoAbS)za određivanjeimidakloprida.DirektnikompetitivniELISA(dc-ELISA)testovisapogodnimMoAbSsuispitivaniprilikomodređivanjaimidaklopridauuzorcimavoćaipovrćabezprečišćavanja.

Kim et al. [207]razvijajuELISAtestzaodređivanjetiametoksamauvodi.Triantiserumasuizolovanaizzečevaimunizovanihhapten-KLHkonjugatom.AntiserumisukarakterisaniindirektnomkompetitivnomELISAmetodom.Ispitanisuunakrsnareaktivnost,efektiorganskihrastvarača,pHiuticajjonskejačine.Antiserumjebiospecifičanzatiametoksam.Granicadetekcijeje0,1µgL-1.

Kim et al. [208]razvijajuELISAmetodubaziranunamonoklonalnimantitelima(MoAbS)zaodređivanje imidakloprida. IndirektnikompetitivniELISA(ic-ELISA) testovi sapogodnimantite-limasuprimenjenizaodređivanjeimidaklopridauuzorcimavodeikrastavaca.Efektivnostmetodejebilaod70do120%.Razvijenim icELISA testa sa anti-imidakloprid-MoAbS (E6F3) može se detektovati imidakloprid u koncentraciji od0,1 µgL-1.

Wanatabe et al. [209] razvijajuELISAmetodubaziranunaMoAbSzaodređivanje imida-kloprida i acetamiprida, primenom 3-[5-(nitroiminoimidazolidin-1-ilmetil)-2-piridiltio] propionkiselinskog i 3-[5-(N-)1-cianoiminoetil)-N-metilaminoetil-2-piridiltio]propionkiselinskoghaptenakonjugovanogsagoveđimserumskimalbuminom.DirektnikompetitivniELISAtestovisapogod-nimodgovarajućimMoAbS-imasuprimenjenizaodređivanjeimidaklopridaiacetamipridauvoću i povrćubezprečišćavanjauzoraka,pričemujepostignutaGDvrednostzaimidaklopridiacetamipridod3,3ngmL-1, odnosno1,0ngmL-1.

Watanabe et al.[134]razvijajuELISAmetodubaziranunaMoAbSzaodređivanjeimidak-lopridauuzorcimajabuke.Prinosi(eng. recovery - R)susekretaliizmeđu87,7–112%.UtvrđenojedobroslaganjerezultataELISAtestasakonfirmativnomHPLCmetodom.

Wanatabe et al. [210] su koristiliELISA tehniku za određivanje ostataka imidakloprida u

41

Pavle Jovanov

voćnimsokovima,bezprethodnepripremeuzoraka.Ovajmetodjeomogućioodređivanje5µgL-1 u sokuodjabukei20µgL-1imidaklopridausokuodpomorandže.RSDmetodebilajeispod20%,saprinosimaizmeđu94,2–104,2%.Lažnopozitivnirezulatatinisupronađeni,adobijenirezultatisuukorelacijisarezulatatimadobijenimupotrebomHPLC.

Wanatabe et al.[211]prikazujupotencijalkomercijalnodostupnihELISAkitovazaodređivanjeacetamipridauvoćuipovrćusavelikomosetljivošćuiGDod0,053ngg-1.Autorisuodabralimetanolkaoekstrakcionosredstvozapripremuuzoraka.Prinosidobijeniovommetodomsubiliiznad95%,arezultatisuupoređenisarezultatimadobijenimHPLCtehnikom.

2.6.6 Hromatografske metode

Najčešćeprimenjivanaanalitičkatehnikazaodređivanjeneonikotinoida,premaraspoloživojliteraturi,jestehromatografija,presvegahromatografijakombinovanasadrugimtehnikama.

2.6.6.1 Gasna hromatografija

Razvijenesubrojnemetodeodređivanjapesticidakojesezasnivajunagasnojhromatografiji(GC).Ipak,velikijebrojionihjedinjenjakojasenemogudirektnopratitiGCtehnikom,jersune-dovoljnoisparljivailitermolabilna.Ovakvajedinjenjaseprethodnomorajuprevestiuisparljivoblik.Ovojgrupipripadaivećinaneonikotinoida,madapostojeistraživanjakojaobuhvatajuanalizuneoni-kotinoidagasnomhromatografijom.

Vílchez et al. [212]određuju imidaklopriduuzorcimavode izemljištaprimenomGC-MS.Metodaobuhvataekstrakcijuimidaklopridahloroformom,hidrolizuimidaklopridaubaznojsrediniimerenjauSIMrežimurada(eng. selected ion mode–SIM,praćenjeodabranogjona).PriSIMme-renjima,signalimatriksanisuuticalinarezultat.GDjezauzorkevodebio0,16µgL-1,azauzorkezemljišta1µgkg-1saRSDod0,3–1%,uzprinosod100%.Metodajeprimenjenazakontrolukvalite-tavodaizemljištaGranade.

Navalón et al. [213] su razradili metodu određivanja imidakloprida u povrću (paradajz,krastavac,paprikaizelenibiber)primenomGC-MStehnike.Metodasezasnivanaekstrakcijiimida-klopridadihlormetanomihidroliziimidaklopridaubaznojsredini.PostignutaGOjebila12,5µgL-1,aRSDnanivou125,0µgL-1jebila0,7%.Prinosmetodebiojeizmeđu94,3–105,8%.

Zheng i Liu [47]ispititujustabilnostiimidaklopridakoristećiGC-MStehnikuza proučavanjenjegovehidrolize iidentifikacijudegradacionih proizvoda.Hidrolizaimidaklopridajenajbrža u ba-znojsredni,pričemujeglavnidegradacioniproizvod1-[(6-hlor-3-piridinil)metil]-2-imidazolidon.

Mateu-Sánchez et al. [214] razvijajubrzu i jednostavnuGCmetodu za određivanje acet-amipridauvoćuipovrću.UsvomradukoristeMSikombinovaniMS/MSdetektor.Ekstrakcijusuvršilietil-acetatom,asistemomGC-MS/MSsupostigliGOod0,001mgL-1.Prinosacetamipridajebio82,4–85,7%,aRSDmanjaod12,2%.

42


Ko et al.[215]određivalisuostatkeimidaklopridainjegovihmetabolitauzelenojsalatigas-nomhromatografijomsadetektoromsazahvatomelektrona(eng.electron-capture detector-ECD).Granicedetekcije i određivanjabile su0,015mgL-1, odnosno0,05mgL-1.Prinosi nadvanivoaobogaćivanjasusekretaliizmeđu72,8–108,3%saRSD<8,0%.RezultatisupotvrđeniprimenomGC-MS/MS.

Li et al.[216]supratilismanjenjesadržajaklotianidinauparadajzuizemljištunaotvorenompoljugasnomhromatografijomsaprinosimaizmeđu92i102%iRSDod3–5%.Rezultatiispitivanjasuukazalinavećekoličineklotianidinanapokožiciparadajzauodnosunajezgronadanbranja.

Lozowicka[217]jerazvilamultirezidualnumetoduzaodređivanje153pesticida,međuko-jimaiacetamiprida,umedonosnimpčelamazakojesesumnjalodasuotrovanetokomaplikacijepes-ticidanapoljima.Metodazaodređivanjebilajegasnahromatografijasadualnimselektivnimdetek-torimasazahvatomelektrona.NiskeGD(0,003–0,04µgg-1)iGO(0,005–0,05µgg-1)saproširenommernomnesigurnošću od 28%učinili su ovumetodu pogodnom za ispitivanje ostataka različitihpesticidakodpčelauPoljskoj.Primenomrazvijenemetodeu33uzorkapčelapronađenojeprisustvo14insekticidai3fungicida.

Rossi et al.[218]suodređivalisadržajimidaklopridaumedonosnimpčelama,polenu,traviicveću,kojisubiliuneposrednojokolinitokomsetvesemenakojejebilotretiranoimidaklopridom.Razvijenesudvemetodeodređivanja,HPLC-UViGC-MS.GC-MSjeomogućilapraćenjedegrada-cionihproizvodaimidaklopridauzemljištu.

2.6.6.2 Tečna hromatografija

Zadirektnoodređivanjeteškoisparljivihpesticidainjihovihmetabolita idegradacionihproiz-voda koriste seanalitičke metode bazirane natečnojhromatografijisaodgovarajućimdetektorima.Najvećibrojispitivanjaneonikotinoidaupravosebaziranatečnojhromatografiji.

Fernández-Alba et al. [219] opisuju HPLC-DAD metodu za određivanje ostataka imida-kloprida u povrću u opsegu od 0,01–0,60mg L-1. Prinos metode iznosi 95%, a RSD je 4,7%.Dinamički opsegsekreće između2,0-120,0ng(0,01–0,60mgL-1),dokGDimidakloprida iznosi0,01ngL-1.

Martinez-Galera et al. [220]vrše analizuimidaklopridainjegovogglavnogdegradacionogproizvoda,6-hlornikotinskekiseline(dvajedinjenjaveomasličnepolarnosti),uvodipomoćuHPLC-DADtehnike,kombinujućiielementehemometrike.Koristećigrafičkutehnikuiračunarskialgoritamzasnovannatrodimenzionalnimmatriksima,poboljšalisuselektivnostmetode.Metodasepokazalazadovoljavajućom za određivanje insekticida saprinosomod90–114%.Granice detekcije iznose0,25 µgL-1za 6-hlornikotinskukiselinui0,30µgL-1zaimidakloprid.

Mandić et al. [221] određuju imidakloprid tehnikomHPLC-DAD u uzorcima krompira iluka.Uzorcikrompirasuekstrahovanisamodihlormetanom,doksuekstraktiuzorakalukadodatnoprečišćeninaLC-Florisilkoloni.PostignutesuvrednostiGOzakrompirod0,015mgL-1,azaluk0,012mgL-1,saprinosomod94–99%iRSD5%.

43

Pavle Jovanov

Obana et al.[222]suodredilitriinsekticida,acetamiprid,imidaklopridinitenpiramprimenomHPLC-DADnakonekstrakcijeacetonitrilomukrompiru,paradajzuipatlidžanu.Ekstraktjefiltriranprekoanjonsko-izmjenjivačkogfiltra, apotomprekosilikagelskog sistema za filtriranje. Pesticidisu određeni saprinosomod90%u slučajuacetamipridaiimidaklopridai64–84%uslučajuniten-pirama.RSDjeusvakomslučajubilamanjaod10%,saGOod0,08–0,14mgL-1.

Sing et al.[223]suprimeniliekstrakcijupotpomognutumikrotalasima(eng.microwave-sup-ported extraction)kombinovanusačvrsto-faznomekstrakcijomzasimultanoodređivanjetiametoksa-ma,imidaklopridaikarbendazimausvežemikuvanompovrću(paprika,krompir,bundeva,paradajzi čili) primenom HPLC-DAD i HPLC-MS,saGOuopseguod0,030–0,048µgg-1.Zahvaljujući primenimikrotalasnogekstraktoraprinosmetodejepovećansa37,2–61,4%na68,1–106%,uzRSD<7%.Autorisuustanovilidasekuvanjempovrćaredukujesadržajispitivanihneonikotinoida,pričemujenajizraženijistepensmanjenjasadržajazabeleženuslučajukarbendazimaukuvanimuzor-cimabundeveiparadajza.Ukuvanimmatriksimanisunađenidegradacioniproizvodi.

Blasco et al. [224]opisujumetoduodređivanjaimidaklopridai joštripesticidauuzorcimabreskveinektarinekombinacijomtečnehromatografijesahemijskomjonizacijompriatmosferskompritisku(eng.atmospheric pressure chemical ionization-APCI)imasenimspektrometrijskimdetek-torom,kojiprevazilazivećinunedostatakadrugihdetektora.Razrađenametodaimadinamičkiopsegod0,02–2,00mgL-1,RSD14%iprinosod108%.

Hernández et al. [225] predlažu vrlo brzu, osetljivu, specifičnu i automatizovanumetoduza određivanje35pesticida(međunjimaiimidakloprida)uuzorcimazemljištaipovršinskihvoda.Metoda jebazirananaupotrebikolonezaekstrakcijunačvrstoj fazispregnuteon-line saLC-ESI(elektrosprejjonizacija,eng.electrospray ionization-ESI)-MS/MStehnikom.Koristećisamo1,3mL

profiltriranevodezaanalizu,najvećideopesticidasemožeodreditiinanivoukoncentracijeod25ngL-1priukupnomvremenuanalizeod18min.Ovametoda,zahvaljujućinjenojbrzini,osetljivosti,au-tomatizacijiiodsustvukompleksnihtretiranjaprimarnihuzoraka,smatrasedelotvornomanalitičkom metodom za određivanjepesticidauvodi.

Obana et al. [226]razvilisubrzuijednostavnumetoduza simultanoodređivanjeneonikoti-noidau12različitih uzoraka voćaipovrća.Pripremauzorakasastojalaseuekstrakcijimetanolomiprečišćavanjuekstraktauzpomoćekstrakcionogfilteraodgrafitizovanogugljenikaispunjenogmeta-nolskim rastvorom (20%,v/v).Koncentrovani rastvor, nakon daljeg rastvaranjametanolom, anal-iziranjenaostatkepesticidapomoćuLC-MSuAPCI-pozitivnommodu.RSDsubilenižeod10%zasveponovljenetestove. Predloženametodajebrza,lakoizvodljivaipremaautorimamoglabibitiuvrštenaumetoderedovnogmonitoringaostatakapesticida.

Ferrer et al.[227]opisujuLC-TOF/MSmetoduzaidentifikacijuiodređivanjeacetamiprida,imidaklopridaitiaklopridaubiljnimuzorcima.PrimenjenametodaimaGDod0,002–0,010mgL-1,anađeneGOsubileuopsegu0,02–0,17mgL-1.RSDjeiznosila2–3%tokomjednogdanai5%utokuvećegbrojadana.

44


Martín et al. [228] primenjuju LC-MS/MS kombinovanu tehniku za određivanje sadržaja acetamipridauatmosferistaklenikaiplastenika.AdsorpcijapesticidavršenajenaChromosorb-102kolonivezanojzapersonalniuzorkivačvazduha.Primenjenametodapokazujetačnostod72–92%,RSD2–13%iniskuvrednostGDodnekolikoµgL-1.

Seccia et al.[229]razvilisuLC-MS metoduzaodređivanje četiri neonikotinoida(imidak-loprida,tiametoksama,acetamiprida itiakloprida) usmesiuuzorcima pijaćevode.Zaprečišćavanjeuzoraka korišćenajeekstrakcijanačvrstojfazisaLiChrolutENkolonom.OvommetodompostignutaGOneonikotinoidaiznosilaje0,03µgL-1,saRSD<20%.Istiautoriispitivalisuisadržajpomenutačetirineonikotinoidaumlekugoveda[167].Ekstrakcijauzorakapodrazumevalajeprečišćavanjepri-menomChemElutketridža,aodređivanjejevršenoprimenomHPLC-DAD.Prinosineonikotinoidasusekretaliod85,1–99,7%saRSD<10%.OdređeneGOsusekretaleizmeđu0,01–0,04mgL-1,podudarajućisesaMDKzaneonikotinoideuEU(0,01–0,05mgL-1).

Fidente et al. [128] primenjuju već navedenumetodu Seccia et al.[229]za određivanjepomenutačetirineonikotinoidauuzorcimameda,pričemuzaprečišćavanjekoristeExtrelutNT20kolonu.OvommetodomGDneonikotinoidasubileizmeđu0,01–0,1mgL-1saRSD<10%.

Muccio et al. [165]primenjujuvećnavedenemetodeFidente et al.[128]iSeccia et al.[229]za određivanjepomenuta četiri neonikotinoidauuzorcimapovrća, pri čemuzaprečišćavanje ko-riste,takođe,ExtrelutNT20kolonu.Primarnuekstrakcijuneonikotinoidavršeacetonom,aponovnuekstrakciju dihlormetanom. Kao i u slučajumeda, ovommetodom se neonikotinoidi određuju u opsegu0,1–0,5mgL-1saRSD<10%iprinosomod74,5%do105,0%,nakoncentracijskimnivoimaod0,1mgL-1i1,0mgL-1.

Ruíz de Erenchun et al. [230] razvijaju HPLC metodu, sa pulsnom reduktivnom am-perometrijskom detekcijom, za određivanje imidakloprida i njegovog glavnog degradacionogproizvoda,6-hloronikotinskekiseline,uzemljištu.Granicadetekcijeovemetode iznosi4,56ngmL-1,dokjeRSD3,25%.

Rancan et al. [231]razrađujuhromatografskumetodusapostkolonskimfotohemijskimreak-torom i elektrohemijskom detekcijom za određivanjeimidaklopridainjegovihglavnihdegradacionihproizvoda(olefinskih ihidroksilnihproizvoda)uspajkovanimuzorcimapolena,cvetnihuzoraka ipčela.PostignutevrednostiGOiznosilesu0,053–0,904µgg-1,uzuspešnorazdvajanjedegradacionihproizvoda,štonijeslučajkoduporedneGC-MStehnike.

Wang et al.[153]ispitivalisuprisustvo7neonikotinoidaubraonpirinču,kukuruzu,ovsu i sirkuupotrebomDSPE-DLLME-HPLC-DAD.Sviprinosiiznosilisuizmeđu76-123%saRSDod0,9-12,6%.GDbilajeizmeđu0,002–0,005mgL-1,aGO0,007–0,018mgL-1.

Rahman et al.[177]razvilisumetoduzasnovanunamodifikovanojQuEChERSekstrakcijiitečnojhromatografijisaUVdetektoromuultraljubičastojoblastispektra(HPLC-UV)zaodređivanjedinatefuranainjegovihmetabolitauuzorcimadinje.Dobijenjedobarprinos70,6–93,5%saRSD<10%.GDsekretalauopsegu0,02–0,05mgL-1,dokjeGObilauopsegu0,06–0,16mgL-1.

45

Pavle Jovanov

Mohan et al.[232]suispitivalisadržajtrineonikotinoida(imidakloprida,acetamipridaitiak-loprida)usemenupamukametodomHPLC-UV,koristećiSPEekstrakcionutehniku.GDzaispiti-vaneneonikotinoidebilesuizmeđu5–20mgL-1.

De Oliveira et al.[233]suispitivaliefekatkojiimajurazličitekoncentracijetiametoksa-maiklotianidinanadopaminergičnisistempacovaupotrebomtečnehromatografijesaelektrohe-mijskimdetektorom(HPLC-EC).Ustanovljenojedarazličitekoncentracijeovihneonikotinoidautičunapostsinaptičkinikotinskiacetilholin-receptor.

Vichapong et al. [154] razvili su metodu za određivanje 5 neonikotinoida (acetamiprida,klotianidina,nitenpirama,imidaklopridaitiametoksama)uuzorcimapovršinskihvodaivoćnihso-kovaupotrebomvorteksompotpomognutetečno-tečnemikroekstrakcijesadodatkomemulgujućegrastvoraiHPLCsistemasafotodiodnimdetektorom(eng.photodiode array detector-PAD).Nađenisuoptimalniusloviekstrakcijeipostignutjenizaknivodetekcije(GD,0,1–0,5µgL-1).

Wu et al.[156]suispitivalisadržaj4neonikotinoida(acetamiprida,imidakloprida,tiaklopri-daitiametoksama)uuzorcimaparadajzaikrastavacaupotrebomDSPEiDLLMEsaHPLC-DAD.MetodajeomogućilaGDneonikotinoidaurasponu0,5–0,1ngg-1.

Wu et al.[234]pratilisuostatkeimidaklopridaukupusuizemljištuuzpomoćHPLC-UV.MetodajeomogućilaGDod0,0075mgL-1zakupusi0,003mgL-1zazemljište,savremenompoluraspadaimidaklopridaod3,1danuzemljištui2,2danaukupusu.

Guzsvány et al. [235] su razvilimetoduzasnovanuna tečnojhromatografijikuplovanoj saoptotermičkimdetektorom (eng. thermal lens spectroscopy -TLS) idetektoromodnizadiodazaodređivanjetiametoksama(GO,50µgL-1),imidakloprida(GO,89µgL-1),acetamiprida(GO,10µgL-1)itiakloprida(GO,25µgL-1).KonfirmativnirezultatisudobijeniinaHPLC-DAD.

Abramović et al.[236]suispitivalifotodegradacijutiaklopridapoddejstvomUViUV/H2O2.FotodegradacijatiaklopridajepraćenapomoćuHPLC-DADsistema.Ispitivanjeuklanjanjatiaklopri-daizvodajepokazalodananjegovouklanjanjenajvišeutičeprisustvoHCO3

–.

Tanner et al. [174] su razvili analitičku metodu za simultano određivanje ostataka osamneonikotinoida (acetamiprida,klotianidina,dinotefurana,flonikamida, imidakloprida,nitenpirama,tiaklopridaitiametoksama)i2metabolita(acetamipridaIM2-1iflonikamidaTFNA-AM)umedu,koristećiLC-MS/MS.Autorisu imalidvapristupapripremiuzoraka(QuEChERSiekstrakcijanačvrstojfaziupotrebomChemElutketridža),kojesuistraživali.Finalnametodajeobuhvatalaekstrak-cijuacetonitrilomikasnijeprečišćavanjedisperzionomčvrsto-faznomekstrakcijom–QuEChERS.Prinosiodređivanjasuiznosiliod60–114%,saRSDizmeđu2,7–12,8%.GDiGOsubileuopsezimaod0,6–5,0µgL-1i2,0–10,0µgL-1.Metodajeprimenjenanaispitivanjesadržajaodabranihneoni-kotinoidaumedusapodručjaAustrije,štojerezultiralootkrivanjemacetamiprida,tiaklopridaitia-metoksamaumedu,aliukoncentracijamaispodMDKuEU.

Xie et al. [237]sudetektovali ikvantifikovali6neonikotinoida(dinotefuran, tiametoksam,klotianidin, imidakloprid, acetamiprid i tiakloprid) u kestenu, đumbiru i čaju korišćenjemčvrsto-

46


fazne ekstrakcije sa LC-MS/MS sa praćenje višestruke reakcije (eng. multiple reaction monitoring - MRM) režimu rada. Prinosi su se kretali u opsegu 82,1–108,5%, a GO u opsegu 0,01–0,02 mg L-1. Prisustvo imidakloprida i acetamiprida detektovano je u preko 150 ispitanih uzoraka u kon-centracijama 0,05–3,6 mg L-1.

Lacina et al. [173] su koristili ultratečnu visoke kuplovanu sa vre-menom preleta masenim detektorom (uHPLC-TOF MS) za ispitivanje 2012 pesticida u biljnom ma-terijalu. Za 96% uzoraka GO bila je ≤ 10 µg L-1, a analiza je sprovedena za manje od 24 min.

Xiao et al. [166] razvili su metodu za istovremeno određivanje 7 neonikotinoida u mišićima i jetri goveda. Priprema uzoraka se sastojala u korišćenju automatizovane ekstrakcije rastvaračima pod pritiskom u kombinaciji sa čvrsto-faznom ekstrakcijom. Određivanje je sprovedeno korišćenjem LC-MS/MS u MRM režimu rada. Prinosi odabranih neonikotinoida su se kretali u opsegu 83,2–101,9% sa RSD <10,8%. GD i GO iznosile su 0,8–1,5 µg L-1 i 2,5–5,0 µg L-1.

Xiao et al. [238] su razvili brzu, osetljivu i ekološki prihvatljivu metodu za istovremeno određivanje 7 neonikotinoida (dinotefurana, nitenpirama, tiametoksama, imidakloprida, klotianidina, acetamiprida i tiakloprida) u uzorcima jegulja. Za ekstrakciju je korišćena subkritična ekstrakcija vo-dom. Određivanje odabranih neonikotinoida je izvršeno sa uHPLC-MS/MS u MRM režimu rada sa prinosima u opsegu 84,6–102,0% sa RSD <10,8%. GD i GO iznosile su 0,12–0,36 µg L-1 i 0,42–1,12 µg L-1.

Arienzo et al. [175] su razvili metodu za određivanje 14 pesticida, uključujući i imidakloprid, zasnovan na QuEChERS ekstrakcionoj tehnici i LC-MS/MS u 145 uzoraka povrća u Italiji. Imidak-loprid nije pronađen u količina iznad MDK u EU.

Dujaković et al. [239] su razvili osetljivu metodu za određivanje 14 najzastupljenijih pesticida u RS uključujući insekticide, fungicide i herbicide. Između ostalih, ispitivan je i sadržaj acetamiprida i imidakloprida u površinskim i podzemnim vodama upotrebom LC-MS/MS. Prinosi od 72–129% sa GD u opsegu 0,4–5,5 ng L-1 i GO u opsegu 1,1–18,2 ng L-1 su postignuti za sve ispitivane pesticide.

Yanez et al. [240] razvili su novi metod zasnovan na LC-MS određivanju 7 neonikotinoida (acetamiprida, klotianidina, dinotefurana, imidakloprida, nitenpirama, tiakloprida i tiametoksama) u uzorcima pčelinjeg voska. Odabrani neonikotinoidi su ekstrahovani tečno-tečnom ekstrakcijom sa vodom, a prethodno topljeni u n-heksan/2-propanol smesi. Metoda je rezultirala postizanjem GD 0,4–2,3 µg L-1 i GO 1,5–7,0 µg L-1 odabranih neonikotinoida.

2.7 Imajući u vidu činjenicu da je najveći broj istraživanja neonikotinoida sproveden upra-

vo primenom tečne sa masenom spektometrijom kao detektorom, ove dve tehnike određivanja su detaljnije opisane.

Hromatografski sistem se može podeliti na četiri dela: deo za unos uzorka, mobilnu fazu, stacionarnu fazu i detektor. Zavisno od hromatografske tehnike koja se primenjuje i ova četiri dela se

47

Pavle Jovanov

razlikujuposvojojvažnostiikarakteristikama.Naprimer,ugasnojhromatografiji,injektorjemoždainajbitnijideo,jermorabitiprilagođenkarakteristikamaispitivanihsupstanciiodnjegazavisidaljitokanalize.UHPLCtehnici,injektorjeneophodansamozaunostačnezapremine.

Dvaneophodnadelakojasuzaduženazaodvajanjesupstancisumobilnaistacionarnafaza.UHPLCtehnici,mobilnafazajerastvaračkojiprotičepoddejstvomvisokogpritiska(čakdo1300bara)kakobiosiguraokonstantanprotokireproduktivnoispitivanje,dokjestacionarnafazaupak-ovanaukolonukojamožedapodnesevisokipritisak.Principrazdvajanjasupstanciutečnojhromato-grafijiodvijaseprocesomadsorpcije,raspodeleizmeđudvarastvarača,jonskeizmeneiliraspodelepremaveličinimolekula,pa tako razlikujemoadsorpcionu,afinitetnu,podeonu, jonoizmenjivačkuhromatografijuiekskluzionuhromatografiju.

Tečnahromatografijasemožepodelitipremamehanizmuretencije,nanormalno-faznuhro-matografiju(ipodvrsta:hromatografijasahidrofilniminterakcijama),reverzno-faznuhromatografiju(ipodvrste:hromatografijasagrađenjemjonskihparova,micelarnahromatografija,hromatografijasa hidrofobnim interakcijama), jonoizmenjivačku hromatografiju i afinitetnu hromatografiju. Kodnormalno-fazne hromatografije stacionarna faza je polarna (npr. sadrži vezane amino-, cijano- ilihidroksilnegrupe),dokjemobilnafazanepolarna,pasekoristizaispitivanjepolarnihsupstanciizamnogenepolarnesupstance,kojebisenareverzno-faznojkoloniprejakovezaleililošerazdvojile.Razdvajanjesezasnivanastvaranjuvodoničnihvezailinapolarniminterakcijamaizmeđuispitivanihsupstanci i stacionarne faze,paćepolarnije supstanceeluiratikasnije sakolone.Sadrugestrane,kodreverzno-faznehromatografijestacionarnafazajenepolarna(npr.sadrživezaneugljovodoničnelance),dokjemobilnafazapolarna,pasekoristiuvećinislučajevazaispitivanjenepolarnihsupstan-ci.Razdvajanjesezasnivanahidrofobniminterakcijamaizmeđuispitivanihsupstanciistacionarnefaze,tećenepolarnijesupstanceeluiratikasnijesakolone.

PostojivišetipovadetektorakojisemogunaćiusprezisaHPLC,zavisnoodtipauzorkakojiseispituje.Kvalitativnaidentifikacijasezasnivanapoređenjuretencionihkarakteristika,vremenaizapremine,nepoznatesupstancesanekomreferentnomsupstancom.KodHPLCsesituacijakompli-kuje,jerpostojemnogevarijacijemobilneistacionarnefaze,shodnotome,ivećibrojretencionihkarakteristikajednogjedinjenja,štopredstavljateškoćuprilikomidentifikacije,jerretencionavreme-nanenosesasobomnikakvestrukturneinformacije.KakojeHPLCmanjeefikasnatehnikazasamorazdvajanjesupstanciuodnosunaGC,dobijenipikovisuširi,aizmerenaretencionavremenamanjeprecizna.Precizno i tačnokvantitativnoodređivanjeunajvećojmerizavisiodselektivnostidatogdetektorazbogmogućegpozadinskogšumausleddetektovanihnečistoća.NajvećuprimenuuHPLCtehniciimajuUVdetektori,kojičestonisudovoljnoselektivni,padolazidopreklapanjapikovaprianalizismesa.Fluorescentnidetektorisuosetljivijiiselektivniji,poštojekombinacijaemisioneiap-sorpcionetalasnedužinekarakterističnazadatianalit,aliimjenedostataktajštosuprimenjivisamonaograničenibrojanalita.Umasenojsprektrometrijiidealnekarakteristikeikvantitativnogikvalita-tivnogdetektorasesvodenapružanjepodatakaomolekulskojmasiistrukturiispitivanihjedinjenja[244].

48


Naslici2.12prikazan jeblokdijagramisastavne jedinice tipičnogHPLCsistema,čijećekomponentebitiopisaneunarednomdelu,poštosuvažnezauspešnopovezivanjeiradHPLC-MSsistema.

OsnovnizadatakpumpeuuređajuzaHPLCjestedaobezbediprotokemobilnefazeurasponuod10µLmin-1do2mLmin-1zavisnoodkorišćenoginterfejsazaHPLC-MS,dužine,prečnikako-loneidimenzijačesticačvrstefazeHPLCkolone.Naprimer,ukolikosekoristielektrosprejinterfejsi2,1mmHPLCkolona,pumpatrebadaobezbediprotokesadonjelestviceraspona,dokseprilikomkorišćenjastandardne4,6mmkolonezahtevajuvećiprotoci, što je, takođe, slučajukolikoseko-ristihemijskajonizacijapodatmosferskimpritiskomkaointerfejs.Postojivišetipovakomercijalnodostupnihpumpi,alijenajpopularnijaklipnapumpa.SagledištaMS,pumpanesmedapulsiraimoradaodržavakonstantanprotok, jerpulsiranjemožedaprouzrokujeoscilacijeukupnejonskestruje,kojemogudanavedunapogrešnuinterpretacijumasenihsignala[244].

Slika 2.12.a)Blokdijagramib)sastavnejedinicetipičnogHPLCsistema:1.posudezarastvarače,mobilnefaze,2.degazer,3.gradijentventil,4.mešačmobilnihfaza,5.visoko-pritisnapumpa,6.switchventil,pozicijainjektovanja,6’.switchventil,pozicijaubrizgavanja,7.petlja(loop)injek-tovanjauzorka,8.pred-kolona(zaštitna),9.kolona,10.detektor,11.kompjuter,12.sakupljačot-

padailifrakcija[241]

Zarazlikuodgasnehromatografijeukojojsekoristivišetipovainjektora,utečnojhromato-grafijiseskorouvekkoristisamojedantipinjektora,injektorsapetljom.Injektorsapetljom,ili,kakoganekinazivaju,ventil-injektor(slika2.13),predstavljapogodannačindasetečniuzorakuneseumobilnufazuisadržitzv.petljunominalnezapremine,ukojuseunosiuzorakkorišćenjemšpricazauzorkovanje.Doksepetljapuniuzorkom,mobilnafazasepumpaprekoventilaukolonu,kakobiseodržaoneometanprotokmobilnefazekrozsistemitimeomogućilioptimalniuslovihromatografisanja.Kadajevremezainjektovanje,rotirajućiprekidačsepomera,omogućavajućimobilnojfazidaprodreupetljuiodneseuzoraknavrhhromatografskekolone.Kvantitativnapreciznostceloghromatograf-isanjazavisićeiodtogakolikoisakojomreproduktivnošćusepetljamožeiznovaiiznovapuniti.

49

Pavle Jovanov

Slika 2.13. a) Punjenjeinjektorauzorkom,b)injektovanjeuzorkauhromatografskukolonu[242]

Gledajući iz uglamasene spektrometrije, injektor nije od suštinskog značaja za ispitivanje,izuzevčinjenicedaeventualnimehuriunetiuinjektormoguporemetitiprotokmobilnefazeitimedestabilizovatiodgovormasenogdetektora.

Mobilna faza ili gas nosačugasnoj hromatografiji neučestvujeumehanizmupreraspodelečestica između dve faze, dok u tečnoj hromatografiji interakcija analita samobilnom i stacionar-nomfazomodređujeretencionekarakteristikesamoganalita,pa,stoga,različiteinterakcijesaovimfazamauslovljavajuuspešnostrazdvajanja.ZaHPLCtehniku,mobilnafazamoradabuderastvaračukojojćeseanalitrastvarati.Odabirmobilnefazevršisenaosnovuhemijskeprirodekomponenata(polarnosti,hidrofobnosti,mogućnostigrađenjavodoničnihveza,naelektrisanjaidr.)izuzorkakojejepotrebnorazdvojitiiidentifikovati.Takođe,bitnajeikompatibilnostmobilnefazesadetektorom,naprimer,rastvaračinemešljivisavodom,neisparljivesupstanceisupstancekojegradeadukteilijonskeparovenisukompatibilnesaelektrosprejMSdetektorom,rastvaračikojiapsorbujuuUVsaUVdetektorom,rastvaračikojiselakooksidujuiliredukujusaelektrohemijskim,teškoisparljivisaELSDdetektorom.Naslici2.14prikazanisurastvarači,kaoinjihovapolarnost,kojisenajčešćeko-ristekaomobilnefazepriizvođenjuHPLCanalize[244].

50


Slika 2.14.Shematskiprikazpolarnostinekihrastvarača

VećinaHPLCanalizakoristereverzno-faznuhromatografiju,tj.usloveprikojimajemobilnafazapolarnijaodstacionarne,pričemisedužezadržavajujedinjenjakojaispoljavajuizrazitijihidro-fobni karakter.Nasuprot tome, kod normalno-fazne hromatografije uspostavljaju se polarne inter-akcije(vodoničneveze,jon-dipol,dipol-dipol,dipol-indukovanidipol)imolekulisposobnizaoveinterakcijejačećesevezivati.Čestonijemogućepostićizadovoljavajućerazdvajanjekorišćenjemjednograstvaračakaomobilnefaze,pase,stoga,čestokoristesmeserastvarača.Ukolikosesastavmobilnefazenemenjasavremenom,nezavisnoodtogakolikokomponenatajeonasadržala,režimradamobilnefazesenazivaizokratskim,dokjegradijentnionajukomesesastavmobilnefazemenjasavremenomtrajanjaanalize.Akodatamobilnafazadobrorazdvajapolarnekomponente,značidaseone(dovoljno)dugozadržavajunakoloni.Ato,opet,značidaćesenepolarnijeverovatnovrlokratkozadržavatiieluiratisaniskimfaktorom kapaciteta (k’).Gradijentnaanalizasekoristidabisek’svihkomponentismesesvedenaprihvatljivopseg(1–10,idealno2–5),odnosnodaobezbedidaseijedinjenjakojaseslabovezujudovoljnodugozadrženakoloniidasepostignezadovoljavajućerazdvajanje.Sadrugestrane,dajedinjenjakojasejakovezujueluirajudovoljnobrzo(atakodaseizbegnupredugavremenaanalize,širenjepikovailošaosetljivost)[243,244].Zamešanjerastvaračau određenom odnosu odgovoran je gradijentno-proporcionišući ventil (kod sistema samešanjempriniskompritisku)ilisamepumpe(kodmešanjaprivisokompritisku).RastvaračikojisekoristekaomobilnefazezaHPLCmorajubitiodgovarajućegkvaliteta(HPLCgrade).Ukolikosemobilnefazepripremaju,morajusepriprematiodbidestilovanevodeinakondodatkaodgovarajućekompo-nente,obaveznomorajubitiprofiltriranekrozspecijalnefiltre,kakobisesprečioulazakinajsitnijihnečistoćausistem. UHPLCtehnici,neorganskipuferi,poputnatrijumilikalijum-fosfata,dodajusemobilnojfazi,kakobiseobezbedilazadovoljavajućaretencijajonizabilnihjedinjenja,reproduktivna

51

Pavle Jovanov

retencionavremenaizadovoljavajućioblikpikova.NajefikasnijejekoristitipuferečijajepKavred-nostbliskapHvrednostinakojojćesevršitiispitivanje.Fosfatnipuferisenajčešćekoriste,jerimajutripHregionagdesuefikasni(pH2,7ili12).AcetatnipuferjeefikasanokopH4,aamonijačniokopH9.

Kako je jedna od uloga HPLC-MS interfejsa odstranjivanje mobilne faze, bilo kakvozadržavanjemolekulapuferaunjemumožeometatiraddetektora,takodaHPLC-MSmetodezahteva-jukorišćenjeisparljvihaditivapoputamonijum-acetata.Uticajkojisastavmobilnefazeimanaradinterfejsazavisiodsamihparametaramobilnefaze,kaoštosutačkaključanja,provodljivost,stependegaziranosti(kakobisesprečilapojavamehurauinterfejsu)idrugi.Dizajnnekihinterfejsajetakavdastrujaefluentaneulazidirekno,pravomputanjomdubljeujonskiizvorianalizator.Umestotoga,joniseelektričnimpoljemusmeravajuizlomljenomilikrivolinijskomputanjomdubljeusistem,doksenenaelektrisanekomponente(rastvarač)krećupoinercijiibivajuodstranjene.Jedantakavprimerje „Z-sprej“ interfejs, prikazanna slici2.15,kodkoga jemobilna faza raspršena iznadkonusnogdelazasakupljanjejonapodnaponom,kojiprivlačiodgovarajućinaelektrisanejone,terajućiihdaprođukroznjegaumasenispektrometar,dokmolekulirastvaračaipuferasamoprolazeiznadibivajuispumpanidaljeuotpad.

Slika 2.15.Z-sprejinterfejs[244]

Mobilna faza igra bitnu ulogu pri radu detektora, jer ukoliko se koristi mobilna faza sanečistoćamamakarinanivouod0,000001%,priprotokuod1mLmin-1,dovodiotprilike1ngs-1 supstance do detektora, štomože da prouzrokuje stalnu pojavu pozadinskog šumapri analizi, pajeneophodnokoristitimaksimalnočisterastvaračezamobilnufazu.Ovajmogućiproblemsepre-vazilaziiupotrebomodgovarajućejonizacionetehnikekojajenajčešćetakvadastvarajonevećihvrednostimasa/naelektrisanjeodnosa(m/z)negoštosudobijenevrednostieventualnihnečistoćamo-bilnefaze,kaoimodifikovanjemopsegaskeniranja,kakobibileprikazanesamovećevrednostim/z. VećinaanalizakojesesprovodekorišćenjemHPLCtehnike,najčešćeseizvodenareverzno-faznimsistemima.Najvišekorišćenekolonesadržestacionarnufazuodhemijskimodifikovanogsilicijum-dioksida, čijamodifikacijaodređuje interakcijekoje semoguuspostaviti između stacionarne fazeianalita[245].JednaodmodifikacijaogledaseuvezivanjuC18alkil-grupezapovršinusilike.Za razlikuodgasnehromatografije,ukojojprivisokimtemperaturamastacionarnafazamožeuticatinapojavuvelikogšumaudetektoru,uHPLCtehnicitonijeslučaj,semukolikojepHmobilnefazetakavdauzrokujeraspadanjestacionarnefaze.

52


Odabir pogodnog detektora je od suštinske važnosti u tečnoj hromatografiji visokih per-formansi.Detektorikoji supronašlinajvećuprimenusuUV/DAD,fluorescentni,elektrohemijski,refraktometrijski (eng. refractive index detector - RID), radiohemijski,maseno-sprektrometrijski,NMR,konduktometrijski,detektorrasipanjasvetlostinaisparenomuzorku(eng.evaporativelightscatteringdetector-ELSD)idetektorizabliskuinfracrvenuoblast[244,246,247].

Klasifikacijadetektorasemožeizvršitina:

• Selektivneiopštedetektore;

• Detektoreosetljivenapromenukoncentracijeilimase.

Selektivnidetektoriprateodređenosvojstvokarakterističnozaanalit(apsorpcijauUViliVISpodručju,m/z jona, struja usled elektrohemijske reakcije, fluorescencija i sl.).Univerzalni (opšti)pratesvojstvarastvorakaoceline,npr.indeksprelamanja,sadržajneisparljivihmaterija,elektropro-vodljivostitd.

UHPLCtehniciUVapsorpcijajenačindetektovanjakojisenajvišeprimenjujesaosobinamaiselektivnogiopštegdetektora.Detekcijasezasnivanamerenjuapsorbancijeispitivanesupstancenaodređenojtalasnojdužini,apremaLambert-Beer-ovomzakonuapsorbancijajedirektnopropor-cionalnakoncentracijiispitivanesupstanceurastvoru.Ukolikojepoznatmaksimumapsorpcijeispi-tivanesupstance(λmax),možeseprimenitiUVdetektorkaospecifičanzadatuispitivanusupstancu.

Međutim,UVapsorpcijanepredstavljadovoljnoselektivannačindetektovanja,zbogširegopse-gasupstancikojemoguimatisličanilipribližnoistimaksimumapsorpcijeiveomaširokespektralnetrake-čakiakoseapsorpcionimaksimumirazlikujuzapardesetinanm,trakećeseidaljepreklapati.UtusvrhusekoristiDAD,kojiomogućavapraćenjevišeodnosatalasnihdužinaiapsorbanci.Slaganjetakvihodnosa izmeđureferentnesupstancei ispitivane,omogućavapouzdaniji rezultatslaganja,stimštoseitadanemožepostićimaksimalnapouzdanostudobijenirezultat.Mnogiorganskimole-kulikojiimajuaromatičnustrukturuilikonjugovanedvostrukevezeapsorbujuzračenjeuUVdeluzračenjana254nmiukolikosekoristiovatalasnadužina,takavdetektorsemožesmatratiopštimzaorganskajedinjenja.PostojimogućnostkorišćenjaiindirektneUVdetekcijeukojojsemobilnojfazidodajesupstancakojaapsorbujeuUVdeluspektra.Praćenjemmenjanjapozadinskogsignalakojisesmanjuje,kadasedetektujeispitivanasupstanca,kojaneapsorbujeuUVoblasti,mogućejeapsorbo-vatitakvesupstance.NaprincipuekscitacijeuzorkaUVzračenjemradifluorescentnidetektor.Nakonekscitacijeuzorakemitujezračenjenajčešćevećetalasnedužine,odnosnofluorescira.Određivanjesevršiprekoretencionogvremenaitalasnihdužinaekscitacijeiemisije,čimeseujednopostižeivećaselektivnost.Ovomeideuprilogičinjenicadasamooko10%organskihjedinjenjamožedafluoresciraa,takođe,jemnogoboljiodnosS/N.

JedanodopštihdetektorakojiimavelikuprimenujeRIDdetektor,kojipratipromeneure-frakcionomindeksuefluenta,dokse ispitivanasupstancaeluirakrozkolonu.Intenzitetstrujekojanastajekaoposledicaelektrolitičkeoksidacijeiliredukcijeispitivanesupstancenapovršinielektrodemerielektrohemijskidetektor.Ovidetektorisujakoosetljiviiselektivni.

PoputUVdetektora,masenispektrometarsemožekoristiti ikaoopšti ikaospecifičnide-tektor.Skeniranjemcelogmasenogspektrapostižesedetekcijasvihjonizabilnihkomponenatapridatimuslovima,doksesnimanjemodabranihjonailitandemskommasenomspektrometrijom(MSn)postižespecifičnodetektovanjeispitivanihsupstanci.

