NATÁLIA CARRILLO GAETA

Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação

com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento

de resistência a antimicrobianos

São Paulo

2020

NATÁLIA CARRILLO GAETA

Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a

mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de

resistência a antimicrobianos

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Clínica Veterinária da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutora em Ciências.

Departamento:

Clínica Médica

Área de concentração:

Clínica Veterinária

Orientador:

Prof. Dra. Lilian Gregory

De acordo:____________ __________

Orientador

São Paulo

2021

Obs.: A versão original encontra-se disponível na Biblioteca da FMVZ/USP.

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Maria Aparecida Laet, CRB 5673-8, da FMVZ/USP.

T. 4009 Gaeta, Natália Carrillo FMVZ Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação

com a modificação da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos / Natália Carrillo Gaeta. – 2020.

155 f. : il.

Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia. Departamento de Clínica Médica, São Paulo, 2021.

Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária.

Área de concentração: Clínica Veterinária.

Orientadora: Profa. Dra. Lilian Gregory.

1. Metais pesados. 2. Microbioma. 3. Resistência a antimicrobianos. 4. Bovinos leiteiros. 5. Mineração. I. Título.

.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: GAETA, Natália Carrillo

Título: Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e

sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o

desenvolvimento de resistência a antimicrobianos

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Data: / /

Banca Examinadora

Prof. Dr.

Instituição: Julgamento:

Prof. Dr.

Instituição: Julgamento:

Prof. Dr.

Instituição: Julgamento:

DEDICATÓRIA

Este trabalho é inteiramente dedicado

a Deus, a minha família, e aos meus filhos

de pelos e penas, pilares que sustentam minha vida.

AGRADECIMENTOS

Deus, infinitamente justo e bom, a causa primária e todas as coisas. Meu Pai, meu

criador. Agradeço imensamente pela oportunidade que me concedestes a mais uma

encarnação neste planeta. Agradeço pela oportunidade de me tornar doutora, por ter

me dado força, saúde e sabedoria para completar mais um ciclo da minha vida.

Agradeço, também, pelos momentos difíceis, afinal, foram neles que aprendi as

maiores lições e cresci como ser humano.

Aos meus amados pais Geraldo e Rosana e minha querida irmã Isabella, pelo amor,

apoio, compreensão e carinho de todos os dias, e, principalmente, por me darem o

exemplo do que é trilhar o caminho do bem, do amor e da caridade. Ao meu cunhado

Ederson por todo carinho, muito obrigada!

Aos meus avós Roberval e Ignês e tios Renata e Ronaldo por todo amor e apoio em

todos os momentos da minha vida.

Ao meu noivo, amor, amigo e companheiro Daniel, pelo carinho, apoio, compreensão

e paciência, principalmente durante o tempo em que permanecemos longe um do

outro. Obrigada por estar sempre ao meu lado.

À minha nova família, composta pelos meus amados sogros Daniel e Carla, aos meus

cunhados Luis Fernando e Fernanda e a vovó Diva por todo amor nesses anos que

estamos juntos. Por me permitirem entrar nessa família tão linda e por todo apoio. Um

especial agradecimento aos doces maravilhosos da minha sogra.

Aos meus companheiros de estimação que ainda estão encarnados: Nino (cão), Tico

(canarinho), Jujuba (calopsita) e Gertrudes (porquinho-da-índia) e àqueles que já se

foram: Nina, Penélope, Bob e Susy, meu muito obrigada por todo amor incondicional

e carinho. Vocês são a razão por eu ter escolhido esta profissão. Aos melhores amigos

que um ser humano por ter, ofereço-lhes todo meu amor.

A todos os passarinhos que passam pela minha janela todos os dias (Norberta,

Rolandinha, Rolinê, Pacífica, Santa Maria, Nina, Pinta, Azulão e Azulina, Floriano e

aos demais que não consegui nomear) esperando serem alimentados com sementes

e frutas, que cantam e têm bebes na minha laranjeira, alegrando ainda mais meus

dias, o meu muito obrigada.

Aos queridos Raquel Kojima, Fernando Katsuo e Alejandro Vera pelo apoio e

acompanhamento no momento mais difícil que passei durante esses quatros anos. O

meu muito obrigada.

Aos meus companheiros do grupo de jovens da SEEIC: Rafael, Wesley, Adriano,

Thais, Maria Eduarda, Leonardo, Eric, Alec, Julia, Helena e Paulo, ofereço todo meu

amor, e carinho. Agradeço muito pelo apoio e principalmente por confiarem no meu

trabalho como docente. Devo muito a vocês.

À minha querida orientadora Profª. Dra. Lilian Gregory, pela oportunidade de ser sua

aluna há dez anos, pelos ensinamentos, pela confiança que sempre depositou em

mim e, principalmente, por me abrir as portas do mundo, o meu muito obrigada. Este

não é o fim, mas o início de um novo ciclo. Ao seu esposo Arnaldo, sua filha Suraia e

sua cachorrinha Gigi, tão queridos que sempre me receberam muito bem e ao qual

sou muito grata, ofereço todo meu carinho.

Aos meus grandes amigos Mário e Jeferson, pelas risadas, apoio, carinho, ajuda nas

coletas e por aguentarem minhas chatices. Sem vocês, esse trabalho não seria

concluído. À Margarida que, embora tenha chegado nos momentos finais, sempre me

acolheu com carinho e apoio. Muito obrigada.

A minha querida amiga e orientadora Erika Korzune Ganda pela confiança,

ensinamentos, amizade, passeios na Ross e por me proporcionar a honra de ser sua

primeira aluna e membro do “The Ganda Lab”, o meu muito obrigada. E junto ao seu

esposo Joe Ricotta, me permitiram viver em sua casa pelos três meses que passei

nos EUA. Não tenho palavras para agradecer.

Aos demais membros do “The Ganda Lab”, Asha Miles e Emily Bean. Sem vocês esse

trabalho são seria possível. Agradeço a amizade, os ensinamentos e tenham certeza

que, assim como a Erika, vocês são os exemplos na área de microbioma que me

espelho todos os dias. Quando crescer, quero ser igual a vocês. Girl Power!

À meus lindos e amados colegas do ICB Izadora, Maysa, Aline, Camila, Giovanni,

Felipe, Cris e Alexandre pelas boas risadas, desabafos, fofocas. Vocês fizeram esses

quatro anos muito mais leves! Ao mestre Prof. Dr. Jorge Timenetsky pelo carinho,

apoio, amizade e ensinamentos. Sou muito grata pela confiança e pela oportunidade

de desenvolver minhas pesquisas no seu laboratório. Por ter sido acolhida e ter meu

trabalho reconhecido por todos vocês, me sinto a pessoa mais sortuda que conheço.

Ao Prof. Dr. Nilton Lincopan e sua equipe: Fernanda, Brenda, Maria, Miriam, e a todos

os demais que me ajudaram muito durante este trabalho. Pelos ensinamentos, dicas

e ombro amigo, dedico a todos o meu carinho. Um especial agradecimento ao Danny

Fuentes pelo desenho do Mapa de colheita de amostras do rio e ao querido Herrison

por toda ajuda e ensinamentos indispensáveis na área de bioinformática.

Ao Prof. Dr. Luigi Jovane e a aluna Patricia Pádua, pela oportunidade de desenvolver

meu trabalho no seu laboratório no Instituto de Oceanografia da Universidade de São

Paulo. Pela confiança e pelos grandes ensinamentos, meu muito obrigada.

Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Scapin, por todo auxílio valioso com a técnica de

fluorescência de raio-x. Por acreditar neste trabalho e sempre estar disponível para

novos desafios, o meu muito obrigada.

À Prof. Dra. Adivane Costa e seu aluno Arthur, que auxiliaram na colheita de amostras

de água na Bacia do Rio Doce. Muito obrigada.

Aos queridos Prof. Dr. Edson Luiz Durigon e Luciano Matsumyia Thomazelli, por me

permitir utilizar os equipamentos do laboratório que foram fundamentais para a

execução deste trabalho. Muito obrigada!

Ao Dr. Jesús Ulises Garza Ramos Martínez e ao Dr. Humberto Barrios Camacho do

Laboratório de Resistencia Bacteriana do Centro de Investigaciones sobre

Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública, em Cuernavaca,

México, pela valiosa ajuda na determinação do sequence typing da cepa K. variicola,

“muchas gracias por su atención e ayuda”.

À todos os colegas de pós-graduação pela amizade, risadas, companheirismo durante

as disciplinas e as conversas nos corredores.

A todos os professores do Departamento de Clínica Médica que me acolhem há dez

anos e a quem sou grata por todo apoio e carinho, o meu muito obrigada.

Meu carinho, amor e homenagem ao querido Prof. Dr. Fernando José Benesi, incrível

como pessoa e profissional e que tive a honra de conviver. Agradeço por sua amizade,

preocupação comigo e minha família e, principalmente, por tudo que o senhor fez pela

pesquisa e pela medicina veterinária brasileira. Cacilda Becker, como sentimos sua

falta aqui neste plano!

A todos os funcionários da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo, que direta ou indiretamente ajudaram no desenvolvimento

desta pesquisa. Um especial agradecimento às secretárias Adelaide e Silvana e às

técnicas Claudia, Clara e Dinha, por toda ajuda indispensável nesses anos de pós-

graduação.

Aos proprietários que abriram as portas de suas fazendas e permitiram que nosso

grupo de pesquisa pudesse colher as amostras e executar este trabalho. O meu muito

obrigada.

À todos as fêmeas leiteiras que participaram desta pesquisa. Sua encarnação atual

não foi em vão. Tenha certeza de que pela valiosa ajuda na evolução da pesquisa,

vocês já subiram alguns degraus na escada da evolução. Muito obrigada meninas!

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio a este doutorado

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de

doutorado concedida (PROCESSO FAPESP 2016/23204-9).

“Teu trabalho é a oficina em que podes forçar a tua própria luz. ” (Francisco Cândido Xavier, pelo espírito Emmanuel)

“Os animais têm alma e valem pelos melhores amigos”

(Francisco Cândido Xavier)

“Estude a si mesmo, observando que o autoconhecimento traz humildade e sem humildade é impossível ser feliz. Amor é a força da via e trabalho vinculado ao amor é a usina geradora

da felicidade” (Francisco Cândido Xavier, pelo espírito Emmanuel)

RESUMO

GAETA, N. C. Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos [Evaluation of cattle exposed to high concentration of heavy metals and their relationship with changes in intestinal, ruminal and respiratory microbiota and the development of antimicrobial resistance]. 2020. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021.

Casos de contaminação ambiental originados a partir de erros humanos estão

ganhando cada vez mais espaço na mídia, alertando a todos quanto a fragilidade do

meio ambiente perante os acontecimentos. Problemas técnicos e estruturais de

barragens foram destaque na mídia nacional e internacional, ao qual geraram

consequências inimagináveis tanto pela contaminação ambiental quanto pela morte

de centenas pessoas no Estado de Minas Gerais, Brasil. Em 2015, o município

mineiro de Mariana foi severamente acometido pelo vazamento de mais de 43

milhões de metros cúbicos de rejeito de minério de ferro devido ao rompimento da

barragem do Fundão. A isso, o ambiente da região também sofre com o

contínuo despejo de esgotos domésticos e agropecuários, contendo elementos

nocivos ao equilíbrio ambiental. Os metais pesados podem, por vários

mecanismos, desencadear a resistência a antibióticos e a modificação da

microbiota, impactando na saúde dos animais e, consequentemente, na

economia da região, além de ocasionar consequências negativas a saúde

humana. O presente trabalho teve como objetivo estudar bovinos leiteiros criados

na região de Mariana, Minas Gerais (impactada por resíduos tóxicos), quanto a

saúde, ocorrência de resistência bacteriana aos antimicrobianos e as possíveis

mudanças na microbiota desses animais. A água do rio também foi avaliada quanto

a presença de metais pesados e bactérias resistentes a antimicrobianos. Cinquenta

e oito fêmeas bovinas leiteiras foram estudadas, sendo 28 criadas em Mariana,

Minas Gerais (F1) e 30 criadas em Caldas, Minas Gerais (local sem histórico de

contaminação ambiental) (F2). Foram obtidas amostras de sangue total (para

obtenção de soro), swab fecal e nasal profundo, líquido ruminal e água dos dois

locais. Fez-se a avaliação física e do perfil renal e hepático dos animais, bem

como da concentração de metais pesados no soro e na água utilizando a

metodologia de fluorescência de raio-x. Estudou-se o microbioma e resistoma

intestinal, ruminal e respiratório e, por fim, a presença de bactérias resistentes à

antimicrobianos nas

amostras de água. No momento da visita às propriedades, os animais não

apresentavam nenhuma manifestação clínica decorrente de intoxicação por metais

pesados. Houve detecção de arsênio e alumínio em animais de ambas regiões

estudadas, em concentração abaixo do limite máximo seguro para a espécie. Quando

ao metagenoma bovino, o microbioma e resistoma de F1 foi diferente de F2. A

abundância relativa e prevalência de genes de resistência a antimicrobianos foi maior

em F1 que em F2. As amostras de F1 apresentaram alta presença de genes de

resistência a antibióticos, metais, biocidas e de multirresistência. A análise da água do

rio indicou a presença de alumínio e ferro em concentrações consideradas abaixo do

limite estabelecido pelos órgãos reguladores. O estudo microbiológico da água revelou

inúmeras bactérias resistentes a antibióticos e metais pesados como arsênio e

mercúrio e com a análise genética sugeriu-se a ocorrência da co-resistência. Sabendo

que a contaminação por metais pesados afeta o microbioma e resistoma animal, a

qualidade da água e o equilíbrio ambiental, ações ambientais em relação à mineração

são necessárias e urgentes, como construção e manutenção adequadas de

barragens, buscas por métodos de extração mineral menos danosos e com menor

produção de rejeitos, adequado tratamento de rejeitos e avaliação continuada da

presença e disseminação de genes de resistência. Essas ações são fundamentais

para garantir a proteção ambiental, animal, e do sistema de produção de alimentos

das consequências perigosas decorrentes do alto despejo de contaminantes.

Palavras-chave: Metais pesados, Microbioma, Resistência a antimicrobianos,

Bovinos leiteiros, Mineração.

ABSTRACT

GAETA, N. C. Evaluation of cattle exposed to high concentration of heavy metals and their relationship with changes in intestinal, ruminal and respiratory microbiota and the development of antimicrobial resistance [Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos]. 2020. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade deMedicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021.

Cases of environmental contamination originating from human errors are gaining more

and more space in the media, alerting everyone to the fragility of the environment in

the face of events. Technical and structural problems of dams were highlighted in the

national and international media, which generated unimaginable consequences both

for the environmental contamination and for the death of hundreds of people in the

State of Minas Gerais, Brazil. In 2015, the mining municipality of Mariana was severely

affected by the spill of over 43 million cubic meters of iron ore tailings due to the

collapse of the Fundão dam. As a result, the region's environment also suffers from

the continuous dumping of domestic and agricultural sewage, containing elements

harmful to the environmental balance. Heavy metals can, by various mechanisms,

trigger resistance to antibiotics and the modification of the microbiota, impacting the

health of animals and, consequently, the economy of the region, in addition to causing

negative consequences to human health. This study aimed to study dairy cattle raised

in the region of Mariana, Minas Gerais (impacted by toxic waste), regarding health, the

occurrence of bacterial resistance to antimicrobials, and possible changes in the

microbiota of these animals. The river water was also evaluated for the presence of

heavy metals and bacteria resistant to antimicrobials. Fourty-eight cattle females were

studied, 28 raised in Mariana, Minas Gerais (F1), and 30 raised in Caldas, Minas

Gerais (place without a history of environmental contamination) (F2). Samples of whole

blood (to obtain serum), fecal and deep nasal swab, ruminal fluid, and water were

obtained from both locations. The physical and renal and hepatic profiles of the animals

were evaluated, as well as the concentration of heavy metals in serum and water using

the x-ray fluorescence methodology. The intestinal, ruminal, and respiratory

microbiome and resistome were studied and, finally, the presence of antimicrobial-

resistant bacteria in the water samples. At the time of the visit to the properties, the

animals did not show any clinical manifestation due to heavy metal poisoning. There

was the detection of arsenic and aluminum in animals from both regions studied, in

concentrations below the maximum safe limit for the species. As for the bovine

metagenome, the F1 microbiome and resistome were different from F2. The relative

abundance and prevalence of antimicrobial resistance genes were higher in F1 than in

F2. F1 samples showed a high presence of antibiotics, metal, biocide, and multidrug

resistance genes. The analysis of the river water indicated the presence of aluminum

and iron in concentrations considered below the limit established by Organs regulatory

agencies. The microbiological study of water revealed innumerable bacteria resistant

to antibiotics and heavy metals such as arsenic and mercury and with genetic analysis,

the occurrence of co-resistance was suggested. Knowing that heavy metal

contamination affects the microbiome and animal resistome, water quality, and

environmental balance, environmental actions concerning mining are necessary and

urgent, such as adequate construction and maintenance of dams, searches for less

harmful mineral extraction methods and with less production of tailings, adequate

tailings treatment and continued evaluation of the presence and dissemination of

resistance genes. These actions are fundamental to guarantee the environmental,

animal, and food production system protection from the dangerous consequences

resulting from the high dumping of contaminants.

Keywords: Heavy metals, Microbiome, Antimicrobial resistance, Dairy cattle, Mining.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Destruição de construções e evidências do acidente em árvores à beira do

Rio do Carmo, provocadas pela lama despejada após o rompimento da barragem do

Fundão em Mariana, Minas Gerais, Brasil, 2020....................................................... 35

Figura 2 – Exemplos de mecanismos moleculares relacionados a co-seleção de

metais e antibióticos .................................................................................................. 43

Figura 3 - Localização dos municípios de Mariana (fazenda 1) e Caldas (fazenda 2),

em Minas Gerais, Brasil ............................................................................................ 52

Figura 4 - Pontos de colheita de água na Bacia do Rio Doce. Letras indicam amostras

para detecção de bactérias resistentes. Asteriscos indicam amostras obtidas para

estudo dos metais pesados. A: Gualaxo; B: Paracatu; C: Campinas/Pedras; D:

Gesteira; E: Barra Longa urbano; F: Barra Longa rural; G: Rio do Carmo; H: Rio Doce.

..................................................................................................................................54

Figura 5 - Disposição dos discos de antibióticos na placa de petri contendo ágar

Mueller Hinton ........................................................................................................... 58

Figura 6 - Esquema da placa utilizada para determinação do CIM. ......................... 63

Figura 7 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas

amostras fecais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em

Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) .................. 74

Figura 8 -. Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas

amostras fecais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em

Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05).................. 75

Figura 9 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas

amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em

Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) .................. 76

Figura 10 - Boxplot evidenciando os cinco gêneros mais abundantes presentes nas

amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em

Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05).................. 77

Figura 11 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas

amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas

em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) ................. 78

Figura 12 - Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas

amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas

em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com

correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) ................. 79

Figura 13 – Abundância relativa de filos e gêneros entre fazendas e sítios anatômicos.

Heatmaps demonstrando a abundância relativa dos filos (A) e gêneros (B) mais

abundantes determinados nas amostras fecais, ruminais e nasais de bovinos leiteiros

das fazendas 1 e 2 .................................................................................................... 80

Figura 14 - Perfil de resistência a antibióticos dos isolados obtidos nas amostras de

água de oito pontos ao longo da Bacia do Rio Doce (incluindo F 1) e da F2, localizadas

no estado de Minas Gerais, Brasil. Três isolados apresentando perfil de beta-

lactamase de espectro estendido (ESBL) estão assinalados com um asterisco 88

Figura 15 - Frequência de detecção de cepas resistentes a metais pesados (isoladas

de amostras de água) em relação a seleção utilizando placas suplementadas com os

elementos tóxicos. ..................................................................................................... 93

Figura 16 - Esquema demonstrando a sequência de etapas para estudo da presença

concomitante de resistência a antibióticos e metais pesados nos isolados de água.94

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Sequência de oligonucleotídeos iniciadores para detecção de genes

codificadores de ESBL .............................................................................................. 59

Tabela 2 - Metais pesados utilizados na padronização do teste de concentração

inibitória mínima. São Paulo. 2019 ............................................................................ 61

Tabela 3 - Concentração das soluções estoque e trabalho, e a diluição inicial utilizada

no teste para determinação do CIM para cada elemento. São Paulo. 2019 .............. 62

Tabela 4 - Frequência dos parâmetros clínicos gerais obtidos das fêmeas bovinas

pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de

Minas Gerais, Brasil. ................................................................................................. 71

Tabela 5 - Frequência de parâmetros clínicos específicos do sistema respiratório

obtidos das fêmeas bovinas pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas),

localizadas no estado de Minas Gerais, Brasil. ......................................................... 72

Tabela 6 - Comparação de médias entre as variáveis estudadas em bovinos leiteiros

das fazendas 1 e 2, localizadas nas cidades de Mariana e Caldas, respectivamente,

Minas Gerais, Brasil. Valores em negrito indicam significância estatística no teste

Wilcox Sum Rank com Correção de Continuidade (P < 0.05). .................................. 73

Tabela 7 - Número médio de funções únicas identificadas por fazenda e sítio

anatômico (fezes, rúmen e swab nasal). IIQ: Intervalo interquartil. ........................... 82

Tabela 8 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s

identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação às fazendas 1 e 2 82

Tabela 9 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s

identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação aos sítios anatômicos

..................................................................................................................................83

Tabela 10 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s

identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação a composição fazendas

e sítios anatômicos .................................................................................................... 85

Tabela 11 - Tabela X. Detecção de alumínio (Al). Cromo (Cr), ferro (Fe), cobalto (Co),

arsênio (As), mercúrio (Hg) e cobre (Cu) em quatro pontos da bacia do Rio Doce

(incluindo a fazenda 1) e a fazenda 2, utilizando WDXRF. Valores precedidos pelo

sinal < significam que estão abaixo do limite de quantificação da técnica. ............... 86

Tabela 12 - Relação de cepas isoladas da água da Bacia do Rio Doce e a fazenda 2,

apresentando resistência a ao menos um elemento tóxico estudado de acordo com o

teste padronizado ...................................................................................................... 90

Tabela 13 - Presença concomitante do fenótipo de resistência a elementos tóxicos e

antibióticos dos isolados obtidos a partir da triagem de amostras de água da Bacia do

Rio Doce (incluindo Fazenda 1) e Fazenda 2, Minas Gerais, Brasil. ......................... 96

Tabela 14 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST e sorotipo de alguns

isolados de E. coli obtidos a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas

Gerais, Brasil. .......................................................................................................... 100

Tabela 15 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST, wzi, e k_O locus da cepa

C2-C (K. variicola subsp. variicola) obtida a partir da análise da água da Bacia do Rio

Doce, Minas Gerais, Brasil. ..................................................................................... 103

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 23

2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 25

2.1 METAIS PESADOS ................................................................................. 25

2.1.1 Características, participação biológica e toxicidade................................... 25

2.1.1.1 Mercúrio ....................................................................................................... 26

2.1.1.2 Arsênio .................................................................................................... 27

2.1.1.3 Chumbo ................................................................................................... 28

2.1.1.4 Cádmio .................................................................................................... 29

2.1.1.5 Cobre ....................................................................................................... 29

2.1.1.6 Alumínio .................................................................................................. 31

2.1.1.7 Cromo ...................................................................................................... 31

2.1.1.8 Ferro ........................................................................................................ 32

2.1.1.9 Cobalto .................................................................................................... 32

2.2 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL ............................................................... 32

2.2.1 Consequências da exposição prolongada a metais pesados ............ 36

2.2.1.2 Modificação da microbiota animal e humana ...................................... 36

2.2.1.3 Modificação do microbiota ambiental .................................................. 38

2.2.2 Resistência a antimicrobianos .............................................................. 39

2.2.2.2 Origem e mecanismos ........................................................................... 40

2.2.2.3 Resistência a metais pesados e a co-resistência ................................ 42

2.3 DETECÇÃO DOS METAIS PESADOS .................................................... 46

2.4 SHOTGUN SEQUENCING....................................................................... 47

3 OBJETIVOS ............................................................................................. 49

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 49

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 49

3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................... 51

3.1 AMOSTRAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO ............ 51

3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ..................................................................... 52

3.3 EXAME FÍSICO ........................................................................................ 52

3.4 AMOSTRAS ............................................................................................. 53

3.4.1 Sangue total ............................................................................................ 53

3.4.2 Água ........................................................................................................ 54

3.4.3 Swab fecal ............................................................................................... 54

3.4.4 Swab nasal profundo ............................................................................. 55

3.4.5 Conteúdo ruminal ................................................................................... 55

3.5 ANÁLISES LABORATORIAIS .................................................................. 55

3.5.1 Determinação da concentração de metais pesados............................ 55

3.5.2 Perfis renal e hepático ........................................................................... 56

3.5.3 Estudo das bactérias resistentes na água ........................................... 56

3.5.4 Determinação de bactérias resistentes à antibióticos ........................ 57

3.5.5 Sensibilidade bacteriana à metais pesados ......................................... 60

3.5.6 Identificação das espécies bacterianas ................................................ 63

3.5.7 Sequenciamento de cepas representativas ......................................... 64

4.5.8.1 Extração de DNA ......................................................................................... 65

3.5.8.1 Shotgun Sequencing .............................................................................. 66

3.6 ANÁLISE .................................................................................................. 66

3.6.1 Variáveis clínicas e laboratoriais .......................................................... 66

3.6.2 Microbioma ............................................................................................. 67

3.6.3 Resistoma ............................................................................................... 67

3.6.4 Anotação funcional do metagenoma .................................................... 68

4 RESULTADOS ......................................................................................... 70

4.1 CARACTERÍSTICAS DAS PROPRIEDADES ESTUDADAS ................... 70

4.2 PARÂMETROS CLÍNICOS DOS ANIMAIS .............................................. 71

4.3 CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NO SORO DOS BOVINOS. 73

4.4 PERFIL RENAL E HEPÁTICO DOS BOVINOS ....................................... 73

4.5 METAGENOMA BOVINO ......................................................................... 74

4.5.1 Microbiota ............................................................................................... 74

4.5.2 Resistoma ............................................................................................... 81

4.5.3 Anotação funcional ................................................................................ 81

4.6 ANÁLISE DA ÁGUA ................................................................................. 86

4.6.1 Detecção de elementos tóxicos ............................................................ 86

4.6.2 Detecção de bactérias resistentes a antibióticos na água ................. 86

4.6.3 Detecção de espécies resistentes a metal pesado na água ............... 88

4.6.4 Presença concomitante de resistência a metais pesados e

antibióticos nos isolados ....................................................................... 94

4.7 ANÁLISE GENÔMICA DE CEPAS REPRESENTATIVAS ....................... 98

4.7.1 Escherichia coli ...................................................................................... 98

4.7.2 Klebsiella pneumoniae Complex ......................................................... 102

5 DISCUSSÃO .......................................................................................... 104

5.1 SAÚDE BOVINA ..................................................................................... 104

5.2 MICROBIOMA, RESISTOMA E ANOTAÇÃO FUNCIONAL ................... 106

5.3 ELEMENTOS TÓXICOS NA ÁGUA ....................................................... 110

5.4 BACTÉRIAS ISOLADAS DA ÁGUA DE BEBIDA ................................... 111

5.5 CEPAS SEQUENCIADAS – CARACTERÍSTICAS E IMPLICAÇÕES .... 114

6 CONCLUSÃO ........................................................................................ 121

7 REFERENCIAS ...................................................................................... 122

23

1. INTRODUÇÃO

Em 2019, o Brasil contava com um rebanho bovino de aproximadamente 215

milhões de animais. Neste mesmo ano, o efetivo de vacas ordenhadas chegou a 16,3

milhões, com produção de quase 35 bilhões de litros de leite (BARROS, 2020). A

região sudeste voltou a liderar o ranking de maior produtora de leite, sendo o estado

de Minas Gerais o principal produtor e número um deste ranking. Dentre as inúmeras

regiões mineiras de produção leiteira, encontra-se aquela estabelecida na Bacia do

Rio Doce, localizada no quadrilátero ferrífero.

