número 5 (Ciencias Naturales y Exactas) - UASLP

I n d u c c I ó n a l a c I e n c I a , l a T e c n o l o g í a y l a I n n o v a c I ó n e n l a u a S l P

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í n d I c e d e r e P o r T e S T é c n I c o S


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PURIFICACIÓN DE H+-ATPASA A PARTIR DE MEMBRANA PLASMÁTICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y PURIFICACIÓN DE Ca2+ ATPASA A PARTIR DE TEJIDO MUSCULAR DE CONEJO

Bajonero Arroyo María Fernanda · InstItuto tecnológIco suPerIor de IraPuato

Sampedro Pérez José Guadalupe · InstItuto de FísIca - uaslP

LAS CELULAS TUMORALES MODIFICAN LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA DE RA-TAS SOMETIDAS A UN PROTOCOLO DE DESINCRONIZACIÓN CIRCADIANA

Bazúa Gerez Dania · InstItuto tecnológIco y de estudIos suPerIores de monterrey

Salgado Delgado Roberto Carlos · Facultad de cIencIas - uaslP

RELACIÓN DE PKC EN LA EXPRESIÓN DEL CANAL BKCa EN MÚSCULO LISO VASCULAR DE AORTA EN RATAS DIABÈTICAS

Blanco Sandate Jorge Oliver · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPAlgara Suárez Paola · Facultad de enFermería - uaslP

EXPRESIÓN DEL CANAL DE POTASIO DE ALTA CONDUCTANCIA ACTIVADO POR CALCIO EN MUSCULO LISO DE AORTA EN UN MODELO DE DIABETES EN RATA

Castillo Arriaga Karen Nallely · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPAlgara Suárez Paola · Facultad de enFermería - uaslP

USO DE NANOPARTICULAS METALICAS DE ORO PARA SERS PARA DIAGNOSTICO TEMPRANO, NO INVASIVO DE AFECCIONES EN HUMANOS

Coronado Ruis Carlos Daniel · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPNavarro Contreras Hugo Ricardo · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

MICROPROPAGACIÓN DE STANHOPEA TIGRINA BATEMAN, ORQUÍDEA MEXICANA EN PELIGRO DE EXTINCIÓN Y CATTLEYA SP. ORQUÍDEA HÍBRIDO DE INTERÉS COMERCIAL

Choza Farías Sofía · InstItuto tecnológIco de sonora

Carranza Álvarez Candy · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona huasteca - uaslP

USO DE LA TEORÍA DEL FUNCIONAL DE LA DENSIDAD PARA DETERMINAR LOS ISÓMEROS DE MÍNIMA ENERGÍA EN FULLERENOS FUNCIONALIZADOS CON GRUPOS SCH3

Contreras Andrade Saraí · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPChavira Quintero Rigoberto · Facultad de cIencIas - uaslP

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índIce de rePortes técnIcos

cIencIas naturales y eXactas

SUPERFICIES HIDRÓFOBAS DE MEZCLAS DE POLÍMEROS: ANÁLISIS DE LA TO-POGRAFÍA DEL ESMALTE DENTAL CON RECUBRIMIENTO DE OCTADECIL TRI-CLORO SILANO PARA LA PROTECCIÓN CONTRA LA EROSIÓN ÁCIDA

Aguilar Palos María Isabel · unIVersIdad autónoma de aguascalIentes

Pérez López José Elías · InstItuto de FísIca - uaslP

EFECTOS DE LA HIPERGLUCEMIA SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Y MIGRACIÒN CELULAR EN MÚSCULO LISO VASCULAR DE RATAS DIABÉTICAS

Álvarez De Leon Leobardo Emmanuel · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslPEspinosa Tanguma Ricardo · Facultad de medIcIna - uaslP

EVALUACIÓN DEL POTENCIAL TÓXICO DE SUELOS DEL ESTADO SONORA

Alcaraz Nava Ulises Antonio · unIVersIdad autónoma de aguascalIentes

Mejía Saavedra José de Jesús · Facultad de medIcIna - uaslP

FABRICACIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO DOPADOS CON NITRÓGENO

Araiza Acosta Carlos Alberto · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPMuñoz Sandoval Emilio · InstItuto PotosIno de InVestIgacIón cIentíFIca y tecnológIca

CONTRACCIÓN EN MUSCULO LISO DE RAMAS DE ARTERIA MESENTÉRICA EN RATAS MEDIADA POR CANALES IONICOS

Arcos Rivera Esaú · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPAlgara Suárez Paola · Facultad de enFermería - uaslP

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ESTUDIO DE CELDAS MICROELECTROFORETICAS PARA MEDIR POTENCIAL ZETA

Diaz De la Cruz Cinthya Guadalupe · InstItuto tecnológIco de VIllahermosa

Arauz Lara Bernardo José Luis · InstItuto de FísIca - uaslP

PRE-ACLIMATACIÓN Y ACLIMATACIÓN DE EPIDENDRUM CARDIOPHORUM Y MYRMECOPHILA GRANDILFORA, ORQUÍDEAS DE LA HUASTECA POTOSINA

García Zepeda Claudia · unIVersIdad autónoma agrarIa antonIo narro

Carranza Álvarez Candy · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona huasteca - uaslP

BRADICIDINA, RESPUESTA CONTRACTIL Y SU RELACION CON EL FLUJO EN ARTERIAS CAROTIDAS DE COBAYO

Godínez Bravo Israel · Facultad de cIencIas - uaslPEspinosa Tanguma Ricardo · Facultad de medIcIna - uaslP

ANALISIS PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOELECTROENFOQUE EN CAPILAR

Hernández Gutiérrez Iván Jaziel · unIVersIdad autónoma de aguascalIentes

Maldonado Cervantes Enrique · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslP

TRANSICIÓN DE FASE DE UN FLUIDO SIMPLE DE LENNARD- JONES

García Romero Emiliano · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPGuerrero García Guillermo Iván · InstItuto de FísIca - uaslP

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE PUNTOS CUÁNTICOS DE InAs/GaAs (100) MEDIANTE MBE

Fonseca Maya Omar · unIVersIdad autónoma de Querétaro

Méndez García Víctor Hugo · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

OCURRENCIA DE INCENDIOS FORESTALES BAJO ESCENARIOS DE VARIABILDIAD CLIMÁTICA DE CERCANO, MEDIANO Y LEJANO PLAZO EN LA SIERRA MADRE ORIENTAL

García García Ana Monica de Jhesu · Facultad de cIencIas socIales y humanIdades - uaslPMuñoz Robles Carlos Alfonso · InstItuto de InVestIgacIón en Zonas desértIcas - uaslP

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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE HIDROGELES POLIMÉRICOS ELECTROACTIVOS DE QUITOSANA

Cotlame Pérez Sandra · unIVersIdad VeracruZana

Ovando Medina Víctor Manuel · coordInacIón académIca regIón altIPlano - uaslP

CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS DIFERENTES DOMINIOS DEL SUPRESOR TUMORAL RETINOBLASTOMA

Cruz Rubio Gissela Margarita del Rosario · unIVersIdad autónoma metroPolItana

Olivares Illana Vanesa · InstItuto de FísIca - uaslP

EXPRESIÓN HETERÓLOGA Y CARACTERIZACIÓN DE UNA ASPARAGINASA PARA EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

Cruz Santos Juan Carlos · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPCházaro Ruiz Luis Felipe · InstItuto PotosIno de InVestIgacIón cIentíFIca y tecnológIca

ESTATIGRAFÍA VOLCÁNICA DE LA PORCIÓN SURESTE DEL GRABEN DE BLEDOS, S.L.P.

De la Cruz Arias Joel Rodrigo · InstItuto tecnológIco de la chontalPa

Torres Hernández José Ramón · InstItuto de geología - uaslP

USO DE LA ESPECTROSCOPIA RAMAN PARA EL ANÁLISIS DE LESIONES EN PIEL

Delgado Chávez Ana Cristina · unIVersIdad autónoma de coahuIla

González Contreras Francisco Javier · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

PAPEL DEL GLUCOCÁLIX EN LA CONTRACCIÓN INDUCIDA POR BRADICININA

Delgado Cruz José Alfredo · unIVersIdad VeracruZana

Espinosa Tanguma Ricardo · Facultad de medIcIna - uaslP

ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASA EN UN GRADIENTE DE CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS EN VILLA DE LA PAZ-MATEHUALA, S.L.P. (MÉXICO)

De la Cruz Chable Kenia Mishell · InstItuto tecnológIco suPerIor de comalcalco

Ilizaliturri Hernández César Arturo · Facultad de medIcIna - uaslP

ESTANDARIZACIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN POR qPCR DUPLEX DEL COCIENTE DNA MITOCONDRIAL Y DNA GENÓMICO EN EL DESARROLLO DE CEREBRO EMBRIONARIO DE RATÓN

De la Rosa Hernández Martina · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona huasteca - uaslPAntaramian Salas Anaid · InstItuto de neurobIología - unam

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IDENTIFICACION DE LA EXPRESIÓN DEL CANAL BKCa EN MESENTERICA DE RATAS DIABÉTICAS

Medina Ramos Jorge Enrique · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPAlgara Suárez Paola · Facultad de enFermería - uaslP

LISTADO PRELIMINAR DE AVIFAUNA EN LA COMUNIDAD DE EL GARBANZO, CUENCA BAJA DEL RÍO TEMASCATÍO, IRAPUATO, GUANAJUATO, MÉXICO

Mendez González Karen Neftali · Facultad de medIcIna - uaslPHernández Navarro Efrén Martín · InstItuto tecnológIco suPerIor de IraPuato

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CICATRIZANTE DE Hamelia patens (RUBICEAE) EN RATAS DIABÉTICAS

Morales Martínez Nancy Lorena · InstItuto tecnológIco suPerIor de IraPuato

Cilia López Virginia Gabriela · Facultad de medIcIna - uaslP

ADSORCION DE CROMO HEXAVALENTE POR MEDIO DE ADSORBENTES NO COMERCIALES

Ortiz Anaya Israel · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPCalixto Olalde Ma. Elena · InstItuto tecnológIco suPerIor de IraPuato

CONCEPTOS DEL DISEÑO DESDE LAS CIENCIAS

Ortega Guzmán Ramón de Jesús · unIVersIdad autónoma de Zacatecas

García Santibáñez Saucedo Héctor Fernando · Facultad del hábItat - uaslP

DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA EL ALMACENAMIENTO DE ENERGIAS LIMPIAS: ANCLAJE DE Ce6 EN LA MOLECULA DEL GRAFENO Y OXIDO DE GRAFENO

Morato Marquez José Aminadat · InstItuto tecnológIco de VIllahermosa

Quintana Ruiz Mildred · InstItuto de FísIca - uaslP

DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA ALMACENAMIENTO DE ENERGIAS LIMPIAS. EXFOLIACIÓN DE GRAFITO Y OXIDO DE GRAFITO EN MEDIOS BUFFER FOSFATO SALINO Y AGUA DESIONIZADA POR CLORINA E6

Muñoz Cabrera Ángela Patricia · unIVersIdad marIana


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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE HIDROGELES ELECTROACTIVOS DE POLI(ACRILAMIDA-CO-ÁCIDO ACRÍLICO)/POLIPIRROL

Hernández Landín Carlos Antonio · InstItuto tecnológIco de celaya

Ovando Medina Víctor Manuel · coordInacIón académIca regIón altIPlano - uaslP

LAS P-ATPASAS, ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y ESTABILIDAD EN CONDICIONES DE ESTRÉS

Ibarra Faz Estefanía · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPSampedro Pérez José Guadalupe · InstItuto de FísIca - uaslP

IMPLEMENTACIÓN DE UNA PINZA MAGNÉTICA PARA APLICACIONES BIOLÓGICAS

Juárez Tello Andrea · Facultad de cIencIas - uaslPMoctezuma Martiñón Rosario Esperanza · InstItuto de FísIca - uaslP

ALTERACIONES EN EL MICROCIRCUITO DEL ESTRIADO EN UN MODELO DE AUTISMO EN LA RATA

López de Olmos Sánchez Said · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPIbáñez Sandoval Osvaldo · Facultad de medIcIna - uaslP

ÁLGEBRAS DE LIE E IMPLEMENTACIÓN DE ALGORITMOS EN MAXIMA

Martínez Salazar Brenda · Facultad de cIencIas - uaslPRodríguez Vallarte María del Carmen · Facultad de cIencIas - uaslP

USO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SERS PARA DIAGNÓSTICO TEMPRANO, NO INVASIVO DE AFECCIONES EN HUMANOS

Herrera Hernández Martha Mariana · unIVersIdad autónoma de aguascalIentes

Navarro Contreras Hugo Ricardo · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

SUPERFICIES HIDRÓFOBAS DE MEZCLA DE POLÍMEROS: FUNCIONALIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ÓXIDO DE GRAFENO POR ESPECTROSCOPIA DE RA-MAN Y MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

Hernández Mora Abdonai Manuel · unIVersIdad autónoma metroPolItana

Pérez López José Elías · InstItuto de FísIca - uaslP

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PERFIL PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOLECTROENFOQUE EN CAPILAR

Ramos Patiño Ana Laura · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslPMaldonado Cervantes Enrique · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslP

GRAVITACIÓN CUÁNTICA Y LOS NÚMEROS PRIMOS

Rentería López Oliver Josué · Facultad de cIencIas - uaslPBerra Montiel Oscar Jasel · Facultad de cIencIas - uaslP

EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN A CONTAMINANTES ORGÁNICOS PERSISTEN-TES (COPs) EN TORTUGA LORA (Lepidochelys kempii) EN TAMAUILIPAS, MÉXICO

Rangel Duarte Silvia Gabriela · unIVersIdad autónoma de Querétaro

Espinosa Reyes Guillermo · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

ANALISIS DE DENSIDAD DE CARGA Y MOMENTO MAGNETICO DE LAS PRINCI-PALES ISOENZIMAS DE CYP450 ASOCIADAS A LA METABOLIZACION DE FARMA-COS: CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 y CYP2C8

Rodríguez Jonguitud Enoé · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPNieto Delgado Pablo Guillermo · dePartamento de FísIco - matemátIcas - uaslP

EFECTO DE LA HIPERGLUCEMIA SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE ES-TRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Y LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS DE MÚS-CULO LISO VASCULAR PROVENIENTES DE RATAS NORMALES

Ruiz Torres Lucero Berenice · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPEspinosa Tanguma Ricardo · Facultad de medIcIna - uaslP

COMPARACIÓN DE LA CURVA DÓSIS-RESPUESTA A FENILEFRINA EN EL MÚSCULO LISO VASCULAR OBTENIDO DE ARTERIA MESENTÉRICA ENTRE RATAS SANAS Y DIABÉTICAS CON 2 SEMANAS DE EVOLUCIÓN INDUCIDAS CON ESTREPTOZOTOCINA

Rodríguez Lara Salma Aurora · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPEspinosa Tanguma Ricardo · Facultad de medIcIna - uaslP

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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE PELÍCULAS DELGADAS DE CeO2 Y DE CeO2-Gd POR EL MÉTODO SPIN COATING

Ortiz Estrada Juan José · unIVersIdad autónoma de Querétaro

Rodríguez Vázquez Ángel Gabriel · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

A SEARCH FOR DOUBLE-LOBED RADIO EMISSION FROM GALACTIC STARS AND SPIRAL GALAXIES

Ortiz Martínez Abiel Felipe · Facultad de cIencIas - uaslPAndernach Kuhlmann Heinz · unIVersIdad de guanajuato

DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN PLÁNTULAS REGADAS CON AGUA DESINFECTADA

Padrón Azúa Iván · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona huasteca - uaslPFeregrino Perez Ana Angélica · unIVersIdad autónoma de Querétaro

IMPLEMENTACIÓN DE PINZAS MAGNÉTICAS PARA APLICACIONES BIOLÓGICAS: INTERACCIONES BIOMOLECULARES

Peña Balderas Ana María · Facultad de cIencIas - uaslPArauz Lara Bernardo José Luis · InstItuto de FísIca - uaslP

PERFIL PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOELECTROENFOQUE EN CAPILAR

Pérez Medrano Nereida · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslPMaldonado Cervantes Enrique · unIdad académIca multIdIscIPlInarIa Zona medIa - uaslP

ACOPLE LUZ-MATERIA EN MICROCAVIDADES SEMICONDUCTORAS:CRECIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN-SITU

Ramírez Díaz Ana Laura · unIVersIdad autónoma de Zacatecas

Cerda Méndez Edgar Armando · InstItuto de InVestIgacIón en comunIcacIón óPtIca - uaslP

CARACTERIZACIÓN DE UN FLUIDO DE LENNARD-JONES UTILIZANDO SIMULACIONES DE DINÁMICA MOLECULAR IMPLEMENTADAS EN TARJETAS GRÁFICAS

Posadas Vidales Luis Gabriel · Facultad de cIencIas - uaslPGuerrero García Guillermo Iván · InstItuto de FísIca - uaslP

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FABRICACIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO DOPADAS CON NITRÓGENO: NANOTUBOS

Vázquez Tovar Guillermo · unIVersIdad autónoma de Querétaro

Elías Alfaro Claudia Guadalupe · InstItuto de metalurgIa - uaslP

CONTENIDO DE MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO EN UN GRADIENTE DE CON-TAMINACIÓN POR METALES PESADOS EN VILLA DE LA PAZ, MATEHUALA

Virgen Urcelay Alejandra · unIVersIdad la salle, a.c.Ilizaliturri Hernández César Arturo · Facultad de medIcIna - uaslP

DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA ALMACENAMIENTO DE ENERGÍAS LIMPIAS: SÍNTESIS DE FULLERITAS

Zapata Isidro Diego · InstItuto tecnológIco de VIllahermosa



Zúñiga Pérez Edgar Alberto · Facultad de cIencIas - uaslPMoctezuma Martiñón Rosario Esperanza · InstItuto de FísIca - uaslP

ELECTROADSORCIÓN DE CROMO EN CARBÓN ACTIVADO

Zavala Arias Karla Gissela · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPAlvarado Montalvo Lucia Guadalupe · unIVersIdad de guanajuato

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ESTABILIDAD RELATIVA Y PROPIEDADES ELECTRÓNICAS DE LOS ISÓMEROS DE MÍNIMA ENERGÍA PARA FULLERENOS HIDROXILADOS MEDIANTE ESTU-DIOS BASADOS EN LA TEORÍA DEL FUNCIONAL DE LA DENSIDAD

Salto Quintana Felipe · Facultad de cIencIas QuímIcas - uaslPChavira Quintero Rigoberto · Facultad de cIencIas - uaslP

modalIdad: Local

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ANÁLISIS DEL CLC-2 DE RATÓN MEDIANTE ESTIMACIÓN DEL COSTO ENERGÉTICO DEL TRANSITO DE IONES, POR MEDIO DE CALCULOS DFT EN EQUIPOS DE SUPERCOMPUTO

Sánchez Trujillo Diana Laura · unIVersIdad autónoma de Zacatecas

Nieto Delgado Pablo Guillermo · dePartamento de FísIco - matemátIcas - uaslP

modalIdad: Regional

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MEDICIÓN DE POTENCIAL ZETA MEDIANTE MICRO-ELECTROFORESIS

Sánchez Gallegos Javier Alejandro · unIVersIdad autónoma de Zacatecas

Arauz Lara Bernardo José Luis · InstItuto de FísIca - uaslP


Santos Valente Ana Patricia · InstItuto tecnológIco de celaya

Olivares Illana Vanesa · InstItuto de FísIca - uaslP

INTERACCIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO CON SISTEMAS BIOLÓGICOS

Valencia Chablé Carlos Virgilio · InstItuto tecnológIco de VIllahermosa


EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE SUELOS DE UN SITIO MINERO DE SONORA, MÉXICO

Vargas López Alma Guadalupe · InstItuto tecnológIco de sonora

Espinosa Reyes Guillermo · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

RIZOBACTERIAS AOSCIADAS A ESPECIES VEGETALES EN JALE MINERO EN VILLA DE LA PAZ, SAN LUIS POTOSÍ

Varela Guardado Arisbet · unIVersIdad autónoma de Zacatecas

Vallejo Pérez Moisés Roberto · coordInacIón Para la InnoVacIón y aPlIcacIón de la cIencIa y la tecnología - uaslP

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INTRODUCCIÓN El término erosión, describe el proceso de destrucción gradual de la superficie de un cuerpo, usualmente por procesos electrolíticos o químicos. En odontología, el término clínico de erosión dental es usado para describir el resultado físico de una pérdida dental patológica, crónica, localizada, indolora, de los tejidos dentales por acción química de ácidos y/o quelantes, no asociados a los producidos por la flora bacteriana5 que origina la caries dental o por factores mecánicos o traumáticos [EUR J ORAL SCI. 1996]. El desgaste dental o pérdida de sustancia se ha identificado como un problema en salud oral en niños y adultos [Torres, Fuentes, Bornhardt, & Iturriaga, 2015]. La erosión dental es una de las formas más comunes de desgaste dental que ocurre en la dentición temporal y permanente, y puede afectar cualquier superficie dental, pero es más frecuente en las superficies palatinas de dientes anteriores superiores y en superficies oclusales de molares inferiores [TY - JOURTI]. Esmalte de los dientes es la sustancia más dura en el cuerpo de los mamíferos, compuesto por hidroxiapatita de calcio Ca10(PO4)6(OH)2 94%; 3 – 5% agua y 1 – 2% material orgánico. La hidroxiapatita comienza a desmineralizar naturalmente por debajo del pH 5.5, en estudios anteriores, donde se recubrieron los dientes con OTS se demostró la resistencia a la erosión acida [Patiño-Herrera et al., 2015]. En el presente trabajo se propone y analiza una posible solución al problema de la erosión ácida, siendo un tema de gran importancia en el área de la salud y particularmente para la odontología, a partir de un proceso de silanización del esmalte con octadecil tricloro silano (OTS), en dos concentraciones 1% y 4% (v/v), favoreciendo la modificación del esmalte del diente, es decir, su topografía y la condición de mojado. Los polímeros son ampliamente utilizados para fabricar superficies hidrófobas o super-hidrófobas a través de diferentes métodos, tales como procesos mecánicos, polimerización de grabado por plasma, solvente inducido o técnicas electrodinámicas. En general, una superficie es hidrófila si 𝜃 < 90°, es hidrófoba si 90° < 𝜃 < 150°, y si 𝜃 > 150° se le denomina super-hidrófoba [ZHAO N., WENG L., XIE Q., ZHANG X. AND XU J. 2006]. Se sabe que el fenómeno de la mojabilidad de una superficie está determinado por su rugosidad y composición química. El objetivo del presente trabajo es estudiar el efecto del tiempo en la erosión ácida del esmalte dental recubierto con OTS. Como objetivos específicos: determinar el efecto de la concentración (1% y 4% v/v) para el silanizado del esmalte dental, el efecto del tiempo (8 h) en el proceso de silanizado y por último el efecto del pH (3, 4 y 5).

MATERIALES Y METODOLOGÍA Se tienen diferentes muestras dentales (incisivos, caninos y premolares) de humano para el tratamiento de recubrimiento con OTS, se realizó una exhaustiva limpieza eliminando restos de tejido y contaminantes. Se realizaron cortes transversales al diente mediante la cortadora de precisión Isomet con un grosor de 2mm, de la coronilla del diente, que es la parte que mantiene el recubrimiento de esmalte. Los dientes con solución EDTA 17% (v/v) (J.T. Baker), durante 3 min, se enjuagó con agua desionizada, después con hipoclorito de sodio (2.5/97.5 mL) (J.T. Baker) durante 5 minutos y nuevamente en EDTA por 3 min, para finalizar se enjuagaron con agua desionizada y secaron con nitrógeno. Se introdujeron los dientes en un frasco con 10mL de cloroformo (Caledon), después se añadió 0.1 mL y 0.4 mL de OTS (Sigma-Aldrich), en frascos diferentes, para obtener concentraciones de 1% y 4% (v/v), respectivamente, al añadir OTS se llena el frasco con nitrógeno y se cierra rápidamente para evitar que se hidrolice el OTS, se sella perfectamente el frasco con papel parafilm, se deja por un tiempo de 8 horas, para llevar a cabo el efecto de silanización. Después los dientes silanizados fueron evaluados in vitro con ácido cítrico (Sigma-Aldrich) (pH=3, 4 y 5), por diferentes periodos de tiempo (24, 72 y 95 horas).

Se empleó la técnica de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier para identificar la estructura química del esmalte limpio (sin silanizar), el esmalte silanizado sin exposición ácida y el esmalte del diente silanizado después de la exposición acida (pH=3, pH=4 y pH=5), y así, determinar la presencia de OTS sobre la superficie del esmalte y las modificaciones de los grupos funcionales de la hidroxiapatita. El

SUPERFICIES HIDRÓFOBAS DE MEZCLAS DE POLÍMEROS: ANÁLISIS DE LA TOPO-GRAFÍA DEL ESMALTE DENTAL CON RECUBRIMIENTO DE OCTADECIL TRICLO-

RO SILANO PARA LA PROTECCIÓN CONTRA LA EROSIÓN ÁCIDA

1Universidad Autónoma de Aguascalientes. Depto. de apoyo a la investigación. Av. Universidad No. 940, Ciudad Universitaria, C.P: 20131, Aguascalientes, México. 2Instituto de Física, UASLP, Álvaro Obregón 64, San Luis Potosí, 78000, México. Colaboradores: Patiño Herrera, Rosalba3 y Catarino Centeno, Rafael. 3Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tec-nológico y Antonio García Cubas s/n. Celaya, Guanajuato 38010, México. 4Doctorado en Ciencias Aplicadas, Facultad de Ciencias, UASLP, Álvaro Obregón 64, San Luis Potosí, 78000, México. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]

Aguilar Palos, M. I.1 y Pérez López, E.2

RESUMEN La erosión dental comprende la pérdida del tejido dentario por acción química de ácidos y/o quelantes, no asociados a los producidos por la flora bacteriana y es desde siempre un problema en salud oral. En el presente trabajo se propone una posible solución a dicho problema, a partir del recubrimiento del diente con octadecil tricloro silano (OTS), un polímero hidrófobo que le confiere la capacidad de repeler el agua. Los dientes se silanizaron en concentraciones de 1% y 4% (v/v) con OTS durante 8h. Mediante las técnicas de espectroscopia infrarrojo (FTIR) y microscopía de fuerza atómica se evaluó la presencias de los grupos químicos del OTS sobre la superficie del esmalte dental y evaluar la topografía de la misma; posteriormente se demuestra su efecto y duración, sometiéndolo en soluciones acidas (pH=3, 4 y 5), se observó que a un tiempo de exposición de 95h la película de OTS se conserva.

ABSTRACT The erosion dental includes the loss of tooth tissue by chemical action of acids or chelating agents, not associated with those produced by the bacterial flora, it is always a problem of oral health for children and adults. In the present work proposes a possible solution to this problem, from the covering of the tooth with OTS, a polymer hydrophobic confers the ability to repel water from its surface. Is silanization the teeth with concentrations of 4% and 1% (v/v) with OTS, for 8 h. Using the techniques infrared spectroscopy of FTIR and atomic force microscopy was evaluated the presence chemical groups of OTS on the surface of the tooth enamel and then demonstrates its effect and duration, subjecting them in solutions acid (pH = 3, 4 and 5), it was observed that OTS film is preserved to a 95-hour exposure time.

Palabras clave: erosión, silanizado, hidrófobo.


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20I n d u c c I ó n a l a c I e n c I a , l a T e c n o l o g í a y l a I n n o v a c I ó n e n l a u a S l P

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El espectro de FTIR del esmalte del diente (Figura 1) mostró las bandas características de la hidroxiapatita (HA), que corresponde a los grupos fosfato funcionales, hidroxilo y carbonatos sustitutos en la estructura de HA. Se observó también el espectro de FTIR del compuesto de silanización octadecil tricloro silano (OTS) (Figura 2) están representadas las bandas características de los diferentes grupos funcionales que lo conforman, se observan diferentes bandas que corresponden a los enlaces haluro, los grupos metilo terminales al octadecil y diferentes interacciones del silano con otros elementos. El número de la longitud de onda de las principales bandas del análisis del esmalte dental y de OTS está descrito en Tabla 1. El espectro FTIR del diente recubierto, OTS 4%-8h (Figura 3) y OTS 1%-8h (Figura 4), muestran modificaciones en la estructura original del esmalte, en ambos casos se observa que las bandas de los distintos grupos funcionales se intensifican de manera significativa, la banda 3000-3500 del agua, se presenta la banda 1200 de Si-CH2, grupo funcional de OTS, se evidencia que la silanización con una concentración OTS 4% el recubrimiento es mayor.

800-600 C-Cl 1260±5 Si(CH3)3

3700-3200 Si-OH 2926±10 - 2855±10 CH2

2962±10 - 2872±10 CH3 1100, 822 y 450 Si-O-Si

Figura 3. Análisis FTIR: (A) esmalte dental sin recubrimiento, (B) esmalte dental recubierto con OTS 4%(v/v) con un tiempo de silanización de 8

horas.

Figura 4. Análisis FTIR: (A) esmalte dental sin recubrimiento, (B) esmalte dental recubierto

con OTS 1%(v/v) con un tiempo de silanización de 8 horas.

1)

equipo que se utilizó fue Nicolet Nexus 470 FTIR (Nicolet, Madison,WI, USA), cubriendo un rango espectral de 4000 -500 cm−1 con una resolución de 2 cm-1 con exploraciones de 80 ciclos, que fueron realizados a temperatura ambiente. El procesamiento y análisis de las regiones de la banda de espectros se realizaron con el software OMNIC E.S.P.5.1 (Nicolet). La técnica de microscopia de fuerza atómica (AFM, Bruker, Dimension Edge) se empleó para caracterizar la topografía y determinar la rugosidad (𝑅q) de las muestras de las superficies del esmalte silanizado con OTS. El equipo se operó en modo intermitente (mode tapping), con un área de escaneo de 20𝜇𝑚 x 20𝜇m, para este modo se utilizó una punta modelo SCM-PIT, el barrido se hizo a una velocidad de escaneo de 0.3 Hz. Para el procesamiento de las imágenes se utilizó el software NanoScope Analysis v1.40. La 𝑅q es el promedio de las desviaciones cuadráticas respecto a la altura media (cantidad estadística), matemáticamente está definida por:

Rq = �1𝑛 ∑ (𝑥𝑖 − �̅�𝑖 )2 (1)

Donde 𝑛, 𝑥𝑖 y �̅� son el número de alturas medidas, altura de cada punto y promedio de las alturas, respectivamente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 1. Análisis FTIR del esmalte dental (hidroxiapatita)

Figura 2. Análisis FTIR del Octadecil Tricloro Silano (OTS)

Tabla 1. Grupos funcionales con su respectivo número de onda.

NÚMERO DE ONDA (cm-1) GRUPO FUNCIONAL

~ 472 ν2(PO43-) ~ 970 ν1(PO43-)

602, 563 e 575 ν4(PO43-) 1197 – 950 ν3(PO43-)

1660 - 1300 e 873 CO32- 3750 – 2500 Deformación axial-H en

el enlace de hidrógeno intermolecular


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Las Figuras 7 y 8, son imágenes AFM del esmalte silanizado, revelan características topográficas del polímero OTS, los cambio de la rugosidad se muestran en la Tabla 2. En el caso del OTS 1%-8h, 𝑅𝑞 = 351.3 ± 121.7 𝑛𝑚, durante la exposición ácida la rugosidad aumenta proporcional al tiempo de exposición, lo cual indica la fijación de nano-estructuras de ácido cítrico sobre la superficie del diente, este fenómeno se presenta muy poco en el caso del recubierto con OTS 4%-8h, posiblemente debido a la alta concentración de OTS. Se evaluó de manera demostrativa el ángulo de contacto en los dientes y al igual que en el caso de la rugosidad, el ángulo aumenta después de la silanización y aún más después de la exposición al ácido cítrico.

CONCLUSIONES Se logró el recubrimiento de esmalte dental con OTS, confiriéndole la capacidad del repeler al agua de su superficie, protegiéndolo así de la erosión ácida. Con un tiempo de silanizado de 8 horas. Además se observó que a la concentración con OTS del 4% se logra un mejor silanizado del diente. Al exponer la superficie del diente silanizado al ácido cítrico se forman nano-estructuras con una topografía propia. Cabe resaltar que la exposición ácida del diente silanizado no desgasta la película de OTS. Finalmente, también se realizaron los mediciones evaluar que a un tiempo de exposición del diente silanizado al ácido por 95 h, la película se conserva.

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Tabla 2. Valores Rq del análisis AFM del diente silanizado, después de la exposición acida.

Muestra Condiciones Rq (nm) OTS 4% (v/v)-8h Control 301.7 ± 89.8

24 h de exposición pH=3 134.8 ± 46.9 pH=5 268.0 ± 89.6

72 h de exposición pH=3 230.1 ± 8 pH=4 818.1 ± 221.4 pH=5 167.7 ± 40.4

95 h de exposición pH=3 160.5 ± 66.8 pH=4 181.7 ± 55.8 pH=5 451.1 ± 239.1

OTS 1% (v/v)-8h Control 351.3 ± 121.7 24 h de exposición pH=3 323.9 ± 128.5

pH=5 101.7 ± 28.3



La Figura 5 se muestra una imagen topográfica del lado facial del diente, sin recubrimiento, obtenida por AFM, con un valor en la rugosidad cuadrática media de 𝑅𝑞 = 21.4 ± 3.6 𝑛𝑚, mientras que la Figura 6, corresponde a una imagen de AFM tomada directamente en la capa del esmalte, en el corte transversal del diente, sobrepuesta sobre la Figura 6 se observa la foto de una rebanada del diente con sus diferentes capas (pulpa, dentina y esmalte), se obtuvo la rugosidad cuadrática media de 𝑅𝑞 = 594.8 ± 183.5 𝑛𝑚, un valor más grande que el del lado facial, esto debido al tipo de muestra, en la Figura 6, se observan los poros dentarios los cuales presentan cierta profundidad y en análisis de las desviaciones cuadráticas de altura, tienen alta importancia el cálculo de la Rq.

Figura 5. Imagen de AFM en esmalte del lado facial del diente sin recubrimiento. 𝑹𝒒 = 𝟐𝟏.𝟒 ±

𝟑.𝟔 𝒏𝒎.

Figura 6. Imagen AFM del esmalte en un corte transversal del diente sin recubrimiento. 𝑹𝒒 =

𝟓𝟗𝟒.𝟖 ± 𝟏𝟖𝟑.𝟓 𝒏𝒎.

Figura 7. Imagen AFM del esmalte dental recubierto con OTS 4%(v/v) con un tiempo de

silanización de 8 horas.

Figura 8. Imagen de AFM del esmalte dental recubierto con OTS 1%(v/v) con un tiempo de

silanización de 8 horas.


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EVALUACIÓN DEL POTENCIAL TÓXICO DE SUELOS DEL ESTADO SONORA

1Universidad Autónoma de Aguascalientes, Departamento de Bioquímica, Colonia Universidad, C.P 20100. Aguascalientes, Ags, México, [email protected]. 2Centro de Investigación Aplicada en Ambiente y Salud, CIACYT-Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Av. Sie-rra Leona 550. Col Lomas 2ª. Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, SLP, México, [email protected]

Alcaraz Nava, U. A.1; Mejía Saavedra J. J.2

RESUMEN La minería es una actividad económica de gran importancia en México, su importancia radica en beneficios como es la generación de empleos, de divisas, inversión extranjera, entre otros. Sin embargo hay un impacto ambiental en la que se efectúa la emisión de contaminantes como lo son los metales pesados. Como consecuencia ha modificado el intercambio natural de estos elementos al grado de incrementar sus concentraciones a niveles que pueden causar efectos adversos tanto a los seres humanos como a la biota en general. Debido a que el estado de Sonora presenta una gran riqueza mineral, posiblemente se presente contaminación con elementos con potencial tóxico generados por la actividad minera, por lo tanto el objetivo del presente trabajo fue evaluar la toxicidad de los suelos por medio de bioensayos toxicológicos.

Palabras clave: ensayo cometa, letalidad, toxicología ambiental, metales pesados.

ABSTRACT Mining is an important economic activity in Mexico, its importance lies in benefits such as job creation, foreign exchange, foreign investment, among others. However there is an environmental impact on the emission of pollutants such as heavy metals is conducted. As a result it has changed the natural exchange of these elements to the degree of their concentrations increase to levels that cause adverse health effects. Because the state of Sonora has a great mineral wealth, possibly present contamination with potentially toxic elements generated by mining activity, therefore the objective of this study was to evaluate the toxicity of soils through toxicology bioassays.

INTRODUCCIÓN México cuenta con una amplia riqueza de minerales en todo el territorio nacional, tanto en minerales metálicos como en no metálicos. El sector minero aporta entre el 1.17% y 1.5% al producto interno bruto nacional, mantiene un saldo positivo en la balanza de pagos y contribuye con el 1.5% al empleo nacional. De manera estimada la producción minera nacional representa el 2.4% de la producción minera mundial,

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RESULTADOS En el bioensayo de letalidad se registraron los siguientes porcentajes de sobrevivencia: Referencia (–) 98.9%, Control (-) 97.3 %, Problema 92. 3 % y el Referencia (+) 88.8% (Figura 1). Es importante mencionar que el bioensayo es válido si el control negativo no presenta letalidad mayor del 10%, desde este punto de vista el bioensayo fue valido pues el control negativo registró una letalidad menor al 3%. De acurdo a los resultados obtenidos se puede observar que el sitio Problema no presenta toxicidad pues la letalidad registrada no fue mayor del 10%. El único sitio que registró letalidad superior al 10% fue el Referencia positiva, aunque fue muy leve, por lo que es necesario mantener vigilancia en el sitio, sin embargo el efecto es debido a un enriquecimiento natural por lo que difícilmente se podría hacer una intervención en dicho sitio.

Figura 1. Porcentaje de sobrevivencia en los sitios de estudio

Ensayo cometa: desafortunadamente los resultados obtenidos en este ensayo no fueron satisfactorios, probablemente debido a la falta de experiencia y al poco tiempo de capacitación no se logró realizar la técnica de manera adecuada. Esto fue evidente al momento de observar las laminillas al microscopio de fluorescencia, donde se pudo apreciar que la técnica fue mal hecha, Por consiguiente no se contó con un resultado para reportar. Sin embargo se aprendió el uso del microscopio y la determinación de los parámetros necesarios para evaluar el daño al ADN por esta técnica. Como se observa en la siguiente tabla, realicé la determinación de los parámetros de evaluación Olive Tail Moment y Tail Length, en laminillas de una misma muestra realizadas en el laboratorio. Es evidente la variación en el resultado, lo cual habla de la falta de experiencia en el manejo de este tipo de equipos.

Tabla 1. Lecturas de la referencia (-) del ensayo cometa en 7 laminillas

Laminilla OliveTail Moment Tail Length 01 2,07 5.04 02 1.54 5,65 03 1.24 4.60 04 1.23 4.37

México ocupa el 9º lugar en la producción minera mundial y el 4º lugar en la producción minera de Latinoamérica (Musik, 2009). El estado de Sonora ha sido afectado a través del tiempo geológico por varios eventos tectónicos de gran importancia, los cuales conjuntamente con otras características geológicas ocasionaron que Sonora fuera un lugar privilegiado, con las condiciones necesarias para el emplazamiento de una gran variedad de depósitos minerales tanto metálicos como no metálicos. Por lo tanto, Sonora ha sido tradicionalmente considerado como un estado minero de gran importancia, con una amplia gama de recursos en éste renglón. Entre los minerales metálicos, se tienen los principales yacimientos de cobre, molibdeno y oro del país, mientras que entre los minerales no metálicos están los yacimientos más importantes de grafito, wollastonita y barita ocupando desde hace muchos años el primer lugar dentro de los principales estados mineros productores, debido principalmente a la explotación de las dos minas más grandes del país: Cananea y La Caridad (http://www.sgm.gob.mx/pdfs/SONORA.pdf).

MARCO TEÓRICO El impacto ambiental que genera la actividad minera tiene que ver en principio con la modificación que se lleva a cabo sobre los ecosistemas donde se ubican las explotaciones mineras, y las consecuencias que esto puede tener sobre el medio físico y la biodiversidad, además de la agresión física al medio, un aspecto de gran relevancia es la contaminación de carácter químico sobre el suelo y cuerpos de agua y sobre la salud humana que significan los procesos de extracción (Zavala. 2001). Los bioensayos son herramientas ampliamente utilizadas en el campo de la ecotoxicología, la cual se ocupa del estudio del efecto y destino de los agentes tóxicos de origen antropogénico a los ecosistemas acuícolas y terrestres (Larrain, 1995). Las pruebas de toxicidad son una herramienta importante en la evaluación de la toxicidad de los contaminantes presentes, de manera individual o formando mezclas, en matrices ambientales como suelo, agua y sedimentos (Mejía-Saavedra et al., 2005). En los bioensayos de toxicidad se exponen a los organismos de prueba a las matrices contaminadas simulando un escenario de exposición real, posteriormente a un tiempo de incubación se mide una respuesta biológica ecológicamente relevante y fácil de estandarizar (Nikunen & Miettinen, 1985). La lombriz de tierra es utilizada ampliamente como un organismo bioindicador pues permite identificar la presencia de estresores ambientales. La lombriz de tierra Eisenia andrei es un organismo muy sensible a los cambios del ambiente en que habitan, son de fácil manejo en condiciones de laboratorio, no ocupan mucho espacio, su tiempo de respuesta a estresores ambientales y su ciclo de vida son cortos

METODOLOGÍA El estudio consistió en realizar bioensayos en los cuales se evaluó la supervivencia y la genotoxicidad, para ello, se colectaron 10 muestras de suelo en sitios con diferentes características; uno con actividad minera (sitio problema); un sitio sin actividad minera pero con enriquecimiento natural de minerales (referencia positiva); y un sitio sin actividad minera y sin enriquecimiento natural (referencia negativa). Conjuntamente con las muestras, se procesó un control negativo para validar el método y los organismos de prueba, como organismo de prueba se utilizó a la especie de lombriz de tierra Eisenia andrei. El bioensayo de letalidad se realizó con base en lo descrito en la guía 207 de la OECD para la evaluación de sustancias (OCDE, 1984). Se expuso a 10 lombrices de tierra (Eisenia andrei) a muestras de suelo de las tres sitios y un control negativo de laboratorio. El ensayo tuvo una duración de 14 días, al final del tiempo se determinó la letalidad. También se evaluó el daño al ADN mediante el ensayo cometa, para ello se siguió la metodología propuesta por González-Mille et al., (2012). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.


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Mejía-Saavedra J., S. Sánchez-Armass, G. Santos-Medrano, R. González-Amaro, I. Razo-Soto, R. Rico-Martínez, & F. DíazBarriga, 2005. Effect of Co-exposure to ddt and Manganese on Freshwater Invertebrates: Pore Water from Contaminated Rivers and Laboratory Studies. Environmental Toxicology and Chemistry, 24(8):2037-2044.

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05 1.81 6.24 06 1.82 6.44 07 0.93 3.93

Promedio 1.52 5.18

DISCUSIÓN De acurdo a los resultados obtenidos se puede observar que el sitio Problema no presenta toxicidad pues la letalidad registrada no fue mayor del 10%. El único sitio que registró letalidad superior al 10% fue el Referencia positiva, aunque fue muy leve, por lo que es necesario mantener vigilancia en el sitio, sin embargo el efecto es debido a un enriquecimiento natural por lo que difícilmente se podría hacer una intervención en dicho sitio. Se realizó el ensayo cometa para los mismos sitios, por posible mal manejo de reactivos o mal procedimiento del desarrollo de la técnica no se tuvieron resultados satisfactorios para el sitio problema ya que las laminillas no pudieron ser leídas en el microscopio.

CONCLUSIÓN En el ensayo de letalidad de la muestra problema, la cual se consideraba como posible muestra de contaminación por metales pesados, se obtuvo una letalidad menor al 10%, lo que nos habla que por el momento la presencia de metales con potencial toxico no se encuentran de forma biodisponible o bien que no alcanzan el umbral de toxicidad para causar efecto en los organismos invertebrados. En lo que respecta al ensayo cometa, prueba para evaluar la genotoxicidad, puedo concluir que es una técnica relativamente sencilla pero que requiere de capacitación y experiencia para lograr resultados satisfactorios y veraces.

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Figura 1. Vías divergentes de señalización que conducen a la disminución de masa pancreática en DM

Por otro lado se ha asociado la disfunción endotelial en respuesta a la hiperglucemia, cuyo diana principal está en los vasos sanguíneos de mediano calibre. Se han reportado que diversos estímulos físicos como el Shear Stress y determinados agentes bioquímicos, así como fenómenos quimiotácticos y conocidas migraciones celulares, modifican su actividad y promueven cambios en la actividad endocrina del órgano, así como su relación con las células de músculo liso vascular. (Palma Gámiz; 2007) Por esta razón estamos interesados en estudiar los efectos de la hiperglucemia en el estrés de RE, así como evaluar las alteraciones que ocurren en las células de músculo liso vascular (CMLV) ya que se ha demostrado que éstas juegan un papel fundamental en el mecanismo fisiopatológico.

METODOLOGÍA Inducción de DM en ratas de la cepa Winstar mediante la administración de

estreptozotocina. Se hicieron dos grupos de ratas macho de la cepa Winstar; el grupo control (3 ratas), no recibió tratamiento previo al sacrificio. En el segundo grupo (3 ratas) se indujo DM crónica con Estreptozotocina 60 mg/Kg de peso a través de la vena caudal. Las ratas pertenecientes a cada grupo fueron sacrificadas a las cuatro semanas para la obtención de los anillos de tejido aórtico. La siguiente tabla muestra las condiciones de pesos y glucemias de los dos grupos.

Tabla 1. Condiciones de peso y glucemia en ratas controles e inducidas

Condición n Peso (g) al inicio del

Tratamiento

Peso (g) al final del

Tratamiento

Glucemia (mg/dL) Inicio del

tratamiento

Glucemia (mg/dL) final

del tratamiento

HbA1c (%)

Controles 6 201±17.25 354.6±26.42 52.67±6.47 64±5.019 3.47±0.26 Inducidas 4 190±17.30 278.75±52.83 78.25±15.15 235.25±177.6 7.45±1.74 Establecer el modelo de cultivo celular de aorta de ratas normales y diabéticas en

condiciones de asepsia. Las ratas se sacrificaron con una sobredosis de Pentobarbital sódico administrado en la vena caudal (60 mg/kg de peso). Inmediatamente se realizó una toracotomía y extracción del bloque

EFECTOS DE LA HIPERGLUCEMIA SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Y MIGRACIÒN CELULAR

EN MÚSCULO LISO VASCULAR DE RATAS DIABÉTICAS

Departamento de Fisiología y Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí; Av. Venustiano Carranza 2405, Colonia Los Filtros; C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P. Méxi-

co; [email protected], [email protected].

Álvarez-De León L.; Mejía-Elizondo, R.; Espinosa-Tanguma, R.

INTRODUCCIÓN La diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad crónico-degenerativa cuya característica principal es la presencia de hiperglucemia plasmática, ya sea por un defecto en la producción de insulina en las células β-pancreáticas (tipo 1), o bien la resistencia hacia la misma (tipo 2). A esta característica se le atribuye una serie de complicaciones clínicas de tipo macrovascular y microvascular, entre las que cabe destacar el Infarto agudo de Miocardio, Insuficiencia Renal, Retinopatía y muerte prematura. (Hernández-Ávila et al; 2013) Diversas investigaciones han señalado que entre los eventos celulares más sobresalientes y potencialmente dañinos están las respuestas de estrés reguladas por factores de transcripción, cuyas vías de señalización convergen en una condición de estrés del retículo endoplásmico (RE). Esta condición patológica conduce a un aumento de la respuesta a las proteínas mal plegadas (UPR’s) y cuya expresión representa una amenaza para el resto de las células vivas, alterando la homeostasis al disminuir la traducción de proteínas de plegamiento o en su defecto, inducir apoptosis. (Decio L. Eizirik et al; 2008) Tal como lo describe Chuan Yin Liu & Peter Walter, la UPR es una vía de señalización intracelular que transmite información acerca del estado de plegamiento de proteínas desde el RE hasta el núcleo y el Citoplasma con el fin de recuperar la producción de proteínas funcionales. Entre los procesos más importantes rio abajo se encuentra la inducción de la transcripción génica, la atenuación traduccional de síntesis global proteica y degradación asociada a RE. Estas condiciones meramente adaptativas le proveen diferentes alternativas de supervivencia a la célula afectada; sin embargo, si no se corrige este defecto, la célula induce apoptosis. Estos datos son congruentes con las observaciones clínicas postmortem, donde se sugiere una pérdida importante de la masa celular pancreática, y por lo tanto, un declive en la secreción y acción de la insulina. Huang et al. recientemente reportó un incremento en la expresión en la expresión de CHOP en las células β de individuos obesos con y sin diabetes, basado en dichas observaciones se ha especulado que su traslocación nuclear es necesaria para la inducción de apoptosis; sin embargo, en la actualidad todavía no se ha dilucidado de forma específica.


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con Tritón X-100 al 0.25%. Finalmente se “bloquearon” con solución BSA al 5% durante 45 minutos, incubándose con los anticuerpos antes mencionados. Se tuvieron resultados favorables al observar las proteínas de interés.

Fig. 2 Presencia de β-actina en Inmunofluorescencia

Fig. 3 Presencia de Miosina en Inmunofluorescencia

Evaluar la presencia de estrés de RE midiendo la expresión de marcadores mediante

Western Blot. Para estos experimentos sembramos por duplicado cajas de 35 mm con aproximadamente 10 000 células por caja. Para el caso de las CMLV de las ratas diabéticas y controles se permitió que llegaran a confluencia del 80% y a esta condición se le denominó tiempo cero, a partir de ahí se dejaron en cultivo para las condiciones de una y dos semanas. En cada uno de los tiempos se obtuvo un lisado celular siguiendo el siguiente protocolo: Se pusieron las cajas sobre hielo y se les adicionaron 250 µl de buffer RIPA 1x adicionado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Se incubaron durante cinco minutos, y con ayuda de una punta de micropipeta, se lograron levantar las células. Posteriormente se procedió a sonicarlos y centrifugaerlos a 14 000 g durante 10 minutos para recuperar el sobredrenante. Se hizo una electroforesis de proteína para ver su concentración y calidad y finalmente, electroforesis de 50 µg de proteína para su transferencia al filtro y detección protéica en estrés de RE como son XBP-1, ATF 6 Y SERCA. Además se corrió β-actina como control de carga. Hasta la fecha se tienen los lisados celulares de todas las células obtenidas cuantificados, lo que permitió realizar el resto del protocolo sin inconvenientes, sin embargo aún no se han presentado los datos finales de estos experimentos. La especificidad se logró mediante la utilización de anticuerpos específicos para nuestras proteínas (Abcam®).

Figura 4. Lisado de proteína total (SDS PAGE 10%)

cardiopulmonar para colocarlo en una caja de Petri con solución Salina 0.9%. En seguida, en una campana de flujo laminar, con la ayuda de un microscopio estereoscópico y con el uso de instrumental quirúrgico fino, se disecó la aorta torácica. El exceso de tejido graso y conjuntivo se descartó junto con las arterias colaterales y se eliminó la adventicia aòrtica. Posteriormente se realizó un corte longitudinal a lo largo de toda la aorta, exponiendo el endotelio, mismo que se eliminó raspando firmemente con un hisopo de algodón. Finalmente se cortaron varios segmentos de tejido muscular de aproximadamente 1-2 mm x 1-2 mm. De cada aorta torácica obtuvimos aproximadamente 40 segmentos, y se colocaron en frascos de cultivo estériles de 25 ml, con el lado luminal hacia arriba y la adventicia adherida a la superficie de la caja, separándolos de forma uniforme en toda la superficie de la caja. Se dejaron reposar tres horas para permitir adherencia de tejido al substrato, entonces se colocaron 6 ml de medio de cultivo DMEM en condiciones de baja glucosa 5 mM (Dulbecco´s Moldified Eagle Medium) y suplementado con 10 000 Unidades de Penicilina, 10 mg/ml de Estreptomicina y suero Bovino fetal al 10% (SBF). Posteriormente colocamos el frasco de cultivo en una incubadora a 37º C y CO2 AL 5%. Las células comenzaron a crecer a partir de los trozos de tejido. En los primeros días de cultivo se alcanzó a diferenciar la apariencia típica fusiforme de las células musculares lisas. Se realizaron recambios en el medio de cultivo cada 48 horas. Una vez alcanzada confluencia celular deseada (aprox. 15 días: 80%) se retiraron los trozos de tejido y se permitió el crecimiento en los sitios donde éstos se encontraban. Para confirmar que nuestras células provienen de músculo liso se llevó a cabo su caracterización mediante inmunocitoquímica. Sin embargo, previo a este procedimiento se pudo confirmar que se trataba de CMLV al mostrar el patrón típico de crecimiento de colinas y valles (Hill and Valley) que logra dilucidarse cuando las células llegan a su confluencia máxima. Durante el cultivo celular tuvimos contaminación de algunas cajas por lo que tuvieron que ser descartadas y reemplazadas con un grupo de ratas adicionales para tener una n=6 en cada uno de los tratamientos. Cuando las cajas alcanzaron confluencia, las células fueron levantadas con una solución de Tripsina/EDTA al 0.25% y se resembraron (aprox. 10 000 células/caja) en cinco cajas de Petri de 100 mm por cada cultivo. A éstas cajas se les colocó el medio de cultivo con las características iniciales y se realizó un protocolo para congelar las células a -70 ºC (1x106 cel/ml DMEM + 0.5% DMSO) y poder conservarlas para futuros experimentos. Por otro lado, realizamos la obtención de CMLV de tejido aórtico de ratas normales, para probar diferentes concentraciones de glucosa, lo que nos permitirá establecer un protocolo de hiperglucemia sin la necesidad de inducir y sacrificar nuestras ratas. Para poder validar esta respuesta realizaremos experimentos para medir la migración celular así como experimentos para medir el estés de RE mediante la técnica de Western Blot. Caracterizar los cultivos celulares por inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos

contra α-actina, cadena pesada de miosina de músculo liso y XBP-1. El anticuerpo se une al fluoróforo que cuando es excitado emite luminiscencia. Esta luz emitida se detecta mediante un microscopio capaz de medirla o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. Para este experimento se cultivaron las CMLV sobre cubreobjetos tratados con poli L-lisina en una placa de 24 pozos hasta alcanzar una confluencia de 40-50% paraq obtener una buena definición de la morfología celular. Dichas células se mantuvieron inmersas en medio DMEM suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal para posteriormente cambiar el porcentaje de suero al 1%, esto con la finalidad de inducir un fenotipo contráctil. Posteriormente las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos con sus respectivos lavados con Buffer Salino Fosfato (PBS), se permeabilizaron


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Del total de ratas, se logró estandarizar una técnica experimental usando el recambio de las condiciones en las que se encontraban inmersas para disminuir el número de ratas sacrificadas, este método podría ser probado y usado posteriormente como un modelo que contribuya a mejorar la Investigación. Asimismo, se detallaron los datos obtenidos de forma previa para revisar la migración de CMLV en condiciones establecidas, siendo el grupo de las 24 horas un dato interesante para continuar con su estudio (Ver gráfica 1).

CONCLUSIONES

En general, me agradó bastante la calidez y la forma de trabajar por parte de mis Investigadores, así como de nuestro grupo de trabajo. Durante la marcha pudimos poner a prueba nuestras habilidades lingüísticas, de redacción y praxiológicas para sacar adelante el proyecto de Investigación. Fueron diversas las cosas que logré aprender de forma clara, técnicas que nunca había realizado así como algunas de las que ya tenía conocimientos previos. Sugiero continuar con esta línea de Investigación ya que todavía es un campo que nos presenta un sinfín de cuestionamientos y del cual se pueden sacar muchas herramientas con las cuales resolver prolemas y ayudar a mejorar la calidad de vida de las personas.

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Finalmente, se incluyeron cultivos de CMLV provenientes de ratas normales expuestas a 5 mM de glucosa, 15 mM de glucosa y 15 mM de Manitol como control de osmolaridad durante 48 horas, una semana y dos semanas. Hasta el momento se cuenta con los lisados celulares en todas las condiciones y tiempos para las seis ratas, en las cuales recién se empezó su cuantificación mediante el revelado a partir de los respectivos Western Blot.

Medir y comparar la migración de CMLV usando el modelo de herida-cicatrización. Para llevar a cabo estos experimentos sembramos por duplicado cajas de 35 mm con aprox. 10 000 células por caja (70% Confluencia) a la que se le llamó tiempo cero, dejando posteriormente las cajas en cultivo para medir sus condiciones en una y dos semanas. Pasado el tiempo de incubación se realizó una herida en sentido vertical con la punta de una micropipeta de 200 µl a un ángulo de 45º y se tomó una fotografía al término de este procedimiento, se mantuvieron los tratamientos para las posteriores fotografías conforme al tiempo de incubación, para las fotografías el Investigador utilizó un microscopio invertido con cámara integrada para posteriormente analizarlo con el programa Image J. No se ha culminado la toma de fotografías. Además sembramos CMLV provenientes de ratas normales, expuestas a los controles 5 mM glucosa, 15 mM glucosa y 15 mM manitol durante 48 horas, una y dos semanas. Apenas se cuenta con los datos anteriores de migración los cuales se muestran en la siguiente gráfica.

Gráfica 1. Resultados preliminares de migración celular, según controles de glucosa y manitol.

Conocer la dinámica de las ondas de Calcio (Ca2+) en CMLV y su relación con el aumento de migración Para lograr esta meta, el Investigador pretende medir los cambios de frecuencia y magnitud de las ondas de Ca2+ en células de ratas normales en condiciones de normoglucemia, hiperglucemia y con DM así como medir la concentración de Ca2+ en las CMLV de ratas diabéticas para enfrentarlo con las ratas normales. Quedó pendiente llevar a cabo esta actividad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al finalizar este trabajo de Investigación logramos tener datos preliminares basados en la Observación y en el análisis de cada una de sus etapas ya que el tiempo no fue suficiente. En primer lugar se obtuvieron los cultivos de CMLV de forma exitosa en cada una de las ratas, dándonos un medio confiable para trabajar, mismos que se usaron para los explantes y los experimentos posteriores. Al realizar la inmunofuorescencia, se obtuvieron las fotografías que evidencian todo un trabajo previo de Investigación y enseñanza por parte del Investigador y los alumnos del Verano (Ver figura 2 y figura 3).


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El dopaje con heteroátomos es una excelente técnica para lograr un control de los estados electrónicos de valencia. En relación a este tipo de dopaje, el nitrógeno ha sido de gran interés debido a los cambios que trae consigo respecto a la dureza, conductividad eléctrica y reactividad. En la actualidad la pirólisis de aerosoles líquidos a partir de una mezcla de hidrocarburos con metalocenos ha resultado ser un método eficiente para la producción de NTC debido a que permite un crecimiento a lo largo de las paredes del reactor y con ello dar lugar a la formación de nanotubos así como el proceso de dopaje del nitrógeno. Este proceso en conjunto con la Deposición Química de Vapor se ve como un método prometedor para el control de las propiedades fisicoquímicas de los NTC. La Deposición Química de Vapor (o CVD por sus siglas en inglés de Chemical Vapor Deposition) involucra la descomposición del catalizador, el cual se extrae directamente de una fuente de carbono. Este método ha sido muy utilizado debido a las ventajas que presenta en comparación con otros métodos, destacando el hecho de que es útil cuando se tienen fuentes de carbono ya sea en sólidos, líquidos o gases. Los bajos costos que se pueden llegar a tener lo hace un método con viabilidad de ser explotado comercialmente y fácilmente escalable, aunado a la gran área de reacción con la que se cuenta, el control en las características fisicoquímicas de los NTC así como la facilidad en el uso de los sustratos ya que no requieren preparación previa. Para el uso eficiente de los NTC es necesario tener dimensiones específicas así como diferentes niveles de homogeneidad, por lo cual es imperativo controlar sus propiedades físicas a través del control de los átomos que se introducen dentro la red cristalina. Los recientes estudios se han concentrado en optimizar los parámetros de la síntesis para con ello ampliar sus aplicaciones. El nitrógeno es altamente reactivo, por lo cual su uso implica consideraciones experimentales exactas para una síntesis exitosa. La fuente de carbono así como historial de pretratamiento son factores que influyen en el área superficial del compuesto de carbono y con ello el área de funcionalización. Diversos trabajos han utilizado tolueno, amonio o ciclohexano como precursores, sin embargo estos representan un alto costo aunado también al riesgo que representa su manejo y uso. El presente trabajo tiene como objetivo probar la viabilidad del uso de la mezcla isopropanol/bencilamina/ferroceno como fuentes para la obtención de NTC dopados con nitrógeno.

METODOLOGIA El método de síntesis se llevó a cabo a través del proceso de pirólisis de aerosoles. El método consiste en el uso de un sprayer el cual tiene un elemento piezoeléctrico en donde se lleva a cabo la pirólisis. El aerosol fue trasportado mediante gas argón con un flujo de 2.5 l/min, a través de un tubo de cuarzo el cual estaba dentro de dos hornos de convección. La reacción fue llevada a cabo a 850 °C con un tiempo de 30 minutos. Una vez terminado el tiempo de reacción el sprayer se apagó, el tubo se dejó enfriar a través de un método de convección forzada y el flujo de argón se disminuyó hasta 0.3 l/min. El tubo estaba conectado directamente hacia una trampa de acetona donde se depositaron los residuos. Para la solución precursora se utilizó ferroceno (C10H10Fe, 98%, Aldrich), bencilamina (C7H9N, 99%, Aldrich) e isopropanol (C3H8O, 99.95%, CTR Scientific) con las composiciones de 48.75% de bencilamina, 48.75% de isopropanol y 2.5% de ferroceno, en peso. El ferroceno es un metaloceno el cual contiene al catalizador. El tubo de cuarzo fue marcado cada centímetro, esto con el motivo de tomar muestras cada centímetro a partir de los 10 cm desde donde inicia la cabeza del tubo, para con ello hacer un análisis de distribución de pesos. Para la caracterización morfológica se utilizó SEM (Microscopio Electrónico de Barrido Dual Beam FIB/SEM FEI-Helios Nanolab 600) para posteriormente realizar una distribución de los diámetros obtenidos. Se realizó también un análisis termogravimétrico (PerkinElmer TGA 4000).

FABRICACIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO DOPADOS CON NITRÓGENO

1Facultad de Ciencias Químicas, Av. Dr. Manuel Nava No. 6, Zona Universitaria, C.P. 78120, San Luis Potosí, S. L. P., México; [email protected]; 2Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A. C., División de Materiales Avanzados, Camino a la Presa San José 2055, Col. Lo-

mas 4ª sección, C.P. 78216, San Luis Potosí, S. L.P., México, [email protected]

Araiza Acosta, C. A.1; Muñoz Sandoval, E.2

RESUMEN Los nanotubos de carbono han sido de interés debido a sus propiedades. El dopaje con nitrógeno ha atraído mucha atención debido a los cambios que trae consigo respecto a la dureza, conductividad eléctrica y reactividad. La pirólisis de aerosoles líquidos ha resultado ser un método eficiente para la producción de NTC que permite el dopaje del nitrógeno, que en conjunto con el método CVD se ve como un proceso prometedor. El presente trabajo tiene como objetivo demostrar la viabilidad del isopropanol/bencilamina/ferroceno como fuentes para la obtención de NTC dopados con nitrógeno. Durante la reacción el aerosol fue trasportado mediante argón, a través de un tubo de cuarzo a 850 °C durante 30 minutos. Se realizaron estudios de SEM y TGA. Se sintetizaron nanotubos de carbono a partir de la solución precursora propuesta. El isopropanol influyó en los diámetros obtenidos. El acomodo de los reactores influyó en la distribución de pesos.

ABSTRACT Carbon nanotubes have been of interest because of its properties. The nitrogen doping has attracted much attention because of the changes brought about hardness, electrical conductivity and reactivity. Pyrolysis of liquid aerosols has proven to be an efficient method for producing NTC allowing doping nitrogen, which together with the CVD method is seen as a promising process. This paper aims to demonstrate the feasibility of isopropanol/benzylamine/ferrocene as sources for obtaining NTC doped with nitrogen. During the reaction the aerosol was transported by argon through a quartz tube at 850 ° C for 30 minutes. SEM and TGA studies were conducted. Carbon nanotubes were synthesized from the precursor solution proposal. Isopropanol influenced in the diameters obtained. The arrangement of the reactors influenced the weight distribution. Palabras clave: nanotubos de carbono, isopropanol, Deposición química de vapor.

INTRODUCCIÓN Los nanotubos de carbono (NTC) han sido de gran interés para el mundo de la investigación actual debido a sus aplicaciones en el campo de la electrónica, fuentes de emisión, desarrollo y fabricación de nanocompositos. En su estado puro, son químicamente inertes, de ahí la necesidad de funcionalizarlos o modificar su superficie. Al dopar un nanotubo se tiene que tener en cuenta el uso que tendrá y en base a ello dar una estimación del nivel de dopaje necesario.


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Figura 2. Imágenes de SEM, a su lado derecho cada una contiene su distribución de diámetros.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la figura 1 se muestra el análisis de distribución de pesos. En este análisis podemos observar que en el centímetro 33 es donde se obtuvo mayor cantidad de muestra. Cabe destacar que cada horno de convección mide 40 cm, por lo cual se puede observar que los mayores pesos se obtienen en los últimos 8 centímetros del primer horno de convección, a partir del inicio del siguiente horno se observa una caída abrupta en los pesos obtenidos.

Figura 1. Distribución de pesos a lo largo del tubo de cuarzo. En la figura 2 se tienen las imágenes realizadas mediante SEM. Cada gráfico muestra una marca de clase que representa un promedio de diámetros por donde rondan los valores originales analizados en cada imagen. En la figura 2b se observa que la mayor parte de los diámetros oscilan entre los 0.07 y 0.09 μm; en la figura 2d se observa que existe más dispersión en los diámetros oscilando entre los 0.06 0.11 μm; en la figura 2f se observa que existe una dispersión que oscila entre 0.06 y 0.11 μm; en la figura 2h se observa que los diámetros rondan 0.09 a 0.11 μm, donde la mayor parte se encuentran en 0.11 μm; en la figura 2j se observa que los diámetros rondan entre 0.04 y 0.08 μm, donde la mayor parte se encuentra entre 0.08. La mayor parte de los nanotubos oscilan entre 0.06 a 0.11 donde, en comparación con el uso de etanol como fuente de carbono [2], se observa que los diámetros son más grandes a partir del uso del isopropanol.


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5. Pinault, M., Mayne-L'Hermite, M., Reynaud, C., Beyssac, O., Rouzaud, J., & Clinard, C. (2004). Carbon nanotubes produced by aerosol pyrolysis: growth mechanisms and post-annealing effects. DIAMOND AND RELATED MATERIALS, 1266-1269.

6. Pinault, M., Mayne-L'Hermite, M., Reynaud, C., Pichot, V., Launois, P., & Ballutaud, D. (2005). Growth of multiwalled carbon nanotubes during the initial stages of aerosol-assisted CCVD. CARBON, 2968-2976.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se pudo llevar a cabo gracias al proyecto CB-2013-220744-CONACYT del Dr. Emilio Muñoz Sandoval y 3971 Bilateral 246023-CONACYT del Dr. Florentino López Urías, así como al IPICYT, a la División de Materiales Avanzados, LINAN, Verano de la Ciencia de la Academia Mexicana de Ciencias y al CONACYT

En la figura 3 se tiene el análisis termogravimétrico donde observamos que a partir de 430 °C la oxidación de los NTC tiene un decaimiento notable, llegando su máximo en 520 °C donde el peso se empieza a mantener constante. El porcentaje de peso restante corresponde a la cantidad de hierro proveniente del metaloceno.

Figura 3. Análisis de TGA realizado para una muestra con un peso inicial de 4.775 mg, desde 50 °C hasta 950 °C, con un flujo de calor de 5.00 °C/min en atmósfera de oxígeno.

CONCLUSIONES

Se sintetizaron nanotubos de carbono a partir de la mezcla isopropanol/bencilamina/ferroceno. La fuente de carbono, en este caso el isopropanol jugó un papel importante en los diámetros obtenidos donde al compararlo con estudios previos se determinó que se obtienen diámetros más grandes en comparación con el etanol. El acomodo de los reactores fungió un papel importante en la distribución de pesos que se obtuvieron, debido a que en la intersección entre donde termina un reactor y donde empieza el otro existió un cambio abrupto en dichos pesos.

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la población puesto que acarrea distintos tipos de complicaciones entre los que destacan retinopatías,ulceraciones,hipertensión,problemas renales, posibles amputaciones, comprometimiento cardiaco y neuropatías(principalmente a nivel de extremidades).Entre las afecciones de diabetes se encuentra el daño vascular, el cual se genera por daño al endotelio vascular y musculo liso debido al estrés oxidativo provocado por la hiperglucemia clásica de diabetes mellitus. Esto provoca una modificación en la funcionalidad del tejido y se altera la contractilidad del mismo, guiando este desorden a alteraciones en la resistencia vascular periférica y como subsecuente a un aumento en la presión arterial. Como tal estos desordenes en la RVP pueden ser estudiados en diversos puntos durante la contracción en el caso del tejido vascular se aborda el papel de los canales de calcio puesto que durante este proceso la presencia de calcio es realmente importante para lograr una contracción significativa. Guiados en este tenor de la contracción del tejido vascular se propusieron diversos objetivos para ayudar en la estandarización de una técnica capaz de medir de forma eficiente la contracción y relajación vascular, el primero de ellos fue aprender de una técnica de montaje y en lo posible hacerla más sencilla para el manejo de tejido, como segunda propuesta estuvo generar un protocolo el cual estableciera las condiciones óptimas para llevar a cabo el experimento y como tercer pauta montar el sistema para obtener registros y en medida de lo posible fijar dos tejidos en un sistema separado para aplicar tratamientos individuales a cada tejido.

MARCO TEORICO La contracción vascular es un proceso de naturaleza compleja, el cual funciona gracias a receptores de membrana como los α adrenérgicos acoplados a proteínas G, las cuales al interaccionar con sustancias de carácter agonista para este receptor generan una vía de señalización con diferentes intermediarios cuya función es elevar la concentración citosolica de calcio. El aumento de calcio permite la formación del complejo calcio-calmodulina que activa a la cinasa de cadena liviana de miosina y esta a su vez ayude en el solapamiento que origina la contracción de las fibras de actina y miosina. El proceso de relajación vascular es diferente, pues en él se necesita de las células endoteliales, las cuales cuando son activadas por agonistas colinérgicos que activan una vía de señalización la cual genera óxido nítrico y este a su vez difunde por la célula endotelial y pasa al miocito, en el cual se activa otra vía de señalización que incrementa los niveles de GMPc que son responsables de activar una fosfatasa con la finalidad de relajar las fibras de actina y miosina previamente solapadas en el proceso de contracción.

METODOLOGIA El manejo de animales de experimentación se encontró bajo la supervisión del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina, acorde a la norma NOM-062-ZOO-1999.Se trabajó con ramificaciones de la arteria mesentérica de ratas macho de la especie Wistar, previamente eutanizadas con una dosis letal de pentobarbital sódico aplicado intraperitonealmente. Se eliminó el tejido conectivo y endotelio bajo un microscopio estereoscópico. El tejido muscular fue montado en el miógrafo DMT (wire miograph system-420A), con el fin de medir la respuesta frente a fármacos contra la tensión del tejido. La respuesta de contracción fue obtenida con el software Labchart. Se utilizaron diferentes soluciones y fármacos para el montaje y experimentación de este trabajo, entre ellos: Solución fisiológica (NaCl 140mM, KCl 5mM, MgSO4 25 mM, KH2PO4 75 mM, CaCl2 0.2mM, Hepes 5mM, Dextrosa10mM) pH 7.4. La temperatura de trabajo fue de 37°C(fisiológica), la cual fue controlada por una cámara de calentamiento provista por el mismo equipo.

CONTRACCIÓN EN MUSCULO LISO DE RAMAS DE ARTERIA MESENTÉRICA EN RATAS MEDIADA POR CANALES IONICOS

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO;[email protected]; 2Facultad de Enfermería, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Niño Artillero #130 Zona Universitaria San Luis Po-

tosí, S.L.P., México; [email protected]

Arcos Rivera, E.1; Algara Suárez, P.2

RESUMEN La contracción de las células de musculo liso vascular es un proceso complejo que resulta de gran importancia de estudio puesto que en diferentes patologías el proceso de contracción en este tipo de tejido se ve afectado generando sensibilidad a sustancias endógenas y exógenas como los fármacos agonistas de la contracción. En el presente estudio como principales metas, se propuso generar y aprender técnicas de disección de tejido vascular, así como mejorar el montaje del mismo en el miógrafo DMT y después de esto corroborar la funcionalidad del tejido añadiendo diferentes fármacos promotores de la contracción y relajación en el musculo liso vascular. El protocolo anterior nos ayudó a fortalecer el trabajo de investigación que precede a este trabajo, puesto que se mejoró la técnica de montaje en el miógrafo y se generaron diversos registros de contracción/dilatación vascular con la finalidad de obtener las mejores condiciones de manejo del tejido.

Palabras clave: Musculo liso vascular, miógrafo DMT, disección de tejido.

ABSTRACT Vascular smooth muscle contraction is a complex process that is of great importance to study because on different pathologies the contraction process is affected generating sensitivity to endogenous and exogenous substances such as contractile agonist. In the present study as main goals, we set out to create and learn dissection techniques of vascular tissue as well as improve the assembly and mounting in a DMT myograph. It was also our aim to confirm the functionality of the tissue by adding different vascular contraction and relaxation agonist. Protocol helped us strengthen the research work preceding this one, because the mounting technique was improved in the myograph and some isometric force records were successfully generated in order to obtain the best conditions for tissue management. Keywords: vascular smooth muscle, DMT miograph, tissue dissection.

INTRODUCCION La diabetes mellitus representa uno de los problemas de salud de mayor repercusión dentro de los estados mexicanos, pues su índice en la población es de 6.4 millones de personas (9.2%) incrementando su prevalencia en un 59.6%(ENSANUT 2012).Dicha situación afecta principalmente en la calidad de vida de


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En la figura 1 es posible observar el tejido diseccionado, limpiado y alambrado para su posterior montaje en el miógrafo DMT, posteriormente en la figura 2 fue posible montar un sistema de 2 tejidos anclados a este sistema que está dividido en 2 secciones listas para recibir un tratamiento farmacológico diferente para comparar la acción de cada uno de ellos en los vasos sanguíneos, cuya precarga inicial fue fijada en 6 mN. En la figura 3 y 4 es posible ver el comportamiento del tejido vascular frente a diferentes fármacos, primero se analiza la funcionalidad del tejido frente a un agonista adrenérgico como la fenilefrina y es posible ver el aumento en la contracción del vaso sanguíneo, elevando la fuerza del estado basal que registra el aparato(mN). En el caso del uso en el tejido de carbacol tenemos dos puntos de vista diferente, pues para corroborar la susceptibilidad del tejido y que la respuesta sea debida al carbacol usamos ramificaciones con y sin endotelio puesto que la acción colinérgica-relajante de este fármaco comienza en el endotelio y sin él es imposible que la relajación del vaso se lleve a cabo. Lo que fue confirmado en los registros porque en el tejido sin endotelio se mantuvo la contracción, mientras que en el tejido con endotelio fue muy evidente la relajación ocurrida en el vaso. Para cuando se usó el TEA-Cl, un bloqueador de canales de potasio fue visible el comportamiento de este ion en la relajación del musculo liso, esto debido a que para que la relajación en el musculo se produzca es necesario que el potasio salga de la célula, debido a que los canales estaban cerrados el potasio no pudo salir del miocito y subsecuentemente no hubo relajación muscular manteniendo el estado de contracción y alargándolo un poco. Cuando fue administrado la nifedipina, un bloqueador de canales de calcio fue evidente el papel del calcio en la contracción muscular, porque como ya fue mencionado anteriormente el calcio y su unión a calmodulina son de gran importancia para continuar con la cascada de señalización correspondiente a la contracción. Entonces al bloquear la entrada de calcio por sus canales esta parte de la secuencia se fue cortando y como consecuente la contracción se detuvo dando como resultado que el tejido se relajara.

CONCLUSIONES Como panorama general se cumplieron gran parte de los objetivos planeados para este proyecto, entre lo más destacable es la disección y el montaje del tejido en el miógrafo DMT que a su vez nos brindó la capacidad de estandarizar las condiciones óptimas de montaje del tejido por ejemplo se trabaja con ramificaciones arteriales de rama mesentérica con una longitud de 3 mm aproximadamente y de diámetro cercano a un milímetro puesto que las ramificaciones de la arteria que no cumplen con estas especificaciones no generan registros adecuados legibles. La precarga (pequeño ajuste de tensión hecho al inicio del experimento) quedo establecido en 6 mN, porque dentro de los ensayos es la fuerza que se debe aplicar para arrojar contracciones más consistentes y en cuanto a los lavados de los tejidos se coincidió en un sistema de perfusión inicialmente rustico que utiliza jeringas para que el flujo del líquido suministrado (solución fisiológica) no genere malas lecturas en el sistema(ruido).Fue posible el montar dos tejidos en el miógrafo y aplicar tratamientos distintos, para corroborar la funcionabilidad del septo divisorio del aparato. Respecto a los registros, se pueden hacer distintas interpretaciones respecto a cada fármaco utilizado. Las cuales ya fueron analizadas previamente, pero entre lo más destacable está el papel de los iones en la contracción vascular, como lo es el calcio o en la relajación el potasio. Aunado a esto vimos la importancia del endotelio en la señalización del tejido para relajarse debido a la producción del óxido nítrico y dado esto podemos inferir que en procesos como la diabetes que se daña este, la latencia a estar contraído el musculo es más factible. Como tal los procesos de estandarización y montaje del tejido fueron en su mayoría satisfactorios puesto que el porcentaje de error fue muy poco, por ello se generaron nuevos y mejores formas de realizarlos. Lo que en un futuro servirá de apoyo para la continuación del proyecto de investigación que precede a este trabajo y aplicarlo a modelos de ratas diabéticas lo que posiblemente genere conocimiento adecuado sobre la susceptibilidad del tejido frente a varios fármacos.

Los lavados del equipo fueron realizados con solución fisiológica para deshacer cualquier interferencia provocada por un fármaco agregado anteriormente, se hicieron con 2 jeringas de 10 ml una con la aguja y otra sin ella, Tratando de ser lo más próximos al tejido y sin generar mucho movimiento en el entendido de que el movimiento genera interferencias. Fenilefrina[10uM] Carbacol [100nM] Nifedipina[1uM] TEA-Cl[10mM] NS[10uM]

DISCUSION Y RESULTADOS

Figura 1.Disección y alambrado de ramificaciones de la

arteria mesentérica.

Figura 2.Tejido vascular montado en el miógrafo DMT.

Figura 3.Registro de contracción usando fenilefrina y

carbacol en tejido sin endotelio.

Figura 4.Registro de contracción en dos arterias

diferentes con endotelio, usando fenilefrina,carbacol,TEA-Cl y nifedipina para ambos tejidos.

Carbacol.

Fenilefrina.

Fenilefrina.

Carbacol.

Lavados con solución fisiológica.

Fenilefrina.

TEA-Cl

Nifedipina.


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PURIFICACIÓN DE H+- ATPASA A PARTIR DE MEMBRANA

PLASMÁTICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y PURIFICACIÓN DE Ca2+ ATPASA A PARTIR DE TEJIDO MUSCULAR DE CONEJO

1Instituto Tecnológico Superior de Irapuato (ITESI; Carretera Irapuato-Silao km 12.5, C.P. 36821, Ira-puato, Guanajuato, México; [email protected]; 2Universidad Autónoma de San Luis Po-tosí (UASLP), Instituto de Física, Materiales Biomoleculares y Biofísica; Av. Manuel Nava #6, Zona

Universitaria, C.P. 78290, San Luis Potosí, San Luis Potosí; México, [email protected].

Bajonero Arroyo, M. F.1; Sampedro Pérez, J. G.2

RESUMEN Las ATPasas constituyen un amplio grupo de enzimas cuya función es la hidrólisis o la síntesis de ATP; dentro de este grupo se encuentran la H+-ATPasa y la Ca2+-ATPasa. La actividad de ambas ATPasas es importante para el correcto funcionamiento celular por lo que su estudio se considera relevante. La obtención de ambas ATPasas en forma pura permitiría la realización de estudios estructurales y cinéticos en diversas condiciones. En el presente reporte se detalla la manera en que la H+-ATPasa y la Ca2+-ATPasa fueron purificadas a partir de Saccharomyces cerevisiae y de músculo de conejo. En la purificación de las enzimas se utilizaron las técnicas de centrifugación diferencial y ultracentrifugación, así como la realización de geles de poliacrilamida para confirmar la purificación de dichas enzimas.

ABSTRACT

ATPases are a large group of enzymes whose function is the hydrolysis or synthesis of ATP; H+-ATPase and Ca2+-ATPase are within this group. The activity of both ATPases is important for correct cell function; thus their study is considered relevant. In this regard, the isolation of both ATPases at high purity is a priority, as it would allow structural and kinetics studies. In this report, it is described the purification of H+-ATPase and Ca2+-ATPase from the yeast Saccharomyces cerevisiae and rabbit muscle. Differential centrifugation and ultracentrifugation were used for enzymes purification. Polyacrylamide gels and Coomassie blue stain were performed in order to confirm the presence of the purified enzymes.

Palabras clave: enzimas, ATPasas, P-ATPasas, H+-ATPasa, Ca2+-ATPasa, purificación.

INTRODUCCIÓN Las ATPasas son proteínas de tipo transmembranal, cuya función es la hidrólisis o la síntesis de ATP acoplada al transporte activo de cationes a través de la membrana. En general, se puede mencionar que existen 3 tipos diferentes de ATPasas, los cuales son: las ATPasas de tipo P que se encuentran localizadas en la membrana plasmática que son las encargadas del transporte de cationes (H+, Na+, K+, Cu2+, Cd2+ y Mg2+) en contra de un gradiente de concentración y son autofosforiladas por el ATP durante dicho proceso; las ATPasas de tipo F (F1F0) cuya función es la translocación de protones hacia el interior de las mitocondrias y la síntesis de ATP; las ATPasas de tipo V que se encuentran presentes en las membranas vacuolares de las plantas y que pueden considerarse homólogas a las ATPasas de tipo F; las ATPasas de

BIBLIOGRAFIA

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EGTA. Una vez resuspendida la pastilla, ésta se centrifugó a 18,000 rpm durante 60 min y se obtuvo una pastilla. La misma fue resuspendida con pincel en buffer EGTA, la muestra fue depositada en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se guardó a -72 ºC para su conservación y evitar que las proteínas presentes en dicha muestra perdieran actividad. Posteriormente se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida para corroborar la presencia de la enzima en las membranas de ambas cepas. Purificación de la H+-ATPasa a partir de las membranas plasmáticas Se procedió a diluir las muestras (BY4741 y ∆BMH1 de S. cerevisiae) en una solución buffer hasta alcanzar un volumen de 20 mL; se sometieron a agitación constante durante 10 min, posteriormente dichas muestras se centrifugaron a 100,000g durante 60 min. Al término de la centrifugación, se realizó un ensayo de Lowry a la pastilla y el sobrenadante obtenidos para determinar la cantidad de proteína presente. La pastilla se disolvió con ayuda de un pincel en una solución amortiguadora y se centrifugó a 100,000g durante 60 min. Como resultado del proceso anterior se obtuvo un sobrenadante al que se le determinó la cantidad de proteína presente, una vez hecho el cálculo, se procedió a agregar azolectina (previamente sometida a sonicación) y zwittergent que se mezcló con ayuda de un equipo Wise Stir. Después de realizado el paso anterior, se tomaron 8 mL de la muestra de membranas obtenida de la cepa BY4741 los cuales fueron colocados en un gradiente de trehalosa (45%, 40%, 35% y 30%) para posteriormente ser centrifugados a 100,000g durante 14 hrs. Al finalizar el proceso anterior, se recuperó la proteína presente entre las fracciones de trehalosa, así como también se recuperó la fracción remanente de muestra y otra fracción que se encontraba por encima del gradiente de trehalosa de 30% la cual presumiblemente correspondía a lípidos. Purificación de Ca2+-ATPasa La purificación comenzó con la molienda de tejido muscular proveniente de las extremidades traseras de un conejo, para centrifugarse a 3,000 rpm durante 5 min; el sobrenadante obtenido se centrifugó a 9,200 rpm durante 15 min, del cual se obtuvo un sobrenadante que fue centrifugado a 16,700 rpm durante 2 hrs. La pastilla resultante fue dividida en dos fracciones las cuales se solubilizaron con sacarosa y trehalosa, respectivamente. Posteriormente, ambas fracciones fueron centrifugadas a 10,100 rpm durante 4 min; el sobrenadante obtenido se llevó a una concentración de 0.6M de KCl y 0.15M de sacarosa o trehalosa (de acuerdo a la fracción solubilizada con el azúcar correspondiente) y se centrifugaron a 18,000 rpm durante 2 hrs con 45 min. Las pastillas obtenidas se solubilizaron en buffer de EGTA 2mM, KCl 0.1M, TRIS 5mM y 0.3M de sacarosa o trehalosa según correspondiera y se guardaron a -72 ºC para su conservación. Electroforesis en geles de poliacrilamida Para corroborar la presencia de la ATPasa y por ende, la correcta realización del proceso, se procedió a realizar un gel de poliacrilamida.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Una vez realizado el proceso de purificación de las enzimas se procedió a la realización de la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con el propósito de visualizar la presencia de las ATPasas purificadas. En las siguientes figuras, se muestran los geles SDS-PAGE de las muestras correspondientes al proceso de obtención de membranas a partir de S. cerevisiae de la cepa BY4741 y de la mutación ∆BMH1. En los mismos geles también se corrieron muestras que correspondían a distintas fracciones (sobrenadante o pastilla) obtenidas en el proceso de purificación; esto con el propósito de comprobar que la proteína no había quedado en alguna otra fracción al momento de purificarla. En las figuras antes mencionadas también se puede observar una flecha que indica la banda correspondiente a un peso de 100kDa, en la cual se encuentra la H+-ATPasa; la aseveración anterior se hace en base a experimentaciones similares previamente realizadas en este laboratorio[12]; por lo que, al

tipo ABC cuyo nombre deriva de las siglas de su denominación en inglés “ATP-binding cassette” tienen entre sus funciones principales la resistencia a ciertos fármacos, además algunas alteraciones de las mismas se encuentran implicadas en procesos patológicos. [1] [2] La H+-ATPasa de la membrana plasmática de hongos se fosforila transitoriamente como parte del ciclo catalítico en dónde se hidroliza el ATP. [3] El estudio de la H+-ATPasa se remonta a los años sesenta [4], pero la propuesta de la existencia de este tipo de transportadores en la membrana plasmática de levaduras fue presentada hasta los años 70 por Rothstein [5]; sin embargo, muchos de los estudios realizados en este tema datan de las década de los ochenta y noventa. La utilización de la levadura S. cerevisiae para la obtención de la H+-ATPasa se debe a que esta especie es considerada un modelo en el estudio de las levaduras. En este estudio se utilizó la cepa silvestre BY4741 y otra que presenta la eliminación del gen codificante de la proteína BMH1; lo anterior debido a que se ha observado que una modificación de la proteína BMH1 puede llegar a causar modificaciones menores en el crecimiento y viabilidad de las células de levadura. [6] [7] Por otra parte, la Ca2+-ATPasa es una enzima hidrolítica que posee dos estados energéticos en su ciclo: E1 de alta afinidad al calcio y E2 de baja afinidad al calcio [8]; su actividad es el trasporte de calcio al lumen del retículo sarcoplásmico de las células musculares utilizando la energía de hidrólisis del ATP. [9] Por lo anterior, la obtención de la enzima pura permitiría la realización de estudios estructurales y cinéticos que brindarían información sobre su estructura y función.

MARCO TEÓRICO

El proceso de purificación de proteínas forma parte de una serie de actividades complejas que permiten el estudio de dichas moléculas, por ello es necesario el establecimiento de las técnicas adecuadas que permitan lograr los mejores resultados dentro del proceso. El análisis científico de las ATPasas, específicamente aquellas que son objeto de estudio en este reporte, puede remontarse hasta la década de los setenta, tal como lo muestra el artículo publicado por Rothstein, A. [4]; sin embargo, el proceso de purificación de dichas enzimas comenzó a ser mejorado en las décadas de los ochenta y noventa, cuando el estudio de las ATPasas, especialmente la H+-ATPasa comenzó a tener una mayor relevancia, tal como lo demuestra el artículo realizado por Perlin, D. et al en 1989[10], donde se menciona la utilización de la técnica de centrifugación para obtener la H+-ATPasa. Posterior a las décadas anteriormente mencionadas, se pueden encontrar una gran variedad de artículos donde el uso de la técnica de centrifugación es empleada para la obtención de ATPasas específicas, tal es el caso de aquel publicado por Sampedro, J. et al [11], en el año 2002.

MÉTODOS Y MATERIALES Purificación de las membranas plasmáticas El proceso de purificación comenzó cuando una muestra de S. cerevisiae de la cepa BY4741 y otra con la mutación denominada ∆BMH1 se colocaron en medio YPD y se incubaron durante 25 hrs a 30 ºC con una agitación de 250 rpm, para después obtener la biomasa por medio de centrifugación a 5,000 rmp durante 10 min. Posteriormente, las células de levadura fueron incubadas a 30 ºC, en buffer de sorbitol 1.0 M el cual contenía liticasa (50 U/g levadura), por aproximadamente 2 hrs durante las cuales se tomó lectura de absorbencia cada 15 min, con el propósito de detectar una disminución en la misma la cual indicaría la formación de esferoplastos. Una vez se terminó de medir la absorbencia, ambas muestras se sometieron a sonicación y posteriormente se centrifugaron a 3,500 rpm durante 10 min, se obtuvo una pastilla y un sobrenadante (respectivamente). El sobrenadante obtenido fue centrifugado a 12,000 rpm durante 30 min y se obtuvo un sobrenadante que se centrifugó a 18,000 rpm durante 60 min para nuevamente obtener un sobrenadante y una pastilla, dicha pastilla fue resuspendida con ayuda de un pincel en buffer que contenía


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Figura 3. BN-PAGE de los distintos estados oligoméricos de la H+-ATPasa de la cepa BY4741. Carril 1, muestra obtenida del proceso de purificación.

Así mismo, se realizó un gel en poliacrilamida para corroborar la presencia de la Ca2+-ATPasa obtenida del tejido muscular de conejo. En la figura siguiente se puede observar la banda que indica la presencia de dicha enzima, en un peso de alrededor de 100 kDa. En los demás carriles del gel se colocaron las distintas fracciones (de sobrenadante y pastilla) obtenidas durante el proceso.

Figura 4. Gel de Ca2+-ATPasa obtenida. Carril 1, pastilla de la primera centrifugación; carril 2, pastilla de la segunda centrifugación; carril 3, pastilla (en sacarosa) de la cuarta centrifugación;

carril 4, pastilla (en trehalosa) de la cuarta centrifugación; carril 5, sobrenadante (en sacarosa) de la quinta centrifugación; carril 6, sobrenadante (en trehalosa) de la quinta centrifugación; carril 7,

Ca2+-ATPasa (en sacarosa) dilución 1:10; carril 8, Ca2+-ATPasa (en trehalosa) dilución 1:10.

CONCLUSIONES Como ya se ha mencionado anteriormente, la purificación de las enzimas mencionadas en este reporte constituye un paso esencial dentro del estudio de las mismas, además de que dicho proceso requiere de gran precisión al momento de llevarse a cabo; por ello, los resultados obtenidos durante esta estancia de investigación representan la culminación de actividades que permitirán el estudio posterior de las funciones de ambas ATPasas, lo cual podrá llegar a brindar información relevante sobre las mismas, y ésta podrá ser aplicable en experimentos futuros.

Hexámero

Tetrámero

observar la presencia de dicha banda en el carril donde se colocó la muestra de membrana (de la cepa BY4741 y de la mutación ∆BMH, respectivamente), se puede afirmar que el proceso de obtención de membranas se llevó a cabo de manera correcta.

Figura 1. Gel de membranas obtenidas de la cepa BY4741. Carril 1, pastilla de la primera centrifugación; carril 2, pastilla de la segunda centrifugación; carril 3, sobrenadante de la tercera

centrifugación; carril 4, sobrenadante de la cuarta centrifugación; carril 5, membranas obtenidas en dilución 1:10.

Figura 2. Gel de membranas obtenidas de la cepa con mutación ∆BMH1. Carril 1, pastilla de la primera centrifugación; carril 2, pastilla de la segunda centrifugación; carril 3, sobrenadante de la

tercera centrifugación; carril 4, membranas obtenidas (sin diluir).

A continuación, se muestra el gel donde se pueden observar, tenuemente, algunos de los estados oligoméricos de la H+-ATPasa obtenida a partir de la cepa BY474, ya que fue la única muestra de membrana sometida al proceso de purificación en gradiente de trehalosa; la muestra de membrana de la cepa con la mutación ∆BMH1 no se sometió al proceso de purificación anteriormente mencionado debido a que la cantidad de proteína presente era muy poca (2.7 mg/ml).


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LAS CELULAS TUMORALES MODIFICAN LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA DE RATAS SOMETIDAS A UN PROTOCOLO DE DESINCRONIZACIÓN CIRCADIANA

1Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey, Eugenio Garza Sada 2501, C.P. 64849, Monterrey, Nuevo León., MÉXICO, [email protected]; 2Facultad de Ciencias, Universidad Autó-noma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., México, scr.

[email protected]; [email protected]

Bazúa Gerez, D.1; Cardenas Romero, S.2; Salgado Delgado, R.2

RESUMEN El Núcleo Supraquismatico (NSQ) del hipotálamo organiza toda nuestra fisiología, sin embargo, cuando se somete un organismo a condiciones constantes de iluminación se produce una desincronización circadiana la cual genera consecuencias graves en la salud. Resultados previos muestran que las ratas sometidas a un protocolo de luz constante (L:L) e inoculadas con células tumorales presentan una distribución conductual diferente con respecto a aquellos que solo se les desincroniza. Esto lleva a preguntarnos si el tumor afecta la actividad neuronal del NSQ y por lo tanto la conducta. Para analizar esto se cuantificó la expresión de la proteína c-Fos, encontrando que la actividad neuronal del grupo L:L con tumor presenta mayor actividad a las 1 PM y menor a la 1 AM contrario a lo esperado, lo que podría indicar que el tumor afecta la actividad del NSQ de manera humoral, sin embargo esto no se ve reflejado en la conducta.

ABSTRACT The Suprachiasmatic Nucleus (SCN) of the hypothalamus organizes our physiology, nonetheless, when an organism is subjected to a condition of constant light, a circadian desynchronization is produced which generates important consequences in healt. Previous studies show that rats that are under a constant light protocol (L:L) and are inoculated with tumoral cells present a different behavioral distribution when compared to those that are only desynchronized. This leads to the question that if the tumor affects the neuronal activity of the SCN and therefore behavior. To analyze this the expression of the protein c-Fos was quantified, finding that the neuronal activity of the group L:L with a tumor presents more activity a 1 PM and lower at 1 AM contrary to what is expected, which could indicate that the tumor affects the activity of the SCN at a humoral level, this not being reflected in the behavior. Palabras clave: Núcleo Supraquiasmático, c-Fos, actividad locomotora.

INTRODUCCIÓN Los seres humanos se rigen por ritmos biológicos que son encargados de regular la mayoria de los procesos fisiologicos de nuestro cuerpo. Los ritmos circadianos son ritmos biológicos generados endógenamente con una duración de alrededor de 24 horas y regulan la actividad metabólica, hormonal y conductual (Rosas, 2010). Estos se establecen por la actividad transcripcional de un grupo de genes conocidos como genes reloj quienes se expresan siguiendo un ritmo en el cerebro y otros tejidos. En todos los mamíferos el reloj circadiano se encuentra ubicado en el núcleo supraquiasmático (NSQ) el cual es una

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horas oscuridad 2 12 horas luz/ 12

horas oscuridad No L:D s/t

3 24 horas luz Sí L:L c/t 4 24 horas luz No L:L s/t

Tabla 1. Grupos de cerebros utilizados para el análisis de la expresión de C-fos.

Para poder analizar los cerebros se siguió un protocolo previo en el laboratorio descrito de la siguiente manera.

REGISTRO CONDUCTUAL Una vez que se asignó el protocolo a las ratas, la actividad locomotora de cada animal fue monitoreada con un sistema de registro conductual implementado con sensores de presión colocados debajo de cada caja y sensores infrarrojo colocados arriba de las cajas. Estos registros se mantuvieron activos durante todo el protocolo. Por medio de ambos sensores se obtuvo información acerca del número de veces que la rata se mueve durante cada minuto. A partir de los datos, se obtuvieron actogramas de cada animal, los cuales representan la suma de la actividad cumplida en intervalos de 15 minutos a lo largo de las 24 horas. INOCULACION DE CELULAS Las ratas asignadas previamente a los grupos L:D y L:L con tumor fueron inoculadas con un total de 8 millones de células/300 μl de medio RPMI 1640 sin suplementar, inyectadas en la zona interescapular y se registro su crecimiento diariamente por 21 dias.

OBTENCION DE MUESTRAS Las ratas fueron anestesiadas profundamente con una sobredosis de pentobarbital sódico (Sedalpharma, 65 mg/ml). Los cerebros fueron removidos y postfijados en paraformaldehido al 4% por 24 horas, y después crioprotegidos en sacarosa al 30% por 4 días.

INMUNOHISTOQUIMICA Los cerebros de los diferentes grupos fueron cortados en rebanadas de 40 μm. De los cortes obtenidos de cada cerebro se seleccionaron 3 rebanadas en donde se pudo visualizar claramente el NSQ, estas se incubaron con el anticuerpo anti c-Fos hecho en conejo (1:2500). La incubación se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) en agitación constante, posteriormente se incubó durante 48 horas a 4°C. Posteriormente, los cortes se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo hecho en cabra (1:200) durante 2 horas a TA en agitación constante. Después se realizó una incubación con el complejo avidina-biotina (1:500) por 2 horas a TA. Pasado este tiempo, se revelaron utilizando una solución compuesta de diaminobenzidina (DAB), peróxido de hidrógeno, sulfato de níquel y amonio en buffer tris salino (TBS) durante 5 minutos. Los cerebros revelados se colocaron en portaobjetos y se deshidrataron utilizando alcoholes de diferentes concentraciones, cubiertos con Entellan y cubreobjetos. Los cortes fueron seleccionados en un microscopio de luz transmitida y las imágenes fueron capturadas con una ampliación ocular de 4X y 10X usando el programa Leica Application Suite Versión 3.0.0 (LAS EZ). Las células inmunoreactivas fueron contadas bilateralmente usando el sistema de análisis de imágenes computarizado Image J.

agrupación de alrededor de 10 mil neuronas en la parte anterior del hipotálamo. El reloj circadiano se encuentra sincronizado principalmente por los ciclos externos de la luz-oscuridad (Cardinali y cols.,1994). Estudios previos del laboratorio sugieren que la alteración de los ritmos biologicos representa un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer, así como el aumento en la proliferación tumoral (Cárdenas-Romero y cols., 2016). Así mismo, se observó que el grupo de ratas sometidos a un protocolo de luz constante e inoculadas con celulas tumorales presentaba una distribucion conductual diferente con respecto a aquellas que solo se les desincronizaba (Cárdenas-Romero y cols., 2016). Al analizar los datos de los actogramas de los animales asignados a cada grupo se obtuvieron gráficas que muestran la distribución de la actividad locomotora durante las 24 horas (Figura 1 y Figura 2). Con estas gráficas se observó que los grupos L:L s/t y L:L c/t presentan una arritmicidad en su actividad conductual. Por otro lado, el grupo L:D c/t presentó una disminución en la amplitud de la actividad locomotora en la fase de obscuridad con respecto al grupo L:D s/t. Esto lleva a preguntarnos si el tumor afecta la actividad del NSQ. Para analizar esto se cuantificó la expresión de la proteína c-Fos la cual es un gen de expresión temprana neuronal y se encuentra presente cuando las neuronas están activas inhibiendo la actividad conductual de los animales.

Figura 1. Distribución de la actividad locomotora durante las 24 horas para grupos L:D s/t y L:L s/t. Tomado de Cárdenas y

cols., 2016.

Figura 2. Distribución de la actividad locomotora durante las 24 horas para grupos L:D c/t y L:L c/t. Tomada de

Cárdenas y cols., 2016.

Por lo tanto, los objetivos del presente trabajo fue cuantificar y comparar en ratas sincronizadas (fotoperiodo 12 horas luz y 12 horas oscuridad) y arrítmicas bajo luz constante, con y sin inoculación de células cancerígenas el nivel de expresión de la proteína c-Fos en el NSQ.

METODOLOGIA MODELO ANIMAL Se utilizaron cerebros de ratas macho de la cepa Wistar con pesos iniciales entre 160 - 180 g. Estas fueron alojadas de forma individual en cajas transparentes de acrílico (27cm*37cm* 15cm) y colocadas en racks aislados del ruido, temperatura constante (23 ± 1 °C), aire circulante y libre acceso al agua y comida. Las ratas se dividieron aleatoriamente en 4 diferentes grupos (Tabla 1). Cada grupo consistía de 2 a 3 réplicas, así como dos puntos temporales ZT6 (1 PM) y ZT18 (1 AM).

Grupo Fotoperiodo Tumor Abreviatura 1 12 horas luz/ 12 Sí L:D c/t


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Figura 5. Conteo de células inmuoreactivas de c-Fos en ZT6 y ZT18.

Figura 6. Conteo de células inmuoreactivas de c-Fos en ZT6.

Figura 7. Conteo de células inmuoreactivas de c-Fos en ZT18

Diversos estudios han demostrado que la luz ambiental es el principal estímulo para el NSQ. Esta señal es percibida por el NSQ a través de una vía de señalización en la cual intervienen diferentes neurotransmisores, provocando la activación del mismo (Klein y cols., 1991). Posteriormente, el NSQ a través de señales inhibidoras o activadoras puede controlar diversos procesos fisiológicos como la actividad locomotora. Los animales nocturnos presentan una mayor actividad conductual en la fase de obscuridad mientras que en la fase de luz disminuye esta actividad. Esto debido a que en presencia de luz el NSQ se mantiene activo inhibiendo la actividad locomotora de los animales. Por esta razón se esperaría que en ZT6 (fase de luz) hubiera una mayor expresión de c-Fos contrario a lo que se esperaría en ZT18 (fase de oscuridad). Con nuestros resultados se pudo corroborar en los grupos L:D s/t y L:D c/t que la mayor expresión de c-Fos fue en ZT6 lo cual concuerda con la disminución de la actividad conductual de los animales, contrario a lo que se observó en ZT18 (Figura 5). Sin embargo, se esperaba que el grupo L:D c/t presentara cambios evidentes en la expresión de c-Fos, debido a que la actividad locomotora de estos animales presentó un ligero aumento en su fase de descanso y disminución en su fase de actividad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se obtuvieron micrografías ópticas representativas de los 4 grupos mencionados anteriormente en ZT6 (Figura 3) y ZT18 (Figura 2) para realizar una comparación visual. En las imágenes de la Figura 1 se pueden ver las neuronas positivas para la proteína c-Fos. A simple vista se observó que en el grupo L:L c/t (Figura 3, D) la actividad de las neuronas tiene una tendencia a ser mayor con respecto a los otros grupos.

Figura 3. Actividad neuronal del NSQ por medio de c-Fos en ZT6. A) L:D s/t B) L:D c/t C) L:L s/t D) L:L c/t

Con respecto a las imágenes representativas en ZT18, se observó que la actividad neuronal de los grupos L:D s/t, L:D c/t y L:L c/t (Figura 4,A, B y D, respectivamente) son visualmente menores al grupo L:L s/t (Figura 4,C).

Figura 4. Actividad neuronal del NSQ por medio de c-Fos en ZT18. A) L:D s/t B) L:D c/t C) L:L s/t D) L:L c/t

Se observó que el grupo L:D s/t presenta su mayor actividad en ZT6 y esta no se modificó en el grupo L:D c/t, sin embargo la expresión de la proteína c-Fos con respecto a los otros grupos en ZT6 fue menor (Figura 6). Además, se contempló que los grupos L:D s/t y L:D c/t presentaron una menor expresión de c-Fos con respecto a los grupos L:L s/t y L:L c/t en ZT18 (Figura 7). Por otro lado, se observó que la actividad neuronal del NSQ (c-Fos) en ZT6 es mayor que en ZT18 en los grupos L:D s/t, L:D c/t y L:L c/t. Además en el grupo L:L s/t se observó que la actividad neuronal de c-Fos es similar en ambos puntos temporales (ZT6 y ZT18), lo que correlaciona con la actividad arrítmica observada.


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RELACIÓN DE PKC EN LA EXPRESIÓN DEL CANAL BKCa EN MÚSCULO LISO VASCULAR DE AORTA EN RATAS DIABÈTICAS

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Facultad de Enfermería, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Niño Artillero No.130 C.P. 78290, San Luis Potosí,

S.L.P., MÉXICO, [email protected]; [email protected]

Blanco Sandate, J. O.1; Algara Suárez, P.2; Hernández García A. P.2

RESUMEN La Diabetes Mellitus es una enfermedad crónica que debido a las complicaciones que implica y su elevada mortalidad tiene un gran impacto en la población. A causa del estado hiperglucémico generado en este padecimiento se ha propuesto un aumento en la actividad de la proteína cinasa C(PKC), la cual disminuye la actividad de los canales de K+ de alta conductancia activados por Ca2+(BKCa) del musculo liso vascular(VSM); estos últimos desempeña un papel crucial en el mantenimiento del tono vascular debido a que regulan los procesos de excitación- contracción, por lo que esta alteración se ha relacionado con un incremento a desarrollar enfermedad arterial que conlleva a padecer trastornos cardiovasculares. El propósito de este estudio fue determinar el nivel de expresión del canal BKCa en relación con PKC en aorta de ratas diabéticas por medio de la técnica de Western Blot. Palabras clave: Diabetes Mellitus; Canal BKCa, PKC.

ABSTRACT Diabetes Mellitus is a chronic disease involving vascular complications and high mortality, hence with great impact on the population. Because the hyperglycemic state generated in this condition has been proposed an increase in activity of protein kinase C (PKC), which reduces the activity of the large conductance Ca2+-activated K+ channel (BKCa) in vascular smooth muscle (VSM); these last ones play a crucial role in maintaining vascular tone due to regulating processes excitement-contraction, so that this alteration is associated with increased to develop arterial disease leading to cardiovascular disorders. The purpose of this study was to determine the expression level of the BKCa channel in relative with PKC in aorta of diabetic rats by the Western Blot technique. Key words: Diabetes Mellitus; Western Blot; BKCa Channel, PKC

INTRODUCCIÓN La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica la cual se caracteriza por un trastorno de la utilización de la glucosa, ya sea por una carencia relativa o absoluta de insulina, ocasionando la generación de un estado hiperglucémico.1 En México se sabe que existe una prevalencia de 9.2% (6.4 millones) según la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición (ENSANUT) en 2012, y actualmente representa una de las principales causa de muerte en el país.2 Entre las principales complicaciones asociadas a este padecimiento se encuentra una mayor tendencia a desarrollar hipertensión, lo que puede

Con respecto a los grupos L:L s/t y L:L c/t nosotros esperábamos que la actividad neuronal en ambos puntos temporales se mantuviera igual (arritmico). Los resultados obtenidos para el grupo L:L s/t sí concordaron con nuestra hipótesis ya que los niveles de expresión para c-Fos se mantuvieron constantes tanto para ZT6 como para ZT18. Sin embargo, para el grupo L:L c/t no se observó esto ya que hubo una mayor y menor expresión de c-Fos en ZT6 y ZT18 respectivamente comportándose similar a los grupos sometidos a un fotoperiodo LD (Figura 5). Estos resultados se pueden deber a que el tumor está liberando diferentes sustancias como las citosinas o algun factor de crecimiento que pueden estar modificando la actividad neural del NSQ.

CONCLUSIONES En diversos trabajos se ha demostrado que diferentes protocolos de desincronización circadiana como la luz constante provocan arritmicidad en la actividad locomotora de los animales y en la actividad neuronal del NSQ. De manera interesante observamos que la presencia del tumor ejerce una influencia sobre la actividad del NSQ provocando un aumento en la actividad neuronal en ZT6. Esto es de gran interés ya que a pesar de que la actividad conductual se observa arrítmica, la actividad neuronal del NSQ presenta un patrón circadiano similar a su control. Para poder entender y explicar este evento serían necesarios más estudios.

BIBLIOGRAFIA CÁRDENAS-ROMERO, S., & SALGADO-DELGADO, R. (2016). La desincronización circadiana y su relación con el cáncer: interacción entre los genes reloj y genes que regulan el ciclo celular (tesis de maestría no publicada). Universidad Autónoma de San Luis Potosí. CARDINALI PD., JORDÁ CJJ., SÁNCHEZ, B. (1994). Introducción a la cronobiología: fisiología de los ritmos biológicos. Editorial Universidad de Cantabria V. Caja Cantabria. pp. 612.821. KLEIN, D. C., MOORE, R. Y., & REPPERT, S. M. (1991). Suprachiasmatic nucleus: The mind's clock. New York: Oxford University Press. MEIJER, R., WATNABE, K., SHCAAP, J., ALBUS, H. & DETARI, L. (1998). Light Responsiveness of the Suprachiasmatic Nucleus: Long-Term Multiunit and Single-Unit Recordings in Freely Moving Rats. The Journal of Neuroscience. 18(21):9078–9087. ROSAS, F., & SANTIAGO, J. (2010). Ritmos circadianos, genes reloj y cancer. iMedPub Journals, 6, 1-8.


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ya que de ser el caso la proteína se desnaturaliza; después de esto se centrifugo a 12000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ªC, y el sobrenadante (extracto proteico) fue transferido a otro tubo Eppendorf evitando pasar el pellet. 5.-CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: Con la finalidad de correr una concentración adecuada de proteínas en la electroforesis se realizo la cuantificación de proteínas por el método de Bradford siguiendo las instrucciones sugeridas por el fabricante (Biorad), para ello se realizo una curva de calibración utilizando el kit especializado para ello (Pierce, Rockford, 500-0204). Para esto se obtuvieron 7 estándares y 1 blanco (tabla. 1) utilizando como diluyente RIPA 1:10.

Tubo Volumen de estándar (μl)

Fuente de estándar

Volumen de diluyente (μl)

Concentración [Proteína] (μg/ml)

1 70 2 mg/ml stock 0 2000 2 75 2 mg/ml stock 25 1500 3 70 2 mg/ml stock 70 1000 4 35 Tubo 2 35 750 5 70 Tubo 3 70 500 6 70 Tubo 5 70 250 7 70 Tubo 6 70 125

8 (blanco) - - 70 0

Tabla. 1. Contenido de cada tubo para la realización de la Curva de Calibración; Estándares En el caso de las muestras primeramente fueron diluidas en una concentración 1:10. Se procedió a medir los estándares utilizando 20 μl de cada uno y se agrego un 1 ml del reactivo de Bradford en tubos de ensaye, se mezclaron con el vortex durante 5 segundos y se hizo la medición en el espectrofotómetro (SmartSpec 3000, Bio-Rad) a una longitud de onda de 595 nm, utilizando una celdilla de plástico la cual se limpio entre cada cambio de estándar, con el fin de obtener una curva de calibración con una r2 > 0.90, y en base a esto se midieron las muestras bajo las mismas condiciones que los estándares. 6.- DESNATURALIZACION DE PROTEINAS: el extracto proteico previamente descrito se diluyo 1:4 con buffer de carga el cual contiene β-mercaptoetanol y SDS, se mezclo con ayuda del vórtex y cada una de las muestras se llevaron a ebullición a 95°C por 5 minutos. 7.- ELECTROFORESIS DE PROTEINAS: En primer lugar se prepararon los geles de poliacrilamida SDS al 8% separador y concentrador, el gel separador se vacía en medio de los dos cristales del equipo de electroforesis y con ayuda de isopropanol se eliminan las burbujas y se revisa que el gel quede completamente horizontal. Una vez polimerizado se lava el gel separador con agua destilada y se añade el gel alineador, se coloca el peine para formar los pozos. Una vez polimerizados ambos geles se colocan en el modulo de corrimiento, y se paso al tanque de electroforesis el cual se lleno con buffer de corrida Gly/SDS 1x tanto en la parte de entre los geles como en la parte interior de la cámara cerrando el circuito para correr la electroforesis. Se cargaron 30 µl de las muestras (tabla. 2) en cada uno de los pozos y en el primer carril el marcador de peso molecular durante una hora con treinta minutos a 120 V.

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Muestra Marcador

de peso molecular

Aorta con

Vehículo

Aorta con LY333531

Aorta con

Vehículo

Aorta con LY333531

Aorta con

Vehículo

Aorta control

Aorta con

Vehículo

Aorta con

LY33353 Tabla 2. Contenido de cada carril de la electroforesis

llevar a padecer enfermedades cardiovasculares, como accidente cerebrovascular e infarto al miocardio, entre otros problemas. Es por esto que los procesos por los cuales se promueve la vasodilatación y vasoconstricción de vasos sanguíneos son de suma importancia, para lo cual se han propuesto diversos mecanismos operados por proteínas canales presentes en musculo liso vascular. Para que se lleve a cabo la contracción del musculo liso vascular se requiere un influjo de calcio mediado principalmente por canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo L (ICa) en la célula, que se abren en respuesta a la despolarización o bien por la liberación a partir de almacenamientos intracelulares como el retículo endoplásmico, este ion permite la interacción de los filamentos de actina y misiona a través de la activación de la cadena ligera de misiona cinasa(MLCK).3 Es así que los canales de K+ activados por Ca2+ de larga conductancia (BKCa) juegan un papel importante en la mantenimiento normal del tono vascular, ya que actúan como un mecanismo de retroalimentación para eliminar el exceso de actividad mecánica muscular, al ser activados en respuesta a altas concentraciones de calcio intracelulares y cambios en el potencial de membrana, ocasionando la hiperpolarización del potencial de membrana provocando que se cierren los canales de Ca2+ dependientes de voltaje, reduciendo la concentración de Ca2+ intracelular y conduciendo a la vasorelajacion.4.5 La actividad del canal BKCa se encuentra regulada por muchos factores como hormonas esteroideas, especies reactivas de oxigeno (ROS), monóxido de carbono (CO), monóxido de nitrógeno (NO), o bien por fosforolacion, esta ultima depende de proteínas cinasas especificas y puede conducir a alteraciones en la sensibilidad a voltaje y calcio. En general la función del canal BKCa es estimulada por la proteína quinasa A dependiente de AMPc(PKA) y la proteína quinasa G dependiente de GMPc (PKG) pero inhibida por la proteína quinasa C dependiente de Ca2+ y diacilglicerol(PKC).7.8 Debido a que en la diabetes la hiperglucemia se incrementa la síntesis de novo de diacilglicerol(DAG) a partir de intermediarios glicolíticos en particular de dihidroxiacetona fosfato(DHAP), PKC se activa y se cree que fosforila a los canales BKCa, ocasionando que se cierren y aumenten las concentraciones intracelulares de Ca2+ contribuyendo aun mas a la acción de esta proteína, induciendo un estado prolongado de despolarización en las células de musculo liso vascular (VSM) que conlleva a producir una acentuada vasoconstricción5.6, por lo que este mecanismo se piensa que es uno de los responsables de producir alteración vascular generando hipertensión; cabe destacar que no se ha descrito por completo una relación directa entre ambas proteínas por lo que el propósito de este trabajo es medir los niveles de expresión de la proteína BKCa en función a PKC en músculo liso vascular de aorta de ratas diabéticas mediante el uso de Western Blot.

