NATÁLIA CARRILLO GAETA
Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação
com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento
de resistência a antimicrobianos
São Paulo
2020
NATÁLIA CARRILLO GAETA
Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a
mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de
resistência a antimicrobianos
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Clínica Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutora em Ciências.
Departamento:
Clínica Médica
Área de concentração:
Clínica Veterinária
Orientador:
Prof. Dra. Lilian Gregory
De acordo:____________ __________
Orientador
São Paulo
2021
Obs.: A versão original encontra-se disponível na Biblioteca da FMVZ/USP.
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Maria Aparecida Laet, CRB 5673-8, da FMVZ/USP.
T. 4009 Gaeta, Natália Carrillo FMVZ Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação
com a modificação da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos / Natália Carrillo Gaeta. – 2020.
155 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia. Departamento de Clínica Médica, São Paulo, 2021.
Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária.
Área de concentração: Clínica Veterinária.
Orientadora: Profa. Dra. Lilian Gregory.
1. Metais pesados. 2. Microbioma. 3. Resistência a antimicrobianos. 4. Bovinos leiteiros. 5. Mineração. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Autor: GAETA, Natália Carrillo
Título: Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e
sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o
desenvolvimento de resistência a antimicrobianos
Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Data: / /
Banca Examinadora
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
Prof. Dr.
Instituição: Julgamento:
DEDICATÓRIA
Este trabalho é inteiramente dedicado
a Deus, a minha família, e aos meus filhos
de pelos e penas, pilares que sustentam minha vida.
AGRADECIMENTOS
Deus, infinitamente justo e bom, a causa primária e todas as coisas. Meu Pai, meu
criador. Agradeço imensamente pela oportunidade que me concedestes a mais uma
encarnação neste planeta. Agradeço pela oportunidade de me tornar doutora, por ter
me dado força, saúde e sabedoria para completar mais um ciclo da minha vida.
Agradeço, também, pelos momentos difíceis, afinal, foram neles que aprendi as
maiores lições e cresci como ser humano.
Aos meus amados pais Geraldo e Rosana e minha querida irmã Isabella, pelo amor,
apoio, compreensão e carinho de todos os dias, e, principalmente, por me darem o
exemplo do que é trilhar o caminho do bem, do amor e da caridade. Ao meu cunhado
Ederson por todo carinho, muito obrigada!
Aos meus avós Roberval e Ignês e tios Renata e Ronaldo por todo amor e apoio em
todos os momentos da minha vida.
Ao meu noivo, amor, amigo e companheiro Daniel, pelo carinho, apoio, compreensão
e paciência, principalmente durante o tempo em que permanecemos longe um do
outro. Obrigada por estar sempre ao meu lado.
À minha nova família, composta pelos meus amados sogros Daniel e Carla, aos meus
cunhados Luis Fernando e Fernanda e a vovó Diva por todo amor nesses anos que
estamos juntos. Por me permitirem entrar nessa família tão linda e por todo apoio. Um
especial agradecimento aos doces maravilhosos da minha sogra.
Aos meus companheiros de estimação que ainda estão encarnados: Nino (cão), Tico
(canarinho), Jujuba (calopsita) e Gertrudes (porquinho-da-índia) e àqueles que já se
foram: Nina, Penélope, Bob e Susy, meu muito obrigada por todo amor incondicional
e carinho. Vocês são a razão por eu ter escolhido esta profissão. Aos melhores amigos
que um ser humano por ter, ofereço-lhes todo meu amor.
A todos os passarinhos que passam pela minha janela todos os dias (Norberta,
Rolandinha, Rolinê, Pacífica, Santa Maria, Nina, Pinta, Azulão e Azulina, Floriano e
aos demais que não consegui nomear) esperando serem alimentados com sementes
e frutas, que cantam e têm bebes na minha laranjeira, alegrando ainda mais meus
dias, o meu muito obrigada.
Aos queridos Raquel Kojima, Fernando Katsuo e Alejandro Vera pelo apoio e
acompanhamento no momento mais difícil que passei durante esses quatros anos. O
meu muito obrigada.
Aos meus companheiros do grupo de jovens da SEEIC: Rafael, Wesley, Adriano,
Thais, Maria Eduarda, Leonardo, Eric, Alec, Julia, Helena e Paulo, ofereço todo meu
amor, e carinho. Agradeço muito pelo apoio e principalmente por confiarem no meu
trabalho como docente. Devo muito a vocês.
À minha querida orientadora Profª. Dra. Lilian Gregory, pela oportunidade de ser sua
aluna há dez anos, pelos ensinamentos, pela confiança que sempre depositou em
mim e, principalmente, por me abrir as portas do mundo, o meu muito obrigada. Este
não é o fim, mas o início de um novo ciclo. Ao seu esposo Arnaldo, sua filha Suraia e
sua cachorrinha Gigi, tão queridos que sempre me receberam muito bem e ao qual
sou muito grata, ofereço todo meu carinho.
Aos meus grandes amigos Mário e Jeferson, pelas risadas, apoio, carinho, ajuda nas
coletas e por aguentarem minhas chatices. Sem vocês, esse trabalho não seria
concluído. À Margarida que, embora tenha chegado nos momentos finais, sempre me
acolheu com carinho e apoio. Muito obrigada.
A minha querida amiga e orientadora Erika Korzune Ganda pela confiança,
ensinamentos, amizade, passeios na Ross e por me proporcionar a honra de ser sua
primeira aluna e membro do “The Ganda Lab”, o meu muito obrigada. E junto ao seu
esposo Joe Ricotta, me permitiram viver em sua casa pelos três meses que passei
nos EUA. Não tenho palavras para agradecer.
Aos demais membros do “The Ganda Lab”, Asha Miles e Emily Bean. Sem vocês esse
trabalho são seria possível. Agradeço a amizade, os ensinamentos e tenham certeza
que, assim como a Erika, vocês são os exemplos na área de microbioma que me
espelho todos os dias. Quando crescer, quero ser igual a vocês. Girl Power!