A região do quadrilátero ferrífero abrange os municípios de Sabará,

Santa Barbara, Mariana, Congonhas, Ouro Preto, João Monlevade, Rio Piracicaba,

Itaúna e Itabira. Desde o final do século XVII a região tem se destacado como uma

das mais famosas produtoras de ouro do Brasil. A partir deste período, padrões

modernos de exploração mineral foram instalados juntamente com técnicas

rudimentares de extração por garimpo, sendo esta última, de forma mais extensiva,

descontrolada e predatória com a utilização de mercúrio no processo. As grandes

minerações de ferro-manganês, iniciaram a exploração extensiva de suas jazidas na

segunda metade do século XX, sobretudo a partir do início da década de 80.

O Quadrilátero Ferrífero está localizado na região da bacia hidrográfica do Rio

Doce, cuja nascente encontra-se no estado de Minas Gerais e chega até o Espírito

Santo. Os fatores sociais e econômicos envolvidos na Bacia do Rio Doce e das sub-

bacias de seus afluentes também são considerados quando se analisa o uso das

águas, tanto em relação ao potencial poluidor como das necessidades de usos. O

desenvolvimento no entorno da bacia trouxe também sérias consequências

ambientais. Os poluentes lançados pelos esgotos domésticos, efluentes industriais e

da atividade de mineração provocam impactos significativos na qualidade das águas,

que já são monitoradas em relação aos parâmetros físico-químicos e microbiológicos.

No processo de ocupação econômica da bacia do Rio Doce, as extrações vegetal e

mineral tiveram um papel importante no desenvolvimento da região. A mineração se

destacou com a extração de ferro, ouro, bauxita, manganês, pedras preciosas, dentre

outros. Essa região ganhou destaque na mídia nacional e internacional devido a dois

acidentes ambientas ocorridos em 2015 e 2016 em Mariana e Brumadinho,

respectivamente, com centenas de perdas humanas, animais e vegetais.

24

Casos de contaminação ambiental originados a partir de erros humanos vêm

ganhando cada vez mais espaço nas mídias, alertando a população quanto a

fragilidade do meio ambiente perante os acontecimentos, em vários países, incluindo

o Brasil. Contaminação pode ser definida como concentrações de elementos acima

de níveis estabelecidos por normativas, sejam no solo, água ou em organismos vivos

(RIBEIRO, 2013). Os metais estão naturalmente presentes no meio ambiente, em

concentrações que mantém o equilíbrio ambiental. Entretanto, ações antropomórficas

como mineração, atividade industrial, agropecuária, residencial e hospitalar são

responsáveis pela deposição de grande quantidade desses elementos no meio

ambiente, desencadeando o desequilíbrio dos ciclos biológicos. A poluição por metais

pesados tem grande impacto na saúde de animais e dos seres humanos, já que muitos

desses elementos tem meia-vida longa e permanecem depositados nas células

animais e no ambiente (HAN, F.X.; KINGERY, W.L.; SELIM, 2001).

A avaliação das consequências da exposição prolongada a esses elementos

tóxicos nos meios bióticos e abióticos é necessária a fim de se conhecer os possíveis

impactos na saúde animal e humana, impedir a contaminação de alimentos e gerar

políticas de recuperação e preservação ambiental.

25

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 METAIS PESADOS

2.1.1 Características, participação biológica e toxicidade

Por definição, metais são elementos que conduzem eletricidade, são

maleáveis, dúcteis, formam cátions e possuem óxidos básicos (ATKINS, P.; JONES,

1997). Vários elementos são inclusos quando essa definição é utilizada, de modo que

os metais são geralmente classificados em subgrupos, dentre eles, o chamado “metal

pesado”.

O termo “metal pesado” é geralmente utilizado para elementos químicos

pertencentes ao grupo dos metais e metaloides que estão relacionados a poluição

ambiental, efeitos nocivos aos seres vivos e toxicidade (DUFFS, 2002; ALI; KHAN,

2018). São considerados elementos com propriedades metálicas e com número

atômico acima de 20 (TANGAHU et al., 2011). Ainda, os metais pesados também são

definidos como elementos com densidade específica acima de 5g/cm3. Entretanto, a

International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) reforça que este termo é

usado incorretamente, já que não existem bases científicas para determinar que os

elementos foram corretamente classificados como metais pesados e que este termo

pode não ter significado (DUFFS, 2002). Apesar dessas diferenças em relação a

definição, e devido ao uso corriqueiro na comunidade científica, o termo “metal

pesado” será utilizado ao longo deste trabalho.

Alguns desses elementos classificados como metais pesados participam de

processos biológicos, sendo essenciais aos seres vivos. O cobre (Cu) está

relacionado a manutenção dos tecidos epitelial e conjuntivo, produção de

hemoglobina, mielina, melanina e funcionamento da tireoide (OSREDKAR, 2011). O

zinco (Zn), por sua vez, é responsável pela atividade de várias enzimas e participa da

resposta imune, da síntese de DNA e da divisão celular (PRASAD, 1978;

SOLOMONS, 2009). O manganês (Mn) é parte fundamental do metabolismo lipídico,

proteico e de carboidrato, além de ser utilizado por várias enzimas (ANDREINI et al.,

26

2008). O cobalto (Co) é parte da vitamina B-12, que participa da manutenção de

hemácias e do sistema nervoso. O molibdênio (Mo) é responsável a síntese proteica,

o crescimento e a síntese de purina (COUGHLAN, 1983). O cromo (Cr) modula a

glicemia (LEWICKI et al., 2014). O Ferro (Fe) atua na eritropoiese, transporte de

oxigênio, regulação gênica, reações de transferência de elétrons, diferenciação celular

e é parte de enzimas que regulam o metabolismo (BEARD, 2001). O manganês (Mg)

atua como cofator para muitas enzimas, dentre elas o manganês-superóxido

desmutase, que possui ação antioxidante (MARTINEZ-FINLEY; CHAKRABORTY;

ASCHNER, 2013). Por fim, o selênio (Se) está envolvido no metabolismo dos

hormônios tiroidianos, ação antioxidante e função imune (BROWN; ARTHUR, 2001).

Alguns elementos classificados como metais pesados são tóxicos para os seres

vivos, podendo ocorrer casos de intoxicação aguda ou crônica, levando o indivíduo a

morte. Os processos de bioacumulação e biomagnificação são fundamentais para a

acumulação e propagação desses elementos tóxicos ao longo da cadeia alimentar,

até chegar ao ser humano. A bioacumulação refere-se à acumulação de elementos

tóxicos nos organismos em decorrência de sua obtenção a partir da dieta ou do

ambiente. Biomagnificação, por sua vez, está relacionada ao aumento da

concentração de elementos tóxicos ao longo da cadeia alimentar (ALI; KHAN, 2019).

Metais pesados nocivos aos seres vivos e com importância na clínica de bovinos são

descritos abaixo.

2.1.1.1 Mercúrio

A intoxicação por mercúrio (Hg) ocorre na dependência da via de contaminação

(ingestão, inalação ou contato), duração da exposição e da dose. Quando em alta

concentração no meio ambiente, a forma inorgânica é transformada na forma orgânica

(metil-mercúrio) a qual participa do processo de bioacumulação e biomagnificação ao

longo da cadeia alimentar (EFSA, 2012; BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013).

O mercúrio orgânico é a forma mais tóxica deste elemento, levando a casos de

intoxicação quando ingerido, já que é quase todo absorvido no sistema

gastrointestinal. É capaz de passar as barreiras hematoencefálica e placentária

(LANGFORD; FERNER, 1999) e geralmente acumula-se nos rins e no fígado,

27

podendo também se acumular no cérebro. As manifestações clínicas observadas

estão relacionadas ao acometimento do sistema nervoso central. Em casos de

intoxicação crônica pela forma orgânica, os animais podem apresentar ataxia,

incoordenação, paresia, convulsão e falência renal, com óbito como desfecho. A forma

inorgânica, por sua vez, tem baixa absorção no sistema gastrointestinal, se

acumulando nos rins (CONSTABLE et al., 2017). Ao exame físico, os animais com

intoxicação hiperaguda pela forma inorgânica vão apresentar gastroenterite e severa

diarreia, com o óbito ocorrendo em poucas horas após o início das manifestações. Em

casos agudos, os animais podem sobreviver por alguns dias e observa-se salivação,

taquicardia, respiração fétida, paralisia posterior e convulsão. Em sua forma crônica,

anorexia, paresia, alopecia, petéquias gengivais, diarreia, incoordenação e

convulsões podem ser observadas (IRVING; BUTLER, 1975; CONSTABLE et al.,

2017; GUPTA et al., 2018).

2.1.1.2 Arsênio

A intoxicação por arsênio (As) pode ocorrer devido a ingestão ou contato com

as formas orgânica ou inorgânica. O acúmulo deste elemento no fígado pode

comprometer a saúde (CONSTABLE et al., 2017). Ainda, a disponibilidade do arsênio

nos alimentos também dependerá da maneira como são preparados para o consumo

(EFSA, 2009). De maneira geral, existem efeitos no sistema gastrointestinal e

neurológico (geralmente em leitões e cordeiros). Os bovinos com síndrome

gastrointestinal podem apresentar casos hiperagudos, com os animais indo a óbito

pouco tempo após o contato. Nos casos agudos, os animais apresentam salivação

intensa, estase ruminal, diarreia fétida e, às vezes, hemorrágica, taquicardia,

desidratação e oligúria. Em casos crônicos, os animais apresentam fatiga, eritema de

mucosas, diminuição da produção leiteira e lesões de pele (CONSTABLE et al., 2017).

BERTIN et al., (2013) realizaram uma meta-análise de 156 casos de intoxicação

bovina por arsênio, e verificaram principalmente diarreia, ataxia, desidratação,

dificuldade respiratória e o óbito dos animais.

28

2.1.1.3 Chumbo

O contato com chumbo (Pb), e consequente intoxicação ocorre geralmente

devido ao comportamento curioso do animal, o qual tem contato com objetos que

contém este elemento, havendo lambedura e ingestão indiscriminada (SHARPE;

LIVESEY, 2006). Embora ocorra naturalmente no ambiente, o uso deste elemento em

atividades antrópicas como mineração, indústrias de baterias, etc., acarreta no

acúmulo em água, solo, ar e, consequentemente, nos alimentos (EFSA, 2010). No

estudo retrospectivo realizado por PUSCHNER; VARGA, (2012), a intoxicação por

chumbo apresentou-se como uma das dez principais origens dos casos de intoxicação

analisados pelos autores. Estudando especificamente casos de intoxicação por

chumbo, SHARPE; LIVESEY, (2006) observaram que esta condição em bezerros é

geralmente ocasionada pelo comportamento curioso, enquanto que nos adultos está

associada ao contato com fontes geoquímicas. Os mesmos autores ainda destacaram

a implicação deste metal pesado na cadeia de produção de alimentos, com potencial

risco a saúde humana, principalmente quando da ingestão contínua e crônica do

chumbo por meio do solo contaminado. Ainda, bovinos, felinos e caninos já foram

descritos como sentinelas para a determinação da exposição humana ao chumbo

(BISCHOFF; PRIEST; MOUNT-LONG, 2010). De maneira geral, a intoxicação por

este elemento leva a manifestações clínicas decorrentes de encefalopatia,

gastroenterite e degeneração de nervos periféricos. Entretanto, tudo depende da

espécie animal, dose e duração da exposição (CONSTABLE et al., 2017). Nos

bovinos, a intoxicação aguda ocorre geralmente nos animais mais jovens e tem curso

rápido (12-24 horas). Ocorre acometimento do sistema nervoso central, com os

animais apresentando convulsões, pupilas dilatadas, opistótono e tremores

musculares particularmente em cabeça e pescoço. Espuma na boca e cegueira são

frequentes. Hiperestesia ao toque e ao som e elevação das frequências cardíaca e

respiratória também são observadas. O óbito geralmente ocorre devido a parada

respiratória durante o quadro convulsivo. Nos adultos, a forma subaguda é a mais

frequente, e os animais geralmente vão a óbito após 4 dias. A função gastrointestinal

é geralmente comprometida e os bovinos intoxicados apresentam inicialmente atonia

ruminal e constipação, seguida de diarreia fétida. Cegueira, opacidade ocular,

tremores musculares e hiperestesia são comuns. Surtos de intoxicação por chumbo

29

já foram descritos no Brasil tanto em bovinos quanto em galinhas (BARBOSA et

al.,2014; TRAVERSO et al., 2004)

2.1.1.4 Cádmio

Embora presente no ambiente devido a atividades vulcânicas (WILLIAMS;

HARRISON, 1984), as atividades antropogênicas (esgotos industriais, fertilizantes e

mineração) também elevaram a concentração de cádmio (Cd) no ambiente tornando-

se, portanto, importante contaminante ambiental (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.;

NITAS, 2013). Em geral, o aumento na concentração de cádmio no solo implica em

maior captação pela vegetação, que servirá de alimento para vários seres vivos, como

os bovinos (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013). Este elemento se acumula

principalmente em rins e fígado e, sabendo que este último é de grande interesse na

alimentação humana, o cádmio é mais um elemento nocivo que pode chegar até o ser

humano por meio da indústria de alimentos (CONSTABLE et al., 2017). Embora não

apresente funções biológicas nos organismos, este elemento mimetiza íons divalentes

e compete com zinco e cobre e se liga a metalotioneína, enzima presente

principalmente em rins e fígado (daí a sua maior deposição nestes orgãos). Como não

consegue ser excretado com sucesso, mantem-se por longos períodos nas células

renais e hepáticas (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013; CONSTABLE et al.,

2017). Casos de intoxicação crônica são geralmente os mais comuns e os animais

apresentam inapetência, fraqueza, perda de peso, opacidade de pelos, pouca

queratinização e descamação da pele (POWELL et al., 1964; CONSTABLE et al.,

2017).

2.1.1.5 Cobre

Embora seja um elemento envolvido em processos biológicos, altas

concentrações de cobre (Cu) são nocivas aos organismos. Os animais podem

apresentar casos agudos ou crônicos, seja devido a exposição por via oral ou injetável

30

(CONSTABLE et al., 2017). A intoxicação é mais frequente em ruminantes,

principalmente ovinos. Ao ser ingerido, este elemento é depositado principalmente no

fígado, seguido por rins e cérebro (FAZZIO et al., 2012). Os animais podem apresentar

intoxicação do tipo primária ou secundária. No primeiro caso, animais acometidos pela

forma aguda geralmente vão a óbito em até três dias após a ingestão de altas

concentrações. Os animais podem apresentar gastroenterite, salivação, diarrreia,

desidratação, fezes de coloração azul-esverdeada e o óbito é precedido de choque

com diminuição da temperatura corporal e aumento da frequência cardíaca (REIS et

al., 2010). A intoxicação crônica, por sua vez, está relacionada a liberação do cobre

na corrente sanguínea após a necrose dos hepatócitos, como consequência da

deposição deste elemento por longos períodos. Os animais nesta fase apresentam

hemólise severa devido a modificação da composição da hemoglobina, com

consequente hemoglobinúria e mucosas amareladas e depressão. Em um surto de

intoxicação crônica por cobre no Canadá, bovinos leiteiros apresentaram anorexia,

fraqueza, pouco reflexo pupilar, decúbito, mucosas amareladas, sangue com

coloração chocolate e foram a óbito (BRADLEY, 1993). No tipo secundário, os animais

são intoxicados pela ingestão crônica de forrageiras como Trifolium subterraneum

(Intoxicação crônica por cobre devido a plantas) e Heliotropium europaem e Ecchium

plantagineum (Intoxicação hepática crônica) que, respectivamente, apresentam

pequenas quantidades do elemento ou favorecem sua concentração nos tecidos

(REIS et al., 2010; CONSTABLE et al., 2017). Em 2004, ovinos da raça Corriedale

foram tratados com solução de sulfato de cobre 5% após um surto de footrot. Devido

a impossibilidade de acesso a água por mais de 17 horas, os animais ingeriram a

solução de tratamento e ORTOLANI, E. L.; ANTONELLI, A. C.; SARKIS, (2004)

observaram sinais de intoxicação aguda por cobre, tais como anorexia, gemidos,

atonia ruminal, diarreia azul-esverdeada e membranas congestas. Baixo hematócrito

e elevação dos valores de AST e GGT, ureia e creatinina também foram observados.

Dos 27 animais acometidos, seis foram a óbito e, à necropsia, ulceras gastrointestinais

e hemorragia em mucosas foram observadas. Microscopicamente, havia lesões

hepáticas severas e lesões renais moderadas.

31

2.1.1.6 Alumínio

O alumínio (Al) é considerado um contaminante ambiental e não apresenta

qualquer função biológica conhecida, sendo tóxico para humanos e animais

(BECARIA; CAMPBELL; BONDY, 2002). Quando ingerido, esse elemento se

concentra principalmente nos ossos, e, quando na corrente sanguínea, consegue

transpassar a barreira hematoencefálica. Assim, aqueles que ingerem alta doses de

alumínio podem apresentar manifestações neurológicas, osteoartrite e anemia. Na

revisão sistemática realizada por IGBOKWE; IGWENAGU; IGBOKWE, (2019),

observou-se que os relatos disponíveis na literatura descrevem a presença de alta

concentração de alumínio associada a alterações imunológicas, genotoxicidade,

efeitos pró-inflamatórios, desnaturação de peptídeos, disfunção enzimática,

amiloidose, desregulação na homeostasia do ferro, apoptose e necrose, com

pneumonias intersticial ou alveolar, granulomas, miocardite, trombose, autismo,

pancreatite, câncer de mama, doença de Alzheimer, Doença de Crohn, infertilidade,

dentre outros.

2.1.1.7 Cromo

O Cromo (Cr) em sua forma hexavalente, apresenta-se como grande agente

oxidante, capaz de transpassar barreiras biológicas e a sua inalação é geralmente

responsável por casos de intoxicação. Já a forma trivalente é obtida pela ingestão ou

administração parenteral. Havendo a forma aguda, o indivíduo intoxicado por cromo

apresentará gastroenterite, lesões renais e hepáticas (THOMPSON, 2018).

32

2.1.1.8 Ferro

A intoxicação por ferro (Fe) é incomum em grandes animais e pode ocorrer

devido a ingestão de alimentos contaminados (com danos gastrointestinais) ou por via

injetável (havendo insuficiência e falência hepática) (CONSTABLE et al., 2017).

2.1.1.9 Cobalto

Como dito anteriormente, o cobalto (Co) é parte essencial da cianocobalamina

(Vitamina B12). Os ruminantes são capazes de sintetizar esta vitamina, havendo a

devida ingestão de cobalto. A intoxicação por este elemento geralmente ocorre devido

a preparo errôneo de ração ou ingestão de água contaminada. Os animais com

intoxicação por cobalto apresentam anorexia, apatia, perda de peso e incoordenação

(CONSTABLE et al., 2017). Poliúria, excessiva defecação e salivação também podem

ser observados (NRC, 2001).

2.2 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL

Além dos elementos considerados essencialmente tóxicos, àqueles com

participação biológica podem causar toxicidade desde que em concentração acima do

necessário. A presença de atividades antropogênicas levaram a contaminação

ambiental inclusive para a região da Antarctica, havendo detecção de poluentes no ar,

neve e organismos marinhos por conta de derramamento de óleo, incineração de lixo,

esgoto e queima de combustível pelo turismo e pesquisa na região (BARGAGLI,

2008). Embora presentes no meio ambiente e em concentrações que permitem o

equilíbrio ecológico, atividades antropogênicas como mineração, indústrias, esgotos

residenciais e hospitalares e atividades agrícolas são as grandes responsáveis pelo

aumento da concentração destes elementos no meio ambiente (solo, água e ar).

33

A atividade agrícola é umas das grandes responsáveis pelo descarte de

produtos tóxicos no meio ambiente, culminando na contaminação de fauna e flora.

Dados da Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO),

mostraram que o Brasil foi o país que mais consumiu agrotóxicos em 2013, estando

em sétimo lugar no ranking de gastos totais por área cultivada. O Brasil, ainda, ocupa

o 13º lugar no ranking de países consumidores de agrotóxicos, levando em

consideração os gastos com pesticidas e o tamanho da produção agrícola (GRIGORI,

2019). Em revisão sobre o potencial de herbicidas utilizados em culturas de milho, soja

e cana-de-açúcar, VIEIRA et al., (2020), verificaram que o glifosato é o herbicida mais

utilizado no Brasil e que, todos os princípios ativos utilizados chegam ao solo e aos

cursos d’água por meio de processos de lixiviação e escoamento superficial, podendo

interferir negativamente na saúde humana e animal. Relatos da presença de outros

princípios ativos no meio ambiente estão disponíveis na literatura nacional (ARMAS

et al., 2007; DORES et al., 2008; BRITTO et al., 2012).

O esgoto doméstico contém resíduos de excreções, produtos sanitizantes,

farmacêuticos, cosméticos, dentre outras substâncias. Todos apresentam elementos

contaminantes como metais pesados, antimicrobianos (medicamentos e

desinfetantes), hormônios, anti-inflamatórios, etc. (DAUGHTON; TERNES, 1999).

Essas substâncias são geralmente geradas a partir dos resíduos da cozinha,

lavanderia, banho e lavagem de roupas (MORIYAMA et al., 1988) e descartadas nos

cursos d’água, podendo contaminar solo, vegetais e sendo diretamente consumidos

por animais e humanos. Na revisão produzida por LIU; WONG, (2013), destaca-se

que, embora o risco de intoxicação aguda por produtos farmacêuticos e de cuidados

pessoais contaminando o ambiente seja baixa, casos de intoxicação crônica não

podem ser descartados e, pontuam ainda, a crescente detecção de resistência

bacteriana na China, tendo a contaminação ambiental como possível causa. A

presença de subdoses de antimicrobianos pode ocasionar a persistência e a

emergência de genes de resistência a antibióticos, fato este de grande interesse na

saúde pública humana e veterinária (WHO, 2018).

A atividade industrial também é responsável pela contaminação ambiental

pelos resíduos gerados em suas atividades. A presença de inúmeras substâncias

nocivas ao meio ambiente como metais, colocam em risco a manutenção do equilíbrio

ecológico. Na estimativa realizada em 2002, somente 22% do resíduo industrial

gerado no Brasil recebia o tratamento adequado, de forma que o restante era

34

acondicionado em aterros sanitários (CAMPANILI, 2002), representando risco ao meio

ambiente e aos seres humanos. Em 2001, adultos e crianças da cidade de Paulínia,

Estado de São Paulo, apresentaram, respectivamente, intoxicação crônica e altos

níveis de cádmio, alumínio, zinco, cobre, arsênio e manganês, após serem expostos

a resíduos de uma importante indústria química (GUAIME, 2001). Em 2002, o Brasil

se deparou com a contaminação de 314 crianças por chumbo devido a liberação deste

elemento pelas chaminés de uma fábrica de baterias automotivas (TOMITA; PADULA,

2005). Animais e produtos agrícolas e de origem animal também apresentaram-se

contaminados, gerando prejuízos à vida e a economia da região de Bauru, Estado de

São Paulo (ACEITUNO, 2002a, 2002b, 2002c). Estes fatos salientam a necessidade

de fiscalizações mais rigorosas quanto a produção e descarte de resíduos industriais

no ambiente.

A mineração também destaca-se como potencial fonte de contaminação

ambiental. Os resíduos de mineração geralmente apresentam grande quantidade de

componentes que em parte são re-extraídos e utilizados na indústria (AZAROVА;

USMANOVA; MEZHIBOR, 2018). Entretanto, os resíduos restantes ainda apresentam

elementos em altas concentrações, sendo considerados fontes de contaminação

ambiental. De maneira geral, podem apresentar metais nativos como ouro, além dos

elementos associados a óxidos, carbonatos e sulfatos que contém elementos

potencialmente perigosos, como arsênio, cobre, cádmio e chumbo (BINI, 2014; BINI;

MALECI; WAHSHA, 2017). Estima-se que a geração de resíduos é proporcional a

extração dos elementos (BINI; MALECI; WAHSHA, 2017). A depender da natureza do

mineral extraído, o resíduo pode ser recuperado em pilhas, montes ou barragens, mas

quando a construção e a manutenção destas não é realizada de maneira correta, todo

resíduo ali depositado pode ser liberado no meio ambiente, havendo danos para flora,

fauna e na vida das pessoas que habitam a região.