METODOLOGÍA 1.-OBTENCIÓN DE RATAS DIABÉTICAS: Se utilizo como unidad experimental ratas de la cepa Wistar macho entre 200-220 gr de peso y se les indujo DM mediante la aplicación del agente oxidante para células β, Estreptozotocina (STZ). 2.-DISECCIÓN DE AORTA: Después de seis semanas se disecó la aorta; el tejido obtenido se limpio de tejido conectivo y endotelio, y fue colocado en solución fisiológica. 3.-ALMACENAMIENTO DE TEJIDO: Las muestras fueron incubadas con inhibidor de PKC (LY333531) o DMSO durante 30 minutos, pasado este tiempo se agregó RIPA 1X y se mezcló con inhibidores de proteasas y fosfatasas, y se almacenaron a -77°C. Al momento de su uso, se colocaron solamente en hielo para que se descongelaran. 4.- HOMOGENIZACIÓN Y OBTENCION DE PROTEÌNAS: por medio de ondas sonoras (sonicación) la aorta se homogenizo aplicando cinco ciclos de diez pulsos, cuidando que la muestra no se sobrecalentara


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75 kD 100 kD

150 kD

Figura 2. Detección de canal BKCa durante 1 hora de exposición. El recuadro rojo demuestra la

posición donde debieron haberse revelado las bandas correspondientes al canal BKCa

25 kD

37 kD

Figura 3. Detección de proteínas de bajo peso molecular con anticuerpo para BKCa

Se revelaron las proteínas de alto peso molecular sin encontrar bandas representativas al canal BKCa (figura. 2) por lo que se procedió a exponer el papel fotográfico en obscuridad durante más tiempo con el fin de tener una señal más fuerte de proteínas que permitiera visualizar las bandas. Así mismo se reveló por error las proteínas de bajo peso molecular (figura. 3) encontrando una fuerte señal a las proteínas presentes en este lado de la membrana lo cual indica que el anticuerpo primario era muy inespecífico pára el canal BKCa, ya que este solo debe de unirse a esta proteína irreversiblemente debido su interacción especifica con la subunidad α, por lo que no debió haber habido señal alguna para estas proteínas.

75 kD 100 kD 150 kD

Figura 4. Detección de canal BKCa durante 2 horas de exposición. El recuadro rojo demuestra la

posición donde debieron haberse revelado las bandas correspondientes al canal BKCa Dicho esto era de esperarse que a pesar de un tiempo más prolongado de exposición del papel fotográfico (figura. 4), no se detectaran bandas nuevamente.

25 kD

37 kD 50 kD

75 kD 100 kD 150 kD

Figura 5. Detección de las bandas control. El recuadro rojo demuestra la posición donde debieron

haberse revelado las bandas correspondientes a beta actina

8.- TRANSFERENCIA DE PROTEINAS: Se hidrato la membrana de PVDF para la transferencia con metanol durante 10 minutos en agitación; se desecho el gel concentrador y el gel sometido a la transferencia fue el gel separador, el sándwich de la cámara de transferencia fue colocado en el siguiente orden: papel filtro, membrana, gel y papel filtro, remojando cada uno de estos con buffer de transferencia Tris Gly 1x cada vez que se colocaban en la cámara. Con ayuda de un tubo de ensaye se removieron las burbujas que se pudieron haber formado y se corrió a 0.28 A durante una hora. Una vez finalizada la transferencia se desmonto el sándwich de la cámara de transferencia y se tiño el gel con azul de Comassie durante 24 horas para la detección de proteínas totales, y para el caso de la membrana esta se tiño con Rojo de Ponceu para verificar el proceso de transferencia 9.-DETECCIÓN: La membrana se incubo con solución bloqueadora elaborada buffer TBS-T(Tris 25 mM, NaCl 135, KCl 2.7 mM, y Tween 20 al 0.1 %, pH 7.4) más leche libre de ácidos grasos (Svelty) al 5%, durante 1 hora a 4 ªC y finalizada la incubación se lavó la membrana y se procedió a incubar con el anticuerpo primario dirigido contra la subunidad α de los canales BKCa a una concentración de 1:500 diluido en TBS-T más 2% de leche (Abcam, Cambridge, Ma.) durante toda la noche a 4° C en agitación. Posteriormente, la membrana se lavo durante 5 minutos con el buffer TBS-T 3 veces en agitación constante y se incubo con el anticuerpo secundario contra conejo conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000) (Abcam, Cambridge, Ma.) por 1 hora a temperatura ambiente posterior a la cual se realizaron otros 3 lavados con TBS-T. Se añadió a la membrana una solución de luminol y H2O2 (1:1) (Clarity Western ECL, Biorad) y después, en condiciones de obscuridad, se coloco dentro de dos acetatos en la placa de revelado y se expuso al papel fotográfico (CL-XPosure (TM) Film, Pierce Biotecnology) durante 1 y 2 horas. Enseguida el papel fotográfico se introdujo en solución reveladora, agua destilada, solución fijadora, y nuevamente en agua destilada durante aproximadamente 1 minuto en cada uno, se marco la banda de peso molecular en el papel fotográfico y se retiro la membrana de la placa de revelado. Con el fin de revelar la expresión de beta actina se incubo nuevamente la membrana con solución bloqueadora buffer TBS-T más leche libre de ácidos grasos al 2%, bajo las mismas condiciones previamente descritas, y se procedió a incubar la membrana con el anticuerpo primario policlonal de conejo a una concentración de 1:2000 diluido en TBS-T más 2% de leche, durante 4 horas en hielo en agitación. Se siguieron las mismas condiciones de detección por quimioluminiscencia solo que el papel fotográfico fue expuesto a condiciones de obscuridad en la placa de revelado durante 5 segundos.


Figura 1. Gel de acrilamida al 8% posterior a la transferencia teñido con azul Coomassie. El

recuadro rojo demuestra la posición de los marcadores de 100 y 150 Kd.

Debido al alto peso molecular del canal BKCa (131 kD) se utilizo un gel con un bajo porcentaje de poliacrilamida (8%), y se comprobó que las condiciones electroforéticas fueron adecuadas para el

corrimiento de proteínas, ya que como se muestra en el gel (figura. 1) se observan bandas tenues entre los marcadores de 100 y 150 kD.


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EXPRESIÓN DEL CANAL DE POTASIO DE ALTA CONDUCTANCIA ACTIVADO POR CALCIO EN MUSCULO LISO DE AORTA EN UN MODELO DE DIABETES EN RATA

Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; Facultad de Enfer-mería, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Niño Artillero No.130, C.P. 78290, San Luis

Potosí, S.L.P., México, [email protected]; [email protected]

Castillo Arriaga, K. N.; Hernández García, A. P.; Algara Suárez, P.

RESUMEN La diabetes mellitus es una enfermedad crónica presente cuando el páncreas no produce insulina suficiente o no la utiliza eficazmente. El efecto de la diabetes no controlada es la hiperglucemia, con el tiempo daña muchos órganos y sistemas, especialmente nervios y vasos sanguíneos, se presentan alteraciones a nivel de endotelio y musculo liso vascular. El calcio tiene un papel importante en la generación de la contracción del musculo liso, la entrada de Ca2+ se da a través de canales iónicos dependientes de voltaje, el Ca2+ activa la cinasa de la cadena ligera de miocina (MLCK) mediante la formación de un complejo calcio-calmodulina intensificando la contracción. La conductancia prolongada de Ca2+ activa los canales BKCa que dirigen la hiperpolarización restaurando el potencial de membrana. En el presente trabajo se identificó la expresión del canal BK, en musculo liso aórtico en ratas diabéticas, y se comparó con muestras de ratas sanas. Palabras clave: Diabetes mellitus, musculo liso vascular, canales BKCa

ABSTRACT Diabetes mellitus is a chronic disease present when the pancreas does not produce enough insulin or does not use it effectively. The effect of uncontrolled diabetes is hyperglycemia, eventually damages many organs and systems, especially the nerves and blood vessels, alterations occurs at the level of endothelium and vascular smooth muscle. Calcium plays an important role in the generation of the smooth muscle contraction; the Ca2+ influx occurs through voltage-dependent ion channels, Ca2+ activated myosin light-chain kinase (MLCK) by forming a calcium-calmodulin complex intensifying contraction. Prolonged conductance Ca2+ activates BKCa channels which direct the hyperpolarization to restore the membrane potential. We identify the presence of BKCa channels in aortic smooth muscle in diabetic rats and compared with samples of healthy rats. Keywords: Diabetes mellitus, vascular smooth muscle, BKCa channels

INTRODUCCIÓN Actualmente se estima que en el mundo hay más de 347 millones de personas con diabetes. De acuerdo con la Federación Internacional de Diabetes, China, India, Estados Unidos, Brasil, Rusia y México, son –en ese orden– los países con mayor número de diabéticos. Del total de la población de adultos en México,

Para el caso de la detección de las bandas control tampoco se detecto señal entre los marcadores de 50 y 75kD, sugiriendo en este caso que el bloqueo de la membrana se realizo a una cantidad de solución muy baja de leche, por lo que el anticuerpo primario dirigido contra beta actina (51 kD) estaba reconociendo sitios de unión no específicos, además de que este al ser un anticuerpo policlonal reconocerá múltiples epitomes de diversas proteínas presentes en la membrana causando ruido a la hora de la detección, otra cosa que cabe señalar es que la incubación realizada con este solo se realizo utilizando hielo sin tener una temperatura fija por lo que el anticuerpo pudo haberse desnaturalizado.

CONCLUSIONES A causa de la inespecifidad que presento el anticuerpo primario dirigido contra el canal BKCa, no se logro demostrar una relación directa entre esta proteína y PKC siendo el objetivo principal de este estudio pero de haber sido el caso se esperaría que las bandas de muestra de aorta con vehículo tuvieran una menor intensidad que las que tienen el inhibidor de PKC (LY333531), debido a que en el primer caso al haberse inducido diabetes en las ratas ocasiona que los niveles de PKC aumentan, reduciendo los niveles de expresión del canal BKCa encontrando una relación directa entre ambas proteínas, y para la caso de las bandas control estas debieron haberse mostrado con la misma intensidad en todos los carriles ya que en condiciones de diabetes la expresión de beta actina no está alterada.

BIBLIOGRAFÍA 1. F. J. TÈBAR MASSÓ, F. ESCOBAR JIMÉNEZ. (2009). La Diabetes Mellitus en la Práctica

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Se cuantificaron las proteínas presentes mediante el método de Bradford, utilizando el kit (Pierce, Rockford, 500-0204) primero se realizó una curva de calibración a partir del estándar de 2 mg/ml del kit diluido con RIPA 1:10. Las muestras obtenidas se desnaturalizaron con β-mercaptoetanol contenido en el buffer de carga y llevando a ebullición a 95°C aproximadamente durante 5 minutos. Se procedió a separar las proteínas presentes mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS al 8%. Teniendo 10 carriles en el gel, se colocaron las muestras y el marcador de la siguiente manera; 1 marcador de peso molecular; 2, 4, 6 y 8 muestra de ratas sanas, 3, 5, 7 y 9 correspondieron a muestra de ratas diabéticas, en el pozo 10 no se colocó muestra. El corrimiento se llevó a cabo a 120V durante 1 h 45 min. Las proteínas se transfirieron mediante Western blot del gel de poliacrilamida a una membrana PVDF la cual se activó con 5 ml de metanol previo a la transferencia. Al finalizar la transferencia la membrana se incubó con solución bloqueadora buffer TBS-T (Tris 25 mM, NaCl 135, KCl 2.7 mM, y Tween 20 al 0.1 %, pH 7.4) con leche libre de ácidos grasos (Svelty) al 5% durante 1 h. Posteriormente se lavó la membrana y se incubo con anticuerpo primario contra la subunidad α de los canales BKCa a una concentración final de 1:500 en TBS-T más 2% de leche (Abcam, Cambridge, Ma.) durante toda la noche en agitación y temperatura constante (4ºC). Después del periodo de incubación se procedió a lavar con solución TBS-T tres lavados, cada lavado de 10 mL durante 5 minutos cada uno. La segunda incubación se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (contra conejo conjugado con peroxidasa de rabano) diluido 1:5000 a temperatura ambiente. Al finalizar la incubación se realizaron nuevamente los tres lavados con solución TBS-T y se revelaron las bandas mediante el kit de quimioluminiscencia (Bio-Rad) exponiéndolas a placas fotográficas especializadas. (Thermo Fisher Sci. Inc., Rockford, Il). Las bandas fueron normalizadas a la expresión de beta-actina (anticuerpo policlonal de conejo, Abcam 1/2000).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La transferencia de las proteínas del gel a la membrana se llevó a cabo adecuadamente ya que las bandas presentes en el gel teñido con azul de coomassie se observaron con una coloración de menor intensidad que antes de la transferencia. Otros indicativos de que la transferencia de proteínas fue adecuada fue la observación de las bandas del marcador de peso molecular en la membrana PVDF después de la transferencia (figura 1) y al añadir solución de Rojo Ponceau se observaron las bandas nuevamente. A)

B)

Figura 1. A) Gel de poliacrilamida teñido con azul de coomassie después de la transferencia. Se observan bandas tenues en la región de alto peso.

B) Membrana PVDF después de la transferencia. Se observan las bandas del estándar o marcador de peso molecular indicativo de que se llevó a cabo la transferencia adecuadamente.

9.17% reportó tener un diagnóstico previo de diabetes por un médico, lo que equivale a 6.4 millones de personas. El desafío para la sociedad y los sistemas de salud es enorme, debido al costo económico y la pérdida de calidad de vida para quienes padecen diabetes y sus familias, así como por los importantes recursos que requieren en el sistema público de salud para su atención3. La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica que aparece cuando el páncreas no produce insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina que produce. El efecto de la diabetes no controlada es la hiperglucemia, que con el tiempo daña gravemente muchos órganos y sistemas, especialmente los nervios y los vasos sanguíneos. Las complicaciones de la diabetes pueden ser microvasculares y macrovasculares tales como las enfermedades cardiovasculares (1,2). Cada tipo de musculo liso que posee el cuerpo humano tiene propiedades funcionales diferentes, como la velocidad de contracción, fatigabilidad, rigidez, consumo de energía, duración de la contracción y varios efectos mecánicos; dichas diferencias derivan de la distribución de los canales y receptores en la membrana celular1. El calcio tiene un papel importante en la generación de la contracción muscular, los recursos disponibles de Ca2+ por señalización citoplasmática de células de musculo liso incluyen entrada de Ca2+ a través de canales iónicos (tipo L dependientes de voltaje) regulado por una ATPasa localizados en la membrana plasmática, y Ca2+ liberado de compartimientos intracelulares mediado por dos tipos de canales iónicos permeables a Ca2+ localizados en el retículo sarcoplasmático, receptores de Rianodina y receptores de IP34. La contracción de la célula de músculo liso vascular (CMLV) es controlada principalmente por la fosforilación de la cadena ligera de miosina, la cual, en el estado de equilibrio, depende del equilibrio entre las acciones de la cinasa de cadena ligera de miosina (MLCK) y la fosfatasa de la cadena ligera de miosina (MLCP). El calcio activa la MLCK a través de la formación de un complejo calcio-calmodulina. La fosforilación de la cadena ligera de la miosina por acción de esta cinasa aumenta la actividad de ATP-asa de la miosina e intensifica la contracción. La MLCP desfosforila la cadena ligera de la misma, disminuyendo la actividad de la ATPasa de miosina y la fuerza contráctil. La fosforilación de la subunidad fijadora de miosina (thr695) de la fosfatasa de la cadena ligera de miosina por la cinasa de Rho inhibe la actividad de la fosfatasa y desencadena la sensibilización al calcio del aparato contráctil9. Otro de los efectos de la liberación de Ca2+ es la activación de canales de K+ (canales BKCa y SK) por conductancia prolongada de Ca2+ que dirigen la hiperpolarización para restaurar el potencial de membrana. La ausencia o disfunción del canal BKCa podría desencadenar problemas cardiovasculares tal como la hipertensión al no conseguir llegar al potencial de membrana en (entre -40 y -80mV) y por tanto se mantiene la contracción provocando un incremento de la resistencia vascular periférica y por consiguiente de la presión arterial. El canal BK es un tetrámero con siente dominios transmembrana (S0-S6) 5,6 está formado por una subunidad α y una subunidad β regulatoria, la subunidad alfa con seis dominios transmembrana forma el poro, es expresada por un solo gen. La subunidad β tiene la mayor sensibilidad a Ca2+. Se conocen cuatro isoformas cada una con dos dominios transmembrana de estas la subunidad β1 es la más común en musculo liso vascular7. Los daños que se presentan como consecuencia de la DM como ya se mencionó pueden llegar a ser sumamente graves y complicados, por esto en el presente trabajo se busca identificar variaciones en la expresión del canal BKCa en musculo liso de aorta de ratas diabéticas y sanas mediante la técnica Western Blot con la finalidad de establecer su influencia en la restauración de potencial de acción en la contracción de dicho tejido.

METODOLOGÍA

El tejido utilizado fue musculo liso de aorta obtenido de un modelo de ratas wistar diabéticas (n=4) inducidas mediante la inyección de Estreptozotocina en la vena lateral de la cola y de ratas sanas (n=4). Al tejido obtenido se le retiro el endotelio y se procedió a la homogenización de las muestras mediante ondas sonoras (sonicación).


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CONCLUSIONES

La intensidad de las bandas se del canal BKCa se vieron disminuidas en las muestras de ratas diabéticas respecto a lo observado en las muestras de ratas sanas. El protocolo de inducción de DM podría tener mejores resultados con 6 semanas, sin embargo se debe tomar en cuenta que cada organismo reacciona de diferente forma a ciertos fármacos por esto también podrían realizarse mediciones a diferentes periodos de tiempo para verificar que existe variación en la expresión y en cuanto tiempo esta es evidente. Si bien se observó el efecto esperado, es necesario realizar más experimentos utilizando un modelo estadístico para la obtención de resultados contundentes ya que podría tratarse de una diana terapéutica en el tratamiento de complicaciones asociadas a diabetes mellitus o bien otras afecciones en las cuales intervenga el canal BKCa. Es importante considerar procesos involucrados en el funcionamiento del canal tal como vías de señalización que lo activan (Por ejemplo: PKC) ya que esto puede ser determinante del grado de daño que tenga el tejido. Se pueden realizar estudios de tensión con el musculo liso de aorta en el mismo modelo de ratas para determinar si existen alteraciones en la contractilidad, la cual podría deberse a una menor cantidad de canales en la célula de musculo liso, por tanto no se lleva a cabo la entrada de K+ necesario para la restauración del potencial de membrana.

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En la placa fotográfica revelada se observa en casi todas las muestras la banda correspondiente al canal BKCa (figura 2). En el grupo de ratas sanas se pudo observar que la intensidad de las bandas se mantuvo constante en cambio para el grupo de ratas diabéticas se observó una disminución en la intensidad de las bandas en la muestra 3 y 9, y la ausencia de la banda en las muestras 5 y 7 lo cual es indicativo de la posible disminución en la expresión del canal BKCa en musculo liso de aorta en las ratas diabéticas, sin embargo dicho resultado no se pudo corroborar al no obtenerse las bandas para beta-actina. Es importante mencionar que la muestra del carril 3 correspondía a una rata con 4 semanas de DM y las demás muestras correspondían a ratas con 6 semanas de DM por tanto puede ser necesario que los modelos de inducción de DM sean de 6 semanas para poder determinar con mayor exactitud el nivel de expresión del canal BKCa

Figura 2. Western blot de la subunidad α del canal BKCa. En la región de alto peso molecular entre los marcadores de 100 kD y 150 kD se observan

bandas que podrían corresponder al canal (131 kD aproximadamente). Las bandas del carril 1 corresponden al marcador de peso molecular, el carril 2, 4, 6 y 8 corresponden a muestra de ratas sanas. Los carriles 3, 5, 7 y 9 son muestras de ratas diabéticas, señalando que la

muestra del carril 3 corresponde a una rata con 4 semanas de DM y las demás a 6 semanas con DM.

Además de la banda que corresponde al canal se observan otras bandas, estas pudieron deberse a que el anticuerpo presento inespecificidad y/o bien que el bloqueo de la membrana realizado antes de las incubaciones con los anticuerpos, no se llevó a cabo adecuadamente quizá la cantidad de leche utilizada no fue suficiente para bloquear totalmente los sitios de unión de la membrana por tanto el anticuerpo primario y/o secundario pudo anclarse y dar señal al momento del revelado. En el caso de la normalización de las bandas con beta-actina, el resultado no fue favorable ya que la unión con el anticuerpo primario no fue la adecuada afectando a su vez la unión con el anticuerpo secundario y el revelado, no se logró observar las bandas en la placa fotográfica, esto pudo deberse a que el bloqueo de la membrana no fue eficiente, se requiere una mayor cantidad de leche para el bloqueo de todos los sitios libres y/o por la temperatura de incubación del anticuerpo primario ya que tuvo ciertas variaciones, debido a fallas del equipo no se pudo mantener a 4ºC.


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MICROPROPAGACIÓN DE STANHOPEA TIGRINA BATEMAN, ORQUÍDEA MEXICANA EN PELIGRO DE EXTINCIÓN

Y CATTLEYA SP. ORQUÍDEA HÍBRIDO DE INTERÉS COMERCIAL

1Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de Febrero No. 818 Sur, C.P. 85000, Cd. Obregón, Sonora, Méxi-co; [email protected]; 2Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Au-tónoma de San Luis Potosí, Romualdo del Campo No. 501, Rafael Curiel, C.P. 79060, Cd. Valles,

S.L.P. , México, [email protected]; [email protected]; [email protected]

Choza Farías, S.1; Carranza Álvarez, C.2; Benavides Hernández, D. M.2; Castillo Pérez, L. J.2

RESUMEN Stanhopea tigrina Bateman, es una orquídea endémica de México y con importante distribución en la Huasteca Potosina, actualmente se encuentra en peligro de extinción de acuerdo a la NOM-059-SEMARNAT-2010, en tanto que las orquídeas del género Cattleya son uno de los híbridos más comercializados a nivel mundial, por ello, es importante implementar técnicas de propagación masiva como la micropropagación para dichas especies. El objetivo de esta investigación fue analizar el efecto de diferentes extractos orgánicos (agua de coco, puré de manzana y puré de plátano) y de la hormona bencilaminopurina (BAP) en la respuesta morfogenética de las orquídeas Stanhopea tigrina Bateman y Cattleya sp. Las plántulas se evaluaron durante 30 días para determinar el porcentaje de contaminación y oxidación, además del número y altura de los brotes formados de cada especie. Los resultados mostraron un efecto benéfico por la adición de sustratos naturales en la morfogénesis de ambas especies vegetales. Palabras clave: orquídeas, conservación, propagación.

ABSTRACT

Stanhopea tigrina Bateman, is an endemic orchid of Mexico and important distribution in the Huasteca Potosina, is currently in danger of extinction according to the NOM-059-SEMARNAT-2010, while orchids of the genus Cattleya are classified as one of more hybrids sold worldwide, for this reason it is important to implement mass propagation techniques for these species. The plant tissue culture is a biotechnological alternative for the propagation of orchids, it applied for conservation or commercial interest. The objective of this research was to analyze the effect of different organic extracts (coconut water, applesauce and mashed banana) and hormone benzylaminopurine (BAP) in the morphogenetic response of Stanhopea tigrina Bateman and one hybrid of Cattleya sp. orchids. The seedlings were evaluated for 30 days to determine the percentage of contamination and oxidation , in addition the number and height of shoots formed from each species. The results showed a beneficial effect by the addition of natural substrates in the morphogenesis of both plant species. Keywords: orchids, conservation, propagation

INTRODUCCIÓN Las orquídeas forman una de las más grandes familias del reino vegetal, se estima que existen alrededor de 30 mil especies en todo el mundo, divididas en aproximadamente 1000 géneros. Son consideraras

(8) Hernández García, A. (2016). Caracterización del canal de potasio de alta conductancia

activado por calcio (BKca) en tejido vascular de un modelo de hiperglucemia en rata (Tesis de licenciatura en revisión). Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Facultad de Enfermería.

(9) HARRISON PRINCIPIOS DE MEDICINA INTERNA Volumen2. (2012) (18th ed., pp. 1798-1802). México.


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de hipoclorito de sodio al 10%, 3) se llevó acabo un enjuague con agua corriente y 4) los frascos fueron sometidos a un proceso de secado en la estufa de convección LINDBERG/BLUE a 200º C durante 1 hora. Los frascos con medio de cultivo y el material utilizado para la resiembra del material vegetativo (pinzas, vaso de precipitado y cajas Petri) fueron esterilizados en la autoclave FELISA por 45 minutos a 15 lb pulg2 y 121ºC. Preparación de los medio de cultivo Se utilizó como medio de cultivo el medio MS comercial (Murashige y Skoog, 1962) (Phyto-Technology) para lo cual se disolvieron 4.43 g/L de las sales del medio y se añadieron 30 g/L de sacarosa comercial, 3 g/L de carbón activado y 8 g/L de agar Plant TC como gelificante, se enriquecieron con extractos orgánicos (puré de manzana: PM; puré de plátano: PP; agua de coco: AC; todos al 10% v/v) y diferentes concentraciones de la fitohormona sintética BAP (5 y 10 ppm). El pH se ajustó a 5.6-5.8 con NaOH o HCl 1 N. Evaluaciones y condiciones de cultivo Todos los cultivos fueron colocados en el cuarto de cultivo con una intensidad lumínica de 40 mmol m-2s-1 generados con lámparas fluorescentes, de luz blanca, con un con fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad a una temperatura de 25 ± 2 °C y una humedad relativa de 70%. Se evaluó el porcentaje de contaminación y oxidación, el número de brotes y la altura de las plantas durante dos periodos de 15 días cada uno, de acuerdo a los parámetros establecidos en el CTV. Análisis estadístico e interpretación de resultados Se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Los datos fueron sometidos a una prueba de ANOVA, pruebas de t de Student y a un análisis estadístico de Tukey. Los valores con una p ≤ 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Se utilizaron los Software Statistica 8.0 y Sigma Plot 11.0 para la generación de las gráficas comparativas y la posterior interpretación de los datos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Porcentaje de oxidación y contaminación de los cultivos in vitro, después de 30 días de cultivo Durante 30 días de cultivo in vitro de las orquídeas en estudio, se presentó un bajo porcentaje de oxidación en general (Tabla 1), con excepción de los tratamientos con BAP 5 en Stanhopea tigrina (75%) y puré de manzana en Cattleya sp. (50%), sin embargo la oxidación presentada en todas las unidades experimentales fueron de tipo I (+), es decir, que la oxidación comenzaba a ocurrir, y probablemente procedía de la manipulación a las que estuvieron sujetas las plántulas durante su resiembra. Una manera de solucionar dicho problema es resembrando el material vegetativo y eliminando las plántulas oxidadas. La oxidación es uno de los problemas más comunes en el CTV, dicho proceso, es debido a una mayor actividad de la enzima polifenol oxidasa (Guerrero, 2009), la cual aumentan su actividad por el daño mecánico que sufren los explantes durante la siembra en el medio de cultivo. Dicha enzima, oxida los compuestos fenólicos y forma la sustancia que confiere el color oscuro a los tejidos vegetales, denominada melanina (Urán y Cano, 2008).

cosmopolitas ya que pueden crecer en cualquier tipo de ecosistema, con excepción de las zonas polares y los desiertos extremos (Hágsater et al., 2015). Aunado a las especies silvestres o naturales, se han creado miles de híbridos con fines comerciales, los cuales producen ganancias millonarias cada año a las empresas hortícolas en todo el mundo. Se estima que los costos de las orquídeas híbridas comerciales en México oscilan desde los $300.00 hasta los $2000.00, dependiendo de la especie. Las especies más comercializadas de orquídeas hibrido son las Phalaenopsis, Dendrobium y Cattleyas (Eccardi y Becerra, 2003). Sin embargo y de manera lamentable, no solo las especies hibridas legales se comercializan. Actualmente en México y otros países de América Latina, existen amplias redes de tráfico ilegal de especies vegetales y la familia Orchidaceae se localiza entre las principales especies de flora con las que se trafica, solo superadas por las cactáceas (Alvarado, 2012). Aunado a este problema, otras situaciones de carácter antropogénico como la tala ilegal, el cambio de usos de suelo y los incendios forestales, han colocado a 189 especies de orquídeas mexicanas en alguna categoría de riesgo y a una especie, Laelia gouldiana extinta por completo de la naturaleza. (SEMARNAT, 2010). Stanhopea tigrina Bateman es una de las orquídeas más representativas de México, y con amplia distribución en climas tropicales. S. tigrina es una planta mediana, epifita o litófita de unos 50 cm de alto, con pseudobulbos globosos y una sola hoja terminal. Produce una inflorescencia con una o dos flores de hasta 15 cm de diámetro color marfil con manchas color vino y con fuerte aroma a chocolate. La descripción de esta especie fue realizada en 1838 a partir de un ejemplar colectado en los alrededores de Xalapa, Veracruz México. Sin embargo la alteración y destrucción de los hábitats naturales, su escasa y compleja germinación simbiótica, la baja tasa de repoblación, así como el saqueo indiscriminado de ejemplares silvestres para su comercialización ha puesto a esta especie en el grado de amenazada (Moreno y Menchaca, 2007). Una de las alternativas para la propagación masiva de plantas vulnerables o de interés comercial es el Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV). El CTV es el conjunto de técnicas diseñadas para la multiplicación de células, tejidos u órganos en condiciones asépticas, en medios de cultivo sintéticos y en condiciones ambientales controladas (Roca y Mroginski, 1991). Una de las variantes dentro del CTV, es la adición de compuestos orgánicos al medio de cultivo basal (Hicks, 2004). Entre los más utilizados en la micropropagación de orquídeas destacan el puré de plátano, de tomate, de manzana y el agua de coco debido al alto contenido de azúcares, aminoácidos, antioxidantes, minerales, ácidos orgánicos y agentes promotores del crecimiento que contienen (Arditti, 1993). En la presente investigación se evaluaron diferentes tratamientos suplementados con extractos orgánicos (puré de manzana al 10%, puré de plátano al 10% y agua de coco al 10%), y se compararon con el efecto de diferentes concentraciones de BAP (5 y 10 ppm) en la morfogénesis de las plántulas de Stanhopea tigrina y Cattleya sp.

METODOLOGÍA Material vegetal Se utilizaron como explante, plántulas de Stanhopea tigrina Bateman y un híbrido de Cattleya sp. denominado como “Híbrido 3”, germinadas previamente en condiciones in vitro en el año 2015, y conservadas en el cuarto de cultivo del Laboratorio de Ciencias Ambientales de la U.A.S.L.P.-U.A.M.Z.H. bajo condiciones controladas. Esterilización Todos los materiales utilizados durante la presente investigación fueron previamente esterilizados. Los frascos de cristal tipo “Gerber” se sometieron a un proceso de asepsia, el cual se llevó a cabo de la siguiente manera: 1) se lavaron con agua corriente y jabón comercial, 2) se sumergieron en una solución


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Núm

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rote

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a aa a

a

AC PM PP BAP 5 BAP 10

P < 0.05

TRATAMIENTOS

Figura 1. Número de brotes de S. tigrina después de 30 días de cultivo in vitro.

Altu

ra (c

m)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

a

bbc

ab

ab

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AC PM PP BAP 5 BAP 10 TRATAMIENTOS

Figura 2. Altura de brotes de S. tigrina después de 30 días de cultivo in vitro.

Efecto de los extractos orgánicos y BAP sobre el número y altura de brotes de Cattleya sp. después de 30 días de cultivo in vitro La Figura 3 muestra que después de 30 días de cultivo in vitro el tratamiento que produjo el mayor número de brotes fue el medio MS enriquecido con 5 mg/L de BAP, desarrollando en promedio 3.60 ± 0.28 brotes. Sin embargo, no se presentaron diferencias estadísticamente significativas en comparación con el resto de los tratamientos, lo que sugiere que todos produjeron el mismo efecto. Estos resultados concuerdan con los obtenidos para la especie Stanhopea tigrina durante este mismo experimento, lo que apoya la hipótesis de que las plántulas probablemente necesiten más tiempo a exposición en los diferentes medios de cultivo para poder lograr alguna diferencia estadísticamente significativa. En cuanto a la altura de los brotes de Cattleya sp., se puede observar en la Figura 4 que el mejor tratamiento fue el PM (puré de manzana al 10%) desarrollando plántulas de hasta 3.10 cm, dicho tratamiento mostró diferencias estadísticamente significativas contra todos los demás posicionándose como el mejor tratamiento para la inducción de elongación de brotes. Los tratamientos AC (agua de coco al 10%), BAP 5 y BAP 10, formaron de 1.55± 0.07 cm, 1.45± 0.07 cm y 1.35± 0.07 cm, respectivamente sin mostrar diferencias estadísticamente significativas entre ellos.

Tabla 1. Porcentaje de oxidación y contaminación en plántulas de Stanhopea tigrina y Cattleya sp. después de 30 días de cultivo in vitro

*Tratamientos: AC=agua de coco; PM=puré de manzana; PP=puré de plátano BAP5= BAP 5 ppm; BAP10=BAP10 ppm

La contaminación no ocurrió en ninguna de las unidades experimentales evaluadas en este proyecto para ningún tratamiento, lo que sugiere que los procesos de asepsia utilizados durante la presente investigación fueron satisfactorios (Tabla 1). Lo anterior, es de suma importancia, ya que la contaminación microbiana es el principal obstáculo para establecer protocolos de micropropagación por cultivo de tejidos vegetales. Los principales microorganismos que colonizan los medios de cultivo son los hongos, las levaduras y las bacterias, esto debido a que los medios de cultivo que se utilizan contienen todos los nutrientes necesarios para hospedar a dichos organismos. Efecto de los extractos orgánicos y BAP sobre el número y altura de brotes de Stanhopea tigrina después de 30 días de cultivo in vitro. En la Figura 1 se presentan los resultados de las evaluaciones realizadas en cuanto al número y altura de los brotes de las orquídeas en estudio después de 30 días de cultivo in vitro. Los resultados demuestran que se produjeron en promedio 1.25 ± 0.35 brotes en todos los tratamientos, a excepción del tratamiento con BAP 10, en el cual se produjeron 1.15± 0.21 brotes, sin embargo no se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los tratamientos, lo que sugiere que todos los tratamientos produjeron el mismo efecto, y que podrían utilizarse cualquiera de los suplementos orgánicos en la multiplicación de esta especie para reducir los costos de la micropropagación. En cuanto a la altura de los brotes de Stanhopea tigrina, se puede observar en la Figura 2 que el mejor tratamiento fue el AC (agua de coco al 10%) desarrollando plántulas de hasta 2.65 ± 0.35 cm, aunque dicho tratamiento no mostró diferencias estadísticamente significativas contra los tratamientos PP (puré de plátano) y BAP 5, los cuales fueron los siguientes en cuanto al efecto sobre la altura de los brotes alcanzando longitudes de 2.10 ± 0.14 cm y 1.85 ± 0.07 cm, respectivamente. El tratamiento que indujo la menor longitud en las plántulas fue el tratamiento PM (puré de manzana) en el cual los brotes alcanzaron una altura de apenas 1.35 ± 0.07 cm.

0 Hongos Bacterias LevadurasAC 67% 33% 0% 0% 0% 0% 0%PM 67% 33% 0% 0% 0% 0% 0%PP 67% 33% 0% 0% 0% 0% 0%

BAP 5 25% 75% 0% 0% 0% 0% 0%BAP 10 67% 33% 0% 0% 0% 0% 0%

PC 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0%PM 50% 50% 0% 0% 0% 0% 0%PP 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

BAP 5 95% 5% 0% 0% 0% 0% 0%BAP 10 67% 33% 0% 0% 0% 0% 0%

Especie Tratamientos*

Stanhopea tigrina

Cattleya sp.

ContaminaciónOxidacion+ ++ +++


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manzana al 10%. Estos resultados sugieren que los costos de la micropropagación para estas orquídeas se pueden reducir al sustituir el uso de reguladores de crecimiento sintéticos por sustratos naturales de bajo costo.

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Núm

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a

a

a

a

a

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AC PM PP BAP 5 BAP 10 TRATAMIENTOS

Figura 3. Número de brotes de Cattleya sp. después de

30 días de cultivo in vitro.

Altu

ra (c

m)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

a

b

cbc bc

AC PM BAP 5PP BAP 10

P < 0.05

TRATAMIENTOS

Figura 4. Altura de brotes de Cattleya sp. después de 30 días de cultivo in vitro.

En la Figura 5, se presenta la apariencia de los brotes de Stanhopea tigrina y Cattleya sp. en los diferentes tratamientos evaluados durante este proyecto de investigación.

Figura 5. Apariencia de los brotes de Stanhopea tigrina y Cattleya sp. “Híbrido 3” en los diferentes tratamientos probados.

CONCLUSIÓN

Se logró establecer un protocolo de micropropagación a base de sustratos naturales y fitohormonas sintéticas con el 100% de asepsia en todos los tratamientos evaluados. En cuanto al efecto de los sustratos sobre la morfogénesis, se obtuvo que para la especie S. tigrina no hubo diferencias estadísticamente significativas en cuanto al número de brotes y la altura de las plantas formadas en todos los tratamientos evaluados, mientras que para el híbrido de Cattleya sp. se presentó un mayor número de brotes en los tratamientos con 5 mg/L de BAP, y brotes de mayor altura en los medios enriquecidos con puré de

Stanhopea tigrina AC PM PP BAP 5 BAP 10

Cattleya sp. “Híbrido 3” AC PM PP BAP 5 BAP 10


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Uno de estos sorprendentes materiales son los llamados fullerenos, que consiste en una jaula más o menos esférica de 60 átomos de carbono dispuestos en hexágonos y pentágonos entrelazados (C60). Desde su descubrimiento en 1985, el C60 ha capturado una gran atención como consecuencia de su composición química única y sus propiedades físicas. Los fullerenos no son muy reactivos debido a la estabilidad de los enlaces tipo grafito, y son también muy poco solubles en la mayoría de disolventes. Entre los disolventes comunes para los fullerenos se incluyen el tolueno y el disulfuro de carbono. El fullereno es la única forma alotrópica del carbono que puede ser disuelta. Una de las características a destacar es que el fullereno puede resultar peligroso para diversos organismos, por lo que actualmente se utiliza, aunque con extremo cuidado. Los fullerenos son, en general, altamente inestables en aplicaciones prácticas debido a su insolubilidad y extrema sensibilidad al aire. Sin embargo, nuevos procedimientos han sido desarrollados para solubilizar y proteger estos compuestos de carbono mediante la realización de la funcionalización de su superficie con una variedad de moléculas además de que se ha comprobado que su reactividad aumenta uniendo grupos activos a las superficies de los fullerenos, abriendo nuevas oportunidades para potenciales aplicaciones en la ciencia biomédica y los nanomateriales. Uno de los adsorbatos son grupos funcionales que contienen azufre, tales como tioles o disulfuro que se utilizan para unir selectivamente moléculas orgánicas multifuncionales grandes o nanopartículas metálicas a fullerenos C60 y nanotubos de carbono. La unión tiol para el material de carbono se hace a través de especies de nitrógeno, de átomos metálicos, o estructuras en forma de anillo, mientras que el átomo de S está siempre apuntando hacia el exterior, que se utilizan normalmente para procedimientos posteriores de funcionalización. Se pretende hacer varias configuraciones de adsorbatos que contienen azufre funcionalizados con el fullereno C60 con el fin de conocer los isómeros relevantes para en un futuro estudiar los efectos térmicos y determinar si con un aumento de la Temperatura son igual de estables o si podría existir algún cambio. Además del fullereno C60 existen una gran variedad de fullerenos en los que cabe destacar el C20 que es el fullereno más pequeño y el C960 que es el más grande. Además del C60 hablaremos del C82 que tiene varios isómeros pero que nos enfocaremos en el C82-cs pues han sido reportados resultados afines a los aquí buscados.

METODOLOGÍA Las propiedades estructurales y electrónicas neutrales de nuestra molécula se obtendrán dentro del enfoque DFT usando la aproximación del pseudopotencial para la interacción de electrones y de iones en una base de ondas planas, fijando para las funciones de onda con el uso del código PWscf que resuelven las ecuaciones de Kohn y Sham. Para todas nuestras estructuras consideradas, la energía de corte para la expansión de ondas planas se toma como 408.17 eV y la energía de corte de la densidad es de 2993.25 eV, cabe mencionar que el valor de la energía de corte de la densidad oscila en un intervalo de 6 a 8 veces el valor de la energía de corte. Se empleó para los cálculos una supercelda cúbica con una dimensión lateral tan grande como 35 Å y sólo el punto Γ para la integración en la primera Zona de Brillouin (ZB). En todos los casos, se utiliza el pseudopotencial Perdew-Burke-Ernzerhof (PBE) porque ha arrojado buenos resultados y las optimizaciones estructurales se realizaron sin restricciones para todos los isómeros considerados. El criterio para la convergencia en la energía se estableció como 10-6 y la optimización estructural se realizó hasta que un valor inferior a 1 meV/Å fue alcanzado por las fuerzas restantes para cada átomo. Se utilizaron los visualizadores Avogadro y Jmol para obtener las figuras de las moléculas optimizadas. Cabe mencionar que es un método de primeros principios por lo que los resultados son a T=0, donde T es la temperatura.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la determinación de los isómeros más estables en fullerenos funcionalizados con grupos SCH3 se comparó la energía en eV además se observó la longitud de los diferentes enlaces y el valor del gap HOMO-LUMO. Para poder corroborar que las estructuras optimizadas del C60 con los SCH3 adsorbidos

USO DE LA TEORÍA DEL FUNCIONAL DE LA DENSIDAD PARA DETERMINAR LOS ISÓMEROS DE MÍNIMA ENERGÍA EN FULLERENOS FUNCIONALIZADOS CON GRUPOS SCH3

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Salvador Nava No. 6, 78260 San Luis Potosí, México; 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Salvador Nava S/N, 78260 San Luis Potosí, México, [email protected];

[email protected]

Contreras Andrade, S.1; Chavira Quintero, R.2

RESUMEN Los fullerenos son altamente inestables en aplicaciones prácticas por lo que se han desarrollado procedimientos para proteger y solubilizar estos compuestos de carbono mediante la funcionalización de su superficie con una gran variedad de moléculas. El fullereno C60 funcionalizado con adsorbatos SCH3 se optimizó con el fin de encontrar la estructura más estable, es decir, la configuración de mínima energía. Para encontrar la energía de las moléculas optimizadas se empleó un enfoque DFT usando la aproximación del pseudopotencial para la interacción de electrones en una base de ondas planas que resuelven las ecuaciones de Kohn y Sham. Las estructuras más estables del C60 para tres adsorbatos es cuando están opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal, mientras que para dos adsorbatos la más estable es cuando están adyacentes. Las diferencias de energía entre las diferentes estructuras optimizadas varían considerablemente debido al software utilizado por lo que es importante nombrarlo.

ABSTRACT Fullerenes are highly unstable in practical applications so methods have been developed to protect and solubilize these carbon compounds by functionalization of its surface with a variety of molecules. Fullerene C60 is functionalized adsorbates SCH3 optimized in order to find the stablest structure, ie, the minimum energy configuration. To find the energy of a DFT approach molecules optimized using the pseudopotential approach for interaction of electrons in a base plane wave that solve equations Kohn and Sham was used. The stablest structures for three adsorbates is C60 when opposite on a hexagonal carbon chain, whereas for two adsorbates is the most stable when they are adjacent. The energy differences between different optimized structures vary considerably due to the software used by naming what is important. Palabras clave: Fullerenos, adsorbatos, ondas planas.

INTRODUCCIÓN

Los materiales nanoestructurados a base de carbono se encuentran en una posición privilegiada dentro del alcance de los científicos e ingenieros en todo el mundo como consecuencia de sus propiedades inusuales y aplicaciones actuales y futuras casi ilimitadas en prácticamente todas las áreas de la ciencia y la tecnología.


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uno de ellos se encuentra opuesto en una cadena hexagonal de carbonos, con esta información se podría explorar que cuando el número de grupos funcionales es impar la estructura más estable sería cuando cada una de las moléculas SCH3 están opuestas en una cadena de carbonos hexagonal basándonos en los resultados arrojados por tres adsorbatos. Para el caso de dos adsorbatos se probaron algunas configuraciones posibles para encontrar isómeros relevantes, encontrando que al seguir un camino en forma de zigzag ningún isómero es relevante, sin embargo, cuando las moléculas adsorbidas están separadas por dos o cuatro carbonos su energía tiende a ser más cercana a la del isómero más relevante. Ésta tendencia se probó con tres adsorbatos funcionalizados a la superficie del C60 resultando que cuando dos adsorbatos están adyacentes sobre el mismo enlace C-C y uno ésta separado por dos y cuatros carbonos el isómero si resulta relevante. Las similitudes encontradas para dos y tres grupos funcionalizados al C60 podrían ponerse en práctica para cualquier número de adsorbatos. Además de las estructuras optimizadas se graficó la densidad de estados de cada uno de los isómeros relevantes observando que los niveles de energía son prácticamente idénticos. De igual manera se aprecia la transferencia de carga por parte del Azufre hacia los carbonos con los que está enlazado observando el incremento del enlace C-C sobre el carbono que esta adsorbido al SCH3 sobre la superficie del fullereno C60. El orden de la energía de adsorción para tres adsorbatos oscila entre 3.4 y 3.6 eV, ésta energía nos dice que tan fuerte es la adsorción del grupo funcional hacia el fullereno. Cuando la energía de adsorción está muy por debajo de 0.8673 eV hablamos de fisisorción y en este caso si se incrementa la temperatura y desciende la presión puede ocurrir el fenómeno de desorción, por lo tanto los tres adsorbatos SCH3 están fuertemente adsorbidas al fullereno.

Figura 2. Configuraciones de mínima energía del fullereno C60 funcionalizado con tres adsorbatos SCH3: a) opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal, b) dos adsorbatos adyacentes y un

adsorbato separados por dos carbonos sobre una cadena en zigzag, c) dos adsorbatos adyacentes y un adsorbato separados por cuatro carbonos sobre una cadena en zigzag

Algo interesante que hay que destacar es que el gap HOMO-LUMO tiende a ser mayor para el isómero más estable sin embargo esto no se cumplió para tres adsorbatos, el mayor gap se presentó para un isómero no relevante. Dado que el objetivo es encontrar isómeros relevantes para el estudio posterior de los efectos térmicos, en la revisión bibliográfica se encontró que en el artículo “Unprecedented Chemical Reactivity of a Paramagnetic Endohedral Metallofullerene La@Cs-C82 that Leads Hydrogen Addition in the 1,3Dipolar Cycloaddition Reaction” 3 donde las estructuras ya habían sido relajadas por otro software y que además

fueran las correctas se compararon los ángulos entre los distintos átomos así como la longitud de los enlaces, la referencia eran los datos que arrojaba cada una de las moléculas por separado. La distancia entre el enlace C-S oscila entre 1.87-1.88 Å mientras que la longitud del enlace S-C es del orden de 1.81-1.82 Å, además el ángulo formado entre los átomos enlazados C-S-C se encuentra en el rango de 100-105°. El primer caso que se analizó es cuando dos grupos SCH3 están funcionalizados a la superficie del fullereno C60 encontrando que existe sólo un isómero relevante respecto al isómero de menor energía. El criterio empleado para saber si un isómero es relevante o no es que la diferencia de energía del isómero del que se desea saber su importancia sea menor o igual a 0.1301 eV respecto al isómero de menor energía. El isómero más relevante resultó cuando los grupos SCH3 se encuentran adyacentes sobre el mismo enlace C-C adsorbidos a la superficie del C60 como se observa en la Figura 1a), seguido por el fullereno C60 funcionalizado con dos adsorbatos cuando están opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal (Figura 1b)) con una diferencia de energía de 0.0267 eV con respecto al isómero más estable. En ambas figuras se puede observar que el azufre presente en los adsorbatos cede carga hacia los carbonos con los que está enlazado generando la deformación del C60, es decir, un aumento en la distancia C-C sobre el carbono que esta adsorbido el tiol. La energía de adsorción para dos adsorbatos funcionalizados a la superficie del C60 es del orden de 2.4-2.5 eV. El gap HOMO-LUMO del isómero más estable es del orden de 1.4 eV.

Figura 1. Configuraciones de mínima de energía del fullereno C60 funcionalizado con dos adsorbatos SCH3: a) adyacentes, b) opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal

Una vez encontrados los isómeros relevantes con dos adsorbatos se procedió a optimizar el fullereno C60 con tres grupos funcionales probando varias configuraciones, encontrando que la estructura más estable es cuando los grupos SCH3 se encuentran cada uno opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal como se observa en la Figura 2a). Las Figuras 2b) y 2c) nos muestran los isómeros relevantes respecto a la Figura 2a) que es la estructura optimizada de menor energía, las diferencias de energía de la Figura 2 son 0 eV, 0.0994 eV y 0.1180 eV respecto al orden observado en dicha figura. Cabe mencionar que no se estudiaron todas las configuraciones posibles debido a la gran variedad de éstas si no que se observó la tendencia y en base a ello se estudiaron ciertas configuraciones. Una de las tendencias que se empleó para conocer la importancia de los isómeros para dos y tres adsorbatos funcionalizados al C60, es la trayectoria que se observa con una línea en zigzag de color rojo en la Figura 2b) y 2c). Respecto a la configuración mínima de energía de dos grupos funcionalizados a la superficie del fullereno C60 se encontró que sólo un isómero es relevante además de que se encontró una relación con la separación de los SCH3, en el caso de dos grupos funcionales adsorbidos al fullereno resultó que un isómero relevante es cuando los SCH3 están opuestos sobre una cadena de carbonos hexagonal mientras que la estructura más estable cuando tenemos tres grupos adsorbidos es cuando cada


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emplearon en el artículo mencionado podrían ser relevantes debido a que la diferencia de energía entre cada isómero es menor además de investigar el efecto de la Temperatura en cada uno de los isómeros estudiados con anterioridad.

BIBLIOGRAFÍA

1 LEYVA FABELO A., PIÑERA HERNÁNDEZ I., LEYVA PERNÍA D., CRUZ INCLÁN C. M., ABREU ALFONSO Y., DÍAZ GARCÍA A., MARTÍNEZ TURTÓS R. (2012). Monte Carlo calculation of carbon atom displacement damage in C60 fullerene bulk materials irradiated with gamma rays. Nucleus No. 51, 20-21 2 CHAVIRA QUINTERO R., GUIRARDO LÓPEZ R. (2013). Thiol-based molecular overlayers adsorbed on C60: Role of the end-group and charge state on the stability of the complexes. The journal of Chemical Physics No. 139, 174307-1- 174307-3 3 TAKANO YUTA, SLANINA ZDENEK, MATEOS JAIME, YOSHI TSUCHIYA TAKA, KURIHARA HIROKI, UHLIK FILIP, HERRANZ MARÍA ÁNGELES, MARTÍN NAZARIO, NAGASE SHIGERU, Y AKASAKA TAKESHI (2014). Unprecedented Chemical Reactivity of a Paramagnetic Endohedral Metallofullerene La@Cs-C82 that Leads Hydrogen Addition in the 1,3Dipolar Cycloaddition Reaction. Journal of the American Chemical Society No. 136, 17537-17546

cumplía con las características que estamos buscando, es decir, las diferencias de energía entre los isómeros relevantes era menor a 0.1301 eV respecto a la estructura más estable. Se optimizó la estructura La@C82CMe2NMeCHPh donde Me representa un metilo y Ph un benceno. Basados en el artículo anteriormente mencionado se optimizaron cuatro estructuras con dicha molécula pero con diferente colocación obteniendo que la estructura más estable es la Figura 3a) y se encontró que el único isómero relevante es la Figura 3b) con una diferencia de energía de 0.0218 eV con respecto al isómero más estable, los resultados fueron comparados con el artículo anteriormente mencionado observando diferencias sustanciales en los datos debido a que en el estudio usaron un software que usa un esquema de cálculo all electron y el software en el que nos apoyamos utiliza un esquema de cálculo de pseudopotenciales y esto claramente causó una diferencia significativa. Esto nos pone a pensar que los isómeros que consideramos no relevantes con el software que empleamos pudieran ser relevantes si se estudian con el software en el que está basado el artículo mencionado con anterioridad debido a que es más preciso aunque también requiere mayor tiempo de cómputo y su uso es bajo licencia, mientras que el usado en nuestro estudio es de distribución libre.

Figura 3. Configuraciones de mínima energía de la molécula La@C82CMe2NMeCHPh: a) B1, b) C1

CONCLUSIONES Para el caso de dos adsorbatos se encontró sólo un isómero relevante respecto al isómero de menor energía resultando que la configuración más estable es cuando dos moléculas de SCH3 adsorbidas a la superficie del fullereno C60 están adyacentes sobre la misma cadena de carbonos. Se encontraron tendencias en la colocación de las moléculas adheridas al fullereno y se usaron para tres adsorbatos determinando que las inclinaciones de dos adsorbatos difieren para tres moléculas adsorbidas, sin embargo ambas resultan importantes debido a que empleando estas preferencias se obtuvieron isómeros relevantes esto se comprobó al observar que el isómero más estable para tres adsorbatos fue cuando cada una de las moléculas se encuentran separadas sobre una cadena de carbonos hexagonal. Estas tendencias podrían ser estudiadas para cualquier número de adsorbatos esperando que arrojen los mismos resultados que los que estudiamos. Respecto a las estructuras optimizadas del fullereno La@C82-cs funcionalizado con la molécula CMe2NMeCHPh al comparar los datos obtenidos con el artículo donde se obtuvieron las coordenadas ya optimizadas de las estructuras se encontró una gran diferencia debido al software que se usó, sin embargo eso nos pone a pensar como proyecto a futuro que los isómeros que encontramos irrelevantes para el C60 con el software en el que nos apoyamos con el software que


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ingresos bajos y medios, ha sido mediante el conocimiento de los primeros signos y síntomas, exploración de las mamas y mastografías, lo que dificulta la detección temprana del cáncer de mama. Actualmente se plantea la posibilidad de hacer detecciones de cáncer de mama incluso en estadios tempranos de la enfermedad, mediante la detección del incremento en la concentración de ácido siálico, que ha sido reconocido como un importante marcador para esta y otras enfermedades, debido a trastornos en el metabolismo de dicho compuesto presentes en procesos fisiopatológicos como el cáncer de mama, de esta manera el ácido siálico se podría usar como un biomarcador no solo para el diagnóstico si no para evaluar el estado de la enfermedad; el ácido siálico se puede encontrar de fluidos corporales como plasma sanguíneo, leche materna, orina entre otros fluidos y en tejidos como estómago, cérvix, cartílago, y glándulas salivales, por lo que se sugiere el desarrollo de técnicas de detección no invasivas , por ejemplo en saliva. Se ha demostrado la posibilidad de detectar el ácido siálico mediante su análisis por espectroscopia Raman, por el efecto SERS con el uso de nanopartículas metálicas reducidas con citrato en su superficie, dicha técnica permite la amplificación de la señal Raman del Ácido Siálico.

METODOLOGIA Síntesis de nanopartículas de oro, Síntesis de nanoestrellas de oro y caracterización Las nanopartículas de oro recubiertas con citrato (AuNPs-citrato) fueron sintetizadas por el método Turkevich. Una solución de ácido cloro áurico (HAuCl4) 2.5 mM en agua desionizada fue calentada hasta 95°C con agitación suave y posteriormente se le agregó una solución de Citrato trisódico 2.5mM, las solución resultante esta en relación 1:1 de HAuCl4 y Citrato; al paso de 5 minutos la solución transparente se torna violeta. La suspensión de AuNPs-citrato se lavó al haberse enfriado, mediante 3 ciclos de centrifugación- resuspensión con agua desionizada. A partir de las AuNPs-citrato se sintetizaron las nanoestrellas de oro, realizándose dos tipos de nanoestrellas a distintas concentraciones de AuNPs-citrato y solución tampón HEPES (ácido 4- (2 - hidroxietil) -1 - piperazinetanosulfónico) 25mM; las nanoestrellas de oro denominadas AuNSs2 y AuNSs4 se sintetizaron con 500 µl y 800 µl de suspensión de AuNPs-citrato que fueron agregados en 15.42 ml y 15.12 ml de HEPES 25mM y 75 mM respectivamente, que había estado en un baño de hielos y en agitación, posteriormente se agregó a ambas soluciones 80 µl de Hidroxilamina (NH2OH) al 0.1 M y 4 ml de HAuCl4 1mM por goteo, la solución final tomaría un color azul claro en ambas casos. Las imágenes de Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) para la caracterización de las nanopartículas y las nanoestrellas se obtuvieron con un INSPECT F50-scanning electron microscopy; las muestras fueron preparadas agregando un poco de la suspensión de AuNPs-citrato, AuNSs2 y AuNSs4 en sustrato de Silicio y secadas al aire. Mediciones SERS Las mediciones de los espectros SERS se realizaron con un espectrómetro RAMAN HORIBA con software LabSpec con dos líneas de excitación, laser verde a 532 nm y una abertura de 100 µm. Este instrumento estaba equipado con un microscopio óptico con objetivo de x10, que permite enfocar la superficie del líquido. Durante cada análisis se realizaron 4 acumulaciones en un rango de 800 a 1800 cm�� con 40 segundos de exposición. El substrato para depositar las muestras es de aluminio, con una capacidad aproximada de 100 µl por pozo. Se prepararon mezclas agregando 50 µl de cada nanopartícula (AuNPs-citrato, AuNSs2 y AuNSs4) y 25 µl de soluciones de Neu5Ac a concentraciones 20 mg/dl, 100 mg/dl y 200 mg/dl; cada mezcla se depositó en el sustrato de aluminio y se llevó a medición Raman.

USO DE NANOPARTICULAS METALICAS DE ORO PARA SERS PARA DIAGNOSTICO TEMPRANO, NO INVASIVO DE AFECCIONES EN HUMANOS

Coordinación para la Innovación y Aplicación de la Ciencia y la Tecnología, Av. Sierra Leona #550, Col. Lomas 2a., C.P. 78210, San Luis Potosí, SLP, México, [email protected]; [email protected]

Coronado Ruis, C. D.; Navarro Contreras, H. R.

RESUMEN El cáncer mama es una enfermedad muy frecuente y cada año afecta a cientos de personas alrededor del mundo, actualmente uno de los desafíos para la medicina es contar con métodos de diagnóstico temprano de la enfermedad que permita brindar tratamientos oportunos y en las primeras etapas de la patología. Se ha indicado a través de varios estudios al ácido siálico (Neu5Ac) como un importante biomarcador de varias fisiopatologías entre el que se encuentra el cáncer de mama, en donde sus concentraciones corporales se ven aumentadas por un trastorno en su metabolismo, aun así, sus concentraciones son muy bajas y esto dificulta su cuantificación. En este estudio se plantea el uso de nanopartículas metálicas de distintas características morfológicas y recubiertas con citrato para generar el efecto SERS y maximizar la señal Raman del ácido Siálico, permitiendo su cuantificación por espectroscopia.

ABSTRACT The breast cancer is a very common disease and each year affects hundreds of people around the world, currently one of the challenges for medicine is to have methods of early diagnosis of the disease that allows provide timely treatment and in the early stages of pathology. It has been suggested by several studies to sialic acid as an important biomarker of several physiopathologies between which is breast cancer, where his body concentrations are increased by a disorder in their metabolism, even so, their concentrations are very low, making it difficult to quantify. In this study proposes the use of metal nanoparticles coated with different morphological and citrate to generate the SERS effect and maximize sialic acid Raman signal, allowing quantification from the spectroscopic characteristics. Keywords: SERS, sialic acid, Raman, nanoparticles.

INTRODUCCIÓN

El cáncer de mama es el cáncer más frecuente en mujeres tanto en los países desarrollados como en los países en vías de desarrollo. Se estima que en 2004 murieron 519,000 mujeres el 69% de ellas en países en vías de desarrollo y para el 2012 la cifra aumento a 521,000 defunciones. La detección del cáncer de mama en las fases tempranas de la enfermedad es de gran importancia debido a que las estrategias de prevención y control no permiten una reducción de un gran número de dichos casos, sin embargo, las técnicas actuales de detección precoz para la mayoría de los países del mundo, con


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Los espectros SERS (Figura 6) resultante del análisis de las nanopartículas AuNSs2 frente de Agua desionizada y Neu5Ac a distintas concentraciones (20mg/dL, 100mg/dL y 200mg/dL) muestran una serie de bandas constantes, al igual que los espectros obtenidos para las AuNPs-citrato se eligieron arbitrariamente tres de estas bandas que en este caso corresponden a 1108cm-1, 1448 cm-1 y 1640 cm-1, de los datos de cada banda se realizó un ajuste lineal que se representa en la Figura 7, dejando ver un claro incremento de la señal Raman conforme aumentaba la concentración en cada una de las bandas, siendo la banda a 1640 cm-1 las sufrió un mayor incremento de intensidad. Aun así las intensidades obtenidas con estas nanoestrellas no es mayor que las obtenidas con las AuNPs-citrato, probablemente debido a que no se carga el suficiente citrato en la superficie de sus estructuras o a las propias condiciones del medio.

En cuanto a los espectros obtenidos de las nanopartículas AuNSs4 con agua desionizada y Neu5Ac a las concentraciones anteriormente mencionadas, se presentan en la Figura 8, mostrando al igual que los espectros de las partículas anteriores, bandas que aparecen constantemente en cada uno de los espectros por lo que se procedió a analizar tres de estas bandas que fueron elegidas indistintamente, de los datos de las bandas a 1218 cm-1, 1324 cm-1 y 1551 cm-1 se realizó un ajuste lineal y se construyó la gráfica que se muestra en la Figura 9, observándose a diferencia de las partículas anteriores, un efecto inverso, al presentar una disminución de la intensidad Raman al incrementar la concentración de Neu5Ac.

Figura 6. Espectros SERS de las AuNSs2 frente á:(A) Agua desionizada;(B) Neu5Ac 20mg/dL;(C) Neu5Ac

100mg/dL;(D) Neu5Ac 200mg/dL.

Figura 7. Ajuste lineal de las Bandas:(A)Banda

1640cm-1;(B)Banda 1448cm-1;(C)Banda 1108cm-1.

Figura 8. Espectros SERS de las AuNSs4 frente á:(A) Agua desionizada;(B) Neu5Ac 20mg/dL;(C) Neu5Ac

100mg/dL;(D) Neu5Ac 200mg/dL.


1551cm-1;(B)Banda 1324cm-1;(C)Banda 1218cm-1

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las imágenes del SEM obtenidas de las distintas nanopartículas son representadas en las Figura 1,2 y 3. El análisis por SEM de las AuNPs-citrato (A) deja ver el núcleo metálico de oro, la cubierta de citrato y su estructura esferoidal, su diámetro medio es de 47.74 nm; las imágenes de las AuNSs2 (B) no permiten observar el núcleo metálico pero si muestran estructuras con picos, mostrando una morfología propia de una estrella de oro, su diámetro medio es de 153.07 nm y las fotografías de las AuNSs4 (C) nos dejan ver que estas nanoestrellas comparten características morfológicas con las AuNSs2, pero los picos son más visibles, su diámetro medio es de 131.19 nm.

Figura 1. Imágenes obtenidas por SEM de AuNPs-citrato.

Figura 2. Imágenes obtenidas por SEM de AuNSs2.

Figura 3. Imágenes obtenidas por SEM de AuNSs4.

En la Figura 4 se muestran los espectros SERS de las nanopartículas AuNPs-citrato frente a Agua desionizada y Neu5Ac en distintas concentraciones (20mg/dL, 100mg/dL y 200mg/dL), se observa que aparecen constantemente en los distintos espectros bandas en diferentes números de onda, se tomaron arbitrariamente 3 picos distintivos a 909 cm-1, 1328 cm-1 y 1560 cm-1. Se realizó un ajuste lineal de los datos de estas tres bandas para compararlas lo que se representa en la Figura 5, en está tabla se observa un incremento de la intensidad Raman conforme aumenta la concentración de Neu5Ac en cada uno de las bandas, siendo la banda ubicada a 1560 cm-1 la que presenta un mayor incremento.

Figura 4. Espectros SERS de las AuNPs-citrato frente

á:(A) Agua desionizada;(B) Neu5Ac 20mg/dL;(C) Neu5Ac 100mg/dL;(D) Neu5Ac 200mg/dL.


1560cm-1;(B)Banda 1328cm-1;(C)Banda 909cm-1


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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE HIDROGELES POLIMÉRICOS ELECTROACTIVOS DE QUITOSANA

Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Veracruzana, Prol. de Av. Ote 6 1009, Rafael Alvarado, C. P. 94340 Orizaba, Veracruz, MÉXICO, [email protected]; Universidad Autónoma de San Luis Potosí,Dirección postal, Carretera Cedral, Km. 5 + 600, C.P. 78700, Matehuala,San Luis

Potosí., MÉXICO, [email protected]

Cotlame Pérez, S.; Ovando Medina, V. M.; Hernández Landín, C. A.

RESUMEN En el presente trabajo se describe el método de síntesis de hidrogeles absorbentes interpenetrados de poliacrilamida (PAAm) y quitosana, para su posterior uso en la polimerización de pirrol mediante oxidación química con persulfato de amonio, obteniendo así hidrogeles capaces de absorber sustancias dependiendo los grupos funcionales presentes en su estructura. Todo esto con el fin de emplearlos a futuro en la liberación controlada de un antibiótico. Así también, se llevó a cabo la caracterización de los hidrogeles sin y con polipirrol (PPy), mediante espectroscopia UV Visible e Infrarrojo, además del estudio de la cinética de hinchamiento de los hidrogeles de PAAm/Quitosana/PPy para conocer mediante modelos matemáticos el comportamiento del hidrogel en soluciones acuosas. Cabe mencionar la importancia de tener liberaciones controladas, sobre todo en medicina, debido a la optimización del suministro de fármacos, en los cuales se podría prescindir de recursos humanos y materiales para atender las necesidades de pacientes con lesiones potencialmente infecciosas.

ABSTRACT In this paper the synthesis method absorbent hydrogels interpenetrated polyacrylamide (PAAm) and chitosan, for later use in polymerization of pyrrole by chemical oxidation with ammonium persulfate described, obtaining hydrogels capable of absorbing depending functional groups substances present in its structure. All this in order to use them in the future controlled release of an antibiotic. So too, was carried out the characterization of the hydrogels without and polypyrrole (PPy), using UV Visible and Infrared addition to the study of the kinetics of swelling of hydrogels PAAm / Chitosan / PPy to learn using mathematical models the hydrogel behavior in aqueous solutions. It is worth mentioning the importance of controlled release, especially in medicine, due to optimization of drug delivery, in which they could do without human and material resources to meet the needs of patients with potentially infectiouslesions. Palabras clave: Hidrogel, Quitosana, Poliacrilamida, polipirrol

INTRODUCCIÓN Las matrices poliméricas hinchadas con agua o hidrogeles son materiales poliméricos entrecruzados en forma de red tridimensional de origen natural o sintetico (Sáez, 2003) caracterizados por la capacidad que poseen de absorber grandes cantidades de disolventes, ocasionando cambios macroscópicos visibles en las dimensiones del polímero (Lucio, et. al., 2006) Éstos crecen hasta alcanzar el equilibrio fisicoquímico, pero sin perder su forma. El estado de hinchamiento resulta del balance entre las fuerzas dispersivas y las

Es importante mencionar, que el incremento de la señal Raman por efecto SERS fue mucho más marcado con las AuNPs-citrato (de morfología esférica confirmada por SEM) que con las nanoestrellas AuNSs2 y AuNSs4, esto es contrario a lo esperado, debido a que teóricamente las señales Raman de mayor intensidad se desarrollan con nanoestrellas, ocasionado por el acoplamiento plasmónico que ocurren en las bifurcaciones de la superficie rugosa de estas partículas. No obstante, la amplificación de la señal Raman no solo depende de las características superficiales de las partículas metálicas, si no, en conjunto del sistema de análisis (Nanopartículas-Analito-Matriz), en relación a esto, las condiciones de experimentación en las cuales se usaron las nanoestrellas no son las adecuadas para realizar la cuantificación del Ácido Siálico debido los resultados no convenientes de las mediciones SERS obtenidos. Se proponen cambios en las condiciones experimentales, tales como el uso de un láser diferente (laser infrarrojo) y un recubrimiento en las nanopartículas distinto al citrato, para desarrollar un sistema adecuado y evaluar su comportamiento, esperando una mejora en las mediciones cuantitativas para el Ácido Siálico.

CONCLUSIONES

En base a las observaciones y resultados obtenidos durante el estudio podemos aseverar que: De las distintas nanopartículas sintetizadas y evaluadas, son las AuNPs-citrato las que mostraron una

mayor potenciación de la intensidad Raman del Neu5Ac debido al efecto SERS. Con las AuNPs-citrato, el incremento de la intensidad Raman debido al Efecto SERS es proporcional

a la concentración del Neu5Ac, esto se puede observar en los Espectros SERS y en los ajustes lineales de las bandas.

Las Nanoestrellas de oro AuNSs2 no mostraron un incremento en la intensidad de la señal Raman del Neu5Ac mayor que las nanoesferas AuNPs-citrato, por lo que no son efectivas para su uso en la cuantificación de Neu5Ac en las condiciones experimentales utilizadas.

Las Nanoestrellas de oro AuNSs4 disminuyen la intensidad de la señal Raman del Ácido Siálico conforme incrementa la concentración de esté, por lo que su uso para cuantificación de Neu5Ac en las condiciones experimentales utilizadas no es recomendable.

BIBLIOGRAFIA

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Tabla. 1. Proporciones usadas en la síntesis de la matriz Caracterización.- Se cortaron cilindros de .5 cm. De grosor de los hidrogeles sin y con PY, éstos fueron llevados a la estufa por 24 horas a 60 °C, hasta peso constante, después se trituraron en un mortero de porcelana hasta tener fragmentos muy pequeños, y se colocaron en el área de muestra del Infrarrojo Agilent 630 FT-IR y posteriormente fueron analizados con el programa Microlab para determinar su composición. Cinética de hinchamiento.- Para calcular la cinética de hinchamiento en la absorción de agua, se cortó 1 cilindro de .5 cm de cada hidrogel, con pirrol y sin pirrol. Después se colocaron cada uno en recipientes de plástico dentro de la estufa a 60°C, hasta peso constante, esto con la finalidad de eliminar toda el agua posible dentro del hidrogel; posterior a eso, se colocó a cada uno en vasos de precipitados de 200 mL. Con el agua suficiente para cubrir el hidrogel. Cada hora se tomó el peso de los hidrogeles, quitándoles agua externa con papel absorbente, hasta que no se observó variación notable en la masa con respecto al tiempo Tomando como referencia la ley de difusión de Fick (Geankoplis, 1998) Los datos obtenidos fueron analizados en Excel, calculando la cinética y el crecimiento porcentual en referencia al tiempo mediante las siguientes ecuaciones:

(1) (2)


Caracterización de los hidrogeles sin polimerización.- Con el fin de determinar las estructuras antes y después de polimerizar, obtuvimos Infrarrojos de cada uno de los hidrogeles secos y pulverizados, a continuación se presentan los espectros obtenidos, en los cuales se señalan los grupos funcionales características de los monómeros que los componen.

Run AAM Quitosana NNMBAM APS AAM/Quitosana 100/0 2.4 gr. 0 gr. 0.024 gr. 0.014 gr. AAM/Quitosana 90/10 2.16 gr. 0.24 gr. 0.024 gr. 0.014 gr. AAM/Quitosana 80/20 1.92 gr. 0.48 gr. 0.024 gr. 0.014 gr.

cohesivas intermoleculares que actúan en las cadenas hidratadas. Las fuerzas cohesivas se deben principalmente a entrecruzamientos covalentes, aunque también contribuyen las fuerzas electrostáticas, hidrófobas, o interacciones dipolo-dipolo, (Sáez, 2003) los hidrogeles reaccionan después de ser estimulados con diferentes factores, como la luz, fuerza iónica, temperatura, pH, campo eléctrico o concentración de disolvente (Pinzón, et. al., 2002) El carácter hidrófilo de los hidrogeles deriva de su interior, en el cual poseen grupos como: -OH, -COOH, -CONH2 y –SO3H, la presencia de éstos grupos a lo largo de las cadenas del polímero forma una gran cantidad de enlaces tipo puente de hidrógeno en toda la estructura (Rodríguez, 2010) Para realizar la polimerización, se hace uso de un agente entrecruzante, el entrecruzamiento es debido no solo a uniones covalentes (enlaces sigma), que son típicas de cualquier material entrecruzado si no también a fuerzas intermoleculares de Van der Walls y a los enlaces de hidrógeno. Los procesos de entrecruzamiento pueden ser por: radiación o reacción química (Sáez, 2003) El polímero usado como segundo monómero en éste proyecto es el quitosana, el cual es un copolímero del tipo amino-polisacárido compuesto por D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina, que es obtenido por la desacetilación alcalina de la quitina, principal material estructural en los exoesqueletos de crustáceos y otras especies animales. El quitosana es el único polisacárido catiónico natural y es conocido por su biocompatibilidad y biodegradabilidad. (Santoni, 2008) El carácter hidrofílico de éstos polímeros proporciona la posibilidad de ser utilizados en un gran número de aplicaciones científicas y tecnologías prácticas, algunos ejemplos de aplicaciones son, en la que los hidrogeles sirven para mantener la humedad de la tierra cultivada, como materiales absorbentes, membranas, microcápsulas, soporte para catalizadores, recubrimientos, productos auxiliares para la industria del papel, ligantes de productos farmaceúticos, aislamiento y fragmentación de biopolímeros y análisis. (Palencia, 2013)

METODOLOGIA Materiales Acrilamida (AAM) al 99% (Sigma-Aldrich), Persulfato de amonio (APS) al 98% (Jalmek), N-N´Metilen-bisacrilamida (NNMBAM) al 99% (Sigma Aldrich), Quitosana (QUIT) (Alfa Delta), Pirrol (PY) al 98% (Sigma-Aldrich), Cloruro de potasio, (KCl) (J. T.Baker) En viales que contenían 20 ml. De agua destilada se mezcló cada reactivo en el orden que aparece en la tabla 1, las mezclan que contenían quitosana se mantuvieron en agitación, luego se colocaron todas las muestras en baño maría por 1 hora, las muestras que contenían quitosana se mantuviron en agitación también durante ésta hora. Acabado el tiempo, se sacaron los hidrogeles de los viales y se colocaron en 200 ml. Con el fin de retirar impurezas, se realizaron lavados cada 12 horas por 2 días. Todas las síntesis se hicieron por duplicado, debido a que posterior a los lavados, un hidrogel de cada corrida se usó para polimerización, y otro para caracterización por medio de espectroscopia infrarroja, con la cual, conoceríamos los grupos funcionales presentes en nuestro hidrogel. Para la polimerización, se usó la técnica de oxidación química, en la cual los hidrogeles lavados fueron cortados en cilindros de 3 cm., se les insertó una varilla de acero inoxidable de 4 cm. Por .3 cm. Y se colocaron en una solución que contenia 200 mL. De agua destilada, 1.34 gr. De Pirrol (como monómero) y 3.5 gr. De KCl (como electrolito de transporte), lo dejamos reposar durante 24 horas, para permitir la difusión/ adsorción de Pirrol en el interior del hidrogel, después, se agregó APS como oxidante, en la misma cantidad molar del pirrol agregado en la solución “A”, la cual fue de .0998 M, que equivalía a 4.56 gr. De APS, se dejó reposar 24 horas más en la solución oxidante.


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Figura 4. Espectro Infrarrojo del hidrogel 1 con polipirrol

Figura 5. Espectro infrarrojo del hidrogel 2 con polipirrol, se observa la diferencia de espectro al tener quitosana en la muestra

Figura 6. Espectro Infrarrojo del hidrogel 3, en el cual observamos similitud al hidrogel 2, debido a la presencia de la molécula de quitosana

Al observar los espectros de los infrarrojos de los hidrogeles ya polimerizados, notamos el cambio al no tener el quitosana en el primer hidrogel, y las bandas características del pirrol en 1600.

Cinética de hinchamiento Al obtener los pesos de los hidrogeles hinchados, se analizaron con Excel, los cuales nos arrojaron las siguientes gráficas:

Figura 1. Espectro Infrarrojo del Hidrogel 1, se observan bandas características de acrilamida

Figura 2. Espectro infrarrojo del hidrogel 2, observamos bandas de acrilamida y quitosana

Figura 3. Espectro infrarrojo del hidrogel 3, las bandas de quitosana se hacen un poco más notorias

Revisando los 3 espectros, podemos observar 2 bandas de 3000 a 3500, y una más en 2800, las cuales son características de la acrilamida, también dobletes en 1600 que corresponden al quitosana.

Al oxidar químicamente con APS la solución tomó una coloración obscura, y los hidrogeles se tornaron negros completamente, para retirar impurezas volvimos a hacer lavados, los cuales duraron 4 días, debido a que la solución en la que estaban inmersos los hidrogeles seguía viéndose con coloración amarilla e impurezas. Caracterización del hidrogel con polipirrol Se realizó de la misma manera que los hidrogeles sin polipirrol, y obtuvimos los siguientes espectros:


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Rodríguez, R. J. (2010). Estudio de polímeros hidrogeles sintetizados a partir de acrilamida, quitosana y diferentes ácidos. Sáez, V., Hernández, E., & Sanz-Angulo, L. (2003). Liberación controlada de fármacos. Hidrogeles. Revista Iberoamericana de Polímeros, 4(1), 26-27 Santoni, N., Matos, M., Müller-Karger, C., Nicola, H., Sabino, M. A., & Müller, A. J. (2008). Caracterización de hidrogeles de quitosana entrecruzados covalentemente con genipina. Revista Iberoamericana de Polímeros, 9(3), 2 Palencia, G. (2016). Hidrogeles. Síntesis, caracterización y aplicaciones.: Hidrogeles. [online] Hidrogelesbiodegradables.blogspot.mx. Available at: http://hidrogelesbiodegradables.blogspot.mx/2013/03/800x600-normal-0-21-false-false-false.html [Accessed 11 Jul. 2016]. Geankoplis, C. J. (1998). PROCESOS DE TRANSPORTE Y OPERACIONES UNITARIAS. México: COMPAÑÍA EDITORIAL CONTINENTAL, S.A. DE C.V.

Figura 7.El crecimiento de acuerdo al porcentaje y a la masa, respectivamente, de la matriz de Acrilamida

Figura 8. Crecimiento en porcentaje y en peso de los hidrogeles polimerizados.

Podemos observar como el crecimiento se da a una mayor velocidad al principio, estabilizándose aproximadamente en las 30 horas.

CONCLUSIONES El objetivo de esta investigación fue caracterizar por medio de espectroscopia infrarroja las estructuras de hidrogeles poliméricos, y así, junto con el cálculo de la cinética de hinchamiento, determinar su composición y la utilidad de éstos. Se concluyó que las características físicas y químicas del hidrogel sintetizado, dependerán del agente entrecruzante, la temperatura en la que se realice la reacción, así como el tipo de oxidación al que sea sometido. Así, encontramos que los hidrogeles sintetizados son de gran utilidad en posibles aplicaciones biomédicas, debido a la biocompatibilidad del pirrol, con soluciones que contengan grupos hidrofílicos parecidos a los del agua.

BIBLIOGRAFIA Sáez, V., Hernández, E., & Sanz-Angulo, L. (2003). Liberación controlada de fármacos. Hidrogeles. Revista Iberoamericana de Polímeros, 4(1), 1 Lucio, E. O., Cruz, R. C. A., Gómez, J. C., Martínez, A. M. M., & Cepeda, A. B. M. (2006). Síntesis y caracterización de hidrogeles obtenidos a partir de acrilamida y metilcelulosa. Revista Iberoamericana de Polímeros, 7(4), 247-253. Sáez, V., Hernández, E., & Sanz-Angulo, L. (2003). Liberación controlada de fármacos. Hidrogeles. Revista Iberoamericana de Polímeros, 4(1), 2 Pinzón, N., Espinosa, A., Perilla, J., Hernáez, E., & Katime, I. (2002). Modelamiento del hinchamiento y Difusión de Solutos en Hidrogeles. Revista Iberoamericana de Polímeros, 3(2), 39.


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MARCO TEÓRICO RB1 puede estar mutado en distintos tipos comunes de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón de células pequeñas y de mama, también se inactiva mediante la unión y la desestabilización de la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) en la mayoría de los cánceres de cuello uterino. Este gen (RB1) fue el primer supresor tumoral descrito y clonado, localizado en el cromosoma 13 y codifica para una fosfoproteína de 928 aminoácidos. Esta proteína juega un papel clave en la regulación del ciclo celular en la fase G1 y S, lográndose mediante la regulación negativa de dos reguladores positivos importantes de entrada del ciclo celular, factores de transcripción y quinasas dependientes de ciclina, con la finalidad de inhibir el ciclo celular. La fosfoproteína RB tiene un peso de 110 KDa en su estado hipofosforilado se encuentra activa e impide la continuación del ciclo celular, por el contrario es su estado hiperfosforilado se encuentra inactiva permitiendo que las células pasen de la fase G1 a la fase S, por lo que la ausencia de RB provoca una división celular descontrolada, conduciendo al cáncer. RB está compuesta de tres dominios estructurales, un dominio N-terminal, un dominio central (A y B) y un dominio C-terminal (Fig 1). La proteína RB forma parte de una familia de tres miembros, los cuales contienen un dominio conservado que se refiere como el "Pocket”. Está región bien conservada consiste en los dominios A y B que están separados por una región o espaciador flexible. Parte de la región de A y B se encuentran los dominios designados como Small pocket y Large pocket (Fig 1). La combinación del dominio Small Pocket y el dominio C-terminal es lo que se designa como Large pocket. El dominio Small Pocket se definió originalmente como el dominio mínimo necesario para unirse a las oncoproteínas virales, y el dominio Large Pocket es un dominio que puede unirse a factores de transcripción, como E2F. La unión de RB (hipofosforilada) y E2F restringe la entrada de las células a la fase S. Estas proteínas virales contienen un motivo peptídico llamado LXCXE que es esencial para una interacción estable con proteínas de la familia RB.

Figura 1. Representación esquemática de RB1, señalando sus diferentes dominios.

METODOLOGÍA Se planteó la clonación utilizando el vector pET 28 con tres dominios de RB1: 1) el Large pocket más una pequeña secuencia espaciadora ID (que esta entre el N-terminal y el dominio A) con 1715 pb, 2) el dominio Large pocket con 1644 pb y 3) el C-terminal con 423 pb. Solo se logró obtener la construcción del dominio 2) Large pocket, por lo que en la metodología solo se hará referencia a ese dominio. La expresión del dominio ya mencionado se realizó en cepas de E. coli BL21 para facilitar su purificación y caracterización, los pasos seguidos en la metodología se muestran en el siguiente esquema.

CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS DIFERENTESDOMINIOS DEL SUPRESOR TUMORAL RETINOBLASTOMA

1Universidad Autónoma Metropolitana UAM-C, Av. Vasco de Quiroga, Santa Fe, C.P. 05000, Ciudad de México, [email protected]; 2Institución de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Manuel Nava No. 6, Ciudad Universitaria, C.P. 78290, San Luis Potosí, S.L.P.,

México, [email protected]

Cruz Rubio, G. M. del R.1; Olivares Illana, V.2

RESUMEN El retinoblastoma es una neoplasia infantil de las más frecuentes en edad pediátrica en el mundo y en México. La proteína de retinoblastoma (RB1) juega un importante rol en la regulación del progreso en la división del ciclo celular de las fases G1 y S. Las proteínas de la familia de retinoblastoma se encuentran en distintos organismos como los seres humanos, plantas, e insectos. En este trabajo se logró clonar el dominio Large pocket y su posterior expresión y purificación.

ABSTRACT Retinoblastoma is a childhood neoplasm of the most frequent in pediatric age in the world and in México. The retinoblastoma protein (RB1) plays an important role in regulating advancement of the cell division cycle from the G1 to S phases. The retinoblastoma (RB) family of proteins are found in organisms as humans, plants, and insects. This work achievement clone the Large pocket domain and its subsequent expression and purification. Palabras clave: Retinoblastoma, Large pocket, clonación, expresión.

INTRODUCCIÓN El retinoblastoma es una neoplasia de las células de la retina, muy frecuente en niños, siendo la segunda neoplasia más común en edad pediátrica en México. Una variedad de reportes indican que de 17 al 83% de los pacientes con retinoblastoma tienen algún tipo de alteración en RB1, sin embargo aunque originalmente se encontró en cáncer de retina, en la actualidad se sabe que se encuentra alterado en diversos tipos de cáncer. En México es un problema oncológico ya que representa el 4.3% de las neoplasias en niños y la segunda más común en niños menores de un año y la tercera en niños de 1-4 años. Los pacientes con tumores bilaterales tienen un elevado porcentaje de desarrollar otros tumores malignos, y si de adultos procrean e producto de cada embarazo tiene un riesgo cercano al 50% de padecer la enfermedad, no así los pacientes de la forma unilateral que son la mayoría. La invasión tumoral y la metástasis representan las causas principales de mortalidad. Su diagnóstico es principalmente clínico por lo que se detecta en estadios ya avanzados comprometiendo el órgano afectado y la vida del paciente. Por lo que se estudia los mecanismos moleculares de la enfermedad con la finalidad de encontrar metodologías para una detección temprana con posibilidad de terapias menos agresivas.


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incubo por 3 horas a 37°C. La adición de IPTG al cultivo en crecimiento induce la transcripción del ADN blanco bajo el control de promotores derivados del promotor lac. Purificación con etiquetas His Después de las tres horas se centrifugó dos veces a 3400 rpm por 15 minutos, se decantó el sobrenadante, se resuspendió el pellet y se congeló a -80 °C. Se lisaron las células por pulsos de ultrasonidos y utilizando Tris A. Se centrifugó a alta velocidades para eliminar los restos celulares, y a partir de aquí se obtienen dos extractos: el soluble y el insoluble. Se toma una alícuota de la fracción total y de cada uno de los dos extractos (soluble e insoluble) se toman alícuotas del sobrenadante, la fracción no unida (la que no se adhiere a la columna) y la elución. Esto para verificar en que paso de la purificación se obtuvo la proteína. Para la purificación del dominio se tiene una etiqueta-His, constituida por 6 histidinas consecutivas, que permite la afinidad y unión del péptido por los iones de níquel de la resina dentro de la columna, permitiendo el paso de todas las demás proteínas sin etiqueta. Por último se hizo un gel de SDS-PAGE al 10%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se inició amplificando tres dominios: el Large pocket más la secuencia espaciadora ID con un peso de 1715 pb, el Large pocket de 1644 pb y el dominio C-terminal con 423 pb, los cuales se pueden observar en el gel de agarosa, Figura 3a, los dos primeros dominios se encuentran entre 1500 y 2000 pb y el dominio C-terminal cerca del peso molecular de 500 pb. En el último carril se amplifico a RB1 sirviendo como un control, con esto se verificó que todas las bandas obtenidas estuvieran por debajo de 3000 pb, y se puede suponer que se logró la amplificación de los tres dominios. En la figura 3b se muestra el gel de agarosa del vector pET28a después de su digestión con enzimas de restricción, con lo cual se lograría tenerlo abierto y lineal, verificando su peso entre 5000 pb y 6000 pb. Después se cortaron las bandas correspondientes a los dominios y al vector pET28, para su purificación y su posterior ligación entre ellos.

a)

Figura 3. Amplificación y digestión del vector pET28a. 3a) Gel de agarosa al 1% que muestra la amplificación de los tres dominios de RB1 Large pocket más la secuencia espaciadora ID, el Large pocket y el dominio C-terminal, usando como control a RB1. 3b) Vector de clonación pET28 con un

peso 5000 pb y 6000 pb.

Para la construcción que se realizó entre la ligación del vector de clonación pET28a con alguno de los dominios, se transformo a células de E. coli Top 10, las cuales al crecer en medio con antibiótico, solo se obtendrían colonias que hubiera adquirido el plásmido que contiene un gen de resistencia al antibiótico. De las colonias obtenidas se picaron solo 4 por cada uno de los dominios y se realizó una PCR en colonia, donde el objetivo era verificar que el vector no estuviera vacío, si no con el domino. En la Figura 4 se muestra el gel de agarosa al 1% y se puede observar las colonias donde se pudo amplificar el dominio

b) b)

Amplificación Teniendo la construcción de RB1 en el vector de pET28, se realizó una PCR amplificando el domino Large Pocket con los siguientes primer’s: Forward 5’-GGGAAGCTTATGAACACTATCCAACAATTAAT-3’ y Reverse 5’-CCCAAGCTTTGCTTTCTCTTCCCTTGTTTGAGG-3’, la estructura de los primer’s tiene un triplete de GGG y CCC para el posicionamiento de la polimerasa, un sitio de restricción en para BamHI y HindIII en el extremo 5’, y debe de estar compuesto entre 17 y 24 bases, posteriormente se purificaron los fragmentos obtenidos de la PCR. Se hizo una digestión a 37°C por dos horas con dos enzimas de restricción BamHI y HindIII, para la obtención del dominio Large Pocket. Se corrieron las muestras en un gel de agarosa al 1% y se cortaron las bandas que concordaban con el peso molecular del dominio, 1644 pb. Las bandas de gel obtenidas se purificaron obteniendo una concentración de 93.2 ng/µl. Vector pET28 El vector pET28a vacío (sin el inserto de RB1) se digirió con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, esto para abrir el vector y poder insertar el dominio Large pocket. Antes de esto, se desfosforila el vector en sus extremos libres, con la finalidad de evitar su cierre nuevamente. Se corrió en un gel de agarosa al 1%, se cortó la banda que se encontraba cerca del peso molecular de 5000 pb, la banda se purifico y se obtuvo una concentración de 36.4 ng/µl. Ligación Se realizó la ligación del vector pET28a con el fragmento de PCR obtenido (Large pocket) empleando la ligasa T7 en un volumen final de 50 µl. Con la finalidad de formar una nueva molécula

recombinante, la reacción se incubo por 16 horas a 18°C. Los mejores resultados se obtienen cuando la relación de ligación inserto:vector es 3:1. Transformación bacteriana E. coli Top 10 El producto de la ligación se utilizó para la transformación de células de E. coli Top 10 competentes (la competencia de una célula es el estado en el cual la célula es capaz de capturar ADN del medio). Primero se realizó un choque térmico, que permitiría la introducción de la construcción realizada: plásmido-inserto, esto por los cambios bruscos de temperatura, haciendo permeable la membrana bacteriana. Se adicionaron 400 µL de medio LB y se incubaron una hora a 37°C, posteriormente se decantó el sobrenadante, se resuspendió la pastilla obtenida y se sembró en cajas con kanamicina. Usualmente los plásmidos contienen un gen de resistencia a un antibiótico que permite esta selección. Sólo aquellas células que contengan el vector podrán crecer en el medio que contiene el antibiótico. Después de la transformación, se realiza una PCR colonia para determinar las colonias que tienen la construcción vector-dominio, usando primer’s que flanquean el inserto, en este caso dos colonias se flanquearon desde T7 promotor al T7 Terminador y dos colonias desde el inicio del inserto al T7 terminador. Se purifica las construcciones con una miniprep y son analizadas mediante la digestión, en el cual el vector se corta con enzimas de restricción para verificar la presencia del fragmento (inserto) correcto, esto en un gel de agarosa al 1%. Expresión de la proteína Se realizó un precultivo con kanamicina por 24 horas y se agregó a un cultivo de 2XYT. Se midió la absorbancia y al llegar a una OD de 0.9-1.0 se adicionó IPTG (isopropil-D-tiogalactopiranósido), se


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que indicara un fragmento por debajo de 500 pb. Este último punto no es muy concordante, ya que en la Figura 3 si se logra amplificar el domino en las colonias 3C y 3D, sin embargo podría suponerse que la digestión no se realizó correctamente, impidiendo que se apreciaran dos fragmentos. A las colonias 2A, 2C y 2D se usaron para la transformaron en células de E. coli BL21 con una tag de Histidinas en el C-terminal usando el vector pET28. La expresión del dominio fue con el inductor IPTG a concentración 0.5 mM por 3 horas a 37 °C, el cual permite la transcripción de la polimerasa T7 permitiendo la transcripción del gen de interés. La purificación de la proteína se logra a partir de que el dominio tiene una etiqueta de histidinas (que tienen un anillo de imidazol) que se unen a los iones de níquel de la columna, y será eluída con una solución de imidazol, que competirá con las proteínas que tienen la etiqueta. En la figura 6 se muestra el gel SDS-PAGE al 10%. En la fracción total no se aprecian bandas definidas por ser el conjunto total de proteínas de la célula. En la fracción de elución concentrada soluble se aprecian bandas de 60 a 73 kDa y el péptido que pertenecería al dominio Large pocket pesaría aproximadamente 60.28 kDa (Figura 6), por lo que se podría concluir que la proteína se pudo obtener dentro de la fracción soluble, sin embargo se tendría que realizar un western blot para verificar su presencia, utilizando anticuerpos contra la etiqueta de histidinas.

Figura 5. Bandas correspondientes al peso molecular del dominio Large pocket y C-terminal, después de hacer la miniprep y su posterior digestión con BamHI y HindIII.

correspondiente. Se picaron 4 colonias por cada dominio, dos colonias se flanquearon desde T7 promotor al T7 Terminador y dos colonias desde el inicio del Forward del inserto al Reverse del T7 terminador, esto se realizó con la finalidad de aumentar las posibilidades de amplificar los dominios a partir de diferentes Forward’s. El primer carril corresponde al marcador de peso molecular, los siguientes cuatro carriles al dominio Large pocket más la secuencia espaciadora ID, en donde no se pudo amplificar el dominio, lo que indica que el vector estaba vacío y no se había ligado al dominio. Los consecutivos cuatro carriles pertenecen al dominio Large pocket, las primeras dos colonias 2A y 2B se amplificaron con primer’s desde T7 promotor al T7 Terminador, las siguientes dos, 2C y 2D, con los primer’s Forward del dominio y Reverse del T7 Terminador. Para las colonias del C-terminal al igual que el dominio pasado los primeros dos carriles pertenecen a colonias que se amplificaron con los primer’s Forward T7 promotor y Reverse del T7 Terminador (3A y 3B), para las últimas dos colonias 3C y 3D con los primer’s Forward del dominio y Reverse del T7 Terminador. Se utilizaron como controles a RB1 y a C-terminal (últimos dos carriles). Se puede apreciar en la Figura 4 que las bandas que se obtuvieron positivas son menores al control de RB1. La colonia 3A se ubica cerca de las 1000 pb con respecto al marcador de peso molecular, por lo que muy probablemente no sea el dominio, las colonias 3C y 3D concuerdan con el control C-terminal cerca de las 500 pb.

Figura 4. Bandas de PCR colonia. Colonias positivas que tienen el vector con el inserto, las bandas de las colonias que se amplificaron con primer’s Forward T7 promotor y Reverse T7 Terminador están ligeramente por arriba de las colonias en las que se utilizó los primer’s Forward dominio y Reverse T7 terminador, que es lo que se esperaba. Sin embargo la colonia 3A se encuentra muy

por arriba de las colonias 3C y 3D, muy probablemente no corresponda al domio C-terminal.

Para la verificación de la construcción del vector con el dominio establecido, al final de la miniprep y antes de comenzar la expresión con E.coli BL21 se hizo una digestión. Se esperaba que el vector al ser digerido se obtuvieran dos bandas: una del vector lineal vacío y otra del dominio clonado. En la Figura 2 se muestra el gel de agarosa de las colonias 2A, 2C y 2D que pertenecen al dominio Large pocket y las colonias 3A, 3C y 3D pertenecen al dominio C-terminal. Se utilizaron de controles positivos a RB1, C-terminal y Small pocket. Las colonias donde se comprueba que se tiene la construcción correcta son 2A, 2C y 2D, porque el plásmido vacío se encuentra en 5000 pb y la banda que pertenecería al dominio Large pocket se sitúa ligeramente arriba de 1500 pb, al contrario de las colonias de C-terminal donde no se aprecia una banda

2A 2B 2C 2D 3A 3B

3C

3DD

RB1

C-terminal


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EXPRESIÓN HETERÓLOGA Y CARACTERIZACIÓN DE UNA ASPARAGINASA PARA EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, Zona Universitaria, C.P: 78260, San Luis Potosí, S.L.P., México; 2Instituto de Investigación Cientí-fi ca y Tecnológica A.C., Camino a La Presa de San José 2055, Lomas 4ta. Sección, C.P: 78216, San

Luis Potosí, S.L.P., México; [email protected]; [email protected]

Cruz Santos, J. C.1; Santos Martínez, M. L.2

RESUMEN La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la enfermedad más común de leucemia entre niños. La L-asparaginasa (L-ASNasa) se utiliza en el tratamiento de LLA. Esta enzima produce la depleción a nivel sistémico de L-asparagina provocando la activación de la apoptosis en los linfoblastos. Su uso se ve limitado debido a que las fórmulas comerciales son de origen bacteriano provocando hipersensibilidad severa. El genoma de Thermoplasma acidophilum contiene un gen que codifica para una ASNasa con porcentajes de similitud e identidad cercanos a la enzima humana. Esto sugiere que la enzima de T. acidophilum provocaría menor exacerbación inmunitaria. En este trabajo la proteína se sobreexpresó, purificó, se obtuvo una concentración de 0.195 mg/mL y una actividad enzimática de 4488.02 ASPU/g.

ABSTRACT Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most frequently type of leukemia among children. L-asparaginase (L-ASNase) is used for the treatment of ALL. This enzyme produces systemically the depletion of L-asparagine causing the activation of apoptosis in lymphoblasts. Its use is limited because the commercial formulas are from bacterial origin causing severe hypersensitivity. Thermoplasma acidophilum’s genome contains an encoding gene, ASNase, whose similarity and identity are closer to the human enzyme. This suggests that T. acidophilim enzyme could reduce this immune exacerbation. In this work the protein was overexpressed, purified, with a concentration of 0.195 mg/mL and enzymatic activity of 4488.02 ASPU/g. Palabras Clave: Thermoplasma acidophilum, L-asparaginasa, LLA.

INTRODUCCIÓN La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la enfermedad más común de leucemia entre niños. El término “aguda” se refiere a que la enfermedad puede progresar rápidamente, pudiendo ser fatal en pocos meses si no es tratada a tiempo. Las células leucémicas, responsables de la enfermedad, son linfocitos inmaduros dañados que se desarrollan anormalmente e inhiben sus mecanismos de apoptosis por lo que sobreviven, tienden a acumularse en la médula ósea y, posteriormente, invaden el torrente sanguíneo pudiendo afectar las funciones de otras células del cuerpo (American Cancer Society, 2016). Entre los fármacos utilizados en el tratamiento de la enfermedad se encuentran: vincristina, L-asparaginasa, citarabina, daunorrubicina y prednisona (Longo et al., 2013). La L-asparaginasa (L-ASP o

Figura 6. Gel SDS-PEGDA al 10%, en la fracción soluble se observan dos bandas entre 60 kDa y 75 kDa, las cuales podrían pertenecer a la proteína de interés.

CONCLUSIONES En este trabajo se logró la clonación de uno de los tres dominios que inicialmente se quería clonar, así como la determinación de los parámetros para la producción y purificación de la proteína en E. coli BL21, ya que se logra obtener en la fracción soluble y no en la insoluble (que indicaría que se va a cuerpos de inclusión). Sin embargo, faltaría la secuenciación del fragmento amplificado para corroborar que se tiene el dominio Large pocket.

BIBLIOGRAFIA HENLEY, S. A., & DICK, F. A. (2012). The retinoblastoma family of proteins and their regulatory functions in the mammalian cell division cycle. Cell Division, 7(1), 10-10. LAMBER, E. P., BEURON, F., MORRIS, E. P., SVERGUN, D. I., & MITTNACHT, S. (2013). Structural insights into the mechanism of phosphoregulation of the retinoblastoma protein. PloS One, 8(3), e58463. Diagnóstico y Manejo de Retinoblastoma, México: Secretaría de Salud, (2013).


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cultivo a las 4 y 8 horas para posterior análisis SDS-PAGE. Finalmente se recuperaron ~90 mL de cultivo, volumen que se repartió en dos tubos (~45 mL cada uno), se centrifugaron a 4000 x g por 20 minutos. Se les retiró el sobrenadante y las pastillas obtenidas se guardaron a -20°C. Purificación de L-ASNasa por cromatografía de afinidad por níquel La pastilla proveniente de ~45 mL de cultivo se resuspendió en 5670 µL de buffer de lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0). Se añadió aproximadamente 1 mg de lisozima y se incubó en hielo durante 25 min. Posteriormente se centrifugó a 12000 x g durante 25 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante. La columna Ni-NTA (marca QIAGEN Cat. No. 31314) se equilibró con 600 µL de buffer de lisis, se centrifugó por 2 min a 890 x g. Una vez equilibrada la columna, se cargaron a ésta, 600 µL del lisado celular; se centrifugó por 5 min a 270 x g. La columna fue lavada dos veces con buffer de lavado (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0) y centrifugada, en cada lavado, a 890 x g por 5 min. Finalmente, la proteína se eluyó dos veces con 300 µL de buffer de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0). Las centrifugaciones fueron por 2 minutos a 890 x g; se recuperaron las eluciones. Las eluciones fueron dializadas con tubo de diálisis 8kDa y con buffer Tris-HCl (10 mM). Cuantificación de la proteína por el método de Bradford La concentración de L-ASNasa fue determinada a partir de una curva de calibración de Albúmina de Suero Bovino (BSA). El ensayo se realizó por duplicado. El rango de concentración de las soluciones estándar de BSA fue de 0.002 mg/mL a 0.02 mg/mL. La solución problema se preparó con 10 µL de proteína dializada y 990 µL de agua. A todas las soluciones se les agregó 300 µL de reactivo de Bradford. Se les dejó reposar por 15 minutos. Finalmente se leyeron las absorbancias a 600 nm en espectrofotómetro (Eppendor biophotometer) y se generó la curva de calibración. Determinación de la actividad enzimática de la proteína Para la determinación de la actividad de la ASNasa se generó una curva estándar de sulfato de amonio. Se prepararon cinco soluciones mezcla de reacción. A cada una de las soluciones se les agregó 2 mL de solución sustrato (1.5 g de L-Asp en 100 mL de buffer de ácido cítrico 0.1 M), enseguida, se incubaron en baño de agua por 10 min. Tras la incubación se añadieron, a cada tubo, 100 µL de solución estándar de (NH4)2SO4 apropiada (Estándar #1: 1.3 mg/mL, Estándar #2: 2.6 mg/mL, Estándar #3: 7.8 mg/mL, Estándar #4: 13.0 mg/mL, Estándar #5: 19.5 mg/mL). Las soluciones se incubaron exactamente por 30 min en baño de agua. A continuación, se les agregó 0.4 mL de solución de paro TCA (1.53 M). Una vez preparadas las cinco soluciones de reacción, se tomaron de cada una 20 µL, se mezclaron con 170 µL de fenol nitroprusiato y 170 µL de solución de HClO al 0.2%; esto para el desarrollo del color. Las soluciones se incubaron en baño de agua por 10 min. La muestra problema fue preparada siguiendo el procedimiento anterior, omitiendo la solución estándar y, en su lugar, se agregó 230 µL de proteína purificada. Posterior a la incubación, las soluciones se transfirieron a cubetas de espectrofotómetro y se leyeron las absorbancias a 600 nm. Los datos obtenidos fueron utilizados para generar la curva estándar y calcular la actividad enzimática de la proteína.

RESULTADOS Análisis del perfil de restricción de E. coli BL21(DE3)pLysS + pET-28a(+)-Ta0338 Determinar la presencia del plásmido pET-28a(+)-Ta0338 en las bacterias E. coli BL21(DE3)pLysS, permite continuar con los procesos de sobreexpresión y purificación de la proteína de interés. Para ello, se realizaron dos digestiones utilizando BspEI y XhoI-BspEI. El posterior análisis del gel de electroforesis muestra en el carril 1 dos bandas que no se desplazaron correctamente, aun así, es el resultado que se esperaba. Por otro lado, en el carril 2 las bandas tampoco han avanzado correctamente pues se esperaban tamaños de ~156 pb, ~3274 pb, ~2778 pb, siendo en la última donde se encuentra el gen de interés. Sin embargo, se observan tres bandas por lo que se da por hecho que la cepa tenía el plásmido (Figura 1).

ASNasa), enzima que hidroliza la L-asparagina en L-aspartato y amonio, produce la depleción a nivel sistémico de este aminoácido, inhibiendo la síntesis proteica y, provocando así, la activación de los mecanismos de apoptosis de los linfoblastos. Sin embargo, su uso se ve limitado, debido a que, las fórmulas comerciales de esta enzima tienen origen enterobacteriano (E. coli o Erwinia chrysanthemi), provocando reacciones de hipersensibilidad y formación de anticuerpos. Además, tienen una limitada distribución farmacocinética y una rápida eliminación del cuerpo (Ballón Cossío, 2014). Las L-ASNasa se clasifican en dos tipos: bacteriano y planta. Las L-ASNasa de tipo planta poseen una alta similaridad con las aspartilglucosamidasas, que también poseen actividad de L-ASNasa, provenientes de bacterias y humanos. Estás se expresan primero como precursores inactivos, requiriendo de una posterior autoproteólisis para su activación y la formación de formas oligoméricas activas así como heterotetrámeros (dímeros de heterodímeros alfa y beta) (Guzmán-Rodríguez, Serna-Domínguez, & Santos, 2014). Thermoplasma acidophilum (crecimiento óptimo: 55-60°C y pH 0.5-4.0), es una arquea interesante debido a sus propiedades termoacidofílicas, siendo así que, sus enzimas termoestables tienen un gran potencial biotecnológico. Durante el análisis genómico de este microorganismo (Ruepp et al., 2000), fue detectado un marco abierto de lectura (orf , por sus siglas en inglés), cuya secuencia de aminoácidos es similar a la L-ASNasa del humano (hASGRL1) (Cantor et al., 2009). En el estudio realizado por Guzmám Rodríguez et al., 2014, el análisis bioinformático demostró que la L-ASNasa tipo planta de T. acidophilum tenía un 30.03% de identidad y un 45.69% de similaridad con la enzima humana, porcentajes mayores en comparación con otras enzimas provenientes de otros organismos. Dichas comparaciones sugieren que la enzima proveniente de T. acidophilum podría generar una menor respuesta inmune. En el presente trabajo se describe la sobreexpresión heteróloga, purificación, cuantificación y detección preliminar de la actividad enzimática de la L-ASNasa de T. acidophilum.

METODOLOGÍA Análisis de restricción de las clonas de E. coli usando BspEI y BspEI-XhoI En un trabajo previo se generó el vector pET-28a(+)-Ta0338 para sobreexpresar la proteína Ta0338. La cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS fue transformada con el vector pET-28a(+)-Ta0338 mediante choque térmico. Las bacterias se crecieron en medio sólido selectivo Luria Bertani (LB). El plásmido fue extraído con QIAprep® Spin Miniprep Kit (50) (Cat. No. 27104). La presencia del plásmido e inserto fue corroborada mediante dos perfiles de restricción. La primera reacción de digestión (digestión simple) fue preparada con 10 µL de DNA plasmídico, 5 µL de enzima BspEI, 2.5 µL de buffer NEB3 (10x) y 7.5 µL de agua estéril. Para la segunda reacción (digestión doble) se mezclaron 10 µL de DNA plasmídico, 2.5 µL de enzima XhoI, 5 µL de enzima BspEI, 0.25 µL de BSA (100x), 2.5 µL de buffer NEB3 (10x) y 4.75 µL de agua estéril. Las mezclas de reacción se incubaron a 37°C en termostato durante 1 hora. Posteriormente, los productos de digestión fueron cargados en gel de agarosa al 1% para su análisis. La electroforesis se corrió a 120v durante 1 hora; empleando como marcador de peso molecular: GeneRuler 1kb DNA Ladder. Sobreexpresión heteróloga de la proteína L-ASNasa Se inoculó una colonia aislada de bacterias a 20 mL de medio de cultivo líquido LB que contenía ampicilina (10 mg/mL) y cloranfenicol (34 mg/mL). El cultivo se dejó a 37°C durante toda la noche. Posteriormente se transfirieron 5 mL del cultivo de la noche anterior a 100 mL de medio de cultivo líquido selectivo LB; se dejaron crecer las bacterias a 37°C hasta alcanzar una Densidad Óptica a 600 nm de 0.6. Una vez alcanzada la OD requerida, se tomó una muestra de 1mL de cultivo (marcado como 0 h) y se procedió a agregar 100 µL de IPTG (1M) para inducir la expresión. Los cultivos fueron incubados a 37°C con agitación constante durante 8 horas. Durante el tiempo transcurrido se tomaron muestras de 1 mL del


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Curva de calibración de BSA y cuantificación de la proteína Para calcular la actividad enzimática de la ASNasa fue necesario determinar primero, la concentración de proteína que fue purificada, por lo que se generó una curva de calibración de BSA tal como se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Curva de calibración de BSA para la cuantificación de ASNasa

Empleando la ecuación de la recta obtenida y aplicando el factor de dilución, se estableció que, la concentración de proteína purificada era de 0.1953822 mg/mL. Actividad enzimática de la ASNasa La actividad de la asparaginasa se expresa en unidades ASPU. Una ASPU se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µmol de amoníaco de la L-asparagina por minuto bajo condiciones de ensayo (pH=5.0; 37°C). la actividad fue calculada utilizando una curva estándar de (NH4)2SO4 (Figura 4).

Figura 4. Curva estándar de (NH4)2SO4 para la determinación de la actividad de la ASNasa

En base a la ecuación de la recta obtenida de la gráfica y la ecuación 1) se procedió a calcular las ASPU/g.

(1)

Figura 1. Perfil de restricción de E. coli BL21(DE3)pLysS + pET-28a(+)-Ta0338. MPM: marcador de peso molecular, 1: digestión simple, 2: digestión doble

Análisis SDS-PAGE de las muestras de inducción y proteína purificada Durante la sobreexpresión de la proteína fueron tomadas tres muestras, las cuales correspondían a las 0 h (previo a la inducción), 4 h y 8 h. El análisis SDS-PAGE de estas muestras permite monitorear el proceso de la sobreexpresión. Las muestras fueron centrifugadas a 4000 x g por 20 min. Posteriormente las pastillas fueron tratadas con 1 mg de lisozima y llevadas a 95°C por 5 min en termostato. Se cargaron en el gel de poliacrilamida al 10%, 25 µL tanto de las muestras como de la proteína dializada y se corrieron a 200 v por 1 hora; utilizando BenchMark™ Protein Ladder como marcador de peso molecular. El revelado del gel muestra una serie de bandas de un tamaño de ~30 kDa que aumentan de intensidad según en el tiempo en que se tomó la muestra (mayor acumulamiento a las 8 h). Este tamaño de las bandas se asemeja a los 32 kDa de la ASNasa de T. aquaticus, dando así por hecho que esta es la proteína de interés. Por otro lado, en el carril 4 se puede observar una banda limpia de ~30 kDa, lo que indica que la purificación de la ASNasa fue exitosa (Figura 2).

Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% de las muestras de inducción y proteína

purificada. MPM: marcador de peso molecular, 1: muestra 0 h, 2: muestra 4 h, 3: muestra 8 h, 4: proteína pura

1 2 MPM

50

kDa

30

40

8000 5000

2000

pb

MPM 1 2 3 4


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ESTATIGRAFÍA VOLCÁNICA DE LA PORCIÓN SURESTE DEL GRABEN DE BLEDOS, S.L.P.

1Instituto Tecnológico de la Chontalpa, C.P. 86220, Carr. Nacajuca-Jalpa de Méndez Km. 0+800, Ej. Rivera Alta, Nacajuca, Tabasco, México. [email protected]; 2Instituto de Geología, Uni-versidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No.6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P.,

México; [email protected]

De la Cruz-Arias, J. R.1; Torres Hernández, J. R.2

RESUMEN El presente trabajo se encuentra enfocado en poder reconocer a más a detalle los diferentes tipos de eventos volcánicos que dieron origen a las diferentes unidades litológicas que rellenaron el Graben de Bledos (GB) en su porción Sureste (SE). Dicho graben presenta ciertas peculiaridades puesto que el tipo de secuencias que se esperaría para su rellenaron no fueron materiales siliciclasticos de tipo aluvial, sino productos de origen volcánico (basaltos, andesitas, ignimbrita). Se realizaron diversas visitas de campo a la zona de estudio para documentar de los diferentes tipos de unidades volcánicas que se depositaron dentro del graben y así poder construir las secciones y columnas estratigráficas que se expone en esta parte del graben. En este trabajo se detallan las características de los depósitos piroclásticos que se tenían registrados en trabajos anteriores como la ignimbrita panalillo inferior (“Tap”) y en los cuales solo se hacía mención general del tipo de depósito piroclásticos que la forman, pero no se documentaron los constituyentes y estructura de depósito, ni se detalló las implicaciones de los cambios en el estilo eruptivo asociándolo a la evolución del graben. De este trabajo se ha podido documentar que la evolución del graben fue compleja, pues aunque predomina un estilo eruptivo, donde el vulcanismo piroclásticos se manifestó en forma de oleadas piroclásticas (“surges”). De manera intermitente la columna eruptiva pudo mantenerse el tiempo necesario para generar depósitos de corrientes piroclásticas de densidad (“ash flow deposits”) de pómez y cenizas (“ignimbritas”). No es claro, con evidencia de campo, porque de manera drástica, se interrumpiera el vulcanismo piroclástico de carácter riolítico, y se manifestara actividad extrusiva de lavas basálticas (bimodalidad), lo cierto es que entre ambos productos no se documentaron depósitos sedimentarios importantes, a excepción de un discreto y discontinuo horizonte de depósitos epiclásticos antes que ocurriera la erupción paroxismal que formó la denominada Ignimbrita Panalillo Superior, la cual finalizó el proceso volcánico en esta parte del Campo Volcánico de San Luis Potosí. Esto sugiere que la actividad volcánica no se interrumpió por largos periodos de tiempo durante la formación del graben.

ABSTRACT This work is focused on being able to recognize more detail the different types of volcanic events that gave rise to the different lithological units that completed the Graben Bledos (GB) in its portion Southeast (SE). Graben has certain peculiarities such as the type of sequence you would be expected for they were not siliciclastics filled alluvial type materials but products of volcanic (basalts, andesites, ignimbrites). For the study we conducted several field visits were made to the area of study to document the different types of volcanic units that were deposited within the graben so you can

Donde: A es la absorbancia de la muestra problema (0.087), V es el volumen inicial de la muestra problema (25 mL), Df es el factor de dilución (1), 106 es el factor de conversión de moles a µmoles, a es la pendiente de la curva estándar (0.0451 mL/mg), M es el peso molecular del (NH4)2SO4 (132,14 g/mol), W es el peso de la muestra (4.6x10-5 g), 30 es el tiempo de reacción (min), 103 es el factor de conversión de mg a g. Comprobando de esta manera que la ASNasa proveniente de T. acidophilum tiene una actividad de 4866.17 ASPU/g.

CONCLUSIONES

La L-asparaginasa ha sido utilizada en el tratamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda. La ASNasa de T. acidophilum es candidata a sumarse en la lista de L-Asparaginasas; con la posible ventaja de provocar menos reacciones inmunes. En este trabajo la proteína recombinante se sobreexpresó satisfactoriamente de manera heteróloga en E. coli y posteriormente se purificó. Se realizaron ensayos para determinar la concentración y actividad enzimática; teniendo como resultado 0.195 mg/mL y 4488.02 ASPU/g, respectivamente. El siguiente paso del proyecto será sobreexpresar la proteína a una mayor escala, para así obtener suficiente cantidad, la cual será empleada en los ensayos de caracterización enzimática y actividad asparaginasa en linfocitos normales y líneas celulares de linfoblastos inmortales.

BIBLIOGRAFIA

BALLÓN COSSÍO, D. (2014). L-Asparaginasa, un arma de doble filo pero de vital importancia. Revista de la Sociedad Boliviana de Pediatría, 53, 24-28.