À meus lindos e amados colegas do ICB Izadora, Maysa, Aline, Camila, Giovanni,
Felipe, Cris e Alexandre pelas boas risadas, desabafos, fofocas. Vocês fizeram esses
quatro anos muito mais leves! Ao mestre Prof. Dr. Jorge Timenetsky pelo carinho,
apoio, amizade e ensinamentos. Sou muito grata pela confiança e pela oportunidade
de desenvolver minhas pesquisas no seu laboratório. Por ter sido acolhida e ter meu
trabalho reconhecido por todos vocês, me sinto a pessoa mais sortuda que conheço.
Ao Prof. Dr. Nilton Lincopan e sua equipe: Fernanda, Brenda, Maria, Miriam, e a todos
os demais que me ajudaram muito durante este trabalho. Pelos ensinamentos, dicas
e ombro amigo, dedico a todos o meu carinho. Um especial agradecimento ao Danny
Fuentes pelo desenho do Mapa de colheita de amostras do rio e ao querido Herrison
por toda ajuda e ensinamentos indispensáveis na área de bioinformática.
Ao Prof. Dr. Luigi Jovane e a aluna Patricia Pádua, pela oportunidade de desenvolver
meu trabalho no seu laboratório no Instituto de Oceanografia da Universidade de São
Paulo. Pela confiança e pelos grandes ensinamentos, meu muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Scapin, por todo auxílio valioso com a técnica de
fluorescência de raio-x. Por acreditar neste trabalho e sempre estar disponível para
novos desafios, o meu muito obrigada.
À Prof. Dra. Adivane Costa e seu aluno Arthur, que auxiliaram na colheita de amostras
de água na Bacia do Rio Doce. Muito obrigada.
Aos queridos Prof. Dr. Edson Luiz Durigon e Luciano Matsumyia Thomazelli, por me
permitir utilizar os equipamentos do laboratório que foram fundamentais para a
execução deste trabalho. Muito obrigada!
Ao Dr. Jesús Ulises Garza Ramos Martínez e ao Dr. Humberto Barrios Camacho do
Laboratório de Resistencia Bacteriana do Centro de Investigaciones sobre
Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública, em Cuernavaca,
México, pela valiosa ajuda na determinação do sequence typing da cepa K. variicola,
“muchas gracias por su atención e ayuda”.
À todos os colegas de pós-graduação pela amizade, risadas, companheirismo durante
as disciplinas e as conversas nos corredores.
A todos os professores do Departamento de Clínica Médica que me acolhem há dez
anos e a quem sou grata por todo apoio e carinho, o meu muito obrigada.
Meu carinho, amor e homenagem ao querido Prof. Dr. Fernando José Benesi, incrível
como pessoa e profissional e que tive a honra de conviver. Agradeço por sua amizade,
preocupação comigo e minha família e, principalmente, por tudo que o senhor fez pela
pesquisa e pela medicina veterinária brasileira. Cacilda Becker, como sentimos sua
falta aqui neste plano!
A todos os funcionários da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, que direta ou indiretamente ajudaram no desenvolvimento
desta pesquisa. Um especial agradecimento às secretárias Adelaide e Silvana e às
técnicas Claudia, Clara e Dinha, por toda ajuda indispensável nesses anos de pós-
graduação.
Aos proprietários que abriram as portas de suas fazendas e permitiram que nosso
grupo de pesquisa pudesse colher as amostras e executar este trabalho. O meu muito
obrigada.
À todos as fêmeas leiteiras que participaram desta pesquisa. Sua encarnação atual
não foi em vão. Tenha certeza de que pela valiosa ajuda na evolução da pesquisa,
vocês já subiram alguns degraus na escada da evolução. Muito obrigada meninas!
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio a este doutorado
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de
doutorado concedida (PROCESSO FAPESP 2016/23204-9).
“Teu trabalho é a oficina em que podes forçar a tua própria luz. ” (Francisco Cândido Xavier, pelo espírito Emmanuel)
“Os animais têm alma e valem pelos melhores amigos”
(Francisco Cândido Xavier)
“Estude a si mesmo, observando que o autoconhecimento traz humildade e sem humildade é impossível ser feliz. Amor é a força da via e trabalho vinculado ao amor é a usina geradora
da felicidade” (Francisco Cândido Xavier, pelo espírito Emmanuel)
RESUMO
GAETA, N. C. Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos [Evaluation of cattle exposed to high concentration of heavy metals and their relationship with changes in intestinal, ruminal and respiratory microbiota and the development of antimicrobial resistance]. 2020. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021.
Casos de contaminação ambiental originados a partir de erros humanos estão
ganhando cada vez mais espaço na mídia, alertando a todos quanto a fragilidade do
meio ambiente perante os acontecimentos. Problemas técnicos e estruturais de
barragens foram destaque na mídia nacional e internacional, ao qual geraram
consequências inimagináveis tanto pela contaminação ambiental quanto pela morte
de centenas pessoas no Estado de Minas Gerais, Brasil. Em 2015, o município
mineiro de Mariana foi severamente acometido pelo vazamento de mais de 43
milhões de metros cúbicos de rejeito de minério de ferro devido ao rompimento da
barragem do Fundão. A isso, o ambiente da região também sofre com o
contínuo despejo de esgotos domésticos e agropecuários, contendo elementos
nocivos ao equilíbrio ambiental. Os metais pesados podem, por vários
mecanismos, desencadear a resistência a antibióticos e a modificação da
microbiota, impactando na saúde dos animais e, consequentemente, na
economia da região, além de ocasionar consequências negativas a saúde
humana. O presente trabalho teve como objetivo estudar bovinos leiteiros criados
na região de Mariana, Minas Gerais (impactada por resíduos tóxicos), quanto a
saúde, ocorrência de resistência bacteriana aos antimicrobianos e as possíveis
mudanças na microbiota desses animais. A água do rio também foi avaliada quanto
a presença de metais pesados e bactérias resistentes a antimicrobianos. Cinquenta
e oito fêmeas bovinas leiteiras foram estudadas, sendo 28 criadas em Mariana,
Minas Gerais (F1) e 30 criadas em Caldas, Minas Gerais (local sem histórico de
contaminação ambiental) (F2). Foram obtidas amostras de sangue total (para
obtenção de soro), swab fecal e nasal profundo, líquido ruminal e água dos dois
locais. Fez-se a avaliação física e do perfil renal e hepático dos animais, bem
como da concentração de metais pesados no soro e na água utilizando a
metodologia de fluorescência de raio-x. Estudou-se o microbioma e resistoma
intestinal, ruminal e respiratório e, por fim, a presença de bactérias resistentes à
antimicrobianos nas
amostras de água. No momento da visita às propriedades, os animais não
apresentavam nenhuma manifestação clínica decorrente de intoxicação por metais
pesados. Houve detecção de arsênio e alumínio em animais de ambas regiões
estudadas, em concentração abaixo do limite máximo seguro para a espécie. Quando
ao metagenoma bovino, o microbioma e resistoma de F1 foi diferente de F2. A
abundância relativa e prevalência de genes de resistência a antimicrobianos foi maior
em F1 que em F2. As amostras de F1 apresentaram alta presença de genes de
resistência a antibióticos, metais, biocidas e de multirresistência. A análise da água do
rio indicou a presença de alumínio e ferro em concentrações consideradas abaixo do
limite estabelecido pelos órgãos reguladores. O estudo microbiológico da água revelou
inúmeras bactérias resistentes a antibióticos e metais pesados como arsênio e
mercúrio e com a análise genética sugeriu-se a ocorrência da co-resistência. Sabendo
que a contaminação por metais pesados afeta o microbioma e resistoma animal, a
qualidade da água e o equilíbrio ambiental, ações ambientais em relação à mineração
são necessárias e urgentes, como construção e manutenção adequadas de
barragens, buscas por métodos de extração mineral menos danosos e com menor
produção de rejeitos, adequado tratamento de rejeitos e avaliação continuada da
presença e disseminação de genes de resistência. Essas ações são fundamentais
para garantir a proteção ambiental, animal, e do sistema de produção de alimentos
das consequências perigosas decorrentes do alto despejo de contaminantes.
