BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HOÀNG THỊ BÍCH

Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch

vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HOÀNG THỊ BÍCH

Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch

vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất tự nhiên

Mã số: 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương

2. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến

HÀ NỘI - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được hình thành

và phát triển từ những quan điểm của cá nhân tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.

Lê Mai Hương và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo thêm các tài liệu đáng

tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận án là hoàn toàn trung

thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này.

Tác giả luận án

Hoàng Thị Bích

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Lê

Mai Hương và PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm huyết

của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia

sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi nghiên cứu luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa

học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện Hóa

học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án

của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các anh chị phụ trách của Học Viện Khoa

học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị em đồng nghiệp Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển các SPTN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành công

trình nghiên cứu này.

Tôi cảm ơn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tạo chế phẩm

acid béo đa nối đôi (n3 - PUFA) từ nguyên liệu tự nhiên bổ sung vào thức ăn ương

nuôi một số đối tượng cá biển chủ lực” và “Nghiên cứu thành phần hóa học, điều tra

và đánh giá chất lượng tinh dầu trầm hiện đang được sản xuất ở Việt Nam”, mã số

VAST 04; đã tài trợ kinh phí.

Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn

động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành công trình nghiên cứu

khoa học này.

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Hoàng Thị Bích

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ............................................................................................................... i

Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii

Mục lục ...................................................................................................................... iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .................................................................... vii

Danh mục bảng ......................................................................................................... ix

Danh mục hình vẽ ....................................................................................................... x

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học xanh”

trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ... 3

1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn

gốc thiên nhiên ............................................................................... 3

1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn

gốc thiên nhiên ............................................................................... 4

1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi enzyme ..... 7

1.1.4. Lợi ích và khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE ....................... 9

1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ enzyme hỗ trợ chưng cất (EAD) và

enzyme hỗ trợ chiết xuất (EAE) ............................................................. 10

1.2.1. Các enzyme phân giải cấu trúc thành tế bào nguyên liệu

lignocellulose ............................................................................... 10

1.2.2. Enzyme protease phân giải cấu trúc nguyên liệu giàu protein ..... 16

1.2.3. Enzyme lipase thủy phân lipid thành axit béo tự do .................... 19

1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất và

làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước......................... 22

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 22

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước .......................................................... 26

1.4. Tổng quan về quế Cinnamomum cassia ................................................ 27

iv

1.4.1. Giới thiệu về Quế C.cassia ........................................................... 27

1.4.2. Những nghiên cứu về thành phần hóa học C. cassia ................... 29

1.4.3. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học C. cassia ...................... 31

1.4.4. Các phương pháp chiết xuất tinh dầu quế .................................... 33

1.5. Tổng quan về cá ngừ .............................................................................. 35

1.5.1. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm cá ngừ ................ 35

1.5.2. Dầu cá và các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA ............... 37

1.5.3. Các phương pháp chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo không

no .................................................................................................. 39

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 41

2.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 42

2.1.1. Mẫu nguyên liệu ........................................................................... 42

2.1.2. Enzyme sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 43

2.1.3. Bộ chủng vi sinh vật kiểm định .................................................... 44

2.1.4. Dòng tế bào .................................................................................. 45

2.2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 45

2.2.1. Hóa chất ........................................................................................ 45

2.2.2. Thiết bị ......................................................................................... 46

2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 46

2.3.1. Các phương pháp phân tích hóa sinh ........................................... 46

2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học ......................... 46

2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme ................................ 47

2.3.4. Các phương pháp thủy phân ......................................................... 49

2.3.5. Các phương pháp xác định sản phẩm thủy phân .......................... 50

2.3.6. Phương pháp làm giàu các axit béo bằng kết tinh ure ................. 52

2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu .................................. 52

2.3.8. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học ............................. 53

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 54

3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ

phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia ................................ 54

v

3.1.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền và tinh dầu của mẫu cành

lá và mẫu vỏ quế C. cassia ........................................................... 55

3.1.2. Nghiên cứu tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá

trình chưng cất tinh dầu ................................................................ 55

3.1.3. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme

kết hợp Laccase-Htec2 ................................................................ 58

3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong

chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ...... 60

3.2.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A.

crassna ........................................................................................... 60

3.2.2. Nghiên cứu thăm dò tác động của việc xử lý enzyme Laccase- Htec2

lên quá trình chưng cất tinh dầu từ bột gỗ gió bầu A. crassna ........ 60

3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu

các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares ... 61

3.3.1. Nghiên cứu thành phần chất nền và lipid tổng của một số loại đầu

cá ngừ của Việt Nam .................................................................... 62

3.3.2. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chiết xuất lipid từ đầu

cá ngừ vây vàng T. albarcares ..................................................... 62

3.3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase kết hợp ure trong quá trình

làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T.

albacares ...................................................................................... 64

CHƯƠNG 4. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 66

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu

từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia................. 66

4.1.1. Kết quả phân tích các chất nền và tinh dầu của cành lá và vỏ quế C.

cassia ............................................................................................ 66

4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng

cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............................................ 71

4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng

cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia ................................................... 85

vi

4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết

hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế . 95

4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng

cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ............. 106

4.2.1. Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A.

crassna ........................................................................................ 106

4.2.2. Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng

và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu A.

crassna ....................................................................................... 107

4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm

giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus

albarcares ............................................................................................. 111

4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit béo của một số

loại đầu cá ngừ của Việt Nam .................................................... 111

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid từ đầu

cá ngừ vây vàng T. albarcares ................................................... 115

4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL trong quá trình

làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T.

albacares bằng phương pháp ure ............................................... 118

4.3.4. Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết

xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T.

albacares .................................................................................... 126

KẾT LUẬN ................................................................................................ 130

KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................ 133

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................. 134

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ALA : Alpha linolenic acid Axit Alpha linolenic

CMC : Carboxymethylcellulose Carboxymethylcellulose

DHA : Docosahexaenoic acid Axit Docosahexaenoic

DMSO : Dimethyl Sulphoxide Dimethyl Sulphoxide

DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid 3,5-dinitrosalicylic acid

DPA : Docosapentaenoic acid Axit Docosapentaenoic

DPPH : Diphenylpicrylhydrazyl Diphenylpicrylhydrazyl

EAD : Enzyme assisted distillation Chưng cất có enzyme hỗ trợ

EAE : Enzyme assisted extraction Chiết xuất có enzyme hỗ trợ

EAMD : Enzyme assisted microway extraction Chiết xuất có enzyme kết hợp vi

sóng

EDTA : Ethylene Diamine Triacetic Acid Ethylene Diamine Triacetic Acid

EPA : Eicosapentaenoic acid Axit Eicosapentaenoic

FAO : Food and Agriculture Organization of

the United Nations

Tổ chức Lương nông Thế giới

FPH : Fish protein hydrolysate Protein thủy phân từ cá

GC : Gas chromatography Sắc ký khí

GC-MS : Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký kết hợp khối phổ

HD : Hydrodistillation Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hep-G2 : Human hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan

HPLC : High Performanc/e liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Htec2 : Cellic HTec2 Enzyme Enzym Cellic HTec2

IC50 : Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50%

KPH : Không phát hiện

Laccase : Laccase enzyme Enzym laccase

viii

LD100 : Lethal Dose at 100% Liều lượng gây chết cho 100% số

động vật thử nghiệm

LU : Human lung adenocarcinoma Dòng tế bào ung thư phổi

MCF-7 : Michigan Cancer Foundation 7 Dòng tế bào ung thư vú

MIC : Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MTT :(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide

(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide

MUFA : Monounsaturated fatty acid Axit béo không no 1 nối đôi

NO : Nitric oxid Nitơ mônôxit

PUFA : Polyunsaturated fatty acid Axit béo không no đa nối đôi

RD : Human rhabdomyosarcoma Dòng tế bào ung thư mô liên kết

SCFE : Supercritical fluid extraction Chiết Siêu tới hạn

SE : Solvent extraction Chiết xuất bằng dung môi

SFA : Saturated fatty acid Axit béo no

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC : Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TT : Thứ tự

TS : Transition state Trạng thái chuyển

USD : United States dollar Đô la Mỹ

USDA : United States Department of

Agriculture

Bộ Nông nghiệp Hoa kỳ

VSV : Vi sinh vật

ix

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số loại sinh khối.........................11

Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần của cá ngừ ...................................................36

Bảng 3.1. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế..............56

Bảng 3.2. Một số thông số của quá trình thủy phân bởi enzyme protease..............62

Bảng 4.1. Kết quả phân tích chất nền của nguyên liệu ...........................................66

Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu ...............................67

Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức

độ thủy phân các chất nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế..............72

Bảng 4.4. Hàm lượng tinh dầu thu nhận theo thời gian chưng cất mẫu cành lá quế có

và không có enzyme hỗ trợ.......................................................................................73

Bảng 4.5. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được

từ cành lá quế có và không có xử lý với enzyme......................................................79

Bảng 4.6a. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.................................81

Bảng 4.6b. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 03 dòng tế bào ung thư.........82

Bảng 4.6c. Kết quả thử khả năng ức chế sự sinh NO trên tế bào RAW 264.7.........83

Bảng 4.6d. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH...............................84

Bảng 4.7. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức

độ thủy phân thành tế bào và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ vỏ quế......................85

Bảng 4.8. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế có và không có

enzyme hỗ trợ...........................................................................................................87

Bảng 4.9. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được

từ vỏ quế có và không có xử lý với enzyme.............................................................93

Bảng 4.10a. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng.......................................100

Bảng 4.10b. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm...................................101

Bảng 4.11a. Kết quả phân tích thành phần bột gỗ gió bầu A. crassna...................107

Bảng 4.11b. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương thu được

từ gỗ cây gió bầu A. crassna bằng 2 phương pháp khác nhau.....................................107

Bảng 4.12. Thành phần các chất nền của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam...........111

x

Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu một số loài cá

ngừ của Việt Nam..................................................................................................113

Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình chiết xuất lipid..............................................115

Bảng 4.15. Thành phần axit béo của các lipid chiết xuất từ đầu cá ngừ vây vàng

T. albacare bằng các phương pháp khác nhau....................................................116

Bảng 4.16a. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do

của lipase CRL......................................................................................................119

Bảng 4.16b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố pH......120

Bảng 4.17a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự

do của lipase CRL..................................................................................................120

Bảng 4.17b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố nhiệt

độ...........................................................................................................................121

Bảng 4.18a. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân lipid thành

axit béo tự do của lipase CRL...............................................................................121

Bảng 4.18b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất

...............................................................................................................................122

Bảng 4.19a. Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân lipid thành axit

béo tự do của enzyme lipase..................................................................................122

Bảng 4.19b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của thời gian thủy phân

...............................................................................................................................122

Bảng 4.20. Thành phần axit béo trước và sau khi làm giàu n-3 PUFA.................124

Bảng 4.21a. Các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm axit béo giàu n-3 PUFA................129

Bảng 4.21b. Các thành phần axit amin tự do của sản phẩm bột đạm hòa tan giàu axit

amin........................................................................................................................129

xi

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng có và không có xúc tác nhờ

enzyme ............................................................................................ 5

Hình 1.2. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose 6

Hình 1.3. Công nghệ enzyme kết hợp dung môi sinh học chiết xuất các hợp

chất thiên nhiên ............................................................................... 7

Hình 1.4a. Các đơn vị cơ bản của lignin ....................................................... 11

Hình 1.4b. Cấu trúc của lignin ...................................................................... 12

Hình 1.5a. Công thức hóa học của cellulose ................................................ 13

Hình 1.5b. Cơ chế phân giải cellulose của hệ enzyme cellulase ................. 14

Hình 1.6a. Cấu trúc polymer xylan .............................................................. 15

Hình 1.6b. Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan ..... 15

Hình 1.7. Phản ứng thủy phân protein của enzyme protease ........................ 17

Hình 1.8. Phân tử lipid và các vị trí thủy phân của enyme lipase ................. 20

Hình 1.9a. Cành lá và hoa C. cassia ............................................................. 27

Hình 1.9b. Cây C. cassia ............................................................................... 27

Hình 1.10a. Một số polyphenol trong quế Cinnamomum............................. 29

Hình 1.10b. Một số thành phần chính và phụ trong tinh dầu C. cassia ........ 30

Hình 1.11. Sơ đồ chưng cất tinh dầu quế có nồi hơi riêng............................ 34

Hình 1.12. Cấu trúc của một số acid béo nhóm n-3 PUFA .......................... 38

Hình 2.1. Mẫu cành lá quế Cinnamomum cassia .......................................... 42

Hình 2.2. Mẫu vỏ quế Cinnamomum cassia ................................................. 42

Hình 2.3. Mẫu bột gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ................................... 42

Hình 2.4. Mẫu đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares .............................. 43

Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp DNS .................. 51

Hình 2.6. Đồ thị đường chuẩn protein .......................................................... 51

Hình 3.1. Qui trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất tinh dầu 54

Hình 3.2. Quy trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid và

làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ ................................................ 61

xii

Hình 3.3. Ba pha sản phẩm sau ly tâm .......................................................... 63

Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid ....................... 69

Hinh 4.1b. Một số thành phần thuộc nhóm sesquiterpenoid ......................... 70

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân các chất

nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế ...................... 72

Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu

cành lá quế có và không có enzyme hỗ trợ ................................... 74

Hình 4.4a. Sắc ký đồ của tinh dầu cành lá quế chưng cất theo cách thông

thường, nguyên liệu không qua xử lý enzyme ............................ 75

Hình 4.4b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme

Laccase EAD .............................................................................. 76

Hình 4.4c. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme

Htec2 EAD ................................................................................. 77

Hình 4.4d. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ

enzyme Laccase-Htec2 ............................................................... 78

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân thành tế

bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế ............................................ 86

Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu

vỏ quế có và không có enzyme hỗ trợ .......................................... 87

Hình 4.7a. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu không xử lý enzyme ..... 89

Hình 4.7b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ

enzyme Laccase- EAD ............................................................... 90

Hình 4.7c. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme

Htec2-EAD ................................................................................. 91

Hình 4.7d. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme

Laccase - Htec2- EAD ................................................................ 92

Hình 4.8a. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của pH lên hàm lượng đường

khử ................................................................................................ 96

Hình 4.8b. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của nhiệt độ lên hàm lượng

đường khử ................................................................................... 97

xiii

Hình 4.8c. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase/cơ chất lên hàm

lượng đường khử ......................................................................... 97

Hình 4.8d. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2/cơ chất lên hàm

lượng đường khử ......................................................................... 98

Hình 4.8e. Bảng và đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên hàm lượng

đường khử ................................................................................... 99

Hình 4.9a. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x1x2 .......................... 104

Hình 4.9b. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x2x4 .......................... 104

Hình 4.9c. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x3x5 .......................... 104

Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-

Htec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............ 105

Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương ............ 110

Hình 4.12. Tinh thể ure kết hợp với axit béo bão hòa................................. 123

Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo sau khi làm giàu ................................... 124

Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết

xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng. 126

1

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã dẫn đến nhu cầu

cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên

theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng suất, giảm thời gian, tận dụng hiệu quả nguồn

nguyên liệu và giảm ô nhiễm môi trường. Rất nhiều các nỗ lực nghiên cứu để cải

thiện năng suất cũng như chất lượng các hoạt chất, trong đó ứng dụng công nghệ

enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ

trong vài chục năm trở lại đây và bước đầu đưa ra tính khả thi trong công nghiệp. Đây

được coi là một trong những giải pháp “Xanh” trong chiết xuất các HCTN do giảm

lượng dung môi, sử dụng các dung môi thay thế, tạo ra các sản phẩm sạch “organic”

và phế liệu của quá trình cũng ở dạng dễ phân hủy, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi

trường.

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm cộng với đường bờ biển trải dài

qua nhiều vĩ tuyến khác nhau nên nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô

cùng phong phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng. Trong đó

phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy sản) là những mặt

hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm

dầu từ quế và cá ngừ ngày càng được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tinh dầu

quế là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, dầu cá ngừ chứa hàm lượng lớn các acid béo

không no đa nối đôi PUFAs (polyunsaturated fatty acids), đặc biệt là nhóm axit béo

không no đa nối đôi thiết yếu omega 3 như DHA và EPA có vai trò quan trọng trong

các lĩnh vực y, dược và công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên trong công nghiệp, quá

trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống (cất cuốn

hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn

nguyên liệu.

Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ enzyme có khả

năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao, phổ cơ chất rộng... thì công

nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên

(enzyme assisted extraction- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là

2

vấn đề cấp thiết [134]. Nhằm mục đích tăng hiệu suất chiết tách, phát triển hướng

nghiên cứu mới - chiết xuất và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi

lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách

và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên” với các đối tượng được lựa

chọn là cành lá quế, vỏ quế C. cassia, gỗ gió bầu A. crassna và phụ phẩm đầu cá ngừ.

Trong nghiên cứu này, quá trình chưng cất tinh dầu, quá trình chiết xuất lipid, làm

giàu các n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ được thử nghiệm kết hợp với một số

enzyme có sẵn nhằm đánh giá hiệu quả tác động của enzyme lên chất lượng sản phẩm

tạo thành. Một số thông số tối ưu của quá trình xử lý bằng enzyme được khảo sát và

tối ưu hóa bằng qui hoạch thực nghiệm.

Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết xuất và làm giàu

các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassia, trầm hương

từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ

nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu “XANH” trong khai thác các

SPTN.

Nội dung chính của luận án bao gồm:

- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ

phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác động của việc xử lý nguyên

liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản

phẩm tinh dầu (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học).

- Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong

chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna.

- Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các

axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares: tác động của enzyme

lên quá trình được đánh giá qua thành phần axit béo n-3 PUFA.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học

xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên

1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn

gốc thiên nhiên

Mọi sinh vật, đặc biệt là thực vật trên cạn và sinh vật biển đều có chứa các

hoạt chất sinh học có khả năng ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm...

Những hợp chất này được gọi là những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.

Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi hữu cơ (solvent extraction- SE) vẫn

đang được sử dụng rộng rãi trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên từ các nguyên

liệu khác nhau như trầm tích, đất, polymer, vi khuẩn, nấm, tảo, vi tảo và phổ biến

nhất là thực vật. Ưu điểm của phương pháp sử dụng dung môi là dễ thao tác, tuy

nhiên, các dung môi lại độc cho người và nguy hại đến môi trường. Nhận thức này

đã dẫn đến nhu cầu ngày càng tăng cho các sản phẩm được sản xuất thông qua quá

trình thân thiện với môi trường còn được gọi “Hóa học xanh” [121].

Hóa học Xanh, còn gọi là hóa học bền vững là một phần của hóa học và công

nghệ hóa học tập trung vào việc tạo ra những sản phẩm, qui trình giảm thiểu việc sử

dụng hoặc phát sinh các chất độc hại. Hóa học xanh tập trung vào phương pháp tiếp

cận công nghệ để ngăn ngừa ô nhiễm, giảm tiêu thụ nguồn tài nguyên không thể tái

tạo. Trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên, quá trình chiết xuất “Xanh” liên quan

đến việc sử dụng các dung môi thân thiện với môi trường sinh thái, nguyên liệu bền

vững và tái tạo, giảm chất thải gây ô nhiễm môi trường [86].

Rất nhiều phương pháp để “Xanh hóa” những qui trình công nghệ hóa học.

Những phương pháp này có thể thực hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với các qui trình của

công nghệ hóa học, nhằm mục tiêu làm tăng hiệu suất và giảm lượng thải độc hại.

Trong báo cáo thường niên (xuất bản năm 2011) của cơ quan quản lý năng lượng và

môi trường Pháp (French Environment and Energy Management Agency) với tựa đề:

“Khó khăn khi thay thế hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong quá trình công nghiệp”

đã trình bày các “giải pháp khắc phục kỹ thuật, hạn chế hoặc thay thế các dung môi

4

truyền thống” [86]. Hai trong số các giải pháp đặt ra đã hướng tới ứng dụng công

nghệ enzyme với tự đề:

+ Giải pháp cơ học kết hợp tiền xử lý enzyme

+ Chiết nước kết hợp tiền xử lý enzyme

Ngày nay, những tiến bộ trong xúc tác enzyme, sự đa dạng và sẵn có của các

enzyme công nghiệp cộng với tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng thì

các giải pháp công nghệ, trong đó có công nghệ chiết xuất có enzyme hỗ trợ

(enzyme assisted extraction, viết tắt là EAE) nhằm thay thế dung môi hữu cơ là vấn

đề cấp thiết [134].

1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn gốc

thiên nhiên

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học

quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với

độ đặc hiệu cơ chất lớn, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học khác khó thể thực

hiện [14].

Enzyme có tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học, có hoạt tính xúc

tác lớn. Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các enzyme xảy ra với tốc độ nhanh gấp 108 -

1011 lần so với phản ứng không có chất xúc tác. Bên cạnh đó, enzyme có tính đặc

hiệu cao và tác dụng trong điều kiện êm dịu, nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động

30-50oC, pH trung tính và áp suất thường. Đặc biệt, hầu hết các enzyme có nguồn

gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm

và y học [32].

Sinh vật thường được cấu tạo từ những đại phân tử tương đối trơ (polypeptid,

polysaccharid) không có khả năng hòa tan trong dung môi hữu cơ [25]. Các hợp chất

thiên nhiên có hoạt tính sinh học thường tồn tại ở dạng không tan hoặc lưu giữ trong

các bào quan dự trữ, hoặc tồn tại tại ở dạng keo kết hợp với các thành phần vách tế

bào [108]. Muốn cắt đứt các liên kết và giải phóng chúng ra khỏi tế bào cần năng

lượng hoạt hóa, tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để

cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Về lý thuyết, tốc độ phản

ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa. Năng lượng hoạt hóa

càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh và ngược lại.

5

Bất kỳ enzyme nào cũng xúc tác theo trình tự sau:

E + S ES EP E+ P

Trong đó, E là enzyme, S là cơ chất, P là sản phẩm phản ứng. ES và EP là

phức hợp enzyme với cơ chất và sản phẩm.

Sơ đồ trên Hình 1.1 cho thấy đường cong của năng lượng phản ứng có và

không có xúc tác enzyme

Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng được và không được xúc tác nhờ enzyme [14]

Ghi chú: TSc1, TSc2 và TSc3 là các trạng thái chuyển (transition state)

[ES]: tổ hợp phức hệ enzyme-cơ chất

[EP]: tổ hợp phức hệ enzyme- sản phẩm

- Con đường không có xúc tác chỉ đi qua trạng thái chuyển tiếp TS* với năng

lượng tự do Gkhông xúc tác cao, cần mức năng lượng hoạt hóa cao hơn.

- Con đường đi qua phản ứng xúc tác enzyme đi qua các trạng thái chuyển tiếp

TSc1, TSc2 và TSc3, với năng lượng tự do Gcó xúc tác thấp. Chất xúc tác làm giảm năng

lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, nó chỉ tham gia vào các giai đoạn trung gian

mà không tham gia trực tiếp vào phản ứng. Năng lượng liên kết do các tương tác yếu

tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng để làm căng hoặc uốn gấp khúc cơ chất,

tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng. Chính vì vậy, enzyme tạo

được thế năng đặc biệt có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng, tạo ra

vô số sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp, áp suất thường.

6

Trái với phương pháp dung môi, tách các HCTN nhờ vào mức độ phân cực của

chúng, phương pháp ứng dụng enzyme sử dụng nước là dung môi đặc biệt để hòa tan,

phá vỡ các rào cản ngăn cản sự giải phóng hoạt chất. Lúc này, các hoạt chất đang bị

lưu giữ trong cấu trúc khép kín được giải phóng một cách tự nhiên (Hình 1.2).

Hình 1.2. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose [91]

Hình 1.2 miêu tả quá trình chiết xuất hoạt chất liên kết với mạng lưới

lignocellulose thành tế bào thực vật (chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose và

lignin). Quá trình phân giải chất nền (matrix, ma trận) của thành tế bào đã thúc đẩy

quá trình giải phóng các hoạt chất được dễ dàng và thuận lợi.

Quá trình chiết xuất lipid dưới tác dụng của enzyme protease cũng được áp

dụng nhiều trên nhiều đối tượng sinh vật biển và các hạt có dầu (cấu trúc nguyên liệu

chủ yếu là protein và lipid). Các phân tử lipid thường bị lưu giữ trong chất nền protein

của nguyên liệu. Các enzyme protease thủy phân protein màng tế bào cũng như bên

trong tế bào chất thành các peptid nhỏ hơn và các axit amin, từ đó nới lỏng sự toàn

vẹn của cấu trúc, thúc đẩy quá trình giải phóng dầu khỏi chất nền protein khi kết hợp

với các phương pháp ly tâm hoặc gia nhiệt [128]. Toàn bộ quá trình thủy phân diễn

ra trong điều kiện nhẹ nhàng ở nhiệt độ thấp (40-60oC) làm cho các chất có hoạt tính

sinh học gần như không bị thay đổi

7

Do tính chất kỵ nước của các cấu tử không hòa tan vào trong nước nên sau xử

lý enzyme, biện pháp cơ học hoặc vật lý được sử dụng để phân tách các hoạt chất ra

khỏi hỗn hợp. Ngày nay, các ứng dụng của công nghệ enzyme trong chiết xuất các

HCTN rất đa dạng, sự kết hợp enzyme với các dung môi sinh học thay thế dung môi

độc hại đã khiến cho EAE thực hiện trên cả các nguyên liệu không phải cây chứa dầu

đã mang đến sự đa dạng cho các sản phẩm được hình thành (Hình 1.3).

Hình 1.3. Công nghệ enzyme kết hợp dung môi sinh học chiết xuất các hợp chất

thiên nhiên

1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi enzyme

Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố [32]:

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất

lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ

enzyme tăng, tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn V = Vmax thì

nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ phản ứng thủy phân bởi enzyme tăng không

đáng kể, thậm chí không tăng.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc

độ thủy phân, khi càng tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng tăng,

nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt đến giới hạn V = Vmax, nếu tiếp tục tăng

nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng hầu như không tăng nữa.

Khi nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động tự do

và sự cung cấp hạn chế cơ chất sẽ xác định tốc độ phản ứng. Ngược lại nồng độ cơ

8

chất cao, hầu hết các trung tâm hoạt động bị chiếm lĩnh do đó lúc này số lượng phân

tử enzyme lại là yếu tố quyết định phản ứng.

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những

chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc

mất hoạt tính. Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy, khi sử dụng

enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hàm nó để điều chỉnh phản ứng.

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: chất hoạt hóa là những chất khi có mặt

trong phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa

học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất

hoạt hóa chỉ có tác dụng giới hạn nồng độ xác định. Khi dùng quá nồng độ cho phép,

hoạt độ enzyme này sẽ giảm.

Ảnh hưởng của nhiệt độ: bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay

giảm nhiệt độ thường có thể ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme, enzyme thể

hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất định. Thông thường

đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng từ 40 - 50oC, ở nhiệt

độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy, nhiệt độ 70oC gọi là nhiệt

độ tới hạn của enzyme.

Tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ. Nhưng khi vượt

quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính

của phân tử protein-enzyme. Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme,

là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ

tối thích khác nhau. Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy

theo từng điều kiện từng sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử

protein-enzyme.

Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme vì

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất. Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp

trong vùng trung tính từ 5-7, một số enzyme protease, pH thích hợp nằm trong vùng

axit (pepsin,…) hoặc nằm trong vùng kiềm (trypsin, subtilin,...). Với từng enzyme,

giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt độ, loại cơ chất,... thay đổi.

9

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: thời gian thủy phân cần thích hợp để

enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá

trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt. Thời

gian thủy phân dài, ngắn khác nhau tùy thuộc vào từng loại enzyme, nồng độ cơ chất,

pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất hoạt hóa, ức chế... Trong thực tế, thời gian thủy phân

phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân

cụ thể.

Ngoài ra, còn một số các yếu tố khác ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng như tỷ

lệ nước/cơ chất, tốc độ khuấy,...

1.1.4. Lợi ích và khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE

Lợi ích của công nghệ EAE

- Công nghệ EAE ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm

Trong thực tế, các phương pháp chiết xuất truyền thống thường sử dụng

phương pháp vật lý như ép, cất... chưa cho hiệu quả cao. Công nghệ EAE thường cho

kết quả tăng hiệu suất do tác động phân giải thành tế bào của enzyme đã giải phóng

dễ dàng hơn các hoạt chất vốn bị lưu giữ trong cấu trúc chất nền thành tế bào (thực

vật) hay chất nền protein tăng tính thấm của màng tế bào do đó dẫn đến năng suất cao

hơn khi chưng cất. [65], [81], [94], [161]. Mặt khác, enzyme thường hoạt động trong

điều kiện nhiệt độ thường 40-50oC, pH trung tính 5-7 nên ít ảnh hưởng đến hoạt chất

chiết xuất, cho chất lượng sản phẩm thường cao hơn so với các phương pháp truyền

thống (sử dụng hóa chất, nhiệt độ, áp suất cao...).

- Công nghệ EAE cho các sản phẩm phụ có giá trị gia tăng

Bên cạnh các sản phẩm chính của quá trình, EAE còn có các sản phẩm thủy

phân có giá trị gia tăng như các protein, polysaccharid, polyphenol... Quá trình thu

nhận các sản phẩm này không những không ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm

chính mà còn có tác động có lợi giúp cho quá trình giải phóng hoạt chất thuận lợi

hơn, giảm sự biến chất của sản phẩm.

- Công nghệ EAE tác động lên thời gian chiết

Các phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ cần thời gian ngâm chiết kéo dài

nếu thiếu sự hỗ trợ của siêu âm, vi sóng, soxhlet... Enzyme có cường lực xúc tác lớn,

10

tốc độ phản ứng nhanh, chỉ vài phút (ribonucelase), vài giờ (protease,...). Sau quá

trình thủy phân, các hoạt chất đã được giải phóng ở dạng tự do hoặc liên kết lỏng lẻo

với cơ chất, chỉ cần một tác động nhỏ như năng lượng nhiệt hay ly tâm cũng đủ để

phân tách chúng khỏi hỗn hợp. Do đó, thời gian chiết xuất nhanh hơn so với không

xử lý enzyme.

- Công nghệ EAE thân thiện với môi trường

EAE đã giảm thiểu việc sử dụng dung môi, giảm lượng phế thải, chuyển hóa

phế liệu thành dạng đơn giản, có thể tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu, giảm các

nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.

Khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE

Công nghệ EAE còn hạn chế về khả năng thương mại và công nghệ như:

- Giá các enzyme là tương đối đắt khi xử lý khối lượng lớn nguyên liệu thô;

- Chế phẩm enzyme có sẵn có thể không hoàn toàn thủy phân thành tế bào

thực vật, hạn chế hiệu suất chiết xuất các hợp chất; Vì vậy, tìm được hệ enzyme thích

hợp để phân giải cơ chất là hết sức quan trọng.

- Enzyme dễ chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Ở quy mô khác nhau,

enzyme có sự biến động về điểm hoạt động tối ưu như như tỷ lệ phần trăm oxy hòa

tan, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất là khác nhau. Do đó, ở qui mô công nghiệp,

kiểm soát các yếu tố phản ứng enzyme là yếu tố then chốt quyết định hiệu quả của

quá trình xử lý bằng enzyme.

Hiệu suất chiết của các hợp chất hòa tan trong nước phụ thuộc vào tất cả công

nghệ (enzyme, cơ học,...) để làm tăng khả năng hòa tan vào nước của chúng. Do đó,

sử dụng enzyme hỗ trợ phải hiểu biết đầy đủ về thành phần thành tế bào, hoạt tính

enzyme và ảnh hưởng của điều kiện tiền xử lý và điều kiện thực nghiệm để đảm bảo

việc xử lý bằng enzyme được hiệu quả. Tuy nhiên, nếu những hạn chế trên có thể

được khắc phục, xử lý bằng enzyme dựa trên một qui trình tối ưu sẽ không chỉ làm

tăng năng suất chiết, mà còn tăng chất lượng sản phẩm khi qui trình chiết xuất được

thực hiện ở nhiệt độ thấp, áp suất thường.

1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ enzyme hỗ trợ chưng cất (EAD)

và enzyme hỗ trợ chiết xuất (EAE)

1.2.1. Các enzyme phân giải cấu trúc thành tế bào nguyên liệu lignocellulose

11

Một số thành phần lignocellulose của một vài nguyên liệu thực vật được

Kumar, 2009 khảo sát [110] và chỉ ra trong Bảng 1.1:

Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số loại sinh khối

Nguyên liệu

lignocellulose

Hàm lượng (%)

Cellulose Hemicellulose Lignin

Gỗ cứng 40-55 24-40 18-25

Gỗ mềm 45-50 25-35 25-35

Cỏ 25-40 35-50 10-30

Rơm lúa mì 30 50 15

Lá 15-20 80-85 0

Bảng 1.1 cho thấy, thành phần lignocellulose ở các cây thân gỗ gồm khoảng 40-

45% (trọng lượng khô) cellulose, 24-40% hemicellulose (ít pectin hơn vì các khoảng

trống giữa các sợi cellulose nhỏ) và lignin (chiếm tới 18-25% trọng lượng khô). Vì vậy,

cấu trúc tế bào ở gỗ cứng bền vững hơn rất nhiều so với lá không có hoặc rất ít lignin.

Do sự phức tạp của cấu trúc thực vật nên sự phân giải của lignocellulose là một quá trình

đa enzyme liên quan đến sự biến đổi thủy phân và oxy hóa.

1.2.1.1. Quá trình oxy hóa loại lignin

Lignin là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở

những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm nước

qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật. Lignin là sản phẩm

ngưng tụ của 3 thành phần chủ yếu gồm trans--coumaryl, trans-coniferyl, và trans-

sinapyl alcohol theo tỷ lệ khác nhau [39].

Hình 1.4a. Các đơn vị cơ bản của lignin [39]

Các polymer này có các liên kết ngang (cross-linked) với nhau tạo nên mạng

12

lưới polymer - lignin.

Hình 1.4b. Cấu trúc của lignin [39]

Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhưng

không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên

kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết. Carbon alpha

(Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối

hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và

4-O-methylglucuronic acid là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có

thể là ether, ester (liên kết với xylan qua 4-O-methyl-D-glucuronic acid), hay

glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của

lignin) [63].

Các ligninase là các enzyme phân hủy lignin. Ba enzyme quan trọng được

công nhận rộng rãi có khả năng oxy hóa lignin là LiP (lignin peroxidase), MnP

(mangan peroxidase) và Laccase (polyphenol oxidase) [55]. Nấm đảm

Basidiomycetes (nấm mục trắng -white rot fungy) và nấm mục nâu là nhóm sản sinh

hiệu quả nhất của các ligninase.

13

Phân hủy lignin được khởi động thông qua việc sản xuất oxy tự do gốc tự do

nấm mục trắng (white rot fungy) và nấm mục nâu (brown rot fungy). Các gốc oxy

được sản xuất thông qua các phản ứng Fenton và sau đó tấn công các phần lignin của

vách tế bào thực vật và tạo điều kiện cho các protein enzyme khác xâm nhập cấu trúc

lignocellulose [63].

Trong số 3 enzyme, laccase (EC 1.10.3.2, p- diphenol oxidase) là enzyme oxy

hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy

phân tử làm chất nhận điện tử. Không giống như lignin peroxidase và peroxidase

mangan, laccase có lợi thế hơn peroxidase trong việc sử dụng oxy như một cofactor,

có khả năng xúc tác cho quá trình oxy hóa của các hợp chất hữu cơ trong sự vắng mặt

của H2O2 hoặc Mn2+, cho phép laccase được áp dụng hiệu quả trong công nghiệp, bao

gồm tẩy trắng trong công nghiệp giấy, loại màu của thuốc nhuộm, loại bỏ các loại

thuốc diệt cỏ từ ngũ cốc cây trồng và phân hủy sinh học và bioconversion thực phẩm

và chất thải nông nghiệp [95]. Chính quá trình oxy hóa mở vòng thơm của các enzyme

phân giải lignin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các enzyme cellulase và hemicellulase

tấn công, phân giải các bó sợi cellulose, hemicellulose vốn bị lignin che chắn [39].

1.2.1.2. Quá trình phân giải cellulose

Cellulose là polymer được cấu tạo từ các mắt xích β-D-Glucose liên kết với

nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay

[C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ

yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật [79].

Hình 1.5a. Công thức hóa học của cellulose [79]

Cellulase là enzyme phân hủy các phần cellulose. Cơ chế tác dụng của

cellulase không hoàn toàn rõ ràng, Zhang & cs. xem xét cơ chế hóa học được chấp

14

nhận rộng rãi nhất là sự hiệp đồng của 3 loại enzyme chính.

Hình 1.5b. Cơ chế phân giải cellulose của hệ enzyme cellulase [80]

+ Enzyme nội bào Endoglycanase hay 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC

3.2.1.4): Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là

enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác

dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các

chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh

thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ

tiếp cận.

+ Exoglucanase: exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase

(EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan

cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của

enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose.

+ β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21): giải phóng

phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác.

1.2.1.3. Quá trình phân giải hemicellulose

Khác với cellulose, hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh,

độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon

(gồm glucose, mannose và galactose) và đường 5 carbon (gồm xylose và arabinose)

và một vài acid [110].

15

Ở thực vật bậc cao, thành phần cơ bản của hemicellulose là xylan liên kết với

nhau bằng liên kết β-1,4-D-xylopyranose. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở

trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các

gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác

cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác.

Hình 1.6a. Cấu trúc polymer xylan [110]

Hemicellulase là enzyme phân hủy hemicellulose. Do tính chất biến động

nhiều hơn, có nhiều enzyme hoạt động trên hemicellulose. Xylanase và mannanase

là những enzyme phân giải liên kết β-1,4 trong xylan và mannan và giải phóng

oligosaccharide mà có thể thủy phân tiếp thành xylose và mannose bởi β-xylosidase

và β-mannosidase [39].

Hình 1.6b. Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan

Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-O-Me-GlcA: α-4-O-

methylglucuronic acid

Enzyme acetylxylan esterase là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl

16

với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong

tự nhiên.

Vi sinh vật phân giải hemicellulose: hemicellulose khác cellulose vì chứa cả

đường pentose và hexose và cũng thường chứa axit uronic. Những vi khuẩn có khả

năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng sử dụng hemicellulose. Tuy nhiên,

không phải tất cả các loài sử dụng được hemicellulose đều có khả năng thủy phân

cellulose. Một số loài VSV phân giải hemicellulose là Butyrivibrio fibrisovens,

Lachnospira multiparus và Bacteroides ruminicola…

Enzyme phân giải cellulose, hemicellulose là nhóm enzyme ứng dụng rất nhiều

trong công nghiệp (chỉ sau protease) với các chế phẩm enzyme dạng bột, dịch [14].