Problemas técnicos e estruturais de barragens brasileiras foram destaque na

mídia nacional e internacional, pois geraram consequências inimagináveis tanto pela

contaminação ambiental quanto pela morte de centenas de pessoas no Estado de

Minas Gerais. Em 2006, cerca de 400 milhões de litros de rejeito de lavagem de

bauxita foram vazados da barragem localizada no município mineiro de Miraí (à 335

km da capital Belo Horizonte). Em 2007, aproximadamente dois milhões de metros

cúbicos de lama armazenadas na mesma barragem foram novamente despejados no

meio ambiente, prejudicando a natureza e a estrutura do município, que ficou sem

35

abastecimento de água devido a contaminação do rio Muriaé (ACAYABA, C.;

BAPTISTA, R.; NOGUEIRA, 2007).

O município mineiro de Mariana foi severamente acometido pelo vazamento

de mais de 43 milhões de metros cúbicos de rejeito de minério de ferro devido ao

rompimento da barragem do Fundão (CARMO et al., 2017), em novembro de 2015. A

lama percorreu quase 670 km de cursos d’agua, ocasionando a poluição da bacia do

Rio Doce (chegando até o oceano Atlântico) e a destruição da vegetação nativa,

deixando cerca de 19 moradores mortos e centenas de desabrigados (G1, 2019). A

lama invadiu casas, comércios, escolas (Figura 1), além de destruírem propriedades

leiteiras e plantações localizadas na bacia do Rio Doce. Dois anos após o rompimento,

CARVALHO et al., (2017) analisaram a água da região e verificaram altas

concentrações de elementos como chumbo, arsênio, níquel, cobre, alumínio e

manganês, podendo estarem relacionados ao ocorrido em 2015. Assim, observa-se

que as consequências se mantêm por longos períodos, podendo impactar a saúde

humana e animal devido a exposição a longo prazo.

Figura 1 - Destruição de construções e evidências do acidente em árvores à beira do Rio do Carmo, provocadas pela lama despejada após o rompimento da barragem do Fundão em Mariana, Minas

Gerais, Brasil, 2020.

Fonte: Gaeta, N.C.; 2021

36

Embora o acontecido em Mariana seja considerado o maior desastre

ambiental do país, o ano de 2019 foi marcado pela morte de 259 pessoas, além de 11

desaparecidos após o rompimento de outra barragem em Brumadinho, Minas Gerais.

Catorze milhões de toneladas de lama e rejeitos de minério de ferro foram despejados

e percorreram o rio Paraopeba, contaminando solo, água, e destruindo tudo à sua

frente (RODRIGUES, 2019).

Esses acontecimentos evidenciam a situação frágil e de negligência quanto a

gestão dos resíduos de minério no Brasil. A contaminação ambiental, animal e

humana decorrente desses fatos pode levar a graves consequências a saúde devido

a presença de elementos tóxicos como os metais pesados.

2.2.1 Consequências da exposição prolongada a metais pesados

2.2.1.2 Modificação da microbiota animal e humana

A ingestão crônica de metais pesados pode levar a complicações a saúde

devido tanto ao seu efeito direto, quanto ao seu efeito acumulativo (JAISHANKAR et

al., 2014). Uma vez ingerido, o intestino absorve os elementos, que se depositam

principalmente no fígado. Entretanto, parte do ingerido permanece no lúmen intestinal,

podendo interferir no microambiente e no seu funcionamento (BRETON et al., 2013).

No estudo realizado por BRETON et al., (2013), a administração de chumbo

e cádmio modificou a microbiota intestinal de ratos. Por meio de sequenciamento do

gene 16S rRNA, observou-se a diminuição da abundância de Lachnospiraceaee e

aumento de Lactobacillaceae e Erysipelotrichaceacae. A baixa abundância de

Lachnospiraceae está associada a colite e inflamação intestinal (LEPAGE et al.,

2011). Ainda, ratos foram expostos a arsênio e cadmio por meio da água de bebida,

e os resultados indicaram que o cádmio foi responsável por modificação significativa

na microbiota intestinal destes animais, com diversidade microbiana mais baixa,

diferentemente do arsênio cuja diminuição da diversidade não foi significante. Ainda,

para ambos os tratamentos, houve diminuição de gêneros bacterianos, principalmente

daqueles produtores de butirato (LI et al., 2019). GUO et al., (2014) estudaram ratos

37

que receberam arsênio (3 mg/L em água), ferro (5 mg/L em água) e uma combinação

dos dois elementos por 90 dias e observaram que a abundância relativa de Firmicutes,

Tenericutes e Proteobacteria apresentaram-se mais elevadas nos três grupo,

enquanto que houve diminuição de Bacteroidetes e TM7. Acidobacteria e

Cyanobacteria apresentaram-se mais elevadas nos animais expostos somente ao

arsênio. Já na presença de ferro (sozinho ou em combinação), observou-se o aumento

na abundância de Verrucomicrobia. Em sua revisão, ROSENFELD, (2017) destaca a

variação dos resultados entre os estudos que avaliam a modificação da microbiota de

animais frente a ingestão contínua de metais pesados. A autora afirma que essa

diferença observada é multifatorial, havendo a interferência de diferentes

espécies/genótipos de ratos utilizados, diferentes agentes químicos, doses e períodos

e a utilização da água como única maneira de exposição aos agentes, mesmo a

comunidade científica sabendo da possibilidade de contato por meio de ingestão e até

via transdérmica.

No ambiente ruminal FORSBERG, (1978b) demonstrou que Bacteroides

succinogenses, Ruminococcus albus, Bacteroides amylophilus e Eubacterium

ruminantium foram sensíveis a elementos como cadmio, mercúrio, cobre, arsênio e

cromo. FORSBERG, (1978a), avaliou o efeito do arsênio no crescimento de algumas

bactérias residentes no rúmen e destacou o efeito inibitório no crescimento de

Selenomonas ruminantium e aumento no crescimento de Streptococcus bovis como

resposta a presença de arsenato de sódio. É sabido que os microrganismos residentes

no rúmen são responsáveis pela fermentação e produção de metabólitos importantes

que mantem a saúde do animal. Modificações em alguns componentes da microbiota

podem provocar disbioses e consequências negativas a saúde e produção dos

ruminantes. O resultado descrito por FORSBERG, (1978a) é particularmente

importante pois a presença de arsênio no rúmen (em alta concentração), pode

ocasionar quadros de acidose aguda, enfermidade relacionada ao predomínio de

bactérias produtoras de ácido láctico como S. bovis em detrimento a espécies

utilizadoras como S. ruminantium (KIM et al., 2020).

Em seres humanos, SHAO; ZHU, (2020) avaliaram a diversidade da

microbiota intestinal de homens e mulheres residentes em locais próximos a áreas de

mineração na China, estando expostos cronicamente a arsênio, cádmio, cobre,

chumbo e zinco. Os resultados indicaram alta abundância de Lachnospiraceae,

Eubacterium eligens, Ruminococcaceae UGG-

38

014, Erysipelotrichaceae UCG -003, Tyzzerella 3, Bacteroides, Slackia e Roseburia.

Ainda, a microbiota masculina apresentou-se mais uniforme e rica e estas

modificações estariam relacionadas a maior exposição desse gênero devido aos

hábitos diários como o trabalho direto na mineração. Crianças expostas a alta e baixa

concentração de arsênio foram estudadas em Bangladesh, e o sequenciamento do

gene 16S rRNA revelou elevada abundância de Proteobacteria nas crianças expostas

ao arsênio em elevada concentração (DONG et al., 2017). Este grupo ainda

apresentou cepas de Escherichia coli contendo operons de resistência ao arsênio se

expressando mais que no grupo controle.

2.2.1.3 Modificação do microbiota ambiental

A microbiota ambiental também sofre as consequências da exposição

prolongada a metais pesados, havendo a prevalência de bactérias resistentes a esses

elementos. Isso vem sendo comprovado por várias pesquisas como a realizada por

PEREIRA; VICENTINI; OTTOBONI, (2015), na qual estudaram amostras de solo e

drenagem de uma mina de cobre brasileira e observaram a dominância de bactérias

do gênero Meiothermus, geralmente presentes em ambientes termais (SIKORSKI et

al., 2010), nas amostras de drenagem e em ambos ambientes, observaram bactérias

heterotróficas, incluindo aquelas resistentes a metais pesados. CHEN et al., (2018b)

verificaram que a contaminação prolongada por mercúrio influenciou o microbioma

presente nos sedimentos do Rio Amarelo, localizado na China. Os filos

Proteobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes, apresentaram genes de resistência a este

elemento e foram os filos funcionais centrais nos sedimentos contaminados. A análise

dos componentes bacterianos e fúngicos de solos contaminados por mercúrio

indicaram que a exposição prolongada levou a modificação da estrutura da

comunidade desses dois grupos, quando comparado a solos não contaminados. O

estudo do efeito a curto prazo não evidenciou nenhuma modificação das comunidades.

Os autores observaram que a abundância do gene merA, importante redutase parte

do sistema que confere resistência ao mercúrio, era maior quanto maior a

concentração desse elemento no solo, independentemente do tempo de exposição.

39

É importante salientar que, embora o estudo da microbiota do solo não seja

parte do escopo deste trabalho, o conhecimento sobre sua modificação taxonômica e

quanto ao resistoma em decorrência da exposição aos metais pesados é de extrema

importância. Durante a pastagem, os ruminantes geralmente ingerem o solo com a

gramínea, havendo, portanto, a ingestão desses microrganismos resistentes e de

elementos nocivos à saúde.

2.2.2 Resistência a antimicrobianos

A ser considerada uma das principais causas de morte em seres humano em

2050 (WHO, 2015), a resistência a antimicrobianos é um dos tópicos mais estudados

no meio acadêmico, tanto pela medicina humana e veterinária quanto às ciências da

vida, com estudo de ambientes e organismos bióticos e abióticos. Hoje, é parte da

chamada Saúde Única (One Health), já que muitas bactérias antes consideradas

comensais estão sendo apontadas como agentes emergentes de enfermidades em

seres humanos (principalmente infecções nosocomiais). Ainda, a disseminação dos

genes de resistência pode ocorrer de bactérias com baixa virulência, para aquelas

consideradas altamente virulentas, causando dificuldades para o tratamento de

animais e seres humanos.

A resistência a antimicrobianos é um fato que ocorre naturalmente nos

microrganismos. No ambiente, muitos deles produzem substâncias antimicrobianas e,

para sobreviverem, necessitam de mecanismos que impeçam a ação dessas

substâncias. Estes convivem com outros microrganismos na comunidade, havendo,

portanto, troca de material genético (MUNITA; ARIAS, 2016). Entretanto, ações

antropomórficas são responsáveis pela maior pressão de seleção e,

consequentemente, rápido surgimento e disseminação de genes de resistência. O

esgoto (hospitalar, industrial, doméstico, e aquele produzido pela atividade agrícola) é

geralmente despejado em rios, lagos ou oceanos, cuja água pode ser utilizada para

irrigação, na produção animal ou para a pesca. Hortifrútis, produtos de origem animal

e até mesmo a água são vetores de disseminação desses genes ao ser humano e aos

animais (GWENZI; MUSIYIWA; MANGORI, 2020).

40

2.2.2.2 Origem e mecanismos

Os microrganismos podem apresentar inúmeros mecanismos de resistência a

antimicrobianos, cuja origem pode ser intrínseca ou adquirida.

Resistência de origem intrínseca é aquela em que é compartilhada com os

indivíduos da mesma espécie, independe de prévia exposição ao agente e não está

relacionada a transferência genética horizontal (MARTINEZ, 2014). Dentro deste

grupo, destacam-se dois mecanismos: i) limitação da captação da droga e ii) efluxo

ativo da droga. O primeiro mecanismo ocorre devido a permeabilidade da membrana

externa existente nas bactérias Gram-negativas, fina membrana que circunda uma

fina camada de peptideoglicanos. Essa membrana externa apresenta moléculas

chamadas de lipídio A, que estão covalentemente ligadas a polissacarídeos. Cada

molécula de lipídio A liga-se a várias cadeias de aminoácidos, de modo a contribuir

com o aumento do limite de permeabilidade (COX; WRIGHT, 2013). Isso permite que

várias bactérias Gram-negativas sejam intrinsicamente resistentes a inúmeros

princípios ativos, como ocorre com Pseudomonas aeruginosa (ANGUS et al., 1982)

(embora esta característica por si só não explique todo o fenótipo observado nesta

espécie). P. aeruginosa como outras, apresentam outros mecanismos intrínsecos

denominados Bombas de Efluxo Multidroga Resistentes (do inglês Multidrug

Resistance Efflux Pumps) (mecanismo de efluxo ativo da droga), cujos genes

codificadores estão presentes nos cromossomos (COX; WRIGHT, 2013). Essas

bombas de efluxo são classificadas em cinco tipos: ATP binding cassete (ABC), major

facilitator (MF), multidrug and toxic-compound efflux (MATE), small multidrug

resistance (SMR) e resistance-nodulation division (RND), sendo este o principal

relacionado a resistência intrínseca de Gram-negativas (COLCLOUGH et al., 2020).

Vale salientar que os mecanismos que conferem resistência intrínseca a

antimicrobianos são encontrados tanto em bactérias patogênicas quanto em

comensais e ambientais.

Microrganismos que inicialmente eram sensíveis a um determinado

antimicrobiano, mas que devido a i) mutação de genes cromossomais ou a ii) obtenção

de determinantes genéticos externos, apresentam mecanismos de resistência de

origem adquirida (MUNITA; ARIAS, 2016; C REYGAERT, 2018). A mutação de genes

41

cromossomais ocorrem geralmente pela presença de fatores estressantes como falta

de nutrientes, radiação ultravioleta, dentre outros, e está frequentemente relacionada

a genes específicos associados a dois outros mecanismos que conferem resistência,

denominados “modificação do alvo” e “inativação da droga”. Associados às mutações,

os genes externos são obtidos pelos microrganismos por meio da transferência

horizontal, seja por transformação, transposição e/ou conjugação, tendo os

plasmídeos sua principal rota de aquisição de material genético externo (VAN HOEK

et al., 2011; MUNITA; ARIAS, 2016; REYGAERT, 2018). Diferentemente da

intrínseca, a resistência adquirida ocorre devido ao uso de antimicrobianos, seja em

baixa dose ou dose sub-letal e até mesmo devido a exposição prolongada,

promovendo elevação da taxa de mutações pela seleção de indivíduos cada vez mais

resistentes (REYGAERT, 2018). O mecanismo de modificação do alvo ocorre, por

exemplo, em indivíduos Gram-positivos que apresentam proteínas ligantes de

penicilina (do inglês penicilin-binding proteins). A diminuição ou perda da habilidade

da droga em se ligar a essas proteínas está relacionada ao aumento no número de

proteínas presentes e na modificação de sua estrutura, como ocorre nos S. aureus

devido a presença do gene mecA (REYGAERT, 2009). Em Gram-negativas,

modificações na DNA gyrase (gene gyrA) e em precursores de peptideoglicanos (gene

van), são exemplos desse mecanismo de resistência (COX; WRIGHT, 2013).

Sendo provavelmente o mecanismo mais estudado, a modificação da droga

tem grande importância em bactérias comensais e patogênicas devido a sua alta

prevalência. A degradação da droga geralmente ocorre devido a atuação de enzimas,

como as beta-lactamases. A produção de beta-lactamases é o principal mecanismo

de resistência utilizada pelos indivíduos Gram-negativos contra a ação de

medicamentos beta-lactâmicos (C REYGAERT, 2018). Essas enzimas são

geralmente classificadas quanto a sua estrutura (AMBLER, 1980) e função (BUSH;

JACOBY, 2010). Em relação a estrutura, as beta-lactamases são classificadas em 4

classes (A, B, C e D), estando relacionadas a identidade da sequência de aminoácidos

(AMBLER, 1980). Quanto a função bioquímica, as beta-lactamases são classificadas

de acordo com a especificidade do substrato (cefalosporinases, serino-beta-

lactamases e metallo-beta-lactamases) (BUSH; JACOBY, 2010). Essas enzimas

podem ser tanto encontradas nos cromossomos quanto serem adquiridas via

transferência horizontal por meio de plasmídeos, ocorrendo principalmente nas

Enterobacteriaceae. A enzima AmpC (codificada pelo gene ampC), foi a primeira beta-

42

lactamase a ser descrita; é pertencente à classe C da classificação estrutural

(AMBLER, 1980) e cefalosporinase do grupo I, de acordo com a classificação

funcional (BUSH; JACOBY, 2010). O gene é codificado no cromossomo e a enzima

confere resistência a penicilinases, cefalosporinas de primeira geração e aztreonam

(MUNITA; ARIAS, 2016). Enzimas que conferem resistência a penicilinas, e

cefalosporinas de primeiras e última gerações são designadas “beta-lactamases de

espectro estendido” (do inglês extended-spectrum beta-lactamase – ESBL), que

podem pertencer às famílias TEM, SHV, CTX-M e OXA, todas codificadas pelo gene

bla. A família CTX-M é a mais numerosa, sendo amplamente detectada em humanos

(WOERTHER et al., 2013; SCHMITHAUSEN et al., 2019; WANG et al., 2019), animais

(SHIRAKI et al., 2004; MA et al., 2012; CUNHA et al., 2017; PALMEIRA et al., 2018;

CARVALHO et al., 2020) e no ambiente (KIM; KANG; LEE, 2008; MA et al., 2012;

ZURFLUH et al., 2013; AMOS et al., 2014). Os microrganismos produtores de ESBL

geralmente são sensíveis a inibidores de beta-lactamases como amoxicilina com ácido

clavulânico, piperaciclina com tazobactam e ampicilina com sulbactam (SCHULTSZ;

GEERLINGS, 2012). Por fim, as carbapenemases são classificadas em dois grupos:

Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs) e Enterobacteriaceae resistentes a

carbapenêmicos (ERC), cujas enzimas mais detectadas são IMP-1 (do inglês

imipenem resistance) e VIM-1 (do inglês Verona integron encoded metallo-beta-

lactamase). Uma nova metallo-beta-lactamase identificada foi a NDM-1 (do inglês

New-Delhi metallo-beta-lactamase). Microrganismos produtores de carbapenemases

são de grande importância clínica por serem resistentes a todos os medicamentos

beta-lactâmicos, e suas infecções são de difícil tratamento (BAJAJ; SINGH; VIRDI,

2016; CODJOE; DONKOR, 2017).

2.2.2.3 Resistência a metais pesados e a co-resistência

Além de poderem apresentar resistência a antibióticos, as bactérias podem

apresentar tolerância a inúmeros metais pesados. Bactérias isoladas de esgoto

hospitalar e de uma faculdade apresentaram tolerância a cromo (principalmente

Gram-positivas) e prata e mercúrio (Gram-negativas), sendo este último elemento com

a porcentagem de tolerância mais significante (LIMA E SILVA et al., 2012)

43

principalmente naqueles microrganismos recuperados de esgoto hospitalar. JARDINE

et al. (2019) estudaram bactérias isoladas de água e sedimento de águas termais na

África do Sul e detectaram indivíduos tolerantes ao menos a dois dos seguintes

elementos: alumínio, cromo, cobre, ferro, mercúrio, manganês, níquel e chumbo.

Microrganismos Gram-negativos de importância médica (E. coli, A. baumannii e P.

putida) obtidos de esgoto na Índia foram tolerantes a mercúrio, cádmio, cromo e cobre

(MANDAL; DAS; MANDAL, 2020).

Somado aos inconvenientes diretos relacionados à saúde humana e animal,

os metais pesados também possuem importante papel na co-seleção e disseminação

da resistência a antimicrobianos, estando associados a dois importantes mecanismos.

A co-resistência, é o mecanismo na qual dois ou mais genes de resistência se

localizam no mesmo elemento genético móvel (plasmídeo, integron, transposon)

(CHAPMAN, 2003; BAKER-AUSTIN et al., 2006) e, quando há transferência de um

gene, ocorre a transferência do outro gene. A resistência cruzada, no entanto, ocorre

quando dois ou mais antimicrobianos possuem o mesmo alvo de ação, compartilham

a mesma via de acesso ao seu alvo ou induzem o mecanismo de apoptose pela

mesma via (CHAPMAN, 2003; BAKER-AUSTIN et al., 2006) (Figura 2).

Figura 2 – Exemplos de mecanismos moleculares relacionados a co-seleção de metais e antibióticos

Fonte: Baker-Austin et al., 2006

44

Alguns mecanismos de resistência aos metais são amplamente estudados e

seus componentes conhecidos, como é o caso da resistência ao mercúrio, arsênio,

prata e cobre. A resistência ao mercúrio é conferida pelo trabalho de uma redutase e

um sistema de proteínas que transportam o íon para fora da célula. O operon de

resistência ao mercúrio é formado pelos genes merA (codificadora da enzima mercúrio

redutase, responsável por reduzir Hg2+ a Hg0), merB (codificadora da enzima liase

organomercurial – presença facultativa no operon, conferindo resistência ao mercúrio

orgânico), merP (codifica uma proteína periplasmática), merT, merC, merE, merF e

merG (codificam proteínas de membrana interna com a possibilidade da presença de

um ou mais genes – transportando Hg2+ para o citoplasma, onde será reduzido pela

redutase), merR e merD (proteínas regulatórias – possibilidade da presença de

somente um dos genes) (HOBMAN; CROSSMAN, 2015). A evidência indireta de co-

resistência entre mercúrio e antibióticos foi descrita por SUMMERS et al., (1993), os

quais demonstraram a transferência de resistência de mercúrio e antibióticos por

plasmídeo conjugativo. A partir disso, outros estudos indicaram a possibilidade de co-

resistência, como no conduzido por RASMUSSEN, L.D.; SORENSEN, (1998), que

descreveram uma evidência indireta de co-resistência a mercúrio e tetraciclina devido

a presença dos genes de resistência em plasmídeos conjugativos. Recentemente, o

transposon de resistência ao mercúrio Tn21-like foi descrito em várias bactérias Gram-

negativas (HOBMAN; CROSSMAN, 2015) e é considerado um dos melhores

exemplos de ligação genética entre metais e genes de resistência a antibióticos e

compostos de quaternário de amônio (PAL et al., 2015).

O mecanismo de resistência ao arsênio é outro sistema bem estabelecido,

sendo conferido pelo ars operon. O operon funcional mais simples é formado pelos

genes arsR (codificador de proteína repressora transcricional responsiva ao arsenito),

arsB (codificador de antiporter de arsenito) e arsC (codificador de arsenato redutase).

Alguns microrganismos apresentam genes adicionais, como arsD (codificador de uma

metalochaperona relacionada ao efluxo de arsenito associada a arsAB) e arsA

(codificador de ATPase, associada a proteína ArsB) (HOBMAN; CROSSMAN, 2015).

Ainda, é possível a presença do gene arsR, codificador de uma proteína

metaloregulatória (BEN FEKIH et al., 2018). Além destes genes presentes em

plasmídeos, um componente cromossômico já foi identificado em Alcaligenes faecalis

e Thiobacillus ferrooxidans (BUTCHER; DEANE; RAWLINGS, 2000; BEN FEKIH et

al., 2018).

45

A resistência a prata é geralmente conferida pelo sil operon, formado por

genes codificadores de proteínas regulatórias (silR e silS), ATPase (silP), sistema de

efluxo (silCBA), chaperona periplasmática (silF), proteína periplasmática ligante de

prata (silE). Resistência endógena também foi observada em bactérias Gram-

negativas, como E. coli, a partir da derepressão do sistema cromossomal Cus e perda

de porinas na membrana externa (LOK et al., 2008). Bactérias multidroga resistentes

e com diferentes sil genes foram isoladas de queimaduras e feridas de humanos e a

conjugação de plasmídeos permitiu a transferência da resistência a prata para as

bactérias transformantes (FINLEY et al., 2015; HOSNY et al., 2019). SÜTTERLIN et

al., (2017) detectaram alta frequência de genes de resistência a prata em isolados de

Enterobacter sp. e Klebsiella sp. e Escherichia coli.

Por fim, na resistência ao cobre, existem dois sistemas codificados por genes

presentes o cromossomo: cue e cus, os quais foram inicialmente identificados em E.

coli (BONDARCZUK; PIOTROWSKA-SEGET, 2013; HOBMAN, J.L.; CROSSMAN,

2015). O primeiro sistema tem sua expressão induzida por baixa concentração de

cobre e é composto pelo gene cueR (codificador de uma proteína reguladora), copA

(codificador de ATPase de efluxo de cobre) e cueO (codificador de uma oxidase multi-

cobre) (OUTTEN et al., 2001; HOBMAN, J.L.; CROSSMAN, 2015). Já o sistema cus,

cuja expressão é induzida por alta concentração de cobre, é formado por duas

proteínas regulatórias (CusRS – gene cusRS), uma bomba de efluxo da família

Resistance-Nodulation-cell division (CusCBA – gene cusCBA) e uma

metalochaperona periplasmática (CusF – gene cusF) (HOBMAN, J.L.; CROSSMAN,

2015). Outro mecanismo possível é o sistema pco, inicialmente detectado em E. coli

isolada a partir de amostras de efluentes suínos, cujos animais eram suplementados

com cobre (TETAZ; LUKE, 1983; BROWN et al., 1995). Este sistema é composto por

duas proteínas regulatórias (PcoRS – gene pcoRS), proteínas periplasmáticas (PcoA

– uma oxidase, PcoC – uma chaperona e PcoE – genes pcoA, pcoC e pcoE), uma

proteína de membrana externa (PcoB – gene pcoB) e interna (PcoD – gene pcoD).

RENSING; GRASS, (2003) afirmaram que, a presença de PcoC e PcoD é necessária

para a resistência ao cobre ser completa

46

2.3 DETECÇÃO DOS METAIS PESADOS

A análise de metais pesados é usualmente realizada por meio das técnicas

destrutivas de espectroscopia de massa por plasma indutivamente acoplado (do inglês

inductively coupled plasma – mass spectrometer -ICP-MS) ou espectrofotometria de

emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (inductively coupled plasma –

optical emission spectrophotometer – ICP-OES). As análises destrutivas geralmente

são mais acuradas e precisas, entretanto, necessita de processos de preparação das

amostras que podem introduzir contaminação e atrapalhar as análises (CHOI et al.,

2019).