CANTOR, J. R., STONE, E. M., CHANTRANUPONG, L., & GEORGIOU, G. (2009). The Human

Asparaginase-Like Protein 1 hASRGL1is an Ntn Hydrolase with β-aspartyl Peptidase Activity. Biochemistry, 48(46), 11026-11031. doi:10.1021/bi901397h

GUZMÁN RODRÍGUEZ, M., SERNA DOMÍNGUEZ, M. G., & SANTOS, L. (2014). Identification,

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LONGO, D. L., FAUCI, A. S., KASPER, D. L., HAUSER, S. L., JAMESON, J. L., & LOSCALZO, J.

(2013). Harrison: Manual de Medicina Mc Graw Hill. RUEPP, A., GRAML, W., SANTOS MARTINEZ, M.-L., KORETKE, K. K., VOLKER, C., MEWES, H.

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METODOLOGÍA Para la realización del presente trabajo, este se llevó acabo de cuatro principales etapas: Recopilación bibliográfica. Se consultaron los principales trabajos realizados sobre el Graben de Bledos, así como los trabajos cartográficos Escala 1:50 000, del Instituto de Geología, Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) y Servicio Geológico Mexicano (SGM). De este análisis se elaboró un mapa base del área que se pretendía estudiar. Trabajo de campo. Consistió en el levantamiento de tres secciones estratigráficas de la parte SE del graben. Laboratorio. Se describieron las diferentes unidades en muestras de mano; se prepararon láminas delgadas para su análisis al microscopio petrográfico. Trabajo de gabinete. La información recabada en campo y del laboratorio se vacío en mapa, se elaboró la columna estratigráfica compuesta de la parte SE del GB, de la cual se expone la presente interpretación.

RESULTADOS La descripción detalla de los depósitos de flujos piroclásticos que afloran en la parte SE del GB permitieron documentar que la actividad volcánica fue primero de tipo explosivo, generando una serie de depósitos estratificados de oleadas piroclásticas , que presentan diversas estructuras de depósito como estratificación cruzada, dunas y antidunas , también presentan depósitos planares. El material está bien clasificado y sin soldar. Es común que los cristales que contiene estén fragmentados. En algunos de los depósitos se formaron en su parte superior estructuras columnares discretas de forma pentagonal hexagonal característica. El espesor de estos depósitos es de 7 a 15 cm. En algunos depósitos se observó lapilli acrecional y lapilli armados, este ultimo de 1 a 5 cm de diámetro. Luego, sobre la secuencia estratificada descrita, se presentan depósitos masivos de ceniza y pómez con espesores de 1.5 a 7 m, la pómez es blanca, fibrosa, en general de forma angular a subangular. En algunos de estos depósitos hay horizontes ricos en líticos. De manera aislada se observaron tubos de escape de gas. Estos depósitos no presentan soldamiento. Siguiendo hacia arriba en la columna se

Figura 1: Imagen de Satélite “Google Earth” (a la izquierda) y Mapa Geológico del área de estudio del Graben de Bledos, escala 1:50,000, tomado de Torres-Aguilera, J.M., (2005).

build sections and stratigraphic columns set out in this part of the graben. In this paper the characteristics of the pyroclastic deposits that were recorded in previous jobs like ignimbrite lower Panalillo ("Tap") and in which only general mention the type of pyroclastic deposit that form became detailed, but not documented the constituents and structure of deposit, nor the implications of changes in the eruptive style associating the graben evolution outlined above. This work has been documented that the evolution of the graben was complex, because although the predominant eruptive style, where the pyroclastic volcanism manifested as pyroclastic surges ("surges") intermittently eruptive column could be maintained long enough to pyroclastic deposits generated density currents ("ash flow deposits") of pumice and ash ("ignimbrite"). It is not clear, with field evidence because, quite dramatically, the pyroclastic volcanism is interrupted and extrusive activity basaltic lavas (bimodality) manifested itself, the fact is that the two products are not sedimentary deposits were documented, suggesting that the activity volcanic was not interrupted for long periods of time.

INTRODUCCIÓN El Graben de Bledos se encuentra ubicado dentro de la porción sudoriental del Campo Volcánico de San Luis Potosí “CVSLP” (De la calleja-Moctezuma, 2015). La fosa tectónica de Bledos es considerada como un valle, el cual, según trabajos anteriores en la zona, fechan su formación Oligoceno entre 32 y 27 Ma., (Labarthe-Hernández y De la Huerta-Cobos, 1998). El GB presenta ciertos rasgos geomorfológicos que son poco inusual para este tipo de estructura ya que la fosa no se rellenó de materiales de tipo aluvión debido a que en la zona de estudio se presentó un actividad volcánica de alto dinamismo y complejidad (vulcanismo bimodal) en donde los diversos procesos geológicos (intemperismo, erosión, transporte y sedimentación) no pudieron actuar por la constante actividad volcánica de una serie de secuencias de lava y flujos piroclásticos (Tristán-González et al., 2009). Este mismo dinamismo volcánico tan especial, hizo que se convertirá en un tema de investigación interesante para poder tratar explicar cómo fue que dicho graben fue rellenado por materiales piroclásticos y basaltos y porque solo en su fase final ocurrieron depósitos sedimentarios (Conglomerados Halcones “Tcgh”) de tipo aluvial. En trabajos previos se describen de manera adecuada las diferentes unidades litodémicas de las márgenes e interior del graben, pero se trata de manera superficial sobre los diferentes procesos que se dieron en cuanto a mecanismos de erupción y controles de emisión de esas unidades durante la evolución del graben. En el presente trabajo de estratigrafía volcánica, se detalla sobre las características de los diferentes productos volcánicos (depósitos de flujos piroclásticos, de oleadas piroclásticas, depósitos de ceniza de caída, lahares, lavas basálticas) que rellenan esta depresión tectónica.


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CONCLUSIONES 1. – El GB es una estructura tectónica cuya evolución estuvo ligada aun vulcanismo félsico principalmente piroclásticos, posiblemente con aportes discretos de agua en el fenómeno (hidrovulcanismo). 2. – La parte final del proceso volcáno-tectónico estuvo mercada por emisiones de lava basáltica en lugares dispersos dentro del graben. 3. – La presencia de sedimentos epiclásticos encima del horizonte con lavas basálticas es el único indicio que se interrumpió el fenómeno volcánico por un breve periodo de tiempo y ocurrió sedimentación clástica. 4. – La reactivación del vulcanismo piroclásticos generó depósitos de ignimbritas no soldadas, que transicionalmente pasaron a depósitos con soldamiento discretos y, finalmente ocurrió el evento paroxismal que generó a una ignimbrita con alto grado de soldamiento.

BIBLIOGRAFÍA

De la Calleja-Moctezuma, Alfredo Ernesto. (2015). Análisis Estructural de la Porción Noroccidental del Graben de Bledos. (Tesis). Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Instituto de Geología.

Roca hipocristalina, de cristales subhedrales a

anhedrales, de textura porfiritica, matriz vítrea,

parcialmente desvitrificada (algunas esferulitas).

Contiene un 15%

de pómez gris claro parcialm

ente colapsada y deform

ada. Los cristales son anhedrales a subhedrales, en su m

ayoría rotos o fragmentados y

corresponden a cuarzo y feldespato potásico principalm

ente, contiene biotita y muy escasa

plagioclasa (oligoclasa). Se clasifica como una

ignimbrita riolítica. M

icrofotografía con Nicoles cruzados.

Roca holocristalina grano fino, inequigranular, de

textura microlítica form

ada en su mayoría de cristales

de plagioclasas, olivino y piroxeno y augita. Los cristales de plagioclasa y piroxeno son euhedrales, los de olivino subhedrales. Se clasifica com

o basalto de olivino y piroxeno.

Muestra petrográfica de un flujo piroclásticos de corriente

de densidad, la cual presenta una matriz de vitroclastos,

en donde sus cristales principalmente los cuarzos se

encuentran fracturados debido al mism

o dinamism

o que presento al m

omento de su efusión.

Roca form

ada por ceniza y escasos cristales de cuarzo. Incluye tam

bién aislados líticos dim

inutos. La matriz es

criptocristalina y sus componentes

no presentan soldamiento.

Roca formada por póm

ez y ceniza. La póm

ez constituye 15% de la

muestra, La m

atriz está formada

por ceniza (vitroclastos) sin soldar, y cristales fragm

entados de cuarzo, feldespato potásico y escasa plagioclasa (oligoclasa). La m

atriz tiene textura microlítica.

Toba riolítica no soldada.

Figura 2: Estratigrafía volcánica de la porción SE del G

raben de Bledos

observaron derrames de basalto de olivino y piroxeno. Lateralmente, en lugar de lavas basálticas se observaron depósitos epiclasticos, que contienen principalmente ceniza volcánica y líticos de riolita; escasamente también basalto. Finalmente, sobre las lavas basálticas, o sobre los epiclasticos, se presenta una ignimbrita con grado medio de soldamiento, aunque en su base es incipientemente soldada.

DISCUSIÓN

La estratigrafía del relleno del GB en la parte SE del mismo, no aflora su base, nos permite asumir que la subsidencia de esta estructura y el vulcanismo ocurrieron de manera sincrónica, es decir, no era una depresión ya formada que pudiera recibir productos de erosión de los hombros del graben; de otra manera, la presencia de epiclástos hubiera sido inevitable. Dado que el mecanismo que se asocia a las erupciones que generan flujos piroclásticos poco densos (oleadas piroclásticas o “surges”) se asocia a la interacción agua-magma, puede plantearse que las fallas que limitan el GB permitían el descenso de agua, alimentando un acuífero, el cual durante el ascenso el magma encontraba generando explosiones de ceniza y pómez muy explosivas y muy diluidas. El cambio de estilo de erupción que creo depósitos masivos de pómez y ceniza, implica un aporte continuo temporal de material piroclásticos, lo que supone una columna eruptiva sostenida. Probablemente estas condiciones indiquen un agotamiento del acuífero. La presencia de lavas de basalto y de depósitos epiclasticos indica que se interrumpió el fenómeno volcánico por un periodo de tiempo corto, antes de que se diera el evento paroxismal que generó una ignimbrita con alto grado de soldamiento que corona a toda la secuencia. El Conglomerado Halcones representa el relleno de la depresión después que ceso el vulcanismo.


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ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASAEN UN GRADIENTE DE CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS

EN VILLA DE LA PAZ-MATEHUALA, S.L.P. (MÉXICO)

1Instituto Tecnológico Superior de Comalcalco, Carretera Vecinal Comalcalco - Paraíso Km. 2, Ra. Occidente 3ra. Sección, C.P. 86651, Comalcalco, Tabasco; México, [email protected]; 2Facultad de Ciencias Químicas, Universidad La Salle México, Benjamín Franklin 47, Cuauhtémoc, Condesa, C. P. 06140 Ciudad de México, D.F., [email protected]; 3Facultad de Ingenie-ría, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Dr. Manuel Nava #8 Zona Universitaria poniente, C.P. 78290, San Luis Potosí , S.L.P, México; [email protected]; 4Coordinación para la Innova-ción y la Aplicación de la Ciencia y Tecnología, CIACYT-Facultad de Medicina, Universidad Autó-noma de San Luis Potosí. Sierra Leona #550, Lomas 2da Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P,

México; [email protected];

De la Cruz Chable, K. M.1; Virgen Urcelay, A.2; Lugo Pérez, A.3; Ilizaliturri Hernández, C. A.4

RESUMEN Este proyecto de investigación se realizó con la finalidad de hacer un análisis de la actividad biológica del suelo en el municipio de Villa de la Paz-Matehuala perteneciente al estado de San Luis Potosí, este estado es considerado unos de los más grandes productores de metales en México; la intensa actividad minera ha sido responsable de la acumulación de contaminantes en el suelo, según estudios realizados se ha comprobado que el sitio presenta altos niveles de contaminación por metales pesados (Pb, As, Zn, Cd) en el suelo. Los resultados nos permitieron conocer la actividad enzimática del suelo, esto se hizo mediante la utilización de enzimas que nos reflejaron el estado del suelo y nos brindaron información sobre la capacidad potencial del mismo. Se comprobó en este estudio y en investigaciones anteriores que las altas concentraciones de metales pesados inhiben la actividad enzimática de muchas enzimas en los suelos.

ABSTRACT This research project was conducted in order to analyze the biological activity of the soil in the municipality of Villa de la Paz- Matehuala belonging to the state of San Luis Potosi, this state is considered one of the largest producers of metals Mexico; the intense mining activity has been responsible for the accumulation of contaminants in soil , according to studies it was found that the site has high levels of contamination by heavy metals (Pb , As, Zn , Cd ) in the soil . The results allowed us to know the enzymatic activity of the soil, this was done by using enzymes that reflected us the state of the soil and we provided information on the potential of the capacity. It was found in this study and previous research that high concentrations of heavy metals inhibit the enzymatic activity of many enzymes in soils.

Palabras clave: Metales pesados, Actividad biológica, Actividad enzimática, Contaminación, Enzimas, Ureasa.

INTRODUCCIÓN La industria minera en México es una de las más importantes actividades económicas, y globalmente el estado de San Luis potosí ocupa uno de los principales lugares productores de metales. Muchos de sus

Labarthe-Hernández, G. y De la Huerta-Cobos, Ma. L., 1998, Geología del Semigraben de Bledos, San Luis Potosí, México (Escala 1:20,000),: Inst. Geol., Univ. Aut. S.L.P., Folleto Técnico No.124. Torres-Aguilera, Juan Manuel. (2005). Caracterización Petrográfica y Geoquímica del Vulcanismo Bimodal, en el Semigraben de Bledos, en el Campo Volcánico de San Luis Potosí (Tesis).Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Instituto de Geología. Tristán-Gonzáles, M., Aguillón-Robles, A., Barboza-Gudiño, J.R., Torres-Hernández, J.R., Bellon, H., López-Doncel, R., Rodríguez-Ríos, R., Labarthe-Hernández, G., Geocronología y distribución espacial del vulcanismo en el Campo Volcánico de San Luis Potosí., Boletín de la Sociedad Geológica Mexicana, Volumen 61, Num.3, 2009, P.287-303.


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g de cada muestra, para trazar el gradiente nos apoyamos a través de la aplicación de Google Maps, y así mismo del INEGI. Las distancia de los puntos de muestreo: Punto inicial, 1m, 5m, 10 m, 25 m, 50 m, 100 m, 250 m 500 m, 1 km, 3 Km. Procedimiento: Introducimos el nucleador en el suelo en el primer punto de muestreo a una profundidad de 15 cm, con ayuda del martillo geólogo, cuidadosamente comenzamosa a retirar el nucleador del suelo con movimientos giratorios de modo que se retiramos la muestra con mayor facilidad y una vez ya retirada, tomamos con cuidado la muestra de suelo y la colocamos en el filtro de 500 mm para tamizar. Una vez que obtuvimos lo más fino posible el suelo, lo colocamos en un tubo cónico previamente rotulado señalizando el número de muestra, posteriormente colocamos la tapa y sellamos con parafilm. Con la ayuda de la cinta tomamos la demás distancias de cada punto de muestreo. Al finalizar el muestreo colocamos todas las muestras en un recipiente con hielo para conservar las muestras, y posteriormente las colocamos en un refrigerador 4 ªC. NOTA: De cada punto, se tomaran 4 muestras en forma horizontal. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE HUMEDAD, PH Y CONDUCTIVIDAD ELÉCTRICA Determinación de humedad El método utilizado para esta medición fue el gravimétrico, para determinar únicamente la cantidad de agua de los suelos. La humedad del suelo se calculó por la diferencia de peso entre una misma muestra húmeda, y después de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante. Determinación de pH y Conductividad eléctrica Para la determinación del pH se utilizó el método potenciométrico (Willard, 1974) y para la determinación de la conductividad eléctrica se determinó según el método de (Benton-Jones, 2001). Los datos se muestran en la Tabla 1). ESTIMACIÓN DE LA ACTIVIDAD UREASA DEL SUELO Se estimó la actividad de la enzima Ureasa mediante la técnica de Determinación Colorimétrica de amonio, método propuesto por Kandeler y Gerber (1988). En este método, el amoniaco producido por la actividad ureasa reacciona con salicilato y dicloroisocianurato para dar un color verde azulado. La absorbancia se lee a 690 nm en un espectrofotómetro y es directamente proporcional a la concentración del nitrógeno amoniacal. La actividad de la ureasa se expresó en µg de NH4-N g-1 2 h-1. Nota: el suelo debe ser analizado en fresco lo antes posible después de la colecta y mantenerlo refrigerado a 4 ª C La medición de la actividad enzimática se realizó por triplicado y como control se utilizó un blanco Preparación de la curva Para la preparación de los reactivos y soluciones checar la estimación de la Actividad Ureasa del suelo según el método de Kandeler y Gerber (1988) (Carlos García F. G., 2003) Estándares de Cloruro de amonio: Para los estándares de amonio pipeteamos volúmenes de 0, 0.01,

0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 ml en matraces aforados de 10 ml, luego completar el volumen con la

depósitos mineros generan efectos negativos en la salud humana y en los ecosistemas (Ilizaliturri, 2016). Debido a que en este estado la actividad minera tiene un gran auge, principalmente en la parte norte del estado, se realizó un estudio en los suelos de uno de sus municipios de este estado, el cual gracias a investigaciones ya realizadas se ha comprobado que presentan altos niveles de concentración por metales pesados en el suelo. La importancia del suelo radica en que es un elemento natural dinámico y vivo que constituye la interfaz entre la atmósfera, la litosfera, la biosfera y la hidrosfera, sistemas con los que mantiene un continuo intercambio de materia y energía. Esto lo convierte en una pieza clave del desarrollo de los ciclos biogeoquímicos superficiales y le confiere la capacidad para desarrollar una serie de funciones esenciales en la naturaleza de carácter medioambiental, ecológico, económico, social y cultural. (García, 2003)El suelo, a través de su poder de amortiguación o desactivación natural de la contaminación, filtra, almacena, degrada, neutraliza e inmoviliza substancias orgánicas e inorgánicas tóxicas, impidiendo que alcancen un efecto negativo sobre la salud de los organismos vivos e incluso en la salud del suelo La importancia fundamental de estudiar la actividad de las enzimas, es que se consideran útiles para monitorizar cambios en las actividades microbianas y estas nos ofrecen información sobre la capacidad potencial del suelo para llevar a cabo reacciones específicas, y de esa forma radica en que el funcionamiento de los ecosistemas no se puede entender correctamente sin la participación de los procesos enzimáticos, ya que las enzimas determinan la pauta de gran parte de las transformaciones químicas que se producen en el suelo. En esta investigación se analizó la actividad enzimática de los suelos de Villa de la Paz en la cual está siendo fuertemente inhibida por la presencia de metales pesados, esto se hizo mediante la utilización de la enzima ureasa la cual nos permitió reflejar el estado potencial del suelo ante los niveles de contaminación. La actividad enzimática se ve como un indicador de contaminación, como una medida de la eficiencia de los tratamientos biológicos para remediar suelos impactados por diferentes contaminantes. Muchas enzimas llevan a cabo procesos que benefician al suelo, la enzima ureasa según investigaciones ya realizadas se encuentra acumulada en el suelo de forma significativa (Bur78), por otro lado es una de las más estudiadas junto con otro grupo de hidrolasas y que son enzimas básicas en la evaluación del impacto de contaminantes en el suelo y es sensible a la presencia de metales pesados. En el desarrollo de la presente investigación el principal objetivo fue evaluar la actividad biológica del suelo en un gradiente de contaminación, (Razo, 2006) por metales pesados en el municipio de Villa de la Paz- Matehuala, contaminados por jales y deslaves mineros. De acuerdo a los estudios realizados se obtuvieron resultados que nos permitieron conocer cuánto afecta la concentración de dichos metales pesados en la actividad enzimática de la ureasa en los suelos de Villa de la Paz.

METODOLOGÍA

MUESTREO DE SUELO EN VILLA DE LA PAZ Los materiales para el muestreo: fueron tamices de 200 y 500 mm, tubos cónicos de 15, palas plásticas, martillo de geólogo, máscara de polvo, guantes, hielera, bolsas de plástico, nucleador. Como primera etapa a esta investigación se realizó un muestreo exploratorio para determinar la distribución de los Elementos Potencialmente tóxicos con relación al gradiente establecido a 3 km por debajo de los jales mineros de Villa de la Paz – Matehuala, en los cuales se identificaron 11 puntos de muestreo dentro del gradiente. En el mes de Junio de 2016 se recolectaron 4 muestras de cada punto, haciendo un total de 44 muestras del sitio de Villa de la Paz, estas muestras se tomaron a una profundidad de 15 cm desde la superficie del suelo y a diferentes distancias en línea horizontal al punto principal, aproximadamente se recolectaron 20


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Figura 1. Relación de las absorbancias obtenidas de la Ureasa con los diferentes puntos de distancia del gradiente. Las letras muestran diferencias entre las distancias (p<0.05).

La Figura 1) muestra la relación que hay entre las absorbancias y las distancias, lo cual indica que en todos los puntos “a” tienen la misma concentración es decir que no hay presencia de actividad enzimática, esto podría ser por la presencia de metales pesados, los cuales inhiben la actividad enzimática de la ureasa, según números estudios presentados por González-Mille (2006), quien reportó las siguientes concentraciones en suelos de Villa de la Paz, medias ± desviación estándar en un sitio impactado de este distrito minero: encontró 222.1 ± 53.1 mg/kg de As, 231.9 ± 55.7 mg/kg de Cu, 204.3 ± 80.1 mg/kg de Pb y 175.4 ± 35.9 mg/kg de Zn. También encontró que los valores del sitio impactado fueron más altos que los sitios de referencia, y el As fue 345 veces más alto, el Cu 27 veces, el Pb 52 veces y el Zn 40 veces. Nuestros resultados muestran que a mayor distancia, hay un incremento de la actividad enzimática en los suelos de Villa de la Paz, por lo tanto, los puntos de 0, 1, 5, 10, 25, 50, y 100 m más cercanos a los jales mineros son los más afectados por la concentración de los Elementos Potencialmente Tóxicos. De acuerdo a los resultados se observa que en a partir de una distancia de 100 m se nota que la actividad empieza a ser mayor conforme se aleja del punto más afectado.

Tabla. 1. Relación de los parámetros fisicoquímicos con la actividad de la Ureasa.

Variables Correlaciones significativas a p< ,05000 N=44 Dist. (m) pH Cent. pH Res CE µS M.O Ureasa

Distancia (m)

1 0,7196 p=,000

0,8168 -0,5531 0,7704 0,8043

p=--- p=,000 p=,000 p=,000 p=,000 pH 0,7196 1 0,8137 -0,8509 0,6571 0,7912 p=,000 p=--- p=,000 p=,000 p=,000 p=,000 CE -0,5531 -0,8509 -0,8083 1 -0,4885 -0,6678

D is ta n c ia (m )

Ure

asa

(Ab

s)

0 1 5 1 0 2 5 5 01 0 0

2 5 05 0 0

1 0 0 03 0 0 0

0 .0 0

0 .0 2

0 .0 4

0 .0 6

0 .0 8

0 .1 0

a a a a a a a

b

b

b b

disolución de KCL (1M)-HCL (0.01 M). Los estándares tuvieron una concentración de 0, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 µg.

Se tomó 1 ml de cada uno de los estándares y se le añadió 9 mL de agua desionizada teniendo una concentración final de: 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 µg. Para la generación de color en los estándares se les adicionó a cada uno 5 mL de la disolución de salicilato de sodio – hidróxido de sodio y 2 mL de la solución de Dicloroisocianurato de sodio (Nota: Después de la coloración es estable durante 8 horas) después se agitaron las muestras por pocos segundos y se dejaron reposar durante 30 min a temperatura ambiente, posteriormente se leyó la absorbancia a 690 nm en el espectrofotómetro. Se recomienda hacer al menos tres repeticiones del blanco. (Razo, 2006) Preparación de las muestras Para la preparación de los reactivos y soluciones checar la estimación de la Actividad Ureasa del suelo según el método de Kandeler y Gerber (1988) en (García, 2003). Preparación del blanco: Se pesó 1 g de suelo fresco en tubos cónicos. Se le añadió a cada matraz o

tubo 1.5 mL de agua desionizada se incubó a 2 h a 37ª C. Después se le colocó 13.5 mL de la disolución de KCL (1M)-HCL (0.01 M), agitamos 30 min a 120 oscilaciones, como estaban en tubos centrifugamos a 5000 rpm por 15 min.

Preparación de las muestras: Se pesó 1 g de suelo y se le añadió 1.5 mL de solución Urea a cada muestra, posteriormente incubamos a 2 h a 37ª C. El amonio liberado en la incubación lo extraemos añadiendo tras el tiempo de incubación 13.5 mL de la disolución de KCL (1M)-HCL (0.01 M), se agitó 30 min a 120 oscilaciones, posteriormente como ya estaban en tubos, se centrifugó a 5000 rpm por 15 min. (Carlos García F. G., 2003)

. Determinación del amonio Una vez centrifugado se pipetearon1 mL del sobrenadante del blanco y de las muestras en matraces Erlenmeyer de 25 mL, después añadí 9 mL de agua desionizada para diluir el extracto. Para el desarrollo del color se le adicionó 5 mL de la disolución de salicilato sódico en hidróxido de sodio y 2 mL de la solución de Dicloroisocianurato de sodio; la mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 30 min, pasado este tiempo se midió la densidad óptica a 690 nm. El color desarrollado en el análisis de amonio es estable al menos 8 h a temperatura ambiente. (García, 2003). ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizaron bases de datos en Excel y cuadros donde se presentaron estadísticas descriptivas Las gráficas se realizaron con ayuda del software GraphPad Prism Version 6. Para encontrar si existe algún tipo de asociación entre las variables de exposición (contaminantes ambientales) y de efecto (Características físicas y químicas) se realizaron correlaciones múltiples. Para comprobar las distancias se utilizó un ANOVA.


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embargo los puntos más alejados muestran un incremento tanto en la actividad enzimática como en la materia orgánica. Este estudio proporciona información del estado de la actividad enzimática del suelo en una región minera de San Luis Potosí (Ilizaliturri, 2016).

BIBLIOGRAFIAS

García, (2003). Técnicas de Análisis de Parámetros Bioquímicos en suelos: Medida de Actividades Enzimáticas y Biomasa Microbiana. Barcelona, México: Ediciones Mundi-Prensa. Ilizaliturri, Hernández, C.A, (2016). Evaluation of enzyme activities in long- term polluted soils with mining tailing deposits, San Luis Potosí, México. Rocha, Montes, a. (2016), Efecto De los métales pesados sobre la actividad Biológica del suelo. San Luis Potosí, México. Razo, Soto, I, (2006). Identificación de áreas prioritarias de Restauración de suelos contaminados por Arsénico y métales pesados en el sitio minero y metalúrgico de Villa de la Paz- Matehuala (Tesis de Doctorado) Universidad Autónoma de San Luis Potosí, San Luis Potosí, México.

p=,000 p=,000 p=,000 p=--- p=,001 p=,000 MO 0,7704 0,6571 0,6442 -0,4885 1 0,792 p=,000 p=,000 p=,000 p=,001 p=--- p=,000 Ureasa 0,8043 0,7912 0,7968 -0,6678 0,792 1 p=,000 p=,000 p=,000 p=,000 p=,000 p=---

Los resultados de las características fisicoquímicas estudiadas en el sitio de Villa de la Paz son presentadas en la Tabla 1. Los resultados muestran que el pH de los sitios contaminados aumenta conforme hay una mayor distancia de los jales, Los valores de pH variaron en un rango de 6.33 a 8.23, el valor mínimo se encontró en el primer sitio (a 0 m de distancia) y el valor máximo en el sitio más alejado (a 3000 m de distancia).el pH evaluado en los primeros sitios son moderadamente ácidos, esto comprueba la falta de vegetación que había en los sitios muestreados. Y los puntos H, I, J, K se consideran alcalinos. De la misma forma se observan diferencias significativas en los sitios, en el caso de la conductividad eléctrica se obtuvieron valores muy bajos y probablemente la disminución se deba a la relación con los métales pesados. Los resultados muestran una relación entre algunos parámetros como la distancia, el pH, la materia orgánica y la actividad enzimática de la ureasa, es decir conforme aumentan las distancias también hay un incremento en la concentración de materia orgánica y por ende hay mayor actividad enzimática en el suelo. Con los datos obtenidos podemos decir que cuando los metales entran en el suelo en grandes cantidades, el pH puede ser alterado causando la acidificación de los suelos, esto podría ser la explicación de la alta correlación entre el valor pH y la concentración de los metales pesados. SITIO DEL MUESTREO

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES Comparando los resultados obtenidos con otros estudios anteriores se podría decir que la actividad metalúrgica llevada a cabo por más de 200 años probablemente sea la principal fuente de las altas concentraciones de Elementos Potencialmente Tóxicos en los suelos de Villa de la Paz, en las cuales han causado efectos negativos en la salud del suelo (Ilizaliturri, 2016), estos han generado a lo largo de este periodo que la actividad de muchas enzimas sea inhibida por la concentración de metales pesados en el sitio (Razo, 2006). Nuestros resultados muestran una relación entre los diferentes parámetros fisicoquímicos pH, OM, con la actividad enzimática y esta con los metales pesados. De acuerdo a los datos obtenidos durante este estudio, podríamos decir que la presencia de metales pesados si afecta a la actividad enzimática de la ureasa, principalmente en los puntos más cercanos a los jales mineros, sin

Figura. 2. Jales mineros de Villa de la Paz-Matehuala Figura. 3. Zona de muestreo


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mitocondriales en un organismo, existe la hipótesis de que las mitocondrias en una célula, así como el número de copias de su genoma es dinámica a lo largo del desarrollo. Una particularidad de estos organelos es que poseen un sistema genético de expresión que les permite replicar, transcribir y traducir la información genética que contienen (Solano et al., 2001). En el ser humano el ADNmt constituye una molécula circular de 16.569 pares de bases que contienen información para 37 genes que codifican para ARNs ribosomales (ARNr), ARNs de transferencia (ARNt), proteínas involucradas en la síntesis de proteínas y un conjunto de subunidades polipeptídicas de los complejos membranales translocadores de protones de la FOS-OX (González et al., 2003). El genoma mitocondrial del Ratón resulta ser homólogo en su secuencia y organización genética al ADNmt humano (Bibb et al., 2004), por lo que es de gran ayuda en la investigación de enfermedades hereditarias. Por lo anterior, y con el fin de poder medir el cociente de ADNmt y ADN genómico a lo largo de cualquier estadio en el desarrollo embrionario y en la vida adulta del ratón, en este trabajo se buscó estandarizar la amplificación de un fragmento de ADN mitocondrial y un fragmento de un gen unicopia genómico utilizando sondas (FAM y JOEN) para detectar un gen mitocondrial y el gen PtgS2 en una misma reacción de qPCR en Dúplex, a partir de diferentes concentraciones de DNA total obtenido de telencéfalo de un embrión de ratón en el estadio 13.5.

MÉTODOS Y MATERIALES

Obtención de la muestra Se sacrificó un ratón hembra de 13.5 días de gestación por dislocación cervical, se extrajeron los embriones y se eligió un embrión, el cual se decapitó para la obtención del telencéfalo. Este se guardó a 4ºC para su procesamiento.

Purificación de DNA total con kit Promega™ En un tubo epppendorf estéril se colocó el telencéfalo con 600µL de solución de lisis en hielo y se homogenizó perfectamente con un homogeneizador de tejido. La muestra se incubó 15 min en un baño seco a 65ºC, posteriormente se agregaron 3µl de la enzima ARNasa, se homogenizó y se incubó a 37ºC en una incubadora por 15 minutos. Después se agregaron 200 µl de solución de precipitación de proteínas, incubándose 5 min en hielo, se mezcló por inversión y se centrifugó 10 min a 13600xg. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo con 600 µl de isopropanol y se mezcló por inversión; este se centrifugó por 1 min a 13000xg. Se descartó el sobrenadante y la pastilla se lavó con 600 µl de etanol al 70% (-4ºC). El tubo se centrifugó por 1 min a máxima velocidad en una microcentrífuga. Se eliminó el etanol y se dejó secar el tubo a 37ºC por 40 min en una incubadora. Finalmente, la pastilla se resuspendió perfectamente en 100 µl de agua libre de nucleasas y se incubó 5 min a 65ºC en un baño seco, hasta obtener la consistencia homogénea, la muestra purificada se conservó a -20ºC.

Cuantificación de DNA total Para medir la pureza y concentración de DNA total purificado se tomaron 2 µl de la muestra y se midieron con el espectrofotómetro para ácidos nucleicos NanoDrop de Thermo Scientific™ utilizando un blanco de agua, con la relación 260/280 (pureza) y 230/260 (contaminación). Para la cuantificación en el lector de placas de fluorescencia Varioskan Flash de Thermo Scientific™ se midieron estándares de 100, 30, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 y 0 ng/µl para obtener una curva de calibración. Para esto se preparó una mezcla con 7524 µl de buffer 1X y 76 µl de colorante intercalante de DNA. Se agregaron 10 µl de cada estándar y 1 µl de la muestra de interés por triplicado a 200 µl de la mezcla por separado en una placa con 96 pozos.

Digestión con enzima Hind III

La digestión enzimática se realizó en un microtubo, con 18 µl de agua libre de nucleasas, más 2 µl de buffer Tango, 1 µl de la muestra de DNA y 1 µl de la enzima Hind III, se mezcló en vortex y se incubó a

ESTANDARIZACIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN POR qPCR DUPLEX DEL COCIENTE DNA MITOCONDRIAL Y DNA GENÓMICO

EN EL DESARROLLO DE CEREBRO EMBRIONARIO DE RATÓN

1Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Romualdo del campo No. 501, Fracc. Rafael Curiel, C.P. 79060, Cd. Valles, S.L.P., México; [email protected]; 2Instituto de Neurobiología, Unidad de Proteogenómica, Boulevard Juriqui-

lla #3001, C.P. 76230, UNAM-Campus Juriquilla, Querétaro Qro. México; [email protected]

De La Rosa Hernandez, M.1; Antaramian Salas, A.2

RESUMEN Existe la hipótesis de que la cantidad de mitocondrias en una célula y el número de copias de su genoma es dinámica durante el desarrollo, el uso de ratones como modelos animales y su semejanza genómica han sido de gran ayuda en la investigación. Es motivo de estudio el papel que tienen las mitocondrias en el metabolismo, envejecimiento y fisiopatogenia de enfermedades en los seres humanos (Rodríguez et al., 2010). En el presente trabajo se estandarizó exitosamente la cuantificación por qPCR Dúplex del cociente del mtDNA y el gDNA amplificando un fragmento del genoma mitocondrial y un intrón de un gen genómico utilizando un par de sondas con dos fluoróforos (FAM y JOEN) en la misma reacción a partir de diferentes concentraciones de DNA total extraído de telencéfalo de ratón, en el estadio 13.5 de desarrollo embrionario. Finalmente se mencionan variables que pueden interferir como la degradación de la muestra.

ABSTRACT The number of mitochondria in a cell and its genome copies are dynamic throughout development, the use of animal models such as mice and genomic similarity have been helpful in research. The functional mitochondrial role in metabolism, aging and disease pathogenesis in humans is an interesting field of research (Rodríguez et al., 2010). In the present study, we standardized successfully the optimal conditions of Duplex qPCR using a pair of probes with two different fluorophores (FAM and JOEN) in order to determine the mtDNA/gDNA ratio using different concentrations of total DNA extracted from mouse telencephalon at day 13.5 of embryonic development. Finally mentioned variables that can interfere as the degradation of the sample. Palabras Clave: qPCR-Dúplex, DNA mitocondrial, sonda-FAM-JOEN, gen-PtgS2, Telencéfalo

INTRODUCCIÓN Las células eucariontes tienen organelos llamados mitocondrias, la principal función de estas es proporcionar energía al metabolismo celular. Esta energía es sintetizada en forma de ATP a partir de la cadena transportadora de electrones durante la fosforilación oxidativa (FOS-OX) (Rodríguez y González, 2009). Sin embargo, las mitocondrias son organelos biológicos dinámicos, es decir, más que brindarnos energía celular, también pueden sufrir alteraciones que podrían heredarse (Maron, 2015) originando enfermedades neurológicas importantes. Aunque no se conoce con certeza la cantidad de genomas


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productos de qPCR secuenciados mostrados en la tabla 3. Afortunadamente la aplificación de ambos genes pudo realizarse (DNAmt en verde) y DNAg en azul) con las concentraciones utilizadas en el ensayo (fig. 4). La curva estándar se hizo en base a los resultados obtenidos durante la estandarización, ya que las concentraciones usadas de DNA y oligos PtgS2 no permitían una amplificación óptima para detectar el gen PtgS2; Se obtuvieron valores para el R2 de 0.96 y 0.98, curva del mitocondrial y del PtgS2 respectivamente (figura 6). Se observó que con mayores concentraciones de oligos y DNA el PtgS2(rojo) se detecta dentro del rango dinámico en el que ocurre la reacción (figura 5).

Figura 1. Digestión de DNA total con Hind III en gel de agarosa al 1%; A) DNAt sin

digerir, B) DNAt digerido

Figura 3. Curva estándar y

correlación lineal: 100, 30, 3, 1, 0.3, 0.1 y 0.03 ng de DNA.

Tabla 1. Florescencia de la muestra medida por triplicado y concentración obtenida por el Varioskan flash a partir de la

ecuación de la recta

Florescencia ng/µl Promedio ng/µl Desviación Estándar

102.2 86.627 87.64

2.096

106.5 90.301

102.3 86.713

A

y = 1.1705x + 0.8026R² = 0.9994

0

50

100

150

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100

Flor

esce

ncia

ng/µl

Figura 2. Valor de florescencia obtenido por el Varioskan, A) Estándares 100, 30, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 y 0 ng/µl, B) Muestra

Telencéfalo de E8 por triplicado

B A B

37ºC por una hora. La integridad del DNA total purificado se evaluó mediante electroforesis, para ello se preparó un gel de agarosa al 1%, en 30ml de buffer TB 0.5X, más 1µl de reactivo Gelred™. Se cargaron 11 µl de la muestra digerida con 4 µl de amortiguador de carga, la electroforesis se corrió a 100 volts durante 40 minutos y se visualizó en un transiluminador de luz UV.

Estandarización de PCR en tiempo real-DUPLEX Para la estandarización de la cuantificación del Genoma mitocondrial y el Genoma Nuclear en diferentes estadios del desarrollo embrionario de ratón con qPCR-Dúplex se construyó una curva utilizando diluciones a partir de 50 ng/µl de DNA purificado y un par de sondas. Se prepararon concentraciones a 100 ng/µl, 50 ng/µl y 5 ng/µl para determinar la concentración de DNA óptima de amplificación de reacción de la qPCR. Para esto se preparó una mezcla para 5 y 2 tubos por separado, fueron agregados 20 µl y 8 µl de Master Mix de Promega™, 5 y 2 µl mezcla de oligos Mitocondriales (150 nM), 1.5 y 0.6µl de oligos For y Rev de la sonda PtgS2 (300nM) y 18.5 y 5.4 µl de agua grado qPCR respectivamente. Se agregaron 9 µl de la mezcla para 5 tubos más 1µl de DNA a 50 y 5 ng/µl por duplicado, mientras que para la concentración de 100 ng/µl se tomaron 8 µl de la mezcla para 2 tubos más 2 µl de DNA a 50 ng/µl. Los tubos sin burbujas se centrifugaron 10 seg. a máxima velocidad y se colocaron en la gradilla del StepOne de Applied Biosystems ™ para realizar la corrida. Las condiciones óptimas para la reacción fueron: desnaturalización a 95ºC por 10 min., 40 ciclos amplificación a 92ºC por 15 segundos y 60ºC por 1 min. Los datos obtenidos se analizaron en el software de StepOne Real-Time PCR System.

Curva estándar en qPCR-Dúplex Se prepararon 6 diluciones 1:3 a partir de 100 ng/µl de DNA genómico proporcionada por el laboratorio para una curva estándar bajo diferentes condiciones de concentración de oligos del set de PtgS2 y de DNA. Para esto se preparó una mezcla para 20 tubos con 20µl de agua grado qPCR, 20µl del set de PtgS2, 20µl de oligos mitocondriales y 80µl de Master Mix de Promega ™. Después 7µl de la mezcla anterior fueron agregados a cada tubo más 3µl de DNA a 40, 13.3, 4.4,1.46,.48 y.16 ng/µl por triplicado.

RESULTADOS

La calidad del DNA total obtenido a partir del telencéfalo de embrión de ratón se observa en la figura 1, en el tercer carril del gel de agarosa se muestra la integridad del DNA, un barrido bien definido por los múltiples cortes de la enzima Hind III durante una hora de digestión. De acuerdo a los valores obtenidos en el NanoDrop, el DNA extraído mediante kit tiene un cociente 260/280 de 1.86, y un cociente de 230/260 de 2.08 con una concentración de 338 ng/µl. Estos datos son favorables para un DNA puro y limpio con valores aproximados a 1.8 y 2.0-2.2, valores menores a estos indican contaminantes que absorbe a 230 nm (Glassing et al., 2016). Sin embargo, el NanoDrop sobreestima los valores de concentración, por lo que se determinó con el Varioskan las concentraciones reales, en la figura 2 se presenta la florescencia tanto de los estándares, como de la muestra por triplicado. La figura 3 indica la correlación entre cada uno de los estándares y la curva de calibración para determinar concentraciones. El DNA extraído tubo una concentración de 87.64 ng/µl (tabla 1). Respecto a la estandarización, se logró amplificar el gen mitocondrial y el gen PtgS2 (prostaglandina-endoperóxido sintasa) utilizando concentraciones de 100 y 50 ng/µl de DNA total de telencéfalo de ratón en el estadio 13.5. Sin embargo, en este primer ensayo el gen PtgS2 no se detectó a 5ng/µl de DNA, esto puede ser debido a que el DNA mitocondrial es mucho más abundante que el nuclear en el desarrollo. Los CT obtenidos por la amplificación con las sondas FAM y JOEN se muestran en la tabla 2, se observa mínima variación entre duplicados, pero entre diluciones existe una diferencia menor de 1.5 ciclos, esto indica que existen errores en la técnica de pipeteo al depositar la muestra. Todas las muestras están dentro del rango dinámico de detección de 10 a 33 ciclos aproximadamente. Por otra parte, los productos amplificados corresponden a los genes diana ya que se utilizaron oligos y sodas definidas a partir de


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Figura 5. Curva de amplificación a 120, 39.99, 13.2, 4.38, 1.44 y 0.48 ng/ µl de DNAt con mayores concentraciones de set de oligos PtgS2 (rojo) y muestra.

Figura 6. A) Curva estándar para el gen mitocondrial: pendiente -3.35, R2 0.96, eficiencia 94.9%; B)

Curva estándar para el PtgS2: pendiente -3.5, R2 0.98, eficiencia 92.89%

CONCLUSIONES Se comprobó que el DNA mitocondrial y el gen PtgS2 pueden ser amplificados en la misma reacción de qPCR dúplex con concentraciones de 50 y 100ng de DNA total de tejido cerebral de ratón utilizando un par de sondas (FAM y JOEN), mezcla de oligos mitocondriales y set de oligos para PtgS2. Lo anterior es de gran importancia ya que este trabajo demuestra que estas condiciones son óptimas para amplificar estos genes, esto permitirá determinar el cociente entre el DNA mitocondrial y DNA genómico para futuras investigaciones que deseen estudiar el dinamismo del genoma mitocondrial durante el desarrollo embrionario y/o del adulto, así como las posibles variaciones genéticas que ocurren en diferentes etapas de la vida. Con la curva estándar se determinó que es necesario utilizar concentraciones mayores de oligos PtgS2 y DNA para obtener una buena amplificación y detectar a PtgS2, ya que posiblemente la degradación del DNA purificado tuvo un afecto negativo durante la eficiencia del ensayo debido a la manipulación, congelación y/o descongelación de esta. Se deben trabajar muestras con un alto grado de pureza, porque la degradación no permite una amplificación óptima; además, no se recomienda utilizar conservadores porque pueden interferir o inhibir la reacción de PCR en tiempo real.

A

B

Mit Ptg2s

Tabla 2. Valores de CT obtenidos durante la amplificación del gen mitocondrial y PtgS2 por

qPCR Duplex utilizando las sondas FAM y JOEN en el sofware del StepOne

Muestra

ng Gen Sonda CT

0 Mit JOEN FUERA DE RANGO (34.031)

0 PtgS2 FAM INDETERMINADO 100 Mit JOEN 13.098 100 PtgS2 FAM 25.209 100 Mit JOEN 12.713 100 PtgS2 FAM 25.562 50 Mit JOEN 13.11 50 PtgS2 FAM 38.031 50 Mit JOEN 14.858 50 PtgS2 FAM 38.316 5 Mit JOEN 15.685 5 PtgS2 FAM INDETERMINADO 5 Mit JOEN 16.999 5 PtgS2 FAM INDETERMINADO

Figura 4. Curva de amplificación de DNA

mitocondrial y nuclear a 100, 50 y 5 ng/µl de DNA total de telencéfalo de ratón con 13.5 días de

desarrollo embrionario

PRIMER/SONDA GEN MITOCONDRIAL Secuencia 5’-3’

GEN PtgS2 Secuencia 5’-3’

Oligo fw AACAACCAACAAACCCACTAA TACCCATGGCTCACAGAATTG

Oligo rev TATTTCTACACAGCATTCAACTGC GTCTGTAGTTATTGGTGAGGGC

FAM --------------------------------- TGGTTGACTAGGGTTTGGGTCAGA

JOEN GCAGTTGAATGCTGTGTAGAAATA ---------------------------------

Tabla 3. Secuencias de Primer y Sondas utilizadas para la estandarización de la cuantificación de genoma nuclear y mitocondrial a partir de productos de qPCR ya secuenciadas.


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USO DE LA ESPECTROSCOPIA RAMAN PARA EL ANÁLISIS DE LESIONES EN PIEL

¹Universidad Autónoma de Coahuila, Facultad de Ciencias Biológicas, Blvd. Torreón-Matamoros Km 7.5, Ejido el Águila, Ciudad Universitaria, C.P. 27275, Torreón, Coah, MÉXICO, [email protected]; ²CIACYT, Laboratorio Nacional, UASLP, Av. Sierra Leona 550, Lomas 2ª sección,

C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P, MÉXICO, [email protected]

Delgado Chávez, A. C.¹; González Contreras, F. J.²

RESUMEN Las biopsias ópticas se consideran técnicas no invasivas para el estudio de distintas muestras, proporcionan huellas digitales acerca de la composición molecular y química, así como los cambios químicos entre muestras de piel, pudiendo llegar a diferenciar entre una muestra de piel con cierta lesión y piel sana. En este estudio se presentan espectros Raman in vitro de una muestra de piel humana. Mediante el uso de mapeo automático con un espectrómetro Raman se obtuvo una imagen en 2D mostrando un mapa de Fluorescencia en su superficie respecto a un componente específico de la piel y las variaciones del componente en cada sección de la muestra, proporcionando información complementaria a histología para el diagnóstico de una enfermedad en la piel por medio de una técnica óptica no invasiva.

Palabras clave: biopsia óptica, espectroscopia Raman, imagen por Fluorescencia

ABSTRACT Optical biopsies are considered noninvasive techniques for the study of different samples, providing finger prints about molecular and chemical composition, as well as chemical changes in the skin samples, allowing us to differentiate between a skin lesion and healthy skin sample. In this study are presented in vitro Raman spectra of a human skin sample. By using automatic mapping with Raman spectroscopy, a 2D image was obtained showing a Fluorescence map over its surface with respect of a specific skin component and the variations of the component in each section of the sample, providing additional information for histology in the diagnosis of a skin disease by using a non-invasive technique.

Keywords: optical biopsy, Raman spectroscopy, Fluorescence imaging.

INTRODUCCIÓN El cáncer de piel es el más común entre los diferentes tipos de cáncer que existe; el melanoma conforma el 1% de los casos de cáncer de piel y la causa de la mayoría de muertes por cáncer (American Cancer Society, 2015), en estados unidos han sido diagnosticados 3.5 millones de casos, incrementando en un 3% la tasa anual. La identificación de melanomas es generalmente realizada por dermatólogos, en la cual una evaluación para lesiones requiere de biopsias quirúrgicas, mismas que se vuelven imprácticas para

BIBLIOGRAFÍA

Glassing A., Dowd S. E., Galandiuk S., Davis B. y Chiodini R. J., (2016). Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples; Gut Pathogens, 8:24, pp 1-12. Maron F. D., (2015) Recortar el ADN mitocondrial dañado en ratones y células humanas es un paso hacia la prevención de enfermedades hereditarias graves. En Revista Scientific American en español Vol. 248, Issue 3, Consultada en http://www.scientificamerican.com/espanol/noticias/controversial-gene-editing-approach-gains-ground/(fecha de consulta 04-07-2016). Rodríguez-Violante M., Cervantes-Arriaga A., Vargas-Cañas S. y Corona T. (2010) Papel de la función mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas; Una Revisión, Rev. Arch. Neurocien (Mex) Vol. 15, No. 1: 39-46, Enero-marzo, pp. 39-46. Rodríguez-Salinas E. y González-Halphen D., (2009) Los genomas mitocondriales: ¿Qué nos dicen sobre la evolución de las algas verdes? Una Revisión; Revista Latinoamericana de Microbiología, Vol. 52, Nos. 1-2, Enero-marzo, pp. 44-57. Bibb M. J., Van Etten R. A., Wright C. T., Walberg M. W. y Clayton D. A., (2004) Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA, Journal Cell, Volumen 26, Número 2, Parte 2, octubre, pp.167-180. González-Halphen D., Pérez-Martínez X., Funes S., Reyes-Prieto A. y Santillán-Torres J. L., (2003) La migración de genes de la mitocondria al núcleo y la evolución de los genomas mitocondriales. En Mensaje bioquímico UNAM, Vol. 27, pp. 201-219. Solano A., Playán A., López-Pérez M. J., Montoya J., (2001) Enfermedades genéticas del ADN mitocondrial humano, una revisión. Revista de Salud Pública Mex; Vol.43, No. 2, Marzo-abril, pp.151-161.


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Fig. 1 Morfología de muestra de piel tomada en SEM. A imagen reconstruida de morfología completa de la muestra del SEM. B acercamiento de región del mapeo. C región de la muestra

donde se realizó el mapeo. D imagen óptica de la muestra.

Mediante el uso de la microscopia Raman se pueden reconstruir imágenes tanto de espectros Raman (fig.2B, fig.3A) como espectros de Fluorescencia (fig.2C, fig.3B) y con ellas ver las diferencias de tonalidades en una escala de 0 a 1, lo cual significa una diferencia de la proporción de lo que es el polisacárido (fig.2B, 2C) y la amida III en la muestra (fig.3A, 3B).

Fig. 2 Reconstrucciones de la imagen a partir del polisacárido en la banda de 848cmˉ ¹. A. Región de la imagen obtenida con el SEM. B. Imagen reconstruida a partir de espectros de Fluorescencia.

C. Imagen reconstruida a partir de espectros Raman.

Fig. 3 Reconstrucciones de la imagen a partir del compuesto Amida III en la banda de 1270cmˉ ¹. A. Imagen reconstruida a partir de espectros de Fluorescencia. B. Imagen reconstruida a partir de

espectros Raman.

A B

C

A D

A B C

A B

individuos con gran cantidad de lesiones (Zeng, Lui, & McLean, 2011) y la precisión de su diagnóstico está entre el 49 y el 81%, con un tercio de melanomas diagnosticados erróneamente. En los últimos años ha surgido un método de biopsia óptica el cual se encuentra bajo investigación para el diagnóstico de lesiones en la piel (Lui, Zhao, McLean, & Zeng, 2012) el cual puede mejorar la especificidad de los diagnósticos reduciendo falsos positivos, debido a su habilidad para detectar cambios moleculares asociados con patologías de tejido (Zeng, Lui, & McLean, 2011). La identificación de lesiones y enfermedades se lleva a cabo a través de las características generales y los cambios específicos en cantidad y/o conformación de los ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y carbohidratos de una muestra (Choo-Smith, y otros, 2002). La espectroscopia Raman permite dicha identificación mediante variaciones estructurales de los picos del espectro, correspondientes a vibraciones de la cantidad y/o conformación de los compuestos antes mencionados, proporcionando así una huella digital del tejido (González, y otros, 2012). El objetivo de este proyecto es analizar y obtener una imagen mediante microscopía electrónica de barrido y espectroscopia Raman, a fin de demostrar la utilidad de las biopsias ópticas en el diagnóstico de enfermedades de piel.

METODOLOGÍA La muestra analizada de piel procede de una biopsia realizada en el Hospital Central Dr. Ignacio Morones Prieto de la ciudad de San Luis Potosí, misma que fue cubierta de parafilm para su conservación y mejora en la manipulación. La muestra fue estudiada morfológicamente utilizando el equipo SEM (JEOL, NeoScope JCM-5000) mediante aumentos de 44x, 10kv y bajo vacío. Los espectros Raman fueron obtenidos mediante mapeo automático en una región 51.56x51.63μm, con un espectrómetro Raman (Horiba Scientific Xplora Plus) utilizando un aumento de 10x, un láser infrarrojo de longitud de 785nm y una potencia de 100%, con un rango de longitud para medición de la muestra de 500 – 1800 cm��. Una vez obtenidos los espectros con el mapeo, se procesaron mediante el programa Vancouver Raman Algorithm a fin de remover la fluorescencia de cada uno de ellos. Los datos de los espectros obtenidos del programa Vancouver se tabularon y se eligió la longitud de la banda en 848.195cm-¹ el cual representa un polisacárido, y la longitud de la banda en 1270.27cm-¹ y con los 100 espectros de dichas banda se realizaron matrices de 10x5 mismas que se llevaron a normalización tomando el valor máximo como 1 y el valor mínimo como 0. Con las matrices se reconstruyó la imagen de la misma región seleccionada del SEM obteniendo una imagen 2D con un mapa de Fluorescencia sobre su superficie, mediante el uso del software MATLAB.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La microscopia electrónica de barrido (fig.1A) proporcionó una imagen con mayor claridad, la cual se pudo amplificar 44x, mostrando la región específica que se llevó a cabo en el mapeo con el espectroscopio Raman (fig. 1B, 1C) y teniendo un enfoque más nítido que el que se obtiene con una imagen óptica (fig. 1D).


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PAPEL DEL GLUCOCÁLIX EN LA CONTRACCIÓN INDUCIDA POR BRADICININA

Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Carranza No. 2405, CP.78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; [email protected]; arlo92000@

yahoo.com.mx

Delgado Cruz J. A.; Espinosa Tanguma, R.; Hernández Méndez, A.

RESUMEN El glucocálix de las células endoteliales es una capa superficial compuesta principalmente por proteoglucanos, que incluyen heparan sulfato, condroitin sulfato y ácido hialurónico, así como glucoproteinas. El glucocálix ha sido estudiado extensamente por su papel en la mecanotransducción celular a lo largo de la última década. No obstante, los mecanismos mediante los cuales las células de músculo liso sienten y transforman la presión de tipo “shear stress” en una respuesta celular bioquímica no han sido determinados. El presente estudio fue diseñado con el fin de examinar el efecto de la Bradicinina en arterias carótidas de cobayos Americanos y para investigar la participación del endotelio intacto, así como del glucocálix mediante la remoción del mismo. La Bradicinina produjo una respuesta dependiente de la dosis y el flujo. Así como también se observó un aumento de la respuesta contráctil de las arterias en las arterias tratadas con heparinasa.

ABSTRACT The glycocalyx of the endothelial cells is a surface layer composed primarily of proteoglycans, that includes heparan sulfato, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid, and glycoproteins. The EC glycocalyx has been studied extensively for its role in cellular mechanotransduction over the last decade. However, the mechanisms by wich SMCs sense and transform shear stress into cellular biochemical responses have not been conclusively determined. The present study was designed in order to examine the effect of bradykinin on isolated guinea pig carotids arteries and to investigate the role of intact endothelium, as well as the glycocalyx by mean of removing it. Bradykinin produced a dose-and flow dependent-contractions of the isolated guinea pig carotid arteries and contrary to what was believed, in lack of glycocalyx, the contractile response to bradykinin is higher. Palabras clave: Glucocálix, Bradicinina, Arteria carótida, Músculo liso vascular

CONCLUSIONES Gracias al uso de la microscopia electrónica en conjunto con espectroscopia Raman se puede obtener una imagen bidimensional la cual proporciona información complementaria al equipo de histología, debido a que se obtienen proporciones de un compuesto en una misma muestra pudiendo observar las variaciones y llegar a un diagnóstico más preciso. Perspectivas futuras se centran en la cuantificación de algunos de los componentes de la piel, así como encontrar las variaciones de más componentes en la piel que llegan a causar enfermedades en ella.

BIBLIOGRAFÍA

AMERICAN CANCER SOCIETY. (13 de Mayo de 2015). American Cancer Society. Recuperado el 08 de Junio de 2016, de Cáncer de piel tipo melanoma: www.cancer.org. ZENG, H., LUI, H., & MCLEAN, D. I. (2011). Skin cancer detection using in vivo Raman spectroscopy. SPIE, 1-3. LUI, H., ZHAO, J., MCLEAN, O., & ZENG, H. (2012). Real-time Raman Spectroscopy for In Vivo Skin Cancer. American Association for Cancer Research, 72, 2491-2500. CHOO-SMITH, L.; EDWARDS, H.; ENDTZ, H.; KROS, J.; HEULE, F; BARR, H.; ROBINSON, J. S.; BRUINING, A. & PUPPELS, G. (2002). Medical Applications of Raman Spectroscopy: from Proof of Principle to Clinal Implementation. National Research Council of Canada, 67, 1-9. GONZÁLEZ, J.; MARTÍNEZ , J.; MARTÍNEZ, B.; PALOMARES , P.; TORRES, L.; VARGAS, H.; GALLEGOS, L.; GONZÁLEZ , R.; JUÁREZ, H. & ESPINOZA, P. (2012). Aplicaciones de la espectroscopia Raman de superficie amplificada en el diagnóstico del cáncer basado en el análisis de muestras de suero sanguíneo. Ide@s CONCYTEG, 1091-1100.


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PREPARACIÓN DEL TEJIDO Las arterias carótidas izquierda y derecha fueron cuidadosamente aisladas de los cobayos, disecadas del tejido graso y conectivo e inmediatamente sumergidas en solución de Krebs. Se introdujo una cánula en sentido del flujo sanguíneo normal y fue sujetada con hilo para posteriormente conectar la cánula y la arteria a un sistema de flujo alimentado por una bomba peristáltica. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Después del procedimiento inicial que se llevó a cabo con el animal, se hizo pasar un flujo de 5 ml/min a través de la arteria durante quince minutos por sistema de flujo antes comentado, esto para predisponer a las arterias a la fuerza de tensión a la que serían expuestas. Posteriormente aumentamos el flujo a 16 ml/min durante cinco minutos con el mismo propósito, este es el flujo máximo utilizado durante el experimento. Cabe mencionar que la fuerza de tensión fue siempre detectada a través de un transductor, el cual nos indicaba a través del sistema BIOPAC MP 100 la presión ejercida en las paredes arteriales (mmHg). Después de haber preparado a la arteria con los flujos de 5 y 16 ml/min respectivamente, se bajó el flujo hasta 11 ml/min durante cinco minutos y posteriormente se añadieron 50 microlitros de Bradicinina 1 µM cada cinco minutos durante veinte minutos. Finalmente se pasó a un flujo de 16 ml/min y se repitió el procedimiento realizado con el flujo de 11 ml/min.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bradicinina (1 µM) produjo una respuesta contráctil en arterias carótidas intactas aisladas de cobayo que fue dependiente de la dosis y el flujo, ya que la respuesta contráctil observada durante estos (11 ml/min y 16 ml/min), mostró variaciones con cada dosis aplicada. (Figuras 1 A y B).

Figura 1 A. En esta figura se muestra la representación del protocolo realizado con una arteria carótida intacta aislada de cobayo, se observa la disminución de la respuesta contráctil durante el

flujo de 11 ml/min así como el aumento de la misma cuando el flujo se aumentó a 16 ml/min.

INTRODUCCIÓN Las cininas son una familia de péptidos vasoactivos que incluyen Bradicinina, Calidina y Metionil-lisil-bradicinina, los últimos dos compuestos son convertidos rápidamente a bradicinina por aminopeptidasas. Bradicinina es una molécula de bajo peso molecular, la cual es rápidamente metabolizada por metaloproteasas incluyendo la Enzima Convertidora de Angiotensina, Endopeptidasas neutras, Carboxipeptidasas N y Aminopeptidasas P. La Bradicinina tiene una corta vida en plasma de en promedio 15 seg., y sus niveles circulantes son usualmente bajos. La Bradicinina controla y modula procesos fisiológicos importantes y ha sido reconocida como una herramienta farmacológica excepcionalmente útil. Por ejemplo, la Bradicinina ejerce potentes efectos antihipertensivos, antitrombogénicos, antiproliferativos y antifibrogénicos, además, participa en procesos inflamatorios activando células endoteliales para promover vasodilatación e incrementar la permeabilidad vascular, produciendo los síntomas clásicos de inflamación como enrojecimiento, calor, hinchazón y dolor. Las cininas ejercen su actividad a través de la activación selectiva de receptores cinina específicos. Este grupo de receptores engloba dos tipos bien definidos, llamados receptores de cininas B1 y B2. Dos receptores adicionales han sido además propuestos, llamados B3 y B4 aunque estos están aún bajo investigación. El receptor B1 (inducible, de desensibilización lenta) y el B2 (expresado constitutivamente, de desensibilización rápida) son receptores acoplados a proteínas G que interactúan principalmente por la vía de proteínas Gq y Gi y también independientemente de proteínas G a través de efectos intracelulares. Por ejemplo, la unión de Bradicinina al receptor B2 endotelial deriva en la producción de óxido nítrico, formación de prostaciclina, elevación de calcio intracelular y la formación de factor hiperpolarizante desencadenando vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular. El glucocálix de las células endoteliales, una estructura que recubre la superficie luminal del endotelio vascular, y su mecanotransducción relacionada han sido estudiadas por muchos durante los últimos años. De cualquier forma, el papel del glucocálix de las células de músculo liso vascular en la mecanotransducción celular ha desencadenado cierta atención. Muchas funciones residen en el glucocálix de las células endoteliales: limita el intercambio de solutos entre el plasma, las células endoteliales y el intersticio y media la adhesión leucocitaria, la extravasación y mantenimiento de un ambiente anticoagulante. En añadidura, estímulos aplicados al endotelio luminal modula funciones parenquimales a través de la liberación de efectores parácrinos. Uno de estos estímulos es el flujo sanguíneo. Este trabajo pretende poner en claro el papel del glucocálix en la respuesta contráctil inducida por bradicinina así como las diferencias existentes al cambio de fljujo.

METODOLOGIA ANIMALES Nuestro proyecto fue desarrollado con cobayos machos, con un peso de entre 600 y 700 gr, mantenidos en el bioterio de la Facultad de Medicina UASLP, bajo condiciones de un ciclo estándar de luz (12 hrs. de luz/ 12 hrs. de ciclo oscuro), una adecuada temperatura (21±1°C) y humedad(75±1%). Cada cobayo fue inyectado con una dosis de Pentobarbital sódico (0.1 ml x 100 gr., 80 mg/Kg) ) y Heparina (0.200 ml) vía subcutánea, posteriormente se mantuvo al cobayo bajo condiciones de oscuridad y sin ruido durante 10 a 15 minutos. Antes de comenzar con el aislamiento de las arterias carótidas se corroboró que la dosis hubiera sido efectiva mediante la aplicación de un estímulo en la pata del animal.


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Una de las hipótesis planteadas al inicio del proyecto fue el importante papel que desempeñaría el glucocálix en la respuesta contráctil inducida por bradicinina y que posterior a la denudación en la arteria carótida de este, la contracción en cada dosis sería igual o menor que en las arterias intactas. Por el contrario, lo observado después del tratamiento de la arteria con heparinasa indican que si bien el glucocálix ejerce un papel en la respuesta contráctil de la arteria carótida de cobayo, no lo hace de una manera positiva ya que los porcentajes de la contracción en la arteria fueron mayores cuando se le extrajo el glucocálix en relación con la arteria intacta. (Figura 3).

Figura 3. Esta figura nos muestra la comparación de las respuestas contráctiles inducidas por Bradicinina en los dos flujos diferentes utilizados.

Es bien conocido que la Bradicinina ejerce diversos efectos a nivel cardiovascular tanto en el ser humano como en diferentes especies; se han documentado trabajos que demuestran los efectos contráctiles en vasos sanguíneos de cobayos y el papel que desarrolla el endotelio en estas respuestas es importante, no obstante existen aún muchas interrogantes sobre los mecanismos implicados. Con el estudio anterior se puede observar que en la respuesta contráctil inducida por Bradicinina, el flujo juega un papel importante, así también, el glucocálix interfiere por mecanismos que aún no están claramente dilucidados.

CONCLUSIONES Dentro de las contribuciones más importantes que se obtuvieron por medio de este trabajo se encuentran:

Se pudo obtener una contracción inducida por Bradicinina en arterias carótidas intactas de cobayo.

En las respuestas contráctiles existen diferencias en cada una de las dosis durante los flujos de 11 ml/min y 16 ml/min por lo que se concluye que la respuesta a Bradicinina es dependiente del flujo.

Bajo un flujo de 11 ml/min existe decremento de la respuesta contráctil con cada dosis aplicada, por el contrario, durante el flujo de 16 ml/min la respuesta es igual o mayor a la máxima respuesta registrada bajo el flujo menor.

El glucocálix ejerce un papel importante durante la contracción inducida por Bradicinina.

Figura 1 B. La gráfica anterior representa el porcentaje de las respuestas contráctiles observada en cuatro estímulos simultáneos sobre las arterias carótidas durante los diferentes flujos. (n=4)

Los resultados observados durante el protocolo indican que las respuestas contráctiles a Bradicinina de las arterias carótidas intactas durante el flujo de 11 ml/min fue disminuyendo, lo anterior debido probablemente a que se produjo desensibilización de los receptores. Por el contrario, a flujo de 16 ml/min la respuesta observada por parte de la arteria intacta en cada dosis fue considerablemente mayor en relación con los estímulos durante el flujo de 11 ml/min. La variación de los resultados en cada uno de los flujos nos indica que la respuesta contráctil a diferentes flujos puede estar mediada por receptores y/o mecanismos diferentes. Posteriormente, los resultados obtenidos de las contracciones inducidas por Bradicinina en arteria carótida de cobayo tratada con heparinasa revelan que las contracciones fueron aún mayores que las mostradas por las arterias intactas. (Figura 2 A y B). Cabe mencionar que por cuestiones de tiempo, no se pudieron reproducir los resultados con arterias tratadas con heparinasa por lo que n fue igual a 1.

Figura 2 A. Representación del protocolo en arteria

tratada con heparinasa. Figura 2 B. Respuestas contráctiles en cuatro

estímulos simultáneos sobre la arteria carótida tratada con heparinasa durante los diferentes flujos.


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ESTUDIO DE CELDAS MICROELECTROFORETICAS PARA MEDIR POTENCIAL ZETA

1Instituto Tecnológico De Villahermosa, Carretera Villahermosa-Frontera Km. 3.5, Ciudad Industrial, C.P. 86010 Villahermosa, Tabasco., MÉXICO, [email protected]; 2Unidad académica de física, Universidad Autónoma de Zacatecas, Calzada Solidaridad, Hidráulica, C.P. 98068 Zacatecas, Zac., MEXICO, [email protected]; 3Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava 6, Zona Universitaria, C.P. 78290 San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO;

[email protected], [email protected]

Díaz De la Cruz, C. G.1; Sánchez Gallegos, J. A.2; Ramírez Saito, M. de los A.3; Arauz Lara, B. J. L.3

RESUMEN Los coloides están en todas partes, entre ellos cosméticos, la leche y pinturas, por lo tanto la medición del potencial zeta puede ser utilizado para su conocimiento y control. El potencial zeta es una medida de la magnitud de repulsión o atracción entre partículas, utilizada en la técnica de microelectroforesis, siendo esta ultima un método de estudio de diversas partículas dispersas utilizando microscopia óptica. Este método permite la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico, dando lugar a una imagen de partículas en movimiento, dentro de un medio cerrado con observaciones críticas de enfoque y el ajuste de la lente del microscopio. En esta dirección el siguiente proyecto de investigación permite el estudio de diversas celdas micro electroforéticas, con el propósito de analizar sus componentes y ubicar materiales, dando lugar a la elaboración de celdas, con dos tipos de electrodos, para analizar el comportamiento de las partículas. Palabras claves: Electrodos, microelectroforesis, celda.

ABSTRACT Colloids are everywhere. Cosmetics, milk and oils are colloids; therefore measuring their zeta potential can be used for their information and control. The zeta potential measures the magnitude of attraction or repulsion between particles, used in the micro electrophoresis technique, the latter being a method of study of various dispersed particles using optical microscopy. This method allows the separation of molecules according to their mobility in an electric field, resulting in an image of moving particles within a closed medium with critical observations on focus and the adjusting lens of the microscope. The following research project allows the study of various micro electrophoresis cells, with the purpose to analyze their components and locate materials. This results in the development of cells with two types of electrodes, in order to analyze the behavior of particles. Key words: Electrodes, microelectrophoresis, cell.

INTRODUCCIÓN El presente trabajo consiste en el estudio y elaboración de celdas micro electroforéticas con distintos tipos de electrodos con la finalidad de obtener una que permita analizar soluciones de partículas para el estudio

BIBLIOGRAFIA

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ejemplo, la observación de los glóbulos rojos, neutrófilos y bacterias. Este tipo de electroforesis se lleva a cabo en un medio cerrado con observaciones críticas de enfoque y el ajuste de la lente de microscopio. La complejidad de este método se asocia con electro-ósmosis generada por campo eléctrico influencia en las capas dobles de las paredes de la celda, lo que lleva a la parabólica perfil de velocidad. Hay dos capas fijas, donde el fluido no se mueve. Posición de estas capas con respecto a las paredes de la celda estacionarias depende de la geometria de la celdam. Es posible enfocar el microscopio en esta capas fijas y observar el movimiento de partículas no se ve afectado con electro-ósmosis. El segundo complejidad proviene de la necesidad de diluir la muestra, si se concentró inicialmente. Siendo la concentración suficientemente baja para la observación de las partículas individuales. (Union internacional de quimica pura y aplicada, 2005). El acero inoxidable es una aleación de hierro, carbono y cromo o níquel, el contenido de cromo está entre el 13 y el 27%. Además del cromo y el níquel pueden contener otros metales para añadir nuevas características. La principal característica del acero inoxidable es su resistencia a la corrosión debido a la protección que le da el níquel, que se oxida en la superficie. El óxido de níquel es un material duro que impide que la corrosión penetre en el interior de la pieza de acero inoxidable. El acero inoxidable austenitico tienen un alto desempeño ya que proporcionan una proteccion adecuada contra la corrosion y el deterioro del material, teniendo un gran uso en el campo electrico, metalurgia y aplicaciones criogenicas (Garratt, 2000). Los aceros inoxidables ferriticos son magneticos , tienen una buena ductibilidad y son resistentes a la corrosion y oxidacion a temperaturas elevadas , este tipo de acero inoxidable son muy economicos debido a su bajo contenido de niquel, no cumplen con las caracteristicas de el acero inoxidable austenitico sin embargo puede funcionar como alternativa en algunos procesos no tan complejos como el del anterior. (Eusebio, 2012)

METODOLOGIA Para el estudio, diseño y elaboración de las celdas micro electroforéticas se llevó a cabo la indagación de diversas fuentes de información, con la finalidad de conocer las características y materiales de aquellas ya antes elaboradas, permitiendo mejorar su calidad y funcionalidad. Los componentes más importantes de una celda micro electroforética son: los electrodos, por tal motivo se elaboraron dos de diferente material (Acero inoxidable ferritico, Acero inoxidable austenitico), teniendo como objetivo observar el comportamiento de las velocidades de las partículas al momento de aplicar un campo eléctrico en cada celda con diferente electrodo y calcular el potencial zeta.

Tabla. 1. Dimensiones de los diferentes tipos de electrodos.

Tipo de electrodo Alto Ancho Largo Acero inoxidable ferritico 0.1 cm 1 cm 3 cm Acero inoxidable austenitico 0.8 cm 0.8 cm 2.9 cm

Nuestra celda consta de dos electrodos a los lados, con una distancia entre ellos de 3.8. cm aproximadamente, colocados en un porta objeto de cristal con dimensiones de 3’ x 1’ x 1.2 mm, este cuenta con un pequeño orificio para permitir el llenado de la solución con partículas a analizar. La tapa de la celda, es un cubre objeto cuyas dimensiones de 24 x 60 mm, siendo un cristal aún más delgado, este último nos permitirá la observación de la muestra cerca del objetivo del microscopio, posteriormente se usan láminas de acrílico y polietileno con grosor adaptable a cada electrodo, con la finalidad de rellenar los espacios vacíos entre el cristal y los electrodos, pegados con resina epo-tek 302. Después del secado de la celda (24 hrs), se procede a llevar a cabo el estudio de las partículas a través de microelectroforesis, la solución utilizada para llenar la celda se encuentra compuesta de 1950μL de agua

de microelectroforesis, sabiendo que es un método que permite la separación de las partículas, según su movilidad con un campo eléctrico, dando lugar a poder calcular el potencial zeta. El potencial Z es un parámetro extremadamente importante en una gran variedad de actividades industriales como las bebidas, cerámica, farmacéutica, medicina, procesado mineral o tratamiento de aguas. Muchas industrias usan grandes cantidades de agua, que pueden ser contaminadas durante procesos de producción. (Arturo, 2001). En el interior de este se especifica la metodología llevada a cabo con aquellos datos y especificaciones que se utilizaron, teniendo así una serie de resultados que ayudan a observar el comportamiento de partículas según el tipo de electrodo utilizado (acero inoxidable ferritico y austenitico), conociendo que entre las propiedades de este materiales se encuentra su alta resistividad a la corrosión, llegando a las conclusiones de saber cuál de los dos resulta ser más óptimo gracias a sus composiciones, basándonos en el comportamiento de las partículas con respecto a los datos y graficas dadas, así mismo teniendo una celda como las convencionales, sabiendo de igual forma cuales serían descartadas por su baja resistividad en los electrodos, afectando la vida útil de la celda completa.

MARCO TEORICO Las medidas de potencial zeta algunas veces son hechas usando la técnica llamada microelectroforesis. Un microscopio de alta calidad es usado para observar cómodamente las partículas coloidales que encuentran dentro de una cámara llamada celda electroforética. Dos electrodos colocados en los extremos de la cámara son conectados a una fuente de poder creándose un campo eléctrico que cruza la celda. Los coloides cargados migran en el campo y su movimiento y su dirección están relacionados con su potencial zeta. (Zeta-Meter Inc., 2009). La velocidad de particulas es medida por el potencial zeta y depende de la viscosidad del fluido donde estas se encuentran en movimiento. La parte mas importante de la microelectroforesis es la celda , esta se encuentra convencionalmente elaborada de Plexiglass (placa de acrilico). La muestra se mantiene contenida en un tubo cilindrico entre un electrodo de molibdeno positivo y un electrodo de platino negativo. El electrodo de molibdeno reacciona con algo de oxigeno formado por la electrolisis en el anodo, por lo tanto las burbujas de gas pueden causar un movimiento en el liquido. El movimiento electroforetico de las particulas puede ser observado mediante un microscopio, pero se recomienda ser calculado a partir de donde la velocidad es cero hacia el medio teniendo aproximadamente una distancia de 14.7%, es importante hacer hincapie en que la carga de la celda causara un flujo en el liquido con un perfil de velocidad laminar. (Sandvik, 1968). Para una partícula grande con una doble capa delgada moviéndose a través de un líquido estacionario, de modo que la partícula se mueve en dirección opuesta se toma en cuenta la siguiente ecuación:

𝑢𝐸 =(4𝜋𝜀0)𝐷𝜁

𝜂 = 𝜀𝜁𝜂

Donde 𝑢𝐸 es la movilidad de la partícula, ζ el potencial zeta, η la viscosidad del fluido y ε la constante dieléctrica del solvente, esta es conocida como la ecuación de Smoluchowski para la movilidad electroforética. Se puede obtener una ecuación similar haciendo balance de fuerzas eléctricas en la partícula y la ecuación de Stokes para la resistencia a la fricción para obtener:

𝑢𝐸 = 𝑣𝑒𝐸𝑧

= 𝑣𝑒𝑉/𝐿 = 𝑄

6𝜋𝑎𝜂

La microelectroforesis es un método de estudio de electroforesis de diversos partículas dispersas utilizando óptica microscopía . Este método proporciona una imagen de partículas en movimiento, por

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Con respecto al análisis de datos velocidad en x,y en las partículas, incluyendo el producto de voltaje por distancia para adecuar los resultados a la ecuación de potencial zeta, se obtuvieron las siguientes graficas:

Figura 5. Grafica voltaje-velocidad de las partículas para celda con electrodos de acero

inoxidable austenitico

Figura 6. Grafica voltaje-velocidad de las partículas para celda con electrodos de acero

inoxidables ferritico

Para finalizar los resultados, se obtuvo el potencial zeta de la siguiente forma, tomando en cuenta el cálculo de pendiente en ambas graficas siendo esta la movilidad electroforética.

𝑢𝐸 ��𝑒�� 𝑥��𝑎��𝑒 �𝑒�� = 0.0065 𝑚2

𝑉𝑠𝑒𝑔

𝑢𝐸 ��𝑒�� 𝑥��𝑎��𝑒 𝑎𝑢𝑠�𝑒�� = 0.0039 𝑚2

𝑉𝑠𝑒𝑔 Posteriormente se obtiene de la siguiente forma los potenciales zeta para cada celda según el tipo de electrodo que se utiliza.

𝑢𝐸 = 𝜀𝜁𝜂 𝜁 = 𝑢𝐸𝜂

𝜀

𝜁 ��𝑒�� 𝑥��𝑎��𝑒 �𝑒�� =(0.0065 𝑚2

𝑉𝑠𝑒𝑔) (1.005 𝑘𝑔𝑚𝑠)

80.4 = 8.125 𝑥10�5 𝑁𝑉

𝜁 ��𝑒�� 𝑥��𝑎��𝑒 𝑎𝑢𝑠�𝑒�� =(0.0039 𝑚2

𝑉𝑠𝑒𝑔) (1.005 𝑘𝑔𝑚𝑠)

80.4 = 4.875 𝑥10�5 𝑁𝑉

CONCLUSIONES Como resultado de la investigación presentada es posible concluir en primer lugar, que antes de aplicar un campo eléctrico a la solución de partículas que se analiza existe un movimiento browniano en las partículas, posteriormente es importante hacer hincapié que al emplear un voltaje determinado se observa

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filtrada (0.1μm) y 50μL de partículas de poliestireno (tamaño: 2μm), se recomienda agitar la muestra con sonicacion antes de ser inyectada y sellada la celda. En un microscopio Zeiss con objetivo de 50x es observada la muestra, conectando a cada electrodo un caimán positivo a la izquierda y otro negativo a la derecha, permitiendo el paso de corriente controlada de una fuente de voltaje. Con el microscopio conectado a una cámara y a un dispositivo de grabación, se observa el comportamiento de las partículas al aplicar una diferencia de voltaje, llevando a cabo el registro de videos por un tiempo aproximado de 3 min. a distintos voltajes para cada celda.

Figura 2. Estudio y observación de partículas a diferentes voltajes.

Al obtener los videos correspondientes se utiliza un software especializado para transferir los archivos al disco duro, después de esto, con ayuda de DG Index estos videos son transformados a formato avi., los cuales a través de Virtual dub podrán ser divididos en imágenes individuales, que permitirán ser analizadas en un programa de IDL que localizará aquellas partículas visibles a través de parámetros que detectan los puntos brillantes para cada partícula observada en las distintas imágenes, estos serán analizados a través de programas proporcionaran las trayectorias y velocidades con respecto a x,y, siendo promediadas y graficadas contra el voltaje, haciendo hincapié que este proceso es aplicado para cada tipo de celda con diferente electrodo. Con los últimos datos obtenidos es dada a través de la pendiente la movilidad electroforética, aquella necesaria para obtener el potencial zeta.


Entre los resultados obtenidos en este proyecto de investigación se observa lo siguiente en los electrodos a un voltaje establecido de 30 volts:

Electrodo de acero austenitico: Tras la observación de una hora a 30 volts, no se observa quemaduras ni oxidación del electrodo, sin embargo se presenta cambio en el movimiento de las partículas a un tiempo máximo de una hora.

Electrodo de acero inoxidable ferritico: Tras la observación de 40 minutos a 30 volts, no presenta quemaduras, sin embargo se observa cómo se lleva a cabo la corrosión debida a la alta exposición del voltaje liberando una capa de óxido, la cual afecta el movimiento de las partículas.

Figura 3.Celda microelectroforética con electrodo de acero inoxidable austenitico

Figura 4. Celda microelectroforetica con electrodo de acero inoxidable ferritico


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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE PUNTOS CUÁNTICOS DE InAs/GaAs (100) MEDIANTE MBE

1Facultad de Ingeniería campus aeropuerto, Universidad Autónoma de Querétaro, Carr. a Chichimequillas S/N, Terrenos Ejidales Bolaños, C. P. 76140, Querétaro, Qro. MÉXICO; [email protected]; 2Laboratorio Nacional CIACYT-Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Sierra Leona 550,

Col. Lomas 2a. Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]

Fonseca Maya, O.1; Méndez García, V. H.2

RESUMEN En el presente trabajo, se realizaron crecimientos de Puntos Cuánticos (QDs) de InAs sobre sustratos de GaAs (100) por medio del autoensamble (Stransky-Krastanov) utilizando la técnica de Epitaxia por Haces Moleculares (MBE). La caracterización se realizó mediante 2 técnicas; la primera fue una caracterización in-situ mediante un sistema de Reflexión de Electrones Difractados de Alta Energía (RHEED) acoplado al MBE, donde se pudo monitorear todo el crecimiento, controlando la cinética de crecimiento y a la vez observando etapas como el degasado del sustrato y la aparición de chevrones característicos de la formación de puntos cuánticos. Finalmente, mediante un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) se realizó la caracterización morfológica de las muestras.

ABSTRACT In this paper, the Stransky-Krastanov self-assembly of InAs Quantum Dots (QDs) on GaAs (100) substrates employing Molecular Beam Epitaxy (MBE) was performed. The characterization was done using 2 techniques; the first one was the in-situ characterization technique Reflection High Energy Electron diffraction (RHEED) coupled to the MBE. RHEED is used to monitor all the growth from process, controlling the growth kinetics, and it is very useful to observe the substrate oxides desorption and the apparition of chevrons, which is characteristic of the quantum dots formation. Finally, using Atomic Force Microscope (AFM) the morphological characterization of the samples was performed. Keywords: quantum dots, quantum confinement, MBE, RHEED, AFM.

INTRODUCCIÓN En la actualidad uno de los campos de la nanotecnología más importantes son los puntos cuánticos. Debido a sus extraordinarias propiedades la comunidad científica se está dedicando a estudiarlas cada vez más, deseosos de poder implementar nueva tecnología basada en puntos cuánticos. Unas de las aplicaciones más interesantes son LEDs de alta eficiencia, computadoras cuánticas y celdas solares de banda intermedia. Las propiedades inusuales de los puntos cuánticos se deben al confinamiento cuántico de portadores de carga que presentan en las tres dimensiones espaciales. El presente trabajo se realiza con objetivo a futuro de implementar los puntos cuánticos para la realización de celdas solares más eficientes que las actuales.

un régimen de flujo laminar dentro de la celda, mostrando como el flujo va hacia el electrodo negativo en las paredes y a medida que se acerca al centro cambia hacia dirección contraria, presentando el comportamiento mencionado en la literatura estudiada. Siendo recomendado comenzar a medir la movilidad electroforética a partir de ese cambio de direcciones.

Figura 5. Régimen de flujo dentro de la celda al aplicar un campo eléctrico. (Bruce B. Weiner, 1993 Por otro lado, se concluye que la vida útil de la celda y calidad del material del electrodo varía con respecto al tiempo de exposición de voltaje. Estas observaciones y con respecto a los resultados se puede decir que el uso de electrodos de acero inoxidable austenitico aumenta la calidad y resistividad de la celda micro electroforética, debido a que los componentes de este son molibdeno y níquel, haciendo parecidos a los electrodos convencionales, de igual manera se pudo observar en los resultados de la gráfica el cambio drástico de velocidad en la celda de electrodos de acero inoxidable ferritico cuando estos comienzas a presentar corrosión, siendo al momento de el gran aumento de voltaje. Es importante analizar la muestra con una solución diluida, el tiempo de sedimentación es rápido, si se desea llevar a cabo un estudio de partículas prolongado se recomienda aplicar una agitación con el sonicador, debido a que se deja de observar gran cantidad de partículas en el campo de visión. Con respecto al análisis de partículas es significativo verificar los parámetros de búsqueda para poder identificarlos, recalcando que IDL solo localiza aquellos puntos brillantes, lo cual al momento de encontrar trayectorias y velocidades resulta ser un tanto complejo obtener resultados utilizables. La obtención del potencial zeta se llevó a cabo con ayuda de las gráficas tomando en cuenta aquellos puntos donde se observa una velocidad adecuada para obtener una correcta movilidad a través de la pendiente.

BIBLIOGRAFIA

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http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/2009-2-Potencialzeta-AlexCervantes_7040.pdf


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de puntos cuánticos con diámetro entre 1 y 10 nanómetros con un alto grado de uniformidad en un único paso de crecimiento.

METODOLOGIA En los crecimientos de las tres heteroestructuras sintetizadas se utilizó un MBE Riber-32. Para realizar el crecimiento de InAs/GaAs (100) se inició cortando el sustrato de GaAs (100) de alta pureza y se pegó con In de alta pureza en un molyblock, el cuál fue colocado dentro de la cámara de introducción, después se transportó a la cámara de degasado para la eliminación de óxidos nativos de la superficie del sustrato, terminado el predegasado, el sustrato se trasladó a la cámara de transferencia. Después se dispusó a controlar las temperaturas de las celdas de efusión a utilizar manteniéndolas en: TGa=960°C, Tas=230°C, TIn-Tp=750°C, TIn-Bk=690°C y Pas=8.6E-6 Torr. Cuando se tuvieron los parámetros adecuados para el crecimiento se dispusó a transportar el sustrato a la cámara de crecimiento donde se realizó nuevamente un degasado para comenzar el crecimiento sobre el sustrato de GaAs(100) completamente puro; en seguida se inició el crecimiento de la capa buffer de GaAs a Tman=675°C durante 14 min 56 seg, haciendo una interrupción a los 2 min para medir oscilaciones, se continuó con el crecimiento de la capa de InGaAs a Tman=580°C durante 1min 10 seg, se siguió con el crecimiento de una capa espaciadora de GaAs antes de crecer los puntos cuánticos de InAs a Tman=580°C, variando el tiempo de crecimiento de 4, 11 y 18 seg respectivamente en los tres crecimientos realizados. Por último, se crecieron los puntos cuánticos de InAs a Tman=580°C durante 20 seg. Para la caracterización in-situ se utilizó un RHEED acoplado al MBE, la caracterización morfológica se realizó con un AFM.

Figura 1. Estructura del 1er.

Crecimiento.

Figura 2. Estructura del 2do.

crecimiento.

Figura 3. Estructura del 3er.

crecimiento.


Por medio de la carcterización RHEED se obtuvieron patrones de difracción en las diferentes etapas durante los crecimientos, mediante su análisis se logró apreciar la formación del patrón de difracción conocido como chevrones en la dirección [1-10], el cual nos indica la correcta formación de puntos cuánticos sobre las heteroestucturas, como se puede observar con claridad en las figuras 4,5 y 6.

El objetivo del presente trabajo es el autoensamblado de Puntos Cuánticos de InAs sobre sustratos de GaAs en orientación (100) mediante la técnica de MBE y la caracterización utilizando RHEED y AFM.

MARCO TEÓRICO

Epitaxia por haces moleculares (MBE) La técnica MBE es un método de evaporación basado en ultra alto vacío, es una técnica de depósito capaz de obtener materiales con un nivel de impurezas por debajo de diez partes por billón de una manera reproducible, con un control importante sobre la composición, el dopaje de las estructuras y sobre el espesor a escala nanométrica. La técnica de crecimiento mediante MBE es una de las más importantes para sintetizar puntos cuánticos. Esta técnica tiene ventajas sobre otras técnicas de crecimiento de películas epitaxiales, por ejemplo, se puede controlar el crecimiento en dimensiones menores a monocapas atómicas y la posibilidad de monitorear el crecimiento in situ y en tiempo real usando técnicas como reflexión de electrones difractados de alta energía (RHEED). En esencia, la técnica MBE es más que un método de evaporación basado en ultra alto vacío.

Puntos cuánticos Un punto cuántico es considerado un nanocristal con confinamiento cuántico en las tres dimensiones espaciales que puede confinar portadores de carga dentro de sus dimensiones físicas, el confinamiento se debe a los potenciales generados por la combinación de los materiales cristalinos, el confinamiento de portadores de carga le concede al material propiedades diferentes a que si estuviera en bulto. Un punto cuántico tiene un espectro discreto de energía cuantizada, el punto cuántico confina un número reducido de portadores de carga generalmente menor a 100, el confinamiento de portadores de carga se puede modificar variando el tamaño de los puntos cuánticos, con ello podemos obtener nuevas propiedades del material; para poder observar los efectos cuánticos, los nanocristales debe tener dimensiones comparables con la longitud de onda de Broglie de los portadores de carga del material. Una de las propiedades más interesantes de los puntos cuánticos es que al ser iluminados pueden reemitir la luz en una longitud de onda muy especifíca y que depende del tamaño del punto cuántico, entre más pequeños son los puntos cuánticos, menor es la longitud de onda por lo tanto mayor la energía. Los puntos cuánticos pueden ser sintetizados por varias técnicas como litografía, MBE y métodos coloidales.

Autoensamble de QDs Uno de los métodos más importantes y el que utilizamos en este trabajo para el autoensamble de puntos cuánticos es el de crecimiento Stransky-Krastanov. La obtención de PCs autoensamblados mediante el modo de crecimiento de Stransky-Krastanov (S-K) se basa en la relajación de energía elástica producida por la diferencia en constantes de red del material a depositar y el substrato. En este trabajo el crecimiento fue de InAs sobre GaAs. Estos cristales poseen diferente constante de red, 6.05Å del InAs y 5.65Å del GaAs, lo cual conduce a un desacople de redes de aproximadamente 7%. En las etapas iniciales del depósito de InAs, éste crece acoplado a la red cristalina del substrato GaAs, a esta primera capa que cubre toda la superficie del substrato se le conoce como capa de mojado. Sin embargo, los esfuerzos debidos al desajuste de los parámetros de red provocan la deformación elástica del InAs acumulando energía elástica conforme avanza el crecimiento, a esta etapa del crecimiento se le denomina régimen pseudomórfico, con el aumento del volumen de InAs depositado, la energía elástica se va acumulando, esta situación persiste hasta alcanzar un determinado espesor, denominado espesor crítico, para el que la energía acumulada se libera mediante la formación espontánea (o autoensamble) de nanoislas tridimensionales coherentes, es decir, islas de InAs libres de defectos cristalinos. Este mecanismo de autoensamble de nanoestructuras 0-dimensionales permite la síntesis de miles de millones


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Figura 10. I vs t de InAs, 1er.

Crecimiento.

Figura 11. I vs t de InAs, 2do.

Crecimiento.

Figura 12. I vs t de InAs, 3er.

Crecimiento. Con el fin de conocer la estructura morfológica de los puntos cuánticos crecidos, las muestras fueron caracterizadas mediante AFM. En las figuras 13, 14 y 15, se muestran las imágenes de AFM.

Figura 13. Medición AFM .5µmx.5µm

del 1er. Crecimiento.


del 2do. Crecimiento.


del 3er. Crecimiento. Con las imágenes obtenidas se realizaron mediciones promedio de alturas y diámetros de los puntos cuánticos en los diferentes crecimientos, así como también se utilizaron para calcular la densidad promedio. En la tabla 1, se muestran los resultados.

Tabla 1. Alturas, diámetros y densidades promedio de los QD´s de InAs obtenidos en los 3 crecimientos.

Altura promedio Diámetro promedio Densidad promedio

1er. crecimiento [9.560 ± 0.076] nm [38.413 ± 0.569] nm 5.44x1010 QD´s / cm2

2do. crecimiento [8.820 ± 0.111] nm [31.020 ± 0.819] nm 4.56x1010 QD´s / cm2

3er. crecimiento [7.440 ± 0.111] nm [26.062 ± 0.508] nm 1.36x1010 QD´s / cm2

CONCLUSIONES Por medio de las caracterizaciones realizadas a los diferentes crecimientos se pudo verificar la correcta síntesis de puntos cuánticos de InAs/GaAs (100), mediante RHEED, se comprobó al observar en la dirección [1-10] el patrón de difracción conocido como chevrones característico de la formación de puntos

Figura 4. Patrón RHEED en la dirección [1-10] (formación de

chevrones) del 1er. Crecimiento.

Figura 5. Patrón RHEED

dirección [1-10] (formación de chevrones) del 2do.

Crecimiento.

Figura 6. Patrón RHEED dirección [1-10] (formación de chevrones) del 3er. Crecimiento.

Se analizaron los videos obtenidos mediante RHEED para analizar oscilaciones en unas gráficas de Intensidad vs Tiempo, con el fin de obtener las velocidades de crecimiento en cada una de las capas de los crecimientos, las cuáles nos sirvieron para obtener el espesor de cada capa de las heteroestructuras. En las gráficas Intensidad vs Tiempo se observaron las oscilaciones correspondientes al crecimiento de monocapa por monocapa, con ello se obtuvo la cantidad de monocapas crecidas de cada material y conociendo su parámetro de red se obtuvo el grosor de las capas de los distintos materiales, el grosor de las capas se menciona en las figuras 1,2 y 3. En las figuras 7,8 y 9, se presentan las gráficas de Intensidad vs Tiempo de los crecimientos de GaAs e InGaAs con sus respectivas velocidades de creccimiento a las temperaturas indicadas.

Figura 7. I vs t de GaAs e InGaAs,

1er. crecimiento.


2do. crecimiento.


3er. crecimiento. Para medir la velocidad de crecimiento del InAs, se consideró un hecho bastante estudiado, que el punto crítico de InAs sobre GaAs se alcanza cuando se han crecido 1.7 monocapas; debido a que en este momento es cuando se generan los puntos cuánticos, se midió el tiempo que tardó en aparecer el patrón de difracción conocido como chevrones, las velocidades de crecimiento se muestran en las figuras 10,11 y 12.


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OCURRENCIA DE INCENDIOS FORESTALES BAJO ESCENARIOS DE VARIABILDIAD CLIMÁTICA DE CERCANO,

MEDIANO Y LEJANO PLAZO EN LA SIERRA MADRE ORIENTAL

Instituto de Investigación de Zonas Desérticas, Col. Del Llano, C.P. 78377, San Luis Potosí, San Luis Potosí., MÉXICO; [email protected]; [email protected]

García García, A.; Muñoz Robles, C.

RESUMEN Este trabajo da a conocer escenarios a futuro de variabilidad climática que muestran la manera en que la temperatura y la precipitación influirán en la ocurrencia de incendios forestales en la Sierra Madre Oriental. En primer lugar, se utilizaron puntos de calor para conocer la densidad de incendios forestales/𝐾𝑚� (número de incendios ocurridos dentro de una unidad espacial). Asimismo, a través de árboles de regresión, se identificaron los principales umbrales de precipitación y temperatura en los que ocurren los incendios forestales. Una vez obtenidos estos umbrales, se emplearon modelos climáticos para estimar la densidad de incendios, durante los periodos de horizonte cercano (2015-2039), mediano (2045-2069) y lejano (2075-2099) plazo, así como las áreas que potencialmente serán afectadas por incendios forestales. Por medio de estos escenarios, es posible entender la dinámica futura de los incendios y permite implementar un sistema de alerta que minimice pérdidas socioeconómicas y ambientales, en la Sierra Madre Oriental.

ABSTRACT This study aimed to present future scenarios of climate variability that describe how temperature and precipitation influence the occurrence of forest fires in the Sierra Madre Oriental. First, fire hotspots were used to determine the density of forest (number of fires within a spatial unit) fires. Also, through regression trees, the main precipitation and temperature thresholds where forest fires occur were identified. Once these thresholds were derived, climate models were used to estimate fires density, in periods of near (2015-2039), medium (2045-2069) and long (2075-2099) term. Through these scenarios, it is possible to implement warning system to minimise socio-economic and environmental impacts in the Sierra Madre Oriental. Palabras clave: Variabilidad climática, puntos de calor, incendios forestales, escenarios a futuro.

INTRODUCCIÓN Los incendios forestales son naturales y necesarios para algunos ecosistemas terrestres, sin embargo, en los últimos años ha sido evidente como las condiciones climáticas junto con los incendios forestales han afectado de manera negativa algunos estados de la Sierra Madre Oriental, como el caso de Coahuila en el 2011. Esto es debido a que la variabilidad de la precipitación y la temperatura influyen directamente n las condiciones de humedad realitca del ambiente y la vegetación. Cuando existe una condición negativa en el

y por AFM se determinó al observar las imágenes donde se mostraban estructuras con apariencia de montaña sobre la superficie de las muestras. Al comparar los resultados obtenidos de los 3 crecimientos acerca de la altura, diámetro y densidad promedio de los puntos cuánticos y teniendo en cuenta que el único parámetro variable en los diferentes crecimientos fue el tamaño de la capa espaciadora de GaAs se logró concluir que debido a las tensiones generadas por la deformación elástica entre los materiales afectó la velocidad de crecimiento del InAs, concluyendo, entre mayor fue la capa espaciadora de GaAs la velocidad de crecimiento del InAs fue menor, por lo tanto se tardó más tiempo en llegar al punto crítico, teniendo así una menor densidad de puntos cuánticos y de menor tamaño.

BIBLIOGRAFIA

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Dr. Víctor Hugo Méndez García por su paciencia, enseñanzas y tiempo dedicado a lo largo de este verano de la ciencia, así como por permitirme trabajar y aprender en este proyecto. Así mismo, a los compañeros de posgrado que participan en el proyecto: Eric, Ángel, Irving y Christian, por su ayuda y enseñanzas durante el verano.


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Para conocer los valores de precipitación se hizo uso de imágenes satelitales del programa TRMM (Tropical Rainfall Measuring Mission), mientras que para la temperatura, la información será obtenida por imágenes del satélite MODIS (Moderate Resolution Imaging Spectroradiometer), ambas proporcionadas por la Aeronáutica Nacional y Administración Espacial (EOSDIS, del a página http://reverb.echo.nasa.gov/reverb). Para procesar esta información, se utilizó la herramienta de ArcMap “Zonal Statistics as Table”, la cual permite conocer a través de la organización y el conjunto de datos, las zonas que cuenta con los mismos valores, es decir, se extrajo cada uno de los valores de temperatura y precipitación de cada punto de calor en esos años (2000-2015) en esa temporada, dando como resultado las zonas afectadas con el mismo valor. Segunda etapa Se obtuvo la densidad de incendios forestales a través de los puntos de calor de cada mes de los años 2000 a 2015, para esto se realizó un mapa raster de densidad de incendios forestales por medio de la herramienta “Kernel Density”, proporcionada por el Sistema de Información Geográfica ArcMap. Se realizó un muestreo aleatorio simple, en el cual se calculó tomando en cuenta la varianza de la densidad de puntos de calor, dando como resultado una muestra aleatoria de 6080 puntos, con un margen de error aceptable del 1% y un nivel de confianza de 5%. El muestreo se realizó, a través de la herramienta de ArcMap, “Create Random Points”, los 6080 puntos fueron distribuidos por toda el área de estudio, incluyendo lugares donde ocurrieron y no ocurrieron incendios forestales. Una vez obtenidos los mapas de densidad de incendios forestales y las imágenes de precipitación y temperatura, se extrajo el valor de los 6080 puntos distribuidos por toda la zona de estudio, para cada mes de los años 2000 a 2015 por medio de la herramienta “Zonal Statistics as Table” de ArcMap, lo que dio como resultado 6080 valores de precipitación, temperatura y densidad de incendios forestales de la Sierra Madre Oriental. Finalmente los valores de densidad de incendios forestales /𝐾𝑚�, precipitación y temperatura, fueron procesados a través del programa estadístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), por medio de la herramienta “Árboles de regresión”, con la técnica estadística no paramétrica llamada CART. Tercera etapa. Se utilizaron los modelos climáticos proporcionados por el Atlas Climático Digital de México por parte de la Unidad de Informática para las Ciencias Atmosféricas y Ambientales (UNIATMOS) del Centro de Ciencias de la Atmósfera de la Universidad Autónoma de México (UNAM), en la página: http://atlasclimatico.unam.mx/atlas/. Asimismo, se implementaron los árboles de regresión obtenidos en la etapa anterior en el programa ENVI, usando como mapas de entrada los escenarios futuros de temperatura y precipitación proporcionados por los modelos climáticos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tomando en cuenta los resultados de los cuatro meses, los umbrales de precipitación y temperatura mostraron que la precipitación es la variable que tiene una influencia mayor en esta temporada de incendios forestales (marzo-junio). Los árboles de regresión permitieron obtener 14 nodos con 14 densidades de 7 grupos de ambas variables (Figura 1). La variable principal en el árbol de densidad sed incendios para los cuatro meses es la precipitación, con cantidades mayor o menor a 290.8 mm con densidades de 0.122 y 0.352. Esta se divide a la derecha con lluvias mayor o menor a 433.0 mm, con densidades de 0.511 y 1.342, de ahí el nodo se distribuye en otros dos grupos de precipitación en donde a la derecha se tienen cantidades mayor o menor a 479 mm y con densidades de 0.622 y 0.144, mientras que de lado izquierdo se tienen cantidades mayor o menor a 292 mm con densidades de 3.222 y 1.272. Por otra parte, de lado izquierdo se divide en temperatura con cantidades mayor o menor a 28°C y densidades de

comportamiento de estos factores se presenta la sequía, lo cual representa perdida de humedad en combustibles forestales (material seco) que incrementa la susceptibilidad de un incendio (Jímenez, 2015). De acuerdo con estudios hechos por el Panel intergubernamental de Cambio Climático (IPCC) y la Convención Marco de las Naciones Unidas sobre el Cambio Climático (CMCC), existe evidencia de la estrecha relación entre los cambios históricos del clima y el aumento de la ocurrencia de incendios forestales. En los últimos doce años (1995-2006) once figuran entre los doce más cálidos en los registros de la temperatura de la superficie mundial (desde 1850). La tendencia lineal a 100 años (1906-2005), cifrada en 0,74°C es superior a la tendencia correspondiente de 0,6°C (1901-2000). En todo el mundo, la superficie afectada por las sequías ha aumentado probablemente desde el decenio de 1970 (IPCC, 2007). Con base en lo anterior, en últimos años han existido condiciones climáticas para incrementar la ocurrencia de incendios forestales en México. En el año de 1998 se presentaron más de 14, 445 incendios forestales que afectaron 850,000 hectáreas (CONAFOR, 2004), debido a una intensa sequía asociada a condiciones de El Niño (Magaña, 1999), mientras que las condiciones de La Niña generaron déficit de precipitación en el norte de México, como la ocurrida entre los años 2010 y 2012. Asimismo, las condiciones climáticas anómalas de temperatura en la primavera del 2011 alcanzaron los 5°C por encima del valor medio en el norte de Coahuila (INECC, 2012). Desde 1999 CONABIO monitorea los incendios forestales a través de los puntos de calor localizados a través de imágenes satelitales (INECC, 2012), sin embargo, este programa se enfoca en el número de incendios forestales y el estrés hídrico de la vegetación, no existen escenarios a futuro sobre la ocurrencia de incendios forestales que permitan indicar un cómo y cuándo y en qué medida cambiara la precipitación (Magañas, 2004) o la temperatura, y por lo tanto evitar pérdidas ambientales y socioeconómicas a futuro en regiones como la Sierra Madre Oriental. A pesar de la evidencia internacional y nacional que se ha presentado por parte de estas organizaciones como el IPCC, aún no existen suficientes estudios que permitan comprender de manera certera la relación entre la variabilidad climática y la ocurrencia de incendios forestales, ya que la mayoría de los estudios se han realizado de manera relevante en lugares fríos, como Canadá y Rusia (Flannigan, 2005), y no en lugares intertropicales como los en México. Asimismo, ante la evidencia sobre la estrecha relación entre el aumento de incendios forestales con respecto a los cambios en la temperatura y la precipitación (IPCC, 2007), es fundamental realizar estudios de carácter espacial y temporal que permitan conocer el comportamiento de la variabilidad climáticas con respecto a la ocurrencia de incendios a través de la proyección de escenarios a futuro de cercano, mediano y largo plazo, que posibiliten la creación de un sistema de alerta temprana que establezca la implementación de medidas de prevención y mitigación en la Sierra Madre Oriental.

METODOLOGIA La metodología empleada para realizar este estudio consta de tres etapas: Primera etapa. Se obtuvo la densidad de incendios forestales a través de los puntos de calor de la primera temporada de incendios forestales marzo-junio, de los años 2000 a 2015, para esto se realizó un mapa raster de densidad de incendios forestales por medio de la herramienta “Kernel Density”, proporcionada por el Sistema de Información Geográfica ArcMap. Así, obtuvimos un mapa raster en donde fue posible conocer la densidad de incendios forestales de la Sierra Madre Oriental con un radio de búsqueda para cada uno de los puntos de calor de 10 000 metros para cada uno de los meses.


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Mapa 1. Escenario de horizonte cercano (2015-

2039) en la Sierra Madre Oriental. Mapa 2. Escenario de horizonte cercano (2015-

2039) en la Sierra Madre Oriental.

Mapa 3. Escenario de horizonte cercano (2015-2039) en la Sierra Madre Oriental

0.657 y 0.210, al igual que el nodo derecho, se divide en otros dos grupos de precipitación con lluvias mayor o menor a 242.2 mm con densidades de 0.153 y 0.309 de lado derecho, mientras que de lado izquierdo si se tiene lluvias mayor o menor a 254 mm, se tendrán densidades de 0.422 y 0.760 (Figura 1).

Figura 1. Árbol de regresión total de la primera temporada de secas del mes de marzo-junio.

Los modelos climáticos permitieron realizar escenarios de variabilidad climática que estimaron las áreas con un mayor número de incendios para el horizonte cercano (mapa 1), mediano (mapa 2) y lejano (mapa 3) en la Sierra Madre Oriental, a través de la densidad estimada por los árboles de regresión.


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TRANSICIÓN DE FASE DE UN FLUIDO SIMPLE DE LENNARD- JONES

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Instituto de Física, Uni-versidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P.,

MÉXICO, [email protected]

García-Romero, E.1; Guerrero-García, G. I.2

RESUMEN Los fluidos simples de Lennard -Jones pueden presentar diferentes fases de acuerdo a sus condiciones, en este trabajo se hizo variar la temperatura con el objetivo de observar su comportamiento. Se utilizaron dos algoritmos para generar los datos aleatorios, en uno de ellos varía el número de partículas mientras que en el otro fue constante; fueron procesados en GPU’s para después ser analizados con una serie de métodos computacionales de acuerdo al desplazamiento cuadrático medio, la densidad de partículas y al coeficiente de difusión. Como resultado se observó que a T’=0.6 se genera una transición de fase, mientras que a T’=1.2 el sistema se mantiene homogéneo. La simulación de partículas puede ser un método alternativo no solo para cuestiones académicas, ya que facilita la obtención de resultados exactos con un ahorro económico. El uso de GPU’s pueden tener una aplicación práctica cuando se requiere trabajar con algoritmos avanzados.

ABSTRACT Lennard –Jones simple fluids can show different phases according their conditions, the aim of the present study was to use to different temperatures with the purpose to observe their behavior. Two algorithms were used to generate random data, in the first one there were different particles number while the second one didn’t change; data was processed by GPU’s for further analysis with a serial of computed methods according with the mean squared displacement, particle density and diffusion coefficient. As a result, T’=0.6 generates a phase transition, while T’=1.2 the system remains homogeneous. The particle simulation can be an alternative method not only for academic issues, since it facilitates getting the exact results with an economical saving. The use of GPU’s can have a practical application when working with advanced algorithms.

INTRODUCCIÓN Los líquidos se encuentran de diferentes formas, colores y en diferentes proporciones, pueden estar en forma de vapor o congelados. La vida como la conocemos está envuelta en la fase líquida, y otros organismos por reacciones químicas que ocurren en los líquidos. Existen muchos detalles fascinantes del comportamiento de los líquidos, que contemplan termodinámica, estructura y movimiento. El estudio del estado líquido de la materia tiene una larga historia desde el punto de vista teórico y experimental, con lo que se ha tratado de entender la estructura y dinámica de las partículas que caracterizan los líquidos. Al mismo tiempo, los teóricos han tratado de construir modelos simples que expliquen el comportamiento de

CONCLUSIONES

Los tres escenarios permiten identificar las zonas con mayor susceptibilidad de ocurrencia de incendios, por lo tanto es posible implementar un sistema de prevención de incendios y manejo del fuego para la Sierra Madre Oriental.

La precipitación fue la variable que tiene a influir de mayor manera, esto puede ser debido a que no se esperan diferencias importantes en el cambio para los escenarios de horizonte cercano (2015-2039) y lejano (2045-2079) en la Sierra Madre Oriental. Debido a que la diferencia en concentraciones proyectadas de CO2 es mínima para las primeras tres décadas, los contrastes en el forzamiento radiativo entre un escenario y otro son marcados.

La precipitación muestra un cambio significativo en la temporada de marzo a junio, tomando en cuenta que la mayoría de los estados presenta precipitaciones de 400 mm a 1500 mm y los escenarios estiman una posible precipitación menor o mayor de 179 a 200 mm en este mes, es posible encontrar un cambio en esta variable. Un ejemplo de esto son los estados de Veracruz y Puebla, en donde se presentan precipitaciones de mayor o menor a 200 mm, cuando la normal es de 1500 y 1270 mm para el mes de Junio (García, 1998).

BIBLIOGRAFIA

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Figura 1: Algoritmo que hace correr la simulación para 1000000 partículas(línea 2) con una temperatura de 1.2(línea 12).Generando dos archivos (líneas 14 y 15). Así mismo, se corrió otro algoritmo elaborado con HOOMD-blue con el propósito de analizar el fluido simple de Lennard-Jones cuando las partículas se mantienen constantes. En este caso se programó para que el número de partículas fuera de 100000. Se puede notar que la única diferencia con el anterior se encuentra en la línea 17, a continuación se describe su función. (Figura 2)

Figura 2: Algoritmo para correr 100000 partículas (línea 2) con una temperatura de 0.6 (línea 12). Generando doce archivos (líneas 14,15 y 17)

El algoritmo anterior genera archivos de texto, llamados “Fotos” con su respectivo número de aparición. Estos archivos contienen las coordenadas de las partículas. Es el comando de la línea 17 el que le dice al programa que genere un archivo cada 10000 pasos. De esta manera terminamos con diez archivos de texto por cada temperatura. Se procedió a transformarlos de manera que Jmol (visor Java de código abierto para estructuras químicas en tres dimensiones) pudiera leerlos y reproducirlos. Para la transformación se utilizó Canopy con el lenguaje de programación Python. De esta manera se obtuvieron 20 archivos de texto que contenían las coordenadas de las partículas a trabajar, después fueron reducidos a dos archivos de texto uno para las partículas a temperatura de 0.6 y otro para 1.2. Lo anterior se efectuó para tener una forma totalmente tridimensional y bastante interactiva de ver que es lo que ocurría con el fluido, sin embargo se obtuvo mucha más información al relacionar la temperatura,

los líquidos. En los últimos años se han utilizado modelos con objetos físicos representando moléculas, pero el uso de un gran número de objetos representando moléculas puede ser muy tedioso y tomar mucho tiempo. Lo más práctico es utilizar un modelo matemático, en lugar de un modelo físico, y hacer los análisis por computadora. Las computadoras antiguas ya procesaban modelos simples, hoy en día las computadoras actuales pueden correr modelos de simulación con alta eficiencia (Allen et al. 1989). El primer trabajo se basó en el modelo Monte Carlo “MC” más tarde los simuladores MC fueron realizados con el potencial de interacción Lennard-Jones. La simulación por computadora también se ha utilizado para incrementar el entendimiento de las transiciones de fase y el comportamiento en las interfaces. Entendamos por transición de fase la transformación de un sistema termodinámico, como por ejemplo las transiciones entre los estados de agregación de la materia o cambios de estado. La simulación por computadora provee una ruta directa desde los detalles del microscopio de un sistema (la masa de los átomos) hacia propiedades macroscópicas de interés experimental (transporte de coeficientes, parámetros de orden estructural, etc.). El método de revisión de teorías antes de aplicarlas al mundo real se llama “experimento en computadora”. La simulación por computadora tiene dos propósitos: da al teórico la sensación física del problema, y genera resultados “exactos” que pueden utilizarse para probar la calidad de la teoría a construirse (Hansen & McDonald, 2013). Los simuladores de dinámica molecular calculan los movimientos de moléculas individuales de sólidos, líquidos y gases. La idea aquí es que el movimiento, que describe posiciones, velocidades y orientaciones cambia con el tiempo. La dinámica molecular asigna valores numéricos a los estados, entonces hace a estos estados observables, al menos para modelar substancias. Propiedades importantes y visibles en estas sustancias son: el desplazamiento cuadrático medio (“msd” por sus siglas en inglés) definido como la medida más común de la difusión de partículas con movimiento aleatorio y el coeficiente de difusión (Haile, 1993). El objetivo del presente trabajo fue comparar el comportamiento de un fluido simple de Lennard- Jones a diferentes temperaturas, utilizando métodos computacionales tanto para la programación y construcción de los modelos a observar, como para el análisis y entendimiento de los resultados.

METODOLOGÍA Este trabajo fue realizado utilizando los GPU’s (Graphics Processor Unit) del centro de cómputo del Instituto de Física de la UASLP, principalmente desde las terminales del laboratorio de computación de Biofísica, debido a que los programas utilizados para la generación de datos lo requerían. El programa que arrojó los datos con los cuales se trabajó el resto del proyecto se realizó con HOOMD-blue (Caja de herramientas de simulación de partículas con un propósito general) descrito por Guerrero et al.(2010). Se corrió para temperaturas reducidas de T’=0.6 y T’=1.2, donde T’ se define como: 𝑇� = 𝜀

𝑘�𝑇 ,

siendo 𝜀 la profundidad del pozo del potencial de Lennard-Jones y 𝑘� la constante de Boltzmann. Variando el número de partículas (desde 100 hasta 1000000). Ejemplo de un de los casos del programa (Figura 1).


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RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los archivos “Foto” que se corrieron en Jmol generan fotogramas que fueron convertidos en un gif animado; con ellos se pudo apreciar el movimiento de las partículas, destacando una transición de fase en el fluido a una temperatura de 0.6 (huecos a lo largo del volumen estudiado), mientras que a 1.2 las partículas se mantiene en un rango constante, es decir el sistema a esa temperatura es básicamente homogéneo. (Figura 4)

Figura 4: (1) Fotograma 1 a T’=1.2; (2) Fotograma 1 a T’=0.6; (3) Fotograma 10 a T’=1.2; (4) Fotograma 10 a T’=0.6. Fuente:

La transición de fase es también visible en gráficas de coeficiente de difusión, siendo constante cuando no hay cambio en el sistema (T’=1.2) y variando cuando hay una transición de fase (T’=0.6). Representado (Figura 5).

Figura 5: Coeficiente de difusión contra número de partículas. Línea naranja T’=1.2. Línea azul T’=0.6.

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1.00000E-04

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2.50000E-04

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4.00000E-04

4.50000E-04

5.00000E-04

-200000 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000

COEF

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NTE

DE D

IFUS

IÓN

NÚMERO DE PARTÍCULAS

msd, tiempo, densidad, numero de partículas y el coeficiente de difusión. Para esto se hicieron gráficas y se analizó la transición de fase. Primero con el programa Excel se graficó el msd contra tiempo, para cada uno de las temperaturas y cada cantidad de partículas. Por medio del método de mínimos cuadrados se obtuvieron las pendientes de dichas gráficas, para poder calcular el coeficiente de difusión, esto con la simple ecuación: 𝐷 = 𝑚/6 donde m, es la pendiente. A su vez se graficó el coeficiente de difusión contra el número de partículas. Un algoritmo fue desarrollado para calcular las densidades que existen secciones o tajadas definidas (x) de la caja de estudio (Figura 3). Una vez que se obtuvo esta información, se graficó densidad contra número de partículas.