Novozyme là công ty sản xuất enzyme lớn với một số sản phẩm thủy phân cellulose và

hemicellulose như Cellic CTec2, Cellic Ctec3, Cellic Htec2 (cellulase và xylanase),

Cellulase 1.5 LFG, Novozyme 188 (β-glucosidase), Novozyme NS50013 (Cellulase),

Novozyme NS5001 (β-glucosidase), Novozyme NS50012 (hỗn hợp glucosidase,

xylanase). Cellic Htec2 là hỗn hợp đa enzyme bao gồm cellulase và xylanase đã được

ứng dụng rất nhiều trong chuyển hóa cellulose của rơm rạ, rong biển thành bioethanol

cho hiệu quả thủy phân cao, phổ cơ chất rộng [29].

1.2.2. Enzyme protease phân giải cấu trúc nguyên liệu giàu protein

Protease hay peptidase (EC.3.4.) là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt

mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ

chất tương tự thành các axit amin tự do hoặc các peptide phân tử thấp.

17

H2N - CH - CO - NH - CH - CO - ... - NH - CH - COOH

H2N - CH - COOH + H2N - CH - CO.... NH - CH - COOH

Hình 1.7. Phản ứng thủy phân protein của enzyme protease

Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại. Trong trung tâm

hoạt động của chúng có chứa gốc axit amin đặc hiệu. Đối với hydrolase thường chứa

hai nhóm chức. Ví dụ: + Vòng imidazol của histidin + Nhóm hydroxyl (một số axit

amin: serine, threonine) Sự tương tác giữa hai nhóm đặc hiệu (-OH, - imidazol) đã hình

thành tâm ái nhân. Xung quanh trung tâm hoạt động của hydrolase còn chứa nhiều

các axit amin, vai trò của serine có chứa nhóm - OH có tác động rất lớn làm thay đổi

trung tâm hoạt động theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Do cấu

trúc bậc 3 của phân tử protein-enzyme mà nhóm hydroxyl của serine và vòng

imidazol của histidin gần nhau, tạo ra liên kết hydroxyl giữa gốc - OH của serine với

nitơ bậc 3 của histidin. Nhờ quá trình đó mà nhóm hydroxyl xuất hiện tính chất ái

nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của cơ chất.

Các enzyme protease sử dụng phân tách các liên kết peptid đã được ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm từ rất lâu đời. Chủ yếu là protein thực vật và sữa. Từ

những năm 1960, protease được ứng dụng để thủy phân các protein từ cá nhằm hướng

tới nguồn dinh dưỡng giá rẻ. Các protein thủy phân từ cá (FPH- fish protein

hydrolysate) đã được tách chiết bằng phương pháp này đã rất thành công trong sản

xuất thức ăn gia súc, sản xuất protein cô đặc bổ sung vào nước mắm ... [109]. Quá

trình thủy phân protein gắn liền sự giải phóng lipid trong dịch thủy phân nên phương

pháp ly tâm thường được sử dụng để tách lipid. Phế liệu đầu từ cá ngừ đại dương

ngoài protein có giá trị (axit amin thiết yếu 30-35%) còn chứa hàm lượng lipid cao

với các axit béo không no thiết yếu (EPA, DHA 18-22%) [12], [138].

R1 R2 Rx

R1

H2O

R2 Rx

18

Phân loại: Protease được phân làm 2 loại, endopeptidase và exopeptidase.

- Exopeptidase được phân thành 2 loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptid.

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi

polypeptid để giải phóng ra một axit amin, một dipeptide hoặc tripeptid.

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc một dipeptide.

- Endopeptidase gồm serinproteinase và cystein protease

+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm -OH của gốc serine trong trong

tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.

Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin

bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin và elastase. Nhóm subtilisin

bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine

protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất

tương đối rộng.

+ Cysteine protease: các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động.

Cystein proteinase bao gồm các protein thực vật như papain, bromelain, một vài

protein động vật và kí sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng

pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspatic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin có

chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung

tính bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin.

+ Metalloproteinase: là nhóm proteinase tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng

như các VSV bậc cao, thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh

dưới tác dụng của EDTA.

Có thể thu nhận protease từ rất nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật

hay vi sinh vật. Tuy nhiên, enzyme thực vật và enzyme từ vi sinh vật là hai nhóm

enzyme được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. Một số chế phẩm enzyme công

nghiệp thường được sử dụng trong chế biến các sản phẩm giàu protein [32].

- Các chế phẩm enzyme có nguồn gốc thực vật

+ Papain và chymopapain: là hai chế phẩm enzyme chứa chủ yếu là protease

19

và đều nhận được từ mủ nhựa đu đủ Carica Papaya (L) (Caricaceae). Hàm lượng

chymopapain trong nhựa đu đủ lớn hơn papain. Chế phẩm papain có hoạt tính cao

trong phân giải amit và ester, có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với các enzyme khác,

nhiệt độ hoạt động tới hạn là 80oC. Trong khi đó, chymopapain xúc tác thủy phân các

mối liên kết peptid và ester.

+ Physin: thu được từ nhựa quả sung. Trung bình quả xanh trọng lượng từ 10-

15g có thể thu được 100-200 mg physin. Physin tương đối ổn định ở pH 6-8.

+ Bromelain: Enzyme này có nhiều trong lá và vỏ dứa, cũng thủy phân casein

tốt như papain, nhưng đối với hemoglobin vận tốc tăng lên 4 lần. Bromelain là nhóm

endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein để chuyển

phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là peptid. Thành phần chủ yếu của Bromelain

có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein. Trọng lượng phân tử 33.200- 33.500 Da,

bromelain trích ly từ thân dứa có điểm đẳng điện pI 9.55 trong khi trích từ quả lại là

protein acid có điểm đẳng điện pI 4.6.

- Các chế phẩm enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật

+ Alcalase 2.4l, Neutrase 0.5l, Esperase 7.5l, Protamex, Novozyme FM2.0L:

chúng là các chế phẩm enzyme chứa chủ yếu là endopeptidase thu nhận từ vi khuẩn.

Các chế phẩm này được sử dụng để cải thiện các tính chất công nghệ, dinh dưỡng và

hương vị của protein.

+ Flavourzym MG, Kojizyme đây là hỗn hợp của enzyme exo- và endo peptidase

thu nhận từ nấm mốc. Các chế phẩm này dùng để tăng cường thủy phân protein.

Quá trình chiết xuất lipid bằng enzyme thủy phân đạt hiệu quả liên quan đến

việc lựa chọn được loại enzyme protease phù hợp nhằm đảm bảo chất lượng của bột

đạm thủy phân và lipid

1.2.3. Enzyme lipase thủy phân lipid thành axit béo tự do

Các axit béo không no đa nối đôi chuỗi dài n-3 PUFA, đặc biệt là EPA, DHA

có vai trò rất lớn đối với đời sống sức khỏe con người và vật nuôi. Tuy nhiên, dầu cá

bị hạn chế vì chúng chứa một lượng đáng kể các axit béo no và cholesterol [92]. Có

rất nhiều phương pháp làm giàu n-3 PUFA nhưng lipase là phương án được chú ý

20

gần đây bởi chúng phản ứng ở điều kiện nhiệt độ thường, hạn chế sự biến tính các

axit béo mạch dài, đồng thời giảm thiểu lượng dung môi hóa chất sử dụng, thân thiện

với môi trường sinh thái.

Phản ứng thủy phân lipid là một trong những bước kỹ thuật quan trọng để thu

được các axit béo tự do, là yếu tố then chốt dẫn đến hiệu quả quyết định khi kết tinh

ure. Để làm giàu các axit béo không no đa nối đôi PUFA, nâng cao chất lượng sản

phẩm dầu từ đầu cá ngừ, dầu cá thường được thủy phân thành các axit tự do bằng

cách đun nóng với tác nhân axit hoặc kiềm, sau đó kết tinh với ure trong cồn. Phương

pháp này hiệu quả song tốn một lượng hóa chất, gây ô nhiễm môi trường.

Lipase hydrolase (EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác thủy phân triglycerid thành

di, mono glycerid hoặc glyxerol và các axit béo nhờ hoạt động trên bề mặt phân pha

dầu, nước. Lipase là enzyme linh hoạt có thể sử dụng xúc tác nhiều loại phản ứng

khác nhau, có khả năng chịu kiềm, chịu nhiệt. Chính vì thế, lipase được ứng dụng

rộng rãi trong công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp hóa học, công

nghiệp mỹ phẩm, công nghiệp da, trong y dược và các ngành công nghiệp khác.

Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α- ester chứ không cắt

cùng lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác như

protease, carbohydradase.

Hình 1.8. Phân tử lipid và các vị trí thủy phân của enyme lipase

Enzyme được kích hoạt tại giao diện dầu-nước do mở nắp cấu tạo của lipase

tại giao diện của hệ thống [20, 21]. Cơ chế liên quan đến sự gắn kết của nhóm acyl

(RCOO -) trên bề mặt điện tích dương (NH3 +) và sự gắn kết của ion hydro (H+) trên

bề mặt mang điện tích âm (COO-). Nhờ vậy giải phóng các axit béo tự do. Lipase

hydrolase khác với lipase esterase ở điểm chỉ thuỷ phân cơ chất không tan trong nước

21

và hoạt lực được tăng cường khi ở bề mặt phân chia pha cơ chất - nước (interfacial

activation). Vì vậy, hoạt lực tối ưu của lipase chỉ được thể hiện trong hệ nhũ tương,

khi đó thì diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme sẽ tăng lên rất nhiều. Ngoài ra,

không những xúc tác cho hệ nhũ tương bình thường (dầu trong nước), lipase còn hoạt

động mạnh ở những hệ nhũ tương là nước trong dầu và dầu hoà tan trong dung môi

hữu cơ.

Lipase thu từ các nguồn khác nhau và có đặc trưng khác nhau.

- Lipase thu nhận từ động vật: Lipase thu nhận từ những cơ quan, mô của một

số loài động vật có vú đã được nghiên cứu rất nhiều. Bản chất của chúng là những

glycoprotein, phân tử lượng 50 kDa, không có hoặc ít hoạt tính đối với phospholipid.

Lipase của động vật có vú bền ở pH thấp, được hoạt hóa bởi muối mật và đặc hiệu tại

vị trí sn-3 của cơ chất. Lipoprotein lipase người có chức năng thủy phân

triacylglycerol trong chylomicron. Để có hoạt tính thì enzyme này kết hợp với

apolipoprotein C-II để tạo thành dimer và được hoạt hóa bởi heparin. Tuy nhiên,

lipase trong gan thực hiện chức năng chuyển hóa lipoprotein nhưng không liên kết

với apo C-II. Lipase có trong sữa mẹ được hoạt hóa bởi muối mật để giúp trẻ sơ sinh

tiêu hóa chất béo có trong sữa.

- Lipase từ thực vật: Lipase từ thực vật không được chú ý nhiều so với những

nguồn thu nhận khác. Tuy nhiên, gần đây, loại enzyme này đã bắt đầu được quan tâm

và nghiên cứu khá phổ biến. Trong đó, lipase từ những hạt có dầu là được quan tâm

nhất. Những enzyme này nếu khác nhau từ nguồn nguyên liệu thu nhận thì đặc hiệu

về cơ chất, pH tối ưu, khả năng phản ứng với sulfuhydryl, tính kỵ nước cũng khác

nhau. Những enzyme này có quan hệ mật thiết với triacylglycerol có trong bản thân

hạt dầu đó và chỉ được tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt.

- Lipase từ vi sinh vật: Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều

nhất theo quy mô công nghiệp. Khác với thực vật và động vật, vi sinh vật được cấu

tạo từ một tế bào, chính vì vậy mà nó có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực

vật. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian

ngắn, hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ động vật

22

và thực vật; và ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi

sản xuất.

Lipase được thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc

là những enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tụy. Các loài nấm

mốc có khả năng sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus

spp., Penicillium spp., Geotrichum spp. Đối với nấm men gồm những loài Torulopis

spp., Candida spp. Và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm:

Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp. Loài vi sinh vật được

sử dụng sản xuất lipase theo quy mô công nghiệp chủ yếu là nấm sợi.

Dựa vào tính đặc hiệu của enzyme lipase, mục đích của quá trình thủy phân

theo nhiều phương thức khác nhau. Lipase được sử dụng để gia tăng hàm lượng các

axit béo n-3 PUFA (EPA, DHA) trong dầu bằng việc thủy phân các thành phần axit

béo no, lipase từ Chromobacterium viscosum, Pseudomonas sp. lại giải phóng tất cả

các loại axit béo [92].

1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất

và làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Có rất nhiều các nghiên cứu đối với các loại cây có dầu [162]. Gần đây, một

số ứng dụng enzyme được sử dụng hỗ trợ tách tinh dầu và các thành phần dễ bay hơi

như:

- Freese & Binnings, (1993) đã sử dụng của enzyme trong quá trình chiết xuất

dầu và tinh dầu từ gừng, tỏi, hạt tiêu đã được báo cáo là tăng năng suất của dầu lên

30-50% so với đối chứng không xử lý enzyme [90].

- Sowbhagya et al. (2009) đã xử lý enzyme cellulase, pectinase, protease và

Viscozyme trước khi chưng cất tinh dầu từ tỏi làm tăng hàm lượng từ (0,39-0,51%)

so với đối chứng (0,28%). Tác giả cũng chứng minh rằng enzyme tạo thuận lợi cho

việc khai thác dầu tỏi, dẫn đến sự gia tăng hiệu suất và ít thay đổi hương vị hay tính

chất hóa lý của dầu [161]. Ngoài ra, Sowbhagya (2011) cũng chứng minh hiệu quả

23

của các enzyme hỗ trợ tách tinh dầu hạt cần tây (Apium graveolens L.), hạt thì là

(Cuminum cyminum L.). Enzyme cellulase, hemicellulase, pectinase, protease và hỗn

hợp cellulase + hemicellulase đều làm tăng sản lượng tinh dầu hạt cần tây (22-27%),

tinh dầu hạt thì là 18-22% so với đối chứng không sử dụng enzyme. Tác giả cũng cho

rằng, enzyme không làm thay đổi bất kỳ đặc tính cảm quan, tính chất vật lý hoặc tính

chất hóa học của tinh dầu. Tuy nhiên, có sự gia tăng đáng kể về thành phần limomene

trong tinh dầu cần tây (82.2%) khi xử lý với cellulase so với đối chứng (63.9%) [163],

[164].

- Theo Boulila A. et al. (2015) tiền xử lý lá Nguyệt Quế (Laurus nobilis L.)

bằng enzyme cellulase, hemicellulase, xylanase và hỗn hợp các enzyme đã tăng hiệu

suất thu nhận tinh dầu lần lượt là 243, 227, 240.54 và 0.48% tương ứng với các

phương án xử lý. Các kết quả phân tích GC-MS cũng cho thấy quá trình xử lý bằng

enzyme không những không làm biến đổi thành phần các hợp chất dễ bay hơi mà

còn làm giàu các thành phần monoterpenoid trong tinh dầu, từ đó làm gia tăng hoạt

tính chống oxy hóa của sản phẩm thông qua thử nghiệm với DPPH và ABTS [58].

- Sayantani Dutta and Paramita Bhattacharjee (2015) đã kết hợp α-amylase với

CO2 siêu tới hạn đã tăng hiệu suất nhựa dầu hạt tiêu lên 2.13 lần khi không xử lý

enzyme trong khi xử lý bằng enzyme (1,25 lần). Quá trình kết hợp enzyme và CO2

đã tăng hiệu suất chiết 53% cũng làm giàu hàm lượng piperin có trong hỗn hợp so

với đối chứng không sử dụng enzyme [154].

Như vậy, vai trò của enzyme ngoài hỗ trợ quá trình chiết tách, làm giảm thời

gian và năng lượng còn gia tăng hàm lượng chất chính trong sản phẩm.

Trên đối tượng sinh vật biển, quá trình chiết xuất lipid và làm giàu các axit

béo không no đa nối đôi PUFA nhờ enzyme hỗ trợ cũng được nghiên cứu.

- Năm 2002, Liaset và cộng sự đã sử dụng enzyme Protamex để thủy phân phế

phụ phẩm của cá hồi sau khi fillet, lượng lipid thu được sau quá trình ly tâm xấp xỉ

77% lượng lipid tổng số có trong nguyên liệu ban đầu và phần lipid này có chứa hàm

lượng EPA và DHA cao [117]. Tác giả cũng cho thấy phương pháp thủy phân bằng

enzyme thu được dầu cá giàu hàm lượng ω-3 với hiệu suất thu hồi cao (khoảng 77%)

24

cũng như thu được nhiều thành phần khác có giá trị như: các peptid và các axit amin

không thay thế [118].

- Linder et al., (2005) đã sử dụng các enzyme protease thương mại khác nhau

là Alcalase, Neutrase và Flavourzyme để tách chiết dầu thô từ đầu cá hồi và enzyme

lipase Aspergillus oryzae (Novozym SP 398) để thủy phân dầu thành các axit béo và

các acylglycerol. Hiệu suất thu hồi dầu cao nhất (17,4% sau 2h) đạt được khi sử dụng

Alcalase, gần với hiệu suất thu hồi dầu đạt được bằng phương pháp Blight and Dyer

(20%), quá trình thủy phân bằng enzyme lipase đạt được 45% trong 24 giờ đã làm

giảm các axit béo no SFA 27,2% xuống 20,2% và làm giàu các axit béo không no đa

nối đôi PUFA từ 41,6% lên 46,5% trong đó DHA từ 9,9% đến 11,6% và EPA từ 3,6%

đến 5,6% [120].

- Dumay và cộng sự (2006) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu hồi lipid

và phospholipid từ nội tạng cá mòi sử dụng các enzyme thương mại là Flavourzyme,

Protamex, Alcalase. Quá trình thủy phân tiến hành trong 24h kết hợp khuấy đảo liên

tục. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid tổng số trong các phần chất lỏng

sau khi ly tâm (phần dầu và phần dung dịch) tăng lên (ít nhất 85% các lipid đã được

xác định có trong nguyên liệu có mặt trong các pha này). Quá trình giúp cải thiện

sự thu hồi lipid đối với các ứng dụng mang tính thương mại. Thêm vào đó, các phần

lipid này giàu các phosphoslipid hơn lipid được chiết bằng phương pháp hóa học cổ

điển, đặc biệt là sau khi thủy phân bằng Alcalase [83].

- Laplante và cộng sự (2009) đã tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu quả tách

chiết thu hồi dầu từ cá thu và cá trích theo 2 phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp là

phương pháp tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn và phương pháp thủy phân bằng

enzyme Protamex. Trong đó, quá trình thủy phân được tiến hành ở các điều kiện: pH

7, nhiệt độ 45oC, thời gian thủy phân 2,5 giờ, tỷ lệ enzyme / nguyên liệu là 0,01%

(w/w), tỷ lệ nước / nguyên liệu là 1/1 (w/w). Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi dầu

từ hai loại cá này đạt được khi sử dụng phương pháp thủy phân cao hơn so với phương

pháp chiết CO2 siêu tới hạn, hay nói cách khác, quá trình tách chiết bằng phương

pháp thủy phân thể hiện hiệu quả có thể so sánh hoặc tốt hơn tách chiết dầu bằng CO2

25

siêu tới hạn. Bên cạnh đó, chi phí sản xuất đối với phương pháp thủy phân lại thấp

hơn, do đó phương pháp này cũng có thể là một lựa chọn tốt hơn khi sản xuất dầu ở

quy mô công nghiệp [108].

- Mbatia (2011) đã sử dụng các loại protease (Protex 30L và Bromelain) để

giải phóng dầu từ phế liệu cá rô sông Nile (Lates niloticus) và cá hồi (Salmon salar).

Hiệu suất thu hồi dầu tương ứng đối với đầu cá rô sông Nile nước ấm và đầu cá hồi

nước lạnh lần lượt là 11,2% và 15,7% khối lượng nguyên liệu. Trong khi đó, việc

tách chiết dầu bằng dung môi hữu cơ từ hai loại nguyên liệu này tương ứng lần lượt

là 13,8% và 17,6%. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung nước trong quá trình

thủy phân bằng enzyme làm giảm hiệu suất thu hồi dầu và thời gian thủy phân tốt

nhất cho việc thu hồi dầu là 2 giờ [128].

Nhìn chung, các nghiên cứu thu hồi dầu cá từ các phế liệu của quá trình sản

xuất trên thế giới hiện nay khá đa dạng và ngày càng mở rộng không những về đối

tượng nguyên liệu, phương pháp tách chiết thu hồi dầu mà đi sâu vào khai thác, phát

triển các khía cạnh mới và các lĩnh vực khác nhau của công nghệ sản xuất và tinh chế

dầu cá.

Nối tiếp các công trình nghiên cứu thu hồi dầu thô từ các phế liệu của các loại

cá khác nhau sau quá trình chế biến, các quá trình làm giàu các axit béo không no đa

nối đôi PUFA bằng enzyme lipase cũng được nghiên cứu.

Gámez - Meza và cộng sự (2003) đã nghiên cứu làm tăng hàm lượng DHA và

EPA của dầu cá mòi bằng phương pháp thủy phân và tạo phức với ure. Nghiên cứu

cho thấy sự kết hợp của phương pháp thủy phân bằng enzyme hoặc hóa chất kết hợp

với quá trình tạo phức với ure là một phương pháp hứa hẹn để thu được các axit béo

chưa bão hòa omega-3 nồng độ cao từ dầu cá mòi [92].

Liu và cộng sự (2006) đã nghiên cứu quá trình dùng enzyme để tách chiết dầu

dựa trên việc thủy phân protein từ đầu cá ngừ, sau đó tiến hành bước tạo phức với

ure, thu được hỗn hợp DHA và EPA với độ tinh khiết 85,02% và hiệu suất 25,01%

[122].

Tóm lại, trên thế giới, các nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme ứng dụng

26

tiền xử lý các nguyên liệu thiên nhiên như động, thực vật, tảo... để chiết xuất các chất

có hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sử dụng phương án enzyme

bước đầu đã cho hiệu quả cao và tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp, trở thành

một trong những công cụ quan trọng của hóa học xanh, cho phép tạo ra các công nghệ

mới sử dụng các hóa chất thân thiện với môi trường, tiết kiệm về năng lượng và chi

phí. Ứng dụng công nghệ enzyme thường cho kết quả là giảm thời gian chiết, giảm

thiểu việc sử dụng các dung môi và tăng năng suất và chất lượng của sản phẩm.

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất

thiên nhiên cũng được quan tâm trong khoảng 20 năm trở lại đây.

Nguyễn Văn Chung (2004) đã sử dụng enzyme α-amylase trong quá trình

chưng cất tinh dầu hồ tiêu đã làm tăng hiệu suất tinh dầu 8% [4].

Lưu Thị Lệ Thủy (2008) đã nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận

dầu từ hạt bí đỏ bằng phương pháp enzyme Alcalase và Viscozyme cho hiệu suất lần

lượt 75,7 và 70,3% so với chiết bằng hexan. Sản phẩm dầu tạo ra có chất lượng tương

đương dầu tinh khiết, có giá trị dinh dưỡng cao (hàm lượng axít béo omega-6 > 50%)

[34].

Nguyễn Thị Minh Nguyệt [23] sử dụng enzyme protease, hemicellulase và

carbohydradase trong chiết tách dầu béo và các thành phần của cám gạo. Hiệu suất

thu dầu cám chỉ đạt 77,5% so với phương pháp chiết bằng dung môi hexan nhưng

ngoài dầu béo, sản phẩm thu được là protein có trong cám gạo 75,4% và xơ hòa tan

10,4%. Năm 2007, nhóm nghiên cứu cũng đã tách chiết và làm giàu các axit béo

không no đa nối đôi omega-3 và omega-6 bằng enzyme để ứng dụng trong công

nghiệp thực phẩm và thực phẩm chức năng.

Ứng dụng enzyme trong chiết xuất các HCTN vẫn là hướng mới mẻ đối với các

nghiên cứu trong nước. Chủ yếu các nghiên cứu trên một số loại cây có dầu. Tuy nhiên,

hoạt chất sinh học chứa trong các nguyên liệu thực vật thân gỗ rất đa dạng và phong

phú, sử dụng enzyme để phá vỡ cấu trúc thành tế bào chứa lignocellulose thì chưa có

công trình nghiên cứu nào đề cập, đặc biệt là ứng dụng trên các loại cây chứa tinh dầu,

nguồn nguyên liệu rất giá trị ở các vùng nhiệt đới như Việt Nam.

27

Chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng cũng đã có một số nghiên cứu trong

nước ứng dụng, tuy nhiên vẫn còn ở dạng sơ khai, chưa đi sâu ứng dụng. Tối ưu hóa

quá trình kép sử dụng hệ enzyme protease và lipase tiền xử lý vào 2 giai đoạn chiết

xuất và làm giàu các axit béo không no đa nối đôi omega-3 từ đầu cá ngừ vây vàng

cho tiềm năng ứng dụng cao trong công nghiệp khi tạo được sản phẩm dầu cá giàu

omega3 đạt tiêu chuẩn thực phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu các vấn đề nêu trên là rất

cần thiết và mang ý nghĩa thực tiễn cao.

1.4. Tổng quan về quế Cinnamomum cassia

1.4.1. Giới thiệu về Quế C.cassia

Quế Cinnamomum cassia còn có tên gọi khác là Quế Đơn, Quế bì, Quế quan,

Quế thanh... Loài này được (Nees & T.Nees) J.Presl miêu tả khoa học đầu tiên năm

1825.

Đặc điểm thực vật: là loại cây lâu năm, thân gỗ, chỉ phát triển ở một số vùng

nhất định có khí hậu nhiệt đới gió mùa. Cây trưởng thành có kích thước trung bình

12 - 17 m, lá mọc so le, dài và cứng, cuống to, hoa mọc thành chùy ở kẽ những lá

phía trên, quả hình trứng, thuôn, phía dưới có đài tồn tại hoặc nguyên hoặc hơi chia

(Hình 1.9a và 1.9b).

Hình 1.9a. Cành lá và hoa C. cassia

Hình 1.9b. Cây Cinnamomum cassia

Nguồn gốc và phân bố: Loài quế Đơn (Cinnamomum cassia) là cây nguyên

sản ở Việt Nam, hiện gặp và phân bố tự nhiên tại một số khu rừng ẩm nhiệt đới ở Việt

Nam (Cúc Phương, núi Đinh...). Đây là loài Quế quen thuộc đã được gây trồng và sử

28

dụng từ lâu đời ở nước ta. Có thể gặp Quế đơn mọc dải rác hoặc gây trồng trên những

diện tích lớn tại nhiều địa phương: Yên Bái, Quảng Ninh, Hà Tây, Ninh Bình, Thanh

Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Bà Rịa - Vũng Tàu

(núi Đinh)... (Lã Đình Mỡi, 2001) [21].

Công dụng: Từ thời thượng cổ, trước Công nguyên hàng thế kỷ, người Trung

Quốc cũng như cha ông ta đã biết dùng Quế để chữa bệnh như điều trị mãn tính viêm

phế quản, liệt dương, khó thở, thấp khớp...; Trong Tây y, Quế và tinh dầu quế được

sử dụng làm thuốc kích thích tăng khả năng tuần hoàn, tiêu hóa, hô hấp, bài tiết... Quế

cũng được coi là chất kích thích, tăng nhu động ruột và gây co bóp tử cung. Quế

cassia là một thuốc khử nấm, chống dị ứng, ung thư dạ dày, tiêu chảy, làm đổ mồ hôi,

kháng những chất gây đột biến như benzopyren và cyclphosphamid.

Bột quế, tinh dầu Quế được dùng phổ biến để làm phụ gia thực phẩm, gia vị

và hương liệu do chúng có hoạt tính chống đầy hơi, chất chống oxy hóa và chất bảo

quản [146].

Sản xuất và tiêu thụ:

Đến năm 1998, diện tích rừng quế ở nước ta đạt khoảng 61.820 ha (trong đó

có 19.743 ha có thể khai thác) với trữ lượng ước tính khoảng 29.000 - 30.000 tấn

vỏ. Hàng năm Việt Nam xuất khẩu khoảng 1.500 - 2.000 tấn vỏ và 5 - 7 tấn tinh dầu

quế. Theo thống kê của FAO (1998) tổng diện tích quế đến tuổi khai thác tại Quảng

Đông và Quảng Tây (Trung Quốc) vào khoảng 35.000 ha với sản lượng ước chừng

28.000 tấn. Trung Quốc là nước sản xuất, tiêu dùng và xuất khẩu Quế Đơn lớn nhất.

Nước ta là quê hương của loài Quế đơn (C. cassia). Tổng diện tích Quế đơn ở

nước ta vào khoảng 16.000 ha trong đó riêng huyện Văn Yên, Yên Bái, C. cassia

trồng ở 27/27 xã và thị trấn với tổng diện tích khoảng 15.000 ha, trong đó trên 50%

diện tích có thể sẵn sàng cho vỏ cây sau thu hoạch với sản lượng quế vỏ 5.160

tấn/năm, gỗ quế 25.800 m3 và các loại lá và cành (60 - 70 000 tấn/năm) [142].

Vỏ, tinh dầu vỏ, tinh dầu lá của Quế đơn đều là những sản phẩm có giá trị

thương mại cao. Sức tiêu thụ của thị trường thế giới vào khoảng 20 - 30.000 tấn

quế/năm. Các nước nhập khẩu nhiều quế là Hoa Kỳ, Pháp, Canada, Nhật Bản,

Singapor, Ấn Độ và Hồng Kông... Giá mua bán trên thị trường thay đổi trong khoảng

29

3.000 - 4.000 USD/tấn quế vỏ, 52.000-100.000 USD/tấn tinh dầu từ quế vỏ và 30-

35.000 USD/tấn tinh dầu từ lá quế [21].

1.4.2. Những nghiên cứu về thành phần hóa học C. cassia

Các hợp chất chính chủ yếu được chiết xuất và xác định trong vỏ quế gồm:

polyphenols và các phenol dễ bay hơi (2-hydroxycinnamaldehyde, dẫn xuất

cinnamaldehyde), flavan-3-ols [155].

Trong số các polyphenol của quế có chứa vanillic, caffeic, galic, protocatechuic,

p-coumaric và ferulic acid (Hình 1.10a) (Nabavi S.F, 2015) [136].

Vanilic acid

Galic acid

Protocatechuic acid

Caffeic acid

Ferulic acid

-coumaric acid

Hình 1.10a. Một số polyphenol trong quế Cinnamomum

Với các hợp chất dễ bay hơi, thành phần hóa học của tinh dầu phụ thuộc vào

bộ phận thực vật mà nó chiết xuất. Ở C. cassia, thành phần chính là trans-

Cinnamaldehyde (70-90%),phụ thuộc vào phương pháp chiết (chưng cất bằng hơi

nước có hàm lượng cao hơn chiết Soxhlet, ngoài ra còn có coumarin, cinnamyl acetat,

2-methoxycinamaldehyde, benzaldehyde, cinnamyl alcohol [21]. Một số thành phần

chính và phụ trong tinh dầu quế C. cassia (Hình 1.10b).

trans- Cinnamaldehyde

Coumarin

Cinnamyl acetat

30

Methoxycinamaldehyde

Benzaldehyde

Cinnamyl alcohol

Hình 1.10b. Một số thành phần chính và phụ trong tinh dầu C. cassia

Tinh dầu Quế thuộc tinh dầu phenylpropanoid (C6-C3) do cinnamaldehyde

(hay aldehyde cinnamic) là thành phần quan trọng nhất, quyết định chất lượng tinh

dầu Quế, chiếm từ 70-95% tinh dầu, tạo nên mùi hương đặc trưng của quế [13]. Ngoài

phenylpropanoid và terpen, trong tinh dầu chứa còn chứa các hợp chất dễ bay hơi

khác.

Tinh dầu từ vỏ có màu vàng nâu nhạt, sánh, vị cay, thơm ngọt, nóng, nặng hơn

nước. Tinh dầu từ lá thường có màu nâu đậm và giá trị tinh dầu thường thấp hơn so

với tinh dầu từ vỏ. Thành phần tinh dầu luôn có sự biến động về số lượng giữa các

loài trong cùng một chi, tập quán canh tác, vị trí địa lý, thời gian canh tác...

Tinh dầu cất từ vỏ và cành lá của quế đơn C. cassia có thành phần tương tự

nhau, chủ yếu là cinnamaldehyde (70-90%), ngoài ta còn có coumarin, cinnamyl

acetat, 2-methoxycinamaldehyde, benzaldehyde... với rất ít hoặc không có eugenol.

Trong khi đó, tinh dầu từ vỏ của C. zeylanicum chứa 60-80% cinnamaldehyde và sấp

xỉ 2% eugenol còn tinh dầu từ lá của loài này rất giầu eugenol (70-75%) [22].

Tinh dầu vỏ C. cassia ở Trung Quốc khá phức tạp, có gần 100 hợp chất và

hiện nay đã phát hiện được 93 hợp chất, trong đó nhiều nhất là E-cinnamaldehyde

(65.5%), các hợp chất khác có hàm lượng đáng kể lần lượt là coumarin (8.7%),

cinnamyl acetat (3.6%), methoxycinnamaldehyd (2.7%), benzaldehyde (0.9%)...

Tinh dầu vỏ Quế đơn (C. cassia) được sản xuất từ Australia thì thành phần hóa

học gồm khoảng 40 hợp chất, trong đó chủ yếu là cinnamaldehyde (87,0%), tiếp đến

là benzaldehyd (4,7%), 2-phenylethanol (2,5%), 3- phenylpropanal (2,0%), 1,8-

cineol (0,7%), 4-ethylguaiacol (0,5%), ethyl cinnamat (0,4%), cuminaldehyd (0,4%),

chavicol (0,3%) và coumarin (0,3%); các thành phần còn lại chỉ có hàm lượng không

đáng kể hoặc vết [140].

31

Ở nước ta, khi phân tích các mẫu tinh dầu quế đơn C. cassia khác nhau đã cho

thấy chúng dao động trong những giới hạn nhất. Hàm lượng E-cinnamaldehyde từ

80-95%, ngoài ra còn có các hợp chất khác như cinnamyl acetat, cinnamyl alcohol,

coumarin, benzyl benzoat (Lã Đình Mỡi, 2001) [21].

Tinh dầu lá quế đơn trồng tại Trung Quốc, Ping Li và cộng sự (2015) đã xác

định được 15 hợp chất, trong đó nhiều nhất là cinnamaldehyde (74,1%), 2-

methoxycinnamaldehyd (10,5%), cinnamyl acetat (6,6%), coumarin (1,2%),

benzaldehyd (1,1%), các hợp chất còn lại có hàm lượng không đáng kể [140].

Tinh dầu lá C. cassia sinh trưởng tại Australia, theo Ravindran (2004), ngoài

thành phần chính là cinnamaldehyde (77,2%) còn có tới trên 30 hợp chất khác, trong

đó đáng chú ý là coumarin (15,3%), benzaldehyd (1,2%), 4-ethylguaiacol (0,8%),

ethyl cinnamate (0,4%). Các thành phần còn lại thường không đáng [146].

Quế đơn đem từ Việt Nam qua trồng bên Trung Hoa có tên là C. cassia

macrophyllum: số lượng tinh dầu chiết xuất nói chung vượt hẳn quế bản xứ (%): 2,0

(so với 1,98) ở vỏ; 0.36 (so với 0.69) ở cành; 1,96 (so với 0.37) ở lá; cinnamaldehyde

sản xuất cũng lớn hơn (%): 61,20 (so với 52,92) ở vỏ; 77,34 (so với 64.75) ở lá. Người

Trung Hoa đánh giá quế ta tốt hơn quế họ để sản xuất thuốc chữa bệnh.

Tinh dầu lá quế đơn C. cassia trồng tại Yên Bái thu vào 2 vụ trong năm (tháng

5 và tháng 9), Lê Tùng Châu và cộng sự (1988) đã nhận thấy hàm lượng

cinnamaldehyde ở các mẫu thu ở tháng 5 thường rất cao (90%), còn các mẫu thu vào

tháng 9 thường thấp hơn (chỉ từ 50-80%) (Lã Đình Mỡi, 2001) [21].

Như vậy, hàm lượng E-cinnamaldehyde cũng như các thành phần khác trong

tinh dầu vỏ và tinh dầu lá quế đơn cũng luôn biến động dưới tác động của các yếu tố

di truyền, điều kiện môi trường và thời điểm thu hái.

1.4.3. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học C. cassia

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của quế in vitro và in vivo cho thấy quế

có nhiều lợi ích sức khỏe và hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chất chống oxy hóa,

chống đái tháo đường, chống khối u, hạ huyết áp, cholesterol và bảo vệ dạ dày [137]

[76]. Theo Domadia P. et al,(2007), trans-cinnamaldehyde sử dụng trong dược phẩm

32

như thuốc chống đầy hơi, cảm lạnh, chống tập kết tiểu cầu, chống gây đột biến và

diệt khuẩn. Và những sản phẩm tự nhiên này hầu như không độc hại, không gây đột

biến gene và không có chất gây ung thư (Bickers D., 2005) [53]

Hoạt tính kháng khuẩn: Tinh dầu là nguồn kháng sinh tự nhiên tiềm năng và đã

được sử dụng rất nhiều trong y học dân tộc từ lâu đời [84], [125]. Nó ức chế hoàn toàn

sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus,

Enterobacter, Helicobacter pylori, Mycobacterium smegmatis [43], [130]. Trong số

các vi khuẩn đường ruột ở người, cinnamaldehyde có hoạt tính ức chế sự phát triển

của các vi khuẩn có hại như Cl. pergringens và B. fragilis hơn là các vi khuẩn có lợi

như Bifidobacteria và L. acidophilus [114]. Huang Y.F. & cs., (2014) cho rằng

thành phần của tinh dầu có thể kết hợp với bề mặt tế bào vi sinh vật và sau đó thâm

nhập vào lớp phospholipid của màng tế bào chất và enzyme liên kết màng, cho phép

chúng tích lũy trong màng tế bào, làm biến đổi cầu trúc và làm tăng tính thấm của

màng tế bào, phá hủy các thành phần nội bào, dẫn đến sự chết của tế bào [100].