A fluorescência de raio-X é uma ferramenta do tipo não destrutiva, cuja

introdução de contaminação não é um problema, já que geralmente não necessita de

prévia preparação de amostras, mas precisa de uma matriz de referência que pode

introduzir certa limitação quanto a acurácia das análises (CHOI et al., 2019). Esta

técnica é rápida e de análise quantitativa e qualitativa multi-elementar. Aqui, os átomos

presentes nas amostras são excitados pelo feixe de raio-X com alta energia, havendo

emissão de fótons cuja energia é determinada pelo número atômico do elemento

(STRELLI, C.; WOBRAUSCHEK, P.; KREGSAMER, 1999). As técnicas de

fluorescência de raio-X existentes atualmente são: Fluorescência de raio-X dispersivo

de comprimento de onda (do inglês Wavelengh dispersive x ray fluorescence -

WDXRF), Espectrometria de fluorescência de raio-X por dispersão de energia (do

inglês Energy Dispersive X-ray Fluorescence - EDXRF), Espectrometria

de fluorescência de raio-X com geometria cartesiana ( do inglês Cartesian Geometry

Energy Dispersive X-ray Fluorescence Spectrometer -NEX CG), Espectrometria de

fluorescência de raio-X por reflexão total (do inglês Total Reflection X-ray

Fluorescence Spectrometry - TXRF)

Espectrometria de fluorescência de raio-X com fonte de luz sincrotron (do inglês

Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence - SRXRF) e Espectrometria

de fluorescência de raio-X por indução de partículas (do inglês Particle-Induced X-ray

Emission - PIXE). Comercialmente, EDXRF, NEX CG e WDXRF são as técnicas mais

utilizadas. A WDXRF possui equipamento de bancada, facilitando sua utilização em

pequenos espaços. Ao iniciar a análise, o equipamento emite feixos de raio-X na

amostra, com produção de

47

fluorescência padrão para cada elemento químico. Cada fluorescência emitida é

difratada por um cristal analisador e captada por um detector (SCAPIN, 2003).

O WDXRF vem sendo utilizado na área médica para análise de elementos

traço presentes em sangue humano de pacientes com câncer (SINGH et al., 2018),

diabetes mellitus tipo 2 (DURAK et al., 2010) e em placenta (ÖZDEMIR et al., 2009).

Em animais, já foi utilizado para avaliar a composição de besouros d’agua (ERMAN,

2011), moluscos bivalves (COSTA et al., 2019), couro ovino e bovino (NEIVA et al.,

2018) e dentina bovina, suína e ovina (TERUEL et al., 2015). CARVALHO, (2019) foi

o primeiro a implementou uma metodologia para avaliação de elementos tóxicos em

soro de aves e ao nosso conhecimento, não existem trabalhos até o momento que

tenham utilizado esta técnica em soro de ruminantes.

2.4 SHOTGUN SEQUENCING

Técnicas cultivo-dependentes são frequentemente utilizadas como ferramentas

diagnósticas, mas são limitadas já que a maioria dos microrganismos são de difícil

cultivo e isolamento em laboratório (SHARPTON, 2014). O sequenciamento de nova

geração permitiu o estudo da microbiota presente numa amostra, incluindo espécies

de difícil cultivo. Diferentemente do sequenciamento do gene 16S rRNA (que fornece

apenas informações taxonômicas), o metagenoma (shotgun sequencing) é uma

ferramenta em cujo protocolo o DNA é cortado em pequenos fragmentos que,

sequenciados independentemente, permit a avaliação de comunidades bacterianas,

predição de genes, diversidade proteica, perfil funcional e o perfil de genes de

resistência a antimicrobianos (SHARPTON, 2014; QUINCE et al., 2017).

Esta ferramenta vem sendo amplamente utilizada na área veterinária para

estudo de dermatite digital em bovinos (ZINICOLA et al., 2015), metrite bovina

(BICALHO et al., 2017), predição de eficiência alimentar e consumo em bovinos

(DELGADO et al., 2019), mastite bovina (BHATT et al., 2012), resistoma em fezes

vacas leiteiras (LIU et al., 2019), dentre outros. Ainda, o shotgun sequencing também

vem sendo a ferramenta de escolha para o estudo da modificação do resistoma e do

48

microbioma de amostras ambientais em decorrência da presença de metais pesados,

como em solo agriculturável (SALAM et al., 2020), sedimento de lagos glaciais

(FILIPIC et al., 2020) e solos cronicamente poluídos (SALAM, 2020).

Atividades antropogênicas como a mineração são responsáveis pela deposição

de elementos tóxicos no ambiente (NGUYEN et al., 2019). Como já mencionado

anteriormente, em 2015 houve a ruptura da barragem do Fundão em Minas Gerais,

com a liberação de aproximadamente 45 milhões de metros cúbicos de rejeito de

minério de ferro no ambiente (SAMARCO, 2016; CARMO et al., 2017), afetando os

cursos d’água, flora e fauna da região. É importante ressaltar que a região apresenta

várias fazendas leiteiras que foram diretamente e indiretamente afetadas com o

acidente. Após dois anos do acontecimento, a análise da água da Bacia do rio Doce,

(utilizada para lazer, irrigação e água de bebida de animais de produção) revelou

níveis elevados de alumínio, níquel, arsênio. manganês, cobre e chumbo

(CARVALHO et al., 2017). Sabendo dos efeitos negativos na saúde e no microbioma

de animais e na disseminação de genes de resistência a antimicrobianos, fazia-se

necessário o estudo dos efeitos da exposição prolongada a metais pesados na saúde

dos bovinos leiteiros da região e na água do rio, utilizada diariamente como fonte de

água de bebida.

49

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar as consequências da

exposição prolongada de bovinos leiteiros a água da Bacia do Rio Doce, local com

atividade extrativista e histórico recente de acidente ambiental envolvendo resíduos

de mineração.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar exame físico dos bovinos estudados em Minas Gerais.

Determinar as funções renal e hepática no soro dos bovinos estudados

em Minas Gerais.

Determinar a concentração de metais pesados no soro dos bovinos

estudados em Minas Gerais.

Determinar a concentração de metais pesados na água de bebida dos

animais das regiões acometidas e não acometidas pelo acidente ambiental em Minas

Gerais, Brasil;

Avaliar por meio de antibiograma e testes moleculares, o perfil de

resistência aos antibióticos e metais pesados das bactérias presentes na água de

bebida dos bovinos das regiões acometidas e não acometidas pelo acidente ambiental

em Minas Gerais, Brasil;

Caracterizar, por meio do sequenciamento do genoma inteiro, a

presença dos genes de resistência a antimicrobianos (expressos ou não), genes de

virulência, plasmídeos, e outras características importantes de algumas bactérias com

perfil de resistência confirmado por testes fenotípicos e moleculares,

Avaliar por meio de sequenciamento do genoma inteiro (shotgun

sequencing), a microbiota e o resistoma intestinal, ruminal e respiratória dos bovinos

50

das regiões acometidas e não acometidas pelo acidente ambiental em Minas Gerais,

Brasil.

51

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO

O teste para duas proporções foi utilizado para obter o número de animais a

serem estudados. Para o cálculo, considerou-se poder de 60%, significância 5%, a

proporção de linha de base (baseline proportion) 50% e a proporção de comparação

(comparison proportion) de 30%. Assim, 60 fêmeas bovinas leiteiras deveriam ser

estudadas, sendo 30 criadas na Bacia do Rio Doce, na região de mineração e

acometida pelo acidente ambiental e 30 criadas numa região não acometida pelo

acidente. Assim, o presente estudo foi realizado em duas propriedades situadas em

diferentes municípios do estado de Minas Gerais, Brasil.

A Bacia do rio Doce leva o nome de seu rio principal, o rio Doce, que apresenta

853 km de extensão, desaguando no oceano Atlântico, pelo litoral do estado do

Espírito Santo. O rio Doce é formado pelo encontro dos rios Piranga e Rio do Carmo

e tem como afluentes os rios Piracicaba, Santo Antônio, Suaçuí, Caratinga e

Manhuaçú. A fazenda 1 (F1) localiza-se em Paracatú de Baixo, subdistrito do

município de Mariana, às margens do rio Gualaxo do Norte (bacia do Rio Doce),

(Latitude: 20º 22' 40" S; Longitude: 43º 24' 58" W) (Figura 3). A F1 recebeu boa parte

dos rejeitos da mineração lançados durante o rompimento da barragem. Desde o

momento do acidente, os animais permanecem em constante contato com a água do

rio, utilizando-a como fonte de água de bebida, além de permanecerem deitados nos

bancos de areia que aparecem durante o período de estiagem no rio.

A fazenda 2 (F2) localiza-se no município de Caldas, Minas Gerais (Latitude:

21º 55' 25" S; Longitude: 46º 23' 10" W), a 535,5 Km de distância da bacia do Rio Doce

(Figura 3). O município faz parte da grande bacia leiteira existente no sul do estado e

não há registros de quaisquer acidentes envolvendo rejeitos de mineração. Estando

fora da região acometida pelos rejeitos, foi utilizada para comparação de resultados.

52

Figura 3 - Localização dos municípios de Mariana (fazenda 1) e Caldas (fazenda 2), em Minas Gerais, Brasil.

Fonte: GAETA, N.C., 2021

3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

Para serem incluídas no estudo, as fêmeas deveriam apresentar acima de 2

anos de idade (garantindo que estivessem na propriedade durante o acidente). F1 e

F2 deveriam apresentar manejo alimentar semelhante e estarem distantes em no

mínimo 100 quilômetros (evitando a presença de moléculas de metais pesados

levadas pelo vento).

3.3 EXAME FÍSICO

Previamente à obtenção das amostras, o exame físico foi realizado em todos

animais, segundo o preconizado por ROSENBERGER, (1993). Dados relacionados a

parâmetros vitais (frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e

movimento ruminal), grau de hidratação e coloração de mucosas, escore de condição

corporal (escala de 1 a 5, sendo 1 referente ao animal extremamente magro e 5 para

53

o animal extremamente gordo) (EDMONSON et al., 1989) e nível de consciência. Em

seguida, foi realizado exame físico específico dos seguintes sistemas:

Respiratório: avaliação da presença de tosse, corrimento nasal (e sua

característica), lesões de narina, odor nasal (e sua característica), fluxo de ar,

tipo respiratório, sons obtidos à percussão do gradil costal, ruídos obtidos à

auscultação pulmonar;

Reprodutivo: avaliação vulvar, observando presença de traumas, vesículas,

nódulos, sangue, pústulas, fezes e urina e secreção (e suas características) e

avaliação vaginal, observando posição, presença de lesões, coloração,

presença de edema e secreção (e suas características).

Digestivo: avaliação da simetria abdominal, apreensão do alimento, mastigação

e deglutição adequadas, estratificação ruminal, abomaso e alças intestinais,

presença de lesões em lábios e cavidade bucal e número de movimentos

ruminais.

Os sistemas tegumentar e nervoso e a glândula mamária foram

especificamente avaliados quando da presença de alguma alteração visível.

3.4 AMOSTRAS

3.4.1 Sangue total

Amostras de sangue total foram obtidas a partir da punção das veias coccígea

ou jugular utilizando sistema vacutainer. As amostras foram acondicionadas em tubo

seco com ativador de coagulação (para o estudo dos perfis renal e hepático) (BD,

EUA) e em tubos Trace Metals (BD, EUA) para o estudo dos metais. Posteriormente,

os tubos foram mantidos em repouso até a completa retração do coágulo. Os soros

obtidos foram acondicionados em microtubos e mantidos a -40ºC.

54

3.4.2 Água

Com o objetivo de avaliar a presença de bactérias resistentes a

antimicrobianos na água do rio, foram obtidos 500 ml de água de oito pontos da Bacia

do Rio Doce (Figura 4), os quais foram acondicionados em garrafas plásticas

previamente auto clavadas e que foram abertas somente quando já em contato com

a água do rio. Para tal, ao serem obtidas, as amostras foram imediatamente resfriadas

e assim permaneceram até o momento do processamento. Para o estudo da presença

dos metais pesados, foram obtidos 20 L de água de quatro pontos da Bacia do Rio

Doce e um ponto da propriedade controle.

Figura 4 - Pontos de colheita de água na Bacia do Rio Doce. Letras indicam amostras para detecção de bactérias resistentes. Asteriscos indicam amostras obtidas para estudo dos metais pesados. A: Gualaxo; B: Paracatu; C: Campinas/Pedras; D: Gesteira; E: Barra Longa urbano; F: Barra Longa

rural; G: Rio do Carmo; H: Rio Doce.

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

3.4.3 Swab fecal

Os swabs foram introduzidos no reto dos animais e rotacionados durante 15

segundos. Para o estudo do metagenoma, os swabs foram imediatamente colocados

em criotubos e acondicionados em nitrogênio líquido.

55

3.4.4 Swab nasal profundo

A amostra foi obtida somente de uma das narinas, que foi inicialmente limpa

com papel para remoção de muco e sujidades. Em seguida, um swab de

aproximadamente 90 centímetros de comprimento, contendo uma proteção de

plástico para a ponta de algodão (Provar, São Paulo, Brasil), foi introduzido na narina

até que uma resistência fosse detectada. Nesse momento, a ponta de algodão foi

removida da proteção de plástico e, em contato com a mucosa respiratória, pelo

menos dez movimentos de “vai e vem” foram realizados. Em seguida, a ponta foi

reintroduzida na camisa de plástico e o swab foi removido da narina do animal e

imediatamente acondicionado em nitrogênio.

3.4.5 Conteúdo ruminal

Para a obtenção do líquido ruminal, uma sonda plástica foi introduzida pela

boca do animal e, por sistema à vácuo, o conteúdo foi obtido e imediatamente

acondicionado em nitrogênio líquido. Entre cada colheita, o sistema era limpo com

água e álcool 70%.

3.5 ANÁLISES LABORATORIAIS

3.5.1 Determinação da concentração de metais pesados

A análise da concentração de metais pesados foi realizada por meio do

equipamento de fluorescência de raio-X (WDXRF) - Supermini 200 (Rigaku, Japão) -

pertencente ao Laboratório de Geoprocessamento do Instituto de Oceanografia da

Universidade de São Paulo.

56

Para a determinação dos elementos potencialmente tóxicos no soro dos

bovinos, utilizou-se o protocolo descrito por Carvalho, (2019), no qual 50 µL de cada

amostra foram depositados em filtros tipo Microcarry (Rigaku, Japan) (Droplet Method)

(MORIYAMA, T.; MORIKAWA, 2017). Em seguida, os filtros foram inseridos no

equipamento e a leitura realizada em “atmosfera de vácuo”, como aconselhado pelo

fabricante. A metodologia foi validada para a determinação de alumínio (Al), cromo

(Cr), cobalto (Co), ferro (Fe), cobre (Cu), arsênio (As) e mercúrio (Hg). Os resultados

obtidos foram expressos em miligramas por litro (mg/L).

Para a determinação dos elementos potencialmente tóxicos na água, dez

litros de cada amostra foram concentrados em estufa a 50ºC até atingirem o volume

de 10 mL. Em seguida, o mesmo protocolo descrito acima foi realizado.

3.5.2 Perfis renal e hepático

As concentrações séricas foram determinadas por meio dos kits comerciais

da Labtest (Minas Gerais, Brasil) para Creatinina (Cód. 96-300), proteínas totais (Cód.

99-250), bilirrubina direta (Cód. 93-1/104) e bilirrubina total (Cód. 94-1/104) e da

Biosystems (Barcelona, Espanha) para Ureia (Cód. 11541), ALT (Cód. 11568), AST

(Cód. 11531) e GGT (Cód. 11520). Todos os kits foram validados para o equipamento

Labmax-240 (Labtest Diagnostica SA), rotineiramente empregado no Laboratório

Clínico do Departamento de Clínica Médica/Hospital Veterinário – FMVZ-USP.

3.5.3 Estudo das bactérias resistentes na água

As amostras de água obtidas ao longo do Rio Doce em F1 e F2 foram

processadas pelos métodos de centrifugação e filtração, para que houvesse a maior

chance de se obter o isolamento bacteriano.

No primeiro método, 40 mL de água foram transferidos para tubos tipo Falcon

estéreis e centrifugados à 5000 rpm por 30 minutos (Eppendorf ®). Em seguida, mais

40 mL de água foram adicionados ao tubo e centrifugados novamente. Por fim, o pellet

57

formado foi suspendido em três mililitros de caldo Brain Heart Infusion (BHI)

(Acumedia®) e incubados à 35 ºC - 37 ºC, em shaker, por 24 horas. Os crescimentos

bacterianos foram mantidos em geladeira até o processamento. No segundo método,

100 mL de água foram filtrados utilizando filtros de 0,45 µm (Merck Millipore ®). Em

seguida, os filtros foram colocados em tubos tipo Falcon contendo cinco mililitros de

caldo BHI ® e incubados à 35 ºC - 37 ºC, em shaker, por 24 horas. Os crescimentos

bacterianos foram mantidos em geladeira até o processamento.

3.5.4 Determinação de bactérias resistentes à antibióticos

A pesquisa de bactérias resistentes à antibióticos foi realizada no crescimento

bacteriano proveniente do processamento da água (centrifugada e filtrada).

Inicialmente, as amostras foram semeadas em placas de ágar MacConkey

(Acumedia®) suplementadas com 2,5 µg/mL de ceftriaxona (CRO) e 3,0 µg/mL de

polimixina B (POL), as quais foram incubadas à 35 ºC - 37 °C por 24 horas. As colônias

observadas foram identificadas quanto a fermentação de lactose e características

morfológicas e estocadas em meio Triptone Soy Agar (Acumedia®) semi-sólido, à

temperatura ambiente. Vale ressaltar que somente uma colônia de cada espécie

observada foi estocada, a fim de que os testes subsequentes sempre fossem

realizados com os clones da espécie selecionada.

A triagem de bactérias resistentes à antibióticos foi realizada por meio do

método de disco difusão ou disco aproximação (Kirby-Bauer), de acordo com as

diretrizes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). O teste inicia-

se com a preparação do inóculo, utilizando de três a cinco colônias de um cultivo

fresco (com 18 - 24 horas de crescimento). Estas foram colocadas em caldo Mueller

Hinton (BD, New Jersey, USA), cuja turbidez foi ajustada de modo a obter uma

turbidez óptica semelhante à solução de McFarland na escala 0,5 (108 UFC/mL). Em

seguida, mergulhou-se um swab de algodão estéril na suspensão ajustada e o

excesso de inóculo foi removido da ponta de algodão após girá-lo e pressioná-lo

algumas vezes na parte interna do tubo. O inóculo, então, foi semeado em placas de

petri de 140mm X 15 mm contendo ágar Mueller Hinton (BD, New Jersey, USA),

atentando-se para semear toda a superfície do ágar. O procedimento é repetido pelo

58

menos três vezes, girando a placa em aproximadamente 60°, assegurando a

distribuição uniforme do inóculo. Após a diminuição de umidade da placa (três a cinco

minutos à temperatura ambiente), os discos de antibiótico foram distribuídos com

auxílio de uma pinça estéril (Figura 5). As placas foram incubadas à 35 ºC - 37 ºC por

18 a 24 horas. Após esse período, o diâmetro dos halos de inibição de crescimento foi

medido.

Os discos de antibióticos utilizados (DME, São Paulo, Brasil) e suas

respectivas concentrações (microgramas) estão a seguir: Aztreonam 30 (ATM),

Sulfazotrim 25 (SUT), Ertapenem 10 (ETP), Ceftriaxona 30 (CRO), Ácido Nalidíxico

30 (NAL), Imipenem 10 (IMP), Ceftazidima 30 (CAZ), Amoxicilina com ácido

clavulânico 30 (AMC), Cefotaxima 30 (CTX), Cefoxitina 30 (CFO), Meropenem 10

(MER), Cefepime 30 (CPM), Ciprofloxacina 05 (CIP), Amicacina 30 (AMI) e

Gentamicina 10 (GEN).

Figura 5 - Disposição dos discos de antibióticos na placa de petri contendo ágar Mueller Hinton.

Fonte: GAETA, N.C., 2021

Para identificação dos genes codificadores dos padrões de resistência

detectados na análise fenotípica, o DNA bacteriano total foi extraído (CHAPMAN et al.

2001). A bactéria foi semeada em caldo LB estéril e incubado em shaker à 37°C por

18 a 24 horas à 150 rpm. Após o período de incubação, dois mililitros da cultura foram

transferidos para um microtubo e centrifugados à 5000 rpm por 15 minutos. O

sobrenadante foi descartado e o pellet pesado. O ideal é obter no mínimo 0,05 g de

células. Em seguida, o pellet foi ressuspendido na quantidade de água

correspondente ao peso do pellet. Em seguida, a suspensão foi colocada em banho-

maria seco à 100 °C por 10 minutos e, então, em gelo por cinco minutos. Por fim, a

59

suspensão foi centrifugada 9000 rpm por 15 minutos e 100 µL do sobrenadante,

contendo o material genético bacteriano, foram transferidos para um microtubo estéril

e armazenados à -20° C.

A reação da polimerase em cadeia (PCR) do tipo convencional foi realizada

para detecção do gene de resistência presente na bactéria. Devido ao perfil de

resistência encontrado em algumas cepas, realizou-se a detecção do gene CTX-M

(blaCTX-M), de acordo com BONNET et al. (2001), incluindo a detecção de CTX-M-2

(blaCTX-M2) (DROPA et al. 2015) e CTX-M-15 (blaCTX-M15) (MUZAHEED et al., 2008),

oligonucleotídeos iniciadores disponíveis para uso no laboratório (Tabela 1).

Tabela 1 - Sequência de oligonucleotídeos iniciadores para detecção de genes codificadores de ESBL.

Grupo Sequência dos iniciadores (5’-3’) T°Ca Pbb

Referência

blaCTX-M

F: CGCTTTGCGATGTGCAG

R: ACCCGCGATATCGTTGGT 55 550 BONNET et al., 2001

blaCTX-M2

F: GACTCAGAGCATTCGCCGC

R:TCAGAAACCGYGGGTTACGA

55

870

DROPA et al., 2015

blaCTX-M15

F: CACACGTGGAATTTAGGGACT

R:GCCGTCTAAGGCGATAAACA

56

995

MUZAHEED et al.,

2008

T °Ca: temperatura de anelamento; Pbb: pares de base. Fonte: Gaeta, N.C., 2021

As reações foram elaboradas para um volume final de 25 µL, constituída por:

2,5 µL de tampão para PCR (10X PCR Buffer + Mg2+) e 0,25 µL de Taq Polimerase

5U/ µL (Sinopse™); 2,5 µL de solução de deoxiribonucleotídeos (200 µM); 0,5 µL de

cada oligonucleotídeo iniciador (25 pmol) e 1 µL de DNA cromossomal. As condições

para as reações de amplificação foram: 1) Desnaturação inicial à 94 °C durante cinco

minutos; 2) Ciclo inicial de desnaturação à 94 ºC durante um minuto, anelamento dos

iniciadores à 56 ºC para blaCTX-M e blaCTX-M15 e à 58 ºC para blaCTX-M2, durante um

minuto e extensão à 72 ºC por um minuto; 3) Repetição da etapa 2 por 29 vezes; 4)

Extensão final à 72 ºC durante cinco minutos. Os amplificados obtidos pela PCR foram

60

separados por eletroforese em gel de agarose 1,0%, com 0,5 µg/mL de brometo de

etídeo, utilizando tampão tris-acetato-EDTA (TAE) e marcador de peso molecular de

100pb DNA Ladder (Invitrogen™). A visualização dos produtos foi realizada sob luz

ultravioleta por meio do Transiluminador Vilber Lourmat®.

O teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para ceftriaxona, de acordo

com o preconizado pelo CLSI (2013) nos isolados ESBL positivos.

3.5.5 Sensibilidade bacteriana à metais pesados

Para este estudo, as amostras foram semeadas em meio MacConkey

(Acumedia®) suplementadas com metais pesados. A fim de saber qual a

concentração dos elementos a ser adicionada ao meio, determinou-se a concentração

inibitória mínima (CIM) de cada elemento escolhido frente a estirpes-padrão, bem

como controles positivos contendo alguns genes de resistência para metais pesados.

Foram utilizados cinco metais pesados disponíveis no laboratório (Tabela 2)

e 13 bactérias, sendo 11 cepas-padrão: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli

ATCC 8739, Escherichia coli J53, Escherichia coli C600, Enterobacter aerogenes

ATCC 13048, Salmonella ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Enterococcus faecalis ATCC 29212,

Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e duas

cepas disponíveis no banco genético do laboratório, apresentando genes de

resistência para metais pesados: KPN 535 - Klebsiella pneumoniae contendo arsA-D

e arsH (genes de resistência ao arsênio), merA-C (genes de resistência ao mercúrio),

pcoA-E e pcoR-S (gene de resistência ao cobre), silR-S, silC e silE (gene de

resistência ao prata) e nikA-E (gene de resistência ao níquel) e KP 171 – Klebsiella

pneumoniae contendo arsA-B e arsH (genes de resistência ao arsênio), merC (gene

de resistência ao mercúrio), pcoC-D e pcoR (gene de resistência ao cobre), silR-S,

silC e silE (gene de resistência ao prata), nikA-E (gene de resistência ao níquel) e zntA

(gene de resistência ao zinco).

61

Tabela 2 - Metais pesados utilizados na padronização do teste de concentração inibitória mínima. São Paulo. 2019.

Metal

Símbolo

Marca

Peso molecular

(g/mol)

Arsenito de sódio AsNaO7 Baker & Adamson, USA 129,90

Cloreto de mercúrio

HgCl2

Mallinckrodt, UK 271,52

Sulfato de cobre

CuSO4. 5H2O

Synth, Brasil 249,68

Nitrato de prata

AgNO3

Merck, Alemanha 168,89

Cloreto de cobalto

CoCl2

Baker & Adamson, USA 287,95

Dicromato de potássio

K2Cr2O7

Vetec, Brasil 294,18

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Para a realização do teste da CIM, uma colônia de cada espécie foi semeada

em tubos contendo dois mililitros de Mueller Hinton Broth estéril (BD, New Jersey,

USA) e incubadas em shaker à 35 °C – 37°C durante quatro a seis horas, momento

no qual atingiram a fase Log de crescimento. No momento da realização do teste,

soluções de 10 mL à 0,1 M de cada elemento foram preparadas utilizando água Milli

Q estéril (Tabela 3). Em seguida, soluções de trabalho foram preparadas, garantindo

que a concentração desta apresentasse uma diluição acima daquela inicial a ser

utilizada na placa (Tabela 4). As soluções foram acondicionadas em tubos tipo Falcon

envoltos em papel alumínio, garantindo que os metais não tivessem contato com a luz

e não fossem inativados.