Palavras-chave: Metais pesados, Microbioma, Resistência a antimicrobianos,
Bovinos leiteiros, Mineração.
ABSTRACT
GAETA, N. C. Evaluation of cattle exposed to high concentration of heavy metals and their relationship with changes in intestinal, ruminal and respiratory microbiota and the development of antimicrobial resistance [Avaliação de bovinos expostos a alta concentração de metais pesados e sua relação com a mudança da microbiota intestinal, ruminal e respiratória e o desenvolvimento de resistência a antimicrobianos]. 2020. 156 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade deMedicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021.
Cases of environmental contamination originating from human errors are gaining more
and more space in the media, alerting everyone to the fragility of the environment in
the face of events. Technical and structural problems of dams were highlighted in the
national and international media, which generated unimaginable consequences both
for the environmental contamination and for the death of hundreds of people in the
State of Minas Gerais, Brazil. In 2015, the mining municipality of Mariana was severely
affected by the spill of over 43 million cubic meters of iron ore tailings due to the
collapse of the Fundão dam. As a result, the region's environment also suffers from
the continuous dumping of domestic and agricultural sewage, containing elements
harmful to the environmental balance. Heavy metals can, by various mechanisms,
trigger resistance to antibiotics and the modification of the microbiota, impacting the
health of animals and, consequently, the economy of the region, in addition to causing
negative consequences to human health. This study aimed to study dairy cattle raised
in the region of Mariana, Minas Gerais (impacted by toxic waste), regarding health, the
occurrence of bacterial resistance to antimicrobials, and possible changes in the
microbiota of these animals. The river water was also evaluated for the presence of
heavy metals and bacteria resistant to antimicrobials. Fourty-eight cattle females were
studied, 28 raised in Mariana, Minas Gerais (F1), and 30 raised in Caldas, Minas
Gerais (place without a history of environmental contamination) (F2). Samples of whole
blood (to obtain serum), fecal and deep nasal swab, ruminal fluid, and water were
obtained from both locations. The physical and renal and hepatic profiles of the animals
were evaluated, as well as the concentration of heavy metals in serum and water using
the x-ray fluorescence methodology. The intestinal, ruminal, and respiratory
microbiome and resistome were studied and, finally, the presence of antimicrobial-
resistant bacteria in the water samples. At the time of the visit to the properties, the
animals did not show any clinical manifestation due to heavy metal poisoning. There
was the detection of arsenic and aluminum in animals from both regions studied, in
concentrations below the maximum safe limit for the species. As for the bovine
metagenome, the F1 microbiome and resistome were different from F2. The relative
abundance and prevalence of antimicrobial resistance genes were higher in F1 than in
F2. F1 samples showed a high presence of antibiotics, metal, biocide, and multidrug
resistance genes. The analysis of the river water indicated the presence of aluminum
and iron in concentrations considered below the limit established by Organs regulatory
agencies. The microbiological study of water revealed innumerable bacteria resistant
to antibiotics and heavy metals such as arsenic and mercury and with genetic analysis,
the occurrence of co-resistance was suggested. Knowing that heavy metal
contamination affects the microbiome and animal resistome, water quality, and
environmental balance, environmental actions concerning mining are necessary and
urgent, such as adequate construction and maintenance of dams, searches for less
harmful mineral extraction methods and with less production of tailings, adequate
tailings treatment and continued evaluation of the presence and dissemination of
resistance genes. These actions are fundamental to guarantee the environmental,
animal, and food production system protection from the dangerous consequences
resulting from the high dumping of contaminants.
Keywords: Heavy metals, Microbiome, Antimicrobial resistance, Dairy cattle, Mining.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Destruição de construções e evidências do acidente em árvores à beira do
Rio do Carmo, provocadas pela lama despejada após o rompimento da barragem do
Fundão em Mariana, Minas Gerais, Brasil, 2020....................................................... 35
Figura 2 – Exemplos de mecanismos moleculares relacionados a co-seleção de
metais e antibióticos .................................................................................................. 43
Figura 3 - Localização dos municípios de Mariana (fazenda 1) e Caldas (fazenda 2),
em Minas Gerais, Brasil ............................................................................................ 52
Figura 4 - Pontos de colheita de água na Bacia do Rio Doce. Letras indicam amostras
para detecção de bactérias resistentes. Asteriscos indicam amostras obtidas para
estudo dos metais pesados. A: Gualaxo; B: Paracatu; C: Campinas/Pedras; D:
Gesteira; E: Barra Longa urbano; F: Barra Longa rural; G: Rio do Carmo; H: Rio Doce.