Hoạt tính kháng u: Cao chiết từ vỏ quế đã cho thấy khả năng ức chế sự gia

tăng của một số dòng thế bào ung thư ở người, bao gồm ung thư vú, ung thư gan, ung

thư bạch cầu, ung thư buồng trứng và ung thư phổi trên các nghiên cứu in vitro và in

vivo [96]. Các tác giả đã cho thấy rằng, các hợp chất này có hoạt tính chống tăng sinh,

gây apoptosis thông qua sự kích hoạt p53 và ít có tác dụng gây độc tế bào trên các tế

bào bình thường bởi rất nhiều các báo khác nhau bao gồm tế bào nguyên sợi thường

(normal fibroblasts), tế bào lympho chuột chính (primary mouse lymphocytes), MCF-

10 (dòng tế bào biểu mô vú bình thường) và tế bào nguyên sợi chuột (normal rat

fibroblasts- F2408 cells) [169]. Tác giả Huang T.C. &cs., (2007) cho thấy thành phần

cinnamaldehyde trong tinh dầu lá quế Cinnamomum osmophloeum đã tác động gây

apotosis thông qua sự phá vỡ màng ty thể, kích thích sản sinh ROS, suy giảm

glutathione và kích hoạt caspase trên dòng tế bào ung thư bạch cầu người K562 [99].

Hoạt tính chống oxy hóa. Nhiều loại gia vị trong đó Quế được biết đến có hoạt

tính chống oxy hóa mạnh. Các hợp chất phenolic trong các nguyên liệu thực vật này

có mối quan hệ mật thiết với hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Cao chiết từ vỏ C

33

zaylanicum có giá trị TEAC (107.69 mmol / 100 g) và tổng hàm lượng phenolic

(11.90 g of GAE/100g), trong đó vỏ C. cassia có giá trị TEAC (61.75 mmol /100 g)

và tổng hàm lượng phenolic (6.34galic), (Shan B., 2005) [155]. Hoạt tính chống oxy

hóa từ lá của 5 loài Cinnamomum (C. burmanni, C. cassia, C. pauciflorum, C. tamala

và C. zeylanicum) đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy C. zeylanicum cho hàm

lượng phenolic cao nhất trong khi C. burmanni có hàm lượng flavonoid cao nhất. Các

thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ethanol và chiết lỏng siêu tới hạn

sCO2 từ vỏ, chồi và lá C. cassia cho thấy cao chiết ethanol của vỏ quế có hoạt động

chống oxy hóa mạnh nhất so với các bộ phận khác (Chao L., 2008) [69].

Hoạt tính kháng viêm: Các đại thực bào có liên quan đến tình trạng viêm mãn

tính bằng cách sản xuất chất trung gian gây viêm khác nhau bao gồm các cytokine,

chemokine, interferon, các yếu tố kích thích tạo dòng (colony-stimulating factors-

CSF), lysozymes, protease, các yếu tố tăng trưởn, eicosanoids, và nitric oxide (NO).

Trong số này, Nitric oxide (NO) được tổng hợp bởi men tổng hợp NO cảm

ứng (inducible nitric oxide synthase-iNOS) tại nội mô và cơ trơn mạch máu dưới

tác dụng của các cytokine gây viêm. NO sinh ra quá mức bởi iNOS tạo ra rất nhiều

bệnh lý bao gồm hen suyễn, viêm khớp, bệnh đa xơ cứng, viêm đại tràng, bệnh vẩy

nến, rối loạn thoái hóa thần kinh, phát triển khối u và thải ghép sốc nhiễm khuẩn [66].

Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của cao chiết vỏ quế C. cassia trên tế bào

macrophage RAW 264.7 đã được Lee &cs., 2002 khảo sát [112], các nghiên cứu

tiếp theo của nhóm nghiên cứu cho thấy một số thành phần trong tinh dầu lá quế C.

cassia như Cinnamaldehyde, Cinnamyl aclcohol có khả năng ức chế sản sinh NO

trong khi rất ít hoặc không có hiệu lực ức chế được quan sát thấy ở một số thành

phần khác như Cadinene, Cinnamic acid, α-Copaene, Eugenol, Limonene [112].

1.4.4. Các phương pháp chiết xuất tinh dầu quế

Tinh dầu quế là loại tinh dầu đắt tiền trên thị trường vì khó chiết xuất so với

đa số các loại tinh dầu khác, giá nguyên liệu cao và chất lượng tinh dầu phụ thuộc

vào từng loại nguyên liệu.

Phương pháp chưng cất hơi nước: Cũng như các loại tinh dầu khác, dầu quế

34

cũng được sản xuất bằng phương pháp chưng cất hơi nước (hydrodistillation, viết tắt

là HD) [13] vì sản phẩm không lẫn tạp chất từ dung môi hữu cơ nên rất an toàn cho

sức khỏe và đủ tiêu chuẩn để xuất khẩu (Hình 1.11).

Hình 1.11. Sơ đồ chưng cất tinh dầu quế có nồi hơi riêng

Cơ sở của quá trình cất là quá trình chuyển trạng thái lỏng thành trạng thái bay

hơi và ngưng tụ trạng thái hơi thành trạng thái lỏng. Hiệu suất chưng cất bằng hơi

nước nhìn chung còn thấp: 100 kg vỏ quế thường cất được khoảng 2 lít tinh dầu; 1000

kg cành lá, ngọn quế cất được khoảng 1l tinh dầu, Hàm lượng cinnamaldehyde trong

tinh dầu thường chỉ đạt 60 - 70% [8].

Ngày nay, một số nghiên cứu nhằm cải thiện hiệu suất tinh dầu từ quế hướng

tới công nghệ chiết xuất “Xanh” nhằm tăng hiệu suất chiết, giảm lượng dung môi sử

dụng, an toàn và giảm ô nhiễm môi trường như: CO2 siêu tới hạn, vi sóng, siêu âm...

Chiết siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction - SCFE): là một công cụ đa

năng để giải quyết những bất lợi của công nghệ chiết xuất thông thường của tinh dầu

và nhựa dầu. Trong quá trình này nguyên liệu tiếp xúc với dung môi siêu tới hạn ở áp

suất tương đối cao, dao động từ 60-300 bar ở nhiệt độ 35-70°C. Chất siêu tới hạn có

thể hòa tan được chất tan giống như chất lỏng và có tính khuếch tán, xâm nhập vào

nguyên liệu dễ dàng như chất khí, do đó sự trích ly và tách pha có thể nhanh hơn. Vỏ

quế được chiết xuất với CO2 siêu tới hạn sử dụng áp suất 300, 400, 500 và 600 bar

cho năng suất khoảng 1,4% so với cất (0.5-0.8%). Tuy nhiên, quy trình SCFE không

Hơi nước

Nguyên

liệu

Dầu

Bình

ngưng

TB phân ly

35

được thực hiện cho sản xuất quế thương mại hoặc sản xuất nhựa oleoisin do quá trình

này là rất tốn kém và sản phẩm không khác biệt nhiều về chất lượng từ các sản phẩm

chiết xuất dung môi.

Phương pháp vi sóng hỗ trợ (Microway assisted hydrodistillation -MAHD):

Jeyaratnam N. et al. (2016) đã sử dụng vi sóng hỗ trợ quá trình chưng cất tinh dầu vỏ

quế (MAHD). Phổ GC-MS cho thấy phương pháp vi sóng tăng 9% các hợp chất chứa

oxy so với phương pháp thủy chưng cất (HD). Hơn nữa, MAHD tiết kiệm năng lượng

hơn, thân thiện với môi trường khi giảm phát thải CO2 tổng thể 59% so với HD. Ngoài

ra, các nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu MAHD có giá trị LC50 (51,2

mg/l) thấp hơn so với HD (68,9 mg/l) [137].

Phương pháp siêu âm: Ping Li et al (2015) đã sử dụng siêu âm để hỗ trợ quá

trình chưng cất tinh dầu vỏ quế. Quá trình siêu âm cũng có tác dụng lớn vào sản lượng

dầu. Hiệu suất tinh dầu quế có thể đạt tới 14,8034%, trong đó trans- cinnamaldehyde

là 82,62% bằng phân tích HPLC [140]. Tuy nhiên phương pháp này cũng khó áp

dụng ở qui mô công nghiệp.

Phương pháp enzyme hỗ trợ (enzyme assisted distillation- EAD) hoặc enzyme

hỗ trợ kết hợp với vi sóng (enzyme assisted microwave distillation -EAMD): đến nay

chưa được ứng dụng trong trích ly tinh dầu quế hay những cây cho tinh dầu từ thân

và vỏ thân (Long não) hay những cây cho tinh dầu từ rễ, thân rễ (Hương bài, Pơ Mu,

Thiên niên kiện,...) hay tinh dầu thuộc thành phần khó bay hơi như nhựa hay sáp

(Trầm hương)...

1.5. Tổng quan về cá ngừ

1.5.1. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm cá ngừ

Cá ngừ đại dương là loại cá lớn thuộc họ Cá bạc má (Scombridae), chủ yếu

thuộc chi (Thunnus), sinh sống ở vùng biển ấm, cách bờ độ 185 km trở ra, bao gồm

cá ngừ vây vàng Thunnus albacares, cá ngừ mắt to Thunnus obesus, cá ngừ bò

Thunnus tonggol. Một số loài nằm trong các chi khác thuộc họ Scombridae như cá

ngừ ồ Auxis rochei, cá ngừ chù Auxix thazad, cá ngừ chấm Euthynnus affinis , cá ngừ

vằn Katsuwonus pelamis... Ở nước ta, nhóm loài di cư đại dương (cá ngừ vây vàng

và cá ngừ mắt to) là những loài kích thước lớn 70-200 cm, khối lượng 1,6-64kg, còn

lại là nhóm loài có kích thước nhỏ 20-70 cm, khối lượng từ 0.5-4kg, di cư trong phạm

36

vi địa lý hẹp.

Vùng biển Việt Nam có trữ lượng cá ngừ ước tính 600 000 tấn, trong đó khả

năng cho phép khai thác cá ngừ vằn hơn 220 000 tấn/năm (theo đánh giá nguồn lợi

và trữ lượng cá ngừ ở biển Việt Nam giai đoạn 2011-2013 do Viện Nghiên cứu Hải

sản thực hiện), cá ngừ vây vàng, mắt to hơn 45 000 tấn, khả năng cho phép khai thác

từ 17000 - 22 000 tấn/năm. Từ năm 2012, nghề câu tay kết hợp với ánh sáng phát

triển, năng suất khai thác vượt trội, số lượng tăng mạnh nên năng suất đạt 16234 tấn

Năm 2011, trong khi sản lượng khai thác cá ngừ toàn cầu đạt khoảng 4,76 triệu

tấn, thì lượng sản phẩm cá ngừ đóng hộp gần 2 triệu tấn. Chất thải rắn hoặc các phụ

phẩm được thải ra từ sản xuất cá ngừ đóng hộp (bao gồm đầu, bộ xương, nội tạng,

mang, phần thịt màu sẫm, vây bụng và da) có thể chiếm khoảng 65% lượng nguyên

liệu ban đầu. Các số liệu báo cáo trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cũng cho thấy các

phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 40% tổng nguyên liệu ban đầu.

Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần của cá ngừ

Đầu (%) Xương (%) Vây, vẩy (%) Nội tạng (%) Thịt cá (%)

20 8 1 11 60

Về sản lượng khai thác cá ngừ đại dương, theo FAO tổng sản lượng khai thác

cá ngừ đại dương trên Thế Giới đã tăng lên không ngừng từ những năm 1950 và

ước đạt 393.134 tấn và năm 2010 là 4.246.558 tấn. Riêng ở Việt Nam tổng sản

lượng cá ngừ đại dương đánh bắt được đã không ngừng tăng lên từ những năm 2007

đến 2011. Theo Nguyễn Anh Tuấn và cộng sự (2011) tổng sản lượng cá trong năm

2007 đạt 19979.2 tấn và đến năm 2011 tăng lên đến 22938,1 tấn [38]. Trong khi trữ

lượng ước tính vượt trên 100.000 tấn bao gồm cả hai loài nói trên. Như vậy, theo

Bảng 1.2, mỗi năm 8000 tấn phụ phẩm cá ngừ đại dương, trong đó riêng đầu cá ngừ

đại dương 4000 tấn/năm. Đây là nguồn phụ phẩm rất có giá trị, đầu và xương cá ngừ

còn chứa rất nhiều các cơ thịt, vì vậy có thể lợi dụng quá trình thuỷ phân để tạo ra

những sản phẩm có ích như thức ăn chăn nuôi, có thể sử dụng sản phẩm thủy phân

trong việc sản xuất bột nêm gia vị, bột đạm dinh dưỡng, nước mắm… [11]. Theo

Bougatef Ali (2012), tổng axit amin thu được từ quá trình thủy phân protein đầu cá

ngừ vây xanh (Thunnus thynnus) bằng enzyme Alcalase khoảng 35%, trong đó các

axit amin thiết yếu chiếm 50,52% axit amin tổng số. Các protein thủy phân từ cá ngừ

37

có hoạt tính oxy hóa cao rất hữu ích trong thực phẩm và dinh dưỡng [57].

Đầu và bộ xương cá ngừ còn có hàm lượng canxi và photpho thích hợp để bổ

xung canxi vào thức ăn chăn nuôi hoặc bổ sung vào thực phẩm phục vụ cho con

người. Xương, bong bóng, da cá ngừ là nguyên liệu tốt dùng để sản xuất keo cá có

chất lượng cao. Gelatin trong công nghiệp thực phẩm dùng làm nguyên liệu phụ trong

sản xuất bánh điểm tâm, lạp xưởng, đồ hộp, kem cốc, chất ổn định và chất nhũ hoá

trong thực phẩm, và rất nhiều công dụng trong công nghiệp.

Ngoài ra trong phụ phẩm cá ngừ, đặc biệt là các loài cá ngừ đại dương có chứa

hàm lượng lipid cao với nhiều các axit béo không no đa nối đôi thiết yếu có giá trị [12]

[57] [138] [157]. Hàm lượng lipid trong đầu cá ngừ đại dương dao động trong khoảng

10-15% như cá ngừ vây vàng Thunnus albacares (13.5%) [138], đầu cá ngừ mắt to

Thunnus obesus (14.2%) [30], đầu cá ngừ vây xanh Thunnus thynnus (10.4%) [57]. So

với các phế liệu đầu cá ngừ kích thước nhỏ như cá ngừ sọc dưa Sarda orientalis

(8.02%), cá ngừ chấm Euthynnus affinis (5.5%) [30] và một số phế liệu đầu cá hồi

(3.57%), đầu cá basa (3,41%), đầu cá tra (3.15%) [17], cho thấy phụ phẩm đầu cá ngừ

là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất dầu cá và các sản phẩm giàu các axit béo

không đo đa nối đôi n-3 PUFA phục vụ trong công nghiệp thực phẩm và y dược.

1.5.2. Dầu cá và các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA

Lipid (chất béo, dầu cá) trong cá chủ yếu là các triglycerid, do các axit béo bậc

cao kết hợp với glycerin. Ngoài ra, còn có thành phần không phải là glycein gọi là

chất không xà phòng. Ở nhiệt độ thường, phần lớn chất béo bày ở thể lỏng nên còn

gọi là dầu cá [16].

Axit béo không no đa nối đôi PUFA có vai trò quan trọng trong các lĩnh vực y,

dược và công nghiệp thực phẩm. Đây là những axit béo thiết yếu (essential fatty acid),

không tự sinh tổng hợp được trong cơ thể người mà phải bổ sung qua con đường thức ăn.

Nếu thiếu hụt các axit béo này thì sẽ gây ra mất cân bằng, làm rối loạn hệ thống miễn dịch

và chống viêm của cơ thể, dẫn đến hàng loạt bệnh tật phát sinh.

Các axit béo đa nối đôi mạch siêu dài nhóm omega-3 tiêu biểu được đưa ra

làm đại diện gồm có Alpha linoleic acid (ALA C18:3n-3 ), Eicosapentaenoic axit

(EPA C20:5 n-3), Docosahexaenoic axit (DHA C22:6 n-3). Ngoài ra, còn một thành

38

phần trung gian của hai axit béo này là Docosapentaenoic axit (DPA C22:5 n-3). Các

axit này có đặc thù riêng, sản phẩm chứa đồng thời cả ba loại axit béo này với hàm

lượng lớn thường rất hiếm gặp, chủ yếu chúng có nguồn gốc từ vi tảo hoặc một số

loài sinh vật biển đầu chuỗi thức ăn.

Alpha linolenic acid (C18:3 n-3)

Eicosapentaenoic acid (C20:5 n-3)

Docosapentaenoic acid (C22:5 n-3)

Docosahexaenoic acid (C22:6 n-3)

Hình 1.12. Cấu trúc của một số acid béo nhóm n-3 PUFA

Alpha linoleic acid (ALA) được tạo thành từ quá trình khử no của linoleic acid

dười tác dụng của enzyme 15-desaturase. Con người không tự tổng hợp được acid

này trong cơ thể do không có 15-desaturase, vì vậy chúng phải cung cấp qua chế độ

ăn. ALA ở dạng ester glycerol trong một số loài thực vật như dầu lanh, dầu tía tô, dầu

hạt cải và dầu đậu tương.

Trong cơ thể Eicosapentaenoic acid (EPA) được xem là axit béo thiết yếu sẽ

chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng như prostaglandin, leucotrien… Loại

prostaglandin này có tác dụng ức chế sự đông vón tiểu cầu, giảm và phòng ngừa hình

thành huyết khối, đồng thời có thể giảm bớt lượng cholesterol, giảm bớt triglyceride

trong máu làm giảm độ nhớt dính của máu, giữ cho tuần hoàn được thông thoáng.

EPA còn tác dụng làm giảm tình trạng xơ vữa động mạch. Vì vậy EPA có tác dụng

tốt đối với việc phòng ngừa và chữa trị các bệnh tim mạch do xơ vữa mạch Akoh C,

2008, [41] [Chow Ching K. 2008, [74].

Docosahexaenoic acid (DHA) là thành phần quan trọng của phospholipid

màng tế bào, đặc biệt là não bộ, võng mạc. Thành phần của não là chất béo và DHA

chiếm khoảng 1/4 lượng chất béo này. Chúng cần thiết cho sự phát triển hoàn thiện

39

chức năng nhìn của mắt và sự phát triển hoàn hảo của hệ thần kinh, não bộ ở giai

đoạn đầu đời. Với người lớn, DHA có tác dụng bảo vệ tim mạch do làm giảm

Cholesterol và Triglycerid máu. DHA liều cao còn có khả năng ức chế và tiêu diệt tế

bào ung thư trên thực nghiệm [Đặng Diễm Hồng, 2016] [9] [Akoh C.C et al., 2008]

[41], [Makrides M. et al., 2010] [127].

Docosapentaenoic acid (DPA) chứa hai chất đồng phân, cụ thể là DPAn-3 và

DPAn-6, trong đó có mặt chủ yếu trong sinh vật biển. DPAn-3 được tìm thấy chủ yếu

trong dầu cá và dầu hải cẩu, trong khi một số loại dầu vi tảo chứa đáng kể lượng

DPAn-6 [107]. DPA đồng phân là trung gian của sự trao đổi chất và sinh tổng hợp

các PUFA. Các nghiên cứu cho rằng, tỷ lệ DPA và DHA làm giảm đáng kể nguy cơ

biến tính mạch vành cấp tính, trong khi đó không có mối liên quan giữa tỷ lệ của EPA

và nguy cơ biến cố mạch vành cấp. DPA có thể hiệu quả hơn EPA hoặc DHA trong

một số ứng dụng trị liệu, chẳng hạn như giữ thành động mạch mềm và mảng bám tự

do và giúp đỡ để chữa lành các mạch máu bị hư hỏng.

Lipid (dầu) cá ngừ chứa hàm lượng cao các axit béo không no đa nối đôi n-3

PUFA (khoảng 6% EPA, 25% DHA và khoảng 3% đồng phân DPA [96], cao hơn

các dầu cá khác. Linder et al., (2005) công bố trong dầu cá ngừ chứa 5,1% EPA,

18,8% DHA và nhiều axit béo không no khác rất có lợi cho sức khỏe con người. Dầu

mắt cá ngừ chứa hàm lượng lipid tổng là 22,4%, trong đó chủ yếu là axit béo không

no (PUFA) không có khả năng sinh cholesterol.

EPA và DHA có lẽ là các axit béo thương mại thành công nhất có nguồn gốc

từ dầu cá. Mặc dù bắt đầu phát triển khá chậm từ năm 2000, thị trường omega-3 hiện

nay đã có những tăng trưởng rất đáng kể. Theo một số nghiên cứu thị trường, trong

năm 2010 nhu cầu toàn cầu cho các thành phần của omega-3 là khoảng 1,595 tỷ USD

[38].

1.5.3. Các phương pháp chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo không no

Phương pháp chiết xuất lipid tổng

Chiết lipid tổng là một trong những bước quan trọng nhất trong toàn bộ qui

trình bởi hàm lượng lipid tổng ban đầu và thành phần các hoạt chất trong lipid tổng

sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất qui trình.

Trong nghiên cứu, chiết xuất lipid từ sinh vật biển có những đặc trưng riêng

40

biệt so với các sinh vật trên cạn do trong cơ thể sinh vật biển chứa hàm lượng nước

cao (>70%) và có nhiều muối khoáng. Mặt khác, lipid từ sinh vật biển có nhiều axit

béo không no đa nối đôi nên phương pháp đồi hỏi phải xử lý mẫu một cách thận trọng

để giảm sự oxy hóa tới mức tối thiểu [a10]. Tuy không tan trong nước mà chỉ tan

trong dung môi hữu cơ nhưng lipid tổng vẫn khó chiết vì một số dung môi không hòa

tan được các lipid phân cực (chủ yếu là phospholipid). Chính vì vậy, phương pháp

chiết và tinh chế lipid phải đáp ứng các điều kiện nhanh và hiệu quả.

Rất nhiều qui trình chiết xuất lipid nhưng qui trình của Blight & Dyer (1959),

hỗn hợp CHCl3 và CH3OH được sử dụng rộng rãi như các dung môi chiết lipid và

quan sát giản đồ CHCl3-CH3OH-H2O kéo theo những giả thiết việc chiết lipid thuận

lợi nhất đem lại hiệu quả cao. Phương pháp Blight & Dyer nổi trội hơn các phương

pháp chiết khác là thực hiện trong thời gian ngắn, hiệu suất cao, có thể tái sử dụng

dung môi và tránh được các thao tác có hại.đã được áp dụng cho nghiên cứu, sàng

lọc, khảo sát lipid và axit béo trên đối tượng sinh vật biển. Tuy nhiên, nếu triển khai

ở qui mô công nghiệp, tồn dư dung môi trong sản phẩm cần quan tâm.

Chiết xuất lipid bằng phương pháp ép nhiệt có tính an toàn vì không phải sử

dụng các dung môi hữu cơ ảnh hưởng có hại cho sức khỏe con người, tuy nhiên hiệu

suất chiết xuất lipid thấp hơn phương pháp dung môi do còn dư lại một lượng lớn

lipid còn lại trong nguyên liệu. Phương pháp ly tâm được sử dụng kết hợp đã cải thiện

được hiệu quả chiết. Tuy nhiên, phương pháp này phù hợp với nguyên liệu là hạt

chứa dầu hoặc nội quan sinh vật biển có chứa hàm lượng dầu cao trong nguyên liệu,

đồng thời nhiệt độ cao làm bất hoạt các enzyme thủy phân có trong nguyên liệu, làm

giảm tác động của enzyme lên lipid chiết xuất được.

Tao và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tách chiết dầu từ mắt cá ngừ vây vàng bằng

phương pháp tách chiết siêu tới hạn. Kết quả cho thấy dầu cá thô thu được có chỉ số

peroxyt là 2,33 mg/kg, chỉ số iot là 192,19% và chất không xà phòng hóa là 0,77%.

Ngày nay, phương pháp chiết xuất lipid dưới tác dụng của enzyme protease

đang được áp dụng nhiều trên nhiều đối tượng sinh vật biển và các hạt có dầu. Các

enzyme protease thủy phân protein màng tế bào hay màng bào quan thành các peptide

nhỏ hơn và các amino axit, thúc đẩy quá trình giải phóng dầu. Ưu điểm chính đối với

phương pháp tách chiết dầu bằng enzyme là nó có thể được tiến hành dưới các điều

41

kiện nhẹ nhàng như: nhiệt độ thấp (< 60oC) nên hạn chế đến mức tối thiểu sự oxy hóa

các axit béo không bão hòa đa nối đôi (PUFA), không sử dụng dung môi hữu cơ và

quá trình thủy phân tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn (Mbatia, 2011) [128].

Phương pháp làm giàu axit béo không no đa nối đôi PUFA

Phương pháp hóa học là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay,

lipid tổng được thủy phân bởi tác nhân kiềm hoặc axit tạo thành các axit béo tự do.

Sau đó, hỗn hợp aixt béo PUFA được tách khỏi hỗn hợp khi cho kết tinh với ure trong

etanol. Việc phát hiện khả năng tạo phức kết tinh với ure các hợp chất hydrocarbon

mạch thẳng trong dung môi etanol hoặc metanol được thực hiện bởi Bengen F. và các

cộng sự (1940) như một cuộc cách mạng trong công nghiệp hóa dầu. Kỹ thuật này rất

hiệu quả trong việc làm sạch các axit béo không no đa nối đôi từ lipid tổng. Tuy

nhiên, quá trình thủy phân lipid bằng kiềm hoặc axit thành các axit béo tự do ở nhiệt

độ 70-80oC trong thời gian dài đã làm đổi màu lipid tổng, đồng thời tiêu tốn lượng

lớn kiềm và nước thải ra môi trường sau thủy phân, gây ô nhiễm môi trường sinh thái.

Tách trên cột Silica gel, tráng bạc AgNO3, phù hợp trên quy mô nghiên cứu

lượng nhỏ cho phân tích thí nghiệm, tuy nhiên trong triển khai với quy mô lớn cho

ứng dụng sản xuất thì không phù hợp vì AgNO3 có giá thành rất cao.

Dùng Sắc kí lỏng cao áp pha đảo C18, tuy nhiên phương pháp này sẽ tốn lượng

lớn dung môi tinh khiết, làm cho chi phí lớn dẫn tới giá thành sản phẩm sẽ cao.

Sử dụng hệ enzyme đặc hiệu Lipase để thủy phân lipid thành các axit béo tự

do. Phương pháp này đã được Gloria &cs., 2010 sử dụng để làm tăng hàm lượng

omega 3 axit (EPA và DHA) từ dầu cá hồi bằng enzyme lipase cố định. Một số nghiên

cứu khác nhờ sử dụng hệ enzyme lipase cũng đã được trình bày bởi Fernandez-

Lafuente R &cs., (1998), Godoy CA &cs., (2010)... Ưu điểm của phương pháp sử

dụng enzyme là hạn chế được việc sử dụng dung môi, hóa chất, ít gây độc hại. Sự kết

hợp phương pháp thủy phân lipase với phương pháp kết tinh ure trong làm giàu các

axit béo không no PUFA cũng đã được đề cập bởi một số tác giả. Nghiên cứu cho

thấy sự kết hợp của phương pháp thủy phân bằng enzyme kết hợp với quá trình tạo

phức với ure là một phương pháp hứa hẹn để thu được các axit béo chưa bão hòa

omega-3 nồng độ cao.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

42

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Mẫu nguyên liệu

- Cành lá quế và vỏ quế Cinnamomum cassia

Hình 2.1. Mẫu cành lá quế C. cassia Hình 2.2. Mẫu vỏ quế C. cassia

Mẫu cành lá quế (Hình 2.1), vỏ quế (Hình 2.2) thu hái ở xã Tân Đồng, huyện

Trấn Yên, tỉnh Yên Bái. Mẫu được thu ở cây có độ tuổi 12 năm trồng và được thu hái

vào 3/2015. Các mẫu nghiên cứu được PGS. TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật định danh là loài Cinnamomum cassia (L.) J.Presl thuộc họ

Lauraceae. Nguyên liệu được hong khô trong bóng râm, xay nghiền thành bột, kích

thước 1 - 1,5 mm và đóng gói trong túi ni lông hút chân không, bảo quản ở nơi kín

gió, tránh ánh sáng trực tiếp cho đến khi sử dụng.

- Bột gỗ gió bầu Aquilaria crassna

Hình 2.3. Bột gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna

43

Bột của gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna trồng ở Phú Quốc. Mẫu được cung

cấp bởi kỹ sư lâm nghiệp Nguyễn Thoan, giám đốc công ty TNHH Lâm Viên, Xuân

Đỉnh, Bắc Từ liêm, Hà Nội.

- Phụ phẩm đầu cá ngừ

Hình 2.4. Mẫu đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares

08 mẫu đầu cá ngừ (đã bỏ mắt và mang) của 08 loài cá ngừ có các kích cỡ

khác nhau được cung cấp bởi các công ty chế biến thủy hải sản tại thành phố Nha

Trang, tỉnh Khánh Hòa và thành phố Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên. Đầu cá ngừ vây vàng

được cung cấp bởi công ty TNHH JK FISH Nha Trang, Khánh Hòa. Các mẫu nguyên

liệu được cấp đông ở -18oC trước khi chuyển về cơ sở nghiên cứu. Nguyên liệu được

đánh số ký hiệu, bảo quản ở -4oC tại tủ đông của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển

các SPTN, Viện Hóa học các HCTN.

2.1.2. Enzyme sử dụng trong nghiên cứu

+ Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-Đan Mạch) là hỗn hợp đa enzyme bao

gồm cellulase và xylanase, phổ cơ chất rộng. Enzyme hoạt động ở nhiệt độ 40 - 600C

(tối ưu 500C), pH 4,5 - 6,0 (tối ưu 5,5). Hoạt tính xác định được: cellulase 2800 UI/g

theo phương pháp của Wood, (1987) [171], xylanase 1500 UI/g theo phương pháp

của Bailey, (1992) [48].

+ Enzyme laccase là enzyme thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Ganoderma

lucidum. Chủng giống Ganoderma lucidum được cung cấp bởi Viện Di truyền nông

nghiệp, cấy truyền và giữ giống ở 40C trên môi trường thạch PDA. Môi trường lên men

bao gồm 50% PDA lỏng, 10 g glucose, 2 g MgSO4·7H2O and 3 g KH2PO4. Bổ sung

44

0,05% chất cảm ứng ABTS (2,2'-di--azino 3-ethyl-benzothiazolin-sulphonate). Hoạt

tính xác định được là 178 UI/ml theo phương pháp của Ding et al. (2012) [77].

+ Nhóm enzyme protease từ vi sinh vật sử dụng hai enzyme Protamex và

Alcalase mua của hãng Novozyme Đan Mạch; Protamex được sản xuất nhờ quá trình

lên men chìm chủng Bacillus amyloliquefaciens thường được dùng để phá vỡ liên kết

peptide. Đây là một protease trung tính hoạt động tối ưu trong khoảng pH 5,5 - 7,5;

nhiệt độ tối ưu: 45 - 550C. Hoạt tính Protamex theo khuyến cáo của nhà sản xuất là

1,5 AU/g. Alcalase là enzyme protease kiềm được sản xuất từ Bacillus licheniformis.

Alcalase có tính đặc hiệu cơ chất rất rộng, hoạt động giữa pH 7,5 và 9,0, tối ưu ở 8,5;

nhiệt độ hoạt động tối ưu 45 và 650C với hoạt tính mạnh nhất vào khoảng 550C. Hoạt

tính Alcalase theo khuyến cáo của nhà sản xuất là 1.5 AU/ml.

+ Nhóm enzyme Protease từ thực vật sử dụng hai enzyme Bromelain và

Papain, là enzyme trong nước, cung cấp bởi công ty Biogreen. Hoạt tính khuyến cáo

của nhà sản xuất là 2000 UI/mg.

+ Enzyme Lipase CRL của Novozyme được sản xuất từ quá trình lên men của

nấm men Candida rugosa, là hỗn hợp đa enzyme với 5 loại isoenzyme (chủ yếu là

hydrolase và esterase), khả năng thủy phân ngẫu nhiên liên kết ester của glycerol và

axit béo và hoạt tính theo khuyến cáo của nhà sản xuất > 2000 UI/mg. Hoạt động ở

pH 6 - 8 (tối ưu pH 7,0), nhiệt độ 30 - 40°C (tối ưu 35°C).

2.1.3. Bộ chủng vi sinh vật kiểm định

Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa

(ATCC 25923; Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis ATCC 11774, Staphylococcus

aureus subsp. aureus ATCC 11632; Nấm sợi: Aspergillus niger 439, Fusarium

oxysporum M42; Nấm men: Candida albicans ATCC 7754, Saccharomyces

cerevisiae SH 20.

Môi trường duy trì và bảo tồn giống nuôi cấy vi sinh vật kiểm định: Saboraud

Dextrose Broth (Sigma-Aldrich, Mỹ) cho nấm men và nấm sợi. Trypcase Soya Broth

(Sigma-Aldrich, Mỹ) cho vi khuẩn Gram (-) và Gram (+).

Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn và Mycophil

45

(Difco, Mỹ) cho nấm.

Các chủng VSV kiểm định đang được lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm,

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.1.4. Dòng tế bào

- Đại thực bào macrophage RAW 264.7 do GS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học

Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp, đang được lưu

giữ tại phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam. Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường

DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0

mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO). Tế

bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều

kiện 37oC, 5% CO2.

- 03 dòng tế bào ung thư bao gồm dòng Hep-G2 (Human hepatocellular

carcinoma - Ung thư gan), dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma - Ung thư biểu

mô phổi) và dòng RD (Human rhabdomyosarcoma - Ung thư mô liên kết). Các dòng

tế bào ung thư đang được lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các

hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Hóa chất

+ Các loại dung môi: ethanol (99,5 %), methanol (99,5 %), axeton (99%).

+ Các thuốc thử: DNS (Signa), ABTS, Congo red.

+ Các hóa chất phân tích: bản mỏng Silica gel 60 F254 của Merck, NaOH,

Na2SO4, HCl, KOH, Ure, CMC, xylan từ gỗ mềm (Sigma), xylose, glucose, Casein

sodium caseinat (Sigma), Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc).

+ Dung dịch thuốc thử định tính enzyme: Congo đỏ, Thuốc thử Lugon

+ Lipopolysaccharides (LPS) từ E. coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum

(FBS) của hãng Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite,

sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide

46

(DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

+ Các dung dịch đệm

+ Một số hóa chất khác

2.2.2. Thiết bị

Thiết bị chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu: thiết bị chưng cất tinh dầu quy mô

100 g nguyên liệu/mẻ và 500 g nguyên liệu/mẻ, thiết bị cô quay chân không Buchi

(Thụy sỹ), thiết bị sắc ký khí GC-MS6890N Aligent Technologies (Mỹ), máy ly tâm

Universal 32, tủ sấy tự động khống chế nhiệt độ KOTTERMANN (Đức), Tủ lạnh, Tủ

lạnh đông Alaska (Việt Nam), máy xay, máy khuấy, bể ổn nhiệt (Memmert), máy so

màu UV-VIS Double Beam, Model UVD-3200 Labomed, máy khuấy, máy khuấy từ

gia nhiệt, pH meter (713- pH Meter Metrohm)....

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Các phương pháp phân tích hóa sinh

2.3.1.1. Một số phương pháp phân tích trên mẫu thực vật

- Phương pháp xác định hàm ẩm được theo TCVN 1867:2001.

- Phương pháp xác định hàm lượng cellulose theo phương pháp Kurshner [5].

- Phương pháp xác định hàm lượng hemicellulose theo phương pháp Bromua-

Bromat biến tính (Tương ứng với tiêu chuẩn TAPPI T223) [5].

- Phương pháp xác định hàm lượng lignin Klason xác định theo phương pháp

biến tính Komarov [5].

- Phương pháp xác định hàm lượng chất trích ly trong cồn [5].

- Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam IV [2].

2.3.1.2. Một số phương pháp phân tích trên mẫu cá ngừ

- Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng theo Blight & Dyer [56].

- Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng theo Kjeldahl TCVN

4328:2001.

- Phương pháp xác định hàm lượng tro theo TCVN 5253-1990.

- Phương pháp xác định chỉ số axit theo TCVN 6127:1996.

- Phương pháp xác định chỉ số xà phòng hóa theo TCVN 6126: 2007.

- Phương pháp xác định chỉ số peroxit theo TCVN 6121 : 2010.

2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học

47

2.3.2.1. Phương pháp xác định thành phần tinh dầu bằng GC-MS

Thành phần hóa học của tinh dầu quế được xác định trên máy sắc ký khí Agilent

HP mode 7890A gas chromatograph trang bị cột tách mao quản (60 m x 0.25 mm x

0.25 µm) Hewlett Packard HP5-MS (5% phenyl methyl siloxane), kết nối với máy đo

phổ khối Agilent 5975C mass spectrometer. Các điều kiện phân tích sắc ký bao gồm:

nhiệt độ injector và detector là 250oC; chương trình nhiệt độ từ 60 đến 240°C (tốc độ

4°C/phút); khí mang là He (lưu lượng 1.0 ml/phút); lượng mẫu đo là 1 µl; tỉ lệ chia

dòng là 100:1. Máy đo phổ khối chạy ở chế độ EI-MS, năng lượng ion hóa là 70 eV. Các

chất được nhận dạng bằng cách so sánh phổ khối lượng và chỉ số thời gian lưu của chúng

với các dữ liệu có trong các ngân hàng dữ liệu GC-MS bao gồm NIST 08, Wiley 09 và

HPCH1607. Phần mềm xử lý số liệu phổ Mass Finder 4.0.

Thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương cũng được xác định trên máy

sắc ký khí Agilent HP mode 7890A gas chromatograph tương tự như tinh dầu quế

nhưng có sự khác biệt là trang bị cột tách mao quản (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

Hewlett Packard DB- XLB kết nối với máy đo phổ khối Agilent 5975C mass

spectrometer và chương trình chạy sắc ký nhiệt độ từ 40oC (tăng 20o/phút), giữ ở

140oC (trong 5 phút), tiếp tục tăng lên 2700C (tốc độ 4°C/phút).

2.3.2.2. Phương pháp xác định thành phần axit béo

Mẫu được đo trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của

hãng Agilent Technologies HP 6890N trang bị cột mao quản DB‐ Wax (60 m × 0,25

mm, 0,25 µm) và DB‐ 23 (60 m × 0,25 mm, 0,25 µm). Agilent Technologies HP

6890N ghép nối với khối phổ Agilent 5973 Network Mass Selective Detector. Chạy

theo chương trình nhiệt độ: 140oC/5 phút, 165oC/10 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên

190oC (tốc độ 5oC/phút) và giữ ở 190oC/55 phút. Tăng nhiệt độ lên 280oC, nhiệt độ

nguồn ion 210oC, khí mang He, tốc độ dòng 1,5ml/phút. Tỷ lệ chia dòng 30:1. Máy

đo phổ khối chạy ở chế độ EI-MS, năng lượng ion hóa là 70 eV.

Các axit béo được nhận dạng bằng cách so sánh phổ khối lượng và chỉ số thời

gian lưu của chúng với các dữ liệu có trong các ngân hàng dữ liệu GC-MS bao gồm

NIST 08, FAME DB23.L Wiley 09 và HPCH1607. Phần mềm xử lý số liệu phổ Mass

Finder 4.0.