62

Tabela 3 - Concentração das soluções estoque e trabalho, e a diluição inicial utilizada no teste para determinação do CIM para cada elemento. São Paulo. 2019.

Elemento

Concentração da

solução estoque

(µg/mL)

Concentração

da solução de

trabalho

(µg/mL)

Diluição inicial na placa

para a CIM

(µg/mL)

AsNaO7 12990 2048 1024

HgCl2 27152 128 64

CuSO4. 5H2O 24970 2048 1024

AgNO3 16987 128 64

CoCl2 28795 4096 2048

K2Cr2O7 29418 4096 2048

Fonte: Gaeta, 2021

Após o preparo das soluções, 100 µL de Mueller Hinton Broth cátion ajustado

estéril (BD, New Jersey, USA) foram distribuídos em placas estéreis de 96 poços com

fundo U. Em seguida, 100 µL da solução de trabalho foram distribuídos na primeira

coluna da placa e, com auxílio de uma pipeta multicanal, fez-se diluições seriadas com

fator 2 até a coluna 10. Posteriormente, os inóculos crescidos foram ajustados de

modo a obter uma turbidez óptica semelhante à solução de McFarland na escala 0,5

(108 UFC/mL), utilizando o espectrofotômetro (Quimis®), realizando a leitura no

comprimento de onda 624 nm. Após o ajuste, 100 µL desta nova suspensão foram

adicionados em 900 µL de Mueller Hinton Broth cátion ajustado estéril (BD, New

Jersey, USA) em microtubos estéreis. Finalmente, cinco microlitros de cada

suspensão foram adicionados em cada linha, até a coluna 11 (Figura 6). As placas

foram incubadas à 35 °C – 37 °C e a leitura realizada após incubação por 18 a 24

horas. A CIM é definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento

bacteriano visível (Figura 6). Para a padronização, o teste para cada metal foi realizado

em triplicada.

63

Figura 6 - Esquema da placa utilizada para determinação do CIM.

Fonte: GAETA, N.C., 2021

Após a determinação da CIM, placas de ágar MacConkey (Acumedia®) foram

preparadas e suplementadas com os metais pesados. Em seguida, os crescimentos

bacterianos provenientes do processamento da água (centrifugada e filtrada) foram

semeados. As placas foram incubadas à 35 °C – 37 °C por 24 horas. As colônias

obtidas foram caracterizadas quanto sua morfologia e fermentação de lactose e

estocadas em TSA semi-sólido à temperatura ambiente. Posteriormente, para cada

estirpe isolada, a CIM dos metais estudados foi determinada utilizando a metodologia

descrita anteriormente. Para este caso, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC

13883 e K. pneumoniae 535 foram utilizados como controle.

3.5.6 Identificação das espécies bacterianas

As espécies bacterianas foram identificadas por meio do Matrix Assisted Laser

Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (Maldi-Tof).

64

3.5.7 Sequenciamento de cepas representativas

O sequenciamento de cepas representativas foi realizado por meio da MiSeq

Platform (Illumina Inc., San Diego, CA) a 300 × 300 bp. As reads foram trimadas e

filtradas utilizando TrimGalore v.0.6.5 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore).

Em seguida, a montagem de novo foi realizada por meio do Unicycler v.1.2.10

(https://github.com/rrwick/Unicycler) (WICK et al., 2017). A sequência obtida foi

anotada utilizando o Rast: Rapid Annotation Using Subsystem Technology (www.

http://rast.nmpdr.org/) (AZIZ et al., 2008). Resistoma (genes de resistência a

antimicrobianos, mutações presentes em cromossomos pontuais e genes de

resistência a metais pesados), genes de virulência e plasmídeos foram determinados

utilizando Abricate (https://github.com/tseemann/abricate) com os bancos de dados

ResFinder (ZANKARI et al., 2012), MegaRes 2.0 (DOSTER et al., 2019) e BacMet

(banco de dados de aminoácidos) (PAL et al., 2014), Virulence Finder Database

(CHEN et al., 2016) e PlasmidFinder (CARATTOLI et al., 2014), respectivamente.

Multilocus Sequence Typing, Plasmid Multilocus Sequence Typing e sorotipos foram

identificados utilizando os serviços MLST 2.0.4, pMLST 0.1.0 e SeroTypeFinder 2.0.1,

respectivamente, disponíveis no Center for

Genomic Epidemiology (http://genomicepidemiology.org/). Para as cepas de E. coli,

os filogrupos foram determinados, in silico, por meio do ClermonTyping (BEGHAIN et

al., 2018). Para cepas pertencentes ao K. pneumoniae species complex, utilizou-se o

Kleborate (https://github.com/katholt/Kleborate). Para o isolado de K. variicola, o ST

foi caracterizado pelo laboratório de resistência bacteriana do instituto Nacional de

Salud Pública de Cuernavaca, Mexico. Como critério de aceitação para a presença

dos genes, considerou-se cobertura igual ou acima de 95% e identidade igual ou

acima de 85%.

65

3.5.8 Análise do microbioma e resistoma bovino

4.5.8.1 Extração de DNA

Antes da extração do DNA genômico, todos os swabs foram pré-processados

para a obtenção da máxima concentração de DNA possível. Um mililitro de tampão

PBS 1X (pH: 7.4) foi adicionado às amostras e todas foram homogenizadas por 30

minutos. Os swabs foram removidos e as amostras centrifugadas a 14 000 rpm por 30

minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet suspendido em 300 µl de PBS 1X.

A extração do DNA foi realizada utilizando MagMAXTM CORE Nucleic Acid

Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), de acordo com as

instruções do fabricante. Brevemente, as placas referentes as soluções de lavagem 1

e 2 foram preparadas com a adição de 500 µl de cada reagente em placas de 96

poços. A solução de Bead/proteinase K foi preparada por meio da adição de 20

µl/amostra de MagMAXTM CORE Magnetic Beads e 10 µl/amostra de MagMAXTM

CORE proteinase K em um tubo estéril de 50 mL. A solução de lise/ligação foi

preparada por meio da adição de 350 µl/amostra de MagMAXTM CORE Lysis Solution

e 350 µl/amostra de MagMAXTM CORE Binding Solution em um tubo estéril de 50 mL.

Após estas etapas, a placa de amostras foi preparada por meio da adição de 200 µl

de cada amostra nos poços correspondente e 30 µl da suspensão bead/proteinase K

em cada poço. A placa de amostra foi vigorosamente agitada por dois minutos. Então,

700 µl da solução de lise/ligação foi adicionado a cada poço. Finalmente, a placa de

eluição foi preparada por meio da adição de 90 µl de MagMAXTM CORE Elution Buffer

em cada poço de uma placa padrão. Cada placa foi colocada no equipamento e o

protocolo apropriado selecionado. Após a extração, a concentração de DNA foi obtida

por meio de espectrofotômetro (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,

MA).

66

3.5.8.1 Shotgun Sequencing

Shotgun whole metagenome sequencing foi realizado no Genome Sciences

and Bioinformatics Core, Penn State College of Medicine, Hershey, PA, USA. Dez

nanogramas de cada DNA genômico quantificados pelo Qubit foram fragmentados

utilizando Covaris E220, instrumento operando SonoLab v6.2.6, gerando fragmentos

de aproximadamente 300 bp. Entre 10 e 100 ng do DNA fragmentado foram

processados em kit Illumina compatível para preparo da biblioteca, usando sparQ DNA

Library Prep Kit (Quantabio). A cada biblioteca foram adicionados barcodes

(sequências de índice duplo exclusivas) (NEXTFLEX® Unique Dual Index Barcodes,

BioO Scientific). Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip foi utilizado para confirmar o

tamanho e a quantidade da biblioteca. Os produtos de PCR foram limpos utilizando

AMPure XP beads. Bibliotecas equimolares foram adicionadas e o pool formado foi

submetido a sequenciamento Illumina NovaSeq 6000 a 2x150 bp (Illumina).

Illumina bcl2fastq (versão 2.20.0.422) foi utilizado para a extração das reads

demultiplexadas.

3.6 ANÁLISE

3.6.1 Variáveis clínicas e laboratoriais

As variáveis clínicas e laboratoriais (perfis renal e hepático) foram

comparadas entre as fazendas por meio do teste Wilcox Sum Rank Test com correção

de continuidade. As medianas e o intervalo inter-quatil foram utilizados para a

demonstração dos resultados. Todos os cálculos foram realizados no RStudio v.4.0

(RTEAM, 2020).

67

3.6.2 Microbioma

Os arquivos fastq demultiplexados foram carregados no servidor MG-RAST

(KEEGAN; GLASS; MEYER, 2016), concatenados e submetidos a pipeline padrão a

fim de determinar a abundância relativa da microbiota presente nas amostras fecais,

ruminais e nasais. No MG-RAST, as sequências foram submetidas a controle de

qualidade, havendo remoção de sequências espécie-específicas do hospedeiro (Bos

taurus, UMD v3.0), filtragem de bases ambíguas e filtragem por tamanho de reads. Os

fragmentos obtidos foram mapeados contra o banco de dados não-redundantes (N5nr)

e para a determinação da abundância dos organismos, utilizou-se os parâmetros

default (e-value máximo = 1x10-5, ponto de corte mínimo de identidade d

= 60% e ponto de corte para tamanho de alinhamento mínimo = 15).

Após completar a pipeline, os resultados foram baixados, transferidos para

uma planilha, na qual a abundância relativa de cada taxa foi calculada. A normalidade

dos dados foi avaliada por meio do Shapiro-Wilk test (SHAPIRO; WILK, 1965). As

variâncias foram analisadas pelo Bartlett’s test (BARTLETT, 1937). A abundância

relativa de cada nível taxonômico foi analisado por meio do Wilcoxon rank-sum test

(WILCOXON, 1945) de acordo com a fazenda (F1 e F2). Os resultados foram descritos

por mediana (M) e intervalo interquartil (IIQ). Todas as análises estatísticas foram

realizados no R software v. 3.6.0 (RSTUDIO TEAM, 2020). Variáveis com P < 0.05

foram consideradas significativas.

3.6.3 Resistoma

Inicialmente, a qualidade das reads foi acessada a partir de um subconjunto

aleatório de 10 amostras, utilizando FastQC (ANDREWS, 2010). As reads foram

trimadas utilizando o software Trimmomatic, para um tamanho mínimo de 50bp

(BOLGER; LOHSE; USADEL, 2014). As paired-end reads foram fundidas (merged)

utilizando FLASH e convertidas em arquivos tipo FASTA por meio do Seqkit (SHEN et

al., 2016). As reads foram alinhadas a uma base de dados customizada com genes

de resistência a antimicrobianos, construídas no BLAST (ALTSCHULet al., 1990), a

partir do banco de dados de resistência antimicrobiana MEGARes 2.0, disponível

68

publicamente. O MEGARes 2.0 é um banco de dados que incorpora genes disponíveis

no CARD, ARGANNOT, AMRFinder, NCBI, ResFinder, BacMet, Lahey e Resfinder,

num total de 7,868 genes ou operons, que conferem resistência a metais, biocidas,

drogas, ou resistência multi-níveis (DOSTER et al., 2019). Os genes contaminantes

foram detectados e removidos por meio do pacote “decontam”, disponível no software

R, baseando-se nas amostras de controle negativo da extração de DNA (n=1) (DAVIS

et al., 2017). Uma amostra tipo “mock community” (Zymo Research, USA) foi utilizada

como controle positivo durante as etapas de extração, PCR e sequenciamento para

controle de qualidade.

A contagem de genes foi normalizada e estes dados foram convertidos para

abundância relativa, a amostra com a maior contagem normalizada de genes foi

classificado como 1. Os dados foram apresentados como a média da presença dos

genes ou abundância relativa média. Os dados estavam fortemente distorcidos em

zero e essa distribuição não foi corrigida pela transformação de variáveis, portanto,

testes não-paramétricos foram usados para comparações de pares. Os limiares de

significância foram definidos em False Discovery Rate corrigida P <0,05 (BENJAMINI,

Y.; HOCHBERG, 1995). Comparações foram feitas para tipo de resistência, classe,

mecanismo e grupo. As comparações entre as fazendas foram realizadas por meio do

Wilcox Rank-Sum test, com ajuste de False Discovery Rate para comparações

múltiplas. As comparações entre locais anatômicos em cada fazenda foram feitas por

meio do teste de Kruskal-Wallis com ajuste de False Discovery Rate para

comparações múltiplas.

3.6.4 Anotação funcional do metagenoma

A anotação funcional do metagenoma foi realizada com o objetivo de se

discutir os mecanismos funcionais mais importantes na população bacteriana de cada

fazenda no momento do estudo, e como a potencial contaminação ambiental pelo

acidente com o rejeito de minérios poderia influenciar nos padrões encontrados.

O Mi-faser (pipeline para análise de metagenoma de alta precisão) (ZHU et

al., 2018) foi utilizado para determinar se F1 apresentava mais funções que

promoveriam resistência a antimicrobianos e metais pesados. Os arquivos tipo fastq

69

foram submetidos online (https://services.bromberglab.org/mifaser/submit) e antes do

mapeamento das sequências à base de dados, realizou-se controle de qualidade

utilizando o fastp (qualidade phred = 20, tamanho de read = 40), na própria pipeline.

Os arquivos resultantes da análise pelo mi-faser apresentavam números de enzimas

catalogadas (E.C.), anotação funcional e contagem de sequências por anotação. Para

comparação entre fazendas e sítios anatômicos (amostras), utilizou-se o Wilcox rank-

sum test. As sequências foram normalizadas de acordo com a contagem total de reads

de cada metagenoma individual. Estes dados e informações importantes como

“identificação de amostra”, “fazenda” e “sítio anatômico” foram importadas para o

software Waikato Environment for Knowledge Analysis (WEKA) (FRANK et al., 2016),

que calculou o valor relativo de cada E.C. medindo o ganho de informação a respeito

de três classes nominais: 1) “fazenda” (dois níveis), 2) “sítio anatômico” (três níveis) e

3) classe composta por “fazenda por sítio” (seis níveis). Os dados foram reduzidos

pela seleção dos 10 principais E.C.s de cada classe, para mapeamento de vias

utilizando o Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Mapper (KANEHISA;

SATO, 2020).

Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio do software RStudio

(v. 3.6.0) (RSTUDIO TEAM, 2020).

70

4 RESULTADOS

4.1 CARACTERÍSTICAS DAS PROPRIEDADES ESTUDADAS

Das 60 fêmeas que deveriam ser estudadas, foram colocadas 58 fêmeas

bovinas leiteiras no estudo, sendo 28 pertencentes à F1 e 30 fêmeas pertencentes à

F2. Devido ao risco para a segurança dos animais e dos pesquisadores, dois animais

de F1 não foram avaliados.

A F1 apresentava 30 fêmeas em lactação, em sistema de criação do tipo semi

- extensivo. Os animais pastejam à beira do rio durante a noite, momento no qual

ingerem a água do Rio do Carmo e durante o dia, ingerem água de uma nascente.

Além da pastagem, os animais são suplementados com soja, trigo, fubá e sal mineral.

O rebanho é vacinado contra raiva e febre aftosa. Os animais adquiridos são

quarentenados por pelo menos 30 dias, mas nenhum exame laboratorial para

detecção de patógenos é realizado. Os bovinos têm contato com cães, gatos, aves

(galináceos e silvestres), caprinos e ovinos. Não havia anotações quanto ao uso de

antimicrobianos nos animais e o funcionário, por ser recente na função, não soube dar

maiores informações.

A F2 apresentava 70 fêmeas lactantes em sistema de criação do tipo semi-

extensivo. Os animais permanecem no pasto a maior parte do tempo, sendo

suplementados com concentrado, silagem e sal mineral. Ingerem água de um rio

próximo ou de um lago, a depender do piquete em que se encontram. O rebanho é

vacinado contra leptospirose e febre aftosa. Os animais doentes são alocados em

local próprio, com outros doentes. O funcionário não soube informar sobre a realização

de exames antes da aquisição de animais. Os bovinos têm contato com cães, gatos e

aves (galináceos e silvestres). Não havia anotações quanto ao uso de antimicrobianos

nos animais e o funcionário não soube dar maiores informações.

71

4.2 PARÂMETROS CLÍNICOS DOS ANIMAIS

Muitos animais apresentavam-se agitados devido a presença dos

pesquisadores e das condições climáticas do dia. Em Mariana, a temperatura média

e a umidade relativa do ar durante o período de coleta foram respectivamente 30º C

e 60%. De maneira semelhante, a temperatura média e a umidade relativa do ar em

Caldas, durante o período de coleta, foram respectivamente 30° C e 65%. Os

resultados obtidos durante o exame físico dos animais estão descritos na tabela 4.

Tabela 4 - Frequência dos parâmetros clínicos gerais obtidos das fêmeas bovinas pertencentes à

fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de Minas Gerais, Brasil.

Fazenda

Parâmetros Fazenda 1 % (N/T)

Fazenda 2 % (N/T)

Nível de consciência

Alerta 100 (28/28) 100 (30/30)

Grau de hidratação

Normal 71,4 (20/28) 93,3 (28/30 Leve desidratação 14,3 (04/28) 03,3 (01/30)

Sem dados 14,3 (04/28) 03,3 (01/30)

Frequência cardíaca (bpm)

60-80 92,9 (26/28) 30,0 (09/30) >80 07,1 (02/28) 60,0 (18/30)

Sem dados 00,0 (00/00) 10,0 (03/30)

Frequência respiratória (mrpm) 10-30 60,7 (17/28) 26,7 (08/30) >30 35,7 (10/28) 60,0 (18/30)

Sem dados 03,6 (01/28) 13,3 (04/30)

Temperatura (°C)

37,5-39,3 85,7 (24/28) 80,0 (24/30) >39,3 03,6 (01/28) 06,7 (02/30) Sem dados 10,7 (03/28) 10,0 (03/30) N: número de manifestações observadas; T: total de animais; bpm: batimentos por minuto; mrpm:

movimentos respiratórios por minuto; mrm: movimentos ruminais por minuto. Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Particularmente durante a avaliação do sistema respiratório, alguns animais

apresentaram sons alterados à auscultação como crepitação grossa, crepitação fina,

ronco e sibilo (Tabela 5).

72

Tabela 5 - Frequência de parâmetros clínicos específicos do sistema respiratório obtidos das

fêmeas bovinas pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de

Minas Gerais, Brasil.

Fazendas

Parâmetros Fazenda 1 % (N/T)

Fazenda 2 % (N/T)

Tosse

Ausente 96,4 (27/28) 100 (30/30)

Exsudato nasal

Normal 64,3 (18/28) 40,0 (12/30) Seroso 35,7 (10/28) 56,7 (17/30)

Sem dados 00,0 (00/00) 03,3(01/30)

Tipo respiratório

Costoabdominal 92,8 (26/28) 93,3 (28/30) Abdominal 00,0 (00/00) 03,3 (01/30)

Sem dados 07,2(042/28) 03,3(01/30)

Percussão torácica

Claro 92,9 (26/28) 86,7 (26/30) Maciço/submaciço 00,0 (00/00) 00,0 (00/00)

Sem dados 07,2(02/28) 13,3(04/30)

Auscultação pulmonar

Normal 82,1 (23/28) 80,0 (24/30) Alterado 10,7 (03/28) 10,0 (03/30)

Sem dados 07,2(02/28) 10,0 (03/30)

Crepitação grossa 66,6 (02/03) 66,6 (02/03) Crepitação fina 33,3 (01/03) 33,3 (01/03)

Ruídos anexos

Presentes 10,7 (03/28) 06,6 (02/30) Ausentes 89,3 (25/28) 93,4(28/30)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Durante a avaliação do sistema reprodutivo das fêmeas, observou-se que

grande parte dos animais apresentavam vesículas na mucosa vulvar (F1=32,1%;

F2=53,3). Por fim, não foram observadas alterações no sistema gástrico e na glândula

mamária das fêmeas avaliadas.

73

4.3 CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NO SORO DOS BOVINOS

Pela técnica de WDXRF, houve detecção de alumínio nos soros bovinos das

duas fazendas. O alumínio foi detectado em 58,6% (17/29) das vacas de F1 (Média:

0,00824 mg/L, desvio padrão 0,0038) e em 40% (12/30) de vacas de F2 (Média:

0,00570 mg/L, desvio padrão 0,0030). Observa-se que a média é numericamente mais

elevada em F1 (P = 0,07, t-test).

4.4 PERFIL RENAL E HEPÁTICO DOS BOVINOS

Com a avaliação do perfil renal e hepático dos bovinos leiteiros, observou-se

que os níveis de AST, creatinina e bilirrubina total estavam mais elevados nos animais

da fazenda 1 (P < 0.05). Entretanto, os níveis de ureia e proteína estavam mais

elevados na fazenda 2 (P < 0.05) (Tabela 6).

Tabela 6 - Comparação de médias entre as variáveis estudadas em bovinos leiteiros das fazendas 1

e 2, localizadas nas cidades de Mariana e Caldas, respectivamente, Minas Gerais, Brasil. Valores em

negrito indicam significância estatística no teste Wilcox Sum Rank com Correção de Continuidade (P

< 0.05).

Variáveis FAZENDA 1

(Mediana ±IIQ)

FAZENDA 2

(Mediana ±IIQ) P-valor

AST (U/L) 36,20±8.9 31,4±7,35 0.008 GGT (U/L) 9,70±3,7 10,0±5,28 0,096 Ureia (mg/dL) 11,70±3,5 42,4±25,1 <0.001 ALB (g/L) 2,74±0,33 2,74±0,308 0,93 Proteína (g/L) 7,75±0,83 8,440±0,81 <0.001 Creatinina (mg/dL) 1,12±0,3 0,945±0,205 0,002 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,06±0,03 0,050±0,027 0,266 Bilirrubina total (mg/dL) 0,16±0,08 0,115±0,10 0.010

Fonte: Gaeta, N.C.; 2021

74

4.5 METAGENOMA BOVINO

O estudo do metagenoma bovino foi realizado com 90 amostras, sendo 31

swabs fecais (F1=16; F2=15), 28 fluidos ruminais (F1=15; F2=13) e 30 swabs nasais

(F1=16; F2=14).

4.5.1 Microbiota

A análise das amostras fecais revelou 28 filos presentes em todas as amostras,

com três grupos predominantes: Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria (Figure

13a). Dos cinco filos mais abundantes, Bacteroidetes foi maior em F1 (P = 0.01) e

Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria foram mais abundantes em F2 (P < 0.05)

(Figura 7).

Figura 7 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras fecais de

bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho

(P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C.,2021

75

A análise a nível de gênero revelou 20 gêneros dominantes na microbiota fecal

dos bovinos, particularmente Bacteroides, Clostridium e Escherichia. Dos dez gêneros

mais prevalentes (Figura 8), Bacteroides (P = 0.03), Escherichia (P = 0.03),

Parabacteroides (P = 0.02) e Alistipes (P = 0.04) foram mais abundantes em F1 (P <

0.05). Já Clostridium (P = 0.02), Eubacterium (P = 0.04), Bacillus (P = 0.004),

Ruminococcus (P = 0.008) e Enterococcus (P = 0.03) foram mais abundantes em F2

(P < 0.05). Outros gêneros importantes como Butyrivibrio e Shigella também foram

detectados nas amostras das duas propriedades (Figure 13b).

Figura 8 -. Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas amostras fecais de

bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho

(P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Ao nível de filo, a análise de amostras ruminais revelou a presença de 28

grupos, destacando-se Bacteroidetes e Firmicutes (Figura 13a). Dos cinco filos mais

frequentes, Proteobacteria (F1: MD = 0.08; IIQ = 0.01; F2: MD = 0.06; IIQ = 0.01) e

Fibrobacteres (F1: MD = 0.01; IIQ = 0.007; F2: MD = 0.005; IIQ = 0.002) (P < 0.05)

foram mais abundantes em F1 que F2 (Figura 9).

76

Figura 9 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras ruminais de

bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho

(P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

A análise de gêneros presentes nas amostras ruminais revelou a

predominância de 20 grupos, com destaque para Bacteroides, Prevotella e Clostridium

(Figura 13b). Prevotella (MD=0.18; IIQ = 0.04; MD = 0.23; IIQ=0.009) foi mais

abundante em F2 (P < 0.05), enquanto que Fibrobacter (MD=0.01; IIQ = 0.007; MD =

0.005; IIQ=0.002) foi mais abundante em F1(P = 0.004) (Figura 10). Bacteroides foi

numericamente mais abundante de F2 que em F1 (P > 0.05). Outros gêneros

comumente presentes no fluido ruminal bovino, tais como Ruminococcus,

Eubacterium, Clostridium, Butyrivibrio, Enterococcus e Parabacteroides foram

detectados nas duas propriedades.

77

Figura 10 - Boxplot evidenciando os cinco gêneros mais abundantes presentes nas amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco

vermelho (P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

A análise das amostras nasais profundas, ao nível de filo revelou a presença

de 30 filos nas amostras respiratórias, sendo estas dominadas por Proteobacteria,

Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes (Figura 13a). A abundância relativa do filo

Proteobacteria foi maior em F1 (MD = 0.297, IIQ = 0.13) que F2 (MD = 0.195, IIQ =

0.084) (P = 0.001). Já o grupo Bacteroidetes foi mais abundante em F2 (MD = 0.120,

IIQ = 0.059) que em F1 (MD = 0.053, IIQ = 0.035) (Figura 11).

78

Figura 11 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um

asterisco vermelho (P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Por fim, a análise das amostras nasais profundas ao nível de gênero, revelou

10 grupos mais frequentes, principalmente Escherichia, Eubacterium, Acinetobacter,

Streptococcus, Bacillus e Bacteroides (Figura 13b). Eubacterium foi mais abundante

em F1 (F1: MD = 0.121; IIQ = 0.077/. F2: MD = 0.040; IIQ = 0.143). Bacteroides (F1:

MD = 0.022; IIQ = 0.011/ F2: MD = 0.051; IIQ = 0.025) e Clostridium (F1: MD = 0.021;

IIQ = 0.020/ F2: MD = 0.058; IIQ = 0.024) foram mais abundantes na F2 (P = 0.0002;

P = 0.0003, respectivamente). Pseudomonas (F1: MD = 0.013; IIQ = 0.005/ F2: MD =

0.007; IIQ = 0.006) e Enterobacter, (F1: MD = 0.0008; IIQ = 0.000/ F2: MD = 0.0005;

IIQ = 0.001) no entanto, foram mais abundantes em F1 (P = 0.01; P = 0.02,

respectivamente) (Figura 12).