Figura 3: Algoritmo que primero localiza y cuenta en que sección se encuentra cada partícula, para después hacer el cálculo de la densidad por medio de la ecuación: 𝜌 = 𝑛/(∆𝑥)( 𝑙�) donde 𝑛, es el número de partículas y 𝑙, la longitud de la caja de estudio. Desarrollado en el programa Matlab.

U densidad por medio de la ecuación:


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PRE-ACLIMATACIÓN Y ACLIMATACIÓN DE EPIDENDRUM CARDIOPHORUM Y MYRMECOPHILA GRANDILFORA, ORQUÍDEAS DE LA HUASTECA POTOSINA

Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Departamento Forestal. Calzada Antonio Narro 1923, Buenavista, 25315 Saltillo, COAH. MEXICO, [email protected]; Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Cd. Valles, S.L.P. MÉXICO, Romualdo del Campo 501, Fracc.

Rafael Curiel. Laboratorio de Investigación en Ciencias Ambientales. [email protected].

García Zepeda. C.; Carranza Álvarez. C.

RESUMEN La familia Orchidaceae es una de las más grandes y diversas familias de plantas. Sin embargo, su distribución ha disminuido notablemente debido a la alteración y destrucción de su hábitat así como, su difícil reproducción. Una alternativa para disminuir el tiempo de regeneración de las orquídeas es la micropropagación. En este proyecto se micropropagaron y preaclimataron dos especies de orquídeas Epidendrum cardiophorum y Myrmecophila grandiflora. Se probaron tres sustratos (Carbón vegetal, Corteza roja, Agar Plant TC), se evaluó la respuesta a dos auxinas de crecimiento (Indole-3-Butyric-Acid (AIB) y Indole-3-Acetic-Acid (AIA)) ambas a una concentración de 1 ppm. Se realizó una evaluación semanal durante tres semanas. En el análisis de varianza y prueba Tukey se muestra que no hay diferencias significativas entre los tratamientos. Palabras Clave: Pre- aclimatación, vitro-orquídeas, auxinas.

ABSTRACT The orchid family is one of the largest and most diverse plant families. However, its distribution has decreased significantly due to the alteration and destruction of their habitat and their difficult reproduction. An alternative to reduce the regeneration time is the micropropagation. In this project they were micropropagated and pre-acclimated two species of orchids Epidendrum cardiophorum and Myrmecophila grandiflora. Three substrates (Charcoal, red bark, Agar Plant TC) were tested, the response to two auxin growth (Indole-3-Butyric-Acid (AIB) and Indole-3-Acetic-Acid (AIA)) was evaluated both to a concentration of 1 ppm. A weekly evaluation was performed for three weeks. In the analysis of variance and Tukey test shows no significant differences between treatments. Key words : Pre- acclimatization, vitro-orchids, auxin

INTRODUCCIÓN

Las orquídeas pertenecen a la familia botánica Orchidaceae, que comprende entre 25 mil y 30 mil especies muchas de las cuales tienen una gran importancia económica y socio-cultural. A pesar de la numerosa cantidad de especies que comprende la familia Orchidaceae, la riqueza de las orquídeas está siendo

Por último, al graficar la densidad de partículas cuando estas son constantes es totalmente evidente que existe un cambio en el número de ellas para la temperatura de T’=0.6 por el contrario a T’=1.2 la densidad es homogénea todo el tiempo. (Figura 6)

Figura 6: Longitud de caja contra densidad de partículas ; se puede apreciar que la línea naranja y la gris son prácticamente iguales, lo que nos dice que el sistema a T’=1.2 se mantuvo con las mismas densidades a lo largo de la simulación. Sin embargo la línea azul, difiere de la gris, por ende sabemos que la densidad varió con el tiempo a T’=0.6.

CONCLUSIONES

Se cumplió el objetivo del trabajo pudiendo analizar el fluido simple, aun sabiendo de antemano que los datos con los que se trabajó fueron inventados, la información que arrojó es la esperada en sistemas reales. Las transiciones de fase son de suma importancia, no solo para el entendimiento de conceptos y la parte académica, hoy en día numerosas empresas e industrias utilizan reactores en los que se lleva a cabo alguna transición de fase, poder predecir qué es lo que va a ocurrir por medio de una simulación de dinámica molecular mejoraría significativamente tanto en lo económico como en seguridad del mismo reactor. Se concluye entonces, que utilizar sistemas computacionales para el planteamiento y desarrollo de problemas reales es un método efectivo y acertado. La implementación de GPU’s para el procesamiento de diversos algoritmos también es bastante recomendable, ya que ahorran tiempo a la hora de desarrollar un proyecto.

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0.2

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Dens

idad

Longitud de caja

x9 a 0.6 x9 a1.2 x0 a ambas T


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La campana y los recipientes se limpiaron con etanol al 70%, dentro de la campana colocamos recipientes y materiales a utilizar para el trasplante, se activó el flujo de aire (3 min), y posteriormente se activaron los rayos ultravioleta (3 repeticiones). Para el trasplante se utilizó equipo de protección (bata, lentes y cubre-bocas), para evitar que las plántulas se contaminaran. Por cada recipiente se colocaron 2 plántulas y se realizaron 27 frascos para cada especie (E. cardiphorun y M. grandiflora). Las plantas fueron colocadas en el cuarto de cultivo con un fotoperiodo de 16/8 h, se realizaron tres evaluaciones semanales, registrando el número de raíces, numero de brotes, altura de plántulas, contaminación (hongo, levadura, bacteria) y oxidación de plantas. La contaminación y oxidación se evaluó todos los días para retirar las muestras dañadas y evitar la propagación del agente contaminante. Transcurridas las tres semanas de evaluación las plantas con una altura de 5.5 a 8 cm de cada tratamiento fueron trasplantadas a macetas y colocadas en domos para conservar el 70% de humedad (B y C). Análisis estadístico Todos tratamientos se realizaron por triplicado, y se realizaron dos experimentos independientes. Se evaluó el porcentaje de oxidación y contaminación, y el número de brotes cada semana. El número de raíces y plántulas representa el promedio de cada tratamiento. Se utilizó el programa STATISTICA 8. Los gráficos se realizaron en Sigma Plot.


Respuesta de E. cardiophorum y M. grandiflora en la etapa de pre-aclimatación En la Figura 1, se presentan los resultados obtenidos de la pre-aclimatación de E. cardiophorum y M. grandiflora. En el análisis estadístico a los tratamientos establecidos durante tres semanas de evaluación, no se muestran diferencias estadísticamente significativas en las variables medidas (incremento en altura, número de brotes, y número de raíces) (p>0.05) entre ninguno de los tratamientos probados para ambas especies de orquídeas. A) B)

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amenazada debido a su vulnerabilidad, inestabilidad y al abuso en su uso como recurso y destrucción de su hábitat (Cox, 2013). Además, la incursión indebida del hombre en los medios naturales ha generado desequilibrio tanto en las orquídeas como en otras especies nativas (Tiza, 2010). Por ello, surge la necesidad de recuperar especies nativas en peligro de extinción a través de otras técnicas biotecnológicas como es el cultivo in vitro de tejidos vegetales. El cultivo in vitro o la micropropagación se inicia con la extracción de pequeños fragmentos de tejido tomados de diversas partes de la planta, para después ser llevados a un medio de cultivo determinado. Por esta técnica se han multiplicado diversas especies de orquídeas como Euchile mariae (Ames) Withner, Laelia speciosa, Dendrobium, Laelia anceps, Phalaenopsis y Sobralia xantholeuca. Por ello, el objetivo de este proyecto fue pre aclimatar plántulas de Epidendrum cardiophorum y Myrmecophila grandiflora.

MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal El material para realizar la micropropagación de plantas se obtuvo de la Región Huasteca del estado de San Luis Potosí. Esterilizado de material Los recipientes que se utilizaron en el proceso fueron desinfectados en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 10 % de concentración durante una hora, después se enjuagaron con agua del grifo y se colocaron en la estufa de convección con una temperatura de 200 ° C. Preparación de medios de cultivo Se empleó el medio de cultivo comercial Murashige–Skoog (MS; Murashige & Skoog 1962, Phytotechnology®), el cual se preparó disolviendo 4.43 g/L de medio, se enriqueció con 30 g/L de sacarosa comercial y 3g/L de carbón activado. El pH se ajustó a 5.7 con NAOH 1N con el uso de un potenciómetro. Para la preparación del medio semisólido se añadieron 8 g/L de agar Plant TC®, y finalmente se esterilizaron en autoclave a 121°C/ 20 min a 15 libras de presión atmosférica. Previo a la adición del agar se añadieron los reguladores de crecimiento vegetal y/o los extractos naturales al medio de cultivo antes de ser esterilizado. Pre-aclimatación de M. grandiflora y E. cardhioporum Para iniciar la pre-aclimatación de las especies en estudio, se realizaron seis repeticiones de cada uno de los tratamientos (n= 18) evaluados. El Tratamiento control (T1) contenía únicamente 20 mL de Medio basal (MS), el tratamiento T2 contenía 1 ppm de Indole-3-Butyric-Acid (AIB) y el tratamiento T3 contenían Indole-3-Acetic-Acid (AIA). En cada uno de los tratamientos se probaron tres soportes naturales para evitar el uso de agar plant (Tabla 1). Todos los tratamientos se prepararon en recipientes de 500 mL de capacidad y fueron sellados con papel vitafilm y esterilizados en autoclave. Se realizaron evaluaciones semanales para determinar la formación de nuevas raíces, brotes y acelerar el crecimiento de las plántulas de E. cardiphorun y M. grandiflora.

Trasplante de E. cardiphorun y M. grandiflora en condiciones de asepsia

Tabla 1. Tratamientos empleados en la aclimatación de las orquídeas

Tratamiento Contenido Sustrato

Corteza Agar Carbón T1 MB 6 6 6 T2 MB+AIA (1

ppm) 6 6 6

T3 MB +AIB (1ppm) 6 6 6


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de plántulas micropropagadas in vitro no sobreviven a las condiciones medio ambientales, debido a que tienen más baja humedad relativa, niveles altos de intensidad luminosa y un entorno séptico que generan estrés en las plántulas (Chugh et al., 2009). Por ello, es de suma importancia realizar una etapa de pre-aclimatación a las plantas de manera que éstas puedan sobrevivir cuando sean llevadas al medio ambiente. Los experimentos pre-aclimatación realizados en este proyecto, favorecieron el alto porcentaje de sobrevivencia mostrado en E. cardiophorum y M. grandiflora. En un estudio realizado por Ávila y Salgado-Garciglia (2006), se obtuvo un porcentaje de sobrevivencia del 70% en L. autumnalis, L. albida, E. citrina y O. cavendishianum, mientras que en L. speciosa, la sobrevivencia fue de hasta de un 98%, debido a que las plántulas in vitro se mantuvieron por 20 días en condiciones de invernadero previo a su transplante. La aclimatación es la etapa final, donde la manipulación debe ser muy cuidadosa, ya que es donde se produce el mayor índice de mortandad, principalmente en el proceso de trasplante. Van ginderdeuren (2009), menciona que la mayoría de las plantas producidas in vitro deben ser aclimatadas para obtener así un número suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al medio ambiente, además en este estudio con Chloraea virescens (Willd.), demostró que el tamaño de las plántulas es un factor importante para lograr un mayor porcentaje de sobrevivencia.

Figura 1. Sustrato corteza roja

y MSA

Myrmercophila grandifloraB

Figura 2.Aclimatacion de Epidendrum cardiophorum C

Figura 2. Etapas de preaclimatación in vitro y aclimatación ex vitro. A) Etapa de pre-aclimatación de Epidendrum cardiophorum sobre corteza de pino; B) Etapa de aclimatación de Epidendrum

cardiophorum C) Etapa de aclimatación de Myrmecophila grandiflora.

CONCLUSIONES

Se estableció un sistema de pre-aclimatación in vitro con diferentes sustratos naturales de soporte. Dado que el análisis estadístico realizado en esta etapa demostró que no existe diferencia significativa entre los tratamientos, es posible sustituir el uso de agar en la última etapa de cultivo in vitro, de manera que se reduzcan los costos de la micropropagación, y se favorezca la calidad de los brotes. Además, se encontró que la etapa de pre-aclimatación es factor indispensable para lograr un mayor porcentaje de sobrevivencia durante la etapa de aclimatación de las orquídeas Epidendrum cardiophorum y Myrmecophila grandiflora.

BIBLIOGRAFÍA Ávila, D. I., Salgado-Garciglia, R. (2006). Propagación y mantenimiento in vitro de orquídeas mexicanas,

para colaborar en su conservación. BIOLÓGICAS, Facultad de Biología de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, 8, 138–149.

Figura 1. Respuesta morfogenética (incremento de la altura, nuevos brotes y formación de raíces en los diferentes soportes (carbón vegetal, corteza de pino y agar). A) Epidendrum cardiophorum; B) Myrmecophila grandiflora. Aunque las diferencias observadas en la respuesta morfogenética no son significativas en este periodo de tiempo, se observó que para E. cardiophorum, el carbón vegetal favoreció brotes de mayor calidad y con mayor altura cuando el sustrato fue enriquecido con AIB, mientras que en el sustrato de corteza de árbol con esta misma auxina se obtuvieron brotes más sanos y con una mayor calidad de raíces (Figura 1A). En cuanto a M. grandiflora aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas (Figura 1B), se observaron nuevos brotes y raíces nuevas de mayor calidad en los tratamientos con corteza de árbol. Estos resultados demuestran que el uso de agar en las etapas de enraizamiento y pre-aclimatación podría sustituirse por el uso de sustratos de soporte naturales como la corteza de pino. E. cardiophorum y M. grandiflora al igual que Encyclia mariae son orquídeas epifitas, en las cuales es imprescindible la aireación de sus raíces para su supervivencia (Santos y Carranza, 2009). Los sustrato naturales como el carbón vegetal y corteza de pino se caracterizan por su alta porosidad permitiendo una correcta aireación en las raíces y en consecuencia, la absorción de agua y nutrientes para el desarrollo de las plántulas. Moreno y Menchaca (2007) observaron que la adición de sustratos orgánicos durante el cultivo in vitro aumentan el porcentaje de supervivencia de las plántulas durante la etapa de aclimatación, adjudicando este factor a los resultados observados en este experimento. Respuesta de E. cardiophorum y M. grandiflora en la etapa de trasplante ex vitro Una vez realizado el proceso de pre-aclimatación, las plántulas de E. cardiophorum y M. grandiflora que alcanzaron una mayor altura y un mayor número de brotes, se sometieron al proceso de aclimatación ex vitro. En la Figura 2, se presenta la apariencia de las plántulas en esta etapa de cultivo. En esta etapa el porcentaje de sobrevivencia fue del 100% para ambas especies después de dos semanas de evaluación; además, no se registró contaminación ni oxidación. Es importante mencionar que un número considerable

Tratamientos

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Carbon MS Carbon AIA Carbon AIA: 0,3074 Carbon AIB Carbon AIB: 0,2778 Corteza MS Corteza MS: 0,5741 Corteza AIA Corteza AIA: 0,4444 Corteza AIB Corteza AIB: 0,4722 Agar MS Agar AIA Agar AIA : 0,2667 Agar AIB Agar AIB: 0,2222

Carbón Corteza Agar

MS

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Col 1 Col 1: 0,7222 Col 3 Col 5 Col 7 Col 7: 1,2222 Col 9 Col 11 Col 11: 0,9444 Col 13 Col 13: 0,6296 Col 15 Col 17 Col 17: 0,1667

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BRADICIDINA, RESPUESTA CONTRACTIL Y SU RELACION CON EL FLUJO EN ARTERIAS CAROTIDAS DE COBAYO

Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Venustiano Carranza #2405, Col. Los Filtros, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P, MÉXICO; [email protected]; espinosr@

uaslp.mx; [email protected]

Godinez Bravo, I.; Espinosa Tanguma, R.; Hernández Méndez, A.

RESUMEN Las arterias del sistema circulatorio son capaces de adaptarse a diferentes variables, es decir, pueden relajarse (vasodilatación) o contraerse (vasoconstricción) según sean las necesidades del organismo. Una de estas variables es el flujo. El principal objetivo del estudio fue saber más acerca de este mecanismo, de cómo es que la arteria ‘’sensa’’ cuando el flujo es bajo o alto, lo cual significa un reto ya que el flujo es algo meramente mecánico. Para lograrlo realizamos experimentos sobre arteria carótida de cobayo estimulada con Bradicidina, un péptido vasoconstrictor del grupo de las cininas, apoyados por un controlador de flujo llamado ‘’Harvard Apparatus Speed Control’’, un sistema de adquisición de datos BIOPAC y un transductor. Los experimentos generaron resultados positivos, la respuesta contráctil del tejido a estímulos de Bradicidina fue dependiente del flujo, tal que la respuesta a un flujo bajo va siendo menor conforme se van dando los estímulos y cuando se maneja un flujo alto la respuesta es invariable.

ABSTRACT Arteries from circulatory system are able to adapt themselves depending on different variables, in fact, they can expand or contract according to the organism needs, one of this variable is flow. The principal objective of this study is to know more about this mechanism, to know how arterie sense when the flow gets high or low, this mean a hard work beacuse flow is purely mechanical. We realize experiments on carotid artery of guinea pig estimulated with Bradykinin, a peptide of the kinin group that cause blood vessels to dilate, supported by a flux modulator called ‘’Harvard Apparatus Speed Control’’, a system of data acquisiton BIOPAC and a transductor. The results were succesful, contráctil response of carotid arterie to Bradikinin were dependent on flow level, at a low flow the response of the vessel goes down while at high flow the response doesn’t change. Palabras clave: Flujo, Bradicidina, Arteria carótida, Vasoconstricción, Vasodilatación.

INTRODUCCIÓN En los últimos años el estudio del sistema circulatorio ha tomado más importancia debido a su relación con múltiples enfermedades tales como la hipertensión y la diabetes mellitus, entre otras. El sistema

Barrera-Vargas, D.G., Chavez-Avila V.M., Sandoval-Zapotitla E (S/A). Propagación in vitro vía organogénesis indirecta de Laelia speciosa L. (Orchidaceae) especie en peligro de extinción. XI congreso Nacional de Biotecnología Y Bioingeniería. Universidad Autónoma de México. •

Chugh S., Guha S., Rao U. (2009). Micropopagation of orchids: A review on the potential of different explants. Scientia Horticulturae. 122: 507 – 520.

Cox T. L. D. (2013). Orquídeas: Importancia y uso en México. Bioagrociencias, 6 (2). Obtenida el 12 de julio de 2016 de: http://www.ccba.uady.mx/revistas/bioagro/V6N2/Articulo%201.pdf

Moreno M. D., Menchaca G. R. (2007). Efecto de los compuestos orgánicos en la propagación in vitro de Stanhopea tigrina bateman (Orchidaceae)” en Foresta Veracruzana 9(2): 27 – 32.

Pérez-Molphe, B., Ramírez-Malagón, R., Núñez-Palenius, H.G., Ochoa-Alejo, A. (1999). Introducción al cultivo de tejidos vegetales. Universidad Autónoma de Aguascalientes. Dentro de: Munguía-Sánchez, L.G. y Castro-Aranda, N.I. (2012).Micropropagación de especies forestales de la Huasteca Potosina. Universidad de San Luis Potosí Campus Huasteca.

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Tiza A. G. (2010). Propagación in vitro de las orquídeas Dendrobium, Laelia anceps, Phalaenopsis y Sobralia xantholeuca, Universidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Químicas. Versión electrónica obtenida el 12 de julio de 2016 de: http://cdigital.uv.mx/bitstream/123456789/31065/1/TizaArias.pdf.

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Tabla 1. Reactivos para solución fisiológica Sustancia 1L 2L NaCl 67.5ml 135ml KCl 2.36ml 4.72ml MgSO4 2ml 4ml KH2PO4 2ml 4ml CaCl2 2.2ml 4.4ml Dextrosa 1.01g 2.02g Hepes 2.38g 4.76g

Dicha solución puede variar depende del uso que se le quiera dar, pero la mayoría llevan casi los mismos reactivos, se agregaron los reactivos a un recipiente con agua destilada y se dejaron agitar unos minutos, una vez diluidos todos los reactivos en la solución, se procedió a ajustar el pH con ayuda del pHmetro. El pHmetro debía ser calibrado previamente cada vez que este se requería, usando dos sustancias con pH fijos, uno con pH de 4 y otro de 7, hecho esto, colocamos el electrodo del pHmetro en la solución, la cual normalmente poseía un pH inicial de entre 5 y 6, por lo que para ajustarlo al valor indicado (7.4) usamos un gotero con el que se iba agregando cuidadosamente hidróxido de sodio para que así, la solución, inicialmente acida fuese haciéndose más básica hasta llegar al valor de 7.4. Modelo animal El modelo animal usado fue sobre cobayo, específicamente arterias carótidas, usamos cobayos macho de entre 600 y 700 gramos. Estos fueron anestesiados con Pentobarbital (1ml/g) y Heparina (200µl), después de la dosis esperamos entre 10 y 20 minutos para que esta haga efecto, para comprobarlo, se da un pequeño pinchazo en la pata del animal para observar su reacción, si este reacciona se añade una pequeña dosis más, de lo contrario se procede con la cirugía, en la que haciendo uso de un respirador, una fuente de luz variable, un poco de nuestra solución Krebs y material quirúrgico como tijeras y pinzas, se obtienen 2 carótidas de entre .5-1 cm. Estas fueron limpiadas, es decir, se cortó el tejido graso adyacente a ambas carótidas apoyándonos de un microscopio y material fino (pinzas y tijeras) y después fueron montadas en una cánula, la cual debía insertarse en el lado indicado de la carótida, para que el fluido vaya en el mismo sentido a como la sangre fluye en el organismo vivo. Harvard apparatus speed control Una vez las carótidas en las cánulas, estas fueron montadas en un aparato que permite controlar la velocidad con la que cierto fluido pasa a través de un vaso sanguíneo y mantenerla a cierta temperatura; para nuestro objetivo usamos carótidas de cobayo y el fluido usado fue solución de Krebs a una temperatura de 37 centígrados. Este controlador de flujo debía ser previamente calibrado cada vez que fuera a usarse, haciendo uno de un tubo y un timer, moviendo la manija del controlador para ubicar 5, 11 y 16 ml/min. Las carótidas debían ser ‘’acondicionadas’’ al flujo del controlador, por lo que cada uno de los experimentos que realizamos tenía el siguiente orden: 15 minutos a un flujo de 5 ml/min, 5 minutos a un flujo de 16 ml/min, 5 minutos a un flujo de 11 ml/min, 4 estímulos de Bradicidina 1µM con 5 minutos entre cada uno de ellos, 5 minutos a un flujo de 16 ml/min , 4 estímulos de Bradicidina 1µM, y finalmente 2 minutos a un flujo de 5 minutos, donde los primeros 20 minutos eran para este ‘’acondicionamiento’’ de las carótidas al flujo. La presión fue detectada mediante un transductor el cual, mediante un sistema de adquisición de datos (BIOPAC) muestreo y envío datos de presión a una frecuencia de muestreo de 1 muestra/segundo a un

circulatorio tiene como función transportar la sangre y las diferentes moléculas que hay en ella hacia las células del cuerpo, este sistema está formado por el corazón, los vasos sanguíneos (arterias, venas y capilares), la sangre y el sistema linfático. El corazón se encarga de generar diferencias de presión entre él mismo y los vasos, para que la sangre pueda fluir a través del sistema, el cual es un sistema cerrado, las venas tienen la función de retornar la sangre venosa (con muy poco oxigeno) hacia el corazón, las arterias son las encargadas de transportar la sangre oxigenada del corazón a los órganos, estas tienen paredes gruesas y ligeramente elásticas ya que deben ajustarse según la presión ejercida sobre ellas, por ejemplo, en condiciones de ejercicio, nuestros músculos demandan más oxígeno, por lo que las arterias se dilatan para que la resistencia de éstas al flujo sea menor, y así la sangre sea llevada más fácilmente hacia las células musculares . Las arterias constan de tres capas concéntricas, interna o intima, media y adventicia o externa. La capa interna está constituida por el endotelio, una lámina basal y una capa conjuntiva subendotelial, la capa media está compuesta por fibras musculares lisas dispuestas de forma concéntrica, y la capa externa está formada por tejido conjuntivo laxo. El control en el área de la luz de las arterias es posible gracias a estas células de musculo liso vascular (MLV) en la capa media, células que pueden contraerse o relajarse según sean las necesidades fisiológicas del organismo. Existen substancias autacoides relacionadas a la dilatación, contracción y permeabilidad vascular los cuales son parte del llamado grupo de las cininas, entre estos péptidos se encuentra la Bradicidina. Rocha e Silva y sus colaboradores (1949) señalaron que la tripsina y algunos venenos de serpiente actuaban en una globulina plasmática para producir una sustancia que disminuía la presión arterial y que ocasionaba contracción de aparición lenta en el intestino, sustancia a la que llamaron Bradicidina. Se conocen como mínimo dos receptores diferentes de cininas que han sido llamados B1 y B2. El receptor B2, liga selectivamente Bradicinina, y es un constitutivo de casi todos los tejidos normales. Los receptores B2 median la mayor parte de los efectos de la Bradicinina. El receptor B1 se liga de modo selectivo a los metabolitos des-Arg en la terminación carboxi de la Bradicinina y es menor su número que el del receptor B2 en casi todos los tejidos. Los receptores B1 están en el músculo liso normal de vasos; son regulados en forma aditiva por la inflamación. Durante situaciones de estrés, como traumatismo, presión tisular o inflamación, pueden predominar los efectos en receptores B1. Los mecanismos de envío de señales de dichas estructuras no se han definido con la precisión que se ha obtenido con los receptores B2. Bradicidina es bien conocida por sus efectos hipotensores en modelos animales, por lo que el objetivo de la investigación es indagar acerca de sus efectos contráctiles, con el flujo como una de las variables principales. Se espera que la respuesta contráctil de las carótidas a estímulos de Bradicidina sea diferente en diferentes condiciones, es decir, que la respuesta cuando se estimule la carótida con un flujo de 11 ml/min difiera de la respuesta cuando se estimule con un flujo de 16 ml/min.

METODOLOGIA Solución fisiológica La solución fisiológica o solución de Krebs fue algo básico y fundamental en el estudio. Las células de la arteria carótida que usamos deben estar en un medio similar al de nuestro organismo, para ello usamos solución de Krebs, la cual es una disolución acuosa de sustancias compatibles con los organismos vivos debido a sus características definidas de osmoticidad, pH y fuerza iónica. Dicha solución contiene las siguientes sustancias: Cloruro de Sodio 2M, Cloruro de Potasio 2M, Sulfato de Magnesio .6M, Cloruro de Calcio .5M, Fosfato de Potasio Monobásico .6M, Dextrosa y Hepes; en las cantidades mostradas en la Tabla 1.


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la acción de un ligando, como resultado de la acción de este ligando sobre la célula, en farmacología es la pérdida de respuesta proveniente de la acción del fármaco agonista, esto igualmente podría explicar porque la respuesta contráctil de la arteria carótida va en disminución cuando se maneja el flujo de 11 ml/min mientras que para el comportamiento observado a un flujo de 16 ml/min podría hablarse de una hipersensibilización de receptores o de que los receptores inicialmente desensibilizados vuelvan a ser afines al agonista, en este caso Bradicidina. Probablemente al tratar a la arteria carótida con un flujo de 11 ml/min los receptores B2 son los que están mediando la respuesta a los primeros 4 estímulos de Bradicidina mientras que, cuando hacemos que el controlador maneje un flujo de 16 ml/min parte de los receptores B2 aun median esta respuesta, pero apoyados por los receptores B1, los cuales son regulados por inflamación, situaciones de estrés, traumatismo y/o presión tisular. La figura 2 pretende dar una visión más general acerca de los cambios en la respuesta contráctil de la arteria carótida a estímulos de Bradicidina, incluyendo los datos de los 4 experimentos con una respuesta favorable junto con su error (SEM)

Figura 2. Grafico que muestra los cambios de presión en porcentaje de los estímulos 2, 3 y 4 con respecto del 1 (100%) los cuales son dados a un flujo de 11 ml/min y de los estímulos 6, 7 y 8 con

respecto del 5 (100%) los cuales son dados a un flujo de 16 ml/min.

computador que a su vez, apoyado en el software ‘’ AcqKnowledge’’ desplegaba en el monitor un gráfico en tiempo real de presión contra tiempo. Análisis estadístico Para el análisis, extrajimos los datos de AcqKnowledge y los convertimos a un archivo de texto .txt para así poder hacer uso de estos usando ‘’Graph Pad v6’’. En Graph Pad v6 insertamos los datos usando la función ‘’import’’ y los graficamos usando el tipo de grafica ‘’points only’’, después fue necesario acondicionar la gráfica, eliminando algunos símbolos, ajustando las escalas tanto en el eje de las abscisas cono en el de las ordenadas para una mejor apariencia del trazo y colocando las etiquetas respectivas a los ejes e indicando los tiempos en los que los estímulos fueron aplicados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la figura 1 se muestra el trazo representativo del experimento usando estímulos con Bradicidina (1µM), en el que se puede observar que el flujo podría modular de alguna manera la repuesta contráctil, es decir, que al igual que Bradicidina, el flujo podría ser un agonista, un agonista físico del cual, poco conocimiento hay acerca de su funcionamiento.

Figura 1. Trazo representativo del experimento sobre arteria carótida de cobayo. A un flujo de 11

ml/min se observa que, conforme se van dando las dosis de Bradicidina (1µM) la respuesta del tejido a este va disminuyendo, mientras que a un flujo de 16 ml/min la respuesta no varía mucho conforme se

van dando los estímulos. Esta diferencia en la respuesta contráctil de la arteria carótida a estímulos de Bradicidina (1µM) podría ser causada por varios factores: el tiempo que transcurre mientras la carótida es tratada, una desensibilización de los receptores de las cininas o algún otro mecanismo desconocido aun. El tiempo podría ser un factor ya que al estar dando estímulos continuos de Bradicidina y cambiando el flujo, el tejido se vaya dañando, cambiando así su respuesta contráctil, lo cual podría explicar la disminución en la respuesta mientras se maneja el flujo de 11 ml/min, pero no podría explicar porque la respuesta no se ve afectada cuando se maneja el flujo de 16 ml/min. La desensibilización de receptores es la perdida de respuesta de una célula a


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ANALISIS PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOELECTROENFOQUE EN CAPILAR

Unidad Académica Multidisciplinaria de la Zona Media, Carretera Rioverde – San Ciro Km 4, Ejido Puente del Carmen, CP 79617, Zona Media, Rioverde, S.L.P. México, [email protected]

Hernández Gutiérrez, I.; Maldonado Cervantes, E.

RESUMEN La producción y consumo de la cerveza, presenta una tendencia alcista, intentando recuperar la tradición en la elaboración, pudiendo comprometer la calidad del producto final. Es por ello que se analizó la cantidad de proteína de una cerveza artesanal producida por la UASLP, por dos métodos de cuantificación: Bradford (2.39 mg/ml) y BCA (1.14 mg/ml). Estas diferencias se atribuyen a la afinidad de ambos reactivos por compuestos orgánicos extras contenidos en la cerveza.

ABSTRACT The production and consumption of the beer, he presents a high trend, trying to recover the tradition in the production, being able to compromise the quality of the final product. It is for it that one analyzed the quantity of protein of a handcrafted produced beer for UASLP whit two methods of quantification: Bradford (2.39 mg/ml) and BCA (1.14 mg/ml). These differences attribute to themselves to the affinity of both reagents for organic compounds extras contained in the beer. Palabras Clave: CERVEZA, PROTEÌNA, ELECTROFORESIS, ISOELECTROENFOQUE

INTRODUCCIÓN En el presente proyecto se tuvo como objetivo principal, obtener un perfil proteico de una cerveza artesanal que se prepara con fines didácticos de procesos industriales en la bioquímica de alimentos por alumnos de la carrera de Ing. Agroindustrial de la U.A.S.L.P. Los métodos realizados, se enfocaron en la obtención de un perfil de cuantificación y análisis electroforético de doble dimensión de las proteínas contenidas en dicho producto.

MARCO TEORICO De manera general se debe conocer como proteína, a un “polímero lineal en los que las unidades monoméricas son los aminoácidos que lo conforman; éstos se pliegan en una notable diversidad de formas tridimensionales, que les proporcionan una correspondiente variedad de funciones bioquímicas.” (Teijón J. 2006)

CONCLUSIONES Se logró aislar arterias carótidas de cobayo manteniéndolas en el medio adecuado, y además manipular correctamente el ‘’Harvard Apparatus Speed Control’’ para montar en el mismo el tejido y así realizar el experimento. A pesar de que es difícil dar una interpretación clara hacia lo que sucede con la respuesta contráctil de la arteria carótida de cobayo cuando esta se estimula con Bradicidina (1µM) y se tiene al flujo como principal variable, se obtuvieron resultados positivos y reproducibles, 4 de ellos muy buenos en los que se muestra la clara diferencia entre lo que sucede con la respuesta contráctil de la arteria carótida a un flujo de 11 ml/min contra lo que pasa con esta a un flujo de 16 ml/min, la disminución en la respuesta de los primeros 4 estímulos a un flujo ‘’bajo’’ y la invariabilidad de los 4 últimos a un flujo ‘’alto’’. Sería adecuado realizar muchos más experimentos controlando algunas otras variables, tal como la presencia del glucocalix o el endotelio, así como manejar otro tipo de fármacos, para tener un panorama más abierto acerca del comportamiento de estos sistemas biológicos.

BIBLIOGRAFIA

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Tabla 1. Cantidades de Reactivo Bradford y muestra de concentración conocida para la obtención de los estándares de calibración y analito.

Concentración ml. de Buffer de fosfatos ml. muestra de concentración conocida 0 1 0

0.2 0.998 0.002 0.4 0.996 0.004 0.6 0.994 0.006 0.8 0.992 0.008 1 0 1

Analito 1.5 0.03 Con estos estándares se realizaron tres curvas de calibración midiendo su absorbancia a 595 nm obteniendo el siguiente resultado. Tabla 2. Valores de Abs en nm de los estándares y el analito

ESTÁNDAR (mg/ml) Abs 1 (nm) Abs 2 (nm) Abs 3 (nm) 0 0.0875 0.2 0.920 0.815 0.852 0.4 1.127 0.958 0.6 1.116 1.081 1.091 0.8 1.308 1.172 1.187 1 ND 1.322 1.328 ANALITO 0.858 0.896 0.874

Se calculó la ecuación de la recta de nuestra lectura 3 (y= 0.5854x + 0.734) obteniendo de ésta un R= 0.99 como grado de confianza para posterior a esto, ubicar nuestro analito 0.874 nm en la variable X obteniendo por interpolación una concentración.

Gráfica 1. Curva de calibración, ecuación de la recta y R.

Método con ácido biscinconico. Para realizar nuestra curva de calibración se elaboró una solución de trabajo con la que se prepararon nuestros estándares y muestra. Para éste, se mezcló 9.8 ml de ácido biscinconico con 0.2 ml de CuSO4 obteniendo así 10 ml. del mismo. Se realizaron 6 estándares de 1 ml.

Existen diversas formas de cuantificar las proteínas en un analito. Para el presente proyecto se realizaron dos cuantificaciones basadas en los métodos: Brandford y Ácido Biscinconico. Respectivamente, el primero se basa en la unión específica del colorante Coomassie blue G-250 o reactivo de Bradford con las proteínas disponibles de las muestras a analizar. Las proteínas se unen a la forma azul para formar el complejo proteína-colorante, produciendo una absorbancia máxima de 595 nm. “La determinación del contenido proteico requiere una comparación del valor de absorbancia de la muestra con las obtenidas, a partir de las cantidades conocidas de proteínas, con el que se construye una recta de calibración; a mayor cantidad de proteínas, mayor desarrollo y, por tanto, mayor absorbancia.” (Martinez A. 2015). Por su parte, el segundo método se basa en la acción de “un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret)”. (Fernandez E. et.al. 2012). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible. Dichas moléculas, para su clasificación e identificación, además de poseer un determinado peso molecular definido, tienen una característica llamada punto isoeléctrico, que a definición de (Harris D. 2006), en dicho punto, la carga media de todas las formas de la proteína es cero, por lo tanto, cuando una proteína se encuentra en su punto o pH isoeléctrico, no migra en un campo eléctrico. Siendo este efecto es el fundamento de parte de la técnica realizada para la separación de proteínas. La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de las proteínas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer lugar “las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separación por carga las proteínas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE), que le confiere a la proteína la propiedad de migrar en una sola dirección. Tras la tinción del gel (con Coomassie blue) las proteínas aparecen formando manchas circulares”. (Morales D. 2006)

METODOLOGIA Se comenzó con la preparacion de 10 ml. de Buffer de Fosfatos (Na2HPO4 0.1 M) pesando en balanza analítica 0.2922 g de NaCl y 0.14196 g de Na2HPO4 para mezclar ambos reactivos con 7 ml. de agua destilada y nivelando su pH con un potenciómetro a 7 con solución NaOH, al llegar al dicho punto, se aforó a 10 ml. Se procedió a obtener nuestro analito de cerveza desarrollando precipitación seriada. Se colocó en 6 tubos Ependorf 300 ul de muestra con 900 ul de Acetona y se dejaron reposar para su precipitación a 4° C durante dos horas. Luego de este tiempo, se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante por decantación. La precipitación seriada se realizó colocando 300 ul de buffer de fosfatos (Na2HPO4)al primer tubo, agitándolo en el Vortex para luego pasar dicho contenido homogéneo al próximo tubo, realizando esto sucesivamente para obtener en el sexto tubo un concentrado. Método Brafford. Para realizar nuestra curva de calibración se elaboró una solución de trabajo con la que se prepararon por triplicado nuestros estándares y muestra. Para éste, se mezcló 6 ml del reactivo Bradford ( 5mg de Azul de Coomasie G-250, 2.5 ml de etanol, 5ml de ácido fosfórico aforando a 50 ml.) con 24 ml de H2O destilada obteniendo así 30 ml. del mismo. Para cada curva se realizaron 6 estándares de 1 ml. con concentraciones conocidas de albumina de suero bovino de 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg/ml. y 1.503 ml. del analito de la siguiente manera.


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Electroforesis sds-page. Se elaboró el gel de separación con 2.77 ml de Acrilamida al 30%, 1.64 ml de Agua Destilada, 1.5 ml de Tris 15m pH=8.8, 60 ul de SDS 10%, 30 ul de PSA 10% y 3 ul de TEMED. La mezcla anterior se desgasificó durante 15 minutos y se colocó en el molde del gel previamente armado y se dejó polimerizar durante una hora. Para el gel concentrador se mezclaron con 0.132 ml de Acrilamida al 4%, 0.603 ml de Agua Destilada, 0.250 ml de Tris 0.5 M pH=6.8, 0.1 ml de SDS 10%, 0.05 ml de PSA 10% y 0.005 ul de TEMED colocando esta última mezcla en la parte superior del molde. Se prepararon 5 muestras añadiendo 8.36 ul de muestra concentrada con 3 ul de Buffer de Fostatos y 4ul de buffer de carga. Se colocó un marcador de peso molecular conocido en el primer espacio de corrida del gel para en los siguientes cinco, colocar nuestras muestras. La electroforesis se desarrolló a 20 mA constante hasta correr completamente la muestra a lo largo del gel. Posteriormente el gel se tiñó en Azul de Coomassie al 0.025% durante 12 horas, para luego sumergirlo en una solución de desteñido con 50% etanol, 10% Acido Acético y 40% agua destilada.


Tabla 5. Concentraciones obtenidas respecto al método usado.

MÉTODO CONCENTRACIÓN (mg/ml) Bradford 1.14 Ácido Biscinconico 2.39

La concentración mayor se obtuvo por el método de Ácido Biscinconico siendo casi el doble de proteína que por método Bradford, esta diferencia significativa puede deberse a la afinidad que tienen los reactivos hacia otros componentes dentro de la muestra. La intensidad de absorción en el método Bradford tal como lo describe García et. al. (1998) depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos, existiendo alguna inferencia debido a compuestos nitrogenados y/o aromáticos extra dentro de nuestra muestra de origen artesanal. Otras sustancias que interfieren estos ensayos con BCA son los agentes fuertemente alcalinos que en congruencia con Roca. P. et.al. (2003) es fácilmente solucionable con la utilización de buffers. Mismo autor señala que las respuestas en la absorbancia no tienden a ser lineal debido a que el colorante no es estable con el tiempo. Los únicos componentes presentes en nuestro método que pudieron de alguna forma contaminar nuestras muestras fueron SDS, Triton x-100. Dado que una proteína contiene varios grupos cargados, su solubilidad depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad componentes nutritivos de la muestra como sacarosa, el pH y la temperatura. Autores como Harris D. (2006) describen que cualquier reactivo en la muestra que disminuya el pH a menos de 11 puede afectar la sensibilidad y reproductibilidad del ensayo. Como se señala en distintas Técnicas de análisis instrumental el reactivo Bradford no tiene interferencias con polifenoles ni carbohidratos, pudiendo de esta manera fundamentar el resultado menor en los dos análisis, debido a que el reactivo ignora dichos componentes que pudieran estar en nuestra muestra de cerveza artesanal.

con concentraciones conocidas de albumina de suero bovino 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg/ml. y 1.5 ml. del analito de la siguiente manera. Tabla 3. Cantidades de Buffer de fosfatos y muestra de concentración conocida para la obtención de los estándares de calibración y analito.

Concentración ml. de Buffer de fosfatos ml. muestra de concentración conocida

0 1 0

0.2 0.998 0.002

0.4 0.996 0.004

0.6 0.994 0.006

0.8 0.992 0.008

1 0 1

ANALITO 1.4 0.08 Se procedió a incubar dichos estándares durante 30 minutos a 37°C. Con estos estándares se realizó una curva de calibración midiendo su absorbancia a 595 nm obteniendo el siguiente resultado. Tabla 4. Valores de absorbancia en nm de los estándares.

ESTANDAR (mg/ml) Abs (nm) 0 0.267 0.2 0.398 0.4 0.588 0.6 0.811 0.8 0.905 1 1.024

Posterior a esto, se hizo la lecutura de absorbancia de nuestro analito, obtieniendo Abs= 1.117 nm. Para ubicar nuestro conocer su concentración, se calculó la ecuación de la recta (y= 0.7899x + 0.2706) con los valores de abs de concentración conocida teniendo como grado de confianza un R=0.99, ubicando nuestro analito en la variable X por interpolación.

Gráfica 2. Curva de calibración, ecuación de la recta y R.


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SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE HIDROGELES ELECTROACTIVOS DE POLI(ACRILAMIDA-CO-ÁCIDO ACRÍLICO)/POLIPIRROL

1Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y Antonio García Cubas Pte #600, C.P. 38010, Cela-ya, Guanajuato., México, [email protected]; 2Universidad Autónoma de San Luis Potosí Co-ordinación Académica Región Altiplano (Campus Matehuala), Carretera Cedral KM 5+600, Col. Ejido

San José de las Trojes, C.P. 78700, Matehuala, San Luis Potosí., México, [email protected]

Hernández Landín, C. A.1; Ovando Medina, V. M.2

RESUMEN En este trabajo, se sintetizaron hidrogeles de poli(acrilamida-co-ácido acrílico) (AAm/AAc) variando la relación de acrilamida/ácido acrílico en 100:0, 70:30 y 50:50 usando persulfato de amonio como iniciador. Los hidrogeles obtenidos de esta manera, fueron usados para preparar un composito de hidrogeles electroactivos mediante la polimerización de pirrol en presencia de los hidrogeles, obteniendo un composito de AAm/AAc/Polipirrol. Los materiales fueron caracterizados mediante espectroscopia de FTIR y se determinaron sus propiedades de hinchamiento. Se observó mediante un modelo de hinchamiento de pseudo-primer orden que el hidrogel con mayor capacidad de hinchamiento y mayor velocidad de hinchamiento inicial fue el hidrogel AAm/AAc 70/30, siendo de igual manera rígido en su estructura y resistente en su manipulación.

ABSTRACT In this report Hydrogels were synthesized from poly(acrylamide-co-acrylic acid) (AAm/AAc) varying the relation of acrylamide/acrylic acid in 100:0, 70:30 and 50:50 using ammonium persulfate as initiator. Hydrogels obtained from this way, were used to prepare an electroactive hydrogels composite through the pyrrole polymerization in presence of the hydrogels, obtaining an AAm/AAc/Polypyrrole composite. Materials were characterized by FTIR spectroscopy and it was determined their properties of swelling. It was observed by swelling kinetic of pseudo first order the hydrogel with higher swelling maximum capacity and higher initial swelling speed was hydrogel AAm/AAc 70/30, being also rigid in his structure and resistant on him manipulation. Keywords: Hydrogel, polymerized, swelling_kinetic, Polypyrrole.

INTRODUCCIÓN Los sistemas avanzados de liberación controlada ofrecen un grado significativo en la libertad en la elección del lugar de aplicación. Mientras que muchas formulaciones tradicionales deben ser inyectadas o ingeridas, los sistemas poliméricos de liberación controlada pueden ser localizados prácticamente en cualquier cavidad corporal, de modo que estos soportes de fármacos pueden situarse en el organismo en, o cerca de la zona de interés, pueden ser implantados o pueden ser adheridos externamente a la piel, gracias a ello han aparecido nuevas rutas posibles de administración de fármacos. Los sólidos poliméricos son especialmente aptos para formar geles gracias a su estructura de largas cadenas. La flexibilidad de estas cadenas hace posible que se deformen para permitir la entrada de moléculas de algún disolvente dentro de su estructura tridimensional.

Figura 1. Marcador de peso molecular y muestras corridas en el Gel de Poliacrilamida

CONCLUSIONES: La cerveza es una de las bebidas más consumidas a nivel mundial por lo que su interés

nutricional de compuestos bioactivos es importante para la industria. La utilización de material adecuado y evitar contaminación de reactivos es importante durante el

análisis proteómico. Los dos distintos métodos: Bradford y BCA para la cuantificación de proteínas tienen una gran

diferencia significativa en la sensibilidad y afinidad por compuestos nitrogenados y aromáticos. La electroforesis SDS PAGE es un método ideal para el análisis de proteínas.

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7. Roca. P. et.al.2003. Bioquímica: técnicas y métodos. Editorial Hélice. 348 pp


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disolución se pesó y disolvió acido acrílico (AAc) en la solución y una vez se disolviera realizar lo mismo con N,N’ Bisacrilamida de metileno (NNMBAM) y de igual manera con persulfato de amonio según las cantidades que le correspondiese según la sustancia a tratar para la realización del hidrogel mostradas en la Tabla 2. Los viales se colocaron a baño maría a 60ºC con una agitación magnética por un periodo de una hora para que después del periodo de reacción la sustancia en el vial cambiara de estado líquido a sólido mostrando así la formación del hidrogel. El vial contenedor de cada hidrogel fue roto para así liberar el hidrogel y colocarlo en un vaso de precipitados con 200 ml de agua destilada de manera que el hidrogel fuese cubierto completamente por el agua con el objetivo de retirar impurezas de los componentes que no reaccionaron. Este proceso de lavado se repitió por cuatro veces, cambiando el agua de lavado cada doce horas. Así mismo se realizaron duplicados de la síntesis de los hidrogeles siendo una caracterización y otra para su posterior uso en la polimerización de pirrol.

Tabla 2. Cantidad en gramos de reactivos de composición de hidrogeles según sus concentraciones en base de acrilamida y ácido acrílico

Agua, g AAm, g AAc, g NNMBAM, g APS, g

AAm/AAC 100/0 20 2.40 0.00 0.024 0.014 AAm/AAC 70/30 20 1.68 0.72 0.024 0.014 AAm/AAC 50/50 20 1.20 1.20 0.024 0.014

Polimerización de pirrol dentro de la matriz de poliacrilamida y ácido acrílico. Los hidrogeles lavados se cortaron en discos de 3 cm de longitud y se dejaron reposar en una solución de agua destilada (200ml), pirrol como monómero (1.34 gr) y cloruro de potasio como electrolito de transporte (3.5 gr) por aproximadamente 24 horas con el fin de permitir la difusión/adsorción de pirrol en el interior del hidrogel. Una vez terminado el tiempo para la difusión de pirrol en el hidrogel se recurrió a la técnica de oxidación con persulfato de amonio en la solución acuosa de los hidrogeles en la misma concentración molar que la del pirrol en dicha solución (0.0099866 M) siendo la cantidad de 4.56 gramos de persulfato de amonio. Una vez realizado esta oxidación se lavó el hidrogel en agua destilada a manera de sumergir los hidrogeles completamente con el fin de retirar impurezas cambiando así el agua en un ciclo de 12 horas repitiendo dicho ciclo 4 veces. Los hidrogeles que se guardaron como replicas no se polimerizaron. Se tomaron muestras de estos hidrogeles y de aquellos con pirrol y así fueron secados en estufa con el objetivo de realizar un espectro FTIR e identificar sus grupos funcionales y así, discutir si dicho hidrogel tenía los grupos funcionales requeridos por sus compuestos. De igual manera se tomaron muestras de los hidrogeles polimerizados con objetivo de realizar la cinética de hinchamiento siendo que dichas muestras fueron secadas en estufa hasta lograr un peso constante (peso inicial) y llevadas a agua destilada para su constante monitoreo y revisión por lapsos de tiempo para la medición de su peso hasta alcanzar un equilibrio en donde dichos hidrogeles no incrementaran su peso en lapsos de tiempo considerablemente largos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La cantidad en gramos de cada componente de los hidrogeles se reportan en la tabla 3 con el hidrogel (A) y su réplica (B). Tabla 3. Cantidad en gramos reportada de los hidrogeles y sus réplicas en la experimentación

Agua, gr AAm, gr AAc, gr NNMBAM, gr APS, gr

AAm/AAc 100/0 (A) 20.02 2.4024 0 0.0242 0.0137 AAm/AAc 100/0 (B) 20.13 2.4076 0 0.0246 0.0141 AAm/AAc 70/30 (A) 20.03 1.6794 0.7226 0.0248 0.0147

Como antecedentes se tiene el desarrollo de hidrogeles electroconductivos inteligentes por polimerización de pirrol dentro de hidrogel de poliacrilamida para impartir las propiedades múltiples de estímulos sensibles, además de la optimización de la formación del hidrogel (Sáez y Sanz, 2016). De igual manera el antecedente de la preparación química de nanoestructuras de polipirrol (PPy) de soluciones acuosas individuales que contengan L-serina y ácido L-glutamico para la comprobación de la aplicación como dispositivo de implante con objetivo de la liberación de un fármaco (Valencia, 2014). En éste último trabajo, además se hace mención que el polipirrol ha sido extensivamente estudiado dado su capacidad térmica y química, facilitando la preparación y electroactividad y es conocido como material biocompatible por lo cual ha sido utilizado en algunas aplicaciones médicas que incluyen biosensores, ingeniería de tejidos, implantes neurales y dispositivos de administración de fármacos. Para los usos biomédicos, la adhesión de biomoleculas o especies biológicamente activas a polipirrol (PPy) es un paso crítico para lograr su biofuncionalidad.

MARCO TEÓRICO En la síntesis de hidrogeles junto a los elementos habituales de cualquier reacción de polimerización, tales como el disolvente, monómero y el iniciador, se necesita de un agente entrecruzante, que será el responsable de la estructura rígida del gel (Ratner y Hoffman, 1976). Al sintetizar un hidrogel se puede elegir un gran número de monómeros los cuales se dividen en distintas categorías, monómeros con sustituyentes laterales no ionizables (de entre los cuales se puede incluir a la acrilamida); monómeros con grupos funcionales ionizables o monómeros zwiteriónicos, estos últimos consisten en dos grupos cargados y unidos a la cadena principal. Su característica primordial es que para el polímero entrecruzado el hinchamiento de la red es mayor en disolución salina que en agua. Los hidrogeles se preparan mediante el hinchamiento de una estructura entrecruzada en agua o fluidos biológicos que contienen grandes cantidades de ésta. De entre los métodos para su preparación entrecruzada está la reacción química, el cuál es una reacción de copolimerización y entrecruzamiento entre uno o más monómeros y un monómero multifuncional el cual está presente en pequeñas proporciones, este último es denominado agente entrecruzante el cual presenta una masa molecular pequeña que se une a cadenas de peso molecular grande a través de sus grupos funcionales. Es necesario emplear un agente desencadenante de la reacción de polimerización o iniciador. Los sistemas de iniciación que pueden emplearse son los habituales en la síntesis de polímeros, siendo estos radicales libres, temperatura, iniciadores iónicos, radiación gamma o par redox (Sáez y Sanz, 2003).

METODOLOGÍA Durante la experimentación en el laboratorio se utilizaron los siguientes reactivos descritos en la Tabla 1 con su respectivo grado de pureza y la compañía de la cual el reactivo fue adquirido. Dichos reactivos fueron utilizados tal y como se encontraban en su almacenamiento en el laboratorio. Así mismo se hizo uso del equipo de infrarrojo Agilent Technologies Cary 630 FTIR para la obtención de los espectros de infrarrojo.

Tabla 1. Reactivos químicos usados en la experimentación

Reactivo Compañía Grado de pureza Acrilamida Sigma Aldrich >99%

Persulfato de amonio Jalmek >=98% N,N’ – Bisacrilamida de metileno Sigma Aldrich 99%

Acido acrílico Sigma Aldrich 99% Pirrol Aldrich Chemistry 98%

Cloruro de potasio, Cristal J.T. Baker 100% Síntesis de la matriz de poliacrilamida con ácido acrílico (PAAm/AAc). En un vial de tapa rosca con capacidad de 25 ml se depositaron agua destilada para posteriormente pesar y agregar una dewtrminada cantidad de acrilamida (AAm) y una vez se realizó su completa


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Figura 4. Infrarrojo de hidrogel AAm/AAc

50/50 sin pirrol (no polimerizado)

Figura 5. Infrarrojo de hidrogel AAm/AAc 50/50

con pirrol (polimerizado) Siendo 1. Amina (-NH2), 2. Grupo carboxílico (-COOH), 3.Cetona (C=O), 4. Amida (-CONH2) por lo cual los hidrogeles obtuvieron los grupos funcionales y además en la figura 6 la cetona es más a resaltar por el pirrol. De misma manera se tomaron muestras de los hidrogeles polimerizados y de las réplicas no polimerizadas para llevar a cabo un análisis de hinchamiento llevando los hidrogeles a secado y luego sumergiéndolos en agua destilada, tomando muestra del peso y tiempo sumergido hasta alcanzar un equilibrio con el fin de obtener una de hinchamiento gracias a la ecuación 1), ecuación 2) y ecuación 3) (Peppas, 1983).

𝑆 = �𝑡−�0�0

𝑥100% (1)

𝑊 = �𝑡−�0�𝑡

𝑥100% (2)

𝑘�,�𝑡 =1

(��−�)− 1

�� (3)

Así dio paso a la obtención de la figura 6 y la figura 7. Se determinó el peso de hinchamiento máximo (qmáx), la constante de hinchamiento (K2,s) y la velocidad inicial de hinchamiento (r0) mostradas en la tabla 5.

Figura 6. Cinética de hinchamiento de

hidrogeles en función de AAm/AAc

Figura 7. Porcentaje de agua absorbida por

los hidrogeles

Tabla 5. Resultados de la muestra de hinchamiento

2 1

3

4 1

2

3 4

AAm/AAc 70/30 (B) 20.09 1.6829 0.7226 0.0239 0.0137 AAm/AAc 50/50 (A) 20.05 1.2010 1.2116 0.0242 0.014 AAm/AAc 50/50 (B) 20.04 1.2003 1.2026 0.024 0.0148

Estas cantidades de solución fueron colocadas en viales a baño maría por una hora a 60°C para llevar a cabo la síntesis de la matriz. Terminado dicho proceso, se lavaron con agua destilada para retirar impurezas. Por el contacto extenso con el agua algunos hidrogeles se hincharon como se muestra en la figura 1, figura 2 y figura 3.

Figura 1. Hidrogel AAm/AAc

100/0

Figura 2. Hidrogel AAm/AAc

70/30

Figura 3. Hidrogel AAm/AAc 50/50

Los hidrogeles fueron cortados en cilindros de 3 cm de longitud de los cuales se obtuvieron dos cilindros por cada hidrogel aproximadamente. Se preparó la solución de pirrol con las concentraciones reportadas en la tabla 4 y se dejó reposar un cilindro de cada hidrogel en su respectiva solución.

Tabla 4. Solución para la polimerización de los hidrogeles

Agua destilada, gr Pirrol, gr KCL, gr Solución AAm/AAc 100/0 (A) 200 1.35 3.5001 Solución AAm/AAc 70/30 (A) 200 1.35 3.4995 Solución AAm/AAc 50/50 (A) 200 1.36 3.5071

Posteriormente de un lapso de tiempo se realizó la polimerización con ayuda de un potenciostato a 1.5 V por 10 minutos al hidrogel AAm/AAc 100/0 sin embargo no se obtuvieron los resultados esperados puesto que el hidrogel no reaccionó de la manera propuesta siendo que se deshizo por las descargas y el tiempo de 10 minutos no fue óptimo en dicha polimerización (Cotlame 2016) por lo cual se optó por la técnica de oxidación con persulfato de amonio en la solución de pirrol en la cual los hidrogeles se encontraban reposando. Al término de su lapso de oxidación, se tomó una muestra de los hidrogeles polimerizados y de las réplicas que no fueron polimerizadas para ser llevadas a secado por estufa a 60°C con el fin de realizar un análisis en infrarrojo y así determinar sus grupos funcionales en dichos hidrogeles para comprobar la obtención de dichos grupos característicos de los componentes en el hidrogel, ver figura 4 y figura 5.


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SUPERFICIES HIDRÓFOBAS DE MEZCLA DE POLÍMEROS:FUNCIONALIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ÓXIDO DE GRAFENO

POR ESPECTROSCOPIA DE RAMAN Y MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

1Universidad Autónoma Metropolitana UAM-C, Av. Vasco de Quiroga, Santa Fe, C.P. 05000, Ciudad de México, México, [email protected]; 2Instituto de Física, Universidad Autóno-ma de San Luis Potosí, Av. Dr. Manuel Nava No. 6, Ciudad Universitaria, C.P. 78290, San Luis Poto-

sí, S.L.P., México, [email protected]

Hernandez Mora, A. M.1; Pérez López, J. E.2

RESUMEN Dentro de el estudio de superficies hidrofóbas el grafeno puede ser un buen agente para modular esta propiedad. El grafeno es un nanomaterial que se observa como un plano atómico constituido principalmente de carbono el cual puede ser obtenido a partir de grafito comercial o si se desenrolla un nanotubo hasta puede ser si un fullereno es extendido. En este trabajo hemos observado la síntesis del óxido de grafeno y como es su caracterización por diferentes técnicas como lo es la espectroscopia de raman particularmente su grado de oxidación cuando pasa de ser grafito a óxido de grafeno y con la microscopia electrónica de barrido se ha determinado la superficie y el grado de una funcionalización con nanopartículas de hierro comprobándolo con las micrografías. Finalmente comprendiendo los diferentes tipos de preparación y tratamiento de muestras para poder ser leídas en los equipos.

ABSTRACT In the study of hydrophobic surfaces graphene can be a good agent to modulate this property. Graphene is a nanomaterial that is observed as an atomic plane consisting mainly of carbon which can be obtained from commercial graphite or a nanotube to be unwound if a fullerene is extended. In this work we have observed graphene oxide synthesis and characterization as different techniques as it is particularly raman spectroscopy degree of oxidation when changes from graphite to graphene oxide and the scanning electron microscopy has been determined the surface and the degree of functionalization with iron nanoparticles by checking with the micrographs. Finally comprising different types of preparation and processing of samples to be read on computers. Palabras clave: Grafito, grafeno, óxido de grafeno, GO, nanopartículas de hierro.

INTRODUCCIÓN El carbono es uno de los elementos químicos con mayor abundancia en la naturaleza y es uno de los pilares principales de la química orgánica. Se puede encontrar en sus diferentes formas alotrópicas las cuales son dependientes de cómo se enlazan sus átomos. Las primeras formas alotrópicas descubiertas fueron el grafito y el diamante. En el caso del grafito, sus átomos de carbono se encuentran unidos por otros tres átomos en un plano componiendo planos con celdas hexagonales y a su vez los planos se unen entre sí por fuerzas de Van der Walls. Para el diamante cada átomo de carbono está unido a otros cuatro átomos obteniendo una estructura tridimensional dura e isotrópica.

qmáx K2,s, x10-3 r0, h-1

AAm/ AAc 100/0 (1) 12.7551 251.08497 40.84967 AAm/AAc 70/30 (2) 136.9863 0.5748651 136.9863 AAm/AAc 50/50 (3) 74.6268 1.296462 7.22021

La constante de hinchamiento del hidrogel sin ácido acrílico es alta en comparación con aquellos que tienen ácido. Además el hidrogel que tiene mayor velocidad inicial de hinchamiento es el (2), siendo que de igual manera es aquel que tiene el mayor peso de hinchamiento máximo de entre los hidrogeles. Sin embargo el que tiene menor velocidad de hinchamiento inicial es el (3) siendo incluso aún más baja que el (1) pero con mayor peso de hinchamiento gracias al ácido acrílico.

CONCLUSIONES La cinética de hinchamiento de AAm/AAc 70/30 fue la mayor dada su consistencia física

más rígida. Su capacidad de absorber agua igualmente es proporcional al acido acrílico sin embargo la Acrilamida es de igual importancia como muestra el hidrogel AAm/AAc 50/50 y el 100/0, siendo que el mejor balance para la mayor capacidad y mayor velocidad de hinchamiento fue AAm/AAc 70/30.

La consistencia física de los hidrogeles se ve afectada por la concentración de ácido acrílico, siendo aquel con una concentración cero de ácido el más rígido y resistente por sobre los demás y aquel con concentración de 50/50 como el más delicado pues por la manipulación del mismo tiende a deshacerse.

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Por otra parte se realizó una síntesis de nanopartículas de hierro (FeNPs) a través de química verde en primera instancia se hirvieron 16.5 g de té verde en 275 mL de agua destilada, se dejó reposar durante una noche y para finalizar, el contenido fue filtrado. Posteriormente se preparó una solución 1M de cloruro ferroso tetrahidratado (FeCl2 * 4H2O) para realizar una mezcla en relación 2:3 (v/v) entre el FeCl2 * 4H2O y el extracto del té (50 mL: 75 mL), al añadir el extracto del té se forman instantáneamente las nanopartículas de hierro comprobándose su formación cuando la solución se torna en color negro. El exceso de agua se eliminó hirviendo la mezcla hasta obtener un concentrado. Ya obtenido el GO y las nanopartículas de hierro, se realizó una mezcla GO-FeNPs en un tubo falcon de 15 mL añadiendo 5 mL de FeNPs con 1mL de GO, posteriormente dejando en un baño sónico durante 4 horas para obtener una conjugación de manera supramolecular. Finalizando con una caracterización de las muestras por diferentes métodos en este caso el GO fue caracterizado por espectroscopia de raman y microscopía electrónica de barrido mientras que las muestras de FeNPs y el conjugado GO-FeNPs fueron realizadas únicamente por microscopía electrónica de barrido en este ultimo caso usando 2 diferentes técnicas de depositario en una placa se silicio “dip coatin” y “drop casting”.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La espectroscopia de raman es una técnica de caracterización no destructiva muy útil para estudiar las propiedades estructurales de diferentes materiales, la literatura indica que el espectro de raman para el óxido de grafeno cuenta con bandas D, G y 2D localizándose a 1350 cm-1, 1600 cm-1 y 2700 cm-1. El grafico 1 representa a la muestra de GO sintetizada, el espectro de raman cuenta con las bandas importantes ya antes mencionadas teniendo la banda G en aproximadamente 1600 cm-1, la banda D en aproximadamente 1360 cm-1 y la banda 2D alrededor de 2680 cm-1. Esto nos indica que el tratamiento que se le dio al grafito fue realizado correctamente aunque si observamos hay una seria de bandas en el rango de 2800 cm-1 hasta 3200 cm-1 indicando que la muestra no obtuvo un lavado suficiente dejando residuos del tratamiento ácido.

Grafico 1. Espectro RAMAN del óxido de grafeno.

En la actualidad se han encontrado diferentes formas como los fullerenos descubiertos en 1985 por H. Kroto, para 1991 los nanotubos de carbono fueron descubiertos por el japonés S. Lijima y el grafeno fue descubierto más recientemente en el 2004 por K. Novoselov y A. Geim, las diferentes formas alotrópicas se observan en la figura 1. Mientras que los fulleneros se encuentran constituidos con pentágonos y hexágonos de carbono en una estructura cerrada esférica, los nanotubos de carbono presentan forma de redes hexagonales de carbono curvadas y cerradas y finalmente el grafeno, obtenido a partir del aislamiento de grafito, es un material bidimensional donde sus átomos de carbono se encuentran unidos a otros tres átomos de este mismo mediante enlaces sp2 para así formar una lámina plana, actualmente el uso de los nanomateriales en la investigación va en aumento, desde el uso en áreas biológicas, biomédicas, industriales entro otros. El grafeno que es obtenido a partir del grafito, es un material al cual se le ha dado un gran interés, ya que este cuenta con propiedades electrónicas únicas y a partir de este material se pueden obtener otras nanoestructuras como el óxido de grafeno (GO) y el óxido de grafeno reducido (rGO) como se observa en la figura 1, una de las características del GO es la funcionalización en su superficie, en esta se encuentran como grupos hidroxilo (-OH), ácidos carboxílicos (-COOH) y epóxidos (C-O-C), lo que lo convierte en un compuesto muy hidrófilo, aunque el GO también cuenta con regiones no modificadas que le dan una característica hidrofóbica. Con esto el GO puede actuar como una superficie e interactuar con una gran gama de moléculas de diferentes características; de ahí la importancia en su caracterización para saber el grado de funcionalización que se le ha conferido junto las propiedades que puede tomar.

Figura 1. Esquema de naoestructruras a partir de grafito, a) Grafeno, b) Óxido de grafeno y c) Óxido de grafeno reducido.

Algunas técnicas de caracterización son la espectrometría UV-VIS, espectrometría de RAMAN, Microscopia de fuerza atómica, microscopia electrónica de barrido (SEM) entre otras.

METODOLOGIA El óxido de grafeno fue sintetizado a partir del método de Hummers modificado adaptándolo a 2 g de grafito, las láminas de nano-grafito fueron mezcladas con H2SO4: H3PO4 (240:30 mL), posteriormente se añadió 12 g de KMnO4 dejando reaccionar 10 horas a una temperatura constante de 35 °C. La reacción es enfriada con hielo, consecutivamente se añadió 10 mL de H2O2 al 30%. Finalizando con 2 lavados de HCl y H2O destilada 5000 rpm a una temperatura de 20 °C durante 30 minutos. Posteriormente una parte del concentrado de GO se le realizo una funcionalización de ácidos carboxílicos en su superficie esta fue realizada por el protocolo de el protocolo de Kyeong-Won el cual se basa en una reacción del GO con ácido cloroacético (ClCH2COOH) e hidróxido de sodio (NaOH), dejando la mezcla en sonicación por un tiempo de 4 horas y finalizando con lavados de H2O destilada a 5000 rpm.


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Figura 3. Micrografías por SEM del nanopartículas de hierro depositadas en placas de silicio por el método de a) drop casting y b) dipcoating

En la figura 3a se tienen las nanopartículas sintetizadas, con tamaños de 40 hasta 200 nm en esta micrografía logramos observar la polidispersidad en los tamaños, también se da a notar que estas se agregaron generando cúmulos grandes de nanopartículas siendo más difícil el observar su morfología. Para la figura 3b el método de dip coatin no se lograron observar las nanopartículas solo observando agregados pero no definidos.

Figura 4. Micrografías por SEM de conjugado GOFeNPs depositadas en placas de silicio por el método de a) drop casting y b) dipcoating

La banda D está asociada a los desórdenes, y durante la oxidación hay un incremento muy significativo a comparación del basal del grafeno puro, esto es dado al rompimiento en la simetría de las hojas, mientras que la banda G hace referencia a la hibridación sp2 experimentando un leve ensanchamiento y el desplazamiento hacia la izquierda, pero como es el pico más característico de la estructura del grafeno esta no desaparece o sufre grandes cambios, a la banda 2D se le llama banda de sobre tono de la banda D y está asociada al desorden estructural o defectos de borde y en ayuda junto con la banda D se puede determinar el aproximado de capas que tiene el GO, para este caso el GO sintetizado se tienen en un aproximado de 2 a 5 hojas por la intensidad marcada en 2D. El realizar imágenes con el SEM nos ayuda a observar el tamaño y homogeneidad del GO sintetizado tanto del tamaño de las nanopartículas de hierro como del conjugado GO-FeNPs. En esta ocasión se realizaron dos diferentes métodos de deposición del material drop casting y dip coating. Para observar cuál de los 2 se tiene una mejor medición, la figura 2 representa a la muestra de GO en la placa de silicio, la figura 3 se observa las FeNPs y para la figura 4 el conjugado GO-FeNPs por ambas metodologías.

Figura 2. Micrografías por SEM del óxido de grafeno por los métodos a) drop casting y b) dip coating.

La figura 2 inciso a nos muestra las laminillas del GO dispersas sobre la placa del sílice por el método de drop casting pareciendo tener una mayor concentración en láminas de tamaño de 1 micra mientras que en la parte central se observa una hoja de aproximadamente 2 a 2.5 micras de diámetro, en la figura 2 inciso b depositadas con el método dip coatin hay una mayor dispersión de las laminillas y una mejor observación de su morfología, mientras que en los alrededores hay laminillas de diferentes tamaños se puede observar en la parte central varias laminillas encimadas una con otra con tamaños de1 a 2 micras. De debe resaltar que en ambas imágenes la superficie se observa es de una manera casi lisa.


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USO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SERS PARA DIAGNÓSTICO TEMPRANO, NO INVASIVO DE AFECCIONES EN HUMANOS

1Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes, Av. Universidad No. 940, Ciudad Universitaria, C.P. 20131, Aguascalientes, Ags., MÉXICO; [email protected]; 2Coordinación para la Innovación y Aplicación de la Ciencia y la Tecnología, Av. Sierra Leona #550,

Col. Lomas 2ª, C.P. 78210, San Luis Potosí, SLP, MÉXICO; [email protected].

Herrera Hernández, M. M.1; Navarro Contreras, H. R.2

RESUMEN El ácido siálico (SA, Neu5Ac), es un importante marcador fisiopatológico y es característico encontrarlo en elevadas concentraciones en saliva de personas con cáncer de mamá. Debido a esto, la medición de SA, se plantea como una forma de diagnóstico temprano, eficaz y no invasivo de la neoplasia mamaria. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) es un fenómeno que realza la emisión Raman, procedente de un analito que se adsorbe o se encuentra en la proximidad cercana a una superficie metálica rugosa. En este trabajo se demuestra, que el uso de la técnica SERS, proporciona alta sensibilidad, la selectividad y especificidad de detección de SA (analito), lo que lo convierte en un método viable de diagnóstico.

ABSTRACT The Sialic Acid (SA), is an important pathophysiological marker and is typical to find it in high concentrations in saliva of persons with breast cancer. Due to this, SA's measurement, it appears as a form of early, effective and not invasive diagnosis of the mammary neoplasia. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) is a phenomenon that heightens the emission Raman, proceeding from an analito that is adsorbed or be located in the proximity near to a metallic rugose surface. In this work is demonstrated, that the use of the technique SERS, provides the high sensibility, the selectivity and specificity of SA's detection, what turns it into a viable method of diagnosis. Palabras Clave: Nanopartículas de plata, SERS, Ácido Siálico.

INTRODUCCIÓN El cáncer de mama es el más común entre las mujeres en todo el mundo, pues representa el 16% de todos los cánceres femeninos. Se estima que en 2004 murieron 519 000 mujeres por cáncer de mama. Las bajas tasas de supervivencia observadas en países poco desarrollados pueden explicarse principalmente por la falta de programas de detección precoz, que hace que un alto porcentaje de mujeres acudan al médico con la enfermedad ya muy avanzada. Así pues, la detección precoz con vistas a mejorar el pronóstico y la supervivencia de esos casos sigue siendo la piedra angular del control del cáncer de mama (OMS, 2004). En la búsqueda de métodos eficaces, sencillos y no invasivos, para la detección temprana de cáncer de mama, ha generado gran interés, la medición de ácido siálico en líquidos corporales por métodos

Para la imagen 4a se tiene varias laminillas de GO con esferas de FeNPs en su superficie con tamaños variados de 50 a 100 nm y en la imagen 4b hay una sola laminilla de GO con una esfera de un tamaño aproximado de 80 nm en la esquina inferior derecha. Pero se puede destacar que la unión de las nanopartículas de hierro y el óxido de grafeno se puede ser lograda.

CONCLUSIONES Se han entendido diferentes técnicas de caracterización para el óxido de grafeno, siendo que la espectroscopia de raman una de las más usadas para saber hasta cierto grado la pureza con la que se ha sintetizado. La importancia de la preparación de las muestras para la caracterización por SEM en este caso ambas metodologías que se trabajaron funcionaron una más que otra pero eso dependerá del material a caracterizar como lo fue en el caso del GO funciono de mejor manera el método de dip coating, pero para el caso de las FeNPs y el conjugado GO-FeNPs el método drop casting da imágenes con una mejor dispersión. Para finalizar se observaron las características de funcionalización del GO obteniendo así conjugados teniendo en cuenta de que el GO puede ser conjugado con una gran cantidad de materiales en su superficie.

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Figura 1. A) Proceso de dispersión de Raman en ausencia de partículas metálicas. B) Proceso de dispersión de Raman en presencia de partículas metálicas.

En este trabajo, se pretende demostrar la viabilidad de la aplicación de la técnica SERS, con sustrato coloidal de nanopartículas de plata, en un método de detección temprano de cáncer de mama, estableciendo las condiciones para una curva de calibración de SA. Dicha curva se asentará en un sistema que permita medir la concentración de SA presente en saliva y relacionarla con indicios de un padecimiento. Debido a la importancia de la topografía del sustrato coloidal en un buen mejoramiento SERS, se obtienen espectros utilizando nanopartículas con diferente morfología, al fin de conseguir la mayor amplificación de la señal Raman.

METODOLOGÍA Síntesis de nanopartículas esféricas de plata (AgNPs) por el método de Turkevich. La solución coloidal de AgNPs fue preparada por reducción de Ag+ con citrato trisódico (C6H5Na3O7 · 2H2O). A 10 mL de una solución de nitrato de plata (AgNO3) 2.5 mM en agua desionizada (ADI), que es calentada a 95ºC y con agitación creciente, durante un tiempo aproximado de 45 min, se le añadieron 10 mL de una solución de citrato trisódico 2.5 mM. Alrededor de 25 min después de la adición del citrato, se obtuvo la solución final, color gris-lechoso, indicativo de la formación de nanopartículas de plata. Una vez a temperatura ambiente, las AgNPs se lavaron en cuatro ciclos de centrifugación (6000 rpm por 3 min.) - redispersión en ADI. Síntesis de nanoestrellas de plata (AgNSs). Se prepararon dos soluciones coloidales de NSs, variando la concentración de soluciones acuosas de AgNO3 y de ácido ascórbico (L-AA). A temperatura ambiente, se colocaron 7.5 mL de AgNO3 0.7 mM en agitación (con barra magnética) de aprox. 200 rpm, e inmediatamente se adicionaron 2.5 mL de L-AA 100mM. Después de 10 min de agitación, se obtuvo una solución, ligeramente gris, de AgNSs. En seguida, se realizó el lavado del producto, con tres ciclos de centrifugación (6000 rpm por 3 min.) - redispersión en ADI y un ciclo intermedio con etanol. Se repitió el procedimiento anterior, para la síntesis y lavado de la segunda solución de AgNSs, a partir de AgNO3 0.25mM y L-AA 0.5mM. Caracterización. Se colocaron 20 µL solución de AgNPs 2.5 mM, AgNSs 0.7 mM y AgNSs 0.25 mM, cada una sobre una placa de silicio, para su observación por microscopia electrónica de barrido SEM (en inglés, Scanning Electron Microscope) en INSPECT F50-scanning electron microscopy. Medición SERS. Se prepararon soluciones de ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) en agua desionizada, en concentraciones 20, 100 y 200 mg/dL. Mezclas 2:1 de los tres tipos de partículas de plata, con cada una de las concentraciones de Neu5Ac, se depositaron en sustrato de aluminio. Además, se hicieron 3 depósitos, de cada tipo de coloide de plata en ADI (sin Neu5Ac). Se obtuvieron 12 espectros SERS en el micro RAMAN HORIBA con software LabSpec y dos líneas de excitación, láser verde (532 nm), objetivo

altamente sensibles, como la técnica espectroscópica Surface-enhanced Raman Scattering (SERS), lo cual se estudia para su aplicación diagnóstica. El término Ácido Siálico (SA, por su nombre en inglés) es el nombre genérico para los derivados N- u O- sustituidos del ácido neuramínico, un monosacárido de nueve carbonos. El N- ácido acetilneuramínico (Neu5Ac) es la forma predominante de SA y casi la única forma encontrada en seres humanos. Un grupo n-acetil y el grupo carboxilo confiere una carga negativa sobre la molécula bajo condiciones fisiológicas. La concentración de SA en fluidos corporales puede reflejar el estado metabólico y se ha reconocido como un marcador biológico para una variedad de procesos fisiopatológicos. Elevados niveles de SA han demostrado ser un rasgo característico en saliva de pacientes con cáncer de mama, y por lo tanto, se ha sugerido como un marcador predictivo, no invasivo, para los pacientes con este tipo de cáncer. Actualmente los métodos disponibles de detección específica y cuantificación son complicados, costosos y laboriosos, mientras que las técnicas más sólidas sufren de la no especificidad e interferencia (Vinogradova E., et al, 2014), de tal manera que se plantea SERS como una mejor técnica de análisis. SERS es una de las más poderosas técnicas espectroscópicas y ha sido utilizado en áreas como la química, ciencia de los materiales y ciencias biológicas (Liu J., et al, 2016). Tiene un gran potencial como una sonda analítica molecularmente específica, para la detección de la débil señal Raman de analitos en concentraciones bajas o con una baja dispersión Raman (Vinogradova E., et al, 2014). Denominada en español, espectroscopia de Raman amplificada por superficie, SERS ocurre cuando un analito es adsorbido o se encuentra en la proximidad cercana a una superficie metálica rugosa (principalmente el oro o la plata) en un proceso que realza enormemente la emisión Raman. Suspensiones coloidales metálicas de tamaño nano son los substratos SERS más comunes debido a su facilidad de preparación, larga vida útil y alto factor de intensificación (EF) de la señal Raman que puede ser excitada desde el ultravioleta (UV) a la región espectral infrarroja (Uskoković S., 2016). Las nanopartículas de los metales nobles al ser excitadas directamente con radiación electromagnética producen plasmones localizados resonantes de superficie (LSPR). Comparados con las estructuras cuánticas (moléculas), las nanoestructuras metálicas tienen una capacidad o sección eficaz de absorción y dispersión que puede ser varios órdenes de magnitud superiores a las secciones eficaces normales de las moléculas. En forma simple, puede decirse que la amplificación en SERS es la re-radiación (dispersión elástica) por el metal de la dispersión Raman molecular. (Aroca, F., 2014). La mayor amplificación se obtiene en agregados de nanopartículas, en la intersección de dos o más nanoestructuras y bifurcaciones, construidas sobre el sustrato SERS (Cheng L., et al, 2014). Solo un número muy limitado de metales tienen las propiedades ópticas adecuadas (función dieléctrica) para sostener plasmones localizados de superficies en nanoestructuras, en la región del espectro electromagnético en que se llevan a cabo los experimentos Raman. El oro y la plata son los más notables con estas características. La amplificación de la dispersión molecular y de la fluorescencia molecular son máximas cuando las frecuencias moleculares se acoplan con nanoestructuras cuya resonancia del plasmón coincide con las frecuencias moleculares de emisión o dispersión. Oro y plata, son radiativos y tienen una sección eficaz de dispersión varios órdenes de magnitud mayores que las moléculas. (Aroca, F., 2014).


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Figura 3. Espectros SERS en sustrato de Cit-

AgNPs: Nanopartículas en ausencia de Neu5Ac (A), con Neu5Ac 20 (B), 100 (C) y 200mg/dL (D).

Figura 4. Ajuste lineal de las bandas 976 (A),

1347 (B) y 1598 cm-1 (C), de los espectros SERS en sustrato Cit-AgNPs, en presencia de Neu5Ac

a diferentes concentraciones.

En los espectros SERS en sustrato AA-AgNSs 0.25mM, presentados en la figura 5, se observó que picos característicos localizados en 1212, 1323 y 1549 cm-1, tienen una intensidad mayor, conforme el análisis se corre ante mayor cantidad de Neu5Ac. De igual manera que en el caso de las Cit-AgNPs, se hizo un ajuste lineal, de cada una las 3 bandas características, las resultantes también muestran, que existe una tendencia a aumentar su intensidad, en relación con el incremento de Neu5Ac (Figura 6). Sin embargo, las intensidades Raman de las bandas en estos espectros, son significativamente menores, a las alcanzadas con Cit-AgNPs.

Figura 5. Espectros SERS en sustrato de AA-AgNSs 0.25mM: Nanoestrellas en ausencia de Neu5Ac (A), con Neu5Ac 20 (B), 100 (C) y 200

mg/dL (D).

Figura 6. Ajuste lineal de las bandas 1212 (A),

1323 (B) y 1549 cm-1 (C), de los espectros SERS en sustrato AA-AgNSs 0.25mM, en presencia de

Neu5Ac a diferentes concentraciones.

La utilización de diferente tipo de nanoestrellas, AA-AgNSs 0.7mM, generó los espectros SERS mostrados en la figura 7, a partir de los cuales, se encontraron picos característicos ubicados en 873 y 1448 cm-1. Los espectros en general muestran algunas bandas que incrementan su intensidad, por aumento del Neu5Ac, de manera similar a lo ocurrido con las Cit-AgNPs y AA-NSs 0.25mM, tal es el caso de la banda en 1448 cm-1 que muestra dicha tendencia (Figura 8.B). Pero además, se detectó un comportamiento opuesto, particular de la banda en 873 cm-1, es decir, la existencia de grandes concentraciones de Neu5Ac,

x10, rango de 400 a 1800 cm-1, tiempo de exposición de 40 segundos, 4 acumulaciones, 1800 gr/mm, abertura de 100µm, enfocado sobre la superficie del líquido. La fluorescencia se substrajo con el programa OriginLab.

RESULTADOS Las imágenes obtenidas por Scanning Electron Microscopy (SEM), de las Nanopartículas de plata, por reducción con citrato (Cit-AgNPs), y los 2 tipos de Nanoestrellas de plata, por reducción con ácido ascórbico (AA-AgNSs), se observan en la figura 2. En base a las mediciones en SEM, el diámetro promedio para las Cit-AgNPs fue de 30.38 nm. Dichas nanopartículas se encontraron fuertemente aglomeradas, formando cúmulos al momento de secarse sobre el sustrato de silicio, aparentemente rodeados por una cubierta de citrato, dentro de los cuales, se distinguen las estructuras cuasi esféricas de las partículas de plata. Las nanoestrellas de plata sintetizadas a partir de AgNO3 0.25mM y L-AA 0.5mM (AA-AgNSs 0.25mM) no se mostraron aglomeradas y presentaron un diámetro de 298.25nm. Exhibieron semi desarrollo de picos, así como una capa traslúcida de L-AA. Finalmente, las nanoestrellas de plata sintetizadas con AgNO3 0.7mM y L-AA 100mM (AA-AgNSs 0.7mM), presentaron cubierta de L-AA y abundante crecimiento de picos, con lo que se observa claramente la morfología que evoca a una estrella.

Figura 2. Imágenes SEM: A) Vista panorámica de Cit-AgNPs 2.5mM, diámetro promedio 30.38nm; a) acercamiento a las nanopartículas aglomeradas, con cubierta de citrato, donde se distingue su

forma cuasi esférica, B) Vista panorámica de AA-AgNSs 0.25mM, diámetro promedio 298.25nm; b) Nanoestrella individual, se aprecia el semi crecimiento de picos y su cubierta de L-AA, C) Vista

panorámica de AA-AgNSs 0.7mM; c) Acercamiento a una nanoestrella, donde se observa el abundante crecimiento de picos y su cubierta de L-AA.

En la figura 3, se muestran los espectros SERS, medidos en sustrato de Cit-AgNPs, esferoidal, en presencia de diferentes concentraciones de Neu5Ac. La comparación de los espectros, arrojó bandas de intensidad representativas localizadas en 976, 1347 y 1598 cm-1. Es notable, el realce en la intensidad de estos picos, en los espectros tomados a mayores concentraciones de Neu5Ac, lo que se demuestra con el ajuste lineal de los mismos (Figura 4). Dado de que el primer espectro (Fig. 3.A), es solo una referencia para observar el comportamiento en cada sistema, el ajuste de las bandas seleccionadas, se realizó en base a los medidos en presencia de Neu5Ac. En las líneas resultantes, se aprecia claramente la tendencia de aumento de la intensidad, en dirección al aumento de la cantidad de Neu5Ac.


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Se comprobó que la técnica espectroscópica SERS, es un método viable para la detección temprana, no invasiva, altamente sensible y especifica de Neu5Ac.

El uso de nanoestrellas de plata cubiertas con ácido ascórbico (AA-AgNSs) no es conveniente como sustrato SERS, en las condiciones aplicadas en este trabajo, para la medición de Neu5Ac.

Queda abierto el estudio, de la técnica espectroscópica en sustrato de AA-AgNSs, para la medición de Neu5Ac, utilizando una fuente de radiación de la región infrarroja.

BIBLIOGRAFIA

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disminuyen la intensidad de este pico del espectro. Lo último se ve reflejado, en la línea de tendencia con pendiente negativa mostrada en la figura 8.A.

Figura 7. Espectros SERS en sustrato de AA-AgNSs 0.7mM: Nanoestrellas en ausencia de

Neu5Ac (A), con Neu5Ac 20 (B), 100 (C) y 200mg/dL (D).

Figura 8. Ajuste lineal de las bandas 873 (A), y

1448 cm-1 (B), de los espectros SERS en sustrato AA-AgNSs 0.7mM, en presencia de

Neu5Ac a diferentes concentraciones.

Es de gran interés recalcar que, las mayores intensidades de la señal Raman, se percibieron en las mediciones SERS con Cit-AgNPs esferoidales ya que, por el contrario, se esperaba un mejor realce con el uso de partículas con diferente topografía superficial. En literatura, basada en la experimentación con nanopartículas (sintetizadas a partir metodologías afines a las de este proyecto), ya se ha comprobado copiosamente, que la mayor amplificación de la emisión Raman, se obtiene en agregados de nanopartículas, en la intersección de dos o más nanoestructuras y bifurcaciones, construidas sobre el sustrato SERS, ya que se puede producir un efecto de acoplamiento plasmónico que, conduce a plasmones localizados resonantes de superficie (LSPR), (Cheng L., et al, 2014). Sin embargo, el realce Raman no solo depende de las características de la partícula metálica, sino más bien, del sistema coloidal completo: cubierta-nanopartícula- molécula orgánica en estudio. Los resultados parecen indicar, que la molécula orgánica ensayada, Neu5Ac, no le favorece el efecto SERS en sustrato de AA-AgNSs, comportamiento demostrado significativamente por el decremento de la intensidad de la banda 873cm-1, del espectro SERS en AA-AgNSs 0.7mM, siendo contraproducente y por tanto, poco conveniente, para la detección altamente sensible que se desea conseguir. Por otra parte, el campo dispersado por la partícula metálica resulta ser muchísimo más grande cuando la frecuencia incidente, se hace coincidir con la frecuencia de resonancia de los plasmones superficiales del metal, (García J., 2004), entonces, también se debe señalar, la importancia de la frecuencia de la radiación que se incide en el sistema, durante la espectroscopia. Debido a que la energía de resonancia de los pasmones de superficie, se ve desplazada, comúnmente hacia la región infrarroja, por el cambio en la morfología de la nanopartícula, habrá que estudiarse el uso de una fuente de luz distinta, para el análisis de Neu5Ac en sustrato AA-AgNSs.

CONCLUSIONES Se observó que las Nanopartículas esféricas de plata cubiertas con citrato (Cit-AgNPs), son las más

convenientes para intensificación de la dispersión Raman, en la medición SERS de N - ácido acetilneuramínico (Neu5Ac).


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H+-ATPasa, polipéptido de 100kDa (Ruiz Granados et al 2006), presentes en la membrana plasmática, generando un gradiente electroquímico de protones, con mayor concentración al exterior de la célula (Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter P, 2004), la acidificación del medio impide el crecimiento de otros organismos (Ramirez J., Peña A., 2000). Uno de los procesos utilizados para la purificación de la membrana plasmática es la ultracentrifugacion en un gradiente de trehalosa, anteriormente realizado en el laboratorio para Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae. Las cepas consideradas en el trabajo son Saccharomyces cerevisiae BY4741 y ∆BMH1. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se han identificado 282 transportadores transmembranales, de los cuales, 125 se sabe que están localizados en la membrana plasmática, algunos de estos transportadores, como la ATPasa de protones, son esenciales en todas las condiciones de crecimiento (Ramirez J., Peña A., 2000). La Ca2+-ATPasa del retículo endoplasmático/sarco (SERCA) bombea activamente Ca2+ hacia afuera del citosol, los aumentos de la [Ca2+] citosólica, disparan numerosas respuestas celulares, entre las cuales figura la contracción muscular (Voet, 2006), cualquier cambio en esta concentración se verá reflejado en diversos mecanismos, como por ejemplo mecanismos de señalización, expresión de genes, proliferación celular e incluso muerte celular (Páez Pérez, 2015). Se realizó el proceso de purificación para la proteína SERCA de musculo de conejo.

METODOLOGIA Purificación de membrana plasmática Se cultivó la cepa Saccharomyces cerevisiae BY4741 en 3 L en medio YPD a 30 ͦC durante 20 h, la biomasa fue lavada con agua desionizada y obtenida por centrifugación a 5,000 rpm durante 5 min. Las células fueron incubadas a 30 ͦC con agitación manual en amortiguador sorbitol 1 M pH 7.0 (20 mL por cada 4 g de levadura) y se adicionó 10 μL de β-mercaptoetanol por cada 20 mL de amortiguador de sorbitol y se adicionó liticasa para la producción de esferoplastos estos fueron detectados por la disminución de la absorbancia a 660 nm, posteriormente a la solución de levaduras se le agregó 80 μL de solución PMSF 1M por cada 40 mL de solución de levadura, esta solución fue sometida a sonicacion, posteriormente por centrifugación diferencial como lo indica el método empleado por Sampedro et al (2002) las membranas fueron obtenidas. El procedimiento fue repetido con la cepa Saccharomyces cerevisiae ∆BMH1. La identificación de la proteína en la membrana aislada fue realizada en un SDS-PAGE, la concentración de proteína de la purificación de membrana se obtuvo por un ensayo de Lowry para las cepas S. cerevisiae BY4741 y ∆BMH1. Purificación de la H+-ATPasa La purificación de la H+-ATPasa se realizó a partir de la membraa plasmática de Saccharomyces cerevisiae BY4741, la cual se incubó en buffer A (KCl 0.6M, TRIS 75 mM, EDTA 6 mM, EGTA 100 mM y 0.01% p/V de desoxicolato) durante 10 min a 4 ͦC, después se centrifugó a 34,000 rpm 1h, se recuperó el pellet, el cual se resuspendió en un volumen de buffer B (KCl 0.3M, TRIS 255 mM, Glicerol 45% V/V, EDTA 2 mM, pH 7.2), se midió la concentración de proteína por el método de Lowry, esto nos sirvió para ajustar el buffer B a 5 mg/ml. Se agregó azolectina y zwittergent, ajustadas a concentraciones finales de 5 mg/ml y 0.85 p/p, respectivamente. La suspensión se homogenizó aproximadamente 5 min y se centrifugó a 34,000 rpm 1h. El sobrenadante se diluyó en EGTA 2mM, se sometió a centrifugación durante 14 h a 34,000 rpm en un gradiente de trehalosa (45, 40, 35, 30%), la banda de H+ ATPasa que se encontraba encima del gradiente 40% se recuperó y se centrifugó durante 3 h a 34,000 rpm. El pellet fue resuspendido en un volumen de EGTA 2 mM pH 7.2 y se almacenó a -75 ͦ C. La purificación de la H+ ATPasa para la cepa Saccharomyces cerevisiae BY4741 se comprobó con un SDS-PAGE.

LAS P-ATPASAS, ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y ESTABILIDAD EN CONDICIONES DE ESTRÉS

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Manuel Nava No. 6, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; 2Institu-to de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Manuel Nava No. 6, C.P. 78290, San

Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]

Ibarra Faz, E.1; Sampedro, J. G.2

RESUMEN El presente trabajo trata sobre el estudio de la Ca2+-ATPasa de musculo de conejo, así como la H+-ATPasa de las cepas Saccharomyces cerevisiae, BY4741 y ∆BMH1. Las dos enzimas fueron purificadas, la H+-ATPasa se obtuvo después de una centrifugación en un gradiente de trehalosa, a partir de la membrana plasmática previamente recuperada por centrifugación diferencial, para la Ca2+-ATPasa fue sacrificado un conejo para obtener el musculo de las patas traseras y se llevó a cabo el proceso de purificación. Para la comprobación de los resultados se realizaron SDS-PAGE, además para la enzima Ca2+-ATPasa se hizo un ensayo de marcaje con FITC, para la H+-ATPasa de levadura también se elaboró BN-PAGE para visualizar los estados oligómericos de la proteína.

ABSTRACT

The following paper describes the study of Ca2+-ATPase from rabbit muscle, as well as plasma membrane H+-ATPase from Saccharomyces cerevisiae strains BY4741 and ΔBMH1. Both enzymes were purified, the H+-ATPase was obtained after centrifugation in a gradient of trehalose, from plasma membrane previously recovered by differential centrifugation. Ca2+-ATPase was isolated from rabbit muscle; briefly, a rabbit was sacrificed to obtain the hind legs muscle followed by a standard purification process. Proteins were visualized by Coomassie stain in a SDS–PAGE. In addition, FITC assay was performed in the Ca2+-ATPase. H+-ATPase from yeast was subjected to BN-PAGE to display the oligomeric state of the protein. Palabras clave: Ca2+-ATPasa, H+-ATPasa,

INTRODUCCIÓN

El mantenimiento de las concentraciones iónicas internas celulares viene regulado por las vías homeostáticas muy complejas donde los transportadores juegan un papel importante en la entrada y salida de cationes (Planta, 2011). Las proteínas ATPasas son unas de las encargadas de mantener el rango óptimo de iones para el sistema celular. Las ATPasas de tipo P, llamadas así porque se autofosforilan por el ATP durante el ciclo catalítico, pueden transportar H+, Na+, K+, Ca2+, Cu2+, Cd2+ y Mg2+ en contra de un gradiente de concentración (Voet, 2006). En organismos como levaduras el transporte de solutos hacia el interior de la célula depende de la


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concentración que se obtuvo para S. cerevisiae BY4741 y ∆BMH1 fue de 5.03 mg/ml y 2.7 mg/ml de proteína respectivamente.

Figura 1. SDS-PAGE de la Purificación de membrana plasmática

Figura 2. SDS-PAGE de la Purificación de la de la H+-ATPasa

La pastilla recuperada en la centrifugación posterior al gradiente de trehalosa para la purificación de H+-ATPasa se visualiza en el carril 5 (figura 2), la banda correspondiente a los 100 kDa muestra que se logró recuperar la proteína, el carril 1 y 2 pertenecen a la fracción soluble de la primera centrifugación del proceso para S. cerevisiae BY4741 y ∆BMH1 respectivamente. El carril 3 y 4 procede del pellet obtenido en la segunda centrifugación, de igual forma corresponden a S. cerevisiae BY4741 y ∆BMH1 respectivamente. Para el gradiente de trehalosa solo la cepa S. cerevisiae BY4741 fue procesada.

Mr.(kDa) 1 2 3 4 5

25015010075

50

37

25 20 15 10

Mr.(kDa) 1 2 3 4 5

250 150 100 75 50 37 25

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Purificación de Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplasmático Se modificó ligeramente el método empleado por Bobo et al (1978), resumiendo el proceso fue, los músculos de las patas traseras de conejo fueron molidas en tres volúmenes de buffer KCl 100 mM, la mezcla fue centrifugada 15 min a 9,200 rpm y se recuperó el sobrenadante, esté fue centrifugado a 16,700 rpm 2 h, el pellet se resuspendió en un volumen 0.5 M de sacarosa y fue centrifugado 15 min a 10,100 rpm, el sobrenadante se recuperó y se centrifugó a 18,000 rpm 2 h en un buffer 0.6 M KCl y 0.15 M de sacarosa, se centrifugó 2 h 45 min a 27,000 rpm, el pellet se resuspendió en un buffer con pH 7.0 con 0.3 M de sacarosa 0.1 KCl y 5 mM Tris. La visualización de la Ca2+-ATPasa aislada se realizó por SDS-PAGE con un ensayo de marcaje por FITC. SDS-PAGE Los cristales de electroforesis fueron colocados en el soporte y fue agregado el gel separador, se esperó a que polimerizara para agregar el gel concentrador, se colocó el peine y nuevamente se esperó la polimerización. Para el gel separador fue utilizado 2.5 mL de una solución 30% de acrilamida, 0.95 mL de amortiguador tris 0.3 M pH 8.8, 3.9 mL de agua, 200 μL de SDS al 10% y finalmente 5 μL de TEMED y 50 μL de persulfato de amonio al 10 %. El gel concentrador se preparó de la siguiente manera; 0.4 mL de una solución 30% de acrilamida, 0.5 mL de amortiguador tris 0.5 M pH 6.8, 1.8 mL de agua, 200 μL de SDS al 10% y finalmente 5 μL de TEMED y 50 μL de persulfato de amonio al 10%, posteriormente el gel se colocó en la cámara de electroforesis. El amortiguador de corrida contiene Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0.1%. Se corrió a 50 V durante 30 min y a continuación 100 V 15 mA por 2 h. BN-PAGE A diferencia del SDS-PAGE, para el gel separador se utilizó un formador de gradientes con dos cilindros, con diferentes concentraciones de acrilamida cada uno, 15% y 5%, al cilindro correspondiente a mayor concentración de acrilamida fue agregado 0.87 mL de una solución de acrilamida 48.5% y bisacrilamida 1.5%, 1.17 mL de amortiguador 3x, 1 mL de glicerol 80%, 0.44 mL de agua destilada, 6 μL de TEMED y 18 μL de persulfato de amonio al 10%, el cilindro de menor concentración contiene; 0.36 mL de una solución de acrilamida 48.5% y bisacrilamida 1.5%, 1.17 mL de amortiguador 3x (imidazol 75 mM trehalosa 300 mM, pH 7.0), 0.25 mL de glicerol 80%, 1.7 mL de agua destilada, 6 μL de TEMED y 18 μL de persufato de amonio al 10%. Una vez polimerizado se colocó el gel concentrador al 4%. Se corrió a 4 ͦC, 100 V y 15 mA durante 20 min, y luego a 250 V. Se usaron dos amortiguadores en la cámara de electroforesis, del cátodo y del ánodo. El amortiguador del cátodo contiene, Tricina 50 mM, Imidazol 7.5 mM, azul de coomassie 0.02%, se ajustó a 1 L con agua. El amortiguador para el ánodo incluye, Imidazol 25 mM y se ajustó a 1 L con agua, pH 7.0. FITC Se preparó una solución de 10 μM de FITC, y la reacción se llevó a cabo en KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, Tris 30 mM con un pH 8.9. Fue una incubación de 20 min a 25 ͦC con la proteína, se agregó la solución de azul de comassie y las muestras fueron cargadas al gel SDS-PAGE.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN De la purificación de la membrana plasmática de S. cerevisiae BY4741 (figura 1) se logró determinar la presencia de la H+-ATPasa con un peso de aproximadamente 100 kDa en el carril 5, que pertenece a la última fracción recolectada, en el carril 1, 2, y 3, también se logra observar la enzima, el 1 y 2 son la pastilla recuperadas en las dos primeras centrifugaciones posteriores a la sonicación, corresponden a pared celular y mitocondria respectivamente, el carril 3 y 4 son las fracciones solubles de las dos siguientes centrifugaciones, el carril 4 muestra que la proteína se logra sedimentar y es recuperada en el pellet. La


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CONCLUSIONES Fue posible obtener las enzimas Ca2+-ATPasa de musculo de conejo y H+-ATPasa de levadura, sin embrago para la purificación de la H+-ATPasa la concentración conseguida fue muy baja comparada con las reportadas en otras cepas, como es el caso de Kluyveromyces lactis, es necesario modificar el protocolo para una mejor purificación de la proteína. Además de que la poca concentración de proteína dificultara el BN-PAGE puesto que las bandas son muy marcadas. Se observó que en el ensayo de FITC para que ocurra la reacción es importante utilizar el FITC recién preparado. Posteriormente a estas purificaciones se realizan estudios a la enzima, como por ejemplo actividad enzimática, que ayudaran a comprender funcionamiento, estructura, formas de responder a diversos factores, y que son de importancia biológica.

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Voet, D. (2006). Bioquímica. Buenos AIires: Médica Panamericana.

Figura 3. BN-PAGE de la Purificación de la de la H+-ATPasa

El carril 1 de la figura 3 procede de la purificación de la de H+-ATPasa para la cepa S. cerevisiae BY4741 en donde podemos visualizar algunos de los estados oligoméricos de esta proteína, mostrando el tetrámero, hexámero y posiblemente el octámero.

Figura 4. SDS-PAGE de la Purificación de Ca2+-ATPasa de musculo de conejo

Figura 5. SDS-PAGE, ensayo FITC Ca2+-ATPasa de conejo

Se realizó el gel de la purificación de la Ca2+-ATPasa de músculo de conejo (figura 4) en donde el carril 2 y 3 la última fracción recolectada del proceso, los cuales muestran que se logra obtener la Ca2+-ATPasa exitosamente, el carril 1 sólo es un control de albumina para el ensayo FITC. La figura 5 correspondiente a la figura 4 pero vista bajo efectos de radiación UV, en donde se puede apreciar claramente en los carriles 2 y 3 la emisión de luz por parte de la interacción de la Ca2+-ATPasa-FITC.

Mr.(kDa) 1 2 3

668 440 232 142 66

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El Dr. Steven Smith es un físico que junto con el Dr. Carlos Bustamante establecieron las bases de una técnica de manipulación de moléculas individuales que ahora es ampliamente utilizado y conocido como pinzas magnéticas de una sola molécula. Estos dispositivos permiten la manipulación de moléculas individuales, es deci,r permiten atrapar una molécula a la vez. (Vlaminck, Dekker, 2012). En los últimos años, las técnicas de una sola molécula han demostrado una amplia aplicabilidad en el estudio de los procesos de las proteínas motoras y otras enzimas, dando una idea de su cinética y la mecanoquímica subyacente a estos procesos. Las pinzas magnéticas en particular han logrado combinar una gran flexibilidad en cuanto a manipulación molecular con una alta resolución espacial y temporal. (Lipfert, et al. 2014). Es por esto que las pinzas magnéticas adquieren una gran relevancia en el estudio de sistemas biológicos. Las pinzas magnéticas tienen la capacidad de generar la salida de un campo magnético, al aplicarles una corriente, su diseño consta esencialmente de tres partes: un núcleo de hierro, un embobinado con alambre de cobre y una capa de resina epoxi y cinta aislante. Un reto particular del diseño de la pinza es la punta, pues se debe considerar la distancia entre el objetivo y la muestra dentro del microscopio. Esto implica además el ángulo necesario para una manipulación óptima de la pinza. Es por esto que la punta de la pinza debe tener un ángulo que permita reducir las limitaciones de espacio, lo cual, aunado a la terminación en forma de punta, permite un control puntual de la muestra. El alambre de cobre actúa como un solenoide capaz de crear un campo magnético sumamente uniforme e intenso en su interior, y muy débil en el exterior.

MARCO TEÒRICO Campo magnético de un solenoide Un solenoide es un alambre largo enrollado en forma de hélice. Con esta configuración, puede producirse un campo magnético razonablemente uniforme en el espacio rodeado por las vueltas del alambre —llamado interior del solenoide— cuando éste lleva una corriente. Cuando hay muy poco espacio entre las vueltas, cada una puede tratarse como si fuera una espira circular, y el campo magnético neto es la suma vectorial de los campos que resultan de todas las vueltas. Si las vueltas están muy apretadas y el solenoide es de longitud finita, su distribución de líneas de campo es similar a la que rodea un imán de barra. En consecuencia, un extremo del solenoide se comporta como polo norte del imán, y el extremo opuesto se comporta como polo sur. Conforme se incrementa la longitud del solenoide, el campo interior se vuelve más uniforme y el exterior más débil. Se obtiene un solenoide ideal, cuando las vueltas están muy apretadas y la longitud es mucho mayor que los radios de las vueltas. En un solenoide ideal, se puede utilizar la ley de Ampere (1) para obtener una expresión cuantitativa del campo magnético interior. Cuando el solenoide es ideal, B es uniforme en el espacio interior y paralelo al eje, y las líneas de campo magnético en el espacio exterior forman círculos alrededor del solenoide. La ley de Ampère aplicada a la trayectoria circular cerca de la parte baja cuyo plano es perpendicular a la página, se puede usar para mostrar que existe un campo débil externo al solenoide. La ley de Ampère aplicada a la trayectoria rectangular discontinua en el plano de la página puede ser usada para calcular la magnitud del campo interno.

∮𝐵𝑑𝑙 = 𝜇�𝐼 (1)


Instituto de Física “Manuel Sandoval Vallarta”, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Av. Ma-nuel Nava Nº 6, Zona Universitaria, 78290, San Luis Potosí, S.L.P., México; andi_9510@hotmail.

com, [email protected], [email protected], [email protected].

Juárez Tello, A.; Moctezuma Martiñón, R. E.; Zúñiga Pérez, E. A.; Peña Balderas, A. M.

RESUMEN El uso de pinzas magnéticas en el estudio de sistemas biológicos ha tenido un gran auge desde que demostraron ser útiles en el manejo de moléculas individuales en el estudio del ADN. En el presente trabajo se estudió la forma de implementar una pinza magnética capaz de manipular puntualmente partículas magnéticas dentro de sistemas biológicos como lo son las células. Se construyeron tres pinzas magnéticas con diferente número de vueltas y diferentes puntas. Se analizó el procedimiento que se sigue en el laboratorio para estudiar propiedades dinámicas de partículas coloidales, con el fin de utilizarlo más adelante para determinar la eficacia de la pinza magnética. Encontramos que la pinza que contenía un mayor número de vueltas y un diámetro menor en la punta nos brinda mejores resultados.

Palabras clave: pinzas magnéticas, partículas magnéticas, solenoide.

ABSTRACT The use of magnetic tweezers in the study of biological systems has been of great interest since it was proved that they are useful to manage individual molecules in the study of DNA. In this work, we study how to implement a magnetic tweezer to precisely control the movement of magnetic particles inside biological systems such as cells. Three magnetic tweezers were performed with different number of turns and different tips. We analyzed the method used in the laboratory to study the dynamical properties of colloidal particles in order to later determine, using this method, the effectiveness of the tweezer. We found that the tweezer containing a larger number of turns and a smaller diameter at the tip gives us better results.

Keywords: magnetic tweezers, magnetic particles, solenoid.

INTRODUCCIÓN La electricidad y magnetismo están estrechamente relacionados y son temas de gran importancia para la física. El uso de las leyes de la física en el estudio de sistemas biológicos representa un gran avance en el contexto de la ciencia interdisciplinaria.


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209

Para la visualización de las partículas se utilizaron dos cámaras con sus respectivos softwares: Canon EOS Rebel T5i (EOS Utility 2.13.30.0) y Dino-lite Digital Microscope Premier (Dinocapture 2.0).

Pinza 1 Pinza 2 Pinza 3 Longitud del núcleo 17.5 17.5 12 Número de vueltas 2 capas de 50 vueltas 2 capas de 50 vueltas 6 capas de 50 vueltas Diámetro de la punta 0.035 pulgadas 0.030 pulgadas 0.022 pulgadas Diámetro del núcleo 6 mm 6 mm 6 mm Seguimiento de partículas El seguimiento de partículas se realiza de la siguiente forma:

Se graba con cámara CCD (charge-coupled device) acoplada al microscopio. El video se pasa a formato AVI, con el códec adecuado, utilizando Virtual Dub, el cual es es un

software para la conversión entre distintos formatos de vídeo y audio. Se obtienen de todos los frames del video Se realiza un tratamiento digital a las imágenes con una macro programada en ImageJ, con el fin

de obtener el fondo obscuro y las partículas más blancas. El objetivo es que el centro de la partícula sea la parte más clara de la imagen para que se le pueda dar seguimiento con un plugin basado en el algoritmo de Grier. (Crocker J.C, Grier D.G. 1996)

Se utiliza el plugin de ImageJ, Mosaic, para obtener las trayectorias de las partículas. Este programa se basa en el algoritmo de Crocker y Grier.

Figura 1: pinzas magnéticas

Figura 2: Arreglo experimental

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las siguientes graficas muestran los valores del campo magnético para las tres pinzas respectivamente. Podemos observar que llegamos a un punto de “saturación”, lo que nos indica que eventualmente la pinza se magnetiza hasta llegar a un máximo. Esta situación se tendrá que considerar al realizar los experimentos. La grafica de la segunda pinza nos indica que el material de la punta no se está magnetizando al mismo ritmo que la pinza uno y tres. En este caso la pinza que nos genera un mayor campo magnético es la pinza tres. Esta última resultó ser más eficiente pues nos permite generar un campo magnético mayor aplicándole una menor cantidad de corriente, evitando que la pinza se caliente a una tasa de tiempo menor. Esto nos permite hacer uso de la pinza en un lapso de tiempo mayor.

Para un solenoide consideramos

∮𝐵 ∙ 𝑑𝑠 = ∫ 𝐵 ∙ 𝑑𝑠 = 𝐵 ∫ 𝑑𝑠 = 𝐵𝑙.��

.��

(2)

El lado derecho de la ley de Ampère se refiere a la corriente total I a través del área limitada por la trayectoria de integración. En este caso, la corriente total a través de la trayectoria rectangular es igual a la corriente en cada vuelta multiplicada por el número de vueltas. Si la longitud es ℓ, y N es el número de vueltas, entonces la corriente total a través del rectángulo es NI. Por tanto, la ley de Ampère aplicada a esta trayectoria da:

𝐵 = 𝜇��𝑙 𝐼 = 𝜇�𝑛𝐼

(3)

Donde n = N/ℓ es el número de vueltas por unidad de longitud. (serway, Jewitt, 2012)

METODOLOGIA

El trabajo se llevó a cabo en el Instituto de Física “Manuel Sandoval Vallarta” de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí del 06 de junio al 15 de julio de 2015, comenzando con la recopilación de información correspondiente al tema de estudio. Posteriormente se realizaron los experimentos pertinentes. El trabajo consistió en sesiones de experimentos combinados con sesiones de pruebas en el microscopio y preparación de muestras. Este trabajo presenta un enfoque experimental, además de ser un estudio cuantitativo donde se hace uso de un sistema conformado por la pinza magnética que se realizó y las muestras de partículas magnéticas, que a su vez se encontraban en un arreglo (figura 2) conformado por el microscopio, la fuente, la pinza magnética y la computadora. El campo magnético se generó con una fuente modelo GW Instek (GPC-30600). Se hicieron tres pinzas diferentes con el fin de determinar cuál resultaba más útil a nuestros propósitos. (figura 1) Para construir las pinzas magnéticas se realizaron los siguientes pasos:

Se hicieron los núcleos de hierro y se les incorporó una punta de diferente tamaño a cada una (Tabla 1).

Se realizaron unos sujetadores de acrílico con el fin de evitar que el embobinado se separara. Se realizó el embobinado de los núcleos de hierro. Entre cada capa se colocó una capa de cinta

aislante y se selló con epóxico. En el caso de la tercera pinza se colocó barníz Kemek entre cada capa y se le colocó cinta aislante cada dos capas, y finalmente se selló con epóxico.

Se realizaron muestras a diferentes concentraciones con partículas magnéticas del tipo “SpeedBeads Carboxylate-Modified” que presentan la particularidad de que las partículas tienen dos capas de magnetita lo que duplica la velocidad. Estas partículas presentan un tiempo de respuesta más rápido, lo que las hace idóneas para ensayos clínicos, así como para una gran variedad de ácidos nucleicos y aplicaciones de aislamiento (Thermo scientific, 2011). Para algunas muestras utilizamos separadores con el fin de evitar que las partículas estuvieran juntas totalmente.

Se utilizaron los objetivos correspondientes a 40x, 10x y 5x


2 0 1 6 , vo l . 4 , n u m . 5



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211

automatización del sistema nos permite tener una mayor precisión de las mediciones y realizar los experimentos de manera que sean reproducibles bajo las mismas condiciones.

BIBLIOGRAFÍA

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Algunas de las pinzas mostraron una magnetización inicial que creemos son generadas por el campo magnético de la tierra.

Figura 5. Grafica de campo magnético para las pinzas 1, 2 y 3 respectivamente

Figura 3 : Muestras de partículas

Figura 4 : Reacción de las partículas magnéticas en presencia de un campo magnético

La figura 4 muestra la reacción de las partículas magnéticas en presencia de un campo magnético, en este caso la imagen se obtuvo con la pinza número tres. Los pasos a seguir dentro del proyecto es la automatización de la pinza mediante el software de Labview para que de esta manera los experimentos puedan ser reproducibles bajo las mismas condiciones. Esto nos permitirá estudiar sistemas biológicos con una mayor precisión.

CONCLUSIÓN

A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que cumplimos con los objetivos iniciales del proyecto. Al implementar las pinzas pudimos constatar que son una herramienta muy útil para la manipulación de partículas magnéticas que se utilizarán para el estudio de sistemas biológicos. El análisis de la dinámica de las partículas en presencia de la pinza magnética nos permite evaluar su eficacia. La


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213

síntomas en el ASD se cree que es causado por múltiples factores ambientales, genéticos y prenatales (Guglielmi et al., 2015). Diversos investigadores han sugerido la participación de los ganglios basales (Fucillo et al, 2016) ya que dichos núcleos se encuentran involucrados en el control y planeación de los movimientos voluntarios y en aspectos cognitivos (Albin, R. L. et al, 1989; DeLong M.R. et al, 2006), por lo que pueden estar involucrados en las conductas repetitivas y en la rigidez cognitiva que se observa en los pacientes con ASD. El cuerpo estriado es el módulo de entrada a los ganglios basales, un circuito neuronal necesario para el control de los movimientos voluntarios (Hikosaka et al., 2000), y se compone del caudado putamen y el núcleo accumbens (NAcc). Las aferencias estriatales llegan de 3 principales fuentes: la corteza, el mescencéfalo y el tálamo (Haber, 2003). Además, el estriado tiene dos vías principales eferentes, directa e indirecta (Parent et al, 1984;. Gerfen et al, 1990;. Kawaguchi et al ., 1990; Chuhma et al, 2011), a través de las neuronas de proyección espinosas medianas (EMs), que componen al estriado casi en su totalidad (~ 95%) y el resto (5%) son diferentes tipos de interneuronas, como son las interneuronas colinérgicas (InCs; ~1-2%) y el resto son diversos tipos de interneuronas GABAérgicas que se han dividido de acuerdo a sus propiedades electrofisiológicas, anatómicas y neuroquímicas (Ibáñez-Sandoval et al., 2010, 2011; Kawaguchi, 1993; Tepper et al., 2010). Estudios recientes, muestran un novedoso microcircuito del estriado que participa en la reorientación de la atención ante un estímulo externo (English et al., 2011), el cual involucra a las InCs, a un nuevo tipo de interneurona NPY y a las EMs. En este sentido, hemos observado que en el modelo autista de la rata se encuentra una disminución importante en el número de InCs, lo que sugiere una alteración en la conducta de reorientación de la atención o un incremento exacerbado de la atención en estos animales (Ibáñez-Sandoval, 2016; Tesis de Maestría). Así mismo, se sabe que las InCs en el estriado ventral participan en la conducta hedónica, por lo que es interesante explorar en este mismo modelo si existe una alteración de esta. Por lo anterior, es importante estandarizar una prueba que nos permita evaluar la conducta hedónica, en este modelo de autismo en la rata. Los resultados hasta ahora muestran, que se tienen mejores resultados al emplear gelatina para poder evaluar la conducta hedónica en las ratas.