53

Pavle Jovanov

Poslednjaklasifikacijaseodnosinaproporcionalnostdetektovanogsignalasakoncentracijomiliukupnomkoličinomispitivanesupstancekojaprođekrozdetektor.Ovaklasifikacijajeodposebnevažnostizakvantitativnoodređivanje.Akoseprotokmobilnefazepoveća,koncentracijaispitivanesupstancekojadolazidokoncentracijskiosetljivogdetektoraostajeista,alisekoličinapristiglesup-stanceujedinicivremenamenja,prouzrokujućidobijanjeužegpikasamanjompovršinom,aistomvisinom[248].

Sa stanovišta maseno-osetljivog detektora, povećanje protoka će, takođe, prouzrokova-ti sužavanjepikova,aliće intenzitetnagloporasti.Podovakvimuslovima,MSsemožeprimenitikaomaseno-osetljividetektor.PrednostikorišćenjaMSkaodetektora,ogledajuseumogućnostimadetektovanja supstanci sa sličnim retencionimkarakteristikama,kao i detektovanja supstancikojese nisu u potpunosti razdvojile tokom hromatografisanja. UpotrebaMS kao detektora omogućilajemnogeprednostiprilikomkorišćenjaHPLCtehnike.Naime,upotrebomkomercijalnodostupnihHPLC-MSinterfejsamogućejeizučavatiširokispektarsupstanci,odniskomolekularnihmetabolitadovisokomolekularnihbiopolimera.MSomogućavaidentifikacijupružanjemmasenihistrukturnihinformacijaoželjenomanalitu.VisokaselektivnostMSomogućavaidentifikacijukomponenatakojesudelimičnorazdvojeneHPLC.Visokaselektivnost,omogućavaiupotrebuizotopnooznačenihanal-ita,kaointernihstandarda,kojizajednosavisokomosetljivošćudetektoraobezbeđujuveomatačnuipreciznukvantitativnuanalizu[248].

2.7.1 Hromatografske karakteristike

Mogućnosti hromatografskog sistema da uspešno razdvoji komponente ispitivanog uzorkazavisićeodperformansisamogsistema,kojesemoguopisatisledećimteoretskimparametrima[244].Vremepotrebnodaseanaliteluirakrozhromatografskukolonunazivase retenciono vreme, tr. Kakoćeovovremezavisitioddužinekoloneiprotokamobilnefaze,korisnijejedasekoristifaktor kapa-citeta, k’, kojipovezujeretencionovremesavremenomeluiranjamobilnefaze,tj.supstancikojesenezadržavajuukoloni,jernemajuinterakcijesastacionarnomfazom,t0.Matematičkazavisnostjeprikazanasledećomjednačinom:

Poželjnojedasevrednostik’ krećuizmeđu1i10.Efikasnostrazdvajanjadvekomponente,naprimer,AiB,izražavase faktorom selektivnosti, α,kojipredstavljaodnosfaktorakapaciteta.

Jošjednamerauspešnostikoja,zarazlikuodselektivnosti,uzimauobziriširenjepikovahro-matografskograzdvajanjajesterezolucija, kojasematematičkimožeopisatisledećomjednačinom:

54


u kojoj su wA i wB širine pikovapribaznoj linijinastalihodgovoromdetektoradvejukomponenti.Efikasnostkolonesemožeprikazatibrojem teoretskih podova, N,kojizavisioddužine kolone, L,iliekvivalentom visine teoretskog poda, H,kojinezavisiodL.MatematičkazavisnostN, tr i wsemožeprikazatisledećomjednačinom:

Ekvivalentvisineteoretskogpoda,H,irezolucija, R,mogusepredstavitisadakao:

u kojoj je k’Bfaktorkapacitetadrugeoddvekomponente,aNbrojteoretskihpodovamerenzatukom-ponentu[249].Ukolikoprimenjenidetektornijedovoljnoselektivan,tj.nemožeseizolovatisignalkojipotičesamoodanaliziranesupstanceizispitivanoguzorka,uspešnostdetektovanjazavisićeodhromatografskerezolucije,kojamoradaomogućisignal,kojisemožeizmeritisadovoljnopouzdan-ostiipreciznosti.VelikaprednostMS-ajenjegovasposobnostdakoristinastalejonesupstancikaoidentifikacionifaktorsvakesupstance,zarazlikuod,naprimer,UVdetektora[244,247,250,251].

Kao i drugim hromatografskim tehnikama, identifikacija komponenataHPLC-om se izvodiupoređivanjem retencionihkarakteristika traženihnepoznatih supstanci sa retencionimkarakteris-tikamareferentnihmaterijalapodistimeksperimentalnimuslovima.Vrločestoseupoređujereten-cionovreme,aliovajparametarsemožepromenitisadužinomkoloneiliprotokommobilnefaze,pa je preporučljivije da se upoređuju faktori kapaciteta koji isključujumoguće opisane promene.Ukolikosekoristisamoovajparametarprilikomidentifikacije,identifikacijamožebitiotežana,jermnogesupstanceposedujupribližnoistevrednostik’.Načindaseprevaziđeovakavproblemležiupromenihromatografskogsistema,štouslučajuHPLCtehnikeznačipromenumobilnefazeiponov-noodređivanjevrednostik’,prilikomčegasupstancekojesuimalepribližnoistevrednostifaktorakapacitetaudrugomsistemurastvaračamoguimativeomarazličitetefaktore,paihjetadamogućelakšeidentifikovati.Potpunijaipouzdanijaidentifikacijasepostižekombinovanjemretencionihkara-kteristikasainformacijamadobijenihodspektrometrijskihdetektora.

DetektorikojipružajunajvišeinformacijasuDADdetektor,kojiomogućavasnimanjecelogUVspektraanalitadok izlazi sakolone iMSdetektor.UVspektaromogućavaodređivanjeklasejedinjenja,pričemuMSpružapodatkeomolekulskimmasama,kaoistrukturnihpodataka[252].

55

Pavle Jovanov

KvantifikacijauHPLCtehnici,svodisenaupoređivanjeintenzitetasignalaanalita(visineilipovršine pika) sa intenzitetom signala nekog referentnog matarijala pod istim eksperimentalnimuslovima.Performansekvantitativne analizemogu se opisati nizomparametara; uključujući šum,granicudetekcije,linearniidinamičkiopseg.Šumsemožedefinisatikaopromenasignaladetektorabezprisustvaanalitautokuvremena.Upraksiodsustvošumauodsustvuanalitajeneuobičajeno,jerkomponentemobilnefaze,varijacijeutemperaturi,oscilacijestrujemoguuzrokovatielektričneilihemijskepromeneuodgovorudetektora,štomožeprouzrokovatipomeranjebaznelinijekojučiniidealniodgovordetektoranasistembezanalita.Intenzitetsignalaanalitauodnosunašumoznačavasekaosignal-šumodnos[253].Linearni opsegpredstavljaopsegukomejesignalanalitalinearnoproporcionalankoličinianalita.Iznadovogopsega,unosvećihkoličinaanalitaprouzrokujepovećanjesignala,alionovišenijeudirektnoproporcionalnomodnosusakoličinomanalita.Tajdeosenazivadinamičkim opsegom iprilikomdostizanja limitadinamičkogopsega,detektornedajevećiodzivsignalanasvevećiunoskoličineanalita,odnosnosmatrasedajedetektorzasićen.

PreciznostitačnostHPLCtehnikesuparametriodnajvećegznačajaprilikomtumačenjadobi-jenihrezultata.OovimparametrimabićevišerečiudeluRezultati i diskusija.

2.8 Masena spektrometrija

Principradamasenogspektrometrazasnivasenarazdvajanjujonizovanihatomailimolekulanaosnovurazlikeuodnosunjihovemasepremanaelektrisanju,m/z.Jonisestvarajuizneutralnihvrstakojedobijajupozitivnoilinegativnonaelektrisanje.Kadaseformiraju,joniseelektrostatičkiusmeravajuumasenianalizator,gdeserazdvajajupo m/z inakrajudetektuju.Masenaspektrometrija,stoga,služizakvantifikacijuatomailimolekula,kaoizadobijanjehemijskihistrukturnihinformaci-jaoodređenommolekulu.Sobziromnatodamolekuliimajurazličitefragmentacioneprofile,naovajnačinmožesedoćidoinformacijaostrukturijedinjenja,osnosnotakoizvršitinjihovaidentifikacija.

Četiriosnovnekomponentemasenogspektrometrasu:sistemzaunošenjeuzorka,jonskiiz-vor,masenianalizatorijonskidetektor.Kodnekihinstrumenatasusistemzaunošenjeuzorkaijonskiizvorkombinovani,doksukodnekihkombinovanimasenianalizatoridetektor.Usvakomslučaju,uzorakprolazikrozistiproces.Uzorakseunosiuinstrumentkrozsistemzaunošenjeuzorka,mole-kuliseujonskomizvorupretvarajuujone,prenegoštoseelektrostatičkiubrzavajupremamasenomanalizatoru.Jonisetadarazdvajajupremanjihovomm/zodnosu umasenomanalizatoru,nakončega

detektorgenerišeelektričnisignal,kojiseprenosinaračunar[244].

Usistemuzaunošenjeuzorkavršiseisparavanje,kakobiseprisutnimolekulipreveliugaso-

vitostanje.Neprelazenužnosvimolekuliugasnufazu(naročitokodESIprivišimprotocima),niti

oninužnoprelazeugasnufazuprejonizacije(kodESI,dolazidoisparavanjajona).Kodnekihvrsta

jonizacijegasovitimolekuli izlažusebombardovanjuelektronimau jonskom izvoru,akao rezul-

tatstvarajusejednostrukoilivišestrukonaelektrisanijoni.Umasenomanalizatorukvadrupoluili

jonskojzamciovijoniserazdvajajupoddejstvompromenljivogmagnetnogpolja,takodasvakoj

vrednostimagnetnogpoljaodgovaraodređenajonskavrstaokarakterisanasvojimodnosomm/z.

56


Ovakorazdvojenejonskevrstestižudodetektorakojiregistrujenjihovoprisustvoirelativnukoncen-

traciju.Umasenomspektrometruidealnekonstrukcije,jonnaputuodjonskogizvoradodetektora

nebismeodasesudarisadrugimjonomilimolekulom,semnamerno,kaonpr.ukolizionojćeliji.

Upraksi,ovojemogućesamopribližnopostićiodržavanjemvisokogvakuuma,ispod10-5torr(mm

Hg)ucelominstrumentu,pričemujesrednjadužinaslobodnogputajonaznatnovećaodputakojibi

jonprevalioodtrenutkastvaranjapriatmosferskompritisku.JednoodneslaganjaHPLCiMSogleda

seučinjenicidaHPLCkoristitečnumobilnufazu,najčešćesaodređenomkoličinomvode,saproto-

komod1mLmin-1,dokmasenispektrometarmoradaradipoduslovimavisokogvakuuma.Posto-

janjeinterfejsakojipovezujedvauređaja,presvega,obezbeđujeuklanjanjeneželjenemobilnefaze,

održavajućikonstantanprotokmaksimalnekoličineanalitauMS.Ovosemorapostićineometajući

radMS-a[244,254,255].

2.8.1 Metode jonizacione

Metodajonizacijepodrazumevamehanizampokomeseodigravajonizacija,dokjejonskiizvor

uređajkojiomogućavadasejonizacijaodigra.Metodejonizacijesu:jonizacijaneutralnogmolekula

izbacivanjemelektrona,apsorpcijomelektrona,protonacijom,katjonizacijom,anjonizacijom,depro-

tonizacijomiliprevođenjemnaelektrisanogmolekulaizkondenzovanefazeugasnufazu.

Metoda jonizacije izbacivanjem elektronapostižese izbacivanjemelektrona iz spoljašnjeg

elektronskogomotačadabisedobilo+1pozitivnonaelektrisanje.Javljasenajčešćekodelektron-

jonizacionih(EI)jonskihizvoraiobičnosevršinarelativnonepolarnimjedinjenjimasamalimmole-

kulskimmasama,akaonjenproizvodnastajevelikibrojfragmentnihjona.

Protonizacija jemetoda jonizacijeukojoj seprotondodajemolekulu, čime sedobija neto

pozitivnonaelektrisanjeod+1posvakomdodatomprotonu.Peptidisečestojonizujumetodompro-

tonizacije.

Deprotonacijajejonizacionametodakodkojesenetonegativnonaelektrisanjeod-1postiže

uklanjanjemprotonaizmolekula.Ovajmehanizamjonizacijeveomajekoristanzajonizacijukiselih

molekula,kaoštosufenoli,karboksilnekiselineisulfonskekiseline.

Katjonizacijajemetodajonizacijekojistvaranaelektrisanikompleksnekovalentnomadicijom

pozitivnonaelektrisanihjonananeutralanmolekul.Korisnajezamolekulekojiseteškoprotonuju.

Vezivanjekatjonakojinijeprotonjemanjekovalentno,takodanaelektrisanjeostajelokalizovanona

katjonu.Ovominimalizujedelokalizacijunaelektrisanjaifragmentacijumolekula.Postižesepomoću

matriksompotpomognutelaserskedesorpcijeijonizacije(eng.matrix-assisted laser desorption/ion-

ization –MALDI), elektrosprej jonizacijom i hemijskom jonizacijom pri atmosferskom pritisku.

Ugljenihidratisuodličnikandidatizakatjonizaciju,aNa+ jeuobičajenikatjon.

57

Pavle Jovanov

Prenos već naelektrisanih jedinjenjaobičnosedešavadesorpcijomiliizbacivanjemnaelek-

trisanevrsteizkondenzovanefazeugasnufazukodMALDIiESIizvora.Metodaapsorpcijeelektro-

naobuhvatanetonegativnonaelektrisanjeod-1,kojesepostižeapsorpcijomilihvatanjemelektrona.

Ovajmehanizamjekarakterističanzamolekulesavisokimafinitetompremaelektronima,poputha-

logenihjedinjenja[244,256].Izborjonskogizvorazavisiodpolarnostiimolekulskemaseispitivanesupstance,kaoštojeprikazanonaslici2.16.

Slika 2.16. Izborjonskogizvorauzavisnostiodpolarnostii molekulskemaseispitivanesupstance

[258]

Problem jonizacije termolabilnih komponenti je delimično prevaziđen bombardovanjembrzimatomima/jonima(eng.fast atom/ion bombardment-FAB),kojesetemeljinačinjenicidajeobezbeđivanjeenergijemolekulubrženegonjegovadekompozicija.UpotrebaFAB-alimitiranajeuslučajuanalizejedinjenjavećihmolekulskihmasa,pajeneophodnoprimenitihemijskemetode,pop-utenzimatskehidrolize,kojaomogućavadobijanjemanjihmolekulskihmasapogodnihzajonizaciju.NeohodniuslovizakorišćenjeFABjonizacijeobuhvatajuikorišćenjeodgovarajućihdetektorakojisuustanjudadetektujuvelikemolekulskemase,poštodetektoripoputelektronskogmultiplikatoraneposedujudovoljnuefikasnost,štoseodražavananabavnucenuuređaja,činećijeveomaskupom.

Elektrosprej jonizacija je jonizacionametodakojaprevazilaziovakveprobleme.Tečnostukojojjerastvorenanalitsepropuštakrozmetalnukapilaru(nebulajzer)naatmosferskompritiskupodvisokimnaponom.Naponnakapilariproizvodielektričnigradijentnafluidu,kojirazdvajatečnostnavisokonaelektrisanekapljice,kojenailazenastrujuazota,kojaomogućavanjihovudesolvataciju

58


naputukamasenomanalizatoru[257].Veličinakapljicasesmanjujedomomentakadakulonovskoodbijanjenapovršinipremašujepovršinskinaponikapljiceeksplodirajuumanjekapljice,ispuštajućijone.Kakosejonizacijaizvodidirektnoizrastvora,termolabilnekoponentemogusejonizovatibeznjihovedegradacije.Zarazlikuoddrugihjonizacionihizvora,većinaproizvedenihjonasuvisokonaelektrisani,štojeodvelikogznačaja,zbogčinjenicedamasenispektrometarmerim/zodnos,pasemaseniopseg instrumentaovimbitnomožepovećati.ShemaelektrosprejHPLC-MS interfejsaprikazanajenaslici2.17.

Slika 2.17. ShemaelektrosprejHPLC-MSinterfejsa[254]

ESIpredstavljatakozvanu“najmekšu”tehnikujonizacije,jerjonipoprimajuniskeenergijepanedolazidofragmentacijeuznačajnojmeri,stogajeprimanjimenergijamajonizacijenamasenomspektrudominantanprotonovanijon[M+H]+.Generalno,supstancekojeseovimjonskimizvorommoguanaliziratisuneutralnailipolarnajedinjenja,kojasemoguprotonovati,deprotonovati,graditiaduktesakatjonimailianjonima,iliposedujupermanentnušaržuinepolarnajedinjenja,kojapodležuoksidacijinavrhuelektrosprejkapilare.Vrstamobilnefaze,pH,viskozitet,provodljivost,površinskinaponipolarnost,značajnoutičunaelektrosprejproces.ESIjemetodakojaserutinskikoristikodanalizepeptida,proteina,ugljenihhidrata,manjiholigonukleotida,veštačkihpolimerailipida.Ele-ktrosprejniskogprotokanazivasejošinanoelektrosprej,nanosprejimikroelektrosprejjonizacija.JonskiizvorjevarijantaESI,gdejesprejkapilaraveomamalaipozicioniranablizuulazaumasenianalizator.Rezultatovihpromenajepovećanaefikasnostismanjenjepotrebnekoličineuzorka[244].

Hemijska jonizacija pri atmosferskom pritisku je važna metoda jonizacije, jer generišejonedirektnoizrastvoraiomogućavaanalizurelativnonepolarnihjedinjenja.Ovajjonskiizvorsenapaja tečnimuzorkom.APCIsadržizagrejani isparivač,kojipomažebrzudesolvataciju i ispara-vanjekapljica,nakončegaseisparenimolekuliprovodedaljekrozovajuređajpriatmosferskompri-tisku.Jonizacijasejavlja,jerjerastvaračekscitovanijonizovanzbogpražnjenjaukoroni.Hemijskajonizacijaanalita jeveomaefikasna, jerseanalitčestosudarasa jonimareagensa,poštosu joniizloženiatmosferskompritisku.

59

Pavle Jovanov

Fotojonizacija pri atmosferskom pritisku postala je važan jonizacioni izvor, jermožedagenerišejonedirektnoizrastvora,samalopozadinskejonizacije,imožedaanalizirarelativnonepo-larnajedinjenja.ČestojeAPPImnogoosetljivijaodESIiAPCIiimavećiodnossignalaišumazbogniže pozadinske jonizacije, što je prouzrokovano visokim jonizacionim potencijalom standardnihrastvarača,kojenejonizujekriptonskalampa.

Matriksom potpomognuta laserska desorpcija i jonizacija je jonski izvor koji je našaonajvećuprimenuuanalizipeptida,proteinaivećinebiomolekula.UpotrebaMALDI-jazaanalizuheterogenihuzorakačinigaveomaatraktivnimzamasenuanalizukompleksnihbiološkihuzoraka.Iako je tačanmehanizamMALDI-janepoznat,veruje sedaMALDIuzrokuje jonizaciju iprenosuzorkaugasnufazulaserskomekscitacijom.

Bombardovanje brzim atomima/jonimajejonizacijasličnaMALDI-jupotomeštokoristimatriksivisokoenergetskizrakčesticazadesorpcijujonasapovršine.RazlikeizmeđuMALDI-jaiFAB-asusledeće:kodMALDI-jaenergetskizrakjepulsnolaserskosvetlo,dokjekodFAB-akon-tinualnijonskizrak;kodMALDI-jamatriksječvrstikristal,akodFABmatriksjetečan.FABjeoko1000putamanjeosetljivodMALDI-ja.

Jonizacija elektronima (eng.electron ionization - EI)jejedanodnajvažnijihjonskihizvorazarutinskeanalizemalih,hidrofobnih,termostabilnihmolekulaiimaširokuupotrebu.PoštoEIobičnoproizvodivelikibrojfragmentnihjona,spadau“tvrde”jonskeizvore.Međutim,informacijeofrag-mentimamogubitiveomakorisne.Korišćenjembazepodatakakojasadržipreko400000masenihspektaradobijenihjonizacijomelektronimamogućejeidentifikovatinepoznatojedinjenjeunekolikosekundi(poduslovomdapostojiubazi).Ovebaze,kombinovanesaračunarskimmemorijskimkapa-citetimaipretraživačkimalgoritmima,omogućavajubrzoupoređivanjesaovimbazama,štouvelikoolakšavaidentifikacijumalihmolekula.

Hemijska jonizacija(CI)seprimenjujenasličneuzorkekaoiEIiprvenstvenosekoristizapovećanjeobilnostimolekularnogjona.CIkoristigasno-faznujon-molekulskureakcijuuvakuumudaproizvedejoneanalita.Procesinicirareagens-gaskojisejonizujesudaromsaelektronima.Dolazidojon-molekulskereakcijeizmeđujonareagens-gasaineutralnihmolekulagasa.Nekiproizvodireakcijemogudareagujusaanalitomiproizvodejone.Takođe,kaokodEI,uzorakmoradabudestabilannapovišenojtemperaturi,jerseisparavanjevršizagrevanjem[244,258].

2.8.2 Razdvajanje jona

Nakonproizvodnjejonakorišćenjemodgovarajućejonizacionemetode,neophodnojerazdvo-jitijonepom/zodnosu,odredititajodnosinakontogaizmeritirelativniintenzitetsvakegrupejona.Sarazvojemmetodajonizacijeuslediojeirazvojmasenihanalizatora,kakobisezadovoljilizahtevianalize širokog spektrabiomolekula sappm tačnošćumerenjamase i saosetljivošćumanjomodfemtomola(10-15mola).

Najvećapreprekaurazvojumasenihanalizatora,bilojespajanjejonskogizvorasaatmosfers-

60


kimpritiskom(760Torr)saanalizatoromukomeseodržavapritisakod10-5do10-11Torr.

Postojivišemasenihanalizatoraodkojihsvakiimasvojeprednostiinedostatke.Performansemasenihanalizatoramogusepredstavitiparametrimakojiuključujurezoluciju,brzinuskeniranjairasponmasa.

Rezolucija je moć analizatora da razlikuje 2 jona različitih odnosa m/z. Veća rezolucijaznači povećanumogućnost razlikovanja jona.Najčešća definicija rezolucije, R, data je sledećomjednačinom:

Rezolucija = M / ΔM

gdejeModnosm/z,aΔMpredstavljaširinupikanapolovininjegovemaksimalnevisine.Rezolucijainstrumenta određuje, do neke mere, tačnost instrumenta. Prosečna molekulska masa se računakorišćenjem izmerene prosečnemase svih izotopa svakog elementa od kojih semolekul sastoji.Monoizotopskamasaseračunakorišćenjemmaseizotopakojijenajprisutnijiumolekulu.Akoin-strumentnemožedarazdvajaizotope,proizvešćeširokpikčijićecentarpredstavljatiprosečnumasu.Većarezolucijamožedadoprineserazdvajanjuizotopaelemenata.

Brzina skeniranjaseodnosinabrzinukojomanalizatorskeniraodređenirasponmasa.Većiniinstrumenatasupotrebnesekundedaizvršiceloskeniranje,aliovomožedrastičnodavarirauzavis-nostiodanalizatora.Naprimer,TOFanalizatorzavršianalizuunekolikomilisekundiilimanje.

Raspon masaseodnosinarasponm/zmasenoganalizatora.Naprimer,kvadrupolnianalizatormožedaskeniram/zdo3000,analizatorsamagnetnimsektoromdo10000,aanalizatorsavremenompreleta,TOF,imaskoroneograničendomet[244].

2.8.3 Maseni analizatori

Utvrđeno je da su izvori jonameđusobno različiti po načinu dobijanja jona. ESI proizvodijoneukontinualnojstrujiistogakvadrupolpredstavljaodgovarajućianalizatorzaESI.MALDI,naprimer,generišejonekratkim,nanosekundskimlaserskimpulsevimaikompatibilanjesaTOFanali-zatorom,kojipreciznomeritajmiranejonskepakete.

Kvadrupolni maseni analizatorisekoristesaEIveomadugo,kaonajčešćekorišćenimasenianalizatori,alisunašlinovuprimenuukombinacijisaESIiAPCI.Kvadrupoliimaju3prednosti.Tolerantnisunarelativnovisokepritiske,merepriličanrasponmasa(m/zdo4000),štojekorisnopriESIanaliziproteinaiostalihbiomolekula(uobičajenem/zsu1000-3500)irelativnosujeftini.Šipke analizatora(slika2.18)suspojeneparalelnonaizvorradiofrekventne(RF)ijednosmernestruje(DC).Suprotnešipkesupovezaneelektričnimputemkaopar.Dvešipke jednogparaubilokojevremeimajupotencijalistogintenziteta,alisuprotnogznaka.RFpoljeomogućavatransmisijujona,aDC(jednosmerni)naponfiltriraodređenum/z.Jonikojinemajustabilnuputanjusesudarajusašipkamainikadanestižudodetektora.Teži(tromiji)joniuglavnomreagujunaDCkomponentupolja,doklakši(brži)jonitakođereagujuinanaizmeničnuRFkomponentu.Jedanparšipkiigraulogufilteragornje

61

Pavle Jovanov

graniceiteratežejoneusredinuizmeđuelektroda.Jonimanjemasereagujubrzo,jednomusvakomciklusu,dokjenetosilaDCiRFkomponentiprivlačnakratkovreme.Ukolikojemasajonadovoljnomala,joniseubrzavajupremajednojodelektrodaiudarajuunjuprenegoštosilaponovopromenismer.Drugiparšipkiigraulogufilteradonjegranice.Jonivećemasećereagovatinaprivlačnusiluiudarićejednuodelektroda.Jonimalemaseće,takođe,osetitiprivlačnusilutokomvećinevremena,alićejednomuciklusu,reagovatinasiluodbijanjaiodbitisepremasrediniizmeđuelektroda.Jonikojiimajustabilnuputanjuikrozfiltergornjegraniceikrozfilterdonjegraniceproćićekrozuskiotvoribitidetektovani.MasenispektarsedobijaskeniranjemodnosaDCiRFpotencijalaisniman-jemobilnostidetektovanihjona.KadaseradisamosaRF(bezsaopštavanjaDCvoltaže),joniširokogopsegam/zprolazekrozanalizator[244].

Slika 2.18.Kvadrupolnimasenianalizator[259]

Tandemska masena analiza(MSn)jetehnikakojapružamogućnostdamasenianalizatorraz-dvajamolekulskejone,proizvodećiiznjihfragmentnejone,čijumasupotommeri.Fragmentnijonislužezastrukturnaodređivanjaizvornihmolekulskihjona.Malajeverovatnoćadasamamolekulskamasa bude dovoljna za određivanje strukture jedinjenja, pa se taj problemprevazilazi upotrebomtandemskemaseneanalize,MSn.Spregnutamasenaanalizajeterminkojipokrivavelikibrojtehnikaukojima se jedan stupanjmasene spektrometrije, nemorabiti prvi, koristi za izolovanje jonaodinteresa,dokdruga faza služi zaodređivanjezavisnosti tog jona saostalimu sistemu [260,261].Trostrukikvadrupol(QqQiliMS/MS)jenajzastupljenijiuređajzaMSntehniku.Hardversesastojiodtrikvadrupolauseriji(slika2.19).Ukolizionućeliju(drugikvadrupol,Q2)ulazijonprekursorizQ1(MS1)iunjojsevršinjegovafragmentacija.Q3(MS2)daljerazdvajadobijenefragmente(uscaniliSIMmodu).ObičnosetandemMSeksperimentiizvodesudaromodabranogjonaatomimainertnihgasova(Ar,He)ifiltriranjemimerenjem(uscaniliSIMmodu)prekursoraiprodukata.MSn sekoristizaodređivanjesekvenceaminokiselina,strukturnihkarakteristikaugljenihhidrata,manjiholigonukleotida,lipida,fenolnihjedinjenja,pesticida,mikotoksina,itd.[244].

Termin“spregnuta”ili“tandemmasenaanaliza”potičeodčinjenicedasuspregnutiuprostoruilivremenu.Spregnutamasenaanalizauprostorusevršiuzastopnomanalizom,doksespregnutamasenaanalizauvremenuvršiuistomanalizatorukojiizolujeinteresnejone,fragmentiraihianalizira.

62


Slika 2.19.Shematrostrukogkvadrupolnogmasenogspektrometra,QqQ

Kvadrupolni maseni analizator sa jonskom zamkomrazvijenjeuistovremekaoikvadru-polnimasenianalizator,izbogtogasuobaanalizatoraslična.Međutim,umasenomanalizatorusajonskomzamkom,joni,umestodaprođukrozkvadrupolnianalizatorpriodgovarajućojelektromag-netnojfrekvencijipolja,bivajuzarobljeniukvadrupolnompolju.Uređajsesastoji odjedneprste-nasteelektrodeidvetanjiraste,kojezatvarajuprstensadonjei gornjestrane,stvarajući tako komoru ukojojsu„zarobljeni“jonirazličitihmasa.Većgenerisanijoniuvodeseuzamku.Variranjempoljajoniseiliskeniraju(izbacujuredom,premam/z,udetektor)ilifiltriraju(odbacujusesvijonisemželjenem/z).Zatimsepodešavanjempoljamožeiniciratikolizijaovihjonasagasomza“hlađenje”,štodovodidofragmentacije.Daljesedobijeniproduktiponovoskenirajuilifiltriraju.Veomakorisnaosobina jonskihzamki jemogućnostdase izoluje jedna jonskavrsta izbacivanjemsvihostalih izzamke.Izolovanijonisedaljemogufragmentovatikolizionomaktivacijomizatimdetektovati.Glav-naprednostkvadrupolnihjonskihzamkijebrzinakojomsemoguizvoditieksperimentidisocijacijaizazvanesudarimabezprisustvadrugihanalizatora.Ostalebitneprednostikvadrupolnihanalizatorasajonskomzamkomsunjihovakompaktnostisposobnostdazarobeiakumulirajujone,kakobisedobioboljijonskisignal[244,263].

Najstarijimasenianalizatori,analizatori sa magnetnim sektorom,surazdvajalijoneumag-netnompolju.Umagnetnojanalizi, joniseubrzavajuumagnetnopoljekoristećielektričnopolje.Naelektrisanačesticaputujekrozmagnetnopoljepokružnojputanji čiji prečnikzavisiodbrzinejona, jačinemagnetnogpoljaim/zodnosajona.Masenispektarsedobijaskeniranjemmagnetnogpoljaipraćenjemjonakakoudarajuofiksiranutačkudetektora.Uciljupovećanjarezolucije,mag-netniinstrumentisumodifikovanidodavanjemelektrostatičkoganalizatorakojifokusirajone.Onisenazivajuinstrumentimasaduplimsektoromilisadvasektora[262].OvianalizatorisadvostrukimfokusiranjemsekoristesaESI,FABiEIjonizacijom,alinemajuširokuprimenu,prvenstvenozbogvelikihdimenzijaiuspehaTOF,kvadrupolnihanalizatorasaESIiMALDIjonizacijama[263].

Maseni analizatori sa vremenom preleta su najjednostavniji maseni analizatori. Oni sudoživeli procvat sa pronalaskomMALDI-ja, a u poslednje vreme primenjuju se sa elektrosprej ielektronskomjonizacijom.TOFanalizajebazirananaubrzanjugrupejonakadetektoru,gdesesvimjonimasaopštavaistakoličinaenergijepomoćurazlikepotencijala.Poštosvijoniimajuistuenergiju,alirazličitumasu,lakšijoniprvistižudodetektorazbognjihovevećebrzine,doktežimjonimatrebaviševremenazbognjihovevećemase i sporijebrzine.Otuda seovi analizatori i zovu“masenimanalizatorimasavremenompreleta”,štoznačidasemasaodređujenaosnovuvremenastizanjajona.Masa,naelektrisanjeikinetičkaenergijajona,igrajuuloguuvremenustizanjadodetektora.Kom-

63

Pavle Jovanov

pletnimasenispektarsedobijanakondovoljnogvremenadasvijonipristignudodetektora.PrednostiTOFuređajajesunjegovavisokarezolucijaibrzinaskeniranja,štogačiniveomapogodnimzaanal-izeHPLC-MStehnikom[263].

2.8.4 Maseni detektori

Nakonštosujonirazdvojeniumasenomanalizatoru,onistižudojonskogdetektora,kojiproiz-vodielektričnisignalnaosnovuupadnihjona.Najčešćekorišćendetektorjeelektronskimultiplika-tor,kojiprenosikinetičkuenergijuupadnih jonanapovršinukojaproizvodisekundarneelektrone(slika2.20).

Elektronski multiplikatorjesastavljenoddinodeodaluminijum-oksida(Al2O3).Joniudarajuopovršinudinode,štoprouzrokujeemisijuelektrona.Ovielektronisezatimkaskadnoumnožavajuucevimultiplikatora.Formirasekaskadaelektrona,kaorezultatcelokupnograstapotencijalananivouodjednogmilionailivišeelektrona[244].

Dinoda visoke energije(eng.high energy dinode-HED)koristiubrzavajućeelektrostatičkopoljedabisegenerisalielektroni.Timeseobezbeđujedaumultiplikatornedospejujoni,kojibigabrzozagadili,negoelektroni.Poštosignalelektronskogmultiplikatoraumnogomezavisiodbrzinejona,HEDslužidauvećasignal,atimeiosetljivost.

Slika 2.20.Shemaelektronskogmultiplikatora[264]

Primenukaodetektor ima iFaradejeva šolja,koja jebazirananaudarima jonaopovršinudiode,kojiprouzrokujuemisijusekundarnihelektrona,koji,dalje,indukujupozitivnonaelektrisanjenadetektoru.Ostalidetektorikojisekoristesu:diodnikonverzionifotomultiplikatori,rednidetektor,naelektrisani(induktivni)detektoridrugi[263-265].

2.8.5 Maseni spektri

Zapotrebeidentifikacijejedinjenjanajčešćesevršiakvizicijauscanrežimu,kojapodrazumevapraćenjeobilnostijonaufunkcijim/z.Tumačenjemasenihspektarapodrazumevapraćenjetokafrag-mentacije,naosnovum/ziobilnostidobijenihfragmenata,čestouzkorišćenjetandemskiheksperi-menata[265].

Kvantitativnaanalizasesastoji,kaoikoddrugihtehnika,uupoređivanjuintenzitetasignalaanalitasaintenzitetimasignalapoznatihkoličinareferentnihmaterijala.Nekiodnačinazadobijanjekvalitativnihpodatakasuproduct ion scan, precursor ion scan, neutral loss, neutral gain,alizakvan-titativnepodatkekoristisesamopraćenjeodabranogjonaipraćenjevišestrukereakcije.Poznavajućim/zanalita,korišćenjemSIMtehnikesepovećavaosetljivostiselektivnostuređaja,kaoibrzinaske-niranjajona.Poželjnojedajonibuduvećegm/zodnosa,kakobisesprečileeventualneinterferenceuzrokovanejonimaizmobilnefazeiliostalihnekarakterističnihjonamatriksa. Praćenjemvišestruke

64


reakcije,prati senastajanjedva fragmentna jona, jednogkoji služi zakvantifikaciju, adrugogzakvalitativnupotvrduispitivanogjedinjenja.JonikojinastajufragmentacijomiliproduktjonikojisebirajuzaMRMsujoninajjačegintezitetaiodređenespecifičnosti.

OvelikojprimeniHPLC-MStehnikesvedočeimnogenaučnepublikacijeobjavljenetokomposlednjedecenije[262,266-268].

2.9 Primena hemometrije u razvoju analitičkih metoda

Hemijskadisciplinakojakoristimatematičke,statističkeidrugelogičkemetodezadizajniranjeiodabiroptimalniheksperimenatai procesamerenja,kakodabisedobiomaksimumrelevantnihin-formacijaanaliziranjemdostupnihhemijskihpodatakanazivasehemometrija[269,270].

Zbog svog sistematičnog pristupa hemometrija je našla primenu i u razvoju i optimizacijianalitičkihmetoda.Klasičanpristupoptimizaciji metode podrazumeva optimizovanje jednog pojednogfaktora,dok seostali faktoriodržavajunakonstantnomnivou.Takavnačinoptimizacijeimamnogenedostatkekaoštosunemogućnostdetektovanjainterakcijerazličitihfaktoraineuzimanjeurazmatranjeuzakopsegvrednostifaktora,kaoidetektovanjevrednostifaktorakoječestonisuipraveoptimalnevrednostiispitivanihfaktora(slika2.21a).

Slika 2.21. Poređenje dobijene i stvarne optimalne vrednosti faktorakod(a) klasičnogpris-tupaoptimizacijimetodei(b)primenomeksperimentalnog dizajna[271]

Sdrugestrane,primenomeksperimentalnogdizajna,svakifaktor se možeispitatiioptimizo-vati uunapreddefinisanom opseguizvođenjem relativnomalogbroja eksperimenata u kojimasevrednostiviše faktoraistovremenomenjaju.Ovimsepostižeistovremenaoptimizacijacelogsistemaiotkrivanje njihove prave optimalne vrednosti, jer seuzima uobzir međusobniuticaj faktora naposmatranisistem(slika2.21b)[271].

65

Pavle Jovanov

2.9.1 Eksperimentalni dizajn

Metodologija planiranja i izvođenja eksperimenata u cilju dobijanjamaksimalne količineinformacijaizšto manjeg broja eksperimenatanazivaseeksperimentalnidizajn[272]. Poznavanjeteorijske osnoveovakvogdizajnajebitnozanjegovodobrosprovođenje.

Smisao eksperimentalnog dizajna se zasniva na opštoj teoriji sistema, po kojoj je sistem ograničenacelinakojasesastojiodulaza, izlaza i transformacijakojesemeđunjimadešavaju.Intenzitetulazaiizlazanazivasenivo.

Ulazi su veličinekojemogu,aliinemoraju,imatiuticajanasistemimogubiti označenikaofaktori.Faktori definišu kaopromenljivekojeutiču naodređeni rezultat ili proces,odnosnoimajuuticaja na sistem. Izlazi su veličine na koje može, ali i ne mora,da utičesistem. Izlazinakojesistemimauticajanazivajuseodzivisistema.Vezuizmeđufaktoraiodzivasistemapredstavljatrans-formacija.Funkcija odziva ilimatematički model je matematička funkcijakojaopisujeponašanjesistemai povezujenivoefaktorainivoeodziva sistema[273,274].

Najjednostavnijimatematičkimodelkojipovezujefaktore(nezavisnopromenljive, označenesa x1, x2...xn)iodziv sistema (zavisno promenjivu, označenu say) jestelinearnimodelilipolinomprvogreda:

y= b0+ b1x1+ b2x2+ b3x3+...+bnxn+ ε

gde jen ukupan broj faktora, ε greška, b0 odsečak, ab1x1,b2x2.., su linearničlanovi.

Složeniji model predstavlja se polinomom drugog reda i naziva se interakcioni model.Interakcionimodel sadržiodsečak, linearne članove ičlanove interakcija.

y= b0+ b1x1+ b2x2+ b3x3+...+bnxn+ b12x1x2+ b13x1x3+...+b(n-1)x1n-1xn+ ε

gdesub12x1x2,b13x1x3,...,b(n-1)x1n-1xnčlanoviinterakcija.Nelinearnevezeizmeđufaktora i odziva sistemaopisujekvadratnimodelkoji, za razlikuod interakcionogmodela,sadrži još i kvadratnečlanove:

y= b0+ b1x1+ b2x2+ b3x3+...+bnxn+ b12x1x2+ b13x1x3+...+b(n-1)x1n-1xn+ b11x12+ b22x2

2+...+bnnxn2 + ε

gdesub11x12,b22x2

2,...,bnnxn2 , kvadratničlanovi[275,276].

Pozitivni ili negativni koeficijenti u polinomima (b1, b2...bn, b12, b13… ) ukazuju da lisu faktor i odzivsistema u direktnoj ili obrnutoj srazmeri. Pozitivankoeficijentznačida sesa povećanjem vrednosti ispitivanog faktora, povećava i vrednost odziva sistema.U slučaju negativnevrednostikoeficijentamodelasituacijajeobrnuta.Najčešćepostojineslaganjeeksperi-mentalno dobijene vrednosti odziva sistema, koje seoznačavaju sa y,i odzivima sistema koji sudobijeniračunskiiz polinomakojiopisujemodel,akojiseoznačavaju sa ŷ[273,277,278].

Odirektnoj veziizmeđu ispitivanih faktoraiodzivasistemagovorekoeficijenti linearnihčlanova.Koeficijentikvadratnihčlanovasuzaslužnizazakrivljenostpovršineodziva,asamimtim i pojavu minimuma imaksimuma. Zahvaljujući tome mogu se odrediti optimalni nivoi

66


ispitivanih faktora. Prisutneinterakcijeizmeđufaktoraopisujukoeficijenti članova interakcija.Značajovihkoeficijenatase možeprocenitiprekopovršineodzivasistema.Naprimer,ukolikojepovršinaodziva planarna,može se zaključiti danema statistički značajnih interakcija. Ukolikoima interakcija izmeđudvafaktora,intenzitetuticajajednogfaktoranaodzivsistemazavisiod intenzitetadrugogfaktora[278,279].

Izračunavanje koeficijenаta modela se postiže uz pomoć statističkih programa koji ko-riste višestrukulinearnuregresionuanalizu(eng.multiple linear regression),regresionuanalizuglavnihkomponenata (eng.principal components regression)ili metodu parcijalno najmanjihkvadrata (eng.partial least squares).Kakosu faktoriieksperimentalniopsezi,ukojimaseoniispitujurazličitineophodnojekodiratinivoedabi koeficijenti modela biliuporedivi, i da bi semogli lakše tumačiti.Najučestalijinačinkodiranja jematematički, pri čemuseniži,viši i sred-njinivokodirajuoznakama-1,+1i0.Veličinakoeficijenatafaktoraodređujenjihovznačaj.Veći koeficijent znači i većiuticaj togfaktoranasistem.Statistička procenaznačajaseprocenjujenajčešćeuzpomoćStudentovogt-testa,F-testailigrafikaverovatnoće normalneraspodele(eng.normal probability plots).U slučaju Studentovog t-testa izračunata t-vrednost se upoređuje sa tabelarnomt-vrednošću za odgovarajući broj stepeni slobode i odabranu verovatnoću,pričemufaktore čija jeizračunatat-vrednostvećaodtabelarne,smatramoznačajnim[280].Osim proceneznačajafaktora,neophodnajeiprocenapostojanjaneslaganjeizabranogmatematičkogmodelaidobijeniheksperimentalnihpodataka(eng.lack of fit)primenomanalizevarijanse(eng.analysis of variance - ANOVA)[273,298].

Početna faza svakog istraživanja obično podrazumeva screening fazu, čiji je zadatak smanjenjebrojaeksperimenatanatajnačinšto se procenjujekojifaktoriimajuznačajanuticajnaponašanjesistema,kakobisesamoonidetaljnijeispitivaliu sledećimfazama.Kaomodelinajčešćesekoristelinearniiinterakcionimodel,pasekaoscreening dizajnnajvišekoristepunfaktorski i frakcioni faktorskidizajn [272,277].U screening dizajnucilj je smanjenje broja eksperimenata,pase najčešće faktori ispituju nadvanivoa (viši inižinivo), anivoiodređuju naosnovurezultatapreliminarnihispitivanja.Punfaktorskidizajnpodrazumevadasesvi faktoriispitujunasvimnivoima,aukupanbrojeksperimenatase računa kao 2n ako se koriste dva nivoa,gde jen brojispitivanihfaktora.Ukolikoseispitujutrifaktoranadvanivoaukupanbroj eksperimanataje23=8 ieksperimentisemogu prikazati kaouglovi kocke (slika 2.22a).Kakorastebrojfaktora, rasteibrojeksperimenata kojejepotrebno izvršiti,pasevršifrakcionisanjefaktorskogdizajna,odnosnoizbacivanjeodređeniheksperimenata izsamogdizajnanaosnovupretpostavkedasu interakcijeizmeđu tri i višefaktorazanemarljiveupoređenjusaglavnimutica-jemfaktoraiinterakcijomizmeđudvafaktora[ 2 7 2 ] .Brojeksperimenatautakvomfrakcionomfaktorskomdizajnuje2n-m+C,gdejen brojispitivanihfaktora,C jebrojponavljanjaucentralnojtački i m jeceobrojkojipokazujekakojefrakcionisanfaktorskidizajn.Naslici2.22bjepredstav-ljenprostornirasporedeksperimenata23-1 frakcionogfaktorskogdizajna,pričemueksperimentiimaju formugeometrijske figure tetraedara.To jenajvećamogućazapreminakojumogu daograniče četiri tačkeutrodimenzionalnomprostoruuzizvođenjeograničenogbrojaeksperimenata.