79

Figura 12 - Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais,

Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05)

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

80

Figura 13 – Abundância relativa de filos e gêneros entre fazendas e sítios anatômicos. Heatmaps demonstrando a abundância relativa dos filos (A) e

gêneros (B) mais abundantes determinados nas amostras fecais, ruminais e nasais de bovinos leiteiros das fazendas 1 e 2.

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

4.5.2 Resistoma

Após a filtragem dos dados, 549 grupos de resistência antimicrobiana, formados

por genes e operons foram detectados em todas as amostras. Os genes apresentaram

distribuição heterogênea entre as amostras, de forma que a maioria dos genes foram

detectados em poucas delas.

A fazenda 1 apresentou maior abundância relativa e maior prevalência de

resistência de drogas, biocidas, metais e multi-compostos que a fazenda 2. A alta

prevalência de genes de biocidas em F1 decorreu-se da presença das bombas de efluxo

ATP-Binding Cassette (ABC) de resistência multi-biocida (F1: média = 1,375; F2: média

0,628) e Resistance Nodulation Division (RND) (F1: média = 3,5; F2: média 1,581). Em

relação aos metais, a alta prevalência foi conferida pela resistência ao telúrio e por

resistência multi-metal, com destaque para a bomba de efluxo de resistência multi-metal

RND (F1: média = 0,438; F2: média 0,047). Genes caracterizados como de resistência

multi-composto para drogas e biocidas incluíram bombas de efluxo tipo RND e Major

Facilitator (MFS), os quais estiveram quase totalmente ausentes nas amostras de F2.

Mecanismos de resistência a aminoglicosídeos, beta-lactâmicos, glicopeptídeos,

macrolídeos e tetraciclinas foram mais abundantes na F1.

Em relação aos sítios anatômicos, as fezes apresentaram a maior diferença em

relação a abundância e prevalência de genes quando comparado às amostras ruminais

e nasais (estas apresentando a menor quantidade de genes) (P < 0.05).

4.5.3 Anotação funcional

A tabela 7 apresenta a mediana das funções únicas identificadas mi-faser para

cada sítio anatômico. O maior número de funções únicas foi identificado nas amostras

fecais de F2 (P = 0.05), mas nenhuma diferença na anotação funcional foi identificada

nas sequências do rúmen e nas amostras nasais entre as fazendas.

82

Tabela 7 - Número médio de funções únicas identificadas por fazenda e sítio anatômico (fezes, rúmen e swab nasal). IIQ: Intervalo interquartil.

Fazenda Fezes Rúmen Swab Nasal Mediana IIQ Mediana IIQ Mediana IIQ Fazenda A 765.50 152.25 693.50 101.50 109.50 127.50 Fazenda B 922.00 154.50 703.00 208.00 164.00 391.50

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Os 10 mais importantes E.C.s para cada classe nominal, foram estratificados por

fazenda e sítio anatômico. A tabela 8 apresenta a contagem normalizada das sequências

dos 10 E.C.s mais informativos nas fazendas, sendo esses mapeados em relação a vias

KEGG e funções biológicas, como metabolismo microbiano, síntese de

lipopolissacarídeos e receptor de sinalização de células T (Tabela 8). De maneira geral,

as enzimas descritas foram mais prevalentes na fazenda 2.

Tabela 8 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe

e via metabólica (KEGG), em relação às fazendas 1 e 2.

E.C. Classe Via Metabólica Fazenda 1

Fazenda 2

1.1.1.49

Oxidoreductase

Fosfato pentose; Metabolismo de glutationa; Vias metabólicas; Biosíntese de metabólitos secundários, Metabolismo microbiano em diversos ambientes

0

5.9

2.7.7.7 Nucleotidiltransferase DNA-directed DNA polymerase1 797 1010 2.8.4.3 Methilsulfanil transferase Envolvido na metilação do tRNA 343.5 403

6.3.5.5

Carbon-nitrogen ligase Metabolismo de pirimidina, alanina, aspartato e glutamato; Vias metabólicas

167.9

123.2

2.5.1.7

Alkiltransferase Metabolismo de amino açúcar e nucleotide açúcar; Biosíntese de peptideoglicano; Vias metabólicas

289.2

413.6

2.1.1.74 Methiltransferase Flavoproteina envolvida na modificação pós-tradução1

222.5 253

3.1.3.16

Phosphoric-monoester hidrolase

Sinalização de receptor de células T; Expressão e checkpoint de PD- L1 em câncer; Diferenciação de células Th1e Th2

3.4

6.5

2.3.1.191 Aciltransferase Biossíntese de lipopolisacarideo Vias metabólicas

6.6 6.5

2.7.7.8 Nucleotidiltransferase Polyribonucleotideo nucleotidyltransferase1

867.5 1065.4

2.4.2.14

Pentosiltransferase Metabolismo de purina; Metabolismo de alanina, aspartato

e glutamato; Vias metabólicas;

199.1

202.4

83

Biossíntese de metabólitos secundários

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

Os 10 E.C.s mais informativos em relação aos sítios anatômicos, os foram

mapeados em diversas vias KEGG, como metabolismo microbiano, metabolismo de

metano e degradação de parede de células vegetais (Tabela 9). De maneira geral, houve

diferença entre os sítios anatômicos, sendo as amostras de swab nasal, aquelas com

menores informações obtidas.

Tabela 9 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe

e via metabólica (KEGG), em relação aos sítios anatômicos

E.C. Classe Vias metabólicas Fezes Rúmen SNP

1.5.1.43 Oxidoreductase Metabolismo de arginina e prolina; Vias metabólicas

17.4 60.7 0

3.1.1.73 Carboxilic-ester

hidrolase Auxilia na quebra da hemicelulose da parede das células vegetais

46.7 717.5 0

1.1.1.271

Oxidoreductase

Metabolismo de frutose e manose; Metabolismo de amino açúcar e nucleotídeo açúcar; Vias metabólicas

104.9

265.2

0

5.4.2.11

Fosfotransferase

Glicólise/Gliconeogenese; Metabolismo de glycina, serina e treonina; Metabolismo de metano; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários; Metabolismo microbiano em diversos ambientes

33.1

287.7

247109

5.1.3.11 Epimerase Catalisa a interconversão entre D- glicose e D-manose1

45.5 190.6 0

1.1.1.192 Oxidoreductase Degradação de ácidos graxos 53.9 120.8 0 3.2.1.80 Glicosilase Metabolismo de frutose e manose 18.2 84.9 0

2.5.1.47

Alkiltransferase

Metabolismo de cisteína e metionina; Metabolismo de enxofre; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários; Metabolismo microbiano em diversos ambientes

652.1

1104.1

0

4.2.1.45

Liase Metabolismo de amino açúcar e nucleotídeo açúcar; Vias metabólicas

31.7

92.1

0

1.11.1.22 Peroxidase Protege as células da peroxidação lipídica

15.8 180 0

Fonte: Gaeta, 2020

84

Por fim, os 10 E.C.s mais informativos para a composição fazenda X sítio

anatômico, foram mapeados para metabolismo microbiano, metabolismo de

aminoácidos, reparo de DNA, checkpoints de expressão gênica e degradação de parede

de células vegetais (Tabela 10).

Tabela 10 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação a composição fazendas e sítios anatômicos

Fazenda 1 Fazenda 2

E.C. Classe Vias metabólicas Fezes Rúmen SNP2 Fezes Rúmen SNP2

1.4.7.1

Oxidoreductase

Metabolismo de glioxilato e dicarboxilato; Metabolisdo de nitrogênio; Metabolismo microbiano em diversos ambientes

214.9

770.2

0

123.3

744.2

377.4

6.5.1.2 DNA ligase Forma ligações fosfodiester, reparo de quebras em DNA simples fita1

529.4 363.9 0 613.2 348.5 327.1

6.3.5.4

Carbon-Nitrogen ligase

Metabolismo de alanina, aspartateo e glutamate; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários

85.4

452.3

0

21.33

524.4

0

3.6.1.27 Hidrolase Biossíntese de peptidoglicano 81.3 34.5 0 73.8 32.4 0

27.1.162 Fosfotransferase Degradação de lacto-N-biose/galacto-N-biose em Bifidobacterium longum1

145.3 51.4 0 178.1 24.8 0

4.2.2.23 Carbon-oxygen

liase Degradação de rhamnogalacturonan em Bacillus subtilis e Aspergillus aculeatus1

22.1 300.2 0 52.8 303.6 0

3.2.1.156 Oligosaccharide

reducing-end xilanase

Envolvido na quebra de hemicellulose na parede celular vegetal1

17.0

89.5

0

233.0

69.4

0

3.4.21.116

Peptide hidrolase Checkpoint regulatório de expressão gênica essencial na horação de esporos resistentes ao calor1

135.7

23.9

0

160.6

23.4

0

1.5.1.43 Oxidoreductase Metabolismo de arginina e prolina; Vias metabólicas

18.0 56.1 0. 13.6 66.3 0

3.1.1.96 Carboxilic-ester

hidrolase Cliva tRNAAla com carga incorreta; implicado na tolerância ao etanol 11

89.4 71.4 0 100.5 54.7 0

Fonte: Gaeta, N.C., 2021

86

4.6 ANÁLISE DA ÁGUA

4.6.1 Detecção de elementos tóxicos

A detecção dos metais pesados foi realizada em quatro pontos da bacia do

Rio Doce (incluindo a F1) e em um ponto na F2 (Tabela 11). O alumínio foi identificado

em todos os pontos avaliados. O ferro foi detectado somente nos dois primeiros pontos

da bacia do Rio Doce e na F2. Por fim, o mercúrio foi detectado somente na F2.

Tabela 11 - Tabela X. Detecção de alumínio (Al). Cromo (Cr), ferro (Fe), cobalto (Co), arsênio (As),

mercúrio (Hg) e cobre (Cu) em quatro pontos da bacia do Rio Doce (incluindo a fazenda 1) e a fazenda 2, utilizando WDXRF. Valores precedidos pelo sinal < significam que estão abaixo do limite

de quantificação da técnica.

Local Al

mg L-1

Cr

mg L-1

Fe

mg L-1

Co

mg L-1

As

mg L-1

Hg

mg L-1

Cu

mg L-1

Gualaxo 0,056 < 0,0003 0,039 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003

Fazenda 1 0,072 < 0,0003 0,015 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003

Campinas 0,006 < 0,0003 < 0,0007 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003

Gesteira 0,010 < 0,0003 < 0,0007 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003

Fazenda 2 0,095 < 0,0003 0,006 < 0,0002 <0,0036 0,003 < 0,0003

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

4.6.2 Detecção de bactérias resistentes a antibióticos na água

Após a triagem das amostras de água da Bacia do Rio Doce, houve o

isolamento de 31 cepas. Destas, 14 cepas apresentaram-se sensíveis a todos os

princípios testados. Das cepas que apresentaram resistência a algum dos antibióticos

testados (N=17), 64,7% (11/17) foram resistentes a sulfazotrim, 53,0% (09/17) a

ceftriaxona, 47,0% (08/17) a cefotaxima, 47,0% (08/17) a cefoxitina, 41,2% (07/17) a

ácido nalidíxico, 29,4% (05/147) a amoxicilina com ácido clavulânico, 17,6% (03/17) a

aztreonam, 17,6% (03/17) a cefepime, 11,8% (02/17) a gentamicina e 5,9% (01/17) a

ciprofloxacina. Três cepas apresentaram resistência a quatro classes de antibióticos

87

diferentes, sendo elas B2-C (cefalosporinas, penicilinas, monobactâmicos e

aminoglicosídeos), C2-C (monobactâmicos, aminoglicosídeos, sulfonamidas e

cefalosporinas) e F3-F (cefalosporinas, quinolonas, sulfonamidas e penicilinas),

caracterizando-se como multirresistentes (Figura 14).

Dois isolados de E. coli (B2-C e C3-F) e um isolado de K. variicola (C2-C)

apresentaram detecção fenotípica de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL)

com detecção molecular do gene blaCTX-M. Com os primers disponíveis no

laboratório no momento deste estudo, os genes blaCTX-M2 e blaCTX-M15 foram detectados

nas cepas B2-C e C2-C, respectivamente. Não foi possível confirmar a variante do

gene CTX-M presente na cepa C3-F (E. coli), indicando a presença de uma outra

variante. Estas três cepas foram submetidas ao sequenciamento do genoma inteiro e

os resultados são descritos mais adiante.

A triagem das amostras de água da F2 resultou no isolamento de quatro

cepas, sendo que três delas apresentaram resistência a algum antibiótico. A cepa C3

foi a única que apresentou perfil multirresistente (resistência a sulfazotrim, quinolonas,

cefalosporinas e monobactâmicos) (Figura 14).

88

Figura 14 - Perfil de resistência a antibióticos dos isolados obtidos nas amostras de água de oito pontos ao longo da Bacia do Rio Doce (incluindo F 1) e da F2, localizadas no estado de Minas

Gerais, Brasil. Três isolados apresentando perfil de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) estão assinalados com um asterisco

ATM: Aztreonan; ETP: Ertapenen; IPM: Imipenem; CIP: Ciprofloxacina; GEN: Gentamicina; AMI: Amicacina; MER: Meropenen; CAZ: ceftazidima; CFO: Cefoxitina; NAL: Ácido nalidíxico; SUT: Sulfazotrim; AMC: Amoxicilina + Ácido clavulânico; CTX: cefotaxima, CRO: ceftriaxona, COM: Cefepime. ESBL: Extended-spectrum beta-lactamase; GNNF: Gram-Negativa não fermentadora; Enterobactéria: cepas cujas espécies ou gêneros não foram detectados; R: resistente; I: intermediária; S: Sensível. **Localização da Fazenda 1.

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

4.6.3 Detecção de espécies resistentes a metal pesado na água

A CIM para os elementos tóxicos foi realizada em triplicata para a

determinação das concentrações a serem utilizadas nas placas de ágar MacConkey,

as quais foram 1024 µg/mL de arsenito de sódio, 4 µg/mL de cloreto de mercúrio, 2048

µg/mL de sulfato de cobre, 4 µg/mL de nitrato de prata, 512 µg/mL cloreto de cobalto

e 256 µg/mL de dicromato de potássio. Após o pré-processamento da água, foram

obtidos 74 isolados provenientes da água da Bacia do Rio Doce (incluindo F1) e 13

isolados de F2. Em relação às amostras da bacia do Rio Doce, foram obtidos mais

isolados provenientes da semeadura em placas com mercúrio (27,0%; 20/74) seguido

por arsênio (25,7%; 19/74), prata (24,3%; 18/74), cobalto (17,5%; 13/74), e cromo

89

(5,4%; 04/74). Na água de F2, foram obtidos isolados de placas com mercúrio (39%;

05/13), seguido por prata (23%; 03/13), arsênio (15%; 02/13), cobalto (15%; 02/13) e

cromo (08%; 01/13). Não foram obtidos isolados em placas contendo cobre.

Em todos os testes, ATCC 25922 (E. coli), ATCC 13883 (K. pneumoniae) e KP

535 (K. pneumoniae -controle positivo) foram utilizados como controles, a fim de que

se pudesse determinar quais cepas poderiam ser consideradas resistentes ao

elemento testado. Foram consideradas resistentes (ou candidatas à resistência) as

cepas que apresentassem CIM para As ≥ 1024 µg/mL, Hg ≥ 8 µg/mL, Cu ≥ 5096

µg/mL, Co ≥ 2048 µg/mL, Cr ≥ 1024 µg/mL e Ag ≥ 8 µg/mL.

Das 74 cepas testadas (bacia do Rio Doce, incluindo a fazenda 1), 47,3%

(35/74) apresentaram resistência a pelo menos um metal pesado (Tabela 13). Cerca

de 91,4% das cepas (32/35) apresentaram resistência a somente um elemento, sendo

84,4% (27/32) à As e 16,6% (05/32) à Hg. Três cepas apresentaram resistência a As

e Hg simultaneamente (Tabela 12).

Quanto às fazendas, 14 cepas foram isoladas a partir da água na região de F1,

sendo que somente seis apresentaram resistência a pelo menos um elemento tóxico.

Cerca de 83,3% (05/6) apresentaram resistência a As, e 16,7% (01/6) à As e Hg. Já

na água de F2, 13 cepas foram isoladas, das quais somente duas apresentaram

resistência à arsênio (Tabela 12).

90

Tabela 12 - Relação de cepas isoladas da água da Bacia do Rio Doce e a fazenda 2, apresentando resistência a ao menos um elemento tóxico estudado de acordo com o teste padronizado.

Local Placa ID Espécie CIM (µg/mL)

As Hg Cu Co Cr Ag

A As A2-F C. freundii ≥1024 1 2048 1024 256 4

A As A3-C S. marcensis ≥1024 2 2048 1024 512 4

A Hg A1-C A. caviae 256 16 2048 512 128 0.25

B Ag B4 E. coli ≥1024 1 >1024 512 128 4

B As B1-F E. asburiae ≥1024 1 2048 512 256 8

B Hg B1-C E. coli ≥1024 8 2048 512 128 4

C As C4-C P. monteilii 512 16 1024 1024 128 4

C Ag C6-C A. caviae ≥1024 1 2014 512 128 2

C Ag C4-F E. coli ≥1024 1 1024 512 256 4

C Co C2-F S. marcensis ≥1024 1 >1024 1024 256 4

D Co D1-C S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 512 4

D Co D2 C. freundii ≥1024 1 >1024 512 256 4

D As D3-F S. marcensis ≥1024 1 2048 512 256 2

D As D4-C R. ornithinolytica ≥1024 1 2048 1024 512 4

D As D2-F Enterobactéria ≥1024 1 2048 1024 512 4

D As D3-C R. ornithinolytica 512 16 2048 512 256 4

E Co E2-C S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 256 8

91

E As E1-F S. marcensis ≥1024 1 2048 1024 512 4

F As F6-C P. putida ≥1024 1 2048 512 128 1

F Cr F2-C Enterobactéria ≥1024 1 512 512 128 1

F Ag F5-F R. ornithinolytica ≥1024 1 2048 512 64 0.5

G As G5-C K. pneumoniae 512 8 >1024 512 128 4

G Ag G4-F K. pneumoniae ≥1024 1 2048 512 64 2

G Ag G6-C K. pneumoniae ≥1024 1 2048 512 128 4

G Co G1-F S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 512 8

G Hg G3-C E. asburiae ≥1024 8 2048 512 256 4

H Ag H5-F E. coli ≥1024 0,5 1024 1024 128 4

F1 As H3-F P. putida ≥1024 0.5 1024 1024 512 0.5

F1 Ag H5 E. coli ≥1024 0.5 1024 1024 128 4

F1 Co H2-C S. marcensis ≥1024 1 >1024 1024 512 4

F1 Co H1-C S. marcensis ≥1024 0.5 1024 1024 128 8

F1 Cr H3-C S. marcensis 512 32 2048 512 512 8

F1 Hg H9-F P. mosselii ≥1024 32 2048 512 256 8

F2 As Cont1-F E. coli ≥1024 0.25 1024 512 <4 2

F2 Ag Cont2-C A. baumanii ≥1024 0.5 1024 256 128 2

25922

C -

E. coli

32

1

1024

512

128

4

13883 C - K. pneumoniae 64 1 1024 512 256 4

92

535 C + K. pneumoniae ≥1024 8 2048 512 128 4

ID: identificação; Ferm: Fermentação de lactose; CIM: concentração inibitória mínima; As: arsênio; Hg: mercúrio; Cu: cobre; Co: cobalto; Cr: cromo; Ag: prata.

Em negrito: CIM semelhantes ao controle positivo.

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

93

Por fim, observou-se que cepas resistentes a arsênio foram detectadas

principalmente naquelas placas contendo arsênio, seguida de cobalto, prata e cromo.

Cepas resistentes a arsênio+mercúrio foram isoladas de todas as placas. Não houve

crescimento bacteriano nas placas suplementadas com cobre (Figura 15).

Figura 15 - Frequência de detecção de cepas resistentes a metais pesados (isoladas de amostras de

água) em relação a seleção utilizando placas suplementadas com os elementos tóxicos.

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

94

4.6.4 Presença concomitante de resistência a metais pesados e antibióticos

nos isolados

A figura 16 descreve a avaliação da presença concomitante de resistência a

metais pesados e antibióticos (7). Os isolados obtidos após a triagem para bactérias

resistentes a antibióticos (1) foram submetidos ao teste de sensibilidade a antibióticos

pela técnica de disco-difusão (2). Aqueles resistentes foram submetidos à

determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para metais pesados (3).

Concomitantemente, os isolados obtidos após a triagem para bactérias resistentes a

metais pesados (4) foram submetidos à determinação da CIM para metais (5). Aqueles

resistentes, foram submetidos ao teste de disco-difusão (6).

Figura 16 - Esquema demonstrando a sequência de etapas para estudo da presença concomitante de

resistência a antibióticos e metais pesados nos isolados de água.

Fonte: Gaeta, N.C.20201

Dos 38 isolados resistentes aos metais pesados, 60,5% (23/38) apresentaram

resistência a ao menos um antibiótico (Tabela 13). A maioria dos isolados resistentes

95

a arsênio, apresentaram resistência a CFO, AMC e CTX. Já a maioria daquelas

resistentes a mercúrio, também foram resistentes a NAL, CFO e AMC. A cepa B1-C

(Hg), resistente a mercúrio e arsênio, apresentou perfil ESBL, com detecção molecular

do gene blaCTX-M-2.

Notou-se que, das quatro cepas com perfil ESBL, 25% (01/04) apresentaram

resistência à As, 25% (01/04) à Hg e 50% (02/04) não apresentaram resistência a

nenhum dos elementos testados.

96

Tabela 13 - Presença concomitante do fenótipo de resistência a elementos tóxicos e antibióticos dos isolados obtidos a partir da triagem de amostras de

água da Bacia do Rio Doce (incluindo Fazenda 1) e Fazenda 2, Minas Gerais, Brasil.

Local ID Espécie Perfil Metal Perfil ATB Perfil ESBL

A A3-C (As) S. marcensis As AMC NEG

A A1-C (Hg) A. caviae Hg NAL, CFO, AMC NEG

A A2-F (As) C. freundii As AMC, GEN (I), CFO, AMP NEG

B B1-F (As) E. asburiae As CFO, AMC NEG

B B1-C (Hg) E. coli As, Hg CRO, CTX, GEN POS

B B2-C E. coli Hg GEN, SUT, ATM, CTX, CRO, CPM, CAZ (I) POS

C C2-F (Co) S. marcensis As AMC, CTX (I), CFO (I) NEG

C C4-C (As) P. monteilii Hg ATM (I), CFO, AMC, NEG

C C4-F (Ag) E. coli As CTX (I) NEG

C C2-C K. variicola NDN GEN, SUT, ATM, CTX, CRO, CPM, CAZ (I) POS

C C3-F E. coli NDN CTX, CRO, CPM, ATM (I) NEG

C C4-F P. mosselii As SUT, CIP, NAL, CTX, CFO POS

C C6-C (Ag) A. caviae As CFO, NEG

D D1-C (Co) S. marcensis As AMC, NEG

D D2-F (Ag) Enterobactéria As AMC, NEG

D D3-F (As) S. marcensis As CFO, AMC NEG

E E1-F (As) S. marcensis As AMC NEG

G G3-C (Hg) E. asburiae As, Hg NAL, CFO, AMC, NEG

G G5-C (As) K. pneumoniae Hg CTX (I) NEG

97

H H3-F (As) P. putida As SUT, ATM, NAL, CRO, CFO, CTX, CAZ (I) NEG

H H2-C (Co) S. marcensis As AMC NEG

H H1-C (Co) S. marcensis As AMC (I) NEG

H H3-C (Cr) P. aeruginosa Hg SUT, NAL, CRO, CFO, CTX, AMC NEG

H H9-F (Hg) P. mosselii As, Hg SUT, ATM, NAL, CRO, CFO, CTX, NEG

Ctrl 2-C (Ag) A. baumanii As ATM, CRO, CFO, CTX, CAZ, NEG

ATM: Aztreonan; ETP: Ertapenen; IPM: Imipenem; CIP: Ciprofloxacina; GEN: Gentamicina; AMI: Amicacina; MER: Meropenen; CAZ: ceftazidima; CFO:

Cefoxitina; NAL: Ácido nalidíxico; SUT: Sulfazotrim; AMC: Amoxicilina + Ácido clavulânico; CTX: Cefotaxima, CRO: Ceftriaxona, CPM: Cefepime. ESBL:

Extended-spectrum beta-lactamase; GNNF: Gram-Negativa não fermentadora; Enterobactéria: cepas cujas espécies ou gêneros não foram detectados; I:

intermediária; Ag: Prata, As: Arsênio, Hg: Mercúrio; Faz1: Fazenda 1; Faz2: Fazenda 2.

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

98

4.7 ANÁLISE GENÔMICA DE CEPAS REPRESENTATIVAS

O sequenciamento do genoma inteiro foi realizado em cinco cepas

representativas (B2-C(CRO), C3-F(CRO), C2-C(CRO), B1-C(Hg) e C4-F(As),

utilizando as plataformas Miseq e NextSeq Illumina.

4.7.1 Escherichia coli

A análise da cepa B2-C (CRO) revelou esta pertencendo ao ST219, sorogrupo

O-:H16 e filogrupo E. A presença do gene blaCTX-M-2, foi confirmada, bem como a

presença de genes de resistência a tetraciclina, sulfonamidas e aminoglicosídeos

(fenótipos confirmados com teste de disco difusão). Quanto a outros antimicrobianos,

a análise genética revelou a presença de genes de resistência a metais pesados e

biocidas, tais como operon de resistência ao mercúrio, níquel, cobre, arsênio, zinco,

biocidas e metais, e multi-metal. O gene qacE∆1 também foi detectado. Vale ressaltar

que os genes blaCTX-M-2, tetAR e sul1, qacE e àqueles relacionados a resistência

ao mercúrio encontram-se próximos e presentes no mesmo contig (contig 36), assim

como um elemento genético móvel (ISEc58). Ainda, plasmídeo de incompatibilidade

(IncF) também foi detectado, sendo o IncFII presente no contig 36. Importantes genes

de virulência, tais como aqueles relacionados a Salmochelina, Colicina V, Fimbria Tipo

1, Receptor de membrana heme/hemoglobina, Sobrevivência no soro, invasão,

Hemolisina E, enterotoxina-1 calor resistente, e pilus comum de E. coli (Tabela 14)

também estão presentes.