..................................................................................................................................54
Figura 5 - Disposição dos discos de antibióticos na placa de petri contendo ágar
Mueller Hinton ........................................................................................................... 58
Figura 6 - Esquema da placa utilizada para determinação do CIM. ......................... 63
Figura 7 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas
amostras fecais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em
Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) .................. 74
Figura 8 -. Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas
amostras fecais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em
Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05).................. 75
Figura 9 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas
amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em
Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) .................. 76
Figura 10 - Boxplot evidenciando os cinco gêneros mais abundantes presentes nas
amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em
Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05).................. 77
Figura 11 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas
amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas
em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) ................. 78
Figura 12 - Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas
amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas
em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com
correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05) ................. 79
Figura 13 – Abundância relativa de filos e gêneros entre fazendas e sítios anatômicos.
Heatmaps demonstrando a abundância relativa dos filos (A) e gêneros (B) mais
abundantes determinados nas amostras fecais, ruminais e nasais de bovinos leiteiros
das fazendas 1 e 2 .................................................................................................... 80
Figura 14 - Perfil de resistência a antibióticos dos isolados obtidos nas amostras de
água de oito pontos ao longo da Bacia do Rio Doce (incluindo F 1) e da F2, localizadas
no estado de Minas Gerais, Brasil. Três isolados apresentando perfil de beta-
lactamase de espectro estendido (ESBL) estão assinalados com um asterisco 88
Figura 15 - Frequência de detecção de cepas resistentes a metais pesados (isoladas
de amostras de água) em relação a seleção utilizando placas suplementadas com os
elementos tóxicos. ..................................................................................................... 93
Figura 16 - Esquema demonstrando a sequência de etapas para estudo da presença
concomitante de resistência a antibióticos e metais pesados nos isolados de água.94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sequência de oligonucleotídeos iniciadores para detecção de genes
codificadores de ESBL .............................................................................................. 59
Tabela 2 - Metais pesados utilizados na padronização do teste de concentração
inibitória mínima. São Paulo. 2019 ............................................................................ 61
Tabela 3 - Concentração das soluções estoque e trabalho, e a diluição inicial utilizada
no teste para determinação do CIM para cada elemento. São Paulo. 2019 .............. 62
Tabela 4 - Frequência dos parâmetros clínicos gerais obtidos das fêmeas bovinas
pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de
Minas Gerais, Brasil. ................................................................................................. 71
Tabela 5 - Frequência de parâmetros clínicos específicos do sistema respiratório
obtidos das fêmeas bovinas pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas),
localizadas no estado de Minas Gerais, Brasil. ......................................................... 72
Tabela 6 - Comparação de médias entre as variáveis estudadas em bovinos leiteiros
das fazendas 1 e 2, localizadas nas cidades de Mariana e Caldas, respectivamente,
Minas Gerais, Brasil. Valores em negrito indicam significância estatística no teste
Wilcox Sum Rank com Correção de Continuidade (P < 0.05). .................................. 73
Tabela 7 - Número médio de funções únicas identificadas por fazenda e sítio
anatômico (fezes, rúmen e swab nasal). IIQ: Intervalo interquartil. ........................... 82
Tabela 8 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s
identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação às fazendas 1 e 2 82
Tabela 9 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s
identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação aos sítios anatômicos
..................................................................................................................................83
Tabela 10 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s
identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação a composição fazendas
e sítios anatômicos .................................................................................................... 85
Tabela 11 - Tabela X. Detecção de alumínio (Al). Cromo (Cr), ferro (Fe), cobalto (Co),
arsênio (As), mercúrio (Hg) e cobre (Cu) em quatro pontos da bacia do Rio Doce
(incluindo a fazenda 1) e a fazenda 2, utilizando WDXRF. Valores precedidos pelo
sinal < significam que estão abaixo do limite de quantificação da técnica. ............... 86
Tabela 12 - Relação de cepas isoladas da água da Bacia do Rio Doce e a fazenda 2,
apresentando resistência a ao menos um elemento tóxico estudado de acordo com o
teste padronizado ...................................................................................................... 90
Tabela 13 - Presença concomitante do fenótipo de resistência a elementos tóxicos e
antibióticos dos isolados obtidos a partir da triagem de amostras de água da Bacia do
Rio Doce (incluindo Fazenda 1) e Fazenda 2, Minas Gerais, Brasil. ......................... 96
Tabela 14 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST e sorotipo de alguns
isolados de E. coli obtidos a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas
Gerais, Brasil. .......................................................................................................... 100
Tabela 15 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST, wzi, e k_O locus da cepa
C2-C (K. variicola subsp. variicola) obtida a partir da análise da água da Bacia do Rio
Doce, Minas Gerais, Brasil. ..................................................................................... 103
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 23
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 25
2.1 METAIS PESADOS ................................................................................. 25
2.1.1 Características, participação biológica e toxicidade................................... 25
2.1.1.1 Mercúrio ....................................................................................................... 26
2.1.1.2 Arsênio .................................................................................................... 27
2.1.1.3 Chumbo ................................................................................................... 28
2.1.1.4 Cádmio .................................................................................................... 29
2.1.1.5 Cobre ....................................................................................................... 29
2.1.1.6 Alumínio .................................................................................................. 31
2.1.1.7 Cromo ...................................................................................................... 31
2.1.1.8 Ferro ........................................................................................................ 32
2.1.1.9 Cobalto .................................................................................................... 32
2.2 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL ............................................................... 32
2.2.1 Consequências da exposição prolongada a metais pesados ............ 36