67

Pavle Jovanov

Slika 2.22.Planeksperimenatapriispitivanjutripromenljivenadvanivoauslučaju a) punogfaktorskogdizajna,b)23-1 frakcionogfaktorskogdizajnaic)centralnog

kompozitnogdizajnad)Box-Behnken-ov dizajna[277]

Detaljnijaanalizasistemapostižeseupotrebomoptimizacionihvrstadizajnakod kojih se izabranifaktoriispitujunavišenivoa.Njihovzadatakjeoptimizacijafaktorakojiimajuznačajanuticajnaponašanjesistema.Utusvrhuse najčešćekoristepunfaktorski,centralnokompozitniili Box-Behnken-ov dizajn[273,278,281-285].Centralnokompozitnidizajnnastajenadograd-njompunog ili frakcionog faktorskogdizajna aksijalnimdizajnom (slika2.22c).Ukupanbrojeksperimenatasan faktoraje2n + 2n + C.Prvideojednačineseodnosinafaktorskidizajn,drugideonaaksijalnidizajn,a treći jebrojponavljanjau centralnoj tački.Eksperimentalnugreškuodređujeponavljanjeispitivanjaucentralnojtački.Dužinagranauaksijalnomdizajnu(α)igranajznačajnijuuloguuizgleducentralnogkompozicionogdizajna.Ukolikojeα≠1,svakapromen-ljiva ćeseispitivatinapetnivoa(−α,−1,0,+1,+α)[279,281,284,285].Vrednost α zavisi od brojafaktoraimože se izračunatikaoα = 2n/4[286]. Za određivanjeoptimalnihvrednostiispiti-vanihfaktoraovavrstadizajnakoristikvadratnimodelimetodologijupovršineodziva(eng.re-sponse surface methodology - RSM),kojapredstavljageometrijskuslikuodzivasistemauokviru eksperimentalnogregionaufunkcijijednogilivišefaktora.Dobijeniodzivmože biti prikazankaolinijaudvodimenzionalnomprostoru(ispitujesejedanfaktor),površinau trodimenzional-nomprostoru(dvafaktoraseispituju)ilihiperpovršinau višedimenzionalnomprostoru(ispitujese većibrojfaktora).Naovajnačinje jednostavnoutvrditioptimalnuvrednostzaodređenifaktor,jeronapredstavljaminimumilimaksimumnadobijenojpovršiniodziva.Box-Behnken-ov dizajnimaprednostnadostalimupogleduefikasnosti,odnosnoodnosaizmeđubrojakoeficijenatakojisejavljajuuodabranommodeluibrojaeksperimenatakojepotrebnoizvesti[172,285,298].

68


2.9.2 Funkcija poželjnog odziva

Korišćenjem metodologije površine odziva relativno je jednostavno utvrditi optimalnuvrednost za jedan faktor.Međutim, problem nastaje ako je potrebno optimizovati više fak-tora istovremeno.Akoseoptimalnevrednosti ispitivanih faktoranalazeurazličitim delovima eksperimentalne oblasti ipritomsenepreklapaju,problemjepronaćiuslovekojiistovremenozadovoljavaju više postavljenih ciljeva,odnosnoodziva sistema.Utakvimslučajevima se ko-risti metodologija višekriterijumskogodlučivanja (eng.multicriteria methodology ili multiple response methodology)[280].

KadajeupitanjuoptimizacijaanalitičkihmetodaDeringerova funkcija poželjnog odziva(eng.Derringer desirability function)jenajznačajnijainajčešće korišćenametodologijamulti-kriterijumskog odlučivanja.Onajeprimenljivainalinearnei nelinearnematematičkemodele.Ovametodologijasebaziranakonstruisanjufunkcijepoželjnogodgovorazasvaki pojedinačanodzivsistema(di)ukojuseunoseciljevi,injihovrelativniznačaj,kojesvaki odziv sistema treba da zadovolji. Vrednosti pojedinačnih funkcija poželjnog odziva zapotpuno nepoželjan nivoodzivaje0,dokjezasavršenopoželjanodgovord =1.

Naprimer,ukoliko je cilj dobijanje maksimalnog odziva sistema, pojedinačna funkcija poželjnogodzivaseračunapremajednačini:

gdejeYiodzivsistema,Maxi i Minisunajvišainajnižadobijenavrednostodzivasistema,awti je relativniznačajkojijedodeljenodzivusistema.Pričemuje Mini<Yi<Maxi.

Uzpomoć pojedinačnih funkcija poželjnih odziva računa seukupna funkcijapoželjnogodziva(D)prekoformule:

gdejei brojposmatranihodzivasistema.Ukupnafunkcijapoželjnogodziva predstavljatežinskugeometrijskusredinupojedinačnihfunkcijapoželjnihodziva.Ukupnafunkcijapoželjnogodzi-va,poputpojedinačnih,može da ima vrednostiD =0do1. Što je D vrednostbližajedinici,toje sistem bližicelokupnojoptimalnojvrednosti,odnosnosviodzivisistemasubližipoželjenojvred-nosti.Ukupnafunkcijapoželjnogodzivasemožeprikazatiuvidu trodimenzionalnog prostoraradi lakšeguočavanjacelokupneoptimalnevrednostisistema[285,287-290,298].

69

3. EKSPERIMENTALNI DEO

Poglavlje 3

Pavle Jovanov

71

EksperimentalnideoovedisertacijeurađenjeuNaučnominstitutuzaprehrambenetehnologijeuNovomSadu(FINS)iulaboratorijizainstrumentalnuanalizuDepartmanazahemiju,biohemijuizaštituživotnesredinePrirodno-matematičkogfakultetauNovomSadu,UniverzitetauNovomSadu.

3.1 Hemikalije i reagensiSpisak hemikalija i rastvora koji su korišćeni tokom izvođenja eksperimentalnog dela

istraživanjadatisuunastavku.

Standardineonikotinoida:

Dinotefuran(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Nitenpiram(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Tiametoksam(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Klotianidin(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Imidakloprid(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Acetamiprid(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Tiakloprid(čistoće>99,9%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Acetonitril(ACN,HPLCčistoće),(Merck,Nemačka);

Dihlormetan(DHM,HPLCčistoće),(Merck,Nemačka);

Hloroform(CHCl3,HPLCčistoće),(Merck,Nemačka);

Metanol(HPLCčistoće),(J.T.Backer,SAD);

Mravljakiselina(čistoće>98%),(Sigma-Aldrich,Nemačka);

Ultračistavoda,(FINS,RepublikaSrbija);

Aceton,(J.T.Backer,SAD);

Natrijum-hlorid(NaCl,p.a.čistoće),(Carlo Erba Reagents,Francuska);

Dinatrijum-hidrogen-citrat-seskvihidrat,(Supelco,SAD);

Trinatrijum-citrat-dihidrat,(EuroHemija,RepublikaSrbija);

Magnezijum-sulfat(MgSO4anhidrovani,čistoće98%),(Hemrad,RepublikaSrbija);

Vodonik-peroksid(H2O2,p.a.čistoće),(LGHemija,RepublikaSrbija);

Višezidneugljeničnenanoceviigvožđemdekorisanevišezidneugljeničnenanocevi(MWCNTiFe-MWCNT)(sintetisaneulaboratorijiprof.drGoranaBoškovića,Tehnološkifakultet,UniverzitetuNovomSadu)[291-293].


72

Standardni rastvori neonikotinoida:Pripremljenisustandardnirastvoripojedinačnihneoni-kotinoidakoncentracije100,0mgL−1.Odmerenojeoko0,01gstandardaodgovarajućegneonikoti-noida,prenesenouodmernisudod100mLidopunjenodocrtevodomičuvanona-10°Cumraku.Naovajnačinstandardisubilistabilnitokom3meseca.

Standardni zbirni rastvor neonikotinoida: Pripremljen je standardni rastvor ispitivanihneonikotinoidakoncentracije100,0μgL−1mešanjemodgovarajućezapreminestandardnograstvorapojedinogneonikotinoidasavodomuodgovarajućemodmernomsudu.Ovajrastvorjekorišćenzaobogaćivanje(spajkovanje)uzoraka,ispitivanjeuticajamatriksaiispitivanjelinearnosti.Rastvorječuvanna4°Cumrakuibiojestabilantokommesecdana.

MMC rastvori:Radiispitivanjauticajamatriksanarezultateodređivanjasadržajaneonikoti-noidakorišćenisuMMC(eng.matrix-matched standards) rastvorikojisupripremani takoštoseodređenakoličinastandardnograstvorailistandardnogzbirnograstvoraneonikotinoidadodaupo-slednjemdeluprocedurepripremeuzoraka,tj.nakonuparavanja,aprerekonstituisanjauzorka.

QuEChERS kitovi za ekstrakciju:KorišćenisukomercijalnodostupniQuEChERSkitovi(EN156622008standard,2008;[175])nabavljeniodUnited Chemical Technologies(UCT,SAD).Upotrebljenisuekstrakcionikitovisaodgovarajućimpuferom(deobrojECQUEU750CT)iopštitipekstrakcionogkitazaprečišćavanjevoćaipovrća(deobrojECMPS15CT).

3.2 Oprema

Spisakkorišćeneopreme:

Vorteksuređaj,(BOECO,Nemačka);

Ultrazvučnokupatilo,(L&R ultrasonics LTD,Engleska)(37kHz,400W);

Centrifuga,(Tehtnica,SFRJugoslavija);

TečnihromatografAgilent1200,(Agilent Technologies,SAD)saDADdetektoromimasenidetek-tor:Agilent6410BTripleQuad,(Agilent Technologies,SAD)(slika3.1);

Kolone:ZorbaxEclipseXDBC18(50×4,6mm;1,8µm);ZORBAXEclipsePlusC8(100× 2,1mm;1,8μm),(Agilent Technologies,SAD);

Sistemzauparavanjeustrujiazotailivazduha:Reacti-Thermmodul,(Thermo-Scientific,SAD);

SimplicityUVsistemzaprečišćavanjevode,(Millipore,SAD);

StrataDiscoveryDSC-18SPEkolone,3mL,(Supelco,SAD);

VakuummanifoldzaSPE,(Phenomex,SAD);

Automatskepipete:Eppendorf10-10000µL,(Hamburg,Nemačka);

Pavle Jovanov

73

Tehničkavaga,(Mettler Toledo,SAD);

Analitičkavaga,(Mettler Toledo,SAD);

Membranskifilteri:regenerisanaceluloza,veličinapora:0,45i0,22µm;prečnik:25mm,(Agilent Technologies,SAD);

Bočicezaautosampler,2mLvijalice,(Agilent Technologies,SAD);

Plastičnišpricevi,2mL,(Nipro-Romed,RepublikaSrbija);

JSM6460LVskenirajućielektronskimikroskopsaEDSuredjajemOxfordINCA(JEOL,Japan)(uzzahvalnostDipl.biologuMilošuT.Bokorovu,Prirodno-matematičkifakultet,UniverzitetuNovomSadu)

Softverzaprikupljanjeiobradupodataka:AgilentMassHunterWorkstation,verzijaB.03.01,(Agilent Technologies,SAD);Design-Expert7.0.0.,(Stat-Ease,SAD).

Slika 3.1.IzgledHPLC-DAD/MS/MSinstrumenta(NaučniinstitutzaprehrambenetehnologijeuNovomSadu)

3.3 Ispitivani uzorci

Određivanje neonikotinoida tečnom hromatografijom sprovedeno je u sledećim odabranim

uzorcima:medu,likeruodmeda-mediciiudunavskojvodi.

Medkaoglavnipčelinjiproizvodispitivanjenaprisustvoodabranihneonikotinoida.Tokom

prveserijeispitivanjauzorakameda,kojasuuključivalarazvojmetodazapripremuuzoraka,uzorci

(15)sunabavljeniuprodavnicamauNovomSadu.Nakonoptimizovanjametodazapripremuuzor-

akaihromatografskihuslova,104uzorkamedasunabavljenaiz7okruganateritorijiAutonomne


74

PokrajineVojvodine.Mestaicvetnoporeklomeda(suncokretov,livadski,bagremovilipinmed)su

označeninaslici3.2.Sviuzorcisučuvaninasobnojtemperaturi,kaoštobisečuvalitokomupotrebe

udomaćinstvima(slika3.3).Slepaprobajedobijenamešanjem5uzorakamedarazličitogcvetnog

porekla(10,0g)sapoznatih lokalitetanakojimanijebilamoguća izloženostmedauticajuneoni-

kotinoida.ZaispitivanjemedaprimenomDLLMEtehnikepripremeuzoraka,pripremljenjevodeni

rastvormedakoncentracije50,0gL-1,kojijeslužioizaodređivanjeperformansirazvijenihmetoda

određivanjaneonikotinoida.

Slika 3.2.Lokalitetiuzetihuzorakamedainjihovocvetnoporeklo(51uzoraksuncokretovog,26uzorakalivadskog,22uzorkabagremovogi5uzorakalipovogmeda)

Pavle Jovanov

75

Slika 3.3. Uzorci meda u laboratoriji

Uzorcilikeraodmeda-medicenabavljenisuuprodavnicamauNovomSaduiliodpojedinih

proizvođačaovoglikeranateritorijiAutonomnePokrajineVojvodine.Slepaprobajenačinjenana

istinačinkaoiuslučajuuzorakameda,mešanjem5medicazakojeseverovalodanesadržeostatke

neonikotinoida.Slepaprobamedicekorišćenajeizaispitivanjeperformansirazvijenemetode.

DunavskavodajeodabranakaomatrikszaispitivanjemogućnostiupotrebeMWCNTiFe-

MWCNTzauklanjanjeneonikotinoidaizvodenesredine. Uzorakrečnevodeuzetnaobali reke

DunavuNovomSadutokommaja2013.godine,štojeprikazanonaslici3.4.

Slika 3.4.MestouzorkovanjavoderekeDunav,NoviSad,RepublikaSrbija


76

3.4 Procedure za pripremu uzoraka

Ispitivanjekompleksnihuzorakatečnomhromatografijomnijemogućedirektnobezprethodneodgovarajućepripremeuzoraka.Procedurepripremeiodređivanjauzorakaopisanesuunarednomtekstu.

3.4.1 Tečno-tečna i ekstrakcija na čvrstoj fazi

Odmerenesuodvageod2,5gmedakojesurastvoreneu10,0mLvode.Nakontoga,rastvoreniuzorcimeda sukvantitativnopreneti u levke zaodvajanje (slika3.5a)ukoje je dodataodređenakoličinaNaCl radi boljeg raslojavanja.U levcima je vršena ekstrakcija sa 5,0mL dihlormetana.Ekstrakcijajeponovljenatriputaisveorganskefrakcijesusjedinjeneuepruveti.Sadržajuepruvetijeuparendosuvaustrujiazotauzpomoćuređajaprikazanognaslici3.5b.

Slika 3.5.a)Ekstrakcijasadihlormetanomib)uparavanjedosuvaustrujiazota

Uzorcisuzatimrekonstruisanisa2,0mLvodenaultrazvučnomkupatilutokom5min(slika3.6a).Usledilo jeprečišćavanjeuzorakaupotrebomekstrakcijenačvrstoj fazi.KolonezaSPEsukondicioniranesa4,0mLmetanola,pasa4,0mLvodedabi,nakontoga,bilinanetiuzorci,azatimkoloneispranesa2,0mLvodeinakrajuanaliteluiransaSPEkolonemetanolom.UređajpomoćukogajevršenaSPEjeprikazannaslici3.6b.

Slika 3.6.a)Rekonstruisanjeuzorakauultrazvučnomkupatiluib)vakuummanifoldsetzaSPE

Pavle Jovanov

77

NakoneluiranjakrozSPEkolone,uzorcisuuparenidosuvaustrujiazota,nakončegasurastvoreniu1,0mLmobilnefaze,kojasesastojalaiz70%vode(0,1%HCOOH)i30%acetonitrila.Uzorcisu,posletoga,krozfiltre,čijesuporedimenzija0,45µm,uzpomoćšpricaiiglepreneseniuvijaliceradidaljeHPLC-DADanalize.

3.4.2 QuEChERS ekstrakcija

Ekstrakcijaodabranihneonikotinoidaizuzorkamedaililikeraodmedavršenajeposledećojproceduri:Odmerenoje10,0gmeda(15,0mLlikeramediceili15,0mL50,0gL-1spajkovanograstvorameda)dodatojepo10,0mLacetonitrila(slika3.7a)ipripremljenapuferskasmesasoli(4,0gmagnezijum-sulfata,1,0gnatrijum-hlorida,1,0gnatrijum-citrata-dihidratai0,5gdinatr-ijum-citrata-seskvihidrata),nakončega jeusledilomućkanje1min,vorteksovanje (slika3.7b) icentrifugiranje5min(slika3.8a)na3000omin-1.

Slika 3.7.a)QuEChERS-oveekstrakcioneepruveteib)vortekssistemzamešanje

Odgornjegsloja(acetonitrilskog)prenetoje6mLekstraktaukivetukojasadržismesu150mgPSAi900mgMgSO4isnažnomućkano30sekundi,azatimcentrifugirano5minna3000omin

-1.Na-konponovnogmućkanjaicentrifugiranjauzetoje1,5mLtečnogsloja,kojijeuparendosuvauzpomoćmodifikovanogmanifoldazaSPE(slika3.8b).Nakonuparavanja,uzorakjerekonstruisansa1,0mL(1,5mLzamedicuilispajkovanmed)mobilnefazeiprenetu2mLvijalicezadaljahromatografskaispitivanja[176].

Slika 3.8.a)Centrifugaib)modifikovanimanifoldzauparavanje


78

3.4.3 DLLME protokol za pripremu uzoraka meda

Alikvotod5,0mluzorkameda(50,0gL-1)ililikeramedice,0,5mLACNkaodisperzionograstvaračai2,0mLDHMkaoekstrakcionogsredstvasedodajuukivetusaokruglimdnomod10mL.Kivetasezatimvorteksuje1min,azatimostavitokom10minnaultrazvučnomkupatilunakončegasejoš1minponovovorteksuje.Sledicentrifugiranje5minna2500omin-1.Nakonrazdvajanjafaza(slika3.9)donjafazaseuklanjapomoćušpricaiigleiprenosiudruguepruvetu.Prenetadonjafaza(dihlormetanskafrakcija)sezatimuparavapomoćustrujevazduha,kakobisavdihlormetanispario.Krajnjisuviostatakserekonstruišesa0,2mL(0,5mLzamedicu)mobilnefaze(90%voda(0,1%HCOOH):10%ACN,v:v),filtriraiprenosiuvijalicezadaljehromatografskoispitivanje.

Slika 3.9.RazdvanjanjefazanakoncentrifugiranjaprimenomDLLMEtehnike

3.4.4 Procedura ispitivanja mogućnosti uklanjanja odabranih neonikotinoida iz vode

Alikvotod25,0mLuzetjeizuzorkadunavskevodeukojujedodatispitivanineonikotinoid

(dinotefuran,klotianidinilitiakloprid),takodanjegovakoncentracijaiznosipribližno1mgL-1.Na-

konprenošenja takopripremljenihrastvoraučašeod100mLsamagnetnimjezgrom,dodata je

određenazapreminaH2O2koncentracije125,00mmolL-1i/ili0,01gnanomaterijala(mikroskopska

snimanjananomaterijalavršenasuprirazličitimuvećanjima,beznjihoveprethodnepripreme),nakon

čegasučašesaispitivanimsistemimapostavljenenamagnetnumešalicu.Sprovedenisueksperi-

mentiispitivanjamogućnostiuklanjanjaneonikotinoidaizuzorkavodesaibezdodatakaH2O2,sai

bezdodatkaMWCNT,saibezdodatkaH2O2iMWCNT,kaoisaibezdodatkaFe-MWCNTuprisus-

tvu i odsustvu H2O2.Alikvotisuuzimanišpricemizčašena0min,1min,5min,10min,20min,30

mini60min,teposlefiltriranjapomoćufilteraod0,22µmprenetidirektnouvialezahromatografsku

analizu.Uzimanjealikvotajevršenoutriponavljanjainakon1dan,7dana,10danai14dana.

Pavle Jovanov

79

3.5 Metodologija površine odziva

3.5.1 Optimizacija DLLME procedure

Optimizacija eksperimentalnih uslova DLLME vršena je kako bi se uverili da su izabranieksperimentalni usloviDLLMEujedno i optimalni, pri čemu je korišćenametodologija površineodziva,RSM.Ispitivanjecentralnokompozitnidizajndrugogredasadvafaktora(zapreminamaekstrak-cionogsredstvaDHMidisperznogsredstvaACN)na3nivoa.Eksperimentalnidizajnuključivaoje13eksperimenatasa5ponavljanjacentralnetačke.Prinossvakogneonikotinoida(eng.recovery-R,%)predstavljaojeodzivsistema.Opseziispitivanihfaktorasuprikazaniutabeli3.1.

Statistička analiza i optimizacija su urađene primenom softveraDesign-Expert 7.0.0. (Stat-Ease,Minneapolis,USA).

Tabela 3.1.FaktoriitestiraniopseziprilikomoptimizacijepripremeuzorakaDLLMEprocedurom

FAKTOR NAZIVFAKTORA MIN MAX JEDINICEA ACN 0,0 1,0 mLB DHM 1,0 3,0 mL

3.5.2 Optimizacija hromatografskih uslova

Eksperimentalnidizajn,ANOVAanalizadobijenihpodatakaifunkcijapoželjnihodgovorasuizvedeneupotrebomsoftveraDesign-Expert7.0.0.(Stat-Ease,Minneapolis,USA).Ispitivanifaktorisuodabraninaosnovupreliminarnihispitivanja.IzabranjekvadratnimodelsaBox-Behnken-ovim dizajnom.Izvršenoje17eksperimenatasa3ponavljanjaucentralnojtački.Odgovorisistemasuodabranikakobisepostiglinajboljiprinosineonikotinoidaprimenomtečnehromatografije.Optimi-zacijaosamodzivasistema(retencionavremenaprvogiposlednjeganalitairezolucijaizmeđusvakadvapikaneonikotinoida) je zasnovananamodifikovanojmetodi razvijenoj od straneDerringer i Suich[295].Metodaoptimizacijesesastojalaododabirakriterijumaoptimizacijeiprevođenjaodzivasistemaubezdimenzionepojedinačnefunkcijepoželjnihodziva,kojesunakontogakombinovaneujedanodzivsistemakojičinikonačnufunkcijupoželjnostiprocesa.Faktoriitestiraniintervalihro-matografskihuslovasuprikazaniutabeli3.2.

Tabela 3.2.Faktoriitestiraniintervalihromatografskihuslova

FAKTOR NAZIVFAKTORA MIN MAX JEDINICEA ACN 10,0 40,0 %B vreme 0,0 6,0 minC protok 0,50 0,80 mLmin-1


80

3.6 HPLC-DAD/MS/MS uslovi rada

HPLCsistemAgilent1200serije(Agilent Technologies,USA)sesastojaooddegazera,binarnepumpesamešanjemprivisokompritisku, autosamplera i termostatiranogdelazahromatografskukolonu.

Za ispitivanje uzoraka meda (pripremljenih DLLME postupkom) (MS/MS detekcija), preoptimizacije hromatografskih uslova primenom RSM, razdvajanje neonikotinoida postignuto jekorišćenjemZORBAXEclipseXDB-C18kolonenatemperaturiod30°C.Mobilnafazasesastojalaodultračistevodesa0,1%mravljekiselineiACN,priprotokuod0,5mLmin−1.IzokratskirežimeluiranjajeprimenjenpriodnosuACN/voda(0,1%mravljakiselina)20:80,v/v.Zapreminainjek-tovanjajebila20µL,avremeanalize15min.

Zaispitivanjeuzorakamedanakonoptimizacijehromatografskihuslova(DADiMS/MSde-tekcija)upotrebomDLLMEiQuEChERSprocedurapripremeuzorakaiRSM,razdvajanjeodabra-nihneonikotinoidapostignutojekorišćenjemZORBAXEclipseXDB-C18kolonenatemperaturiod30°C.MobilnafazasesastojalaodACN(A)iultračistevodesa0,1%mravljekiseline(B),priprotokuod0,7mLmin−1.Gradijentniprogram:90%Bnapočetkuanalizesalinearnimgradijentomdo60%Bnakon6minizatimnazaddo90%Bdozavršetkaanalize(10min).DADradnetalasnedužinesubile244nmi266nm.Takođe,testiranajeimogućnostrazdvajanjaodabranihneonikoti-noidakorišćenjemZORBAXEclipsePlusC8kolonepriprotoku0,2mLmin−1ilinearnimgradijen-tnimprogramomzaB:0,0–1,8min90%;1,8–5,0min80%;5,0–7,0min60%;7,0–19,0min90%.Zapreminainjektovanjajebila20µL.

Zaispitivanjeuzorakamedice(pripremljenihkorišćenjemDLLMEiQuEChERS)ianal-izeuklanjanjaneonikotinoidaizvode(MS/MSdetekcija)razdvajanjeodabranihneonikotinoidapostignutojekorišćenjemZORBAXEclipseXDB-C18kolonenatemperaturiod30°C.MobilnafazasesastojalaodACN(A)iultračistevodesa0,1%mravljekiseline(B),priprotokuod0,7mLmin−1.Gradijentniprogram:90%Bnapočetkuanalizesalinearnimgradijentomdo60%Bnakon6minizatimnazaddo90%Bdozavršetkaanalize(10min).Zapreminainjektovanjajebila20µL.

Za ispitivanjeuzorakameda (DADdetekcija)prilikompreliminarnih ispitivanjaparametaraDLLMEtehnikepripremeuzorakakorišćenajeZORBAXEclipseXDB-C18kolonanatemperaturiod30°C.Primenjenjeizokratskirežimeluiranjasamobilnomfazomod30%ACNi70%vodesa0,1%mravljekiseline.Zapreminainjektovanjajebila10µL.Protokmobilnefaze0,6mLmin−1.Ta-lasnadužinanakojojsupraćenisignalibilaje266nmireferentnisignalpraćenjena500nm.Analizajetrajala5minuta.

Zaispitivanjeuzorakameda(DADdetekcija)primenomkombinacijetečno-tečneičvrsto-fazneekstrakcijeprimenjenajeZORBAXEclipseXDB-C18kolonanatemperaturiod25°C. Primenjenjeizokratskirežimeluiranjasamobilnomfazomod30%ACNi70%vodesa0,1%mravljekiseline.Zapreminainjektovanjajebila20µL,aprotokmobilnefaze0,5mLmin-1.Talasnadužinanakojojsupraćenisignalibilaje266nmireferentnisignalpraćenjena500nm.Analizajetrajala5minuta.

Pavle Jovanov

81

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS maseni spektrometar (Agilent Technologies Inc., USA)je korišćen samultimod-jonskim izvorom sa ESI pozitivnom jonizacijom.MassHunter Worksta-tion Data Acquisition i MassHunter Workstation Qualitative Data Analysis softver izdanje B.03.01 korišćen je za kontrolu uređaja, prikupljanje i analiziranje podataka.Operativni parametri instru-mentasubilisledeći:temperaturagasazasušenje325°C,atemperaturaisparivača200°C.Azotjekorišćenkaogaszaraspršivanjesapritiskomnaraspršivačuod50psi,protokomgasaod5Lmin-1,naponomkapilareod2500Vinaponompunjenja2000V.MRMi/iliSIMrežimiradasuodabranizaispitivanjaneonikotinoidauzavisnostiodpostavljenihciljeva.NajintenzivnijeMRMtranzicijesuodabranezasvakineonikotinoid.Optimizovaninaponifragmentoraikolizioneenergijeispitivanihneonikotinoidasuprikazaniutabeli3.3.

Tabela 3.3.Odgovarajućim/zprekursor-jona(Q1),m/zpraćenihprodukt-jona(Q3),naponifrag-

mentora(FV)ikolizioneenergije(CE)zasvakiispitivanineonikotinoid

Neonikotinoid Q1 Q3 FV(V) CE(V)

Dinotefuran 203,1129,1 82 8113,1 82 8

Nitenpiram 271,2225,1 102 856,1 102 30

Tiametoksam 292,2211,1 82 8181,1 82 20

Klotianidin 250,0169,1 92 8131,9 92 16

Imidakloprid 256,1209,0 92 12175,1 92 16

Acetamiprid 223,1126,0 124 1256,1 124 20

Tiakloprid 253,1126,0 102 2090,0 102 30

3.7 Validacija metode

Razvijene i optimizovane metode su validovane radi ispunjavanja zahteva standarda SAN-CO/12495/2011–Validacija metoda i procedure za kontrolu kvaliteta analiza ostataka pesticida u hrani i hrani za životinje [296].Kalibracionekrive ispitivanihneonikotinoidaučistomrastvaračuiliumatriksusukonstruisanecrtanjemzavisnostikoncentracijaneonikotinoidaipovršinanjihovihpikovasadobijenihhromatograma.Kalibracionekrivesukonstruisanenaosnovunajmanje4tačkeutriponavljanja,tj.četirikoncentracijeneonikotinoidaurasponuodGOdo100,0μgL−1.Linearnidinamičkiopsegmetodejestenjenasposobnostdagenerišeodgovorkoji je linearnoproporciona-lankoncentracijianalitauuzorcimaudatomopsegu.Linearnostseutvrđujekrozopseganalitičkogpostupkaipredstavljaseregresionomjednačinom.Linearnostkalibracionihkrivihjeiskazanakroz


82

kvadrat koeficijenta korelacije (r2).Granica detekcije i određivanja su procenjenena osnovume-renjaopadajućihkoncentracijaMMCrastvora imerenjaodgovorasignalapriodnosuS/Nod≥3zaGDiS/N≥10zaGO.Specifičnostmetodepodrazumevaodgovorzasamojedananalit.Metodaje selektivnakada senjomemožeodrediti analit uprisustvuometajućih supstancikojimogubitiprisutniumatriksuuzorka.Dabisedokazalaselektivnostmetode,potrebnojedobitihromatogramsajasnooznačenimstandardimananajnižemkalibracionomnivou,zatimhromatogrameslepeprobeiuzorkaobogaćenognanivoukvantifikacijeitozasvakianalitisvakimatriks.Uzorakkojiseko-ristikaoslepaprobanesmeimatiprisutneanaliteukoncentracijamavećimod30%odGO.Kakobiseokarakterisalespecifičnostiselektivnostispitivanihmetoda,proučavanjeuticajostalihkom-ponenata odabranihmatriksa ispitivanjemMMC rastvora pripremljenih korišćenjem slepe probe.SpecifičnostHPLC-MS/MSmetodejedodatnoispitivanakorišćenjemspajkovanihuzorakaukojimasu praćena po dva produkt jona (target i qualifier) za svaki ispitivani neonikotinoid, imerenjemodnosaizmeđuproduktjona,saprihvatljivomtolerancijomopsegaod±10%uodnosunanjihovod-nosukalibracionimstandardima.Zakonstrukcijukalibracionihkrivihkojeobuhvatajuiuticajsamogispitivanogmatriksa(MMCkrive),slepaprobajenakonprocedurepripremeuzorakauposlednjemrekonstrukcionomkorakurastvorenauzdodatakodređenihstandardaneonikotinoidauispitivanomlinearnomopseguodGOdo100,0μgkg−1.Ispitivaniopsegjeobuhvataonajmanje5različitihkon-centracijaneonikotinoida.Zaodređivanjetačnostimetode,ispitivanisuprinosineonikotinoidaipre-ciznostkrozrelativnustandardnudevijacijuprinosametoda(RSD,%)obogaćivanjemslepihprobauzorakapoznatimkoncentracijamaneonikotinoidapreanalizeiupoređivanjemsasrednjimvrednos-tima dobijenih koncentracija korišćenjemMMCkalibracionih krivi. Preciznost analitičkemetodeizražavablizinuslaganja(stepenrasipanja)izmeđuvrednostinizamerenjadobijenihizvišestrukihuzorkovanjaistoghomogenoguzorka.Preciznostanalitičkogpostupkaseizražavakaovarijacija,rel-ativnostandardnoodstupanjeilikoeficijentvarijacijeiznizamerenja.Preciznostmožedaserazmatranavišenivoa:ponovljivost(eng.repetability),reproduktivnost(eng.reproducibility),intermedijernareproduktivnost,robusnostitd.PreciznostmetodaiskazanajeputemRSDispitujućiponovljivostiintermedijernureproduktivnostmetoda.MetodesurazvijanesaciljemdaRSDbude≤20%.Ponov-ljivostmetodajeispitivanaspajkovanjemuzorakaneonikotinoidimanatrikoncentracionanivoa,pričemusuuzorcianaliziranipetputatokomistogdanaodstraneistogoperateranaistomuređaju.Inter-medijernareproduktivnostmetodajeispitivanaspajkovanjemuzorakaneonikotinoidimanatrikon-centracionanivoa,pričemusuuzorcianaliziranitokomtrirazličitadanaodstraneistoganalitičarainaistomuređaju[296].

4. REZULTATI I DISKUSIJA

Poglavlje 4

85

Pavle Jovanov

4.1 Razvoj metode za određivanje klotianidina u medu primenom tečno-tečne i ekstrakcije na čvrstoj fazi i HPLC-DAD analize

Ispitana jemogućnostodređivanjaklotianidinapomoćuHPLC-DADpoopisanompostupkupripremeuzorakaprimenomkombinacijetečno-tečneiekstrakcijenačvrstojfazi.Kaoštosesaslike4.1možeuočiti,klotianidinseelurasakolonenaretencionomvremenuod1,70min,pričemurelativ-nastandardnadevijacijaizračunatanaosnovuosammerenjaneprelazi0,9%.Linearniopsegmerenjatestiranjeuužemintervalukoncentracijaod1,0–7,5µgmL-1,jerseutojoblastinalazeočekivanisignaliklotianidinauspajkovanimuzorcimameda.

U slučajumodel rastvoraklotianidina,naosnovuanaliziranih signala (slika4.1, tabela4.1)možesezaključitidakoncentracijekorelirajusaodgovarajućimpovršinamapikovahromatograma,pričemukoeficijetkorelacijeiznosi0,999.Ovazavisnostjeprikazananaslici4.2.

Tabela 4.1.Proučavanekoncentracijeklotianidinaiodgovarajućepovršinepikahromatograma

Koncentracija,x(µgmL-1) Površina,y(mAUmin)1,0 73,72,5 174,75,0 343,37,5 514,2

Postojirealnamogućnostdajelinerniopsegširiodispitivanog,aliimajućiuvidučinjenicudasumodel-uzorcimedaobogaćeniklotianidinomupravouovomintervalukoncentracija,možesesmatratidamodel-sistemiobuhvatajuistraživaniopsegkoncentracija.

Nakonproučavanjaprirodeanalitičkogsignalastandardaklotianidina,proučavanisudobijenihromatogramimatriksamedanakonnjegovogprečišćavanja.Nakonprečišćavanjameda,dobijenjeekstrakt jednostavnijegsastava,sauklonjenimkomponentamakojebikoeluiralesaciljanimanal-itom.NaosnovudobijenihhromatogramauočenojedauzorcimedanemogubitidirektnonaneseninaSPEkolonuuoblikuvodenihrastvora,jeronivrlobrzozasitetj.blokirajusorbens.Stogajekaoprvafazapripremesirovoguzorkamedaprimenjenatečno-tečnaekstrakcija,kaotehnikavećegka-paciteta,azatimjeprimenjenadrugafazakojajeobuhvatalaprečišćavanjepomoćuSPE.Dobijenihromatogramprečišćenogmatriksamedabezdodatkaklotianidinaprikazanjenaslici4.3.

Posle proučavanja model-rastvora ciljnog analita i prirode prečišćenog ekstrakta matriksa,klotianidinjedodatupribližnoisteodvagemeda(nadvakoncentracijskanivoa)i takoobogaćeniuzorcisupodvrgnutiproceduripripreme/prečišćavanjauzorakazahromatografskamerenja.Odvage,zapremineobogaćivanja iodgovarajućepovršineočitanihpikovasahromatogramaprikazanisuu

tabeli4.2.

86


Slika 4.1. Hromatogrami klotianidina (tr=1,70 min) snimljeni pri istim uslovima i pri različitim koncentracijama klotianidina a) 1,0 µg mL-1; b) 2,5 µg mL-1; c) 5,0 µg mL-1 i d) 7,5 µg mL-1

87

Pavle Jovanov

Slika 4.2.Kalibracionakrivazaklotianidin

Slika 4.3.Hromatogramekstraktamatriksamedaprečišćenogpomoćutečno-tečneekstrakcijekombinovanesaSPEbezdodatkaklotianidina

88


Tabela 4.2.Odvagemeda,spajkovaninivoiklotianidinaiodgovarajućidobijenihromatografskipodaci

Odvagameda

(g)

Spajkovanazapreminaklotianidina

(µL)

Koncentracijaosnovnogstandarda

(µgmL-1)

Koncentracijaklotianidinau

medu (µgg-1)

Očekivanakoncentracijaupriprem-

ljenomuzorku(µgmL-1)

Površinapika

Očitanakoncentracijaupripremljenom

uzorku

(µgmL-1)

Prinos(%)

2,7752 12,5 99,87 0,450 1,248 63,21 0,852 68,32,4992 12,5 99,87 0,500 1,248 56,69 0,755 60,52,5216 12,5 99,87 0,495 1,248 60,61 0,813 65,22,5611 50,0 99,87 1,950 4,994 161,2 2,298 46,02,5461 50,0 99,87 1,961 4,994 159,7 2,276 45,62,5846 50,0 99,87 1,932 4,994 167,7 2,394 47,9

Izdobijenihrezultatasemožezaključitidajeovajtipprečišćavanjauzorakadelotvornijizamalekoncentracijereziduaklotianidinaumedu(0,5µgg-1,prinos≈70%),štojeilustrovanoslikom hromatograma(slika4.4).Nasuprottome,zavećekoncentracijeklotianidinaneophodnojemodifiko-vatiprocedurupripremezbogmanjegprinosametode(prinos≈46%),štosemožepripisatimogućemzasićenjukolonezaekstrakcijunačvrstojfaziilinekomdrugomrazlogu.

Slika 4.4.Hromatogramimedaspajkovanogsadverazličitekoličineklotianidina(tr =1,70min),prečišćenipomoćutečno-tečneekstrakcijekombinovanesaekstrakcijomnačvrstojfaziisnimljenipriistimuslovimahromatografisanja.Spajkovaniuzorcisadržea)2,0µgg-1ib)0,5µgg-1klotianidina

Naosnovu istraživanjakoja seodnosena tečno-tečnuekstrakciju (primenomDHM),može

sezaključitidazbogkompleksneprirodemedaopisanametodapripremenijepogodnazadirektna

određivanjaklotianidinapomoćuHPLC-DAD.Naime,pritečno-tečnojekstrakcijivodenafazaidi-

hlormetanmoguseprimenitisamouzveomapažljivomućkanje(čakiuprisustvunatrijum-hlorida)

89

Pavle Jovanov

inačedolazidovećihgubitakaanalita.Ovakopripremljeniuzorci/ekstraktimedaidaljenisudovoljno

čistizaHPLC-DADmerenjaklotianidina,jeronijošsadržekomponentekojesekoeluirajusaklotian-

idinom,aabsorbujusvetlostna266nm,tj.naradnojtalasnojdužinidetektora,kaoisamklotianidin.

Zbog toga je neophodno dalje prečišćavanje uzoraka na odabranim SPE kolonama.Ovameto-

daprečišćavanjazahtevadobropoznavanjemetodologijeradaiuvežbanostanalitičara.Naosnovu

prvihrezultatamožesekonstatovatidakorišćenjeStrataDiscoverySPEkolonaukombinacijisatečno-

tečnomekstrakcijomDHMpokazujeprinosklotianidinado70%uuzorcimamedaprikoncentracijiod

oko0,5µgg-1klotianidina.

Shodno navedenom, dalja istraživanja bila su usmerena ka razvitku drugih ekstrakcionih

tehnikakojebiobezbedilevišiprinosneonikotinoidauširemkoncentracijskomopsegu.

4.2 Razvoj metode za određivanje klotianidina u medu primenom DLLME tehnike i HPLC-DAD analize

Nakonodređivanjaneonikotinoidaklotianidinaprimenomkombinovanetečno-tečneekstrak-

cijeiekstrakcijenačvrstojfazizapripremuuzorakameda,dobijenirelativnoniskiprinosineoni-

kotinoida(R≤70%)ukazujunaneophodnostpronalaženjaodgovarajućestrategijepripremeuzoraka

meda.Narednaodabranatehnikapripremeuzorakamedajedisperznatečno-tečnamikroekstrakcija.

RadioptimizacijeDLLME tehnikeneophodno jebilo ispitati ključneparametrekojiutičuna efi-

kasnostoveekstrakcionetehnike,kaoštosu:zapreminaivrstadisperznihiekstrakcionihsredstava,

načininjihovoguvođenja/disperzijeuekstrakcionesisteme,brzinaivremecentrifugiranjaitd.

Preduslovzaproučavanjemogućnostiprimene,apotomiefikasnostiDLLMEtehnike je

postojanjepouzdaneHPLC-DADmetodezaodređivanjeklotianidina.Mobilnafazakojasekoristi

uovojmetodisastojiseod30%ACNi70%vode(0,1%HCOOH).Pripremljenajeserijastandardnih

rastvoraklotianidinakoncentracije0,05–2,5mgL-1ili,ukasnijimispitivanjimaosetljivostiiefikas-

nostiDLLMEprocedure,od0,001–0,05mgL-1.

Kalibracionakrivajekonstruisananaosnovudobijenihpovršinapikovaispitivanihstandard-

nihrastvoraklotianidinaprikazanihutabeli4.3.Izračunatajejednačinapraveikoeficijentkorelacije

(slika4.5).

90


Tabela 4.3.Proučavanistandardnirastvoriklotianidinaiodgovarajućepovršinepikova

Koncentracija,x(mgL-1) Površina,y(mAUmin)0,05 3,600,10 7,600,20 13,50,50 32,01,00 60,22,00 121,02,50 157,2

Slika 4.5.Kalibracionakrivaklotianidinazakoncentracijskiinterval0,05–2,5mgL-1

Radi ispitivanjamogućnostiprimeneDLLMEtehnikepripremani suuzorcimedasa ibez

dodatkaklotianidina.Medukoličiniod100grastvorenjeu1Lvodeinatajnačindobijenjeras-

tvormedakoncentracije100gL-1,kojijedaljepodvrgnutDLLMEprocedurizapripremuuzoraka

ilijeobogaćen(spajkovan)načetirikoncentracionanivoa:0,1,0,2,0,5i1,0mgkg-1meda,azatim

podvrgnutistompostupkumikroekstrakcije.Spajkovanjeuzorakaizvršenojetakoštosuprvododate

izračunatezapreminestandardnograstvoraklotianidinaod100mgL-1uodmernesudoveod100mL,

azatimsusudovidopunjenidocrtesanapravljenimrastvorommedakoncentracije100gL-1.Radi

razvijanjametodezaekstrakciju,korišćenjemedučijemhromatogramujeuočenmanjibrojsup-

stancikojemogudainterferirajusaklotianidinom,auciljuispitivanjaoperacionihkorakaiključnih

parametaraDLLMEprocedure.Unarednimpoglavljimaioblastima,razmatranisurazličitimatriksi

medaiodgovarajućeekstrakcionetehnike,uključujućiiDLLME.