A cepa B1-C (Hg) apresenta características muito semelhantes a cepa B2-C

(CRO). Entretanto, em B1-C foi detectado o gene arsA e somente os genes de

resistência a tetraciclina, beta-lactâmicos e mercúrio estão presentes no mesmo

contig (Contig 42), assim como o plasmídeo IncFII. Já os genes relacionados a

resistência a sulfa e a quartenário de amônio estão juntos em outro contig (contig 61).

A análise da cepa C3-F revelou que esta pertence a ST155. Confirmou-se a

presença do gene CTX-M, sendo esta da variante CTX-M-55. Detectou-se a presença

de genes de resistência a níquel, arsênio cobre, zinco e teilurito. Foram detectados 2

99

plasmídeos, IncFII(pHN7A8) e Col440II. Observou-se a presença dos genes

blaCTXM-55 e blaTEM-141 presentes no mesmo contig (contig 45), assim como um

elemento genético móvel (IS26). Das cinco cepas sequenciadas, esta foi a única em

que o processo de conjugação foi possível, havendo a transferência do perfil ESBL

para a bactéria receptora.

Por fim, a cepa C4-F revelou a inexistência de quaisquer genes de resistência

a antibiótico, característica observada pelo fenótipo. Ainda, nenhum plasmídeo foi

observado nesta cepa. Mutação cromossômica pontual foi detectada no gene parE

(Tabela 15). Os genes de resistência ao arsênio arsABCDR foram detectados,

confirmando-se o fenótipo observado no teste de sensibilidade a antimicrobianos pelo

método de microdiluição em caldo (MIC).

100

Tabela 14 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST e sorotipo de alguns isolados de E. coli obtidos a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas Gerais, Brasil.

ID Antibióticos CPM Genes metais

pesados

Outros

compostos Virulência Plasmídios pMLST MLST Sorotipo Filogrupo

FimH/

FumC

B2-C

(CRO)

blaCTX-M2,

tetAR, sul1,

aac(3)-VIa

None

merRTPCAD,

nikBCDE,

pcoABCDER,

cusABCFRS, cueOR,

copA, silABCEFRS,

arsRBC, zntA, zitB,

zraPRS, tehAB

qacE

IronBCDEN,

FimH, astA,

ecpBCDER,

gadX, mchF,

traT, sitA

IncF

(FII e FIB)

F24:A-:B1

ST219

O_:H16

E

FimH370

FumC53

B1-C

(Hg)

CTX-M2,

tetAR, sul1,

aac(3)-Via,

None

merRTPCAD,

nikBCDE,

pcoABCDR,

cusABCFRS, cueOR,

copA, silABEFPRS,

arsABC, zntAR, zitB,

zraPRS, tehA,

qacE

IronBCDEN,

FimH, astA,

ecpABCDER,

sitA traA,

chuA,

IncFIB

F24:A-:B1

ST219

O_:H16

E

FimH370

FumC53

C3-F

CTX-M55

None

arsRBC, cueR, copa,

cusABCFRS,

nikBCDE, zntA,

zraPRS,

None

FimH, lpfA,

traT

IncFII,

Col440I,

Col440II

F33:A-:B-

ST155

H51:O86

B1

FimH32

FumC4

C4-F

None

parE,

arsRDABC,

nikBCDE, nikBCDE,

cusABCFRS,

None

chuA,

FimH,

ompT, sitA

None

None

ST10284

O22b:H49

D

FimH54

FumC302

101

cueOR, tehA, zntAR,

zraPRS

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

102

4.7.2 Klebsiella pneumoniae Complex

Uma cepa pertencente ao Complexo Klebsiella pneumoniae foi sequenciada

para análise genética mais aprofundada.

A cepa C2-C, pertencente à espécie K. variicola subsp. variicola apresentou

12 genes de resistência a antibióticos, sendo o gene blaLEN16 presente em todas as

espécies do complexo. Para os antibióticos não testados anteriormente, cujos genes

de resistência foram detectados, o fenótipo foi posteriormente confirmado pelo teste

de disco-difusão. Mutações pontuais em cromossomos (acrR, ompK36 e ompK37)

foram detectados e a cepa, ainda, apresentou plasmídeos dos grupos IncF e IncH

(Tabela 15). Por fim, vale ressaltar que os genes aac(3)-IId, tet(D), blaCTX-M-15 e

blaTEM-1B estão no mesmo contig (contig 36). Já no contig 40, estão sul1, aadA2,

ere(A) e dfrA32. Os genes blaLEN16, fosA, oqxAB, estão nos contigs 6, 14 e 2,

respectivamente. Esta cepa foi classificada como ST 175, sendo um novo Sequence

Type.

103

Tabela 15 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST, wzi, e k_O locus da cepa C2-C (K. variicola subsp. variicola) obtida a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas Gerais, Brasil.

ID

Genes

antibióticos

Chromosomal

point

mutation

Genes

metais

pesados

Genes

outros

compostos

Plasmídio

pMLST

MLST

WZI

K_O

locus

C2-C

blaCTX-M-15,

blaTEM-1B,

blaLEN16,

fosA, oqxA,

oqxB, aac(3)-

IId, tet(D),

sul1, aadA2,

ere(A), dfrA32

acrR, ompK36,

ompK37

arsB,

copa,

terABCDE,

CusA,

CusR

qacE∆,

qacF

IncFII_1pKP91,

IncFIB(K)_Kpn3,

IncHI1B_1_pNDM-MAR,

IncFIB(Mar)_1_pNDM-

Mar

IncF

[K25:A-:B-]

175

161

KL13_O5

*Locus non detected.

Fonte: Gaeta, N.C. 2021

.

104

5 DISCUSSÃO

No presente trabalho avaliou-se as consequências da exposição prolongada de

bovinos leiteiros a água da bacia do Rio Doce, impactada por elementos tóxicos devido

a atividade extrativista constante, ao histórico recente de acidente ambiental e ao

despejo de resíduos agropecuários e domésticos. Para isso, os animais foram

avaliados fisicamente, e deles, obteve-se dados quanto as funções renal e hepática e

concentração sérica de metais pesados, microbiota e resistoma em amostras nasais,

ruminais e fecais. Além disso, fez-se a avaliação da água de bebida dos animais (rio)

como potencial veículo de contaminação por metais pesados e disseminador de

bactérias resistentes a antimicrobianos. Pela metagenômica, observou-se diferenças

na composição bacteriana dos animais e maior abundância e prevalência de genes

de resistência a antimicrobianos nos bovinos de Mariana. Por técnicas cultivo-

dependentes, bactérias resistentes a antibióticos e metais pesados foram identificadas

principalmente na bacia do Rio Doce. Ainda, alumínio e ferro foram detectados na

água de bebida e alumínio no soro dos animais, porém em baixas concentrações.

5.1 SAÚDE BOVINA

É sabido que a região da bacia do Rio Doce apresenta alta concentração de

arsênio naturalmente devido a presença de rochas que hospedam depósitos auríferos

sulfetados (BORBA et al., 2004; SANTOLIN, 2015). Mesmo assim, este elemento

apresentou-se em baixa concentração no soro dos animais, utilizando a técnica de

fluorescência de raio-X. Este dado, somado a ausência de manifestações clínicas de

qualquer intoxicação por metais pesados, indica que, no momento deste estudo, esses

elementos não estavam sendo ingeridos em quantidade e concentração tais que

levem a intoxicações bovinas de caráter agudo. Para determinar a presença do

processo de bioacumulação (principal responsável pela concentração de elementos

tóxicos nas células animais) (ALI; KHAN, 2019) e a possibilidade de ocorrência de

intoxicações crônicas, seria necessária a detecção destes elementos em tecidos

bovinos (como o fígado). Esta etapa, no entanto, é suplementar a este trabalho, e, por

105

isso, ressalta-se a necessidade de novos estudos na área. Vale ressaltar que um dos

objetivos da presente pesquisa era implementar para bovinos, uma nova metodologia

recentemente utilizada para soro de aves para identificação de elementos tóxicos

utilizando WDXRF. Esta técnica de fluorescência de raio-X, embora utilizada na área

da geologia, é pouco utilizada na área médica (CUSTÓDIO et al., 2005). Ao nosso

conhecimento, ainda não havia sido utilizada na área veterinária para a detecção de

elementos tóxicos em amostras clínicas bovinas. Dado as suas vantagens (ausência

de resíduos químicos, ausência de perda de amostra e resultados obtidos

rapidamente), esta técnica deve ser mais explorada como uma alternativa na

ocorrência de situações onde rápidas respostas são necessárias, como em acidentes

ambientais envolvendo elementos nocivos à saúde.

A análise do perfil renal e hepático dos bovinos também foi realizada, de modo

a complementar os achados observados no exame físico e no WDXRF, e se os

animais apresentam indícios de mau funcionamento e/ou lesão hepática e renal. No

presente trabalho, AST (0-132 U/L), creatinina (1,0-2,0 mg/dL) e bilirrubina total (0,01-

0,5 mg/dL) apresentaram-se mais elevadas nos animais da fazenda 1, e ureia (23-58

mg/dL) e proteína mais elevadas na fazenda 2, embora dentro dos valores

considerados normais para a espécie. A enzima aspartato aminotransferase (AST) é

liberada na corrente sanguínea devido a lesão na membrana de células do fígado,

músculos esqueléticos, coração, rins, cérebro e hemácias (CONSTABLE et al., 2017).

Estando presente em tantos tecidos, a utilização desta enzima como parâmetro para

avaliação do funcionamento hepático só é válida quando da presença dos resultados

de outras enzimas mais específicas. Vale a pena ressaltar que em bovinos adultos,

outras enzimas como gama glutamiltransferase, são úteis na detecção de animais com

doença hepática crônica. Uma das possíveis causas de aumento da bilirrubina total, é

a obstrução canalículo biliar (CONSTABLE et al., 2017). Ureia e creatinina são

metabólitos que podem ser utilizados para avaliar a função renal. A ureia, por si, é o

produto final do metabolismo proteico que é excretado pelos rins e que também pode

ser utilizado para verificar o aporte proteico da dieta. Como já descrito, todos os

parâmetros enzimáticos e metabólicos avaliados apresentaram-se dentro da

normalidade para a espécie. Uma limitação deste estudo foi a não verificação da

concentração desses elementos no solo e na alimentação dos animais. No entanto,

omado a concentração dos elementos tóxicos no soro e a avaliação física, observa-

106

se que, no momento da amostragem, os animais não apresentaram nenhuma

evidência de intoxicação.

5.2 MICROBIOMA, RESISTOMA E ANOTAÇÃO FUNCIONAL

A exposição prolongada a metais pesados aparenta interferir na microbiota fecal

dos bovinos leiteiros ao nível “filo”. Firmicutes é descrito como o filo mais abundante

em amostras fecais de vacas leiteiras em diversos estudos não relacionados a

contaminação com elementos tóxicos (LIU et al., 2016; XU et al., 2017; HAGEY et al.,

2019). Entretanto, no presente trabalho este filo foi o mais abundante em F2. De

maneira geral, pesquisas descrevem gêneros como Clostridium, Bacteroides,

Ruminococcus, Prevotella, Enterococcus spp., dentre outros, como os mais

abundantes nas amostras fecais (Dowd et al., 2008). Na presente pesquisa,

Bacteroides, Escherichia, Clostridium, Prevotella, Bacillus, Eubacterium e

Ruminococcus, foram os gêneros mais abundantes em ambas fazendas, dos quais

Clostridium, Bacillus Eubacterium, Ruminococcus e Enterococcus foram mais

presentes na fazenda 2. Utilizando roedores como modelo experimental, BRETON et

al., (2013) demonstraram que a microbiota desses animais foi modificada após a

exposição a metais pesados, provavelmente pela ação dos elementos não absorvidos.

Ainda, a avaliação das consequências da exposição prolongada a metais pesados

revelou a diminuição da diversidade de espécies e da população de bactérias

probióticas presentes na microbiota intestinal de Bufo raddei (sapo mongol) (ZHANG

et al., 2016). Nossos dados sugerem que a exposição prolongada a água contaminada

com elementos tóxicos também pode interferir na microbiota de bovinos leiteiros ao

nível “gênero”, provavelmente devido a presença de grupos bacterianos mais ou

menos sensíveis aos elementos.

Com a análise do fluido ruminal ao nível “filo” verificou-se que Bacteroidetes e

Firmicutes foram os mais abundantes. A microbiota ruminal é geralmente composta

principalmente por bactérias Gram-negativas quando os animais são alimentados com

dietas ricas em forragem. (HUNGATE, 1966) e os resultado do presente estudo

confirmam este dado, já que aos animais de ambas fazendas, era fornecida uma dieta

baseada em forragem. Fibrobacter succinogenes (gênero Fibrobacter) são bactérias

107

produtoras de butirato que estão presentes no rúmen e o gênero Fibrobacter estava

mais presente nos bovinos de F1 que F2. Prevotella e Bacteroides foram os gêneros

mais abundantes em todas as amostras deste estudo. Prevotella tem sido reportada

como o gênero mais abundante no rumen (CHAUCHEYRAS-DURAND; OSSA, 2014;

JAMI; WHITE; MIZRAHI, 2014; LIMA et al., 2015; TONG et al., 2018), cujas espécies

estão relacionadas a degradação de amido, hemicellulose e proteína (HENDERSON

et al., 2015). Prevotella, que também já foi positivamente correlacionada a produção

de leite, apresentou-se mais abundante na F2. Neste trabalho, Ruminococcus foi mais

abundante na F1 e Eubacterium na F2, embora não significantes. Tong et al., (2018)

demonstraram elevadas abundâncias de Ruminococcus 2 e Eubacterium

coprostanoligenes em vacas de alta produção. Eubacterium já foi associado a baixo

consumo residual de ração (ELOLIMY et al., 2018), e esse gêneros estão relacionados

a degradação de celulose no rumen e algumas espécies, na síntese de butirato (FLINT

et al., 2007), fonte de energia para os bovinos. Aqui, se hipotetizou que a baixa

abundância de Eubacterium e Prevotella na F1 pode estar contribuindo para a baixa

produção leiteira reportada na F1, na qual, antes do acidente, produziam-se 250 L

leite/dia e, mais recentemente 200 L leite/dia.

Pesquisas com amostras da nasofaringe são frequentemente conduzidas para

entender a doença respiratória bovina ou para verificar as mudanças na microbiota

dessa região anatômica de bovinos confinados. Este é o primeiro trabalho que

comparou a microbiota nasal de vacas leiteiras criadas em um ambiente

potencialmente contaminado com metais pesados e um não contaminado, utilizando

animais sem manifestações de doenças respiratórias. Ao nível “filo”, observou-se

Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, e Bacteroidetes como os grupos mais

abundantes. Resultados similares foram descritos por LIMA et al., (2016) e GAETA et

al., (2016), em cujos estudos o filo Proteobacteria foi o mais abundante tanto em

animais sadios quanto àqueles com doença respiratória bovina. Em relação aos

gêneros, Eubacterium, Streptococcus, Acinetobacter e Bacillus foram os principais

grupos observados no presente estudo. Esses achados estão de acordo com o que

tem sido reportado na literatura, sendo o Acinetobacter comumente detectado na

microbiota nasofaringea de bovinos (GAETA et al., 2016; HOLMAN et al., 2017;

ZEINELDIN et al., 2017). O gênero Streptococcus (em particular a espécie S.

pneumoniae) é comumente relacionado a pneumonia em humanos (JAIN et al., 2015),

e tem sido detectado no trato respiratório bovino (KLIMA et al., 2019). Bacillus são

108

bactérias presentes no ambiente que podem ser inaladas pelos bovinos e, portanto,

detectadas no trato respiratório Algumas espécies deste gênero produzem peptídeos

antimicrobianos (SHELBURNE et al., 2006) que inibem o crescimento in vitro de P.

multocida, M. haemolytica, e H. somni (Xie et al., 2009), patógenos importantes

relacionados a doença respiratória bovina. A presença de Bacillus como um dos

gêneros mais abundantes na região nasofaringea dos bovinos estudados nesta

pesquisa, pode estar relacionada a baixa abundância de Pasteurella, Mannheimia, e

Histophilus e, consequentemente, pode ter contribuído para a ausência de animais

com manifestações clínicas de acometimento do sistema respiratório.

A persistência prolongada e a continua deposição de metais pesados no

ambiente (ex. fonte de água e solo) permite a interação microbiana e a transferência

de genes de resistência, potencializando o aparecimento de bactérias resistentes a

antimicrobianos nos animais de produção e o aumento da exposição humana a estes

genes de resistência por meio da cadeia de produção (produção primária, indústria de

alimentos e ambiente doméstico) (ONICIUC et al., 2019; PÉREZ-RODRÍGUEZ;

MERCANOGLU TABAN, 2019). Bombas de efluxo são sistemas de proteínas

relacionadas a resistência cruzada (BAKER-AUSTIN et al., 2006; MARTINEZ et al.,

2009), já que diversas moléculas de antimicrobianos (como metais pesados e

antibióticos) são lançadas para fora da célula pelo mesmo sistema. Em bactérias

Gram-negativas (como E. coli, C. jejuni e P. aeruginosa), os sistemas proteicos de

importância clínica são membros da superfamília RND. Já nas bactérias Gram-

positivas e micobactérias, como S. aureus, Bacillus spp. e M. tuberculosis, os sistemas

são principalmente das superfamílias Major Facilitator Superfamily (MFS) e ATP-

Binding Cassettes (ABC) (PIDDOCK, 2006; ROUTH et al., 2011). Os resultados do

presente trabalho sugerem que tanto os mecanismos de resistência cruzada quando

de co-resistência podem estar ocorrendo mais em F1 devido à alta prevalência das

bombas de efluxo (incluindo multi-metal resistance RND e multi-biocide resistance

ABC), além de proteínas conferindo resistência a diversas classes de antibióticos,

elevados possivelmente pela contaminação ambiental. Ainda, a detecção de vários

mecanismos de resistência alerta para a possível presença de bactérias multidroga

resistentes nas fezes e rúmen podendo contaminar o leite cru (AMAGLIANI et al.,

2012; RIBEIRO et al., 2019), carcaças, superfícies de abatedouros, profissionais e

consumidores, fatos que estão bem documentados na literatura (MCEVOY et al.,

2003; SCHLEGELOVÁ et al., 2004; ATNAFIE et al., 2017; SAVIN et al., 2020).

109

O desenvolvimento de resistência a antimicrobianos é um evento natural que

pode ser exacerbado pela administração terapêutica, como metafilaxia, profilaxia e/ou

de promotores de crescimento (PÉREZ-RODRÍGUEZ; MERCANOGLU TABAN,

2019). No presente trabalho, verificou-se que as fezes apresentaram a maior presença

de genes de resistência quando comparado às amostras de fluido ruminal e nasal,

implicando na amostragem de futuros trabalhos que utilizarão shotgun sequencing.

A relação simbiótica entre as comunidades bacterianas ruminais é responsável

pela produção de proteína microbiana pela utilização de amônia. A assimilação de

amônia ocorre principalmente por duas vias, as quais a participação da enzima

glutamato sintetase é fundamental. Esta enzima é classificada de acordo com o

doador de elétrons: dependente de DADH e dependente de NADPH e esta enzima é

comumente encontrada em várias bactérias. A glutamato sintetase dependente de

ferredoxina é detectada em cianobactérias (PENGPENG; TAN, 2013). No presente

trabalho, os resultados mostraram que a glutamate sintetase dependente de

ferrodoxina (E.C. 1.4.7.1) estava super-representada no rúmen das amostras de

ambas fazendas, e nas amostras nasais, na F2. Cyanobacteria estava super-

representada em duas amostras na F2 o que pode explicar o resultado observado

nesse sítio anatômico. A enzima asparagine sintetase dependente de glutamina (E.C.

6.3.5.4), e que também é identificada na via de utilização de amônia nas bactérias

ruminais (PENGPENG; TAN, 2013), estava super-representada na F2, nas amostras

ruminais. Ainda, com a concomitante presença de glutamato sintetase dependente de

ferrodoxina, sugere que a produção de proteína microbiana no rúmen dos bovinos

leiteiros da F2 está aumentada

A 2,3-difosfoglicerato dependente de fosfoglicerato mutase (E.C. 5.4.2.11)

estava super-representada no rúmen quando comparado as amostras fecais, mas sua

presença estava notadamente mais evidente nas amostras nasais, e provavelmente

independente da fazenda. Esta enzima independente de metal, que está presente em

vertebrados, leveduras e diversas bactérias, como Haemophilus influenzae, participa

dos processos de glicólise e gliconeogênese e metabolismo de metano (JEDRZEJAS,

2000). Ainda, a enzima DNA ligase (E.C. 6.5.1.2) estava presente nas amostras fecais

e ruminais, mas super-representada nas amostras nasais da F2. Esta enzima,

comumente encontrada em bactérias, participa na replicação de DNA pela formação

de pontes fosfodiester e na reparação do DNA. Já a enzima glicose 6-fosfato

dehidrogenase dependente de NADP (E.C. 1.1.1.49), que apresentou-se super-

110

representada na F2 participa da via fosfato pentose que produz, principalmente,

NADPH e ribose-5-fosfato, um precursor dos ácidos nucleicos (STANTON, 2012).

Finalmente, a DNA polimerase DNA direcionada (E.C. 2.7.7.7), também apresentou-

se super-representada na F2 e é responsável pela síntese de novas fitas de DNA pela

adição de nucleotídeos (ROETTGER, M.P.; BAKHTINA, M.; KUMAR, S.; TSAI, 2010),

e também está implicada no reparo de DNA. Assim, esses achados permitem inferir

que as vacas da F2 apresentam replicação bacteriana mais ativa que na F1 e as

bactérias da F1 são mais suscetíveis a mutação e morte celular, já que nelas a

habilidade de manutenção da integridade do DNA está diminuída. Assim, mais

pesquisas são necessárias para entender as diferenças no metabolismo bacteriano e

o comportamento em vacas de regiões potencialmente contaminadas e não

contaminadas com elementos tóxicos. É importante mencionar que as amostras

nasais se caracterizaram pela alta variação na anotação funcional, a qual pode ser

relacionada a baixa qualidade do DNA e dificuldade de extração de DNA dos swabs.

Para melhor entender o que está ocorrendo no ambiente nasofaríngeo, amostragens

e protocolos de extração precisam ser otimizados para obtenção de amostras mais

representativas.

5.3 ELEMENTOS TÓXICOS NA ÁGUA

O Conselho Nacional do Meio ambiente (CONAMA) determina que rios

semelhantes àqueles que compõe a bacia do Rio Doce apresentem como valores

máximos: 0,2 mg L-1 para o alumínio, 0,033 mg L-1 para o arsênio, 0,2 mg L-1 para

cobalto, 0,013 mg L-1 para cobre, 0,05 mg L-1 para cromo, 5,0 mg L-1 para ferro e 0,002

mg L-1 para mercúrio, dentre outros elementos (CONAMA, 2005). No presente

trabalho, os limites de detecção para cada um dos elementos na metodologia

padronizada (WDXRF) e utilizada foram: 0,0005 mg L-1 alumínio, 0,0036 mg L-1 para

arsênio, 0,0003 mg L-1 para cromo, 0,0002 mg L-1 para cobalto, 0,0007 mg L-1 para

ferro, 0,0003 mg L-1 para cobre e 0,0015 mg L-1 para mercúrio. Estes limites de

quantificação estão bem abaixo dos limites estabelecidos CONAMA, garantindo a

segurança dos resultados. No presente trabalho, as concentrações de alumínio

detectadas em todos os pontos estão abaixo dos limites estabelecidos pelo CONAMA.

111

Nossos resultados são mais baixos que aqueles descritos por CARVALHO et al.,

(2017), os quais analisaram a água da Bacia do Rio Doce após 2 anos do acidente,

utilizando espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS).

Os autores verificaram alta concentração de chumbo (0,013-0,097 mg L-1), arsênio

(0,012-0,911 mg L-1), níquel (0,051-1,078 mg L-1), alumínio (0.465-9,432 mg L-1), cobre

(0,062-1,427 mg L-1) e manganês (0,041-1,638 mg L-1), muitos deles acima dos limites

estabelecidos pelo CONAMA.

De acordo com o Nutrient Requirements of Dairy Cattle (NRC, 2001), existem

concentrações de alguns elementos potencialmente tóxicos e contaminantes na água

oferecida aos animais que são consideradas seguras para os bovinos, sendo eles

alumínio (0,5 mg L-1), arsênio (0,1 mg L-1), cromo (0,1 mg L-1), cobalto (1,0 mg L-1) e

mercúrio (0,01 mg L-1). No presente trabalho, o limite de detecção para esses

elementos é mais baixo que os valores limites, indicando a segurança desta técnica.

Utilizando o WDXRF, as amostras colhidas em 2018 apresentaram alumínio, porém

em concentrações mais baixas que os valores estabelecidos pelo NRC. Vale ressaltar

que, os bovinos da F1 estão no rebanho desde o acidente, de modo que houve

provável ingestão de água com alta concentração desses elementos tóxicos ao longo

dos anos, principalmente em períodos próximos ao momento do acidente.

5.4 BACTÉRIAS ISOLADAS DA ÁGUA DE BEBIDA

O estudo da água de bebida dos animais foi fundamental para avaliação desta

como fonte e veículo de transmissão de bactérias resistentes a antimicrobianos a

todos os seres vivos que dela se utilizam. Para isso, utilizou-se métodos de cultivo e

isolamento de bactérias Gram-negativas aeróbias. Pela presença da membrana

celular externa, este grupo bacteriano é geralmente mais resistente a antibióticos que

o grupo das Gram-positivas (EXNER et al., 2017). Ressalta-se, ainda a grande

importância de algumas espécies Gram-negativas na saúde pública (BREIJYEH;

JUBEH; KARAMAN, 2020), como, por exemplo, E. coli, K. pneumoniae and A.

baumannii.