2.2.1.2 Modificação da microbiota animal e humana ...................................... 36
2.2.1.3 Modificação do microbiota ambiental .................................................. 38
2.2.2 Resistência a antimicrobianos .............................................................. 39
2.2.2.2 Origem e mecanismos ........................................................................... 40
2.2.2.3 Resistência a metais pesados e a co-resistência ................................ 42
2.3 DETECÇÃO DOS METAIS PESADOS .................................................... 46
2.4 SHOTGUN SEQUENCING....................................................................... 47
3 OBJETIVOS ............................................................................................. 49
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 49
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 49
3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................... 51
3.1 AMOSTRAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO ............ 51
3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ..................................................................... 52
3.3 EXAME FÍSICO ........................................................................................ 52
3.4 AMOSTRAS ............................................................................................. 53
3.4.1 Sangue total ............................................................................................ 53
3.4.2 Água ........................................................................................................ 54
3.4.3 Swab fecal ............................................................................................... 54
3.4.4 Swab nasal profundo ............................................................................. 55
3.4.5 Conteúdo ruminal ................................................................................... 55
3.5 ANÁLISES LABORATORIAIS .................................................................. 55
3.5.1 Determinação da concentração de metais pesados............................ 55
3.5.2 Perfis renal e hepático ........................................................................... 56
3.5.3 Estudo das bactérias resistentes na água ........................................... 56
3.5.4 Determinação de bactérias resistentes à antibióticos ........................ 57
3.5.5 Sensibilidade bacteriana à metais pesados ......................................... 60
3.5.6 Identificação das espécies bacterianas ................................................ 63
3.5.7 Sequenciamento de cepas representativas ......................................... 64
4.5.8.1 Extração de DNA ......................................................................................... 65
3.5.8.1 Shotgun Sequencing .............................................................................. 66
3.6 ANÁLISE .................................................................................................. 66
3.6.1 Variáveis clínicas e laboratoriais .......................................................... 66
3.6.2 Microbioma ............................................................................................. 67
3.6.3 Resistoma ............................................................................................... 67
3.6.4 Anotação funcional do metagenoma .................................................... 68
4 RESULTADOS ......................................................................................... 70
4.1 CARACTERÍSTICAS DAS PROPRIEDADES ESTUDADAS ................... 70
4.2 PARÂMETROS CLÍNICOS DOS ANIMAIS .............................................. 71
4.3 CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NO SORO DOS BOVINOS. 73
4.4 PERFIL RENAL E HEPÁTICO DOS BOVINOS ....................................... 73
4.5 METAGENOMA BOVINO ......................................................................... 74
4.5.1 Microbiota ............................................................................................... 74
4.5.2 Resistoma ............................................................................................... 81
4.5.3 Anotação funcional ................................................................................ 81
4.6 ANÁLISE DA ÁGUA ................................................................................. 86
4.6.1 Detecção de elementos tóxicos ............................................................ 86
4.6.2 Detecção de bactérias resistentes a antibióticos na água ................. 86
4.6.3 Detecção de espécies resistentes a metal pesado na água ............... 88
4.6.4 Presença concomitante de resistência a metais pesados e
antibióticos nos isolados ....................................................................... 94
4.7 ANÁLISE GENÔMICA DE CEPAS REPRESENTATIVAS ....................... 98
4.7.1 Escherichia coli ...................................................................................... 98
4.7.2 Klebsiella pneumoniae Complex ......................................................... 102
5 DISCUSSÃO .......................................................................................... 104
5.1 SAÚDE BOVINA ..................................................................................... 104
5.2 MICROBIOMA, RESISTOMA E ANOTAÇÃO FUNCIONAL ................... 106
5.3 ELEMENTOS TÓXICOS NA ÁGUA ....................................................... 110
5.4 BACTÉRIAS ISOLADAS DA ÁGUA DE BEBIDA ................................... 111
5.5 CEPAS SEQUENCIADAS – CARACTERÍSTICAS E IMPLICAÇÕES .... 114
6 CONCLUSÃO ........................................................................................ 121
7 REFERENCIAS ...................................................................................... 122
23
1. INTRODUÇÃO
Em 2019, o Brasil contava com um rebanho bovino de aproximadamente 215
milhões de animais. Neste mesmo ano, o efetivo de vacas ordenhadas chegou a 16,3
milhões, com produção de quase 35 bilhões de litros de leite (BARROS, 2020). A
região sudeste voltou a liderar o ranking de maior produtora de leite, sendo o estado
de Minas Gerais o principal produtor e número um deste ranking. Dentre as inúmeras
regiões mineiras de produção leiteira, encontra-se aquela estabelecida na Bacia do
Rio Doce, localizada no quadrilátero ferrífero.
A região do quadrilátero ferrífero abrange os municípios de Sabará,
Santa Barbara, Mariana, Congonhas, Ouro Preto, João Monlevade, Rio Piracicaba,
Itaúna e Itabira. Desde o final do século XVII a região tem se destacado como uma
das mais famosas produtoras de ouro do Brasil. A partir deste período, padrões
modernos de exploração mineral foram instalados juntamente com técnicas
rudimentares de extração por garimpo, sendo esta última, de forma mais extensiva,
descontrolada e predatória com a utilização de mercúrio no processo. As grandes
minerações de ferro-manganês, iniciaram a exploração extensiva de suas jazidas na
segunda metade do século XX, sobretudo a partir do início da década de 80.
O Quadrilátero Ferrífero está localizado na região da bacia hidrográfica do Rio
Doce, cuja nascente encontra-se no estado de Minas Gerais e chega até o Espírito
Santo. Os fatores sociais e econômicos envolvidos na Bacia do Rio Doce e das sub-
bacias de seus afluentes também são considerados quando se analisa o uso das
águas, tanto em relação ao potencial poluidor como das necessidades de usos. O
desenvolvimento no entorno da bacia trouxe também sérias consequências
ambientais. Os poluentes lançados pelos esgotos domésticos, efluentes industriais e
da atividade de mineração provocam impactos significativos na qualidade das águas,
que já são monitoradas em relação aos parâmetros físico-químicos e microbiológicos.
No processo de ocupação econômica da bacia do Rio Doce, as extrações vegetal e
mineral tiveram um papel importante no desenvolvimento da região. A mineração se
destacou com a extração de ferro, ouro, bauxita, manganês, pedras preciosas, dentre
outros. Essa região ganhou destaque na mídia nacional e internacional devido a dois
acidentes ambientas ocorridos em 2015 e 2016 em Mariana e Brumadinho,
respectivamente, com centenas de perdas humanas, animais e vegetais.