2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

48

2.3.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase

Hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy được định lượng bằng phương pháp

carboxymethy cellulase (CMC) theo Wood, (1987) [171].

Cụ thể: 0,9 ml CMC 1% trong 0,2M đệm acetate (pH 5,0) để ở 50°C trong 20

phút ở bể ổn nhiệt. 0,1 ml dịch enzyme đã được hòa loãng các cấp độ khác nhau được

bổ sung vào hỗ hợp phản ứng và ủ ở 50oC trong bể ổn nhiệt trong 20 phút. Mẫu trắng

không chứa enzyme cũng được làm tương tự. Hàm lượng đường khử được sản sinh

trong quá trình phản ứng được xác định bằng thuốc thử DNS (Miller, 1959) ở bước

sóng 540 nm trong máy so màu (ELICO- SL 164). Một đơn vị hoạt tính enzyme

cellulase được xác định bằng lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmole đường

glucose trong mỗi phút

CMCase = (TN- Mkt)/20

Trong đó: + TN: Nồng độ đường glucose trong mẫu thí nghiệm (µmole)

+ Mkt: Nồng độ đường glucose trong mẫu đối chứng (µmole)

+ 20: Thời gian phản ứng (phút)

2.3.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase (Bailey, 1992) [48]

Cơ chất: Xylan 1% trong đệm Na-citrat 0.05 M (pH 5.3). Đồng nhất 1 g xylan

trong 80 ml đệm ở 60oC trên bếp khuấy từ gia nhiệt đến khi đồng nhất. Dừng gia

nhiệt, tiếp tục khuấy trong điều kiện mát qua đêm. Bổ sung đệm định mức đến 100

ml.

Phản ứng gồm 0,9 ml cơ chất xylan 1% trong đệm Na-citrat 0,05 M để ở nhiệt

độ 50oC ở bể ổn nhiệt, thêm 100 μl dịch enzyme đã hòa loãng ở cấp độ khác nhau

được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng và ủ ở 50oC trong 5 phút (300 s). Mẫu trắng

không chứa enzyme cũng được làm tương tự. Hàm lượng đường khử được giải phóng

trong quá trình phản ứng được xác định bằng thuốc thử DNS (Miler, 1959) ở bước

sóng 540 nm trong máy so màu (ELICO - SL 164). Một đơn vị hoạt tính enzyme

xylanase được xác định bằng lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmole đường

xylose trong mỗi phút ở điều kiện phản ứng.

Xylanase (UI/ml) = (MTN - Mkt)/20

49

Trong đó: + MTN: Nồng độ mol đường xylose trong mẫu thí nghiệm (µmole)

+ MKT: Nồng độ mol đường xylose trong mẫu đối chứng (µmole)

+ 20: Thời gian phản ứng (phút)

2.3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme Laccase (Ding, 2012) [77]

Dung dịch phản ứng enzyme gồm: 850 µl dung dịch đệm sodium acetate 0,1

M pH 5, 100 µl ABTS 1 mM. Ủ hỗn hợp này ở 27oC trong 10 phút. Bổ sung 50 µl

enzyme. Trộn đều hỗn hợp phản ứng so sánh với mẫu kiểm chứng sau mỗi phút phản

ứng. Phản ứng kiểm chứng sử dụng nước khử ion thay cho enzyme. Một đơn vị hoạt

độ laccase là lượng enzyme cần thiết để xúc tác oxy hóa 1µmol ABTS trong 1 phút

ở 27oC trong dung dịch đệm sodium acetate pH 5.

Hoạt tính laccase được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS (2,2- azino-bis 3-

ethylbenzothi azoline - 6- sulfonic acid) thành hợp chất được hấp thụ ánh sáng mạnh

tại bước sóng 420 nm. Hỗn hợp phản ứng gồm 800 µl đệm acetate 0.5M, pH 5,0; 100

µl ABTS 5mM, 100 µl dịch enzyme. Phản ứng được ủ trong 10 phút ở 40oC. TCA

50% (v/v) được sử dụng làm chất ngừng phản ứng.

Laccase (U/ml) = [A*(106/e420*d)* V/v*F]/t

Trong đó: - A: sự chênh lện giá trị hấp thụ ánh sáng ở 420 nm

- 106/e420*d: sự chuyển đổi sang µmol cơ chất/ ml (εATBS, 420

nm = 3600 M-1)

- d: chiều dài đường sáng đi qua dung dịch theo mm (10mm)

- V: tổng thể tích (1000 µl)

- v: thể tích mẫu (100 µl)

- v/v: độ pha loãng của mẫu thí nghiệm (11)

- F: độ pha loãng ban đầu

- t: thời gian phản ứng (10 phút)

2.3.4. Các phương pháp thủy phân

2.3.4.1. Phương pháp thủy phân với dung môi là nước (áp dụng cho enzyme

cellulase, hemicellulase, protease...)

Nguyên liệu sau sơ chế được bổ sung nước theo tỷ lệ nhất định. Quá trình thủy

phân diễn ra trong bể ổn nhiệt có khuấy cơ học bằng khuấy từ có điều nhiệt. Khi nhiệt

độ trong bình thủy phân phù hợp với nhiệt độ từng enzyme hoạt động thì bổ sung

50

enzyme với tỷ lệ thích hợp. Thời gian thủy phân được tính tại thời điểm bổ sung

enzyme. Sau thủy phân, hỗn hợp thủy phân được gia nhiệt đến 80oC để bất hoạt

enzyme kết thúc quá trình thủy phân.

2.3.4.2. Phương pháp thủy phân trong hệ dung môi hai pha (áp dụng cho

enzyme lipase) theo Fernádez Lorente G. và cs. (2011) [88]

Phản ứng thủy phân được thực hiện trong hệ dung môi hai pha với tỷ lệ pha

nước - pha hữu cơ 1:1 (v/v), tỉ lệ dầu - dung môi 3:7 (w/v). Pha nước chuẩn bị với

đệm ở các dải pH từ 5 - 9. Phản ứng được ủ ở dải nhiệt độ 20 – 50oC và luôn được

khuấy trộn (500 vòng/phút) để đạt được sự phân tán đồng nhất của các pha. Ở các

khoảng thời gian xác định (0 h, 2 h, 4 h ...) mẫu được tách ra bằng ly tâm. Theo

Fernádez Lorente G (2010), 95% axit béo tự do có mặt trong pha dung môi. Vì vậy,

chỉ số axit được xác định sau khi loại toàn bộ dung môi [32].

- Chỉ số axit: Chỉ số axit của dầu cá trước và sau thủy phân được xác định là

số mg KOH cần dùng để trung hòa hết acid béo tự do có trong 1 g chất béo [22].

- Chỉ số xà phòng hóa là số mg KOH dùng để trung hòa hết glycerid và axit

béo tự do có trong 1 g chất béo [22].

Hiệu suất thủy phân =

Chỉ số axit (dầu thủy phân) - Chỉ số axit (dầu chưa thủy phân)

x 100% Chỉ số xà phòng hóa - Chỉ số axit (dầu chưa thủy phân)

2.3.5. Các phương pháp xác định sản phẩm thủy phân

2.3.5.1. Định lượng đường khử bằng DNS (theo Miller, 1959) [129]

Nguyên lý: Dựa trên khả năng hydro hóa cơ chất CMC của enzyme Cellulase

để biến đổi thành đường Glucose. Glucose phản ứng tạo màu với thuốc thử DNS.

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường Glucose trong

một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng phương pháp

đo quang ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của Glucose tinh khiết

với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường sinh ra trong mẫu thí

nghiệm.

51

Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp DNS

2.3.5.2. Định lượng protein- axit amin bằng Coomasssie Brilliant Blue G-250

(theo Bradford, 2009) [59]

Phương pháp Bradford là phương pháp dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi

Coomasssie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein (màu xanh) trong dung dịch

axit. G250 liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với các nhóm kỵ nước và các

nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Các protein khi phản ứng xanh

Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

590 nm, G250 thường được sử dụng để nhuộm đối với những protein có trọng lượng

phân tử polypeptid thấp [22].

Hình 2.6. Đồ thị đường chuẩn protein

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 10 20 30 40 50 60 70

OD

54

0 n

m

Glucose (µg/ml)

y = 1.19x + 0.1996

R2 = 0.9826

y = 0.0149x + 0.0348

R² = 0.9805

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 10 20 30 40 50 60 70

OD

59

5n

m

Nồng độ BSA (µg/ml)

52

2.3.6. Phương pháp làm giàu các axit béo bằng kết tinh ure [11]

Hỗn hợp axit béo FFA được hòa tan dung môi theo tỷ lệ nhất định ure - cồn

3:16, FFA/ure = 1:3. Sau đó, dung dịch thu được để kết tinh ở nhiệt độ 4oC trong thời

gian là 18 - 20 giờ. Sau quá trình kết tinh, hỗn hợp pha rắn và pha lỏng được lọc qua

giấy lọc tại nhiệt độ kết tinh, rửa lại bằng dung môi có nhiệt độ kết tinh, sau đó tách

pha rắn và pha lỏng. Khối lượng hai pha thu được xác định sau khi làm bay hơi dung

môi. Thành phần axit béo của pha lỏng được phân tích trên máy GC-MS.

2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân

2.3.7.1. Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phần mềm Exel

Quá trình thủy phân được khảo sát một số các yếu tố ảnh hưởng theo phương

pháp tối ưu một yếu tố, giữ nguyên các thông số, chỉ thay đổi 1 thông số. Từ đó, đánh

giá hiệu quả của quá trình thủy phân. Số liệu được xử lý bằng chương trình phần mềm

Microsoft excel.

2.3.7.2. Xử lý số liệu thực nghiệm bằng phương pháp bình phương tối thiểu [7]

Phương pháp tối ưu hóa để lựa chọn một đường khớp nhất cho một dải dữ liệu

ứng với cực trị của tổng các sai số thống kê giữa đường khớp và dữ liệu.

2.3.7.3. Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm [7]

Số thực nghiệm để tìm mô hình hóa thực nghiệm bậc 2 tâm trực giao Box-

Wilson được tính toán theo công thức:

N = 2n ± 2n + No

Trong đó: 2n: số thực nghiệm điểm sao

No: số thực nghiệm ở điểm tâm, thường lấy N0 = 1

Các bước tiến hành qui hoạch hóa thực nghiệm bậc 2 tâm trực giao:

- Xác định và mã hóa các điều kiện tối ưu thực nghiệm (pH, nhiệt độ, tỷ lệ

E/S, thời gian ...).

- Lập ma trận thực nghiệm mã hóa của mô hình thực nghiệm bậc 2 tâm trực giao.

- Tính hệ số hồi qui của phương trình hồi qui bậc 2 tâm trực giao.

- Đánh giá tính có ý nghĩa của hệ số hồi qui.

- Đánh giá tính phù hợp của mô hình theo phương trình hồi qui bậc 2 tâm trực

giao.

53

2.3.8. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định: theo phương pháp

mô tả bởi Vanden Berghe & Vlietinck (1991) [170].

- Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity): theo phương

pháp của Likhitayawuid và cộng sự [119] đang triển khai tại Viện nghiên cứu ung

thư Quốc gia Mỹ (NCI).

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm: thông qua khả năng ức chế sản

sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 theo phương pháp của Lee et al., (2009)

[112].

- Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa: được xác định bằng thử

nghiệm trên hệ DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), dựa trên nguyên tắc DPPH có

khả năng tạo ra các gốc tự do bên trong dung dịch ethanol bão hòa theo phương pháp

Blois M S. (1958) [60].

54

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu

từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia

Quá trình nghiên cứu chiết xuất tinh dầu quế có enzyme hỗ trợ được thực

hiên theo sơ đồ sau:

Hình 3.1. Qui trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất tinh dầu

Laccase

Htec 2

Nguyên liệu cành lá quế, vỏ

quế

Xay, nghiền

Sơ chế

Xác định thành

phần sinh hóa

Cellulose

Pentose

Ligin

HC trích ly

Thủy phân

Tinh dầu (EAD)

Tinh dầu (HD)

Cất cuốn

hơi nước

Laccase +

Htec 2

Xác định hàm

lượng đường

Xác định hàm

lượng lignin

Hàm lượng tinh dầu

Thành phần hóa học

Hoạt tính sinh học

Đánh giá

Thời gian chưng cất

Cất cuốn

hơi nước

55

3.1.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền và tinh dầu của mẫu cành

lá và mẫu vỏ quế C. cassia

3.1.1.1. Phân tích thành phần chất nền của mẫu cành lá và mẫu vỏ quế C. cassia

Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 5 g bột nguyên liệu đem phân tích hàm ẩm theo TCVN

1867:2001. Từ đó, xác định hàm lượng hàm lượng cellulose, pentose, hàm lượng

ligin, hàm lượng các chất trích ly theo khối lượng khô tuyệt đối.

3.1.1.2. Xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu của mẫu cành lá và

mẫu vỏ quế C. cassia

- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất cuốn hơi nước (Dược điển Việt

Nam IV [2].

Thí nghiệm 100 g bột cành lá quế, vỏ quế ngâm với nước ở nhiệt độ phòng, tỷ

lệ nguyên liệu - nước 1:5, thời gian ngâm 24 h (cành lá quế), 72 h (vỏ quế). Nguyên

liệu cho vào bình cầu dung tích 2 l, bổ sung thêm nước cất sao cho khối lượng cất

chiếm 50% thể tích bình. Tinh dầu thu được nhờ hệ thống cất tinh dầu Clevenger, sản

phẩm thu được được làm khan bằng Na2SO4.

Hàm lượng tinh dầu (%) = Khối lượng tinh dầu (g)

x 100 Khối lượng nguyên liệu (g)

- Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng GC-MS (mục 2.3.2.1).

3.1.2. Nghiên cứu tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá

trình chưng cất tinh dầu

3.1.2.1. Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ thủy phân và hiệu suất thu

tinh dầu quế C. cassia

Bột cành lá quế, vỏ quế bổ sung thêm nước theo tỷ lệ tương ứng là 1:5 và 1:7,

ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24 h ủ đối với cành lá quế và 72 h ủ đối với vỏ quế,

điều chỉnh bình thủy phân đến nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động thì bổ sung

enzyme. Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt, tốc độ khuấy đảo nguyên liệu

120 vòng/phút. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế chỉ ra

ở Bảng 3.1.

56

Bảng 3.1. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế

TT Thông số quá trình Phương án bổ sung enzyme

Laccase Htec2 Laccase-Htec2

1 pH 3-8 3-8 3-8

2 Nhiệt độ 30-60oC 30-60oC 30-60oC

3 Tỷ lệ E/S 0.2-1 ml/g 0.5-2%

Laccase: 0.2-1,0 ml/g,

Htec2 0.5-2%

4 Tốc độ khuấy 120 vòng/phút 120 vòng/phút 120 vòng/phút

5 Thời gian thủy phân 6 h 6 h 6 h

Các thông số sau đây được xác định trong mỗi thực nghiệm:

* Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (µg/ml).

Các thí nghiệm với 10 g nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung

50 ml nước. Khử trùng ở nhiệt độ 120oC/30 phút. Quá trình thủy phân diễn ra trên

máy khuấy từ gia nhiệt (IKA -Đức) với các thông số theo các phương án xử lý (Bảng

3.1). Sau 6 h thủy phân, 10 ml dịch sau thủy phân được ly tâm ở 6000 vòng/phút

trong 15 phút. Dịch thủy phân được xác định hàm lượng đường khử bằng phương

pháp DNS trên máy so màu UV-VIS Double Beam, Model UVD-3200 Labomed đo

ở bước sóng 540 nm. Hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình thủy phân được

tính toán theo đường chuẩn glucose theo mục 2.3.3.1.

Hàm lượng đường khử = Hàm lượng đường sau thủy phân - Hàm lượng đường khử

trước thủy phân (μg/ml).

* Hàm lượng lignin trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (% tính trên khối

lượng nguyên liệu khô).

Toàn bộ phần cặn không tan sau ly tâm được rửa nhiều lần bằng nước cất, sấy

khô đến trọng lượng không đổi ở nhiệt độ 60oC. Xác định hàm lượng lignin còn lại

trong nguyên liệu.

* Hàm lượng tinh dầu (% tinh dầu tính trên khối lượng nguyên liệu khô gió).

Mẫu thí nghiệm với 100 g nguyên liệu/mẻ trong cốc có mỏ 1000 ml, bổ sung

thêm 500 ml nước. Quá trình thủy phân diễn ra trong bể ổn nhiệt (Memmert- Đức),

khuấy đảo hỗn hợp bằng máy khuấy cơ (IKA- Đức), tốc độ 120 vòng/phút với các

thông số theo các phương án xử lý (Bảng 3.1).

57

Sau thủy phân, hỗn hợp nguyên liệu được đem đi chiết xuất tinh dầu bằng

phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trên bộ cất Clevenger [2]. Sự gia tăng hàm

lượng tinh dầu so với đối chứng không sử dụng enzyme được xác định theo công

thức:

Tỷ lệ gia tăng hàm lượng tinh dầu %= ℎ𝑒−ℎ0

ℎ0

Trong đó: he (%): Hàm lượng tinh dầu theo phương pháp enzyme hỗ trợ

h0 (%): Hàm lượng tinh dầu không sử dụng enzyme

3.1.2.2. Nghiên cứu thời gian cất tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu của mẫu xử lý enzyme thu được sau khi chưng cất 2h, 3h,

4h... được xác định. Mẫu không enzyme cũng được tiến hành song song.

3.1.2.3. Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu

Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu tinh dầu khi xử lý bằng các phương

pháp khác nhau được xác định bằng phương pháp GC-MS trên máy sắc ký khí Agilent

HP mode 7890A gas chromatograph trang bị cột tách mao quản (60 m x 0.25 mm x

0.25 µm) Hewlett Packard HP5-MS (5% phenyl methyl siloxane), kết nối với máy đo

phổ khối Agilent 5973 mass spectrometer.

3.1.2.4. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu

Mẫu tinh dầu có sử dụng và không sử dụng enzyme được xác định một số hoạt

tính kháng vi sinh vật, hoạt tính kháng u, hoạt tính chống oxy hóa (tại phòng Sinh

học thực nghiệm, Viện Hóa học các HCTN), hoạt tính kháng viêm tại phòng Thử

nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.

* Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Trước khi tiến hành thí nghiệm, các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha

loãng theo tiêu chuẩn McFarland 0,5 (khoảng 108 VSV/ml). Các phiến thí nghiệm

trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.

Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu MIC.

* Xác định khả năng gây độc tế bào

Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến pha log sẽ được sử dụng cho thử

test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở các thang nồng độ khác nhau. Mỗi giếng thử

58

gồm tế bào, môi trường nuôi cấy và mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37oC/48

trong72h. Sau cố định tế bào và nhuộm bằng thuốc nhuộm SRB, đọc kết quả trên

máy đọc Elisa bước sóng 515 nm, từ đó xác định tỉ lệ CS (Cell survival, tế bào sống

sót). Giá trị IC50 được xác định bằng phần mềm TableCurve v4.0 (Systat Software

Inc.).

* Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7

Tế bào RAW 264.7 được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong

2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h.

Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối

chứng âm, chứng dương là cardamonin. Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc

tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation,

WI, USA). Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào

đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

* Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được xác định bằng thử nghiệm

trên hệ DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), dựa trên nguyên tắc DPPH có khả

năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hòa. Khả năng hấp thụ của

DPPH ở 515 nm được đo bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch

mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng. Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá

trị trung bình của 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05). Giá trị SC50

(Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của

DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve v4.0.

3.1.3. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme

kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế

3.1.3.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH

Thực hiện 07 thí nghiệm, mỗi mẫu 10g bột nguyên liệu cho vào bình tam giác

250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số

của quá trình như nhiệt độ 40oC, bổ sung enzyme theo Bảng 3.1, thay đổi các giá trị

59

pH từ 3,0-8,0 (bước nhảy 1) bằng axit HCl 0.01N và NaOH 0.01M. Chỉnh pH bằng

máy đo pH.

Sau 6 giờ thủy phân, tiến hành đo hàm lượng lượng đường khử bằng phương

pháp DNS. Hàm lượng đường sinh ra càng lớn, khả năng thủy phân càng hiệu quả,

lựa chọn pH 5 thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Thực hiện 07 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm 10g bột nguyên liệu cho vào

bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định

các thông số của quá trình như pH 5, bổ sung enzyme theo Bảng 3.1, thay đổi các giá

trị nhiệt độ từ từ 30- 60oC, bước nhảy 5oC.

Sau 6 giờ thủy phân, tiến hành đo hàm lượng lượng đường khử. Hàm lượng

đường sinh ra càng lớn, khả năng thủy phân càng hiệu quả, lựa chọn nhiệt độ 450C

thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme /cơ chất

Ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase / cơ chất

Thực hiện 06 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm được thực hiện với 10g bột

nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua

đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ 45oC, bổ sung enzyme

Htec2 1%, thay đổi tỷ lệ enzyme laccase bổ sung: 0.1 - 0.7 ml/g cơ chất. Tương tự,

xác định hàm lượng đường khử sau 6 giờ thủy phân.

Ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2 / cơ chất

Thực hiện 06 thí nghiệm, mỗi mẫu thí nghiệm được thực hiện với 10g bột

nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, bổ sung 50 ml nước cất và ngâm nước qua

đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ 45oC, bổ sung enzyme

Laccase phù hợp, thay đổi tỷ lệ enzyme Htec2 bổ sung: 0.5% - 1,75% (w/w), bước

nhảy 0.25%. Tương tự, xác định hàm lượng đường khử sau 6 giờ thủy phân, kết quả

lựa chọn tỷ lệ enzyme phù hợp.

* Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân

60

100 g bột nguyên liệu cho vào cốc có mỏ 1000 ml, bổ sung 500 ml nước cất

và ngâm nước qua đêm. Giữ cố định các thông số của quá trình như pH 5, nhiệt độ

45oC, bổ sung enzyme Laccase, Htec 2 phù hợp. Ở các thời điểm khác nhau của quá

trình thủy phân, hút 5 ml dịch thủy phân đem ly tâm và xác định hàm lượng đường

khử sinh ra. Lựa chọn khoảng thời gian phù hợp mà cho hàm lượng đường khử sinh

ra là lớn nhất.

3.1.3.2. Tối ưu hóa bằng qui hoạch hóa thực nghiệm

Sau khi khảo sát lựa chọn được vùng tối ưu ảnh hưởng đến mức độ thủy phân

cành lá quế bởi hệ enzyme Laccase-Htec2, để tìm điều kiện tối ưu chính xác trên cơ

sở mô hình tính toán, chúng tôi áp dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm. Các

bước thực hiện theo mục 2.3.7.2.

3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong

chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna

3.2.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A.

crassna

Thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna cũng được phân tích tương

tự như đối với mẫu cành lá quế và vỏ quế được trình bày ở mục 3.11.

3.2.2. Nghiên cứu thăm dò tác động của việc xử lý enzyme Laccase- Htec2

lên quá trình chưng cất tinh dầu từ bột gỗ gió bầu A. crassna

Hai thực nghiệm được tiến hành song song, trong đó bột gỗ gió bầu đều được

ngâm trong nước (tỉ lệ bột gỗ - nước là 1:7) trong 2 tuần. Tiếp theo, mẫu đối chứng

được chưng cất ngay sau khi ủ, mẫu nghiên cứu được xử lý với hệ enzyme Laccase-

Htec2 ở pH 5.2, nhiệt độ 440C, tốc độ khuấy 120 vòng/phút, tỷ lệ enzyme Laccase/S

0.7 ml/g, Htec2 / cơ chất 1.5% và thời gian thủy phân 8 giờ rồi đem cất lôi cuốn hơi

nước trong thiết bị Clevenger để thu lấy tinh dầu.

Hàm lượng tinh dầu sau chưng cất được xác định tương tự như đối với nguyên

liệu quế. Thành phần tinh dầu từ gỗ gió bầu A. crassna có và không có enzyme hỗ

trợ được xác định bằng GC-MS.

61

3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm

giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares

Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 3.2. Quy trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid và làm giàu

n-3 PUFA từ đầu cá ngừ

Đầu cá ngừ

Xác định thành

phần hóa học Sơ chế

Protamex

Thủy phân

Alcalase

Xác định hiệu

suất

Protein

Lipid

Tro

Bromelain

Xác định TP

axit béo

Lọc Xương

Dịch thủy

phân

Nước

Papain Ly

tâm

Lipid

Dịch protein

hoà tan

Cặn protein

không tan

Xác định hàm

lượng protein

Axit béo

FFA

Axit béo giàu

n-3PUFFA

Lipase

CRL

Xác định chỉ

số axit

Ure/ethanol

62

3.3.1. Nghiên cứu thành phần chất nền và lipid tổng của một số loại đầu cá

ngừ của Việt Nam

3.3.1.1. Nghiên cứu thành phần chất nền.

08 mẫu đầu cá ngừ thuộc 08 loài cá ngừ (đã bỏ mang, mắt) được rửa sạch, chặt

nhỏ và xay nhuyễn thành hỗn hợp đồng nhất. Sau đó phân tích hàm lượng nước, tro,

protein tổng, lipid tổng.

3.3.1.2. Nghiên cứu khảo sát thành phần axit béo

Thành phần axit béo của các mẫu lipid được xác định bằng GC-MS.

Hệ số đánh giá = % lipid tổng * % n-3 PUFA

3.3.2. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chiết xuất lipid từ đầu

cá ngừ vây vàng T. albarcares

3.3.2.1. Mối tương quan giữa mức độ thủy phân và hiệu suất chiết xuất lipid

Mỗi mẫu thí nghiệm 100 g đầu cá ngừ đã xay nhỏ, bổ sung thêm nước, đánh

tan để đồng nhất mẫu. Quá trình thủy phân được thực hiện trong cốc có mỏ. Nâng

nhiệt độ lên 80-90oC trong 15 phút để diệt vi sinh vật. Sau đó, hạ nhiệt độ về nhiệt độ

thủy phân thì bổ sung enzyme. Các enzyme được sử dụng để đánh giá mức độ thủy

phân đầu cá ngừ bao gồm 02 enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật (Protamex và

Alcalase) và 02 enzyme có nguồn gốc từ thực vật (Bromelain và Papain). Một số yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và chiết xuất lipid được khảo sát sơ bộ và chỉ

ra ở Bảng 3.2

Bảng 3.2. Một số thông số của quá trình thủy phân bởi enzyme protease

Thông số Protamex Alcalase Bromelain Papain

Tỷ lệ NL/nước 1:1-1:5

1:2

1:1-1:5

1:2

1:1-1:5

1:2

1:1-1:5

1:2

pH 4-7

(6.5)

5-9

(8.0)

4-7

(5.0)

4-7

(5.0)

Nhiệt độ (30-60)

45oC

(30-60)

50oC

(30-60)

50oC

(30-60)

50oC

Tốc độ khuấy 200 rpm 200 rpm 200 rpm 200 rpm

Tỷ lệ E/S 0.5-1.5%

(0.5)

0.5-1.5%

(0.5)

0.5-1.5%

(1%)

0.5-1.5%

(1%)

Thời gian thủy phân 6h 6h 6h 6h

63

Sau quá trình thủy phân, enzyme được bất hoạt bằng cách nâng nhiệt độ lên

85-90oC trong 15 phút trong bể ổn nhiệt. Sau đó, hỗn hợp được lọc qua rây để tách

riêng phần xương và dịch lọc. Phần dịch lọc được đem ly tâm lạnh 4oC ở tốc độ 10.

000 vòng/phút trong 30 phút. Sau khi ly tâm thu được 3 phần: phần dầu, phần protein

hòa tan và cặn protein (Hình 3.3).

Hình 3.3. 3 pha sản phẩm sau ly tâm

Để đánh giá hiệu quả của quá trình, 2 hàm mục tiêu được xác định là hàm

lượng dầu giải phóng (thu được ở pha dầu) và hàm lượng protein hòa tan.

- Phần dầu được rửa bằng n-hexan hoặc nước muối 0.9% ở 35-40oC làm khan

bằng Na2SO4 sau đó cô quay loại dung môi.

Hàm lượng lipid (%) = Khối lượng lipid

x 100 Khối lượng nguyên liệu

Hiệu suất chiết xuất lipid (%) = Hàm lượng lipid

x 100% Hàm lượng lipid tổng

- Phần dịch thủy phân hòa tan: lượng protein hòa tan thu hồi được tính toán

dựa trên khối lượng protein hòa tan (theo phương pháp Bradford) so với khối lượng

protein trong nguyên liệu ban đầu (theo phương pháp Kjeldahl)

% thu hồi protein hòa tan = Khối lượng protein hòa tan

x 100% Khối lượng protein trong nguyên liệu

Lipid

Protein hòa

tan

Cặn protein

không tan

64

3.3.2.2. Nghiên cứu so sánh thành phần axit béo

Các mẫu lipid chiết xuất được bằng các enzyme khác nhau được phân tích

bằng GC-MS và so sánh với kết quả phân tích mẫu thu được bằng phương pháp Blight

& Dyer. Kết quả lựa chọn enzyme thích hợp dựa trên hệ số đánh giá:

Hệ số đánh giá = % lipid x % n-3 PUFA

3.3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase kết hợp ure trong quá trình làm

giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T. albacares

3.3.3.1. Nghiên cứu thủy phân lipid bằng enzyme lipase CRL

- Trước quá trình thủy phân, lipid tách từ đầu cá ngừ bằng phương pháp

enzyme được xác định một số chỉ số axit, xà phòng hóa. Kết quả thu được dầu từ đầu

cá ngừ có chỉ số axit 0.43 mg KOH/g, chỉ số xà phòng hóa 198.45 (mg KOH/g).

- Phản ứng thủy phân được thực hiện trong hệ dung môi hai pha với tỷ lệ pha

nước - pha hữu cơ 1:1 (v/v), tỉ lệ dầu - dung môi 3:7 (w/v). Pha nước chuẩn bị với

đệm ở các dải pH từ 5-9. Phản ứng được ủ ở dải nhiệt độ 20-50oC và luôn được khuấy

trộn (200 vòng/phút) để đạt được sự phân tán đồng nhất của các pha. Ở các khoảng

thời gian xác định (0h, 2h, 4h...) mẫu được tách ra bằng ly tâm. Theo Fernádez

Lorente G (2010) [88], 95% axit béo tự do có mặt trong pha dung môi. Vì vậy, chỉ số

axit được xác định sau khi loại toàn bộ dung môi.

Hiệu suất thủy phân = Chỉ số axit (dầu thủy phân) - Chỉ số axit (dầu chưa thủy phân)

x 100% Chỉ số xà phòng hóa - Chỉ số axit (dầu chưa thủy phân)

- Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp axit béo tự do (FFA) được loại dung môi

và thực hiện kết tinh bằng ure như mô tả ở mục 2.3.6.

3.3.3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân dầu đầu cá ngừ thành các axit béo tự do bởi enzyme lipase

từ C. rugosa được khảo nghiệm và các điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cho các thử

nghiệm xác định yếu tố cụ thể được đo trực tiếp sau khi vô hoạt enzyme với 3 ml

ethanol 99,5%.

Phản ứng thủy phân lipase là phản ứng bậc 1. Các yếu tố được khảo sát là đơn

biến, khảo sát yếu tố nào thì thay đổi yếu tố đó trong khoảng thời gian nhất định (6

giờ) và giữ nguyên các yếu tố khác. Các yếu tố pH (5,0-9,0) bước nhảy 0.5, nhiệt độ

(20- 50oC) bước nhảy 5oC, tỷ lệ enzyme/cơ chất (0.2-1,2%) bước nhảy 0.2.

65

Kết quả khảo sát được đánh giá dựa trên độ tăng chỉ số axit, hiệu suất thủy phân

dầu được tính toán. Các kết quả tính toán thực nghiệm được so sánh trên phần mềm xử

lý xây dựng phương trình hồi quy theo phương pháp bình phương tối thiểu [6].

3.3.3.3. Kết tinh FFA bằng ure/ethanol

Hỗn hợp axit béo sau thủy phân được bổ sung ure: cồn = 3:16, FFA/ure = 1:3.

Sau đó, dung dịch thu được để kết tinh ở nhiệt độ 4oC trong thời gian là 18-20 giờ.

Sau quá trình kết tinh, hỗn hợp pha rắn và pha lỏng được lọc qua giấy lọc tại nhiệt độ

kết tinh, rửa lại bằng dung môi có nhiệt độ kết tinh, sau đó tách pha rắn và pha lỏng.

Khối lượng hai pha thu được xác định sau khi làm bay hơi dung môi.

Thành phần axit béo của dầu sau kết tinh được phân tích trên máy GC-MS.

66

CHƯƠNG 4. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh

dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia

Trong thực tiễn, tinh dầu quế ở Việt Nam được chiết xuất chủ yếu từ cành và lá

cây quế Cinnamomum cassia bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước. Chỉ có một lượng nhỏ

tinh dầu được chưng cất từ vỏ cây vì nó có giá trị thương mại cao hơn rất nhiều. Trong

luận án này chúng tôi nghiên cứu tác động của việc tiền xử lý bằng enzyme tới hiệu

quả chưng cất tinh dầu của cả hai loại nguyên liệu này. Các mẫu nghiên cứu là cành +

lá và vỏ quế C. cassia thu từ huyện Văn Yên, tỉnh Yên Bái, một trong những huyện có

truyền thống trồng quế và có sản lượng quế lớn nhất nước ta.

4.1.1. Kết quả phân tích các chất nền và tinh dầu của cành lá và vỏ quế C. cassia

4.1.1.1. Hàm lượng các chất nền của cành lá và vỏ quế C. cassia

Kết quả phân tích các thành phần chất nền của hai loại nguyên liệu nêu trên

được trình bày trên Bảng 4.1.

Bảng 4.1. Kết quả phân tích chất nền của nguyên liệu chưng cất tinh dầu quế

(hàm lượng chất tính theo % khối lượng khô tuyệt đối)

TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Cành lá quế Vỏ thân quế

1 Cellulose % 24,74 ± 0,10 20,36 ± 0,10

2 Hemicellulose % 25,50 ± 0,10 14,02 ± 0,10

3 Lignin % 16,28 ± 0,20 25,78 ± 0,20

4 Các hợp chất trích ly (cồn) % 21,02 ± 0,10 29,55 ± 0,10

Kết quả trên Bảng 4.1 cho thấy mẫu cành, lá và mẫu vỏ quế mang đặc trưng

của nhóm cây thân gỗ với thành phần chủ yếu là lignocellulose, chiếm hơn 60% khối

lượng nguyên liệu khô. Hàm lượng các thành phần cấu trúc gồm cellulose,

hemicellulose và lignin xác định được ở mẫu cành, lá có các giá trị tương ứng là

24,74%, 25,50% và 16,28%; ở mẫu vỏ quế là 20,36%, 14,02% và 25,78%.

Tỷ lệ tương quan giữa 3 thành phần trong nguyên liệu cho thấy, cành lá quế

có tổng cellulose + hemicellulose lớn hơn vỏ quế (50,24%, so với 34,38%), còn vỏ

quế có nhiều lignin hơn cành lá quế (25,78% so với 16,28%). Kumar (2009) cho rằng

lignin tồn tại chủ yếu ở những mô hóa gỗ như vỏ cây, thân cây, rơm rạ mà tồn tại ít

67

trong lá [110]. Đặc điểm cấu trúc này cho thấy cấu trúc thành tế bào vỏ quế bền vững

hơn so với cành lá quế và cả hai loại mẫu nguyên liệu nghiên cứu đều là những nguyên

liệu khó bị phân giải bởi enzyme hơn các bộ phận khác của cây như lá, hoa, hay quả.

4.1.1.2. Hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu từ cành lá và vỏ quế

C. cassia

Theo phương pháp truyền thống, các nguyên liệu được ngâm ủ tự nhiên với nước

trước khi chưng cất lấy tinh dầu. Cành lá quế được ủ trong 24 h (tỉ lệ nguyên liệu / nước

là 1:5). Vỏ quế được ủ trong 72 h (tỉ lệ nguyên liệu / nước là 1:7). Hàm lượng tinh dầu

được định lượng bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước trong thiết bị Clevenger. Hàm

lượng tinh dầu cành lá quế, vỏ quế thu được bằng chưng cất hơi nước tương ứng là 0,69

± 0,02% , 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính theo nguyên liệu khô gió).

Tác giả Nguyễn Thị Tâm & cs. (1997) công bố hàm lượng tinh dầu của lá quế

C. cassia trồng tại Yên Bái dao động trong khoảng 0,14 - 1,04% và của vỏ quế trong

khoảng 1 - 3%. Huang & cs. (2014) công bố hàm lượng tinh dầu vỏ cành quế C.

cassia trồng tại Trung Quốc là 2,76 - 3,11% [100]. Điều đó cho thấy, mẫu nghiên cứu

đạt chất lượng để cho các thực nghiệm tiếp theo.

Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu được xác định bằng phương pháp

GC-MS. Các kết quả được tổng hợp ở Bảng 4.2. Các chất được nhận dạng dựa trên

sự phù hợp của phổ khối và chỉ số thời gian lưu (RI, chỉ số Kovats) của chúng với

các dữ kiện trong ngân hàng dữ liệu của máy.

Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá và tinh dầu

vỏ quế C. cassia (hàm lượng chất được tính theo % diện tích của mỗi peak)

TT Chất RI CTPT % trong

TD cành, lá

% trong

TD vỏ

1 Benzaldehyde 968 C7H6O 1,62 0,83

2 Salicylaldehyde 1053 C7H6O2 0,45

3 Benzenepropanal 1172 C9H12 1,59 2,39

4 Benzofuran <2-methyl> 1189 C8H6O 5,90

5 Cinnamaldehyde <Z-> 1230 C9H8O 0,75 0,64

6 Cinnamaldehyde <E-> 1289 C9H8O 67,74 53,99

68

TT Chất RI CTPT % trong

TD cành, lá

% trong

TD vỏ

7 Cinnamyl alcohol <E-> 1317 C9H10O 0,57 0,15

8 Copaene <a-> 1391 C15H24 0,68 13,86

9 Elemene <cis-b-> 1405 C15H24 0,29

10 Sativene 1409 C15H24 0,13

11 Caryophylene <b-> 1439 C15H24 0,26 0,37

12 Bergamotene <a-trans-> 1447 C15H24 0,16

13 Cinnamyl acetate 1455 C11H12O2 17,20 0,27

14 Coumarin 1457 C9H6O2 0,88 0,30

15 Humulene <a-> 1473 C15H24 0,55

16 Caryophyllene 1480 C15H24 0,13

17 Cadina-1(6),4-diene <trans-> 1489 C15H24 0,47

18 Muurolene <g-> 1491 C15H24 0,29 1,40

19 Amorphene <a-> 1495 C15H24 0,20

20 Selinene <b-> 1506 C15H24 0,18

21 Amorphene <g-> 1513 C15H24 1,17

22 Muurolene<a-> 1515 C15H24 3,20

23 Bisabolene <b> 1518 C15H24 0,27

24 Curcumene <b-> 1521 C15H22 0,18

25 Cadinene <g-> 1531 C15H24 0,17 0,26

26 Cadinene <d-> 1537 C15H24 0,56 7,69

27 Calamenene <cis-> 1540 C15H22 1,17

28 Zonarene 1542 C15H24 1,09

29 Bisabolene <E-g-> 1542 C15H24 0,19

30 Methoxycinnamaldehyde <(E)-o> 1543 C10H10O2 1,09

31 Cadina-1,4-diene <trans-> 1549 C15H24 2,29

32 Himachalene <a-dehydro-ar-> 1554 C15H24 0,4

33 Calacorene <a-> 1561 C15H20 0,54

34 Nerolidol <E-> 1569 C15H26O 0,31

69

TT Chất RI CTPT % trong

TD cành, lá

% trong

TD vỏ

35 Axenol (Gleenol) 1600 C15H26O 0,21

36 Caryophyllene oxide 1605 C15H24O 0,12

37 Tetradecanal 1614 C14H28O 0,16

38 Cubenol <1,10-di-epi-> 1646 C15H26O 0,91

39 Muurolol <epi-a-> (=T-Muurolol) 1659 C15H26O 1,33

40 Eudesmol <7-epi-a> 1662 C15H24O 0,68

41 Cadinol <a-> 1672 C15H26O 0,11

42 Bisabolol <a-> 1696 C15H26O 0,18

Tổng 99,41 99,11

Tổng các hydrocarbon 3,87 38,26

Tổng các HC chứa oxy 95,54 60,85

Nhóm Phenylpropanoid 88,73 58,83

trans- Cinnamaldehyde 67,74 53,99

Nhóm Sesquiterpenoid 2,42 40,38

Sesquiterpen hydrocarbon 1,99 35,87

Sesquiterpen chứa oxy 0,43 4,51

Hình 4.1a và 4.1b trình bày cấu trúc của một số phenylpropanoid và

sesquiterpenoid quan trọng trong các mẫu tinh dầu nêu trên Bảng 4.2.

Benzenepropanal

(C9H10O)

trans-Cinnamaldehyde

(C9H8O)

cis-Cinnamaldehyde

(C9H8O)

Cinnamyl alcohol

(C9H10O)

Coumarin

(C9H6O2)

o-Methoxy-

cinamaldehyde

Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid

70

Copaene

(C15H24)

Muurolene

(C15H24)

Calamenene

(C15H22)

Viridiflorene

(C15H24)

Cadinene

(C15H24)

Bisabolene

( C15H24)

Nerolidol

(C15H26O)

Caryophyllene oxide

( C15H24O)

Bisabolol

(C15H26O)

Hinh 4.1b. Một số thành phần thuộc nhóm sesquiterpenoid

Kết quả GC- MS phân tích thành phần hóa học của tinh dầu cành lá quế và

tinh dầu vỏ quế C. cassia cho thấy:

- Khoảng 28 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu cành lá quế C. cassia, trong

đó trans-Cinnamaldehyde là hợp chất chính (69,74%), theo sau là Cinnamyl acetate

(17,2%), 2-Methyl-benzofuran (5,9%), Benzaldehyde (1,62%), Benzenepropanal

(1,59%), Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định với hàm lượng

nhỏ hơn 1%.

- Khoảng 38 hợp chất được phát hiện trong tinh dầu vỏ quế C. cassia, trong

đó trans-Cinnamaldehyde là hợp chất chính (53,99%), theo sau là Copaene (13,86%),

Cadinene (7,69%), Benzenepropanal (2,39%). Ngoài ra, một số các thành phần khác

cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1%.

- Nhóm phenylpropanoid (C6-C3) là nhóm chất chủ yếu trong cả tinh dầu cành

lá quế (71,53%) và vỏ quế (57,47%), trong đó trans-Cinnamaldehyde đều là thành

phần chính với hàm lượng tương ứng là 68,49% và 53,99%.

71

- Tinh dầu cành lá quế có tổng các hợp chất chứa oxy cao hơn tinh dầu vỏ quế

(95,54% so với 60,85%). Hàm lượng Cinnamyl acetate (17,2%) của nó cao hơn hẳn

tinh dầu vỏ quế (0,27%).

- Tinh dầu vỏ quế có tổng các sesquiterpenoid cao hơn hẳn tinh dầu cành lá

quế (40,38% so với 2,71%), gồm các sesquiterpen hydrocacbon là chủ yếu. Một thành

phần đáng chú ý của tinh dầu vỏ quế là o-Methoxy-cinnamaldehyde (1,09%).

Tóm lại, phenylpropanoid là nhóm hợp chất chủ yếu trong tinh dầu cành lá

quế và vỏ quế C. cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trong đó trans-Cinnamaldehyde là

thành phần chính. Tổng của các hợp chất hydrocarbon, của các hợp chất chứa oxy,

của các phenylpropanoid, và của các sesquiterpenoid có sự khác nhau rõ rệt giữa

nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế.

4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng

cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

Bốn dãy thí nghiệm sau đây đã được thực hiện để khảo sát tác động của việc

xử lý nguyên liệu chưng cất với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu từ cành lá

quế C. cassia, đồng thời để chọn ra phương thức xử lý nguyên liệu thích hợp nhất:

- Dãy thí nghiệm 1: Nguyên liệu sau khi ngâm ủ được đem đi chưng cất lôi

cuốn hơi nước trực tiếp để chiết xuất lấy tinh dầu, không qua xử lý với enzyme.

- Dãy thí nghiệm 2: Nguyên liệu sau khi ngâm ủ được xử lý với enzyme

Laccase (là enzyme thô phân giải lignin thu được từ canh trường nuôi cấy nấm

Ganoderma lucidum) trước khi đem đi chưng cất.

- Dãy thí nghiệm 3: Nguyên liệu sau khi ngâm ủ được xử lý với enzyme Htec2

(là hỗn hợp đa enzyme bao gồm cellulase và xylanase) trước khi đem đi chưng cất.

- Dãy thí nghiệm 4: Nguyên liệu sau khi ngâm ủ được xử lý với hệ enzyme kết

hợp gồm Laccase và Htec2 trước khi đem đi chưng cất.

Các thông số sau đây được xác định trong mỗi thực nghiệm:

- Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (µg/ml).

- Hàm lượng lignin trong nguyên liệu sau khi xử lý enzyme (% tính trên khối

lượng nguyên liệu khô tuyệt đối).

- Hàm lượng tinh dầu (% tinh dầu tính trên khối lượng nguyên liệu khô gió).

72

- Thành phần hóa học của các tinh dầu thu được.

- Hoạt tính sinh học của các tinh dầu thu được.

Hai thông số đầu dùng để đánh giá tác động của enzyme lên mức độ thủy phân

thành tế bào của nguyên liệu. Hàm lượng tinh dầu dùng để đánh giá hiệu quả chiết

xuất. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học dùng để đánh giá tính chất và chất

lượng của các tinh dầu thu được.

4.1.2.1. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất thu hồi

tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của cành lá quế

Các kết quả thu được về tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên

hiệu suất thu hồi tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của nguyên liệu được

trình bày trên Bảng 4.3 và biểu diễn trên Hình 4.2.

Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức

độ thủy phân các chất nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế

Enzyme Đường khử

(µg/ml)

Lignin

(%)

Tinh dầu

(%)

Gia tăng tinh

dầu (%)

Đối chứng 0 17,43 ± 0,24 0,69 ± 0,07 0

Laccase thô 3,12 ± 0,2 14,21 ± 0,21 0,74 ± 0,03 7,29

Htec2 18,13 ± 0,21 15,32 ± 0,15 0,80 ± 0,04 16,88

Laccase thô - Htec2 78,14 ± 0,13 13,01 ± 0,24 0,98 ± 0,04 41,70

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân các chất nền và

hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

25

30

Đối chứng Laccase Htec2 Laccase + Htec2 Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g kh

ử (

μg/

ml)

Tỷ lệ

gia

tăn

g ti

nh

dầu

,h

àm lư

ợn

g lig

nin

(%

)

Phương án xử lý enzyme

Cành lá quế Tinh dầu LigninGlucose

73

Các kết quả nêu trên cho thấy quá trình tiền xử lý cành lá quế bằng enzyme đã

làm tăng đáng kể hiệu suất thu hồi tinh dầu (tăng 31,5% so với mẫu đối chứng không

xử lý enzyme). Sự gia tăng của hiệu suất tinh dầu có tương quan tỉ lệ thuận với sự gia

tăng của hàm lượng đường khử (0 so với 58.34 μg/ml) trong dung dịch phản ứng cũng

như sự giảm thiểu của hàm lượng lignin trong nguyên liệu (17.43 so với 13.01%) là

các bằng chứng cụ thể cho tác động của hoạt động enzyme đến sự gia tăng này.

Các kết quả nêu trên cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp enzyme Laccase

và Htec2 cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng riêng rẽ từng enzyme. Điều đó gợi ý cho

ta về khả năng có tác động hiệp đồng của các enzyme nghiên cứu.

4.1.2.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng

cất tinh dầu cành lá quế

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng cất tinh

dầu từ cành lá quế C. cassia được khảo sát bằng cách theo dõi hàm lượng tinh dầu

thu được theo thời gian chưng cất mẫu nguyên liệu được xử lý với hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec (Mẫu enzyme kết hợp). Để so sánh, một thí nghiệm tương tự được tiến

hành với nguyên liệu chưng cất không qua xử lý enzyme (Mẫu cất truyền thống). Kết

quả thu được được trình bày trên Bảng 4.4 và Hình 4.3.

Bảng 4.4. Hàm lượng tinh dầu thu nhận theo thời gian chưng cất mẫu cành lá quế

có và không có enzyme hỗ trợ

Thời gian (giờ)

Phương pháp

Hàm lượng tinh dầu (%)

2 3 4 5 6 7 8

Enzyme kết hợp 0,41 0,73 0,87 0,98 0,97 0,96 0,96

Cất truyền thống 0,06 0,28 0,47 0,60 0,69 0,67 0,69

74

Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu cành

lá quế có và không có enzyme hỗ trợ

Đối với mẫu cành lá quế đã xử lý enzyme, sau 2 h đầu đã thu được hơn 50%

lượng tinh dầu, sau 5 h lượng tinh dầu đạt đến cực đại. Trong khi đó, đối với phương

pháp không sử dụng enzyme sau 2 h đầu mẫu đối chứng chỉ đạt 9 - 10%, sau 8 h

lượng tinh dầu mới đạt đến cực đại. Quá trình xử lý cành lá quế bằng hỗn hợp enzyme

Laccase và Htec2 đã làm giảm đáng kể thời gian cất tinh dầu so với đối chứng không

sử dụng enzyme.

Có thể giải thích rằng, quá trình thủy phân bởi hệ enzyme Laccase-Htec2 đã

làm phá vỡ một phần cấu trúc thành tế bào cành lá quế, mối liên kết cellulose-

hemicellulose-lignin trong hệ lignocellulose được nới lỏng, tạo ra các lỗ hổng trên

thành tế bào, làm tăng tính thấm và các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu dễ dàng giải

thoát ra khỏi tế bào khi có tác dụng nhiệt.

4.1.2.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thành phần hóa

học của tinh dầu cành lá quế

Thành phần hóa học của các tinh dầu thu được từ cành lá quế C. cassia theo 4

phương án như đã nêu ở trên được xác định bằng phương pháp GC-MS. Các kết quả

thu được được tổng hợp trên Bảng 4.5. Các sắc ký đồ tương ứng được trình bày trên

các Hình 4.4a, b, c, và d.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Hàm

lượ

ng

tin

h d

ầu (

%)

Thời gian chưng cất (giờ)

Tinh dầu EADTinh dầu HD

75

Hình 4.4a. Sắc ký đồ của tinh dầu cành lá quế chưng cất theo cách thông thường, nguyên liệu không qua xử lý enzyme

1: Benzaldehyde (1,62%), 2: Benzenepropanal (1.59%), 3: 2-Methyl-benzofuran (5.9%), 4: trans-cinamaldehyde (69.74%), 5: Cinnamyl

acetate (17.2%).

1 2

4

3

5

76

Hình 4.4b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme Laccase EAD

1: Benzaldehyde (1,93%), 2: Benzenepropanal (1,64%), 3: 2-Methyl-benzofuran (4,52%), 4: trans-cinamaldehyde (68,96%), 5: Cinnamyl

acetate (15,58%).

1 2

4

3

5

77

Hình 4.4c. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme Htec2 EAD

1: Benzaldehyde (1,77%), 2: Benzenepropanal (1,14%), 3: 2-Methyl-benzofuran (1,64%), 4: trans-cinamaldehyde (70,54%), 5: Cinnamyl

acetate (21,02%).

1 2

4

3

5

78

Hình 4.4d. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase-Htec2

1: Benzaldehyde (0,69%), 2: Benzenepropanal (0,78%), 3: 2-Methyl-benzofuran (2,44%), 4: trans-cinamaldehyde (85,6%), 5: Cinnamyl

acetate (1,34%).

1 2

4

3 5

79

Bảng 4.5. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được

từ cành lá quế có và không có xử lý với enzyme

(hàm lượng chất được tính theo % diện tích của mỗi peak)

TT Chất

Hàm lượng (%)

Không

enzyme Laccase Htec2

Laccase+

Htec2

1 Benzaldehyde 1,62 1,93 1,77 0,69

2 Salicylaldehyde 0,45 0,51 0,87 0,61

3 Unknown 0,64

4 Benzenepropanal 1,59 1,64 1,14 0,78

5 Benzofuran <2-Methyl> 5,9 4,52 1,64 2,44

6 cis-Cinnamaldehyde 0,75 0,78 0,4 1,23

7 Phenylethyl acetate 0,11

8 trans-Cinnamaldehyde 69,74 68,96 70,54 85,6

9 Unknown 0,16

10 Cinnamyl alcohol 0,57 0,58 0,17 0,29

11 α-Copaene 0,68 0,8 0,32 0,66

12 Caryophylene <b-> 0,26 0,3 0,26

13 Cinnamyl acetate 17,2 15,58 21,02 1,34

14 Coumarin 0,88 0,84 0,65 1,78

15 Caryophyllene <9-epi-(E)> 0,13 0,17 0,26

16 γ-Muurolene 0,29 0,35 0,17 0,47

17 Viridiflorene - 0,28 0,16

18 α-Muurolene - 0,18 0,2

19 β-Bisabolene 0,11

20 γ-Cadinene 0,17 0,21 0,3

21 δ-Cadinene 0,56 0,73 0,12 0,63

22 cis-Calamenene - 0,11 0,21

23 Methoxycinnamaldehyde 0,23

24 γ-Bisabolene 0,19 0,23

25 Nerolidol 0,31 0,34 0,22 0,37

80

26 Caryophyllene oxide 0,12 0,13 0,14

27 Bisabolol 0,13

Tổng 99,41 99,42 99,14 99,81

Tổng các HC hydrocarbon 3,58 5,13 1,75 4,04

Tổng các HC chứa oxy 95,54 94,17 97,39 94,85

Nhóm Phenylpropanoid 88,73 88,38 94,03 91,25

trans-Cinnamaldehyde 69,74 68,96 70,54 85,6

Nhóm Sesquiterpen 2,42 3,83 0,83 3,9

Sesquiterpen hydrocarbon 1,99 3,36 0,61 3,26

Sesquiterpen chứa oxy 0,43 0,47 0,22 0,64

So sánh kết quả phân tích GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy, quá

trình tiền xử lý cành lá quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản chất của tinh

dầu, các mẫu tinh dầu đều có thành phần chính là cinnamaldehyde và có cùng số

lượng các thành phần quan trọng khác.

Ít có sự biến động về tổng các hydrocarbon và tổng các hợp chất chứa oxy.

Thành phần tinh dầu cành lá quế ở cả 4 phương án xử lý đều chứa chủ yếu là các hợp

chất có oxy (94,17 - 97,39%), còn lại là các hợp chất hydrocarbon (1,75 - 5,13%).

Nhóm phenylpropanoid (C6-C3) vẫn là nhóm chất chính trong cả 4 phương án

xử lý, trong đó trans-cinnamaldehyde là thành phần chính có hàm lượng đạt từ

68,49% đến 86,83%.

Tinh dầu thu được bằng cách xử lý nguyên liệu với các enzyme Laccase và

HTec2 riêng rẽ không gây ra biến động lớn về thành phần hóa học, nhưng việc xử lý

nguyên liệu với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 đã làm thay đổi rõ rệt nhất thành

phần % của một số chất quan trọng trong tinh dầu. Cụ thể như sau:

- Làm giàu một số chất mong muốn trong tinh dầu quế C. cassia như: hàm

lượng cinnamaldehyde tăng từ 69,74% lên 85,60%, o-methoxy-cinnamaldehyde từ

0% lên 0,23%.

- Làm giảm hàm lượng một số chất khác, đặc biệt cinnamyl acetat giảm từ

17,2% xuống 1,34%, cinnamyl alcohol giảm từ 0,57% xuống 0,29%. Sự tăng và giảm

của cinnamaldehyde và cinnamyl acetat có thể có mối liên hệ mật thiết với nhau.

81

Quá trình thủy phân bằng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 cho hiệu suất và

chất lượng tinh dầu cao hơn so với phương pháp thông thường hoặc xử lý bằng

enzyme riêng rẽ. Điều này cho thấy việc sử dụng hỗn hợp các hệ enzyme có thể có

các tác động hiệp đồng giữa các enzyme riêng rẽ. Chính vì vậy, trong các nghiên cứu

tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình này.

4.1.2.4. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hoạt tính sinh học

của tinh dầu cành lá quế

Để khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu cành lá quế với enzyme lên

hoạt tính sinh học của sản phẩm thu được, chúng tôi đã sử dụng 2 mẫu sau:

- Mẫu 1 (ký hiệu là tinh dầu HD) là tinh dầu thu được bằng chưng cất lôi cuốn

hơi nước cành lá quế không được tiền xử lý với enzyme.

- Mẫu 2 (ký hiệu là tinh dầu EAD) là tinh dầu thu được bằng chưng cất lôi

cuốn hơi nước cành lá quế được tiền xử lý với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2.

Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hai mẫu tinh dầu cành lá quế C. cassia được thử nghiệm hoạt tính với 8 chủng

vi sinh vật kiểm định. Kết quả được trình bày tại Bảng 4.6a.

Bảng 4.6a. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Ký hiệu mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml)

Vi khuẩn

Gr(-)

Vi khuẩn

Gr(+) Nấm mốc Nấm men

E.

coli

P.

aer

ug

ino

sa

B.

sub

tili

s

S. a

ure

us

A.

nig

er

F. o

xysp

oru

m

S. ce

revi

sia

e

C. a

lbic

an

s

Chứng dương 5,50 11,00 7,10 14,38 23,13 11,56 5,78 11,56

Tinh dầu HD 400 (-) 400 100 200 (-) 400 400

Tinh dầu EAD 400 (-) 400 100 200 (-) 400 400

Ghi chú: Chứng dương là Streptomycin cho vi khuẩn Gr(+), Tetracylin cho vi

khuẩn Gr(-), Nystatin cho nấm sợi và nấm men.

Kết quả cho thấy với nồng độ thử nghiệm ban đầu 400 µg/ml, hai mẫu tinh

dầu HD và EAD đều có hoạt tính kháng 6/8 chủng vi sinh vật kiểm định. Ở các nồng

82

độ pha loãng tiếp theo, hai mẫu tinh dầu đều biểu hiện hoạt tính kháng S. aureus với

MIC = 100 μg/ml, và kháng A. niger với MIC = 200 μg/ml. Huang và cs. (2014) cho

rằng mức độ kháng khuẩn của tinh dầu từ Cinnamomum cassia trồng tại Trung Quốc

có khả năng kháng mạnh các vi khuẩn Gram dương S. aureus với MIC 2.5 mg/ml, B.

subtilis 5.0 mg/ml và E. coli 10 mg/ml. Các nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính kháng

vi sinh vật phổ rộng của tinh dầu quế chủ yếu là do thành phần cinamaldehyde. Tuy

nhiên, trong thử nghiệm này sự chênh lệch về hàm lượng cinamaldehyde của 2 mẫu

tinh dầu đã không thấy có sự biến động về hoạt tính sinh học.

Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của hai mẫu tinh dầu HD và EAD được thử nghiệm

trên 03 dòng tế bào ung thư người, bao gồm dòng Hep-G2 (Human hepatocellular

carcinoma - Ung thư gan), dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma - Ung thư biểu

mô phổi) và dòng RD (Human rhabdomyosarcoma - Ung thư mô liên kết) với chất

đối chứng dương là ellipticine pha trong DMSO. Kết quả được chỉ ra ở Bảng 4.6b.

Bảng 4.6b. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 03 dòng tế bào ung thư

Ký hiệu mẫu

Nồng

độ đầu

(g/ml)

Tỉ lệ CS (%)

trên các dòng tế bào IC50 (g/ml)

Hep-G2 LU-1 RD Hep-

G2 LU-1 RD

Dung môi (DMSO) 100,00 100,00 100,00 - - -

Chứng dương 5 1,340,8 3,660,9 3,871,1 0,29 0,31 0,33

Tinh dầu HD 40 3,620,7 65,601,4 14,811,5 29,25 >40 6,01

Tinh dầu EAD 40 3,780,3 32,671,7 6,10,5 12,89 25,95 2,34

Ghi chú: Chứng dương là chất chuẩn ellipticine, pha trong dung môi DMSO.

Kết quả thử nghiệm ở Bảng 4.6b cho thấy sản phẩm tinh dầu thu được bằng 2

phương pháp chiết xuất, có và không có xử lý enzyme, đều có hoạt tính gây độc tế

bào với nồng độ thử nghiệm ban đầu (40 g/ml). Ở các nồng độ thử nghiệm tiếp theo,

tinh dầu HD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư gan và ung

thư biểu mô liên kết (Hep-G2 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 29,25 và 6,01 g/ml,

83

trong khi tinh dầu EAD biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung

thư (Hep-G2, LU-1 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 12,89, 25,95 và 2,34 g/ml.

Đặc biệt, tinh dầu EAD có hoạt tính khá mạnh trên dòng ung thư biểu mô phổi với

giá trị IC50 là 2,34 g/ml.

Nhiều các công trình công bố cao chiết từ vỏ quế đã cho thấy khả năng ức chế

sự gia tăng của một số dòng thế bào ung thư ở người [96] đồng thời ít có tác dụng

gây độc tế bào trên các tế bào bình thường [169]. Tác giả Huang T.C. &cs., (2007)

cho thấy thành phần cinnamaldehyde trong tinh dầu lá quế Cinnamomum

osmophloeum đã tác động gây độc tế bào thông qua sự phá vỡ màng ty thể, kích thích

sản sinh ROS, suy giảm glutathione và kích hoạt caspase trên dòng tế bào ung thư

bạch cầu người K562 [99]. Có thể sự gia tăng của thành phần chất chính trong tinh

dầu lá quế cinnamaldehyde từ 69,74 lên 85,60% khi sử dụng enzyme Laccase+Htec2

hỗ trợ có thể dẫn đến sự gia tăng hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu EAD trên 03

dòng tế bào ung thư thử nghiệm đều cao hơn so với tinh dầu HD.

Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm

Phép thử hoạt tính kháng viêm của 2 mẫu tinh dầu HD và EAD được đánh giá

thông qua sự ức chế sinh NO bởi LPS trên đại thực bào macrophage RAW 264.7.

Bảng 4.6c. Kết quả thử khả năng ức chế sự sinh NO trên tế bào RAW 264.7

Nồng độ

(µg/ml)

% ức chế NO Nồng độ

(µg/ml)

% ức chế NO

Tinh dầu HD Tinh dầu EAD Cardamonin

100 53,2 0,5 65,8 0,4 10 102,7 0,5

50 74,8 0,5 82,0 0,3 2 84,2 0,3

25 85,6 0,6 87,4 0,4 0,4 41,4 0,4

12,5 55,0 0,8 85,6 0,5 0,08 20,2 0,3

6,25 29,7 0,7 58,6 0,8 - -

IC50 11,0 ± 0,8 - IC50 0,5 ± 0,1

Kết quả trên Bảng 4.6c chỉ ra rằng, sau 24 h cả hai mẫu tinh dầu đều thể hiện

hoạt tính ức chế đại thực bào sản sinh NO ở các khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100

84

μg/ml (P < 0.05 với LPS đối chứng âm), tinh dầu EAD có biểu hiện hoạt tính kháng

viêm mạnh hơn tinh dầu HD. Nguyên nhân có sự chênh lệch đó có thể được giải thích

là do sự biến động của một số thành phần chính trong tinh dầu. Kết quả khảo sát một

số thành phần của lá quế lên khả năng ức chế NO của tác giả Lee H.S. (2009) cho

thấy Cinnamaldehyde, Cinnamyl aclcohol có khả năng ức chế sản sinh NO trong khi

rất ít hoặc không có hiệu lực ức chế được quan sát thấy ở một số thành phần khác như

Cadinene, Cinnamic acid, α-Copaene, Eugenol, Limonene. Đối chiếu với bảng 4.5

kết quả phân tích thành phần hóa học lá quế cho thấy trong tinh dầu EAD có sự gia

tăng của hàm lượng Cinnamaldehyde từ 69,74 lên 85,60%, nhưng Cinnamyl alcohol

giảm từ 0,57 xuống 0,29. Chính vì vậy, độ chênh lệch giữa hàm lượng

Cinnamaldehyde trong tinh dầu EAD đã làm gia tăng hoạt tính ức chế sản sinh NO

so với tinh dầu HD.

Tuy nhiên, tương quan giữa nồng độ và hoạt tính tỏ ra không tuyến tính, đặc

biệt ở vùng 25 đến 100 μg/ml, trong khi chất đối chứng dương là cardamonin hoạt

động ổn định trong thí nghiệm này. Chính vì vậy, cần có những nghiên cứu bổ sung

nhằm làm sáng tỏ kết quả nghiên cứu trên.

Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa

Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH của các mẫu thử được

trình bày ở Bảng 4.6d.

Bảng 4.6d. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH

Kí hiệu mẫu Nồng độ (g/ml) Tỉ lệ trung hòa

gốc tự do (%) SC50 (µg/ml)

Chứng (+) 25 87,22 0,53 11,31

Chứng (-) - 0,0

Tinh dầu HD 100 10,34 0,7 > 100

Tinh dầu EAD 100 4,33 0,5 > 100

Ghi chú: Chứng dương là chất chuẩn ascorbic acid.

Kết quả được nêu trong Bảng 4.6d cho thấy, hai mẫu tinh dầu thử nghiệm chưa

thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH ở nồng độ nghiên cứu.

Nhận xét chung:

Các kết quả thử nghiệm nêu trên cho thấy, hai mẫu tinh dầu có gam hoạt tính

85

sinh học tương tự như nhau. Việc xử lý cành lá quế C. cassia bằng hệ enzyme kết

hợp Laccase-Htec2 không làm thay đổi đáng kể hoạt tính sinh học của sản phẩm tinh

dầu thu được. Sự gia tăng quan sát thấy được của hoạt tính kháng viêm và gây độc tế

bào của mẫu EAD so với mẫu Tinh dầu HD có thể liên quan đến hàm lượng

cinnamaldehyde cao hơn của nó.

Mặt khác, các kết quả thử nghiệm này một lần nữa chứng minh cho khả năng

sử dụng tinh dầu quế C. cassia nói chung như là một hoạt chất tự nhiên để tăng cường

khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và chống u.

4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng

cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia

4.1.3.1. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất thu hồi

tinh dầu và mức độ thủy phân các chất nền của vỏ quế

Các mẫu vỏ quế trước khi chưng cất tinh dầu được ngâm ủ với nước trong 72

h. Trong phương án 01 (đối chứng), nguyên liệu sau khi ngâm ủ được đem đi cất trực

tiếp để lấy tinh dầu. Trong phương án 02, 03, và 04, nguyên liệu sau khi ngâm ủ được

xử lý với các enzyme tương ứng là Laccase, Htec2, cũng như với hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec trước khi cất. Mức độ thủy phân thành tế bào được xác định cùng với

hiệu suất thu nhận tinh dầu. Kết quả chỉ ra ở Bảng 4.7 và Hình 4.5.

Bảng 4.7. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức

độ thủy phân thành tế bào và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ vỏ quế

STT Enzyme Đường khử

(µg/ml)

Lignin

(%)

Tinh dầu

(%)

Gia tăng

tinh dầu

(%)

1 Đối chứng 0 25,78 ± 0,19 2,87 ± 0,05 -

2 Laccase thô 5,43 ± 0,18 22,54 ± 0,20 2,99 ± 0,04 4,35

3 Htec2 10,23 ± 0,24 24,12 ± 0,18 3,03 ± 0,04 5,55

4 Laccase+Htec2 38,34 ± 0,22 20,34 ± 0,22 3,28 ± 0,06 14,57

86

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân thành tế bào và

tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế

Cũng tương tự như cành lá quế, kết quả trên Bảng 4.7 và Hình 4.5 cho thấy

mối tương quan rõ rệt giữa mức độ thủy phân thành tế bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu

vỏ quế C. cassia. Lần lượt từ phương án 01 đến 04, hàm lượng đường khử gia tăng

từ 0 lên đến 38,34 µg/ml, còn hàm lượng lignin giảm từ 25,78 xuống còn 20,34%.

Phương án 04, kết hợp 2 enzyme Laccase và Htec2 cho hiệu quả thủy phân cao nhất

với hàm lượng đường khử là 38,34 µg/ml và tỷ lệ gia tăng hiệu suất tinh dầu đạt

14,57%.

So sánh kết quả giữa hai nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế cho thấy:

- Việc xử lý nguyên liệu chưng cất với enzyme riêng rẽ và với hệ enzyme kết

hợp Laccase-Htec2 đều làm gia tăng hiệu suất thu hồi tinh dầu so với phương án đối

chứng không sử dụng enzyme. Mức độ gia tăng hàm lượng tinh dầu tỷ lệ thuận với

mức độ thủy phân nguyên liệu bởi enzyme, trong đó hàm lượng đường khử tăng và

hàm lượng lignin trong nguyên liệu giảm.

- Các phương án xử lý cho thấy hệ enzyme kết hợp Laccase+Htec2 cho tác

động hiệp đồng trong quá trình thủy phân. Sử dụng riêng rẽ Laccase và Htec2 chưa

đem lại hiệu quả mong muốn.

- Quá trình xử lý cành lá quế bằng hệ enzyme Laccase+Htec2 cho mức độ thủy

phân cao hơn so với vỏ quế. Điều này phù hợp với các kết quả phân tích thành phần

0

10

20

30

40

50

0

5

10

15

20

25

30

ĐC Laccase thô Htec2 Laccase thô + Htec2

Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g kh

ử (

µg/

ml)

Tỷ lệ

gia

tăn

g ti

nh

dầu

, lig

nin

(%

)Vỏ quế

Gia tăng tinh dầu Lignin Đường khử

87

chất nền của nguyên liệu (Bảng 4.1), trong đó nguyên liệu cành lá quế chứa chủ yếu

là cellulose và hemicellose, hàm lượng lignin thấp, khả năng tác dụng enzyme dễ

dàng hơn so với vỏ quế.

4.1.3.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng

cất tinh dầu vỏ quế

Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng cất tinh

dầu từ vỏ quế C. cassia được khảo sát bằng cách theo dõi lượng tinh dầu thu được

theo thời gian chưng cất mẫu nguyên liệu được xử lý với hệ enzyme kết hợp Laccase-

Htec2 (Mẫu enzyme kết hợp). Để so sánh, một thí nghiệm tương tự được tiến hành

với nguyên liệu chưng cất không qua xử lý enzyme (Mẫu cất truyền thống). Kết quả

thu được được trình bày trên Bảng 4.8 và Hình 4.6.

Bảng 4.8. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế có và không có

enzyme hỗ trợ

Thời gian (h)

Phương pháp

Hàm lượng tinh dầu (%)

2 3 4 5 6 7 8 9

Enzyme kết hợp 0,88 1,68 2,72 3,25 3,28 3,27 3,25 3,23

Cất truyền thống 0,59 0,90 1,07 1,74 2,14 2,57 2,87 2,85

Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế

có và không có enzyme hỗ trợ

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hàm

lượ

ng

tin

h d

ầu (

%)

Thời gian chưng cất (giờ)

Vỏ quế Tinh dầu EADTinh dầu HD

88

Cũng tương tự như cành lá quế, kết quả khảo sát trên vỏ quế cho thấy hệ

enzyme Laccase + Htec2 có vai trò tích cực trong việc giảm thời gian chưng cất tinh

dầu quế. Tại các thời điểm khác nhau của quá trình chưng cất: 2h, 3h, 4h... lượng tinh

dầu thu từ mẫu vỏ quế xử lý bằng enzyme đều cao hơn so với không xử lý enzyme.

Sau 6h chưng cất, lượng tinh dầu đạt cực đại (3,28%) trong khi đó sau 8h mẫu không

xử lý enzyme mới đạt cực đại (2,87%).

4.1.3.3. Kết quả đánh giá tác động của các hệ enzyme lên thành phần hóa học

tinh dầu vỏ quế

Thành phần hóa học của các tinh dầu thu được từ vỏ quế C. cassia theo 4

phương án như đã nêu ở trên được xác định bằng phương pháp GC-MS. Các kết quả

thu được được tổng hợp trên Bảng 4.9. Các sắc ký đồ tương ứng được trình bày trên

các Hình 4.7a, b, c, và d.

89

Hình 4.7a. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu không xử lý enzyme

1: Benzenpropanal (2,39%), 2: trans-Cinnamaldehyde (53,99%), 3: Copaene (13,86%), 4: Muurolene (3,2%), 5: Cadinene 7,69%, 6:

Calamenene (1,17%), 7: Cadina-1,4-diene (2,29%)

1

2

5

3

6

7

4

90

Hình 4.7b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase- EAD

1: Benzenpropanal (1,88%), 2: trans-Cinnamaldehyde (59,22%), 3: Copaene (5,78), 4: Muurolene (3,64%), 5: Cadinene (6,41%), 6:

Calamenene (2,82%), 7: Cadina-1,4-diene (1,23%),

1

2

4

3 5

6 7

91

Hình 4.7c. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Htec2-EAD

1: Benzenpropanal (2,01%), 2: trans- Cinnamaldehyde (58,36%), 3: Copaene (5,91%), 4: Muurolene (3,83%), 5: Cadinene (6,56%), 6:

Calamenene (2,6%), 7: Cadina-1,4-diene (1,23%)

1

2

3

4

5

6

7

92

Hình 4.7d. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase - Htec2- EAD

1: Benzenpropanal (2,18%), 2: trans-Cinnamaldehyde (67,6%), 3: Copaene (11,72%), 4: Muurolene (2,14%), 5: Cadinene (4,76%), 6:

Calamenene (1,05%), 7: Cadina-1,4-diene (1,17%).

1

2

3

4

5

6

7

93

Bảng 4.9. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được

từ vỏ quế có và không có xử lý với enzyme

(hàm lượng chất được tính theo % diện tích của mỗi peak)

TT Chất

Hàm lượng (%)

Không

enzyme Laccase Htec2 Lac+Htec2

1 Benzaldehyde 0,83 0,74 0,7 0,86

2 Benzenepropanal 2,39 1,88 2,01 2,18

3 Cinnamaldehyde <Z-> 0,64 0,51 0,51 0,77

4 Cinnamaldehyde <E-> 53,99 59,22 58,36 67,6

5 Cinnamyl alcohol <E-> 0,15 0,12

6 Copaene <a-> 13,86 5,78 5,91 11,72

7 Elemene <cis-b-> 0,29 0,16 0,17 0,23

8 Sativene 0,13 0,27 0,21

9 Caryophylene <E-> 0,37 0,21 0,23 0,27

10 Bergamotene <a-trans-> 0,16 0,12

11 Cinnamyl acetate <E-> 0,27 0,19 0,15 0,31

12 Coumarin 0,30 1,16 1,21

13 Humulene <a-> 0,55 0,32 0,33 0,41

14 Cadina-1(6),4-diene <trans-> 0,47 0,22 0,3 0,17

15 Muurolene <g-> 1,40 1,16 1,19 0,81

16 Amorphene <a-> 0,20 0,18 0,20

17 Selinene<b-> 0,18 0,13 0,13

18 Amorphene <g-> 1,17

19 Muurolene <a-> 3,20 3,64 3,83 2,14

20 Bisabolene <b-> 0,27 0,21 0,21 0,20

21 Curcumene <b-> 0,18 - -

22 Cadinene <g-> 0,26 0,28 0,27 0,18

23 Cadinene <d-> 7,69 6,41 6,56 4,76

24 Calamenene <cis-> 1,17 2,82 2,60 1,05

94

TT Chất

Hàm lượng (%)

Không

enzyme Laccase Htec2 Lac+Htec2

25 Zonarene 1,09

26 Methoxycinnamaldehyde <(E)-o-> 1,09 3,01 3,49

27 Cadina-1,4-diene <trans-> 2,29 1,09 1,23 1,17

28 Himachalene <a-dehydro-ar-> 0,40 0,67 1,37

29 Calacorene <a-> 0,54 0,86 0,91 0,27

30 Axenol (Gleenol) 0,21 0,51 0,46 0,19

31 Tetradecanal 0,16 0,30 0,36

32 Cubenol <1,10-di-epi-> 0,91 1,58 1,32 0,85

33 Muurolol <epi-a-> (=T-Muurolol) 1,33 2,2 1,96 0,90

34 Eudesmol <7-epi-a> 0,68

35 Cadinol <epi-a-.> 1,24 1,12 0,42

36 Cadinol <a-> 0,11 0,40 0,27

37 Cadalene 0,23 0,21

38 Bisabolol <a-> 0,18 0,41 0,44

Tổng 99,11 97,99 96,64 99,28

Tổng hydrocarbon 38,26 26,52 26,29 27,26

Tổng các HC chứa oxy 60,85 71,47 70,35 72,02

Tổng Phenylpropanoid 58,83 65,97 65,73 70,98

trans-cinnamaldehyde 53,99 59,22 58,36 67,6

Tổng sesquiterpenoid 39,29 30,98 29,85 27,44

Sesquiterpen hydrocarbon 35,87 24,64 24,28 25,08

Sesquiterpen chứa oxy 3,42 6,34 5,57 2,36

So sánh thành phần GC-MS của cả 4 phương án xử lý cho thấy quá trình tiền

xử lý vỏ quế bằng enzyme đã không làm thay đổi bản chất của tinh dầu quế, các mẫu

nghiên cứu đều có thành phần chính là cinnamaldehyde và có cùng số lượng các thành

phần quan trọng khác.