91

Pavle Jovanov

4.2.1 Početni DLLME postupak

PrvaDLLMEprocedurajevršenatakoštojeuepruvetusaokruglimdnommikropipetomdo-dato1,5mLacetonitrila,azatim0,5mLhloroforma.Izoveepruvetejeizvučenacelokupnazapremi-naprimenomšpricazapremine2mLiigleprečnika0,8mm,azatimjeovajsadržajnagloubrizganudruguepruvetuukojujeprethodnotrbušastompipetompreneto10,0mLrastvoramedaobogaćenogklotianidinom.Ovaprocedurajesprovedenazasva4spajkovanakoncentracijskanivoaklotianidinautriponavljanja.Nakonubrizgavanjaorganskefazedobijenajeemulzijasajasnim,krupnimdisper-govanimkapljicamahloroformaukojimaseočekivalokoncentrisanjetj.ekstrakcijaklotianidina.

Ovakopripremljeneepruvetesauzorcimacentrifugiranesuna3000omin-1tokom5minuta.Nakoncentrifugiranjauepruvetamasuuočenijasnorazdvojenislojevi,gornjislojsmeseACNivodeidonjislojhloroforma.Glavnideogornjegslojauklonjenjepomoćupipetezapremine5mL.Čistim špricemiiglompažljivojeizdvojendonjislojiprenesenučistuisuvuepruvetu,azatimjeuparenuvakuummanifolduustrujivazduha.Uzorcisunakonuparavanjarekonstruisaniu0,5mLmobilnefaze iprofiltriranipreprenošenjauhromatografskevijale.Nakonovakvepripreme iHPLC-DADanalizeočekivanekoncentracijeklotianidinaidobijeniprinosiklotianidinaprikazanisuutabeli4.4.

Tabela 4.4. OčekivanekoncentracijeidobijeniprinosiklotianidinaposleHPLC-DADanalize

Spajkovanuzorakmeda

(mgkg-1)0,1 0,2 0,5 1,0

Očekivanakoncentracija(mgL-1) 0,2 0,4 1,0 2,0

Prinos(%) 45,2 50,0 48,3 47,6

Nakon analize hromatograma standardaklotianidina jasno su se videli pikovi klotianidinasalinearnimporastomvisinepikasapovećanjemkoncentracije,čijajekalibracionakrivaprikazananaslici4.5.Međutim,prinosispajkovanihrastvoramedaposleopisaneDLLMEproceduresubilidalekoispodočekivanih,štoznačidaseubrizgavanjemacetonitrilaihloroformapomoćušpricanepostižeformiranjezadovoljavajućegdisperznogsistema,paje,shodnotome,prinosekstrakcijebioneadekvatan.

Radipoboljšanjadisperzijeorganskogekstragensauvodenojfazi,unarednomeksperimentunakondodavanjadisperznogiekstrakcionogsredstvaprimenjenjeiproučavanuticajvorteksuređajai ultrazvučnog kupatila na efikasnostDLLME tehnike.Treba napomenuti da ubrizgavanje aceto-nitrila i pogodnog ekstrakcionog sredstvakoristeći špric i iglu nedoprinosi značajnom formiran-judisperzionogsistemakadasuuanalizuuključenivorteksuređajiultrazvučnokupatilo.Shodnotome,udaljimeksperimentimasmesadisperznogiekstrakcionogsredstvadodavana jeprimenomodgovarajućepipete.

92


Naslici4.6prikazanjehromatogramuzorkaspajkovanogmedasa0,5mgkg-1standardnimras-tvoromklotianidinananačingdejeu100mLrastvora100gL-1medadodato50µL100mgL-1rastvora klotianidina,čimejekoncentracijaklotianidinautomrastvoru0,05mgL-1,tj.preračunatonamed0,5mgkg-1.Zatimjeuzetalikvotod10mL,dodatoje1,5mLACNi0,5mLhloroforma,1minvorteks,10minultrazvuk,1minvorteks,centrifugirano,izdvojenjedonjisloj,uparendosuvairekonstituisanu0,5mLmobilnefaze.Nahromatogramuseočekivaopikčijapovršinaodgovarapovršinistandardaklotianidinaod1,0mgL-1(tr =1,7min,površina60,2),međutim,dobijenjepikčijajepovršinaskoroduplomanja,pričemusedobijaneadekvatanprinosodsvega48,3%.

Slika 4.6.Hromatogramekstraktamedaspajkovanogklotianidinomukoncentraciji0,5mgkg-1 (tr=1,7min)

ImajućiuvidudobijanjeniskogprinosaprimenompočetneDLLMEprocedure,neophodnoje bilo ispitati samuDLLME tehniku za ekstrakciju klotianidina, kao i identifikovati sve ključneparametrekojiutičunaprinosovemikroekstrakcije.

4.2.2 Ispitivanje efikasnosti DLLME tehnike korišćenjem standardnih rastvora klotianidina

Zbogniskogprinosaklotianidina,usledećemsetueksperimenataispitivanjeuticajuslovana

efikasnostDLLMEekstrakcijeizstandardnihrastvoraklotianidina.

Kakobiseuticajmatriksamedaisključiokaomogućiuzrokniskogprinosaekstrakcijeklotian-

idina,ovafazaispitivanjaizvedenajenarastvorimaklotianidina,bezprisustvameda.Pripremljenje

standardni rastvorklotianidinaod1,0mgL-1koji jeprimenjenza ispitivanjeefikasnostiekstrakcije.

Poredhloroformatestiran je idihlormetankaopotencijalnoekstrakcionosredstvo.Plan i rezultati

eksperimentapredstavljenisuutabeli4.5.

93

Pavle Jovanov

Tabela 4.5.PlaneksperimentaiodgovarajućiprinosiodređivanjaklotianidinaHPLC-DADmetodomupotrebomDLLMEtehnikepripremeuzoraka

OznakaUzorka

Zapreminastandardnog

(1mgL-1)rastvoraklotianidina(mL)

ZapreminaACN(mL)

Sredstvo za ekstrakciju (1mL)

Prinos(%)

1 5 1 Dihlormetan 81,52 5 1 Hloroform 88,63 5 - Dihlormetan 75,64 5 - Hloroform 86,05 10 - Dihlormetan 68,36 10 - Hloroform 69,7

U svaku probu rastvora klotianidnina od 1,0 mg L-1 prvo je špricem ubrizgano sredstvo

za ekstrakciju sa ili bez acetonitrila. Svakaproba je rađenau tri ponavljanja.Epruvete su najpre

vorteksovane 1 min, a zatim sonicirane 3 min. Dobijena je mutna, beličasta emulzija, sa slabo

uočljivimkapljicamadihlormetana,odnosnohloroforma,što je značajnodrugačijeuodnosunaprve

DLLMEeksperimente.Naime,primenomdodatnihkorakavorteksovanjaiultrazvučnogtretmana,

dobijaseboljadisperzijadvefaze.Uzorci1,2,3i4sucentrifugiranina3000omin-1utrajanjuod

10minuta.Uzorci5i6sucentrifugovani5minutana4000omin-1.Donjislojsvih6probajeprenet

učistuisuvuepruvetu,primenomčistogšpricaiiglezasvakiuzorak.Oveepruvetesuzatimpostav-

ljenenauparavanjeustrujivazduha.Nakonuparavanjauzorci1,2,3i4surekonstruisaniu2mL,a

uzorci5i6u4mLmobilnefaze,čimesezasvihšestuzorakaočekivaopikuhromatogramukojiodgov-

ara2,5mgL-1klotianidina.Ustanovljenojedakorišćenjesmesedisperzionogiekstrakcionogsredstva

vodipoboljšanjuprinosauodnosunakorišćenjesamogekstrakcionograstvora.Naprimer,primenom

smeseDHMsaACNdobijenjeprinosod81,5%(slika4.7itabela4.5),uodnosunakorišćenjesamo

DHMzaekstrakcijusaprinosom75,6%,dokuslučajuupotrebehloroforma,ovarazlikanijebila

tolikoizražena(tabela4.5).

Slika 4.7.Hromatogramekstraktauzorka1kojijeprošaoprocedurukojaobuhvatasmesudisper-znogsredstvaiekstrakcionogsredstva(1mLACNi1mLDHM)(pikklotianidinanatr=1,7min)

94


Zadatakovogeksperimentabilajeioptimizacijaodnosakoličineuzorkaipotrebnekoličinerastvorazaekstrakciju.Uprvačetiriuzorkazapreminaodmerenihuzorakaiznosilaje5,0mL,dokjeuuzorcima5i6onabila10,0mL.Zapreminerastvorazaekstrakcijusenisumenjale,aiznosilesu1mL.Zabeleženisuprinosiklotianidinaod69,7i68,3%,uzavisnostidalijekorišćenCHCl3,odnosnoDHMkaorastvorzaekstrakciju(tabela4.5).Povećanjeodnosazapreminaekstragensaiuzorkanijedoprinelo boljoj ekstrakciji, što ukazuje na potrebu korišćenja odnosa uzorak:ekstrakciona smesa5:1.Korišćenjem5,0mLuzorkase,takođe,omogućavalakšemanipulisanjeuzorkomtokomeksperi-menta,naročitoprilikomvorteksovanjaicentrifugiranja.

4.2.3 Utvrđivanje značajnih faktora DLLME tehnike - odabir i zapremine ekstrakcionog sredstva

NakonispitivanjaefikasnostiDLLMEtehnikenastandardnimrastvorimaklotianidina,rađenisueksperimentikojisuobuhvatalispajkovanimed(1,0mgkg-1).Radiispitivanjauticajazapremineekstrakcionogsredstvanarezultateanalize(prinos)rađenisueksperimentiutriponavljanjasaDHMiCHCl3,gdesudodatezapremineekstrakcionogsredstvaiznosile1mLili2mL(tabela4.6).

Uzorcisuvorteksovani1min,uultrazvučnomkupatilusutretirani3min,nakončegasucen-trifugiranina3000omin-1utrajanjuod5min.Dvefazesuserazdvojile,alisunapovršinidonjegslojauočeniostacinekihkomponentimeda,najverovatnijenekihugljenihhidrata,proteinailifenola,kojesuotežavaleodvajanjedonjegsloja.Radiuklanjanjazapaženognepovoljnogefektauzorcisujošjednomcentrifugirani5min,aliovajputna4000omin-1.Međutim,inakonponovnogcentrifugi-ranjastanjedonjegslojajeostalonepromenjeno.Zatimjedonjislojprenetšpricemučistuepruvetu,tejeuparavanustrujivazduha.Nakonuparavanjauzorcisurekonstruisaniu0,5mLmobilnefaze,vorteksovaniisoniciraniradiboljegrastvaranja.Dobijenirastvorisupropuštenikrozfiltreiprenetiuhromatografskevijale,pričemujeočekivanakoncentracijaklotianidinausvimuzorcimabila1,0mgL-1.

HPLC-DADanalizomdobijenihromatogramiukazujudasuuuzorcima1i2prinosiekstrak-cijeispod60%,doksuuuzorcima3i4prinosiiznosili98,5%,odnosno89,7%(tabela4.6)

Tabela 4.6.PlaneksperimentaiodgovarajućiprinosiodređivanjaklotianidinaHPLC-DADmetodomupotrebomDLLMEtehnikepripremeuzoraka

Oznakauzorka

Zapreminaobogaćenog(1,0mgkg-1)meda(mL)

ZapreminaACN(mL)

Sredstvo za ekstrakciju ikorišćenazapremina

Prinos(%)

1 5 1 Dihlormetan,1mL 54,5

2 5 1 Hloroform,1mL 59,3

3 5 1 Dihlormetan,2mL 98,5

4 5 1 Hloroform,2mL 89,7

95

Pavle Jovanov

Imajući u viduda je dihlormetanmanje opasanpo zdravlje i čovekovuokolinuu odnosunahloroformidajeuprethodnimeksperimentautvrđenodapostojerazlikeukvalitetuekstrakcijeizmeđuovadvareagensa,dihlormetanjeodabrankaoekstrakcionosredstvo.

Ispitivan je uticaj zapremine DHM kao ekstrakcionog sredstva, pri čemu su proučavanialikvotibili1mLi2mL,azapreminadispreznogsredstvasenijemenjalaiiznosilaje1mL.Nakonuparavanjadonjegsloja,uzorcisurekonstituisanisa1,0mLmobilnefaze.Dobijenipikovinahro-matogramutrebadabuduekvivalentnipikovimastandardnograstvoraklotianidinaod0,5mgL-1.Dobijenisuprinosiod84,10%za1mLDHM,i99,3%za2mLDHM,štopokazujedajeprimenaveće zapremineDHMpovoljnija.Ovo ukazuje da je prilikom analize uzorakameda spajkovanihsastandardomklotianidinaboljiodnoszapreminauzorkaiekstrakcionograstvora5:2.Naslici4.8prikazanjehromatogramuzoraka,kojijeekstrahovankorišćenjem2,0mLDHMkaoekstrakcionogsredstva.

.

Slika 4.8.Hromatogramklotianidina(tr=1,7min)uzorkamedaekstrahovanogsa2,0mLDHMi1,0mLACN

4.2.4 Utvrđivanje značajnih faktora DLLME tehnike - zapremina disperznog sredstva

Efikasnostekstrakcijeispitivanajeinanižimkoncentracijamaklotianidina(0,1mgkg-1,0,25mgkg-1 i0,5mgkg-1)urastvorumedakoncentracije500gL-1.Ispitanjeuticajzapreminedisperznogsredstvapri-menomdvezapremineacetonitrilaod1,0mLi0,5mL,prizapreminiDHMod2mL,utriponavljanjashodnodizajnueksperimentaprikazanomutabeli4.7.

Zapreminauzorakausvakojprobiiznosilaje5,0mL.KoraciDLLMEproceduresubilisledeći:sadržajepruvetejevorteksovan1miniultrasonifikovan10minuzpovremenovorteksovanje.Centrifu-giranjejevršenona3500omin-1utrajanjuod10min.Nakoncentrifugiranja,gornjislojjepažljivouklonjenpipetomod5mL,aostatakjeuparavanustrujivazduha.NaovajnačinpokušaoseizbećieventualnigubitakanalitausledprenošenjaDHMslojaudruguepruvetu,kaoiskraćenjevremenaanalize.Međutim,posledicaovakvogpostupka jedužeuparavanje, jer jeuepruvetamazaostajalavodagornjegsloja,koji,ipak,nijeupotpunostimogaobitiuklonjen.

96


Tabela 4.7.Planeksperimenta iodgovarajućiprinosiklotianidinadobijeniHPLC-DADmetodomupotrebomDLLMEtehnikepripremeuzoraka

Oznakauzorka


medu

(mgkg-1)

ZapreminaACN(mL)

Rekonstrukcijaumobilnojfazi

(mL)

Očekivanakoncentracijaklotianidinanahromatogramu

(mgL-1)

Prinos

(%)

1 0,5 1,0 1,25 1,0 /2 0,5 0,5 1,25 1,0 89,23 0,25 1,0 1,25 0,5 /4 0,25 0,5 1,25 0,5 /5 0,1 1,0 1,25 0,2 70,36 0,1 0,5 1,25 0,2 /

Filtriranjeovihuzorakauvijalebilojeotežano,verovatnozbogvećekoncentracijeugljenihhidrataizmeda.HPLC-DADsignaliklotianidinaukazujunatodajeprinosuuzorcimaoznake2i5bioredom89,2%i70,3%,dokuostalimprobamanahromatogramunijezapaženočekivanipikklotianidina.Razlogtomemožebitivelikiuticajmatriksai/ilinedovoljnodobroizvedenafiltracijapresameanalize.Naosnovurezultata ispitivanja,možesezaključitidasezadovoljavajućiprinosekstrakcijeostvarujeprikorišćenju0,5mLACNkaodisperznogsredstva.

4.2.5 Osetljivost i efikasnost DLLME tehnike

RadiproučavanjaosetljivostiiefikasnostiDLLMEeksperimentisupostavljeni,utriponavl-janja,kakojeprikazanoutabeli4.8,pričemujevariranakoncentracijaklotianidina,zapreminauzor-ka,zapreminamobilnefazezarekonstruisanjeuzorakaizapreminaACN,dokjezapreminaDHMiznosila2mL.

Tabela 4.8.Planeksperimenta iodgovarajućiprinosiklotianidinadobijeniHPLC-DADmetodomkorišćenjemDLLMEtehnikepripremeuzoraka

Oznakauzorka


medu

(mgkg-1)

Zapreminauzorka (mL)

ZapreminaACN

(mL)

Rekonstrukcijaumobilnojfazi

(mL)


(mgL-1)

Prinos(%)

1 0,05 5,0 1,0 0,6 0,2 /2 0,05 4,0 1,0 0,5 0,2 /3 0,05 3,0 1,0 0,4 0,2 /4 0,05 5,0 0,5 0,6 0,2 93,15 0,05 5,0 1,0 0,6 0,2 66,66 0,1 5,0 1,0 0,5 0,5 87,47 0,1 4,0 1,0 0,4 0,5 /8 0,1 5,0 1,0 0,5 0,5 /

97

Pavle Jovanov

ShodnokoracimaDLLMEprocedureuzorcisusonicirani15minuta.Centrifugiranjeseodvi-jalona3000omin-1utrajanjuod5minuta,adonjislojjeprenošenučisteepruvetekorišćenjemšprica iigle,čimejevremeuparavanjakojejeusledilobiloznatnokraćeuodnosunaslučajkadajeuparavansadržajepruvetenakonuklanjanjagornjegsloja.

Naosnovudobijenih rezultata,možeseuočitida je izapreminamobilne fazeukojoj jeuzorak rekonstituisan značajan faktor, jer autosamplerHPLCuređaja nije bio umogućnosti dapovučedovoljnukoličinuuzorka, izbog togauzorcikojisu rekonstruisanisamanjeod0,5mLmobilnefazesuostalibezmogućnostiočitanjarezultata.

Klotianidinjeočitansamonahromatogramimauzorakaoznake4,5i6uočekivanimkon-centracijamačijisuprinosiiznosili93,1%,66,6%i87,4%redom(tabela4.8).Možesezaključitidajenajboljiprinosekstrakcijedobijenprikorišćenju0,5mLACNi2,0mLDHM.Zapremineuzorkamanjeod5,0mLsusepokazalekaonezadovoljavajućezaoptimalnoizvođenjeeksperimenta.

Postavkadaljegeksperimentaprikazanajeutabeli4.9,sakorišćenomzapreminomalikvotaod5mL,DHMod2mLiACNod0,5mL.Uzorcisunakonvorteksovanjasoniciraninaultrazvuku20minuta.Centrifugiranisuna3500omin-1utrajanjuod10minuta.Prenošenjedonjegslojaučisteepruveteobavljanoješpricemiiglom.Uparavanjedosuvarađenojeustrujivazduha,arekonstruk-cijaumobilnojfazi.Kakoseuprethodnomeksperimentupokazalodamalakoličinarekonstruisanoguzorka nije dovoljna da bi seHPLC-DAD analiza sprovela, ovoga puta je kao dodatak korišćendodatak vijalici Agilent vial insert 100 mL pulled glass, kakobi se zapreminavijalica smanjila ipodiglapovršinasakojeiglainjektorausisavauzorak.Prinosisusekretaliod68,4%do92,1%,štojezabeleženokoduzorka5(tabela4.9),čimesusedatiparamteriDLLMEekstrakcijepokazalikaooptimalni.

Tabela 4.9.Planeksperimenta iodgovarajućiprinosiklotianidinadobijeniHPLC-DADmetodomupotrebomDLLMEtehnikepripremeuzoraka

Oznakauzorka

Koncentracijaklotianidinauuzorku meda

Rekonstrukcijaumobilnojfazi(mL)


Prinos(%)

1 0,05mgkg-1 1,25 0,1mgL-1 76,3

2 0,05mgkg-1 0,60 0,2mgL-1 71,8

3 0,025mgkg-1 0,60 0,1mgL-1 90,8

4 0,025mgkg-1 0,30 0,2mgL-1 72,3

5 0,01mgkg-1 0,25 0,1mgL-1 92,1

6 0,01mgkg-1 0,125 0,2mgL-1 83,0

7 0,005mgkg-1 0,125 0,1mgL-1 68,4

98


4.3 Optimizacija metode za određivanje odabranih neonikotinoida u medu primenom DLLME i HPLC-MS/MS analize [294]

Nakon preliminarnih ispitivanja optimalnih parametara DLLME tehnike pripreme uzorakamedazaekstrakcijuodabranogneonikotinoidaklotianidina,neophodnojebiloizvršitioptimizacijuDLLMEnanačindaprinosiekstrakcijabuduiznad70%zasveispitivaneneonikotinoide.KakobisedetaljnijeispitaliključniparametriDLLMEtehnike,korišćenajemetodologijapovršinaodziva,kaoidetekcijanaosetljivijemkuplovanommasenomdetektoru.PreliminarnaispitivanjaosobinaDLLMEtehnike dovela su do nekih zaključaka o najbitnijim faktorima koji utiču na prinose ove tehnikeekstrakcijeuslučajuuzorakamedakojisadrženeonikotinoide.

4.3.1 Optimizacija odvage uzoraka meda

Složenostsastavameda(ugljenihidrati,organskekiseline,enzimiidr.)zavisiodvrsteigeo-grafskogporeklameda.Preliminarnaispitivanjavećsupokazaladakoncentracijavodenograstvoramedavišaod50,0gL-1nakonprimeneDLLMEtehnikerezultiraprinosimakojisuneadekvatnizapreciznoitačnoodređivanjeneonikotinoida(R<60%,RSD>20%).Ovojeverovatnoposledicavećegviskozitetarastvorasavišimkoncentracijamameda,kojiutičenaformiranjesedimentacionogostatkaorganskefazenakoncentrifugiranja.Zbogtoga,nadaljejeodabranakoncentracijamedazaekstrak-cijuneonikotinoidaDLLMEtehnikomiznosila50,0gL-1.

4.3.2 Optimizacija DLLME

PreliminarnaispitivanjaoptimalnihuslovaekstrakcijeklotianidinaupotrebomDLLMEtehnikepripremeuzorakadalasuodgovornanajznačajnijefaktorekojiutičunaefikasnostekstrakcije.Ovifaktorisuistovremenotestiraninasvih7neonikotinoida.

4.3.2.1 Zapremina alikvota uzorka

Uprocesuoptimizacijekorišćenisuspajkovaniuzorcimedapričemujefinalnakoncentracijasvihodabranihneonikotinoidaiznosila100,00μgkg-1.VariranajezapreminaalikvotazaDLLMEproceduruuopseguod5,0do10,0mLukoracimaod1,0mL.Nakonsagledavanjaprinosaekstrakcijakojijepredstavljaoodzivsistema,došlosedozaključkadanemastatističkiznačajnerazlikeizmeđupostignutihprinosa(p <0,05).Zapreminaalikvotaod5,0mLjeodabranazadaljaispitivanjazboglakoćemanipulacijesatomzapreminomtokomsprovođenjaeksperimenata.

4.3.2.2 Odabir ekstrakcionog i disperznog sredstva

Odabirodgovarajućegekstrakcionogidisperznogsredstvapredstavljajedanodnajbitnijihfak-toraDLLMEtehnike.PreliminarnaispitivanjapokazalasudanemaznačajnihrazlikaizmeđuDHMihloroforma(odabranihitestiranihnaosnovunjihovevećegustineodvode)kaoekstrakcionihsred-stava u ekstrakciji klotianidina.Međutim, ekstrakcioni prinosi svih 7 neonikotinoida su potvrdiliodabirDHMkaoekstrakcionogsredstva,sobziromnatodasuprinosisvihneonikotinoidabiliveći(najnižiprinosR=74,3%)uodnosunaonedobijeneupotrebomhloroforma(R<70,0%zatiaklopridiacetamiprid).

99

Pavle Jovanov

Dobromešanjedisperznogsredstvasavodenomfazomiekstrakcionimsredstvomjesteglav-niuslovkojimorabiti ispunjenprilikomodabiradisperznogsredstvazaDLLME.Tipdisperznogsredstvautičenapovršinskinaponekstrakcionogsredstva,određujeveličinumikrokapljicakojesestvarajuprilikommešanjaisamimtimeinaefikasnostsameekstrakcije.TokomispitivanjaACNjekorišćenkaodisperznosredstvonaosnovuispitivanjakojesusproveliZacharis et al.[297].

4.3.2.3 Optimizacija zapremine ekstrakcionog i disperznog sredstva

Zapreminaekstrakcionogsredstvaimavelikiuticajnaprinosekstrakcije.Sapovećanjemzapre-mineekstrakcionogsredstvapovećavaseizapreminasedimentacionogdela.Zapreminaekstrakcionogsredstvatimeutičeinaprinosekstrakcije.Onamoraobezbeditidovoljnukoličinusedimentacionogostatkanakoncentrifugiranja.Takođe,odnoszapreminaekstragensaiuzorkautičenaravnotežura-spodele.Raspontestiranihzapreminaekstrakcionogsredstvakretaoseod1,0do3,0mL(1,0mL,2,0mL,3,0mL).Zasveispitivaneneonikotinoideprinosekstrakcijesepovećavaosapovećanjemzapremineekstrakcionogsredstvado2,0mL(R>70%),dokdaljepovećanjezapremineekstrak-cionogsredstvado3,0mLnijestatističkiznačajnouticalonapovećanjeprinosaekstrakcije(p < 0,05).Upotreba2,0mLzapremine ekstrakcionog sredstva zadovoljava, takođe, zahteveočuvanjaživotnesredineupotrebommalihkoličinarastvarača.

RadioptimizacijezapreminedisperznogsredstvatestiranesurazličitezapremineACN(bezdo-datka,0,5mL,1,0mL).IspitivanjasupokazaladasebezupotrebedisperznogsredstvanijeostvariloneophodnorazdvajanjekomponenataDLLMEsistema,štojeusaglasnostisarezultatimadobijenimtokom preliminarnih ispitivanjaDLLMEna klotianidinu, a takođe i sa problemomkoji se javljatokomupotrebeklasičnetečno-tečneekstrakcije.Sapovećanjemzapreminedisperznogsredstvado0,5mL,prinosiekstrakcijesvihneonikotinoidasubilivećiod70%,doksusadaljimpovećavanjemzapremineACN,onipadali ispod65%.Mogućeobjašnjenje ležiučinjenicida se sapovećanjemzapremineACNpovećavairastvorljivostneonikotinoidauvodi,asamimtimesmanjujekoeficijentdistribucijeiefikasnostekstrakcije.

4.3.2.4 Optimizacija vremena ekstrakcije i brzine centrifugiranja

Glavna karakteristikaDLLME ekstrakcione tehnike jeste formiranjemikrokapljica ekstrak-cionograstvaračadispergovanoguvodenojfazi.Velikakontaktnapovršinaizmeđunjihrezultiraubrzomprenosumasa,atimeibrzojekstrakciji.

PerformanseDLLMEtehnikesagledavanesuiupotrebomvorteksmešanjauintervalima1–5min.Kaoštojeiočekivano,kodovakvihbrzihekstrakcionihprenosamasa,vremevorteksovanjanijeimaloznačajanuticajnaprinosekstrakcija.Odlučenojedaseupotrebavorteksaod1minkoristipreinakontretmanauultrazvučnomkupatilu.

Uticajtretmanauultrazvučnomkupatilutestiranjeuvremenskomintervaluod5–15min(ura-sponimaod1min).Porastprinosaekstrakcijajeprimećendo10minupotrebeultrazvučnogkupatila(R76,1–114,0%),nakončegavremetretiranjauultrazvučnomkupatilunijeimaloznačajnijeguticajanaprinosekstrakcija.

100


Uticajbrzinecentrifugiranjatestiranjeurasponuod2000–4000omin-1.Povećanjebrojaobrta-japominuti centrifugiranjado2500omin-1povoljno jeuticalonaprinoseekstrakcija,dokdaljepovećanjenijeimaloefektanaprinose,pajebrzinacentrifugiranjaod2500omin-1odabranazadaljaispitivanja.

4.3.3 Matematički model sistem za DLLME

Da bi se odredili optimalni parametri za DLLME tehniku pripreme uzoraka, korišćen jematematičkimodelzasnovannastatističkojobradidobijeniheksperimentalnihpodataka.Metodologi-japovršinaodzivajekorisnametodologijazaprimenuovakvihmodela,jeromogućavaistovreme-no ispitivanjeviše faktora,kao injihovumeđusobnuzavisnostnaminimalnombrojuponovljeniheksperimenata.Dobijeniparametripredloženihkvadratnihmodelanaosnovueksperimentalnihpro-cedura,prikazanisuutabeli4.10.

Tabela 4.10.Centralnokompozitnidizajn,ANOVArezultati,značajnifaktorimodela(A:V(ACN),mL;B:V(DHM),mL)ikriterijumifunkcijepoželjnihodgovora

Neonikotinoid F-vrednost p-vrednostZnačajnifaktorimodela

r2 Adekvatnapreciznost

Kriterijumi

funkcijepoželjnihod-

govora

Dinotefuran 94,12 0,0105 A,B,A2,B2 0,9958 28,80 maksimalan

Nitenpiram 21,05 0,0460 B2 0,9814 11,92 maksimalan

Tiametoksam 27,52 0,0354 B2 0,9857 13,85 maksimalan

Klotianidin 23,60 0,0411 / 0,9833 12,96 maksimalan

Imidakloprid 201,34 0,0049 A,B,A2,B2 0,9980 44,17 maksimalan

Acetamiprid 89,58 0,0111 A,B,A2,B2 0,9956 25,22 maksimalan

Tiakloprid 25,34 0,0384 A,B,A2 0,9845 12,88 maksimalan

Relativnovisokavrednostkoeficijentakorelacijer2označavadobroslaganjedobijeniheksperi-mentalnih podataka sa predloženim modelima. Značajnost svakog koeficijenta je određena Stu-dentovim t-testom i sadobijenomp-vrednošću.Veća t-vrednost imanjap-vrednostodređujuvećiznačajispitivanogkoeficijentaupredloženommodelsistemu.NaosnovudobijenihrezultatamožesezaključitidajezaprinosekstrakcijaneonikotinoidavećiznačajimalazapreminaDHMnegoACN.KvadratniuticajzapremineDHMbio jenajznačajniji,dok jeznačaj interakcijezapreminaACNiDHMtakođeprisutan.Uovomistraživanjusvikoeficijentikorelacijer2bilisuudozvoljenimgrani-cama r2 ≥0,80,označavajućidobroslaganjeeksperimentalnihpodatakasa jednačinamapolinomadrugogreda.Svimodelibilisuznačajnisavrednostimap<0,05.Adekvatnapreciznostoznačavaodnossignal/šum,pričemujeodnos>4poželjnoostvariti.Odnosiadekvatnepreciznostikretalisu

101

Pavle Jovanov

se11,92–44,17(tabela4.10),označavajućiadekvatnesignale,asamimtimiznačajnemodeledatogprocesa.Relativnastandardnadevijacijajemerareproduktivnostimodela,saprihvatljivimvrednos-timaRSD<10%,štojeipostignutozasvemodele.UticajvariranjazapreminaACNiDHMnaprinosekstrakcijeispitivanihneonikotinoidaprikazanjenaslici4.9.Kaoštosemožeprimetiti,postojipikmaksimumprinosaneonikotinoidazaispitivaniopsegzapreminaACNiDHM.Stoga,bilojeneo-phodnooptimizovatiekstrakcioniprocesusmislukorišćenihzapreminaACNiDHM.SviispitivanineonikotinoidipokazalisusličnasvojstvaupogleduuticajazapreminaACNiDHM.

Slika 4.9.Prinosineonikotinoida(R,%)kaofunkcijezapreminaACNiDHM

102


4.3.4 Optimizacija DLLME upotrebom funkcije poželjnog odziva

Rezultati optimizacije ekstrakcione DLLME procedure korišćenjem Deringerove funkcije

poželjnogodzivazamaksimizacijuprinosaispitivanihneonikotinoidapredstavljenisunaslici4.10.

KriterijumizaoptimizacijuprocesasutakoodabranidazapremineACNiDHMostanuutestiranim

granicama,adaseprinosineonikotinoidakrećuka100%(funkcijapoželjnosti1).Kaoštosenaslici

4.10moževideti,najvišavrednostfunkcijepoželjnogodziva(D=0,903)dobijenajeudeluokocen-

tralnetačke,pričemuoptimalnevrednostizapreminaACNiDHMiznose0,54mLzaACNi2,06mL

zaDHM.RadilakšegizvođenjaDLLMEprocedurevrednostidisperznogsredstva(ACN)od0,5mL

iekstrakcionogsredstva(DHM)od2,0mLusvojenesukaooptimalnezadaljaodređivanjaodabranih

neonikotinoida.

Slika 4.10.GrafikpovršineodzivakojiodgovaramaksimumuoptimalnihvrednostizapreminaACNiDHMupostupkuoptimizacijeDLLMEtehnike

4.3.5 Optimizacija MS/MS parametara

Kakobisepostiglodobrorazdvajanjesavisokomosetljivošćuinedvosmislenomidentifikaci-

jomsvihsedamneonikotinoida,uzorcimedapodvrgnutisurazličitimeksperimentimakojisukao

rezultatomogućilidobijanjeoptimalnihuslovaradauređajazanjihovoodređivanje.Istraživanesu

optimalne tranzicije jonaneonikotinoida injihovipripisaniakvizacioniparametriuMRMrežimu

rada.EksperimentisuautomatskiizvođenipomoćuMassHunterWorkstationOptimizersoftvera.

Početno ispitivanjeoptimalnihuslovaMS/MSsistemasesastojalo izdvadela.Uprvomdelu

vršenajeoptimizacijanaponanafragmentoruzasvih7neonikotinoida,kakobiseobezbedionajjači

signalprekursorjona.Pripozitivnojelektrosprejjonizacijimravljakiselinautičenaformiranje[M+H]+

103

Pavle Jovanov

prekursorjona,utičućinaboljuosetljivost,rezolucijuioblikpikova.Svineonikotinoidisuanalizirani

prinaponufragmentoraurasponuod80–150V(ukoracimaodpo10V).Odabranjeoptimalannapon

nafragmentoruzasvakineonikotinoidupoređujućiibirajućinajvećupovršinupikaprekursorjona.

Analizirajućiodabraneneonikotinoideukoncentraciji10,0μgmL-1izabranesukolizioneenergije

(testiranekolizioneenergije5V,10V,15V,20V,25Vi30V)zakvantifikacioneijonezapotvrdu.

Odabraninaponinafragmentoru,kaoiodgovarajućekolizioneenergijezaispitivaneneonikotinoide,

prikazanisuutabeli3.3.NakonoptimizacijeMS/MSparametara,uzorcimedaspajkovanisunakon-

centracijskomnivouGO–100,0µgkg−1,nakončegasuprošliprocedurupripremeuzorakazasnova-

nunaDLLME.Snimljeniukupni jonskihromatogram(TIC)HPLC-MS/MSmetodomspajkovane

koncentracijeodabranihneonikotinoidaod75,0µgkg−1 jeprikazannaslici4.11,demonstrirajući

dobrohromatografskorazdvajanjeispitivanihneonikotinoida.MRMhromatogramnaistomkoncen-

tracijskomnivoujeprikazannaslici4.12,ističućikvantifikacioneipotvrdnetranzicijeipripadajuće

masenespektre.

Slika 4.11.Ukupnijonskihromatogram(TIC):(a)dinotefuran,(b)nitenpiram,(c)tiametoksam,(d)klotianidin,(e)imidakloprid,(f)acetamipridi(g)tiaklopridu75,0µgkg−1spajkovanomuzorku

meda

104


Slika 4.12.MRMhromatogramijonazapotvrduikvantifikacionogjonaiodgovarajućimasenispektridinotefurana,nitenpirama,tiametoksama,klotianidina,imidakloprida,acetamipridai

tiaklopridau75,0µgkg−1spajkovanomuzorkumeda

105

Pavle Jovanov

4.3.6 Ispitivanje uticaja matriksa

Povećanjeilismanjenjeintenzitetasignalaanalita,kaoposledicauticajamatriksa,predstavljaglavniproblemu tečnojhromatografijikuplovanoj samasenomspektrometrijom i jošuvekpred-stavlja otvoreno pitanje za dalja istraživanja. Iako tačanmehanizampovećanja/smanjenja signalapod uticajemmatriksa nije poznat, pretpostavlja se da komponentematriksa utiču na efektivnostjonizacionogprocesa,uzrokujućipozitivneilinegativneefektenakoličinuformiranihjonaanalita.Korišćenjekolone,kojaneomogućavazadovoljavajućerazdvajanjeanalitaodkomponenatauzorkailikoličinakomponenatamatriksauinjektovanomuzorkusunekiodnegativnihfaktorakojiutičunajonizacijuanalita.Efikasnostizdvajanjaanalitaizuzorkasemeriprinosomneonikotinoida.JedanodnačinaprovereuticajamatriksajesteupoređivanjemRdobijenihkorišćenjemkalibracionekrivekonstruisaneupotrebomstandardarastvorenihučistomrastvaračuilimobilnojfazi(eng.solvent cali-bration curve,SC)iMMCkalibracionekrive.UkolikosedobijuvećeRvrednostiupotrebomSCuodnosunaMMC,komponentematriksasuuticalenapovećanjesignala,dokobrnutslučajoznačavasmanjenjesignalapoduticajemmatriksa.DruginačinprovereuticajamatriksakojijekorišćenjesteupoređivanjemnagibaSC iMMCkrivih, čija razlika ukazuje na postojanje povećanja/smanjenjasignalapoduticajemmatriksa.Naosnovupregledaneregulative,trenutnonepostojionakojapro-pisuje dozvoljen uticajmatriksa na analitički signal.Tokom razvijanjaHPLC-MS/MSmetode zaodređivanjeodabranihneonikotinoidaizuzorakamedakorišćenisuMMCrastvori,kakobiseuticajmatriksanaanalitičkiprinoskompenzovao.Uticajmatriksa,kojisemožeprocenitipoređenjemsig-nalakojipotičeodneonikotinoidaumatriksuuodnosunaistisignalučistomrastvaraču,testiranjenadvakoncentracionanivoaneonikotinoida(50,0i75,0µgkg−1).Dobijeniprinosiizračunatinaos-novukalibracionihkrivihstandardaneonikotinoidarastvorenihučistomrastvaraču(SC)ilimatriksu(MMC),prikazanisuutabeli4.11.

Tabela 4.11. PrinosineonikotinoidanaosnovuSC(Rs)iMMC(R)krivih

Neonikotinoid Nivospajkovanja(µgkg-1) Rs(%) R(%)

Acetamiprid75,0 77,8 88,850,0 81,1 92,2

Klotianidin75,0 53,1 78,450,0 56,8 85,9

Dinotefuran75,0 67,0 98,850,0 63,3 100,0

Imidakloprid75,0 77,4 76,150,0 80,3 80,0

Nitenpiram75,0 30,9 98,050,0 33,9 90,0

Tiakloprid75,0 131,0 114,050,0 131,0 100,0

Tiametoksam75,0 71,9 84,050,0 76,9 90,0

106


Interakcijekomponentiispitivanogmatriksamedauticalesunapovećanjeanalitičkihsignalaimidaklopridaitiakloprida,doksuisteinterakcijeprouzrokovalesmanjenjeanalitičkihsignalatiame-toksama,klotianidina,acetamiprida,dinotefuranainitenpirama.Supstancematriksakojeseeluirajuzajednosaneonikotinoidimasahromatografskekolonemoguuzrokovatiproblemprikvantifikacijiistih,zboginterakcijakojeuzrokujupovećanjeilismanjivanjesignala,stimštosmanjenjusignalanajvišepodležusupstancekojeprve izlazesahromatografskekolone.Analizirajućiostvarenepri-nose,možeseprimetitidajenanitenpiram,dinotefuraniklotianidinnajizraženijiuticajmatriksa(R ≤70%).Međutim,prinosiračunatiupotrebomMMCkalibracionekrivebilisuuzadovoljavajućemopsegu(76,1–114,0%).OvajrezultatujednoiukazujenaneophodnostupotrebeMMCkriveudaljemispitivanjuostatakaneonikotinoidauuzorcimameda.

4.3.7 Validacija metode

LinearnostMMCkrivihispitivanihneonikotinoidajetestiranaukoncentracijskomopseguodGO–100,0μgkg−1.Linearnostizraženakaokoeficijentkorelacije(r2)jebilaiznad0,9906zalinearniopsegsvihispitivanihneonikotinoida(tabela4.12).

Tabela 4.12. Retencionavremena(tr),RSDodtriMMCkrivesapripadajućimr2ispitivanihneoni-kotinoida

NeonikotinoidSrednjavred-nosttr (n=15)

(min)

RSDtr (%)

Linearniopseg (µgkg-1) Linearnejednačine

Koeficijentkorelacije

(r2)Dinotefuran 1,58 2,20 2,0-100,0 y=91,9x-146,4 0,9993Nitenpiram 1,79 3,80 1,5-100,0 y=241,9x+1250,1 0,9956Tiametoksam 2,84 3,70 1,0-100,0 y=420,1x-30,9 0,9968Klotianidin 3,89 2,50 2,5-100,0 y=100,1x-322,3 0,9967Imidakloprid 4,59 0,60 1,0-100,0 y=352,4x-1271,1 0,9915Acetamiprid 5,76 1,26 1,0-100,0 y=1259,3x+3675,4 0,9906Tiakloprid 9,94 1,20 1,0-100,0 y=1147,7x+2150,1 0,9980

Selektivnostmetodejeispitivanaanalizom5slepihuzorakamedaikonstatovanojedanemapikovanaretencionimvremenimaneonikotinoidakojipripadajudrugimsupstancamaizmeda.

MRMhromatogrami spajkovanih uzorakameda sa neonikotinoidima na tri koncentracijskanivoa(10,0,25,0 i50,0µgkg-1)suprikazaninaslici4.13,demonstrirajućidobrehromatografskekarakteristikerazvijenemetodesaprinosimaprikazanimutabeli4.13.

107

Pavle Jovanov

Slika 4.13. EkstrahovaniMRMjonskihromatogramispajkovanihuzorakamedasasmesomneo-nikotinoidaa)dinotefuran,b)nitenpiram,c)tiametoksam,d)klotianidin,e)imidakloprid,f)acet-amipridig)tiaklopridna10,0µgkg-1,25,0µgkg-1i50,0µgkg-1koncentracijskimnivoima

Tabela 4.13. Parametritačnostiipreciznostimetodeodređivanjaneonikotinoidaprimenom

DLLMEiHPLC-MS/MSmetode

Neonikotinoid

Nivo

spajkovanja

(µgkg-1)

Tačnost Ponovljivost(n=5)Intermedijernareproduktivnost

(n=3x5)SrednjavrednostR(%) RSD(%) RSDs(%)

Acetamiprid100,0 90,7 4,26 15,3010,0 82,4 4,16 14,70

Klotianidin100,0 96,1 8,16 13,0210,0 74,3 5,12 8,87

Dinotefuran100,0 95,4 9,58 11,7010,0 96,2 8,09 16,20

Imidakloprid100,0 90,6 4,07 6,7010,0 97,5 10,80 13,98

Nitenpiram100,0 89,2 11,00 15,7010,0 104,4 6,66 13,00

Tiakloprid100,0 99,4 2,74 6,6410,0 113,9 10,30 15,60

Tiametoksam100,0 88,2 11,80 13,1010,0 92,1 7,23 12,20

108


Tačnostmetodeprocenjenajenaosnovuispitivanjaprinosaneonikotinoidaipreciznostisagle-davanjemrelativnestandardnedevijacijeza15ponavljanjaanalizenadvakoncetracijskanivoa(10,0μgkg−1i100,0μgkg−1)korišćenjemspajkovanihuzorakamedaiMMCkrivih.NaosnovuUputstvaEUzavalidacijumetodazaodređivanepesticida,srednjavrednostprinosametodebitrebalodasekreće između 70% i 120%za svaki ispitivani koncentracijski nivo saRSD≤ 20% [296].Rezul-tatiprinosaispitivanihneonikotinoidaprezentovaniutabeli4.13,zadovoljavajugorepomenutiuslovvalidacije.Preciznostuuslovimaponovljivostijeispitanaanalizomistoguzorkau5ponavljanjana2koncentracijskanivoautokuistogdana.DobijeneRSDvrednostisusekretaleizmeđu2,74–11,8%,ispunjavajućineophodanuslovRSD≤20%.Preciznostuuslovimaintermedijernereproduktivnostijeodređenaanalizomspajkovanihuzorakamedanaistimkoncentracijskimnivoima,kaoizaispiti-vanjeprinosaiponovljivosti,tokom3dananaistomuređajuodstranerazličitihoperatera.DobijeneRSDvrednostiprikazanesuu tabeli4.13 ikretalesuse između6,64–16,2%,ukazujućinadobrupreciznostrazvijenemetode.