24
Casos de contaminação ambiental originados a partir de erros humanos vêm
ganhando cada vez mais espaço nas mídias, alertando a população quanto a
fragilidade do meio ambiente perante os acontecimentos, em vários países, incluindo
o Brasil. Contaminação pode ser definida como concentrações de elementos acima
de níveis estabelecidos por normativas, sejam no solo, água ou em organismos vivos
(RIBEIRO, 2013). Os metais estão naturalmente presentes no meio ambiente, em
concentrações que mantém o equilíbrio ambiental. Entretanto, ações antropomórficas
como mineração, atividade industrial, agropecuária, residencial e hospitalar são
responsáveis pela deposição de grande quantidade desses elementos no meio
ambiente, desencadeando o desequilíbrio dos ciclos biológicos. A poluição por metais
pesados tem grande impacto na saúde de animais e dos seres humanos, já que muitos
desses elementos tem meia-vida longa e permanecem depositados nas células
animais e no ambiente (HAN, F.X.; KINGERY, W.L.; SELIM, 2001).
A avaliação das consequências da exposição prolongada a esses elementos
tóxicos nos meios bióticos e abióticos é necessária a fim de se conhecer os possíveis
impactos na saúde animal e humana, impedir a contaminação de alimentos e gerar
políticas de recuperação e preservação ambiental.
25
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 METAIS PESADOS
2.1.1 Características, participação biológica e toxicidade
Por definição, metais são elementos que conduzem eletricidade, são
maleáveis, dúcteis, formam cátions e possuem óxidos básicos (ATKINS, P.; JONES,
1997). Vários elementos são inclusos quando essa definição é utilizada, de modo que
os metais são geralmente classificados em subgrupos, dentre eles, o chamado “metal
pesado”.
O termo “metal pesado” é geralmente utilizado para elementos químicos
pertencentes ao grupo dos metais e metaloides que estão relacionados a poluição
ambiental, efeitos nocivos aos seres vivos e toxicidade (DUFFS, 2002; ALI; KHAN,
2018). São considerados elementos com propriedades metálicas e com número
atômico acima de 20 (TANGAHU et al., 2011). Ainda, os metais pesados também são
definidos como elementos com densidade específica acima de 5g/cm3. Entretanto, a
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) reforça que este termo é
usado incorretamente, já que não existem bases científicas para determinar que os
elementos foram corretamente classificados como metais pesados e que este termo
pode não ter significado (DUFFS, 2002). Apesar dessas diferenças em relação a
definição, e devido ao uso corriqueiro na comunidade científica, o termo “metal
pesado” será utilizado ao longo deste trabalho.
Alguns desses elementos classificados como metais pesados participam de
processos biológicos, sendo essenciais aos seres vivos. O cobre (Cu) está
relacionado a manutenção dos tecidos epitelial e conjuntivo, produção de
hemoglobina, mielina, melanina e funcionamento da tireoide (OSREDKAR, 2011). O
zinco (Zn), por sua vez, é responsável pela atividade de várias enzimas e participa da
resposta imune, da síntese de DNA e da divisão celular (PRASAD, 1978;
SOLOMONS, 2009). O manganês (Mn) é parte fundamental do metabolismo lipídico,
proteico e de carboidrato, além de ser utilizado por várias enzimas (ANDREINI et al.,
26
2008). O cobalto (Co) é parte da vitamina B-12, que participa da manutenção de
hemácias e do sistema nervoso. O molibdênio (Mo) é responsável a síntese proteica,
o crescimento e a síntese de purina (COUGHLAN, 1983). O cromo (Cr) modula a
glicemia (LEWICKI et al., 2014). O Ferro (Fe) atua na eritropoiese, transporte de
oxigênio, regulação gênica, reações de transferência de elétrons, diferenciação celular
e é parte de enzimas que regulam o metabolismo (BEARD, 2001). O manganês (Mg)
atua como cofator para muitas enzimas, dentre elas o manganês-superóxido
desmutase, que possui ação antioxidante (MARTINEZ-FINLEY; CHAKRABORTY;
ASCHNER, 2013). Por fim, o selênio (Se) está envolvido no metabolismo dos
hormônios tiroidianos, ação antioxidante e função imune (BROWN; ARTHUR, 2001).
Alguns elementos classificados como metais pesados são tóxicos para os seres
vivos, podendo ocorrer casos de intoxicação aguda ou crônica, levando o indivíduo a
morte. Os processos de bioacumulação e biomagnificação são fundamentais para a
acumulação e propagação desses elementos tóxicos ao longo da cadeia alimentar,
até chegar ao ser humano. A bioacumulação refere-se à acumulação de elementos
tóxicos nos organismos em decorrência de sua obtenção a partir da dieta ou do
ambiente. Biomagnificação, por sua vez, está relacionada ao aumento da
concentração de elementos tóxicos ao longo da cadeia alimentar (ALI; KHAN, 2019).
Metais pesados nocivos aos seres vivos e com importância na clínica de bovinos são
descritos abaixo.
2.1.1.1 Mercúrio
A intoxicação por mercúrio (Hg) ocorre na dependência da via de contaminação
(ingestão, inalação ou contato), duração da exposição e da dose. Quando em alta
concentração no meio ambiente, a forma inorgânica é transformada na forma orgânica
(metil-mercúrio) a qual participa do processo de bioacumulação e biomagnificação ao
longo da cadeia alimentar (EFSA, 2012; BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013).
O mercúrio orgânico é a forma mais tóxica deste elemento, levando a casos de
intoxicação quando ingerido, já que é quase todo absorvido no sistema
gastrointestinal. É capaz de passar as barreiras hematoencefálica e placentária
(LANGFORD; FERNER, 1999) e geralmente acumula-se nos rins e no fígado,
27
podendo também se acumular no cérebro. As manifestações clínicas observadas
estão relacionadas ao acometimento do sistema nervoso central. Em casos de
intoxicação crônica pela forma orgânica, os animais podem apresentar ataxia,
incoordenação, paresia, convulsão e falência renal, com óbito como desfecho. A forma
inorgânica, por sua vez, tem baixa absorção no sistema gastrointestinal, se
acumulando nos rins (CONSTABLE et al., 2017). Ao exame físico, os animais com
intoxicação hiperaguda pela forma inorgânica vão apresentar gastroenterite e severa
diarreia, com o óbito ocorrendo em poucas horas após o início das manifestações. Em
casos agudos, os animais podem sobreviver por alguns dias e observa-se salivação,
taquicardia, respiração fétida, paralisia posterior e convulsão. Em sua forma crônica,
anorexia, paresia, alopecia, petéquias gengivais, diarreia, incoordenação e
convulsões podem ser observadas (IRVING; BUTLER, 1975; CONSTABLE et al.,
2017; GUPTA et al., 2018).