METODOLOGÍA

Pruebas piloto para el comportamiento hedónico, se realizó con 2 variantes:

1. Prueba Hedónica primer variante: En una caja de dimensiones 84 cm de largo x 35 cm de ancho x 25 cm de alto con 3 subdivisiones formando 3 compartimentos A, B y C, se colocará la rata en el centro (ver Figura 3) mientras que en uno de los extremos (en este experimento en la cabina A) de la caja, se colocarán 2 alimentos, el primero es el común para las ratas llamado “Pellet” y el segundo es un alimento el cual es llamativo y rico en azucares, se trata de las galletas marca “Chokis” (ver Figura 1) y se monitorea la actividad de la rata por 10 minutos.

ALTERACIONES EN EL MICROCIRCUITO DEL ESTRIADO EN UN MODELO DE AUTISMO EN LA RATA

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, Col. Universitaria, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Fa-cultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Venustiano Carranza No. 2405, Col. Universitaria, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; daynaiba-


López de Olmos Sánchez, S.1; Ibáñez Sandoval, O.2; Ibáñez Sandoval, D. N.2; Hernández Maldonado, J. A.2

RESUMEN Estudios recientes mostraron, que en un modelo de autismo en la rata mediante la exposición de ácido valproico en los animales a los 12.5 días de gestación, disminuye significativamente el número de interneuronas colinérgicas (InCs) en el estriado. Estas interneuronas participan tanto en procesos cognitivos, en la toma de decisiones, así como en el comportamiento hedónico. Por lo que es interesante saber, si en este modelo de autismo en donde se observa una disminución de las InCs del estriado, existe una afectación en la conducta hedónica de los animales expuestos al ácido valproico. Por lo que, es imperativo realizar pruebas piloto que nos ayuden a estandarizar un prueba conductual que nos permita evaluar la conducta hedónica en estos animales. Palabras clave: InCs, autismo, ácido valpróico, hedónica.

ABSTRACT Recent studies showed that in an autism model in the rat by exposing of valproic acid in these animals at 12.5 days of gestation, significantly reduces the number of cholinergic interneurons (CIns) in the striatum. These interneurons are involved in cognitive processes, decision-making as well as the hedonic behavior. Thus it is interesting to know, if in this autism model where the number of CIns decreased in the striatum there is involvement in hedonic behavior in animals exposed to valproic acid. Therefore, it is imperative to conduct pilot tests that help us standardize a test of behavior that allows us to evaluate the hedonic behavior in these animals. Keywords: CIns, autism, valproic acid, hedonic.

INTRODUCCIÓN El Trastorno del Espectro Autista (ASD, por sus siglas en inglés) es un problema del neurodesarrollo caracterizado por impedimentos en las habilidades sociales de comunicación, así como de movimientos estereotipados y restringidos intereses (American Psychiatric Association, 2013), dicho trastorno ha cobrado mucha importancia últimamente debido a que hoy en día se desconoce su etología y patogenia, y los trabajos realizados en dicho tema se han enfocado principalmente en anomalías en las conexiones sinápticas dentro del sistema nervioso (Markran & Markran, 2010), la variedad y severidad de los


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2 0 1 6 , vo l . 4 , n u m . 5


215


Primer Variante Segunda Variante

Figura 5 Gráfica que muestra el número de contactos

promedio que tuvieron las ratas con el pellet o la galleta durante los 10 minutos del experimento.

Figura 6 Gráfica que muestra el número de contactos promedio que tuvieron las ratas con la Gelatina s/sabor o

c/sabor durante los 20 minutos del experimento.

Figura 7 Gráfica que muestra el tiempo promedio que

tardan las ratas en tener el primer contacto con el pellet o la galleta durante los 10 minutos del experimento.

Figura 8 Gráfica que muestra el tiempo promedio que

tardan las ratas en tener el primer contacto con la Gelatina s/sabor o c/sabor durante los 20 minutos del experimento.

14

5.5

02468

10121416

Pellet Galleta

N°co

ntac

tos/

10 m

in

Alimento

12.5

15.75

02468

1012141618

Gelatina s/sabor Gelatina c/sabor

N°co

ntac

tos/

20 m

in

Alimento

2.555

8.0375

0123456789

Pellet Galleta

Late

ncia

(seg

undo

s)

Alimento

15.28

11.2225

02468

1012141618


Late

ncia

(seg

undo

s)

Alimento

Figura 1. Fotografía de la caja de pruebas, nótese en el extremo

izquierdo de la caja están colocados paralelamente los alimentos en sus

respectivas charolas.

Figura 2 Fotografía de la caja de pruebas con una rata macho de experimentación, obsérvese como opta por una posición encorvada con las dos patas delanteras posicionadas sobre el rostro del animal.

En este experimento de utilizaron 4 ratas control de la cepa Sprague Dawley de las cuales 2 son machos y 2 hembras. A las ratas se les privó de alimento 24 horas previas al experimento aumentando las posibilidades de que las ratas consuman el pellet o la galleta. Tanto las galletas como el pellet se pesaron previo y después del experimento en una balanza analítica para obtener un Δ del peso (ω inicial – ω final) indicando que tanto consumió el animal, se obtuvo el tiempo en el cual la rata estuvo en contacto con el pellet o con la galleta, el número de mordidas a los alimentos y se tomó nota sobre la realización de “Grooming” (ver Figura 2) la cual es la acción en que las ratas con sus dos patas delanteras comienza a frotarse la cara denotando posible estrés o ansiedad.

2. Prueba Hedónica segunda variante: De la misma manera que la anterior prueba, se colocarán 2 alimentos, ambos son gelatinas pero la única variante es que el primero es sin sabor y el segundo con sabor, colorido y con frutas en su interior (ver Figura 4) y se monitorea la actividad de la rata por 20 minutos.

En este experimento de utilizaron las mismas 4 ratas del experimento anterior, dichas ratas en esta ocasión se les privó de alimento y bebida desde 24 horas previas al experimento, aumentando las posibilidades de que las ratas consuman el alimento. Se tomaron los mismos parámetros y medidas de prevención de la primer variante.

Figura 3 Caja de pruebas dividida en 3

partes, en la parte izquierda de la foto se encuentra el pellet (superior izquierda) y la

fracción de la galleta (inferior izquierda).

Figura 4 Caja de pruebas dividida en 3

partes, en la parte izquierda de la foto se encuentra la gelatina s/sabor (color

amarillo pálido) y c/sabor (color rojo).

A B C

A B C A B C


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217

rigurosas condiciones de trabajo así como el empleo del alimento que probó tener el mayor gusto sobre las ratas con las que se trabajaron, con esto se concluye que la segunda variante de la prueba que tiene por uso de dos gelatinas (sin sabor y con sabor) posicionados en un extremo de la caja de pruebas con tres subdivisiones mientras se coloca en medio a la rata en experimentación que estuvo en ayuno 24 horas previas mientras es monitoreada con cámara de video por 20 minutos, puede usarse como un método de evaluación en ratas autistas para entender el comportamiento hedónico que poseen y con ello permitan esclarecer más el panorama sobre trastorno del espectro autista, obteniendo información valiosa que ayude a realizar en estudios posteriores métodos para el combate del mismo ya en humanos.

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Figura 9 Gráfica que muestra el tiempo promedio en el

cual están en contacto las ratas con el pellet o la galleta durante los 10 minutos del experimento

Figura 10 Gráfica que muestra el tiempo promedio en el

cual están en contacto las ratas con la Gelatina s/sabor o c/sabor durante los 20 minutos del

experimento.

En los resultados anteriores, se logra apreciar notablemente que la segunda variante en la prueba hedónica se obtuvieron los resultados más idóneos con las ratas de la cepa Sprague Dawley, las modificaciones relevantes para el éxito del experimento fueron el tiempo y el alimento, se supo esto debido a que en la revisión de los videos de la primer variante, las ratas tenían primero que adaptarse al nuevo entorno por lo cual 10 minutos resultaban insuficientes para que dichas ratas pudieran comer en calma en un ambiente conocido por lo que se decidió incrementar el tiempo a 20 minutos, además de que durante la realización de la primer variante las ratas se encontraban más estresadas y en cuanto a la alimentación se optó por privar de agua y comida aumentando las posibilidades de que consumieran gelatina con fruta (rica en azúcares y agua) que una galleta (solamente es rica en azúcares). Comparando la Figura 5 y Figura 6 se observa una notable diferencia en el número de contactos que las ratas tuvieron en presencia de un alimento no apetitoso para las ratas, en la primer variante el resultado no mostró lo que se queriamos ver ya que las ratas tuvieron un mayor contacto con el pellet que con la galleta, caso contrario que se observa que hubo más contactos con la gelatina con sabor y fruta que la de sin sabor, obteniéndose un resultado idóneo (ver Figura 7 y Figura 8). De igual forma, hay una diferencia sobresaliente ya que en la primer variante se tardó más tiempo en tener el primer contacto con la galleta que con el pellet (denotando menor importancia), en comparación con la segunda variante, que la latencia fue mucho menor con la gelatina con sabor demostrando que capta mayormente su atención. Por último en la Figura 9 y figura 10, nuevamente en la primer variante, el pellet fue el más deseado por las ratas obteniendo más tiempo con respecto a la galleta y en cuanto a la gelatina con sabor captó por mucho más tiempo la atención de la rata con respecto a su contraparte de la gelatina sin sabor, todo estos resultados están igualmente respaldado por número de mordidas y el contenido neto del alimento neto consumido que fue favorable para la gelatina con sabor.

CONCLUSIONES Partiendo de la idea de una rata sana, éstas por su instinto buscan algo más llamativo, más degustable y/o más placentero, dicho esto es exactamente lo que se evaluó, para ello se modificaron distintas variables cuyo fin era obtener resultados claros y diferenciables que denoten una conducta hedónica normal y satisfactoriamente se obtuvo un prueba que cumpliera los requisitos previamente mencionados, el uso de ratas control de la cepa Sprague Dawley demostró tener un comportamiento hedónico normal bajo las

29.9925

8.525

0

5

10

15

20

25

30

35

Pellet Galleta

Tiem

po d

e co

ntac

to (s

egun

dos)

Alimento

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71

01020304050607080


Tiem

po d

e co

ntac

to (s

egun

dos)

Alimento


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2192 0 1 6 , vo l . 4 , n u m . 5


ÁLGEBRAS DE LIE E IMPLEMENTACIÓN DE ALGORITMOS EN MAXIMA

Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Facultad de Ciencias, Av. Salvador Nava Martínez, C.P. 78290, San Luis Potosí, San Luis Potosí México; [email protected]; mcvallarte@

gmail.com; [email protected]

Martínez Salazar, B.; Rodríguez Vallarte, M. C.; Salgado González, G.

RESUMEN El propósito de este trabajo es emplear el software libre wxMaxima para generar programas que funcionen con conceptos al alcance de los alumnos de los primeros años de licenciatura, y que sean de ayuda para verificar propiedades importantes de álgebras de Lie, conociendo la representación matricial del álgebra de Lie, sin importar la dimensión de la misma, mientras esta sea finita.

ABSTRACT

The purpouse of this work is to use free software like wxMaxima to create programs for users who want to work with Lie algebras. This programs should use concepts aviable for ungraduate students, and must be helpful to verify the Lie algebra’s properties the user needs to know. The programs will need the matricial form of the Lie algebra and will work as long as the dimension of the Lie algebra be finite. Palabras clave: wxMaxima, Álgebra de Lie, Algoritmos.

INTRODUCCIÓN El uso de software para resolver problemas matemáticos es bastante común, lamentablemente algunas veces el software que requerimos no es accesible debido a su costo. Por eso, tener software libre y multiplataforma es de gran ayuda para los estudiantes universitarios. Este tipo de software, como wxMaxima, trabaja en distintos sistemas operativos, incluyendo android, y se encuentra al alcance de cualquier persona con acceso a internet mediante una computadora o un celular. Las funciones con las que el usuario quiera trabajar y las propiedades que necesite verificar para el caso de álgebras de Lie, generalmente no se encuentran definidas en wxMaxima por lo que es necesario crear dichas funciones y programas. Para saber que se debe consturir, es necesario conocer los conceptos con los que se necesita trabajar. Sea 𝑔 un álgebra sobre la cual está definida una función bilineal, llamada el corchete del álgebra, [ , ]:𝑔 ×𝑔 → 𝑔, decimos que 𝑔 es álgebra de Lie si cumple las siguientes propiedades: [𝑥, 𝑥] = 0 ∀ 𝑥 ∈ 𝑔 (1)

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La dimensión del álgebra de Lie se define como n, y la dimensión del subespacio queda definida como r. Con un ciclo se calculan las matrices adjuntas correspondientes al corchete de cada elemento de la base del subespacio con cualquier elemento perteneciente al álgebra de Lie. Después el archivo realiza un ciclo para calcular el producto de los corchetes de los elementos de la base del subespacio consigo mismos en una representación matricial y guarda cada resultado en las variables h[j,k]. A continuación se crea una matriz M, la cual debe incluir una columna de ceros, y a todos los elementos de la base del subespacio. Con un ciclo se crean las matrices M[j,k] las cuales son la matrix extendida de M con el vector h[j,k], con otro ciclo se compara cada matriz M[j,k] con M si el rango de la matriz M[j,k]es igual o menor al de M para todos j y k, (como sucede en el ejemplo) se verá impreso el mensaje “done”, en caso de no serlo mostrará el mensaje “No es subálgebra” junto a los índices con los que se identificó a los vectores base cuyo producto no pertenezca al subespacio.

Figura 1 El ciclo de la entrada %i77 nos muestra que el subespacio es una subálgebra al escribir como resultado “done”

Ejemplo 2 El subespacio generado por 𝑒� es un ideal, ya que el único corchete distinto de cero al multiplicar al elemento del subespacio por todos los de la base es [𝑒�, 𝑒�] = 𝑒� y es posible verificar esta propiedad con el programa ideal_adjuntos.wxm. Este programa es una modificación del programa subalgebra_adjuntos.wxm, dicha modificación se encuentra al realizar los productos con los elementos del subespacio, en este caso los corchetes que se calculan no son únicamente entre los elementos del subespacio consigo mismos, se realizan entre los básicos del subespacio y los elementos de la base del álgebra de Lie con la que se está trabajando. También se denominan h[j,k], la forma de construir la matriz M y las matrices M[j,k] es exactamente la misma a la empleada en el archivo subalgebras_adjuntos.wxm. Se comparan nuevamente las matrices de los elementos de la base del subespacio con los elementos de la base con la matriz de productos. En este caso, si el rango de las matrices M y M[j,k] es el mismo o si el de M[j,k] es menor al de M para todos j y k, se imprime el mensaje “done” y en caso de no serlo, imprime el mensaje “No es un ideal” acompañado de los índices [j,k] que indican que producto no pertenece al generado del subespacio.

�𝑥, [𝑦, 𝑧]� + �𝑦, [𝑧, 𝑥]� + �𝑧, [𝑥, 𝑦]� = 0 ∀ 𝑥, 𝑦, 𝑥 ∈ 𝑔 (2) Sea 𝑠 un subespacio vectorial de 𝑔, se dice que 𝑠 es una subálgebra de Lie de 𝑔 si se cumple lo siguiente: [𝑥, 𝑦] ∈ s ∀ 𝑥, 𝑦 ∈ s (3) Sea 𝑠 un subespacio vectorial de 𝑔, se dice que s es un ideal si se cumple lo siguiente: [𝑥, 𝑦] ∈ s y [𝑦, 𝑥] ∈ s ∀ 𝑥 ∈ 𝑠 y ∀ 𝑦 ∈ s (4) Cabe notar que todo ideal es también una subálgebra. Y que 𝑔 es un subespacio de si misma, y al ser un álgebra se cumple que [𝑥, 𝑦] ∈ g ∀ 𝑥, 𝑦 ∈ g, por lo que el corchete 𝑔�: = [𝑔, 𝑔] es un ideal, y se le denomina ideal central descendente de 𝑔. Se define al n-ésimo ideal central descendente de la siguiente manera, 𝑔� = [𝑔��, 𝑔.) Sea 𝑔 un álgebra de Lie, se dice que es nilpotente de grado n si existe un n tal que 𝑔� = 0 . Todas estas características mencionadas en las definiciones anteriores son lo que se quiere verificar empleando wxMaxima en este trabajo.

METODOLOGÍA Para desarrollar cada algoritmo en wxMaxima el primer paso fue trabajar con álgebras de Lie de dimensiones bajas, es decir: 2, 3, 4 y 5, analizar el algoritmo de cada propiedad con lápiz y papel, para indentificar lo que se podía hacer de manera automática empleando funciones preestablecidas en wxMaxima. Una vez idenficadas estas partes, el siguiente paso fue el desarrollar los programas y funciones que no estaban establecidas en wxMaxima y unir todo lo necesario para crear programas que trabajen con la representación matricial del álgebra de Lie de dimensión finita. Con dichos programas se pretende comprobar cuales subespacios de las álgebras de Lie son subalgebras o ideales, y determinar para cada álgebra de Lie que se introduzca en los programs si es nilpotente o no. Para ejemplificar como trabaja cada uno de los programas, se va a emplear el álgebra de Lie de dimensión 4 la cual se denomina como A4,3 cuyos básicos son

𝑒�, 𝑒�, 𝑒�, 𝑒� con su corchete definido de la siguiente forma [𝑒�, 𝑒�] = 𝑒�; [𝑒�, 𝑒�] = 𝑒�. (7) Ejemplo 1 El subespacio generado por e1 y e2 es una subálgebra, ya que todo lo generado con ellos es e1, e2 o 0. Para comprobarlo en wxMaxima se debe utilizar el archivo subalgebra_adjuntos.wxm que es capaz de determiar si un subespacio es o no una subálgebra, esta rutina requiere la representación matricial del álgebra de Lie (en el caso de este ejemplo, las 4 matrices adjuntas relacionadas al álgebra de Lie empleada fueron denominadas F[1], F[2], F[3], F[4]) y es necesario tener un conjunto de generadores (que fueron denominados se[1] y se[2]), no es necesario que los generadores sean un subconjunto de la base canónica.


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En el ejemplo que se está usando, se comprueba que A4,3 no es nilpotente.

Figura 3 Al evaluar la función “Nilpotente_p” con el álgebra de Lie A4,3 podemos observar que no es nilpotente, el ciclo nos muestra su serie central descendente, y al generador del segundo ideal

central descendente en forma de listas junto al mensaje “No es nilpotente”

Para trabajar con estos algoritmos el lector puede consultar el artículo Invariants of real low dimension Lie algebras*[4] que cuenta con una lista de 83 álgebras de Lie distintas de dimensiones 3, 4, 5 y 6. Los programas funcionan con todas ellas, y con álgebras de Lie de dimensiones mayores encontradas en varios capítulos de algunos títulos mencionados en la bibliografía[1].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los algoritmos funcionan muy bien con cualquier algebra de Lie de dimensiones bajas (menor a 10), para dimensiones más grandes, dependiendo del equipo en el que se esté trabajando, el proceso podría ser mas lento o imposible de realizar. Los teléfonos celulares o Tablet no tienen problema trabajando con dimensiones bajas o haciendo operaciones con matrices de hasta 20 por 20, la única desventaja para dispositivos móviles es que no pueden guardar o abrir archivos, por lo que en caso de querer utilizar estos programas deberán descargar un archivo de texto y copiarlo en la aplicación de wxMaxima. wxMaxima trabaja con números del tipo long double de 80 bits no tiene problemas con números de hasta 1.8E308, el cuál es un límite bastante amplio, pero el que los programas funcionen de manera rápida depende también del tipo de equipo en el que se esté trabajando, ya que en alguno equipos al crecer la dimensión del algebra de Lie los procesos se pueden volver lentos o irrealizables, por lo que en este caso habría que pensar en nuevos algoritmos y determinar si wxMaxima puede seguirse usando o no. Las rutinas pueden determinar de manera eficiente cuando un subespacio de un álgebra de Lie es una subálgebra o un ideal de álgebra. También determina si un álgebra de Lie dada a través de sus constantes de estructura ordenadas en la representación matricial correspondiente es nilpotente. Actualmente el trabajo que se presenta sigue en desarrollo, la rutina que ayudaría a identificar la propiedad de solubilidad está realizándose en base a una modificación a la rutina para identificar álgebras de Lie nilpotentes. En la literatura se puede ver que a partir del trabajo en desarrollo será fácil determinar la forma de Cartan-Killing de algebra de Lie, la cual permite describir otro tipo de propiedades que no describimos en este trabajo, por ejemplo, permitiría determinar si un algebra de Lie es semisimple.

Figura 2 El ciclo de la entrada %i17 al ser evaluado nos muestra que el subespacio elegido para este ejemplo es un ideal al mostrar el mensaje “done” al finalizar

Ejemplo 3 El álgebra de Lie que se toma como ejemplo (A4,3) no es nilpotente, para verificar esto se emplea el archivo IdealDerivado.wxm. Dicho archivo trabaja con la representación matricial del álgebra de Lie dada, el programa se encarga de encontrar la base de cada ideal central descendente para hacerlo necesita que se definan varias funciones. La primer función es la función “bases”, que dado un conjunto de vectores escritos en forma de columna y agrupados en una matriz entrega una base, es decir al número máximo de vectores que son linealmente independientes en ese conjunto. La segunda función es “adjuntos” la cual calcula las matrices adjuntas de un conjunto de vectores asociada a su respectivo producto en un álgebra de Lie determinada, para esto requiere la lista correspondiente a la representación matricial del álgebra de Lie, la dimensión de dicha álgebra, el conjunto de vectores del subespacio y la dimensión de dicho subespacio. La tercer función es MatAx que dada una lista de matrices y el tamaño de la lista da una nueva matriz que resulta de agrupar a todos los elementos de la lista. Por último, la función Nilpotente Después de calcular las bases de cada ideal central descendente, el programa compara la dimensión del espacio generado de cada ideal central descendente con la dimensión del anterior, comienza con el primer ideal derivado, si la dimensión es igual a la dimansión del álgebra de Lie, se imprime el mensaje “Es perfecta” dado que de acuerdo a la literatura, cuando la dimensión del álgebra de Lie es igual a la de su primer ideal central descendente esta se define como perfecta. Si la dimensión del primer ideal derivado es menor a la del álgebra de Lie el proceso continúa, se calculan las bases y dimensiones de cada ideal descendente si en algún momento la dimensión es 0, el álgebra de Lie es nilpotente de acuerdo a la definición enunciada anteriormente, y el programa se detendrá imprimiendo el mensaje “Es nilpotente”, en caso de no serlo si la dimensión del espacio generado por algún 𝑑𝑖𝑚 𝑔� = 𝑑𝑖𝑚 𝑔�+� y es distinta de cero sabemos que g no es nilpotente, por lo que el programa imprimirá el mensaje “No es nilpotente” acompañado de la lista “SCD” que debe mostrar las dimensiones de los ideales derivados hasta el cual comienzan a ser iguales las dimensiones, es decir la serie central descendente del álgebra de Lie.


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IDENTIFICACION DE LA EXPRESIÓN DEL CANAL BKCa EN MESENTERICA DE RATAS DIABÉTICAS

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Facultad de Enfer-mería, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Niño Artillero No.130 C.P. 78290, San Luis

Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; [email protected]

Medina Ramos, J. E.1; Algara Suárez, P.2; Hernández García, A. P.2

RESUMEN La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad actual de alto interés dada su frecuencia a edades tempranas, esta enfermedad puede generar nefropatías así como ceguera entre otras, una característica de la DM es la hiperglucemia que se cree se relaciona a la disminución en la expresión de los canales de potasio de alta conductancia (BKCa) en tejido muscular de vasos sanguíneos, pues se generan altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) que afectan a estos canales, esto aunado a la capacidad de los vasos de censar la presión sanguínea explicaría la hipertensión en DM. Este estudio usó muestras de tejido muscular de mesentérica de ratas diabéticas para analizar mediante western blot la expresión de los canales BKCa, que se sabe participan en la regulación del tono muscular modificando el lumen del vaso y consecuentemente la presión, por lo que comprender la relación de estos canales y la DM significaría un avance en el desarrollo de nuevas dianas farmacológicas para hacer frente a las complicaciones de la DM.

Palabras clave: Diabetes Mellitus, Canales BKCa, Musculo liso.

ABSTRACT Diabetes mellitus (DM) is a current disease of high interest given its frequency at early ages, this disease can generate kidney diseases as well as blindness among others, a feature of the DM is hyperglycemia that is believed to be related to the decrease in the expression of potassium channels of high (BKCa conductance) in muscle tissue of blood vessels, since they generate high levels of reactive oxygen species (ROS) that affect these channels, this combined with the capacity of the vessels in enumerating the blood pressure would explain the hypertension in DM. This study used samples of mesenteric muscle tissue of diabetic rats to analyze by western blot the expression of BKCa channels, which are known to be involved in the regulation of muscle tone by modifying the vessel lumen and consequently the pressure and therefore to understand the relationship of these channels and the DM would mean a step forward in the development of new drug targets to deal with the complications of DM

Key words: Diabetes Mellitus, BKCa channels, Smooth muscle.

INTRODUCCIÓN La diabetes mellitus es una enfermedad considerada en la actualidad como uno de los problemas con mayor frecuencia en el sector salud, cerca de 29 millones de americanos se ven afectados por esta enfermedad lo cual puede generar complicaciones como glaucoma, neuropatía, cetoacidosis,

CONCLUSIONES Se puede concluir que la mayoría de las propiedades importantes de un algebra de Lie se pueden calcular usando las rutinas desarrolladas en este trabajo y un conocimiento básico de algebra lineal. Los programas realizados la cantidad de proceso repetitivos que deber realizarse a mano se reducen casi por completo al igual que la probabilidad de error al realizar un cálculo. Los algoritmos están revisándose para poder escribir rutinas más eficientes en base a las presentadas en este documento, y se espera poder crear más programas para probar más propiedades empleando como base las rutinas mostradas.

BIBLIOGRAFIA

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Tabla. 1.Parametros para la elaboración de la curva estándar para cuantificación por método de Bradford

Tubo Volumen de estándar (μL)

Fuente del estándar

Volumen de RIPAS 1:10

(μL)

Concentracion de proteína final (μg/mL)

1 70 2mg/mL stock 0 2000

2 75 2mg/mL stock 25 1500

3 70 2mg/mL stock 70 1000

4 35 Tubo 2 35 750

5 70 Tubo 3 70 500

6 70 Tubo 5 70 250

7 70 Tubo 6 70 125

8(Blanco) - - 70 0

Una vez obtenida la curva estándar con un coeficiente de relación r<0,90, se procedió a analizar las muestras, preparándolas a concentraciones de 1:10, para lo cual se tomaron 2μL de los sobrenadantes de las muestras obtenidas diluyéndolas en 18μL de *** (Pierce, Rockford, 89900), de concentración 1:10, se agregó posteriormente 1mL del Reactivo de Bradford, se vortexeó cada muestra, para despues tomar las concentraciones de cada una en el espectrofotómetro (SmartSpec 3000, Bio-Rad) a una longitud de onda de 595nm, este procedimiento se realizó simultáneamente y por triplicado para cada muestra. El sobrenadante restante se almaceno a -77°C.

IV. Detección del Canal BKCa Para la identificación del canal BKCa se desnaturalizaron las muestras para lo cual se colocaron 22,5µL de muestra y 7,5µL de buffer de carga 4X, el cual contiene entre otras cosas β-mercaptoetanol un agente desnaturalizante, posteriormente se hirvió a una temperatura de aproximadamente 96°C durante 5 minutos. Una vez desnaturalizadas las muestras realizó una electroforesis en la cual se cargaron 30µL de la muestra en cada pozo del gel de poliacrilamida SDS al 8%, este proceso se ajustó a 1 hora y 35 minutos a un voltaje de 120V. Se transfirieron las proteínas del gel hacia una membrana especial, para lo cual se hizo uso de una cámara de transferencia semi húmeda aplicando un protocolo de una hora a 0,31A. Posteriormente se incubo la membrana con el anticuerpo primario para la subunidad α del canal BKCa a una concentración de 1:500 en TBS-T 0,1% más 2% de leche (Abcam, Cambridge, Ma.) durante una noche para asegurar su unión al canal, una vez que se recuperó la membrana se realizaron lavados con TBS-T 0,1%, posteriormente se incubo la misma con el anticuerpo secundario contra conejo conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000) (Abcam, Cambridge, Ma.) por una hora, enseguida se realizo el bloqueo de la membrana con una solución que contenia: buffer TBST más leche libre de ácidos grasos (Svelty) al 5%, una vez bloqueada se le realizaron 3 lavados con TBST 0,1%, una vez limpia se procedio a revelar las bandas correspondientes al canal BKCa utilizando el kit de quimioluminiscencia (Bio-Rad) exponiendo a la luminiscencia unas placas fotográficas especializadas (Thermo Fisher Sci. Inc., Rockford, Il) durante una hora, y posteriormente

amputaciones además de un incremento en la presión sanguínea entre otras. La presión sanguínea en el organismo es mediada por la capacidad de los vasos sanguíneos para constreñirse o relajarse, disminuyendo o incrementando respectivamente el área de la luz del vaso. En Diabetes Mellitus se ha encontrado que esta capacidad de vasoconstricción se ve afectada a nivel del tejido muscular liso que envuelve los vasos sanguíneos provocando los altos niveles de presión vascular características de la enfermedad. Se sabe que en el proceso de contracción del tejido muscular liso participan un gran número de canales iónicos de distintos iones, entre ellos se encuentran los canales de potasio (K+) entre los cuales se pueden mencionar canales de potasio sensibles a ATP (KATP), canales de K+ sensibles a voltaje (Kv) y los canales de K+ de alta conductancia activados por Ca2+ (BKca), estos últimos canales se ven activados por el incremento en la concentración de Calcio intracelular, llevando así a la constricción del musculo, a su vez la actividad de este tipo de canales se ven afectados por la presencia de una alta concentración de glucosa dado que el metabolismo de este monosacárido puede generar especies reactivas de oxígeno (ROS) entre las cuales se puede originar el OONO- siendo este el producto de la combinación del ion peróxido (O2

-) y el óxido nitroso (NO) uno de los principales agentes relajantes del musculo y que es secretado por el epitelio interno del vaso (endotelio). Dada la relación que se genera entre el estado hiperglucémico y los niveles de ROS, el presente trabajo busca confirmar que esta enfermedad altera los niveles de expresión de los canales BKCa para poder plantear una nueva herramienta que sirva en un futuro para la prevención y/o tratamiento de la DM por medio de fármacos que ayuden a revertir las alteraciones en este tipo de canales de K+.

METODOLOGIA Se realizó un estudio experimental con tejido muscular liso de la arteria mesentérica de ratas de la cepa Wistar, de las cuales se habían distinguido dos grupos, de los cuales uno se sometió al tratamiento experimental donde previamente se les indujo diabetes; las muestras de estas ratas ya se encontraban previamente en tubos ependorf congeladas y almacenadas a -77˚C, al momento de realizar el experimento las muestras se colocaron solamente en hielo para facilitar su manipulación y desintegración por la técnica de sonicación, posteriormente se procedio a la realización de una electroforesis en geles de poliacrilamida, para continuar con una identificación de la proteína de interés (canal BKCa) mediante la técnica de Western Blot.

I. Obtención de muestras Se dispuso de las muestras de mesentérica de ratas de la cepa wistar inducidas con Streptozotocina a una dosis de 60mg/Kg de peso. Estas muestras se encontraban congeladas y almacenadas.

II. Extracción de proteínas Para extraer la proteína de interés de las muestras de tejido, se utilizó un sonicador (Sonifier 250, Branson) con el cual se aplicaron 5 ciclos de 8 pulsaciones ultrasónicas cada uno para asegurar una desintegración completa del tejido aumentando la eficiencia del proceso. Posteriormente se centrifugaron las muestras a 12000 revoluciones por minuto (rpm) durante un lapso de 20 minutos, el sobrenadante generado se conservó a -77°C para su posterior análisis.

III. Cuantificación de proteína Para evaluar cada muestra se sometieron los sobrenadantes obtenidos a un proceso de cuantificación de proteína por el método de Bradford, haciendo uso de un kit especial (Pierce, Rockford, 500-0204), para esta prueba es necesaria la elaboración de una curva estándar, por duplicado, la cual se generó conforme a la siguiente tabla:


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Figura 4. Placa revelada A de actina. Se observa la presencia de una banda de actina a bajos pesos moleculares.

Figura 5. Placa revelada B de actina. Se observa la presencia de una banda de actina a bajo peso molecular.

Para el revelado de las proteínas de bajo peso molecular (figura 4 y figura 5) se revelo contra beta actina cuyo peso es de 51kD y que al parecer se encontraron en ambas figuras a la altura del marcador de 50kD, aunque se pueden observar uniones inespecíficas que se deben posiblemente a algún problema con el bloqueo de la membrana antes de revelarla.

CONCLUSIONES Dada la gran resistencia del tejido muscular a desintegrarse no se logró obtener una concentracion suficiente de proteína para obtener resultados positivos acorde a las concentraciones de la curva de calibración. Dados los datos de las figuras 2 y 3 podemos observar la presencia de algunas barras presuntamente de la subunidad α, sin embargo y aunque se realizó el experimento por duplicado no se puede afirmar que haya una ausencia de la proteína en las demás muestras debido a que no pudimos establecer la concentración de proteina cargada en cada muestra. Respecto a las figuras 4 y 5 podemos observar la presencia de una tenue barra de lo que puede ser actina, por otra parte es posible que el anticuerpo no se haya fijado de manera específica y esto debido en mayor medida a que el bloqueo no haya sido lo suficientemente efectivo para evitar una posible inespecifidad del anticuerpo al momento de revelarse contra actina.

revelando las mismas. Posteriormente se realizó este mismo procedimiento para estandarizar contra actina.


Figura 1.Gel de poliacrilamida posterior a la transferencia teñido con azul de Coomassie. Se observan bandas de alto peso molecular.

Figura 2. Placa revelada A de la subunidad α del canal BKCa. Se observan bandas de alto peso molecular pertenecientes a la subunidad α del canal BKCa.

Figura 3. Placa revelada B de la subunidad α del canal BKCa. Se observan bandas de alto peso molecular pertenecientes a la subunidad α.

Se revelaron proteínas de alto peso molecular pudiéndose observar en las figuras 2 y 3 algunas bandas que pero que debido a la región donde se encuentran no corresponden a la subunidad α pues están entre los marcadores de 250kD y 150kD siendo el peso de la subunidad α de 131kD. Por otra parte también se puede observar una banda no tan específica (figura 3) que podría corresponder a la subunidad α dado que se encuentra entre los marcadores de 100kD y 150kD.


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LISTADO PRELIMINAR DE AVIFAUNA EN LA COMUNIDAD DE EL GARBANZO, CUENCA BAJA DEL RÍO TEMASCATÍO, IRAPUATO, GUANAJUATO, MÉXICO

1Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Facultad de Medicina. Aveni-da Venustiano Carranza 2405, Los Filtros. C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P. México, [email protected]; 2Estación Biológica. Instituto Tecnológico Superior de Irapuato col. El copal C.P. 36821,

Irapuato Guanajuato. México, [email protected]

Méndez González, K. N.1; Martín Hernández Navarro, E.2

RESUMEN El objetivo del presente trabajo fue realizar un listado preliminar de la avifauna en la comunidad “El Garbanzo”, municipio de Irapuato, Guanajuato, para reflejar el valor ecológico y conservación de la zona. El registro se llevó a cabo mediante dos técnicas, la observación directa y captura en redes de niebla en un estudio prospectivo. Se registraron 32 especies, de las cuales dos especies son semiendémicas de México (Cynanthus latirostris y Phainopepla nitens), a (Anas platyrhynchos diazi) registrada en la NOM-059- SEMARNAT-2010, como amenazada, seis especies consideradas de importancia económica en el país, y la presencia de cuatro especies sin registro anterior en la zona, (Piranga flava), (Spizella atrogularis), (Aphelocoma wollweberi) y (Psaltriparus minimus). Los resultados muestran el potencial ecológico del sitio, sin embargo es necesario completar el listado para contribuir en la toma de decisiones en planes futuros de monitoreo y acciones de conservación y manejo en “El Garbanzo”.

ABSTRACT The objective of this study was to perform a preliminary list of bird life in the community “El Garbanzo” in the city of Irapuato, Guanajuato in order to reflect the ecological value and the conservation state of the area. The registration was carried out through the use of two techniques, direct observation and capture using mist nets in a prospective study. 32 species were reported, of which two species are semi endemic of México (Cynanthus latirostris and Phainopepla nitens), (Anas platyrhynchos diazi) registered in the NOM-059- SEMARNAT-2010 as a threatened, six species considered of economic importance in the country and presence of four species without registartion before in the zone, (Piranga flava), (Spizella atrogularis), (Aphelocoma wollweberi) y (Psaltriparus minimus). The results show ecological potential of the site, however it’s necessary to complete the listing in order to influence future descision making focused on conservation and manage in ““El Garbanzo”. Palabras clave: Avifauna, Listado de especies, riqueza.

INTRODUCCIÓN

Los estudios avifaunístico en regiones específicas son fundamentales al contribuir en la comprensión de patrones de distribución espacial y temporal de las aves, por lo que las listas de especies generadas de estos estudios reflejan el valor ecológico y sirven de comparación entre diferentes sitios (Balmer, 2002).

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MÉTODOS Y MATERIALES Registro de aves En este estudio se realizó una salida prospectiva con duración de 4 días en el mes de junio del 2016. Las técnicas de registro fueron la observación directa y captura en redes de niebla (Ralph et al. 1996). Los muestreos se realizaron durante el amanecer y antes del crepúsculo en horarios variados a paso lento, en espacios de vegetación cerrada y abierta. Para las observaciones directas se utilizaron binoculares (10 x 50) y una cámara para el registro digital, para corroborar su correcta identificación, y se utilizó la guía de Howell y Webb 1995, se consideraron 2 estaciones principales para los registros (la laguna y la zona habitada de la comunidad) y partes del trayecto de estación a estación. El registro se complementó con 4 redes de niebla de 6 x 2.5 m, colocadas en diferentes estaciones por dos días cerca de la “Laguna del Galgo”, se revisaron gradualmente para evitar daños en las aves capturadas, de las cuales se evaluó su estado reproductivo y físico y posteriormente se liberaron. Para verificar y ampliar la información, posterior a la salida de campo se siguió el orden taxonómico de American Ornitologists’ Union (AOU 2010), los nombres comunes y tipos de endemismo, así como la distribución para Guanajuato, se tomaron principalmente de CONABIO 2013 y Escalante et al. 2014.

RESULTADOS

Se registraron 8 órdenes, 24 familias, 32 géneros y 32 especies de las cuales 4 fueron capturadas: chivirín saltapared (Tryomanes bewickii), colibrí pico ancho (Cynanthus latirostri)s, zafiro oreja blanca (Hylocharis leucotis) y picogordo tigrillo (Pheucticus melanocephalus),identificadas con parche reproductivo. Se identificaron 4 aves por vocalización: búho cornudo (Bubo virginianus), jilguero dominico (Spinus psaltria), gorrión barba negra (Spizella atrogularis) y matraca del desierto (Campylorhynchus brunneicapillus) y 24 fueron observaciones directas, también se encontraron 2 nidos activos con huevos de toquí pardo (Melozone fusca) ambos en pingüica (Ehretia tinifolia), uno a 80 cm del suelo con 2 huevos y el otro con un huevo a 70 cm del suelo. Se encontraron dos especies semiendémicas de México (Cynanthus latirostris y Phainopepla nitens) y a (Anas platyrhynchos diazi) registrada en la NOM-059- SEMARNAT-2010 (DOF 2010) como amenazada y seis especies consideradas de importancia económica en el país (CONABIO1996) Paloma ala blanca (Zenaida asiática), Paloma Huilota (Zenaida macroura), Tórtola coquita (Columbina passerina), cuervo común (Corvus corax), Cenzontle norteño (Mimus polyglottos) y Cuitlacoche pico curvo (Toxostoma curvirostre).

Tabla 2. Avifauna registrada en la cuenca Baja del Río Temascatío, comunidad “El garbanzo”, Municipio de Irapuato, Guanajuato y comparación de registros en el municipio.

Taxón Nombre común Estacionalidad Endemismo Estatus

NOM-059 UL H&M IV

ANSERIFORMES ANATIDAE Anas platyrhynchos diazi

Pato de collar

R

A

X

X

X

COLUMBIFORMES COLUMBIDAE Columbina inca Columbina passerina Zenaida asiática Zenaida macroura

Tórtola cola larga Tórtola coquita Paloma ala blanca Paloma Huilota

R R R R

X X X X

X X X X

X X X X

CUCULIFORMES CUCULIDAE Geococcyx californianus

Correcaminos norteño

R

X

-

X

En México residen un total de entre 1123 y 1150 especies de aves, colocando al país en el onceavo lugar por su riqueza avifaunística entre los países megadiversos y el cuarto en proporción de especies endémicas (Navarro-Sigüenza el al. 2014). La biodiversidad avifaunística en México se debe a su posición entre dos regiones biogeografías Neárticas y Neotropical (Halffter et al. 2008) y su compleja orografía que producen un mosaico de condiciones ecológicas y geografías, donde distintos procesos de especiación han originado la existencia de un vasto número de especies totales y endémicas (Navarro-Sigüenza et al. 2014). En Guanajuato se cuenta con 366 especies de aves, ubicándose en la posición veintidós en cuanto a la riqueza de especies del país (Gurrola et al., 2012). En el estado la perturbación de hábitats se ha presentado principalmente por acciones antropogenicas, reflejando una pérdida aproximada al 75% de vegetación nativa (Lozoya y Uriarte 2012) que contribuye en la fragmentación de hábitats, resultando en una pérdida de especies (Martínez-Morales 2005). Situación que podría empeorar por el crecimiento acelerado de la ciudad, por ello es imprescindible llevar a cabo acciones orientadas a la conservación de la biodiversidad en aquellas zonas donde aun se aprecian rasgos de la vegetación original (Escobedo et al., 2015) y aunque fragmentadas, las pequeñas áreas podrían contener una amplia diversidad (Bodin et al.2006). El objetivo de este estudio es realizar un listado preliminar de avifauna en la comunidad “El Garbanzo”, municipio de Irapuato, Guanajuato, que pueda evaluar que tan conservada esta la zona, como un paso inicial de monitoreo dentro de planes futuros de manejo que permitan detectar cambios con respecto a riqueza y abundancia y probar que pequeñas áreas pueden albergar diversidad importante. Área de estudio La comunidad “El Garbanzo” (Figura 1) se encuentra dentro de la Cuenca baja del Río Temascatío en el municipio de Irapuato, Guanajuato (20° 47’59.8”N, 101° 10´27.5”) a 2030 msnm. En la región el clima es sub-húmedo, que hacia el poniente pasa a semi-cálido y hacia el norte a semi-seco (INAFED 2003). Los principales tipos de vegetación son: bosque de encino (Quercus), bosque tropical caducifolio, matorral xerófilo y pastizal, con enclaves de bosques mésofilo de montaña y bosques de galería (Rzedowski 1978). Figura 1. Ubicación de la cominidad “El Garbanzo” dentro de la Cuenca Baja del Río Temascatío en

Irapuato, Guanajuato

El Garbanzo


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235

atrogularis), chara pecho gris ( Aphelocoma wollweberi) y sastrecillo (Psaltriparus minimus), a causa probable de los diferentes grados de perturbación, variaciones del clima o la heterogeneidad del paisaje, ya que estos factores influyen estrechamente con la presencia de diferentes especies (Gillespie y Walter, 2001). La presencia de seis especies de importancia económica en el área de estudio podría convertir a “El Garbanzo” en una zona vulnerable a la extracción legal e ilegal que podría resultar en desequilibrios ecológicos.

CONCLUSIONES El listado mostró una riqueza de 32 especies, el cual refleja a primera instancia el valor y carácter ecológico de la comunidad de “El Garbanzo” contribuyendo al conocimiento local del municipio de Irapuato, sin embargo es necesario completar el listado aumentando el esfuerzo del muestreo, ya que al no realizarse en épocas de migración disminuyo la riqueza del registro. Los resultados de un listado completo y fundamentado son necesarios para poder detectar cambios en la riqueza y abundancia, y con ello contribuir a futuro en la toma de decisiones para monitoreos y acciones de conservación y manejo. La observación de los nidos de (Melozone fusca) a poca altura y la presencia del (Bubo virginianus) dentro de la zona habitacional de la comunidad podría indicar una zona de poco disturbio por el hombre o la ausencia de depredadores en la estación de la laguna del Galgo. Las aves registradas en su mayoría son residentes, muchas de las cuales potencialmente se pueden reproducir en el área de estudio, asociadas principalmente a zonas con amplia cobertura vegetal y recursos para alimentarse.

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APODIFORMES TROCHILIDAE Cynanthus latirostris Hylocharis leucotis

Colibrí pico ancho Zafiro oreja blanca

R R

S

- X

- X

X X

ACCIPITRIFORMES ACCIPITRIDAE Accipiter cooperii Buteo jamaincensis

Gavilán de Cooper Aguililla cola roja

M R

- X

- X

- X

CATHARTIDAE Cathartes aura

Zopilote aura

R

X

X

X

STRIGIFORMES STRIGIDAE Bubo virginianus

Búho cornudo

R

X

-

X

PICIFORMES PICIDAE Picoides scalaris

Carpintero mexicano

R

X

X

X

PASSERIFORMES CTYRANNIDAE Pyrocephalus rubinus

Papamoscas cardenalito R

X

X

X

CORVIDAE Aphelocoma wollweberi Corvus cora x

Chara pecho gris Cuervo común

R R

- X

- X

- X

HIRUNDINIDAE Hirundo rustica

Golondrina tijereta

R

X

X

X

AEGITHALIDAE Psaltriparus minimus

Sastrecillo

R

-

-

-

TROGLODITIDAE Troglodytes aedon Thryomanes bewickii Campylorhynchus brunneicapillus

Chivirín saltapared Chivirín cola oscura Matraca del desierto

R R R

X X X

X X X

X X X

MIMIDAE Toxostoma curvirostre

Cuitlacoche pico curvo

R

X

X

X

MINUS Mimus polyglottos

Cenzontle norteño

R

X

-

X

FRINGILLIDAE Haemorhous mexicanus Spinus psaltria

Pinzón mexicano Jilguero dominico

R R

X X

X X

X X

EMBERIZIDAE Melozone fusca Spizella atrogularis

Toquí pardo Gorrión barba negra

R R

- -

X -

X -

CARDINALIDAE Piranga flava Pheucticus melanocephalus Passerina caerulera

Tángara encinera Picogordo trigrillo Picogordo azul

R R R

S

- X X

- - X

- X X

ICTERIDAE Icterus waglerii

Bolsero de Wagler

R

-

-

X

PTILGONATIDAE Phainopepla nitens

Capulinero negro

R

-

X

X

(E) Endémico de México, (S) Semiendémico de México; (R) Residente todo el año, (M) Migratorio únicamente en época de no reproducción. (UL)=Especies registradas en el municipio de Irapuato ANP Cerro de Arandas, registros de aves en Uriarte y Lozoya (2009), Lozoya y Uriarte (2012), (H&M)= Registros de aves en Hernández-Navarro y Moreno (2009), (IV)= Inventario de vertebrados (Escobedo et al 2015).

DISCUSIÓN En este estudio se comparó la presencia de las especies encontradas en el área de estudio con tres de los registros más actuales en Irapuato (Uriarte y Lozoya 2009, Lozoya y Uriarte 2012), (Hernández y Moreno 2009), (Escobedo et al. 2015) (Tabla 2), donde se encontró que un 12% de las aves de la comunidad de “ El Garbanzo” no tienen registro en los trabajos anteriores, 59.4% se encuentran en los tres registros mencionados y el 38.6% está presente en al menos uno de ellos. Por lo que se agrega al registro local, la presencia de cuatro especies, Tángara encinera (Piranga flava), gorrión barba negra (Spizella


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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CICATRIZANTE DE HAMELIA PATENS (RUBICEAE) EN RATAS DIABÉTICAS

1Instituto Tecnológico Superior de Irapuato, Ingeniería Bioquímica, Julián López, 2da sección las Heras, 36640, Irapuato, Guanajuato, MEXICO; [email protected]; 2Facultad de Me-dicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, facultad de medicina, Av. Sierra Leona, 2da sec-

ción lomas, 78210, San Luis Potosí, San Luis Potosí, MÉXICO, [email protected]

Morales Martínez, N. L.1; Cilia López, V. G.2

RESUMEN Hamelia patens perteneciente a la familia Rubiaceae es un arbusto que se distribuye en América, apreciado por sus usos medicinales pues tiene propiedades analgésicas, antimicrobianas y cicatrizantes. En el presente estudio se determinó el contenido químico de las hojas de H, patens. Se realizaron extractos metanólicos y hexánicos de hojas de H. patens recolectadas en la comunidad de Tocoy, San Antonio, S.L.P. Se realizó extracción en equipo Soxhlet. Se encontró una variabilidad de alcanos, ácidos grasos, flavonoides, obteniendo más compuestos en la extracción hexánica.

INTRODUCCIÓN Las plantas medicinales tienen un papel importante, ya que los problemas de salud y la difícil consecución de los medicamentos sintéticos han llevado de nuevo a la búsqueda remedios basados en la medicina tradicional. Es así como el conocimiento de las plantas medicinales ha retomado importancia y cada día se ubica como una alternativa en el cuidado primario de la salud, debido a su eficacia, seguridad y bajo costo siempre y cuando se usada de manera adecuada (Fonnegra et al., 2007). Hamelia patens (Rubiaceae) es un arbusto medicinal ampliamente distribuido en zonas tropicales del continente americano (Reyes et al., 2004). Es de hojas de elípticas a lanceoladas de 5-15 cm de longitud, agudas o acuminadas en el ápice. Son pubescentes, con los pecíolos rojizos. Su tallo color café, las flores de color naranja o escarlata, con corola largamente tubular y terminada en 5 lóbulos, a veces cubierta con pelillos que pueden ser erguidos o reclinados. El fruto es carnoso, globoso, de color rojo y al madurar es negro, mide unos 8 mm de longitud. Las semillas son numerosas y angulosas, su distribución se ve favorecida por pájaros y pequeños mamíferos (Cáceres, 1996). Crece mejor con humedad bien proporcionada y prefiere el sol en lugar de media sombra, Esta planta puede tomar calor y la sequía, pero un fuerte viento puede causar algunas hojas dorado (Gilman et al., 2014). Se distribuye desde el sur de los Estados Unidos hasta Argentina, atravesando México a Bolivia, Paraguay, Brasil e islas del Caribe (Cáceres, 1996). Tiene diversos usos en la medicina tradicional, tiene propiedades analgésicas, antibacterianas, antifúngicas, antiinflamatorias, diuréticas, también se le atribuye propiedad astringente, cicatrizante,

ESCOBEDO, L.A., Hernández, E., Leyte, A. (2015). Inventario de los vertebrados terrestres del área natural protegida Cerro de Arandas, Irapuato, Guanajuato. ITESI e IMPLAN. Pp-32-67 GILLESPIE, T. W. y H. Walter. (2001). Distribution of bird species richness at a regional scale in tropical dry forest of Central America. Journal of Biogeography 28:651-662. GURROLA, M.A., Escalante, B.P., López, A.S., Sanabria, F. T. (2012). “Aves”. La Biodiversidad en Guanajuato: Estudio de Estado vol. II. México. In La Revista Mexicana de Biodiversidad, Supl. 85: S476-S495, 2014 DOI: 10.7550/rmb.41882 Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad/Instituto de Ecología del Estado de Guanajuato. México, D.F. Pp. 244-254. HALFFTER G., Llorente B., J., Morrone, J.J. (2008). La perspectiva biogeográfica histórica. Capital Natural de México, Vol. I: Conocimiento actual de la biodiversidad. Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad. México, D.F. Pp. 67-86. HERNÁNDEZ-NAVARRO, E. M., Moreno, P. E. (2009). Estudio de la avifauna del Área Natural Protegida Cerro de Arandas, Irapuato, Guanajuato. Memorias del VII Congreso Nacional sobre Áreas Naturales Protegidas de México. San Luis Potosí, S.L.P., CONANP. HOWELL, S.N.G. & S. Webb. (1995). A guide to the birds of Mexico and Northern Central America. Oxford University Press. New York. 851 p. INAFED (2003). Enciclopedia de los municipios y delegaciones de México: Estado de Guanajuato, Irapuato. Consultada en http://www.inafed.gob.mx/work/enciclopedia/EMM11guanajuato/municipios/11017a.html (fecha de consulta 07-07-2012)

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tetradecanoic acid ácido graso 13.95 000544-63-8 hexadecanoic acid, 2-oxo-methyl ester esteres 14.339 055836-30-1 dotriacontane alcano 14.345 000544-85-4 3-buten-2-one,4-6(6,6dimethyl-1-ciclohexen-1-yl)

ácido graso 14.928 065133-79-1

1h-imidazole,4-methyl-5-nitro ácido graso 17.303 014003-66-8 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester

Esteres 17.709 000084-69-5

1-hexadecanol alcohol graso sintético

17.892 036653-82-4

hexadenanoi acid, methyl ester Ester 19.58 000112-39-0 n-hexadecanoic acid ácido graso 21.205 000057-10-3 1,2benzenedicarboxylic acid, butyl 8-methylnonyl ester

Éster 21.377 000089-18-9

hexadecanoiic acid ethyl ester ácido graso saturado 22.521 000628-97-7 nanodecanoic acid, ethyl ester Éster 22.527 018281-04-4 1-octadecanol alcohol graso 26.876 000112-92-5 phytol Alcohol 28.386 000150-86-7 9,12-octadecadienoic acid(zz) ácido graso insaturado 29.828 000060-33-3

Tabla 2. Compuestos químicos mayoritarios de Hamelia patens en el extracto metanólico

Nombre Familia Tiempo de detección

Número cas

2-nonylmalonic acid, dimethyl ester éster 5.812 1000210-44-7

4h-pryan-4-one,2,3-dihydroxy-6methyl alcano 6.012 028564-83-2 ciclotetrasiloxane,octamethyl ciclometicona 6.378 000556-67-2 indole amino 7.231 000120-72-9 2-methoxy-4-vinylphenol metoxifenoles 7.357 007786-61-0 phenol-2,35,6-tetrametyl alcohol 7.454 000527-35-5 1h-pyrole-methyl pirroles 7.637 000096-54-8 niacinamide compuesto aromático 8.061 000098-92-0 phenol,2,4-bis(1,1, dimethylethyl) alcohol 9.365 000096-76-4 megastigmatrienone cetonas 11.545 038818-55-2 inositol polioles 13.937 000087-89-8 adenine purines 15.024 000073-24-5 2-heptadecanol ácido graso 16.449 006876-13-7 cyclohexanemethanol,4,(1-methylethyl)-cis

ácido graso 17.227 013828-37-0

1ethynylcyclopentanol alquino 17.942 017356-19-3 octanoic acid, octyl ester éster 18.658 002306-88-9

hexadecanoic acid, methyl ester éster 19.59 000112-39-0 n-hexadecanoic acid ácido graso 20.935 000057-10-3

desinflamante, emoliente (Cáceres, 1996). En México se utiliza para 42 diferentes propósitos medicinales, especialmente para detener el sangrado, cicatrización de úlceras y trastornos menstruales (Mendoza, 2000). La evidencia experimental reciente indica que la aplicación tópica de una pomada elaborada con el extracto etanólico de partes aéreas de H. patens aumenta la resistencia a la rotura de heridas inducidas en ratas (Gomez et al., 2003). Hamelia patens se ha estudiado químicamente, se conoce que contienen alcaloides de oxindole pentacíclicos (Borge, 1979).


Material vegetal: Hamelia patens fue recolectada en la comunidad de Tocoy, San Antonio, S.L.P en el mes de enero. Preparación de extractos Extractos metanólicos: se pesaron 10 g de hojas secas pulverizadas de H. patens y se colocó en papel filtro. Se montó equipo soxhlet colocando 160 mL de metanol en el matraz bola durante 6 ciclos es una extracción exhaustiva a 80°C. Extractos hexánicos: se pesaron 5 g de hojas secas pulverizadas de H. patens y se colocaron en papel filtro dentro de una bureta para fraccionamiento con 120mL de hexano. Se colocó en la campana de extracción y se maceró por 24 horas. Posteriormente se colocó el contenido en un vaso de precipitados, realizando un enjuague con 80 mL de hexano. Después se evaporó el hexano a baño maría a 37°C. Se retiró del baño maría cuando se obtuvo un volumen de 25 mL. Una vez obtenidos los extractos, se tomaron 100µl en un vial para su lectura en el cromatógrafo y conocer los compuestos presentes.

RESULTADOS Las tablas 1 y 2 muestran los componentes encontrados en las hojas de Hamelia patens, las figuras 1 y 2 muestran los compuestos mayoritarios encontrados para ambos extractos. Tabla 1. Compuestos químicos mayoritarios de Hamelia patens presentes en el extracto hexano

Nombre Familia Tiempo de detección

Número CAS

hexadecane alcano 10.563 000544-76-3 diethyl phthalate ftalatos 10.74 000084-66-2 10-methylnonadecane alcano 11.386 05686-62-5 nonadecane alcano 11.444 000629-92-5 hexadecane, 4-methyl alcano 11.644 025117-26-4 heptadecane,9-hexyl 11.919 055124-79-3 heptadecane alcano 12.531 000629-78-7

squalane isopreno 12.685 000111-01-3 n-hexadecylpyridinium bromide alcano 13.395 000140-72-7 10-methylnonadecane alcano 13.584 05686-62-5 ethanol,2-(dodecyloxy) tipo éter (surfactantes) 13.612 004536-30-5


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DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA EL ALMACENAMIENTO DE ENERGIAS LIMPIAS: ANCLAJE DE Ce6 EN LA MOLECULA DEL GRAFENO Y OXIDO DE GRAFENO

Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava 6, Zona Universi-taria, 78290 San Luis Potosí, S.L.P, MÉXICO; [email protected]; quintanamildred@

gmail.com; [email protected]

Morato Marquez, J. A.; Hernández Sánchez, D. ; Quintana Ruiz, M.

RESUMEN En la actualidad, el grafeno y sus derivados son algunos de los muchos tipos de materiales de gran interés, debido a que estos presentan una gran variedad de propiedades mecánicas, ópticas, químicas y electrónicas. Pueden tener muchísimas aplicaciones en el campo de las energías renovables como celdas solares, y así también, en terapia fotodinámica para la ayuda de eliminación de células malignas. En este artículo se explica la metodología empleada para la formación de dos nuevas nanomoleculas híbridas con el objetivo de lograr la funcionalización de pequeñas capas de grafeno (FLG) y oxido de grafeno (GO) en conjunto con la clorina e6 (Ce6) que es un tipo de porfirina la cual actuara como una antena que atrae energía (fotones) y la distribuirá al FLG o al GO según el hibrido preparado, estos fueron preparados en soluciones agua desionizada (DW) o un buffer fosfato salino (PBS) y metanol así teniendo una serie de muestras las cuales fueron preparadas a distintas concentraciones. Palabras Clave: Grafeno, Oxido de Grafeno, Clorina.

ABSTRACT Currently, graphene and its derivatives are some of the many types of materials of great interest, because they present a variety of mechanical, optical, chemical and electronic properties. They can have many applications in the field of renewable energies such as solar cells, and also in Photodynamic Therapy for helping to remove malignant cells. This article explains the methodology used for the formation of two new nanomolecular hybrid, in order to achieve functionalization of few layer graphene (FLG) and graphene oxide (GO) in conjunction with chlorine e6 (Ce6) which is a type of porphyrin that acts as an antenna that attracts energy (photons) and distributes it in few layer graphene (FLG) or graphene oxide (GO) as the hybrid prepared, these solutions were prepared in distilled water (DW) or a buffer phosphate saline (PBS) and methanol, so we have a number of samples that were prepared at different concentrations. KEY WORDS: Graphene, Graphene Oxide, Chlorine

INTRODUCCIÓN En la actualidad resulta evidente la importancia de los materiales carbonosos ya que el interés en estos ha incrementado de forma considerable en las dos últimas décadas debido a las diversas aplicaciones que se les pueden dar ya sea como parte del desarrollo de sensores innovadores, celdas de combustible de alta

8,11octadecadienoic acid, methyl ester éster 27.43 056599-58-7 9,12,15 octadecatrenoic acid, metil ester, (zzz)

éster 27.756 000301-00-8

phytol alcohol 28.305 000150-86-7 octadecanoic acid, methyl ester éster 28.98 000112-61-8 eicosanoic acid, methyl ester éster 38.381 001120-28-1

CONCLUSIONES A partir de las hojas secas de Hamelia patens obtuvimos diferentes compuestos químicos los cuales tiene una función farmacéutica tanto en el extracto de hexano como en el de metanol. Con los compuestos obtenidos y ya sabiendo se puede concluir que Hamelia patens efectivamente tiene un potencial bastante positivo en el área medicinal.

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1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 00

5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

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T i m e - - >

A b u n d a n c e

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1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00

2 0 0 0 0

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3 0 0 0 0 0

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A b u n d a n c e

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Figura 1. Espectro de Hamelia patens en metanol

Figura 2. Espectro de Hamelia patens en hexano


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materiales. Estos compuestos tienen por lo general bandas de absorción en el espectro UV, el azul y el rojo visible, la baja absorción en la región verde es lo que hace que normalmente presenten este color (Oliveira et al., 2014). La clorina e6 es prometedora debido a su baja toxicidad, fácil síntesis y producción, además de su gran eficiencia fotosensibilizador (Park et al., 2012). En este trabajo, la exfoliación de grafito y óxido de grafito para obtener FLG y GO, respectivamente, se llevó a cabo en agua destilada (DW) y en una un conjunto diferente de experimentos en solución buffer fosfato salina (PBS), una solución buffer utilizado comúnmente en la investigación biológica. Esta exfoliación es posible como resultado de la física y interacciones químicas entre ce6 y láminas de carbono. Nosotros mostrar un estudio comparativo sobre la base de las características espectroscópicas de FLG-ce6 y GO-Ce. Se espera que la comprensión de las interacciones entre las moléculas funcionales tales como ce6 y materiales nanoestructurados como FLG y GO allanar el camino para un mayor desarrollo de avanzados con nanohíbridos aplicaciones en energía y biomedicina.

METODOLOGIA

Químicos: clorina e6 (Ce6) la cual se adquirió de Frontier científica Logan , UT. El grafito se adquirió de Bay carbono, Inc. (SP-1 de grafito en polvo, lote N°04100, lote .N°011705, (www.baycarbon.com). Todos los disolventes y productos químicos eran obtenidos a partir de proveedores comerciales y se utilizaron sin más purificación. Preparación de muestras: La exfoliación de grafito y óxido de grafito se realizó en buffer de fosfatos salino y agua desionizada en distintos ensayos de manera independiente empleando distintas concentraciones de Ce6, partiendo de una solución madre preparada en metanol (5 mg/mL). En la tabla 1 se muestran las concentraciones iniciales probadas de los reactivos para cada experimento. En cada ensayo se incluyeron grupos controles, los cuales no contenían Ce6, grafito y GO, respectivamente.

Tabla 2: concentraciones iniciales de muestras

Concentraciones iniciales (mg/ml)

Reactivo Grafito/ GO Clorina e₆

E1 0.1 mg/ml 1 mg/ml

E2 1 mg/ml 0.20 mg/ml

E3 1 mg/ml 1 mg/ml

E4 1 mg/ml 5 mg/ml

Nanohíbrido final

FLG-Ce₆ GO- Ce₆

PBS Agua (DW) PBS Agua

(DW) Se tomaron los espectros de todas las muestras antes de ser sonicadas en un espectrómetro UV-VIS las muestras que contenían GO se dejaron en agitación magnética durante un periodo de 18 horas protegiéndolas de la luz y a temperatura ambiente, después fueron sonicadas las muestras durante 60

eficiencia y campo amplio en aplicaciones biomédicas. Todo esto gracias a la grandes propiedades que el grafeno posee y cualidades únicas por su forma atómica, la cual es una capa de un átomo de espesor los cuales están distribuidos en una forma hexagonal muy parecida a un panal de abejas, esto le permite tener una alta facilidad a los electrones de moverse entre los átomos, y de ahí nace su gran conductividad eléctrica, así como una gran rigidez y una proporción correcta entre fragilidad y ductilidad. (Quintana, et al., 2013). Además de la gran variedad de formas en las cuales se puede presentar este material nanoestructurado como lo es el óxido de grafeno, nanotubos de carbono en mono capa y multicapas, así como fulerenos y más recientemente fuleritas. (Solís, 2011). En particular el grafeno tiene una longitud entre los enlaces C-C de 0.142 nm. El paso de los electrones por el grafeno origina un efecto Hall cuántico que es imprescindible para su comportamiento como semiconductor, (Zhang, Y.B. 2005) pero mientras que otros semiconductores sólo presentan este efecto a temperaturas muy bajas, el grafeno lo mantiene bien incluso a temperatura ambiente, convirtiéndolo en un excelente semiconductor. Es importante mencionar que el grafeno es químicamente inerte y que tiene una banda prohibida de cero, volviéndolo aún más atractivo para su funcionalización con moléculas orgánicas e inorgánicas, modificación química de su superficie y en general la descripción de interacciones covalentes y no covalentes. (Georgakilas, V. 2012) Sin embargo, los costos de producción de grafeno a gran escala limitan que sus aplicaciones puedan ser explotadas al máximo y por lo cual, una ruta económica para obtener grafeno es por medio de la exfoliación química del grafito. para lograr la exfoliación el grafito debe ser sometido a la presencia de solventes orgánicos con distintas polaridades y un medio biocomatible. La forma en que funcionan estos solventes es por medio de cavitación, asi los enlaces π-π del grafito se rompan y el solvente entre en las láminas formadas para no se vuelvan a unir formando así mono capas de grafeno. (Hernández, et al., 2008). Hasta ahora, la exfoliación del grafito se puede lograr siguiendo diversas metodologías. Tales como el uso de un fuerte agente oxidante durante la exfoliación del grafito puede llevar a cabo la síntesis del óxido de grafeno (GO) el cual es un material hidrofilico no conductivo. Aunque su estructura no es muy fácil de determinar, se sabe bien que la red continua del grafeno es interrumpida por grupos epóxidos, alcoholes, carbonilos de cetona y carboxilos. (Marcano et al., 2010). Alternativamente, el grafito se puede exfoliar por medio de energía asistida por la intercalación de moléculas pequeñas utilizando ultrasonicacion (Quintana, et al., 2012) lo cual produce “pequeñas capas de grafeno” (FLG por sus siglas en ingles). Ambos estrategias presentan ventajas y desventajas dependiendo en la demanda de la aplicación. Por ejemplo, GO es una facilidad el material procesable fácilmente dispersable en agua y polar disolventes orgánicos. (Stankovich, et al., 2006). Pero desafortunadamente, la mayoría de las importantes propiedades asociadas al grafeno como una elevada conductividad eléctrica y resistencia mecánica carecen de GO. En su lugar, FLG mantiene las propiedades fundamentales de grafeno, pero disolventes con puntos de ebullición elevados y grandes tenciones superficiales son utilizados durante la exfoliación de grafito dificultando su la evaporación y eliminación completa. (Hernández, et al., 2008) Para solucionar estos problemas, se utilizan aditivos moleculares tales como tensoactivos para poder estabilizar las moléculas de FLG y GO en medios acuosos y orgánicos produciendo un hibrido. En este reporte se describe el procedimiento de exfoliación del grafito y oxido de grafito mediante el uso de la clorina e6 (Ce6). Las clorinas son por mucho los compuestos de tipo porfirinas más abundantes e importantes, tomando en cuenta su incidencia en la naturaleza así como su alcance actual en la medicina y en la ciencia de los


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300 400 500 600 700 800

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavelength (nm)

E1-FLG-PBS E2-FLG-PBS E3-FLG-PBS E4-FLG-PBS

(403.0177, 0.47326)

(656.99231, 0.17458)

(268.98102, 0.28673)

(681.98828, 0.11991)

Figura 1: grafica de espectro de absorción de FLG-PBS

300 400 500 600 700 800

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavelength (nm)

E1-FLG-DW E2-FLG-DW E3-FLG-DW E4-FLG-DW (adjusted) E4-FLG-DW (100 en 3)

(407.01819, 2.78707)

(699.50287, 1.17422)(660.01361, 0.82056)

Figura 2: grafica de espectro de absorción de FLG-DW

En ellas podemos observar claramente que tenemos una mayor absorbancia en las muestras más concentradas con clorina, es decir, el ensayo E4 con la concentración final de 0.9 mg/ml y el mejor

Tabla 2: concentraciones finales de grafeno

Tabla 3: concentraciones finales de óxido de grafeno

minutos a las cuales se les dio un baño de hielo para controlar la temperatura dentro de un procesador ultrasónico GEX 750, al terminar la sonicación se volvieron a tomar espectros y se depositaron en una centrifugadora SOLBAT J-40 durante 90 minutos a 500 revoluciones por minuto (RPM) a temperatura ambiente. Se lograron sedimentar las partículas más grandes así que con ayuda de una pipeta Pasteur se retiraron los sobrenadantes de los contenedores para ser filtrados a través de un sistema de vacío con una membrana PTFE con un tamaño promedio de poros de 0.1 µm y fueron lavadas con las soluciones blanco respectivas hasta desaparecer la señales de Ce6 en la solución. Se depositaron las membranas en una solución blanco de 10 ml para dispersar el FLG-Ce6 y GO-Ce6 obtenido y se sónicaron durante pocos minutos para lograr dispersarse los solutos en el medio líquido y retirar la membrana. Posteriormente se tomaron los espectros de absorción y de fluorescencia a longitud de onda de excitación de 404 nm y de emisión de 656 nm aproximadamente. Posteriormente se elaboraron las curvas de calibrado correspondientes para determinar las concentraciones de grafeno, oxido de grafeno y clorina en cada una de las muestras.


Las concentraciones finales de FLG-Ce6 asi como su aparencia se describen en la Tabla 2 y las de GO-Ce6 en la tabla 3. Los resultados de espectroscopia UV-Vis se obtuvieron de modo que las muestras fueron diluidas en 3 ml de blanco y se agregaron 3 µl de solución para obtener una buena señal. Los resultados de las muestras de FLG-Ce6 en PBS se muestran en la figura 1 en una gráfica de longitud de onda (nm) contra absorbancia (unidades arbitrarias) y las muestras con agua destilada se muestran en la figura 2.


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disolvente fue el agua destilada, los espectros de fluorescencia se tomaron en una emisión de 660 nm y los resultados se muestran en la figura 3 con una gráfica de longitud de onda (nm) contra fluorescencia (unidades arbitrarias), en ella se puede observar nuevamente que la alta concentración de clorina es vital para que la nueva molécula hibrida FLG-Ce6 indique una buena señal.

620 640 660 680 700

Fluo

resc

ence

(a.u

.)

Wavelength (nm)

E1-FLG-PBS E3-FLG-PBS E4 FLG-PBS E1-FLG-DW E3-FLG-DW E4-FLG-DW

Figura 3: grafica de espectro de fluorescencia de emisión de FLG

CONCLUSIONES En este trabajo se presentó la metodología para llevar a cabo la síntesis de dos nanomoléculas hibrido, la unión de la clorina e6 con el grafeno (FLG-Ce6) y el óxido de grafeno (GO-Ce6), y comprobando la presencia de ellas mediante distintos métodos de espectroscopia como UV-Vis y de fluorescencia. La respuesta de la clorina e6 fue la esperada, al funcionar como una molécula estabilizadora, las soluciones fueron fácilmente dispersanbles y homogéneas en agua, en donde a la la cantidad de grafeno y oxido de grafeno es de suma importancia, la respuestas espectroscópicas fueron mejoradas a su vez por la presencia de la clorina, esto dando la idea que el FLG-Ce6 sirve como una antena que capta las señales de energía lo cual da a conocer una muy posible aplicación en el campo de las energías.

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dimensión igual o menor a una millonésima de milímetro (Zhang et al, 2013). Pueden ser obtenidas a partir de diferentes elementos o compuestos químicos. Uno de los nanomateriales que puede revolucionar el mundo de la tecnología es el grafeno (Bernal et al, 2015). El grafeno es un solo plano atómico del grafito (Geim, 2009) siendo un material delgado, fuerte, resistente, de alta conductividad térmica y eléctrica, alta flexibilidad y dureza lo que le permite tener diversas aplicaciones, por ejemplo, en el área de la energía funciona en celdas solares, biosensores (Geng et al, 2010) y en el área de la biomedicina siendo útil para terapias fotodinámicas para el tratamiento del cáncer. Durante los últimos años se han descrito variedad de métodos para la obtención de las nanolaminas de grafeno, entre los que cabe resaltar la exfoliación mecánica empleando Disolventes Eutécticos Profundos (DEP) cuyas principales ventajas de éste, son la sencillez del proceso, ya que agitando una mezcla de grafito con el DEP se obtiene una dispersión homogénea de grafeno, además la elevada calidad del grafeno obtenido, ya que ninguna etapa del proceso implica una transformación química. Por otra parte, al adicionarle agentes oxidantes fuertes se puede producir oxido de grafito (GO), un material de carbono conductor hidrófilo (Higginbotham et al, 2009). El óxido de grafito en forma de láminas ha sido empleado para la fabricación de materiales muy resistentes y que recientemente han atraído la atención como una posible fuente de obtención de grafeno (Dreyer et al, 2010). El grafeno se puede obtener mediante la exfoliación química del grafito donde se puede producir en solventes orgánicos con diferente polaridad y en medios biocompatibles donde las interacciones de los enlaces π-π de las láminas de grafeno son tan fuertes que impiden su fácil exfoliación (Hernandez et al 2016). Las hojas de grafeno preparadas por este método muestran redes de carbono sp2 inalteradas (Geng et al, 2010). La Clorina e6 (Ce6) es una molécula fotoactiva con un núcleo porfirínico simple y que es estudiada tanto para Terapia Fotodinámica, celdas solares orgánicas y como agente intercalador para la producción de grafeno. Las propiedades fotofísicas de Ce6 se pueden ver drásticamente afectadas por fenómenos de agregación, ya sea por formación de puentes de hidrógeno o por hidrofobicidad. También pueden modificarse por la monomerización de sus moléculas por efecto del solvente. Por tanto es importante considerar la interacción solvente-soluto puesto que los solventes generan cambios en la distribución electrónica de los fotosensibilizadores (FS). En este proyecto se pretende exfoliar el grafito (FLG) el óxido de grafito (GO) en una solución buffer fosfato salino (PBS) y agua (DW) gracias a las interacciones físicoquímicas entre las hojas de carbón y la Clorina e6 (Ce6) como agente intercalador la cual sustituye el uso de solventes convencionales: dimethyl formamide (DMF) y N-methyl pyrrolidone (NMP), con elevados puntos de ebullición, tensión superficial y toxicidad, por el empleo de PBS y DW. Además, se expone un estudio comparativo basado en las características espectroscópicas de híbridos FLG-Ce6 y GO-Ce6, con él se pretende comprender las interacciones entre moléculas como Ce6 y algunos sistemas nanoestructurados como FLG y GO para simplificar e incrementar el desarrollo de nanohíbridos. METODOLOGÍA La metodología experimental se desarrolladó en el laboratorio de nanoestructurados multifuncionales dirigido por la Dr. Mildred Quintana del Instituto de Física de la UASLP cuyo objetivo es el desarrollo de nanohibridos a base de grafeno para aplicaciones en los rubros de energía y nanomedicina. Una de las aportaciones más representativas de este trabajo, es la utilización de Ce6 como agente intercalador para la eficiente exfoliación de grafeno. La exfoliación del grafito (FLG), oxido de grafito (GO) y Ce6 se llevó a cabo por medio de la ultrasonicación en dos diferentes solventes: agua desionizada

DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA ALMACENA-MIENTO DE ENERGIAS LIMPIAS. EXFOLIACIÓN DE GRAFITO Y OXIDO DE GRAFI-TO EN MEDIOS BUFFER FOSFATO SALINO Y AGUA DESIONIZADA POR CLORINA E6

1Facultad de Ingeniería, Universidad Mariana, Pasto, COLOMBIA; 2Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava 6, Zona Universitaria, 78290 San Luis Potosí, S.L.P,

MÉXICO; [email protected]; [email protected]; [email protected]

Muñoz Cabrera, A.1; Hernández Sánchez, D.2; Quintana, M.2

RESUMEN El grafeno es un nuevo material que puede revolucionar el mundo de la nanotecnología al ser una estructura bidimenisional de átomos de carbono fuertemente cohesionados en una superficie uniforme y estructura hexagonal, que le permite obtener numerosas propiedades para múltiples aplicaciones en energía, tecnología, electrónica, etc. El grafeno junto con la clorina, molécula fotoactiva y es un compuesto de la porfirina más importante y abundante, pueden formar una estructura altamente útil como material para celdas solares orgánicas y/o terapia fotodinámica. En este artículo se hace la exfoliación del grafito y oxido de grafito en dos medios: buffer fosfato salino y agua desionizada, y la Clorina e6 como agente intercalador, analizando las concentraciones finales tanto de la Clorina e6 como del grafito y oxido de grafito, además de controlar la cantidad de energía que pueden absorber y emitir mediante absorción en espectrofotometría UV-Visible y de fluorescencia. Palabras clave: Grafito, Oxido de grafito, Grafeno, Clorina e6.

ABSTRACT

Graphene is a new material that can revolutionize the world of nanotechnology to be a bidimenisional structure of carbon atoms strongly cohesive on an uniform surface and a hexagonal structure, which allows its to get numerous properties and characteristics being suitable for many applications in energy, technology, electronics, etc. Graphene with chlorine, a photoactive molecule that is by far the most important and abundant porphyrinoid type compound, they can form a highly useful structure as material for organic solar cells and/or photodynamic therapy. This article presents the exfoliation of graphite oxide and graphite in two media: phosphate buffered saline and deionized water, analyzing the final concentrations of both chlorine e6 as graphite and graphite oxide, in addition to controlling the amount of energy that can absorb and emit by absorption spectrophotometry UV-visible and fluorescence. Key words: Graphite, Graphite Oxide, Graphene, Chlorine e6,

INTRODUCCIÓN

Los nanomateriales han acaparado el interés de la investigación científica de las últimas dos décadas dando lugar al advenimiento de una nueva rama del saber científico: la nanotecnología (Rodríguez y Vasilievna, 2008). Nanomateriales es el nombre genérico con que se designa a las partículas de una


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El espectro de absorción de Ce6 presenta un pico intenso a ̴ 400 nm (banda de Soret) y dos bandas Q alrededor de ̴ 500 y ̴ 656 nm mientras que el FLG y GO absorben a ̴ 230 y ̴ 660 mn respectivamente. Una de las principales evidencias de interacción entre los materiales son los cambios en las longitudes de onda de la absorción y aparición de nuevas señales, una segunda evidencia de su interacción es la disminución en la intensidad de fluorescencia de Ce6 una vez anclada a FLG y GO. La longitud de onda de excitación de las muestras fue a ̴ 404 nm y la longitud de onda de emisión fue a ̴ 656 nm. La interacción entre los materiales puede ser por interacciones π-π, puentes de hidrogeno e hidrofobicidad. Las figuras 1 y 2 muestran una muestra representativa del espectro de absorción UV-Vis de FLG en el medio PBS y DW.

Figura 1. Espectro UV-vis de los ensayos con

FLG en el medio PBS después de lavado

Figura 2. Espectro UV-vis de los ensayos con

FLG en el medio DW después de lavado

Respecto al espectro de fluorescencia, la figura 3 indica que cuando la Clorina e6 se encuentra libre, es decir, sin FLG tiene mayor emisión que cuando se encuentra anclada al hibrido

Figura 3. Espectro de fluorescencia representativo

de muestra con FLG y Clorina e6 libre en medios PBS y DW.

Figura 4. Imagen TEM de óxido de grafito (GO) con Clorina e6 en el medio de agua

desionizada (DW).

Hernández et al (2016) señalaron que el espectro de absorción UV-vis tomado antes de exponerlas a 45minutos de exfoliación obtuvo una mayor absorción y emisión de señales para la muestras de DW en FLG y GO, mientras que después de los 45 minutos de exfoliación la alta absorción y emisión de señales

(DW) y buffer fosfato salino (PBS) a diferentes concentraciones de cada reactivo presentadas en la tabla 1 partiendo de una solución stock de Ce6 en metanol (5 mg/ml). En cuatro series de experimentos realizados de manera independiente donde en cada ensayo se incluyeron grupos de control libres de FLG/GO como se muestra en la tabla 2. Los grupos control de Ce6 libres de FLG/GO recibieron el mismo tratamiento de ultrasonicación en PBS y DW. Tabla 1. Concentraciones iniciales de cada ensayo

CONCENTRACIONES INICIALES (mg/ml)

Nanohíbrido (FLG-Ce6/ GO- Ce6

Grafito/ GO (mg/ ml)

Clorina e₆ (mg/ ml)

E1 0.1 1

E2 1 0.20

E3 1 1

E4 1 5

Nanohíbrido final

FLG-Ce₆ GO- Ce₆

PBS (DW) PBS (DW)

Tabla 2. Control de Clorina e6 Ce6

Ensayo 1 y 3

2 ml stock y 8 ml PBS

2 ml stock y 8 ml DW

Ensayo 2 400 µl stock y 9,6 ml PBS

400 µl stock y 9,6 ml DW

Ensayo 4 5 ml stock y 5 ml PBS

5 ml stock y 5 ml DW

Una vez preparadas las dispersiones como se ha especificado, se tomaron los espectros de absorción UV-Visible y de fluorescencia (λExc ̴ 404 nm/ λEm ̴ 655 nm), de cada una de las dispersiones (3 µl de muestra/ 3 ml de blanco), inmediatamente después de haber sido preparadas, incluyendo sus respectivos blancos/controles para la extracción de la línea base. Para la obtención de FLG-Ce6 se ultrasonicaron las muestras durante 45 minutos ininterrupidos en un procesador ultrasónico GEX 750, añadiéndole hielo dentro del ultrasonicador constantemente para evitar el aumento de la temperatura. Para la obtención de GO-Ce6, las muestras se dejaron bajo agitación magnética constante durante 18 horas y protegidas de las luz a temperatura ambiente. Terminados ambos procesos (ultrasonicación y agitación magnética), se procedió a lavar las muestras por centrifugación a 500 RPM durante 90 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se filtraron con sistema de vacío con una membrana PTFE con ≤0,1µ de tamaño hasta desaparecer la señal de Ce6 en la solución filtrada. La membrana con las muestras se resuspendieron en 10 ml de su respectivo solvente. Se tomaron nuevamente los espectros de absorción UV- visible y fluorescencia del sobrenadante lavado. Por último, se realizaron las curvas de calibración con el fin de determinar las concentraciones finales tanto de Ce6 como de FLG y GO.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las muestras se caracterizaron por espectroscopia Ultravioleta-Visible (UV-Vis) y de fluorescencia antes y después de exfoliación para evaluar la interacción entre los materiales, ya que son las técnicas más simples para estudiar las interacciones “soluto-solvente”. Estas interacciones se interpretan por cambios de posición de las bandas de absorción o emisión que se producen al cambiar la polaridad del solvente. A estos cambios se les conoce como solvatocromismo y dependen de la estructura electrónica del FS y de las moléculas del solvente (Shubhajit et al., 2013).


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La figura 4 muestra una representación de las muestras caracterizadas por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) donde se identifica la morfología y estructura del óxido de grafeno y Clorina e6 en el medio de agua desionizada.

CONCLUSIONES La metodología y materiales utilizados para este proyecto resulto ser asequible y sencilla. La exfoliación directa mediante ultrasonicación del grafito y oxido de grafito en medios adecuados ayudaron a estabilizar las muestras con Ce6. Las interacciones entre FLG y Ce6 se basaron en la sinergia de sus fuertes interacciones π-π no covalentes y las interacciones entre GO y Ce6 ocurrieron gracias a que los átomos de carbono oxidado contribuyeron en la estabilización hibrida por la formación de enlaces de hidrogeno. El análisis de las gráficas muestra un resultado que puede ser utilizado para la aplicación del grafeno con clorina en energía y terapias fotodinamicas.

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fue de la muestra de PBS para FLG y GO, la máxima emisión de FLG-Ce6 en DW paso de 661 nm a 652 nm.

Figura 5. Imágenes representativas de la dispersabilidad y estabilidad de los nanohibridos (a) FLG-Ce6 y (b) GO-Ce6. Así como las concentraciones finales de FLG, GO, Ce6 de cada uno de los

nanohibridos, (c) Dispersiones control de Ce6 libres de FLG/GO que recibieron el mismo tratamiento de ultrasonicación en PBS y DW

La figura 5 muestra las concentraciones iniciales y finales de Ce6, FLG y GO donde se hace evidente la reducción de la presencia de moléculas en el solvente debido al lavado de las muestras. Las concentraciones FLG fueron calculadas de la calibración de las curvas a 660 nm con la aplicación de la ley de Lambert-Beer teniendo en cuenta la longitud de onda y la longitud de celda en PBS y DW con 0,005 y 0,1 mgml-1 respectivamente para el ensayo 3 y para GO fueron 0,1 mgml-1 en ambos medios. Hernandez (2016) indica unas concentraciones de 0,004 y 0,007 mgml-1 con las mismas concentraciones iniciales de este ensayo para PBS y DW respectivamente, además señala que las concentraciones de GO fueron calculadas a una longitud de onda de 227 nm en DW y PBS con 0,007 y 0,011 mgml-1 respectivamente. La mayor presencia de grafeno se da para FLG-Ce6 en medio DW y para GO-Ce6 en ambos medios pero con mayor presencia de Ce6 en el medio DW.

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sí o envían hacia el medio; también estudia el análisis del tiempo en conjunción con el espacio, la trayectoria que describe un objeto determinado, entre otras cosas más. El lenguaje de la física son las matemáticas, la cual es un lenguaje muy adecuado para poder describir los fenómenos o modelos ideales que se plantean en diversas teorías físicas. Una ley física es universal, por eso se busca crear modelos por los cuales su comportamiento sea aplicable a cualquier entorno y a su vez sea predecible y comprobable tanto teórica como experimentalmente.

MARCO TEORICO

Al observar la naturaleza, podemos encontrar diferentes tipos de estructuras, las cuales pueden ser ordenadas en diferentes grupos según sus peculiaridades. Hasta la fecha, se han detectado 16 tipos de estructuras que a su vez pueden ser integradas por sus características en grupos más generales.

Estructura recta: Convergen a un eje central; expanden sus ramificaciones con un ordenamiento lineal; se pueden expandir en cualquier dirección siguiendo sus lineamientos de composición. 1. Estructura lineal: Es una de las estructuras más elementales que existen. Este tipo de

estructura se compone por pequeños puntos o líneas unidas desde sus extremos, no siendo necesario que sea una recta horizontal exacta. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: la lluvia, un cometa, etc.

2. Estructura espina: Presenta en su ordenamiento una serie de púas que son aglomeradas a lo largo de un eje central lineal. Sobre la base, están orientadas y agrupadas todas y cada una de las astillas que conforman esta estructura. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las espinas magnéticas, los copos de nieve, etc.

3. Estructura ramificada: Tiene tres partes fundamentales, la primera es una base; ésta es la parte más gruesa donde se concentra la máxima cantidad de energía. La segunda parte son las ramas, ésta es una sección secundaria la cual contribuye a extender y distribuir la energía concentrada desde el origen. La tercera parte son las puntas; éstas son las líneas extremas que delimitan los bordes de esta estructura. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: rayos, los indicios de ríos ya inexistentes en Marte, etc.

4. Estructura crucial: Esta compuesta por dos ejes en un comienzo lineales, los cuales se intersecan generalmente por en medio, como una cruz, al unirse los ejes generan un punto central donde ambos coinciden. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: el choque de dos partículas subatómicas, las imágenes interpretadas de un Quasar, etc.

5. Estructura radial: Tiene un núcleo central donde parte su inicio; este origen puede ser un punto de cualquier forma, generalmente redondo, del cual a partir de éste se incrementa periódicamente el tamaño de sus brazos que se proyectan hacia fuera. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las explosiones radiales de los fuegos artificiales, el sol, etc.

Estructura curva: Pudieran estar generadas de adentro hacia afuera, así como también desde afuera hacia adentro; normalmente el punto central podría estar en el centro de su figura, o podría estar ubicado hacia uno de los bordes de manera equidistante. 6. Estructura concéntrica: Tiene dos elementos esenciales, el primero es un núcleo que se ubica

inicialmente en el centro de la estructura, y el segundo es una serie de circunferencias que envuelven su eje de origen. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: los anillos de Newton, los anillos de Saturno.

7. Estructura espiral: La conforma una curva bi-dimensional o tri-dimensional que es generada a partir de un punto central, desde el cual su tamaño va aumentando gradualmente. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: una galaxia, colisión de partículas, etc.

CONCEPTOS DEL DISEÑO DESDE LAS CIENCIAS

1Universidad Autónoma de Zacatecas, Unidad Académica de Física; Calzada Solidaridad, Hidráu-lica, C.P:98068, Zacatecas, Zacatecas, [email protected]; 2Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Facultad Del Hábitat; Niño Artillero 150, Zona Universitaria, C.P:78290, San Luis

Potosí, San Luis Potosí, [email protected]

Ortega Guzmán, R. J.1; García Santibáñez Saucedo, H. F.2

RESUMEN Este proyecto de investigación, se centra en el estudio de estructuras encontradas en la naturaleza, a partir de un estudio relacionado con las ciencias básicas, en específico la física. El estudio de las estructuras se enfoca en el análisis y la interpretación de datos, para poder darle una explicación cualitativa y que permita entender cómo es que se forman diversos tipos de estructuras y cómo se llegan a repetir otras organizaciones en diferentes campos usando conceptos de la física, sean éstas leyes y principios. Uno de los objetivos principales de este proyecto, es entender la formación y la diversidad de estas estructuras que se encuentran en la naturaleza.

ABSTRACT This research project focuses on the study of structures found in the nature, from a study related to basics sciences, specifically physics. The study of structures focuses on the analysis and interpretation of data, in order to give a qualitative explanation and seek an explanation of how is that different types of structures are formed and how they come to repeat other structures in different fields using concepts of physics, such as laws and physics principles. One of the main objectives of the project is to understand the formation and diversity of these structures found in nature. Palabras Clave: Estructura de la Naturaleza, Física de las Estructuras

INTRODUCCION El hombre en su afán de entender la belleza y perfección de la naturaleza, ha intentado por medio de las ciencias comprender cómo funciona y qué es lo que genera tal perfección. El estudio de la naturaleza nos demuestra que existe un orden regido por leyes, el cual el hombre va descubriendo a través de las ciencias exactas. Este orden natural se realiza por la armonía, que es la adecuada relación entre las partes con el todo. Para estudiar las estructuras en la naturaleza, es importante abordar el campo de la física. El objeto de estudio de esta ciencia es la investigación de la materia. La física analiza las distintas cualidades y propiedades de la materia, como también los factores que puedan generarle una modificación. Otro objeto de estudio de la física, es la energía y los intercambios energéticos que las distintas materias realizan entre


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Estructura alterable: Presentan una configuración inestable; exhibe lineamientos que inducen a pensar que está en movimiento constante; la fuerza del movimiento se manifiesta en la intensidad que presenta la parte mayor, contrastada con la parte menor que va desapareciendo. 16. Estructura mutable: Este no presenta un orden aparente, prevalece prioritariamente el

desorden o el caos. Se presenta principalmente en materiales con un estado líquido o gaseoso. Algunos indicios de estructuras que la forman en diferentes periodos pueden ser la estructura abombonada, meandro, e incluso lineales. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: mancha de tinta, la nebulosa Sagitario, etc.

Los seres humanos siempre nos hemos preocupado por buscar las leyes que rigen la evolución del mundo que nos rodea. Es así como se ha establecido un conjunto de relaciones que nos permiten predecir el futuro de un sistema si se tiene información confiable sobre su estado presente o pasado. Estas reglas que señalan a cada sistema el camino a seguir, se denominan deterministas y pueden ser simples o complejas; de ellas se espera una capacidad predictiva. Es importante la clasificación de estructuras que vimos anteriormente, debido a que nos abre el camino para estudiarlas por medio de sus características y buscar algunas reglas o leyes que nos permitan explicar el comportamiento de éstas. Para comprender cómo se generan las estructuras de la naturaleza desde la física, es necesario identificarnos con algunas reglas utilizadas por esta ciencia. El primero es el principio de mínima acción, el cual hace referencia al paradigma que indica que “Todo cuerpo sigue una trayectoria que minimiza su dinamismo, cuya acción es la menor de todas las posibles”. Otro concepto importante es el principio de conservación de la energía. El enunciado de este paradigma indica que: “En un sistema sobre el que no se realiza trabajo exterior alguno, la energía mecánica del mismo debe permanecer constante“. Es de suma importancia delimitar el sistema y clasificar las fuerzas como exteriores o interiores así como considerar si realizan o no algún trabajo cuando este sistema evoluciona. También es importante clasificar las fuerzas en conservativas y disipativas. Cuando no es posible obtener información confiable sobre el estado presente o pasado de un sistema, nos hace perder la capacidad de predecir el futuro a largo plazo ya que es un verdadero desastre. El caos, y el problema fundamental radica en la estructura de las ecuaciones deterministas que le corresponden a cada sistema. Esto nos lleva a un sistema caótico, el cual resulta impredecible porque es extraordinariamente sensible a la especificación de las condiciones iniciales a partir de las cuales se quiere estudiar su evolución, cualquier pequeño cambio en el estado inicial tiene dramáticos efectos sobre el comportamiento futuro. Para predecir el fenómeno se necesitaría conocer los datos iniciales con precisión infinita, así como un control extremo del proceso; esto es muy complicado, independientemente de qué tanto logremos mejorar nuestros aparatos de medición y control, y de qué tan bien conozcamos las relaciones matemáticas que rigen su comportamiento. Otro de los temas relativamente nuevos que nos ayudan a entender la formación de las estructuras en la naturaleza son los fractales. En el año de 1975, el matemático polaco Benoit Mandelbrot denominó fractales al conjunto de formas que, generadas normalmente por un proceso de repetición, se caracterizaban por presentar detalles repetitivos en cualquier escala de manera infinita, al exhibir dimensiones fraccionales que no eran muy diferentes entre sí. Cabe destacar que los fractales que existen en la naturaleza tienden a ser irregulares y son autosimilares sólo en sentido estadístico; esto es, si tomamos un conjunto suficientemente grande de objetos de la misma clase y amplificamos una porción de alguno de ellos, es posible que no sea idéntico al original, pero seguramente sí será similar a algún otro miembro de la colección. Su dimensión es fraccional pero se obtiene realizando promedios sobre sus valores en muchas regiones y para muchos cuerpos del mismo tipo. Cuando se amplifica una de las partes de un fractal natural, la propiedad de generar la misma figura, o alguna similar, tiene límites inferiores y superiores.

Estructura modulada: Exponen en su ordenamiento compositivo configuraciones geométricas bien definidas; puede variar la cantidad de sus componentes, aunque se identificarán fácilmente por exhibir una serie de formas similares; todas ellas se encuentran organizadas dentro de una retícula que orienta, promueve y limita su expansión siguiendo siempre un mismo patrón, etc. 8. Estructura modular: Se repite permanente el elemento base constituido como módulo, tanto a

lo ancho y largo de su superficie. Este modelo se replicará de manera constante, manteniendo una misma forma, tamaño, proporción, color, textura, material. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las gotas de agua en un vidrio, las esférulas marcianas, etc.

9. Estructura fractal: Es un ordenamiento apoyado en una porción regular o irregular de una figura geométrica, la cual es repetitiva múltiples veces en su forma y en ocasiones en diferente proporción. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: el fuego común, los cráteres presentes en la cara de la luna, etc.

10. Estructura ahuecada: Tiene una extensa multiplicación de agujeros que cubren en gran medida la superficie que el fenómeno constituye, producidos por acciones de gases que se encontraban de manera interna en el material exhibido, así como también por la acción de alguna fuerza que erosiona el material más suave donde se encuentra. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las moléculas de nanografeno, el meteorito Willamette, etc.

11. Estructura de red: Tiene una serie de divisiones que poco a poco van apareciendo con forma de grietas a semejanza de brechas o llagas, las cuales enfatizan un deterioro de la superficie donde se presenta. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: la textura exterior de los craquelados de vasijas, el fondo del cráter Victoria en el planeta Marte, etc.

Estructura ondular: se forman de líneas curvas; algunas de ellas se entrelazan y otras más se desvanecen; su misma orientación indica la dirección con que se desplaza su movimiento; es difícil encontrar una línea recta en estas estructuras. 12. Estructura de ADN: Proviene de la configuración organizativa que presentan los espirales

que la conforman, derivado de la estructura que presenta el acido desoxirribonucleico. Ésta presenta dos ejes en espiral entrelazados. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: turbulencias generadas por una hélice dentro del agua, nubes con forma de ADN, etc.

13. Estructura meandro: Sigue una dirección imprecisa, donde los extremos de su guía principal no encausan la orientación que sigue prioritariamente. La estructura continúa una línea sinuosa, no recta, formada por múltiples curvas. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las formas generadas por el humo, las formas sinuosas de las auroras boreales, etc.

14. Estructura abombonada: Tiene globoides compenetrados entre ellos que le confieren al conjunto, un volumen acolchonado y abultado en muchas aéreas de su espacio. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: las burbujas de jabón, las nubes mamatus, etc.

15. Estructura plasma: los hilos que se generan en este ordenamiento, no presentan una dirección constante de todos sus componentes. Se puede observar que los extremos son ligeramente más amplios que en su parte central, como si estos destellos no desearan salir del núcleo con forma de bola que los ha originado. Algunos fenómenos en la naturaleza que presentan este tipo de estructura son: la esfera de cristal que proyecta ases de plasma, la red generada por neuronas, etc.


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METODOS Y MATERIALES El proceso que se siguió para poder desarrollar el problema al que nos enfrentamos al estudiar las diversas estructuras que se presentan en la naturaleza, fue por medio de la consulta de numerosas fuentes, se consultaron libros, artículos en internet y por medio del análisis de videos y documentales. Por medio de estas herramientas se buscó interpretar y analizar algunas leyes científicas, así como algunos principios para estudiar y comprender las bases matemáticas y teóricas que permitan explicar cualitativamente el origen de algunas estructuras que se encuentran en la naturaleza.

RESULTADOS Al revisar con mayor detenimiento cada uno de los cinco grupos generales de estructuras, encontramos que todas obedecen al principio de mínima acción, esto quiere decir que se minimiza la energía que se desplaza a través de los diferentes tipos de estructuras. La forma de cada estructura se debe a la manera en que la energía se manifiesta en cada fenómeno hasta que la energía del sistema llega al equilibrio. Sin embargo, la forma de la estructura no depende sólo de la energía, existen otros factores como lo son los elementos ambientales, los distintos átomos, las condiciones iniciales, en otras palabras, fuerzas interiores y fuerzas exteriores. Al analizar los diferentes tipos de estructuras que se han encontrado en la naturaleza, encontramos que algunas estructuras pertenecen a la rama de los fractales. Estas estructuras son la de red, plasma, meandro, espina, modular, ramificada y mutable, ya que pertenece a la geometría fractal. Cabe destacar que los fractales encontrados en este tipo de estructuras, tienden a ser irregulares así como auto similares. Un ejemplo sobre cómo el caos puede actuar en los diversos tipos de estructuras, es en la estructura de plasma donde encontramos una nube cirrus tenue, en la estructura abombonada donde están las nubes mammatus, y en la estructura ADN donde se identifica una nube en forma de doble hélice. Ante esto podemos decir que es claro que el entorno puede ser similar, pero con un pequeño cambio en las condiciones iniciales nos puede generar diversos tipos de estructuras. En este caso una nube puede tener 3 o más estructuras.

CONCLUSIONES Toda estructura natural obedece al principio de acción sin importar lo compleja que ésta sea. Existen estructuras en la naturaleza que son más complejas que otras, muchas de ellas se forman a partir de estructuras básicas que se combinación entre ellas. Para predecir el comportamiento de una estructura es necesario conocer las condiciones iniciales y las leyes que interactúan en el entorno, si no se disponen de leyes apropiadas o si no se pueden averiguar las condiciones iniciales, las predicciones se desmoronan. Por esta razón, es importante apoyarse en otras ramas de la ciencia, como la química, la geología, o la biología, las cuales nos brindaría con su estudio condiciones iniciales con mayor exactitud para obtener un resultado más preciso. Otra de las herramientas que nos serían de ayuda para esta investigación es el uso de supercomputadoras. Éstas nos permiten simular modelos con condiciones iniciales deseables, aunque esto sólo comprobaría las predicciones teóricamente. Es importante el estudio sobre los fractales. El conocimiento sobre las reglas básicas de la geometría fractal está revolucionando nuestras concepciones sobre las formas y su imagen, gestación y crecimiento, dándonos nuevas herramientas para descifrar algunas de las claves por las cuales se rige la naturaleza de ese modo. También es importante el estudio de la teoría del Caos, pues ésta parece estar en todos lados, desde la columna de humo de un cigarrillo, o en el movimiento de los automóviles, en astronomía, etc., donde nos haría pensar que más que aclarar los misterios de la naturaleza, nos dirige hacia el misterio con que ésta está generada. Sólo atreviéndonos a investigar, reflexionar, experimentar y comprobar, podremos encontrar una explicación lo más cercana posible a la verdad con la naturaleza se envuelve.


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with a pH 3 during one hour. Chromium quantification was performed according to the NMX-AA-044-SCFI-2014 Standard. The obtained results show that the QT and QT / PVA adsorbents were those with the highest percentage of adsorption, 29% and 34% respectively. Regarding the nanocomposites, the QT / PVA / NTC combination had the lowest adsorption percentage with only 6.25% due to the fact that the addition of clay slightly reduces the adsorption capacity of the nanocomposite QT/NIPA/MMT-Na+ but provides greater stability and therefore increases the life of the adsorbent. Key Words: Adsorption, Chromium VI, Chitosan, N-Isopropylacrylamide, Montmorillonite.

INTRODUCCIÓN Una de las formas más común para la obtención de agua, ya sea para uso doméstico, industrial, agrícola, etc; siempre ha sido por medio de la perforación de pozos, los cuales permiten acceder a ésta, que se ha filtrado hacia el subsuelo y que es relativamente limpia. Lamentablemente debido al uso constante de algunos metales en la industria, como lo es el cromo, que es usado en pinturas, soldaduras, y en una gran parte de la industria metal-mecánica, los mantos acuíferos se han ido contaminando de éstos con el tiempo. La contaminación por cromo hexavalente que se ha dado en algunos de los mantos acuíferos, se debe principalmente a una característica de este metal, que es su alta solubilidad en el agua. La alta solubilidad del cromo en agua propicia que éste se filtre muy fácilmente usando al agua como conducto hacia los mantos freáticos. Esto es un grave problema ya que una gran cantidad del agua de uso común en todos los sectores proviene del subsuelo. El cromo hexavalente en particular es un grave problema para la salud pública ya que la interacción con este metal puede ocasionar desde lesiones cutáneas hasta cáncer, y en casos extremos la muerte. Ya que el cromo se ha convertido en un problema, se ha buscado la manera de removerlo del agua para consumo hasta el límite admitido por la secretaria de salud pública (.05ppm), sin embargo, cuando éste se encuentra en bajas concentraciones es difícil hacerlo, por lo que se ha optado por adsorción como método de remoción. La ventaja de la adsorción para remover metales pesados del agua es que ésta puede remover de bajas hasta muy altas concentraciones del metal.

MARCO TEORICO La adsorción es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en la superficie de un material. Cuando el lecho del material adsorbente está casi saturado, el flujo se detiene y el lecho se regenera térmicamente o por otros métodos, de modo que ocurre una desorción. Así se recupera el material adsorbido (adsorbato) y el adsorbente sólido queda listo para otro ciclo de adsorción. Los adsorbentes suelen tener forma de pelotitas, pequeñas cuentas o gránulos cuyo tamaño va de cerca de 0.1 mm a 12 mm, y las partículas más grandes se usan en los lechos empacados. Una partícula de adsorbente tiene una estructura muy porosa, con numerosos poros muy finos, cuyo volumen alcanza hasta el 50% del volumen total de la partícula. La adsorción suele ocurrir como una mono-capa sobre la superficie de los poros, pero a veces se forman varias capas.

ADSORCION DE CROMO HEXAVALENTE POR MEDIO DE ADSORBENTES NO COMERCIALES

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Departamento de Mate-riales, Instituto Tecnológico Superior de Irapuato, Carretera Irapuato - Silao km 12.5, Col. El Copal,

Irapuato, Gto., MÉXICO; [email protected]

Ortiz Anaya, I.1; Calixto Olalde, M. E.2

RESUMEN El cromo es un metal pesado que debido a su aplicación a nivel industrial en diversas áreas como; pinturas, soldaduras, y en una gran parte de la industria metal-mecánica, ha provocado un incremento en los mantos acuíferos con el tiempo, por lo cual se buscan diferentes formas de llevar a cabo su remoción del agua, por esta razón en este proyecto se realizó la preparación de materiales adsorbentes en forma de perlas de 3-5 mm mediante redes poliméricas interpenetradas QT/PVA, QT/NIPA y los nanocompósitos QT/NIPA/MMT-Na+ y QT/PVA/NTC. Estos materiales adsorbentes fueron secados por liofilización. La adsorción de Cr (VI) se realizó utilizando una solución de Dicromato de potasio de 500 ppm. Se utilizaron en la adsorción 0.025 g de perlas en un volumen de 12.5 mL, a un pH 3 durante una hora.La cuantificación de cromo se realizó utilizando la Norma NMX-AA-044-SCFI-2014. Los resultados obtenidos indican que los materiales adsorbentes de QT y QT/PVA fueron los que presentaron mayor porcentaje de adsorción 29 y 34% respectivamente. En lo que respecta a los nanocompósitos la combinación QT/PVA/NTC presentó el menor porcentaje de adsorción que fue de tan solo el 6.25%, esto ya que la incorporación de arcilla disminuye ligeramente la capacidad de adsorción del nanocompósito QT/NIPA/MMT-Na+ pero otorga mayor estabilidad y por ende aumenta la vida útil del adsorbente. Palabras Clave: Adsorción, Cromo VI, Quitosano, N-Isopropilacrilamida, Montmorillonita

ABSTRACT

Chromium is a heavy metal in which its application at industrial level, such as paints, welds, and a great part of metal mechanic industry, has increased its presence within groundwater over time. It is for this reason that different ways of carrying out its removal of water are sought and for this project was performed the preparation of 3-5 mm bead shaped adsorbent materials through QT/PVA, QT/NIPA interpenetrated polymer networks and QT/NIPA/MMT-Na+ y QT/PVA/NTC nanocomposites. These adsorbents were dried by lyophilization. Cr (VI) adsorption was carried out using a 500 ppm potassium dichromate solution. The adsorption took place using 0.025 g of beads in a volume of 12.5 mL


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Figura 2. Curva de calibración para cromo

hexavalente.

Figura 3. Estándares utilizados en la curva de

calibración.


Se obtuvieron cinco diferentes materiales adsorbentes basados en quitosano e incorporando PVA o NIPA para formar la red polimérica interpenetrada y como agentes reforzantes nanotubos de carbono y montmorillonita. Se pudo observar que la presencia del PVA disminuyó la fragilidad de las perlas obtenidas, mientras con lo que respecta a los nanocompósitos la fragilidad de las perlas fue mayor en las que se utilizaron los NTC como reforzante observándose también un incrementó en su estabilidad dimensional con la incorporación de la montmorillonita. En lo que respecta a la adsorción, las perlas sufren un cambio de coloración, como puede observarse en las figuras 4 y 5.

Figura 4. Perlas adsorbentes antes de someterlas al proceso de adsorción.

Figura 5. Perlas adsorbentes después de someterlas al proceso de adsorción.

En la figura 6 se muestran los resultados obtenidos únicamente para la adsorción a una hora bajo las condiciones establecidas, encontrándose que las redes interpentradas de QT/PVA y de QT son las que

Figura 1. Estructura ampliada de una perla adsorbente.

METODOLOGIA

Preparación del adsorbente: La preparación del adsorbente fue realiza por medio de redes poliméricas interpenetradas secuenciales y su obtención en forma de perlas por coacervación en NaOH 1.5M. Para la preparación de los materiales adsorbentes en forma de perlas se utilizó un volumen final de solución de 15 mL, el quitosano (QT) al 98% se disolvió en una solución de ácido acético al 2%. El orden de adición de los reactivos fue el siguiente; en el volumen especificado anteriormente se adicionó N-isopropilacrilamida (NIPA) al 0.35M y N-N-Metilen-bis-acrilamida (1%) como agentes de entrecruzamiento, la solución resultante se mantuvo en agitación hasta la completa disolución de los componentes, para posteriormente adicionar en pequeñas fracciones el quitosano, continuando con la agitación durante 30 minutos. Después de éste tiempo se adicionaron 3.1 mg de persulfato de amonio como iniciador y 18 microlitros de N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina como acelerador de la reacción. Después de medio minuto de agitación vigorosa, la suspensión se goteo sobre una solución de NaOH 1.5M la cual permitió formación de las perlas y en ella se mantienen durante 24 h. Finalmente las perlas se retiran de la solución de NaOH y se lavan hasta pH neutro. Las perlas húmedas son entrecruzadas con glutaraldehído al 0.5% durante 1 h. El secado de las perlas se realizó mediante liofilización. En el caso de los nancompósitos con nanotubos de carbono (NTC), estos fueron incorporados en la solución ácida manteniéndose en agitación mecánica para favorecer su dispersión y la secuencia de preparación a partir de esto es igual a la antes mencionada. Para las perlas con PVA, éste polímero se disuelve en agua a 80°C durante una hora y ya frío se incorporara en lugar de la NIPA posterior a esto la secuencia es la misma mencionada. Proceso de adsorción: La adsorción de Cr (VI) se realizó utilizando una solución de Dicromato de potasio. La concentración utilizada fue de 500 ppm. Se utilizó 0.025 g de perlas en un volumen de 12.5 mL, a un pH 3 durante 75 minutos y una agitación de 200 rpm. Cuantificación de Cromo: Para realizar la determinación de la cantidad de cromo hexavalente que las perlas adsorbentes fueron capaces de retener, se realizó bajo la norma NOM NMX-AA-044-SCFI-2014 en un espectrofotómetro UV-Vis Cary®50 con luz de Xenon, obteniéndose como resultado una curva de calibración de cromo VI con coeficiente de correlación lineal de 0.999421253 como se muestra en la figura 2.


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más adsorben en mayor porcentaje. Se considera que el PVA favorece la difusión del adsorbato hacia el adsorbente.

Figura 6. Porcentaje de adsorción con respecto a cada adsorbente.

CONCLUSIONES

Todos los adsorbentes fabricados han probado tener la capacidad de retener al cromo VI dentro de su estructura porosa, sin embargo entre más entrecruzado está el material mayor es la disminución de la capacidad de adsorción de éste. A pesar de disminuir la capacidad de adsorción al entrecruzar el material, también se observó una mayor estabilidad de éste, es el caso de QT/NIPA/MMT. Una excepción a lo antes dicho es el caso de QT/PVA, que a pesar de estar entrecruzado aumentó su capacidad de adsorción al igual que su estabilidad. También es importante considerar que el incremento de la fragilidad con la incorporación de los NTC puede atribuirse a una no homogénea dispersión en la matriz, por ello es que se incrementa la fragilidad, es importante que en la optimización de la composición se considere la incorporación de algún agente surfactante o bien modificar la composición de PVA o incorporarlo en los nanocomoósitos. Se sabe de diversos estudios que se han realizado en otras investigaciones, que la capacidad de adsorción de un material depende de varios factores tales como; composición química del material adsorbente, relación gramos de adsorbente/volumen de disolución (mL), concentración de la solución a adsorber, pH principalmente yes importante considerarlo al comparar con otros trabajos, ciertamente los resultados obtenidos en este trabajo darán la pauta para buscar condiciones que favorezcan el incremento en la capacidad de adsorción de cromo del material adsorbente así como su reutilización, lo cual resulta fundamental para que se vuelva un proceso sustentable. Es importante resaltar el efecto que tiene el uso de la interpenetración para la modificación de propiedades, en esta trabajo se pudo observar que el PVA disminuye la fragilidad con respecto al QT puro y que la incorporación de agentes de reforzamiento pueden no ser favorable en cuanto al incremento en la fragilidad, como fue el caso de los NTC.

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de oxígeno, ventanas inteligentes, displays electroquímicos, filtros UV, y catálisis. Para las aplicaciones anteriores, se utilizan con mayor frecuencia películas delgadas de CeO2 debido a su flexibilidad de uso, consideraciones de costo y facilidad de preparación. Las películas delgadas de CeO2 pueden ser preparadas por varias técnicas, incluyendo spray pirolisis, deposición por láser pulsado, sputtering, y spin coating. Éste último es una de las técnicas más ventajosas debido a su versatilidad, eficiencia y factibilidad. Por otra parte, el proceso se puede realizar en condiciones ambientales y por lo tanto un sistema de vacío no se requiere. En el presente trabajo se pretende sintetizar películas delgadas de CeO2 con etanol debido a su bajo costo en comparación con el metanol. Así mismo, se pretende elegir el mejor solvente para su uso en la síntesis de películas delgadas de GDC, misma que se usará para hacer uniones n-p con Si por el método físico de sputtering RF en trabajos futuros.

MÉTODOS Y MATERIALES Para la solución precursora de la síntesis de películas delgadas de CeO2 se utilizó cloruro de cerio heptahidratado (CeCl3·7H2O) disuelto en etanol y metanol con agitación magnética. Para la reparación de esta disolución se utilizaron 5 mL del disolvente. La disolución de cloruro de cerio heptahidratado y disolvente se agitan por cinco minutos y posteriormente se agrega el ácido cítrico –de igual manera se pone en agitación magnética- para obtener las concentraciones requeridas. La metodología se comparó con la que reporta Channei D. et. al.Estas disoluciones se guardan en viales y se dejan reposar por un día. El orden de las muestras se aprecia en la siguiente tabla:

Tabla 1. Muestras de películas delgadas de CeO2 a diferentes concentraciones y empleando distinto disolvente.

Muestra Concentración (M) Disolvente

1 0.4 Metanol 2 0.4 Etanol 3 0.3 Etanol

Se realizó spin coating (Laurell WS-65023) depositando rápidamente ~0.1 mL (cinco gotas consecutivas) de la disolución sobre un sustrato de hastealloy C2761. El equipo se programó a 2400 rpm por 30 segundos. Este procedimiento se realizó 3 veces a cada muestra para aumentar el espesor de la película. Las películas obtenidas se secaron a 500°C por 5 h en una mufla (incremento de temperatura 300°C/h, enfriamiento natural). Posteriormente, se llevó a cabo la síntesis de la película delgada de CeO2-Gd sobre el mismo sustrato metálico y las mismas condiciones del equipo para spin coating de las películas de CeO2 correspondientes a las muestras de la tabla 1.

RESULTADOS En la figura 1 se muestran las micrografías SEM de las películas delgadas correspondientes a la muestra 1 y 2. Este análisis de morfología superficial se realizó en un SEM (INSPECT F50) para las muestras mencionadas. Además, se trabajó con un voltaje de 20 kV en un vacío de orden de magnitud de 10-5 mbar.