Zaidentifikacijuipotvrduprisustvaispitanihneonikotinoidaneophodnojedabarem2tranzi-cionajonaispitivanoganalitadajuznačajnorazličitsignaluodnosunapozadinskišumtokomMS/MSdetekcije.GranicedetekcijeiodređivanjaodređenesunaosnovupraćenjaS/NodnosakoristećiMMCkrivu.ZaGDodnosS/Njeiznosio3,azaGO10idobijenevrednostisuprezentovaneuta-beli4.14.OviparametrisuodređenianalizomserijeMMCrastvorasaopadajućimkoncentracijama.DobijenevrednostiGObilesumanjeuodnosunaMDKEUzaneonikotinoideumedu[1].ZanekeneonikotinoideMDKobuhvatajuzbirostatakadatogneonikotinoidainjegovihmetabolite,paćeseubudućemradupažnjausmeritiinaispitivanjeovihmetabolita.

Tabela 4.14. GranicedetekcijeiodređivanjaodabranihneonikotinoidasamaksimalnodozvoljenimkoličinamaostatakaneonikotinoidaumeduporegulativiEvropskeunije[1]

Neonikotinoid GD(µgkg-1) GO(µgkg-1) MDKEU(µgkg-1)

Acetamiprid 0,5 1,5 50Klotianidin 1,0 2,5 10Dinotefuran 0,9 2,5 10Imidakloprid 0,5 1,5 50Nitenpiram 0,8 1,8 10Tiakloprid 0,5 1,5 200

Tiametoksam 0,7 1,5 10

4.3.8 Primena HPLC-MS/MS metode na realne uzorke

RazvijenaHPLC-MS/MSmetoda primenjena je za analizu 15 komercijalnih uzorakamedacvetnogporekla.Rezultatisupokazalidaispitivaniuzorcimedanisusadržaliostatkeispitivanihneo-nikotinoida.Primenjivostrazvijenemetodenauzorkemedapokazanajespajkovanjemovihuzorakarazličitimkoncentracijamaneonikotinoida (10,0μgkg−1 i 100,0μgkg−1), nakončega sudobijenirezultatikorišćenitokomvalidacijemetoda(tabela4.13),gdesupokazalidaispunjavajusveuslovepropisanestandardomSANCO/12495/2011[296].Shematskiprikazrazvijene,optimizovaneivali-dovanemetodezaodređivanjeneonikotinoidaumeduprimenomHPLC-MS/MSmetodeprikazanjenaslici4.14.

109

Pavle Jovanov

Slik

a 4.

14.ShematskiprikazodređivanjaneonikotinoidaumeduupotrebomDLL

MEiH

PLC-M

S/MS

110


4.4 Razvoj HPLC-DAD metode za određivanje neonikotinoida u medu primenom DLLME i QuEChERS tehnika

Nakonoptimizacijeirazvojabrze,osetljiveipouzdaneekstrakcionemetode,prikojojseko-

ristemalezapreminerastvaračazaekstrakcijuneonikotinoidaizuzorakamedakojisubiliodređivani

korišćenjemHPLC-MS/MSsistema,daljaistraživanjasusebaziralanadodatnojoptimizacijihro-

matografskihuslova.UpotrebljenajeRSM,kakobiodređenioptimalnihromatografskiusloviobez-

bediliosetljivoiselektivnoodređivanjeodabranihneonikotinoidaupotrebomDAD.Natajnačinbi

seomogućilonjihovoodređivanjeukontrolnimlaboratorijama,koje,zbogjošuvekvisokeceneMS/

MSdetektora,imajumogućnostsamoHPLC-DADodređivanja.

4.4.1 Optimizacija hromatografskih uslova

NeonikotinoidisupolarnajedinjenjasaapsorpcionimmaksimumomuUVoblastispektra.Iztog

razlogaHPLC-DADjejednaodnajzastupljenijihmetodaodređivanjaneonikotinoida.Korišćenjem

uređaja koji imamogućnost istovremenedetekcije upotrebomDAD iMS/MSdetektora pruža se

prilikanedvosmislenogodređivanjaneonikotinoidaizrazličitihuzoraka.Preliminarnaispitivanjasu

izvedenaradipronalaženjaoptimalnihhromatografskihuslovauciljuzadovoljavajućeghromatograf-

skograzdvajanjaodređivanihneonikotinoidasadovoljnomosetljivošću.

Smesa standardnih rastvora neonikotinoida (100,0μgL-1) je upotrebljena za ispitivanje op-

timalnihhromatografskihparametara.Različitebrzineprotokamobilnefaze, temperaturekolone i

talasnedužinetestiranesukakobiseodredilinajuticajnijiparametriradinajboljegrazdvajanjakom-

ponenatazaštokraćevremetrajanjaanalize.Naosnovudobijenihrezultatatestiranogtemperaturnog

intervalaod20–40°C,odabranajetemperaturakoloneod30°C.Apsorpcionimaksimumiispitivanih

neonikotinoidabilisuna266nmzaklotianidin,dinotefuraniimidaklopridina244nmzanitenpiram,

tiametoksam,acetamipriditiakloprid.

Odnosrastvaračamobilnefazetokomanalize,kaoibrzinaprotokamobilnefazesuoptimizovani

korišćenjemRSMupotrebomBox-Behnken dizajnaproceduromopisanomueksperimentalnomdelu

disertacije.

Ispitivanjem dodeljenih verovatnoća, odgovori sistema za rezoluciju su pokazali opti-

malnevrednostikorišćenjemkvadratnihmodela,doksuodgovorisistemazaretencionavremena

korišćenjemlinearnihmodeladalioptimalnevrednosti.Krivepovršineodzivalinearnihikvadrat-

nihmodelakojiutičunakompoziciju rastvaračamobilne faze ibrzineprotokamobilne fazesu

prikazanenaslici4.15.

111

Pavle Jovanov

Slika 4.15.Površineodgovorakvadratnihmodela1-6)rezolucijeizmeđuodgovarajućihpikovaR2-1–R7-6i7,8)linearnihmodelaretencionihvremenaprvogiposlednjegpikatr1 i tr7ufunkciji

odnosasastavamobilnefazepriprotokumobilnefazeod0,7mLmin-1

Hromatograminaslici4.16ilustrujurazličitarazdvajanjaneonikotinoidaprimenomrazličitihopsegafaktoraispitivanihpomoćumetodologijepovršineodziva.Kaoštosemožeprimetitisaprika-zanihhromatograma,različitebrzineprotokamobilnefazeirazličitsastavmobilnefazeuzrokovaojepojavurazličitograzdvajanjaneonikotinoida.Optimizacijomprocesaupotrebommetodologijepovršineodzivapostignutojeoptimalnorazdvajanjeneonikotinoida(slike4.18,4.20ai4.21).

112


Slik

a 4.

16. H

romatogrami(266nm

)odabranihneonikotinoidaprirazličitimuslovima:a)izokratskirežim:B

-80%

,protok0,6mLmin

-1b)gradijentnirežim:(0min

B90%

–6minB75%

–10minB90%

),protok0,65mLmin

-1c)gradijentnirežim:(0minB90%

–6minB60%

–10minB90%

),protok0,65mLmin

-1d)gradijentni

režim:(0minB90%

–6minB75%

–10minB90%

),protok0,8mLmin

-1e)gradijentnirežim:(0minB90%

–6minB60%

–10minB90%

),protok0,8mLmin

-1f)

gradijentnirežim:(0minB90%

–6minB80%

–10minB90%

),protok0,7mLmin

-1;1)dinotefuran,2)nitenpiram,3)tiametoksam,4)klotianidin,5)imida-

kloprid,6)acetamipridi7)tiakloprid

113

Pavle Jovanov

PodacidobijenistatističkomobradomkorišćenjemANOVAanalizezasvemodeleprikazanisuutabeli4.15.Uovomistraživanjusvikoeficijentikorelacijebilisuudozvoljenimgranicamar2 ≥0,80,označavajućidobroslaganjeeksperimentalnihpodatakasajednačinamapolinomadrugogreda.Svimodelibilisuznačajnisavrednostimap <0,05.Adekvatnapreciznostoznačavaodnossignal/šum,pričemujepoželjnoostvaritiodnos>4.Odnosiadekvatnepreciznostikretalisuseod5,61–25,99, označavajući adekvatne signale, a samim tim, i značajnemodele datogprocesa.Relativnastandardnadevijacijajemerareproduktivnostimodela,saprihvatljivimvrednostimaRSD<10%,štojeipostignutozasvemodele.Sagledavanjemuslovaikriterijumafunkcijepoželjnihodziva,sprove-denajeproceduraoptimizacije.OptimalniuslovisupostignutisamaksimalnomukupnomfunkcijompoželjnihodzivaD=0,977.Grafikodzivapovršinakojiodgovaramaksimumuoptimalnihvrednostiprikazanjenaslici4.17.Koordinatenagrafikupredstavljajuoptimalnehromatografskeuslove,prikojimseudeokomponenteA(ACN)umobilnojfazipovećavalinearnood10do40%tokom6min,sakonstantnombrzinomprotokaod0,7mLmin-1.

Tabela 4.15. Box-Behnkendizajn,odabranimodeli,ANOVArezultati,faktori(A-udeoACNumo-bilnojfazi,%;B-trajanjegradijenta,min;C-protokmobilnefaze,mLmin-1)ikriterijumifunkcijepoželjnihodziva

Odziv sistema Model

F-

vrednost

P-

vrednost

Značajni faktori modela

Koeficijent korelacije, r2

Adekvatna preciznost

Kriterijumi funkcije

poželjnih odgovora

tr1(dinotefuran) linearni 7,96 0,0029 A,B 0,8474 9,84 ≥1min

R2-1(nitenpiram-

dinotefuran)kvadratan 15,33 0,0008 A,AB,C2 0,9517 9,45 ≥2

R3-2(tiametoksam-

nitenpiram)kvadratan 98,81 <0,0001 A,B,AB,A2,

B2,C2 0,9922 25,99 ≥2

R4-3(klotianidin-

tiametoksam)kvadratan 13,21 0,0013 A,AB,AC,A2,

C2 0,9444 11,46 ≥2

R5-4(imidakloprid-

klotianidin)kvadratan 6,64 0,0103 B,AB,BC,

A2,C2 0,8951 9,35 ≥2

R6-5(acetamiprid-

imidakloprid)kvadratan 3,68 0,0408 AB,C2 0,8256 5,61 ≥2

R7-6(tiakloprid-

acetamiprid)kvadratan 17,03 0,0006 A,AB,AC,

B2,C2 0,9563 11,66 ≥2

tr7(tiakloprid) linearni 23,80 <0,0001 B,C 0,8460 16,03 minimalan

114


Slika 4.17.Grafikodgovorapovršinakojiodgovaramaksimumuoptimalnihvrednosti

ValidacijametodakojekoristeRSMoptimizovanehromatografskeparametre je sprovedenaudaljemispitivanju.RetencionavremenasvihispitivanihneonikotinoidapodovakvimuslovimasubilakonstantnasaRSD≤0,1%(tabela4.16).

Tabela 4.16. Retencionavremena(tr),granicedetekcije iodređivanjaneonikotinoidakorišćenjemDLLMEiQuEChERSprocedurasamaksimalnodozvoljenimkoličinamaostatakaneonikotinoidauRepubliciSrbiji[2]iEvropskojuniji[1]umedu

Pripremauzorka DLLME QuEChERS

Neonikotinoid

Srednjavrednosttr(n=15)(min)

RSDtr (%)

RSMDK

(µgkg-1)

EUMDK

(µgkg-1)

GD

(µgkg-1)

GO

(µgkg-1)

GD

(µgkg-1)

GO

(µgkg-1)

Dinotefuran 1,6 0,02 10,0 10,0 2,0 5,0 2,5 7,5Nitenpiram 2,5 0,06 10,0 10,0 2,5 7,5 2,5 7,5Tiametoksam 3,9 0,01 10,0 10,0 2,0 5,0 2,5 7,5Klotianidin 4,6 0,01 10,0 10,0 2,5 7,5 2,5 10,0Imidakloprid 4,9 0,01 50,0 50,0 1,5 5,0 2,0 5,0Acetamiprid 5,4 0,10 10,0 50,0 2,0 5,0 2,5 7,5Tiakloprid 6,4 0,02 200,0 200,0 1,5 5,0 2,5 7,5

115

Pavle Jovanov


Ispitivanjeuticajamatriksanaprinose(HPLC-DAD)ispitivanihneonikotinoidasprovedenojeupotrebomMMCrastvora.Uovomdeluistraživanjauticajmatriksa(SSE,supresija/povećanjesigna-la,eng.signal suppression / enhancment)jeodređivanzaceolinearniopsegmerenja,upoređivanjemodnosa nagibaMMC i SC kalibracionih krivih za svaki neonikotinoid. Dobijene vrednosti kojekarakterišuuticajmatriksauslučajukorišćenjaDLLMEiQuEChERStehnikazapripremuuzorakasuprikazaneutabeli4.17.Uticajmatriksakojisemanifestujepovećanjemilismanjenjemanalitičkogsignala je primećenkod svih ispitivanihneonikotinoida.Uzorci koji subili pripremljeniQuECh-ERSproceduromsuispoljilivećiuticajmatriksanaanalitičkisignalvećineneonikotinoidauodno-sunauzorkepripremljeneDLLMEprocedurom.Mogućeobjašnjenjepostojanja razlikeuuticajumatriksauslučajudveprimenjeneprocedurepripremeležiuvećojpolarnostiekstrakcionogsredstvakorišćenoguQuEChERSproceduri.Većapolarnostekstracionogsredstva(ACN)možedauzrokujeboljuekstrakcijupolarnihjedinjenjaizmeda,kojase,zajednosaneonikotinoidimaekstrahuju,štoseodražavanaprinoskojipotičeodnjihovoganalitičkogsignala,štojeuskladusaranijimliteraturnimzapažanjima[174].

Od ispitivanih neonikotinoida dinotefuran i imidakloprid su bili najviše podložni uticajimamatriksabezobziranaprocedurupripremeuzoraka.Uticajmatriksaispitivanjeianaliziranjempri-nosaanalitičkogsignalaispitivanihneonikotinoidaprimenomDLLMEtehnikepripremeuzorakanaistimkoncentracijskimopsezimaiHPLC-MS/MSsistema.DobijenevrednostikojekarakterišuuticajmatriksauslučajukorišćenjaDLLMEtehnikezapripremuuzoraka,prikazanesuutabeli4.18,autabeli4.19upoređenisuuticajimatriksapriprimeniMS/MSiDADdetektora.Možesezapazitidajeuticajmatriksanaanalitičkisignaldinotefuranabio izraženijiuslučajuMS/MS,apostrofirajućimanjurobusnostovemetodeodređivanja.

Ispitivanjeuticajamatriksaje još jednomukazalonaneophodnostkorišćenjaMMCkalibra-cionihkrivihzaodređivanjeneonikotinoida.

116


Tab

ela

4.17

. Uticajmatriksa–SSE

,korišćenjem

DLL

MEiQ

uEChERSproceduraračunatkaoodnosnagibaMMCiSC

krivihispitivanihneonikoti-

noidaupotrebomHPL

C-DADsistem

a

MMC-DLL

ME

MMC-QuEChERS

SCSSE(%

)

Neonikotinoid

Jednačinapravezaopseg

GO–100,0µgkg

-1Koeficijent

korelacije(r

2 )Jednačinapravezaopseg

GO–100,0µgkg

-1Koeficijent

korelacije(r

2 )Jednačinapravezaopseg

1,5–100,0µgL

-1

Koeficijent

kore

laci

je

(r2 )

DLL

ME

QuEChERS

Dinotefuran

y=0,072x+0,3558

0,9978

y=0,0645x+0,5262

0,9967

y=0,1025x-0,1079

0,9989

70,2

62,9

Nitenpiram

y=0,1413x+0,2528

0,9978

y=0,1217x+0,5614

0,9981

y=0,1044x+0,3504

0,9987

135,3

116,5

Tiam

etoksam

y=0,0843x-0,1814

0,9958

y=0,0686x-0,0345

0,9956

y=0,0898x-0,1527

0,9981

93,8

76,4

Klotianidin

y=0,1238x-0,4552

0,9946

y=0,097x+0,3541

0,9985

y=0,1168x-0,2302

0,9995

105,9

83,0

Imidakloprid

y=0,1157x+0,0314

0,9954

y=0,1253x+0,1978

0,9994

y=0,1736x-0,0653

0,9973

66,6

72,2

Acetamiprid

y=0,1785x+0,4996

0,9966

y=0,1544x+1,3129

0,9988

y=0,1811x+0,2967

0,9982

98,5

85,2

Tiakloprid

y=0,097x+0,3541

0,9985

y=0,1112x+0,0327

0,9983

y=0,1409x+0,2324

0,9986

68,8

78,9

117

Pavle Jovanov

Tabela 4.18. Uticajmatriksa–SSE,korišćenjemDLLMEprocedureračunatkaoodnosnagibaMMCiSCkrivihispitivanihneonikotinoidaupotrebomHPLC-MS/MSsistema

MMC-DLLME SC

NeonikotinoidJednačinapraveza

opseg

GO–100,0µgkg-1


(r2)

Jednačinapravezaopseg

1,5–100,0µgL-1


(r2)

SSE(%)

Dinotefuran y=334,51x+1319 0,9890 y=1119x-5132,1 0,9988 29,9

Nitenpiram y=645,54x+1472,1 0,9958 y=728,03x+1125,9 0,9933 88,6

Tiametoksam y=552,46x-178,3 0,9981 y=593,92x+479,85 0,9983 93,0

Klotianidin y=41,673-16,939 0,9999 y=41,808x+180,67 0,9953 99,7

Imidakloprid y=338,76x-106,7 0,9980 y=334,38x+968,73 0,9909 101,3

Acetamiprid y=472,31x+866,59 0,9946 y=525,98x-332,6 0,9995 89,8

Tiakloprid y=252,16x+550,63 0,9920 y=306,67x-153,36 0,9995 82,2

Tabela 4.19.Uticajmatriksa na analitičke signaleMS/MS iDADdetektora upotrebomDLLMEtehnikepripremeuzorakameda

SSE(%)Neonikotinoid MS/MS DADDinotefuran 29,9 70,2Nitenpiram 88,6 135,3Tiametoksam 93,0 93,8Klotianidin 99,7 105,9Imidakloprid 101,3 66,6Acetamiprid 89,8 98,5Tiakloprid 82,2 68,8


Nakonoptimizacije hromatografskih uslova razvijenametoda (HPLC-DAD) za određivanjeneonikotinoidaupotrebomDLLMEiQuEChERSprocedurazapripremuuzorakajevalidovan.Testi-ranilinearniopseg(GO–100,0μgkg−1)jerezultiraodobijanjemkoeficijenatakorelacijeiznad0,9946,kao štojeprikazanoutabeli4.18.SpecifičnostmetodeutvrđenajeidentifikacijomanalitanaosnovuupoređivanjanjegovogUVapsorpcionog spektra i retencionogvremena sa istim identifikacionimkarakteristikamaodgovarajućegstandardnograstvoraanalita.Odgovarajućihromatografskipikovi,kojiodgovarajuanalitičkimsignalimakojipotičuodispitivanihneonikotinoida,identifikovanisusazadovoljavajućimS/Nodnosom,bezometajućihpikovanaistimretencionimvremenimaslepeprobe,čimejepotvrđenadobraselektivnostrazvijenemetode.Hromatogramismesestandarda(50,0μgL-1),MMCrastvora,spajkovanihuzorakamedaislepeprobeprikazanisunaslici4.18.

Tačnostmetodeprocenjenajenaosnovuispitivanjaprinosaneonikotinoida,apreciznostmetodesagledavanjemrelativnestandardnedevijacijeza5ponavljanjanatrikoncentracijskanivoa(10,0,50,0i100,0μgkg−1)korišćenjemspajkovanihuzorakameda,pripremljenihDLLMEproceduromiMMCkalibracionihkrivih.

118


Rezultatiprinosautabeli4.20supotvrdilizadovoljavajućutačnostmetode(optimalanprinos70–120%naispitanimkoncentracijskimnivoimasaRSD≤20%).UglavnomnižiprinosinitenpiramaidinotefuranakorišćenjemDLLMEprocedureuodnosunaQuEChERSprocedurumoguseobjasnitinjihovomvećompolarnošćuuodnosunaostaleneonikotinoide.

PrinosiostalihneonikotinoidabilisuvećiprikorišćenjuDLLMEtehnikezapripremuuzor-aka. Preciznostmetode u uslovima ponovljivosti i intermedijerne reproduktivnosti korišćenjemDLLMEtehnikepripremeuzorakaiskazanajevrednostimaRSDod3,28–10,40%zaponovljivosti6,45–14,24%za intermedijernureproduktivnost.Preciznostmetodeuuslovimaponovljivosti iintermedijerne reproduktivnosti korišćenjemQuEChERS tehnike pripreme uzoraka iskazana jevrednostimaRSD3,99–10,22%zaponovljivosti9,12–17,70%zaintermedijernureproduktivnost.IzračunatevrednostiRSDukazujunadobrupreciznostrazvijenemetode.DobijenevrednostizaGDiGOsuprikazaneutabeli4.16.PripremauzorakakorišćenjemDLLMEjeomogućiladostizanjenižihvrednostizaGDiGOuodnosunapripremuuzorakaupotrebomQuEChERSprocedure.DobijenevrednostizaGOsubilenižeuodnosunaEUMDKzaneonikotinoideumedu.MožeseprimetitidasuvrednostiGOdobijeneHPLC-MS/MSmetodomnižeuodnosunaHPLC-DADmetodu.

Tabela 4.20. ParametrivalidacijemetodeodređivanjaneonikotinoidaprimenomHPLC-DADsistema

Neonikotinoid

Nivo

spajkovanja

(µgkg-1)

Tačnost,srednjavrednostpri-nosa,R(%) Ponovljivost(n=5),

RSD(%)

Intermedijernare-produktivnost

(n=3x5),RSD(%)

DLLME QuEChERS DLLME QuEChERS DLLME QuECh-ERS

Dinotefuran

100,0 88,4 89,2 4,37 7,04 8,12 9,48

50,0 78,5 83,6 4,36 7,83 11,30 12,63

10,0 106,1 95,3 6,32 8,65 7,54 12,05

Nitenpiram

100,0 116,1 97,3 3,50 7,88 12,14 11,41

50,0 84,5 88,5 5,25 10,22 6,45 9,81

10,0 107,4 96,1 6,73 8,85 8,87 16,40

Tiametoksam

100,0 77,6 73,8 10,40 4,87 8,98 12,50

50,0 94,5 85,7 7,48 9,45 7,57 14,65

10,0 112,9 81,9 8,22 7,42 13,56 14,87

Klotianidin

100,0 105,4 85,2 5,40 7,24 10,24 12,31

50,0 99,3 81,3 4,12 7,23 14,32 16,87

10,0 118,3 88,4 5,46 6,35 14,24 13,80

Imidakloprid

100,0 94,6 89,9 4,32 6,58 8,74 17,70

50,0 108,5 80,8 3,75 3,99 10,45 14,18

10,0 73,4 79,9 7,63 4,78 12,21 15,02

Acetamiprid

100,0 92,5 89,5 8,23 9,14 8,74 11,80

50,0 104,6 88,2 4,54 10,20 8,58 10,45

10,0 84,1 77,6 4,62 9,87 11,47 16,13

Tiakloprid

100,0 104,4 88,0 3,28 6,51 8,88 9,12

50,0 97,3 84,5 5,68 5,74 14,10 10,07

10,0 89,3 83,6 5,22 6,37 7,71 12,08

119

Pavle Jovanov

Slika 4.18.HPLC-DADhromatogramina266nmstandardaneonikotinoidakoncentracije50,0μgL-1 1),MMCrastvora50,0μgkg-12),spajkovanihuzorakameda50,0μgkg-13)islepeprobe4).Oznake:a)dinotefuran;b)nitenpiram;c)tiametoksam;d)klotianidin;e)imidakloprid;f)acetamiprid;g)tiak-

loprid

4.4.4 Primena metode na realne uzorke

Nakonoptimizacijaekstrakcionogpostupkaihromatografskihuslovazaispitivanjeodabranihneonikotinoidauuzorcimameda,validovanametodaprimenjenajezaanalizuuzorakamedapriku-pljenihsateritorijeAutonomnePokrajineVojvodinetokom2013.godine(slika3.2).Nakonispiti-vanjamalogbrojauzorakaradirazvijanjametoda,opsegispitivanjajeproširenna104uzorkamedaito:51uzoraksuncokretovogmeda,26uzorakalivadskogmeda,22uzorkabagremovogmedai5uzorakalipovogmeda.Kakosukarakteristikeobemetodezapripremuuzoraka(DLLMEiQuECh-ERS)bilezadovoljavajuće,uzorcisupripremanikorišćenjemQuEChERSprocedure.

Rezultatiispitivanjapokazalisudajetiaklopridodređenu5uzoraka(ujednomukoncentraciji29,12μgkg-1,kojajedalekoispodMDKiu4uzorkaunivouGO);imidaklopridu4uzorkaukoncen-tracijamananivouGO;tiametoksamjedetektovanu5uzoraka(GD<detektovanavrednost<GO)(slika4.19).KonfirmacijarezultatadobijenihprimenomHPLC-DADsistemajeizvedenanaHPLC-MS/MSuređaju,pričemujepostignutoslaganjerezultatazadvasistemadetekcijeneonikotinoida.

120


Slika 4.19.UdeouzorakamedakojisusadržavalineonikotinoidiznadGDodispitanih104uzorka

4.5 Razvoj HPLC-MS/MS metode korišćenjem DLLME i QuECh-ERS tehnika za određivanje odabranih neonikotinoida u likeru od

meda [176]Razvijena,optimizovanaivalidovanametodaodređivanjaneonikotinoidaumeduprimenom

HPLC-MS/MSsistemaprimenjenajezaanaliziranjeuzorakalikeraodmeda-medice.Sobziromnatodaseovajlikerpravimešanjemmedaiodređenevoćnerakije,postojiopasnostdaseostacineo-nikotinoidaumedunađuiuovomtradicionalnomalkoholnomnapitku.Upoređivanesudvetehnikepripremeuzoraka,DLLMEiQuEChERS,čijeproceduresuopisaneuEksperimentalnomdeludis-ertacije.

Testiranajemogućnostrazdvajanjaiodređivanjaneonikotinoidaupotrebomrazličitihhromato-grafskihkolona.Ispitanesudvehromatografskekolone(1)Kolona#1,ZORBAXEclipseXDB-C18,i(2)Kolona#2,ZORBAXEclipsePlusC8nakojimasuanaliziranistandardnirastvoriodabranihneonikotinoida,koncentracije75,0μgL-1.Komponentesueluiraneugradijentnomrežimuopisanogueksperimentalnomdeludisertacije(3.6.HPLC-DAD/MS/MSuslovirada)idetektovaneMS/MStehnikom.Naosnovuretencionihvremena,kaoivećerezolucijerazdvajanjaizabranajeC18kolonazadaljaispitivanja.Naslici4.20prikazanisuekstrahovaniMRMjonskihromatogramismesestan-dardaneonikotinoidarazdvojenihupotrebomopisanihhromatografskihkolona.

121

Pavle Jovanov

PrimenjenisuoptimizovanihromatografskiusloviiMS/MSparametriprikazaniuEksperimen-talnomdeludisertacije (3.6.HPLC-DAD/MS/MSuslovi rada). Ispitivanineonikotinoidi suovommetodomispoljilistabilnaretencionavremenasaRSD<2,1%(tabela4.21).

Tabela 4.21.Retencionavremenaistandardnadevijacijaretencionihvremenaispitivanihneonikoti-noida

Neonikotinoid Srednjavrednosttr(n=15)(min)

RSDtr (%)

Dinotefuran 2,22 1,20Nitenpiram 3,37 1,20Tiametoksam 4,35 2,10Klotianidin 5,05 1,50Imidakloprid 5,38 0,80Acetamiprid 5,84 1,46Tiakloprid 6,86 0,90

Slika 4.20.EkstrahovaniMRMhromatogramistandardnesmeseneonikotinoida(75,0μgL-1)a)dinotefuran;b)nitenpiram;c)tiametoksam;d)klotianidin;e)imidakloprid;f)acetamiprid;g)tiak-loprid;1)ZORBAXEclipseXDB-C18kolona;2)ZORBAXEclipsePlusC8kolona

122



Jedan od glavnih nedostataka koji se pripisujeHPLC-MS/MS određivanju jesu problemi uodređivanjukojimogunastatiusleduticajamatriksa.Uispitivanjulikeraodmeda,korišćenjeMMCrastvorajekompenzovaloovajuticaj,kojiseogledausmanjenjuilipovećanjuanalitičkogsignalaanalita,usleduticajaostalihkomponenatamatriksa.Kaoprimer,naslici4.21prikazanjepreklopljenMRMhromatogramsmesestandarda ispitivanihneonikotinoidakoncentracije50,0µgL-1 iMMCrastvornaistomkoncentracijskomnivou.KorišćenajeQuEChERStehnikaprečićavanjauzorakazapripremuMMCrastvora.

Slika 4.21. EkstrahovaniipreklopljeniMRMhromatogrami50,0µgL-1standardnogiMMCrast-voraneonikotinoida(a)dinotefuran;b)nitenpiram;c)tiametoksam;d)klotianidin;e)imidakloprid;f)acetamiprid;g)tiakloprid).Većepovršinepikovaneonikotinoidaodgovarajuneonikotinoidimau

standardnomrastvoru

Uticajmatriksa likeraodmedanaodzivanalitičkogsignalaneonikotinoida ispitivan jenaistinačinkaoiuslučajumatriksameda,upoređivanjemnagibaSCiMMCkrivih.Nadalje,uticajmatriksaispitivanjeiuzavisnostiodnačinapripremeuzoraka(DLLMEiQuEChERS),kaoštojeiprikazanoutabeli4.22.Komponentematriksasuuticalenasmanjenjeanalitičkogsignalasvihneoni-kotinoidanezavisnoodnačinapripremeuzoraka.VelikosmanjenjesignalaprimećenojekorišćenjemQuEChERSprocedure,štosemožeobjasniti,kaoiuslučajumatriksameda,upotrebompolarnijegekstrakcionogsredstva(ACN)kojejemogloekstrahovatiidrugepolarnekomponenteizmatriksaporedneonikotinoida.Uticajmatriksabiojenajizraženijiuslučajunitenpirama,dinotefuranaitiame-toksama.Kaoiuprethodnimslučajevimaispitivanjauticajamatriksa,odnosnoupotrebaMMCkrivihjeustanovljenakaoneophodnazatačnoodređivanjeneonikotinoidauuzorcimalikeraodmeda.

123

Pavle Jovanov

Tabe

la 4

.22.

Uticajmatriksa–SSE

korišćenjem

DLL

MEiQ

uEChERSprocedurazapripremuuzorakaizračunatkaougaoodnosaM

MCiSC

krivih

ispitivanihneonikotinoidaupotrebomHPL

C-M

S/MSsistem

a

MMC-DLL

ME

MMC-QuEChERS

SCSSE(%

)

Neonikotinoid

Linearnajednačinaza

opsegGO–100,0µgL-

1Koeficijent

korelacije(r

2 )Linearnajednačinaza

opsegGO–100,0µgL-

1Koeficijentkore-

lacije(r

2 )Linearnajednačinaza

opseg1,0–100,0µgL

-1

Koeficijent

korelacije(r

2 )DLL

ME

QuEChERS

Dinotefuran

y=93,5x+3818,1

0,9981

y=80,0x-791,5

0,9973

y=127,7x-1957,3

0,9979

73,2

62,6

Nitenpiram

y=123,4x+11130,0

0,9978

y=73,0x-1113,9

0,9951

y=202,8x-2083,3

0,9985

60,8

36,0

Tiam

etoksam

y=103,5x+15012,0

0,9985

y=78,4x-557,5

0,9970

y=152,7x-1752,0

0,9988

67,8

51,3

Klotianidin

y=34,4x-506,8

0,9987

y=35,6x-464,8

0,9982

y=37,1x+344,3

0,9991

93,0

96,2

Imidakloprid

y=87,5x-930,3

0,9990

y=73,1x-856,5

0,9984

y=109,1x-1993,1

0,9990

80,2

66,9

Acetamiprid

y=258,1x-2003,0

0,9974

y=210,7x-2285,7

0,9989

y=296,0x-1847,4

0,9991

87,3

71,2

Tiakloprid

y=186,3x+12379,0

0,9980

y=181,6x-1815,4

0,9981

y=196,1x-7992,5

0,9993

95,0

92,6

124



Razvijena ioptimizovanametodazaodređivanjeneonikotinoidauuzorcima likeraodmeda

upotrebomDLLMEiQuEChERSprocedurazapripremuuzorakajevalidovana.Analiziranopseg

(GO–100,0μgkg−1)jebiolinearaniimaojekoeficijentekorelacijeiznad0,9970,kaoštojeprikazano

utabeli4.22.

Specifičnostmetode utvrđena je identifikacijom analita na osnovu jona prekursora i produ-

katakaoirelativnogretencionogvremenasaistimidentifikacionimkarakteristikamaodgovarajućeg

standardnograstvoraanalita.Odnosijonaispitivanihanalitasupokazaliuglavnomslaganje±10%

saistimodnosomjonaurastvorimastandarda.Odgovarajućihromatografskipikovikojiodgovaraju

analitičkimsignalimakojipotičuodispitivanihneonikotinoidasuidentifikovanisazadovoljavajućim

S/Nodnosombezometajućihpikovanaistimretencionimvremenimaslepeprobe,pajetakopotvrđena

dobraselektivnostrazvijenemetode.Hromatogramispajkovanihuzorakalikeraodmedaneonikoti-

noidimana3koncentracijskanivoa(10,0μgkg-1,25,0μgkg-1i50,0μgkg-1)zavisnoodprocedura

pripremauzorakaprikazanisunaslici4.22,saprinosimaprikazanimutabeli4.23.

Tačnostmetodeprocenjena jenaosnovu ispitivanja sistematskegreške, iskazanepresečnim

prinosomneonikotinoida,apreciznostjeizraženarelativnomstandardnomdevijacijomza8ponav-

ljanjanatrikoncentracijskanivoa(10,0μgkg-1,25,0μgkg-1i100,0μgkg-1),određenihanalizom

spajkovanihuzorakalikeraodmedaiMMCkrivih.

Rezultatiprinosa,datiutabeli4.23supotvrdilioptimalanprinos(prihvatljivopseg70–120%

na ispitanim koncentracijskim nivoima saRSD≤ 20%).Niži prinosi nitempirama i dinotefurana

korišćenjemDLLMEprocedure u odnosu naQuEChERSproceduru semogu objasniti njihovom

većompolarnošćuuodnosunaostaleneonikotinoide.

NjihovelogPvrednostizatečno-tečnuoktanol-vodaraspodelusubile-0,66zanitenpirami

-0,55zadinotefuran,doksuselogPvrednostizaostaleneonikotinoidekretaleizmeđu-0,24i1,26

[174].SobziromnatodaseuDLLMEtehnicikoristidihlormetankaoekstrakcionosredstvo,au

QuEChERSacetonitril,očekivanajeboljaekstrakcijaovihpolarnijihkomponentiQuEChERSpro-

cedurom.PrinosiostalihneonikotinoidasubilivećikorišćenjemDLLMEtehnike.

Preciznost metode izražena u uslovima ponovljivosti i intermedijerne reproduktivnosti

korišćenjemDLLME tehnikepripremeuzoraka imavrednosti zaRSDuopseguod3,21–10,20%

zaponovljivosti9,11–16,62%zaintermedijernureproduktivnost.UslučajukorišćenjaQuEChERS

tehnikezapripremuuzorakaiRSDjeuintervaluod4,19–12,81%zaponovljivosti11,32–16,40%

zaintermedijernureproduktivnost.IzračunatevrednostiRSDupućujunadobrupreciznostrazvijene

metode.DobijeneGD iGO vrednosti su prikazane u tabeli 4.24. Priprema uzoraka korišćenjem

125

Pavle Jovanov

DLLMEtehnikeomogućilajedostizanjenižihGDiGOvrednostiuodnosunapripremuuzoraka

upotrebomQuEChERSprocedure.Izuzetakjebiouslučajutiametoksama,kojijeimaoistevrednosti

zaGDiGOuslučajuprimeneobeprocedurezapripremuuzoraka.Imidaklopridiacetamipridpoka-

zalisuniževrednostiGDiGOuslučajuprimeneQuEChERSprocedure.DobijenevrednostizaGO

subilenižeiliisteuodnosunaEUMDKzaneonikotinoideumedu

.

Tabela 4.23. ParametrivalidacijemetodeodređivanjaneonikotinoidaulikeruodmedaprimenomHPLC-MS/MSsistema

Neonikotinoid Nivospajkovanja (µgkg-1)

Tačnost,srednjavrednostprinosa,R(%)

Ponovljivost(n=5),RSD(%)

Intermedijernareproduktivnost(n=3x5),

RSD(%)

DLLME QuEChERS DLLME QuEChERS DLLME QuEChERS

Dinotefuran50,0 73,6 79,2 3,27 4,19 13,30 13,5525,0 71,8 88,6 4,16 5,77 14,70 13,7010,0 73,5 80,3 5,32 8,65 14,68 14,05

Nitenpiram50,0 74,3 77,8 6,50 7,88 10,32 13,2125,0 72,2 88,4 7,20 12,32 11,52 15,3410,0 69,2 76,6 8,13 12,81 11,80 16,40

Tiametoksam50,0 80,4 83,1 9,30 9,87 12,45 12,8025,0 78,3 85,3 9,45 8,45 16,63 13,6510,0 85,2 80,2 10,2 9,32 15,32 14,87

Klotianidin50,0 88,3 80,7 5,60 6,84 9,48 12,3125,0 80,2 71,8 7,08 8,26 12,63 12,8710,0 83,7 78,9 8,46 9,00 13,05 14,92

Imidakloprid50,0 92,1 86,8 4,32 7,33 9,12 13,6125,0 90,1 80,3 5,68 6,89 13,00 14,5210,0 85,9 78,2 6,02 7,87 12,88 14,02

Acetamiprid50,0 103,9 88,7 3,75 6,36 9,35 11,3225,0 83,3 78,0 4,63 7,04 9,66 11,6010,0 89,9 77,4 5,66 7,83 11,41 14,06

Tiakloprid50,0 89,5 78,7 3,21 6,72 9,11 12,7025,0 113,4 94,9 3,88 9,28 9,67 11,9810,0 90,3 73,2 4,07 8,93 12,04 12,84

126


Slika 4.22.MRMhromatogramispajkovanihuzorakalikeraodmedasasmešomneonikotinoidaa)dinotefuran;b)nitenpiram;c)tiametoksam;d)klotianidin;e)imidakloprid;f)acetamiprid;g)tiak-lopridnanivouod10,0,25,0i50,0µgkg-1korišćenjem1)DLLME,realniuzoraklikeraodmedasa

pikomklotianidinajeoznačeni2)QuEChERSprocedurezapripremuuzoraka

127

Pavle Jovanov

Tabela 4.24. GranicedetekcijeigraniceodređivanjaodabranihneonikotinoidaulikeruodmedasamaksimalnodozvoljenimkoličinamaostatakaneonikotinoidaumeduporegulativiEvropskeunije[1]

Neonikotinoid MDKEUzamed(µgkg-1)

DLLME QuEChERS

GD(µgkg-1) GO(µgkg-1) GD(µgkg-1) GO(µgkg-1)

Dinotefuran 10,0 1,5 5,0 2,5 10,0Nitenpiram 10,0 1,5 5,0 2,5 10,0Tiametoksam 10,0 1,0 2,5 1,0 2,5Klotianidin 10,0 1,0 2,5 1,5 5,0Imidakloprid 50,0 1,5 5,0 1,0 2,5Acetamiprid 50,0 1,5 5,0 1,0 2,5Tiakloprid 200,0 0,5 1,0 1,0 2,5

4.5.3 Primena metode na realne uzorke

Razvijenametodaprimenjenjeza ispitivanje10uzorakalikeraodmeda.Sviuzorcisupri-

premljenikorišćenjemDLLMEprocedure.Od ispitivanihneonikotinoida (tabela4.25)uuzorcima

likeraodmedanađenjeklotianidin(ujednomuzorkuukoncentracijiod2,7µgkg-1),atiaklopridje

detektovanudvauzorkaukoncentracijskomnivouispodGO.Naosnovurezultataispitivanjamože

se zaključiti da je razvijenaHPLC-MS/MSmetodapokazalaodličnu selektivnost i osetljivost za

određivanjeneonikotinoidauuzorcimalikeraodmeda.

128


Tabela 4.25. Rezultatianalizeneonikotinoidauuzorcimalikeraodmeda,(GD<detektovano<GO)

Oznakeuzoraka DINOTEFURAN NITENPIRAM TIAMETOKSAM KLOTIANIDIN IMIDAKLOPRID ACETAMIPRID TIAKLOPRID

1 <GD <GD <GD <GD <GD <GD <GD

2 <GD <GD <GD <GD <GD <GD detektovano


4 <GD <GD <GD 2,7µgkg-1 <GD <GD <GD



7 <GD <GD <GD detektovano <GD <GD <GD


9 <GD <GD <GD <GD <GD <GD detektovano


4.6 Ispitivanje mogućnosti uklanjanja odabranih neonikotinoida iz vodene sredine

Ova serija ispitivanja sprovedena je sa ciljemutvrđivanjamogućnosti uklanjanja odabranih

neonikotinoida(dinotefurana,klotianidina,tiakloprida)izvodenesredine(rekeDunav).Eksperimen-

tikojisuobuhvatali ispitivanja6različitihvrstauklanjanjaodabranihneonikotinoida(uprisustvu

prirodneinsolacijeprilaboratorijskimuslovima,sadodatkomH2O2,sadodatkomMWCNT,sado-

datkomMWCN+H2O2,sadodatkomFe-MWCNT,sadodatkomFe-MWCNT+H2O2),podrazume-

valisuupotrebuprethodnorazvijeneHPLC-MS/MSmetodezaispitivanjeefikasnostiprimenjenog

postupka.Nakonsprovedeniheksperimenataopisanihueksperimentalnomdeludisertacije (3.4.4.

Proceduraispitivanjamogućnostiuklanjanjaodabranihneonikotinoidaizvode),rezultatiispitivanja

ostatakaodabranihneonikotinoidauuzorcimadunavskevodeprikazanisuiprodiskutovaniuovom

poglavlju(tabela4.26).

129

Pavle Jovanov

Vreme

tretiranja

Bez

dod

atak

aDodatakH

2O2

DodatakM

WCNT

Dodatak

MWCNT+

H2O

2DodatakFe-MWCNT

DodatakFe-

MWCNT+

H2O

2

dan

min

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

konc.