2.1.1.2 Arsênio
A intoxicação por arsênio (As) pode ocorrer devido a ingestão ou contato com
as formas orgânica ou inorgânica. O acúmulo deste elemento no fígado pode
comprometer a saúde (CONSTABLE et al., 2017). Ainda, a disponibilidade do arsênio
nos alimentos também dependerá da maneira como são preparados para o consumo
(EFSA, 2009). De maneira geral, existem efeitos no sistema gastrointestinal e
neurológico (geralmente em leitões e cordeiros). Os bovinos com síndrome
gastrointestinal podem apresentar casos hiperagudos, com os animais indo a óbito
pouco tempo após o contato. Nos casos agudos, os animais apresentam salivação
intensa, estase ruminal, diarreia fétida e, às vezes, hemorrágica, taquicardia,
desidratação e oligúria. Em casos crônicos, os animais apresentam fatiga, eritema de
mucosas, diminuição da produção leiteira e lesões de pele (CONSTABLE et al., 2017).
BERTIN et al., (2013) realizaram uma meta-análise de 156 casos de intoxicação
bovina por arsênio, e verificaram principalmente diarreia, ataxia, desidratação,
dificuldade respiratória e o óbito dos animais.
28
2.1.1.3 Chumbo
O contato com chumbo (Pb), e consequente intoxicação ocorre geralmente
devido ao comportamento curioso do animal, o qual tem contato com objetos que
contém este elemento, havendo lambedura e ingestão indiscriminada (SHARPE;
LIVESEY, 2006). Embora ocorra naturalmente no ambiente, o uso deste elemento em
atividades antrópicas como mineração, indústrias de baterias, etc., acarreta no
acúmulo em água, solo, ar e, consequentemente, nos alimentos (EFSA, 2010). No
estudo retrospectivo realizado por PUSCHNER; VARGA, (2012), a intoxicação por
chumbo apresentou-se como uma das dez principais origens dos casos de intoxicação
analisados pelos autores. Estudando especificamente casos de intoxicação por
chumbo, SHARPE; LIVESEY, (2006) observaram que esta condição em bezerros é
geralmente ocasionada pelo comportamento curioso, enquanto que nos adultos está
associada ao contato com fontes geoquímicas. Os mesmos autores ainda destacaram
a implicação deste metal pesado na cadeia de produção de alimentos, com potencial
risco a saúde humana, principalmente quando da ingestão contínua e crônica do
chumbo por meio do solo contaminado. Ainda, bovinos, felinos e caninos já foram
descritos como sentinelas para a determinação da exposição humana ao chumbo
(BISCHOFF; PRIEST; MOUNT-LONG, 2010). De maneira geral, a intoxicação por
este elemento leva a manifestações clínicas decorrentes de encefalopatia,
gastroenterite e degeneração de nervos periféricos. Entretanto, tudo depende da
espécie animal, dose e duração da exposição (CONSTABLE et al., 2017). Nos
bovinos, a intoxicação aguda ocorre geralmente nos animais mais jovens e tem curso
rápido (12-24 horas). Ocorre acometimento do sistema nervoso central, com os
animais apresentando convulsões, pupilas dilatadas, opistótono e tremores
musculares particularmente em cabeça e pescoço. Espuma na boca e cegueira são
frequentes. Hiperestesia ao toque e ao som e elevação das frequências cardíaca e
respiratória também são observadas. O óbito geralmente ocorre devido a parada
respiratória durante o quadro convulsivo. Nos adultos, a forma subaguda é a mais
frequente, e os animais geralmente vão a óbito após 4 dias. A função gastrointestinal
é geralmente comprometida e os bovinos intoxicados apresentam inicialmente atonia
ruminal e constipação, seguida de diarreia fétida. Cegueira, opacidade ocular,
tremores musculares e hiperestesia são comuns. Surtos de intoxicação por chumbo
29
já foram descritos no Brasil tanto em bovinos quanto em galinhas (BARBOSA et
al.,2014; TRAVERSO et al., 2004)
2.1.1.4 Cádmio
Embora presente no ambiente devido a atividades vulcânicas (WILLIAMS;
HARRISON, 1984), as atividades antropogênicas (esgotos industriais, fertilizantes e
mineração) também elevaram a concentração de cádmio (Cd) no ambiente tornando-
se, portanto, importante contaminante ambiental (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.;
NITAS, 2013). Em geral, o aumento na concentração de cádmio no solo implica em
maior captação pela vegetação, que servirá de alimento para vários seres vivos, como
os bovinos (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013). Este elemento se acumula
principalmente em rins e fígado e, sabendo que este último é de grande interesse na
alimentação humana, o cádmio é mais um elemento nocivo que pode chegar até o ser
humano por meio da indústria de alimentos (CONSTABLE et al., 2017). Embora não
apresente funções biológicas nos organismos, este elemento mimetiza íons divalentes
e compete com zinco e cobre e se liga a metalotioneína, enzima presente
principalmente em rins e fígado (daí a sua maior deposição nestes orgãos). Como não
consegue ser excretado com sucesso, mantem-se por longos períodos nas células
renais e hepáticas (BAMPIDIS, V.A.; NISTOR, E.; NITAS, 2013; CONSTABLE et al.,
2017). Casos de intoxicação crônica são geralmente os mais comuns e os animais
apresentam inapetência, fraqueza, perda de peso, opacidade de pelos, pouca
queratinização e descamação da pele (POWELL et al., 1964; CONSTABLE et al.,
2017).