1 Este sustrato metálico se limpia con una disolución de ácido cítrico en etanol por 5 min y posteriormente en puro etanol por 5 min.

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE PELÍCULAS DELGADAS DE CeO2 Y DE CeO2-Gd POR EL MÉTODO SPIN COATING

1Universidad Autónoma de Querétaro, Facultad de Ingeniería; Cerro de las Campanas s/n, C.P:76010, Querétaro, Querétaro, MÉXICO, [email protected]; 2Laboratorio Nacional CIACYT- Uni-versidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Sierra Leona 550, Col. Lomas 2a Sección, C.P: 78210,

San Luis Potosí, S.L.P. MÉXICO, [email protected].

Ortiz Estrada, J. J.1; Rodríguez Vázquez, Á. G.2

RESUMEN Se prepararon películas delgadas de óxido de cerio (CeO2) sobre un sustrato metálico por el método Spin Coating variando las concentraciones de Ce y utilizando dos disolventes. Posteriormente, las películas delgadas fueron caracterizadas por espectroscopia Raman, espectroscopia infrarroja de la transformada de Fourier (FT-IR), microscopía electrónica de barrido (SEM) y fotoluminiscencia (PL). Se estudió el efecto del disolvente en la cristalinidad de las películas delgadas de CeO2 utilizando metanol y etanol. Los resultados de la microscopía SEM muestran que el metanol es el mejor disolvente para obtener películas delgadas con mayor grado de cristalinidad en comparación con el etanol. Por otro lado, se prepararon películas delgadas de CeO2 dopado con gadolinio (GDC) para mejorar las propiedades ópticas de la película. Con la finalidad de obtener uniones n-p de CeO2 y silicio, se pretende realizar un crecimiento de Si sobre la película delgada de CeO2 por el método de sputtering RF.

ABSTRACT Cerium dioxide (CeO2) thin films with different Ce concentrations, and dissolvent, were synthesized; and deposited on metal substrates using spin coating. Later, thin films were characterized by Raman spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), scanning electron microscopy (SEM) and photoluminescence (PL). The dissolvent effect in the CeO2 thin films crystallinity with methanol and ethanol was studied. SEM microscopy results shows that the methanol is the best dissolvent to obtain thin films with higher crystallinity than ethanol. On the other hand, thin films gadolinium doped CeO2 (GDC) were synthetized to improve the optical properties in the thing. In order to obtain n-p junctions of CeO2 and silicon, it is to realize silicon growth on CeO2 thin film by the sputtering RF method. Palabras clave: películas delgadas, spin coating, óxido de cerio, gadolinio.

INTRODUCCIÓN Durante las últimas décadas, los semiconductores de óxidos metálicos han llegado a ser importantes materiales, con numerosas publicaciones centradas en diferentes tipos de estos materiales como: In2O3, TiO2, SnO2 y CeO2. Recientemente, ha habido un creciente interés en el uso de CeO2 debido a sus prometedoras características, incluyendo: (i) es un semiconductor tipo n con un ban-gap de 3.2 eV, (ii) es altamente transparente en la región visible (400-800 nm), y (iii) es barato. Estas ventajas mejoran el potencial del CeO2 para ser usado ampliamente en un rango de aplicaciones, tales como almacenamiento


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etanol) se espera un grado de cristalinidad mayor que para la muestra 3 (0.3 M en etanol) debido a la intensidad que muestra el análisis Raman de la figura 2.

Figura 2. Espectros Raman de películas delgadas de CeO2 variando la concentración de Ce en metanol y etanol como disolventes: a) correspondiente a una concentración 0.4 M de Ce en metanol, b) a una

concentración 0.4 M de Ce en etanol y c) concentración 0.3 M en etanol. En la figura 3 se muestran los resultados del espectro FTIR de la película delgada de GDC. Los picos observados en la región de 802-490 cm-1 corresponden a las vibraciones del enlace Gd-O, el espectro obtenido presenta una banda intensa en ~800 cm-1 correspondiente a los modos vibracionales del enlace gadolinio-oxígeno presentes en la red cristalina de la película delgada de GDC aunque Chandradass J. et al reporta que en la región 850-400 cm-1 del espectro IR los picos observados pueden ser atribuidos a las vibraciones características del enlace Ce-O. El pico a ~1258 cm-1 corresponden a modos vibracionales de grupos NO3. Las bandas de absorción a 1251-1097 cm-1 se beben probablemente a la vibración de tensión del enlace CH-OH.

En las micrografías a) y b), que están a 200 µm, podemos observar que para la muestra 1 se presenta una superficie más lisa y no se logra apreciar fracturas como en el caso de la muestra 2. Ahora bien, en las micrografías c) y d), que corresponden a 20 µm de escala, ya se nota una gran diferencia en la microestructura superficial de ambas muestras; en la c) apenas se logran apreciar las fracturas superficiales, mientras que en la d) las fracturas tienen ~2.5 µm de espesor. Estos resultados demuestran que las películas que se sintetizaron con etanol no son adecuadas para su aplicación como película delgada debido a que presentan muchas fracturas en comparación con las sintetizadas con metanol; esto es, las grietas no permiten una unión n-p uniforme de los semiconductores (CeO2 y silicio). Por otra parte, podemos observar que las micrografías de la muestra 2 de la figura 1 pertenecen a un material con mayor área superficial en comparación con la muestra 1. Este resultado, aunque parece desfavorable para la aplicación en películas delgadas (muestra 1), se puede investigar para las propiedades de funcionalización de superficies para catálisis, donde el área superficial adquiere gran importancia.

Figura 1. Micrografías SEM de películas delgadas de CeO2 sobre un sustrato de hastealloy; a), c), e) y g) (muestra 1), 0.4 M de CeO2 en metanol; b), d), f) y g) (muestra 2), 0.4 M de CeO2 en etanol.

Los resultados de espectrometría Raman se presentan en la figura 2; aquí se tiene los espectros de las tres muestras de la tabla 1. Según Weber et. al. el CeO2 policristalino que correspondiente a la estructura de fluorita presenta tres modos de vibración a frecuencias de 272, 595 y 464 cm.1, siendo esta última la de mayor intensidad. Analizando los espectros de las películas delgadas sintetizadas por spin coating podemos apreciar que también presentan tres picos de intensidad correspondiente a los modos de vibración Raman que se reporta en la literatura. Siendo los resultados experimentales correspondientes a 223.45, 584.60 y 454.02 cm-1. El espectro Raman también nos ayuda a determinar la cristalinidad de las tres muestras de la tabla 1. La intensidad Raman de la muestra 1 (concentración 0.4 M en metanol) resulta ser la mayor, con lo que podemos asegurar un mayor grado de cristalinidad, resultado que se comprueba con los análisis SEM de la morfología de la muestra en comparación con la muestra 2. De igual manera, para la muestra 2 (0.4 M en


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CONCLUSIONES En este trabajo, como muestran las imágenes SEM, se determina que el solvente tiene gran influencia en la síntesis de las películas delgadas. Se utilizó etanol y metanol a diferentes concentraciones; el primer solvente se usó con la finalidad de reducir el costo de la síntesis de películas delgadas. Sin embargo, el metanol resulta ser el mejor solvente. A pesar de que no se presentan resultados cristalográficos, como análisis de difracción de rayos X (XRD), se puede comparar la cristalinidad de las tres muestras de películas delgadas de CeO2 con base en el análisis Raman. Los resultados de PL nos demuestran que las películas delgadas de GDC poseen buenas propiedades ópticas de emisión de luz en el UV a temperatura ambiente, siendo películas delgadas con gran interés para realizar uniones de semiconductores n-p para contactos en circuitos electrónicos.

BIBLIOGRAFÍA

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Figura 3. Espectro FT-IR de la película delgada de GDC.

Para analizar la reflexión de luz en el rango ultravioleta (UV) que el Gd le confiere al CeO2 se realizó un análisis de fotoluminiscencia con un láser de 355 nm, a temperatura ambiente. El espectro PL de la figura 4 muestra los cinco picos más pronunciados; el pico más intenso está a ~543.6 nm (1.78 eV), el siguiente pico más pronunciado está a ~611 nm (2.01 eV) y los de menor intensidad se presentan a ~695 nm (2.28 eV), ~587.142 nm (2.11 eV) y ~ 491 nm (2.52 eV). Estas emisiones de luz de las películas delgadas de GDC corresponden a los parámetros de transición para el estado 5p54f7.

Figura 4. Espectro de fotoluminiscencia de la película delgada de GDC.


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GHz with an angular resolution of 5.4´´ for double radio sources straddling the position of V<10 mag stars within ~30´. We found a total of five such cases, four of them brighter than V~10 mag. The only known type of double-lobed radio stars are the so-called microquasars (Mirabel & Rodríguez 1999), which are stars that have dark companions (black holes or neutron stars) causing the ejection of radio lobes through mass donation from the visible star onto the dark companion, creating an accretion disk around the latter. All of these are close to the Galactic plane and are copious X-ray emitters, very unlike the double-lobed radio stars found by us to coincide with spectroscopically normal stars, all X-ray quiet and at high Galactic latitudes. Three of the latter stars have been followed up in a spectroscopic monitoring program at TIGRE observatory (Schmitt et al. 2014) at La Luz, Guanajuato, in order to search for possible dark companions, but so far no radial velocity changes have been observed, suggesting that any such companion must be in a much wider orbit with a much longer orbital period. In the present work we extend the search for such stars to fainter magnitudes, by searching for radio emission different from point sources, since the latter type of emission has been known for several decades to occur in certain types of active stars. A thorough search for radio-emitting stars in the FIRST radio survey was done by Helfand et al. (1999) and Kimball et al. (2009). However, the first paper was restricted to brighter stars, and did not reveal any radio double sources, while the latter authors only searched stars in the i-band magnitude range from 15 to 19.1 mag, finding candidates for unresolved radio emission in 112 stars, of which however 108±13 are expected to occur by chance. They also reported resolved or more complex emission around another 76 stars. For the unresolved sources these authors restricted their radio source search within a separation of at most 1´´ from the star, while for the more complex radio sources they visually inspected an area of 2´ x 2´ around these. On the other hand, the so-called “classical” radio galaxies are found to be almost exclusively hosted in massive, gas-poor elliptical galaxies (e.g. Best et al. 2005). However, since the work of Ledlow, Owen & Keel (1998) about half a dozen spiral galaxies have been found (see Mao et al. 2015 for a review). Recently Singh et al. (2015) used a sample of 187,005 spiral galaxies, to search for extended radio sources within 3´ on opposite sides of these galaxies which could indicate double radio lobes ejected from the central active nucleus of the spirals, They found only four examples, three of which had been known before. In the present work we apply a similar search algorithm to a three times larger sample of candidate spirals, but without the restrictions imposed by Singh et al. (2015) of having a radio source at their nuclei and that the lobes must be extended. Moreover, we searched for possible lobes out to an angular distance of 6', i.e. twice that of Singh et al. (2015).

METHODS AND MATERIALS A. The Search Algorithm For both of the searches, around stars and around spiral galaxies, we adapted a FORTRAN code originally written by M. A. Jiménez Valencia (Univ. de Sonora, Mexico) during a summer research project with one of us (HA) in 2015. Our code detects all the sources for a given field and places them in an auxiliary file which is then used to calculate, for each radio source, the angular distance from the central star or galaxy, and the orientation of the radius vector from the central object to the radio source (the position angle). For each pair of radio sources three parameters are calculated, namely the so-called “armlength ratio” (ALR) of the distance between central object and the radio sources on each side, as well as the difference between the two position angles (the so-called “misalignment” or bending angle, or DPA), as well as the ratio of integrated flux densities as listed in the FIRST catalog (the so-called flux ratio, FLR). Only source pairs which lie on opposite sides of the central object, within a given tolerance of armlength ratio, bending angle and flux ratio were kept for further inspection. In our initial inspection we concentrated on the most symmetric and aligned objects, with ALR and FLR closest to unity and DPA closest to 0°.

A SEARCH FOR DOUBLE-LOBED RADIO EMISSION FROM GALACTIC STARS AND SPIRAL GALAXIES

1Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Departamento de Astronomía, Universidad de Guanajuato, Cjon de Jalisco s/n, Col. Valenciana, C.P. 36240, Guanajua-

to, Gto., MÉXICO; [email protected]

Ortiz Martínez, A. F.1; Andernach Kuhlmann, H.2

RESUMEN Se presenta una búsqueda sistemática de dos tipos de objetos astronómicos con inusuales características: estrellas y galaxias espirales, emitiendo chorros dobles en radio, lo cual sugiere la eyección de estos chorros dobles desde el objeto óptico. Se usó una muestra de 878,031 estrellas y 675,874 galaxias candidatas a espirales que se combinaron desde varias fuentes de la literatura. Se aplicó un algoritmo para buscar pares de radiofuentes en lados opuestos de éstos. Se encontraron tres nuevos ejemplos de radio estrellas con fuentes dobles, mientras para galaxias espirales sólo se redescubrió una fuente doble conocida, confirmando que estos objetos son extremadamente raros.

ABSTRACT We present a systematic search for two types of extremely rare astronomical objects: Galactic stars and spiral galaxies with "double radio lobes'', i.e. radio emission on opposite sides of the optical object, suggesting the ejection of jets from them. We used unprecedented samples of 878,031 Galactic stars and 675,874 spiral galaxy candidates which we composed from various literature sources. Applying our own algorithm to search for pairs of radio sources straddling these objects, we found three new examples of double-lobed radio stars, while for the spiral galaxies we only rediscovered one known such double source, confirming that the latter objects are extremely rare. Palabras Clave: astrofísica extragaláctica, galaxias espirales, estrellas, radiogalaxias

INTRODUCTION Double-lobed radio sources that originate either from stars or from spiral galaxies are extremely rare. We thus performed a new search for more examples of these types of objects. Within the citizen science project “Radio Galaxy Zoo” (RGZ, radio.galaxyzoo.org), launched in 2013, and of which one of us (HA) is a founding member, several spectroscopically confirmed Galactic stars were found to lie on the axis connecting two radio sources. These suspected “radio lobes” are often extended along the axis between the lobes, very similar to the morphology of the radio emission of classical double radio galaxies. However, different from the latter, the stars usually do not present a radio nucleus at the position of the star. The discovery by a RGZ volunteer of a V~9 mag star (BD+40 2030) motivated one of us (HA) to search the best available radio source catalogue (FIRST, Helfand et al. 2015) performed at 1.4


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RESULTS A. Stars Using TOPCAT we extracted all radio sources from the FIRST catalog within 1´ of the sample of 878,031 stars, keeping only those 7192 stars which had at least two such radio sources. We applied our algorithm to these 16,693 radio sources and found 524 radio source pairs showing a high level of symmetry. Initially we included all objects with ALR >10 in order to find possibly one-sided radio sources for which one source coincided with the star and the other may be ejected from the star. The few cases we had time to inspect did not show evidence for a one-sided ejection, but we could confirm about a dozen unresolved radio sources coinciding with stars that had already been identified by Kimball et al. (2009). In order to concentrate on the most promising candidates for double-lobed sources, we visually inspected all 38 cases which fulfilled the conditions 0.5 ≤ FLR ≤ 2.0, 0.5 ≤ ALR ≤ 2.0 and DPA ≤ 5°. A total of 3 convincing examples were found, which we present in Fig. 1. The upper row shows SDSS J132941.25+151021.8, an r=18.17 mag F9 star with a radio core and two symmetrically placed lobes which have no optical or infrared counterpart. This star had been reported as having complex radio emission by Kimball et al. (2009) but without mentioning its symmetric triple structure. The middle row shows SDSS J094853.03+254411.0, an M5 star with a faint radio core of ~0.6 mJy and two radio lobes 43'' apart, not only symmetrically placed on opposite sides of the star, but being extended along the major axis of the entire source. The optical spectrum leaves no doubt about its stellar nature. The bottom row shows the K3 star SDSS J154013.86+312125.0 within ~2'' of the center of a symmetrical double radio source of size ~45''. While the optical spectrum leaves no doubt about the stellar nature, the optical image of this object shows some gradient from green in the NW to red color in the SE, and leaves a possibility that this is a superposition of a brighter star and a fainter galaxy. B. Spiral Galaxies We extracted all radio sources from FIRST within 6.0´ around the 675,874 spiral candidates. Running our source code to look for source pairs aligned with the spiral candidates, we reduced the resulting sample to the most promising pairs with the smallest DPA, ALR and FLR closest to unity and radio flux > 2.5 mJy. We discarded all cases where one of the radio sources coincided with an optical object from SDSS within 2.4''. We inspected a total of 115 such source pairs, but did not find any evidence for a relation with the spiral galaxy except for a single case, previously reported by Mao et al. (2015). This is the face-on spiral SDSS J164924.01+263502.5 with a classical double radio sources known as B2 1647+26A. Of those spirals with only a single source within 6', about 1290 fell within 1.5'' of the SDSS position, and thus are very likely the true radio nuclei of these spirals. We inspected all 70 radio sources with either a deconvolved size of at least 10'', or larger than 5'' and integrated flux above 10 mJy, All sources were compatible with the radio emission confined within the plane of the galaxies, and thus being due to star formation activity. No single case was found in which the radio orientation indicated a jet-like feature corresponding to a classical radio galaxy oriented perpendicular to the galaxy major axis, again confirming the extreme rareness of these objects.

B. Stars For our search for double-lobed radio stars we used the Sloan Digital Sky Survey Data Release 12 (SDSS DR12, (Alam et al. 2015) which contains 998,703 spectra classified as Galactic stars. We eliminated all duplicate objects within an angular distance of 1´´, leading to a reduced sample of 878,031 stars. For the current exploratory search, and based on the experience of our previous search for bright stars, we restricted our search to radio sources within 1´ (i.e. 60´´) from the star position, and extracted from the latest (2014-Dec-17) version of the FIRST source catalog (Helfand, White, & Becker, 2015) containing 946,432 radio sources. C. Spiral Galaxies Samples of spiral galaxies were extracted from four different sources. Firstly, Kuminski & Shamir (2016, KS16) applied an automated algorithm to classify ~3,000,000 galaxies of which ~900,000 were considered spirals and ~600,000 ellipticals. From their spectral sample we selected those classified as spiral (S), having redshift z > 0.003, a probability of being a star (pstar) of <0.01, and a probability of being a spiral (pspi) of >0.80. Inspection on the SDSS server (skyserver.sdss.org/DR13//en/tools/explore/summary.aspx) led us to select 170,823 further objects with the 0.6 < pspi < 0.8, and pstar < 0.1, and z>0.002. No upper redshift limit was imposed since a visual inspection of several supposedly high-z objects revealed faint low-surface brightness objects with wrongly determined redshift. From the non-spectral sample we selected all objects with pspi > 0.6. A cleaning of all duplicate objects within 1.5'' using TOPCAT (Taylor 2013) resulted in a clean sample of 575,486 supposedly unique objects. Secondly, Willett et al. (2013) have used the votes of over 87,000 volunteers of the Galaxy Zoo 2 (GZ2) project to classify 304,122 galaxies bright enough to allow morphological classification from visual inspection. We considered all objects whose so-called gz2_class, the “most common consensus classification for each galaxy” started with the letter S, indicating any sub-type of a spiral galaxy. After removal of identical objects contained in different subsamples of GZ2 this resulted in 167,249 spiral galaxy candidates. Thirdly, Huertas-Company et al. (2011, HC11) used support vector machines to classify 698,420 galaxies into 4 morphological types (E, S0, Sab, Scd). They also list the so-called “Automatic Spectroscopic K-means based (ASK) classification” as derived by Sánchez-Almeida et al. (2010) only from optical spectra of these galaxies. We selected all galaxies with a probability of at least 0.7 for being Sab or Scd. From all the remaining galaxies we selected those with ASK > 14, which according to Sánchez Almeida et al. (2010) is a good indicator of a late-type spiral. We then excluded all objects with probabilities > 0.5 of being either an E/S0 or S0 type, leaving 129,527 galaxies. Finally, to complete our spiral galaxy sample for the brightest objects, we selected from HyperLEDA (http://leda.univ-lyon1.fr) all galaxies with btc < 16 mag, morphological type T>2.0 and an uncertainty in this type of ΔT<0.5, which resulted in 1150 galaxies in the region observed by the FIRST radio survey. Excluding all duplicates within 2.5” with the KS16 sample, and those between the GZ2, HC11, and HyperLEDA samples, we ended up with 675,874 spiral candidates. This may include a few objects corresponding to different bright regions in the same spiral galaxy. Our final sample is thus ~3.6 times larger than the sample size of Singh et al. (2015). Moreover we searched an area around these objects four times as large, corresponding to a search ~14 times larger than the largest previous systematic search.


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object. Moreover, our algorithm may be applied to other existing and future radio surveys or new optical samples like spectroscopic stars or spiral galaxies.

ACKNOWLEDGEMENTS We are grateful to M. A. Jiménez Valencia (Univ. de Sonora, Mexico) for sharing his FORTRAN code to search for radio source alignments around arbitrary sky positions.

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Fig. 1. Examples of 3 radio stars with double-lobed radio emission found by us; each row shows the radio image on the left, the optical image at center, and the optical spectrum at right (see text

for details)

CONCLUSIONS Using unprecedented samples of 878,031 Galactic stars and 675,874 spiral galaxy candidates we designed an algorithm to search for pairs of radio sources suggesting the emission of radio jets from them, similar to those known in classical radio galaxies. We found three new examples of double-lobed radio stars, while for the spiral galaxies we only rediscovered one previously known double source, confirming that the latter objects are extremely rare. As an aside, we found that the detection of radio emission matching an SDSS object classified as a spectroscopic star, is an efficient method to detect misclassified optical spectra, either very noisy or with wrongly identified spectral lines. The period of 5 weeks for this research project did not allow us to inspect more candidates we found with our algorithm. We plan to clean these large lists further, e.g. by eliminating all radio lobes having an optical counterpart in SDSS, and/or by including in our analysis the orientation of those suspected radio lobes that are listed as extended nearly along the major axis of the pair of lobes straddling the central


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DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN PLÁNTULAS REGADAS CON AGUA DESINFECTADA

1Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca, Romualdo del Campo #501, Fraccionamiento Rafael Curiel CP 79060 Ciudad Valles, S.L.P., MÉXI-CO, [email protected]; 2Universidad Autónoma de Querétaro, Campus Aeropuerto, Labo-ratorio de metabolitos secundarios y metabolómica. Biosistemas. Fac. de Ingeniería. Carretera a Chi-chimequillas, Ejido Bolaños, CP 76140, Querétaro, Qro, MÉXICO, [email protected]

Padrón Azúa, I.1; Feregrino Pérez, A. A.2

RESUMEN La agricultura es una de las actividades económicas que tienen un mayor consumo de agua provocando un impacto al ambiente pero a su vez es necesaria la producción de alimentos por lo que se propone el uso de agua desinfectada (residuales tratadas por fotocatálisis de TiO2 dopado con Ag) para el riego de las mismas, esta agua sería recuperada dándole un segundo uso disminuyendo el consumo de agua directo de afluentes naturales teniendo como objetivo evaluar la diferencia de capacidad antioxidante y equivalentes de ácido gálico en ambos tratamientos. Se determinaron fenoles por el método Folin-Ciocalteau DPPH (Burda y Oleszek, 2001), ABTS por el método Pellegrini y %ARA en plántulas de espinaca y zanahoria regadas con agua desinfectada mostrando que no hay diferencia significativa contra el control de agua corriente tomada de la red pública.

ABSTRACT Agriculture is one of the economic activities that have a high water consumption causing an impact to the environment but it is necesary for food production so the use of disinfected water is proposed (wastewater treated by photocatalysis of TiO2 doped with Ag is necessary) to irrigate them, this water would be recovered giving a second use decreasing water consumption of natural sources aiming evaluate the difference in antioxidant capacity and gallic acid equivalents in both treatments. phenols were determined by the Folin-Ciocalteu DPPH method (Burda and Oleszek, 2001), ABTS by the method Pellegrini and% ARA in seedlings of spinach and carrots irrigated with water disinfected showing no significant difference against the control of tap water taken from the public network.

Palabras Clave: TiO2, Capacidad antioxidante, Riego de cultivos, Fenoles.

INTRODUCCIÓN El recurso natural más importante a nivel mundial es el agua, la cual atraviesa por una crisis de contaminación y mientras la población mundial sigue creciendo también la demanda de agua lo cual ha provocado consecuencias para el ambiente (Teh-Rahman, 2011) por lo que se propone el uso de aguas residuales tratadas por fotocatálisis con TiO2 dopado con Ag para el riego de plantas cuya finalidad es el consumo humano. Las nanopartículas de TiO2 pueden utilizar la radiación UV proveniente de la luz solar

SÁNCHEZ ALMEIDA, J., AGUERRI, J.A.L., MUÑOZ, C., de VICENTE, A., (2010). Automatic Unsupervised Classification of All Sloan Digital Sky Survey Data Release 7 Galaxy Spectra, Astrophys. J. 714, 487-504 SCHMITT, J.H.M.M., SCHRÖDER, K.-P., RAUW, G., HEMPELMANN, A., MITTAG, M., GONZÁLEZ-PÉREZ, J.N., CZESLA, S., WOLTER, U., JACK, D., EENENS, P., TRINIDAD, M.A., (2014). TIGRE: A new robotic spectroscopy telescope at Guanajuato, Mexico, Astron. Nachr., 335, 787-796 SINGH, V., ISHWARA-CHANDRA, C.H., SIEVERS, J., WADADEKAR, Y., HILTON, M., BEELEN, A., (2015), Mon. Not. Roy. astron. Soc. 454, 1556-1572 TAYLOR, M., (2013). TOPCAT - Tool for OPerations on Catalogues And Tables, Starlink User Note 253 (see also http://www.star.bris.ac.uk/~mbt/topcat) WILLETT, K.W., LINTOTT, C.J., BAMFORD, S.P., MASTERS, K.L., SIMMONS, B.D., CASTEELS, K.R.V., EDMONDSON, E.M., FORTSON, L.F., KAVIRAJ, S., KEEL, W.C., MELVIN, T., NICHOL, R.C., RADDICK, M.J., SCHAWINSKI, K., SIMPSON, R.J., SKIBBA, R.A., SMITH, A.M., THOMAS, D., (2013). Galaxy Zoo 2: detailed morphological classifications for 304,122 galaxies from the Sloan Digital Sky Survey, Mon. Not. Roy. astron. Soc., 435, 2835-2860


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Preparación de la muestra Una vez que las plántulas obtuvieron de un tamaño promedio de 4cm, después de las hojas verdaderas se procesaron las muestras. La extracción se realizó con 200 mg de muestra y se adicionaron 10 ml de metanol. Se cubrió de la luz la muestra con papel aluminio y se agita durante 24 h. Centrifugando a 4000 rpm por 10 min, desechando la pastilla formada, quedando el sobrenadante. Determinación de Fenoles Totales Se determinó según el método de Folin-Ciocalteau. Se realizó una curva de calibración utilizando concentraciones de (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 µg/ml de ácido gálico) por triplicado. Determinación de Capacidad antioxidante por DPPH El método modificado adaptado para su uso en mircroplaca. Este método se basa en la disminución de la absorbancia del radical libre DPPH., ya que cuando sufre reducción por un antioxidante, lo que proporciona un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales por la donación de hidrógeno. La actividad antirradical (ARA) se calcula como porcentaje de decoloración de DPPH, usando la siguiente ecuación (Burda y Oleszek, 2001): ARA= 100 x (1-Amuestra / Acontrol) Donde ARA= actividad antirradical, Amuestra es la absorbancia de la muestra a 520nm y Acontrol es la absorbancia del control (ausencia de antioxidante). Determinación de capacidad antioxidante por ABTS

El método de Pellegrini et al, (1999) fue desarrollado usando el 2,2’-asinobis (ácido-6-sulfónico-3-

etilbenzotiazolina (ABTS) modificado para microplaca basándose en la disminución de la absorbancia del radical libre ABTS.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN El contenido de µg equivalentes de ácido gálico/g de muestra fresca entre los dos tratamientos (Agua corriente y desinfectada) entre la misma especie (Tabla 1), es similar sin presentar diferencia significativa (Std Error=4.3149) al igual que los mM equivalentes de trolox/g de muestra por DPPH (Std Error=1.7849) y por ABTS (Std Error=2.6988) y el %ARA (Tabla 2 y 3) entre los dos tratamientos de la misma especie (α=0.05) por lo que se sugiere que tienen una actividad antioxidante similar entre los dos tratamientos mostrando un comportamiento distinto al que reporta Ascensao 2003 que logró incrementar la cantidad de compuestos fenólicos al exponer plantas a membranas de patógenos por lo que no funciona como elicitor.

Tabla. 1. Contenido de equivalentes de ácido gálico a distintos tratamientos.

Zanahoria Espinaca A

Corriente Desinfectada Corriente Desinfectada

µg eq. Ac. Gal 71.6909621 75.0728863 34.2954325 42.01166181 Std Error +/- 1.5680 +/- 5.4609 +/- 0.5911 +/- 7.4125

Tabla. 2. Equivalentes de trolox y %ARA a distintos tratamientos mediante ABTS.

Zanahoria Espinaca A Espinaca B

Corriente Desinfectada Corriente Desinfectada Corriente Desinfectada

mM eq. Trolox 117.9695673 116.1578697 131.0984308 131.3266762 104.151213 93.75653828 Std Error +/- 1.7701 +/- 2.6064 +/- 0.6557 +/- 4.4288 +/- 3.6198 +/- 0.7930

% ARA 97.10199615 95.66431455 107.5204709 107.7015962 86.1363722 77.88762688

para desencadenar la fotocatálisis y degradar compuestos orgánicos (Teh-Rahman, 2011). Además que la Ag potencia su efecto (Seery et al., 2007; Thiel et al., 2007), mejorando la producción de ERO generando un estrés oxidativo que lleva a la muerte celular confiriéndole efecto antibacteriano (Panda et al., 2011) contra Eschericha coli, (Pérez 2014; Wang et al., 2006; Machida et al., 2005 ), Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, (Kedziora et al., 2012) endoesporas bacterianas (Foster et al., 2011) e inactivación de virus (Liga et al., 2011) por lo que tiene un gran potencial para proveer una buena opción para combatir la transmisión de enfermedades infecciosas y tratar las aguas residuales. En cuanto a su toxicidad, debido a la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) sugiere un daño a las membranas celulares de plantas (Ghosh et al., 2010), ratones (Naya et al., 2012; Lindberg et al., 2012) y ligeramente en células humanas (Shukla et al., 2011; Di Virgilio et al., 2010) además de considerar las características de las nanopartículas ya que las nanopartículas de anastasa de 20 nm son genotóxicas mientras que a 200 nm no induce toxicidad (Di Virgilio et al., 2010). Las ERO también son producidas naturalmente por un metabolismo aeróbico normal por lo que naturalmente cuenta con enzimas antioxidantes para proteger las células del estrés oxidativo que puede dañar al ADN, ARN, proteínas y lípidos de membrana (Nantasenamat et al., 2008). Muchos antioxidantes naturales están basados en compuestos fenólicos (Nantasenamat et al., 2008; Hamood-Hossain 2015) ya que actúan como antioxidantes debido a que reaccionan y desactivan radicales libres lo cual conlleva beneficios para salud (Stewart, et al 2008; Dang et al.,2015) protegiendo de los efectos del estrés oxidativo por lo que puede bajar la incidencia en cáncer y enfermedades cardiacas (Mandave et al., 2014) por lo que se tiene como objetivo evaluar la diferencia de capacidad antioxidante y compuestos fenólicos en equivalentes de ácido gálico en ambos tratamientos. Lo anterior proporcionara un aproximado del comportamiento del agua desinfectada en el desarrollo de metabolitos secundarios Vs el agua potable. Los metabolitos secundarios se expresan cuando la planta es sometida a un proceso de estrés de tipo biótico o abiótico, estos metabolitos y de manera particular los fenoles contribuyen a la salud (Rakotomanomana et al., 2016). Se ha encontrado que en alimentos con alta concentración de fenoles funciona como un fuerte antioxidante (Moreira et al., 2008) además funciona como conservador alimenticio previniendo la oxidación de lípidos y alarga su vida de anaquel (Hamdy et al., 2013). Si se logran obtener compuestos bioactivos como lo son los compuestos fenólicos al regar con agua desinfectada en la misma proporción que el agua de la red pública, sería un indicador que este tipo de agua no genera estrés en la plántula y pudiera ser una alternativa de uso en el sector agrícola.

METODOS Y MATERIALES El desarrollo experimental se llevó a cabo en el Campus Aeropuerto en el Laboratorio de Metabolitos Secundarios y Metabolómica de la Facultad de Ingeniería., UAQ. Ubicado en carretera a Chichimequillas, Ejido Bolaños, Querétaro, Qro. En un periodo del 6 de Junio al 15 de Julio del 2016. Obtención de plántulas Se sembraron semillas de zanahoria y espinacas de la marca Germinal ® en almácigos de poliestireno expandido de 26 x 13 pozos con sustrato. Los almácigos se dividieron en dos partes iguales de 13 x 13 en la que una parte se regó con 5 ml de agua corriente (control negativo) y la otra parte con 5 ml de agua desinfectada previamente tratada, con una concentración de plata <30 ppm proporcionada por el laboratorio de Materiales Nanoestructurales y Funcionales de La Universidad Autónoma de Querétaro Campus Aeropuerto cada tercer día durante 3 semanas hasta la obtención de la plántula. Se desarrolló en un invernadero comercial compuesto de una estructura de tubular con dimensiones de 1 x 1 x 2 m con una cubierta plástica impermeable teniendo una temperatura promedio de 27.5°C.


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Tabla. 3. Equivalentes de trolox y %ARA a distintos tratamientos mediante DPPH.

Zanahoria Espinaca A Espinaca B

Corriente Desinfectada Corriente Desinfectada Corriente Desinfectada

mM eq. Trolox 55.84117032 60.01044932 56.87565308 80.78369906 39.6238245 31.57784744 Std Error +/- 1.6667 +/- 1.6433 +/- 2.4557 +/- 0-2435 +/- 2.0614 +/- 1.8110

% ARA 235.6193927 239.0614217 236.47343 256.2111801 222.230849 215.5883368

CONCLUSIONES Al no encontrarse diferencias significativas en los parámetros evaluados puede sugerirse que el agua desinfectada no funge como elicitor en las plantas por lo tanto no les genera estrés mayor al que pudiera generar el agua corriente llevándose el desarrollo de las plántulas similar en ambos tratamientos. Estos resultados sugieren que el agua desinfectada puede ser una alternativa viable en la agricultura.

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Una aplicación de las pinzas magnéticas es el estudio de propiedades mecánicas de macromoléculas biológicas como DNA o proteínas, incluso recientemente se ha realizado el estudio de interacciones biomoleculares proteína-proteína en el citoplasma. Por lo que se puede considerar a las pinzas magnéticas como una herramienta biofísica muy útil. Como ya se mencionó se puede hacer uso de partículas magnéticas para la detección de interacciones específicas proteína-proteína en diferentes condiciones ambientales celulares, funcionalizando microesferas magnéticas modificadas con alguna proteína de interés producida en bacterias. Estas partículas se internalizan en las células por endocitosis, y se recuperan utilizando pinzas magnéticas para analizar las interacciones de la proteína de interés mediante espectrometría de masas y Western Blot. Esta técnica tiene una ventaja sobre otras técnicas, ya que nos permite evaluar interacciones directamente en la célula a diferencia de otros métodos en los que las moléculas pueden interactuar con los extractos celulares totales dando la posibilidad de falsos positivos. Por lo tanto, la implementación de la pinza magnética es necesaria para realizar el análisis de las interacciones biomoleculares de forma más efectiva, obteniendo mejores resultados.

MARCO TEÓRICO

Principio de funcionamiento de la pinza magnética El descubrimiento de Oersted (Físico y químico danés) en 1819 del desvió de la aguja de las brújulas demuestra que un conductor que lleva una corriente produce un campo magnético. Oersted observó que una aguja imantada colocada en dirección paralela a un conductor eléctrico se desviaba cuando se hacía circular una corriente eléctrica por el conductor, demostrando así la existencia de un campo magnético. La ley de Ampère, descrita por André-Marie Ampère en 1826 nos permite calcular estos campos magnéticos generados a partir de corrientes eléctricas y se enuncia:

∮𝐵�⃗ 𝑑𝑙 = μ0IT

La integral de línea del campo magnético a lo largo de una trayectoria cerrada, donde: μ0 es la permeabilidad del vacío dl es un vector tangente a la trayectoria elegida en cada punto IT es la corriente neta que atraviesa la superficie delimitada por la trayectoria, y será positiva o negativa según el sentido con el que atraviese a la superficie. Empleando la ley de Ampère puede calcularse el campo creado por distintos tipos de corriente. Dos ejemplos clásicos son el del toroide circular y el del solenoide. El solenoide es un dispositivo físico capaz de crear un campo magnético sumamente uniforme e intenso en su interior, y muy débil en el exterior. Un ejemplo teórico es el de una bobina de hilo conductor aislado y enrollado helicoidalmente, de longitud indeterminada. En ese caso ideal el campo magnético sería uniforme en su interior y, como consecuencia, afuera sería nulo. En la práctica, una aproximación real a un solenoide es un alambre aislado, de longitud finita, enrollado en forma de hélice (bobina), por el que circula una corriente eléctrica, cuando esto sucede, se genera un campo magnético dentro de la bobina. (Solenoide, 2016). Se puede calcular el campo magnético en un solenoide con la siguiente ecuación:

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IMPLEMENTACIÓN DE PINZAS MAGNÉTICAS PARA APLICACIONES BIOLÓGICAS: INTERACCIONES BIOMOLECULARES

Instituto de Física, UASLP, Avenida Manuel Nava No 6 Zona Universitaria, 78290, San Luis Potosí, S.L.P., México; [email protected]; [email protected]

Peña Balderas, A. M.; Moctezuma Martiñon, R. E.; Juárez Tello, A.;Zúñiga Pérez, E. A.; Arauz Lara, B. J. L.

RESUMEN La manipulación de partículas magnéticas usando pinzas magnéticas es una técnica biofísica versátil que nos permite el estudio de interacciones biomoleculares proteína-proteína evaluando las interacciones directamente en la célula. En el presente trabajo implementamos pinzas magnéticas de bajo costo las cuales nos permiten mover de manera controlada partículas de alrededor de 1 micra con corrientes pequeñas. Una de las ventajas de estas pinzas es que el campo magnético generado por la corriente que pasa a través de la bobina se concentra y magnifica en la punta haciendo que el movimiento de las partículas sea más puntual. Palabras clave: Pinza magnética, partículas magnéticas, interacciones biomoleculares

ABSTRACT

The manipulation of magnetic particles using magnetic tweezers is a versatile biophysical technique that allows the study of protein-protein biomolecular interactions evaluated directly in the cell. In this work, we perform low-cost magnetic tweezers which allow us to move magnetic particles around 1 µm of diameter in a controlled way with small currents. One advantage of these tweezers is that the magnetic field generated by the current passing through the coil is concentrated and magnified in the tip, making the particle motion more precise. Keywords: magnetic tweezers, magnetic particles, Biomolecular interaction

INTRODUCCIÓN

Las pinzas magnéticas son una herramienta que nos permiten manipular de forma puntual y controlada partículas magnéticas que pueden varían en tamaño. El principio de funcionamiento consiste en una fuerza generada por un electroimán: una corriente eléctrica pasa a través de un solenoide que rodea un núcleo de hierro que termina en una punta en la que se concentra todo el campo. La corriente puede ser controlada desde una computadora a través del software LabVIEW, el cual permite el control de sistemas por medio de un lenguaje de programación visual gráfico. La posición de la pinza se controla con un micromanipulador que nos permite el movimiento de traslación en los tres ejes con una precisión micrométrica.


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La corriente pasa a través de la bobina de cobre generando un campo magnético que se propagara hacia la punta. La punta de la pinza concentra el campo magnético generando una fuerza de atracción sobre las partículas magnéticas (1μm).

Se prepararon muestras de partículas magnéticas Sera-Mag SpeedBeads y se observaron en el microscopio. Se tomaron 100 μL de partículas y se diluyeron con agua destilada. Una vez diluidas, se agregaron 20 μL de partículas de latex de mayor tamaño, las cuales nos sirven de separadores entre el cubre objetos y el portaobjetos, permitiendo que nuestras partículas magnéticas puedan moverse libremente. De esta solución se tomaron 4 o 5 μL y se depositaron sobre un portaobjetos, sobre nuestra muestra pusimos un cubreobjetos y sellamos con epóxico para evitar que la muestra se seque. De esta manera hacemos varias muestras a diferentes concentraciones, según se requiera. La aplicación del campo magnético hace que las partículas se alineen en la dirección del campo, y de este modo podemos jalarlas/moverlas hacia donde nosotros queramos. Observamos este comportamiento con un microscopio Olympus, variando los objetivos 40x, 10x y 5x. Mediante la utilización de las cámaras: Canon EOS Rebel T5i que tiene un adaptador para microscopio y Dino-lite Digital Microscope Premier

CARACTERÍSTICAS DE LAS PINZAS MAGNÉTICAS

Pinzas Capas y numero de vueltas en la bobina

Longitud del núcleo (cm)

Diámetro del núcleo (cm)

Diámetro de la punta (μm)

1 2 capas de 50 vueltas 17.5 0.6 889

2 2 capas de 50 vueltas 17.5 0.6 762

3 6 capas de 50 vueltas 12 0.6 432

Figura 2. Pinzas magnéticas. Figura 3. Arreglo experimental.

Tabla 1. Características de las pinzas magnéticas utilizadas.

𝐵 = μ0nI

Donde n= N/l el número de vueltas por unidad de longitud. Esta ecuación solo es válida para los puntos cercanos al centro, ya que en los extremos el campo es más pequeño. La bobina con un núcleo apropiado, se convierte en un electroimán. Los electroimanes generalmente consisten en un gran número de espiras de alambre muy próximas entre sí que crean el campo magnético. Las espiras de alambre a menudo se enrollan alrededor de un núcleo magnético hecho de un material ferromagnético como el hierro; el núcleo magnético concentra el flujo magnético y hace un imán más potente. La principal ventaja de un electroimán sobre un imán permanente es que el campo magnético se puede cambiar de forma rápida mediante el control de la cantidad de corriente eléctrica. Interacciones biomoleculares proteína-proteína

Sera-Mag SpeedBeads son partículas magnéticas comerciales que responden con mayor velocidad cuando están expuestas a un campo magnético y pueden estar modificadas con carboxilo, neutravidina o recubiertas con estreptavidina y proteína A/G. Son útiles en inmunoensayos clínicos en los que la velocidad de respuesta magnética es importante, y para el aislamiento a partir de soluciones viscosas en aplicaciones de biología molecular. Las partículas que nos interesan son las modificadas con carboxilo (1 μm de diámetro) ya que se acoplan de manera covalente a proteínas y tienen baja unión a proteínas de suero no específicas, poca polidispersidad, estabilidad en detergentes y una gran variedad de sistemas de buffer de lisis (pH 1-13) de tal manera que podemos funcionalizarlas con cualquier proteína de interés, como lo es MDM2.

La proteína MDM2 es el principal regulador del supresor tumoral p53, esta proteína juega un papel importante en diferentes vías de señalización, ya que interactúa con una gran variedad de socios, por lo que es de nuestro interés estudiar sus interacciones biomoleculares con otras proteínas mediante el uso de las partículas magnéticas antes mencionadas.

METODOLOGÍA Se hicieron 3 pinzas magnéticas con diferentes características (Ver tabla 1.), enrollando sobre un núcleo de hierro alambre de cobre calibre 20 asemejando una bobina. En dos de ellas se usó epóxico entre cada capa de vueltas y cinta de aislar, mientras que en la otra se intercaló entre cada capa cinta de aislar y barniz Kemek. Esto con el fin de evitar que se calienten demasiado las bobinas, ya que estos materiales funcionan como aislantes. El núcleo tiene en uno de sus extremos una punta que es de diferente diámetro para las tres pinzas, y en la que se va a concentrar todo el campo magnético generado por la corriente eléctrica. La pinza se conectó a una fuente GW instek (GPC-30600) la cual nos da una corriente máxima de 6 A. Más adelante la corriente se manipulará a través de un programa en LabVIEW, el cual nos permitiría condiciones más controladas.

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Figura 1. Partículas magnéticas Sera-Mag

SpeedBeads


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CONCLUSIONES El objetivo de este proyecto se cumplió, se implementaron tres diferentes pinzas magnéticas que nos permiten la manipulación de partículas magnéticas del tamaño de 1 micra. Estas partículas servirán posteriormente para el estudio de interacciones biomoleculares proteína-proteína.

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Figura 4. Campos magnéticos generados a diferentes corrientes para las 3 pinzas magnéticas. Los campos magnéticos fueron medidos con: xplorer GLX Pasco magnetic field sensor.

con sus respectivos software EOS utility 2.13.30.0 y Dinocapture 2.0 instalados previamente en una computadora, podemos tomar fotos y videos de las muestras observadas en el microscopio. Esta pinza magnética va a ser usada, entre sus múltiples aplicaciones, para la detección de interacciones específicas de MDM2 en diferentes ambientes celulares. Para lograr esto primero tenemos que transformar en bacterias, es decir introducimos un plásmido (DNA circular) que tiene el gen que codifica para nuestra proteína de interés, de modo que las bacterias van a empezar a producir la proteína. Una vez que producimos la proteína procedemos a purificarla, aislándola de cualquier otro contenido que se encuentre dentro de la célula bacteriana. Corroboramos su pureza mediante electroforesis; técnica usada para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. Ya que purificamos, funcionalizamos las partículas magnéticas Sera-Mag SpeedBeads modificadas con carboxilo con MDM2, usando carbodiimida (EDAC) que activa los grupos carboxilo de la superficie de las partículas. Lo que se busca hacer posteriormente es internalizar las partículas funcionalizadas en las células por endocitosis, y recuperarlas utilizando las pinzas magnéticas para analizar las interacciones de la proteína.


Al realizar varias pruebas experimentales con las 3 pinzas magnéticas, se apreció claramente que la tercera pinza, la que tiene más vueltas en la bobina y una punta más delgada, genera un campo mayor con menos corriente (Ver figura 4), lo que nos permite manipular fácilmente las muestras de partículas magnéticas. Sin embargo, esta pinza podría ser mejorada; teniendo una bobina con mayor número de vueltas, y donde la punta sea del mismo material que el núcleo. También se pensó en usar un núcleo de ferrita que tiene una alta permeabilidad magnética, lo cual les permite almacenar campos magnéticos con más fuerza que el hierro, sin embargo por falta de tiempo no se pudo conseguir.

Figura 5. A) Pinza magnética 3 (mancha negra) colocada sobre una muestra de partículas magnéticas Sera-Mag SpeedBeads, sin aplicar ninguna corriente. B) Pinza magnética 3 con una corriente pequeña, se aprecia como las partículas magnéticas se alinean en dirección al campo.

C) La pinza magnética 3 está generando un campo magnético muy grande, tanto que las partículas se siente atraídas hacia la punta donde se concentra el campo.


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PERFIL PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOELECTROENFOQUE EN CAPILAR

Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Media, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, ca-rretera Rioverde-San Ciro Km.4, Ejido Puente del Carmen, C.P. 79617, Rioverde San Luis Potosí,

México. [email protected]; [email protected]

Pérez Medrano, N.; Maldonado Cervantes, E.

RESUMEN La cerveza artesanal es una bebida natural y con bajo contenido en calorías (aprox. 42 Kcal por 100 ml), bajo grado de alcohol, no contiene grasas ni azucares y si una cantidad importante de hidratos de carbono, vitaminas y proteínas. En este proyecto se realizó el análisis y cuantificación de proteínas encontradas en muestras de cervezas artesanales, las muestras de cerveza artesanal fueron extraídas y precipitadas, para determinar la concentración de proteína total por medio de dos métodos colorimétricos: método Bradford y Ácido bicinconico (BCA), en los cuales fue empleado un estándar para la cuantificación, la albúmina de suero bovino. La concentración obtenida fue analizada por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS- PAGE, se identificaron las masas moleculares de las muestras obteniendo una ligera variabilidad en pesos moleculares. Sin embargo el estudio requiere de una continuación para identificar las proteínas encontradas en la muestra de cerveza artesanal.

Palabras clave: cerveza, proteínas, electroforesis, gel de poliacrilamida.

ABSTRACT Craft beer is a natural drink and low in calories (approx. 42 kcal per 100 ml), low alcohol, contains no fat or sugar and if a significant amount of carbohydrates, vitamins and proteins. In this project the analysis and quantification of proteins found in samples of microbrews was conducted, samples of craft beer were extracted and precipitated to determine the total protein concentration by two colorimetric methods: Bradford and acid method bicinchoninic (BCA) in which it was used a protein standard pattern for quantification, bovine serum albumin standards for processing. The concentration obtained was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE, the molecular weights of the samples were identified obtaining a slight variability in molecular weights. However, the study requires a continuation to identify the proteins found in the sample of microbrews.

Keywords: beer, proteins, electrophoresis, poliacrylamide gel

INTRODUCCIÓN La cerveza es una bebida alcohólica de baja graduación resultante de fermentar mediante levadura seleccionada, el mosto procedente de malta de cebada, sólo o mezclado con otros productos amiláceos transformables en azúcares por digestión enzimática, cocción y aromatizado con flores de lúpulo. Los

Keir C. Neuman, A. N. (16 de Julio de 2012). Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Obtenido de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3397402/

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Reference Guide, 4-9.


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uniforman sus cargas, por lo que la migración sólo depende de su peso molecular. En este caso se utilizará la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificación de una proteína. El gel de poliacrilamida se prepara a partir de las reacciones entre los radicales libres de los monómeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N’- metilen bisacrilamida para formar una red. La tetrametiléndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerización y el ion persulfato (S2O8 -) realiza la función de catalizador favoreciendo la formación de radicales libres. En un gel de poliacrilamida-SDS, las proteínas pequeñas viajan más rápido que las de mayor tamaño, ya que el tamaño del poro del gel entorpece el paso de las proteínas de mayor peso molecular. El objetivo de esta investigación es el aislamiento, cuantificación y separación de las proteínas encontradas en muestras de cerveza artesanal y determinar el peso molecular mediante técnicas electroforéticas.

METODOLOGIA

La muestra de cerveza artesanal fue elaborada con una proporción de malta de trigo y cebada 1:1 en el laboratorio de Microbiología Aplicada de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí campus Zona Media. Precipitación de la muestra Para la obtención de las proteínas provenientes de la cerveza artesanal se usó una precipitación con acetona, previamente almacenada a -20°C, en tubos eppendorf, se agregó cerveza artesanal y acetona en proporción 1:3 posteriormente y fue almacenada durante una hora a -20°C en Refrigerador modelo: GBMMLOGAVGS Resuspención de la muestra Las muestras precipitadas con acetona fueron centrifugadas a 13,000 rpm durante 10 minutos, eliminando el sobrenadante de los tubos para posteriormente resolubilizar la muestra con una solución amortiguadora de fosfatos (PBS) el conjunto de muestras precipitadas fueran colectadas en una sola muestra concentrada de proteínas, usando pipetas de automáticas regulables de 20-100 μl Thermo scientific. Cuantificación de proteína por método ácido bicinconico (BCA). Se realizaron 5 soluciones estándar con albúmina de suero bovino (BSA) y buffer de fosfatos (PBS) la cuantificación fue realizada basada en el método recomendado por el fabricante: Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) los estándares fueron incubados en Heraterm incubator (Thermo Scientific) a 37°C durante 30 minutos. La lectura del espectrofotómetro fue ajustada a 562 nm. Cuantificación de proteína por método Bradford Se realizaron 5 soluciones estándar de proteína con buffer de fosfatos (PBS) a 0.1 M, pH en 10 mg/ml. La solución stock fue preparada en relación de 20 partes de solución stock más 1 parte de estándar o muestra en tubos de ensayo; agregando a cada tubo de ensayo 1500 ul solución stock y 80 ul de muestra o estándar usando pipetas de automáticas regulables de 20-100 μl y de 200-1000 (Thermo Scientific). Se incubaron en Heraterm incubator (Thermo Scientific) los estándares a 37°C durante 30 minutos. La lectura del espectrofotómetro Spectrophotometer S-22 UV/Vis fue ajustada a 562 nm. Electroforesis sds- page :La elaboración de gel de separación en 6 ml con acrilamida 30%, Agua destilada, tris [1.5M] a pH 8.8, SDS (10%), PSA (10%) y TEMED (0.1–0.2%). Desgasificar durante 15 minutos, la cámara electroforética (Miniprotean II Bio-Rad.) previamente armada con separadores de 0.75 mm, se llenó con la mezcla ya mencionada y se dejó polimerizar durante una hora. Se preparó el gel concentrador en 1 ml con acrilamida 4%, agua destilada, tris [0.5] a pH 6.8, SDS10%, PSA 10%, TEMED (0.1–0.2%), se añadió en la parte inferior del molde y se dejó polimerizar durante una hora.

constituyentes de la cerveza provienen de sus cuatro principales materias primas, malta, lúpulo, agua y levadura. El principal componente de la cerveza es el agua, que se acompaña de otros compuestos como etanol, ácidos orgánicos, compuestos nitrogenados, carbohidratos, sales minerales, vitaminas, sustancias espumantes, sustancias aromáticas y compuestos fenólicos. La cerveza contiene una cantidad variable (20 a 600 mg / L) de proteínas, con masas moleculares de aproximadamente 5 kDa hasta más de 100 kDa, que surgen principalmente a partir de cebada malteada o de otros cereales empleados en la producción de cerveza. Mainente, F., Simonato, B., Zoccatelli, G., & Rizzi, C. (2011). Para la cuantificación de proteínas solubles se utilizan generalmente métodos colorimétricos, en dichos métodos se utiliza el espectrofotómetro. El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, entre otras), están presentes en una disolución y en qué cantidad. Los diferentes métodos para la cuantificar la concentración de proteínas son:

Método de Bradford, se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arginina, Triptófano, Tirosina, Histidina y Fenilalanina de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre produciendo una absorbancia máxima a 595 nm. El método de Bradford sólo es afectado por algunos detergentes y las soluciones básicas y es necesario construir una curva de calibración para determinar la concentración de las muestras.

BCA es un método altamente sensible. Este método combina la reacción de las proteínas con Cu+2 en un medio alcalino produciendo Cu+ con un reactivo para la detección de Cu+ altamente selectivo y sensitivo denominado Acido bicinconico, en la forma de su sal de sodio soluble en agua. La estructura macromolecular de la proteína y cuatro péptidos específicos (cisteína, cistina, triptófano y tirosina y enlaces peptídicos) son los responsables de la formación de color en muestras de proteínas cuando son ensayadas con BCA.

Existen múltiples procedimientos antes de realizar una cuantificación que poseen el objetivo de eliminar elementos que pudieran afectar dicha cuantificación; uno de los procedimientos más habituales es la precipitación de proteínas con solventes orgánicos. La precipitación consiste en la conversión de proteínas solubles a estado insoluble. La precipitación con solventes es una técnica basada en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un solvente orgánico ligeramente polar (acetona) su mecanismo consiste en producir agregados de moléculas proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una mecanismo que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una constante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización de los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad de ésta. Una vez aisladas y cuantificadas la mezcla de proteínas se procede a realizar el análisis de estas. La tecnología más utilizada para la separación y aislamiento de proteínas es la electroforesis, mediante la migración de las partículas o moléculas cargadas ocurre cuando se establece un campo eléctrico. La velocidad de la migración depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado y de la carga neta de las moléculas a separar. La muestra se encuentra disuelta en una disolución llamada amortiguador de corrida; cuando éste se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las proteínas se encontrarán cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo eléctrico migrarán al ánodo. En condiciones normales, la migración diferencial de las proteínas dependerá tanto de la carga como del tamaño y estructura de la proteína, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas y se


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Para evaluar otro método de cuantificación se usó la metodología propuesta por Bradford (1976), la cual como ya se mencionó con anterioridad tiene afinidad con ciertos aminoácidos. A continuación se muestra en la Tabla 2 la preparación de los estándares de calibración para dicha cuantificación.

Tabla 2. Curva de calibración para la cuantificación por el método Bradford

Fuente: Elaboración propia

Grafica 2. Interpolación de resultados obtenidos en lectura del espectrofotómetro, obteniendo como resultado concentración de muestra 2.32 mg/ml. Margen de error de r = 0.997

Como se puede observar en el gel de poliacrilamida de la Figura 2 se observan bandas obtenidas oscilan entre 40 kDa y 60kDa; las cuales corresponden a las reportadas para el caso de proteínas de cerveza (Bak-Jensen, K. S et al 2004) estas bandas pueden pertenecer al aporte proteico de la malta de cebada; aunque es necesario realizar más estudios para verificar esta aseveración.

Figura 2. Gel de poliacrilamida teñido con azul de comassie obtenido mediante electroforesis sds-page de proteinas totales en cerveza artesanal.

REACTIVOS RESULTADOS No. BSA (10MG/ML) PBS R.BRADFORD A_545 1 0.2 98 ul 1420 ul 0.852 2 0.4 96 ul 1420 ul 0.978 3 0.6 94 ul 1420 ul 1.091 4 0.8 92 ul 1420 ul 1.187 5 1 90 ul 1420 ul 1.328

Se prepararon 5 muestras añadiendo 8.36 ul de muestra más 3 µl de buffer de fostatos (PBS), añadiendo a cada muestra 4 ul de buffer de carga. La electroforesis se llevó a cabo a 20 mA constantes, hasta que el azul de bromofenol alcanzo el fondo del gel. Los geles se colocaron en una solución de Azul de Coomassie al 0.025% durante 12 horas, posteriormente se sumergieron en una solución de Metanol al 50% y ácido acético al 10% y Agua destilada durante 1 hora para desteñirlo. Isoelectroenfoque: se preparo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la preparación de la curva de caliobracion se prepararon los estándares usando el estándar para la cuantificación, Albumina de suero Bovina (BSA); para evitar interferencias en la cuantificación se utilizó una solución amortiguadora de fosfatos, la cual usamos para disolver las proteínas de la cerveza. Las cantidades y resultados de la curva de calibración se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Curva de calibración para la cuantificación por el método BCA

Para obtener una representación gráfica de los resultados de la curva de calibración se graficaron los datos y se obtuvieron los parámetros de linealidad y ecuación de la recta, para posteriormente realizar una interpolación de nuestras cuantificaciones. Esta grafica la podemos ver en la Figura 1. Pudimos obtener una curva con una buena linealidad (R= 0.9924) en todos los puntos evaluados

Figura 1. Gráfico de la curva de calibración del método BCA. R= 0.9924, y= 0.7744X + 0.2747

Con la curva de calibración se realizó una interpolación de la lectura arrojada para la cuantificación de las proteínas de la cerveza; en un inicio nos percatamos que la concentración salía del rango de la curva y se tuvo que realizar una dilución en una proporción 1:10; el resultado obtenido fue una cantidad de 1.14 mg/ml. Esta cantidad de proteína concuerda con los reportes.

REACTIVOS RESULTADOS No. BSA (10MG/ML) PBS R.BCA A_562 1 0 100 ul 1420 ul 0.267 2 0.2 98 ul 1420 ul 0.398 3 0.4 96 ul 1420 ul 0.588 4 0.6 94 ul 1420 ul 0.811 5 0.8 92 ul 1420 ul 0.905 6 1 90 ul 1420 ul 1.024


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CARACTERIZACIÓN DE UN FLUIDO DE LENNARD-JONES UTILIZANDO SIMULA-CIONES DE DINÁMICA MOLECULAR IMPLEMENTADAS EN TARJETAS GRÁFICAS

Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; [email protected]

Posadas Vidales, L. G.; Guerrero García, G. I.

RESUMEN

La simulación computacional de dinámica molecular es una herramienta muy potente, que en este

proyecto nos permitió caracterizar un modelo de fluido de Lennard-Jones. Se realizaron distintas

simulaciones en las que partículas simulando un fluido interactuaron entre si según el potencial de

Lennard-Jones. En este proyecto usamos datos arrojados por las simulaciones, como las posiciones de las

partículas y el desplazamiento cuadrático medio, para después usando programación en C++ poder

calcular los distintos parámetros útiles para la caracterización del fluido. Entre los parámetros con los que

se trabajó están la función de distribución radial, el potencial de fuerza media, la fuerza media y el

coeficiente de difusión. También se reconstruyo una animación a partir de los datos arrojados por la

simulación, que nos permitió observar de manera gráfica la interacción entre las partículas del fluido de

Lennard-Jones.

ABSTRACT

Computed simulation of molecular dynamics is a very powerful tool, that allowed us to characterize a

Lennard-Jones fluid model in this project. Various simulations in which particles of a fluid interacted with

each other according to the Lennard-Jones potential were performed. In this project, we rely on the data

produced by the simulations, as the positions of the particles and the mean square displacement, in order

to calculate various useful parameters for the characterization of the fluid using C++ programing. Radial

distribution function, the potential of mean force, the mean force and the diffusion coefficient are included

in those parameters. An animation was also reconstructed from the data obtained from the simulation,

which allowed us to graphically observe the interaction between particles in the Lennard-Jones fluid.

Palabras clave: interacción, modelo, potencial.

INTRODUCCIÓN

Las simulaciones de dinámica molecular registran y analizan el movimiento de moléculas individuales en

modelos de sólidos, líquidos y gases. La idea clave es el movimiento, el cual se describe registrando como

las posiciones, velocidades y orientaciones de las moléculas cambian con el tiempo. Para simplificarlo,

podemos describir una simulación de dinámica molecular como una película que sigue a las moléculas a

través de su movimiento e interacciones con otras moléculas.

Las concentraciones obtenidas en los métodos colorimétricos Bradford y BCA tuvieron ligeras variaciones ya que dichos métodos tienen interferencias a ciertos detergentes tales como Tritón X-100 y SDS y esto se considera que pudo ser un factor que influyó en el resultado. Los pesos moleculares obtenidos mediante la electroforesis sds-page fluctúan entre los 40 kDa y 60 kDa. El protocolo sugerido por el fabricante para el isoelectroenfoque en capilar tuvo interferencias, las cuales repercutieron en el funcionamiento del mismo al momento de dejar correr la muestra.

CONCLUSIONES

Los resultados de esta investigación proporcionan evidencias que la cerveza artesanal contiene una gran cantidad de proteínas, y además se observaron bandas diferenciales con tamaños que oscilan entre 40 kDa y 60 kDa obtenidas mediante sds-page. Más sin embargo se sugiere mayor tiempo para continuar con su análisis e identificación de dichas proteínas por distintos métodos.

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El potencial de LJ se usó como base para la simulación, por lo que en la simulación las partículas

interactuaron entre si siguiendo este tipo de modelo fluido, se corrieron distintas simulaciones usando dos

diferentes temperaturas (KBT siendo igual a 0.6 y 1.2), las cuales se fijaron dentro de la simulación para

que permanecieran constantes; y variando la cantidad de partículas en cada simulación, una simulación de

cada una de las dos temperaturas para 10!, 10", 10� y 10� partículas respectivamente.

Las simulaciones de DM se corrieron usando GPU’s (Unidades de Procesamiento Gráfico) debido a la

notable ventaja que representa este recurso en cuanto a procesamiento, en comparación a las tradicionales

CPU’s. Cada una de las simulaciones dio como resultado un archivo de salida donde se registró el

Desplazamiento Cuadrático Medio (MSD) como función del tiempo total de la simulación y un segundo

archivo conteniendo las variaciones en la temperatura durante el tiempo de la simulación. Para las dos

simulaciones usando 10� partículas (con ambas temperaturas) se obtuvieron de la simulación, además de

los 2 archivos de salida mencionados, una serie de archivos (“fotogramas”) en los que se registró la

posición de cada una de las partículas en 10 instantes de la simulación, datos que nos sirvieron para crear

la animación de estas dos simulaciones.

Durante el desarrollo del proyecto, primero para comprender las bases de las simulaciones de DM y más

adelante para poder automatizar el análisis, procesamiento y obtención de otros parámetros a partir de los

datos obtenidos de las simulaciones, se utilizó la programación en lenguaje C++. Al comienzo del

proyecto se desarrolló un programa en el que se hacía una simulación de partículas cargadas y su

interacción con un campo eléctrico, programa en el que se usaron técnicas básicas para la DM, también se

diseñó un programa capaz de acomodar ‘N’ partículas en posiciones aleatorias dentro de una caja de

simulación. La animación gráfica de las simulaciones también fue posible con el desarrollo de un

programa que, al unir todos los fotogramas con las posiciones de las partículas en un mismo archivo, y al

darle a este archivo un formato “.xyz”, hizo posible que tal archivo fuera reproducible como película

usando el software libre “Jmol”.

Para obtener la función de distribución radial g(r) (la cual describe como varia la densidad de partículas

como función de la distancia desde una partícula de referencia) se diseñó un programa que, leyendo las

posiciones de las partículas desde los archivos de salida de la simulación, mide las distancias entre cada

par de partículas posible y agrupándolas en un histograma obtiene la función de distribución radial.

Usando también programas desarrollados en C++ se obtuvieron el potencial de fuerza media y la fuerza

media. El potencial de fuerza media se calculó a partir de la función de distribución radial siguiendo la

relación de la ecuación 2), y la fuerza media se obtuvo derivando el potencial de fuerza media como se

indica en la ecuación 3).

(2)

(3)


Se muestra la distribución homogénea de partículas obtenida usando el programa de distribución aleatoria;

se muestran 2 resultados, con 100 partículas distribuidas en la figura 2) y con 10000 partículas en la figura

3).

La idea determinista –concebida por Laplace a partir de las leyes de Newton– de que el comportamiento

de un sistema puede ser computado y predicho si se conocen el total de las condiciones iniciales de este

sistema, al ser llevada a una escala molecular, es la que nos permite simular las interacciones entre las

moléculas conociendo inicialmente las posiciones y momentos de cada una de las moléculas, lo cual viene

siendo la simulación de dinámica molecular.

Al correr una simulación de DM podemos obtener una serie de “fotogramas”, archivos generados cada

determinado lapso de tiempo en los cuales se escriben las posiciones y velocidades de cada una de las

moléculas en ese instante de la simulación. Estos registros de posiciones y velocidades en determinados

tiempos nos sirven por si mismos para correr una animación o película en la que vemos de manera gráfica

cómo se comportan las moléculas de nuestro modelo, pero además de poder ver el movimiento de las

moléculas del sólido, liquido, o gas que estemos estudiando, podemos obtener a partir de los registros de

posiciones y velocidades otros parámetros secundarios, pero no por ello menos importantes, parámetros

como el desplazamiento cuadrático medio (MSD por sus siglas en ingles), distribución radial, fuerza

media, potencial de fuerza media o el coeficiente de difusión, parámetros que nos proveen de información

útil al momento de comprender nuestro sistema. La obtención de estos parámetros para la caracterización

del sistema a partir de estos y a partir de la animación de la simulación, fueron los objetivos principales

del proyecto del cual aquí se habla, junto con el aprendizaje y practica de algunos otros de los aspectos

elementales para crear una simulación de DM, aspectos que también trataremos en este reporte.

METODOLOGIA

El principal modelo de estudio usado durante el proyecto fue un fluido de Lennard-Jones (LJ), esto es un

fluido en el cual las partículas interactúan en pares a través del potencial de Lennard-Jones descrito en la

ecuación 1).

(1)

Este potencial es función de la distancia r entre el par de moléculas y depende de los parámetros !

(intensidad de la interacción entre partículas) y " (volumen de exclusión) tal como se muestra en la figura

1.

Figura 1. Energía Potencial de LJ como función de la distancia, y su dependencia de ! y ".


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Figura 5. Función de distribución radial g(r). Con azul el fluido de KBT = 1.2 y con negro el de KBT = 0.6.

Para poder entender más claramente la formación de heterogeneidades en el fluido de LJ de 100,000

partículas con KBT de 0.6, se obtuvo la función de distribución radial, el potencial de fuerza media y la

fuerza media. También se calcularon éstos tres parámetros para el fluido de KBT = 1.2, para poder

comparar y determinar de qué depende la formación de heterogeneidades. En la figura 5) podemos

observar una comparación entre la distribución radial del fluido de KBT de 1.2 y el de 0.6, se ve

claramente que el fluido de 0.6 tiende a formar heterogeneidades al concentrarse un mayor número de

partículas cerca de la partícula de referencia, mientras que en el fluido de 1.2 la distribución radial solo

tiene un par de pequeños picos cerca de la partícula de referencia y luego se vuelve totalmente plana, lo

que nos indica una débil interacción entre partículas, por lo que este cambio en la temperatura entre ambas

simulaciones parece ser un factor muy importante para el agrupamiento y formación de cúmulos en un

fluido de LJ.

Figura 6 y 7. Función de distribución radial g(r) (izquierda) y fuerza media (derecha), ambas como función de la distancia. Se marcan tres momentos diferentes de la simulación de 10� partículas

con KBT de 0.6: con línea morada el comienzo de la simulación, con línea verde una vez transcurrido el 10% de la simulación, y con azul un 60%.

En la figura 6) se muestra la distribución radial en tres diferentes momentos de la simulación de 100,000

partículas con KBT de 0.6, y en dos de ellos se ve claramente el agrupamiento de partículas. En el tiempo 0

de la simulación la distribución radial es totalmente plana debido a que las partículas aún no han

Figura 2. 100 partículas distribuidas aleatoriamente dentro de la caja de simulación.

Figura 3. 10000 partículas distribuidas aleatoriamente dentro de la caja de simulación.

En la figura 4) se muestran algunos cuadros de la animación creada a partir de los fotogramas obtenidos de

la simulación del fluido de LJ. En este caso la simulación se realizó con 100,000 partículas y con un valor

de KBT = 0.6. En ésta animación se observó claramente la formación de cúmulos y otras heterogeneidades

desde los primeros cuadros. De manera contraria, en la animación de 100,000 partículas, pero con KBT de

1.2, no se observaron heterogeneidades evidentes, y el fluido se mantuvo relativamente homogéneo

durante la simulación.

Figura 4. Animación en Jmol de un fluido LJ con 100,000 partículas y KBT = 0.6.


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Figura 10. Coeficiente de difusión en función del número de partículas y la temperatura. Arriba KBT de 1.2, abajo 0.6

CONCLUSIONES

Con el trabajo realizado en este proyecto, aparte del aprendizaje adquirido sobre las bases y técnicas de

simulación computacional, se lograron desarrollar programas que nos sirven como herramientas útiles

para el análisis de dinámica molecular. Y haciendo uso de estas herramientas se llevó a cabo la

caracterización de un modelo de fluido y se estudió su comportamiento en relación a variables como la

cantidad de moléculas del fluido o la temperatura. Sobre este modelo se pudieron comprobar varias

relaciones ya conocidas en la literatura, como es el caso de la relación entre la temperatura y el coeficiente

de difusión, siendo observable en los análisis realizados que una mayor temperatura corresponde a una

mayor movilidad y por lo tanto a una mayor difusión entre las moléculas.

Otra conclusión obtenida de manera clara a partir de los análisis realizados, fue la relación existente entre

la temperatura y el agrupamiento o formación de heterogeneidades, se concluyó que al tener las partículas

más frías una menor difusión o menor movimiento, estas son más propensas a atraerse entre sí y agruparse

formando cúmulos relativamente estables, a diferencia de un fluido con mayor temperatura, que al tener

mayor energía y por lo tanto mayor movimiento entre sus partículas es incapaz de agrupar a sus partículas

en cúmulos estables y en cambio permanece en un constante estado de agitación. La realización de la

animación también fue clave para comprender la dinámica existente en un fluido de Lennard-Jones, y el

como una baja temperatura se traduce a una lenta difusión (que era observable también al medir el MSD),

y todo esto favorece la formación de heterogeneidades, dadas por la naturaleza misma de la mutua

atracción entre moléculas, definida por el potencial de Lennard-Jones.

BIBLIOGRAFIA

ALLEN, M. P., TILDESEY, D. J. (1989) Computer Simulation of Liquids. Oxford Science Publications,

Clarendon Press

FRENKEL, D., SMIT, B. (2002) Understanding Molecular Simulation: From Algorithms to Applications,

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HAILE, J. M. (1992) Molecular Dynamics Simulation: Elementary Methods. John Wiley & Sons

RAPAPORT, D. C. (2004) Art of Molecular Dynamics Simulation, 2nd Edition. Cambridge University

Press

abandonado su posición aleatoria original, por lo cual aún mantienen su distribución homogénea mientras

que, en un segundo y tercer instante la formación de cúmulos aumenta, debido al tiempo que se necesita

para que las partículas interactúen y abandonen su posición original para agruparse entre sí.

En la figura 7) vemos la fuerza media en los mismos tres instantes de la misma simulación, y se puede

observar que la fuerza media que corresponde a un tiempo corto (10% del tiempo de simulación) es

prácticamente de la misma magnitud que la fuerza media correspondiente al tiempo medio (60% de la

simulación). Conociendo esto, se analizó en otras gráficas (no presentadas aquí) la fuerza media para cada

uno de los tiempos de la simulación, y se observó que no varía, por lo que parece ser independiente de la

distribución radial, la cual si varia conforme pasa el tiempo de simulación. Así mismo, el potencial de

fuerza media (estrechamente ligado a la fuerza media) tampoco mostró variaciones dependientes del

tiempo.

Figura 8. Potencial de fuerza media W(r), con rojo el

fluido de KBT = 0.6 y con verde el de 1.2.

Figura 9. Fuerza media como función de la distancia, con rojo el fluido de KBT = 0.6 y con verde el de 1.2.

En la figura 8) se comparan los potenciales de fuerza media como función de la distancia entre el fluido de

LJ con KBT de 0.6 y el de 1.2. Se puede observar que el potencial de fuerza media para 1.2 presenta picos

más altos que para 0.6, además después del primer pico, el potencial para 0.6 parece quedarse en valores

negativos e irse acercando lentamente a 0. En la figura 9) donde se compara la fuerza media, de notan

picos positivos y negativos de mayor amplitud para el fluido con KBT de 1.2 que para el de 0.6. Sin

embargo, después de los primeros picos, la línea de 1.2 se aproxima más a 0 que la de 0.6 en la que

quedan pequeños picos remanentes.

A partir de los datos sobre el MSD en función del tiempo para cada una de las simulaciones con 100,

1000, 10000 y 100000 partículas, se obtuvo el coeficiente de difusión (figura 10), este nos sirve de

parámetro para evaluar la dependencia de la dinámica del fluido respecto a la temperatura y al número de

partículas. En la gráfica se observa como el coeficiente de difusión es proporcional al número de

partículas, y una notable diferencia entre la difusión de los fluidos con diferentes temperaturas, teniendo

una mucho mayor difusión el fluido con una mayor temperatura (KBT = 1.2).


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condensación de Bose-Einstein (Byrnes, T., Kim, N. Y., & Yamamoto, Y., 2014; Buller, J. V. T., Cerda-Méndez, E. A., Balderas-Navarro, R. E., Biermann, K., & Santos, P. V., 2016).). En México no se ha implementado hasta ahora su estudio experimental. El proyecto en el que participé es el primero a nivel nacional en esta área. Para poder fabricar una MC exitosamente, es necesario tener un control muy preciso durante el proceso de crecimiento de la misma. En éste proyecto se implementó y utilizó una técnica por monitoreo óptico in situ la cual provee un método confiable para controlar de forma muy precisa los espesores de las capas que la componen.

MARCO TEORICO

Microcavidades ópticas Una MC es una estructura que consiste en dos espejos de alta reflectividad, llamados Reflectores Distribuidos de Bragg (DBR, por sus siglas en inglés), colocados uno frente del otro y separados por una capa espaciadora [Figura 1a)]. La capa espaciadora, de índice de refracción n, tiene un grosor de λ/2n, donde λ es la longitud de onda de la luz que se desea confinar en la MC. Además, dentro del espaciador existe una capa ultra-delgada (algunos nm de espesor), llamada pozo cuántico (QW, por sus siglas en inglés), donde se confinan electrones. Al entrar luz, esta queda atrapada en la cavidad y en el QW se absorbe un fotón, que provoca un salto de energía de un electrón quedando por un momento un “hueco” (que tiene carga positiva residual del núcleo). Debido a la interacción Coulombiana entre el electrón y el hueco, se forma una nueva cuasi-partícula llamada excitón. Al regresar espontáneamente a su nivel de energía inicial, el excitón emite el fotón que absorbió, y este queda atrapado por un corto periodo en la cavidad. El proceso de emisión y absorción del fotón por el excitón se repite muchas veces (alrededor de 1000) hasta que el fotón sale de la cavidad ya que los DBRs son de reflectividad finita. La repetida emisión y absorción da origen al llamado acople fuerte. Éste último es un régimen donde se modifican las propiedades de fotón y del excitón, los cuales originalmente tienen la misma energía. El resultado es la generación de una nueva cuasi-partícula que es mitad luz y mitad materia denominada polariton. El acople fuerte se puede identificar en una medida de reflectancia, por ejemplo, por el comportamiento de cruce evitado de las líneas de resonancia del excitón y del fotón dentro de la región espectral de la alta reflectividad de los DBRs [Figura 1b)]. Esto es, en lugar de que las señales de los dos componentes se traslapen, se observan dos resonancias separadas por la energía de acople entre el excitón y el fotón (Skolnick, Fisher, & Whittaker, 1998).

Figura 1.a) Esquema de una MC óptica. La flecha apunta hacia la superficie de la muestra. b) Simulación del espectro de reflectancia de una MC en el régimen de acople fuerte. Se observa una

región de alta reflectividad (R) y en el centro, dos valles separados por la energía de acople entre el excitón-fotón.

ACOPLE LUZ-MATERIA EN MICROCAVIDADES SEMICONDUCTORAS: CRECIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN-SITU

1Unidad Académica de Física, Universidad Autónoma de Zacatecas, Calzada Solidaridad esquina Paseo La Bufa s/n, C.P. 98060, Zacatecas, Zac., México, [email protected]; 2Instituto de Inves-tigación en Comunicación Óptica, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Karakorum, Lo-mas Cuarta Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., México; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]

Ramírez Díaz, A. L.1; Cerda Méndez, E. A.2; Ruiz Cigarrillo, O.2; Lastras Martínez, A.2; Ortega Gallegos, J.2; Santiago García, J. G.2

RESUMEN Realizamos el crecimiento parcial de una microcavidad (MC) semiconductora, la cual está compuesta por múltiples capas delgadas de aleaciones semiconductoras. La muestra de MC fue fabricada por la técnica de crecimiento por Epitaxia por Haces Moleculares. Para tener un mayor control de la calidad de la MC implementamos un sistema de monitoreo in situ por medio de medidas de reflectancia. Esto permite evaluar en tiempo real el espesor de cada una de las capas conforme son crecidas. Las medidas de reflectancia las hicimos con un espectrómetro compacto y con un montaje óptico que acoplamos a la cámara de crecimiento a través de un puerto óptico. Se logró el monitoreo in situ del crecimiento de la muestra.

ABSTRACT We carried out the partial growth of a microcavity (MC) semiconductor, which one is composed by mutiple thin layers of semiconductor alloys. The MC simple was fabricated using growth by Molecular Beam Epitaxy. In order to have full control of the quality of the MC, we implemented a system of in situ optical monitoring by measuring reflectance. This allows to assess in real time the thickness of each one of the layers as is grown. We did the measurements of reflectance using a compact spectrometer and with an optical setup that was directly coupled to the growth chamber through an optical port. We successfully realized the in situ monitoring of the sample growth. Palabras Claves: Microcavidades, Acople Fuerte, Excitón, Polaritón, Pozo Cuántico

INTRODUCCIÓN

Las microcavidades ópticas (MC) permiten estudiar la interacción entre la luz y la materia. Esta última se observa en dos regímenes: acople fuerte y acople débil. El acople débil ocurre, por ejemplo, en la emisión de la luz estimulada en los láseres. El acople fuerte, por el contrario, da origen a interesantes fenómenos como la formación de nuevas cuasi-partículas que son mitad luz y mitad materia. Éste último es el objetivo a lograr en la MC de este proyecto. Las MC en estructuras semiconductoras se han estudiado en el régimen de acople fuerte desde 1992 por Weisbuch y colaboradores (Weisbuch, Nishioka, Ishikawa & Arakawa, 1992), los cuales lo demostraron por primera vez en el espectro de reflectividad de MCs hechas de aleaciones de (Al,Ga)As. A partir de entonces, numerosos grupos alrededor del mundo han realizado investigaciones basadas en éste sistema, ya que permite observar interesantes fenómenos como


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Reflectancia para el monitoreo de MBE in-situ En un primer paso, emulamos ex situ las condiciones de medición en la cámara de crecimiento: distancia entre la muestra dentro de la cámara y el arreglo de alrededor de 1 m, la entrada y salida de la luz en la cámara por el puerto óptico (de 5 cm de diámetro) y el espacio limitado con el que se cuenta para colocar los elementos ópticos junto a la cámara. El diseño final del montaje óptico realizado se muestra en la figura 3. El montaje óptico lo colocamos en una placa de aluminio. Éste consiste de la lámpara de tungsteno con un iris de 2 mm de diámetro, una lente de distancia focal de 14 cm con la cual se enfoca la luz sobre la muestra y una segunda lente de 9 cm, la cual enfoca el haz reflejado por la muestra en la entrada de la fibra óptica. El tamaño de la mancha de luz sobre la muestra es de 1.5 cm, que corresponde bien con la magnificación por la lente (x6).

Figura 3. Montaje óptico para medidas in situ. La luz de la lámpara incide en la lente de f = 14 cm y esta la enfoca en la muestra. La luz reflejada llega a la lente de f = 9 cm, que la enfoca en la entrada

de la fibra óptica. Para hacer las pruebas de alineación, se colocó un espejo en la posición que correspondería a la muestra en la cámara. A una distancia de 40cm del montaje óptico (que es la distancia al puerto óptico), obtuvimos las imágenes del rayo incidente y el reflejado Figura 4 para asegurarnos de que la distancia entre ellos fuera menor a la apertura óptica del puerto de 5 cm. Posteriormente la placa con el montaje óptico fue acoplada a la cámara MBE (figura 5).

Debido a que durante el crecimiento la muestra se encuentra rotando, la mancha de luz reflejada precesa alrededor del eje óptico principal. Por esta razón, fue necesario ajustar la segunda lente para asegurarnos que la luz incidiera constantemente en la fibra óptica. Adicionalmente, para cada experimento se promediaron 30 mediciones separadas por un intervalo de 1s con un tiempo de integración de 50ms, ya que, debido a dicha precesión, la cantidad de luz incidente en la fibra variaba con el tiempo.

Figura 4. Foto del haz incidente y reflejado.

Figura 5. Vista lateral superior del arreglo acoplado a la cámara de MBE. La placa esta inclinada a 45° con respecto de la horizontal.

Epitaxia por Haces Moleculares La técnica de Epitaxia por Haces Moleculares (MBE, por sus siglas en inglés) consiste en el crecimiento de películas delgadas cristalinas por medio de la deposición de materiales, capa atómica por capa atómica. El crecimiento por MBE se realiza dentro de una cámara cerrada en condiciones de ultra alto vacío (UHV, por sus siglas en inglés) (1x10-7 Torr.). El crecimiento de la estructura se hace sobre una base cristalina (sustrato). Los elementos que se utilizan en las aleaciones están en hornos, en donde se eleva su temperatura hasta alcanzar su punto de sublimación (900-1000°C). Los átomos de los elementos salen de los contenedores hacia la cámara con una presión muy grande formando haces moleculares colimados y dirigidos al sustrato, que está a temperaturas altas (600°C) y montado sobre una base rotante para favorecer la homogeneidad de la deposición de los átomos (Joyce, 1985).

METODOLOGÍA Caracterizamos las muestras de MC crecidas por MBE por medio de reflectancia ex-situ e in-situ en tiempo real. Éste último lo realizamos por medio de un montaje óptico especial acoplado en la cámara de crecimiento a través de un puerto óptico en la misma para hacer medidas de la muestra dentro de la cámara (Biermann, Cerda-Méndez, Höricke, Santos, & Hey, 2011). Así mismo, se hizo el crecimiento y monitoreo in-situ de un DBR de la MC. Caracterización óptica ex situ En una primera etapa se realizaron pruebas para medir la reflectancia ex situ de muestras de control para entrenarnos en el uso del espectrómetro (Ocean Optics, modelo HR4000) utilizado para el monitoreo in situ. El espectrómetro cuenta con una resolución de 3.45nm y un rango espectral de 200-1100nm. Además, es muy conveniente porque nos permite tener movilidad dado su tamaño pequeño (148.6mmx104.8 mmx45.1mm) y su, facilidad de uso, ya que es un dispositivo “plug and play”. Finalmente, se puede hacer uso de una fibra óptica, lo cual es muy cómodo ya que no interfiere en el espacio donde colocamos el montaje óptico para realizar las medidas in situ. El arreglo para medidas ex situ se muestra en la figura 3a). En este, la luz de una lámpara de tungsteno incide en un iris, para obtener una imagen puntual. Después, llega a un espejo parabólico que colima el haz y lo dirige a la muestra. La luz reflejada es recolectada por el espejo cóncavo. De ahí incide en la entrada de la fibra óptica, la cual esta acoplada al espectrómetro, el cual es controlado por una computadora. Dos medidas de la reflectividad de la muestra de control se muestran en la figura 3b). En éste se observa la zona de alta reflectividad (entre 750 nm y 810 nm) con un valle alrededor de 800 nm, que corresponde a la resonancia de la cavidad. Esta muestra fue crecida anteriormente en el IICO, pero sus propiedades no son óptimas para observar el acople fuerte.

Figura 3. a) Arreglo óptico para mediciones ex situ, b) Espectros de reflectancia de la muestra de control.


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espectros de cada capa, aunque esta vez ligeramente por encima del valor de λ esperado de 840nm [Figura 6b)]. En la capa 15, sin embargo, hubo nuevamente una falla mecánica que provocó que se depositaran dos capas de mismo índice (alto) de refracción, formando una capa de λ/2n. Por ende, se modificaron las formas de línea de los espectros. Posteriormente se realizó una simulación numérica de la estructura (Yariv, & Yeh, 1984) y como se puede ver en la Figura 6c), está reproduce muy bien las formas de línea obtenidas experimentalmente del segundo crecimiento. Como las fallas mecánicas en la cámara se podrían presentar en las demás sesiones sería inconveniente continuar así, por eso se decidió detener el crecimiento para atender las correcciones a la cámara de crecimiento.

Figura 6. Espectros experimentales de reflectancia de a) la primera y b) segunda sesiones de crecimiento. c) Simulación numérica de la segunda sesión. El número de capas aumenta de abajo

hacia arriba

CONCLUSIONES Se implementó, caracterizó y utilizó un montaje óptico para el monitoreo in situ por medidas de reflectancia en tiempo real para crecimiento por MBE. Mediante éste, se pudo observar de forma detallada el crecimiento de una estructura multicapa compleja, así como analizar cuantitativamente los problemas que se presentaron durante el crecimiento y corregirlos en una segunda sesión. Se concluyó que el grosor de las capas crecidas en una primera sesión de crecimiento era más delgado que lo esperado debido a que la tasa de crecimiento disminuyó durante el crecimiento. Esto fue corregido en una segunda sesión de crecimiento. Se presentaron problemas técnicos que tuvieron que ver con cuestiones ajenas al proyecto. A pesar de esto, se pudo crecer una estructura de alta calidad y con parámetros muy cercanos a los esperados. Este trabajo constituye el primer en su tipo en México y es un primer paso para el estudio de interacción luz-materia en el régimen de acople fuerte en semiconductores en el país.

Fabricación de las MC Las MC fabricadas en el IICO están basadas en materiales III-V; en particular con aleaciones (Al,Ga)As. Los DBRs consisten en apilamientos de pares de capas delgadas con diferentes índices de refracción n (uno alto y uno bajo) y de espesor λ/4n (Skolnick et al., 1998), donde λ es la longitud de onda a estudiar. El arreglo de capas alternadas provoca interferencia constructiva de la luz que entra a la MC, lo que produce la región espectral de alta reflectividad. El espaciador se crece después de terminar el primer espejo, su espesor es de λ/2n. En este caso, la muestra fue diseñada para que el centro de la región de alta reflectividad del DBR coincidiera con la energía de emisión de pozos cuánticos de 15 nm a 15 K, que es λ=807 nm (15K es la temperatura de operación de la MC). Debido a que la muestra crece a 600°C, los índices de refracción de los materiales son diferentes, por lo que se espera que el centro se encuentre en 840 nm. El DBR crecido consistió de 12 pares de capas delgadas de la aleación (Al,Ga)As con concentraciones de aluminio de 80% y 15% para tener índices de refracción bajo y alto, respectivamente. Para el crecimiento se tiene que tener un gran control en muchos parámetros. La temperatura del substrato se midió con un pirómetro y al ser la adecuada (600°C) se abrieron las celdas del MBE para determinar un flujo adecuado según las composiciones deseadas para esta muestra. Así se obtuvieron los tiempos de deposición según el espesor deseado. Además, antes del crecimiento se depositó una capa buffer de GaAs para aplanar la superficie a nivel atómico. Éste proceso fue monitoreado por una muy conocida técnica de difracción de un haz rasante de electrones que, después de reflejarse en la superficie de la muestra, incide en una pantalla de fósforo. El MBE está controlado por medio de un programa que permite la apertura y el cierre automatizado de obturadores de las celdas que contienen los elementos a depositar. Los tiempos de deposición de las capas dependen de la tasa de crecimiento, que a su vez depende de la temperatura. La temperatura del Al utilizada fue de 1043°C con una presión de 5.7x10-8Torr.. Las tasas de deposición de las aleaciones fueron: AlGaAs, 0.1482 nm/s; GaAs, 0.0736 nm/s y AlAs, 0.0593 nm/s.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Crecimiento Se realizaron dos sesiones de crecimiento. La técnica de monitoreo in situ consiste en realizar una medida de reflectancia después de que se termina de crecer cada una de las capas que componen el DBR. El espectro medido después del crecimiento de una capa con índice de refracción alto debe presentar un máximo centrado en la longitud de onda para la que fue diseñada la MC, este caso, λ=840 nm. El espectro de una capa de índice de refracción bajo, por el contrario, presenta un mínimo. Dichos máximos y mínimos deben de estar alineados y la estructura de los espectros debe de ser simétrica alrededor de λ. En la Figura 6a) se muestran los resultados de la primera sesión. Aunque los mínimos y máximos se encuentran centrados en 830nm, lo que indica que los espesores de las capas eran menores a los nominales, están alineados el uno con el otro y las formas de línea son bastantes simétricas, lo que indica un crecimiento uniforme. Para aumentar la tasa de crecimiento se incrementó la temperatura de la celda de Al de 1043°C a 1050°C en la capa 13, y en la capa 14 se observó un incremento en la posición de su máximo. Sin embargo, al iniciar la capa 15 hubo un problema mecánico con los obturadores de la cámara, por lo que se creció una capa defectuosa. A partir de ahí, la forma de línea de los espectros se deformó. Disminuimos la temperatura del Al a 1048°C y del Ga a 847°C en el inicio de la capa 17 para tratar de recuperarla. Este cambio sin embargo no fue exitoso por lo que se detuvo el crecimiento. En la segunda sesión [Figura 6b)], se “enterró” el DBR que realizamos en la primera con una capa de GaAs de 0.6 µm de espesor. La forma de línea inicial [espectros 1 y 2, Figura 6b)] mostraba algunas trazas de la estructura del primer crecimiento, ya que la capa buffer no es completamente opaca. Estos, sin embargo, no afectan los resultados principales. Para este crecimiento, se aumentó la temperatura de las celdas un grado respecto al inicio de la primera sesión. La estructura muestra la estructura esperada en los


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PERFIL PROTEOMICO DE LA CERVEZA ARTESANAL POR ISOLECTROENFOQUE EN CAPILAR

Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Media, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Ca-rretera Rioverde- San Ciro Km. 4, Ejido Puente del Carmen, C. P. 79617, Rioverde, S.L.P. México,


Ramos Patiño, A. L.; Maldonado Cervantes, E.

RESUMEN La cerveza es una bebida que contiene una cantidad variable de proteínas que va de 20 a 600 mg/L, contiene una gran cantidad de hidratos de carbono y vitaminas. Realizamos la cuantificación de proteínas en la cerveza artesanal elaborada por alumnos de Ingeniería Agroindustrial, estas muestras fueron precipitadas con acetona debido a que la adición de un solvente orgánico produce agregados de moléculas proteicas que tiende a precipitar. Para la cuantificación de las proteínas en la muestra se utilizaron los métodos BCA y Bradford; en los cuales fueron utilizados estándares de albumina de suero bovino, estos son métodos colorimétricos sus compuestos al tener contacto con la proteínas cambian de color, en método BCA forma un complejo purpura y en el método Bradford toma un color de rojo a azul. Las concentraciones que se obtuvieron fueron analizadas por electroforesis en geles de poliacrilamida SDS- PAGE, sin embargo para el análisis de cuales proteínas se encuentran en la cerveza artesanal se necesita una continuación de este proyecto.

Palabras clave: Proteínas, Cerveza artesanal, electroforesis.

ABSTRACT Beer is a drink containing a variable amount of proteins ranging from 20 to 600 mg / L, it contains a large amount of carbohydrates and vitamins. We perform protein quantification in the home brewed beer by students of Agroindustrial Engineering, these samples were precipitated with acetone because the addition of an organic solvent produces aggregates of protein molecules that tend to precipitate. For quantification of proteins in the sample and the BCA Bradford methods they were used; in which standards were used bovine serum albumin, these compounds are colorimetric methods by contact with the proteins change color in BCA method forms a purple complex and the Bradford method takes a color from red to blue. The concentrations obtained were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE, however for protein analysis which are in the craft beer needs a continuation of this project.

Keywords: Proteins, Craft beer, electrophoresis.

INTRODUCCIÓN La cerveza fue desarrollada por antiguos pueblos elamitas, egipcios y sumerios. La evidencia más antigua de la producción de cerveza van alrededor de IV milenio a. C. La cerveza fue uno de los alimentos más

BIBLIOGRAFÍA WEISBUCH, C., NISHIOKA, M., ISHIKAWA, A., & ARAKAWA, Y., (1992). Observation of the coupled exciton-photon mode spltting in a semiconductor quantum microcavity. Physical Review Letters, 69(23), 3314-3317. BYRNES, T., KIM, N. Y., & YAMAMOTO, Y. (2014). Exciton-polariton condensates. Nature Physics, 10(11), 803–813. BULLER, J. V. T., CERDA-MÉNDEZ, E. A., BALDERAS-NAVARRO, R. E., BIERMANN, K., & SANTOS, P. V. (2016). Spatial self-organization of macroscopic quantum states of exciton-polaritons in acoustic lattices. New Journal of Physics, 18(7), 073002. SKOLNICK, M., FISHER, T., & WHITTAKER, D. (1998). Strong coupling phenomena in quantum microcavity structures. Semiconductor Science and Technology, 13(7), 645-669. YARIV, A. & YEH, P. (1984). Matrix Formulation for Isotropic Layered Media. En Optical waves in crystals: propagation and control of laser radiation, (pp.102-114), Wiley. BIERMANN, K., CERDA-MÉNDEZ, E., HÖRICKE, M., SANTOS, P. AND HEY, R. (2011). Controlled growth of exciton–polariton microcavities using in situ spectral reflectivity measurements. Journal of Crystal Growth, 323(1), 56-59. JOYCE, B. (1985). Molecular beam epitaxy. Reports on Progress in Physics., 48(12), 1637-1697.


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Para la cuantificación de la muestra de cerveza primero se utilizó el método BCA para esto se prepararon estándares con Albumina de suero bovino. De una solución base de BSA (Albumina de suero bovino) 10mg/ml se preparó lo siguiente:

Concentración a obtener

Volumen tomado de la solución base

Volumen de buffer de fosfatos agregada

Volumen final

0 mg/ml 0 µl 100 µl 100 µl 0.2 mg/ml 2 µl 98 µl 100 µl 0.4 mg/ml 4 µl 96 µl 100 µl 0.6 mg/ml 6 µl 94 µl 100 µl 0.8 mg/ml 8 µl 92 µl 100 µl 1 mg/ml 10 µl 90 µl 100 µl

Tabla 1. Se muestra la preparación de los estándares.

Se utilizó el reactivo de Bradford para lo cual se preparó una solución de trabajo de 10 ml y los volúmenes necesarios fueron: 50 partes del reactivo BCA= 9.80 ml + 1 parte de CuSO4 = 0.20 ml de los cuales para tomar la lectura en el espectrofotómetro en cada celda de 1.5 ml se agregó: 1 parte de estándar o muestra= 0.08 ml + 20 partes de solución de trabajo= 1.42 ml, antes de utilizarlas en espectrofotómetro fueron incubadas por 15 min a 60° C, al pasar este tiempo comenzando con el estándar de 0 µl/µg, después el estándar de 0.2 µl/µg y así sucesivamente hasta que nuestra muestra sea la última para obtener su absorbancia, nos arrojó los resultados que se muestran en la tabla 2 y en la figura 1. Para recalcular la concentración de proteína en nuestra muestra utilizamos el método Bradford por triplicado en el cual se utilizaron los estándares hechos con anterioridad y se hizo una solución de trabajo con el reactivo de Bradford de la cual se preparó 30 ml y los volúmenes necesarios fueron: 4 partes de agua= 24 ml + 1 parte del reactivo de Bradford= 6 ml de los cuales para llevar al espectrofotómetro se tomó para cada celda: 20 partes de la solución de trabajo= 1.42 ml + 1 parte de muestra o estándar= 0.08 ml fueron incubados por 30 min a 37° C, después comenzamos con el estándar de 0.2 µl/µg después el de 0.4 µl/µg y así sucesivamente hasta que nuestra muestra sea la última en tomar lectura, esto nos arrogo los resultados que se muestran en la tabla 3 y figura 2. Para realizar la electroforesis primero se preparó la muestra con el reactivo laemly en un tubo eppendorf se agregó 4 µl de laemly con 8.77 µl de la muestra y 6.23 µl de buffer de fosfatos se selló perfectamente, se calentó agua hasta llegar a 100° y se dejó el tubo eppendorf durante 15 min y se dejó en refrigeración a 4° C hasta ser utilizada. En la electroforesis se utiliza el gel de poliacrilamida que está dividido en dos secciones un gel al 30% y otro al 4% los volúmenes utilizados fueron los siguientes:

Gel de poliacrilamida al 30% Gel de poliacrilamida al 4% Acrilamida(30%) 2.77ml Acrilamida(4%) 0.132ml Agua 1.64ml Agua 0.003ml Tris[15M] pH 8.8 1.5ml Tris[0.5M] pH 6.8 0.250ml SDS 10% 60µl SDS 10% 10µl PSA 10% 30µl PSA 10% 5µl TEMED 3µl TEMED 0.5µl

Tabla 4. Volúmenes utilizados para el gel de poliacrilamida

importantes de la dieta de dicha sociedad, usándose como moneda de cambio en distintas transacciones. Los egipcios fueron perfeccionando las técnicas de elaboración aumentando el grado de alcohol. Todas las cervezas se elaboran con ingredientes básicos que son agua, levadura, lúpulo y malta de cebada o de otros cereales. Sin embargo, existen diferencias entre una cerveza artesanal a una industrial. Las industriales se producen base a una formula básica que buscan ingredientes y procesos económicamente viales, utilizan equipos de gran dimensión que producen cerveza en gran escala y menor tiempo. Algunas de las diferencias de mayor importancia son que las cervezas artesanales no se pasteurizan, de modo que los olores y sabores propios de la receta utilizada son conservados. Tampoco sufren un proceso de filtrado, por lo que no se eliminan partículas en suspensión y se obtienen cervezas con mayor turbidez. Al no realizar estos dos procesos sufren una segunda fermentación en la botella debido a que la levadura sigue teniendo sustrato que fermentar. Se consigue saturar a la cerveza de gas carbónico y etanol, obteniendo una graduación alcohólica mayor. La cerveza artesanal aporta una considerable cantidad de hidratos de carbono, vitaminas y proteínas. El objetivo de esta investigación es analizar y cuantificar las proteínas que se encuentran en la cerveza artesanal la cual fue elaborada en nuestra universidad por alumnos de Ing. Agroindustrial. Para cuantificar se utilizaron dos métodos, el primero es el método BCA el cual consiste en que el ácido bicinconico es un compuesto capaz de formar un complejo purpura intenso. Este método depende principalmente de que en un medio alcalino los enlaces peptídicos de las proteínas reducen Cu2+. Los iones Cu1+ producidos se unen a dos moléculas de BCA y al hacerlo les cambia la estructura electrónica de tal manera que ahora absorbe luz a 562nm y se vuelve purpura. El segundo método para cuantificar proteínas fue el método Bradford se basa en la unión de un colorante, Azul de Comassie G-250 a las proteínas. El colorante se torna de rojizo a azul y el máximo de absorción del colorante cambia a 595nm. Para el análisis de las proteínas que se encuentran en nuestra cerveza se utilizó la electroforesis en primera y en segunda dimensión. En primera dimensión mediante isolectroenfoque, una proteína tiene grupos cargados de ambas polaridades por lo que presentan un punto isoeléctrico que corresponde al valor del pH al cual la molécula posee carga neta igual a cero y por lo tanto es inmóvil en un campo eléctrico. Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, en este caso fue de 3 a 10, que puede tener forma de cilindro el cual fue el que se utilizó o de lámina. En la segunda dimensión las separa por su peso molecular por SDS-PAGE se utiliza dodecil sulfato de sodio SDS que es un detergente. La electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida (PAGE) con SDS separa las macromoléculas en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración por geles. Las proteínas se unen al SDS en una proporción uniforme, la carga otorgada por el SDS enmascara a las cargas proteicas de forma que las proteínas tratadas con SDS tienden a presentar relaciones carga/masa casi idénticas y de forma similares (desplegadas). Por esto la separación ocurre por efecto de filtración de geles en función del peso molecular.

MATERIALES Y METODOS La muestra de cerveza tuvo una preparación antes de ser utilizada, para obtener solo las proteínas que contenía se realizó una precipitación con acetona. En 6 tubos eppendorf se agregó a cada uno 300 µl de la muestra de cerveza en y 900 µl de buffer de fosfatos para se mezcló muy bien y se obtuvo un volumen de 1200 µl en cada tubo. Se dejaron a una temperatura de -20° y para la recuperación de la proteína se centrifugo a 13000 rpm durante 10 min. Posteriormente el sobrenadante fue desechado y obtuvimos la proteína en los 6 tubos eppendorf, a uno de los tubos con proteína se le agrego 300 µl de buffer de fosfatos se disolvió completamente en el vortex, posteriormente se realizaron resuspenciones seriadas del primero que teníamos se tomó 300µl, se agregó al segundo y se disolvió completamente en el vortex y así sucesivamente con los tubos restantes hasta obtener un solo tubo eppendorf con muestra. Fue refrigerada a -20° para después ser utilizada.


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Figura 3. Gel de poliacrilamida resultante de la primera electroforesis con la muestra usada en el método BCA.

De igual manera los estándares preparados con anterioridad y una segunda muestra de cerveza se realizó el método Bradford. En este método se hizo por triplicado, los resultados del espectrofotómetro se muestran en la siguiente tabla:

Estándar/ muestra Lectura de absorbancia 1

Lectura de absorbancia 2

Lectura de absorbancia 3

0.2 0.875 0.815 0.852 0.4 0.920 0.958 1.228 0.6 1.127 1.081 1.091 0.8 1.166 1.172 1.187 1 1.308 1.322 1.328

Muestra 0.858 0.896 0.874 Tabla 3. Lectura del espectrofotómetro de cada estándar y muestra por triplicado

Al interpolar los resultados se muestran en la figura 2, la concentración obtenida mediante este método fue de 2.39 mg/ml.

Figura 2. Curva de calibración por método Bradford

Se agregó esta solución en los vidrios del equipo de electroforesis, se introdujo el cepillo para crear los carriles donde será cargada la muestra y se dejó polimerizar, posteriormente la muestra anteriormente preparada fue cargada 20µl (usada en el método BSA) en un carril y se dejó correr a 7 Volts hasta tener resultados. Se hizo una segunda electroforesis con la muestra usada en el método Bradford utilizando los mismos volúmenes para elaborar los geles y el volumen de carga de la muestra fue igual a 20µl pero en 6 carriles de nuestro gel, y esperamos resultados. Cuando toda la muestra corrió se puso cada gel en azul de comassie hasta estar completamente azul fueron desteñidos con una solución de 100 ml compuesta de 50% de Metanol, 10% de Ácido Acético y 40% de agua cada gel, el resultado se muestra en la figura 3 y 4 respectivamente.|

RESULTADOS En el método BCA se analizaron los estándares y la muestra en el espectrofotómetro y los resultados de la absorbancia en cada uno fueron los siguientes:

Estándar/ muestra Lectura de absorbancia 0 0.267

0.2 0.398 0.4 0.588 0.6 0.811 0.8 0.905 1 1.024

Muestra de cerveza 1.177

Tabla 2. Lectura del espectrofotómetro para cada estándar y muestra.

De las lecturas anteriores se hizo una curva de calibración y al interpolar obtuvimos la concentración de proteína de nuestra muestra de cerveza que fue de 1.14 mg/ml.

Figura 1. Curva de calibración por método BCA

Conocida esta concentración la muestra fue utilizada para la primera electroforesis, nuestro resultado se muestra en la imagen 3.


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EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN A CONTAMINANTES ORGÁNICOS PERSISTEN-TES (COPs) EN TORTUGA LORA (Lepidochelys kempii) EN TAMAUILIPAS, MÉXICO

1Facultad de Química, Cerro de las campanas s/n, las campanas, 76010, Querétaro, Querétaro, Méxi-co, [email protected]; 2Universidad Autónoma de San Luis Potosí, CIACYT-Facultad de Medi-cina, Sierra Leona #550, Lomas segunda sección, SLP, SLP, México, [email protected]

Rangel Duarte, S. G.1; Sanjuan Meza, E. U.2; Espinosa Reyes, G.2

RESUMEN Las tortugas marinas son una especie importante debido a que ayudan a mantener sanos los océanos y playas en donde arriban. Sin embargo su población se ha visto reducida debido a la caza, a barcos pesqueros y otro factor importante la contaminación. Lepidochelys kempii es la única tortuga endémica del Golfo de México, esta especie arriba casi exclusivamente en Rancho Nuevo, Tamaulipas y se encuentra en peligro de extinción. El objetivo de este trabajo fue determinar las concentraciones de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) en plasma de L. kempii. Se registró la presencia de siete contaminantes (DDT, DDE, DDD, endosulfan, atrazina, PCB 52 y 153), el patrón de DDT y sus metabolitos y del endosulfan es que existen menores concentraciones en las muestras del 2016 respecto a las de 2015, los PCBs se mantienen en concentraciones similares para ambos años, la atrazina se incrementa significativamente de un año a otro. El hecho de encontrar concentraciones de contaminantes en plasma de tortugas podría representar un riesgo para la sobrevivencia de la especie.

ABSTRACT Sea turtles are an important species because they help maintain healthy oceans and beaches where arrive. But their population has been reduced due to hunting, fishing boats and other major pollution factor. Kemp's ridley sea turtle is the only endemic turtle Gulf of Mexico, this species up almost exclusively in Rancho Nuevo, Tamaulipas and is in danger of extinction. The aim of this study was to determine the concentrations of Persistent Organic Pollutants (POPs) in plasma L. kempii. the presence of seven (DDT, DDE, DDD, endosulfan, atrazina, PCB 52 y 153) pollutants was recorded, the pattern of DDT and its metabolites and endosulfan is that there are lower concentrations in samples from 2016 compared to 2015, PCBs remain at similar levels for both years, atrazine increases significantly from 2015 to 2016. The fact of finding contaminant concentrations in plasma of turtles could pose a risk to the survival of the species. Palabras clave: Ecotoxicología, COPs, Lepidochelys kempii, PCBs

INTRODUCCIÓN Los océanos son tan bastos y profundos que anteriormente se asumía que sin importar la cantidad de basura y químicos que se arrojaran en ellos, los efectos serian mínimos. Aquellos que proponen usar los océanos para arrojar deshechos tienen la frase de que “la solución a la contaminación, es la dilución”.

Conocida esta concentración en un gel de poliacrilamida se cargaron seis carriles y se realizó la electroforesis y nuestro resultado se muestra en la figura 4.

Figura 4. Segunda electroforesis con la muestra usada en el método Bradford.

En la figura anterior podemos observar algunas de las proteínas en la cerveza artesanal que van de un peso de 40 kDa a 60 kDa aproximadamente.

CONCLUSION Comprobamos que la cerveza artesanal contiene una gran cantidad de proteína de 1.14 mg/ml a 2.39 mg/ml, sin embargo para realizar el objetivo de este proyecto que es el isolectroenfoque es necesario más tiempo.

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Seleccionar las especies de biología bien conocida, esto se puede determinar en base a literatura. Se recomienda hacer un muestro poblacional preliminar para establecer si la especie escogida es abundante.

Las especies seleccionadas deben ser de fácil captura y manejo. Realizar un análisis documental básico de los componentes de la red trófica que existen en el sitio

de estudio, con la finalidad de seleccionar especies preferentemente ubicadas en diferentes niveles de la red trófica.

Existen tres tipos de biomarcadores: de susceptibilidad, de respuesta (o efecto) y de exposición. En el presente trabajo se trabajara con un biomarcador de exposición. Éstos se refieren a un compuesto exógeno (o un metabolito) dentro del organismo que refleja la exposición de éste a un xenobiótico. El análisis se realiza en fluidos corporales, sangre y orina principalmente, o incluso aire espirado. En el caso de tóxicos acumulativos, la dosis interna puede también reflejar la cifra de agente tóxico almacenado en uno o varios compartimentos corporales. Por ejemplo, la concentración de bifenilos policlorados (PCBs) en sangre refleja la cifra acumulada en los principales órganos de depósito (tejido graso) (Gil, 2000). En este caso se evaluara la existencia de COPs en el plasma de la tortuga lora (Lepidochelys kempii). La tortuga lora (L. kempii) es de las cinco especies de tortugas que recorren el Golfo de México, es la tortuga más pequeña mide entre 58.5 y 70 cm y pesa en promedio unos 45 kg. Cuenta con un caparazón casi circular. Las tortugas jóvenes son de color gris pero cambian de color al madurar. Las tortugas adultas son de color verde oliva en la parte superior y amarillo de la parte de abajo. Se alimenta de crustáceos (como cangrejos), invertebrados marinos y plantas, en especial cuando son jóvenes. Habitan principalmente en aguas costeras de fondos arenosos y lodosos ricos en crustáceos. Estas tortugas alcanzan la madurez entre los 10 y 15 años. Y en promedio dos veces al año, las hembras salen a tierra durante el día para anidar. La anidación en esta especie es generalmente sincronizada, con un gran número de hembras emergiendo del océano al mismo tiempo, en lo que se conoce como arribadas. Los machos una vez que eclosionan pasan el resto de su vida en el océano. Esta especie se encuentra principalmente en el golfo de México. En donde tiene un lugar preferido para anidar en Rancho Nuevo, Tamaulipas. También lo hace, aunque en menor medida, en Veracruz y Campeche. En 1947 desovaban alrededor de 42 000 hembras en Tamaulipas, pero este número ha ido decreciendo por factores como la recolección de huevos y la pesca excesiva para el consumo de carne, los cuales ya están prohibidos. Como amenazas actuales se encuentra la captura incidental por barcos camaroneros, el comercio ilícito, derrames de aceites e hidrocarburos, ingesta de plásticos, perdida se su hábitat por el desarrollo humano en las costas. Esta especie se encuentra desde 1970’s en peligro de extinción. Desde el establecimiento de la reserva natural Rancho Nuevo, Tamaulipas se han ido recuperado gradualmente las poblaciones de tortuga lora, por ejemplo en 2009 se obtuvo un registro de 5 200 hembras que arribaron en dos días a las playas de Rancho Nuevo. (CONABIO, Travel by mexico, 2011)

JUSTIFICACIÓN La tortugas marina juegan un rol vital en el mantenimiento de los océanos, manteniendo los arrecifes de coral y los lechos de algas marinas, transporta nutrientes del océano a las playas y a las dunas costeras (Wilson, 2010). Además socialmente juega un papel muy importante como parte de leyendas, de la economía, investigación, recreación, conservación, elaboración de artesanías y hasta medicinal (Mendoza, 2015). De las siete especies de tortugas marinas que habitan los mares del mundo seis vienen a anidar en las costas mexicanas y una, la Tortuga lora o kempii, tiene como único hábitat el Golfo de México y en aguas tropicales del Atlántico, por lo tanto es la tortuga marina más escasa del mundo (Travel by Mexico, 2011),

Hoy en día podemos observar islas de basura, principalmente plásticos en descomposición, flotando en el océano lo cual ha llevado a los ecosistemas marinos al borde del colapso (National Geographic, 2015). Los estuarios y aguas costeras reciben muchos de los aproximadamente 70 000 químicos sintéticos que están en uso comercial. Estos químicos, que entran a estas aguas por un sin número de formas, como derrames, desagües urbanos, y descargas municipales e industriales, consisten en hidrocarburos como el petróleo, compuestos clorados, pesticidas, y metales (Mallins, 1984). Estas actividades dan como resultado la destrucción y pérdida de estos hábitats. Los contaminantes que tienen mayor impacto en la salud de los estuarios son los nutrientes (eutrofización), patógenos (bacterias, virus y hongos) y los químicos (NOAA, 2008). Los contaminantes químicos son aquellos creados por el hombre o producidos accidentalmente en un proceso industrial, entre estos, hay una clase de contaminantes llamados Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) (Ngwa, 2015). La mayoría de los COPs fueron ampliamente usados durante el boom de la producción industrial después de la segunda guerra mundial, cuando miles de químicos sintéticos fueron introducidos para uso comercial, usados contra vectores para combatir enfermedades, en la agricultura, y la industria (Kovner, 2015). Los COPs son clasificados generalmente en cinco tipos los cuales incluyen policloro-dibenzopara dioxinas (PCDD) y policloro-dibenzo furanos (PCBF), bifenilos policlorados (PCBs), pesticidas organo-clorados (OC), y retardante de flama polibromado (PBDE). Los primeros tres son también conocidos como compuestos organo-clorados. Los compuestos organo-clorados fueron prohibidos en los 70s debido a su toxicidad, liposolubilidad, persistencia en el ambiente y su potencial de bioacumulación hacen a estos compuestos muy tóxicos (Ngwa, 2015). Estos contaminantes orgánicos son resistentes a la degradación ambiental a través de procesos químicos, biológicos y fotoliticos lo cual les da la habilidad de persistir en el ambiente, ser capaces de transportarse a largas distancias, bioacumularse en tejido animal y humano, bioacumularse en la cadena alimenticia. El potencial de bioacumulación de estos compuestos es debido su estructura halogenada, lo cual provoca que los COPs puedan verse biomagnificados, lo que quiere decir que se produce un incremento en la concentración del contaminante en las posiciones tróficas superiores dentro de la cadena alimenticia (Hong, 2015). Esto puede tener impacto potencialmente significativo en la salud humana y en el ambiente (Ngwa, 2015) debido a que en su mayoría son sustancias potencialmente carcinogénicas y mutagénicas (Zelnicková, 2015). Varios estudios han ligado la exposición a COPs a enfermedades, o anormalidades en un sin número de especies silvestres, como peces, aves y mamíferos. Es por esto que los animales pueden actuar como biomonitores. Ya que con ellos se pueden monitorear anormalidades, como en su comportamiento, defectos de nacimiento, o disminución de la población de la especie. Los animales tienen un largo tiempo sirviendo como monitores y centinelas de peligros ambientales. Desde el tiempo de los romanos, los mineros de carbón eran conscientes de la gran sensibilidad de las aves a la acción venenosa del monóxido de carbono y los llevaban consigo bajo tierra para advertirles del inminente peligro (Fox, 2001). Por otro lado los biomonitores son organismos silvestres que tienen respuestas biológicas a una agresión de un xenobiótico. De acuerdo con Ilizaliturri et al., (2011) al seleccionar un biomonitor se debe considerar lo siguiente:

Tipo de contaminantes presentes en el sitio. Se debe conocer la toxicocinética (la velocidad de cambio de la concentración de las sustancias tóxicas dentro del organismo) y la toxicodinamia (dónde y cómo se lleva acabo el efecto tóxico dentro del organismo) de los contaminantes.