(µgmL-

1 )uklonjeno

(%)

1

00,99

0,00

0,99

0,00

0,99

0,00

0,99

0,00

0,99

0,00

0,99

0,00

Dinotefuran

1

0,99

0,00

0,93

6,06

0,92

7,07

0,95

4,04

0,99

0,00

0,90

9,09

50,99

0,00

0,91

8,08

0,85

14,14

0,82

17,17

0,95

4,04

0,88

11,11

100,90

9,09

0,91

8,08

0,84

15,15

0,77

22,22

0,91

8,08

0,79

20,20

200,87

12,12

0,79

20,20

0,73

26,26

0,74

25,25

0,84

15,15

0,77

22,22

300,80

19,19

0,64

35,35

0,72

27,27

0,50

49,49

0,78

21,21

0,66

33,33

600,75

24,24

0,57

42,42

0,71

28,28

0,48

51,52

0,58

41,41

0,63

36,36

7

0,65

34,34

0,20

79,80

0,67

32,32

0,46

53,54

0,48

51,52

0,55

44,44

10

0,50

49,49

0,10

89,90

0,32

67,68

0,34

65,66

0,48

51,52

0,31

68,69

14

0,49

50,50

0,04

95,96

0,29

70,71

0,26

73,74

0,40

59,60

0,18

81,82

10

1,19

0,00

1,19

0,00

1,19

0,00

1,19

0,00

1,19

0,00

1,19

0,00

klotianidin

11,19

0,00

0,73

39,66

0,97

18,49

0,82

31,09

1,13

5,04

0,88

26,05

5

1,16

2,52

0,24

79,83

0,76

36,13

0,74

37,82

1,11

6,72

0,88

26,05

10

1,15

3,36

0,07

94,12

0,72

39,50

0,62

47,90

1,05

11,76

0,78

34,45

20

1,11

6,72

0,04

96,63

0,70

41,18

0,53

55,46

1,02

14,29

0,71

40,34

300,98

17,64

0,00

100,00

0,70

41,18

0,54

54,62

0,88

26,05

0,68

42,86

600,90

24,37

0,00

100,00

0,62

47,90

0,53

55,46

0,87

26,89

0,60

49,58

7

0,79

33,61

0,00

100,00

0,61

48,74

0,46

61,34

0,78

34,45

0,38

68,07

10

0,64

46,21

0,00

100,00

0,35

70,59

0,36

69,75

0,58

51,26

0,07

94,12

14

0,57

52,10

0,00

100,00

0,18

84,87

0,20

83,19

0,52

56,30

0,02

98,32

10

1,00

0,00

1,00

0,00

1,00

0,00

1,00

0,00

Tiakloprid

11,00

0,00

0,77

23,00

0,61

39,00

0,63

37,00

50,98

2,00

0,72

28,00

0,40

60,00

0,31

69,00

100,86

14,00

0,68

32,00

0,35

65,00

0,24

76,00

200,86

14,00

0,65

35,00

0,32

68,00

0,19

81,00

300,79

21,00

0,46

44,00

0,31

69,00

0,17

83,00

600,73

27,00

0,29

71,00

0,28

72,00

0,16

84,00

7

0,71

29,00

0,07

93,00

0,23

77,00

0,12

88,00

10

0,61

39,00

0,03

97,00

0,15

85,00

0,05

95,00

14

0,52

48,00

0,00

100,00

0,10

90,00

0,03

97,00

Tabe

la 4

.26.Rezultatiispitivanja

mogućnostiuklanjanjaodabranih

neonikotinoida

130


4.6.1 Ispitivanje razgradnje neonikotinoida u laboratorijskim uslovima

Koreliranjemvremenatokomkogajeuzorakdržanpodprirodnominsolacijomulaboratorijisaodnosompočetne(c0)iaktuelnekoncentracije(c)odabranihneonikotinoida(tabela4.26)možesezaključitidaunavedenomsistemudolazisamodoblagepromenekoncentracijeciljnihanalita.Naime,tokom60minutatretmanaukupnosmanjenjekoncentracijedinotefurana,klotianidinaitiak-loprida(slika4.23)uodnosunapočetnekoncentracijeiznosioko25%.

Naosnovukoreliranjac/c0savremenom(t)možeseuočitidauperioduizmeđu10i30min,dolazidobržegopadanjakoncentracijedinotefurana(tabela4.26islika4.24),azatimizmeđu30i60min,procesuklanjanjaseusporava.Procesuklanjanjaklotianidinapriprirodnojinsolacijiulabo-ratorijskimuslovimamožeseokarakterisatiumerenoefikasnimuklanjanjemklotianidinado20min,zatimuperiodudo30.minefikasnijimiuposlednjojetapiuklanjanjado60.minseponovoodvijaumereno.Procesuklanjanjatiaklopridamožeseokarakterisatidvemaetapama,prvomdo10.min,kadajeprocesubrzanidrugometapomod10.do60.min,kadaprocestečeumerenimintenzitetom.

OvirezultatipotvrđujudazabrzoiefikasnouklanjanjeodabranihneonikotinoidaizvodeDu-navanijedovoljnasamaenergijasunca,negojepotrebnoobezbeditiihemijskireagenspogodanzaoksidacijuciljnoganalita(npr.vodonik-peroksid)iliadsorbenskojimožedaukloniciljnianalitnaosnovufizisorpcije(npr.ugljeničnenanocevi).

Slika 4.23.MRMhromatogramtranzicije(m/z253→126,0)snimljentokomispitivanjarazgradnjetiaklopridauuzorkuvodeDunavapoduticajemprirodnesvetlostitokom60min

131

Pavle Jovanov

Slika 4.24.Kriveuklanjanjaklotianidina,dinotefuranaitiaklopridaprilaboratorijskimuslovimauperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

4.6.2 Ispitivanje razgradnje neonikotinoida pod uticajem H2O2

UslučajuuklanjanjaodabranihneonikotinoidauprisustvuH2O2,kojipredstavljaizvorhidrok-sil-radikala(•OH)poduticajemsunčevesvetlosti(kojamožedaprouzrokujefotohemijskorazlaganjeH2O2,zbogUVBzračenjapriλ<310nm)[299]možesezapazitiumerenapromenaintenzitetasigna-lanaretencionomvremenudinotefurana,dokseuslučajuklotianidinaitiaklopridasituacijaznačajnorazlikuje.Analitičkisignaldinotefurana(slika4.25),dobijenuprisustvuH2O2ipodprirodnomin-solacijomulaboratorijskimuslovimautrajanjuod60min,ukazujenauklanjanjeciljnoganalitaodoko40%,dokjepodistimuslovimaH2O2uzrokovaogubitaktiaklopridaodoko70%,aklotianidinaupotpunosti.

132


Slika 4.25.MRMhromatogramtranzicije(m/z203→129,1)snimljentokomispitivanjarazgradnjedinotefurnauuzorkuvodeDunavaprilaboratorijskimuslovimaiuprisustvuH2O2utrajanjuod60

minuta

Dobra stranaovakvog tipauklanjanjaneonikotinoida jeste činjenicada jevodonik-peroksid

jeftinagensidaseposleizvesnogvremenaisamrazlaženaproizvodebezbednepoživotnusredinu

- H2O i O2.Važnojevoditiračunaopogodnojkoncentracijivodonik-peroksidautakvimsistemima,

a važno je pratiti i eventualne degradacione intremedijere nastale tokom oksidativne degradacije

neonikotinoida.

Tokomprvihdesetminutauklanjanjadinotefuranadolazidopromenekoncentracijedinotefu-

rana,pričemuseuklanjaoko10%ciljnoganalita,dokjeuistomperioduuklonjenooko30%tiak-

loprida,aklotianidinačakpreko90%(slika4.26).

Uslučajudinotefuranaovajvremenskiintervalod10minsepoklapasainicijacionimperio-

dom kod eksperimenta bezH2O2.U slučaju tretmana uzorka između 10.minuta i 30.minuta uz

stalnomešanje, iuprisustvuH2O2,možesesmatratida jedegradacijadinotefuranapseudo-prvog

reda.Upoređujućikonstantebrzineuklanjanjadinotefuranaulaboratorijskimuslovimaiuprisustvu

vodonik-peroksidauzprirodnuinsolaciju,možesezaključitidasepripočetnojkoncentracijivodonik-

peroksidaod125mmolL-1iciljnoganalitaod0,99µgmL-1procesrazgradnjeubrzavazaoko3puta.

Prisustvo H2O2prouzrokovalo jebrzu ipotpunurazgradnjuklotianidinaza20min,svrstavšiovaj

hemijskiagensupogodnasredstvazapotpunorazlaganjeklotianidina.Procesuklanjanjatiakloprida

semožeokarakterisatiudveetape,odkojihjejednado20.min,adrugaod20.mindo60.min.

133

Pavle Jovanov

Slika 4.26.Kriveuklanjanjadinotefurana,klotianidinaitiaklopridapriuslovimaprirodneinsolacijeuprisustvuH2O2uperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

4.6.3 Ispitivanje uklanjanja neonikotinoida upotrebom MWCNT

Pored pomenutih sistema koji uključuju prirodnu svetlost i/ili hemijski agens, treći razma-

traninačinuklanjanjaodabranihneonikotinoidauključujeadsorpcijuciljnoganalitanavišezidnim

ugljeničnim nanocevima (MWCNT).Na slici 4.27 prikazane suMWCNT i gvožđem dekorisane

višezidne ugljenične nanocevi (Fe-MWCNT) snimljene skenirajućim elektronskimmikroskopom

(eng.scanning electron microscope-SEM)irezultatimikroanalizeX-zracima(eng.energy dispersive

x-ray spectrometry-EDS).MožeseprimetitidaMWCNTobrazujuspiralneisprepletanepovršinesa

jasnoizraženomvelikomdodirnompovršinom(slika4.27b).Takođe,EDSspektargvožđemdekori-

sanihMWCNTnedvosmislenoukazujenapostojanjeFeustrukturiMWCNT.

134


Slika 4.27.a)SEMizgledMWCNTpriuvećanjuod1000puta,b)SEMizgledMWCNTpriuvećanjuod50000puta,c)SEMizgledFe-MWCNT,d)EDSspektarFe-MWCNT(slikab

uzdozvoluprof.drGoranaBoškovićainjegovihsaradnika)

Naosnovukoreliranjac/c0iodgovarajućihtvrednosti(slika4.28)možeseuočitidasedobi-jajukrivesaturacijezasvatriispitivananeonikotinoida.Dopotpunogiskorišćenjakapacitetadolaziizmeđu10i20minutatretmanaprikoncentracijidinotefuranaod0,99µgmL-1ikoncentracijisus-pendovanihnanočesticaod0,4mgmL-1.Ovimpostupkommožedaseuklonioko30%dinotefuranaizvodenogmatriksa,daklenanocevivežusamomalukoličinuukupnogdinotefurana.Uslučajuad-sorpcijeklotianidinatokomvremenskogperiodaod60minadsorbujeseoko50%,stimdasesatu-racijananocevidešavaveomabrzo,nakon5min.MožesezapazitidaMWCNTnajvišeadsorbujutiakloprid,jersenakon5minadsorbujepreko60%tiakloprida.Naosnovupostignutihrezultatasemožezaključitida seafinitetneonikotinoidapremaMWCNTpovećavasa smanjenjempolarnostiispitivanihneonikotinoida.

135

Pavle Jovanov

Slika 4.28.Kriveuklanjanjadinotefurana,klotianidinaitiaklopridapriuslovimaprirodneinsolacijeuprisustvuMWCNTuperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

PoštoovajtipnanoceviitestiranakoličinaMWCNTpokazujeumerenuefikasnostpriuklanjanjuciljnoganalita,modifikovaniobliciadsorbensailikombinacijaMWCNTsapogodnimhemijskimagen-somsurazmatranikaopotencijalnisistemizapoboljšanjeefikasnostiuklanjanjaovihjedinjenja.

UkombinacijisaH2O2,MWCNTpokazujuboljusposobnostuklanjanjaodabranihneonikoti-noidaizsistema.Sposobnostuklanjanjapoboljšanajeod15–50%,uzavisnostiodispitivanogneo-nikotinoida (slika4.29).Sličan trenduočenpriuklanjanjuneonikotinoidauprisustvuH2O2 (slika4.29),kaoipridodatkusamoMWCNT,ukazujenavezuizmeđupolarnostineonikotinoidaiafinitetaMWCNTzaadsorpciju.

136


Slika 4.29.Kriveuklanjanjadinotefurana,klotianidinaitiaklopridapriuslovimaprirodneinsolacijeuprisustvuMWCNTiH2O2uperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

Druga ispitivana mogućnost poboljšanja efikasnosti MWCNT jeste modifikovanje njihovepovršinesagvožđem.IspitivanineonikotinoididinotefuraniklotianidinispoljilisurazličitaponašanjaprilikomdodatkaFe-MWCNT(slika4.30).Primećenojesmanjenjekoncentracijedinotefuranaodoko40%uvremenskomperioduod60min(slike4.30i4.31),kojejevećeuodnosunasmanjenjeuprisustvuMWCNT,dokjeuslučajuklotianidinamodifikovanjepovršineMWCNTsagvožđemdovelodosman-jenjamogućnostiadsorpcijeuodnosunaMWCNT.Ako50%klotianidinajeuklonjenonaovajnačin.

137

Pavle Jovanov

Slika 4.30.KriveuklanjanjadinotefuranaiklotianidinapriuslovimaprirodneinsolacijeuprisustvuFe-MWCNTuperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

Slika 4.31.MRMhromatogramtranzicije(m/z203→129,1)snimljentokomispitivanjarazgradnjedinotefurnauuzorkuvodeDunavaprilaboratorijskimuslovimaiuprisustvuFe-MWCNTutrajanju

od60minuta

138


Poslednjaispitivanamogućnostuklanjanjaodabranihneonikotinoidaizvodenesredineobuhvatilaje dodatak H2O2 usistempriprirodnojinsolacijisadodatkomFe-MWCNT(slika4.32).Uslučajudi-notefuranadodatakH2O2jeusporionjegovouklanjanjeizsistemauodnosunasistemkojijesadržaosamoFe-MWCNTu posmatranom intervalu od 60min, dok jeH2O2 najverovatnije uslovio bržesmanjenjekoncentracijedinotefuranauodnosunasistemsaFe-MWCNT,posmatrajućiperiododdvenedelje.UklanjanjeklotianidinajeefikasnijesadodatkomH2O2uodnosunasistemsaFe-MWCNTuperioduod60min.Naosnovusvegauočenog,možesezaključitidajeuklanjanjeodabranihneo-nikotinoidauslučajuFe-MWCNTdrugačijeuodnosunaMWCNT.

Slika 4.32.KriveuklanjanjadinotefuranaiklotianidinapriuslovimaprirodneinsolacijeuprisustvuFe-MWCNTiH2O2uperioduod60minsamogućimmatematičkimkoreliranjemtačaka

Važnojeistaćiipitanjeeventualnihnepoželjnihposledicananomaterijalapoživotnusredinuizdravlje.Jednaodprednostinjihovogkorišćenjabibila tadakadasenađemoduszauklanjanjeorganskihzagađujućihmaterijasaugljeničnihnosača,oneposlužekaogorivniizvorizbogvisokogenergetskogsadržaja.Posmatrajućiispitivanesistemeukojimajeanaliziranamogućnostuklanjanjaodabranihneonikotinoidamože sekonstatovati da je zauklanjanjedinotefurananajpovoljniji biosistemsadodatkomMWCNTiH2O2posmatrajućiperiodod60min,dokjeuperioduoddvenedeljenajpovoljnijibiosistemsadodatkomsamoH2O2priprirodnojinsolacijiulaboratorijskimuslovima(slika4.33-3).ZauklanjanjeklotianidinanajvišejedoprineododatakH2O2,pričemujesavklotiani-dinuklonjenuperioduod30min.NauklanjanjetiaklopridaizvodenesredinenajvećiuticajimaojedodatakkombinacijeMWCNTiH2O2usistempriuslovimaprirodneinsolacije.

139

Pavle Jovanov

Slika 4.33.Efikasnostrazličitihsistemanauklanjanjeodabranihneonikotinoida1)tiaklopri-da,2i4)klotianidina,3i5)dinotefuranaizdunavskevode

4.6.4 Mogući intermedijeri

Tokomprocesauklanjanjaodabranihneonikotinoidaizvodenesredine[300],organskekompo-nentesemogupotpunomineralizovatidougljen-dioksidaivode.Međutim,ponekadpolaznajedin-jenjanepodležupotpunojmineralizaciji,pasemožeočekivatipojavanovih jedinjenjanastalih izpolaznihkomponenti,kojaveomačestomogubitisajošizraženijimštetnimsvojstvima.

Analiziranjem masenih spektara proizvoda degradacije odabranih neonikotinoida, prilikomnjihovoguklanjanja izvodene sredineu različitimgoreopisanimsistemima,došlo sedo saznanjao mogućim nastalim intermedijerima. Snimanjem HPLC-MS hromatograma u scan režimu radai analiziranjem masenih spektara uočeni su intermedijeri na retencionom vremenu 1,70 min saodgovarajućimm/zod117,5i140,6uslučajudinotefuranausistemimasaH2O2,MWCNT+H2O2,Fe-MWCNT+H2O2,klotianidinausistemuFe-MWCNT+H2O2,dokuslučajutiaklopridanisudetek-tovaniintermedijeri.Mogućeobjašnjenjeležiučinjenicidajeuovimeksperimentimarađenaanaliza

140


tragovaodabranihneonikotinoida,pajestogazadetaljnijuanalizuintermedijerapotrebnouključitiširiopsegkoncentracijaneonikotinoida,štoćebitipredmetnekihdaljihistraživanja.

Masenispektridetektovanihintermedijeraprikazanisunaslici4.34.Analiziranjempolaznihstrukturapretpostavljasedanastaliintermedijersamolekulskommasomod117možedabudehi-droksi-3-(aminometil)-tetrahidrofuran,prikazannaslici4.35.

Slika 4.34.MasenispektrimogućihintermedijeraA)m/z117,5;B)m/z140,6

Slika 4.35.Mogućahemijskastrukturanađenogintermedijerasam/z117,5(hidroksi-3-(aminometil)-tetrahidrofuran)

Poglavlje 5

5. ZAKLJUČAK

Pavle Jovanov

143

Insekticidi novije generacije, neonikotinoidi, odlikuju se specifičnim načinom delovanja nanervni sistem insekata.Uodređenimuslovimaneonikotinoidimogudapredstavljaju opasnost pomedonosnepčele,anjihoviostacimogusepojavitiukošnicamaiupčelinjimproizvodimapoputmeda.Medkarakterišustrogizahtevikvalitetaizdravstvenebezbednostipropisanizaovajproizvodiproizvodenabazimeda.

Radidobijanjaštobrže ikvalitetnije informacijeo izloženostiživotnesredineoviminsekti-cidimaikoličinamanjihovihostatakauhranipotrebnojeraspolagatiodgovarajućiminstrumental-nimmetodamazanjihovoodređivanje.Razvijenesuioptimizovaneanalitičkemetodezasnovanenatečnojhromatografijizaodređivanjesedamodabranihneonikotinoida(dinotefurana,nitenpirama,tia-metoksama,klotianidina,imidakloprida,acetamipridaitiakloprida)umeduilikeruodmeda.Poredoptimizacije procesa ekstrakcije odabranih neonikotinoida iz ovih uzoraka i optimizacijeHPLC-DAD-MS/MSuslova,testiranajeimogućnostuklanjanjaodabranihneonikotinoidaizvodenesre-dineupotrebomhemijskihagenasaivišezidnihugljeničnihnanocevi.Naosnovusvihsprovedenihispitivanjaidobijenihrezultatamogusedefinisatisledećizaključci:

• Razvoj metode za određivanje klotianidina u medu primenom tečno-tečne i ekstrakcije na čvrstoj fazi i HPLC-DAD analize

Ispitivanajemogućnostodređivanjaklotianidinapomoćutečnehromatografijevisokeefikas-nostisadetektroromodnizadioda(HPLC-DAD)primenomkombinacijetečno-tečneiekstrakcijenačvrstojfaziizuzorakameda.Linearnaoblastmerenjatestiranajeuužemintervalukoncentracijaod1,0–7,5µgmL-1.Kaoprvafazaprimenjenajetečno-tečnaekstrakcija,azatimprečišćavanjepomoćučvrsto-fazne ekstrakcije.Može se zaključiti da je prečišćavanje uzorakameda sa poznatom kon-centracijom klotianidina primenomkombinacije tečno-tečne ekstrakcije i čvrsto-fazne ekstrakcijeefikasnijezamalekoncentracijereziduaumedu(0,5µgg-1)(prinos≈70%),dokjezavećekoncen-tracijeneophodnomodifikovatiprocedurupripremezbogmogućegprezasićenjačvrsto-faznekolonezaprečišćavanjeilinekogdelaprocedurepripremekojiprouzrokujegubitakklotianidina(prinos≈46%).Naosnovupreliminarnih rezultatamože se zaključiti da korišćenje čvrsto-faznih kolonaukombinacijisatečno-tečnomekstrakcijomdihlormetanomrezultiraprihvatljivimprinosomklotian-idinauuzorcimamedaprikoncentracijiodoko0,5µgg-1klotianidina.Daljaistraživanjabilasuus-merenanarazvojdrugihekstrakcionihtehnikakojebiobezbedilevišiprinosneonikotinoida.

• Razvoj metode za određivanje klotianidina u medu primenom DLLME tehnike i HPLC-DAD analize

Nakondobijanjamalihprinosaklotianidinaprimenomkombinacijetečno-tečneičvrsto-fazneekstrakcijeodabranajedisperznatečno-tečnamikroekstrakcija(DLLME)kaotehnikapripremeuzor-akameda.RadioptimizacijeDLLMEtehnikeneophodnojebiloispitatiparametrekojiutičunaefikas-nostodabranetehnike.Testiranajeupotrebaacetonitrilaihloroformakaodisperznogiekstrakcionogsredstva.Rezultatiprinosaklotianidinapokazali suda seubrizgavanjemacetonitrila i hloroformapomoćušpricanepostižeformiranjedobrogdisperznogsistema,pajeiekstrakcijanezadovoljavajućasaneadekvatnimprinosomodsvega48,35%.Poredhloroforma,korišćenjeidihlormetankaodrugo


144

ekstrakcionosredstvo,kakobiseuporedilaefikasnostekstrakcijeuodnosunahloroform.Zabeleženisuprinosiklotianidinaod69,7i68,3%uzavisnostidalijekorišćenhloroform,odnosnoDHMkaorastvor za ekstrakciju.Prilikom razvijanja štopogodnijemetode ekstrakcijeustanovljeno je da jeprinosvećisasmesomdisperzionogsredstvaiekstrakcionograstvorauodnosunakorišćenjesamogekstrakcionograstvorabezdisperznogsredstva.Sahromatogramaseuočavadajeprinosekstrakcijemanjiprilikomkorišćenja1,0mLDHMuodnosunakorišćenje2,0mLDHM,štoukazujeda jeprilikomanalizeuzorakamedaspajkovanihsastandardomklotianidinaoptimalanodnoszapreminauzorkaiekstrakcionograstvora5:2.Ovajodnos,takođe,impliciradajeboljaupotrebavećekoličineekstrakcionograstvorakadaseklotianidinekstrahujeizkompleksnihmatriksa,poputmeda,uodnosunačiststandardnirastvor,kojijeimaovisokiprinosisaodnosom5:1.Daljeispitivanjeobuhvatilojetestiranjezapremineuzorkakojajepotrebnazauspešnoekstrahovanje,kaoizapremineACNiDHM.Možesezaključitidajeprinosekstrakcijebiopovoljnijipriodnosu0,5mLACNi2,0mLDHM.Količineuzorkamanjeod5mLsusepokazalenezadovoljavajućimzaoptimalnoizvođenjeeksperi-menta.Prinosisusekretaliod68,4%do92,1%,štojeukazalodasuparametriDLLMEekstrakcijeoptimalni.

• Optimizacija metode za određivanje odabranih neonikotinoida u medu primenom DLLME i HPLC-MS/MS analize

NakonispitivanjaoptimalnihparametaraDLLMEtehnikezaklotianidin,izvršenajeoptimi-zacijaDLLMEnanačindaprinosi ekstrakcija budu iznad70%za sve ispitivaneneonikotinoide.KakobisedetaljnijeispitaliključniparametriDLLMEtehnike,korišćenajemetodologijapovršineodziva(RSM),kaoidetekcijanaosetljivijemkuplovanommasenomdetektoru(MS/MS).Prelimi-narna ispitivanjaosobinaDLLMEtehnikedovela sudozaključakaonajbitnijimfaktorima (zapr-eminidisperznogiekstrakcionogsredstva)kojiutičunaprinoseove tehnikeekstrakcijeuslučajuuzorakamedakojisadržineonikotinoide.OptimizovanisuHPLC-MS/MSparametrikakobiseobez-bedilozadovoljavajućehromatografskorazdvajanjeiniskegranicedetekcije(GD,0,5–1,0μgkg-1)iodređivanja(GO,1,0–2,5μgkg-1)ispitivanihneonikotinoidaumedu.Upotrebomcentralnokompoz-itnogdizajnakonstruisanisukvadratnimodeliispitivanihfaktora:zapremineekstrakcionog(DHM,1,0–3,0mL)idisperznog(ACN,0,0–1,0mL)sredstva,izračunatistatističkiparametriioptimizovanprocesDLLMEupotrebomDerringer-ovefunkcijepoželjnihodgovora.UpotrebomMMCiSCkrivihuopseguGO–100,0μgkg-1ispitanjeuticajmatriksapričemuzaključenojedajenajvećiuticajmatriksabionaodzivanalitičkogsignalanitenpirama,dinotefuranaiklotianidina.Razvijenaioptimizovanameto-daodređivanja7neonikotinoidajevalidovana,kakobiseispunilineophodnikriterijumizavalidnostanalitičkihmetodauEU.Ispitanisuprinosiodabranihneonikotinoida(R,74,3–113,9%),kaoipre-ciznostmetodeuuslovimaponovljivosti(RSD,2,74–11,8%)iintermedijernereproduktivnosti(RSD,6,64–16,2%).Brza (retencionavremena1,5–9,9min) iosetljivametoda,koja trošimalukoličinurastvarača,primenjenajezaispitivanje15realnihuzorakamedarazličitogcvetnogporekla.RezultatisupokazalidaispitivanimednijesadržaoostatkeispitivanihneonikotinoidaukoncentracijamaiznadGD.

Pavle Jovanov

145

• Razvoj HPLC-DAD metode za određivanje neonikotinoida u medu primenom DLLME i QuEChERS tehnika

CiljovogistraživanjabiojeirazvijanjeioptimizacijaHPLC-DADanalitičkemetodeupotre-bomDLLMEiQuEChERStehnikazapripremuuzorakazaodređivanje7neonikotinoidauuzorcimameda.NakonoptimizacijeDLLMEparametarauovomdeluistraživanjaoptimizovanisuihromato-grafski parametri, upotrebomRSM saBox-Behnken-ovim dizajnom iDerringer-ovom funkcijompoželjnihodgovora.Postavljenjegradijentnisistemeluiranjaanalitapriprotokuod0,7mLmin-1.Određenesutalasnedužineprikojimasuodređivanineonikotinoidi(266nmzaklotianidin,dinote-furan,imidaklopridi244nmzanitenpiram,tiametoksam,acetamipriditiakloprid).Uticajmatriksanacelom linearnomopsegumerenjaLOQ–100,0μgkg-1 ispitivan jekorišćenjemSC iMMCka-libracionihkrivihračunanjemodnosanjihovihnagiba.Odispitivanihneonikotinoidadinotefuraniimidakloprid su bili u najvećojmeri izloženi uticajumatriksa, bez obzira na proceduru pripremeuzoraka.AnaliziranajeiosetljivostmetodemerenjemodzivaanalitičkihsignalaneonikotinoidaupotrebomMMCkalibracionihkrivihidetekcijomsaDADiMS/MSdetektorima.MožeseistaćidajeuticajmatriksanaanalitičkisignaldinotefuranabioizraženijiuslučajuMS/MS,apostrofirajućimanjurobusnostovemetodeodređivanja.Ispitivanjeuticajamatriksajejošjednomukazalonaneo-phodnostkorišćenjaMMCkalibracionihkrivihzaodređivanjeneonikotinoida.Optimizovanameto-dajevalidovana.Prinosineonikotinoidasu(R,73,1–118,3%),preciznostuuslovimaponovljivosti(RSD, 3,28–10,40%) i intermedijerne reproduktivnosti (RSD, 6,45–17,70%), a granice detekcije(GD,1,5–2,5µgkg-1)iodređivanja(GO,5,0–10,0µgkg-1).Razvijena,optimizovanaivalidovanametodaprimenjenajezaispitivanje7neonikotinoidau104uzorkamedarazličitogcvetnogporeklasateritorijeAutonomnePokrajineVojvodine.Detektovanojeprisustvotiakloprida,imidaklopridaitiametoksamaukoličinamakojesubileispodMDKRSiEU,alijenjihovoprisustvopotvrdiloneo-phodnostkontrolisanjaovakvevrsteproizvoda.

• Razvoj HPLC-MS/MS metode korišćenjem DLLME i QuEChERS tehnika za određivanje odabranih neonikotinoida u likeru od meda

Likerodmeda-medicaspadautradicionalnaalkoholnapićasaovihprostora,aproizvodisemešanjemmedasaodređenomvoćnomrakijom,štonosiopasnostdaseostacineonikotinoidaumedunađuiuovomtradicionalnomalkoholnomnapitku.Razvijena,optimizovanaivalidovanametodaodređivanjaneonikotinoidaumeduprimenomHPLC-MS/MSsistemaprimenjenajezaanaliziranjeuzorakalikeraodmeda-medice.Upoređivanesudvetehnikepripremeuzoraka,DLLMEiQuECh-ERS i primenjeni optimizovani hromatografski uslovi iMS/MS parametri. Testirana je i upotrebarazličitihhromatografskihkolona,pričemujezadaljaispitivanjaodabranaonakojajeomogućilakraćaretencionavremenaispitivanihneonikotinoidauzzadovoljavajućerazdvajanje(XDB-C18:50mm× 4,6mm,1,8μm).Komponentematriksasuuticalenasmanjenjeanalitičkogsignalasvihneonikotinoidanezavisnoodnačinapripremeuzoraka.Uslučajunitenpirama,dinotefurana i tiametoksamauticajmatriksabiojenajizraženiji.Uispitivanjulikeraodmeda,korišćenjeMMCrastvorajekompenzo-valouticajmatriksa.Metodajevalidovanaodređivanjemprinosaneonikotinoida(R,69,2–113,4%),preciznostiuuslovimaponovljivosti(RSD,3,21–12,81%)iintermedijernereproduktivnosti(RSD,


146

9,11–16,63%),kaoigranicedetekcije(GD,0,5–2,5µgkg-1)iodređivanja(GO,1,0–10,0µgkg-1).Analizom10komercijalnodostupnihlikeraodmedaotkrivenojeprisustvoklotianidinaitiakloprida,štoukazujenaneophodnostdaljegkontrolisanjaovogproizvodanaprisustvoneonikotinoida.

• Ispitivanje mogućnosti uklanjanja odabranih neonikotinoida iz vodene sredine

Ispitanajemogućnostuklanjanjaodabranihneonikotinoida(dinotefurana,klotianidinai tiak-loprida) iz vodene sredine (reke Dunav) obogaćene ciljnim analitima. Ispitivanje efikasnosti 6različitih vrsta uklanjanja odabranih neonikotinoida (u prisustvu prirodne insolacije, sa dodatkomH2O2,sadodatkomMWCNT,sadodatkomMWCN+H2O2,sadodatkomFe-MWCNT,sadodatkomFe-MWCNT+H2O2)vršenojeupotrebomprethodnorazvijeneHPLC-MS/MSmetodezaodređivanjeneonikotinoidauuzorcimamedailikeraodmeda.Kriveuklanjanjaodabranihneonikotinoida,kojesukonstruisanenaosnovukoreliranjavremenaprikojemjeuzorakdržanpodprirodnominsolacijomu laboratorijskimuslovima,pokazalesuda tokom60minuta tretmanaukupnosmanjenjekoncen-tracijedinotefurana,klotianidina i tiaklopridauodnosunapočetnekoncentracije iznosioko25%,štosemožesmatratiumerenombrzinomdegradacije.OvirezultatipotvrđujudazabrzoiefikasnouklanjanjeodabranihneonikotinoidaizuzorakavodeDunavanijedovoljnasamadirektnafotolizapod uticajem insolacije.Analitički signal dinotefurana dobijen u prisustvuH2O2 i pod prirodnominsolacijomutrajanjuod60minukazujenaumerenouklanjanjeciljnoganalitaodoko40%,dokjepodistimuslovimaH2O2uzrokovaouklanjanjetiaklopridaodoko70%,aklotianidinaupotpunos-ti.Testiranajeadsorpcijaciljnoganalitanavišezidnimugljeničnimnanocevima(MWCNT).Ovimpostupkommožedaseuklonioko30%dinotefurana,oko50%klotianidinai60%tiakloprida,stimdasesaturacijananocevidešavaveomabrzo,nakon5min.AfinitetneonikotinoidapremaMWCNTsepovećava sa smanjenjempolarnosti ispitivanihneonikotinoida.Modifikovani oblici adsorbensailikombinacijaMWCNTsapogodnimhemijskimagensomrazmatranisukaopotencijalnisistemikojipoboljšavajuefikasnostuklanjanjaovogjedinjenja.UkombinacijisaH2O2,MWCNTpokazujuboljusposobnostuklanjanjaodabranihneonikotinoida.Sposobnostuklanjanjapoboljšanaje15–50%u zavisnosti od ispitivanogneonikotinoida.UpotrebaFe-MWCNT i njihovakombinacija saH2O2 otvorila jemogućnostzadalja ispitivanjamehanizmauklanjanja.Ustanovljeno jenastajanje inter-medijerakojimaodgovarajum/zod117,5i140,6uslučajurazgradnjedinotefuranausistemimasaH2O2,MWCNT+H2O2,Fe-MWCNT+H2O2iklotianidinausistemuFe-MWCNT+H2O2,ačijabiiden-tifikacijabilapredmetnekihdaljihispitivanjakojanisuobuhvaćenaovomdisertacijom.

Chapter 6

6. SUMMARY

Poglavlje 6

Pavle Jovanov

149

Neonicotinoidinsecticides,asoneofthefastestgrowingnewgenerationofinsecticides,havecontributedtoasignificantreductionoftoxicityfortheenvironment;however,thereisaconcernthatupontheiruse,asameasureofpestmanagement,beneficialinsectssuchashoneybeesmayalsobeaffected.Moreover,residuesoftheseinsecticidesmayfinallybefoundinbeeproductsuchashoney,pollen,beeswax,propolisetc.Therefore,monitoringanddeterminationoftracelevelsoftheneonic-otinoidsinhoneyarenecessaryanddemandshighlyefficient,selectiveandsensitiveanalyticaltech-niques.Theobjectiveofthepresentworkwastodeveloparapid,sensitive,optimizedandaccurateanalyticalmethodbasedonliquidchromatographyfordeterminingsevenneonicotinoidinsecticides,dinotefuran,nitenpyram, thiamethoxam,clothianidin, imidacloprid,acetamipridand thiacloprid inhoneyandhoneyliqueursamples.Besidestheoptimizationofextractionprocessesofselectedne-onicotinoids, studieswere conducted towards the investigation ofmulti-walled carbon nanotubes(MWCNTs)aspromisingmaterialsforneonicotinoidremoval/adsorptionfromaqueoussystems,duetotheirstabilityandadsorptionproperties.Basedontheresultsthefollowingconclusionsweremade:

• Development of method for determination of clothianidin in honey using liquid-liquid and solid-phase extraction combined with HPLC-DAD analysis

ThepossibilityfordeterminationofclothianidininhoneysamplesbyHPLCwithadiodearraydetector(HPLC-DAD)usingacombinationof liquid-liquidandsolidphaseextractionforsamplepreparationwasinvestigated.Thelinearrangewastestedinanarrowconcentrationrangeoffrom1.0–7.5µgmL-1.Aliquid-liquidextraction,followedbysolid-phaseextraction,wasusedasasamplepreparationprocedure.Itcanbeconcludedthatforthetreatmentofthesampleswithaknownconcen-trationofclothianidin,acombinationofliquid-liquidextractionandsolidphaseextractionwaseffec-tiveforsmallconcentrationsofresidues(0.5µgg-1)inhoney(recovery≈70%),whileforthehigherconcentrationofclothianidinitwasnecessarytomodifytheprocedureduetothepossiblesaturationofasolid-phasecolumn,whichcauseslossesofclothianidin(recovery≈46%).Basedonpreliminaryresults,itcanbeconcludedthattheuseofasolid-phasecolumnincombinationwithaliquid-liquidextractionwithdichloromethaneresultsinanacceptablerecoveryofclothianidininthesampleswithaclothianidinconcentrationofabout0.5µgg-1.Furtherstudieswillbefocusedonthedevelopmentofotherextractiontechniquesthatwillensurehigherrecoveryofneonicotinoids.

• Development of method for determination of clothianidin in honey using DLLME and HPLC-DAD method

Afterobtaininglowrecoveryofclothianidinusingacombinationof liquid-liquidandsolid-phaseextraction,dispersedliquid-liquidmicroextraction(DLLME)wasselectedasatechniqueforthepreparationofhoneysamples.TooptimizeDLLME,itwasnecessarytoexaminewhichparam-etersinfluencetheeffectivenessoftheselectedoptimizationprocedure.Theadequacyofacetonitrileasadispersingagentandchloroformasadispersingsolventwasinvestigated.Theresultsshowedthat injectionofacetonitrileandchloroformbysyringedoesnotachieve the formationofagooddispersionsystemhencetherecoveryofclothianidinwerenotsatisfactory(48.35%).Besides thechloroform,adichloromethanewasusedasasecondextractingagent,inordertocomparetherela-


150

tiveefficiencyoftheextractionsolvents.Obtainedclothianidinrecoveryrangedfrom69.7to68.3%,dependingonwhetheritisusedCHCl3,orDHMastheextractionsolvent.Duringthedevelopmentofthemostsuitablemethodsfortheextractionitwasdiscoveredthatthemixtureofdispersingagentandtheextractantsolutionprovidesbetterextractionrecoveriesincomparisontotheuseoftheex-tractingsolutionwithoutthedispersingagent.Itwasobservedthattheextractionyieldislesswith1.0mLDHMcomparedto2.0mLDHM,indicatingtheoptimalratioofsampleandextractionsolutionof5:2.Furthertestingincludedthetestingofthesamplevolumethatisrequiredforsuccessfulextrac-tion,aswellasthevolumeofACNandDHM.Sampleamountslessthan5mLhavebeenshowntobeunsatisfactoryfortheoptimumperformanceoftheexperiment.Itcanbeconcludedthattheextractionrecovery(68.4–92.1%)wasmorefavorablewiththeuseof0.5mLACNand2.0mlDHM.

• Multi-residue method for determination of selected neonicotinoid insec-ticides in honey using optimized dispersive liquid–liquid microextraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Theobjectiveofthisstudywastodevelopanalyticalmethodbasedonoptimizeddispersiveliquid-liquidmicroextraction(DLLME)asapretreatmentprocedurecombinedwithreversedphaseliquid chromatographic separationonC18columnand isocratic elution for simultaneousMS/MSdeterminationofselectedneonicotinoidinsecticidesinhoney.TheLC-MS/MSparameterswereop-timized tounequivocallyprovidegoodchromatographic separation, lowdetection (LOD,0.5–1.0μgL−1)andquantification(LOQ,1.0–2.5μgL−1) limitsforacetamiprid,clothianidin, thiamethox-am,imidacloprid,dinotefuran,thiaclopridandnitenpyraminhoneysamples.Usingdifferenttypes(chloroform,dichloromethane)andvolumesofextraction(1.0–3.0mL)anddispersive(acetonitrile;0.0–1.0mL)solventandbymathematicalmodelingitwaspossibletoestablishtheoptimalsamplepreparationprocedure.Matrix-matchedcalibrationandblankhoneysamplespikedintheconcentra-tionrangeofLOQ–100.0μgL−1wereusedtocompensatethematrixeffectandtofulfilltherequire-mentsofSANCO/12495/2011fortheaccuracy(R74.3–113.9%)andprecision(expressedintermsofrepeatability(RSD2.74–11.8%)andwithin-laboratoryreproducibility(RSDs6.64–16.2%))oftheproposedmethod.Therapid(retentiontimes1.5–9.9min),sensitiveandlowsolventconsumptionproceduredescribedinthisworkprovidesreliable,simultaneous,andquantitativemethodapplicablefortheroutinelaboratoryanalysisofsevenneonicotinoidresiduesin15realhoneysamples.Neonic-otinoidresidueswerenotdetectedinanyoftheinvestigatedsamples.

• Development of HPLC-DAD method for determination of neonicotinoids in honey based on DLLME and QuEChERS exctraction procedures

TheobjectiveofthisstudywastodevelopandoptimizeHPLC-DADanalyticalmethodwithdispersiveliquid-liquidmicroextraction(DLLME)andQuEChERSsamplepreparationproceduresforthesimultaneouslyanalysisofsevenneonicotinoids(dinotefuran,nitenpyram,thiametoxam,clo-thianidin,imidacloprid,acetamipridandthiacloprid)inhoneysamples.Theliquidchromatograph-icconditionswereoptimizedbyresponsesurfacemethodologywithBox-BehnkendesignandtheglobalDerringer´sdesirability.Theoptimizedmethodwasvalidated to fulfill the requirementsofSANCO/12495/2011standardforbothsamplepretreatmentproceduresprovidingresultsforaccura-cy(R,73.1–118.3%),repeatability(RSD,3.28–10.40%)andwithin-laboratoryreproducibility(RSD,

Pavle Jovanov

151

6.45–17.70%),limitsofdetection(LOD,1.5–2.5µgkg-1)andquantification(LOQ,5.0–10.0µgkg-1).Matrixeffectswerecompensatedbytheuseofmatrix-matchedcalibration.Forthefirsttime,morethan100honeysamplescollectedfromall7countiesofAutonomousProvinceofVojvodinawereanalyzed.Thepresenceofthiacloprid,imidaclopridandthiametoxamwasdiscoveredinasmallnum-berofsamples,thereforeimplicatingapotentialusefulnessofongoingcontrolofthistypeoffood.AlltheresidueswereconfirmedviaLC-MS/MS.

• Development of multiresidue DLLME and QuEChERS based LC-MS/MS method for the determination of selected neonicotinoid insecticides in honey liqueur

Honeyliqueurisanalcoholicdrinkderivedfromhoneyandstrongfruitbrandyofsuitabletype,traditionallymadeinSerbiaandotherBalkancountries.AlthoughEuropeanUnionhasregulatedthelevelsofneonicotinoidinsecticidesinhoneyandpollen,thereisanincreasedriskofthepresenceofthesecompoundsintraditionalproductsmadefromhoney.TheobjectiveofthisstudywastodevelopanoptimizedLC-MS/MSanalyticalmethodwithdispersiveliquid-liquidmicroextraction(DLLME)andQuEChERSsamplepreparationprocedures foranalysisofsevenneonicotinoids (dinotefuran,nitenpyram,thiametoxam,clothianidin,imidacloprid,acetamipridandthiacloprid)inhoneyliqueur.TheLC-MS/MSconditionswereoptimizedtounequivocallyprovidegoodchromatographicsepara-tion,selectivityandspecificityofdevelopedmethod.Themethodwasvalidatedtofulfilltherequire-mentsofSANCO/12495/2011forbothsamplepretreatmentproceduresprovidingresultsforaccu-racy(R,69.2–113.4%forDLLME;71.8–94.9%forQuEChERS),precision(RSDexpressedintermsofrepeatability(3.21–10.20%forDLLME;4.19–12.81%forQuEChERS)andwithin-laboratoryre-producibility(9.11–16.63%forDLLME;11.32–16.40%forQuEChERS)),limitsofdetection(LOD,0.5–1.5µgkg-1forDLLME;1.0–2.5µgkg-1forQuEChERS)andquantification(LOQ,1.0–5.0µgkg-1forDLLME;2.5–10.0µgkg-1 forQuEChERS).Matrix effectswere compensatedby theuseofmatrix-matchedcalibration.Analysisofrealhoneyliqueursamplesobtainedfromlocalmarketsshowedthepresenceofclothianidinorthiaclopridinfouroftheanalyzedsamples,thereforeimplicat-ingthenecessityofongoingcontrolofthistypeoftraditionalproduct.