Na presente pesquisa, microrganismos resistentes a sulfonamidas, beta-

lactâmicos, aminoglicosídeos e/ou fluoroquinolonas foram isolados em ambas

112

regiões, entretanto, o número de bactérias resistentes a antibióticos isolados na água

obtida na bacia do Rio Doce (incluindo F1) foi maior que naquela obtida na F2. Em

2019, outro acidente envolvendo rompimento de barragem de mineração ocorreu na

cidade de Brumadinho, Estado de Minas Gerais (há 127 km de Mariana/MG)

espalhando milhões de metros cúbicos de rejeitos e lama no meio ambiente e no rio

Paraopeba. Ao estudar amostras de solo, sedimento e água dessa região (em áreas

acometidas e não acometidas pelo acidente), por meio de PCR em Tempo Real,

FURLAN et al.,(2020) detectaram 29 genes de resistência a beta-lactâmicos,

quinolonas, aminoglicosídeos, tetraciclinas, sulfonamidas, fenicóis, macrolídeos,

glicopeptídeos, além de genes relacionados ao perfil de beta-lactamase de espectro

estendido. Os autores ressaltaram ainda, que a abundância dos genes de resistência

a antibióticos foi maior nos locais acometidos pelos rejeitos e concluíram que o

acidente resultou no aumento da quantidade e da abundância desses genes no

ambiente. Na presente pesquisa, não foi possível obter amostras de regiões não

acometidas pelos rejeitos de minério na bacia do Rio Doce, mas utilizou-se uma

amostra do mesmo estado, cuja região não apresenta nenhum histórico de

contaminação por metais pesados. A partir dos nossos resultados, sugere-se que,

apesar do desenvolvimento de resistência a antimicrobianos ser um processo natural

dos microrganismos, o contínuo despejo de esgoto doméstico, resíduos

agropecuários, resíduos de mineração de ouro, somado aos milhões de metros

cúbicos de rejeito de minério de ferro despejados após o rompimento da barragem do

Fundão, em 2015, esteja relacionado a este maior número de bactérias resistentes

detectadas na bacia do Rio Doce. Como outra evidência para este fato, os dados do

resistoma bovino indicaram maior prevalência e abundância de genes de resistência

a antimicrobianos nas amostras fecais, ruminais e nasais dos bovinos de Mariana/MG.

Aos microrganismos adquiridos por meio da alimentação, ar inalado e por meio da

lambedura da pele, a água mostrou-se uma importante fonte direta de bactérias

resistentes a antimicrobianos.

A análise da sensibilidade dos isolados a metais pesados também foi realizada.

Ao nosso conhecimento, o presente trabalho é primeiro que objetivou este estudo na

região de Mariana, Minas Gerais, Brasil. Vários isolados apresentaram CIM para

mercúrio e arsênio, igual ou maior que o controle positivo, sendo considerados,

portanto, tolerantes a estes elementos. A exploração de ouro, hoje realizada de

maneira menos acentuada, foi uma atividade muito exercida durante a ocupação da

113

região. Sabe-se que para tal, o mercúrio (em sua forma metálica – metilmercúrio) é

ainda muito utilizado pelos garimpeiros na separação do minério dos demais

sedimentos do rio (ROESER; ROESER, 2010), mesmo com a publicação do Decreto

N°97 507/1989, que veta o uso deste elemento na extração do ouro, exceto em

atividade licenciada. Ainda, como citado anteriormente, já é sabido que a região

apresenta naturalmente níveis maiores de arsênio devido a presença de rochas que

hospedam depósitos auríferos sulfetados (BORBA et al., 2004; SANTOLIN, 2015).

Assim, a detecção de bactérias tolerantes a estes elementos já era esperada. Em um

trabalho semelhante realizado na Bacia do Araçá, no Estado de São Paulo, a maioria

dos isolados apresentaram elevado CIM para Cr (400 - 3200 µg/mL), seguido de Zn

(25-1600 µg/mL), Cd (12,5-400 µg/mL) e Cu (25-1600 µg/mL) (ZAMPIERI et al., 2016),

únicos metais estudados neste trabalho. A bacia do Araçá é uma área que apresenta

ocupações irregulares, contínuo despejo de esgoto proveniente da cidade de São

Sebastião e o terminal aquaviário da Petrobrás. Os isolados do presente trabalho

apresentam valores de CIM para Cr menores (64-512 µg/mL) e semelhantes para o

Cu (1204-2048 µg/mL) quando comparados àqueles obtidos no trabalho citado acima.

Padrões semelhantes são encontrados quando os resultados do presente trabalho

são comparados com àqueles já existentes na literatura (MALIKI, A.; JAISWAL, 2000;

WANG et al., 2015; SAIR; KHAN, 2018). Bactérias capazes de crescer em altas

concentrações de arsênio já foram obtidas a partir de esgoto (ABBAS et al., 2014),

solo utilizado na agricultura (BACHATE; CAVALCA; ANDREONI, 2009) e sedimentos

de lago (PEPI et al., 2007).

A fim de obter indícios da ocorrência do processo de co-resistência, optou-se

por determinar a CIM dos metais estudados para os isolados resistentes a antibióticos

e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados resistentes a arsênio e

mercúrio. Nossos resultados fenotípicos indicaram a presença simultânea de

resistência a ATB e algum dos elementos tóxicos estudados. Verifica-se, portanto, que

a maior pressão ambiental somado ao processo natural de desenvolvimento de

resistência a antimicrobianos provavelmente contribuiu para a exacerbação da

resistência bacteriana a estes elementos na região de Mariana. Vale ressaltar que

este trabalho contribui com novas diretrizes para o estudo da sensibilidade microbiana

aos metais pesados, haja vista a ausência de protocolos padronizados.

114

5.5 CEPAS SEQUENCIADAS – CARACTERÍSTICAS E IMPLICAÇÕES

O sequenciamento do genoma inteiro foi realizado para cinco cepas, sendo

quatro de E. coli (B2-C, B1-C, C3-F e C4-F) e uma de Klebsiella variicola subsp.

variicola (C2-C), todas isoladas a partir de amostras de água da bacia do Rio Doce.

Todos os isolados sequenciados (exceto C4-F), apresentaram variantes da beta-

lactamase CTX-M, que, assim como TEM e SHV são beta-lactamases de espectro

estendido (ESBL) pertencentes a classe A das β-lactamases (BUSH; JACOBY, 2010). A

enzima CTX-M, entretanto, é aquela com maior número de variantes descritas

(CANTÓN; GONZÁLEZ-ALBA; GALÁN, 2012). No presente trabalho, as variantes

CTX-M-2, CTX-M-15 e CTX-M-55 foram detectadas nas amostras da Bacia do Rio

Doce. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho que descreve a presença

de bactérias com perfil ESBL nessa região. Genes referentes às beta-lactamases de

espectro estendido foram detectados em amostras de Brumadinho, Minhas Gerais,

após o acidente ambiental (FURLAN et al., 2020). Em países como Reino Unido

(AMOS et al., 2014), Coreia do Sul (KIM; KANG; LEE, 2008) e Suíça (ZURFLUH et

al., 2013) essas enzimas foram detectadas em rios que continuamente recebem ou

receberam esgoto doméstico e industrial em grande quantidade. Em uma pesquisa

geográfica e temporal com isolados de hospitais e infecções comunitárias, BEVAN;

JONES; HAWKEY, (2017) verificaram que a variante CTX-M-2 é mais prevalente na

América do Sul, enquanto que a CTX-M-15 tornou-se importante em quase todos

países e a CTX-M-55 com relevância no leste asiático.

Klebsiella variicola foi descrita pela primeira vez em 2004, após ser isolada a

partir de bananas (ROSENBLUETH et al., 2004) e, em 2014, foi isolada a partir de

leite proveniente de animais com mastite (PODDER et al., 2014). É uma bactéria

oportunista considerada patógeno emergente na medicina humana (IMAI et al., 2019;

RODRÍGUEZ-MEDINA et al., 2019), e que vem adquirindo importância para a saúde

pública. Recentes pesquisas indicam esta espécie como potencial agente responsável

por enfermidades do sistema urinário (POTTER et al., 2018). Sendo um potencial

reservatório de genes que conferem resistência a vários antibióticos (RODRÍGUEZ-

MEDINA et al., 2019), sua importância clínica veterinária e humana é ainda maior. A

multirresistência a antibióticos foi observada nos resultados do presente trabalho, já

que a cepa C2-C apresentou os genes blaCTX-M15, blaTEM-1B, blaLEN16, fosA,

115

oqxA, oqxB, aac(3)-IId, tet(D), sul1, aadA2, ere(A), dfrA32. Genes de resistência a

metais pesados também foram identificados, embora a resistência não fora

demonstrada pelos testes fenotípicos. Klebsiella variicola, ainda, caracteriza-se pela

resistência intrínseca a ampicilina, conferida pelo gene LEN (RODRÍGUEZ-MEDINA

et al., 2019), como observado na cepa C2-C. Recentemente observou-se que cepas

de K. variicola podem ser tão virulentas quanto cepas de K. pneumoniae produtoras

de ESBL e causar infecções invasivas, com mortalidade similar às cepas de K.

pneumoniae (LONG et al., 2017). Assim, a detecção desta espécie multirresistente na

água da bacia do Rio Doce serve de alerta para profissionais da saúde quanto a

possibilidade de infecções de difícil tratamento em humanos e animais da região.

Na China, a variante CTX-M-55 tornou-se, pela primeira vez, a mais prevalente

entre os isolados clínicos humanos (ZHANG et al., 2014). Embora seja menos comum

na América do sul, a CTX-M-55 também já foi identificada no Equador (DELGADO et

al., 2016) e no Brasil (CUNHA et al. 2017), países que apresentam importantes

relações comerciais com a China, fato esse que pode ter contribuído para a

disseminação desta variante no continente sul-americano. Esta variante é

extensivamente detectada em animais de companhia e de produção, principalmente

em território asiático, sendo a segunda variante mais detectada em animais de

produção saudáveis na China (MA et al., 2012; ZHENG et al., 2012). Esses fatos

sugeriram que a disseminação da CTX-M-55 ocorreu dos animais para os seres

humanos. Ao nosso conhecimento, esta pesquisa é a primeira a identificar CTX-M-55

em um isolado de E. coli (C3-F) obtida a partir de água de rio brasileiro. A presença

desta cepa na bacia do Rio Doce também deve alertar pesquisadores e profissionais

da saúde para sua possível disseminação para a população, seja de maneira direta,

pelo uso dos rios como lazer, ou indireta, por meio da cadeia de produção de

alimentos. De maneira geral, CTX-M-55 e os genes fos são carreados em plasmídeo

tipo IncF, pertencentes ao subgrupo F33:A-:B-, considerado um vetor eficiente para

carrear e disseminar genes de resistência com relevância clínica (CUNHA et al., 2017;

CHEN et al., 2018a). A cepa C3-F apresenta este plasmídeo carreando somente o

gene blaCTX-M-55. Esta cepa pertence a ST155, cuja presença já foi descrita em

amostras de esgoto na India (SALIM et al., 2019) e E.coli isolada de galinhas (YANG

et al., 2017; ADZITEY et al., 2019), suínos (CHEN et al., 2018a) e fezes de cavalos

(SADIKALAY et al., 2018). A cepa C3-F pertence ao grupo filogenético B1, que é

particularmente detectada em animais, embora já tenha sido identificado em humanos

116

(STOPPE et al., 2017), porém com menor importância. No estudo realizado por

CARLOS et al., (2010), este filogrupo foi identificado principalmente em fezes bovinas,

ovinas e caprinas, quando outras fontes de contaminação como fezes humanas,

aviárias e suínas também foram estudadas. Este achado é particularmente importante

já que com livre acesso dos bovinos ao rio da região estudada, as fezes bovinas são

continuamente ali despejadas. Este filogrupo tem sido largamente identificado em

herbívoros (CLERMONT et al., 2011), já tendo sido presente em E. coli patogênicas

isoladas de búfalos com diarreia (COURA et al., 2019). Ainda, obteve-se sucesso no

processo de conjugação da cepa C3-F, com transferência do fenótipo ESBL e de

resistência ao arsênio para a bactéria receptora. Diante de todas essas evidências

acima descritas, sugere-se que esta cepa está presente na água do rio provavelmente

devido a presença de bovinos na região e caracteriza-se como potencial

disseminadora de genes de resistência clinicamente importantes para cepas

patogênicas para humanos e animais.

A variante CTX-M-2, antes de grande importância em quase todos os

continentes, hoje apresenta-se mais relevante na América do sul (BEVAN; JONES;

HAWKEY, 2017). Em revisão feita até 2012, as variantes CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-

M-9, CTX-M-74 e CTX-M-75, eram as mais prevalentes no Estado de Minas Gerais

(SILVA; LINCOPAN, 2012). Na área veterinária e ambiental, o gene blaCTX-M2 já foi,

por exemplo, detectado em E. coli isoladas de fezes e carcaças bovinas no Japão

(SHIRAKI et al., 2004), Indonésia (SUDARWANTO et al., 2016), França (HARTMANN

et al., 2012) e Brasil (PALMEIRA et al., 2018) e em água de rio na Áustria (ZARFEL

et al., 2017). As cepas B2-C e B1-C apresentaram o gene blaCTX-M-2, sendo este

carreado pelo plasmidio IncF subtipo F24:A-:B1. Este plasmídeo já fora identificado

na mesma espécie bacteriana isolada de suínos e de humanos com septicemia

(SUNDE et al., 2015). Os autores citam que este subtipo pode ser um plasmídeo de

sucesso, com grande disseminação entre as E. coli, sejam elas patogênicas ou

comensais. O plasmídeo IncF subtipo F24:A-:B1 conjugativo, carreador do gene CTX-

M-2 já foi detectado em cepa de E. coli isolada de gaivotas (Laurus dominicanus) na

Argentina (LIAKOPOULOS et al., 2016). No presente trabalho, entretanto, não se

obteve sucesso no processo de conjugação de B2-C e B1-C, mas havendo a

descrição anterior do sucesso na conjugação deste plasmídeo, a importância desse

elemento genético móvel como disseminador dos genes de resistência torna-se ainda

maior. Ambas cepas pertencem a ST219, já identificada um gato na França (MELO et

117

al., 2019) e cidadãos tunisianos (BEN SALLEM et al., 2012). O banco de dados

Enterobase (https://enterobase.warwick.ac.uk/), ainda, apresenta E. coli ST219

isoladas de animais de produção, galinhas e de amostras ambientais. O filogrupo E

(ao qual B1-C e B2-C se encaixam), já fora detectado tanto em búfalos diarreicos

quando saudáveis (COURA et al., 2019) e, assim como o filogrupo B1, fora associado

a E. coli isoladas de bovinos (COURA et al., 2015).

A resistência a metais pesados é geralmente conferida por sistemas de bombas

de efluxo (IANEVA, 2009). Algumas dessas proteínas tem papel fundamental no

desenvolvimento do fenótipo de resistência, de modo que a ausência dos genes que

codificam essas proteínas confere a ausência do fenótipo. Nas cepas sequenciadas,

houve detecção dos ars operons arsRDABC e arsABC (em C4-F e B1-C,

respectivamente), o operon arsRBC (em C3-F e B2-C) e o gene arsB (em C2-C). O

ars operon é o sistema mais conhecido que confere resistência a arsenito e arsenato.

Existem três operons mais conhecidos atualmente, sendo eles arsRBC, arsRABC

e arsRDABC (ARGUDÍN; HOEFER; BUTAYE, 2019). Os genes arsA e arsB codificam

uma ATPase e uma proteína de efluxo, respectivamente. Quando interagem entre si,

essas proteínas formam uma bomba de efluxo para arsenito cuja energia para

funcionamento provém da hidrolise de ATP. É dessa maneira que explica-se mais

recentemente, que bactérias que apresentam estes dois genes simultaneamente são

geralmente mais resistentes ao arsênio do que aquelas que apresentam somente o

gene arsB (ROSEN, 1999; YANG et al., 2012).

O fenótipo de resistência ao mercúrio é conferido pelo mer operon, formado por

genes que codificam uma oxiredutase (merA), uma liase, que não ocorre em todos as

cepas (merB), ao menos uma proteína de membrana (merT, merC merE, merF merP

e MerG) e ao menos uma proteína regulatória (merR e merD) (BARKAY; MILLER;

SUMMERS, 2003; BOYD; BARKAY, 2012). Duas cepas (B1-C e B2-C) apresentaram

o operon merRTPCAD, com a tolerância sendo confirmada pelo teste de sensibilidade

pelo método de microdiluição em placa. As cepas sensíveis, por sua vez, não

apresentaram genes de resistência a este elemento. Bactérias resistentes ao mercúrio

já foram isolados a partir de água (KANNAN; KRISHNAMOORTHY, 2006) e

sedimentos de lago (PEPI et al., 2011) e estuário (CHIU et al., 2007) locais

contaminados por esse elemento. Vale ressaltar que a detecção de bactérias

resistentes ao mercúrio era esperada, já que a região é reconhecida pela mineração

de ouro desde o século XVIII (MAY et al., 2019).

118

Por fim, é importante destacar que para as cepas que apresentaram genes

codificadores do sistema pco (para resistência ao cobre), o fenótipo não foi observado,

mesmo estas cepas apresentando os genes pcoC e pcoD, considerados essenciais

para a completa resistência a este elemento (RENSING; GRASS, 2003). A cepa

controle negativas e positivas e as cepas estudas apresentaram a mesma CIM para o

cobre e sugere-se que, nas cepas estudadas, a ausência do gene regulatório pcoS

possa ser responsável pela ausência do fenótipo de resistência, enquanto que os

genes pcoC e pcoD estão ausentes na cepa controle. A determinação da CIM para

uma cepa com o sistema completo seria fundamental para confirmar esta hipótese.

No presente trabalho, as cepas B2-C e B1-C apresentaram-se produtoras de

ESBL, somado a resistência a tetraciclina, sulfametoxazol+trimetoprim e gentamicina

(aminoglicosídeo), além de tolerância a arsênio (somente B1-C) e mercúrio (ambas).

A cepa C3-F foi produtora de ESBL e tolerante ao arsênio e perfil ESBL. A co-

ocorrência de resistência a mercúrio e/ou arsênio e antibióticos em E. coli tem sido

amplamente descrita na literatura e os resultados assemelham-se aos descritos no

presente trabalho. Resistência a quinolonas, tetraciclina e sulfametozazol+trimetoprim

foi detectada em cepas resistentes ao arsênio obtidas em ambientes marinhos

(AVILÉS et al., 1993). Resistência a mercúrio foi observada associada a tetraciclina e

sulfametoxazona+trimetoprim em cepas de Enterobacteriaceae isoladas a partir de

amostras obtidas em plantas de tratamento de esgoto (FERREIRA DA SILVA et al.,

2007) Resistência a mercúrio, quinolonas e fluorquinolonas, somado a alta

prevalência de genes associados ao perfil ESBL foram detectados em isolados obtidos

em um hospital na Algéria (ANSSOUR et al., 2016). Sugere-se, portanto, uma possível

associação entre a resistência a esses elementos tóxicos e as classes de antibióticos

acima descritos, provavelmente devido ao processo de co-seleção.

A co-seleção ocorre devido a mecanismos fisiológicos (resistência cruzada) e

genéticos (co-resistência). A co-resistência está relacionada a ligação genética de dois

ou mais genes de resistência (CHAPMAN, 2003), sendo que com a ativação de um

gene, há a ativação do outro. Ainda, a presença destes genes no mesmo elemento

genético móvel (transposons, plasmídeos), permite a disseminação dos genes. No

presente trabalho, B2-C, B1-C e C2-C apresentaram genes de resistência a

antibióticos e metais no mesmo contig. A cepa C3-F (que apresenta os genes CTX-

M-55 e blaTEM-141 presentes no mesmo contig), por sua vez, foi a única em que a

conjugação foi possível, de modo que o fenótipo ESBL foi transferido para a

119

transconjugante, indicando a possibilidade de transmissão horizontal dos genes no

meio ambiente.

A água contaminada por resíduos derivados de quaisquer atividades

antrópicas e sua associação com a emergência e disseminação de resistência

bacteriana já foi descrita Brasil, nas regiões de Brumadinho (FURLAN et al., 2020) e

na Bacia do Araçá (ZAMPIERI et al., 2016). Fora do Brasil, esse fato foi descrito na

Índia (RAHMAN; SINGH, 2018), China (HUANG et al., 2019), Espanha (SIDRACH-

CARDONA et al., 2014; RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2015) e Estados Unidos

(STORTEBOOM et al., 2010). Vale ressaltar que a disseminação do gene New Delhi

metallo-ß-lactamase-1 (NDM-1) deu-se por água de bebida (WALSH et al., 2011). O

presente trabalho é o primeiro que apresenta resultados que indicam que a água de

diferentes pontos da bacia do Rio Doce é uma importante fonte de contaminação de

bactérias resistentes dentro atividade leiteira. Esse resultado, somado a presença de

inúmeros genes de resistência nas fezes, rúmen e nasofaringe de bovinos (detectados

pelo metagenoma), sugere a ocorrência da passagem desses genes e bactérias do

ambiente aquático para o terrestre. Este fato alerta-nos para a possibilidade de haver

transferência desses genes ao longo da produção de alimentos, com possíveis

consequências nocivas para o ser humano. Estudos futuros são necessários para

determinar se esses genes e microrganismos detectados na região da bacia do Rio

Doce estão sendo transferidos através da cadeia de alimentos da região.

A presença de bactérias resistentes a antimicrobianos e a possível presença

de mecanismos como a co-resistência implicam em dificuldades no uso de antibióticos

na medicina humana e animal, com especial importância para aquelas bactérias

consideradas de alta virulência e patogenicidade, sendo, portanto, uma emergência

na questão da saúde única e saúde global (One Health e Global Health). A saúde

única está relacionada a emergência, disseminação da resistência a antimicrobianos

e, consequentemente, em intervenções locais que visem a redução do problema. A

saúde global, por sua vez, se atenta para as condições que facilitam a disseminação

da resistência em vários países, de modo a implementar políticas de intervenção em

caráter global (HERNANDO-AMADO et al., 2019). As infecções relacionadas têm se

tornado uma emergência global que exige ações de prevenção a crise no uso de

antibióticos. O Grupo de Coordenação Interinstitucional de Antimicrobianos advertiram

que caso nenhuma ação seja tomada, doenças resistentes a drogas antimicrobianas

serão a causa mortis de aproximadamente 10 milhões de mortes/ano

120

até 2050, assim como um dano na economia. Atualmente 700,000 pessoas/ano

morrem devido a doenças resistentes a drogas (IACG, 2019). Em uma rápida tentativa

de impedir estas consequências catastróficas, alguns países adotaram um plano

contra a resistência antimicrobiana. O Plano Global para a Resistencia Antimicrobiana

(WHO, 2015), o plano de ação de 5 anos para a resistência a antimicrobianos do Reino

Unido 2019-2024 (DHSC, 2019), Plano de Ação Antimicrobiana da Nova Zelândia

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(USDA, 2014) e o Plano de Ação Plano de Ação da Resistência Antimicrobiana da

Escócia 2014-2018 (ScotMARAP2) (SCOTTISH GOVERNMENT, 2014) são alguns

exemplos. O Brasil apresenta o Plano de Ação Nacional de Prevenção e Controle da

Resistência aos Antimicrobianos, no âmbito da Agropecuária, em vigência desde 2018

(2018-2020) (BRASIL, 2018).

Metais pesados já foram identificados em produtos de origem animal como

peixes (MAHBOOB et al., 2016), crustáceos (VIRGA; GERALDO; SANTOS, 2007;

KUMAR et al., 2015), leite e derivados (ZIARATI, et al., 2018) e carnes (DI BELLA et

al., 2020). Embora os bovinos estudados nesta pesquisa não tenham apresentado

evidências clínicas de intoxicação por metais pesados, existe a possibilidade da

presença desses elementos em tecidos, tornando-se particularmente importante

quando estes são relacionados ao consumo humano. Para isso, uma etapa

complementar a este estudo é fundamental para a verificação da bioacumulação dos

metais no tecido de bovinos da bacia do Rio Doce.

Os resultados da presente pesquisa somado àqueles já descritos na literatura,

indicam que a contaminação por esgoto de variadas fontes e resíduos de mineração

podem interferir no microbioma e resistoma animal e na abundância de bactérias

resistentes na água. Salienta-se que, em relação à mineração, ações ambientais como

construção e manutenção adequadas de barragens, buscas por métodos de extração

mineral menos danosos e com menor produção de rejeitos, adequado tratamento de

rejeitos e avaliação continuada da presença e disseminação de genes de resistência

são necessárias e urgentes. Essas ações são fundamentais para garantir a proteção

ambiental, animal, e do sistema de produção de alimentos, das consequências

perigosas decorrentes do alto despejo de contaminantes.

121

6 CONCLUSÃO

Neste trabalho, os animais não apresentaram manifestações clínicas

compatíveis com quadros de intoxicação aguda ou crônica por metais pesados. Houve

detecção de baixas concentrações de metais pesados no soro dos bovinos. Os valores

para cada componente dos perfis renal e hepático mostraram-se abaixo dos valores

de referência para a espécie, nas duas fazendas.

Observou-se, também, diferenças na microbiota ruminal e fecal e demonstrou-

se que os bovinos criados em Mariana, Minas Gerais, apresentaram maior prevalência

de genes de resistência a biocidas, antibióticos e metais pesados quando comparados

aos animais criados na região sul do mesmo estado.

A análise da presença de metais pesados na água do rio indicou a presença de

elementos em concentrações abaixo dos níveis máximos de segurança indicados

pelos órgãos reguladores.

No estudo microbiológico da água, foram isoladas inúmeras bactérias

resistentes a antibióticos e/ou metais pesados como o arsênio e o mercúrio. Ressalta-

se o primeiro isolamento de cepas de Escherichia coli produtoras de ESBL e tolerantes

a mercúrio e/ou arsênio e uma cepa de Klebsiella variicola subsp. variicola

multirresistente, na bacia do Rio Doce. Houve sucesso na conjugação de uma cepa

de Escherichia coli, com transferência horizontal de genes de resistência aos beta-

lactâmicos e ao arsênio.

122

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