Las probables rutas de exposición (ingesta, inhalación y dérmica) que dependerán del comportamiento ambiental de los contaminante. Una vez determinados los contaminantes y las rutas de exposición, es posible determinar qué especies son las más expuestas.


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DISCUSIÓN El DDT es un pesticida que fue usado ampliamente en el pasado para controlar insectos en la agricultura e insectos que transmiten enfermedades como el dengue y paludismo. Su uso se ha prohibido por el daño causado a la vida silvestre, aunque hay países en donde aún se utiliza. El DDE y DDD entran en el ambiente como producto de la degradación de DDT. El DDT y sus subproductos en teoría se degrada fácilmente en el aire por la luz solar, pero al evaporarse puedes ser transportados largas distancias en la atmosfera, y depositarse en suelo donde se adhiere firmemente y puede tardar decenas de años en degradarse. Además las partículas de suelo que contienen los contaminantes pueden llegar a entrar a ríos y por tanto llegar a desembocar en el mar, en donde estos contaminantes pueden irse al sedimento donde puede ser absorbido por las algas o acumularse en tejido graso de los organismos que habiten en este caso el océano, como pueden ser peces, moluscos, y como vemos en este caso la tortuga L. kempii, en donde por consumo de otro organismo o planta contaminado se biomagnifica la concentración del contaminante y puede llegar a niveles miles de veces más altos que en el agua (ATSDR, 2002). Los PCBs fueron usados ampliamente como refrigerantes y lubricantes en transformadores, condensadores y otros aparatos eléctricos. Su producción ceso a raíz de evidencia de que se acumulan en el ambiente y que pueden causar efectos perjudiciales. Los PCBs entraron al agua, aire y suelo durante su manufactura y uso. También entraron debido a derrames y escapes accidentales durante su transporte, escapes e incendios en transformadores, condensadores y otros productos que los contenían, y a través de vertederos. Al igual que el DDT y sus subproductos, los PCBs pueden semivolatilizarse y ser transportados largas distancias (efecto saltamontes). Por lo que se encuentran en prácticamente todo el planeta. Y al entrar al agua los PCBs pueden ser transportados por las corrientes, pueden adherirse a los sedimentos, y, como ya se mencionó con el DDT, se acumulan en plantas y en organismos como peces, crustáceos, moluscos, mamíferos marinos, en tortuga. En donde por la cadena trófica van biomagnificandose de un organismo a otro (ATSDR, 2000). Y estos niveles de contaminación en la tortuga pueden llevar a afectar adversamente la reproducción como lo menciona De Andrés et. al., (2016) en un estudio a la tortuga laud (Dermochelys coriacea) en donde se menciona que los COPs pueden tener efectos negativos en la reproducción, como la reducción en el número de crías. Además de mencionar que se ha encontrado evidencia de que los PCBs se transfieren de la madre al huevo, pudiendo estos afectar el desarrollo embrionario y por lo tanto disminuir así el número de crías. Y como mencionan Ming.ch’eng et. al., (2016), los PCBs también pueden afectar la determinación del sexo del embrión, se ha visto en experimentos en los que se incuban huevos de tortugas de agua dulce a temperatura para que se produzcan machos pero al ser expuestos a PCBs cambian de sexo a hembras, y al exponer a PCBs huevos que están en la temperatura para que se produzcan hembras se producen malformaciones en los oviductos de las tortugas. Es debido a estos efectos adversos de los COPs que es importante monitorear las concentraciones que tiene L. kempii, ya que como se ha mencionado es una especie en peligro de extinción, altas concentraciones de estos contaminantes puede llevar a la disminución de esta especie la cual juega un papel importante en el mantenimiento de los océanos y playas. Y como podemos observar en el Cuadro 1 tanto en 2015 como 2016 las concentraciones de DDE y DDD son mayores que las de DDT, por lo que podemos inferir que es DDT residual y que se está degradando, por lo que habría que monitorear que estos niveles sigan así, y en caso de aumentar DDT querría decir que de alguna manera está ingresando nuevamente más de este contaminante al medio, y habría que buscar la ruta de exposición de las tortugas, e intentar cesar esta exposición. Y de igual forma para los PCBs, se tendría que monitorear que sus niveles siguen bajando, así se estaría seguro de que no se están exponiendo aún más a la tortuga a estos contaminantes.

y como ya se mencionó habita particularmente en Tamaulipas. Es una especie que está en un riesgo extremadamente alto de desaparecer en el futuro cercano, debido a factores como la caza y recolección de sus huevos, que ahora ya están restringidos, actualmente una de las causas por las que se ve amenazada son por capturas incidentales por barcos pesqueros, y la pérdida o alteración de su hábitat. Y además de estos factores cabe destacar la adición de contaminantes como los COPs a su ambiente, los cuales pueden tener efectos perjudiciales en la salud de la tortuga y contribuir a la disminución de la población. Los COPs han sido detectados en tejidos de tortugas marinas de todo el mundo (Camacho, 2014; Mendoza, 2015; Merwe, 2010; Ragland, 2011). Esto debido principalmente a que estos compuestos que se degradan difícilmente, tienden a acumularse en tejido adiposo, el cual es abundante en las tortugas marinas, además la concentración de estos se biomagnifica a través de la cadena alimentaria. Otra vía por la cual pueden adquirir estos contaminantes las tortugas es por la ingestión de agua contaminada y por exposición dérmica (cloaca), otra vía que es de las más sutiles es la transferencia de la madre y la acumulación de productos químicos en los huevos de los medios de anidación contaminados. Existen pocos trabajos con tortugas marinas que demuestren efectos por exposición a contaminantes, sin embargo en tortugas dulceacuícolas se han observado daños como la feminización de la morfología externa de tortugas del Lago Ontario, donde se reportan concentraciones de plaguicidas organoclorados (OCP) y bifenilos policlorados (PCBs) concluyendo que las concentraciones de PCBs en el ambiente pueden actuar como disruptores endocrinos y son capaces de revertir el sexo gonadal en tortugas (Mendoza, 2015). Es por esto que el presente trabajo pretende definir si es o no la contaminación química, puntualmente por Contaminantes Orgánicos Persistentes, parte de los factores críticos que provocan la disminución de esta Tortuga marina.

OBJETIVO Cuantificar las concentraciones de Contaminantes Orgánicos Persistentes en plasma de tortuga de Rancho Nuevo, Tamaulipas, México.

METODOLOGÍA Para la extracción de los Compuestos Orgánicos Persistentes en plasma, se usó la técnica de extracción asistida por Sonda Ultrasónica focalizada la cual puede ser aplicada en cualquier matriz ambiental y biológica. La determinación e identificación de los COPs se realizó mediante Cromatografía de Gases masas siguiendo la técnica establecida por Flores-Ramírez et al., (2015).

RESULTADOS En el Cuadro 1 se muestran los promedios de las concentraciones de los COPs registrados en plasma de tortugas lora. Se cuantificaron seis COPs, éstos fueron PCB 52, PCB 153, atrazina, a-endosulfan, DDT, DDE y DDD.

Cuadro 1.- Niveles de COps registrados en plasma de tortugas en 2015 y 2016

Atrazina Endosulfan DDT total PCBs total COPs total 2015 10,05 12,61 11,95 12,17 46,78 2016 41,72 5,06 9,91 12,18 68,87


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CONCLUSIONES Se debe monitorear las concentraciones de COPs en plasma de L. kempii e identificar las fuentes, con la finalidad de minimizar o evitar la exposición de la fauna silvestre que habita en las costas del Golfo de México a éstos contaminantes, de lo contrario los COPs pueden ocasionar efectos adversos en su salud comprometiendo la supervivencia de la especie.

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dependiendo de los signos de la carga. La magnitud de ésta fuerza es mayor que en el caso gravitatorio, y el alcance también es infinito. La fuerza nuclear fuerte es la responsable de mantener unidos a los núcleos atómicos. Aunque su alcance es muy pequeña, la fuerza es más intensa que en el caso electromagnético. Finalmente, la fuerza nuclear débil es la responsable de la desintegración beta de los neutrones. Su intensidad es menor que la electromagnética y su alcance es aún menor que la nuclear fuerte. La relatividad general, desarrollada por el mismísimo Albert Einstein, es una teoría del campo gravitatorio. Las fuerzas anteriormente mencionadas, exceptuando la gravitatoria, pueden describirse en términos de la física cuántica. Hoy en día el problema está en describir la gravedad en términos de la mecánica cuántica, algo que resulta ser difícil porque la descripción de las leyes de la mecánica cuántica no son compatibles con la descripción matemática de la gravedad. Existen varias propuestas de abordar dicho problema, entre la cuales una de las más prometedoras se encuentra la cuantización de lazos. Antes de entrar con la física cuántica en la propuesta a estudiar, se necesita examinar la Hipótesis de Riemann. La función zeta de Riemann se define de la siguiente manera:

ζ(𝑠) = ∑ ��𝑠

��=� (1)

De la ecuación 1) el parámetro s puede ser complejo. Se requiere que la parte real de s sea mayor que 1, dado que para dichos valores la serie es convergente. Si s es igual a 1, entonces la serie es divergente. Los ceros triviales de la función zeta de Riemann son los pares negativos, es decir, -2, -4, -6, y así sucesivamente (Haran, 2014). Ahora bien, los ceros no triviales de la ecuación 1), de acuerdo a la hipótesis de Riemann, tienen como parte real ½ (Riemann, 1859), y parte imaginaria un valor E. De tal manera que los ceros no triviales de la ecuación 1) tienen la siguiente forma:

𝑠 = �2+ 𝑖𝐸 (2)

A lo anteriormente descrito se le conoce como una de las formulaciones de la Hipótesis de Riemann. El matemático Leonhard Euler demostró que los ceros de la función zeta de Riemann predicen la distribución de los números primos. Es aquí entonces en donde los números primos se pueden relacionar con la mecánica cuántica, a través de un operador Hamiltoniano. En la mecánica cuántica estándar, uno hace uso de la representación de Schrödinger, mediante la cual se pueden definir operadores que actúen en un espacio de Hilbert dado, sin embargo existe otra representación la cual resulta ser unitariamente no equivalente a la representación de Schrödinger, en este formalismo estos operadores toman representaciones diferentes teniendo en cuenta que el espacio-tiempo pasa de ser una estructura continua a una discreta. Dicha representación, en el caso de espacios de dimensión finita se le conoce como cuantización polimérica. El objetivo de utilizar éste formalismo es encontrar un operador Hamiltoniano cuyo espectro de energía, o mejor dicho, cuyos eigenvalores de la ecuación de valores propios da como resultado los ceros de la función zeta de Riemann, y sus eigenvalores o funciones de onda definan una distribución de probabilidad relacionada con la posición de los ceros en la recta real.

MARCO TEÓRICO Y METODOLOGÍA Dado un sistema dinámico, uno puede describir el momento y la posición de un sistema de partículas mediante las ecuaciones de movimiento de Hamilton, las cuales están dadas a continuación:

�̇�� = − 𝜕𝐻𝜕𝑞�

(3)

GRAVITACIÓN CUÁNTICA Y LOS NÚMEROS PRIMOS

Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Lateral Av. Salvador Nava s/n, Col. Lomas, C.P. 78290, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; jberra@

fc.uaslp.mx

Rentería López, O. J.; Berra Montiel, O. J.

RESUMEN Uno de los retos de la física en la actualidad es la unión entre la relatividad general y la teoría cuántica, el cual tiene como nombre gravitación cuántica. Una propuesta para construir dicha teoría es a través de la cuantización de lazos, donde el espacio-tiempo toma un carácter discreto. La Hipótesis de Riemann es una conjetura sobre la distribución de los ceros complejos de la función zeta de Riemann, en donde la parte imaginaria se relaciona con la distribución de los números primos. Existe una propuesta en el que los valores de la parte imaginaria de los ceros complejos corresponden a los eigenvalores asociados a un Hamiltoniano de un sistema cuántico. En el presente trabajo analizaremos, mediante el formalismo de cuantización polimérica, el comportamiento de las funciones de onda de un Hamiltoniano cuyo espectro está intrínsecamente relacionado con la distribución de los ceros de la función zeta de Riemann.

ABSTRACT One of the challenges of physics today is the union between general relativity and quantum theory, which has the name of quantum gravity. A proposal to build such a theory is through polymeric quantization or loop quantization, where spacetime takes a discrete character. The Riemann Hypothesis is a conjecture about the distribution of the complex zeros of the Riemann zeta function, where the imaginary part is related to the distribution of prime numbers. There is a proposal in which the values of the imaginary part of the complex zeros are the corresponding eigenvalues of a Hamiltonian of a quantum system. In this paper we analyze, using the formalism of polymeric quantization, the behavior of the wave functions of a Hamiltonian whose spectrum is intrinsically related to the distribution of the zeros of the Riemann zeta function. Palabras clave: Dinámica Hamiltoniana, Cuantización Polimérica, Hipótesis de Riemann.

INTRODUCCIÓN Desde hace mucho se ha intentado unificar la relatividad general con la mecánica cuántica. Existen cuatro fuerzas fundamentales en el universo que son las siguientes: gravitatoria, electromagnética, nuclear fuerte y nuclear débil. La interacción gravitatoria es una fuerza de atracción entre dos objetos cualesquiera del universo y cuya fuente depende de la energía. Aunque el alcance de dicha fuerza es infinita, la magnitud de la fuerza es muy pequeña debido a la magnitud de la constante universal de gravitación. La fuerza electromagnética afecta a los cuerpos eléctricamente cargados, y puede ser de atracción o repulsión


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La diferencia entre éste operador y el de la ecuación 5) es que éste deriva parcialmente respecto a p. Debido a la naturaleza discreta del espacio, en la representación polimérica ya no existe el operador de momento, sino otro operador (Corichi, Vukasinac, & Zapata, 2007), el cual está definido como:

𝑈�𝜆𝜑(𝑝) = 𝑒𝑖𝜆𝑝ħ 𝜑(𝑝) (10)

Para poder hacer uso del operador de momento, debemos hacer una regularización de la ecuación 10), por consiguiente, usando la expansión en serie de Taylor de la función exponencial y despreciando los órdenes de 𝜆3 resultantes (dado que el parámetro λ lo tomaremos infinitesimalmente pequeño), se llega a la siguiente expresión:

𝑝 = ħ𝜆 sin �

𝜆𝑝ħ � (11)

Se propone entonces examinar el Hamiltoniano siguiente en la representación polimérica:

𝐻 = 𝑥𝑝2 (12)

El objetivo de estudiar este Hamiltoniano dada por la ecuación 12) es intentar calcular sus eigenvalores con la ecuación 8) en el espacio de momentos usando la representación polimérica para así determinar el número de estados cuánticos y relacionarlos con la distribución de los ceros de la zeta de Riemann.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resolviendo las ecuaciones 3) y 4) con el Hamiltoniano propuesto en 12), se llega a las siguientes soluciones al sistema clásico:

𝑝(𝑡) = �𝑡−𝐶�

(13)

𝑥(𝑡) = 𝐶2(𝑡 − 𝐶�)2 (14)

En las ecuaciones 13) y 14) C1 y C2 son constantes y t es el tiempo. Se observa que el momento corresponde a una curva asintótica que tiende a cero mientras t avance, y el desplazamiento tiene forma de parábola. Al sustituir y desarrollar las ecuaciones 9) y 11) en 12), que a su vez es aplicada a una función de onda φ(p) en la ecuación 8), se llega a la ecuación de Schrödinger independiente del tiempo:

𝑖ħ2𝜆 ��2 sin �

2𝜆𝑝ħ �𝜑(𝑝) + ħ

𝜆 sin2 �𝜆𝑝ħ �𝜑

�(𝑝)� = 𝐸𝜑(𝑝) (15)

Esta ecuación diferencial tiene como solución:

𝜑(𝑝) = 𝐶𝑒𝑖𝐸𝜆c��𝜆𝑝ħ �

ħ2 csc �𝜆𝑝ħ � (16)

Donde C es una constante de integración. Como veremos a continuación esta función de onda define una distribución de probabilidad de los ceros de la función zeta de Riemann en la recta real.

�̇�� =𝜕𝐻𝜕𝑝�

(4) De las ecuaciones 3) y 4), el subíndice k indica la k-ésima partícula del sistema, p es el momento, q la posición y H es la función Hamiltoniana, la cual está relacionada con la energía de un sistema. La notación del punto encima de la función indica derivada respecto al tiempo. Desarrollando y resolviendo las ecuaciones 3) y 4) uno puede observar que son equivalentes a las leyes de Newton. Cuando uno pasa al formalismo de la mecánica cuántica, en la representación de Schrödinger se encuentran que los operadores de posición y momento, cuando actúan sobre las funciones de onda de un espacio de Hilbert dado están dados por:

𝑥�𝛹(𝑥) = 𝑥𝛹(𝑥) (5)

�̂�𝛹(𝑥) = −𝑖ħ 𝜕𝛹(𝑥)𝜕𝑥 (6)

Es decir, el operador de posición actúa multiplicando por x, mientras que el operador de momento multiplica por el negativo de la unidad imaginaria y la constante de Dirac (1.054×10-34 J∙s) y luego derivando parcialmente respecto a x. Usando estas representaciones, es posible definir el operador Hamiltoniano como:

𝐻� = 𝑝�2

2� + 𝑉(𝑥) (7)

El primer término del sumando de la ecuación 7) corresponde a la energía cinética, y el segundo término es la energía potencial la cual viene dada como una función de las coordenadas x. Las ecuaciones 5), 6), y 7) son los operadores con los que se trabajan en la representación de Schrödinger. La ecuación de Schrödinger independiente del tiempo tiene la siguiente forma:

𝐻�𝛹(𝑥) = 𝐸𝛹(𝑥) (8) Debido a que las soluciones a una ecuación de éste tipo son funciones (a excepción de la multiplicación de un factor de escala), se denominan ecuaciones de valores propios. Una función que resuelve una ecuación de valores propios se llama eigenfunción, y el valor que va con esa función se llama eigenvalor (Arfken, Weber, & Harris, 2013). De la ecuación 8), E corresponde a la energía y Ψ a una función de onda estacionaria. Ahora el reto es encontrar un operador Hamiltoniano, el cual sea autoadjunto, cuyo espectro de energía se relacione con la parte imaginaria de los ceros de la zeta de Riemann. Una propuesta para lograr esto es usando la cuantización polimérica, en donde el espacio-tiempo es discreto y por lo tanto los operadores de posición y momento resultan ser diferentes a los asociados a la representación de Schrödinger. Dado que en la representación polimérica el espacio ya no tiene un carácter continuo, sino que está discretizado por un parámetro λ. Debido a la naturaleza del problema, resulta conveniente usar la representación en el espacio de momentos, en este caso el operador de posición está dado por:

𝑥�𝜑(𝑝) = 𝑖ħ 𝜕𝜑(𝑝)𝜕𝑝 (9)


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ARFKEN, G.; WEBER, H.; HARRIS F. (2013). Mathematical Methods For Physicists. Waltham: Academic Press. CORICHI A.; VUKASINAC T.; ZAPATA J. (2007). Hamiltonian and physical Hilbert space in polymer quantum mechanics. Phys. Rev. D (76) 044016. SIERRA, G. (2008). A physics pathway to the Riemann Hypothesis. Física Teórica Julio Abed. 1-8.

Es posible determinar el números de eigenestados cuánticos con energía entre (0, E) de un sistema, mediante una aproximación semiclásica, para esto uno calcula el área bajo la curva generada por el Hamiltoniano en el espacio fase. Dado que las soluciones a nuestro problema tiene un comportamiento asintótico, no se puede integrar sobre todo el espacio, así que debemos integrar sobre un intervalo acotado por algunas constantes lx y lp , definidas en el espacio fase. De esta manera, el número de eigenestados de energía en la representación polimérica está dada por:

𝐸 ∫ 𝜆2�𝑝ħ2sin2�𝜆𝑝ħ �

�𝐸/�𝑥�𝑝

= 𝐸 ��𝑝− ��𝑥

𝐸�+�−𝐸�𝑝+

𝐸32

��𝑥�

3ħ3 + 𝑂(𝜆3) (17)

Donde el primer término corresponde a una aproximación de la fórmula de Riemann para la distribución de los ceros de la función zeta de Riemann (Sierra, 2008), y los demás términos de orden 𝜆, corresponden a los términos de fluctuación de la fórmula de Riemann-von Mangoldt, los cuales nos dan el comportamiento asintótico de los ceros en la recta real, los cuales se pueden asociar con el comportamiento caótico de un sistema clásico, el cual contenga órbitas periódicas en un espacio compacto. Cabe mencionar que para lograr una mejor aproximación podríamos tomar una discretización caracterizada por una topología p-adica, donde esta tiene como consecuencia hacer que la métrica definida por esta topología tome como puntos cercanos a los números primos, haciendo que la representación polimérica sea más fiable al tomar el número de estados semiclásicos.

CONCLUSIONES Una propuesta de construir una teoría de gravitación cuántica, que intenta unificar la relatividad general con la mecánica cuántica, es a través de la cuantización polimérica. En el formalismo de la cuantización polimérica el espacio-tiempo es discreto y esto da lugar a diferentes representaciones para los operadores de posición y momento, los cuales se utilizan para construir un operador Hamiltoniano con la finalidad de encontrar sus eigenvalores y examinar la relación que éstos tienen con la distribución de los ceros de la función zeta de Riemann. En el trabajo realizado se determinó las eigenfunciones de un Hamiltoniano que cumple las condiciones de la conjetura del caos cuántico en la representación polimérica. De la misma forma se calcularon las soluciones a las ecuaciones de movimiento clásico, y finalmente mediante un análisis semiclásico se obtuvo el número de eigenestados cuánticos, los cuales corresponden a la fórmula asintótica del número de ceros de la función zeta de Riemann, más un término de fluctuaciones. Aún hay mucho trabajo por hacer ya que hasta la fecha no se conoce un Hamiltoniano específico el cual tenga como espectro a todos los ceros de Riemann, sin embargo este mecanismo se ha generalizado a teorías de campos, como es el caso de la ecuación de Dirac. Resulta interesante analizar estos casos bajo la representación polimérica, ya que nos podría dar información acerca de los términos de fluctuaciones los cuales no pueden ser obtenidos mediante la representación estándar de la mecánica cuántica.

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Existen numerosas isoformas del CYP4A50, que se identifican mediante un número que representa la familia génica (secuencia de 40% o más de aminoácidos idénticos), una letra mayúscula que identifica la subfamilia y un número adicional arbitrario que designa la enzima individual. En este trabajo se analizaron las isoenzimas a partir de las estructuras cristalográficas disponibles en el Protein Data Bank (PDB) construimos una serie de modelos moleculares para las isoenzimas: CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 y CYP2C8, cabe destacar que escogemos estas 6 estructuras porque son las más involucradas en la metabolización de fármacos., especialmente en las últimas dos (Levien & Baker, 2003). Se utilizó la metodología Teoría Funcional de la Densidad (DFT por sus siglas en inglés), para calcular densidades de carga y polarización asociada a cada modelo molecular de cada isoenzima; todo esto con el fin de cuantificar las diferencias en la propiedades físicas y tratar de correlacionar éstas con su función metabólica.

METODOLOGIA

DENSIDADES DE CARGA Y POLARIZACION La metodología DFT consiste en resolver las ecuaciones de Kohn –Sham

(1)

(2)

(3) Donde energía total del sistema, nuestra variable fundamental, usando el funcional de energía es:

(4) Se obtuvieron las soluciones numéricas mediante el software “Quantum-espresso” (P. Giannozzi et al. 2009), considerando Perdew-Wang 91 como el potencial de intercambio y correlación. De igual forma se emplearon los softwares de visualización y manipulación molecular Jmol (versión 13.0) y PyMOL (version 1.7.4 Agosto 2015). MODELOS MOLECULARES Para el planteamiento de cada modelo molecular de cada isoenzima se extrajo el grupo heme de sus respectivos cristales y los residuos que estuvieran dentro de un radio de 4 Å, 5 Å y 6 Å del núcleo de Fe asociado, teniendo así 3 modelos moleculares para cada enzima, buscando cuantificar poco a poco las interacciones locales alrededor del Fe. Para poder establecer el tamaño de la celda unitaria asociada a la solución numérica de cada estructura, se medía la distancia entre los átomos más apartados del modelo planteado, y se adicionaban 16 Å a la magnitud medida, para así armar adecuadamente el ensamble estadístico en el que se resolverá numéricamente el sistema.

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21

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ANALISIS DE DENSIDAD DE CARGA Y MOMENTO MAGNETICO DE LAS PRINCIPA-LES ISOENZIMAS DE CYP450 ASOCIADAS A LA METABOLIZACION DE FARMACOS:

CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 y CYP2C8

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; 2Facultad de Ingeniería, DFM, Universidad Autó-noma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO;


Rodríguez Jonguitud, E.1.; Nieto Delgado, P. G.2

RESUMEN El citocromo P450 (CYP 450) es una familia de hemoproteínas que se encarga de la transformación de xenobióticos catalíticos y la biosíntesis y el metabolismo de compuestos endógenos. Existen numerosas isoenzimas del CYP450 (su secuencia es de 40% o más de aminoácidos idénticos), que se encargan de la metabolización de fármacos. En este trabajo usamos la metodología de Teoría Funcional de la Densidad (DFT), para obtener la densidad de carga y el momento magnético del grupo heme y los residuos de su alrededor, con el fin de encontrar y analizar las diferencias entre las 6 isoenzimas que mayormente metabolizan drogas, y tratar de correlacionar las propiedades de carga eléctrica y polarización con la función de cada estructura. Nuestros datos muestran que existe una mayor densidad de carga en el átomo de azufre en las isoenzimas que mejor metabolizan los fármacos. Palabras clave: P450, DFT, momento polar, densidad de carga

INTRODUCCIÓN El citocromo 450 es la familia principal de enzimas que cataliza la biotransformación oxidativa de la mayoría de los medicamentos y algunos xenobióticos, compuestos que no son sintetizados de manera natural pero pueden ser recibidos por el organismo humano. Se divide en familias y en subfamilias. El citocromo 450 se encuentra en varios tejidos como el intestino delgado e hígado (Shirasaka y cols., 2013), principalmente en las mitocondrias y en el retículo endoplásmico. El citocromo 450 también interviene en la biosíntesis de esteroles y ácidos grasos, señalización molecular o factores regulatorios y algunos de sus isoformas están encargadas del metabolismo fase 1; por esto, el estudio de la familia del citocromo 450 ha sido de gran importancia en la farmacología clínica y otras ciencias. El CIPT450 están constituidos por hemoproteínas de 420 a 503 aminoácidos, donde el átomo de hierro del grupo heme tiene un quinto ligando a un grupo triol (-SH) a través de una cisteína.


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Tabla 2. Densidad de carga y momento polar de CYP2C19 y CYP2C9

Densidad Polarización CYP2C19 CYP2C9 CYP2C19 CYP2C9 FE -0.14 -0.18 1.64 1.58 O -0.50 -0.53 0.27 0.29 S 0.19 0.21 0.09 0.09

El momento polar del átomo de azufre de la cisteína es igual en ambas estructuras.

a) b)

Figura 1. Estructuras de las isoenzimas sin hidrogenos enlazada a un grupo O. a) CYP2C9 b) CYP2C19

Las isoenzimas CYP2D6 y CYP3A4 están enlazadas a un átomo de nitrógeno, que a su vez esta enlazado a diferentes compuestos.

Tabla. 3. Densidad de carga y momento polar de CYP2D6 y CYP3A4

Densidad Polarización CYP2D6 CYP 3A4 CYP2D6 CYP 3A4 Fe -0.21 -0.30 1.35 1.21 N -0.09 -0.08 -0.01 -0.02 S 0.19 0.27 0.03 0.19

Para cada modelo se tomó en cuenta los hidrógenos que están enlazados con los aminoácidos y el grupo heme. Se obtuvo la densidad de carga y el momento magnético para cada átomo de cada estructura en todos los modelos planteados. Cabe mencionar que el Fe del grupo heme está unido a diferentes átomos en cada isoenzima de acuerdo a su estructura cristalográfica: en las estructuras de CYP2C19 y CYP2C9 está unido a un átomo de oxígeno, en la CYP2D6 y la CYP3A4 se encuentra un átomo de nitrógeno, y en las estructuras de CYP1A2 y CYP2C8 no está enlazado a otro átomo adicional.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Como se mencionó en la metodología, se plantearon modelos de 4 Å, 5 Å y 6 Å para cada una de las 6 isoenzimas. En la tabla 1 se muestran los resultados de la polarización y la densidad de carga para la CYP2C19

Tabla 1 Densidad de carga y momento polar de 4,5 y 6 Å CYP2C19

Polarización 4 Ans 5 Ans 6 Ans HEM Fe 1.63 1.64 1.64 HEM O3 0.44 0.44 0.45 HEM O1 0.37 0.40 0.42 HEM O4 0.36 0.38 0.39 HEM O2 0.35 0.34 0.35 HOH O 0.22 0.28 0.27 CYS S 0.11 0.10 0.09

Se pudo observar en las estructuras de las 6 isoenzimas planteadas que existe un cambio en los valores de polarización y densidad de carga entre los primeros dos radios de distancia, no obstante los cambios son mínimos entre los modelos de 5 Å y 6 Å, razón por la cual se consideró que si se agregarán más aminoácidos alrededor del átomo de hierro a una distancia mayor de 6 Å no habrá un cambio significativo en el análisis local, puesto que no afectará el momento magnético ni la densidad de carga (Tabla 1). En la tabla 2 están las estructuras de las isoenzimas CYP2C19 y CYP2C9 analizadas que están unidas a un átomo de oxígeno.

Densidad de carga 4 Ans 5 Ans 6 Ans CYS S 0.23 0.19 0.19 HEM N -0.11 -0.11 -0.11 HEM N -0.10 -0.10 -0.10 HEM N -0.08 -0.08 -0.08 HEM N -0.10 -0.10 -0.10 HEM Fe -0.11 -0.13 -0.14 HOH O -0.57 -0.50 -0.50


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CONCLUSIONES Existe cierta similitud en las densidades de carga y las polarizaciones de las isoenzimas cuyo Fe del grupo hemo esta unido al mismo átomo aunque este pertenezca a un residuo diferente. Se puede apreciar esa convergencia especialmente en el átomo enlazado al Fe: en las isoenzimas CYP2C19 y CYP2C9 el átomo de oxígeno tiene valores parecidos (Tabla 2), así como en las isoenzimas CYP2D6 y CYP3A4 el nitrógeno al que están enlazadas tiene magnitudes cercanas (Tabla 3). Es importante resaltar que la densidad de carga del átomo de azufre de la cisteína es mayor en las isoenzimas CYP2C8 y CYP3A4, 0.25 y 0.27 e respectivamente, dichas estructuras son las de mayor metabolización; Así pues, la mayor carga en dicho azufre podría ser la causa de la facilidad con la que el átomo central de Fe lleva a cabo la reducción y la oxidación durante la catálisis, tanto para la CYP2C8 y CYP3A4.

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a) b)

Figura 2. Estructuras de las isoenzimas sin hidrógeno enlazadas a un átomo de N. a) CYP2D6 unido a Prinomastat (PN0) b) CYP3A4 enlazado a 7AW

Las estructuras de las isoenzimas CYP1A2 y CYP2C8 no están unidas a algún radical.

Tabla. 4. Densidad de carga y momento polar de CYP1A2 y CYP2C8

a) b)

Figura 3. Estructuras de las isoenzimas sin enlazar a un radical a) CYP1A2 b) CYP2C8

La CYP1A2 fue la isoenzimas con menor densidad de carga pero fue la que tuvo mayor momento polar, tanto en el S como en el Fe. Si sumáramos la densidad de carga del átomo de azufre y del átomo de hierro en cada una de las estructuras analizadas, se podría ver que el resultado es cercano a cero, excepto en la isoenzima CYP2C8, donde la suma es de 0.11.

Densidad de carga Polarización CYP1A2 CYP2C8 CYP1A2 CYP2C8 S 0.0601 0.25 0.3134 0.16 Fe -0.0529 -0.14 2.3768 1.78


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interacción entre varios eventos básicamente: un incremento en la concentración de Ca2+ intracelular, fosforilación de la cadena ligera de miosina (rMLC) y cambios conformacionales en proteínas contráctiles y del citoesqueleto. Esta actividad resulta en lo que conocemos como tono vascular y su intensidad puede ser variada. Por otra parte la Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad que se caracteriza por elevadas concentraciones de glucosa en sangre en ayunas (por encima de 120 mg/dl). Las principales causas de morbilidad y mortalidad asociadas a DM son afecciones del sistema cardiovascular, entre ellas: retinopatía, cardiopatías, nefropatías, enfermedad cerebro-vascular y amputación de miembros inferiores. Estas complicaciones en el sistema vascular se asocian a daño endotelial y del músculo liso vascular. Siendo la DM el trastorno más común del sistema endócrino, y debido a que los niveles plasmáticos de glucosa están incrementados (hiperglucemia) causa varias afecciones a nivel celular. Los niveles altos de glucosa promueven cambios en las rutas metabólicas, generando un deterioro celular. Un ejemplo de esto, es el exceso en la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO), que en el tejido vascular este exceso de EROs genera segundos mensajeros que pueden mediar varias respuestas fisiológicas como la modulación de la contractibilidad, la permeabilidad y la función endotelial. Siendo por este motivo la importancia de investigar y dar respuesta a las incógnitas que surgen sobre el tipo de respuesta que se desencadena, y quiénes actúan a lo largo de la vía. Sin embargo en este proyecto nos enfocamos a realizar comparaciones e interpretación de los estudios de tensión más que a la identificación de los agentes involucrados en las vías que desencadenan las complicaciones del músculo liso vascular. Para esto fue necesario llevar a cabo las contracciones del tejido, motivo por el cual se decidió utilizar fenilefrina, ya que al ser una amina simpaticomimética (agonista del sistema simpático) actúa principalmente sobre los receptores α-adrenérgicos, dando lugar a una vasoconstricción de las arteriolas. La tapsigargina (Tg) estructuralmente se clasifica como una lactona sesquiterpénica y es un potente activador de un amplio espectro de células (leucocitos neutrófilos y basófilos, mesenterio, pulmón, mastocitos del corazón de rata y plaquetas de sangre humana). Tg es un nuevo tipo de agente selectivo movilizador de Ca2+ que en corazón y músculo liso vascular actúa como un inhibidor no competitivo de la Ca2+ATPasa del retículo sarcoendoplásmico (SERCA), por lo que tiene la capacidad de aumentar la concentración de calcio intracelular en el citosol de la célula, bloqueando la capacidad de esta para bombear calcio hacia el interior del retículo sarcoplásmico. El vaciamiento de los almacenes puede activar secundariamente canales de calcio de la membrana plasmática, permitiendo la entrada de calcio desde el espacio extracelular hacia el citosol. De esta forma induce estrés de retículo endoplásmico, el cual finalmente lleva a la muerte celular.

METODOLOGÍA Generación de ratas diabéticas Este protocolo se realizó en ratas Wistar macho con un peso entre 230-280 gramos, las cuales fueron mantenidas en el bioterio de la Facultad de Medicina UASLP. Las ratas se colocaron en cajas individuales bajo condiciones de temperatura (21 ± 1°C) controlada y con un ciclo de luz y oscuridad de (12 x 12 hrs). La inducción de la DM se hizo al inyectar una solución de Estreptozotocina (diluida en 70 μl de salino) en la vena lateral de la cola, mediante la técnica MAPER, a una dosis de 65 mg/kg de peso. Al grupo control únicamente se les inyectó 70 µl de salino. En ambos grupos de ratas se obtuvieron el peso y los niveles de glucosa plasmática el día de la inducción, una semana posterior de la inducción y el día del experimento. Determinación de glucosa en sangre La glucemia se determinó usando un glucómetro comercial (One Touch Ultra) y las muestras fueron tomadas de la vena de las colas de las ratas en ayunas, antes de la inducción con Estreptozotocina, 8 días posterior a la inducción y el día del protocolo experimental. Así mismo se recolectó una muestra de sangre al grupo de las ratas inducidas con estreptozotocina al momento de sacrificar a las ratas en el día del experimento. Esta muestra sangre fue usada para medir los niveles de hemoglobina glicosilada y corroborar la presencia o no de la DM.

COMPARACIÓN DE LA CURVA DÓSIS-RESPUESTA A FENILEFRINA EN EL MÚSCULO LISO VASCULAR OBTENIDO DE ARTERIA MESENTÉRICA

ENTRE RATAS SANAS Y DIABÉTICAS CON 2 SEMANAS DE EVOLUCIÓN INDUCIDAS CON ESTREPTOZOTOCINA

Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí.Av. Venustiano Carranza No. 2405, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected]; [email protected]; ale-

[email protected]

Rodríguez Lara, S. A.; Espinosa Tanguma, R.; Medina Hernández, A.

RESUMEN La Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad que se caracteriza por elevadas concentraciones de glucosa en sangre en ayunas (hiperglucemia). Las principales causas de morbilidad y mortalidad asociadas a DM son afecciones del sistema cardiovascular y ya que estas complicaciones en el sistema vascular se asocian a daño endotelial y del músculo liso vascular es importante estudiar y comprender los fenómenos que resultan de esta condición. En el presente reporte se describe el estudio de tensión isométrica realizado en la arteria mesentérica libre de tejido endotelial de rata Wistar sana y diabética, con el objetivo de hacer la comparación de la reactividad que presenta el tejido en ambos grupos. Se trabajó con anillos de arteria mesentérica de rata colocados en baños para órganos aislados, inmersos en solución fisiológica a una temperatura de 37°C. Se acondicionó el tejido con precontracciones utilizando fenilefrina y solución fisiológica con alto potasio. Subsecuentemente se preincubó el tejido con tapsigargina y DMSO. Para luego poder visualizar su respuesta por adición de fenilefrina a diferentes concentraciones.

ABSTRACT Diabetes Mellitus (DM) is a disease characterized by elevated concentrations of fasting blood glucose (hyperglycemia). The main causes of morbidity and mortality associated with DM are affections of the cardiovascular system and as these complications in the vascular system are associated to endothelial damage and vascular smooth muscle, the importance of studying and understanding the phenomena that result from this condition arises. In this report is exposed the isometric tension study realized in the mesenteric artery free endothelial tissue of control and diabetic rat Wistar with the aim of making the comparison of the reactivity presented by the tissue in both groups. We worked with rat mesenteric rings in isolated organ baths, bathed in physiological solution at a temperature of 37 ° C. The tissue was conditioned with precontractions using phenylephrine and high potassium physiological solution. Subsequently the tissue was preincubated with thapsigargin and DMSO. Then visualize its response by addition of phenylephrine at different concentrations. Palabras clave: Diabetes Mellitus (DM); tensión isométrica; fenilefrina; tapsigargina; DMSO.

INTRODUCCIÓN Las capas de células del músculo liso están contenidas en las paredes de varios órganos, incluidos vasos sanguíneos, estómago, intestinos, vejiga, vías aéreas, y útero. Este tejido recibe inervación neural proveniente del sistema nervioso autónomo, pero también reacciona ante muchas otras influencias. Media movimientos relativamente lentos, pero no se fatiga con rapidez y puede desarrollar una gran fuerza durante periodos de tiempo prolongados. El estado contráctil del músculo liso es controlado por hormonas y otras señales químicas. Su contracción resulta de una compleja


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Tabla 1. Concentraciones de fenilefrina.

Concentración 100nM 300nM 500nM 700nM 1µM 5µM 10µM

Soluciones Solución Fisiológica Normal: 67.5 ml NaCl 2.0M, 2.36 ml KCl 2.0M, 2.0 ml MgSO4 0.6M, 2.0 ml KH2PO4 0.6M, 2.2 ml CaCl2 0.5M, 1.01 g Dextrosa, 2.38 g Hepes. Proporciona las condiciones definidas de un medio fisiológico en el cual la célula es capaz de mantenerse viable, como lo son el pH, osmoticidad y fuerza iónica.Está solución al tener que contar con un pH de 7.4, se ajustó haciendo uso del pH METER Thermo Scientific Orion por adición de NaOH 2.0M, y a una temperatura de 37°C, por lo que se mantuvo sumergida en un baño térmico. Solución Fisiológica Alto Potasio: 37.5 ml NaCl 2.0M, 30.0 ml KCl 2.0M, 2.0 ml MgSO4 0.6M, 1.92 ml KH2PO4 0.6M, 2.2 ml CaCl2 0.5M, 1.01 g Dextrosa, 2.38 g Hepes. De manera similar a la SFN, esta solución alto potasio busca conferir ciertas características al medio en el que estará inmersos los anillos de arteria mesentérica, con la diferencia que al contar con una concentración muy elevada en potasio, tiene la función de activar los canales de Ca2+sensibles a voltaje por lo tanto favorece la contracción de la célula excitable. Igualmente se ajustó a un pH de 7.4 y se conservó a una temperatura de 37°C.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Antes de iniciar el análisis de los datos experimentales se tuvo que hacer el descarte de algunos de ellos, debido a que como se comentó en la sección anterior en los anillos que se presentara una relajación mayor al 10% en el protocolo experimental no se pueden presentar como parte de los resultados, ya que en estos no fue posible la eliminación del endotelio. Para realizar las comparaciones de los datos experimentales obtenidos del estudio de tensión en los anillos entre las ratas sanas y diabéticas se obtuvieron los porcentajes de contracción donde el promedio de las primeras precontracciones con fenilefrina y solución alto potasio del protocolo experimental representan el 100%. Los datos en porcentaje que fueron graficados son los de la curva por adición de fenilefrina a diferentes concentraciones en el software GraphPad Prism. Obteniendo así las gráficas con los ocho grupos de anillos.

Medición de Tensión Isométrica A las dos semanas de haber inducido DM en las ratas, se procedió a extraer la arteria mesentérica tanto de las ratas control como de las diabéticas. Previamente se les anestesió con pentobarbital sódico en una dosis de 80 mg/kg de peso vía intraperitoneal. Se extrajo la arteria mesentérica y ayudados con un microscopio estereoscópico se limpió la arteria del tejido conectivo mediante el uso de instrumental fino, mientras que el endotelio se eliminó haciendo pasar carbógeno (CO2 y O2) a través de la luz de la arteria por espacio de 1 minuto. Posteriormente se obtuvieron cuatro anillos de aproximadamente 2 mm de longitud, los cuales se montaron en ganchos de acero inoxidable y se colocaron en baños de órgano aislado de 5 ml de volumen. Por medio de los ganchos de acero inoxidable se sujetaron los anillos al fondo del baño, y por el otro extremo a un transductor de tensión. A todos los anillos se les dio un periodo de incubación de 40 minutos, para que el tejido se recuperara. Durante este tiempo los anillos de la mesentérica se mantuvieron en solución fisiológica normal (SFN). Pasado este periodo, se comenzó el protocolo designado a cada anillo añadiendo las drogas directamente al baño. La tensión generada se registró digitalmente utilizando el software POLYVIEW Astro Med, Ins, GRASS (Instrumental Division) para su posterior análisis. Cabe destacar que los experimentos deben ser llevados a cabo a una temperatura de 37°C para mantener en lo posible la viabilidad del tejido, lo cual se consiguió gracias a que los baños cuentan con un reflujo que permite conservar el medio a dicha temperatura. Protocolo Experimental Para todos los experimentos de tensión llevados a cabo se estimuló el tejido agregando 5 μl de fenilefrina (10 µM concentración final en el baño) a tres de los cuatro baños con 5 ml de SFN, ya que previamente se ha observado una máxima contracción óptima a esta concentración. Mientras que al cuarto baño se le añadieron únicamente 5 ml de solución fisiológica alto potasio. Tras lo anteriormente se dejó un tiempo de espera de 15 minutos, ya que posteriormente se realizaron los cuatro lavados (Lx4) con SFN y se dejó estabilizando durante 20 minutos con esta misma solución para los cuatro baños. De este modo, se repitió el procedimiento señalado en una segunda ocasión, debido a que el promedio de estas contracciones nos establece el valor referencia máximo de tensión generada para cada anillo. En la segunda contracción con fenilefrina se añadieron 5 µl de carbacol (10 µM concentración final en el baño) a todos los baños antes de realizar los lavados en 4 ocasiones (Lx4) con SFN por 5 minutos, ya que la falta de relajación ante el carbacol pone de manifiesto que el endotelio fue satisfactoriamente eliminado. Ya que en dado caso, si la relajación fuera mayor al 10% los datos obtenido del experimento no son tomados en cuenta. En seguida los cuatro baños fueron llevados a un volumen de 5 ml con SFN, a uno de ellos se le añadió 5 µl de tapsigargina 1µM, mientras que a un segundo baño se le agregó 5 µl de DMSO, esto por un periodo de media hora para la posterior evaluación de los efectos que ejercen en el tejido, es importante señalar que los baños que se escogieron debieron ser diferentes al baño que recibió el tratamiento con solución fisiológica alto potasio. Se fueron agregando distintas concentraciones de fenilefrina en orden según la tabla 1. Entre cada adición de las diferentes concentraciones del fármaco existe un tiempo de espera de 15 minutos. Obtenidos los siete puntos de la curva con fenilefrina, se realizaron los Lx4 con SFN, y se esperó 20 minutos. Nuevamente los cuatro baños se llevaron a 5 mL de SFN y se les agregó 5 µl de FE 10µM, pasados 15 minutos, se hicieron los lavados con SFN, con un tiempo de espera de 20 minutos. Finalmente se desmontaron los ganchos, se limpiaron con alcohol al 70% y se guardaron. Los baños son lavados tres veces con agua destilada, y con ayuda de un hisopo se remueve los residuos que pudieron haber quedado. De igual forma se realizan otros dos lavados con agua destilada y se dejaron con etanol.


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En el protocolo experimental se muestra que al ser añadidos tanto tapsigargina como DMSO en los baños de órgano aislado indujeron una contracción en el tejido preincubado con estos mismos tanto en las ratas sanas como en las diabéticas, aunque también se presentaron casos donde el tejido de dos anillos de ratas sanas mostraron una ligera relajación. Consecuentemente como se puede observar en las figuras 3 y 4, se incrementó la respuesta contráctil del músculo liso vascular de las ratas diabéticas a comparación de las ratas sanas al añadirse las distintas concentraciones de fenilefrina. Tomando ahora como como referencia la figura 1 y la figura 2, la diferencia es que esta vez al no estar preincubados con Tg o DMSO, las ratas sanas son las que presentan una mayor respuesta contráctil en comparación con las ratas diabéticas. Esto podría explicarse con la función de la bomba SERCA, puesto que Tg al inhibir esta bomba la célula únicamente cuenta con el calcio extracelular lo que en un periodo corto desencadena la relajación del músculo, quedando lo anterior demostrado con las ratas sanas de las figuras 3 y 4 y por esta razón, siendo esto lo que nos permite pensar que en las ratas diabéticas la bomba SERCA se encuentra de alguna manera afectada.

CONCLUSIONES En este proyecto se estudió el papel que desempeña la bomba SERCA en la modulación contracción del músculo liso vascular en condiciones normales y en DM. En las ratas sanas SERCA cumple su función al recapturar el Ca2+ citosólico, para proveer a la célula de esa fuerza contráctil cuando es expuesta a un estímulo, en este caso la fenilefrina y cuando se añade Tg esta es inhibida disminuyendo su capacidad para recapturar el Ca2+hacia el interior del Retículo sarcoendoplasmático. Mientras en el tejido afectado por la DM parece ser que esto no es así, debido a que bajo condiciones normales el músculo liso vascular presenta una reactividad muy baja, y en presencia de Tg esta reactividad parece mantenerse. Es necesario tomar en cuenta que la dispersión de los datos es grande y que, por lo tanto, es necesario realizar experimentos adicionales para corroborar lo reportado aquí.

BIBLIOGRAFÍA CLINTON, R. (2003). Smooth muscle contraction and relaxation. The American physiological society, 27, 201-206. GONZALEZ, R., CARTER, R., KANAGY, N. (2000). Laboratory demonstration of vascular smooth muscle function using rat aortic ring segments. Advances in Physiology Education, 24, 13-21. HUANG, Y., YAO, X., LAU, C., LEUNG CHAN, F., KEI CHAN, N. W., CHENG, Y., CHEN, Z. (2000). Role of endothelium in thapsigargin-induced arterial responses in rat aorta. European Journal of Pharmacology, 392, 51-59. MIKKELSEN, E. O., THASTRUP, O., BRØGGER, CHRISTENSEN, S. (1988). Effects of Thapsigargin in Isolated Rat Thoracic Aorta. Pharmacology & Toxicology, 62, 7-11. MORITOKI, H., HISAYAMA, T., KONDOH, W., TAKEUCHI, S. (1994). Thapsigargin, a Ca2+-ATPase inhibitor, relaxes rat aorta via nitric oxide formation. Life Science, 54, 153-158. XAVIER, F., DAVEL, A. P., ROSSONI, L., VASSALLO, D. (2003). Time-dependent hyperreactivity to phenylephrine in aorta from untreated diabetic rats: role of prostanoids and calcium mobilization. Vascular Pharmacology, 40, 67-76.

S Vs D FE

100n

M

300 n

M

500 n

M70

0nM

1micr

oM

5micr

oM

10micr

oM60

80

100

120

140

SanasDiabéticas

[FENILEFRINA]

Tens

ion

(% P

E co

ntra

ctio

n)

Figura 1. % de contracción a diferentes

concentraciones de Fenilefrina en anillos de ratas sanas y diabéticas. n= 4 sanas y n= 3 diabéticas.

S Vs D K

100n

M

300 n

M

500 n

M70

0nM

1micr

oM

5micr

oM

10micr

oM0

50

100

150

200

250

SanasDiabéticas

[FENILEFRINA]

Tens

ion

(% P

E co

ntra

ctio

n)


concentraciones de Fenilefrina en anillos de mesentérica entre ratas sanas (n=6) y diabéticas (n=2) precontraidos con solución fisiológica alto

potasio.

S Vs D TG

100n

M

300 n

M

500 n

M70

0nM

1micr

oM

5micr

oM

10micr

oM0

50

100

150

SanasDiabéticas

[FENILEFRINA]

Tens

ion

(% P

E co

ntra

ctio

n)


concentraciones de Fenilefrina en anillos de mesentérica entre ratas sanas (n=4) y diabéticas

(n=3) preincubados con Tapsigargina.

S Vs D Veh

100n

M

300 n

M

500 n

M70

0nM

1micr

oM

5micr

oM

10micr

oM0

50

100

150

SanasDiabéticas

[FENILEFRINA]

Tens

ion

(% P

E co

ntra

ctio

n)


concentraciones de Fenilefrina en anillos de mesentérica entre ratas sanas (n=4) y diabéticas

(n=3) preincubados con DMSO.

Realizando la comparación de la figura 1 y 2 podemos notar que la forma de la gráfica es similar, mas es evidente que el porcentaje de contracción que presentan los anillos de ratas sanas precontraidos con solución fisiológica alto potasio es más alto al de los anillos de ratas sanas precontraidos con fenilefrina. Lo cual nos indica que la fenilefrina presenta una mayor capacidad de inducir un estado de contracción que el que se da a través de la vía de señalización mediada por altas concentraciones de potasio. Aunque este fenómeno en el aumento de la contractibilidad no se hace presente en las ratas diabéticas ya que sus porcentajes de contracción son muy similares, lo cual posiblemente nos exponga que algún paso en la cascada de señalización de la fenilefrina aunque no se encuentra totalmente abatido, por lo menos se ve disminuido.


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INTRODUCCIÓN El retículo endoplasmático tiene un papel fundamental en el pleglamiento de proteínas, lo cual si se hace de manera adecuada conlleva a la funcionalidad de éstas, pero si se producen mal plegamientos de proteínas debido a diversos factores como el estrés de retículo, se activa una serie de señales para tratar de reestablecer el equilibrio de plegamiento, ya sea tratando de reparar el mal plegamiento o llevando a la célula a la muerte programada (apoptosis). Cabe mencionar que el estrés de retículo es causado cuando hay “…deprivación de glucosa o nutrientes, infecciones virales, incremento en la síntesis de proteínas secretoras, y expresión de proteínas mutantes o mal plegadas…” (OZCAN, 2004), por lo que se ha propuesto que “la obesidad es un estímulo del estrés de ER en tejido periférico y, que tal vez el estrés de ER es un mecanismo del núcleo involucrado en el desencadenamiento de la resistencia a la insulina y diabetes tipo 2…” (OZCAN, 2004), recordando que la diabétes mellitus (DM) es una enfermedad que “…afecta a casi 100 millones de personas…de las cuales 90% corresponde a diabetes tipo 2…además se ha visto que hay una inflamación que afecta al árbol vascular y a múltiples órganos a nivel microvascular y macrovascular…” (KOLAKALAPUDI, 2015). En la actualidad se ha descubierto que el estrés de retículo provoca que haya una respuesta para las proteínas mal plegadas (UPR-unfolded Protein response) para regresar la célula a su estado de homeostasis. “…La UPR conlleva la inducción transcripcional de genes UPR, la atenuación de la síntesis proteica y la degradación asociada del retículo endoplasmático (ER), los 3 mejores transductores de la UPR son PERK, IRE1 y ATF6…” (YIN LIU, 2003), además existen otras proteínas que modulan la respuesta al estrés de ER, como “el factor transcripcional X-box-binding protein-1 (XBP1) cuya ausencia provoca resistencia a la insulina” (OZCAN, 2004) y SERCA2 complejo proteico con función de bomba Ca++/ATPasa que encontramos en la membrana del retículo sarcoplasmático (RS), que participa en la translocación de iones calcio desde el citosol hacia el RS, participando en la regulación del ciclo de contracción y relajación muscular (que como se ha estudiado en pacientes con diabetes este proceso se ve alterado) e incrementando su expresión para compensar el estrés de ER. (FU, 2011) Así pues, como sólo se ha estudiado en su mayoría los cambios patológicos en las células endoteliales diabéticas, el presente trabajo tiene como objetivo evaluar las alteraciones a nivel de las células de músculo liso vascular debido a su importante participación en el proceso fisiopatológico de la DM. Lo anterior se hizo identificando la expresión de SERCA2, ATF6 y XBP1 las cuales se consideran moduladores de la respuesta ante el estrés de ER. En el presente trabajo se empleó un cultivo de células de musculo liso vascular proveniente de la aorta torácica de ratas Wistar normales y diabéticas (de cuatro semanas de inducción con estreptozotocina), mediante la técnica de cultivo por explante; las células obtenidas fueron caracterizadas contra alfa actina y miosina, mediante Inmunofluorescencia (IF) indirecta que es una propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de baja longitud de onda y alta energía; en la técnica se empleó un anticuerpo primario sin marcar que se une a la proteína de interés y un suero anti-inmunoglobulina conjugado con un fluorocromo, lo cual permitió gracias a un microscopio con lámpara de mercurio (especial para la técnica), la identificación de la ubicación de las proteínas estudiadas. A las mismas células, pero de rata normal se les expuso a condiciones de baja glucosa (5mM), alta glucosa (15mM) y control de osmolaridad (15mM de manitol). Además, para lograr el objetivo se utilizó el método de herida-cicatrización con la cámara de Boyden para el estudio de la migración celular y la técnica de western blot (WB) con el fin de detectar las proteínas para su estudio, confirmando así su presencia, recordemos que “…la especificidad del WB se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés…” (ADVANSTA CORPORATION, 2011).

EFECTO DE LA HIPERGLUCEMIA SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Y LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS

DE MÚSCULO LISO VASCULAR PROVENIENTES DE RATAS NORMALES

Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Venustiano Carranza No. 2405, Col. Los Filtros, C.P. 78210, San Luis Potosí, S. L. P., MÉXICO; [email protected]; espinosr@

uaslp.mx; [email protected]

Ruiz Torres, L. B.; Espinosa Tanguma, R.; Mejía Elizondo R.

RESUMEN La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad que afecta a millones de personas siendo de mayor prevalencia la diabetes tipo 2; en años recientes se ha descubierto una relación entre esta patología y el estrés de retículo cuya característica principal es la activación de una respuesta para las proteínas mal plegadas (UPR), la cual conlleva la expresión de proteínas UPR que contribuyen a compensar el daño causado por este fenómeno. En el siguiente trabajo de ciencia básica se busca ya no estudiar las células endoteliales como se ha trabajado anteriormente, sino evaluar las alteraciones a nivel de las células de músculo liso vascular (CMLV-expuestas a alta glucosa), debido a su importante participación en el proceso fisiopatológico de la DM. Para lograrlo se identificó la expresión de SERCA2, ATF6 y XBP1 (marcadores del estrés de ER) y se midió la migración celular, resultando incrementados todos los parámetros anteriores (en CMLV-DM).

ABSTRACT How we know the diabetes mellitus (DM) is a disease that affects millions of persons, being more common the diabetes type 2; in the recent years a relation has revealed itself between this pathology and the stress of reticulum whose principal characteristic is the activation of the unfolded protein response (UPR), which involves the expression of UPR´s proteins that help to compensate the damage caused by the phenomenon. In the following work of the basic science one seeks already not to study the endotelial cells as like ones has worked previously, but to assess the alterations to level of the cell of smooth vascular muscle (CMLV-exposed to high glucose), due to its important participation in the DM´s fisiopatological process. To achieve it, there was identified the expression of SERCA2, ATF6 and XBP1 (scoreboards of ER´s stress) and was measured the migration celular, turning out a increment in the previous parameters (in CMLV-DM). Palabras clave: músculo liso vascular, migración celular, diabetes mellitus, estrés de retículo, proteínas UPR´s.


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de flujo laminar, ayudándonos de un microscopio estereoscópico y con el uso de instrumental quirúrgico fino; en la limpieza se elimina el tejido graso y conjuntivo, arterías colaterales y la adventicia. Una vez limpio se realizó un corte longitudinal a la aorta quedando expuesto el endotelio el cual se eliminó raspando con un hisopo de algodón con una fuerza ligera. Terminado lo anterior se cortaron tres tiras a lo largo y cada una se cortó en segmentos de 1-2 mm x 1-2mm. Todos los segmentos de colocan en una caja de Petri de 100mm (de diámetro) estéril con el lado luminal hacia arriba y el lado de la adventicia adherido a la superficie de la caja. Se dejan 3 horas para permitir la adherencia del tejido al sustrato, después de este tiempo se colocaron 6mL de medio DMEM con baja glucosa (5mM) y se incubó a 37ºC y CO2 al 5%. Las células empezaron a crecer a partir de los segmentos de tejido aórtico y gracias a los recambios de medio de cultivo realizados dos veces por semana, una vez alcanzada la confluencia celular en toda la caja (aprox. 15 días) se retiraron los trozos de tejido (permitiendo el crecimiento celular en estos sitios por dos días más). Una vez alcanzada la confluencia se levantan las células con solución de tripsina/EDTA al 0.25% y se resembraron (aprox. 10, 000 células por caja) en 5 cajas de Petri de 100mm de diámetro, a cada caja se le colocó medio de cultivo hasta alcanzar confluencia, después de esto se vuelven a levantar las células y se realizó un protocolo para congelar las células (a -70ºC (1x106 células/mL de DMEM+0.5% DMSO) para poderlas conservar para los futuros experimentos (caracterización de las células mediante inmunohistoquímica, experimentos para medir migración y para medir estrés en el retículo endoplásmico, este último mediante la técnica de Western Blot). Con las células de musculo liso vascular (CLMV) obtenidas de ratas normales se probaron diferentes concentraciones de glucosa, para establecer un protocolo de hiperglucemia en ratas sin pasar por la inducción de Diabetes Mellitus con estreptozotocina. § Protocolo de Inmunofluorescencia (indirecta) En el experimento se requirió caracterizar las células obtenidas mediante inmunocitoquímica, para confirmar que éstas provenían de músculo liso, esto se hizo mediante el uso de anticuerpos contra alfa actina y cadena pesada de miosina de músculo liso. Primero se cultivaron células sobre cubreobjetos tratados con poli L-lisina en una placa de 24 pozos sin alcanzar confluencia (30-40%) para obtener una buena definición de la morfología celular, el cultivo se mantiene en medio DMEM suplementado 10%SBF (antes de alcanzar la confluencia) o 1%SBF (cuando se alcanza la confluencia), para cambiar las células de un fenotipo sintético a uno contráctil. En general lo que se hizo (en campana de flujo laminar) fue quitar el medio de cultivo, se lavó con PBS (phosphate buffered saline), se fijó las células con paraformaldehído 4% (15 minutos), se lavó con PBS, se permeabilizaron las células con Tritón 100x 0.25% (porque la proteína buscada no está en la membrana), se lavó con PBS y bloqueó las células con solución BSA al 5% (1 hr), se incubaron las células con anticuerpos contra-alfa-actina y cadena pesada de miosina (toda la noche en cámara húmeda oscura), se volvió a lavar con PBS, se incubó con el anticuerpo secundario 4°C (2 hrs), se lavó con PBS, se incubó con Hoechst o DAPI (para teñir núcleos), se lavó con PBS, se montó la muestra con medio de montaje (puede ser glicerol o vectashiel) en un portaobjetos y se observó al microscopio de inmunofluorescencia en un cuarto oscuro a 4ºC. § Protocolo de Western Blot – WB-(para evaluar la presencia de estrés de retículo endoplasmático) Tras cambiarles las condiciones a cultivos celular (proveniente de ratas normales) en cajas de Petri (35mm) teniendo por duplicado: células expuestas a baja glucosa (5mM), alta glucosa (15mM) y control

Al final de protocolo y analizando los resultados pudimos ver que en respuesta al estrés de ER hay un aumento en la expresión de SERCA y en general de las proteínas UPR´s, además de un aumento en la migración celular en las células de rata normal que se expusieron a alta glucosa (15mM), lo cual nos hizo inferir que estas células presentan el mismo fenotipo que células diabéticas, lo cual nos abre las puertas al manejo de un nuevo modelo de estudio sin necesidad de inducirle diabetes a ratas Wistar para la obtención del cultivo.

MARCO TEORICO En este trabajo se tratará el concepto de migración celular el cual es un proceso por el cual una célula se desplaza, a través de los tejidos, o en la superficie de una placa de cultivo, en el cual intervienen expansiones citoplasmáticas, llamadas lamelipodios y filopodios. En la actualidad se sabe que “la diabetes mellitus tipo 2 y la hipertensión arterial cursan con disfunción endotelial, lo que condiciona inflamación vascular, expresión de moléculas de adhesión que favorecen la migración celular subendotelial y el desarrollo de aterosclerosis... Los pacientes diabéticos muestran niveles significativamente mayores de moléculas de adhesión solubles que los no diabéticos. La coexistencia de hipertensión aumenta significativamente los valores de ICAM, esto podría explicar la mayor frecuencia de complicaciones en los pacientes que cursan con las dos patologías…” (RUBIO, 2008), así pues, al ser la migración celular una característica más asentuada en células diabéticas se usará como patrón para ver el comportamiento de células expuestas a alta glucosa.

METODOLOGIA § Inducción de diabetes mellitus a ratas Wistar macho de entre 200-220g de peso

Se realizó primero el muestreo de las 6 ratas a usar que fueron proporcionadas por el bioterio de la Facultad de Medicina de la UASLP bajo las condiciones de Temperatura de ≈21ºC y humedad de ≈75%, y basados en el manejo establecido por la NOM-062-ZOO-1999. Además, las ratas se encontraban en un ayuno de 24hr, lo que se hizo fue pesarlas para poder determinar cuánto medicamento (Estreptozotocina) había que administrarle para inducirles diabetes (esto se realizó sólo a dos ratas de las 6). La dosis a administrar se maneja como 60mg por Kg de peso de la rata, diluida en 700µL de salino (el medicamento se debe preparar en el momento para ser administrado, pues es muy inestable y si se prepara con anticipación puede perder su efectividad). La dosis es inyectada en la vena lateral de la cola de la rata mediante la técnica de MARPER (“…que conlleva el mínimo de hostilidad, estrés y dolor para el animal…” (CIRIACO)), y durante este procedimiento se le mide el nivel de glucemia con un glucosímetro ordinario (Glucómetro FreeStyleOptium H – marca Abbott). A la par se tuvieron 4 ratas control a las cuales sólo se les inyectó 700µL de salino. Los niveles de glucosa plasmática se midieron cada semana a partir de la inducción a ambas ratas (control o normales y diabéticas), esto por cuatro semanas. § Preparación del medio de cultivo Se preparó medio de cultivo DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) según las especificaciones de fábrica y después se procedió a suplementarlo (enriquecerlo con suero bovino fetal al 10% (SBF), penicilina 0.5µL/mL, estreptomicina 0.4µL/mL, ciprofloxacina 0.0125µL/mL, eritromicina 0.5µL/mL) y por último se esteriliza por medio del filtrado al vacío. § Obtención del cultivo celular Una vez terminadas las cuatro semanas de monitorizar la glucosa de las ratas se procede al sacrificio del modelo animal mediante pentobarbital sódico vía intraperitoneal (60mg/Kg). En seguida mediante una toracotomía y extracción del bloque cardiopulmonar se disecó la aorta torácica. Este tejido se limpia colocándolo en una caja de Petri en solución salina (en condiciones de asepsia) y dentro de una campana


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nos hablan del papel de XBP1, (FU, 2011) donde nos habla del papel de SERCA; aunque la identificación es mucho más clara al terminar el WB.

Los resultados obtenidos hasta ahora nos mostraron que las células de MLV expuestas a alta glucosa durante un periodo de 48 horas no muestran cambios en la migración celular ni en la expresión de las proteínas ATF6 y XBP1, sin embargo, las células de una semana de exposición a alta glucosa mostraron un aumento en la migración celular y un aumento en la expresión de las proteínas marcadoras de estrés. Lo anterior nos hace inferir que las células de rata normal a las que se expuso a alta glucosa presentan un fenotipo similar a las células provenientes de ratas diabéticas. Respecto a SERCA2 se pudo observan un aumento sugiriéndonos que este incremento se da en respuesta de estrés de retículo (por hiperglucemia) con el fin de tratar de revertir los daños que este fenómeno causa. Como vemos el impacto del trabajo es grande pues el tener básicamente el mismo fenotipo las células de MLV de rata normal expuestas a alta glucosa y las células de MLV de rata diabética, nos lleva a conseguir otro modelo de estudio experimental que no conlleva la inducción de diabetes a los roedores trabajados, con lo que evitamos los efectos severos que conlleva esta técnica.

Figura 2. Resultado de electroforesis para identificación de las proteínas XBP1 (PM 29KDa), ATF6 (PM 77KDa) y SERCA2 (PM 110KDa), marcadores característicos del estrés de retículo obtenidas a partir del cultivo celular de aorta de rata normal, cuyas células fueron sometidas a diferentes condiciones: : (a) 48hrs baja glucosa 5Mm, (b)

48hrs alta glucosa 15mM, (c) 48hrs control 15mM de manitol, (d) es la escalera de pesos moleculares, (e) 1 semana baja glucosa 5mM, (f) 1 semana alta glucosa 15mM, (g) 1 semana control manitol 15mM. El gel de poliacrilamida fue

teñido con azul de Coomassie, material proporcionado por el departamento de fisiología y biofísica, FM UASLP.

Figura 3. Imágenes de la técnica de herida-cicatrización (Wound-Healing) y usando la cámara de Boyden, imágenes tomadas por la Dr. Mejía Elizondo R. Departamento de Fisiología y Biofísica, FM de la UASLP, a) fotos

del tiempo 0 al hacer la herida, a las 12 y 24 horas, b) comparación de los resultados de las ratas control y las diabéticas

XBP1

ATF6

a b c d e f g SERCA

de osmolaridad (15mM de manitol) todos estos cultivos a 48 horas y 1 semana; se procede a realizar esta técnica para obtener SERCA, XBP1 y ATF6 (proteínas activadas en respuesta al mal plegamiento proteico en el estrés de retículo, por lo que son marcadores de estrés), beta-actina se corrió como control. La técnica de WB se realizó tanto para las células de rata diabética y control (ratas normales) con y sin cambios de condiciones. Previamente se realizaron los lisados celulares donde se ponen las cajas sobre hielo y se les agrega 250µL de buffer RIPA 1x adicionado con inhibidores de proteasa y fosfatasas, se dejan en incubación por 5 min. y con ayuda de la punta de una micropipeta se levantan las células para posteriormente sonicarlas y centrifugar a 14,000g por 10 min. para recuperar el sobrenadante (este se usó para cuantificar proteína por el método de Bradford-es una electroforesis para ver concentración y calidad de la proteína). Tras el lisado a cada uno de los tiempos. Para ver más detalles de la técnica de Western Blot checar el texto de la Corporación de Advansta (CORPORATION, 2011). § Protocolo para medir y comparar la migración de células del músculo liso vascular Para este procedimiento se usó el modelo de herida cicatrización (Wound-Healing) y la cámara de Boyden. Con los cultivos celulares preparados en cajas de Petri (35mm) de aprox. 10 000 células por caja, después de la confluencia y tras haberles cambiado las condiciones como se planteó anteriormente solo para el caso de las ratas normales, se procedió a realizar una herida en todos los cultivos (de rata normal y diabética) de norte a sur (de las 12 a las 6) con la punta de una micropipeta de 200µL a un ángulo de 45º y se tomaron las fotografías a tiempo 0 (al hacer la herida), a las 12 y 24 horas, esto gracias a un microscopio invertido con cámara integrada. Después se analizó el porcentaje de migración de cada fotografía con el programa Image J y tras esto se compararon los resultados de las ratas control con los resultados obtenidos de ratas diabéticas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las siguientes imágenes representativas nos muestras los resultados de la inmunofluorescencia que nos permite confirmar que las células obtenidas provenían de músculo liso vascular (MLV), pudiendo ver en los filamentos de actina y miosina característicos de este tejido. Esta prueba es importante porque el objetivo era trabajar sobre células de MLV sin endotelio.

En la siguiente figura representativa de la electroforesis realizada en la técnica de WB donde comprobamos la presencia de proteínas UPR´s que nos indican un estado de estrés de retículo como se reporta en los artículos de (YIN LIU, 2003) donde nos hablan de ATF6 y XBP1, (OZCAN, 2004) donde

Figura 1. Imágenes de cultivo celular visto desde el microscopio de inmunofluorescencia de la Facultad de medicina (FM) de la UASLP, a) alfa actina longitud de onda 546nm (rojo), b) y c) cadena pesada de miosina

longitud de onda 488nm (verde), a) b) c) núcleos longitud de onda 355nm (azul).

a b c


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ESTABILIDAD RELATIVA Y PROPIEDADES ELECTRÓNICAS DE LOS ISÓMEROS DE MÍNIMA ENERGÍA PARA FULLERENOS HIDROXILADOS MEDIANTE ESTUDIOS BASADOS EN LA TEORÍA DEL FUNCIONAL DE LA DENSIDAD

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Salvador Nava No. 6, 78260 San Luis Potosí, México; 2Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Dr. Salvador Nava S/N, 78260 San Luis Potosí, México; [email protected];

[email protected]

Salto Quintana, F.1; Chavira Quintero, R.2

RESUMEN Los fullerenos son moléculas con una gama de aplicaciones muy amplia; sin embargo, en algunas ocasiones es inestable para aplicaciones específicas. Es por eso que se busca funcionalizar su superficie con varios adsorbatos para hacer óptimo su desempeño en las diferentes ramas a las que se aplique. Lo que se buscó en el siguiente trabajo fue encontrar la configuración más estable, o de mínima energía, para diferente número de adsorbatos y determinar si hay isómeros relevantes (cuya energía varíe sólo 0.13 eV con respecto al más estable). Para determinar la energía, se empleó un enfoque DFT usando la aproximación del pseudopotencial para la interacción de electrones en una base de ondas planas que resuelven las ecuaciones de Kohn y Sham.

ABSTRACT The molecules of fullerene C60 have a wide range of applications, but sometimes this molecule is unstable to be used in specific applications. That is why is wanted to functionalize its surface with different adsorbates to develop its performance in the various branches of application. In this research we try to find the stablest position, or the minimum energy one, for a different number of adsorbates and to determine if there are relevant isomers (isomers that only change 0.13 eV concerning the stablest). The energy is found by using a DFT approach with a pseudopotential approach for interaction of electrons in a base of plane waves that solve the Kohn & Sham’s equations. Palabras clave: Fullereno, hidroxilación, DFT

INTRODUCCIÓN El fullereno es una molécula compuesta de carbono estructurada de forma esférica, asemejando al grafito en su arreglo hexagonal, pero conteniendo anillos pentagonales también. Fue descubierto por Harold Kroto, Richard Smalley y Robert Curl en 1985. El fullereno más común es el C60, que cuenta con 12 pentágonos y 20 hexágonos; dentro de los fullerenos se pueden encontrar varios de diferente número de carbonos como el C82 o bien el C20, que es el más pequeño. Han pasado más de 30 años desde el descubrimiento de la molécula C60 (fullereno). Durante todo este tiempo se han cimentado las bases de la nanotecnología, que nos ha permitido estudiar con más precisión la naturaleza y propiedades de los fullerenos. Al día de hoy se conoce que las moléculas C60 son muy poco solubles en solventes acuosos; lo

CONCLUSIONES Mi participación en este proyecto conllevó una gran retroalimentación y aprendizaje que fortalece mi preparación académica y personal, ya que en el proyecto se manejaron protocolos con el fin de entender las alteraciones que ocurren a nivel celular del tejido muscular liso vascular, debido a que trabajos anteriores han demostrado que estás células juegan un papel transcendental en la diabetes mellitus. Sin duda está fisiopatología ha cobrado importancia con los años y cada vez se sabe más sobre ella, pero aún faltan muchos mecanismos e interrogantes por conocer, y cuyo conocimiento marcaría la diferencia al tener tratamientos más efectivos para el padecimiento; de ahí que considero de gran importancia la investigación en la que participé. Además, con los resultados que se obtuvieron se pudo demostrar que hay otro modelo de estudio experimental, para el manejo de células diabéticas, que conlleva en lugar de inducción de diabetes a ratas normales, un cambio de condiciones exponiendo las células a alta glucosa (15mM); con lo cual evitamos el daño que sufre la rata al inducirla por 4 semanas e incluso esta técnica para obtener el modelo de estudio tiende a ser más efectiva y rápida. La investigación sigue en marcha pues, aunque nuestra participación en el proyecto concluye, ésta sigue con el objetivo de continuar comprobando los resultados que se han obtenido y el de obtener una n=6, debido a que esto no se ha podido lograr por problemas con los modelos animales a los que se ha inducido diabetes y los controles.

BIBLIOGRAFIA

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Uno de nuestros objetivos fue encontrar la configuración de mínima energía. Dicha energía fue calculada con el programa Quantum Espresso, lo que permitió conocer ciertas tendencias en la energía de las estructuras en relación al arreglo de las mismas. También se buscó encontrar isómeros relevantes, es decir que varíen sólo 0.13 eV con respecto al de mínima energía. Se sabe por experiencia que para los isómeros que cumplen este criterio el rol de la estabilidad relativa se puede ver afectado si se consideran las contribuciones térmicas. Se realizaron optimizaciones con dos grupos diferentes, -NH2 y –OH, también con diferente número de adsorbatos. Cabe destacar que la interacción entre grupos -OH y carbono ya ha sido reportada, pero las nanoestructuras en cuestión fueron nanotubos de carbono.3 Al optimizar la molécula usando sólo un grupo –OH (Figura 1) se encontró que la distancia entre carbonos adyacentes al adsorbato crece hasta estar en el orden de 1.52-1.55 Angstroms. La energía de adsorción fue de 2.31 eV, mientras que el gap HOMO-LUMO fue de 0.733 eV. Es importante determinar la energía de adsorción, pues se ha estudiado que si esta es menor a 0.8 eV, la fuerza del enlace en el adsorbato es débil.

Figura 1. Molécula C60 con un grupo –OH, se observa el crecimiento de los enlaces C-C adyacentes

al adsorbato Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas

Del mismo modo se estudió la adsorción de dos grupos –OH en diferentes posiciones con el objetivo de encontrar la configuración de mínima energía, la cual se logró cuando los grupos –OH están adsorbidos contrapuestos en el mismo hexágono (Figura2a). Se reportó un gap HOMO-LUMO de 1.41 eV y una energía de adsorción de 5.314 eV. El isómero que siguió en orden de estabilidad fue cuando los dos grupos –OH se encontraban juntos en un hexágono, sin embargo, no se considera como relevante puesto que su diferencia de energía con respecto al primero fue de 0.195 eV. (Figura 2b). Cabe mencionar que se estudiaron varias de las múltiples configuraciones posibles, sin embargo, se observó que al acercar los adsorbatos entre sí se encontraban los arreglos de mínima energía.

que las hace no ideales para aplicaciones biológicas. Ante este conflicto se ha buscado la funcionalización de los fullerenos con diversos tipos de adsorbatos, que le permitan ser una molécula estable y soluble en solventes polares. La molécula C60 ha mostrado múltiples aplicaciones durante todos estos años, que van desde la fotolitografía al cambiar sus propiedades bajo la acción de la luz ultravioleta, a la superconducción eléctrica al enfriarlos a temperaturas del orden de 10 a 40K. Otro uso peculiar del fullereno se da gracias a su superficie esférica que permite el deslizamiento entre superficies y les permite actuar como lubricantes. La funcionalización de los fullerenos les ha permitido ser usados en la nanomedicina en investigación sobre el cáncer, enfermedades sanguíneas y pulmonares; así como especies reactivas de oxígeno (ROS). En este trabajo se optimizaron diferentes acomodos de adsorbatos en el fullereno para así obtener la estructura más estable y su energía. Con ello, se determinó si existían isómeros relevantes. Lo que se buscaba era encontrar varios isómeros relevantes con respecto a la molécula más estable, así como determinar la energía de adsorción de cada isómero. El descubrimiento de varios isómeros relevantes con respecto al acomodo de mínima energía nos permitirá avanzar en el estudio de estas moléculas, ya que las aproximaciones de energía se realizaron en el contexto de un método de primeros principios, por lo que los resultados obtenidos son para T=0; y por consiguiente, acotar el estudio de las múltiples combinaciones de adsorciones en la molécula C60 en temperaturas diferentes a T=0, así como detectar patrones de estabilidad en el acomodo de los adsorbatos.

METODOLOGIA Para la determinación de las propiedades del fullereno y sus energías, se usó el programa Quantum Expresso; que realiza, dentro del enfoque DFT, aproximaciones ultra suaves para la interacción de los electrones de valencia de cada átomo y los respectivos iones en una base de ondas planas, usando para las funciones de onda el código PWscf que resuelve las ecuaciones de Kohn y Sham. Para todas las estructuras optimizadas, la energía de corte para la expansión de ondas planas se indica a 408.17 eV, mientras que la energía de corte de la densidad a 2993.25 eV; se considera que el valor de la energía de corte de la densidad oscila en un intervalo de 6 a 8 veces el valor de la energía de corte. Nuestras moléculas son embebidas en una celda cúbica que se repite en todas direcciones y que tiene por lado 35 Angstroms, esto con el objetivo de lograr que la interacción entre las moléculas vecinas sea nula y garantizar que los resultados converjan a los de una molécula aislada; finalmente, sólo se utilizó el punto Γ para la integración en la primera Zona de Brillouin (ZB). Se utilizó en todas las moléculas el pseudopotencial Perdew-Burke-Ernzerhof (PBE) y se realizó la relajación y optimización de todas las estructuras de los isómeros con que se trabajó. Para la convergencia de energía se estableció un criterio de 10-6 y la optimización en la estructura se realizó hasta que las fuerzas restantes en cada átomo alcanzaron un valor inferior a 1 meV/Å. Se utilizaron como visualizadores los programas Avogadro y Jmol, así como para desarrollar las coordenadas moleculares. Este fue un método de primeros principios por lo que los resultados son válidos a T=0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN El C60 en su estado natural (sin adsorbatos) tiene un diámetro de 6.97 Angstroms, y respeta una longitud entre enlace carbono-carbono de1.4-1.45 Angstroms, que varía dependiendo si se forma un enlace doble o sencillo. El gap HOMO-LUMO (es decir, la diferencia de energía entre el último orbital molecular ocupado y el primer orbital molecular no ocupado) que obtuvimos es del orden de 1.65 eV. Estos datos están en común acuerdo con lo ya reportado.1


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Figura 3a. Molécula C60 con tres grupos –OH juntos en el hexágono

Figura 3b. Molécula C60 con tres grupos –OH contrapuestos en el hexágono Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas

Además del grupo –OH, se utilizaron también adsorbatos del grupo -NH2 (Figura 4). Al añadir sólo un adsorbato se reportó un gap HOMO-LUMO de 0.7884 eV. Al igual que la molécula con un solo grupo –OH, las distancias entre los carbonos adyacentes al adsorbato fueron del orden de 1.52-1.55 Angstroms.

Figura 4. Molécula C60 con un grupo -NH2

Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas Al realizar la búsqueda de los isómeros relevantes con dos grupos -NH2 se buscaron repetir las configuraciones que se usaron al adsorber el grupo –OH, y se encontró que la lista de estabilidad en las moléculas volvía a estar encabezada por las mismas combinaciones, lo que sugiere un patrón de estabilidad. La molécula de mínima energía (Figura 5a) se encontró cuando los adsorbatos se encontraban contrapuestos en la misma cara hexagonal, teniendo un gap HOMO-LUMO de 1.4277 eV. El siguiente acomodo en mínima energía (Figura 5b) se encontró cuando los grupos –NH2 estaban juntos en la misma cara hexagonal; sin embargo no se considera relevante pues la diferencia de energías fue de 0.4909 eV.

Figura 2a Figura 2b

Figura 2a. Molécula C60 con dos grupos –OH contrapuestos en el hexágono Figura 2b. Molécula C60 con dos grupos –OH juntos en el hexágono

Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas Al adsorber tres grupos –OH en el C60, se probaron múltiples configuraciones, de las que la más estable se encontró cuando los tres grupos –OH están juntos en una cara hexagonal (Figura3a). Se reportó un gap HOMO-LUMO de 0.73 eV y una energía de adsorción de 8.375 eV. El isómero que siguió en orden de estabilidad fue el caso cuando se encontraban los tres adsorbatos contrapuestos en las caras hexagonales el uno del otro (Figura3b); sin embargo, no se consideró como relevante ya que la diferencia de energía entre el primero y este fue de 0.456 eV. Se volvió a observar la tendencia antes mencionada, que al estar más alejados los adsorbatos crecía la energía. Figura 3a Figura 3b


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Figura 6a. Tendencia del hidrógeno a orientarse al oxígeno Figura 6b. La propiedad se pierde al haber uno o más carbonos entre ellos

Figura 6c. La propiedad continúa en cadenas más largas Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas

CONCLUSIONES

Para concluir, lo más destacado de la investigación fue lo siguiente. Las distancias entre carbono-carbono tienden a cambiar al tener la presencia de un adsorbato. La tendencia de mínima energía observada al acercar los adsorbatos cuando se usan dos grupos –

OH se repite también en mayor número de adsorbatos y en los acomodos usando –NH2. En el grupo –OH, el hidrógeno busca orientarse hacia el oxígeno del carbono adyacente si este se

encuentra en el carbono adyacente inmediato. Las orientaciones del hidrógeno al oxígeno vecino podrían originarse por el momento dipolar que

sufre el adsorbato, lo que sugiere un nuevo tema de investigación. No se encontraron isómeros relevantes; sin embargo, se observó que hay una tendencia de menor

energía cuando los adsorbatos permanecen juntos (en carbonos adyacentes) u opuestos en una cara hexagonal.

BIBLIOGRAFIA

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Figura 5a Figura 5b

Figura 5a. Molécula C60 con tres grupos –NH2 opuestos en el hexágono Figura 5b. Molécula C60 con tres grupos –NH2 juntos en el hexágono

Fuente: Elaborado en el programa J-mol con las coordenadas optimizadas Otra peculiaridad que se observó en el estudio fue que al colocar los grupos -OH en carbonos adyacentes, el hidrógeno de un adsorbato se orienta al oxígeno del otro adsorbato (Figura 6a), no así cuando hay uno o más carbonos entre ellos (Figura 6b). Dicha propiedad se repite aún en mayor número de adsorbatos, lo que nos deja ver una tendencia en la orientación del grupo -OH (Figura 6c). Proponemos que esto es debido a la transferencia de carga, tema que sería importante estudiar en investigaciones siguientes. Figura 6a Figura 6b Figura 6c


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(1)

Más tarde Arne Teselius creó un aparato que le daba una nueva aplicación a la electroforesis en el análisis de mezclas químicas. En 1940 nuevos métodos de electroforesis comenzaron a ser estudiados ya que en el aparato de Teselius tenía fallas, para 1950 con las aportaciones de científicos como Oliver Smithies se permitió la separación eficaz de proteínas con un método relativamente barato. En la actualidad existen diferentes aparatos comerciales que mediante el uso de la electroforesis son capaces de analizar mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos, secuencias de ADN, etc. La pretensión del trabajo actual es, mediante la micro-electroforesis, determinar el potencial zeta de las partículas a estudiar y con dicha información poder conocer las interacciones coloidales en la solución.

MARCO TEÓRICO Cuando dos fases están en contacto se presenta, en general, una diferencia de potencial entre ellos. Si una de las fases es un líquido polar, como el agua, sus moléculas (dipolares) tenderán a ser orientadas en la dirección de la interface y eso generará una diferencia de potencial. Si hay iones o electrones en exceso en una o ambas fases, o grupos iónicos presentes, habrá una tendencia para las cargas eléctricas de distribuirse de forma no uniforme en la interface. Solo en casos muy especiales la región entre las fases adyacentes estará marcada por la separación de cargas eléctricas, cerca o en la superficie de la primera fase hay un exceso de carga de algún signo y las cargas balanceadas están distribuidas de alguna manera a través de la unión de la superficie de la región de la segunda fase. El “arreglo” de cargas (positivas) en la superficie de la fase I y las cargas en el líquido (fase II) es referida como la doble capa eléctrica en la interface. Cuando una de estas fases es provocada a moverse tangencialmente a través de la otra fase, son observados diversos fenómenos que están agrupados bajo el título “efectos electrocinéticos”. Existen cuatro diferentes efectos dependiendo de la forma en que el movimiento es inducido: Electroforesis, electro-osmosis, potencial de “transmisión” y potencial de sedimentación (Hunter, 1998).

(a) Electroforesis: Si una fase consiste de líquido o gas en el cual la segunda fase está suspendida como partículas de solido o líquido, entonces las partículas pueden ser inducidas a moverse aplicando un campo eléctrico a través del sistema. La medición de la velocidad de las partículas bajo el campo eléctrico conocido nos da información acerca de su carga electrica neta, o el potencial de su superficie con respecto al “bulto” de la fase suspendida.

(b) Electro-osmosis: Cuando el sólido permanece estacionario y el líquido se mueve en respuesta a un campo eléctrico aplicado.

(c) Potencial de transmisión. (d) Potencial de sedimentación.

En el caso de la electroforesis para una partícula grande con una doble capa delgada moviéndose a través de un líquido estacionario, de modo que la partícula se mueve en dirección opuesta se propuso la siguiente ecuación:


𝜂 = 𝜀𝜁𝜂

Donde 𝑢𝐸 es la movilidad de la partícula, ésta es conocida como la ecuación de Smoluchowski para la movilidad electroforética.

MEDICIÓN DE POTENCIAL ZETA MEDIANTE MICRO-ELECTROFORESIS

1Unidad Académica de Física, Universidad Autónoma de Zacatecas; Calzada Solidaridad, Campus Universitario II, C.P. 98060, Zacatecas, Zac., MÉXICO, [email protected]; 2Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí; Álvaro Obregón 64, C.P. 78290, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected], [email protected]; 3Instituto Tecnológico de Villa-hermosa-Frontera Km. 3.5, Ciudad Industrial, C.P 86010 Villahermosa, Tabasco., MÉXICO, cinthya.

[email protected]

Sánchez Gallegos, J. A.1; Ramírez Saito, M. A.2; Díaz de la Cruz, C. G.3; Arauz Lara, B. J. L.2

RESUMEN En el presente trabajo se explicará detalladamente el proceso para analizar experimentalmente el fenómeno llamado electroforesis, que forma parte de los fenómenos electrocinéticos y que tiene gran relevancia en el estudio de coloides, en particular para determinar el potencial zeta, el cual permite caracterizar y así poder cambiar las propiedades de dichos coloides en gran diversidad de procesos. La electroforesis es ampliamente usada en procesos como lo es la separación de moléculas. En el actual trabajo no solo se enfatizó en el análisis del fenómeno, si no en los retos de usar materiales de bajo costo para la elaboración de una celda electroforética, con un diseño adecuado para calcular el potencial zeta usando videomicroscopía, cabe mencionar que durante la realización del experimento fue evidente que el material del que estén hechos los electrodos influye significativamente en los resultados finales lo que fue tema de interés a lo largo del experimento.

ABSTRACT In the present work will be explained in detail the process to analice expermimentally a phenomena called electrophoresis which is one of the electrokinetic phenomena which are of importance on the study of colloids, in particular to determine the zeta potential, which allows to characterize and change the properties of colloids in many kind of processes. Electrophoresis is widely used in process like the molecular separation. The present work not only was oriented on the study of the phenomena if not in the challenge of use low-coast material to the production of the electrophoretic cell and its design for calculate the zeta potential using videomicoscopy, something that was of interes during the experiment was the fact that the material of the electrodes affect considerably the final results so this topic was very important during the proyect. Palabras clave: Suspensión coloidal, fenómenos electrocinéticos, modelo de doble capa, potencial zeta.

INTRODUCCIÓN

Los primeros trabajos basados en el fenómeno de electroforesis datan del siglo XIX basados en las leyes de Faraday de electrolisis. Algunos científicos usaron este fenómeno para estudiar las propiedades y comportamientos de pequeños iones, moviéndose en una solución acuosa bajo la influencia de un campo eléctrico. También fueron creadas ecuaciones para variar la concentración de partículas cargadas moviéndose a través de una solución.


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como se muestra en la figura 1, tomando siempre en cuenta que la parte de los electrodos que va a estar en contacto con el agua esté libre de resina, la celda se deja secando 24 horas dentro de una cámara de vacío (tiempo de secado de la resina).

Figura 1. Celdas electroforéticas, con electrodos de aleación de plata, acero ferrítico, acero austenítico

La solución que se utiliza en el experimento es de agua con partículas de poliestireno de 2 𝜇𝑚, la solución se hace de 1950𝜇𝑙 de agua desionizada y 50 𝜇𝑙 de partículas de poliestireno, dicha solución se pone a sonicar durante diez minutos para hacer que las partículas no formen agregados, se inyecta en la celda y se sella con cinta y acetato. 3) Colocar la celda en el microscopio y se conectan los electrodos a la fuente de poder, el arreglo debe quedar como se muestra en la figura 2, hecho lo anterior se procede a hacer pruebas del funcionamiento de las celdas. Las primeras celdas que se hicieron fueron hechas con los electrodos de aleación de plata, las segundas con acero ferrítico y las terceras con acero austenítico, todas con el mismo procedimiento.

Figura 2. La celda electroforética conectada a la fuente de poder colocada sobre el portamuestras hecho de polietileno

La técnica de videomicroscopía es utilizada para observar nuestro sistema y consiste en conectar el microscopio a una cámara, a una televisión y un DVD para poder documentar y analizar posteriormente los fenómenos que ocurran.

(2)

(3)

Hückel re-examinó el problema de la electroforesis y obtuvo un resultado diferente:


6𝜂 = 2𝜀𝜁3𝜂

Se puede obtener una ecuación similar haciendo balance de fuerzas eléctricas en la partícula y la ecuación de Stokes para la resistencia a la fricción para obtener:

𝑢𝐸 = 𝑣𝑒𝐸𝑧

= 𝑄6𝜋𝑎𝜂

Donde 𝑢𝐸 es la movilidad electroforética de la partícula, 𝑄 es la carga de la partícula, 𝐸𝑧 el campo eléctrico, 𝑎 es el radio de la partícula, 𝑣𝑒 es la velocidad, 𝜂 es la viscosidad del líquido, 𝜁 es el potencial zeta, 𝜀 es la constante dieléctrica del líquido, 𝐷 es la permitividad relativa.

MÉTODOS Y MATERIALES Microscopio óptico Zeiss , cámara para microscopio, grabador de DVD, disco virgen, TV, porta objetos, cubre objetos, sonicador, pipetas de diferentes volúmenes, partículas de poli-estireno de 2𝜇𝑚, resina epo-tek 302, fuente de poder, caimanes, metanol, vaso de precipitado, jeringas, electrodos de acero ferrítico, electrodos de aleación de plata, electrodos de acero austenítico, cortador de vidrio, láminas de acrílico, lamina de polietileno, seguetas, computadora de escritorio, dremel. 1) Diseño de la celda: se desea hacer una celda de tamaño pequeño ya que la micro-electroforesis (técnica de medición de la movilidad electroforética mediante el uso de un microscopio) necesita tener un portaobjetos y un cubreobjetos, se debe tener en consideración que una vez que la suspensión coloidal este dentro de la celda no exista ninguna fuga, lo cual es el reto más grande en el diseño, se desea también que sea reutilizable, fácil de desmontar y lavar. El material del que estén hechos los electrodos no debe liberar óxidos o iones al momento de que se genere la diferencia de potencial, ya que se contaminaría la muestra dando resultados incorrectos. 2) Construcción de la celda: las piezas de la que está constituida la celda son cinco, electrodos (aleación de plata, acero ferrítico, acero austenítico) con dimensiones variables dependiendo del material (10x3x27mm, 10x1x30mm, 10x1x27mm, éstas son las dimensiones respectivas de los electrodos), cubre objetos de 60x24x0.1mm, porta objetos de 75x25x1mm, lámina de acrílico de 3mm de grosor, lamina de polietileno de 1mm de grosor, lamina de polietileno de 1.5mm de grosor. Se cortan rectángulos de acrílico de longitud de 7x1.5cm, después se limpian con metanol, al cubre objetos se le hace una perforación a una quinta parte de su longitud y se biselan los lados para que la resina se adhiera mejor al momento de pegar. Es necesario fabricar también un portamuestras con el polietileno de 1.5mm de grosor para poder fijar la celda al estantivo del microscopio, las dimensiones del portamuestras son 14x22cm con sus respectivos cortes para poder fijarlo y el rectángulo de en medio para que la luz del microscopio ilumine la muestra. Se limpian los cubreobjetos y portaobjetos en un soporte especial que va dentro del vaso de precipitado usando agua desionizada, metanol, una plancha calentadora y un agitador magnético, una vez secos se pegan todas las partes de la celda con resina epo-tek (el portaobjetos se pega del lado que esta biselado)


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Figura 6. Datos obtenidos para la celda

con electrodos de acero ferrítico

Figura 7. Recta obtenida despreciando datos para la celda con electrodos de acero ferrítico

Figura 4. Datos obtenidos para la celda con electrodos de aleación de plata

Figura 5. Recta obtenida despreciando datos para la celda con electrodos de aleación de

plata

Figura 8. Datos obtenidos para la celda con

electrodos de acero austenítico Figura 9. Recta obtenida despreciando datos

para la celda con electrodos de acero austenítico

Figura 3. Aparatos necesarios para observar y grabar el sistema

4) Una vez analizado el comportamiento de cada celda (grabar en varias zonas y a varios voltajes) se procede a grabar en alguna región dentro de la celda, la cual será fija para todas las grabaciones, dicha región no es elegida al azar sino que debe ser en una región en la que el movimiento electro-osmótico no influya en las mediciones, esta región está cerca de las paredes inferior y superior. Cuando se tiene ya el área para medir se inserta un disco en el grabador de DVD para comenzar a grabar, la duración del video y la variación del voltaje dependerán del comportamiento de las partículas con cada par de electrodos. 5) Para analizar los videos es necesario descomponer el video en fotogramas usando un software especializado que se encuentra instalado en las computadoras del laboratorio de fluidos complejos, se obtienen imágenes de 640x480 pixeles, en las imágenes se encuentran las partículas y para obtener el centro de dichas partículas se utilizó un programa en IDL para poder hacer tracking de partículas. Para encontrar las trayectorias y calcular las velocidades de las partículas se utiliza un programa hecho en Fortran.

RESULTADOS La movilidad electroforética puede ser obtenida de las gráficas, la teoría nos dice que la movilidad es constante. De 1) despejamos el potencial zeta 𝜁 = 3𝜂

2𝜀 𝑢𝐸 donde 𝜂 = 1.02𝑥10�3𝑃𝑎 ∙ 𝑠 y 𝜀 =7.11𝑥1011𝐶2/𝑁𝑚2 para agua a 20°, la pendiente de las rectas 𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 = 𝑢𝐸 se observa en las siguientes gráficas.


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ANÁLISIS DEL CLC-2 DE RATÓN MEDIANTE ESTIMACIÓN DEL COSTO ENERGÉTICO DEL TRANSITO DE IONES,

POR MEDIO DE CALCULOS DFT EN EQUIPOS DE SUPERCOMPUTO

1Universidad Autónoma de Zacatecas “Francisco García Salinas”, Unidad Académica de Ciencias Químicas; “Campus UAZ SIGLO XXI” Edificio 6. Carr. Zacatecas-Guadalajara Km. 6, Ejido La Escondida, C.P. 98160, Zacatecas, Zac. MÉXICO; 2Facultad de Ingeniería, DFM, Universidad Autó-

noma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, C.P. 78260, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; [email protected].

Sánchez Trujillo, D. L.1; Nieto Delgado, P. G.2

RESUMEN Los canales de cloruro ClC, son proteínas transmembranales que permiten el paso selectivo de iones cloruro por la membrana celular. De la familia de los ClCs el ClC-2, a pesar de estar presente en una gran variedad de células, tejidos y órganos, aún se ignora mucho de su funcionamiento. En el presente trabajo planteamos dos mutaciones en el residuo Y561, primeramente cambiando por Fenilalanina (mutación Y-F) y posteriormente por Alanina (Y-A), con el fin de analizar cómo se afecta el perfil de la conducción iónica en cada estructura. Planteamos un modelo que considera 17 aminoácidos fundamentales, del total que constituye al canal, a partir de la estructura de un modelo por homología para la secuencia de aminoácidos del ClC-2 de ratón. Empleamos la metodología de Teoría Funcional de la Densidad (DFT) para encontrar la posible estructura optimizada restringida, donde solo son libres los residuos mutados y la parte residual de los aminoácidos que se infiere, tienen influencia en el proceso de la conducción iónica (S170, E213). Mostramos el perfil energético de la estructura conforme el Cl sale del poro, y realizamos un importante comparativo entre la estructura silvestre y las mutaciones planteadas. Palabras Clave: Canales ionicos, DFT, modelo por homología, CLC-2, mutación.

INTRODUCCIÓN

Los canales de cloro (ClC-Cl-/H+) son estructuras moleculares complejas que controlan el movimiento de iones cloro (Cl-) y protones (H+) a través de las membranas biológicas. Estas proteínas son homodimeros, cada monómero está conformado por 448 aminoácidos, y su estructura atómica se ha podido resolver en alta resolución y cristalizar gracias a técnicas de difracción de rayos X. Esto ha facilitado su estudio y ha generado como tal una nueva línea de investigación, ya que median muchas funciones fisiológicas como lo es; controlar el ritmo del corazón, regular la secreción de las hormonas en el torrente sanguíneo, y generar los impulsos eléctricos que subyacen a la transferencia de información en el sistema nervioso, entre otras (P. G. Nieto-Delgado et al. 2013). En el trabajo reportado por el profesor de bioquímica Roderick MacKinnon “Gating the Selectivity Filter in ClC Chloride Channels” en el 2003, se postula la existencia de tres sitios por los cuales ocurre el intercambio de iones; Sinterno, Scentral y Sexterno. Dichos sitios están delimitados por ciertos aminoácidos como tal y se plantea que dichos aminoácidos tienen cierta influencia en el transporte de iones cloruro y

Potencial zeta calculado con las mediciones de la celda con electrodos de aleación de plata: 𝜁 = 25.7𝑚𝑉 Potencial zeta calculado con las mediciones de la celda con electrodos de acero ferrítico: 𝜁 = 14.8𝑚𝑉 Potencial zeta calculado con las mediciones de la celda con electrodos de acero austenítico: 𝜁 = 10.2𝑚𝑉

CONCLUSIONES -La diferencia en los tres resultados se debe a que las propiedades de las aleaciones metálicas usadas en los electrodos no son las mismas. -Después de cierto voltaje las celdas comienzan a dar mediciones erróneas debido a que los electrodos comienzan a liberar sustancias que cambian las propiedades de la solución coloidal. -Las celda con electrodos de acero ferrítico soportaron un voltaje más alto y se observan resultados más lineales lo que las hace más adecuadas para la medición del potencial zeta.

BIBLIOGRAFÍA

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Se localizó la S170 ya que es equiparable a la S107 reportada en el trabajo ya mencionado de MacKinnon. Para obtener las estructuras a optimizar y a estudiar. OPTIMIZACIONES MOLECULARES Y ENERGIAS. La metodología DFT que se utilizó para optimizar las tres estructuras moleculares asociadas al ClC-2, consiste en resolver las ecuaciones de Khon-Sham:

(1)

(2)

(3) Donde la energía total del sistema usando el funcional de la energía es:

(4) Dicha solución numérica fue obtenida mediante el software “Quantum-espresso” (P. Giannozzi et al. 2009). Los parámetros que se establecieron en el software fue el tamaño de la celda cubica, este determina la libertad que se le dará a la molécula para moverse y optimizar su nueva estructura; se determinó mediante la medición del largo de la molécula y se le sumo 16 Å para brindarle ese grado de libertad necesario. El resultado de dicha suma fue 38 Å, el tamaño de la celda es igual al corte de energía para la expansión de ondas planas (38 Ry). Adicionalmente se empleó el potencial de intercambio y correlación de Perdew-Wang, puesto que para resolver las ecuaciones de Khon-Sham, se ha probado que dicho potencial brinda resultados precisos en sistemas débilmente interactuantes. El uso de softwares de simulación de estructuras como Jmol (versión 13.0) y PyMOL (versión 1.7.4.5 2015) permitió el análisis y la interpretación de las interacciones obtenidas por las optimizaciones del “Quantum-espresso”.

RESULTADOS

Los residuos importantes; es decir los que tienen influencia en el proceso de transporte de iones a través de la membrana, son aquellos que se encuentran alrededor de la S170 del modelo obtenido por homología del CLC-2 de ratón, (S107 en el caso del intercambiador de E.Coli), es por ello que se crearon tres moléculas con los residuos que estuvieran a 4 Å, 5 Å y 6 Å alrededor del residuo de la S170.

protones a través de la membrana. El sitio interno es aquella parte de la estructura posterior a la S107, el sitio central está delimitado entre la parte anterior de la S107 y el E148 así como la Y445. El sitio externo tiene una carga negativa gracias a la E148. Una de las proteínas ClC más importantes es el ClC-2, ya que desempeña un importante papel fisiológico. ClC-2 es un canal de doble poro ampliamente expresado en los tejidos de los mamíferos, el ClC-2 regula la actividad neuronal mediante el transporte de iones al medio extra e intra celular. Este es necesario para la absorción electroneutral de NaCl y KCl. El mal funcionamiento de los canales de cloro ClC-2 puede resultar en leucoencefalopatía, y su ablación en ratones degenera severamente la retina y los testículos; causando ceguera e infertilidad (Jesús-Pérez et al. 2015). En los seres humanos una deficiencia en el gen CLCN2; gen que codifica para la proteína ClC-2, se relaciona con el padecimiento de epilepsia idiopática generalizada en infantes, está claro que la homeostasis en el equilibrio electroquímico del cuerpo es de suma importancia y lo que genera esta homeóstasis es un correcto funcionamiento de dichas bombas o canales dedicados al transporte de iones y que los genes que las traducen para dichas proteínas sean expresados correctamente. El código genético que traduce para el CLC-2 presenta más similitudes con el de Homo sapiens, que aquel que traduce para el intercambiador de Cl- de la E.coli; es por ello que es más conveniente trabajar con el modelo por homología del CLC-2 de ratón, tomando únicamente como referencia la información existente del intercambiador. En el presente trabajo se plantea una serie de mutaciones en el sitio central de un canal ClC-2 de ratón, estructura obtenida mediante un modelo por homología, generado a partir de la secuencia de aminoácidos del código genético que traduce para dicha proteína. Las mutaciones realizadas son en la Y561, por Fenilalanina y por Alamina respectivamente, se optimizaron dichas estructuras según la metodología DFT y se midió la energía del sistema, para posteriormente realizar una comparación con el modelo inicial sin mutaciones, cabe recalcar que en esta ocasión se utilizó el cristal (3ORG), puesto que en un modelo por homología donde se utilizó el cristal (1OTS) no se reportaron cambios significativos tanto energéticamente como estructuralmente.

METODOLOGÍA MODELO MOLECULAR. El código genético que codifica para el ClC-2 de ratón sirvió para obtener una estructura generada por homología gracias a un modelador en línea SWISS-MODEL, el cual genero tres modelos mostrados en la figura 1, el seleccionado fue el que tenía mayor grado de convergencia (0.68) y mayor resolución (3.5 Å) y se muestra en la figura 1 a.

Figura 1, Modelos por homología obtenidos en línea gracias a SWISS-MODEL. a) el primer modelo tenía un grado de convergencia de 0.60 y una resolución de 3.50 Å, es por ello que se seleccionó como el más apto para trabajar. b) este modelo tenía el mismo grado de resolución que el anterior; 3.50 Å, pero una convergencia de 0.50. c) modelo obtenido por homología de ClC-2 de ratón con 3.40 Å de resolución y 0.40 de convergencia.


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ion Cl- es más propenso a acercarse al Sexterno que delimita la E213. Claro está que se plantea realizar un análisis de cargas para las estructuras donde la parte residual de los aminoácidos de interés se encuentren libres, para dar más veracidad a la hipótesis planteada.

Figura 3. Estructuras optimizadas gracias a la metodología DFT. a) se muestra el empalme de la estructura optimizada WT con la mutación Y-A mientras los residuos de los aa de interés se mantienen fijos. Se denota que el ion Cl- de Y-A se acerca al E213. b)El empalme de las estructura optimizadas de WT con la mutación Y-F mientras los residuos de los aa de interés se encontraban libres, muestran como el ion Cl- de la mutación Y-F se aproxima al Sinterno es decir a la E213, también se denota como la F561 se orienta hacia el Cl- Y-A. c) El análisis de las estructura optimizada de la mutación Y-A mientras se tenía en libertad de movimiento los residuos de los aa de interés, denota al momento de compararla con el WT que el ion Cl- se aleja de la A561 y se aproxima al E213 a pesar de que este tiene carga negativa, además el E213 se orienta hacia dicho ion, lo cual nos hace inferir que la carga negativa del E213 disminuye considerablemente en dicha mutación. Se procedió a medir la energía de las tres estructuras; Wild Type, Y-F, Y-A, en las estructuras que mantenían fijos a los residuos de los aminoácidos de interés. Para determinar si existe un cambio energético significativo en el sistema, se planteó una ruta de transición del ion Cl- del sitio interno hacia el sitio central (ver figura 4), la energía se calculó en cada punto después de que el ion recorría 1 Å hacia el sitio central.

Figura 4.- ruta del Cl- a través de la membrana, del sitio interno al sitio central. a) ruta planteada en el Wild Type. b) ruta planteada para la mutación de tirosina por alanina (Y-A). c) ruta planteada para la mutación de tirosina por fenilalanina (Y-F). Estas rutas se plantearon respectivamente para medir posteriormente el grado energético de dichos puntos.

Figura 2.- a) residuos alrededor de 4Å del residuo de la S170 la secuencia de aminoácidos que la conforman es GSGIPEGPCY. b) residuos alrededor de 5Å del residuo de la S170 la secuencia de aminoácidos que la conforman es GSGIPEGPCGAYI. c) residuos alrededor de 6Å del residuo de la S170 la secuencia de aminoácidos que la conforman es GSGIPEEGPVTCGALYI. En los tres modelos se insertaron los Cl- tomando como referencia la posición de los reportados en el cristal de Christopher Miller del intercambiador de E.coli. La posición de dichos cloros se estabilizo sometiendo los datos de las estructuras a una optimización mediante DFT en el software “Quantum-espresso”. La estructura obtenida con los residuos a 6Å alrededor del fragmento residual de la S170 (figura 2c) fue la seleccionada para trabajar ya que incluye los aminoácidos relevantes en el transporte de iones, reportados en diversos trabajos (2) (3) (4). Dichos aminoácidos son la S170, E213 y Y561. En general la estructura consta de 17 aminoácidos. Se remplazó la Y561 por una fenilalanina esperando que existiera algún cambio en la posición de los iones cloro, lo cual no sucedió de forma relevante, es por ello que se sustituyó en segunda instancia por alanina, obteniendo un cambio en la posición del cloro del sitio central, este se acercó a la alanina 0.85Å y por ende se alejó del E213; (figura 3a). Al ver que existía un cambio en la posición del ion cloruro que ocupa la posición central, las tres estructuras WT (wild type), Y-F y Y-A, se sometieron nuevamente a una optimización, pero ahora dejando libre la parte residual del E213, S170 y del aminoácido 561 ya fuera Y,F o A (dependiendo el caso). Esto con el objeto de establecer como se adecua el sistema al momento del paso de iones hacía el sitio central. Los resultados de la optimización en la mutación Y-F dejando mover la parte residual de los aminoácidos ya mencionados, el cloro del sitio central se movió hacia el E213 1.2 Å, se infiere que la falta del oxígeno de la tirosina y la libertad que se le dio a la fenilalanina de moverse, le dio la capacidad necesaria al sistema de buscar la posición estructural más relajada, además la carga positiva de la fenilalanina calculada en la estructura optimizada que tenía fijos los residuos es menor, comparada con la que tiene la tirosina es por ello que el grado de atracción entre el Cl- y la F561 disminuyo. (Ver figura 3b). Se infiere que cuando se calcule la carga de las estructuras optimizadas con los residuos libres, la carga de la F561 se vuelva negativa y el grado de repulsión del anillo bencénico sea mayor que el que ejerce el E213 y por ello el ion Cl- se acerque al E213 aún más. La estructura optimizada donde se dejó libre la parte residual de los aminoácidos de interés de la mutación Y-A (figura 3c) resulto bastante interesante, ya que el E213 se alineo con el ion Cl- posicionado en el Scentral, la S170 también se movió y oriento su grupo OH- hacia el ion Cl- que ocupa el Scentral, el ion Cl- se acerca al E213 1.27 Å un poco más que en lo reportado para la mutación Y-F, al analizar las cargas calculadas para la estructura donde se mantenían fijos los residuos, se encuentra que la carga del aminoácido que ocupa la posición 561 se reduce significativamente de 0.6196 (Y561) a 0.1991 (A561) por lo tanto ya no existe tanta atracción hacia esa posición y el ion Cl- tiende a alejarse, además la carga de repulsión negativa que tiene el E213 hacia el ion Cl- también disminuye en la mutación Y-A, por lo cual el


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BIBLIOGRAFÍA

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Las energías de las tres estructuras se calcularon en el software “Quantum-espresso”. Y se encontró que la estructura de referencia WT y la estructura de la mutación de Y-F mantenían niveles de energía altos muy similares; con 14.6280 eV como punto más alto, claro está que se esperaba que la energía del sistema aumentara porque la ruta planteada pasa muy cercana de la S170, e incluso llega a enlazar con su parte residual, pero la ruta planteada para la mutación Y-A también pasa a una distancia similar de la S170 y también se enlaza con su parte residual y a pesar de ello reporta un estado energético menor, reportando como punto más alto 10.7880 eV. Los resultados obtenidos fueron comparados con los calculados resultantes de otras estructuras que utilizaron el cristal (1OTS) para obtenerse, en dichos resultados, al contrario que en los obtenidos en las estructuras que utilizaron el nuevo cristal (3ORG), el WT y la mutación Y-A reportaban resultados de energía muy similares.

Grafica 1.- Resultados de los cálculos de energía obtenidos mediante metodología DFT por las estructuras que utilizaron cristal nuevo para generarse, donde se puede observar como la mutación de Y-A reduce la energía del sistema. Grafica 2.- Resultados de los cálculos de energía obtenidos mediante metodología DFT gracias a las estructuras que utilizaron un cristal distinto al nuevo para generarse, se observa como el WT y la mutación Y-A tienen un comportamiento energético muy similar, y la mutación Y-F no tiene un comportamiento energético significante ya que aumenta la energía del sistema, lo que hace más improbable su existencia.

CONCLUSIONES El estudio de los canales de cloro (ClC-Cl-/H+) en particular del ClC-2, permite conocer cómo es que ocurre el transporte iónico en ellos y las posibles alteraciones que podría tener si la estructura se modificara; como lo fue en este caso. Las mutaciones realizadas en las estructuras obtenidas por homología del ClC-2 de ratón permitieron dar a conocer, que cuando se sustituye la Y561 por alanina el sistema reduce su energía y por lo tanto facilita el paso de los iones hacia el sitio externo, en cambio cuando se sustituye Y561 por fenilalanina la energía del sistema también se reduce, pero no lo suficiente para ser significativa, puesto que se reduce en decimales de eV. El estudio del ClC-2 en nuevos cristales sintetizados (3ORG) abre una nueva puerta para la investigación de las estructuras de los canales de cloro, puesto que como se discutió en el presente trabajo, en unas estructuras anteriores obtenidas con un cristal diferente (1OTS) no existía una reducción de la energía del sistema en ninguna de las mutaciones respecto al WT. La estructura que favorece más al sistema es aquella con la mutación Y-A ya que favorece al paso de iones hacia el SExterno. Se plantea como trabajo a futuro realizar optimización en la ruta del Cl- donde este se mantenga fijo y posteriormente se calcule la energía del sistema, buscando así que esta disminuya.


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en la etapa de lactante y preescolar. El retinoblastoma es casi siempre fatal y un retraso en su tratamiento suele suponer un pronóstico visual precario, de ahí la transcendencia del diagnóstico precoz. El gen responsable, es RB1, está localizado en el cromosoma 13 y actúa de forma dominante; es decir, en células donde las dos copias del gen estén dañadas. RB controla la progresión a través del ciclo celular a través de su interacción con la familia de factores de transcripción E2F. Esta familia está compuesta por ocho miembros (E2F1-8), algunos de los cuales tienen funciones activadoras y otros de los cuales tienen funciones represoras. RB es capaz de interactuar con E2F1, E2F2, E2F3 y E2F4, quienes funcionan como activadores transcripcionales uniéndose a secuencias regulatorias en el ADN y estimulando la expresión de genes requeridos para la entrada en fase S. La interacción entre RB y E2F bloquea la función transactivadora de E2F, y por lo tanto restringe la entrada de las células a la fase S.

MARCO TEÓRICO El gen RB1 fue clonado inicialmente en 1986, como uno de los genes cuya mutación predisponía al tumor pediátrico retinoblastoma (Friend et al., 1986). RB1 fue el primer gen supresor de tumores identificado, y poco tiempo después de su identificación, se descubrió que el producto de este gen era una proteína de 105KDa, la cual era inactivada por varias proteínas de los llamados pequeños virus a ADN tumorigénicos (Howley and Livingston, 2009). La función de RB fue dilucidada inicialmente a partir del estudio de su interacción con tres proteínas virales: el antígeno T grande de SV40 (SV40LT), la proteína E1A del adenovirus humano (AdE1A) y la proteína E7 del virus de papiloma humano (HPV-E7) (DeCaprio et al., 1988; Dyson et al., 1989; Whyte et al., 1989). Estos estudios revelaron que RB actuaba en el control de la progresión a través del ciclo celular (Weinberg, 1995). Uno de los principales roles de RB es la restricción del pasaje de la fase G1 a la fase S (fase de síntesis de ADN), la cual es indispensable para asegurar la progresión a través del ciclo celular. Se ha mostrado que RB está formada por 4 dominios. El dominio N-terminal de aproximadamente 370 aminoácidos (RbN), un dominio central denominado RbAB (Small pocket), de 400 aminoácidos, y un dominio C-terminal de aproximadamente 150 aminoácidos (RbC). La combinación de los dominios Small pocket y C-terminal originan el dominio Large pocket. (RbABC). El domino N-terminal y el dominio AB están formados cada uno por un doble motivo de ciclina, un motivo de plegamiento común al factor de transcripción TFIIB y a las ciclinas (Hassler et al., 2007; Lee et al., 1998). El domino C-terminal tiene una estructura desordenada en solución, y contiene 16 sitios de fosforilación por quinasas dependientes de ciclinas (Rubin et al., 2005).