95

Ít có sự biến động về tổng các hydrocarbon và tổng các hợp chất chứa oxy,

thành phần tinh dầu vỏ quế ở cả 4 phương án xử lý đều chứa chủ yếu là các hợp chất

có oxy (60 - 72%), các hợp chất hydrocarbon (28 - 36%).

Phenylpropanoid vẫn là nhóm chất chính trong cả 4 phương án xử lý và

Cinnamaldehyde là thành phần chính với hàm lượng từ 54,63% đến 68,37%. Cũng

tương tự như tinh dầu cành lá quế, tinh dầu thu được nhờ xử lý với các enzyme

Laccase và Htec2 riêng rẽ ít có sự biến động về thành phần hóa học so với hệ enzyme

Laccase-Htec2. Việc xử lý nguyên liệu với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 làm

gia tăng hàm lượng cinnamaldehyde từ 54,63% lên 68,37%.

Tuy nhiên, so sánh sự biến động thành phần hóa học của hai tinh dầu cành lá

quế và vỏ quế cho thấy tinh dầu cành lá quế có sự biến động mạnh mẽ hơn. Có thể

mức độ thủy phân nguyên liệu của cành lá quế bởi hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2

cao hơn so với vỏ quế dẫn đến hiệu quả khác biệt.

4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết

hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế

Các kết quả nghiên cứu ở các phần trên cho thấy việc sử dụng hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec để xử lý cành lá và vỏ quế C. cassia trước khi chưng cất có tác động rất

tốt đến hiệu suất thu hồi, chất lượng và thời gian chưng cất tinh dầu. Vì thế, mục tiêu của

nội dung nghiên cứu này là tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình này.

Các kết quả thử nghiệm trình bày ở Bảng 4.2 (trang 63) cho thấy sự gia tăng

hàm lượng tinh dầu tỷ lệ thuận với mức độ thủy phân nguyên liệu (đánh giá thông

qua sự gia tăng hàm lượng đường khử và sự sụt giảm lignin). Vì thế trong nội dung

nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để xác định điều

kiện tối ưu cho quá trình thủy phân các nguyên liệu chưng cất tinh dầu quế. Chúng

tôi lựa chọn hàm lượng đường khử sinh ra sau khi xử lý nguyên liệu với enzyme làm

chỉ tiêu đánh giá hiệu quả thủy phân vì nó được xác định bằng phương pháp so màu

của Miller với thuốc thử DNS. Phương pháp này cho kết quả nhanh, dễ thao tác và

dễ kiểm soát.

96

4.1.4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân các

nguyên liệu chưng cất quế với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH

Chúng tôi thực hiện 7 thí nghiệm khảo sát trong vùng pH từ 3 - 8 sử dụng hệ

đệm thích hợp, giữ cố định các điều kiện khác như tỷ lệ nguyên liệu/nước 1:5, nhiệt

độ 45oC, thời gian thủy phân 6 h. Các kết quả thu được thể hiện trong Hình 4.8a.

Hình 4.8a. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của pH lên hàm lượng đường khử

Độ pH của môi trường phản ứng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến hoạt động của enzyme trong quá trình thủy phân, mỗi enzyme có một

khoảng hoạt động tối thích riêng. Enzyme Laccase hoạt động tốt nhất trong giải pH

3,5 - 4,5, trong khi enzyme Htec2 hoạt động tốt nhất trong khoảng pH 4,5 - 5,5. Tuy

nhiên khi phối hợp hai enzyme Laccase và Htec2, kết quả khảo sát cho thấy pH 4,5

- 5 cho khả năng thủy phân cao nhất, vì thế được lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp

theo.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân thể hiện

trong Hình 4.8b cho thấy, nhiệt độ càng tăng hiệu quả thủy phân càng cao và đạt cực

đại ở 45oC, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 50 - 55oC thì hiệu quả thủy phân có xu

hướng giảm.

0

10

20

30

40

50

60

70

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g kh

ử (

μg/m

l)

pH

Cành lá quế Vỏ quế

97

Hình 4.8b. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của nhiệt độ lên hàm lượng đường khử

Enzyme laccase từ G. luccidum có khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích ở 35 -

45oC, thấp hơn so với enzyme Htec2 (ở 45 - 55oC). Trong các nghiên cứu trước đây

enzyme Htec2 thường được chúng tôi sử dụng ở nhiệt độ 50oC để thủy phân cellulose

trong rơm rạ và rong biển. Tuy nhiên, khi kết hợp Htec2 với enzyme Laccase, nhiệt độ

50oC không phát huy cao nhất khả năng hoạt động của enzyme này. Các nỗ lực thử

nghiệm riêng rẽ cho lần lượt các enzyme hoạt động ở nhiệt độ tối ưu cũng không đem

lại hiệu quả hơn phương án bổ sung enzyme đồng thời. Bên cạnh đó, nguyên liệu xử

lý là các nguyên liệu chứa tinh dầu, là những hợp chất dễ bay hơi ở nhiệt độ cao (>

50oC). Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 45oC để thủy phân cành lá quế, vỏ

quế vừa đảm bảo quá trình thủy phân hiệu quả, vừa hạn chế sự tác động của nhiệt độ

lên chất lượng tinh dầu sau khi chưng cất.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất

Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Laccase/cơ chất và Htec2/cơ chất được thực hiện

theo mô tả ở phần thực nghiệm 3.5.2. Kết quả được chỉ ra ở Hình 4.8c và 4.8d.

Hình 4.8c. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase/cơ chất lên hàm lượng đường khử

0

10

20

30

40

50

60

70

30,0 35,5 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0

Hàm

lư

ợng đ

ườ

ng k

hử

(μ

g/m

l)

Nhiệt độ (oC)

Cành lá quế (LQ)

Vỏ quế (VQ)Cành lá quế Vỏ quế

0

20

40

60

80

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 1,0

Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g (μ

g/m

l)

Tỷ lệ E laccase/S (ml/g)

Cành lá quế Vỏ quế

Cành lá quế Vỏ quế

98

Hình 4.8d. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2/cơ chất lên hàm lượng

đường khử

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Laccase/cơ chất và Htec2/cơ

chất thực hiện theo phần thực nghiệm 3.5.2 (Hình 4.8c và 4.8d) cho thấy khi nồng độ

enzyme Laccase-Htec2 càng tăng hiệu quả thủy phân càng cao, có nghĩa là lượng

đường khử tạo thành càng nhiều và đạt cực đại tại nồng độ Laccase/cơ chất là 0,4

ml/g và nồng độ Htec2/cơ chất là 1,5% (đối với cành lá quế). Đối với vỏ quế các nồng

độ tương ứng là 0,7 ml/g và 1,5%.

Enzyme laccase thô từ G. lucidum có hoạt tính oxy hóa làm đứt gãy một số liên

kết của lignin, nới lỏng cấu trúc lignocellulose bền chắc, từ đó tạo điều kiện cho enzyme

cellulase và xylanase hoạt động phân giải các polysaccharid thành tế bào. Enzyme

Htec2 xúc tác cho các phản ứng thủy phân polysaccharid, chủ yếu là cellulose, xylan

bị phân cắt thành các oligosaccharid mạch ngắn, được tách ra khỏi cơ chất và khuếch

tán vào trong dung dịch, dẫn đến tăng độ hòa tan của các phân tử trong nước. Phản ứng

thủy phân hiệu quả cao, triệt để và tốn ít chi phí khi nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme

Laccase và Htec2 bổ sung vào phải tương ứng với nhau.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý

Ảnh hưởng của thời gian được xác định thông qua hàm lượng đường khử tạo

thành trong quá trình thủy phân. Kết quả được biểu diễn trên Hình 4.8e.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0

Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g kh

ử (

μg/m

l)

Tỷ lệ enzyme Htec2/cơ chất (%)

cành lá quế Vỏ quế

99

Hình 4.8e. Bảng và đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên hàm lượng đường khử

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý thể hiện ở Hình 4.8e cho thấy

thời gian cũng là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả thủy phân. Thời

gian càng dài thì hiệu quả thủy phân càng tăng và đạt cực đại ở 8 h. Khi đó hàm lượng

đường khử ở mẫu lá quế là 78,14 μg/ml, ở mẫu vỏ quế là 61,14 μg/ml. Nếu tiếp tục

kéo dài thời gian, hiệu quả thủy phân không tăng, ngược lại hàm lượng đường còn

giảm.

Thời gian kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, tăng thời gian

tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Tuy nhiên,

độ bền của enzyme ở nhiệt độ xác định cũng nằm trong khoảng giới hạn. Nếu kéo dài

thời gian thủy phân quá mức thì hoạt tính của enzyme cũng giảm đồng thời các vi

sinh vật lạ phát triển, hoạt động sinh ra nhiều sản phẩm thứ cấp. Còn nếu thời gian

thủy phân ngắn, sự phân cắt cellulose chưa triệt để, hiệu suất thủy phân kém. Các số

liệu và phân tích trên cho thấy thủy phân lignocellulose trong các mẫu cành lá quế,

vỏ quế thì thời gian 8 h là thích hợp.

Nhận xét chung:

Các kết quả nêu trên cho thấy các điều kiện sau đây là tốt nhất cho quá trình

phân giải thành tế bào cành lá và vỏ quế bằng hệ enzyme Laccase-Htec2:

- pH = 4,5 - 5,0

- Nhiệt độ thủy phân: 45oC

0

20

40

60

80

100

2h 4h 6h 8h 10h 12h

Hàm

lượ

ng

đư

ờn

g kh

ử (

μg/

ml)

Thời gian thủy phân

Cành lá quế Vỏ quế

100

- Nồng độ Laccase/cơ chất là 0,4 ml/g và nồng độ Htec2/cơ chất là 1,5% (đối

với cành lá quế). Đối với vỏ quế các nồng độ tương ứng là 0,7 ml/g và 1,5%.

- Thời gian thủy phân: 8 giờ

4.1.4.2. Tối ưu hóa quá trình thủy phân cành lá quế với hệ enzyme kết hợp

Laccase-Htec2 bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm

Để tìm điều kiện tối ưu chính xác của quá trình thủy phân trên cơ sở mô hình

tính toán, chúng tôi áp dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm [7].

Qua phân tích các yếu tố ảnh hưởng, chọn pH là (Z1) , nhiệt độ T là (Z2), thời

gian t là (Z3), tỷ lệ Laccase/cơ chất là (Z4) , và tỷ lệ Htec2/cơ chất là (Z5).

Chọn kế hoạch trực giao bậc 2 Box- Wilson để mô tả vùng gần đường và tìm

điều kiện tối ưu. Với các yếu tố k=5, số thí nghiệm tại tâm n0 =1 ta có cánh tay đòn

α = 1,546. Các giá trị của các yếu tố ảnh hưởng ở các mức tương ứng được thể hiện

trên Bảng 4.10a

Bảng 4.10a. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng

Yếu tố -α -1 0 +1 + α

pH 4,23 4,5 5,0 5,5 5,77

T, 0C 37,3 40 45 50 52,7

t, h 4,91 6 8 10 10,09

Laccase E /S (ml/g) 0,245 0,3 0,4 0,5 0,555

Htec2 /S (%) (g/100g) 1,1 1,25 1,5 1,75 1,89

Trong đó các biến x1, x2, x3, x4, x5 là biến mã hóa mô tả tương ứng với các

biến thực Z1, Z2, Z3, Z4, Z5.

Tổng số thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc 2 là:

N = 22-1 +2.k + n0 = 25-1 + 2.5 + 1 =27

Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm ở Bảng 4.10b với 27 thí nghiệm

chính không nhân kế hoạch là 25-1 với hệ thức phát sinh là x5 = x1 *x2*x3*x4.

101

Bảng 4.10b. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm

STT x0 x1 x2 x3 x4 x5 x1x2 x1x3 x1x4 x1x5 x2x3 x2x4 x2x5 x3x4 x3x5 x4x5 x’1 x’

2 x’3 x’

4 x’5 y1 ŷ1 y2 ŷ2

1 + - - - - + + + + - + + - + - - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 65,208 64,589 0,942 0,938

2 + + - - - - - - - - + + + + + + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 64,19 65,542 0,953 0,944

3 + - + - - - - + + + - - - + + + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 67,284 68,322 0,941 0,931

4 + + + - - + + - - + - - + + - - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 69,598 69,275 0,943 0,937

5 + - - + - - + - + + - + + - - + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 71,18 71,040 0,946 0,942

6 + + - + - + - + - + - + - - + - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 71,494 71,993 0,945 0,948

7 + - + + - + - - + - + - + - + - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 70,588 71,273 0,936 0,935

8 + + + + - - + + - - + - - - - + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 72,57 72,255 0,947 0,941

9 + - - - + - + + - + + - + - + - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 72,576 72,090 0,945 0,944

10 + + - - + + - - + + + - - - - + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 72,89 73,042 0,947 0,950

11 + - + - + + - + - - - + + - - + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 71,984 72,323 0,936 0,938

12 + + + - + - + - + - - + - - + - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 73,966 73,275 0,946 0,943

13 + - - + + + + - - - - - - + + + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 73,88 74,031 0,940 0,949

14 + + - + + - - + + - - - + + - - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 75,844 74,984 0,951 0,954

15 + - + + + - - - - + + + - + - - 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 74,956 74,273 0,939 0,942

16 + + + + + + + + + + + + + + + + 0,23 0,23 0,23 0,23 0,23 75,27 75,226 0,946 0,947

17 + -1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 1,62 -0,77 -0,77 -0,77 74,594 72,618 0,962 0,947

18 + +1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 1,62 -0,77 -0,77 -0,77 75,714 74,091 0,966 0,959

19 + 0 -1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 1,62 -0,77 -0,77 74,654 72,362 0,965 0,958

20 + 0 +1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 1,62 -0,77 -0,77 76,322 74,078 0,941 0,947

21 + 0 0 -1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 1,62 -0,77 73,27 72,169 0,939 0,948

22 + 0 0 +1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 1,62 -0,77 77,438 77,306 0,969 0,955

23 + 0 0 0 -1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 -0,77 -0,77 74,872 71,294 0,930 0,957

24 + 0 0 0 +1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 -0,77 -0,77 78,872 78,055 0,976 0,967

25 + 0 0 0 0 -1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 -0,77 1,62 77,136 77,749 0,962 0,971

26 + 0 0 0 0 +1,546 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 -0,77 1,62 76,482 77,749 0,965 0,971

27 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,23 -0,77 -0,77 -0,77 -0,77 78,118 77,749 0,976 0,971

102

Trong bảng 4.10b, để ma trận kế hoạch hóa có tính trực giao thì các cột 𝑥𝑗2

(j=1.5) được biến đổi tuyến tính thành 𝑥𝑗′ theo công thức:

𝑥𝑗′ = 𝑥𝑗

2 - 𝑥𝑗2

= 𝑥𝑗2

- ∑ 𝑥𝑗𝑖

2𝑛𝑖=1

𝑁 (1)

Cũng trong bảng này thông số tối ưu hóa thứ nhất y1 là hàm lượng đường khử

(μg/ml) và thông số tối ưu hóa thứ hai y2 là hàm lượng tinh dầu (%).

Để xác định phương sai tái sinh đã tiến hành 3 thí nghiệm lặp ở điều kiện:

pH=5,

T= 45oC, τ = 8h, Laccase/S = 0.4, Htec2/S = 1,89 đã nhận được kết quả:

- Đối với y1: 77,71 77,71 và 76.62

- Đối với y2: 0,972 0,973 và 0,968

Các công thức tình để tìm mô hình theo tài liệu []:

bj = ∑ 𝑥𝑗𝑖 𝑦𝑖

𝑁𝑖=1

∑ 𝑥𝑗𝑖2𝑁

𝑖=1

; j = 1, k̅̅̅̅̅ (2)

𝑆𝑏𝑗

2 = 𝑆𝑡𝑠

2

∑ 𝑥𝑗𝑖2𝑁

𝑖=1

(3)

ŷ = 𝑏𝑜′ + ∑ 𝑥𝑖

𝑛𝑖=1 + ∑ 𝑏𝑢𝑗𝑥𝑢𝑥𝑗

𝑘𝑢,𝑗=1 + ∑ 𝑏𝑗𝑗𝑥𝑗

′𝑘𝑗=1 (4)

Hay chuyển hàm số ŷ về dạng thông thường

ŷ = 𝑏𝑜′ + ∑ 𝑏𝑗𝑥𝑗

𝑘𝑗=1 + ∑ 𝑏𝑢𝑗𝑥𝑢𝑥𝑗

𝑘𝑢,𝑗=1 + ∑ 𝑏𝑗𝑗𝑥𝑗

2𝑘𝑗=1 (5)

thì:

bo = 𝑏𝑜′ - 𝑏11𝑥1

2̅̅ ̅ - ……. - 𝑏𝑘𝑘𝑥𝑘2̅̅ ̅ (6)

Ý nghĩa của các hệ số kiểm định theo tiêu chuẩn Student, còn tính tương hợp

của mô hình với kết quả thực nghiệm kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher.

Chúng tôi đã sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 như là phần mềm viết bằng

ngôn ngữ thuật toán FORTRAN để xử lý số liệu ở bảng 4.10b và nhận được kết quả

sau:

ŷ1 = 79,728 + 0,476 x1 + 0,555x2 + 1,662 x3 + 2,187 x4 + 0,439 x1x5 - 0,436 x2x3 -

0,436 x2x4 - 0,689 x3x4 - 1,979 x12 - 1,839 x2

2 - 1,825 x32 - 1,26 x4

2 -1,286 x52 (7)

Với: Sts2 = 0,2984

S𝑏𝑗= 0,09001; S𝑏𝑢𝑗

=0,09657; S𝑏𝑗𝑗= 0,16158

103

t1 = 5,288; t2 =6,161; t3 = 18,447; t4 = 24,275; t15 = 4,542; t23 = 4,519; t24 =

4,519; t34 = 7,131; t11= 12,245; t22 = 11,381; t33 = 11,728; t44 = 7,799; t55 = 7,962 đề

lớn hơn tpr(f) = t0,05(2) = 4,3

𝑠𝑑ư2 =

∑ (𝑦1𝑖−ŷ1𝑖)2𝑛𝑖=1

𝑁−𝑙 =

∑ (𝑦1𝑖−ŷ1𝑖)2𝑛𝑖=1

27−14 = 3,07501

F= 𝑠𝑑ư

2

𝑠𝑡𝑠2 =

3,07501

0,2984 = 10,304 < Fp (f1, f2) = F0,05 (13,2) = 19,4

Giá trị tính toán ŷ1theo phương tính (7) được đưa vào bảng 2.

2. Đối với hàm lượng tinh dầu y2:

�̂�2 = 0,97498 + 0,00285 x1 - 0,00347 x2 + 0,00209 x3 + 0,00328 x4 - 0,00373

x12 - 0,00833 x2

2 - 0,00791 x32 - 0,00833 x4

2 - 0,00394 x52 (8)

Với Sts2 = 7.10-6

sbj=4,3626.10-4

sbuj=4,6771.10-4

sbjj= 7,8253.10-4

t1 =6,528; t2 =7,954; t3 =4,785; t4 =7,514; t11=4,769; t22=10,647; t33=10,112;

t44= 10,647; t55=5,031

đều lớn hơn tp (f)=4,3

𝑠𝑑ư2 =0,00012

F = 𝑠𝑑ư

2

𝑠𝑡𝑠2 =

0,00012

0,7 .10−6 = 17,467 < Fp (f1, f2) = F0.05 (17,2) = 19,45

Giá trị tính toán ŷ2 theo phương tính (8) được đưa vào bảng 2.

Như vậy đã nhận hai phương tính hồi quy (7) và (8) trường hợp với thực

nghiệm. Có thể nhận thấy rằng cả 5 yếu tố đều có ảnh hưởng tới các thông số đầu ra,

tuy nhiên ở phương toán (7) có ảnh hưởng của 4 cặp tương tác. Sử dụng phần mềm

Design Expert 7.0 ta có hình 3D mô tả mặt đáp ứng theo hai yếu tố nhiệt độ và thời

gian cho ŷ1như sau:

104

Hình 4.9a. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x1x2

Hình 4.9b. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x2x4

Hình 4.9c. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x3x5

Tuy nhiên cần giải bài toán tối ưu nhiều mục tiêu (trong trường hợp này là 2:

hàm lượng đường khử và hiệu suất tinh dầu) với nhiều yếu tố ảnh hưởng (trong trường

hợp này là 5 yếu tố: pH, nhiệt độ T, thời gian t, tỷ lệ enzyme laccase/cơ chất, tỷ lệ

enzyme Htec2/cơ chất.

Tìm hàm lượng tinh dầu lớn nhất

ŷ2 = 0,97498 + 0,00285 x1 - 0,00347 x2 + 0,00209 x3 + 0,00328 x4 -

0,00373 𝒙𝟏𝟐 - 0,00833 𝒙𝟐

𝟐 - 0,00791 𝒙𝟑𝟐 - 0,00833 𝒙𝟒

𝟐 - 0,00394 𝒙𝟓𝟐 (9)

Với các điều kiện ràng buộc: -1.546 ≤ xj ≤ 1.546 (j = 1-5)

ŷ1 70 μg/ml

105

Sử dụng thuật toán dung sai trượt FLEXIPLEX của quy hoạch phi tuyến trong

những giá trị ban đầu của các biến ta được kết quả: 𝑥1𝑜𝑝𝑡

=0,381; 𝑥2𝑜𝑝𝑡

=-0,209; 𝑥3𝑜𝑝𝑡

=-

1,242; 𝑥4𝑜𝑝𝑡

=0,196; 𝑥5𝑜𝑝𝑡

= -1,4 ứng với các giá trị thuộc: pH=5,2; T=44oC; τ=5h30’;

Laccase/S= 0,42 và E Htec2/s=1,15. Kết quả kiểm tra lại bằng thực nghiệm cho kết

quả hàm lượng đường 78,14 µg/ml, hàm lượng tinh dầu 0,98 %, tỷ lệ gia tăng tinh

dầu so với đối chứng không enzyme 41,94%.

4.1.4.3. Đề xuất quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-

Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec

trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia

Cành lá quế

Tiền xử lý

H2O/24h

Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S 1,15%,

nhiệt độ 440C, pH 5.2, thời gian

5h30’, tốc độ 200 rpm,

Thủy phân

Tinh dầu+ Nước

Ủ

Xay, nghiền

Chưng cất tinh dầu

Bã nguyên liệu

Phân bón

Na2SO4

Tinh dầu Cassia

106

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu nêu trên, chúng tôi đề xuất một qui trình

công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ

cành lá quế C. cassia.

Thuyết minh quy trình

1. Nguyên liệu: cành lá quế sau khi thu hái được phơi khô trong bóng râm và

đưa về bảo quản trong kho.

2. Tiền xử lý nguyên liệu: nguyên liệu cành lá quế chặt nhỏ và xay nghiền tới

kích thước lọt sàng 3 mm.

3. Ủ nguyên liệu: nguyên liệu trước khi xử lý enzyme bổ sung thêm nước theo

tỷ lệ 1:5, ngâm ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ thường nhằm gia tăng sự hút nước của

nguyên liệu.

4. Thủy phân: Nguyên liệu cho vào nồi hai vỏ có hệ thống điều nhiệt, điều

chỉnh pH bằng axit HCl loãng về pH 5,2. Gia nhiệt đến khi hỗn hợp trong bình thủy

phân đạt 45oC thì bắt đầu bổ sung enzyme theo tỷ lệ Laccase 0,42 ml/g, Htec2 1,15%.

Trong suốt quá trình phản ứng, nhiệt độ được duy trì ở 45oC và quá trình được kiểm

soát bằng hàm lượng đường khử sinh ra. Thời gian phản ứng là 5 giờ 20 phút, được

tính từ khi bổ sung enzyme.

3. Chưng cất tinh dầu bằng cất cuốn hơi nước: Hỗn hợp sau thủy phân được

cho vào nồi có lắp hệ thống chưng cất hơi nước kiểu Clevenger. Gia nhiệt đến nhiệt

độ sôi để hơi nước cuốn theo tinh dầu, dẫn qua hệ thống làm mát thu được hỗn hợp

tinh dầu và nước. Quá trình chưng cất diễn ra khoảng 6 h để chiết triệt để tinh dầu

trong nguyên liệu. Tinh dầu quế nặng hơn nước nên sẽ chìm xuống dưới. Tách phần

tinh dầu khi hỗn hợp tinh dầu và nước phân tách hoàn toàn thành 2 pha.

4. Phần tinh dầu được thu và làm khan bằng Na2SO4 cho tinh dầu thành phẩm.

Bã nguyên liệu sau chưng cất tinh dầu có thể bổ sung vi sinh vật phân hủy để

làm phân hữu cơ.

4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong

chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna

4.2.1. Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna

Kết quả xác định các thành phần kiến tạo nên khung cấu trúc của gỗ gió bầu

(Bảng 4.11a) cho thấy gỗ gió bầu mang các đặc trưng của nguyên liệu chứa

lignocellulose bao gồm cellulose 34,75%, hemicellulose 15,27% và lignin 29,10%. Hàm

107

lượng cellulose và lignin cao cho thấy thành tế bào của nguyên liệu rất bền chắc, gây khó

khăn cho chưng cất tinh dầu. Điều đó giải thích vì sao trong công nghệ truyền thống, bột

gỗ gió bầu thường được ủ ướt một thời gian trước khi đưa đi chưng cất.

Bảng 4.11a. Kết quả phân tích thành phần bột gỗ gió bầu A. crassna

(hàm lượng tính theo % khối lượng khô tuyệt đối)

TT Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng (%)

1 Cellulose 34,75 ± 0,21

2 Lignin 29,10 ± 0,18

3 Pentose 15,27 ± 0,20

4 Các hợp chất trích ly (cồn) 8,32 ± 0,13

4.2.2. Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng

và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna

Dựa trên các kết quả thu được khi nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chưng

cất tinh dầu quế, chúng tôi đã chọn hệ enzyme Laccase-Htec2 để áp dụng cho việc

chưng cất tinh dầu trầm hương.

Kết quả sau 3 ngày chưng cất, mẫu đối chứng (mẫu không có enzyme) cho

0,024% tinh dầu (tính theo khối lượng mẫu khô gió), mẫu nghiên cứu (mẫu có

enzyme) cho 0,032% tinh dầu, tỷ lệ gia tăng tinh dầu đạt 33,3%.

Thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu (Bảng 4.11b) được xác định bằng

phương pháp GC-MS, trong đó việc nhận dạng chất dựa trên sự phù hợp của phổ khối

và chỉ số thời gian lưu (RI, chỉ số Kovats) với các dữ kiện trong ngân hàng dữ liệu

của máy.

Bảng 4.11b. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương thu

được từ gỗ cây gió bầu A. crassna bằng 2 phương pháp khác nhau

STT Chất CTCT RI

Mẫu không

enzyme

(%)

Mẫu có

enzyme

(%)

1 2-Allyl-4-methylphenol C10H12O 1288 0,42

2 Copaene <a-> C15H24 1409 0,56

3 Curcumene <ar-> C15H22 1507 0,15

4 Chamigrene <b-> C15H24 1509 0,24

108

STT Chất CTCT RI

Mẫu không

enzyme

(%)

Mẫu có

enzyme

(%)

5 Muurola-4(14),5-diene <trans-> C15H24 1513 0,12

6 Ionol C15H24O 1519 0,71 2,97

7 Muurolene <a-> C15H24 1537 0,47

8 Selinene <a-> C15H24 1543 0,13

9 Dihydroagarofuran <cis-> C15H26O 1550 0,11

10 Cadinene <d-> C15H24 1552 0,52

11 Calamenene <trans-> 1566 0,41

12 n-Dodecanoic acid C12H24O2 1568 0,12

13 Nerolidol <Z-> C15H26O 1579 0,32

14 Calacorene <a-> C15H20 1590 0,28

15 Agarofuran <a-> C14H22O 1550 0,17

16 Unknown 1628 1,50

17 Salvial-4(14)-en-1-one C15H24O 1666 0,23

18 Eudesmol <10-epi-g-> C15H26O 1676 0,41 1,27

19 Eudesmol <g-> C15H26 1682 0,58 2,72

20 Agarospirol C15H26O 1685 0,23 0,72

21 Guaiol C15H26O 1688 0,50

22 Hinesol C15H26O 1690 0,16 0,56

23 Unknown 1693 1,46

24 Unknown 1699 1,88

25 Valerianol C15H26O 1704 0,89 2,59

26 Cadinol <a-> C15H26O 1710 0,36

27 Eudesmol <b-> C15H26O 1714 0,57 1,61

28 Intermedeol <neo-> C15H26O 1716 0,86 2,08

29 Unknown 1727 1,81

30 Cadalene C15H18 1733 0,82

109

STT Chất CTCT RI

Mẫu không

enzyme

(%)

Mẫu có

enzyme

(%)

31 Eudesma-4(15),7-dien-1b-ol C15H24O 1739 0,83

32 Eudesma-3,11-dien-8-one C15H22O 1746 0,63

33 Unknown 1750 2,26

34 Cadina-1(10),4-dien-8a-ol C15H24 1759 1,40 1,96

35 Unknown 1768 1,49

36 n-Tetradecanoic acid C14H28O2 1771 0,81

37 Unknown 1774 3,59

38 Calamenen-10-one <10-nor> C14H18O 1781 0,43 0,64

39 Isonaviculol 1795 1,08 1,98

40 Unknown 1800 3,07

41 Unknown 1803 1,13

42 Costol <a-> 1824 0,78 1,39

43 Neopetasone C15H22O 1829 0,11 0,76

44 Unknown 1832 2,21

45 Unknown 1842 1,31 2,54

46 Unknown 1857 1,80

47 n-Pentadecanoic acid C15H30O2 1873 2,41

48 Unknown 1891 2,11 3,33

49 Nootkatone C15H22O 1896 0,57 0,86

50 Cyclohexadecanolide C16H30O2 1957 1,97 0,72

51 n-Hexadecanoic acid C16H32O2 1979 47,54 19,45

52 Ethyl palmitate C18H36O2 2004 0,76

53 Unknown 2065 1,21

54 Unknown 2153 1,23

55 Oleic acid C18H34O2 2157 6,44 3,44

56 Unknown 2163 4,32

110

STT Chất CTCT RI

Mẫu không

enzyme

(%)

Mẫu có

enzyme

(%)

57 n-Octadecanoic acid C18H36O2 2178 1,16

58 Ethyl oleate C20H38O2 2181 0,61

59 Diisooctyl phthalate C24H38O4 2566 0,17

Tổng 81,52 80,49

Tổng các dẫn xuất của axit béo 59,85 22,89

Tổng các Terpen hydrocarbon 0 3,70

Tổng các Terpen chứa oxy 8,78 24,76

Tổng các chất khác 2,14 1,64

Tổng các chất chưa xác định được có

hàm lượng > 1%

10,75 27,50

Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương (Hình 4.11).

Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương

Các kết quả trên Bảng 4.11b cho thấy:

- Việc xử lý bột gỗ gió bầu với hệ enzyme Laccase-Htec2 để phá hủy cấu trúc

lignocellulose trước khi chưng cất làm tăng hiệu suất thu hồi tinh dầu từ 0,024% lên

0,032%.

111

- Hàm lượng của các thành phần có giá trị, mang mùi trầm hương đặc trưng

(Bảng 4.11b) cũng tăng lên rõ rệt, cụ thể cis-dihydroagarofuran (0,11%, đối chứng

0%), α-agarofuran (0,17%, đối chứng 0%), agarospirol (0,72%, đối chứng 0,23%),

hinesol (0,56%, đối chứng 0,16%), valerianol (2,59%, đối chứng 0,89%),

neopetasone (0,76%, đối chứng 0,11%), tổng các terpen hydrocarbon (3,70%, đối

chứng 0%), tổng các terpen chứa oxy (24,76%, đối chứng 8,78%).

- Các axit béo và dẫn xuất của chúng là các thành phần không mong muốn

trong tinh dầu trầm hương. Trong mẫu nghiên cứu, hàm lượng của chúng chỉ còn

22,89%, ít hơn hẳn so với đối chứng là 59,85%.

- Tổng số các chất chưa được xác định (unknown) trong kết quả phân tích tinh

dầu trầm hương là rất cao, vì thế cần có các nghiên cứu hóa học tiếp theo để làm rõ.

4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất

lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus

albarcares

4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit béo của một số loại

đầu cá ngừ của Việt Nam

4.3.1.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền

Kết quả phân tích hàm lượng protein, lipid, nước, tro của 08 mẫu đầu (đã bỏ

mang, mắt) của 08 loài cá ngừ của Việt Nam được chỉ ra ở Bảng 4.12:

Bảng 4.12. Thành phần các chất nền của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam

Mẫu Hàm lượng (%)

Nước Lipid Protein* Tro

Cá ngừ ồ

Auxis rochei 61,67 ± 0,23 4,50 ± 0,24 17,3 ± 0,38 9,43 ± 0,46

Cá ngừ chù

Auxis thazard 62,44 ± 0,13 5,10 ± 0,32 18,32 ± 0,26 8,99 ± 0,28

Cá ngừ chấm

Euthynnus affinis 59,39 ± 0,12 5,50 ± 0,14 18,23 ± 0,25 8,98 ± 0,48

Cá ngừ bò

Thunnus tonggol 54,72 ± 0,11 11,71 ± 0,32 17,98 ± 0,33 9,22 ± 0,21

112

Mẫu Hàm lượng (%)

Nước Lipid Protein* Tro

Cá ngừ sọc dưa

Sarda orientalis 55,82 ± 0.21 8,01 ± 0,24 18,75 ± 0,41 7,45 ± 0,32

Cá ngừ vằn

Katsuwonus

pelamis

59,50 ± 0,32 7,21 ± 0,21 17,30 ± 0,45 10,21 ± 0,35

Cá ngừ vây vàng

Thunnus albacares 56,32 ± 0,36 14,80 ± 0,28 17,67 ± 0,43 9,31 ± 0,37

Cá ngừ mắt to

Thunnus obesus 57,45 ± 0,43 14,20 ± 0,48 17,78 ± 0,37 8,13 ± 0,38

Kết quả trên Bảng 4.12 cho thấy:

- Hàm lượng protein của các mẫu dao động trong khoảng 17 - 20%, tương ứng

với 40 - 50% protein tính theo lượng chất khô. Phụ phẩm đầu cá ngừ có hàm lượng

protein cao và chứa nhiều các axit amin thiết yếu, nên đã có nhiều nghiên cứu thủy

phân nguồn protein này [12], [101], [101].

- Hàm lượng lipid của các mẫu dao động trong khoảng 4,5 - 14,8%. Kết quả

cho thấy hàm lượng lipid tăng dần theo kích thước loài, cao nhất là nhóm cá ngừ đại

dương có kích thước lớn (500 – 2.000 mm) như cá ngừ vây vàng (14,8%), cá ngừ mắt

to (14,2%) và thấp nhất ở các loài cá ngừ kích thước nhỏ (140 - 310 mm) như cá ngừ

ồ (4,5%), cá ngừ chù (5,1%) . So sánh với một số phế liệu đầu từ một số loài cá khác,

một số phế liệu đầu cá hồi (3,57%), đầu cá basa (3,41%), đầu cá tra (3,15%) (Phạm

Quốc Long, 2013) [17] cho thấy đây là nguồn nguyên liệu có thể sản xuất dầu cá phục

vụ trong công nghiệp thực phẩm và y dược.

4.3.1.2. Kết quả phân tích thành phần axit béo

Để tìm kiếm nguồn nguyên liệu giàu các axit béo không no n-3 PUFA, đặc

biệt là EPA, DHA và DPA, thành phần các axit béo trong các lipid tổng thu được

đã được phân tích bằng phương pháp GC-MS. Kết quả được trình bày trên Bảng

4.13.

113

Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu một số loài cá

ngừ của Việt Nam (hàm lượng tính bằng % diện tích của các peak)

TT Axit béo Ngừ ồ Ngừ

chù

Ngừ

chấm

Ngừ

vằn

Ngừ

bò

Sọc

dưa

Vây

vàng

Mắt

to

1 14:00 2,82 0,83 0,74 3,50 3,14 1,73 2,70 3,33

2 15:00 0,91 0,71 0,73 1,20 1,12 0,94 0,76 1,14

3 16:1n-9 5,93 0,23 2,38 0,23 0,22

4 16:1n-7 2,05 6,34 4,76 3,08 5,34 5,19

5 16:00 22,12 24,24 23,12 18,43 19,45 20,04 13,78 22,86

6 17:1n-9 1,09 0,52 1,13 1,12 0,84 0,82 0,76

7 17:1n-7 0,92 0,64 0,82 0,83 0,64 0,82

8 17:00 0,93 1,46 1,47 1,74 1,53 1,65 0,80 1,38

9 18:4n-3 0,52 0,54 0,96

10 18:2n-6 2,13 1,33 1,43 1,09 1,19 1,12 1,43 1,34

11 18:1n-9 22,76 16,36 16,42 16,27 13,09 12,35 14,87 10,10

12 18:1n-7 3,12 3,83 3,75 3,24 2,29 3,23 2,71 3,17

13 18:00 6,11 11,46 11,86 7,72 8,74 12,61 4,33 8,39

14 19:00 0,23 0,71 0,31 0,51 0,37 0,52 0,17

15 20:5n-3

(EPA) 4,54 4,55 4,74 5,89 6,31 5,22 8,36 5,94

16 20:4n-6 1,94 4,32 4,42 3,22 2,71 4,36 3,11 2,12

17 20:4n-3 0,31 0,61 0,56 0,35 0,20

18 20:2n-6 0,30 0,31 0,59 0,44 0,36 0,84

19 20:1n-9 1,23 1,06 0,93 1,61 1,09 0,91 2,72 0,47

20 20:00 0,34 0,18 0,31 0,43 0,48 0,52 0,24 0,37

21 22:6n-3

(DHA) 20,33 21,25 18,98 20,26 23,44 22,86 27,75 27,30

22 22:5n-3 0,48 0,75 0,56 2,12 2,04 1,75 3,04 1,60

23 22:3n-6 1,18 1,10 2,53 0,82 2,26 0,73 0,20

24 22:4n-6 0,89 1,72 1,80 1,22 2,71 1,94 2,00

25 22:1n-9 0,24 1,02 0,40

26 22:00 0,50 0,23 0,35

114

TT Axit béo Ngừ ồ Ngừ

chù

Ngừ

chấm

Ngừ

vằn

Ngừ

bò

Sọc

dưa

Vây

vàng

Mắt

to

27 23:00 0,20

28 24:1n-9 0,73 0,72 0,25 0,84 1,60 0,40

29 24:00:00 0,27 0,38

30 unknow 0,22 0,25 0,40 0,50 2,70

Tổng 100 100 100 100 100 100 100 100

Tổng SFA 33,44 39,59 39,04 33,76 35,45 38,59 22,74 37,43

Tổng MUFA 35,05 24,78 25,97 29,65 24,21 22,63 28,86 19,33

Tổng PUFA 31,49 35,63 34,77 36,34 39,94 38,28 48,36 40,50

n-3 PUFA 25,35 26,86 24,28 29,4 32,89 30,18 37,82 34,84

EPA+DHA+DPA 25,35 26,55 24,28 28,27 31,79 29,83 39,15 34,84

Hệ số đánh giá* 114,08 136,99 133,54 217,30 343,98 263,12 559,74 494,73

Ghi chú: Hệ số đánh giá dựa trên hàm lượng lipid tổng * hàm lượng n-3 PUFA

Bảng 4.13 cho thấy có khoảng 30 loại axit béo từ C14 - C24 được tìm thấy trong

lipid tổng từ phụ phẩm đầu của 08 loài cá ngừ. Trong đó thành phần axit béo no SFA

chiếm 22,74 - 39,59%, axit béo không no một nối đôi MUFA chiếm 19,33 - 35,05%,

và axit béo không no đa nối đôi PUFA chiếm 31,49 - 48,36%. Đáng chú ý là phụ

phẩm đầu cá ngừ đại dương kích thước lớn (cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to) có

hàm lượng các acid béo không no đa nối đôi n-3 PUFA cao, lần lượt là 48,36 và

40,5%. Đây là nhóm axit béo có vai trò quyết định chất lượng của lipid với các thành

phần chủ yếu là EPA, DHA và DPA.