• Removal of selected neonicitinoid insecticides from water matrix

Removalofselectedneonicitinoidinsecticides-dinotefuran,clothianidinandthiaclopridus-ingMWCNTandH2O2fromDanubespikedwatermatrixwasinvestigated.Efficiencyofdifferentsystemsforneonicotinoidsremoval(undernaturalinsolation,withH2O2,withMWCNT,withMW-CNT+H2O2,withFe-MWCNT,withFe-MWCNT+H2O2)wasevaluatedwithdevelopedLC-MS/MSmethod.Analysisofdegradationratesrevealedlossof25%oftheinitialneonicotinoidconcentrationundernaturalinsolationinthelaboratoryconditionsduring60min.AdditionofchemicalagentH2O2 promotedlossof40%oftheinitialdinotefuran,70%ofthiaclopridconcentrationandtotalremovalofclothianidinundersameconditions.WiththeadditionofMWCNTconcentrationofdinotefuran,clothianidinand thiaclopriddecayed for30,50and60%, respectively. IronmodificationofMW-CNTincombinationwithH2O2 increased theremovalrateofselectedneonicotinoidfor15–50%.PresenceofintermediateswasdiscoveredinsystemsofdinotefuranwithH2O2,MWCNT+H2O2,Fe-MWCNT+H2O2andofclothianidininsystemswithFe-MWCNT+H2O2 with m/zof117,5and140,6.

7. LITERATURA

Poglavlje 7

155

Pavle Jovanov

1. EU Pesticides database.2013,[pristupljeno06.10.2013.];Dostupno:http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm

2. Pravilnik o maksimalno dozvoljenim količinama ostataka sredstava za zaštitu bilja u hrani i hrani za životinje i o hrani i hrani za životinje za koju se utvrđuju maksimalno dozvoljene količine ostataka sredstava za zaštitu bilja. SlužbeniglasnikRS,2010,25.

3. T.C.Sparks,Insecticide discovery: An evaluation and analysis.PesticBiochemPhys,2013.107(1):p.8-17.

4. Agropages.2013,[pristupljeno06.10.2013.];Dostupno:http://agropages.com/buyersguide/category/neonicotinoid-insecticide-insight.html.

5. S.H.Thany,Neonicotinoid insecticides: historical evolution and resistance mechanisms. AdvExpMedBiol,2010.683:p.75-83.

6. X.Shao,Z.Ye,H.Bao,Z.Liu,X.Xu,Z.Li,X.Qian,Advanced research on cis-neonicoti-noids.Chimia(Aarau),2011.65(12):p.957-960.

7. Compendium of Pesticide Common Names.2013,[pristupljeno06.10.2013.];Dostupno:http://www.alanwood.net/pesticides/class_insecticides.html.

8. P.Jeschke,R.Nauen,Neonicotinoids-from zero to hero in insecticide chemistry.PestManagSci,2008.64(11):p.1084-1098.

9. L.A.Brown,M.Ihara,S.D.Buckingham,K.Matsuda,D.B.Sattelle,Neonicotinoid insecti-cides display partial and super agonist actions on native insect nicotinic acetylcholine recep-tors.JNeurochem,2006.99(2):p.608-615.

10. A.K.Jones,L.A.Brown,D.B.Sattelle,Insect nicotinic acetylcholine receptor gene families: from genetic model organism to vector, pest and beneficial species. InvertNeurosci,2007.7(1):p.67-73.

11. H.Duan,W.Zhang,J.Zhao,D.Liang,X.Yang,S.Jin,A novel halogen bond and a better-known hydrogen bond cooperation of neonicotinoid and insect nicotinic acetylcholine recep-tor recognition.JMolModel,2012.18(8):p.3867-3875.

12. P.Jeschke,R.Nauen,M.Schindler,A.Elbert,Overview of the status and global strategy for neonicotinoids.JAgricFoodChem,2011.59(7):p.2897-2908.

13. P.Jeschke,R.Nauen,M.E.Beck,Nicotinic acetylcholine receptor agonists: a milestone for modern crop protection.AngewChemIntEdEngl,2013.52(36):p.9464-9485.

14. A. Zhang, H. Kayser, P.Maienfisch, J.E. Casida, Insect nicotinic acetylcholine receptor: conserved neonicotinoid specificity of [(3)H]imidacloprid binding site.JNeurochem,2000.75(3):p.1294-1303.

15. S.H.Thany,G.Lenaers,V.Raymond-Delpech,D.B.Sattelle,B.Lapied,Exploring the phar-macological properties of insect nicotinic acetylcholine receptors. Trends Pharmacol Sci,2007.28(1):p.14-22.

16. K.Matsuda,M.Shimomura,M.Ihara,M.Akamatsu,D.B.Sattelle,Neonicotinoids show se-lective and diverse actions on their nicotinic receptor targets: electrophysiology, molecular biology, and receptor modeling studies.BiosciBiotechnolBiochem,2005.69(8):p.1442-1452.

17. M.Tomizawa,Chemical Biology of the Nicotinic Insecticide Receptor,inAdvances in Insect

156


Physiology,C.Ephraim,Editor.2013,AcademicPress,p.63-99.

18. Insect Nicotinic Acetylcholine Receptors,inAdvances in Experimental Medicine and Biology,S.H.Thany,Editor.2010,Springer,NewYork,683:p.1-118.

19. M.Ihara,M.Shimomura,C.Ishida,H.Nishiwaki,M.Akamatsu,D.B.Sattelle,K.Matsuda,A hypothesis to account for the selective and diverse actions of neonicotinoid insecticides at their molecular targets, nicotinic acetylcholine receptors: catch and release in hydrogen bond networks.InvertNeurosci,2007.7(1):p.47-51.

20. A.Decourtye,J.Devillers,Ecotoxicity of neonicotinoid insecticides to bees.AdvExpMedBiol,2010.683:p.85-95.

21. M.Tomizawa,J.E.Casida,Neonicotinoid insecticide toxicology: mechanisms of selective ac-tion.AnnuRevPharmacolToxicol,2005.45(1):p.247-268.

22. T.Perry,P.Batterham,P.J.Daborn,The biology of insecticidal activity and resistance.InsectBiochemMolBiol,2011.41(7):p.411-422.

23. R.Nauen,I.Denholm,Resistance of insect pests to neonicotinoid insecticides: current status and future prospects.ArchInsectBiochemPhysiol,2005.58(4):p.200-215.

24. K.Matsuda,S.Kanaoka,M.Akamatsu,D.B.Sattelle,Diverse actions and target-site selectiv-ity of neonicotinoids: structural insights.MolPharmacol,2009.76(1):p.1-10.

25. D.T.Vo,W.H.Hsu,E.A.Abu-Basha,R.J.Martin,Insect nicotinic acetylcholine receptor ago-nists as flea adulticides in small animals.JVetPharmacolTher,2010.33(4):p.315-322.

26. K.A.Ford,A.G.Gulevich,T.L.Swenson,J.E.Casida,Neonicotinoid insecticides: oxidative stress in planta and metallo-oxidase inhibition. JAgricFoodChem,2011.59(9):p.4860-4867.

27. In focus: neonicotinoid insecticides. Proceedings of the XVI International Plant Protection Congress. October 15-18, 2007. Glasgow, United Kingdom.PestManagSci,2008.64(11):p.1084-1125.

28. R.C.Biever,J.R.Hoberg,B.Jacobson,E.Dionne,M.Sulaiman,P.McCahon,ICON rice seed treatment toxicity to crayfish (Procambarus clarkii) in experimental rice paddies.EnvironToxicolChem,2003.22(1):p.167-174.

29. M.Tomizawa,J.E.Casida,Molecular recognition of neonicotinoid insecticides: the determi-nants of life or death.AccChemRes,2009.42(2):p.260-269.

30. A.Elbert,M.Haas,B.Springer,W.Thielert,R.Nauen,Applied aspects of neonicotinoid uses in crop protection.PestManagSci,2008.64(0):p.1099-1105.

31. Commission,E.,Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. 1991.

32. DruštvozazaštitubiljaSrbije,Sredstva za zaštitu bilja u prometu u Srbiji 2013.Biljnilekar,2013.41(1-2).

33. R.Charvet,M.Katouzian-Safadi,M.E.Colin,P.A.Marchand,J.M.Bonmatin,Systemic in-secticides: new risk for pollinator insects.AnnPharmFr,2004.62(1):p.29-35.

34. T.Blacquiere,G.Smagghe,C.A.vanGestel,V.Mommaerts,Neonicotinoids in bees: a review on concentrations, side-effects and risk assessment.Ecotoxicology,2012.21(4):p.973-992.

157

Pavle Jovanov

35. T.C.VanDijk,M.A.VanStaalduinen,J.P.VanderSluijs,Macro-invertebrate decline in sur-face water polluted with imidacloprid.PLoSONE,2013.8(5):p.e62374.

36. P.C.Lin,H.J.Lin,Y.Y.Liao,H.R.Guo,K.T.Chen,Acute poisoning with neonicotinoid insec-ticides: a case report and literature review.BasicClinPharmacolToxicol,2013.112(4):p.282-286.

37. S.VanTimmeren,J.C.Wise,R.Isaacs,Soil application of neonicotinoid insecticides for con-trol of insect pests in wine grape vineyards.PestManagSci,2012.68(4):p.537-542.

38. V.Girolami,M.Marzaro,L.Vivan,L.Mazzon,M.Greatti,C.Giorio,D.Marton,A.Tapparo,Fatal powdering of bees in flight with particulates of neonicotinoids seed coating and humid-ity implication.JApplEntomol,2012.136(1-2):p.17-26.

39. X.Shi,L.Jiang,H.Wang,K.Qiao,D.Wang,K.Wang,Toxicities and sublethal effects of sev-en neonicotinoid insecticides on survival, growth and reproduction of imidacloprid-resistant cotton aphid, Aphis gossypii.PestManagSci,2011.67(12):p.1528-1533.

40. J.P.VanderSluijs,N.Simon-Delso,D.Goulson,L.Maxim,J.-M.Bonmatin,L.P.Belzunces,Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services.CurrOpinEnvironSust,2013.5(3-4):p.293-305.

41. A.Tapparo,C.Giorio,M.Marzaro,D.Marton, L. Solda,V.Girolami,Rapid analysis of neonicotinoid insecticides in guttation drops of corn seedlings obtained from coated seeds.JEnvironMonit,2011.13(6):p.1564-1568.

42. V.Girolami,L.Mazzon,A.Squartini,N.Mori,M.Marzaro,A.DiBernardo,M.Greatti,C.Giorio,A.Tapparo,Translocation of neonicotinoid insecticides from coated seeds to seedling guttation drops: a novel way of intoxication for bees.JEconEntomol,2009.102(5):p.1808-1815.

43. A.Nikolakis,A.Chapple,R.Friessleben,P.Neumann,T.Schad,R.Schmuck,H.F.Schnier,H.Schnorbach,R.Schöning,C.Maus,Risk mitigation measures for seed treatments using neonicotinoids,JuliusKühnArch,2009.423:p.132.

44. Y.Aliouane,A.K.ElHassani,V.Gary,C.Armengaud,M.Lambin,M.Gauthier,Subchronic exposure of honeybees to sublethal doses of pesticides: effects on behavior.EnvironToxicolChem,2009.28(1):p.113-122.

45. J.M.Bonmatin,I.Moineau,R.Charvet,M.E.Colin,C.Fleche,E.R.Bengsch,Behaviour of Imidacloprid in Fields. Toxicity for Honey Bees,inEnvironmental Chemistry,E.Lichtfouse,J.Schwarzbauer,andD.Robert,Editors.2005.Springer,BerlinHeidelberg,p.483-494.

46. P.N.Moza,K.Hustert,E.Feicht,A.Kettrup,Photolysis of imidacloprid in aqueous solution. Chemosphere,1998.36(3):p.497-502.

47. W.Zheng,W.Liu,Kinetics and mechanism of the hydrolysis of imidacloprid.PestSci,1999.55(4):p.482-485.

48. Environmental Fate of Imidacloprid. M.Fossen,Editor.2006,DepartmentofPesticideRegu-lation,Sacramento,CA.

49. F.J.Placke,E.Weber,Method of determining imidacloprid residues in plant materials.Pflan-zenschutz-NachrichtenBayer,1993.46(2):109-182.

50. J.M.Bonmatin,I.Moineau,R.Charvet,C.Fleche,M.E.Colin,E.R.Bengsch,A LC/APCI-MS/MS method for analysis of imidacloprid in soils, in plants, and in pollens.AnalChem,

158


2003.75(9):p.2027-2033.

51. R.Solecki,Toxicological evaluations-imidacloprid.Pesticideresiduesinfood2001,[pristu-pljeno30.11.2013.];Dostupno:http://www.inchem.org/documents/jmpr/jmpmono/2001pr07.htm.

52. Material Safety Data Sheet.BayerCropScience,2013.

53. United States Environmental ProtectionAgency, U.E.P. Imidacloprid. 2013, [pristupljeno30.11.2013.]; Dostupno: http://www.epa.gov/pesticides/chem_search/ppls/042750-00140-20090204.pdf.

54. K.Matsuda,S.D.Buckingham,D.Kleier, J.J.Rauh,M.Grauso,D.B.Sattelle,Neonicoti-noids: insecticides acting on insect nicotinic acetylcholine receptors.TrendsPharmacolSci,2001.22(11):p.573-580.

55. V.Kindemba,The impact of neonicotinoid insecticides on bumblebees, honey bees and other non-target in vertebrates. 2009,[pristupljeno30.11.2013.];Dostupno:http://www.buglife.org.uk/Resources/Buglife/Neonicotinoid%20insecticides%20report.pdf

56. C.Tomlin,The Pesticide Manual: a World Compendium.2000.Farnham,UnitedKingdom,BritishCropProtectionCouncil.

57. N.V.Mitić,S.Savčić-Petrić,Pesticidi u poljoprivredi i šumarstvu u Jugoslaviji 2002.2002,DruštvozazaštitubiljaSrbije,p.950.

58. L.I.Gilbert,S.S.Gill,Insect Control: Biological and Synthetic Agents.2010.AcademicPress,London.

59. T.Iwasa,N.Motoyama,J.T.Ambrose,R.M.Roe,Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera.CropProt,2004.23(5):p.371-378.

60. V. Guzsvány, Prilog karakterizaciji i određivanju neki neonikotinoida. 2006, Prirodno-matematičkifakultet,Departmanzahemiju,biohemijuizaštituživotnesredine.UniverzitetuNovomSadu,NoviSad,p.1-161.

61. P.Maienfisch,H.Huerlimann,A.Rindlisbacher,L.Gsell,H.Dettwiler,J.Haettenschwiler,E.Sieger,M.Walti,The discovery of thiamethoxam: a second-generation neonicotinoid. Pest ManagSci,2001.57(2):p.165-176.

62. D.Inđić,Z.Klokočar-Šmit,Insekticidi za suzbijanje krompirove zlatice u Jugoslaviji.Biljnilekar,2002.30(3):p.5.

63. J.Tan,J.J.Galligan,R.M.Hollingworth,Agonist actions of neonicotinoids on nicotinic ace-tylcholine receptors expressed by cockroach neurons.Neurotoxicology,2007.28(4):p.829-842.

64. K.A.Ford,J.E.Casida,Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicoti-noid insecticides in spinach,JAgricFoodChem,2008.56(21):p.10168.10175.

65. T.R.Roberts,D.H.Hutson,P.J.Jewess,P.W.Lee,P.H.Nicholls, J.R.Plimmer,Part 2: Insec-ticides and Fungicides,inMetabolic Pathways of Agrochemicals,RSocChem,T.R.Roberts,D.H.Hutson,P.J.Jewess,P.W.Lee,P.H.Nicholls, J.R.Plimmer,Editors.1999.TheRoyalSocietyofChemistry,UK.

66. F.G.Zalom,N.C.T.,F.J.Byrne, Managing resistance is critical to future use of pyrethroids

159

Pavle Jovanov

and neonicotinoids.CalifAgric,2005.59:p.5.

67. M.Irie,Dinotefuran 2000,[pristupljeno04.10.2013.];Dostupno:http://www.fao.org/filead-min/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/Evaluation12/Dinotefuran.pdf.

68. P.Mistretta,Dinotefuran.2009,USDA/ForestService:,Atlanta,Georgia,p.225.

69. J.Pistorius,G.Bischoff,U.Heimbach,M.Stähler,Bee poisoning incidents in Germany in spring 2008 caused by abrasion of active substance from treated seeds during sowing of maize,JuliusKühnArch.,2009.423:p.118.

70. M.Gross,EU ban puts spotlight on complex effects of neonicotinoids.CurrBiol,2013.23(11):p.R462-R464.

71. P.Hendrikx,M.Debin,P.Neuman,I.Fries,W.Ritter,M.Brown,F.Mutinelli,Y.LeConte,A.Gregorc,Bee mortality and bee surveillance in Europe.EFSAJournal,2009.

72. EFSA,European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment for bees for the active substance clothianidin. EFSAJ2013.11(1):3066. [p.58].

73. EFSA,European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment for bees for the active substance imidacloprid. EFSAJ2013.11(1):3068.[p.55].

74. EFSA,European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment for bees for the active substance thiamethoxam. EFSAJ2013.11(1):3067.[p.68].

75. The Daily Green 2011,[pristupljeno30.11.2013.];Dostupno:http://www.thedailygreen.com/environmental-news/latest/einstein-bees.

76. Statistički godišnjak Republike Srbije 2012.RepubličkizavodzastatistikuRepublikeSrbije,2012.

77. G.Celli,B.Maccagnani,Honey bees as bioindicators of environmental pollution.BInsectol,2003.56(1):p.137-139.

78. M.Merchant,Honey bees versus neonicotinoid insecticides. The issues and challenges.2013,UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency,USA.

79. T.Farooqui,A potential link among biogenic amines-based pesticides, learning and memory, and colony collapse disorder: A unique hypothesis.NeurochemInt,2013.62(1):p.122-136.

80. J.E.Cresswell,N.Desneux,D.vanEngelsdorp,Dietary traces of neonicotinoid pesticides as a cause of population declines in honey bees: an evaluation by Hill’s epidemiological criteria. PestManagSci,2012.68(6):p.819-827.

81. J.W.White,Composition of American honeys.1962.U.S.DepartmentofAgriculture,USA.

82. T.Eteraf-Oskouei,M.Najafi,Traditional and modern uses of natural honey in human dis-eases: a review.IranJBasicMedSci,2013.16(6):p.731-742.

83. P.Stanway,The Miracle of Honey: Practical Tips for Health, Home & Beauty.2013,WatkinsPub,UK.

84. N.Al-Waili,K.Salom,A.Al-Ghamdi,M.J.Ansari,Antibiotic, pesticide, and microbial con-taminants of honey: human health hazards.SciWorldJ,2012:p.930849.

85. M.Moniruzzaman,M.I.Khalil,S.A.Sulaiman,S.H.Gan,Physicochemical and antioxidant properties of Malaysian honeys produced by Apis cerana, Apis dorsata and Apis mellifera.

160


BMCComplementAlternMed,2013.13:43.

86. R.H.Anderson,Some chemical and physical properties of South African honeys.1958,Uni-versityofStellenbosch,Stellenbosch,SouthAfrica.

87. A.Simon,K.Traynor,K.Santos,G.Blaser,U.Bode,P.Molan,Medical honey for wound care - still the ‘latest resort’?EvidBasedComplementAlternatMed,2009.6(2):p.165-173.

88. N.Altman,The Honey Prescription: The Amazing Power of Honey as Medicine.2010.InnerTraditions/Bear&Company,Rochester,Vermont,USA.

89. O.O.Erejuwa,S.A.Sulaiman,M.S.Wahab,Honey-a novel antidiabetic agent.IntJBiolSci,2012.8(6):p.913-934.

90. F.M.Adebiyi,I.Akpan.,E.I.Obiajunwa,H.B.Olaniyi,Chemical/physical characterization of nigerian honey.PakistanJNutr,2004.3(5):p.278-281.

91. S.Panseri,A.Catalano,A.Giorgi,F.Arioli,A.Procopio,D.Britti,L.M.Chiesa,Occurrence of pesticide residues in Italian honey from different areas in relation to its potential contami-nation sources.FoodControl,2014.38(0):p.150-156.

92. C.K.deAndrade,V.E.dosAnjos,M.L.Felsner,Y.R.Torres,S.P.Quináia,Direct determina-tion of Cd, Pb and Cr in honey by slurry sampling electrothermal atomic absorption spec-trometry.FoodChem,2014.146(0):p.166-173.

93. L.Castle,M.R.Philo,M.Sharman,The analysis of honey samples for residues of nitroben-zene and petroleum from the possible use of Frow mixture in hives.FoodChem,2004.84(4):p.643-649.

94. T.A.Catelani,I.V.Tóth,J.L.F.C.Lima,L.Pezza,H.R.Pezza,A simple and rapid screening method for sulfonamides in honey using a flow injection system coupled to a liquid waveguide capillary cell.Talanta,2014.121(0):p.281-287.

95. Pčelarstvo.2013,[pristupljeno26.07.2013.];Dostupno:http://www.pcelarstvo.hr/.

96. Medovača.2013,[pristupljeno26.07.2013.];Dostupno:http://www.medovaca.com/2009/07/medena-rakija/.

97. D.A.L.Vignati,D.Secrieru,Y.I.Bogatova, J.Dominik,R.Céréghino,N.A.Berlinsky,G.Oaie,S.Szobotka,A.Stanica,Trace element contamination in the arms of the Danube Delta (Romania/Ukraine): Current state of knowledge and future needs.JEnvironManage,2013.125(0):p.169-178.

98. S.Subotić,S.Spasić,Ž.Višnjić-Jeftić,A.Hegediš,J.Krpo-Ćetković,B.Mićković,S.Skorić,M.Lenhardt,Heavy metal and trace element bioaccumulation in target tissues of four edible fish species from the Danube River (Serbia).EcotoxEnvironSafe,2013.98(0):p.196-202.

99. B.Vrana,V.Klučárová,E.Benická,N.Abou-Mrad,R.Amdany,S.Horáková,A.Draxler,F.Humer,O.Gans,Passive sampling: An effective method for monitoring seasonal and spatial variability of dissolved hydrophobic organic contaminants and metals in the Danube river. EnvironPollut,2014.184(0):p.101-112.

100. N.Andrási,B.Molnár,B.Dobos,A.Vasanits-Zsigrai,G.Záray,I.Molnár-Perl,Determina-tion of steroids in the dissolved and in the suspended phases of wastewater and Danube River samples by gas chromatography, tandem mass spectrometry.Talanta,2013.115(0):p.367-373.

161

Pavle Jovanov

101. A.Covaci,A.Gheorghe,O.Hulea,P.Schepens,Levels and distribution of organochlorine pesticides, polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in sediments and biota from the Danube Delta, Romania.EnvironPollut,2006.140(1):p.136-149.

102. G.Johansson,Extraction/Multistage Countercurrent Distribution,inEncyclopedia of Sepa-ration Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford.p.1398-1405.

103. R.G.Harper,P.M.Harper,M.Hostrup,Extraction/Solvent Based Separation,inEncyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.1424-1434.

104. C.K.Zacharis,I.Rotsias,P.G.Zachariadis,A.Zotos,Dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of organochlorine pesticides residues in honey by gas chromatography-electron capture and ion trap mass spectrometric detection.FoodChem,2012.134(3): p.1665-1672.

105. R.Rial-Otero,E.M.Gaspar,I.Moura,J.L.Capelo,Chromatographic-based methods for pes-ticide determination in honey: An overview.Talanta,2007.71(2):p.503-514.

106. K.Zhang,J.W.Wong,4.12 - Solvent-Based Extraction Techniques for the Determination of Pesticides in Food,inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Edi-tor.2011,AcademicPress,Oxford,p.245-261.

107. M.K.L.Bicking,Extraction/Analytical Extractions,inEncyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.1371-1382.

108. M.Herrero,A.Cifuentes,E.Ibáñez,4.09 - Extraction Techniques for the Determination of Carotenoids and Vitamins in Food,inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.181-201.

109. T.C.Lo,M.H.I.Baird,Solvent Extraction,inEncyclopedia of Physical Science and Technol-ogy (ThirdEdition),R.A.Meyers,Editor.2003,AcademicPress,NewYork,p.341-362.

110. J.Pawliszyn,Theory of Extraction,inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.1-25.

111. C.F.Poole,Solid-Phase Extraction with Discs,inEncyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.4141-4148.

112. A.Zygler,M.Słomińska,J.Namieśnik,Soxhlet Extraction and New Developments Such as Soxtec,inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,Ac-ademicPress,Oxford,p.65-82.

113. M.D.LuquedeCastro,F.Priego-Capote,Soxhlet Extraction Versus Accelerated Solvent Ex-traction, inComprehensive Sampling and Sample Preparation, J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress:Oxford.p.83-103.

114. M.D. Luque deCastro, J. Ruiz Jiménez, L.E.GarcíaAyuso,Environmental Applications/ Soxhlet Extraction, inReference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering.2013,Elsevier,Oxford.

115. J.L. Luque-García,Extraction/Microwave-Assisted Solvent Extraction, inEncyclopedia of Analytical Science (SecondEdition),P.Worsfold,A.Townshend,andC.Poole,Editors.2005,Elsevier,Oxford,p.584-591.

116. J.R.Dean,Microwave Extraction, inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.135-149.

162


117. J.L.Luque-García,Extraction/Pressurized Fluid Extraction, inEncyclopedia of Analytical Science (SecondEdition),P.Worsfold,A.Townshend,andC.Poole,Editors.2005,Elsevier,Oxford,p.591-597.

118. D.J.Rowe,Chemistry and Technology of Flavors and Fragrances.2005,BlackwellPublish-ing,Oxford.

119. L.Ruiz-Aceituno,M.L.Sanz,L.Ramos,Use of ionic liquids in analytical sample preparation of organic compounds from food and environmental samples.TrACTrendAnalChem,2013.43(0):p.121-145.

120. C.Blasco,C.M.Lino,Y.Picó,A.Pena,G.Font,M.I.N.Silveira,Determination of organo-chlorine pesticide residues in honey from the central zone of Portugal and the Valencian com-munity of Spain.JChromatogrA,2004.1049(1-2):p.155-160.

121. B.Albero,C.Sanchez-Brunete, J.L.Tadeo,Analysis of pesticides in honey by solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.JAgricFoodChem,2004.52(19):p.5828-5835.

122. S.R.Rissato,M.S.Galhiane,F.R.N.Knoll,B.M.Apon,Supercritical fluid extraction for pes-ticide multiresidue analysis in honey: determination by gas chromatography with electron-capture and mass spectrometry detection.JChromatogrA,2004.1048(2):p.153-159.

123. Y.Wang,J.You,R.Ren,Y.Xiao,S.Gao,H.Zhang,A.Yu,Determination of triazines in honey by dispersive liquid-liquid microextraction high-performance liquid chromatography. JChromatogrA,2010.1217(26):p.4241-4246.

124. N.Campillo,R.Peñalver,N.Aguinaga,M.Hernández-Córdoba,Solid-phase microextraction and gas chromatography with atomic emission detection for multiresidue determination of pesticides in honey.AnalChimActa,2006.562(1):p.9-15.

125. R.P.Z.Furlani,K.M.Marcilio,F.M.Leme,S.A.V.Tfouni,Analysis of pesticide residues in sugarcane juice using QuEChERS sample preparation and gas chromatography with electron capture detection.FoodChem,2011.126(3):p.1283-1287.

126. A.Kamel,Refined methodology for the determination of neonicotinoid pesticides and their metabolites in honey bees and bee products by liquid chromatography-tandem mass spec-trometry (LC-MS/MS).JAgricFoodChem,2010.58(10):p.5926-5931.

127. M.Anastassiades,S.J.Lehotay,D.Stajnbaher,F.J.Schenck,Fast and easy multiresidue meth-od employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce.JAOACInt,2003.86(2):p.412-431.

128. P. Fidente, S. Seccia, F.Vanni, P.Morrica,Analysis of nicotinoid insecticides residues in honey by solid matrix partition clean-up and liquid chromatography-electrospray mass spec-trometry.JChromatogrA,2005.1094(1-2):p.175-178.

129. S.Liu,Z.Zheng,F.Wei,Y.Ren,W.Gui,H.Wu,G.Zhu,Simultaneous determination of seven neonicotinoid pesticide residues in food by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry.JAgricFoodChem,2010.58(6):p.3271-3278.

130. R. Schoning, Analytical method for the determination of residues of imidacloprid, NTN 33893-5-hydroxy and NTN 33893-olefin by HPLC with electrospray MS/MS-detection in plant and other materials: honey, nectar, bees, wax, corn (pollen, leaves), rape (pollen, flow-ers, leaves), sunflowers (pollen, flowers, leaves), tree (leaves, flowers), horse chestnuts.Pflan-zenschutz-Nachr.Bayer(Ger.Ed.),2001.54(3):p.413-440.

163

Pavle Jovanov

131. R.E.Clement,C.Hao,Liquid-Liquid Extraction: Basic Principles and Automation,inCom-prehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.51-63.

132. M.L.P.Reddy,T.PrasadaRao,A.D.Damodaran,Liquid-Liquid Extraction Processes for the Separation and Purification of Rare Earths.MinerProcessExtractMetallRev,1993.12(2-4):p.91-113.

133. K.Banerjee,D.P.Oulkar,S.Dasgupta,S.B.Patil,S.H.Patil,R.Savant,P.G.Adsule,Valida-tion and uncertainty analysis of a multi-residue method for pesticides in grapes using ethyl acetate extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry.JChromatogrA,2007.1173(1-2):p.98-109.

134. E.Watanabe,H.Eun,K.Baba,T.Arao,Y.Ishii,S.Endo,M.Ueji,Rapid and simple screen-ing analysis for residual imidacloprid in agricultural products with commercially available ELISA.AnalChimActa,2004.521(1):p.45-51.

135. Y.He,Liquid-Based Microextraction Techniques for Environmental Analysis,inComprehen-sive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.835-862.

136. J.M.Kokosa,Advances in solvent-microextraction techniques.TrACTrendAnalChem,2013.43(0):p.2-13.

137. Y.Assadi,M.A.Farajzadeh,A.Bidari,Dispersive Liquid–Liquid Microextraction,inCom-prehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012.AcademicPress,Oxford,p.181-212.

138. M.Rezaee,Y.Assadi,M.R.MilaniHosseini,E.Aghaee,F.Ahmadi,S.Berijani,Determina-tion of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction.JChro-matogrA,2006.1116(1-2):p.1-9.

139. M.Rezaee,Y.Yamini,M.Faraji,Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction meth-od.JChromatogrA,2010.1217(16):p.2342-2357.

140. H.Chen,H.Chen,J.Ying,J.Huang,L.Liao,Dispersive liquid-liquid microextraction fol-lowed by high-performance liquid chromatography as an efficient and sensitive technique for simultaneous determination of chloramphenicol and thiamphenicol in honey.AnalChimActa,2009.632(1):p.80-85.

141. C.K.Zacharis,P.D.Tzanavaras,K.Roubos,K.Dhima,Solvent-based de-emulsification dis-persive liquid-liquid microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry for determination of trace organochlorine pesticides in environmental water samples.JChro-matogrA,2010.1217(38):p.5896-5900.

142. M.I.Leong,S.D.Huang,Dispersive liquid-liquid microextraction method based on solidifica-tion of floating organic drop for extraction of organochlorine pesticides in water samples.JChromatogrA,2009.1216(45):p.7645-7650.

143. M.Farajzadeh,S.Sorouraddin,M.Moghaddam,Liquid phase microextraction of pesticides: a review on current methods.MicrochimActa,2014:p.1-23.

144. M.Asensio-Ramos, J. Hernández-Borges, T.M. Borges-Miquel, M.Á. Rodríguez-Delgad,Ionic liquid-dispersive liquid–liquid microextraction for the simultaneous determination of pesticides and metabolites in soils using high-performance liquid chromatography and fluo-rescence detection.JChromatogrA,2011.1218(30):p.4808-4816.

164


145. E.Yiantzi,E.Psillakis,K.Tyrovola,N.Kalogerakis,Vortex-assisted liquid–liquid microex-traction of octylphenol, nonylphenol and bisphenol-A.Talanta,2010.80(5):p.2057-2062.

146. L.Kocúrová,I.S.Balogh,J.Šandrejová,V.Andruch,Recent advances in dispersive liquid-liquid microextraction using organic solvents lighter than water. A review.Microchem J,2012.102(0):p.11-17.

147. L.Farina,E.Boido,F.Carrau,E.Dellacassa,Determination of volatile phenols in red wines by dispersive liquid-liquid microextraction and gas chromatography-mass spectrometry de-tection.JChromatogrA,2007.1157(1-2):p.46-50.

148. R.R.Kozani,Y.Assadi,F.Shemirani,M.R.M.Hosseini,M.R.Jamali,Determination of tri-halomethanes in drinking water by dispersive liquid-liquid microextraction then gas chroma-tography with electron-capture detection.Chromatographia,2007.66(1-2):p.81-86.

149. Q.Wu,X.Zhou,Y.Li,X.Zang,C.Wang,Z.Wang,Application of dispersive liquid-liquid mi-croextraction combined with high-performance liquid chromatography to the determination of carbamate pesticides in water samples.AnalBioanalChem,2009.393(6-7):p.1755-61.

150. D.Moreno-González,L.Gámiz-Gracia,J.M.Bosque-Sendra,A.M.García-Campaña,Disper-sive liquid–liquid microextraction using a low density extraction solvent for the determina-tion of 17 N-methylcarbamates by micellar electrokinetic chromatography-electrospray-mass spectrometry employing a volatile surfactant.JChromatogrA,2012.1247(0):p.26-34.

151. Z.H.Yang,Y.L.Lu,Y.Liu,T.Wu,Z.Q.Zhou,D.H.Liu,Vortex-assisted surfactant-enhanced-emulsification liquid-liquid microextraction.JChromatogrA,2011.1218(40):p.7071-7077.

152. M.A.Farajzadeh,M.Bahram,M.R.Vardast,M.Bamorowat,Dispersive liquid-liquid micro-extraction for the analysis of three organophosphorus pesticides in real samples by high per-formance liquid chromatography-ultraviolet detection and its optimization by experimental design.MicrochimActa,2010.172(3-4):p.465-470.

153. P.Wang,X.Yang,J.Wang,J.Cui,A.J.Dong,H.T.Zhao,L.W.Zhang,Z.Y.Wang,R.B.Xu,W.J.Li,Y.C.Zhang,H.Zhang,J.Jing,Multi-residue method for determination of seven neo-nicotinoid insecticides in grains using dispersive solid-phase extraction and dispersive liq-uid-liquid micro-extraction by high performance liquid chromatography.FoodChem,2012.134(3):p.1691-1698.

154. J.Vichapong,R.Burakham,S.Srijaranai,Vortex-assisted surfactant-enhanced-emulsification liquid-liquid microextraction with solidification of floating organic droplet combined with HPLC for the determination of neonicotinoid pesticides.Talanta,2013.117(0):p.221-228.

155. S.Zhang,X.Yang,X.Yin,C.Wang,Z.Wang,Dispersive liquid-liquid microextraction com-bined with sweeping micellar electrokinetic chromatography for the determination of some neonicotinoid insecticides in cucumber samples.FoodChem,2012.133(2):p.544-550.

156. Q.Wu,Z.Li,C.Wang,C.Wu,W.Wang,Z.Wang,Dispersive solid-phase extraction clean-up combined with dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of neonicotinoid insecticides in vegetable samples by high-performance liquid chromatography. FoodAnalMethods,2011.4(4):p.559-566.

157. D.Moema,M.M.Nindi,S.Dube,,Development of a dispersive liquid–liquid microextraction method for the determination of fluoroquinolones in chicken liver by high performance liquid chromatography.AnalChimActa,2012.730(0):p.80-86.

158. H.Chen,J.Ying,H.Chen,J.Huang,L.Liao,LC determination of chloramphenicol in honey

165

Pavle Jovanov

using dispersive liquid-liquid microextraction.Chromatographia,2008.68(7-8):p.629-634.

159. G.Font,J.Manes,J.C.Molto,Y.Pico,Solid-phase extraction in multi-residue pesticide anal-ysis of water.JChromatogr,1993.642(1-2):p.135-161.

160. C.F.Poole,Extraction/Solid-Phase Extraction,inEncyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.1405-1416.

161. D.A.Wells,Solid-Phase Extraction with Cartridges,inReference Module in Chemistry, Mo-lecular Sciences and Chemical Engineering.2013,ElsevierB.V.,Amsterdam.

162. S.A.Barker,Solid-phase matrix dispersion: extraction, inEncyclopedia of Separation Sci-ence,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.4148-4153.

163. C.F.Poole,S.K.Poole,Principles and Practice of Solid-Phase Extraction,inComprehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.273-297.

164. J.S.Aulakh,A.K.Malik,V.Kaur,P.Schmitt-Kopplin,A review on solid phase micro extrac-tion - High performance liquid chromatography (SPME-HPLC) analysis of pesticides.CritRevAnalChem,2005.35(1):p.71-85.

165. A.DiMuccio,P.Fidente,D.A.Barbini,R.Dommarco,S.Seccia,P.Morrica,Application of solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry to the determination of neonicotinoid pesticide residues in fruit and vegetables.JChromatogrA,2006.1108(1):p.1-6.

166. Z.Xiao,X.Li,X.Wang,J.Shen,S.Ding,Determination of neonicotinoid insecticides resi-dues in bovine tissues by pressurized solvent extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry.JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2011.879(1):p.117-22.

167. S.Seccia,P.Fidente,D.Montesano,P.Morrica,Determination of neonicotinoid insecticides residues in bovine milk samples by solid-phase extraction clean-up and liquid chromatogra-phy with diode-array detection.JChromatogrA,2008.1214(1-2):p.115-120.

168. J.J.Jiménez,J.L.Bernal,M.J.d.Nozal,C.Alonso,Liquid–liquid extraction followed by solid-phase extraction for the determination of lipophilic pesticides in beeswax by gas chromatog-raphy–electron-capture detection and matrix-matched calibration. J ChromatogrA, 2004.1048(1):p.89-97.

169. R.Cazorla-Reyes,J.L.Fernandez-Moreno,R.Romero-Gonzalez,A.G.Frenich,J.L.Vidal,Single solid phase extraction method for the simultaneous analysis of polar and non-polar pesticides in urine samples by gas chromatography and ultra high pressure liquid chromatog-raphy coupled to tandem mass spectrometry.Talanta,2011.85(1):p.183-196.

170. C.Díez,W.A.Traag,P.Zommer,P.Marinero,J.Atienza,Comparison of an acetonitrile ex-traction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” method with classical multi-residue methods for the extraction of herbicide residues in barley samples.JChromatogrA,2006.1131(1-2):p.11-23.

171. A.Przyjazny, Insecticides/Solid-Phase Extraction, inEncyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.3118-3128.

172. I.S. Jeong,B.M.Kwak, J.H.Ahn,S.H. Jeong,Determination of pesticide residues in milk using a QuEChERS-based method developed by response surface methodology.FoodChem,2012.133(2):p.473-481.

166


173. O.Lacina,J.Urbanova,J.Poustka,J.Hajslova,Identification/quantification of multiple pesti-cide residues in food plants by ultra-high-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry.JChromatogrA,2010.1217(5):p.648-659.

174. G.Tanner,C.Czerwenka,LC-MS/MS analysis of neonicotinoid insecticides in honey: meth-odology and residue findings in Austrian honeys.JAgricFoodChem,2011.59(23):p.12271-12277.

175. M.Arienzo,D.Cataldo,L.Ferrara,Pesticide residues in fresh-cut vegetables from integrated pest management by ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spec-trometry.FoodControl,2013.31(1):p.108-115.

176. P. Jovanov,V.Guzsvány,M.Franko,S.Lazić,M.Sakač, I.Milovanović,N.Nedeljković,Development of multiresidue DLLME and QuEChERS based LC–MS/MS method for determi-nation of selected neonicotinoid insecticides in honey liqueur.FoodResInt,2014.55(0):p.11-19.

177. M.M.Rahman,J.H.Park,A.M.AbdEl-Aty,J.H.Choi,A.Yang,K.H.Park,M.NashirUddinAlMahmud,G.J.Im,J.H.Shim,Feasibility and application of an HPLC/UVD to determine dinotefuran and its shorter wavelength metabolites residues in melon with tandem mass con-firmation.FoodChem,2013.136(2):p.1038-1046.

178. S.Risticevic,D.Vuckovic,H.L.Lord,J.Pawliszyn,Solid-Phase Microextraction,inCom-prehensive Sampling and Sample Preparation,J.Pawliszyn,Editor.2012,AcademicPress,Oxford,p.419-460.

179. A.A.Clifford,Extraction/Supercritical Fluid Extraction,inEncyclopedia of Separation Sci-ence,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.1442-1448.

180. J.J.Ramsden,What is Nanotechnology?, inApplied Nanotechnology (SecondEdition),J.J.Ramsden,Editor.2014,WilliamAndrewPublishing,Oxford,p.3-12.

181. V.J.Morris,Food Technologies: Nanotechnology and Food Safety,inEncyclopedia of Food Safety,Y.Motarjemi,Editor.2014,AcademicPress,Waltham,p.208-210.

182. B.G.Priestly,A.Bartholomaeus,R.Drew,Hazards of Food Contact Material: Nanotech-nologies and Nanomaterials, inEncyclopedia of Food Safety,Y.Motarjemi,Editor. 2014,AcademicPress,Waltham,p.444-448.

183. M.Keidar,I.I.Beilis,Plasma Nanoscience and Nanotechnology,inPlasma Engineering,M.KeidarandI.I.Beilis,Editors.2013,AcademicPress,Boston,p.287-357.

184. F.Augusto,L.W.Hantao,N.G.S.Mogollón,S.C.G.N.Braga,New materials and trends in sorbents for solid-phase extraction.TrACTrendAnalChem,2013.43(0):p.14-23.

185. K. Pyrzynska,Carbon nanotubes as sorbents in the analysis of pesticides. Chemosphere,2011.83(11):p.1407-1413.

186. R.Malik,N.Alvarez,M.Haase,B.Ruff,Y.Song,B.Suberu,D.Shereen,D.Mast,A.Gilpin,M.Schulz,V.Shanov,Carbon Nanotube Sheet: Processing, Characterization and Applica-tions,inNanotube Superfiber Materials,M.J.Schulz,V.N.Shanov,andZ.Yin,Editors.2014,WilliamAndrewPublishing,Boston,p.349-387.

187. N.T.Alvarez,V.N.Shanov,T.Ochmann,B.Ruff,Carbon Nanotube Fiber Doping,inNano-tube Superfiber Materials,M.J.Schulz,V.N.Shanov,andZ.Yin,Editors.2014,WilliamAn-drewPublishing,Boston,p.289-311.

167

Pavle Jovanov

188. R.Zhang,Y.Zhang,F.Wei,Synthesis and Properties of Ultralong Carbon Nanotubes, inNanotube Superfiber Materials,M.J.Schulz,V.N.Shanov,andZ.Yin,Editors.2014,WilliamAndrewPublishing,Boston,p.87-136.

189. C.Li,G.Shi,Carbon nanotube-based fluorescence sensors. JPhotochPhotobioC,2014.19(0):p.20-34.

190. A.Demir,A.Baykal,H.Sözeri,R.Topkaya,Low temperature magnetic investigation of Fe3O4 nanoparticles filled into multiwalled carbon nanotubes.SyntheticMet,2014.187(0):p.75-80.

191. Nanotechnology Now. 2014, [pristupljeno 10.01.2014.]; Dostupno: http://www.nanotech-now.com/nanotube-buckyball-sites.htm.

192. M.Valcárcel,S.Cárdenas,B.M.Simonet,Y.Moliner-Martínez,R.Lucena,Carbon nano-structures as sorbent materials in analytical processes.TrACTrendAnalChem,2008.27(1):p.34-43.

193. B.Pan,B.Xing,Adsorption mechanisms of organic chemicals on carbon nanotubes.EnvironSciTechn,2008.42(24):p.9005-9013.

194. W.Chen,L.Duan,D.Zhu,Adsorption of polar and nonpolar organic chemicals to carbon nanotubes.EnvironSciTechn,2007.41(24):p.8295-8300.