MÉTODOS Y MATERIALES Vector de clonación pET28a (+). Cepa de Escherichia coli Top 10. Cepa de Escherichia coli BL21 DE3. Clonación A partir de la construcción pET28-RB, se amplificaron los diferentes dominios de RB mediante la técnica de PCR utilizando los oligonucleótidos correspondientes a cado dominio. El producto de PCR fue digerido utilizando las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Así mismo el vector pET28a (+) fue digerido con las mismas enzimas de restricción y posteriormente desfosforilado. Todas las digestiones se realizaron a 37ºC durante 2 horas. Tras esto, se llevó a cabo la ligación de cada dominio con pET28a utilizando la


1Instituto Tecnológico de Celaya, Ingeniería Bioquímica; Antonio García Cubas Pte #600 esq. Av. Tecnológico, C.P: 38010, Celaya, Guanajuato, México, [email protected]; 2Univer-sidad Autónoma de San Luis Potosí, Instituto de Física; Av. Dr. M. Nava No.6, C.P: 78260, San Luis

Potosí, S.L.P, México, [email protected].

Santos Valente, A.1; Olivares Illana, V.2

RESUMEN El retinoblastoma es el tumor intraocular más frecuente en la población mundial en edad pediátrica, que aparece en la retina. Representa el 4.3 % de las neoplasias de la infancia. Este padecimiento es causado por mutaciones en el gen RB1, el cual codifica para la proteína supresora de tumores retinoblastoma (RB), esta proteína juega un rol central en el control del ciclo celular en células eucariotas, y su inactivación funcional se encuentra asociada a la progresión del cáncer en humanos. La proteína RB inhibe la expresión de los genes necesarios para la entrada en la fase S por el secuestro de los factores de transcripción de la familia E2F. En el presente trabajo se utilizó la cepa Escherichia coli BL21 DE3 para la expresión y posterior purificación de los diferentes dominios de RB con el fin de brindar resultados para estudiar los mecanismos de interacción de la proteína RB con otras proteínas de interés. Palabras Clave: Retinoblastoma, supresor tumoral.

ABSTRACT Retinoblastoma is the most common intraocular tumor in world population in pediatric age, appearing on the retina. Representing 4.3% of all childhood neoplasms. This condition is caused by mutations in the RB1 gene, which encodes the retinoblastoma tumor suppressor protein (RB), this protein plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. The Rb protein inhibits the expression of genes necessary for entry into the S phase by the kidnapping of the transcription factors of the E2F family. Escherichia coli BL21 DE3 strain was used for expression and purification of the different domains of RB, in order to provide results to study the mechanisms of interaction of RB protein with other proteins of interest. Keywords: Retinoblastoma, tumor suppressor.

INTRODUCCIÓN El retinoblastoma es el tumor intraocular maligno más frecuente en pediatría. Representa el 4.3 % de las neoplasias de la infancia. En México, la incidencia anual varía de acuerdo con la zona geográfica estudiada en un rango de 4 a 24 casos por millón en menores de 15 años y el 95 % de los casos se presenta


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Figura 1. Bandas correspondientes al peso molecular de los diferentes dominios de RB

Para la realización de PCR de colonia se seleccionaron 4 colonias de cada dominio, en 2 de las 4 colonias seleccionadas se utilizaron los oligos Forward del dominio correspondiente (véase la tabla 1) y el oligo T7 terminador correspondiente al vector pET28a, para los otras 2 colonias se utilizaron los oligos T7 promotor y T7 terminador. Los productos de PCR se observaron en geles de agarosa (Figura 2a.). Se corroboro las diferentes construcciones de los dominios en pET28 haciendo una digestión con las enzimas de restricción BamHI y HindIII al ADN plasmídico purificado en la Miniprep, dando positivo solamente para las clonas del dominio Small pocket (carril arriba: 8, 9, 10 y 11) con un tamaño de 1224 pb y Large pocket (carril abajo: 3, 4 y 5) con un tamalo de 1664 pb. El vector pET28a tiene un tamaño de 5369 pb (Figura 2b). a)

enzima T7 ligasa. El producto de la ligación se utilizó para realizar una transformación bacteriana utilizando la cepa Escherichia coli top 10 (que previamente se hizo competente), mediante cambios bruscos de temperatura se favorece la entrada de ADN a las bacterias. Las células transformadas se sembraron en cajas con medio LB y antibiótico kanamicina y se incubaron a 37ºC toda la noche para permitir la proliferación celular. Tras observar el crecimiento celular se seleccionaron 5 colonias de cada caja y se realizó una PCR de colonia con el fin de seleccionar a aquellas colonias que tuvieran la construcción del dominio de interés dentro del ADN plasmídico. Se identificaron la clonas positivas a la transformación mediante la observación en un gel de agarosa. Las colonias seleccionadas se cultivaron en 10 mL de medio LB con kanamicina y se crecieron durante 16 horas en agitación constante. Los cultivos líquidos crecidos se usaron para purificar el ADN plasmídico siguiendo el protocolo del Plasmid MiniPrep Kit. Se corroboró la construcción de los diferentes dominios realizando una digestión al ADN plasmídico con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y se analizó en un gel de agarosa, obteniendo solo la construcción del dominio Small pocket y Large pocket. Expresión. Se realizó una transformación bacteriana utilizando la cepa Escherichia coli BL21 D3 y los dominios Small pocket y Large pocket, mediante choque térmico. De las células de E.coli BL21 D3 transformadas con el plásmido correspondiente a cada dominio, se realizó un precultivo en 10 ml de medio 2xYT + km y se incubo a 37°C por 16 horas. Se realizó un cultivo en 100 ml de 2xYT + km y se tomó 1 ml del precultivo correspondiente hasta llegar a una densidad óptica de 0.1-0.3. Se incubó a 37°C y se midió la absorbancia cada 30 minutos hasta llegar a una D.O de 0.9. Se procedió a la inducción agregando 0.5mM de IPTG y se dejó sobreexpresar durante 3 horas a 37°C. Los cultivos se centrifugaron a 4300 rpm por 15 minutos, se descartó el sobrenadante y se congelo a -80°C hasta su purificación. Purificación La purificación de la proteína se hizo mediante cromatografía de afinidad, utilizando una resina de níquel. Los cultivos bacterianos se resuspendieron en 5 ml de buffer Tris A y 100 mg de PMSF diluido en 200 �l de DMSO con ayuda de vórtex, posteriormente se sonicaron con 15 pulsos de 30 segundos con descansos de 30 segundos y se tomaron alícuota de 80 �l para la fracción total (FT). Se centrifugaron por 15 minutos a 4300 rpm para separar la fracción soluble e insoluble. La fracción soluble se colocó en la columna (previamente equilibrada). Se lavó la columna con buffer Tris A y la proteína se eluyó con buffer Tris B. La fracción insoluble se resuspendió con buffer de urea y se incubó a 12 rpm durante 1 hora, posteriormente se centrifugó a 10000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante obtenido se colocó en la columna (previamente equilibrada). Se lavó con buffer de urea, buffer de urea + tritón 0.2% y buffer Tris A. La proteína se eluyó con buffer Tris B. Las eluciones obtenidas se concentraron utilizando un centricon y se procedió a correr un gel de poliacrilamida así como un western blot

RESULTADOS Los productos de PCR digeridos se analizaron por su separación en geles de agarosa y se compararon los pesos de los diferentes dominios con el marcador de peso molecular (Figura 1.).


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En la figura 3 se aprecia una banda de aproximadamente 45 kDa en la elución soluble e insoluble concentrada correspondiente al dominio Small pocket.

CONCLUSIONES En este trabajo experimental se logró la clonación, expresión y purificación del dominio Small pocket del supresor tumoral retinoblastoma en Escherihica coli BL21 DE3. Cabe recalcar que es necesario repetir los experimentos evaluando distintas condiciones de expresión para saber en cual se obtendría un mayor rendimiento para la producción de cada uno de los diferentes dominios de RB y así lograr una estandarización, esto será de gran ayuda para generar anticuerpos específicos para cada dominio. Debido a que la proteina RB es uno de los principales controles del ciclo celular y esta alterada en diversos tipos de cáncer, siendo uno de los más importantes el retinoblastoma, la importancia de su estudio radica en la necesidad de comprender mejor el funcionamiento de esta proteína así como sus interacciones con otras proteínas de interés, esto permitirá en un futuro poder realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad, por esto necesario obtener la proteína, así como sus dominios en grandes cantidades.

BIBLIOGRAFIA Artículos de revista RODRÍGUEZ, M., SALCEDO, M. (2005). “Perspectivas en la genómica del retinoblastoma: Implicaciones del gen supresor de tumor RB1” en Investigación clinica, Núm. 4, Vol. LVII, Julio-Agosto, [pp. 572-581]. ESPINOZA, M. (2011). “Retinoblastoma” en Revista médica de costa rica y centroamérica, Vol. LXVIII, [pp. 23-27]. LEE, W, BOOKSTEIN, R, HONG, F, YOUNG, L, SHEW, J, LEE, P. (1987). “Human Retinoblastoma Susceptibility Gene: Cloning, Identification, and Sequence” en Science, Vol. CCXXXV, [pp. 1394-1399]. WEINBERG, R.A. (1995). “The retinoblastoma protein and cell cycle control” en Cell, Vol. LXXXI, [pp. 323-330]. Artículos en línea FONTELA, J.R, MASSANA, A, PELEGRÍN, A, ARANDA, A, BURÉS, A, FERRAN, M. (2004). “Retinoblastoma” en La medicina hoy, No. 1564, pp. 33-42. Consultada en http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=13075068&pident_usuario=0&pcontactid=&pident_revista=1&ty=66&accion=L&origen=zonadelectura&web=www.elsevier.es&lan=es&fichero=1v68n1564a13075068pdf001.pdf (fecha de consulta 27-06-2016). CERECEDO, F, LÓPEZ, E, RIVERA, H, ARIAS, J, RAMÍREZ, F, RODRÍGUEZ, M. (2003). “Supervivencia y aspectos clínicos del retinoblastoma” en Anales de Pediatría, No. 58, pp. 3-9. Consultada en http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1695403303779831 (fecha de consulta 9-07-2016). Tesis doctoral CHEMES, L. (2010). “La proteína supresora de tumores Retinoblastoma: caracterización de su dominio AB y mecanismo de interacción con la oncoproteína E7 del papilomavirus humano”. Doctorado. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.

b)

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de PCR colonia y digestión de ADN plasmídico. a) Resultado de la PCR de distintas colonias. b) Bandas correspondientes a las clonas de los

dominios Small pocket, Large pocket y el plásmido pET28. Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 13-15 (arriba) y Carril 11-13 (abajo): RB amplificada con diferentes oligos.

Las eluciones solubles e insolubles de los dominios Small pocket y Large pocket fueron analizadas por western blot (Figura 3.).

Figura 3. Bandas correspondientes a las eluciones de los dominios Small pocket y Large pocketl. Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 2-5: eluciones del dominio Small pocket; Carril 6-9:

eluciones del dominio Large pocket


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INTRODUCCIÓN El uso de las nanoestructuras de carbono como el grafeno, fullereno o los nanotubos de carbono es un tema relativamente nuevo y sigue sorprendiendo debido a sus propiedades tan excepcionales, tales como alta resistencia, flexibilidad y la facilidad con la que las moléculas se adhieren a su superficie, por lo que pueden tener una gran variedad de usos en diferentes áreas como la construcción para reforzar estructuras, en energía como superconductores, en medicina con prótesis entre otros. Sin embargo, durante esta investigación se resaltarán los aspectos y aplicaciones biológicas específicamente la regeneración de tejidos con las nanoestructuras como base estructural y medio para favorecer la regeneración del tejido, esto debido a la alta demanda de tratamientos de regeneración de tejido principalmente para los casos de quemaduras o recuperación después de una cirugía. Para la realización de los experimentos de esta investigación es necesario primero establecer las características de las nanoparticulas de carbono involucradas. El carbono puede ser observado en la naturaleza en distintas formas alotrópicas, dentro de las formas alotrópicas nanométricas del carbono se encuentran el grafeno, nanodiamantes, fullerenos, y nanotubos de carbono (Shenderova, Zhirnov, & Brenner, 2002). El grafeno está formado únicamente por carbono, con átomos dispuestos en patrón regular hexagonal, similar al grafito, pero en una hoja de un átomo de espesor. Se considera 100 veces más fuerte que el acero y su densidad es aproximadamente la misma que la de la fibra de carbono, y es aproximadamente cinco veces más ligero que el aluminio, una lámina de 1 metro cuadrado pesa tan solo 0,77 miligramos. Los nanotubos de carbono (CNT´s) se clasifican en nanotubos de carbono de una sola pared o nanotubos de carbono de paredes múltiples, Los nanotubos de carbono de una sola pared consisten en una sola lámina de grafeno enrollada en forma de cilindro, tienen diámetros que van desde 1 a 10nm y longitudes de 50nm a 1µm, Los nanotubos de carbono de paredes múltiples consisten en dos o más láminas de grafeno enrolladas en cilindros concéntricos, la distancia entre paredes adyacentes es de aproximadamente 0.36nm, sus diámetros van de 2.5 hasta 30nm y sus longitudes de 10nm hasta 1 µm. Las propiedades mecánicas que poseen estas nanoestructuras son únicas, presentan un módulo de Young muy alto que va desde 0.4 a 4.15 TPa (Treacy, Ebbesen, & Gibson, 1998), Los CNT´s son muy flexibles pero dificiles de romper. Debido a sus propiedades, estas nanoestructuras son consideradas como materiales con un gran potencial para aplicaciones biológicas, ya que cuando estos nanotubos se encuentran modificados pueden ser utilizados como acarreadores de fármacos, transportadores de proteínas o en terapias contra el cáncer (Shi Kam & Dai., 2005). El grafeno y los CNTs pueden ser conjugados a lo largo de su superficie con una gran variedad de moléculas, tales como polímeros, proteínas, enzimas, ácidos nucleicos y drogas. Dichas moléculas pueden estar unidas a las nanoestructuras de forma covalente en donde comparten uno o más electrones o pueden unirse de forma no covalente por medio de interacciones tipo π e interacciones hidrófobas. Estas funcionalizaciones han permitido que el grafeno y los CNTs sean buenos candidatos para ser utilizados en una amplia gama de aplicaciones biomédicas, por ejemplo como acarreadores de fármacos, terapia foto-térmica y como sistemas de suministro de genes (Peretz & Regev, 2012). En la literatura ha sido reportado el uso de nanotubos de carbono y el grafeno para mejorar las propiedades mecánicas de algunas plataformas de materiales biodegradables y también que dichas nanoestructuras pueden promover respuestas celulares cuando las células se cultivan sobre su superficie (Olivas-Armendariz, y otros, 2013).

Cabe mencionar que para los experimentos se utilizaron vesículas en lugar de células completas debido a las ventajas que estas otorgan, como un tamaño promedio de 20µm, propiedades mecánicas constantes por un periodo de tiempo aceptable de 7 días, en la relativamente fácil formación de estas que además evita el

INTERACCIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO CON SISTEMAS BIOLÓGICOS

1Instituto Tecnológico de Villahermosa, Carretera Villahermosa-frontera km3.5, Cd. Industrial, 86010, Villahermosa, Tab., MEXICO, [email protected]; 2Instituto de Física, Univer-sidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava 6, Zona Universitaria, 78290 San Luis Potosí,

S.L.P, MÉXICO; [email protected]; [email protected].

Valencia Chablé, C. V.1; Acosta Morales, S. C.2; Quintana Ruiz, M.2

RESUMEN Con la finalidad de optimizar el uso de nanoestructuras de carbono en distintas aplicaciones del campo de la biología, esta investigación aborda el tema sobre su interacción con sistemas biológicos tratando de resolver los comportamientos y efectos de células modelo (vesículas fluorescentes) en presencia de dichas nanoestructuras de carbono. Con el fin de mejorar sus usos en la medicina y la biología, tales como la regeneración de tejidos, como son los tendones, ligamentos y fibras nerviosas, así como también la liberación controlada de fármacos. Con este fin, durante este trabajo se diseñaron superficies en vidrio de nanoestructuras como grafeno (G), oxido de grafeno (GO), nanotubos de carbono oxidados (CNT´s oxidados ) y nanotubos de carbono oxidados y dopados con nitrógeno (CNT´s /N oxidados), y se observaron los efectos que dichas superficies tenían sobre las vesículas fluorescentes, que también fueron sintetizadas durante este proyecto, de esta manera se identificaron las superficies que tenían un efecto en el comportamiento de las vesículas.

Palabras Clave: Nanoestructuras carbono, Oxido de Grafeno, Nanotubos de carbono, Vesículas.

ABSTRACT With the purpose to improve the used of the carbon nanostructures for different applications on the field of biology, this research will address the topic about it´s interactions with biological systems, trying to solve the behaviors and effects of the cells model (fluorescent vesicles) in the presence of said carbon nanostructures in order to improve their medical and biological applications, such as tissue regeneration such as tendons, ligaments and nerve fibers or controlled drugs deliverance. For this purpose, during this work surfaces were designed in glass nanostructures like graphene (G), graphene oxide(GO), oxidized carbon nanotubes (CNT´s oxidized) and oxidized carbon nanotubes doped with nitrogen (CNT´s /N oxidized) and the effects it had on those surfaces fluorescent vesicles were observed, which they were also synthesized during this project, in this way the surfaces that have an effect on behavior of the vesicles are identified. KEY WORDS: Carbon nanostructures, Graphene oxide, Carbon nanotubes, vesicles.


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un vaso con acetona con tapa de parafilm poniéndose a sonicar por 5mins, para después pasarlos a otro vaso con etanol y sonicar 5mins mas por último se pasa a un vaso con isopropanol y se sónica 5mins.

Procedimiento para depositar nanoestructuras en vidrios Se colocan los vidrios (previamente limpiados con agua desionizada y metanol) en la plancha de calentamiento a una temperatura de entre 80°C y 90°C y se tapa la mitad del vidrio con la ayuda de otro (a fin de visualizar el comportamiento de las vesículas) se aplican las nanoestructuras: grafeno, oxido de grafeno, nanotubos de carbono oxidados y nanotubos de carbono oxidados y dopados con nitrógeno, en diferentes vidrios bajo las condiciones anteriores con la ayuda de un aerógrafo (un aerógrafo diferente por tipo de nanoestructura), se agregan alrededor de 700µL de solución en el aerógrafo y se depositan en el vidrio a manera de spray con ayuda de nitrógeno presurizado procurando dejar capas homogéneas de solución o evitar partes con exceso de material, se ponen dentro cajas petri debidamente rotuladas y se meten a un desecador al vacío por 24hrs.

Experimento principal de comportamiento de vesículas en las superficies Una vez secos se colocan los vidrios en la celda adaptador del microscopio de fluorescencia, se agregan de 20 a 35µL de vesículas con 1.2mL de sacarosa, se cierra la celda con un porta objetos y se tapa con aluminio (pues se degradan las vesículas fluorescentes con la luz), se coloca en el equipo de agitación por 25mins, se repite la misma operación con cada vidrio y se coloca en el microscopio tomando fotos de las áreas que tienen nanoestructuras y de las que no. Algunas de las técnicas que se han llevado a cabo para la obtención y caracterización del material fueron:

Preparación de vesículas gigantes por electroformación. Microscopio de fluorescencia. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN De las cuatro superficies con nanoestructuras trabajadas, en 3 se observó cierta preferencia por las superficies las cuales son las figuras 1,2 y 3 por otra parte en la última superficie con CNT´s /N oxidados se muestra una mayor cantidad de vesículas en el área sin material, figura 4.

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Figura 1:Cantidad de vesículas en grafeno

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Material

Figura 2: Cantidad de vesículas en GO

uso excesivo de sujetos de prueba (micheletto, 2014). Las vesículas funcionan como un modelo celular que nos permiten simplificar el problema a abordar.

METODOLOGIA Para el experimento principal se planea depositar diferentes nanoestructuras de carbono como superficie en cubre objetos y proseguir con el uso de vesículas para ver si tienen preferencia o no a las superficies, además de que se compararán con un vidrio con un tratamiento previo de solución piraña.

Preparación de vesículas fluorescentes

Para analizar el comportamiento de los sistemas biológicos en contacto con nanoestructuras de carbono se utilizaron vesículas sintéticas para facilitar su estudio, pues estas solo cuentan con una membrana muy parecida a las células pero sin influencia de proteínas y demás partes de una célula real, además de que el método utilizado provee de vesículas en general del mismo tamaño a una célula. El método utilizado para crear las vesículas es la electroformación, que crea vesículas de una bicapa lipídica de alrededor de 20micras, el medio en que se crean son unos vidrios especiales con un recubrimiento de óxido de indio-estaño sustancia conductora de la electricidad. Para empezar el proceso se lavan los vidrios (se usan pares de vidrios dependiendo de la cantidad de vesículas que se desean) para asegurarse de que no tengan partículas que dañen el experimento, se ponen los vidrios en una base de teflón y se sumergen en un vaso de precipitados con acetona poniéndose a sonicar por 10mins (la acetona quita las grasas del vidrio) después se pasan los vidrios a otro vaso, con metanol y se ponen a sonicar 10mins mas (el metanol quita el polvo y el residuo de acetona) una vez secos se mide la resistencia con un voltímetro por ambos lados del vidrio para identificar el lado conductor, para terminar la limpieza se ponen los vidrios junto los espaciadores de teflón en el desecador a vacío y al horno por una hora a temperatura de entre 60 y 65 °C. Después de sacar los vidrios del horno se depositan 5µL de lípido extraído de la yema de huevo (fosfatidil colina a 4mg/mL en cloroformo con rodamina 0.5% mol/mol para visualizarse en fluorescencia) con ayuda de una jeringa Hamilton de 50µL procurando esparcirlos lo más posible, se secan en vacío por una hora, se agrega grasa de vacío (Dow corning RYE) a los bordes de un vidrio poniendo encima un espaciador, otra capa de grasa de vacío y un nuevo vidrio a manera de que el espaciador quede entre ambos vidrios y que sobresalga un lado de los vidrios para aplicar la corriente, se abren dos agüeros al espaciador y por uno se inyecta sacarosa (al hacer esto se crean algunas vesículas naturalmente). La electroformación empieza aplicando 10Hz y 0.1v por 20mins, después subiendo a 1.5v por 30mins para continuar con 2v por 90mins y para finalizar 2v y 3 Hz por 15mins para despegar las vesículas unas de otras, de esta manera crecerán las vesículas, y sobrevivirán por alrededor de un mes, pero, para los fines a los que se requieren solo se pueden usar hasta una semana después de hacerlas pues la presencia de la sacarosa oxida las vesículas y por lo tanto cambia sus propiedades mecánicas. Para finalizar se retira un vidrio y con la ayuda de una micro pipeta con la punta cortada (para que las vesículas más grandes no se rompan al entrar a la punta) se extraen las vesículas y se depositan en un eppendorf.

Procedimiento para limpieza de vidrios con piraña Se inicia preparando la solución piraña (Ácido peroxosulfúrico) con 2/3 partes en volumen de H2SO4 Y 1/3 DE H2O2 vaciándose muy lentamente el H2SO4 en el H2O2, después se enjuagan los vidrios con etanol y agua destilada y se secan las orillas, se colocan los vidrios en la base de teflón y se mete en el vaso de precipitado que contiene la piraña procurando que la solución solo toque la mitad del vidrio y se deja por 15mins moviéndose cada 5mins, se sacan los vidrios y se enjuagan en agua destilada hasta que tengan el PH del agua, (la piraña crea radicales –OH en la superficie del vidrio)lo siguiente es meter los vidrios en


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CONCLUSIONES En base a los resultados obtenidos se llega a la conclusión de que las mejores superficies para estar en contacto con sistemas biológicos son el GO y el CNT´s oxidado sin embargo, aún se debe investigar con vesículas más complejas, para confirmar estas reacciones y pensar en las aplicaciones, además de buscar la razón de que se crean teters en el grafeno oxidado, que a pesar de que ciertamente estas vesiculas se adhieren a la superficie es discutible la fuerza con la que está anclada debido a la fragilidad de los teters y sin embargo no se puede definir si esto ayuda o perjudica la regeneración de tejido u otro ámbito de la investigación, también para el caso de las CNT´s oxidados se aprecia la tendencia por un orden pero se necesitan más experimentos para identificar la razón de esa forma tan especifica que podría atribuirse a la manera en que se depositaron los nanotubos, defectos del vidrio u otra razón no identificable a simple vista.

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Figura 3:Cantidad de vesículas en CNT´s oxidados

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Figura 4:Cantidad de vesículas en CNT´s/N oxidados

Además se observó un comportamiento peculiar en dos de las muestras, en la primera muestra con GO se aprecia cierta liberación de membrana llamada teters que sostienen a la vesícula, figura 5 y en la segunda muestra con CNT´s oxidados se observa un acomodo lineal de las vesículas, figura 6.

Figura 5:Microscopia de fluorescencia para GO

Figura 6:Microscopia de fluorescencia para

CNT´s oxidado Para finalizar en la muestra con piraña se nota claramente una preferencia por el área en que se trató con esta substancia debido a los radicales –OH que se quedan en esa zona, figura 7.

Figura 7: Microscopia de fluorescencia para piraña


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Las actividades mineras que prevalecen en México, se extienden desde el centro al norte del país y propician la contaminación de suelos y mantos acuíferos por la liberación de elementos potencialmente tóxicos (EPT), presentes en los residuos mineros tales como Pb, Cd, y As. (Castro y Kramar, 1997). La disponibilidad de EPT en el suelo es favorecida por los cambios atmosféricos, difusión de oxígeno, porcentaje de humedad, contenido volumétrico de agua, así como el tipo y contenido de materia orgánica presente en el suelo. Los ETP liberados pueden ser incorporados a las plantas a través del suelo rizosférico previo a su disolución/absorción o ser retenidos en la superficie de las raíces vegetales, y eventualmente pueden ser transportado a tallos, hojas y flores. Para que los metales pesados sean tóxicos a los seres vivos, primero deben encontrarse disponibles en la fase acuosa para ser absorbidos y posteriormente atravesar la membrana biológica. Las interacciones entre microorganismos y metales son fundamentales en los ciclos biogeoquímicos y dependen principalmente de los estados de oxidación en que se presenten. La rizósfera es la parte del suelo inmediata a las raíces en donde se llevan cabo diversas interacciones físicas, químicas y microbiológicas, que modifican la estructura del suelo y la distribución biótica del mismo de manera puntual (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). La presencia de bacterias aerobias en la rizósfera propicia condiciones óptimas para mantener metales en solución. Algunos microorganismos movilizan metales mediante la liberación de ácidos carboxílicos, mismo que pueden formar complejos metálicos solubles. Por lo tanto la tolerancia de algunas plantas vegetales en sitios impactados por la actividad minera esta relacionadas estrechamente con la fracción bioaccesible en el suelo rizosférico así como las propiedades bioquímicas que pueda expresar por su exposición a EPT. En los últimos años se han realizado diversos estudios en Villa de la Paz, para determinar los ambientes más afectados y se ha demostrado la presencia de altas concentraciones de arsénico y otros metales pesados en agua, aire y sedimento así como en plantas. Se han encontrado altas concentraciones de Cd, Cr, Cu, Pb, Zn y metaloides como arsénico, compuestos tóxicos para la flora y fauna de la región, no obstante existe la presencia de algunas especies vegetal que aumentan su proliferación en la región conforme aumenta la concentración de dichos compuestos, por lo que se cree que existen bacterias en la rizósfera que contribuyen a desarrollar mecanismos de adaptación, resistencia o evasión.

Durante el presente trabajo se tuvo por objetivo principal la búsqueda y caracterización de bacterias existentes en la rizósfera de vegetación que crece en el jale minero, así como la determinación de metales pesados en raíz, hoja de plantas colectadas en Villa de la Paz San Luis Potosí.


MUESTREO El muestreo fue basado y adaptado en los criterios que dicta la norma mexicana NMX-AA-132-SCFI-2006 Muestreo de suelos para la identificación y la cuantificación de metales y metaloides, y manejo de la muestra, el 15 de junio del 2016 en Villa de la Paz, Matehuala, S.L.P. Colectando en tres zonas principales: Zona afectada o Jale minero “Zona-1” (Figura 1a) caracterizado por un suelo de polvo fino blanco y escasa vegetación, zona en orilla del jale “Zona-2” (Figura 2b) encontrándose poca vegetación, destacando pirul y mezquite con un suelo rojo y Zona de Control Blanco ubicado a 5km del jale minero de Villa de la Paz “Zona-3” (Figura 3c) con una rica vegetación en biznagas, nopales, líquenes y un suelo firme, siendo siete plantas de flor amarilla, cuatro de un arbusto, un diente de león Taraxacum officinale, y un pasto (13 muestras).

RIZOBACTERIAS AOSCIADAS A ESPECIES VEGETALES EN JALE MINERO EN VILLA DE LA PAZ, SAN LUIS POTOSÍ

1Universidad Autónoma de Zacatecas, Unidad Académica de Ciencias de la Tierra, Calzada de la Uni-versidad No. 108, C.P. 98058, Zacatecas, Zac. México, [email protected]; 2Coordinación para la Innovación y Aplicación de la Ciencia y la Tecnología (CIACyT), LaNGIF-LaDBIO. Av. Sierra Leo-na #550, Col. Lomas 2a., 78210 San Luis Potosí, SLP, México, [email protected]; 3CIACyT. Centro de Investigación y Aplicación en Ambiente y Salud (CIAAS)-Facultad de Medicina.Av. Sierra

Leona #550, Col. Lomas 2a., 78210 San Luis Potosí, SLP, México, [email protected]

Varela Guardado, A.1, Vallejo Pérez, M. R.2, Ilizaliturri Hernández, C. A.3

RESUMEN La zona de Villa de la Paz-Matehuala pertenece al distrito minero de Santa María de la Paz, el cual ha sido explotado en forma continua por más de dos siglos. Durante ese tiempo se ha generado una gran contaminación por metales pesados y arsénico en la zona. Se realizó muestreo de 13 plantas (raíz, hojas y suelo), que crecen en los jales con el objetivo de determinar la concentración de metales pesados, especialmente plomo, así como también caracterizar bacterias existentes en la rizósfera de dichas plantas, siendo que la “colonia blanca” fue predominante en las tres zonas de muestreo y el 100% de las colonias resulto ser bacilos Gram negativos, entonces se plantea que dicha bacterias pueda estar asociadas al desarrollo de tolerancia de las plantas a las altas concentraciones de metales pesados.

ABSTRACT The area of Villa de la Paz-Matehuala belongs to mining district of Santa MarÍa de la Paz, which has been operated continuously for more than two centuries. Period of time that has increased the contamination by heavy metals and arsenic in the area. Sampling of 13 plants (roots, leaves and soil), growing in the tailings in order to determine the concentration of heavy metals, especially lead, and also characterize bacteria in the rhizosphere of these plants was conducted. Bacteria with colonial morphology " white colony "was predominant in the three sampling areas and 100% of the colonies turned out to be Gram negative bacilli, then it arises that the colony may be associated to the adapatatión of plants to high concentrations of heavy metals. Future research are needed.

Palabras Clave: Bacterias, rizósfera, metales pesados, jales

INTRODUCCIÓN La minería es considerada como una actividad productiva de alto impacto ambiental, debido a que en todas sus etapas (exploración, extracción y procesamiento) genera numerosos efectos adversos, así como una gran cantidad de residuos, los cuales pueden causar contaminación en agua, suelo, aire y sedimento. Algunos impactos ambientales generados por la actividad minera son: destrucción de hábitat y hábitats adyacentes, cambio en el régimen y dinámica de ríos, debido a la modificación del flujo y la sedimentación, cambios en el relieve, alteración en el nivel de los acuíferos, incremento de la erosión, generación de polvos durante los procesos, escorrentías de sedimentos, lixiviación de contaminantes en jales y suelo.


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pierda la turbidez, se retirará el vidrio de reloj. Se llevan a sequedad, se removerá el vaso y se dejará enfriar. Se añadirán 5 ml de agua desionizada y se analizaran por espectrofotometría de absorción atómica (concentración del analito en una muestra). AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Para realizar el aislamiento de bacterias se utilizaron las raíces y considerando una réplica para cada una (Figura 3). Se pesaron 0.5 g de muestra principalmente la tierra adherida a las raíces y la raíz más delgada, se suspendió en solución saturada de sacarosa agitando por 10 minutos, se centrifugo a 700 rpm (6 min, 8°C), se descartó la fase sólida y la fase acuosa se sometió a 6,000 rpm (3 min, 8°C), nuevamente se rescató el sobrenadante y se sometió a 14,000 rpm (3 min, 8°C), se decantó y la pastilla acumulada se re-disolvió en 50μl de agua estéril. A partir de la solución preparada y con ayuda de un asa bacteriologica se sembró en PDA y se incubo a 27°C por 24 horas. Para la identificación bacteriana se practicó una tinción GRAM, una descripción de colonias de bacterias y un kit de pruebas bioquímicas. Determinación de niveles de tolerancia Para determinar los niveles de tolerancia a los metales pesado se utiliza agar Luria adicionado con concentraciones ascendentes de arsenito de sodio o arseniato de sodio (8, 6, 4, 2, 1, 0.5, 0.1 mM). Cada una de las placas se inocula con diluciones apropiadas de cultivos bacterianos de 24 h de incubación. Como control, se inocularon placas con agar Luria, sin arsénico. Las placas se incuban a 25ºC durante 24 a 48 h y se observó la presencia de desarrollo bacteriano (Campos, 2007).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se observaron aproximadamente 12 morfologías diferentes en colonias de bacterias, incluyendo bacterias y actinomicetos, en la Tabla 1 se muestra la clave principal de cada colonia, la identificación se basó principalmente en el color para una fácil diferenciación, también se muestra las características de cada una. En las ilustraciones 3, 4 y 5 muestra por zona, la presencia bacteriana, siendo la “colonia blanca” predominante en las tres zonas, con un aprox. de 92.3% de las muestras, exceptuando la muestra A-R-1.

Tabla 1 Morfología general de las colonias bacterianas

CLAVE FORMA TEXTURA COLOR MARGEN ELEVACION SUPERFICE

AMARILLA circular butirosa amarilla ondulado convexa lisa

BLANCA circular húmeda blanca entero convexa lisa

VERDE irregular butirosa verde ondulado elevado brillante

ROJO circular seca rojo entero elevado brillante

AZUL irregular seca azul ondulado plano áspero

CURLED irregular butirosa blanco curvado elevado arrugado

GRIS irregular mucoide gris ondulado plano brillante

CORAL circular seca coral entero elevado brillante

OPACA irregular mucoide opaca ondulado plano áspero

PERLA filamentoso húmeda perla filiforme crateriforme arrugado

BLANCA 2 circular húmeda blanca ondulado convexa arrugado

ÁSPERA irregular seca áspera ondulado plano áspero

Figura 1. Sitios de colecta de rizósfera para analisis microbiológico: a) Sobre el Jale minero, Zona 1; b) A orillas del jale minero, Zona 2 y c) a 5 km del jale minero, Zona 3.

Las muestras tomadas en las zonas 1, 2, 3, se dividieron en tres porciones o grupos para realizar los análisis de: concentración de compuestos en raíz, concentración de compuestos en hoja o flor y siembra en agar. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS VEGETALES PARA DETERMINAR CONCENTRACIÓN DE COMPUESTOS EN RAIZ Y HOJAS Se cortaron en trozos pequeños y pesaron 6 gr de raíz y hoja de cada una de las muestras para su posterior lavado con diversas soluciones, y así eliminar las partículas de suelo adheridas a la superficie de las mismas. El primer lavado de muestras fue con agua corriente con la finalidad de eliminar los residuos de suelo (Figura 2a), posteriormente las muestras se colocaron en vasos de precipitado de 80ml y etiquetados (Figura 2b), posteriormente con un sonicador (Figura 2c) se realizaron lavados seriados con: agua desionizada, solución de extran al 1 %, solución 0.01 N de ácido nítrico, solución 1 mM de cloruro de calcio, solución 0.1 N de hexametafosfato de sodio, con el objetivo de eliminar las partículas de suelo adheridas a la superficie de las raíces durante 3 min cada lavado. Intercalando en cada solución un enjuagado con agua desionizada. En seguida, las muestras se secaran en una estufa a una temperatura de 50° C por una semana. Finalmente, se realizará una pulverización en un molino analítico "Wiley" (Cole-Parmer) con cuchillas de acero inoxidable, el material será recolectado en tubos de polipropileno de 15 mI. (MILLE, 2006).

Figura 2. Procesamiento de muestras vegetales: a) Sobre el Jale minero, Zona 1; b) A orillas del jale minero, Zona 2 y c) a 5 km del jale minero, Zona 3.

Las raíces y/o hojas son sometidas a una digestión ácida, con la finalidad de eliminar la materia orgánica y mineralizar los metales por medio de oxidación. Para ello se pesan 0.2 g de la muestra pulverizada en un vaso de precipitado de 100 ml; se agregaran 5 ml de concentrado y 0.5 mL de ácido perclórico, se cubre el vaso con un vidrio de reloj y se deja reposar toda la noche. Posteriormente se coloca el vaso en una placa de calentamiento a una temperatura aproximada de 80°C. Al cesar los vapores rojos, y la solución


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Ilustración 5 Incidencia de bacterias por muestra Zona 3

De las colonias bacterianas el 100% resulto ser bacilos Gram negativos. Respecto al análisis de concentraciones de metales pesados en raíz y hojas, la falta de tiempo truncó el proceso, quedando las muestras guardadas para una segunda parte del proyecto respectivamente.

CONCLUSIONES Las colonias bacterianas de color blanco se asilaron con mayor frecuencia y es probable que tenga un efecto en la tolerancia de las plantas a las altas concentraciones de los contaminantes; sin embargo, es necesario relaizar pruebas adicionales e identificar las bacterias aisladas mismas que fueron sonservadas en glicerol al 30% a -80ºC.

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Ilustración 3 Incidencia de bacterias por muestra

Ilustración 4 Incidencia de bacterias por muestra Zona 2


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la actividad minera también genera gran cantidad de impactos ambientales (FUNDAR, 2002). Los efectos provocados por las actividades mineras son diversos; entre estos están involucrados los que afectan al suelo. Una de las anomalías biogeoquímicas que se generan al momento de la extracción, es el aumento de la cantidad de elementos potencialmente tóxicos, los cuales perturban negativamente la biota y calidad del sustrato, afectando la abundancia, la diversidad y la actividad de los organismos de este, inhibiendo la descomposición de la materia orgánica (Wong, 2003). Casanova (2005) menciona que el suelo es la capa más superficial de la corteza terrestre; un sistema complejo donde ocurre una vasta gama de procesos químicos, físicos y biológicos. Su composición se basa en minerales y material orgánico como materia sólida, agua y aire en distintas proporciones, constituyendo así un componente vital para el desarrollo de los ecosistemas; razón por la cuál es de gran importancia evaluar la condición del suelo para garantizar un buen desarrollo edafológico y finalmente el del ecosistema. Una herramienta para evaluar las probables afectaciones de la actividad minera son las pruebas de toxicidad o bioensayos en organismos de prueba bajo condiciones controladas de laboratorio, otra alternativa es el uso de biomarcadores, ambas herramientas no brindan respuestas biológicas (letalidad, comportamiento, daño al ADN, inhibición enzimática, etc.) de los organismos sometidas a medios ambientales (agua, suelo, sedimento) impactados. Específicamente nuestro estudio contempla evaluar un biomarcador de efecto, éstos nos indican cambios bioquímicos que acontecen tras la exposición a xenobióticos que incluyen modificaciones en la composición celular sanguínea, alteraciones en actividades enzimáticas, genotoxicidad, incrementos localizados de ARN-m, aumento de determinadas proteínas, e incluso aparición de anticuerpos específicos (auto anticuerpos) contra un xenobiótico o frente a fracciones celulares (núcleo, membrana, etc.) (Hernández, 2007). Los bioensayos son experimentos que se realizan bajo condiciones controladas de laboratorio con el propósito de evaluar cualitativa y cuantitativamente el efecto que los agentes xenobióticos producen sobre organismos vegetales o animales cuidadosamente seleccionados. Para realizar análisis de toxicidad de suelos, generalmente se utilizan lombrices como organismos de prueba para la realización de bioensayos. Utilizamos lombrices de la especie E. andrei ya que son componentes importante del edafón, tienen un papel primordial en los ciclos biogeoquimicos, aeración y adición de nutrimentos en el suelo y viven en contacto directo con el suelo (Cuevas et al., 2012). El objetivo de este estudio fue evaluar la toxicidad del suelo de un sitio minero en lombrices de tierra (Eisenia andrei), para ello se determinó el potencial de letalidad del suelo y el daño al ADN mediante el ensayo cometa en lombrices expuestas a los suelos del sitio minero y se compararon con los sitios de referencia (negativa y positiva) y el control negativo.

METODOLOGIA Se recolectaron diez muestras de suelo en el municipio de Cananea Sonora, cercanas a una zona minera y diez en dos zonas con características bióticas y abióticas similares pero sin actividad minera aparente y alejada del sitio minero, por lo que nos sirvieron de referencia. Una tiene concentraciones bajas de metales y otra presenta enriquecimiento natural de metales, por lo que ambas estaciones de referencia evidencian las condiciones naturales en cuanto a la mineralización de esa región del país. El bioensayo de letalidad se realizó con base en lo descrito en la guía 207 de la OECD para la evaluación de sustancias (OCDE, 1984) y la publicación 96-327 del Departamento de Ecología del Estado de Washington (WSDE, 1996), así como en las experiencias obtenidas a nivel laboratorio (Cuevas et al., 2006). Se expuso a 10 lombrices de tierra (Eisenia andrei) a muestras de suelo de las tres zonas y un control negativo de laboratorio y después de 14 días de exposición se evaluó la letalidad. Además se evaluó el daño al ADN mediante el ensayo cometa, para ello se siguió la metodología propuesta por González-Mille et al., (2012). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El análisis estadístico se realizó con el software STATISTICA 10 2011. Los datos para evaluar el daño al ADN no presentaron una distribución normal, por lo que se utilizó una prueba no paramétrica (Kruskal-wallis) para comparar los sitios.

EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD DE SUELOS DE UN SITIO MINERO DE SONORA, MÉXICO

1Departamento de Ciencias del Agua y del Medio Ambiente, Instituto Tecnológico de Sonora, Cam-pus Náinari, Antonio Caso S/N y E. Kino, Colonia Villa ITSON. C.P. 85130. Ciudad Obregón, So-nora, MÉXICO, [email protected]; 2Coordinación para la Innovación y la Aplicación de la Ciencia y la Tecnología, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Sierra Leona #550, Col.

Lomas 2a. Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, SLP., MÉXICO, [email protected]

Vargas López, A. G.1; Espinosa Reyes, G.2

RESUMEN La minería ha jugado un papel central en el desarrollo de los grupos humanos. México es una nación minera en la mayor parte de su superficie, se ubica entre los primeros productores y exportadores de minerales. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial de toxicidad de suelos mineros mediante bioensayo de letalidad y el daño al ADN en lombrices de tierra (Eisenia andrei). Los resultados demuestran que los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 88% y el 100%; no existe diferencia estadísticamente significativa entre el daño al ADN registrado entre las estaciones de referencia negativa, positiva y problema. No se registró toxicidad de los suelos evaluados, ya que los porcentajes de sobrevivencia fueron elevados y no existió diferencia en el daño al ADN en lombrices expuestas a los suelos de los sitios de estudio.

ABSTRACT Mining has played a central role in the development of human groups. Mexico is a nation for mining in the greater part of its surface, is located between the first producers and exporters of minerals. The objective of this work was to evaluate the potential of soil toxicity bioassay miners through case-fatality and the damage to DNA in earthworms (Eisenia andrei). The results show that the percentages of survival ranged between 88% and 100%; there is no statistically significant difference between the damage to DNA registered between the reference stations negative, positive and problem. Was not recorded toxicity of soils evaluated as the percentages of survival were high and there was no difference in the damage to DNA in worms exposed to the soils of the study sites. Palabras clave: ensayo cometa, letalidad, metales pesados.

INTRODUCCIÓN

El ambiente es el conjunto de componentes físicos, químicos, biológicos que interactúan entre sí e influyen en el desarrollo de los seres vivos en general (Estocolmo, 1978); sin embargo, en la actualidad existe una problemática ambiental que involucra a todo el planeta y surge como consecuencia de múltiples factores que interactúan entre sí, como el incremento del uso de combustibles fósiles a partir de la revolución industrial, abuso de la extracción de minerales, incremento en el uso de sustancias químicas para el control de plagas, el modelo de vida actual que supone un gasto de recursos naturales y energéticos creciente e insostenible trayendo como consecuencia su deterioro (Bacete, 2005). Específicamente la minería ha jugado un papel central en el desarrollo de los grupos humanos. México es una nación minera en la mayor parte de su superficie, se ubica entre los primeros productores y exportadores de minerales como el oro, plata, plomo, cobre, zinc y fierro (INEGI, 2012); sin embargo


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De acuerdo con los resultados se puede inferir que los suelos del sitio problema y referencia positiva presentan condiciones que favorecen el daño al ADN en la lombriz E. andrei, sin embargo no existe diferencia estadísticamente significativa con la referencia negativa. Comparando los resultados de un estudio realizado por Zheng et al., (2013) en suelos contaminados por metales pesados en China, se puede observar una similitud en el comportamiento entre los suelos referencia, con resultados de 12% de TDNA en China y un 10% en el presente estudio. Lo anterior podría deberse a que las concentraciones de metales en el estudio de Zheng et al., (2013) son altas en comparación con las de nuestro sitio de estudio.

CONCLUSIONES

Los resultados con el bioensayo de letalidad sugieren que las muestras de suelo no presentan toxicidad para organismos invertebrados del ecosistema terrestre. En la prueba de genotoxicidad evaluada (ensayo cometa) se registró el mayor daño en la referencia positiva, seguida del sitio problema y de la referencia negativa, sin embargo no existe diferencia estadística entre éstos tres sitios, por lo que podemos afirmar que el daño al ADN en celomocitos de lombriz no es diferenciado y que probablemente es debido a las concentraciones naturales de la región (ej. referencia positiva), por lo que difícilmente se puede extrapolar éste resultado a un ecosistema y las especies que lo componen.

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RESULTADOS

En el bioensayo de letalidad se obtuvieron porcentajes de sobrevivencia similares al control negativo. En la Figura 1 se muestran los valores de sobrevivencia para cada tratamiento evaluado, en el control negativo (100%), referencia negativa (97%), problema (98%) y referencia positiva (88%).

Figura 1. Porcentaje de letalidad de lombrices expuestas a diferentes sitios.

En la Figura 2 se presentan los resultados de genotoxicidad en lombrices de tierra. En los resultados de Olive Time Moment (OTM) y Tail DNA (%DNA) se registró el mismo patrón, no se encontró diferencia significativa entre el control y la referencia negativa (p˃0.05); sin embargo tanto el sitio problema como la referencia positiva mostraron diferencias estadísticamente significativa con respecto al sitio control (p<0.05). Por otro lado los resultados de Tail Length (TL), no se encontró diferencia significativa entre el control y las referencias (p˃0.05) resultando únicamente una diferencia significativa el sitio problema con respecto al sitio control (p<0.05).

Figura 2. Comparación de OTM, TL y TDNA en lombrices E. andrei en diferentes sitios utilizando la prueba de kruskal-wallis p<0.5

DISCUSIÓN

De acuerdo con los resultados del bioensayo de letalidad no existe toxicidad en ninguno de los sitios; comparando los resultados de un estudio realizado por Audronë Matusevièiûtë y colaboradores en 2005 en suelos contaminados con metales pesados en Lituania, se pudo observar una similitud en la sobrevivencia del 90% de los organismos durante 14 días con los suelos de este estudio; sin embargo en el estudio en Lituania después de la tercera semana la supervivencia disminuyó. Estos resultados no concuerdan con el ensayo de genotoxicidad; lo cual puede deberse a que el suelo muestra para el ensayo de letalidad es reciente y el de genotoxicidad es más antiguo.

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Muchos autores se han interesado en sintetizar nanotubos de carbono, y es bien sabido que el medio más común es por la técnica de deposición química de vapor (CVD), además de ser el método predilecto para la tarea de producir nanotubos en gran escala. Hay distintas variaciones del método CVD, sin embargo, todas éstas son similares en el uso de un catalizador y una fuente de carbono para producir distintas estructuras nanométricas de carbono. Estos tipos de procesos son llevados a cabo en tubos de cuarzo que son introducidos en hornos tubulares, lo que conlleva al flujo de precursores a través del cuarzo a altas temperaturas, que resulta en la descomposición de los reactantes (pirolisis) y la formación autoensamblada de estructuras carbonosas. Los nanotubos de carbono dopados con nitrógeno (NCNTs) son un tipo de nanoestructuras a las que se les presta un especial interés en esta investigación debido a su gran conductividad y su posible aplicación en áreas donde se requiera la acción de efecto de campo o la capacidad catalítica de éstas. En lo que se refiere a los átomos que pueden fungir como sustituciones en la red del carbón, el nitrógeno tiene varias ventajas, debido a su excelente rendimiento electrolítico, bajo costo, excelente estabilidad, y el ser respetuoso con el medio ambiente.

MARCO TEORICO

Nanotubos de carbono dopados con nitrógeno (NCNTs); La inserción de nitrógeno cambia la estructura del nanotubo de carbono (CNT) y, por lo tanto, afecta las propiedades físicas y químicas de éstos. Átomos de nitrógeno pueden ser añadidos a la matriz de carbón por medio de diferentes maneras resultando en diferentes configuraciones de enlaces. Las configuraciones que puede tomar el nitrógeno en la red de carbono son tres diferentes, diferencias que recaen en la aportación de electrones pi y en la estructura de los anillos de los cuales forma parte, son: (i) tipo piridínico: el cual aporta 2 electrones pi a la matriz de carbono y el átomo N está enlazado con dos carbonos vecino, esto resulta en la localización de dos electrones libres en las proximidades del átomo N (ii) tipo pirrólico: el átomo N aporta dos electrones p al orbital pi de la matriz. (iii) tipo cuaternario: el átomo N reemplaza a un átomo nativo de la red. Sin importar como sea introducido cuando el nitrógeno de mayor valencia en comparación con la red es introducido, más electrones pi pueden ser obtenidos. Es decir, le confiere una mejor conducción tipo n a la matriz carbonosa. Síntesis de nanotubos a partir de compuestos organometálicos: La síntesis de interés en el procedimiento experimental se denomina in situ y consiste en la inserción de átomos N en la matriz de carbón desde el proceso de síntesis. Para lograr alcanzar un método de síntesis menos complejo se han usado complejos organometálicos como precursores de nanopartículas metálicas, además nos da la oportunidad de controlar el tamaño de ésta por medio de variaciones de condiciones de temperatura y presión. El control de tamaño de tal nanopartícula teóricamente permitiría la homogenización de la geometría de los CNTs. El uso de precursores organometálicos que pueden solubilizar en demás precursores de forma sencilla es conveniente en un proceso de producción por lotes. Por último, se ha demostrado que el complejo ferroceno funge como precursor tanto para la partícula metálica como para la formación del nanotubo por lo que presenta una ventaja sustancial a tomar en cuenta.

METODOLOGIA (i) Síntesis de nanotubos Primero, se prepara la solución de precursores, añadiendo 300ml de Isopropanol, 300ml de bencilamina y 13.58gr de ferroceno sólido (2.5%wt.), éste soluto es solubilizado con ayuda de un sonicador de baño. Después, la misma solución es sometida a frecuencias ultrasónicas en un nebulizador piezoeléctrico para la formación de aerosol que es carreado en un flujo de gas de 2.5l/min (Ar/H2, 95%) que dirige el precursor a la zona de pirólisis constituida por dos hornos tubulares alineados que se mantienen a 850°C por un periodo de 30min. Después de este tiempo la generación del aerosol y el flujo de gas es suspendido, y los hornos son enfriados gradualmente hasta alcanzar la temperatura ambiente. Una vez alcanzada una

FABRICACIÓN DE NANOESTRUCTURAS DE CARBONO DOPADAS CON NITRÓGENO: NANOTUBOS

1Facultad de Ingeniería Campus Aeropuerto, Universidad Autónoma de Querétaro, Carr. a Chichime-quillas S/N Terrenos Ejidales Bolaños, C.P. 76140, Querétaro, Qro. MÉXICO; [email protected]; 2Advanced Materials Department, IPICYT, Camino a la Presa San José 2055, Col.

Lomas 4a Sección, San Luis Potosı´ 78216, MÉXICO; [email protected]

Guillermo Vázquez Tovar, G.1; Emilio Muñoz Sandoval, E.2

RESUMEN Los nanotubos de carbono dopados con nitrógeno (NCNTs) se han vuelto un tema de alta importancia en el estudio de los materiales de carbono. Esto es debido al cambio sustancial de propiedades físicas y químicas que tienen con respecto a los nanotubos de carbono puro (CNT). En este trabajo se estudia el método convencional para la síntesis NCNTs usando precursores tales como isopropanol, bencilamina y ferroceno. Se sintetizaron NCNTs de varias capas con un diámetro externo promedio de 100nm. Este producto fue sometido a dos pruebas de caracterización; Scanning Electron Microscopy (SEM) para reportar la geometría y la morfología de la muestra y Thermogravimetric Analysis (TGA) que fue usado para obtener la temperatura de oxidación.

ABSTRACT

Nitrogen doped carbon nanotubes (NCNTs) have become a topic of high importance in the study of carbon nanomaterials. This is because of the considerable change of physical and chemical properties in comparison to pure carbon nanotubes (CNT). In this approach we study the NCNTs conventional synthesis method using precursors such as isopropyl alcohol, benzylamine and ferrocene. We have synthesized multi-walled NCNTs with an outer diameter of 100nm. This product had been characterized by two methods; Scanning Electron Microscopy (SEM) which has been used to report the geometry and morphology, and Thermogravimetric Analysis results have been analyzed to obtain the oxidation temperature. Palabras Clave: nanotubos de carbono (CNT), complejo organometálico, deposición química de vapor (CVD)

INTRODUCCION

La amplia gama de posibles aplicaciones de materiales de propiedades tan únicas y sorprendentes como las de un nanotubo de carbono han impulsado el enfoque de la investigación nanotecnológica hacia la estandarización de procesos de producción de nanotubos que destaquen por su simplicidad y por su accesibilidad. La síntesis llevada a cabo con precursores de alta pureza y en forma de aerosol provee grandes ventajas en el gasto neto de un proceso de síntesis. Sin embargo, el desafío constante en la producción de nanotubos de calidad industrial sigue siendo la capacidad de lograr nanotubos de dimensiones consistentes.


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RESULTADOS Y DISCUSION En la figura 3, se observa la curva que representa la variación de producto obtenido a lo largo del tubo. Se registró un máximo en el centímetro 35 con un peso de 79.37mg. Además, a lo largo del tubo, se obtuvo un total de 466.74mg. También se anotó un gasto volumétrico de 32ml en la solución precursora restante. La curva presenta un comportamiento típico que se ha observado en trabajos anteriores y simultáneos a éste, es decir, la curva marca un máximo aparente en los centímetros localizados al centro del primer horno tubular. Sin embargo, no hay un segundo máximo como suele ocurrir en estas clases de síntesis, esto puede deberse a la condición del tubo, pues a pesar de que después de usarse fue tratado térmicamente aún contenía algunas imperfecciones en su interior. En la figura 4, se muestran las imágenes obtenidas por microscopía SEM, en ellas es clara la presencia de formas tubulares rectilíneas en el orden nanométrico y micrométrico. También se aprecian algunas estructuras planas y no rectas que a primera vista parecieran nanolistones de carbono o estructuras grafíticas que no tienen una estructura ordenada, sin embargo, son necesarias más caracterizaciones para asegurar esto último. Realizando un mejor análisis a las imágenes encontramos ciertas extremidades de nanotubos en las cuales es posible reconocer estructuras tubulares o cónicas que sobresalen de la boquilla del tubo externo, esto nos lleva a concluir, que lo más acertado es atribuir estos fenómenos a la predominancia del crecimiento en multi-capa al de una sola capa. Es decir, reconocemos de manera analítica que los nanotubos sintetizados son mayormente (sino es que todos) nanotubos de múltiple capa. Por último, es importante mencionar que no se realizó ninguna caracterización que nos permitiera conocer estrictamente la composición de los nanotubos. Sin embargo, basándonos en los resultados arrojados por el análisis termgravimétrico (Figura 5) podemos asociar tal cambio en la temperatura de oxidación en comparación a CNTs puros a la presencia de nitrógenos en la red carbonosa que aportan centros susceptibles a la oxidación. De este modo, en comparación con los rangos de temperaturas de oxidación de algunos nanotubos de carbono de naturaleza pura (<600°C), la variación de respecto al sintetizado en este trabajo puede ser atribuido a la presencia de nitrógeno en la red. Sin embargo, esto no es concluyente debido a que las propiedades químicas dependen también de la estructura del nanotubo y no solo de su composición.

Centímetro en el tubo

Figura 3 . Curva correspondiente a la cantidad de muestra obtenida en un centímetro específico del tubo.

temperatura a la cual la manipulación sea sencilla, se retira el tubo de cuarzo de los hornos y es limpiado mediante la sonicación del residuo (parte del tubo en la que no se alcanza la temperatura crítica de síntesis; <90cm). Al finalizar, el producto de interés es extraído del tubo y es etiquetado según su localización en éste.

Figura 1. Sistema CVD usado para la síntesis de izquierda a derecha a)trampa aceptora de residuos orgánicos que no sufrieron reacción b) hornos tubulares c)sprayer utilizado para la evaporación de

los precursores.

Figura 2. Secciones transversales y centímetros que abarcan en el tubo en el que se realiza la síntesis.

(ii) Extracción y caracterización de las muestras Se procedió a realizar la extracción de muestras, ésto mediante el raspado del tubo en el cual se llevó a cabo la síntesis. Se raspó en intervalos de un centímetro, de 10 a 90 cm en términos de distancia a la boquilla, de manera que se analizó la obtención de un panorama general de nanotubos sintetizados a lo largo del tubo de cuarzo, y por lo mismo, en un rango variado de temperaturas. Donde las temperaturas mayores, se presenta en las regiones centrales de cada horno (Figura 2). Debido a la poca concentración de los primeros y últimos centímetros, la extracción en esta zona se realizó en intervalos más grandes. Enseguida, se realiza la preparación de muestras para las técnicas de caracterización que correspondan, se preparan soluciones del producto obtenido usando etanol como solvente, que después se filtra y se deja secar. Con el producto secado se procede a realizar soluciones de poca concentración, de ésta se añaden cantidades sustanciales de muestra a distintos pines correspondientes a cuatro muestras de importancia que fueron sometidas a microscopía electrónica de barrido. También se sometieron 5mg de producto provenientes del centímetro 33 a un proceso termogravimétrico en un TGA.


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CONCLUSIONES Como las caracterizaciones han demostrado, se obtuvieron nanotubos de carbono en el centímetro 33 de la muestra, Los cuales presentan un promedio de 106 nm de diámetro, tienen una temperatura de oxidación de 555°C. Se atribuye el cambio drástico con respecto a CNTs puros a la presencia de nitrógeno en la matriz de carbono. Debido a la morfología observada en las imágenes SEM podemos inferior que los NCNTs obtenidos son de múltiple capa y no de una sola. Sin embargo, son necesarias más caracterizaciones para concluir con mayor seguridad. A pesar de la presencia de nanotubos, se reconoce que no existe una buena homogenización de nanotubos, por lo tanto, es necesario trabajar con más detalle las condiciones necesarias para la estandarización de un proceso de buen rendimiento de NCNTs.

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AGRADECIMIENTOS Gracias al Dr. Emilio Muñoz Sandoval por la oportunidad que me brindo, el tiempo dedicado y experiencia compartida. También agradezco al equipo de trabajo del laboratorio de Polímeros del IPICYT por brindar un ambiente respetuoso y cómodo para trabajar. Le agradezco al Comité Organizador del 18° Verano de la Ciencia y la Universidad Autónoma de Querétaro por el interés en la formación científica. La realización de esta estancia no se habría podido llevar a cabo sin el proyecto Clave CB-2013-220744-CONACYT del Dr. Emilio Muñoz Sandoval y 3971 Bilateral 246023-CONACYT del Dr. Florentino López Urías. Además, agradezco a las instituciones que nos brindaron el apoyo y las facilidades en este Verano de la Ciencia; IPICYT, División de Materiales Avanzados, LINAN, Verano de la Ciencia de la Academia Mexicana de Ciencias y CONACYT.

Figura 4. Microscopía SEM de la muestra obtenida en el centímetro 33 a) b)

Figura 5. a) Resultados TGA % en peso vs temperatura. Se aprecia una súbita pérdida de masa alrededor de los 550°C. b) Primera derivada de la curva anterior, en la cual se observa el punto de mayor cambio en la pendiente, el cual representa la temperatura de oxidación 555°C.


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La localidad de Villa de la Paz en particular, se ha visto afectada por la gran cantidad de jales que se dispersan debido a las corrientes de aire y a las precipitaciones. Los jales que se encuentran sin control alguno, contienen metales pesados en altas concentraciones. Diversos estudios se han realizado en Villa de la Paz, arrojando resultados que indican que tanto humanos como especies de fauna tienen en su organismo concentraciones de arsénico y plomo (Monroy et al. 2002). También, debido a la presencia de metales en este sitio se han observado efectos en el suelo: se ha acidificado, ha aumentado la conductividad eléctrica y disminuido el porcentaje de materia orgánica (Ilizaliturri et al. 2016). Se ha determinado que los jales del distrito minero Santa María de la Paz tienen concentraciones de As, Pb, Cd, Cu y Zn principalmente y por la manera en la que estos se dispersan hacia los alrededores, existe un gradiente de concentración de los contaminantes; la mayor concentración de estos se encuentra en las zonas cercanas a los jales y disminuye en zonas más alejadas a estos (Razo 2006). La materia orgánica (MO) es un indicador de la calidad del suelo, ya que incide directamente sobre propiedades edáficas, como estructura y disponibilidad de carbono y nitrógeno (Gregorich et al., 1984). Numerosos estudios coinciden en que la MO, es el principal indicador e indudablemente el que posee una influencia más significativa sobre la calidad del suelo y su productividad (Quiroga y Funaro, 2004). El objetivo de este trabajo fue evaluar de manera general la calidad del suelo en Villa de la Paz en un gradiente de contaminación tomando en cuenta los parámetros de pH, conductividad eléctrica y cantidad de materia orgánica, los cuales son indicadores básicos de la actividad química y biológica del suelo.

METODOLOGÍA Muestreo de suelo Materiales:

Tamiz 200 mm Tubos cónicos 15 mL Palas Martillo de geólogo Nucleador Cinta métrica

Método: Se tomaron muestras de 11 puntos distintos con el fin de tener un gradiente de concentración de contaminantes. El punto inicial del muestreo fue directamente en los jales y los demás puntos se localizaron a las siguientes distancias a partir de los jales: 1 m, 5 m, 10 m, 25 m, 50 m, 100 m, 250 m, 500 m, 1000 m y 3000 m, estos puntos se denominaron A, B, C, D, E, F, G, H, I, J Y K respectivamente. Por cada punto de muestreo se tomaron 4 muestras, localizadas en la misma sección transversal. Para tomar la muestra se introdujo el nucleador con la ayuda del martillo a una profundidad de 15 cm, posteriormente se sacó con la muestra de suelo la cual fue tamizada para remover piedras y raíces, se colocó en un tubo cónico y se etiquetó para su identificación. Los tubos cerrados se cubrieron con parafilm y se guardaron en el refrigerador a 4°C.

CONTENIDO DE MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO EN UN GRADIENTE DE CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS EN VILLA DE LA PAZ, MATEHUALA

1Facultad de Ciencias Químicas, Universidad La Salle México. Benjamín Franklin 47, Cuauhtémoc, Condesa, C. P. 06140 Ciudad de México, D.F., [email protected]; 2Instituto Tecnológico Superior de Comalcalco, Carretera Vecinal Comalcalco - Paraíso Km. 2, Ra. Occidente 3ra. Sección, C.P. 86651, Comalcalco, Tabasco; México, [email protected]; 3Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Dr. Manuel Nava 8, Zona Universitaria Poniente, C. P. 78290, San Luis Potosí, SLP. México, [email protected]; 4CIACYT-Facultad de Medicina, Uni-versidad Autónoma de San Luis Potosí; Sierra Leona #550, Lomas 2da Sección, C.P. 78210, San Luis

Potosí, SLP. México, [email protected]

Virgen Urcelay, A.1;De la Cruz Chable, K. M.2; Lugo Pérez, A.3; Ilizaliturri Hernández, C. A.4

RESUMEN Los suelos de Villa de la Paz en el estado de San Luis Potosí han sido contaminados desde hace años debido a la presencia de jales mineros que contienen As, Pb, Cd, Cu y Zn principalmente, estos contaminantes se dispersan por la escorrentía y las corrientes de aire. Se ha estudiado que existe un gradiente de concentración de los contaminantes que parte de los jales. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad del suelo en dicho gradiente tomando muestras a varias distancias para su posterior análisis de pH, conductividad eléctrica y cantidad de materia orgánica. Los resultados mostraron que los contaminantes afectan la calidad del suelo y que la distancia está correlacionada con los parámetros evaluados, indicando que existe un gradiente de efectos en el suelo.

ABSTRACT The soils of Villa de la Paz in the state of San Luis Potosi have been contaminated for years due to the presence of mine tailings containing mainly As, Pb, Cd, Cu and Zn, these pollutants are dispersed by runoff and drafts. It has been studied that there is a concentration gradient of the pollutants from the tailings. The aim of this study was to evaluate the soil quality in that gradient by taking samples at various distances for subsequent analysis of pH, electrical conductivity and amount of organic matter. The results showed that pollutants affect soil quality and that distance is correlated with the parameters evaluated, indicating that there is a gradient effect on the soil.

INTRODUCCIÓN El estado de San Luis Potosí sobresale por su gran actividad minera a lo largo de su historia, lo cual ha impulsado su desarrollo económico, sin embargo dicha actividad ha provocado que se emitan contaminantes hacia el ambiente desde hace décadas, incluso los sitios que actualmente ya no se explotan continúan siendo un foco de emisión debido a los pasivos ambientales que se encuentran en las antiguas minas (Ilizaliturri 2016). La contaminación por metales representa una amenaza tanto para la salud de los seres humanos como para los ecosistemas expuestos a las emisiones, ya que afecta los procesos que se llevan a cabo en el suelo como el crecimiento de plantas y la actividad enzimática (Monroy et al. 2002).


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Se prepararon las soluciones de dicromato de sodio y de sacarosa a las concentraciones deseadas, para la curva de calibración se preparó la serie de estándares tomando 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL de la solución madre de sacarosa y se aforaron a 10 mL con agua desionizada (cada uno se realizó por triplicado). Para las muestras se pesaron 0.5 g de suelo seco y se transfirieron 0.5 mL de cada estándar de sacarosa a matraces Erlenmeyer de 150 mL. Se añadieron 5 mL de solución de dicromato de sodio y 10 mL de ácido sulfúrico agitando constantemente. Los matraces se dejaron reposando en una campana por 30 minutos, posteriormente se agregaron 35 mL de agua desionizada con agitación y se dejaron reposando por 24 horas. La absorbancia del sobrenadante claro fue medida utilizando un espectrofotómetro (Lector Multi-Modal Sinergy H1) a 600 nm. Se graficó la curva de calibración con las absorbancias y los mg de carbono de la serie de estándares de sacarosa. El porcentaje de carbono orgánico se calculó mediante:

% 𝐶 = (𝑎��)∗ 1.2� ∗ 100 (2)

Dónde: a= mg de C en la muestra b= mg de C en el blanco s= masa en mg de la muestra de suelo El porcentaje de materia orgánica se obtuvo mediante:

% 𝑀𝑂 = % 𝐶 ∗ 1.72 (3) Dónde: 1.72= factor estimado de conversión

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los valores de pH variaron en un rango de 6.33 a 8.23, el valor mínimo se encontró en el primer sitio (a 0 m de distancia) y el valor máximo en el sitio más alejado (a 3000 m de distancia). De acuerdo con la NOM-021-SEMARNAT-2000 (DOF 2002) el suelo del sitio A se clasifica como moderadamente ácido y el del sitio K como medianamente alcalino. Los valores de pH mostraron una correlación positiva con la distancia (r= 0.7196, p<0.001) y la materia orgánica (r=0.6571, p<0.001) y negativa con la conductividad eléctrica (r=-0.8509, p<0.001) (Tabla 1). Los valores de conductividad eléctrica varían en un rango de 1418 µS/m a 42.3 µS/m, que corresponden a los sitios B y K respectivamente. La conductividad tiene una correlación negativa con la distancia (r=-0.5531, p<0.001), con el pH y con la materia orgánica (r=-0.4885, p=0.001) (Tabla 1). La concentración de materia orgánica varió de un 1.5% a un 12.96%, dichos valores corresponden a los sitios F y K respectivamente. La concentración de materia orgánica tiene una correlación positiva con la distancia (r=0.7704, p<0.001) y con el pH y negativa con la conductividad eléctrica. De acuerdo con la NOM-021-SEMARNAT-2000 (DOF 2002) el suelo del sitio F (con menor porcentaje de materia orgánica) se clasifica como bajo y el sitio K como muy alto.

Determinación del porcentaje de humedad de las muestras Materiales:

Balanza analítica Charolas de pesado Estufa

Método: De cada una de las muestras se pesaron 2 g y se secaron en la estufa a 80°C durante 24 horas. Posteriormente, para el cálculo de humedad se pesaron nuevamente, se restó el peso de la charola y se obtuvo el porcentaje de humedad mediante la fórmula:

%ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = �𝑒�� 𝑎��𝑒�� 𝑎��𝑒�� 𝑎� ∗ 100 (1)

Determinación de pH y conductividad eléctrica Materiales:

Balanza analítica Potenciómetro Agua desionizada Tubos cónicos 15 mL Soluciones buffer de pH 4, 7 y 10

Método: Se pesó 1 g de suelo seco de cada muestra y se colocaron en tubos cónicos, se añadieron 10 ml de agua desionizada, se agitaron y se dejaron reposar 10 minutos. Las mediciones se realizaron en un potenciómetro (Hanna HI 2216). Para calibrarlo se utilizaron las soluciones buffer de pH 4, 7 y 10. Posteriormente se midió la conductividad eléctrica expresada en µS/m (microsiemens por metro) con el otro electrodo. Determinación de materia orgánica Materiales:

Solución de dicromato de sodio 0.5 mol/L Ácido sulfúrico Solución de sacarosa 100 mg/mL de C Agua desionizada Serie de estándares de sacarosa Espectrofotómetro Balanza analítica Matraces aforados Matraces Erlenmeyer Vasos de precipitado Pipetas

Método: El porcentaje de materia orgánica se obtuvo mediante el método de digestión húmeda (Combs et al. 2010; Metson et al. 1971).


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Se muestra que la conductividad eléctrica disminuye con la distancia, esto se relaciona con la presencia de metales en el suelo, sin embargo, de acuerdo al Consejo Canadiense de Ministros del Medio Ambiente (CCEM) no sobrepasa el límite de los 2 dS/m. Una mayor conductividad eléctrica se relaciona con mayor salinidad, lo cual conduce a pérdida de fertilidad y también puede incrementar la movilidad de los metales pesados (Sherene 2010). La materia orgánica comprende diversas sustancias que tienen un papel importante en la fertilidad, conservación y presencia de vida en los suelos. También es muy importante en los enlaces metálicos, la formación de complejos por ligandos orgánicos, el control de la solubilidad y movilidad de los metales (Ilizaliturri et al. 2016). Altas concentraciones de metales pesados en el suelo pueden cambiar la tasa de mineralización de la materia orgánica y afectar su acumulación y distribución (Zhang y Wang 2007), esto explica la alta correlación positiva con la distancia ya que en los sitios más alejados existe una presencia menor o nula de los contaminantes provenientes de los jales.

CONCLUSIONES Gracias a los datos obtenidos, se puede afirmar que los residuos mineros de Villa de la Paz tienen un grave impacto en la calidad del suelo ya que los que tienen mayor concentración de contaminantes presentaron acidez, alta conductividad eléctrica y poco porcentaje de materia orgánica. Además, los resultados arrojados en este estudio demuestran que al haber un gradiente de contaminantes, también hay un gradiente de efectos en el suelo; el mayor impacto tiene lugar en los suelos más cercanos a los jales mientras que a mientras aumente la distancia, los efectos se vuelven menores. Con las pruebas estadísticas realizadas, se observa que la distancia en la cual el suelo deja de tener efectos tan drásticos es a partir de los 250 metros. Al tener esta información, pueden realizarse más pruebas en el gradiente con otros indicadores como la actividad de determinadas enzimas para saber si también tiene correlación con los parámetros aquí estudiados y así conocer cuáles ciclos biogeoquímicos y en qué medida son afectados. A pesar de que se han realizados diversos estudios sobre la contaminación en este lugar, es necesario continuar colaborando con información valiosa para poder manejar los residuos de manera óptima y comenzar un plan para remediar los ecosistemas contaminados.

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Tabla 1. Correlaciones entre los parámetros evaluados.

Variable Distancia (m) PH Conductividad eléctrica (S/m) Materia orgánica Distancia (m) 1

p= ------ 0.7196 p= .000

-0.5531 p=.000

0.7704 p=.000

PH 0.7196 p=.000

1 p= ------

-0.8509 p=.000

0.6571 p=.000

Conductividad eléctrica -0.5531 p=.000

-0.8509 p=.000

1 p= ------

-0.4885 p=.001

Materia orgánica 0.7704 p=.000

0.6571 p=.000

-0.4885 p=.001

1 p= ------

*Significativo al 5% La siguiente gráfica muestra la relación entre la distancia y el porcentaje de materia orgánica, los puntos corresponden a las medias de cada sitio y las barras al error estándar. Se observa que el porcentaje de materia orgánica cambia a partir del sitio H (250 metros).

Figura 1. Gráfica del porcentaje de materia orgánica en los diferentes sitios de muestreo.

Los metales en el suelo en altas concentraciones pueden alterar el pH acidificándolo (Effron et al. 2004), a pesar de que en este estudio no se evaluaron concentraciones de metales, se sabe que tienen una alta correlación con los valores de pH (Ilizaliturri et al. 2016). Esto puede explicar por qué los suelos de los sitios más alejados son más alcalinos que los que se encuentran cerca de los jales. El suelo en regiones áridas como Villa de la Paz es alcalino debido a la acumulación de carbonato de sodio y la producción de NaOH.


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DESARROLLO DE MATERIALES FUNCIONALES DE CARBONO PARA ALMACENAMIENTO DE ENERGÍAS LIMPIAS: SÍNTESIS DE FULLERITAS

Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí Av. Manuel Nava 6, Zona Universi-taria, 78290 San Luis Potosí, S.L.P, MÉXICO, [email protected]; ayrtonbiofisica93@gmail.

com; [email protected]

Zapata Isidro, D.; Sierra Castillo A.; Quintana Ruiz, M.

RESUMEN El calentamiento global, provocado por la gran contaminación que generan los combustibles fósiles se ha convertido en una amenaza inminente para nuestro mundo y todos los que lo habitan, muchas personas se han preocupado por esto, y por eso han optado por utilizar energías alternas o “limpias”, tales como energía hidráulica, eólica o solar, para reducir el uso de los combustibles fósiles. Un ejemplo de estos dispositivos son los supercapacitores de carbono, ya que son capaces de almacenar una gran cantidad de energía debido a su alta área superficial y a su superconductividad. El material del que se hablará son las fulleritas, las cuales son cristales de Fullereno (C60) que presentan un arreglo cristalino cubico centrado en las caras (fcc), dichas fulleritas pueden ser puras o dopadas con metales alcalinos. La evidencia que se tiene hasta ahora es que las fulleritas al momento de ser dopadas, pueden adquirir la característica de ser semiconductoras e inclusive superconductoras. Por lo tanto, se propone la fabricación de un supercapacitor a base de fulleritas dopadas debido a los amplios beneficios que presentan estos materiales.

ABSTRACT The global warming, induced by the great pollution generated for the fossil fuels has become in an imminent menace for our world and all that live in; many people have worried for this, and so they have chosen use alternative/clean energies such as the hydraulic, wind or solar, to reduce the use of the fossil fuels. An example of these devices are the carbon supercapacitors, because they are able to keep a good deal of energy due to the great surface area and the superconductivity that they possess. The material that we will speak are the fullerides, which are fullerene crystals (C60) they present an arrangement face-centered cubic (fcc), such fullerides can be pure or doped, they can obtain the characteristic of be semiconductor and even superconductor. Thus, it has proposed the fabrication of a supercapacitor based by doped fullerides employing the technique of utrasonication.

INTRODUCCIÓN En una época en la que todas las personas nos debemos preocupar por cuidar del medio ambiente y evitar el uso de los combustibles fósiles surge la posibilidad de implementar materiales y tecnologías de costes bajos y amigables con el medio ambiente. Los alótropos de carbono caben muy bien dentro de estas características ya que tienen una gran área superficial, que puede aumentarse más funcionalizando su superficie, gran capacidad eléctrica o aislante

Monroy M., Díaz-Barriga F., Razo I., Carrizales L. (2002) Evaluación de la contaminación por arsénico y metales pesados (Pb, Cu, Zn) y análisis de riesgo en salud en Villa de la Paz-Matehuala, S.L.P. San Luis Potosí: Instituto de Metalurgia U.A.S.L.P. Quiroga A, y D. Funaro. 2004. Materia orgánica. Factores que condicionan su utilización como indicador de calidad en Molisoles, de las Regiones Semiárida y Subhúmeda Pampeana. XIX Congreso Argentino de la Ciencia del Suelo. Actas Pp: 476. Razo I. (2006) Identificación de áreas prioritarias de restauración de suelos contaminados por arsénico y metales pesados en el sitio minero y metalúrgico de Villa de la Paz-Matehuala, S.L.P. (México). San Luis Potosí: Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Sherene T (2010) Mobility and transport of heavy metals in polluted soil environment. BFAIJ 2(2):112-121 Zhang MK, Wang LP (2007) Impact of heavy metals pollution on soil organic matter accumulation. Ying 561 Yong Sheng Tai Xue Bao:1479-1483


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Figura 2. Representación esquemática de la síntesis de fulleritas a base de grafeno y Fullereno C60 haciendo uso de un sistema ultrasónico.

SÍNTESIS DE FULLERITAS DOPADAS. Cómo en la síntesis anterior, primero comenzamos con 11mg de grafito en 30ml de DMF por dos horas en ciclos 30 segundos on y 30 segundos off, después se agregan 40 mg de Fullereno acompañado de una sal alcalina que tenga metales como el Sodio (Na), Rubidio (Rb), Cesio (Cs), Potasio (K), Hierro (Fe), etc.

Figura 3. Representación esquemática de la síntesis de fulleritas dopadas a base de grafeno, Fullereno C60 y sales alcalinas haciendo uso de un sistema ultrasónico.

Tabla 1. Cantidad de agente dopante para la síntesis de fulleritas dopadas Una vez realizadas las síntesis de las fulleritas se realizó la recuperación de los materiales de forma individual, dicho método consistía en que por medio de una membrana de teflón de 0.2 micras de tamaño de poro y un sistema de filtrado al vacío se retiraba el disolvente para quedar únicamente con el material de interés. Una vez retirado el disolvente el material que quedaba en la membrana era recuperado y se ponía en un sistema de alto vacío para eliminar cualquiera rastro que quedara del disolvente.


Algunas de las técnicas que se han llevado a cabo para la caracterización del material obtenido fueron:

Espectroscopia Ultravioleta-Visible (UV-Vis). Espectroscopia de Raman. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).

La Figura 4a muestra el espectro de Raman del grafito utilizado en el experimento, el espectro del grafito posee dos características, la banda vibracional G (1582 cm-1) y la banda 2D (2723 cm-1), la literatura nos indica que la banda 2D es sensible respecto al número de hojas de grafeno presentes (Ferrari, 2006). En el caso del espectro de Raman que obtuvimos al ultrasonicar (Figura 4b) el grafito nos podemos dar cuenta que no es posible identificar grafenos de una sola capa los cuales tienen una banda intensa y simétrica, sin embargo por la posición y la definición de la banda 2D en aproximadamente 2700 cm-1 y la intensidad relativa de las bandas G y 2D se puede asegurar que la mayor parte de los agregados obtenidos se tratan de hojas de grafeno con pocas capas tal como se observa en la figura (M. Quintana, 2012).

según se desee, además de tener un costo aceptable en el mercado. Debido a la diversidad de materiales de carbono existentes, entender cuáles son las propiedades aprovechables de estos materiales en la construcción de supercapacitores y otras tecnologías en las que se puedan aplicar estas estructuras, es de suma importancia. En esta dirección, el grafeno es un material sobresaliente debido a las extraordinarias propiedades físicas y químicas que presenta (Novoselov, y otros, 2005). Por otra parte gracias a los estudios de la ultrasonicación para la síntesis de nanotubos de múltiples capas a partir del grafito en un solvente orgánico (Palstra, 2008), cómo lo pueden ser la N, N-Dimetilformamida (DMF), Polifloruro de Vinildeno (PVDF), N, N-Dimetilacetnida (DMA), etc. Nos aventuramos a usar la misma técnica para la producción de fulleritas simples, dopadas y con grafeno, todo esto con el fin de tener una matriz porosa y de gran área superficial para su futuro uso en dispositivos eléctricos y electrónicos.

METODOLOGIA Para la síntesis de Fulleritas y el grafeno se utilizó el método de ultrasonicado, que consiste en colocar grafito o Fullereno en un solvente orgánico para luego aplicarle vibraciones a altas frecuencias, ya sea en un baño sónico o con una punta sónica, se produce el fenómeno de cavitación, el cual consiste en la formación de pequeñas burbujas al momento de pasar las ondas de sonido a través del disolvente, dichas burbujas implotan de manera puntual liberando altas presiones, temperaturas y energías.. SINTESIS DE FULLERITAS. Para la síntesis de fulleritas simples se usaron 40mg de Fullereno y 30 ml de N,N-Dimetilformamida (DMF), se sonicaron en un procesador ultrasónico GEX 750 con una amplitud del 39% de la capacidad del equipo en un ciclo de 30 segundos on y 30 segundos off, en un baño de hielo para que la muestra no se sobrecalentara. Después de dos horas se volvió a agregar 40mg de fullereno, y se volvió a preparar un baño de hielo.

Figura 1. Representación esquemática de la síntesis de grafeno a partir de la exfoliación del grafito haciendo uso de un baño sónico.

SINTESIS DE FULLERITAS CON GRAFENO. Para está síntesis primero se colocaron 11mg de grafito en 30ml de DMF y se ultrasonicaron en el mismo equipo descrito anteriormente con el mismo ciclo, pero con una amplitud del equipo de 35%. Después de dos horas se agregaron 40mg de Fullereno, ahora con una amplitud del equipo de 39% durante dos horas, y se volvió a preparar un baño de hielo. Después de 2 horas (tiempo real) se agregaron otros 40 mg de Fullereno.


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En las micrografias de la Figura 6 se muestra la formacion de las fulleritas dopadas con Rubidio donde debio a al presencia de este agente dopante hace que la fullerita adquiera la estructura un poco esferica en lugar de cubica como se tiene la evidencia. Ademas de que siguen presentando los tamaños reportados anteriormente en la literatura.

Figura 6. Imágenes TEM de fulleritas dopadas con Rubidio; a) Formacion de las fulleritas además de la presencia de láminas de grafeno y b) Fullerita dopada de un tamaño aproximado entre 30-40 nm.

CONCLUSIONES Podemos concluir que el método empleado para la síntesis de fulleritas y fulleritas dopadas fue exitoso, gracias a la evidencia de las caracterizaciones antes mencionadas, esto nos abre el camino hacía el supercapacitor deseado y la búsqueda de materiales no contaminantes para producirlo. Cabe mencionar que de las muestras realizadas, las fulleritas dopadas con Cloruro de Potasio (KCl) resultaron ser las más eficientes a la hora de realizar pruebas eléctricas y esto puede ser considerado como una directriz en investigaciones futuras.

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a) b)

Figura 4. Espectros de Raman; a) Grafito puro. b) Hojas de grafeno obtenidas por la ultrasonicación de grafito. El espectro obtenido corresponde al de un grafeno con pocas capas.

En la figura 5 se observan los espectros obtenidos al ultrasonicar grafeno, C60 y las sales metálicas. La figura 4a) muestra el espectro de Raman del Fullereno C60 utilizado para llevar a cabo los experimentos, la principal característica en el espectro de C60 es un pico intenso alrededor de 1468 cm-1, conocido como “pentagonal pinch mode”. En la figura 4b) se muestra el espectro que se obtiene al ultrasonicar grafeno, C60 y cloruro de cesio, en el caso de la figura 4c) se muestra el espectro que se obtiene al ultrasonicar grafeno, C60 y cloruro de potasio es posible observar la presencia de un pequeño pico en 1468 cm-1 el cual nos indica la presencia de Fullereno, la aparición del pico D en 1348 cm-1 se puede considerar como el resultado de la presencia de una fracción no-sp2. El pico presente en 1580 cm es modo G, este pico nos indica que el producto tiene en consecuencia una fracción de material sp3 o un enlace C-C diferente de la de los sitios sp2. En el caso de la figura 4d) se muestra el espectro que se obtiene al ultrasonicar grafeno, C60 y cloruro de rubidio es posible del mismo modo observar la presencia del pico en 1580 cm-1 (modo G) sin embargo no es posible distinguir el pico en 1468 cm-1 esto se puede atribuir a la presencia de una mayor cantidad de material sp3 el cual interfiere con el material sp2, es decir una mezcla de material sp2 y sp3 (Dubrovinskaia, 2005).

Figura 5. Espectros de Raman; a) Fullereno Puro C60. b) Ce@Full. c) K@Full. d) Rb @Full


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remoción, aun y cuando se encuentre en estado trivalente, ya que por interacción del medio puede cambiar su estado de oxidación. Entre los métodos utilizados para su remoción, podemos destacar el empleo de técnicas de intercambio iónico sobre resinas poliméricas, coagulación-floculación, precipitación química, sedimentado y adsorción sobre varios materiales adsorbentes; sobre éste último, el empleo de carbón activado es uno de los métodos más utilizados gracias a su estabilidad físico-química, capacidad de regeneración y costos de operación relativamente bajos, y es en este sentido, que se ha estudiado el uso del carbón activado en la remoción de Cr(VI) de soluciones acuosas (Leyva et al., 2008). Con el mismo propósito, se ha sintetizado carbón activado a partir de precursores naturales (planta Zizaniaca duciflora) empleando soluciones de H3PO4 y ácido tartárico que generan un tamaño de microporo ideal así como un acondicionamiento adecuado, donde los resultados obtenidos han sido favorables, indicando que el éxito de la técnica depende en parte a un adecuado pre tratamiento del carbón (Liu et al., 2014). Por otro lado, la Universidad de Jinan en China, ha empleado el cromo remanente del carbón como colorante de cristales, con objeto de eliminar por completo la acumulación de dichos metales tóxicos (Wang et al., 2016). A pesar de que el uso de carbón activado en adsorción muestra eficacia, se ha intentado aumentar su rendimiento al aplicar un potencial eléctrico, siendo prometedor puesto que las condiciones de reacción son reproducidas de forma precisa y los procesos de oxidación y reducción son más selectivos y controlados fácilmente mediante la medición del potencial del electrodo (Zakaria, 2014). En 1960 se realizaron estudios empleando electrodos porosos de carbón activado para la desalinización de agua de mar, en 1980 se investigó la eliminación de especies como Cr(VI), Mo(VI), W(VI), V(IV) y V(V) procedentes de aguas residuales utilizando telas de carbón activado, resultando que la adsorción de todos los iones se incrementaba al aplicar un campo eléctrico a excepción del V(IV) (Afkhami et al., 2002); lo mismo sucedió con la remoción de Diacetato de mercurio de solución acuosa (A. Wahby et al., 2011) y la adsorción sobre materiales carbonosos de arsénico disuelto en agua (Morallón et al., 2009). Como se puede ver, existen antecedentes que demuestran que el uso de carbón activado puede ayudar a eliminar metales pesados de soluciones acuosas y que el aplicar un potencial eléctrico ofrece ventajas, por lo que el objetivo del presente trabajo es estudiar la adsorción de Cr(III) sobre carbón activado acondicionado con KOH y posteriormente incorporar procesos de electro-adsorción con la finalidad de estudiar los cambios en la capacidad de adsorción y remoción del cromo trivalente.

MÉTODOS Y MATERIALES Las soluciones de Cr (III) se prepararon a partir de CrCl3 6H2O, el carbón activado utilizado fue marca Hycel acondicionado con solución de KOH, grado reactivo (85 %, Monterrey), las mediciones de masa de carbón se realizaron en balanza analítica Precisa 205 A SCS, fue utilizada una placa de agitación multiposición Velp, la agitación se llevó a cabo en todos los experimentos a 600 rpm; el pH y la conductividad de los filtrados fueron medidos con equipos Oakton; después de cada etapa de adsorción las muestras fueron filtradas y analizada su concentración mediante un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer 3100. Acondicionamiento del carbón. 50 g de carbón activado fueron puestos en contacto con 500 mL de una solución 1 N de KOH en agitación durante 30 minutos, posteriormente dicho carbón fue filtrado y secado a 100 °C. Dosificación. Con objeto de determinar la cantidad mínima necesaria de carbón activado acondicionado para efectuar los experimentos posteriores, se realizaron pruebas con distintas cantidades de carbón activado: 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.35, 0.4. 0.5, 1.0, 2.0 y 3.0 g; éstas se añadieron a 95 mL de una solución de 100 ppm de Cr(III) y se mantuvieron en agitación durante 2 horas.

ELECTROADSORCIÓN DE CROMO EN CARBÓN ACTIVADO

1Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Facultad de Ciencias Químicas; Av. Dr. Manuel Nava #6, Zona Universitaria, C.P:78210, San Luis Potosí, SLP. México; [email protected]; 2Universidad de Guanajuato, Departamento de Ingeniería en Minas, Metalurgia y Geología; Ex Hda.

San Matías s/n, Col. San Javier; C.P:36025, Guanajuato, Gto. México; [email protected]

Zavala Arias, K. G.1; Martínez Barrón, J. C.2; Alvarado Montalvo, L. G.3

RESUMEN El siguiente trabajo presenta los resultados obtenidos al estudiar la adsorción y electroadsorción de Cr(III) sobre carbón activado. Las concentraciones empleadas fueron desde 80 a 200 ppm, observándose una remoción de hasta 99% del cromo. La máxima capacidad de adsorción reportada fue de 59.52 mg Cr/g carbón. Por otro lado se observó que dicha capacidad se incrementa tanto por la presencia de grupos OH-

en su superficie así como por la aplicación de un campo eléctrico.

ABSTRACT The present study demonstrates results obtained from experiments of trivalent chromium adsorption and electroadsorption in activated carbon. The concentrations used were from 80 to 200 ppm, observing a removal of Cr (III) of 99%. The maximum capacity of adsorption reported was of 59.52 mg Cr/ g carbon. On the other hand it was observed that the maximum capacity of adsorption is incremented by the presence of OH- groups on carbon surface such as in the application of an electric field. Palabras Clave: Cromo trivalente, Carbón Activado, Adsorción, Electro-adsorción.

INTRODUCCIÓN A partir de la Revolución Industrial la mayoría de los procesos industriales se han acelerado drásticamente; actividades minero-metalúrgicas, militares, textiles, automovilísticas entre otras, han mostrado cambios significativos desde entonces, su demanda incrementa al ritmo del desarrollo de nuevas tecnologías, desencadenando terribles consecuencias ambientales (Departamento de Geografía e Historia, 2016). En este sentido, la contaminación por metales pesados es una problemática actual que concierne a la población mundial, donde la principal causa es su liberación descontrolada mediante efluentes de desecho de diversas industrias(Valdés Perezgasga, 1999). Uno de los metales pesados que se encuentra en este caso y representa una amenaza de impacto ambiental, es el cromo, ya que han sido reportadas toneladas de cromo hexavalente como consecuencia de actividades industriales en Edo. de México y León, Gto. (Instituto Nacional de Ecología, 2007; García, 2014); como es sabido, dicho metal en estado hexavalente es causante de mutaciones y daño en material genético (Celso de Mello Farías et al., 2011). Por anterior, se han empleado diversos métodos de


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remoción se reporta al obtener 0.98 ppm en el medio, es decir, se alcanzó una remoción del 99.02%; por otro lado, los cambios en el pH, mostrados en la Figura 2b muestran el pH con menor acidez al minuto 15, debido a la presencia de grupos OH-en el medio que fueron desplazados de la superficie del carbón cuando el cromo fue adsorbido, punto coincidente el máximo de remoción de cromo del medio. Sin embargo los cambios de pH a través del tiempo son mínimos, variando de 8.3 a 8.7; sin embargo, después de las variaciones, se mantuvo constante con un valor de 8.6.

Isotermas. La capacidad de adsorción fue analizada mediante los modelos de Langmuir y Freundlich. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Experimento 1. Al emplear 0.5 g de carbón el modelo de Freundlich arroja un coeficiente de correlación lineal más cercano a 1 que el modelo de Langmuir, Figura 3b, donde R2=0.99, es decir que los datos experimentales obtenidos se adaptan de mejor manera a éste modelo matemático representado por la siguiente expresión: qe = KCe

n. Experimento 2. Al emplear 1 g de carbón a diferencia del Experimento 1, el modelo de mayor ajuste fue el de Langmuir, obteniendo una R2=0.9837 como se observa en la Figura 4a, donde su modelo matemático está representado por la siguiente expresión:1/qe = 1/qmáx + 1/(qmáx K Ce). Como resultado final, la máxima capacidad de adsorción se obtuvo en el Experimento 2, ésta está representada por el parámetro qmáx obtenido al graficar 1/qe vs 1/Ce, siendo este valor de 59.52 mg de Cr por g de carbón activado. El mejor ajuste en el modelo de Langmuir representa un mayor ajuste, el cual supone que la superficie del carbón activado es homogénea, es decir que las posiciones disponibles para que el cromo sea adsorbido es equivalente y que las moléculas adsorbidas no interaccionan entre sí.

Figura 2a. Cinética: variación de la [Cr] vs tiempo

Figura 2b. Variación del pH del medio vs tiempo

0102030405060708090

100

0 50 100 150 200 250

[Cr]

(p

pm)

Tiempo (min)

8.2

8.3

8.4

8.5

8.6

8.7

0 50 100 150 200 250 300

pH

Tiempo (min)

Cinética. 0.5 g de carbón activado acondicionado se puso en contacto con 95 mL de una solución de Cr(III) con una concentración inicial de 100 ppm a distintos tiempos: 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 y 240 minutos. Isotermas. La capacidad de adsorción del carbón activado con la solución de Cr(III) fue evaluada mediante 2 experimentos, con 0.5 y 1.0 g respectivamente, para determinar las isotermas de adsorción tipo Langmuir y Freundlich, en cada experimento. Las concentraciones de Cr(III) empleadas para ambos casos fueron: 80, 100, 120, 140, 160, 180 y 200 ppm, en un volumen de 100 mL con un periodo de agitación de 15 minutos. Electroadsorción. La experimentación de electroadsorción se llevó a cabo en una celda de microelectrólisis, se emplearon electrodos de grafito. Sobre la superficie de contacto del electrodo de trabajo se colocaron 3.3 mg de carbón activado previamente acondicionado con ayuda de una solución de Nafión marca Aldrich, posteriormente se introdujo en una estufa a 100 °C por 45 minutos. Se realizaron corridas con la superficie de grafito (blanco) y con la capa de carbón activado. La solución problema fue de igual manera Cr(III) 100 ppm; el potencial fue medido respecto a un electrodo de referencia de Hg/Hg2SO4. Se utilizó una ventana de potencial de -2.5 a 2.5 V.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS Dosificación. La finalidad de este experimento fue encontrar la cantidad mínima de carbón activado acondicionado necesaria para efectuar correctamente el fenómeno de adsorción en los experimentos posteriores. En la Figura 1a se aprecia que a partir de los 0.3 g de carbón la concentración de Cromo es removida significativamente del medio, sin embargo la máxima capacidad de remoción, del 98.25%, se logra al emplear 0.5 g, por lo que se destina esta cantidad para las siguientes pruebas. Por otro lado, en la Figura 1b se muestra la variación del pH respecto a la cantidad de masa de carbón utilizada, donde se aprecia que el pH del medio inicialmente es ácido, éste varía con el incremento de carbón empleado, a partir de los 0.5 g comienza a estabilizarse con valores entre 8 y 9. Lo anterior, se presenta como una respuesta del medio, ya que el carbón fue acondicionado con hidróxido de potasio, por lo que al adsorber cromo trivalente, grupos oxhidrilos se liberan al medio provocando basicidad del medio.

Figura 1a. Dosificación: Cambios de [Cr] vs la masa de carbón utilizada

Figura 1b. Cambios de pH durante prueba de dosificación.

Cinética. El objetivo de esta prueba fue conocer el tiempo requerido para que el cromo fuese adsorbido por el carbón activado. Como se aprecia en la Figura 2a se observa cómo la remoción sucede casi de forma instantánea, pues desde el primer minuto se logra una remoción que llega al equilibrio. La máxima

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

Con

cent

raci

ón d

e C

r(II

I) (p

pm)

Masa de carbón (g)

0123456789

10

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

pH

Masa de carbón (g)


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Electro-adsorción. Como puede observarse en la Figura 5, la respuesta en corriente aumenta al emplear carbón activado sobre la superficie del electrodo de grafito (blanco) debido a que éste, más allá de la atracción generada por el campo eléctrico aplicado, aporta grupos OH- superficiales que incrementan la afinidad de adsorción del Cr(III). La respuesta encontrada nos señala que se aumenta la adsorción del Cr(III) en más del 100% respecto a la respuesta en grafito, donde dichas diferencias se refieren a la señal capacitiva, es decir, adsorción de dichos iones sobre el sustrato. Por otro lado, la respuesta señala una capacidad de adsorción y desorción efectiva, al verse favorecido el proceso en ambas direcciones.

CONCLUSIONES Emplear carbón activado para la remoción de cromo de soluciones acuosas resultó ser una alternativa efectiva ya que el fenómeno de adsorción a pesar de no ser altamente específico, se lleva a cabo a partir del primer minuto, empleando una cantidad relativamente baja de carbón. La máxima capacidad de adsorción fue de 59.52 mg Cr/ g de carbón activado, cabe mencionar que para alcanzar esta capacidad se sugieren concentraciones de cromo por debajo de las 200 ppm. Por otro lado se comprobó que la electro-adsorción ofrece numerosas ventajas a la técnica como el poder controlar el proceso de adsorción, así como facilitar la desorción del cromo del carbón activado, posibilitando su regeneración y futura reutilización.

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Figura 3a. Experimento 1: Modelo de Langmuir Figura 3b. Experimento 2: Modelo de Freundlich

Figura 5. Capacidad de Electro-adsorción del cromo en ausencia

y presencia de carbón activado al aplicar un potencial en un rango de -2.5 a 2.5 V.

y = 0.248x - 0.026R² = 0.981

00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1/qe

1/Ce

y = 1.51x + 0.545R² = 0.990

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8

log

qe

log Ce

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

-1.2 -0.8 -0.4 0 0.4 0.8 1.2

I/mA

E/V vs. SSE

Blanco

Carbón Activado

Figura 4a. Experimento 2: Modelo de Langmuir Figura 4b. Experimento 2: Modelo de Freundlich

y = 0.289x - 0.016R² = 0.983

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1/qe

1/Ce

y = 1.282x + 0.489R² = 0.970

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

log

qe

log Ce


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caracterizar la viscoelasticidad de materiales suaves en el régimen no lineal, debido a la alta precisión que puede ser obtenida utilizando controles en tiempo real para la posición de la pinza y la corriente, y a las altas fuerzas que pueden ser producidas utilizando la pinza a distancias de solamente unos cuantos micrómetros de la muestra, todo esto fácilmente adaptable a un microscopio con una cámara para realizar grabaciones que pueden ser analizadas posteriormente (Philip & Ben, 2007). Con el uso de partículas magnéticas cubiertas con ligandos específicos que permiten su unión a la superficie celular y la técnica de pinzas magnéticas, ha sido posible el estudio de las propiedades celulares de mecanotransducción, es decir, el estudio de la activación de señales celulares, a través de estimulación mecánicas inducidas al activar el campo magnético producido por la pinza magnética (Nathan, 2010). En el presente estudio, se llevó a cabo la construcción del arreglo experimental de unas pinzas magnéticas con el propósito de que en el futuro este mismo pueda ser utilizado para realizar experimentos de mecanotrasducción en distintos tipos celulares. Para aumentar la inducción magnética de la pinza, se utilizó un diseño basado en un electroimán con un núcleo de hierro. Se acondicionaron distintos tipos de diseños encontrados en la literatura para utilizar recursos de bajo costo que permitieran la obtención de fuerzas útiles para la realización de experimentos con partículas magnéticas, además de que se buscó que la pinza fuese lo suficientemente precisa y selectiva para poder manipular solamente unas cuantas partículas al mismo tiempo. Para lograr controlar con precisión la corriente aplicada a la pinza, se programó una aplicación en LabVIEW para poder manipular una fuente de corriente programable. Se prepararon muestras con partículas magnéticas para verificar su manipulación por medio de las pinzas magnéticas a través de un microscopio y se grabaron varios videos.

MARCO TEORICO Una de las principales leyes en el electromagnetismo es la Ley de Biot-Savart, la cual nos permite calcular el campo magnético generado por una corriente eléctrica. En su usual forma la ley establece la contribución al campo magnético generado por una corriente circulando en un conductor de longitud unitaria según:

𝛿𝑩 = 𝜇�4𝜋𝑟� 𝑖 𝛿𝒍 𝑋 𝒖

(1) Donde 𝑖 es la corriente circulando en un elemento de longitud 𝛿𝒍 de un conductor, r es la distancia radial, 𝒖 es un vector unitario a lo largo de la dirección radial, 𝛿𝑩 es la contribución al campo magnético y 𝜇� es la permeabilidad del vacío (Raymond A. & John W., 2015). Otra forma de calcular el campo magnético generado por una corriente, y que generalmente resulta más práctica, es mediante la Ley de Ampere. En su forma integral la Ley de Ampere se escribe como:

∮𝑩 ∙ 𝑑𝒍 = 𝜇�𝑁𝑖 (2) Donde N es el número de portadores de corriente, y la integral se realiza a través de una trayectoria cerrada. La unidad de 𝑩, que se conoce como densidad de flujo magnético o inducción magnética, en el SI es el Tesla (T), mientras que en el sistema CGS es el Gauss (G) que equivale a 10-4 T (Jiles, 1998). Por ejemplo, en la superficie de la tierra el campo magnético es de 5 Gauss, y el de un imán de barra es de 100 Gauss. Un solenoide es un alambre aislado enrollado en forma de hélice para formar un cilindro, el cual permite producir un campo magnético razonablemente uniforme en el interior del solenoide cuando éste conduce corriente. Si las vueltas están muy apretadas y la longitud del solenoide es mucho menor que los radios de las vueltas, se dice que se trata de un solenoide ideal y el campo interior es uniforme. Un electroimán es hecho de una manera similar a un solenoide, excepto porque las vueltas son hechas sobre un material ferromagnético tal como el hierro. Este núcleo ferromagnético genera una mayor inducción magnética que


1Instituto de Investigación en Comunicación Óptica, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Karakorum No. 1470, Lomas 4ª. Sección, C.P. 78210, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO, [email protected]; 2Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Manuel Nava No. 6, Zona Universitaria, C.P. 78290, San Luis Potosí, S.L.P., MÉXICO; [email protected];


Zúñiga Pérez, E.1; Moctezuma Martiñón, R.2; Juárez Tello, A.2; Peña Balderas, A.2

RESUMEN En el presente estudio se implementó una pinza magnética mediante el uso de alambre de cobre enrollado sobre un núcleo de hierro en una configuración de tipo solenoide, con el propósito de que al hacer pasar corriente por el alambre se indujera un campo magnético especialmente intenso en el centro del núcleo. El núcleo de hierro se construyó de tal manera que el campo magnético en el centro del solenoide se concentrara en la punta del núcleo, para lo cual fue construida con un diámetro muy pequeño para poder manipular la menor cantidad posible de partículas magnéticas a la vez. Se automatizó la fuente de corriente utilizada mediante un programa en LabVIEW que permitió la aplicación de corrientes variables en el tiempo. Finalmente, se prepararon distintas muestras con partículas magnéticas para probar la pinza magnética. Palabras clave: pinza magnética, partículas magnéticas, mecanotransducción.

ABSTRACT In the present study we perform a magnetic tweezer by coiling copper wire into an iron core in a solenoid type configuration. When the current passes through the wire, a magnetic field is induced especially intense in the center of the core. The iron core was built such that the magnetic field in the center of the solenoid was concentrated in the tip of the core, it was built with a very small diameter to manipulate the fewest possible amount of magnetic particles at the same time. The system was automatized by means of a program designed in LabVIEW that controls the current. Finally, we prepared distinct samples with magnetic particles to test the magnetic tweezer. Keywords: magnetic tweezer, magnetic particles, mechanotransduction

INTRODUCCIÓN La técnica de pinzas magnéticas se ha convertido en una valiosa herramienta para el estudio y manipulación de moléculas simples. Se trata de una técnica flexible, económica y relativamente fácil de implementar que permite el estudio de sistemas biofísicos, y que ha permitido caracterizar por ejemplo, las propiedades elásticas y el enrollamiento del ADN, además de la actividad dinámica de las enzimas del ADN (Iwijn & Cees, 2012). También se ha utilizado para realizar mediciones reológicas y para


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Automatización del sistema en LabVIEW Para controlar la corriente suministrada a la bobina en la pinza magnética, se utilizó una fuente de poder bipolar de alta potencia de la marca Kepco, modelo BOP- MG 1KW, la cual es programable a través del protocolo RS 232 (Serial) y del protocolo IEEE 488 (GPIB). Adicionalmente esta fuente puede ser utilizada como un amplificador de potencia de ganancia fija o variable utilizando una señal de referencia externa, la cual es amplificada y puede ser utilizada para proporcionar la corriente necesaria en la pinza magnética. Se eligió utilizar la fuente como un amplificador de potencia de ganancia variable porque su programación en LabVIEW no requiere de conocimiento de los protocolos RS 232 ni GPIB, ni de los cables y tarjetas necesarios para estos protocolos y que pueden resultar difíciles de conseguir, además al utilizar una ganancia variable se pudo crear un programa que proporcionara señales variables en el tiempo, tales como señales senoidales. La fuente se configuró para funcionar como una fuente de corriente, ya que este parámetro nos permite conocer la intensidad del campo magnético producido por la bobina. Para proporcionar la señal de referencia que posteriormente sería amplificada por la fuente de corriente se utilizó una tarjeta de adquisición de datos (DAQ 6001) de National Instruments, la cual fue configurada en LabVIEW, para generar una señal de voltaje análoga, entre -10v y 10v en demanda y en modo diferencial. El programa en el diagrama de bloques consistió básicamente de un ciclo While que contiene una estructura tipo Case, en la cual se conectó un Combo Box que contenía las opciones para generar distintos tipos de ondas. Los tipos de ondas disponibles fueron DC, impulso, Monopulso Gaussiano, Seno con Modulación Gaussiana, Sinc, Chirp, Triangular, Cuadrada, Diente de Sierra, senoidal y fórmula, esta última opción permitió poder ingresar cualquier expresión matemática deseada para generar una señal con esa forma. Dentro de cada caso se colocó un Sub-Vi de las paletas WaveForm Generation y Signal Generation correspondiente al tipo de onda que se deseaba generar. En el panel frontal se colocaron perillas y controles para ingresar los parámetros necesarios para generar la onda, como amplitud, fase, frecuencia, offset, etc. En el diagrama de bloques estos controles fueron conectados a las funciones para generar ondas y señales según fuese necesario, la señal resultante se conectó a una función DAQ Assistant, configurada como se mencionó anteriormente y a una gráfica tipo WaveForm para poder visualizar la señal aplicada. El panel frontal y el diagrama de bloques de la aplicación en LabVIEW se muestran en la Figura 2.

Figura 2. Se muestran el panel frontal y el diagrama de bloques de la aplicación programada en LabVIEW para automatizar la corriente suministrada a la pinza magnética.

un solenoide para el mismo campo magnético. Se puede demostrar mediante la Ley de Ampere, que el campo magnético cerca del centro de un solenoide ideal está dado por:

𝐵 = 𝑁𝑖� = 𝜇�𝑛𝑖 (3)

Donde n es el número de vueltas por unidad de longitud. La inducción magnética consiste de dos contribuciones, una debido al campo magnético por sí mismo, y otra debido a la magnetización del material. La inducción magnética es simplemente la suma vectorial dada por:

𝑩 = 𝜇�(𝑯 + 𝑴) (4) Donde 𝑯 y 𝑴 tienen unidades de ampere por metro. El campo magnético 𝑯 es generado por corrientes eléctricas afuera del material tanto para un solenoide o electroimán, como para un imán permanente, mientras que la magnetización 𝑴 es generada, como resultado de los espines y momentos angulares (no compensados) de los electrones en el sólido.

METODOLOGIA Construcción de la pinza magnética

Para la construcción de la pinza magnética se realizó un arreglo basado en un electroimán, dónde el núcleo fue construido a partir de una barra de hierro. Se fabricaron tres núcleos de tamaños distintos, el diámetro de los tres núcleos fue de 6 mm, la longitud del primer y segundo núcleo fue de 17.5 cm, y la del tercer núcleo fue de 12 cm. El núcleo se acondicionó para colocarle una aguja en la punta que posteriormente fue doblada a aproximadamente 125°, con el fin de tener un mejor acceso a las muestras bajo el microscopio. A los tres núcleos distintos, se les colocaron tres agujas de diámetros distintos, con el fin de observar qué tamaño era el óptimo para los propósitos requeridos. Los diámetros de las agujas utilizadas en las pinzas fueron de 889 μm, 762 μm y de 558.8 μm, a las cuales se les nombra pinza 1, pinza 2 y pinza 3 respectivamente. Posteriormente se realizó el embobinado del núcleo, utilizando alambre de cobre AWG 20. A la pinza 1 se le enrrollaron 2 capas de 50 vueltas cada una, a la pinza 2 también se le enrrollaron 2 capas de 50 vueltas cada una, y finalmente a la pinza 3 se le enrrollaron 6 capas de 50 vueltas cada una, colocando una capa de barniz de la marca comercial Kemek® entre cada capa y recubriendo con cinta aislante cada 2 capas para evitar calentamiento excesivo de la bobina al momento de utilizarla. Después de que la última capa del embobinado fue colocada, se colocaron dos sujetadores en ambos extremos para sujetar el embobinado y se recubrió utilizando una capa de resina epoxi para asegurar el alambre. Las tres pinzas construidas se muestran en la Figura 1.

Figura 1. Se muestran las tres pinzas magnéticas construidas.


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Figura 4. Se muestra el campo magnético generado por la corriente en las tres pinzas magnéticas.

Como puede observarse en la Figura 4, la pinza 2, presenta una débil respuesta a la generación de un campo magnético debido a la corriente circulando por la bobina, esto puede deberse a que la aguja está hecha de un material que no es ferromagnético y por tanto presenta una magnetización muy pobre, por lo que esta pinza puede no ser útil para nuestros propósitos. Por el contrario la pinza 1 y la pinza 3, presentan una mejor respuesta a la generación del campo magnético, por lo que la punta debe estar compuesta de un material ferromagnético que presenta una buena magnetización al ser expuesta al campo magnético generado por la bobina. También puede observarse que las pinzas presentan una pequeña magnetización incluso antes de que se aplique corriente en ellas, esta magnetización es del orden del campo magnético en la superficie de la tierra, por lo que esta pequeña contribución se atribuye al campo magnético de la tierra. Por último, al contrario de lo que describe la ecuación (3), las pinzas presentan una respuesta lineal únicamente en una pequeña región, lo que significa que existe una saturación, debido a que existe un límite a la magnetización que puede presentar la aguja. En la figura 5 se muestra la respuesta de las partículas magnéticas ante el campo magnético generado por la pinza magnética.

Figura 5. Se observa la respuesta de las partículas magnéticas ante la presencia del campo magnético generado por la pinza magnética 3. El objetivo utilizado es de 5x.

CONCLUSIONES

De acuerdo a los objetivos planteados, podemos concluir que los resultados obtenidos fueron positivos, ya que se logró construir tres pinzas magnéticas, de las cuales 2 resultaron tener una buena respuesta a la generación del campo magnético requerido para futuras aplicaciones de este dispositivo. Para futuros

-2

8

18

28

38

0 1 2 3 4 5 6

B (G

auss

)

I (Amperes)

Campo Magnético Generado por la Pinza Magnética

pinza 1 Pinza 2 Pinza 3

Preparación de las muestras

Las muestras se prepararon utilizando partículas magnéticas Sera-Mag SpeedBeads Carboxylate-Modified de la marca Thermo Scientific®, las cuales poseen dos capas de magnetita para duplicar la velocidad y un rápido tiempo de respuesta magnética y tienen un diámetro de aproximadamente 1 μm. Se utilizó un arreglo de tipo celda, que consistió en colocar un cubreobjetos sobre un portaobjetos, después tres lados del cubreobjetos fueron sellados utilizando resina epoxi y en el lado que quedó descubierto se colocó la muestra de partículas magnéticas diluida en agua destilada a una concentración arbitraria utilizando una micropipeta, de tal manera que la muestra fuese entrando en la celda, y una vez que la muestra se encontraba uniformemente distribuida en la celda, esta se terminó de sellar utilizando la resina epoxi.

Caracterización de la pinza magnética Para conocer las propiedades y la respuesta magnética de la pinza, se midió la magnitud del campo magnético generado a lo largo del eje de la aguja, utilizando un sensor de campo magnético PS-2112, y el equipo de adquisición de datos Xplorer GLX Pasco®. Para generar el campo magnético se utilizó una corriente directa, y la medición del campo se realizó cada 0.5 A, hasta llegar a 6 A.

Observación de las partículas magnéticas Para observar las partículas magnéticas y su respuesta ante la presencia de la pinza magnética, se utilizó un microscopio óptico con objetivos de 5x, 40x y 100x. Se realizaron grabaciones y se tomaron fotografías utilizando la cámara Canon EOS rebel T5i que puede ser adaptada al microscopio y el software EOS Utility 2.13.30.0, también se utilizó la cámara Dino-lite Digital Microscope Premier que posee aumento suficiente para visualizar las partículas por sí misma y el software Dinocapture 2.0. El arreglo experimental se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Arreglo experimental utilizado para observar las partículas magnéticas, y su respuesta ante la presencia de la pinza magnética

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La variación del campo magnético en función de la corriente se muestra en la Figura 4 para las tres pinzas magnéticas.


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estudios, sería de utilidad medir la fuerza generada por el campo magnético sobre las partículas magnéticas, y observar la respuesta de células a las que se les haya introducido previamente partículas magnéticas.

BIBLIOGRAFIA

Iwijn, D. V., & Cees, D. (2012). Recent Advances in Magnetic Tweezers. Annual Review of Biophysics, 453-472. Jiles, D. (1998). Magnetic Fields. En D. Jiles, Introduction to Magnetism and Magnetic Materials (págs.

3-33). New York: Taylor & Francis. Nathan, J. S. (2010). Minireview: A Tiny Touch: Activation of Cell Signaling Pathways with Magnetic

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número 5 (Ciencias Naturales y Exactas) - UASLP

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