So sánh thành phần n-3 PUFA của phụ phẩm đầu cá ngừ với các loài cá khác,

chỉ số này tương đương hoặc vượt trội so với một số loài cá nước mặn khác được

Phạm Quốc Long và cs. (2013) [17] công bố như cá Nục 27,75%, cá Đồng 27,88%,

cá Cơm 23,72% và một số phế liệu cá như đầu cá tra 9,76%, đầu cá basa 10,34%, đầu

cá hồi 12,14% (tác giả Linder M., 2005 [120], công bố hàm lượng n-3 PUFA của đầu

loài cá hồi họ nghiên cứu là 31,7%).

Qua hệ số đánh giá được xác định dựa trên hàm lượng lipid tổng và hàm lượng

n-3 PUFA cho thấy 03 loài cá ngừ có triển vọng trong việc sử dụng làm nguyên liệu

để sản xuất dầu cá chất lượng cao giàu n-3 PUFA là cá ngừ bò, cá ngừ vây vàng, cá

115

ngừ mắt to với hệ số đánh giá cao, lần lượt là 343,98; 559,74 và 494,73; trong đó cao

nhất là cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares. Trong khuôn khổ luận án, chúng tôi lựa

chọn đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares có hệ số đánh giá cao nhất làm đối

tượng nghiên cứu chiết xuất lipid và làm giàu các hợp chât n3-PUFA.

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid từ

đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares

4.3.2.1. Tác động của việc xử lý enzyme lên hiệu suất chiết xuất lipid và mức

độ thủy phân nguyên liệu.

Enzyme protease được thử nghiệm để thủy phân đầu cá ngừ vây vàng Thunnus

albacare đều là các chế phẩm protease thương mại thuộc hai nhóm enzyme protease

từ vi sinh vật (Protamex và Alcalase) và từ thực vật (Bromelain và Papain).

Sau thủy phân, hỗn hợp phản ứng được ly tâm cho ta 2 sản phẩm mục tiêu là

lipid (dầu cá) và dịch protein hòa tan giàu axit amin. Kết quả thu nhận lipid và protein

hòa tan từ quá trình thủy phân bằng enzyme protease khác nhau được trình bày trên

Bảng 4.14, có so sánh với sản phẩm thu được bằng phương pháp ép nhiệt và phương

pháp chiết xuất với dung môi (phương pháp Blight & Dyer).

Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình chiết xuất lipid

Phương pháp Sản phẩm

Lipid (%) Protein hòa tan (%)

Ép nhiệt 3,22 ± 0,34 Dạng thô

Blight & Dyer 14,80 ± 0,28 Loại bỏ

Protamex 9,19 ± 0,14 3,71 ± 0,14

Alcalase 7,84 ± 0,33 3,63 ± 0,26

Bromelain 10,23 ± 0,42 4,12 ± 0,15

Papain 6,71 ± 0,43 3,14 ± 0,34

Kết quả Bảng 4.14 cho thấy:

- So với phương pháp truyền thống (ép nhiệt), phương pháp thủy phân bằng

enzyme protease đã cải thiện đáng kể quá trình tách dầu từ 3,22% lên 6,71 – 10,23%

(tăng 2 - 3 lần), đồng thời thu được sản phẩm protein hòa tan giàu axit amin tự do có

giá trị dinh dưỡng cao hơn khi sử dụng phương pháp ép nhiệt.

116

- So sánh với phương pháp sử dụng dung môi (phương pháp Blight & Dyer),

phương pháp thủy phân bằng enzyme protease có hiệu suất chiết xuất khoảng 45-

70%, phụ thuộc vào từng loại enzyme. Tuy nhiên, phương pháp enzyme tận thu được

triệt để nguồn nguyên liệu protein có giá trị cao trong khi phương pháp sử dụng dung

môi hữu cơ, protein bị loại bỏ trong quá trình chiết lipid. Đặc biệt, về mặt cảm quan,

dầu cá thu được bằng phương pháp thủy phân enzyme có màu sắc (màu vàng sáng)

đẹp hơn so với phương pháp chiết xuất bằng dung môi (màu vàng nâu) và không có

dư lượng dung môi hữu cơ.

- So sánh 4 loại enzyme protease sử dụng trong nghiên cứu, enzyme Bromelain

cho hiệu suất chiết xuất cao hơn các enzyme còn lại.

4.3.2.2. Thành phần axit béo của các lipid chiết xuất từ đầu cá ngừ vây

vàng Thunnus albacare bằng các phương pháp khác nhau

Thành phần axit béo của lipid tổng chiết bằng các phương pháp khác nhau

được xác định bằng GC-MS. Kết quả được tổng hợp trên Bảng 4.15:

Bảng 4.15. Thành phần axit béo của các lipid chiết xuất từ đầu cá ngừ vây vàng

T. albacare bằng các phương pháp khác nhau (hàm lượng tính bằng % diện tích

của các peak)

Axit béo Ép B&D Protamex Alcalase Bromelain Papain

14:00 2,97 2,71 1,08 1,01 1,86 2,43

15:00 0,36 0,75 0,57 0,72 0,86 1,05

16:1n-9 5,48 0,23 2,07 2,01 3,93

16:1n-7 5,35 0,45 3,25 2,41

16:2n-6 0,66 0,53

16:00 37,43 13,75 20,19 26,48 19,24 22,05

17:1n-9 0,21 0,8 0,8 1,07 0,79 0,74

17:1n-7 0,82 0,58 0,46 0,67 0,63

17:00 0,67 0,79 1,53 1,5 1,52 0,95

18:4n-3 0,97 0,36 1,02

18:2n-6 0,6 1,5 0,89 1,58 1,08 0,63

18:1n-9 24,68 14,89 14,5 14,41 11,88 16,61

117

Axit béo Ép B&D Protamex Alcalase Bromelain Papain

18:1n-7 4,78 2,73 3,34 3,75 2,97 6,93

18:00 9,85 4,28 14,33 15,77 11,56 6,69

19:00 0,19 0,59 0,46 0,43 0,16

20:4n-6 0,95 3,1 6,25 5,76 4,41 2,17

20:5n-3 2,42 8,41 4,27 3,47 5,47 9,51

20:3n-6 0,2 0,31

20:4n-3 0,79 0,86 0,62

20:2n-6 0,98 0,72 0,4 0,35

20:1n-9 0,69 2,75 2,12 0,68 1,76

20:00 0,07 0,22 0,63 0,32 0,37 0,21

22:4n-6 0,43 1,91 2,12 2,04 2,27 0,69

22:6n-3 7,34 27,81 16,78 15,29 22,9 16

22:5n-3 1,06 3,00 0,81 0,8 1,83

22:00 0,57 0,27 0,38

22:3n-6 1,22 0,9

22:1n-9 1,02

23:00 0,25 0,66 0,18

24:1n-9 0,37 2,62 0,23 1,53

24,0 0,65 0,39

unknow 0,01 0 1,03 1,33 1,25

Tổng 100 100 100 100 100 100

Tổng SFA 51,35 22,69 40,39 47,19 38,12 33,54

Tổng MUFA 35,84 28,96 26,48 21,93 21,77 33,01

Tổng PUFA 12,82 48,35 32,1 30,88 40,11 33,45

n-3 PUFA 12,82 40,98 24,86 19,56 31,42 27,15

Hệ số đánh giá 34,84 606,5 228,46 158,82 321,42 182.17

Ghi chú: B&D: chiết xuất lipid theo phương pháp Blight &Dyer

Kết quả phân tích nêu trên Bảng 4.15 cho thấy:

- Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ (Blight & Dyer) vẫn là phương pháp

hiệu quả nhất trong chiết xuất lipid từ sinh vật biển, cho tổng các axit béo n-3 PUFA

118

là 40,98%, trong khi chiết xuất nhờ protease, hàm lượng n-3 PUFA dao động 19,56-

31,42%, thấp nhất 19,56% khi sử dụng Alcalase, cao nhất 31,42% khi sử dụng

Bromelain. Điều đó cho thấy trong quá trình xử lý với enzyme có thể đã xảy ra hiện

tượng hydro hóa, oxy hóa, hoặc các hiện tượng khác làm biến đổi chất lượng của dầu.

- So với phương pháp chiết xuất truyền thống (ép nhiệt), phương pháp tách

dầu bằng enzyme đã làm tăng chất lượng dầu khi cho tỷ lệ các axit béo không no đa

nối đôi n-3 PUFA tăng cao hơn gấp 2 - 3 lần (từ 10,82% lên 20 - 30%). Có thể thấy

rằng, các axit béo không no đa nối đôi rất nhạy cảm với nhiệt độ. Phương pháp ép

nhiệt diễn ra ở nhiệt độ cao (trên 1000C) đã làm biến đổi chất lượng của lipid, các axit

béo no (SFA) chiếm 51.35%, trong khi phương pháp thủy phân thực hiện ở nhiệt độ

50oC nên ít ảnh hưởng đến chất lượng của dầu.

- So sánh 4 loại enzyme protease sử dụng trong nghiên cứu, các enzyme từ

thực vật (Bromelain và Papain) cho tỷ lệ các axit béo không no n-3 PUFA cao hơn

hai enzyme từ vi sinh vật (Protamex và Alcalase). Các enzyme protease từ thực vật

như papain, bromelain ít được sử dụng hơn các enzyme Protamex, Alcalase trong

công nghệ thủy phân protein để thu axit amin, nhưng lại được nghiên cứu nhiều để

xử lý nguyên liệu trong chiết xuất các loại dầu béo từ cá hay hạt chứa dầu, do các

enzyme này ngoài khả năng xúc tác còn là một dược liệu có khả năng kháng viêm và

chống oxy hóa. Mặt khác, các enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao hơn các enzyme

từ vi sinh vật, hạn chế sự phát triển vi sinh vật trong quá trình thủy phân, đồng thời

có tác dụng như là chất chống oxy hóa tự nhiên hạn chế quá trình oxy hóa lipid trong

quá trình thủy phân.

- So với 3 enzyme còn lại, Bromelain cho hệ số đánh giá cao nhất và được lựa

chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Qua quá trình khảo sát, chúng tôi lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình

thủy phân đầu cá ngừ vây vàng để thu nhận dầu béo và axit amin hòa tan như sau: Sử

dụng Bromelain làm enzyme thủy phân; Tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:2; Tỷ lệ

enzyme/cơ chất là 1%; Nhiệt độ thủy phân 50oC; Tốc độ khuấy là 200 vòng/phút;

Thời gian thủy phân là 6 giờ.

4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL trong quá trình làm

119

giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T. albacares bằng

phương pháp ure

Lipid tổng sau khi chiết xuất bằng enzyme Bromelain được thủy phân bởi

enzyme lipase CRL từ nấm men Candida rugosa thành các axit béo tự do. Sau đó, sử

dụng phương pháp tạo phức với Ure/ethanol để làm giàu các axit béo không no đa

nối đôi n-3 PUFA.

4.3.3.1. Khảo sát điều kiện thủy phân lipid thành các axit béo tự do bằng

enzyme lipase CRL

Quá trình thủy bằng lipase CRL trong hệ dung môi hai pha n-hexan và nước

được thực hiện theo phương pháp của Fernádez và cs. (2011). Sau đây là các kết quả

khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này (pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme/cơ

chất, thời gian thủy phân). Số liệu thực nghiệm được đánh giá dựa trên phương pháp

bình phương tối thiểu.

Ảnh hưởng của pH

Quá trình thủy phân có sự thay đổi giá trị pH từ 5,0 đến 9,0 cho thấy lipase

CRL hoạt động thích hợp trong môi trường kiềm pH 7,5 - 8,5,trong đó pH 8,0 cho

hiệu quả thủy phân cao nhất với sản phẩm có chỉ số axit là 98.4 mg KOH/g và hiệu

suất thủy phân đạt 49.47% (Bảng 4.16a).

Bảng 4.16a. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do

của lipase CRL

TT pH Chỉ số axit (mg KOH/g) Mức độ thủy phân (%)

1 5,0 78,2 39,32

2 5,5 80,5 40,47

3 6,0 84,7 42,58

4 6,5 89,9 45,20

5 7,0 92,5 46,51

6 7,5 90,7 45,60

7 8,0 98,4 49,47

8 8,5 89,7 45,10

9 9,0 82,7 41,58

Phương trình hồi qui (2.1) biểu diễn ảnh hưởng của yếu tố pH có dạng parabol

120

như sau:

ŷ = −31,023 + 31,528𝑥 − 1,999𝑥2 (2.1)

Phương trình hồi quy (2.1) với tỷ số tương quan ϴ = 0,92 và sai số tương ứng

trung bình δ = 2,22% mô tả ảnh hưởng của pH khá phù hợp với số liệu thực nghiệm

(Bảng 4.16b). Kết quả tính toán chỉ ra rằng ở pH = 7,5 giá trị y là lớn nhất. Giá trị pH

7,5 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 4.16b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố pH

STT x y ŷ | y - ŷ | δ,%(𝜹 = 𝟐, 𝟐𝟐)

1 5 78,2 76,63 1,57 2,00

2 5,5 80,5 81,90 1,4 1,74

3 6 84,7 86,17 1,47 1,74

4 6,5 89,9 89,44 0,46 0,51

5 7 92,5 91,71 0,79 0,86

6 7,5 98,7 95,98 2,72 4,32

7 8 93,4 92,25 1,15 2,25

8 8,5 89,7 92,52 2,82 3,14

9 9 82,7 80,12 2,58 3,02

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Dải nhiệt độ được khảo sát từ 20 đến 50oC cho thấy lipase CRL hoạt động

thích hợp ở nhiệt độ 35 - 40oC (Bảng 4.17a).

Bảng 4.17a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự

do của lipase CRL

TT Nhiệt độ (oC) Chỉ số axit (mg KOH/g) Hiệu suất thủy phân (%)

1 20 79,7 40,07

2 25 88,6 44,54

3 30 98,4 49,47

4 35 102,12 51,34

5 40 108,34 54,47

6 45 95,12 47,82

7 50 87,32 43,90

Phương trình hồi qui có dạng parabol như sau:

121

ŷ = 61,988 + 1,616x – 0,029x2 (2.2)

Bảng 4.17b cho thấy phương trình hồi quy (2.2) với tỷ số tương quan ϴ =

0,938 và sai số tương quant rung bình 𝛿 = 3,05% mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ khá

phù hợp số liệu thực nghiệm. Kết quả tính cũng chỉ ra ở T = 400C giá trị y là lớn nhất.

Bảng 4.17b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ

STT x y Ŷ |∆| Δ,%(𝜹 = 𝟑, 𝟎𝟓%)

1 20 79,7 82,77 3,07 3,68

2 25 88,6 90,83 2,23 2,58

3 30 98,4 102,58 4,18 4,71

4 35 102,12 103,06 0,94 1,14

5 40 108,34 109,75 1,41 1,79

6 45 95,12 95,87 0,75 0,99

7 50 87,32 90,56 3,24 4,8

8 55 79,7 82,71 3,01 4,51

Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất

Bảng 4.18a. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân lipid thành

axit béo tự do của lipase CRL

TT Tỉ lệ E/S Chỉ số axit (mg KOH/g) Hiệu suất thủy phân (%)

1 0,2 88,5 44,49

2 0,4 91,9 46,20

3 0,6 108,3 54,45

4 0,8 106,5 53,54

5 1,0 102,2 51,38

6 1,2 96,78 48,66

7 1,4 90,45 45,48

Tỉ lệ E/S được khảo sát từ 0,2 đến 1,4, kết quả cho thấy tỉ lệ E/S cho hiệu quả

thủy phân cao nhất ở trong khoảng 0,6 đến 0,8. Kết quả tính toán cho phương trình

hồi quy ở dạng parabol như sau:

ŷ = 79,346 + 49,706x - 31,038x2 (2.3)

122

Phương trình hồi quy (2.3) với ϴ = 0,94 và 𝛿=1,09% mô tả khá tốt số liệu thực

nghiệm. Kết quả chỉ ra rằng giá trị ŷ lớn nhất ở tỉ số E/S bằng 0,8 khá phù hợp với

kết quả thực nghiệm.

Bảng 4.18b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất

STT x y ŷ |∆| δ

1 0,2 88,5 88,04 0,46 0,51

2 0,4 91,9 94,26 2,36 2,57

3 0,6 108,3 108,89 0,59 0,31

4 0,8 106,5 109,24 2,74 0,76

5 1 102,2 106,01 3,81 0,19

6 1,2 96,78 95,12 1,66 1,76

7 1,4 90,45 92,34 1,89 0,75

Ảnh hưởng thời gian thủy phân

Ảnh hưởng của thời gian tới kết quả thủy phân được biểu diễn trên Bảng 4.19a.

Bảng 4.19a. Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân lipid thành

axit béo tự do của enzyme lipase

TT Thời gian (giờ) Chỉ số axit (mgKOH/g) Hiệu suất thủy phân (%)

1 2 78,3 40,47

2 4 98,3 50,80

3 6 119,2 61,60

4 8 126,8 65,53

5 10 140,5 72,61

6 12 149,8 77,42

7 14 147,1 76,02

Phương trình hồi quy có dạng parabol như sau:

ŷ = 42,999 + 13,630x - 0,365x2 (2.4)

Với ϴ = 0,997 và 𝛿 = 1,50%, kết quả tính hoàn toàn phù hợp với thực nghiệm

(Bảng 4.19b). Sau quá trình thủy phân ở 40oC, pH 7,5, tỷ lệ enzyme/cơ chất là 0,8%

và thời gian thủy phân là 12 giờ, chỉ số axit đo được là 149,8 mg KOH/g, tỷ lệ axit

béo đã bị thủy phân là 77,42%.

Bảng 4.19b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của thời gian thủy phân

123

STT x y ŷ |∆| δ, 𝜹=1.5%

1 2 78,3 79,61 1,31 2,95

2 4 98,3 99,66 1,36 0,84

3 6 119,2 116,14 3,06 2,20

4 8 126,8 124,06 2,74 1,75

5 10 140,5 139,41 1,09 2,42

6 12 149,8 149,20 0,6 0,24

7 14 147,1 149,05 1,95 1,59

Theo kết quả khảo sát của chúng tôi trên cùng nguyên liệu dầu đầu cá ngừ,

cùng loại enzyme lipase CRL, và với các điều kiện phản ứng tương tự, quá trình thủy

phân bởi enzyme lipase CRL trong hệ hai pha dung môi / nước đã cho hiệu quả cao

hơn so với hệ nhũ hóa dầu / nước (số liệu không trình bày ở đây).

Kết quả chúng tôi thu được ở trên có khác biệt so với các kết quả do Bhandari

và cs. công bố năm 2013, trong đó họ đạt hiệu suất thủy phân 86.5% sau 24 giờ phản

ứng ở 35°C [3].

4.3.3.2. Kết quả làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng

bằng phương pháp ure

Các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng được làm giàu bằng

phương pháp kết tinh với ure trong ethanol dựa trên hiện tượng urê tạo thành tinh thể

với các axit béo bão hòa và kết tủa ở nhiệt độ thấp (Hình 4.12).

Hình 4.12. Tinh thể ure kết hợp với axit béo bão hòa

Ethanol và urê được trộn thành một hỗn hợp đồng nhất với các axit béo. Axit

124

béo sẽ hình thành phức với urê và tủa xuống khi được làm lạnh. Axit béo bão hòa có

mạch thẳng hình thành phức dễ dàng hơn hẳn các axit béo có nối đôi. Số liên kết đôi

càng nhiều thì sự tạo thành phức càng khó khăn hơn. Khi tiến trình kết tinh hoàn

thành, axit béo no và một phần axit béo không no một nối đôi tạo phức, trong khi đó

axit béo đa nối đôi, có phân nhánh, hoặc có vòng sẽ ở lại trong dung dịch.

Kết quả phân tích thành phần axit béo sau khi làm giàu n-3 PUFA được chỉ ra

ở Hình 4.13 và Bảng 4.20.

Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo sau khi làm giàu

Bảng 4.20. Thành phần axit béo trước và sau khi làm giàu n-3 PUFA

TT Axit béo Trước kết tinh Sau kết tinh

1 14:00 1,86 0,24

2 15:00 0,86 0,08

3 16:1n-9 1,83

4 16:1n-7 3,25

5 16:2n-6 0,53

6 16:00 19,24 4,79

7 17:1n-9 0,79 1,11

8 17:1n-7 0,67 0,47

9 17:00 1,52 0,14

10 18:4n-3 0,36

11 18:2n-6 1,08 1,22

12 18:1n-9 11,88 20,34

125

TT Axit béo Trước kết tinh Sau kết tinh

13 18:1n-7 2,97 4,11

14 18: 2n-3 0,30

15 18:00 11,56 1,26

16 19:00 0,43

17 20:4n-6 4,41 6,85

18 20:5n-3 (EPA) 5,47 8,75

19 20:4n-3 0,86 0,42

20 20:2n-6 0,4 0,29

21 20:1n-9 0,68 0,55

22 20:00 0,37

23 22:4n-6 2,27 0,96

24 22:6n-3 (DHA) 22,9 43,75

25 22:5n-3 (DPA) 1,83 2,54

26 22:0 0,38

27 23:0 0,25

28 24:1n-9 1,53

29 24:0 0,39

Tổng 100 100

Tổng SFA 36,56 5,50

Tổng MUFA 21,77 26,59

Tổng PUFA 40,11 67,48

n-3 PUFA 31,42 58,30

Nhận xét chung:

- Thay vì sử dụng kiềm (NaOH) để thủy phân lipid tổng thành các axit béo tự

do trước khi kết tinh ure, quá trình thủy phân lipid tổng bằng enzyme Lipase CRL có

lợi thế hơn phương pháp hóa học là nhiệt độ thủy phân thấp (400C), tốn ít dung môi

hóa chất và giảm thiểu sự nguy hại đối với môi trường.

- Phương pháp kết tinh bằng ure sau khi thủy phân bằng lipase CRL đã làm

giảm các axit béo no (SFA) từ 36,56% xuống 5,5% và làm giàu n-3 PUFA từ 31,13%

lên 58,3%, trong đó EPA từ 5,47 lên 8,59%, DHA từ 22,9 lên 46,70% và DPA từ 1,83

lên 2,68%.

Các nghiên cứu làm giàu n-3 PUFA của tác giả Linder và cs. (2005) [120] sử

126

dụng enzyme lipase Aspergillus oryzae (Novozym SP 398) để thủy phân dầu từ đầu

cá hồi đã làm giảm các axit béo no SFA từ 27,2% xuống 20,2% và làm giàu các axit

béo không no đa nối đôi PUFA từ 41,6% lên 46,5% trong đó DHA từ 9,9% đến 11,6%

và EPA từ 3,6% đến 5,6%). Phương pháp sử dụng enzyme lipase CRL kết hợp với

kết tinh ure của chúng tôi như nêu ở trên cho sản phẩm có mức độ làm giàu các n-3

PUFA cao hơn.

4.3.4. Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất

lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T. albacares

Các kết quả khảo sát nêu trên cho phép chúng tôi đề xuất một qui trình công

nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu

cá ngừ vây vàng T. albacares . Sơ đồ công nghệ được biểu diễn trên Hình 4.14.

Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid

và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng.

Thuyết minh qui trình

127

- Nguyên liệu: phụ phẩm đầu cá ngừ đảm bảo không bị ươn, thối, bốc mùi khó

chịu, được cấp đông ở -180C, bảo quản trong kho đông lạnh đến khi chế biến.

- Giai đoạn 1: Sơ chế nguyên liệu

+ Đầu cá ngừ sau khi rã đông được rửa sạch tạp chất, cát sạn.

+ Xay: Mục đích của xay là phá vỡ kết cấu tế bào, giúp cho lipid tự do nằm

trong các tế bào và mô dễ dàng thoát ra ngoài. Tế bào bị phá vỡ làm tăng diện tích tiếp

xúc của nguyên liệu với enzyme để rút ngắn thời gian thủy phân và quá trình thủy phân

được triệt để hơn. Quá trình xay nhỏ được thực hiện trên máy xay trục vít.

+ Diệt khuẩn: Nguyên liệu cho vào thiết bị thủy phân kết cấu kiểu nồi hai vỏ,

có khuấy và điều khiển nhiệt độ. Sau khi bổ sung nước (tỷ lệ nước / nguyên liệu là

2:1), hỗn hợp được gia nhiệt đến 900C trong 10 phút để diệt vi sinh vật có trong

nguyên liệu, hạn chế tối đa khả năng phát triển các vi sinh vật gây bệnh không mong

muốn trong quá trình thủy phân đồng thời chuyển hóa một phần cấu trúc của nguyên

liệu, khiến quá trình thủy phân diễn ra thuận lợi.

- Giai đoạn 2: Thủy phân hỗn hợp đầu cá ngừ

+ Bổ sung enzyme Bromelain theo tỷ lệ 1% so với trọng lượng nguyên liệu,

chỉnh pH đến 6,5; tốc độ khuấy 200 vòng/ phút ở 450C trong 6 giờ. Giữ ổn định nhiệt

độ, tốc độ khuấy trong suốt quá trình thủy phân.

+ Bất hoạt enzyme: Để kết thúc quá trình thủy phân, enzyme được bất hoạt

bằng cách nâng nhiệt hỗn hợp thủy phân lên 900C trong 15 phút.

- Giai đoạn 3: Lọc:

+ Hỗn hợp sau thủy phân đem lọc qua rây để tách xương và phần dịch lọc.

- Giai đoạn 4: Ly tâm:

+ Dịch thủy phân được ly tâm trên hệ thống ly tâm lỏng - lỏng ở áp suất 1atm,

tốc độ 600 l/giờ thu được 3 phần: phần dầu, phần protein hòa tan và cặn protein thô.

+ Phần dầu được lọc rửa bằng nước muối ấm (0,5%; 35 - 40oC) thu được

dầu thô.

+ Phần protein hòa tan được đông khô hoặc sấy phun cho sản phẩm bột đạm

hòa tan giàu axit amin.

128

+ Phần cặn protein không tan (chứa protein chưa thủy phân, peptide không

tan…) được sấy ở nhiệt độ 60 – 70oC cho sản phẩm bột cá không tan dùng trong chăn

nuôi.

- Giai đoạn 5: Thủy phân dầu bằng enzyme lipase

+ Dầu từ đầu cá ngừ cho vào thiết bị đa năng, sau đó bổ sung n-hexan theo tỷ

lệ (1:1). Lượng nước sau khi chỉnh pH được bổ sung vào hỗn hợp với tỷ lệ pha dung

môi / nước (1:7). Sau khi nhiệt độ hỗn hợp đạt 400C, bổ sung enzyme lipase CRL

theo tỷ lệ 0,8%, khuấy đều hỗn hợp. Giữ ổn định nhiệt độ 400C trong 10 giờ, tốc độ

khuấy 200 vòng/phút. Chỉ số axit được xác định trong quá trình thủy phân để kiểm

soát và đánh giá hiệu suất quá trình thủy phân.

- Giai đoạn 6: Lọc rửa các axit béo

+ Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp các axit béo được lọc qua giấy lọc

Whatman No.2 để loại bỏ enzyme. Sau khi rửa với nước ấm, hỗn hợp axit béo được

làm khan với Na2SO4, cô quay loại dung môi.

- Giai đoạn 7: Kết tinh ure

+ Hỗn hợp axit béo được hòa tan trong dung môi theo tỷ lệ ure / cồn (3:16),

FFA / ure (1:3). Sau đó, dung dịch thu được để kết tinh ở nhiệt độ 40C trong thời gian

là 18 - 20 giờ. Sau quá trình kết tinh, hỗn hợp pha rắn và pha lỏng được lọc qua giấy

lọc tại nhiệt độ kết tinh, rửa lại bằng dung môi có nhiệt độ kết tinh, sau đó tách pha

rắn và pha lỏng.

Các sản phẩm của qui trình:

Các sản phẩm của qui trình gồm: axit béo giàu n-3 PUFA, bột đạm hòa tan

giàu axit amin và bột cá không tan dùng trong chăn nuôi. Thành phần hóa học của

sản phẩm axit béo giàu n-3 PUFA được thể hiện trên Bảng 4.20, các chỉ tiêu hóa lý

được chỉ ra trên Bảng 4.21a. Thành phần axit amin tự do của sản phẩm bột đạm hòa

tan giàu axit amin được chỉ ra ở Bảng 4.21b.

129

Bảng 4.21a. Các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm axit béo giàu n-3 PUFA

Tỷ trọng d20 0,85-0,87 g/ml

Điểm đông đặc 18- 20 oC

Chỉ số khúc xạ 1,458

Chỉ số axit < 0,5 mg KOH/g

Chỉ số peroxit 9,86

Chỉ số iot 145 g I/100 g

Chỉ số xà phòng hóa 160 mg KOH/g

Bảng 4.21b. Các thành phần axit amin tự do của sản phẩm bột đạm hòa tan giàu

axit amin

TT Axit amin Hàm lượng

(µg/100 g) TT Axit amin

Hàm lượng

(µg/100 g)

1 Threonin* 4524 10 Serine 4979.5

2 Valine* 29267 11 Glutamic

acid 6201.3

3 Methionin* 33615 12 Proline 7020

4 Isoleucine* 62825 13 Glycine 4439.5

5 Leucine* 9234.5 14 Alanine KPH

6 Phenylalanine* 46276 15 Tyrosine 71267

7 Tryptophan* 16 Lysine 37661

8 Histidine* 46497 17 Arginin 55952

9 Aspatic acid 4552.1

Tổng axitmin tự do 424 309.84

Axit amin thiết yếu* 232 237.4

Axit amin không thiết yếu 192 072.5

Tóm lại, quy trình chiết xuất lipid và làm giàu các n-3 PUFA ngoài sản phẩm

axit béo không no tương đương với các sản phẩm nhập ngoại (ví dụ DHA selco) còn

cho các sản phẩm có giá trị gia tăng là bột đạm hòa tan giàu axit amin thiết yếu

(232,24 mg/100 g sản phẩm) và bột cá dùng trong chăn nuôi. Qui trình công nghệ này

cho phép tận thu triệt để nguồn nguyên liệu phụ phẩm đầu cá ngừ, hạn chế ô nhiễm

môi trường. Riêng phương pháp chiết xuất dầu béo từ đầu cá ngừ vây vàng đã được

chúng tôi đăng ký giải pháp hữu ích.

130

KẾT LUẬN

Trong luận án này, một số enzyme được nghiên cứu ứng dụng nhằm hỗ trợ

cho quá trình chiết xuất tinh dầu từ cành lá, từ vỏ quế Cinnamomum cassia và từ gỗ

gió bầu Aquilaria crassna cũng như quá trình chiết xuất dầu béo và làm giàu các

axit n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares đã thu được kết quả như

sau:

1. Luận án đã thành công khi sử dụng hệ enzyme Laccase-Htec2 để xử lý các

nguyên liệu cành lá và vỏ quế trước khi chưng cất cho hiệu suất thu hồi tinh dầu tăng

lên rõ rệt, tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành lá quế đạt 41,7%, vỏ quế đạt 14,57%, thời gian

chưng cất tinh dầu được rút ngắn. Đặc biệt, quá trình xử lý bằng hệ enzyme Laccase-

Htec2 đã làm gia tăng hàm lượng chất chính cinnamaldehyde trong tinh dầu cành lá

quế từ 69,74% lên 85,60%, tinh dầu vỏ quế từ 54,63% lên 68,37% và không làm thay

đổi một số hoạt tính sinh học của tinh dầu cành lá quế C.cassia so với đối chứng.

2. Luận án đã sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm để tính toán điều

kiện tối ưu cho quá trình thủy phân cành lá quế trước khi chưng cất ở pH 5,2, nhiệt

độ 44oC, tỷ lệ Laccase/cơ chất 0,42 ml/g, tỷ lệ Htec2/cơ chất 1,15%, thời gian thủy

phân 5 giờ 30 phút. Trên cơ sở các kết quả thu được, một qui trình công nghệ chưng

cất tinh dầu cành lá quế có enzyme hỗ trợ đã được đề xuất.

3. Luận án đã thử nghiệm thăm dò ứng dụng của hệ enzyme Laccase-Htec2 hỗ

trợ quá trình chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna cho

tỷ lệ gia tăng tinh dầu là 33,33%, các thành phần có giá trị của tinh dầu (cis-

dihydroagarofuran, α-agarofuran, agarospirol, hinesol, và neopetasone) tăng lên, các

thành phần axit béo gây cản trở giảm đi rõ rệt.

4. Luận án đã thành công khi chiết xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá

ngừ vây vàng Thunnus albacares bằng hệ enzyme kép Bromelain và Lipase CRL. Qui

trình chiết xuất lipid bằng enzyme Bromelain cho hiệu suất chiết xuất lipid 69%, hàm

lượng n-3 PUFA 31,42%. Qui trình làm giàu n-3 PUFA bằng enzyme Lipase CRL kết

hợp kết tinh ure đã tăng hàm lượng n-3 PUFA từ 31,42% lên 65,08%. Từ đó, cho phép

đề xuất một qui trình công nghệ ứng dụng kết hợp hai enzyme Bromelain và Lipase

131

CRL trong việc chiết xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng. Ngoài

dầu cá giàu axit béo n-3 PUFA đạt chất lượng thương phẩm, qui trình này còn cho các

sản phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng thời giảm thiểu

dung môi hóa chất và ô nhiễm môi trường.

5. Các kết quả nghiên cứu nêu trên là các nghiên cứu ứng dụng enzyme đầu

tiên ở Việt Nam trong việc chiết xuất tinh dầu từ cành lá, vỏ quế C. cassia và từ gỗ

gió bầu A. crassna. Qui trình ứng dụng Bromelain trong việc chiết xuất lipid từ đầu

cá ngừ vây vàng T. albarcares đã được đăng ký giải pháp hữu ích.

132

KIẾN NGHỊ

1. Quy trình chưng cất tinh dầu cành lá quế, vỏ quế nhờ enzyme hỗ trợ bước

đầu cho ưu thế hơn so với phương pháp thông thường trên phương diện gia tăng hiệu

suất, nâng cao chất lượng tinh dầu, giảm thời gian chưng cất và vẫn giữ nguyên được

hoạt tính sinh học... chỉ dừng lại ở qui mô thí nghiệm. Cần thử nghiệm ở qui mô sản

xuất tại địa phương nhằm ổn định công nghệ và chất lượng sản phẩm, đồng thời đánh

giá chi phí tiêu hao năng lượng lẫn giá thành nhằm nâng cao tính ứng dụng khi áp

dụng vào thực tiễn sản xuất.

2. Do nhu cầu cấp bách của thực tiễn sản xuất, phương pháp xử lý gỗ gió bầu

trước khi chưng cất cần được nghiên cứu gấp và sâu hơn.

3. Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy việc ứng dụng enzyme hỗ trợ

các quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên mang lại hiệu quả rõ rệt. Vì thế cần

mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các loại nguyên liệu khác như tảo biển và các lớp

hợp chất thiên nhiên có hoạt chất sinh học có ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm,

y học.

133

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Hoang Thi Bich, Le Tat Thanh, Tran Quoc Toan, Nguyen Huy Tung, Le Xuan

Duy, Nguyen Van Tuyen Anh, Dinh Thi Thu Thuy, Tran Thi Tuyen, Do

Trung Sy, Le Mai Huong, Nguyen Quyet Chien (2016), “Investigation of

enzyme treatments to assist extraction of essential oil from the leaves and

branches of Cinnamomum cassia collected in Yenbai province”, Journal

of Science and Technology, 54 (2C), pp.479-485.

2. Le Tat Thanh, Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Hoang Thi Bich, Pham Thi Bien,

Pham Thu Hue, Dinh Nguyet Thu, Pham Quoc Long (2016), “Survey on

total lipid content and composition of fatty acids from head and viscera of

tuna”, Journal of Science and Technology, 54 (2C), pp.486-492.

3. Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Trần Quốc Toàn, Nguyễn Thị Biển, Nguyễn Quang

Tùng (2016), “Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình thủy phân dầu đầu

cá ngừ bằng enzyme lipase từ Candida rugosa”, Tạp chí Khoa học và Công

nghệ-trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, (số 36-2016), tr.67-70.

4. Hoàng Thị Bích, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Phạm Minh Quân, Phạm Thu Huế,

Nguyễn Quang Tùng, Tô Xuân Thắng, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành

(2017), “Xây dựng quy trình ứng dụng enzyme và các kĩ thuật phối hợp

để thu nhận dầu cá giàu các axit béo không no đa nối đôi EPA, DHA, DPA

từ phụ phẩm chế biến cá ngừ vây vàng Thunnus albacares”, Tạp chí Khoa

học và Công nghệ Biển, tập 17, (01), 2017, tr.95-102.

5. Hoàng Thị Bích, Nguyễn Quyết Chiến, Lê Tất Thành, Đinh Thị Thu Thủy, Đỗ Thị

Thảo, Hoàng Kim Chi, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Lê Mai Hương

(2017), “Khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu cành lá quế cinnamomum cassia

thu nhận từ phương pháp enzyme kết hợp cất cuốn hơi nước”, Tạp chí Dược

học, tháng 5/2017, (493), tr.12-15.

6. Hoang Thi Bich, Le Mai Huong, Nguyen Quyet Chien, Đinh Thi Thu Thuy, Le Tat

Thanh, Đo Trung Sy, Pham Hong Hai (2017), “Optimization of

lignocellulose hydrolysis by (Laccase and Cellic Htec2) enzyme system

assisted essential oil distillation from Cinnamomum cassia leaves and

branches”, Journal of Science and Technolog,y (Chấp nhận đăng 01/2017).