195. B.T.Zhang,X.Zheng,H.F.Li,J.M.Lin,Application of carbon-based nanomaterials in sam-ple preparation: A review.AnalChimActa,2013.784(0):p.1-17.

196. J.Tian,J.Xu,F.Zhu,T.Lu,C.Su,G.Ouyang,Application of nanomaterials in sample prepa-ration.JChromA,2013.1300(0):p.2-16.

197. V.Guzsvány,Z.Papp,S.Lazic,F.Gaál,L.Bjelica,B.Abramovic,A rapid spectrophotometric determination of imidacloprid in selected commercial formulations in the presence of 6-chlo-ronicotinic acid.JSerbChemSoc,2009.74(12):p.1455-1465.

198. Q.Guillermo,A.Sergio,G.Salvador,G.Migueldela,Fourier transform infrared determina-tion of imidacloprid in pesticide formulations.JBrazChemSoc,2004.15(2):p.165-169.

199. V.Guzsvány,L.Rajić,B.Jović,D.Orčić,J.Csanádi,S.Lazić,B.Abramović,Spectroscopic monitoring of photocatalytic degradation of the insecticide acetamiprid and its degradation product 6-chloronicotinic acid on TiO2 catalyst.JEnvironSciHealth,PartA,2012.47(12):p.1919-1929.

200. J.LuisVilchez,R.El-Khattabi,R.Blanc,A.Navalón,Photochemical-fluorimetric method for the determination of the insecticide imidacloprid in water samples.AnalChimActa,1998.371(2-3):p.247-253.

201. J.L.Vı́lchez,M.C.Valencia,A.Navalón,B.Molinero-Morales,L.F.Capitán-Vallvey,Flow injection analysis of the insecticide imidacloprid in water samples with photochemically in-duced fluorescence detection.AnalChimActa,2001.439(2):p.299-305.

202. A.Navalón,R.El-Khattabi,A.González-Casado,J.Vilchez,Differential-pulse polarograph-ic determination of the insecticide imidacloprid in commercial formulations.MicrochimActa,1999.130(4):p.261-265.

203. R.Blanc,A.González-Casado,A.Navalón,J.L.Vı́lchez,On the estimate of blanks in dif-ferential pulse voltammetric techniques: application to detection limits evaluation as recom-mended by IUPAC.AnalChimActa,2000.403(1-2):p.117-123.

168


204. A.Guiberteau,T.Galeano,N.Mora,P.Parrilla,F.Salinas,Study and determination of the pes-ticide Imidacloprid by square wave adsorptive stripping voltammetry.Talanta,2001.53(5):p.943-949.

205. V.Guzsvány,J.Petrović,J.Krstić,Z.Papp,M.Putek,L.Bjelica,A.Bobrowski,B.Abramović,Renewable silver-amalgam film electrode for voltammetric monitoring of solar photodegra-dation of imidacloprid in the presence of Fe/TiO2 and TiO2 catalysts. JElectroanalChem,2013.699(0):p.33-39.

206. E.Watanabe,H.Eun,K.Baba,T.Arao,Y.Ishii,S.Endo,M.Ueji,Evaluation and validation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for the neonicotinoid insec-ticide imidacloprid in agricultural samples.JAgricFoodChem,2004.52(10):p.2756-2762.

207. H.J.Kim,S.Liu,Y.S.Keum,Q.X.Li,Development of an enzyme-linked immunosorbent as-say for the insecticide thiamethoxam.JAgricFoodChem,2003.51(7):p.1823-1830.

208. H.J.Kim,W.L.Shelver,Q.X.Li,Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the insecticide imidacloprid.AnalChimActa,2004.509(1):p.111-118.

209. S.Wanatabe,S.Ito,Y.Kamata,N.Omoda,T.Yamazaki,H.Munakata,T.Kaneko,Y.Yuasa,Development of competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on mono-clonal antibodies for chloronicotinoid insecticides imidacloprid and acetamiprid.AnalChimActa,2001.427(2):p.211-219.

210. E.Watanabe,K.Baba,H.Eun,S.Miyake,Application of a commercial immunoassay to the direct determination of insecticide imidacloprid in fruit juices.FoodChem,2007.102(3):p.745-750.

211. E.Watanabe,S.Miyake,K.Baba,H.Eun,S.Endo,Immunoassay for acetamiprid detection: application to residue analysis and comparison with liquid chromatography.AnalBioanalChem,2006.386(5):p.1441-1448.

212. J.L.Vilchez,R.El-Khattabi,J.Fernández,A.González-Casado,A.Navalón,Determination of imidacloprid in water and soil samples by gas chromatography-mass spectrometry.JChro-matogrA,1996.746(2):p.289-294.

213. A.Navalon,A.Gonzalez-Casado,R.El-Khattabi,J.LuisVilchez,A.R.Fernandez-Alba,De-termination of imidacloprid in vegetable samples by gas chromatography-mass spectrometry. Analyst,1997.122(6):p.579-581.

214. M.Mateu-Sanchez,M.Moreno,F.J.Arrebola,J.L.MartinezVidal,Analysis of acetamiprid in vegetables using gas chromatography-tandem mass spectrometry.AnalSci,2003.19(5):p.701-704.

215. A.Y.Ko,M.M.Rahman,A.M.AbdEl-Aty,J.Jang,J.H.Park,S.K.Cho,J.H.Shim,Develop-ment of a simple extraction and oxidation procedure for the residue analysis of imidacloprid and its metabolites in lettuce using gas chromatography.FoodChem,2014.148(0):p.402-409.

216. L.L.Li,G.Jiang,C.Liu,H.Liang,D.Sun,W.Li,Clothianidin dissipation in tomato and soil, and distribution in tomato peel and flesh.FoodControl,2012.25(1):p.265-269.

217. B.Łozowicka,The development, validation and application of a GC-dual detector (NPD-ECD) multi-pesticide residue method for monitoring bee poisoning incidents.EcotoxEnvironSafe,2013.97(0):p.210-222.

218. S.Rossi,A.G.Sabatini,R.Cenciarini,S.Ghini,S.Girotti,Use of high-performance liquid

169

Pavle Jovanov

chromatography, UV and gas chromatography, mass spectrometry for determination of the imidacloprid content of honeybees, pollen, paper filters, grass, and flowers.Chromatograph-ia,2004.61(3-4):p.189-195.

219. A.R.Fernandez-Alba,A.Valverde,A.Agüera,M.Contreras,S.Chiron,Determination of imidacloprid in vegetables by high-performance liquid chromatography with diode-array de-tection.JChromatogrA,1996.721(1):p.97-105.

220. M.Martı́nezGalera,A.GarridoFrenich,J.L.Martı́nezVidal,P.ParrillaVázquez,Resolu-tion of imidacloprid pesticide and its metabolite 6-chloronicotinic acid using cross-sections of spectrochromatograms obtained by high-performance liquid chromatography with diode-array detection.JChromatogrA,1998.799(1-2):p.149-154.

221. A.Mandic,S.Lazic,S.Okresz,F.Gaal,Determination of the insecticide imidacloprid in potato ( Solanum tuberosum L.) and onion (Allium cepa) by high-performance liquid chroma-tography with diode-array detection.JAnalChem,2005.60(12):p.1134-1138.

222. H.Obana,M.Okihashi,K.Akutsu,Y.Kitagawa,S.Hori,Determination of acetamiprid, imi-dacloprid, and nitenpyram residues in vegetables and fruits by high-performance liquid chro-matography with diode-array detection.JAgricFoodChem,2002.50(16):p.4464-4467.

223. S.B.Singh,G.D.Foster,S.U.Khan,Microwave-assisted extraction for the simultaneous de-termination of thiamethoxam, imidacloprid, and carbendazim residues in fresh and cooked vegetable samples.JAgricFoodChem,2004.52(1):p.105-109.

224. C.Blasco,M.Fernandez,Y.Pico,G.Font, J.Manes,Simultaneous determination of imi-dacloprid, carbendazim, methiocarb and hexythiazox in peaches and nectarines by liquid chromatography-mass spectrometry.AnalChimActa,2002.461(1):p.109-116.

225. F.Hernández,J.V.Sancho,O.Pozo,A.Lara,E.Pitarch,Rapid direct determination of pesti-cides and metabolites in environmental water samples at sub-μg/l level by on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.JChromatogrA,2001.939(1-2):p.1-11.

226. H.Obana,M.Okihashi,K.Akutsu,Y.Kitagawa,S.Hori,Determination of neonicotinoid pes-ticide residues in vegetables and fruits with solid phase extraction and liquid chromatography mass spectrometry.JAgricFoodChem,2003.51(9):p.2501-2505.

227. I.Ferrer,E.M.Thurman,A.R.Fernandez-Alba,Quantitation and accurate mass analysis of pesticides in vegetables by LC/TOF-MS.AnalChem,2005.77(9):p.2818-2825.

228. A.Marı́n,J.L.Martı́nezVidal,F.J.EgeaGonzalez,A.GarridoFrenich,C.R.Glass,M.Sykes,Assessment of potential (inhalation and dermal) and actual exposure to acetamiprid by green-house applicators using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.JChromatogrB,2004.804(2):p.269-275.

229. S.Seccia,P.Fidente,D.A.Barbini,P.Morrica,Multiresidue determination of nicotinoid in-secticide residues in drinking water by liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry.AnalChimActa,2005.553(1-2):p.21-26.

230. N.R.deErenchun,Z.G.deBalugera,M.A.Goicolea,R.J.Barrio,Determination of imida-cloprid and its major metabolite in soils by liquid chromatography with pulsed reductive amperometric detection.AnalChimActa,1997.349(1-3):p.199-206.

231. M.Rancan,A.G.Sabatini,G.Achilli,G.C.Galletti,Determination of imidacloprid and me-tabolites by liquid chromatography with an electrochemical detector and post column photo-

170


chemical reactor.AnalChimActa,2006.555(1):p.20-24.

232. C.Mohan,Y.Kumar,J.Madan,N.Saxena,Multiresidue analysis of neonicotinoids by solid-phase extraction technique using high-performance liquid chromatography.EnvironMonitAssess,2010.165(1-4):p.573-576.

233. I.M.deOliveira,B.V.F.Nunes,D.R.Barbosa,A.M.Pallares,L.R.F.Faro,Effects of the neo-nicotinoids thiametoxam and clothianidin on in vivo dopamine release in rat striatum.ToxicolLett,2010.192(3):p.294-297.

234. M.Wu,J.Cai,J.Yao,B.Dai,Y.Lu,Study of imidaclothiz residues in cabbage and soil by HPLC with UV detection.BullEnvironContamToxicol,2010.84(3):p.289-293.

235. V.Guzsvány,A.Madžgalj, P.Trebše,F.Gaál,M.Franko,Determination of selected neo-nicotinoid insecticides by liquid chromatography with thermal lens spectrometric detection. EnvironChemLett,2007.5(4):p.203-208.

236. B.Abramović,N.Banić,D.Šojić,Degradation of thiacloprid in aqueous solution by UV and UV/H2O2 treatments.Chemosphere,2010.81(1):p.114-119.

237. W.Xie,C.Han,Y.Qian,H.Ding,X.Chen,J.Xi,Determination of neonicotinoid pesticides residues in agricultural samples by solid-phase extraction combined with liquid chromatog-raphy-tandem mass spectrometry.JChromatogrA,2011.1218(28):p.4426-4433.

238. Z.Xiao,Y.Yang,Y.Li,X.Fan,S.Ding,Determination of neonicotinoid insecticides residues in eels using subcritical water extraction and ultra-performance liquid chromatography–tan-dem mass spectrometry.AnalChimActa,2013.777(0):p.32-40.

239. N.Dujaković,S.Grujić,M.Radišić,T.Vasiljević,M.Laušević,Determination of pesticides in surface and ground waters by liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrom-etry.AnalChimActa,2010.678(1):p.63-72.

240. K.P.Yáñez, J.L.Bernal,M.J.Nozal,M.T.Martín, J.Bernal,Determination of seven neo-nicotinoid insecticides in beeswax by liquid chromatography coupled to electrospray-mass spectrometry using a fused-core column.JChromatogrA,2013.1285(0):p.110-117.

241. W.Commons,HPLC apparatus.2014,[pristupljeno10.01.2014.];Dostupno:http://com-mons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus.svg.

242. I.Sources,Getting Started in HPLC.2014,[pristupljeno10.01.2014.];Dostupno:http://www.lcresources.com/resources/getstart/2c01.htm.

243. C.F.Poole,Chromatography,inReference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering.2013,Elsevier.

244. E.R.Ardrey,Liquid Chromatography - Mass Spectrometry:An introduction.2003:Wiley.

245. A.E.Rodrigues,Chromatography/Convective Transport in Chromatographic Media,inEn-cyclopedia of Separation Science,I.D.Wilson,Editor.2000,AcademicPress,Oxford,p.352-358.

246. VonK.Robards,P.R.Haddad,P.E.Jackson,Principles and practice of modern chromato-graphic methods. AcademicPress,London,1994.

247. V.Meyer,Practical High-Performance Liquid Chromatography(Fourthedition).2004.JohnWiley&Sons,p.1-374.

171

Pavle Jovanov

248. E.R.Ardrey,Liquid Chromatography – Mass Spectrometry: An Introduction.2003.JohnWi-ley&Sons.

249. V.R.Meyer,Chromatography/Principles,inReference Module in Chemistry, Molecular Sci-ences and Chemical Engineering.2013,Elsevier.

250. M.C.McMaster,HPLC A Practical User’s Guide.2007,JohnWiley&Sons.

251. L.M.L.Nollet,Food Analysis by HPLC.2000.MarcelDekker,Inc.

252. F.A.Settle,Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry.1997.PrenticeHall.

253. D.C.Harris,Quantitative Chemical Analysis.1995.W.H.Freeman.

254. J.S.RolfEkman,A.Westman-Brinkmalm,A.Kraj,Mass Spectrometry - Instrumentation, Interpretation, and Applications.2009.JohnWiley&Sons.

255. J.H.Gross,Mass Spectroscopy.2004.Springer.

256. C.Lifshitz,T.D.Märk,Mass Spectrometry, Ionization Theory,inEncyclopedia of Spectros-copy and Spectrometry (Second Edition),J.C.Lindon,Editor.1999,AcademicPress:Oxford.p.1459-1469.

257. K.Tang,J.S.Page,R.T.Kelly,I.Marginean,Electrospray Ionization in Mass Spectrometry,inEncyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry (SecondEdition),J.C.Lindon,Editor.2010,AcademicPress,Oxford,p.467-474.

258. V.S.EdmonddeHoffmann,Mass Spectrometry: Principles and Applications.2007.JohnWi-ley&Sons.

259. NASA.Huygens Probe Gas Chromatograph Mass Spectrometer.2013[pristupljeno15.10.2013.];Dostupno:http://huygensgcms.gsfc.nasa.gov/MS_Analyzer_1.htm.

260. F.W.McLafferty,Tandem Mass Spectrometry.1983,JohnWiley&Sons.

261. K.L.Busch,G.L.Glish,S.A.McLuckey,Mass Spectrometry: Techniques and Applications of Tandem Mass Spectrometry.1988,VCH.

262. R.Bateman,Sector Mass Spectrometers,inEncyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry (SecondEdition),J.C.Lindon,Editor.1999,AcademicPress,Oxford,p.2511-2517.

263. S.E.V. Bramer, An Introduction to Mass Spectrometry. 1998, [pristupljeno 12.10.2013.]Dostupno:(http://science.widener.edu/svb/massspec/massspec.pdf).

264. Wikipedia.Electron Multiplier.2013,[pristupljeno12.10.2013.];Dostupno:http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_multiplier.

265. M.Smith,Understanding Mass Spectra: A Basic Approach(SecondEdition),2004.JohnWiley&Sons.

266. W.E.L.Andre,P.DeLeenheer,JanF.VanBocxlaer,Modern Chromatographic Analysis of Vitamins.2000,MarcelDekker,Inc.

267. D.L.BenteWetzel,G.Charalambous, Instrumental Methods in Food and Beverage Analysis.1998,Elsevier.

268. J.Li,E.Altman,Application of Mass Spectrometry to Rapid Analysis of Bacterial Polysac-

172


charides, inComprehensive Natural Products II,H.-W.LiuandL.Mander,Editors.2010,Elsevier,Oxford,p.497-511.

269. S.N.Deming,Y.Michotte,D.L.Massart,L.Kaufman,B.G.M.Vandeginste,Chemometrics: A Textbook. 1988,ElsevierScience.

270. M.Otto.,Chemometrics.2007,JohnWiley&Sons.

271. M.Preu,D.Guyot,M.Petz,Development of a gas chromatography-mass spectrometry meth-od for the analysis of aminoglycoside antibiotics using experimental design for the optimisa-tion of the derivatisation reactions.JChromatogrA,1998.818(1):p.95-108.

272. L.Mutihac,R.Mutihac,Mining in chemometrics.AnalChimActa,2008.612(1):p.1-18.

273. R.G.Brereton,Chemometrics: Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant.2003,JohnWiley&Sons.

274. S.N.Deming,S.L.Morgan,Experimental Design: A Chemometric Approach: A Chemometric Approach.1993,ElsevierScience.

275. J.Trygg,J.Gabrielsson,T.Lundstedt,Background Estimation, Denoising, and Preprocess-ing,inComprehensive Chemometrics,S.D.Brown,R.Tauler,andB.Walczak,Editors.2009,Elsevier,Oxford,p.1-8.

276. J.Trygg,E.Holmes,T.Lundstedt,Chemometrics in Metabonomics.JProteomeRes,2006.6(2):p.469-479.

277. T.Lundstedt,E.Seifert,L.Abramo,B.Thelin,A.Nyström,J.Pettersen,R.Bergman,Experi-mental Design and Optimization. ChemomIntellLabSyst,1998.42(0):p.3-40.

278. R.G.Brereton,Chemometrics and Statistics: (h) Optimisation Strategies,inReference Mod-ule in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering.2013,Elsevier.

279. S.L.Ferreira,R.E.Bruns,E.G.daSilva,W.N.DosSantos,C.M.Quintella,J.M.David,J.B.deAndrade,M.C.Breitkreitz,I.C.Jardim,B.B.Neto,Statistical designs and response surface techniques for the optimization of chromatographic systems.JChromatogrA,2007.1158(1-2):p.2-14.

280. T.P.Ryan,Introduction,inModern Experimental Design.2006,JohnWiley&Sons,p.1-30.

281. M.Nowak,A.Seubert,Application of experimental design for the characterisation of a novel elution system for high-capacity anion chromatography with suppressed conductivity detec-tion.JChromatogrA,1999.855(1):p.91-109.

282. L.K.Skartland,S.A.Mjos,B.Grung,Experimental designs for modeling retention patterns and separation efficiency in analysis of fatty acid methyl esters by gas chromatography-mass spectrometry.JChromatogrA,2011.1218(38):p.6823-6831.

283. S.L.Ferreira,W.N.DosSantos,C.M.Quintella,B.B.Neto,J.M.Bosque-Sendra,Doehlert matrix: a chemometric tool for analytical chemistry-review.Talanta,2004.63(4):p.1061-1067.

284. S.L. Ferreira,R.E.Bruns,H.S. Ferreira,G.D.Matos, J.M.David,G.C.Brandao,E.G. daSilva,L.A.Portugal,P.S.dosReis,A.S.Souza,W.N.dosSantos,Box-Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods.AnalChimActa,2007.597(2):p.179-186.

285. M.A.Bezerra,R.E.Santelli,E.P.Oliveira,L.S.Villar,L.A.Escaleira,Response surface meth-odology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry.Talanta,2008.76(5):p.965-977.

173

Pavle Jovanov

286. N.A.Armstrong,Pharmaceutical Experimental Design and Interpretation (SecondEdition).2006,Taylor&Francis.

287. A.Gonzalez,K.L.Foster,G.Hanrahan,Method development and validation for optimized separation of benzo[a]pyrene-quinone isomers using liquid chromatography-mass spectrom-etry and chemometric response surface methodology.JChromatogrA,2007.1167(2):p.135-142.

288. L.Liu,Y.-B.Wen,K.-N.Liu,L.Sun,M.Wu,G.-F.Han,Y.-X.Lu,Q.-M.Wang,Z.Yin,Opti-mization of on-line solid phase extraction and HPLC conditions using response surface meth-odology for determination of WM-5 in mouse plasma and its application to pharmacokinetic study.JChromatogrB,2013.923-924(0):p.8-15.

289. J.Z.Song,C.F.Qiao,S.L.Li,Y.Zhou,M.T.Hsieh,H.X.Xu,Rapid optimization of dual-mode gradient high performance liquid chromatographic separation of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae by response surface methodology.JChromatogrA,2009.1216(42):p.7007-7012.

290. Y.Zhou,J.Z.Song,F.F.K.Choi,H.F.Wu,C.F.Qiao,L.S.Ding,S.L.Gesang,H.X.Xu,An experimental design approach using response surface techniques to obtain optimal liquid chromatography and mass spectrometry conditions to determine the alkaloids in Meconopsi species.JChromatogrA,2009.1216(42):p.7013-7023.

291. G.Bošković,S.Ratković,E.Kiss,O.Geszti,Carbon nanotubes purification constrains due to large Fe-Ni/Al2O3 catalyst particles encapsulation.BullMaterSci,2013.36(1):p.1-7.

292. S.Ratković,D.Vujičić,E.Kiss,G.Bošković,O.Geszti,Different degrees of weak metal-sup-port interaction in Fe-(Ni)/Al2O3 catalyst governing activity and selectivity in carbon nano-tubes’ production using ethylene.MaterChemandPhys,2011.129(1-2):p.398-405.

293. S.Ratković,E.Kiss,G.Bošković,Synthesis of high-purity carbon nanotubes over alumina and silica supported bimetallic catalysts.ChemIndChemEngQ,2009.15(4):p.227-236.

294. P.Jovanov,V.Guzsvány,M.Franko,S.Lazić,M.Sakač,B.Šarić,V.Banjac,Multi-residue method for determination of selected neonicotinoid insecticides in honey using optimized dispersive liquid-liquid microextraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Talanta,2013.111(0):p.125-133.

295. T.Sivakumar,R.Manavalan,K.Valliappan,Computer-assisted optimization of liquid-liquid extraction for HPLC analysis of domperidone and pantoprazole in human plasma.ActaChro-matogr,2008.20(4):p.549-562.

296. SANCO/12495/2011.Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed.

297. C.K.Zacharis,I.Rotsias,P.G.Zachariadis,A.Zotos,Dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of organochlorine pesticides residues in honey by gas chromatography-electron capture and ion trap mass spectrometric detection.FoodChem,2012.134(3): p.1665-1672.

298. M.P.Malešević,Multikriterijumski pristup modelovanja HPLC metode za odredivanje zolp-idem-tartarata i degradacionih proizvoda. 2013.FarmaceutskiFakultet,UniverzitetuBeo-gradu,Beograd,p.1-132.

299. S.Parra,V.Sarria,S.Malato,P.Péringer,C.Pulgarin,Photochemical versus coupled photo-chemical–biological flow system for the treatment of two biorecalcitrant herbicides: metobro-muron and isoproturon.ApplCataB,2000.27(3):p.153-168.

300. S.Chiron,A.Fernandez-Alba,A.Rodriguez,E.Garcia-Calvo,Pesticide chemical oxidation:

state-of-the-art.WaterRes,2000.34(2):p.366-377.

8. BIOGRAFIJA KANDIDATA

Poglavlje 8

Laboratorije za tehnologiju, kvalitet i bezbednost hrane-FINSLab.

Autor je i koautor mnogih radova i saopštenja prezentovanih na međunarodnom i nacionalnom nivou.

Pored bavljenja naučnoistraživačkim radom, Pavle Jovanov se dugi niz godina uspešno bavi veslan-jem, predstavljajući našu zemlju i Univerzitet u No-vom Sadu na mnogim domaćim i međunarodnim takmičenjima.

Pavle Jovanov je rođen u Novom Kneževcu 17.05.1985. godine, gde je završio osnovnu školu i gimnaziju. Prvu godinu osnovnih studija na Prirodno-matematičkom fakultetu, Univerziteta u Novom Sadu, odsek za hemiju, smer-diplomirani hemičar (opšti smer) upisao je 2004. godine. Dva puta je predstavljao fakultet na “Primatijadi”, 2006. i 2007. godine, gde je sa svojim naučnim radovima osvojio drugo i treće mesto iz oblasti hemije. Godine 2007. dobio je prvu nagradu Uni-verziteta u Novom Sadu za najbolji studentski temat iz hemi-je. Četvrtu godinu osnovnih studija je pohađao, kao student razmene, na University of Alabama in Huntsville, Alabama, SAD, školske 2007/08. godine, tokom koje je postao i počasni građanin grada Huntsville.

Master rad pod nazivom “Ispitivanje antioksidativnih osobina medenjaka obogaćenih heljdinim brašnom“ odbranio je 2010. godine na Tehnološkom fakultetu Univerziteta u Novom Sadu.

Od 2009. godine zaposlen je u Naučnom institutu za prehram-bene tehnologije u Novom Sadu, prvo u zvanju istraživač prip-ravnik, a zatim, od 2010. god., u zvanju istraživač saradnik. U okviru istraživačkog opusa osvojio je IUPAC nagradu za najbolji poster na 49. Savetovanju Srpskog hemijskog drustva 2011. go-dine i prvo mesto za najbolje oralno izlaganje na YISAC konfer-enciji 2012. godine u Sloveniji.

Od 2010. godine obavlja poslove rukovodioca akreditovane

9. KLJUČNA DOKUMENTACIJA

Poglavlje 9

Pavle Jovanov

181

obrazac 5а

UNIVERZITET U NOVOM SADU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Redni broj: RBR

Identifikacioni broj: IBR

Tip dokumentacije: TD

Monografska dokumentacija

Tip zapisa: TZ

Tekstualni štampani materijal

Vrsta rada (dipl., mag., dokt.): VR


Ime i prezime autora: AU

M.Sc. Pavle Jovanov

Mentor (titula, ime, prezime, zvanje): MN

Dr Valerija Gužvanj (Valéria Guzsvány), vanredni profesor

Naslov rada: NR

Optimizacija metoda ekstrackcije i određivanja neonikotinoida tečnom hromatografijom u odabranim uzorcima

Jezik publikacije: JP

Srpski (latinica)

Jezik izvoda: JI

srp. / eng.

Zemlja publikovanja: ZP

Republika Srbija

Uže geografsko područje: UGP

Autonomna PokrajinaVojvodine

Godina: GO

2014


182

Izdavač: IZ

autorski reprint

Mesto i adresa: MA

Departman za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, Prirodno matematički fakultet, Trg D. Obradovića 3, Novi Sad

Fizički opis rada: FO

(broj poglavlja 10/ stranica 190/ slika 66/ tabela 42 / referenci 300)

Naučna oblast: NO

Hemija

Naučna disciplina: ND

Analitička hemija

Predmetna odrednica, ključne reči: PO

tečna hromatografija visoke efikasnosti sa MS/MS i DAD, neonikotinoidi, analiza, ekstrakcija (DLLME i QuEChERS), RSM, med, liker od meda, višezidne ugljenične nanocevi, voda

UDK Čuva se: ČU

U biblioteci Departmana za hemiju, biohemiju i zaštitu životne sredine, PMF, Novi Sad, Trg Dositeja Obradovića 3

Važna napomena: VN

Nema

Izvod: IZ

Insekticidi novije generacije, neonikotinoidi, odlikuju se specifičnim načinom delovanja na

nervni sistem insekata. Radi dobijanja što brže i kvalitetnije informacije o izloženosti životne sredine

ovim insekticidima i količinama njihovih ostataka u hrani potrebno je raspolagati odgovarajućim

instrumentalnim metodama za njihovo određivanje. Razvijene su i optimizovane analitičke metode

zasnovane na tečnoj hromatografiji za određivanje sedam odabranih neonikotinoida (dinotefurana,

nitenpirama, tiametoksama, klotianidina, imidakloprida, acetamiprida i tiakloprida) u medu i likeru od

meda. Ispitivana je mogućnost određivanja klotianidina pomoću tečne hromatografije visoke efikasnosti

sa detektrorom od niza dioda (HPLC-DAD) primenom kombinacije tečno-tečne i ekstrakcije na otsrvčj

fazi iz uzoraka meda. Na osnovu preliminarnih rezultata može se zaključiti da korišćenje otsrvč-hinzaf

kolona u kombinaciji sa tečno-tečnom ekstrakcijom dihlormetanom rezultira prihvatljivim prinosom

klotianidina u uzorcima meda pri koncentraciji od oko 0,5 µg g-1 klotianidina. Radi dobijanja većih

prinosa odabrana je disperzna tečno-tečna mikroekstrakcija (DLLME) kao tehnika pripreme uzoraka

meda. Testirana je upotreba acetonitrila kao disperznog sredstva. Pored hloroforma, korišćen je i

dihlormetan kao drugo ekstrakciono sredstvo, kako bi se uporedila efikasnost ekstrakcije. Zabeleženi su

prinosi klotianidina od 69,7 i 68,3% u zavisnosti da li je korišćen hloroform, odnosno DHM kao rastvor

za ekstrakciju. Može se zaključiti da je prinos ekstrakcije bio povoljniji pri odnosu 0,5 mL ACN i 2,0

mL DHM. Prinosi su se kretali od 68,4% do 92,1%, što je ukazalo da su parametri DLLME ekstrakcije

Pavle Jovanov

183

optimalni. Kako bi se detaljnije ispitali ključni parametri DLLME tehnike, korišćena je metodologija

površine odziva (RSM), kao i detekcija na osetljivijem kuplovanom masenom detektoru (MS/MS).

Optimizovani su HPLC-MS/MS parametri kako bi se obezbedilo zadovoljavajuće hromatografsko

razdvajanje i niske granice detekcije (GD, 0,5–1,0 μg kg-1) i određivanja (GO, 1,0–2,5 μg kg-1)

ispitivanih neonikotinoida u medu. Upotrebom centralno kompozitnog dizajna konstruisani su kvadratni

modeli ispitivanih faktora: zapremine ekstrakcionog (DHM, 1,0–3,0 mL) i disperznog (ACN, 0,0–1,0

mL) sredstva, izračunati statistički parametri i optimizovan proces DLLME upotrebom Derringer-ove

funkcije poželjnih odgovora. Upotrebom MMC i SC krivih u opsegu GO–100,0 μg kg-1 ispitan je uticaj

matriksa pri čemu zaključeno je da je najveći uticaj matriksa bio na odziv analitičkog signala nitenpirama,

dinotefurana i klotianidina. Ispitani su prinosi odabranih neonikotinoida (R, 74,3–113,9%), kao i

preciznost metode u uslovima ponovljivosti (RSD, 2,74–11,8%) i intermedijerne reproduktivnosti (RSD,

6,64–16,2%). Brza (retenciona vremena 1,5–9,9 min) i osetljiva metoda, koja troši malu količinu

rastvarača, primenjena je za ispitivanje 15 realnih uzoraka meda različitog cvetnog porekla. Rezultati su

pokazali da ispitivani med nije sadržao ostatke ispitivanih neonikotinoida u koncentracijama iznad GD.

Dalje istraživanje je bilo usmereno ka razvijanju i optimizaciji HPLC-DAD analitičke metode

upotrebom DLLME i QuEChERS tehnika za pripremu uzoraka za određivanje 7 neonikotinoida u

uzorcima meda. U ovom delu istraživanja optimizovani su i hromatografski parametri, upotrebom RSM

sa Box-Behnken-ovim dizajnom i Derringer-ovom funkcijom poželjnih odgovora. Od ispitivanih

neonikotinoida dinotefuran i imidakloprid su bili u najvećoj meri izloženi uticaju matriksa, bez obzira na

proceduru pripreme uzoraka. Može se istaći da je uticaj matriksa na analitički signal dinotefurana bio

izraženiji u slučaju MS/MS, apostrofirajući manju robusnost ove metode određivanja. Prinosi

neonikotinoida su bili (R, 73,1–118,3%), preciznost u uslovima ponovljivosti (RSD, 3,28–10,40%) i

intermedijerne reproduktivnosti (RSD, 6,45–17,70%), a granice detekcije (GD, 1,5–2,5 µg kg-1) i

određivanja (GO, 5,0–10,0 µg kg-1). Metoda je primenjena za ispitivanje 7 neonikotinoida u 104 uzorka

meda različitog cvetnog porekla sa teritorije Autonomne Pokrajine Vojvodine. Detektovano je prisustvo

tiakloprida, imidakloprida i tiametoksama u količinama koje su bile ispod MDK RS i EU. Analizirani su

uzorci likera od meda - medice. Upoređivane su dve tehnike pripreme uzoraka, DLLME i QuEChERS i

primenjeni optimizovani hromatografski uslovi i MS/MS parametri. U slučaju nitenpirama, dinotefurana i

tiametoksama uticaj matriksa bio je najizraženiji. Metoda je validovana određivanjem prinosa

neonikotinoida (R, 69,2–113,4%), preciznosti u uslovima ponovljivosti (RSD, 3,21–12,81%) i

intermedijerne reproduktivnosti (RSD, 9,11–16,63%), kao i granice detekcije (GD, 0,5–2,5 µg kg-1) i

određivanja (GO, 1,0–10,0 µg kg-1). Analizom 10 komercijalno dostupnih likera od meda otkriveno je

prisustvo klotianidina i tiakloprida, evčzokinotšz na neophodnost daljeg kontrolisanja ovog proizvoda na

prisustvo neonikotinoida. Ispitana je mogućnost uklanjanja odabranih neonikotinoida (dinotefurana,

klotianidina i tiakloprida) iz vodene sredine (reke Dunav). Ispitivanje efikasnosti 6 različitih vrsta

uklanjanja odabranih neonikotinoida (u prisustvu prirodne insolacije u laboratorijskim uslovima, sa

dodatkom H2O2, sa dodatkom MWCNT, sa dodatkom MWCN+H2O2, sa dodatkom Fe-MWCNT, sa


184

dodatkom Fe-MWCNT+H2O2) vršeno je upotrebom prethodno razvijene HPLC-MS/MS metode. Krive

uklanjanja odabranih neonikotinoida, pokazale su da tokom 60 minuta pri prirodnoj insolaciji u

laboratorijskim uslovima koncentracija smanjenje oko 25%. Analitički signal dinotefurana dobijen u

prisustvu H2O2 pod istim uslovima ukazuje na uklanjanje ciljnog analita od oko 40%, tiakloprida od oko

70%, a klotianidina u potpunosti. Testirana je adsorpcija ciljnog analita na višezidnim ugljeničnim

nanocevima (MWCNT). Ovim postupkom može da se ukloni oko 30% dinotefurana, oko 50%

klotianidina i 60% tiakloprida. U kombinaciji sa H2O2, MWCNT pokazuju bolju sposobnost uklanjanja

za 15–50% u zavisnosti od ispitivanog neonikotinoida. Upotreba Fe-MWCNT i njihova kombinacija sa

H2O2 otvorila je mogućnost za dalja ispitivanja mehanizma uklanjanja. Ustanovljeno je nastajanje

intermedijera kojima odgovaraju m/z od 117,5 i 140,6 u slučaju razgradnje dinotefurana u sistemima sa

H2O2, MWCNT+H2O2, Fe-MWCNT+H2O2 i klotianidina u sistemu Fe-MWCNT+H2O2. Datum prihvatanja teme od strane NN veća: DP

22.05.2013.godine na 10. sednici NN veća PMF-a

Datum odbrane: DO

Članovi komisije: (ime i prezime / titula / zvanje / naziv organizacije / status) KO

predsednik: dr Biljana Abramović, redovni professor, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu; mentor: dr Valerija Gužvanj (Valéria Guzsvány), vanredni professor, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu; član: dr Dejan Orčić, docent, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu; član: dr Sanja Lazić, redovni professor, Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Novom Sadu; član: dr Marijana Sakač, naučni savetnik, Naučni institut za prehrambene tehnologije, Univerzitet u Novom Sadu; član: dr Mladen Franko, redovni profesor, Univerzitet u Novoj Gorici, Slovenija.

10. KEY WORD DOCUMENTATION

Chapter 10Poglavlje 10

Pavle Jovanov

187

University of Novi Sad Faculty of Science

Key word documentation

Accession number: ANO

Identification number: INO

Document type: DT

Monograph documentation

Type of record: TR

Textual printed material

Contents code: CC

Doctoral Thesis

Author: AU

Pavle Jovanov, MSc

Mentor: MN

Dr. Valerija Gužvanj (Valéria Guzsvány), Associate Professor

Title: TI

Optimization of extraction and determination of neonicotinoids using liquid chromatography in selected samples

Language of text: LT

Serbian (Latin alphabet)

Language of abstract: LA

eng. / srp.

Country of publication: CP

Republic of Serbia

Locality of publication: LP

Autonomous Province of Vojvodina

Publication year: PY

2014

Publisher: PU

Author' reprints

Publication place: PP

Novi Sad, Department of Chemistry, Biochemistry and Environmental Protection, Faculty of Sciences, Trg Dositeja Obradovića 3

Physical description: PD

(chapters 10/ pages 190 2/ pictures 66/ tables 42 /literature 300)


188

Scientific field SF

Chemistry

Scientific discipline SD

Analytical chemistry

Subject, Key words SKW

High performance liquid chromatography with DAD and MS/MS, neonicotinoids, analysis, extraction (DLLME and QuEChERS), RSM, honey, honey liqueur, multiwalled carbon nanotubes, water

UC Holding data: HD

In the Library of Department of Chemistry, Biochemistry and Environmental Protection, Faculty of Sciences, Novi Sad, Trg Dositeja Obradovića 3

Note: N

No

Abstract/Summary AB

Neonicotinoid insecticides, as one of the fastest growing new generation of insecticides, have

contributed to a significant reduction of toxicity for the environment; therefore, monitoring and

determination of trace levels of the neonicotinoids in honey are necessary and demands highly efficient,

selective and sensitive analytical techniques. The objective of the present work was to develop a rapid,

sensitive, optimized and accurate analytical method based on liquid chromatography for determining

seven neonicotinoid insecticides, dinotefuran, nitenpyram, thiamethoxam, clothianidin, imidacloprid,

acetamiprid and thiacloprid in honey and honey liqueur samples. The possibility for determination of

clothianidin in honey samples was investigated by HPLC with a diode array detector (HPLC-DAD).

Based on preliminary results, it can be concluded that the use of a solid-phase column in combination

with a liquid-liquid extraction with dichloromethane results in an acceptable recovery of clothianidin in

the samples with a clothianidin concentration of about 0.5 µg g-1. After obtaining low recovery of

clothianidin, dispersed liquid-liquid microextraction (DLLME) was selected as a technique for the

preparation of honey samples.. The adequacy of acetonitrile as a dispersing agent was investigated.

Besides the chloroform, a dichloromethane was used as a second extracting agent , in order to compare

the relative efficiency of the extraction solvents. It can be concluded that the extraction recovery (68.4–

92.1%) was more favorable with the use of 0.5 mL ACN and 2.0 mL DHM. Furthermore, LC-MS/MS

parameters were optimized to unequivocally provide good chromatographic separation, low detection

(LOD, 0.5–1.0 μg L−1) and quantification (LOQ, 1.0–2.5 μg L−1) limits for acetamiprid, clothianidin,

thiamethoxam, imidacloprid, dinotefuran, thiacloprid and nitenpyram in honey samples. Using different

types (chloroform, dichloromethane) and volumes of extraction (1.0–3.0 mL) and dispersive

(acetonitrile; 0.0–1.0 mL) solvent and by mathematical modeling it was possible to establish the optimal

sample preparation procedure. Matrix-matched calibration and blank honey sample spiked in the

Pavle Jovanov

189

concentration range of LOQ–100.0 μg kg−1 were used to compensate the matrix effect and to fulfill the

requirements of SANCO/12495/2011 for the accuracy (R 74.3–113.9%) and precision (expressed in

terms of repeatability (RSD 2.74–11.8%) and within-laboratory reproducibility (RSDs 6.64–16.2%)) of

the proposed method. The rapid (retention times 1.5–9.9 min), sensitive and low solvent consumption

procedure described in this work provides reliable, simultaneous, and quantitative method applicable for

the routine laboratory analysis of seven neonicotinoid residues in 15 real honey samples. Neonicotinoid

residues were not detected in any of the investigated samples. The objective of next study was to

develop and optimize HPLC-DAD analytical method with dispersive liquid-liquid microextraction

(DLLME) and QuEChERS sample preparation procedures for the simultaneously analysis of seven

neonicotinoids in honey samples. The liquid chromatographic conditions were optimized by response

surface methodology with Box-Behnken design and the global Derringer´s desirability. The optimized

method was validated to fulfill the requirements of SANCO/12495/2011 standard for both sample

pretreatment procedures providing results for accuracy (R, 73.1–118.3%), repeatability (RSD, 3.28–

10.40%) and within-laboratory reproducibility (RSD, 6.45–17.70%), limits of detection (LOD, 1.5–2.5

gµ gµ-1) and quantification (LOQ, 5.0–10.0 µg kg-1). For the first time, more than 100 honey samples

collected from all 7 counties of Autonomous Province of Vojvodina were analyzed. The presence of

thiacloprid, imidacloprid and thiametoxam was discovered in a small number of samples. The objective

of next study was to develop an optimized LC-MS/MS analytical method with DLLME and QuEChERS

procedures for analysis of 7 neonicotinoids in honey liqueur. The method was validated to fulfill the

requirements of SANCO/12495/2011 for both sample pretreatment procedures providing results for

accuracy (R, 69.2–113.4% for DLLME; 71.8–94.9% for QuEChERS), precision (RSD expressed in

terms of repeatability (3.21–10.20% for DLLME; 4.19–12.81% for QuEChERS) and within-laboratory

reproducibility (9.11–16.63% for DLLME; 11.32–16.40% for QuEChERS)), limits of detection (LOD,

0.5–1.5 gµ µ-1 for DLLME; 1.0–2.5 gµ µ-1 for QuEChERS) and quantification (LOQ, 1.0–5.0 gµ µ-1 for

DLLME; 2.5–10.0 µg L-1 for QuEChERS). Analysis of real honey liqueur samples obtained from local

markets showed the presence of clothianidin or thiacloprid in four of the analyzed samples, therefore

implicating the necessity of ongoing control of this type of traditional product. Removal of selected

neonicitinoid insecticides - dinotefuran, clothianidin and thiacloprid using MWCNT and H2O2 from

Danube water matrix was investigated. Efficiency of different systems for neonicotinoids removal

(under natural insolation in laboratory, with H2O2, with MWCNT, with MWCNT+ H2O2, with Fe-

MWCNT, with Fe-MWCNT+H2O2) was evaluated with developed LC-MS/MS method. Analysis of

degradation rates revealed loss of 25% of the initial neonicotinoid concentration under natural insolation in

the laboratory conditions during 60 min. Addition of chemical agent H2O2 promoted loss of 40% of the

initial dinotefuran, 70% of thiacloprid concentration and total removal of clothianidin under same

conditions. With the addition of MWCNT concentration of dinotefuran, clothianidin and thiacloprid

decayed for 30, 50 and 60%, respectively. Iron modification of MWCNT in combination with H2O2

increased the removal rate of selected neonicotinoid for 15–50%. Presence of intermediates was


190

discovered in systems of dinotefuran with H2O2, MWCNT+H2O2, Fe-MWCNT+H2O2 and of

clothianidin in systems with Fe-MWCNT+H2O2 with m/z of 117,5 and 140,6.

Accepted on Scientific Board on: AS

22.05.2013.

Defended: DE

Thesis Defend Board: DB

president: dr Biljana Abramović, Full Professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad; mentor: dr Valerija Gužvanj (Valéria Guzsvány), Associate Professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad; member: dr Dejan Orčić, Assistant Professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad; member: dr Sanja Lazić, Full Professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad; member: dr Marijana Sakač, Principal research fellow, Institute of Food Technology, University of Novi Sad; member: dr Mladen Franko, Full Professor, University of Nova Gorica, Slovenia.

Pavle Jovanov OPTIMIZACIJA METODA EKSTRAKCIJE I ...

Documents

Transcript of Pavle Jovanov OPTIMIZACIJA METODA EKSTRAKCIJE I ...