134

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường (1990), Tiêu chuẩn Việt Nam, Hà Nội.

2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nxb Hà Nội.

3. Trương Thị Mỹ Chi, Nguyễn Thị Thu Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng chống

oxi hóa in vitro và in vivo của một số loài nấm linh chi (Ganoderma

lucidum) và nấm vân chi (Trametes versicolor), Tạp chí Y học thành phố

Hồ Chí Minh, tập 14, (02), tr.135-141.

4. Nguyễn Văn Chung (2004), Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ và thiết bị chưng

cất và trích ly nhựa dầu hồ tiêu có sử dụng enzyme, Đề tài KC 04-07.

5. Lê Quang Diễn, Doãn Thái Hòa (2013), “Ứng dụng enzyme trong sản xuất bột

giấy hiệu suất cao từ thân cây ngô - Phần I, Hiệu quả của lignin

peroxidase”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ các trường Đại học kỹ thuật,

(92), tr.142-146.

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học,

Nxb Giáo dục, Hà Nội, 537 tr.

7. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi (2007), Xử lí số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong

nghiên cứu hóa học, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.

8. Nguyễn Ngọc Hạnh, Mai Thành Chí (2006), Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết

xuất tinh dầu tiêu, quế và trầm bằng CO2 lỏng siêu tới hạn và sản xuất

piperine từ phế phẩm của tiêu, Tp Hồ Chí Minh.

9. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển I, Nxb Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh.

10. Đặng Diễm Hồng (2016), Nghiên cứu qui trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo

omega 3 và omega 6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng,

Chương trình công nghệ sinh học trong chế biến, Bộ Công thương.

11. Lại Mai Hương (2004), Khảo sát thành phần lipid trong một số loài cá biển Việt

Nam và nghiên cứu phương pháp làm giàu acid béo không no từ phế phụ

phẩm của ngành chế biến hải sản, Đề tài của Trường Đại học Bách Khoa

Tp Hồ Chí Minh.

135

12. Nguyễn Thị Mỹ Hương (2011), “Sử dụng sản phẩm thuỷ phân protein từ đầu cá

ngừ trong thức ăn cho tôm”, Tạp chí khoa học công nghệ thuỷ sản, Đại

học Nha Trang, (1), tr.99-108.

13. Văn Ngọc Hướng (2003), Hương liệu và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật,

Hà Nội.

14. Lê Gia Hy, Đặng Tuyết Phương (2010), Enzyme vi sinh vật và chuyển hóa sinh học -

Nguyên lý và ứng dụng, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.

15. Dương Minh Lam, Trương Thị Chiên (2013), “Nghiên cứu một số đặc tính sinh

học của chủng nấm đảm Trametes maxima CPB30 sinh laccase ứng dụng

trong xử lí màu nước ô nhiễm do thuốc nhuộm”, Tạp chí sinh học, 35(4),

tr.477-483.

16. Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh (2005), Lipid và các axit béo hoạt tính sinh

học có nguồn gốc thiên nhiên, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 213tr.

17. Phạm Quốc Long (chủ nhiệm) (2013), Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất

thuốc chữa bệnh viêm khớp dạng thấp và một số thực phẩm chức năng từ

nguyên liệu sinh vật biển, Đề tài Bộ Công thương, Hà Nội.

18. Vũ Ngọc Lộ, Đỗ Chung Võ, Nguyễn Mạnh Pha, Lê Thúy Hạnh (1996), Những

cây tinh dầu Việt Nam (Khai thác, chế biến, ứng dụng), Nxb Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội, 181tr.

19. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học - Nxb

Thời đại, Hà Nội.

20. Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất một số vi sinh vật có khả năng

tổng hợp cellulase cao và ứng dụng chúng trong công nghệ xử lý chất thải

hữu cơ, Luận án phó tiến sĩ Khoa học và kỹ thuật, Trường Đại học Bách

khoa Hà Nội.

21. Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Cư, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị

Phương Thảo, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2001), Tài nguyên thực

vật có tinh dầu ở Việt Nam, tập 1, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.

22. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà

Nội, 173tr.

136

23. Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trần Nguyễn Mỹ Châu, Võ Bửu Lợi, Đặng Thị Thanh

Hương (2009), Nghiên cứu sử dụng enzyme trong chiết tách dầu béo và

các thành phần của cám gạo, Đề tài Bộ Công thương, Hà Nội.

24. Thái Lâm Phát (2008), Nghiên cứu tinh luyện dầu cá, Luận văn thạc sỹ, Trường

Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.

25. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại

học quốc gia Hồ Chí Minh.

26. Đào Mạnh Sơn, Nguyễn Viết Nghĩa (2006), “Hiện trạng nguồn lợi và tình hình

khai thác cá ngừ đại dương ở Việt Nam”, Tạp chí Thủy sản, (7), tr.20 -

23.

27. Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Đỗ Quang Kháng, Ngô Quốc Anh (2015),

“Nghiên cứu phương pháp thủy phân phế thải rong nâu sử dụng kết hợp

acid và enzyme”, Tạp chí Hóa học, 54 (2e), tr.121-127.

28. Đỗ Trung Sỹ, Ngô Quốc Anh, Hoàng Thị Bích, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành,

Nguyễn Huy Tùng, Đặng Thu Thảo, Lê Mai Hương (2014), Xác định hàm

lượng đường glucose trong dịch thủy phân cellulose có trong rong biển

bởi nấm mốc ASPERGILLUS TERRIUS AF67, Hội nghị khoa học toàn

quốc về sinh học biển và phát triển bền vững lần thứ hai (2014), tr.711-

721.

29. Đỗ Trung Sỹ, Trần Đình Toại, Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Nguyễn Văn

Tuyến Anh, Nguyễn Đình Tuyến, Phạm Quốc Long (2012), Nghiên cứu

quy trình thủy phân cá tạp và phế liệu thủy sản bằng enzyme để sản xuất

sản phẩm cao đạm giàu axit amin ứng dụng trong y, dược, Hội nghị quốc

tế Biển Đông 2012, Nha Trang, 12-14/9/2012, tr.520-528.

30. Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Trần Quốc Toàn, Nguyễn Thị Biển, Nguyễn

Quang Tùng (2016), Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình thủy phân

dầu đầu cá ngừ bằng enzyme lipase từ Candida rugosa.

31. Trần Đình Thắng (2016), Hợp chất thiên nhiên, Nxb Đại học Vinh.

32. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm

(2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 304 tr.

137

33. Đặng Thị Thu, Ngô Tiến Hiền, Quyền Đình Thi, Phùng Thị Thủy, Hoàng Lan,

Đỗ Biên Cương, Thiều Linh Thùy Và Nguyễn Thị Sánh (2004), Nghiên

cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo bằng lipaza, đề tài nhành của

nghiên cứu cấp Nhà nước, mã số: KC 04-07, Viện Công nghệ Thực phẩm,

Hà Nội.

34. Lưu Thị Lệ Thủy (chủ nhiệm) (2008), Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ

sản xuất dầu từ hạt bí đỏ bằng phương pháp enzyme, Đề tài Bộ Công

thương, Hà Nội.

35. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), “Tương lai ứng dụng Enzyme trong xử

lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự

nhiên và Công nghệ, (23), tr.75-85

36. Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên, Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung

Sỹ (2011), “Nghiên cứu tối ưu hoá quá trình thuỷ phân cellulose tách từ

rơm rạ thành đường tan của nấm mốc Aspergillus terrius để sản xuất

ethanol- nhiên liệu sinh học”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (6), tr.38-

42.

37. Trung tâm Thông tin thủy sản (2012), Báo cáo tình hình sản xuất 8 tháng đầu

năm 2012, Hà Nội.

38. Nguyễn Anh Tuấn (2011), Tận dụng nguyên liệu còn lại trong chế biến thủy sản,

Báo cáo hội thảo.

Tài liệu tiếng Anh

39. Abdul Khalil H.P.S., Siti Alwani, M., and Mohd Omar, A. K (2006), Cell walls

of tropical fibers, BioResources 1(2), pp.220-232.

40. Ademola Monsur Hammed A. M, Irwandi Jaswir, Azura Amid, Zahangir Alam,

Tawakalit Tope, Asiyanbi-H & Nazaruddin Ramli (2013), Enzymeatic

Hydrolysis of Plants and Algae for Extraction of Bioactive Compounds,

Food Reviews International, 29(4), pp.352-370.

41. Akoh C.C and Min D.B (2008), Food lipids: chemistry, nutrition, and

biotechnology, 3th ed., CRC Press, Taylor and Francis Group.

138

42. Ali Bougatef, Rafik Balti, Anissa Haddar, Kemel Jellouli, Nabil Souissi, and

Moncef Nasri (2012), Protein Hydrolysates from Bluefin Tuna (Thunnus

thynnus) Heads as Influenced by the Extent of Enzymeatic Hydrolysis,

Biotechnology and Bioprocess Engineering 17, pp.841-852.

43. Ali SM, Khan AA, Ahmed I, Musaddiq M, Ahmed KS, Polasa H, et al (2005),

Antimicrobial activities of eugenol and cinnamaldehyde against the human

gastric pathogen Helicobacter pylori, Ann Clin Microbiol Antimicrob; 4, pp.20.

44. Anastas, Paul T.; Warner, John C. (1998). Green chemistry: theory and practice.

Oxford [England]; New York: Oxford University Press.

45. Asger M., Sharif Y., and Bhatti H. N. (2010), Enhanced production of ligninolytic

enzymes by Ganoderma lucidum IBL-06 using lignocellulosic agricultural

wastes, Inter. J. Chem. Reactor Eng. 8 (1), pp.1-17.

46. Ashgari J., Touli C. K. and Mazaheritehrani M. (2010), Microwave assisted

hydrodistillation of essential oils from Echinophora platyloba DC, Journal

of Medicinal Plants Research, vol. 6 (28), pp. 4475-4480, 2010.

47. Awika, J.M. et al. (2003), Screening methods to measure antioxidant activity of

sorghum (Sorghum bicolor) and sorghum products, J. Agric. Food Chem,

(51), pp.6657-6662.

48. Bailey M.J., Biely P.and Poutanen Kaisa (1992), Interlaboratory testing of methods

for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology, (23), pp.257-270.

49. Bakker, M.E., Gerritsen, A.F., (1989), A suberized layer in the cell wall of

Mucilage cells of Cinnamomum, Ann. Bot. 63, 441-448.

50. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram

quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.

51. Baldrian P. (2006), Fungal laccases - occurrence and properties, FEMS

Microbiol Rev 30(2): 215-42.

52. Bhandari K., Chaurasia S.P & Dalai A.K (2013), Hydrolysis of tuna fish oil using

candida rugosa lipase for producing fatty acids containing DHA,

International Journal of Applied and Natural Sciences (IJANS), Vol. 2,

Issue 3, July 2013, pp.1-12.

139

53. Bickers D, Calow P, Greim H, Hanifin JM, Rogers AE, Saurat JH, et al (2005),

A toxologic and dermatologic assessment of cinnamyl alcohol,

cinnamaldehyde and cinnamic acid when used as fragrance ingredients.

The RIFM expert panel. Food Chem Toxicol; 43, pp.799-836.

54. Biesalski, H.K. et al. (2009), Bioactive compounds: definition and assessment of

activity. Nutrition 25, 1202-1205, Denny, A.R. and Buttriss, J.L. (2007)

Plant Foods and Health: Focus on Plant Bioactives, EuroFIR Synthesis

Report No. 4, EuroFIR Project Management Office/British Nutrition

Foundation, London.

55. Blanchette R.A. (1991), Delignification by wood-decay fungi, Annu. Rev,

Phytopathol, (29), pp.381-398.

56. Blight E. G., and Dyer W. J, (1959), A rapid method of total lipid extration and

purification, Canad. J. Biochem. Physiol, 37, pp. 911.

57. Bougatef A., Balti R., Haddar A., Jellouli K., Nabil Souissi, and Moncef Nasri

(2012), Protein Hydrolysates from Bluefin Tuna (Thunnus thynnus) Heads

as Influenced by the Extent of Enzymeatic Hydrolysis, Biotechnology and

Bioprocess Engineering 17: pp.841-852.

58. Boulila A., Hassen I., Haouari L., Mejri F., Amor I. B., Casabianca H., Hosni K.

(2015), Enzyme-assisted extraction of bioactive compounds from bay

leaves (Laurus nobilis L.), Industrial Crops and Products 74, pp.485-493.

59. Bradford M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye

binding, Anal. Biochem., (72), pp.248-254.

60. Blois, M.S. (1958), Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free

Radical. Nature, 181, 1199-1200..

61. Calinescu, I., Gavrila, A.I., Ivopol, M., Ivopol, G.C., Popescu, M., Mircioaga, N.,

(2014), Microwave assisted extraction of essential oils of enzymeatically

pretreated lavender (Lavandula angustifolia Miller), Cent. Eur. J. Chem,

(12), pp.829-836.

140

62. Camarero, S.; Ibarra, D.; Martínez, M.J.; Martinez, A.T (2005), Lignin-Derived

Compounds as Efficient Laccase Mediators for Decolorization of

Different Types of Recalcitrant Dyes, Appl. Environ. Microbiol, 71),

pp.1775-1784.

63. Camarero, S.; Martínez, M.J.; Martínez, A.T (2014), Understanding lignin

biodegradation for the improved utilization of plant biomass in modern

biorefineries, Biofuels Bioprod. Biorefin, (8), pp.615-625.

64. Cater, C.M., R.D. Hagenmaier, and K.F. Mattil (1974), Aqueous extraction- an

alternative oilseed milling process, Journal of the American Oil Chemists'

Society, 1974. 54(4): p. 137-141.

65. Cintra, O., Lopez-Munguia, A. and Vernon, J. (1986), Coconut oil extraction by

a new enzymeatic process, J. Food Sci., (51), pp.695-697.

66. Coussens, L.M.; Werb, Z (2002), Inflammation and cancer, Nature 2002, 420,

860-867.

67. Chang, K.-S., Tak, J.-H., Kim, S.-I., Lee, W.-.J., Ahn, Y.-J., (2006), Repellency

of Cinnamomum cassia bark compounds and cream containing cassia oil

to Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) under laboratory and indoor

conditions. Pest Manag. Sci. 62, 1032-1038.

68. Chang, S.-T., Chen, P.-F., Chang, S.-C., (2001), Antibacterial activity of leaf

essential oils and their constituents from Cinnamomum osmophloeum. J.

Ethnopharmacol. 77, 123-127.

69. Chao L, Yang RF, Fu XF (2008), Ultrasonic-assisted supercritical CO2

extraction of volatile oil from compound recipe of clove and cinnamon, J

S China Univ Technol 36:67-71.

70. Chao LK, Hua K-F, Hsu H-Y et al (2005), Study on the antiinflammatory activity

of essential oil from leaves of Cinnamomum osmophloeum, J Agric Food

Chem 53:7274-7278

71. Cheng, S.-S., Chua, M.-T., Chang, E.-H., Huang, C.-G., Chen, W.-J., Chang, S.-

T., (2009), Variation in insecticidal activity and chemical compositions of

leaf essential oils from Cryptomeria japonica at different ages, Bioresour.

Technol. 100, 465-470.

141

72. Chiozza L. (1856), On the artificial production of cinnamon oil, Comptes rendus

(in French), (42), pp. 222-227.

73. Choi, J, Lee, K.-T., Ka, H., Jung, W.-T., Jung, H.-J., Park, H.-J., (2001),

Constituents of the essential oil of the Cinnamomum cassia stem bark and

the biological properties.

74. Chow Ching K. (2008), Fatty acids in foods and their health implication 3th ed.,

CRC Press, Taylor and Francis Group.

75. Chu, Q.-G., Hu, Z.-H., (1999), Comparative anatomy of oil cells and mucilage

cells in the leaves of the Lauraceae in China. Acta Phytotaxon, Sin. 37 (6),

529-540 (In Chinese with an English abstract).

76. Denys J. Charles (2013), Antioxidant Properties of Spices, Herbs and Other

Sources, Norway, IA, USA, 589 pp.

77. Ding Z., Peng L., Chen Y., Zhang L., Gu Z., Shi G. and Zhang K. (2012),

Production and characterization of thermostable laccase from the

mushroom, Ganoderma lucidum, using submerged fermentation, African

Journal of Microbiology Research 6 (6), pp. 1147-1157.

78. Dobozi, S., Halasz, A., Kovacs, K. E., & Szacks, G. (1988), Enhancement of

mustard oil yield by cellulolytic pretreatment, Applied Microbiology

Biotechnology, 29(1), pp. 39-43

79. Doi R. H. (2008), Cellulases of Mesophilic Microorganisms: Cellulosome and

Noncellulosome Producers, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1125, pp.267-279.

80. Domadia P., Swarup S., Bhunia A., Sivaraman J., Dasgupta D. (2007), Inhibition

of bacterial cell division protein FtsZ by cinnamaldehyde, Biochemical

pharmacology 74, pp.831-840.

81. Dominquez, H., Nunez, M. J. and Loma, Y. M. (1994), Enzymeatic treatment to

enhance oil extraction from fruits and oil seeds: a review, Food Chem,

(49), pp.271-286.

82. Dumas J., Peligot E. (1834), On cinnamon oil, the hippuric acid and sebacic acid,

Organic chemistry reseach, (57), pp.305-34.

142

83. Dumay, J., Donnay-Moreno, C., Barnathan, G., Jaouen, P., Bergé, J.P., (2006),

Improvement of lipid and phospholipid recoveries from sardine (Sardina

pilchardus) viscera using industrial proteases, Process Biochemistry 41,

pp.2327-2332.

84. Eur J Gastroenterol Hepatol (1996), Jones FA. Herbs-useful plants. Their role in

history and today.;8, pp.1227-31.

85. Farid Chemat and Jochen Strube (Eds.) (2015), Green extraction of natural

products: theory and practice.

86. Farid Chemat and Maryline Abert Vian (Eds) (2016), Alternative solvents for

Natural products extraction.

87. Farnet AM, Gil G, Ferre E. (2008), Effects of pollutants on laccase activities of

Marasmius quercophilus, a white-rot fungus isolated from a

mediterranean schlerophyllous litter, Chemosphere 70(5): 895-900.

88. Fernandez G. L, Betancor L., Alfonso V., Carrascosa J., Guisan J.M (2011),

Release of Omega 3 Fatty acids by the Hydrolysis of fish oil catalyzed by

Lipase Immobilized on hydrophobic supports, J. Am Oil Chem Soc 88,

pp.173-1178.

89. Folin, O. and Ciocalteau, P. (1927), J.Biol.Chem, 73, pp.627.

90. Freese, S. and Binning, R. (1993), Enzymeatic extraction of spice aromas,

Gordian 93(11), pp.171-175.

91. G. Joana Gil-Chávez, José A. Villa, J. Fernando Ayala-Zavala, J. Basilio Heredia,

David Sepulveda, Elhadi M. Yahia,and Gustavo A. González Aguilar

(2013), Technologies for Extraction and Production of Bioactive

Compounds to be Used as Nutraceuticals and Food Ingredients:An

Overview, Food Science and Food Safety, Vol.12.

92. Gámez-Meza, N., et al., (2003), Concentration of eicosapentaenoic acid and

docosahexaenoic acid from fish oil by hydrolysis and urea complexation,

Food Research International 36, pp.721-727.

93. Gardossi, L. et al. (2009), Guidelines for reporting of biocatalytic reactions,

Trends Biotechnol. 28, pp.171-180.

143

94. Golmakani, M. T., & Rezaei, K. (2008), Comparison of microwave-assisted

hydrodistillation with the traditional hydrodistillation method in the

extraction of essential oils from Thymus vulgaris L., Food Chemistry,

(109), pp.925-930.

95. Giardina, P.; Faraco, V.; Pezzella, C.; Piscitelli, A.; Vanhulle, S.; Sannia, G. Laccases

(2010), A never-ending story. Cell. Mol. Life Sci, (67), pp.369-385.

96. Hamidpour R., Hamidpour M., Hamidpour S., Shahlari M. (2015), Cinnamon

from the selection of traditional applications to its novel effects on the

inhibition of angiogenesis in cancer cells and prevention of Alzheimer's

disease, and a series of functions such as antioxidant, anticholesterol,

antidiabetes, antibacterial, antifungal, nematicidal, acaracidal, and

repellent activities, Journal of Traditional and Complementary Medicine

5, pp.66-70.

97. Hammed A.M, Jaswir I., Amid A., Alam Z., Asiyanbi T.T, ramli N. (2013),

Enzymeatic Hydrolysis of Plants and Algae for Extraction of Bioactive

Compounds, Food Reviews International, (29), pp.352-370.

98. Hongyan Mu, Jun Jin, Dan Xie, Xiaoqiang Zou, Xiaosan Wang, Xingguo Wang,

Qingzhe Jin (2016), Combined Urea Complexation and Argentated Silica

Gel Column Chromatography for Concentration and Separation of

PUFAs from Tuna Oil: Based on Improved DPA Level, J Am Oil Chem

Soc 93, pp.1157-1167.

99. Huang T.C, Fu H.Y., Ho C. T., Tan D. , Huang Y.T., Pan M.H (2007), Induction

of apoptosis by cinnamaldehyde from indigenous cinnamon Cinnamomum

osmophloeum Kaneh through reactive oxygen species production,

glutathione depletion, and caspase activation in human leukemia K562

cells, Food Chemistry 103 (2007) 434–443

100. Huang Y.F., Huang J.W., Tao L., Zhang Y. M., (2005), Chemical components

of essential oils of Cinnamomum cassia Presl, in different growth year,

Acta Sci. Nat. Univ. Sunyatseni 44 (1), pp.82-85.

144

101. Huong Thi My Nguyen, Raul Perez- Galvez, Jean Pascal Berge (2012), Effect

of diets containing tuna head hydrolysates on the surcival and growth of

shrimp Penaeus vannamei, Aquaculture, pp. 324-325.

102. Huong Thi My Nguyen (2013), Protein and lipid recovery from tuna head using

industrial protease, J. Sci. & Devel., Vol. 11, No. 8: 1150-1158.

103. Jeyaratnam, N., Nour, A.H., Akindoyo, J.O., (2016), Comparative study

between Hydrodistillation and Microwave-Assisted Hydrodistillation for

extraction of Cinnamomum Cassia oil, J. Eng. Appl. Sci, 11 (4), pp.2647-

2652.

104. Jeyaratnam, N., Nour, A.H., Akindoyo, J.O., (2016), The potential of Microwave

Assisted Hydrodistillation in extraction of essential oil from Cinnamomum

cassia (cinnamon), J. Eng. Appl. Sci. 11 (4), pp.2179-2183.

105. Jiang, Z.-H. and Argyropoulos, D.S (1999), Isolation and Characterization of

Residual Lignins in Kraft Pulps, Journal of Pulp and Papar Science, Vol.

25 (1),pp. 25-29.

106. Jiao Jiao, Yu-Jie Fu, Yuan-Gang Zu, Meng Luo, Wei Wang, Lin Zhang, Ji Li

(2012), Enzyme-assisted microwave hydro-distillation essential oil from

Fructus forsythia, chemical constituents, and its antimicrobial and

antioxidant activities, Food Chemistry, (134), pp.235-243.

107. Kaur Gunveen, DavidCameron-Smith Manohar Garg, Sinclair Andrew J

(2011), Docosapentaenoic acid (22:5n-3): a review of its biological

effects, Progr Lipid Res 50, pp.28-34.

108. Kim, Y.J. et al. (2005), Phenolic extraction from apple peel by cellulases from

Thermobifida fusca. J. Agric, Food Chem, (53), pp.9560- 9565.

109. Kristinsson H. G. and Rasco B. A. (2000), Fish Protein Hydrolysates:

Production, Biochemical, and Functional Properties, Critical Reviews in

Food Science and Nutrition, 40(1), pp.43-81.

110. Kumar, P.; Barrett, D.M.; Delwiche, M.J.; Stroeve, P. (2009), Methods for

pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and

biofuel production. Ind. Eng. Chem. Res., 48, pp.3713-3729.

145

111. Laplante, S., Souchet, N., and Bryl, P., (2009), Comparison of low-temperature

processes for oil and coenzyme Q10 extraction from mackerel and

herring, Eur. J., Lipid Sci. Technol., 111, pp.135-141.

112. Lee H.S., Kim BS, and Kim MK (2002) Suppression effect of Cinnamomum

cassia bark-derived component on nitric oxide synthase. J Agric Food

Chem 50, 7700- 7703.

113. Lee H. S (2009), Chemical Composition of Cinnamomum cassia Leaf Oils and

Suppression Effect of Cinnamyl Alcohol on Nitric Oxide Synthase, J.

Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 52(5), pp.480-485.

114. Lee HS, Ahn YJ (1998), Growth-inhibiting effects of Cinnamomum cassia bark

derived materials on human intestinal bacteria, J Agric Food Chem;46,

pp.8-12.

115. Leskovac V. (2003), Comprehensive enzyme kinetics, Kluwer Academic

Publishers: New York, 1st edn, ISBN 978-0306467127.

116. Li, Y.-q., Kong, D.-x., Huang, R.-s., Liang, H.-l., Xu, C.-g., Wu, H., (2013),

Variations in essential oil yields and compositions of Cinnamomum cassia

leaves at different developmental stages, Ind. Crops Prod, (47), pp.92-101.

117. Liaset, B., Julshamn, K., Espe, M., (2003), Chemical composition and

theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymeic

hydrolysis of salmon frames with Protamex, Process Biochemistry 38,

pp.1747-1759.

118. Liaset, B., Nortvedt, R., Lied, E., Espe, M., (2002), Studies on the nitrogen

recovery in enzymeic hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar, L.)

frames by Protamex protease, Process Biochemistry 37, pp.1263-1269.

119. Likhitayawuid K., Angerhofer C.K. (1993), “Cytotoxic and antimalarial

bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta”, Jounal of Natural

Products, 56 (1), pp.30-38.

120. Linder, M., Fanni, J., Parmentier, M., (2005), Proteolytic extraction of salmon

oil and PUFA concentration by lipases, Marine Biotechnology, 7(1),

pp.70-75.

121. Linthorst J. A.(2010), An overview: origins and development of green

146

chemistry, Found Chem, (12), pp.55-68.

122. Liu, S., Zhang, C., Hong, P., Ji, H., (2006), Concentration of docosahexaenoic

acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea

complexion: Optimization of process parameters, Journal of Food

Engineering, 73, pp.203, 209.

123. Lucchesi ME, Chemat F, Smadja J (2004), Solvent-free microwave extraction

of essential oil from aromatic herbs: comparison with conventional hydro-

distillation, J Chromatogr A 1043:323-327.

124. Madzak C, Mimmi MC, Caminade E, Brault A, Baumberger S, Briozzo P,

Mougin C, Jo- livalt C (2006), Shifting the optimal ph of activity for a

laccase from the fungus Trametes versicolor by structure-based

mutagenesis, Protein Eng Des Sel, 19(2), pp.77-84.

125. Magiatis P, Skaltsounis AL, Chinou I, Haroutounian SA (2002), Chemical

composition and in vitro antimicrobial activity of the essential oils of three

Greek Achillea species, Z Naturforsch C;57, pp.287-90.

126. Maheshwari M. L., Jain T. C., Bates RB, Battacharyya S.C., (1993), Terpenoids

XLI. Structure and absolute configuration of alpha- agrofuran, beta-

agarofuran and dihydroagarofuran, Tetrahedron, (19), pp.1079-1019.

127. Makrides M, Gibson RA, McPhee AJ, Yelland L, Quinlivan J, Ryan P. (2010),

Effect of DHA supplementation during pregnancy on maternal depression

and neurodevelopment of young children: a randomized controlled trial,

JAMA. 304 (15), pp.1675 -83.

128. Mbatia, N.B., (2011), Valorisation of fish waste biomass through recovery of

nutritional lipids and biogas, Doctoral thesis, Lund University, Sweden.

129. Miller G. L (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar, Anal. Chem. 3, pp. 426-428.

130. Moleyar V, Narasimham P (1992), Antibacterial activity of essential oil

components, Int J Food Microbiol;16, pp. 337-42.

131. Moller JKS, Lindberg Madsen H, Aaltonen T, Skibsted LH (1999), Dittany

(Origanum dictamnus) as a source of water-extractable antioxidants,

147

Food Chem 1999, 64:215-219.

132. Mondal, K., I. Roy, and M.N. Gupta (2004), Enhancement of catalytic efficiencies

of xylanase, pectinase and cellulase by microwave pretreatment of their

substrates, Biocatalysis and Biotransformations, (22), pp. 9-16.

133. Mukhopadhayay M., (2000), Natural Extracts Using Supercritical Carbon

Dioxide. CRC Press Florida.

134. Munish Puri, Deepika Sharma and Colin J. Barrow (2012), Enzyme assisted

extraction of bioactives from plants, Trends in Biotechnology, Vol. 30,

No. 1, pp. 37-44.

135. Murugesan K, Nam I, Kim Y, Chang Y. (2007), Decolorization of reactive dyes

by a ther-mostable laccase produced by Ganoderma lucidum in solid state

culture, Enzyme Microb Technol, 40(7), pp. 1662-1672.

136. Nabavi S.F, Lorenzo A. D, Izadi M., Sánchez E.S, Daglia M. and Nabavi S.M.,

(2015), Antibacterial Effects of Cinnamon: From Farm to Food, Cosmetic

and Pharmaceutical Industries, Nutrients, 7(9), pp.7729-7748.

137. Nitthiyah Jeyaratnam, Abdurahman Hamid Nour, Ramesh Kanthasamy, Azhari

Hamid Nour, A.R. Yuvaraj, John Olabode Akindoyo (2016), Essential oil

from Cinnamomum cassia bark through hydrodistillation and advanced

microwave assisted hydrodistillation, Industrial Crops and Products, (92),

pp.57-66.

138. Nguyen H.T.M., Sylla K. S. B., Randriamahatody Z., Donnay-Moreno C.,

Moreau J., Tran L.T, Berge J. P. (2011), Enzymeatic hydrolysis of

yellowfin tuna (Thunnus albacares) by products using Protamex protease,

Food Technology and Biotechnology 49 (1), pp.48-55.

139. Pereira E. B., Castro, moraes F. F. D., Morase F. F.D and Zanin G.M (2001),

Kinetic Studies of Lipase from Candida rugosa- A Comparative Study

Between Free and Immobilized Enzyme onto Porous Chitosan Beads,

Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 91-93, pp.739-752.

140. Ping Li, Lin Tian, Tao Li (2015), Study on Ultrasonic-Assisted Extraction of

Essential Oil from Cinnamon Bark and Preliminary Investigation of Its

148

Antibacterial Activity.

141. Presti, M. L., Ragusa, S., Trozzi, A., Dugo, P., Visinoni, F., Fazio, A., (2005),

A comparison between different techniques for the isolation of rosemary

essential oil, Journal of Separation Science, (28), pp.273-280.

142. Pham Thanh Loan, Ngo The Long, Cao Van, Nguyen Thi Kim Thom, Nguyen

Đac Trien (2015), Building the models of Intergrated Pest Management

(IPM) for Cinnamomum cassia in Van Yen district, Yen Bai province,

Journal of Agricultural Technology 2015 Vol. 11(8): 2469-2480.

143. Qin Chen, megan N. Marshall, Scott M. Geib (2012), Effects of laccase on

lignin depolymerization and enzymeatic hydrolysis of ensied corn stover,

Bioresourse

144. Ramadan, M.F. et al. (2009), Chromatographic analysis for fatty acids and

lipid-soluble bioactives of Derris indica crude seed oil, J. Chromatogr.

(70), pp.103-108.

145. Ranalli, A., Lucera, L., Contento, S., Simone, N. and Re, P. del. (2004),

Bioactive constituents, flavours and aroma of virgin oils obtained by

processing olives with a natural enzyme extract, European Journal of

Lipid Science and Technology. 106(3), pp.187-197.

146. Ravindran, P., Nirmal Babu, K., Shylaja, M., (2004), C Innamon and Cassia:

the Genus Cinnamomum, Medicinal and Aromatic Plants-industrial

Profiles v. 36. CRC Press, Boca Raton.

147. Rosenthal, A., D.L. Pyle, and K. Niranjan (1996), Aqueous and enzymeatic

processes for edible oil extraction, Enzyme and Microbial Technology,

(19), pp. 403-429.

148. Rui Wang, Ruijiang Wang, Bao Yang (2009), Extraction of essential oils from

five cinnamon leaves and identification of their volatile compound

compositions, Innovative Food Science and Emerging Technologies 10,

pp. 289-292.

149. Salampessy J., Phillips M, Seneweera S, Kailasapathy K (2010), Release of

antimicrobial peptides through bromelain hydrolysis of leatherjacket

149

(Meuchenia sp.) insoluble proteins, Food Chemistry 120, pp. 556-560.

150. Salgado-Roman, M., Botello-Alvarez, E., Rico-Martinez, R., Jimenez-Islas, H.,

Cardenas-Manriquez, M., & Navarrete-Bolanos, J. L. (2008), Enzymeatic

treatment to improve extraction of capsaicinoids and carotenoids from

chili (Capsicum annuum) fruits, Journal of Agriculture Food Chemistry,

56(21), pp.10012-10018.

151. Salina H. F., Shima A.R., Masniza M., Faeizah H. N (2013), Enzyme assisted

aqueous extraction and phenolic antioxidants of onion oil, International

Journal of Science, Environment and Technology, Vol. 2, No 5, pp.949 - 955.

152. Sarot Cheenpracha, Eun-Jung Park, Bahman Rostama, John M. Pezzuto and

Leng Chee Chang (2010). Inhibition of Nitric Oxide (NO) Production in

Lipopolysaccharide (LPS)-Activated Murine Macrophage RAW 264.7

Cells by the Norsesterterpene Peroxide, Epimuqubilin A, Mar. Drugs

2010, 8, pp.429-437.

153. Sathivel, S., Smiley, S., Prinyawiwatkul, W., and Bechtel, J.P., (2005),

Functional and Nutritional Properties of Red Salmon (Oncorhynchus

nerka) Enzymeatic Hydrolysates, Journal of Food Science - Vol. 70,

pp.401-406.

154. Sayantani Dutta and Paramita Bhattacharjee (2015), Enzyme-assisted

supercritical carbon dioxide extraction of black pepper oleoresin for

enhanced yield of piperine-rich extract, Journal of Bioscience and

Bioengineering Vol. 120 No. 1, pp.17-23.

155. Shan B., Yizhong Z. C., Sun M., and Corke H., (2005), Antioxidant Capacity of

26 Spice Extracts and Characterization of Their Phenolic Constituents, J.

Agric. Food Chem., 2005, 53 (20), pp. 7749-7759.

156. Shilei Geng, Zhaoxue Cui, Xinchao Huang a, Yufen Chen, Di Xu c, Ping Xiong

(2011), Variations in essential oil yield and composition during

Cinnamomum cassia bark growth, Industrial Crops and Products, (33),

pp.248-252.

157. Shimada, Y., Maruyama, K., Sugihara, A. Moriyama, S., Tominaga, Y. (1997),

Purifi cation of docosahexaenoic acid from tuna oil by a two-step

150

enzymeatic method: hydrolysis and selective esterifi cation, Journal of the

American Oil Chemists’ Society.74, pp.1441-1446.

158. Sibel .K, N. Sedef, K. Nural, S. Sahin, S. Gulum and B. Beste (2012),

Microwave-assaited hydrodistillation of essential oil from rosemary,

Journal of Food Science Technology.

159. Slizyté, R., Dauksas, E., Falch, E., Rustad, T., Storro, I., (2005), Yield and

composition of different fractions obtained after enzymeatic hydrolysis of cod

(Gardus morhua) by-products, Process Biochemistry, (40), pp.1415-1424.

160. Slizyté, R., Rustad, T., Storro, I., (2005), Enzymeatic hydrolysis of cod (Gardus

morhua) by-products - Optimization of yield and properties of lipid and

protein fraction, Process Biochemistry, (40), pp.3680-3692.

161. Sowbhagya H.B., Purnima K. T., Florence S. P., Rao A.G., Srinivas P. (2009),

Evaluation of enzyme-assisted extraction on quality of garlic volatile oil,

Food Chemistry 113, pp. 1234-1238.

162. Sowbhagya H. B. & Chitra V. N. (2010), Enzyme-Assisted Extraction of

Flavorings and Colorants from Plant Materials, Critical Reviews in Food

Science and Nutrition, 50:2, pp.146-161.

163. Sowbhagya H.B., Srinivas P., Krishnamurthy N. (2010), Effect of enzymes on

extraction of volatiles from celery seeds, Food Chemistry, (120), pp.230-234.

164. Sowbhagya H.B., Srinivas P., Purnima K.T., Krishnamurthy N. (2011),

Enzyme-assisted extraction of volatiles from cumin (Cuminum cyminum

L.) seeds, Food Chemistry, (127), pp.1856-1861.

165. Srebotnik E., Hammel K. E. (2000), Degradation of nonphenolic lignin by the

laccase/1-hydroxybenzotriazole system, Journal of Biotechnology (81),

pp.179-188.

166. Sun J. X. and Sun R. C. (2004), Isolation and characterization of cellulose from

sugarcane bagasse, Journal Polymer Degradation and Stability,Vol 84,

Issue 2, pp. 331-339.

167. Thomas M, Wood and K. Mahalingeshwara Bhat (1998), Methods in

Enzymeology, Vol. 160, 8, pp.7-112.

151

168. Tran Thanh Truc, Le Kim Thanh and Nguyen Van Muoi (2008), Effect of pH

and temperature on activity of bromelain in pineapple fruit, The

1st Conference Food Science and Technology Mekong delta, March 20-

22, pp.35-138.

169. Unlu M., Ergene E., Unlu G.V., Zeytinoglu H.S., Vural N. (2010), Composition,

antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity of essential oil from

Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae), Food and Chemical

Toxicology 48, 3274-3280.

170. Vanden Bergher D. A., and Vlietinck (1991), “Screening methods for

Antibacterial and Ativiral Agent from Higher Plants”, Methods in Plant

biochemistry, Academic Press., USA, Vol. 6, pp.113-117.

171. Wood T. M. and Bhat K. M (1988), Methods for measuring cellulose activities,

Methods in Enzymeology 160, pp. 87-112.

172. Yoshii Eiichi, Koizumi Toru, Oribe Takiko (1987), The structure of

agarotetrol: a novel highly oxygenated chromone from agarwood (Jinko),

Tetrahedron Letters, (41), pp.3921-3924.

173. Zhongyang Ding, Lin Peng, Youzhi Chen, Liang Zhang, ZhenghuaGu, Guiyang

Shi and Kechang Zhang (2012), Production and characterization of

thermostable laccase from the mushroom, Ganoderma lucidum, using

submerged fermentation, African Journal of Microbiology Research, Vol.

6 (6), pp.1147-1157.

PHỤ LỤC