2.1.1.5 Cobre
Embora seja um elemento envolvido em processos biológicos, altas
concentrações de cobre (Cu) são nocivas aos organismos. Os animais podem
apresentar casos agudos ou crônicos, seja devido a exposição por via oral ou injetável
30
(CONSTABLE et al., 2017). A intoxicação é mais frequente em ruminantes,
principalmente ovinos. Ao ser ingerido, este elemento é depositado principalmente no
fígado, seguido por rins e cérebro (FAZZIO et al., 2012). Os animais podem apresentar
intoxicação do tipo primária ou secundária. No primeiro caso, animais acometidos pela
forma aguda geralmente vão a óbito em até três dias após a ingestão de altas
concentrações. Os animais podem apresentar gastroenterite, salivação, diarrreia,
desidratação, fezes de coloração azul-esverdeada e o óbito é precedido de choque
com diminuição da temperatura corporal e aumento da frequência cardíaca (REIS et
al., 2010). A intoxicação crônica, por sua vez, está relacionada a liberação do cobre
na corrente sanguínea após a necrose dos hepatócitos, como consequência da
deposição deste elemento por longos períodos. Os animais nesta fase apresentam
hemólise severa devido a modificação da composição da hemoglobina, com
consequente hemoglobinúria e mucosas amareladas e depressão. Em um surto de
intoxicação crônica por cobre no Canadá, bovinos leiteiros apresentaram anorexia,
fraqueza, pouco reflexo pupilar, decúbito, mucosas amareladas, sangue com
coloração chocolate e foram a óbito (BRADLEY, 1993). No tipo secundário, os animais
são intoxicados pela ingestão crônica de forrageiras como Trifolium subterraneum
(Intoxicação crônica por cobre devido a plantas) e Heliotropium europaem e Ecchium
plantagineum (Intoxicação hepática crônica) que, respectivamente, apresentam
pequenas quantidades do elemento ou favorecem sua concentração nos tecidos
(REIS et al., 2010; CONSTABLE et al., 2017). Em 2004, ovinos da raça Corriedale
foram tratados com solução de sulfato de cobre 5% após um surto de footrot. Devido
a impossibilidade de acesso a água por mais de 17 horas, os animais ingeriram a
solução de tratamento e ORTOLANI, E. L.; ANTONELLI, A. C.; SARKIS, (2004)
observaram sinais de intoxicação aguda por cobre, tais como anorexia, gemidos,
atonia ruminal, diarreia azul-esverdeada e membranas congestas. Baixo hematócrito
e elevação dos valores de AST e GGT, ureia e creatinina também foram observados.
Dos 27 animais acometidos, seis foram a óbito e, à necropsia, ulceras gastrointestinais
e hemorragia em mucosas foram observadas. Microscopicamente, havia lesões
hepáticas severas e lesões renais moderadas.
31
2.1.1.6 Alumínio
O alumínio (Al) é considerado um contaminante ambiental e não apresenta
qualquer função biológica conhecida, sendo tóxico para humanos e animais
(BECARIA; CAMPBELL; BONDY, 2002). Quando ingerido, esse elemento se
concentra principalmente nos ossos, e, quando na corrente sanguínea, consegue
transpassar a barreira hematoencefálica. Assim, aqueles que ingerem alta doses de
alumínio podem apresentar manifestações neurológicas, osteoartrite e anemia. Na
revisão sistemática realizada por IGBOKWE; IGWENAGU; IGBOKWE, (2019),
observou-se que os relatos disponíveis na literatura descrevem a presença de alta
concentração de alumínio associada a alterações imunológicas, genotoxicidade,
efeitos pró-inflamatórios, desnaturação de peptídeos, disfunção enzimática,
amiloidose, desregulação na homeostasia do ferro, apoptose e necrose, com
pneumonias intersticial ou alveolar, granulomas, miocardite, trombose, autismo,
pancreatite, câncer de mama, doença de Alzheimer, Doença de Crohn, infertilidade,
dentre outros.
2.1.1.7 Cromo
O Cromo (Cr) em sua forma hexavalente, apresenta-se como grande agente
oxidante, capaz de transpassar barreiras biológicas e a sua inalação é geralmente
responsável por casos de intoxicação. Já a forma trivalente é obtida pela ingestão ou
administração parenteral. Havendo a forma aguda, o indivíduo intoxicado por cromo
apresentará gastroenterite, lesões renais e hepáticas (THOMPSON, 2018).
32
2.1.1.8 Ferro
A intoxicação por ferro (Fe) é incomum em grandes animais e pode ocorrer
devido a ingestão de alimentos contaminados (com danos gastrointestinais) ou por via
injetável (havendo insuficiência e falência hepática) (CONSTABLE et al., 2017).
2.1.1.9 Cobalto
Como dito anteriormente, o cobalto (Co) é parte essencial da cianocobalamina
(Vitamina B12). Os ruminantes são capazes de sintetizar esta vitamina, havendo a
devida ingestão de cobalto. A intoxicação por este elemento geralmente ocorre devido
a preparo errôneo de ração ou ingestão de água contaminada. Os animais com
intoxicação por cobalto apresentam anorexia, apatia, perda de peso e incoordenação
(CONSTABLE et al., 2017). Poliúria, excessiva defecação e salivação também podem
ser observados (NRC, 2001).
2.2 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
Além dos elementos considerados essencialmente tóxicos, àqueles com
participação biológica podem causar toxicidade desde que em concentração acima do
necessário. A presença de atividades antropogênicas levaram a contaminação
ambiental inclusive para a região da Antarctica, havendo detecção de poluentes no ar,
neve e organismos marinhos por conta de derramamento de óleo, incineração de lixo,
esgoto e queima de combustível pelo turismo e pesquisa na região (BARGAGLI,
2008). Embora presentes no meio ambiente e em concentrações que permitem o
equilíbrio ecológico, atividades antropogênicas como mineração, indústrias, esgotos
residenciais e hospitalares e atividades agrícolas são as grandes responsáveis pelo
aumento da concentração destes elementos no meio ambiente (solo, água e ar).
33
A atividade agrícola é umas das grandes responsáveis pelo descarte de
produtos tóxicos no meio ambiente, culminando na contaminação de fauna e flora.
Dados da Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO),
mostraram que o Brasil foi o país que mais consumiu agrotóxicos em 2013, estando
em sétimo lugar no ranking de gastos totais por área cultivada. O Brasil, ainda, ocupa
o 13º lugar no ranking de países consumidores de agrotóxicos, levando em
consideração os gastos com pesticidas e o tamanho da produção agrícola (GRIGORI,
2019). Em revisão sobre o potencial de herbicidas utilizados em culturas de milho, soja
e cana-de-açúcar, VIEIRA et al., (2020), verificaram que o glifosato é o herbicida mais
utilizado no Brasil e que, todos os princípios ativos utilizados chegam ao solo e aos
cursos d’água por meio de processos de lixiviação e escoamento superficial, podendo
interferir negativamente na saúde humana e animal. Relatos da presença de outros
princípios ativos no meio ambiente estão disponíveis na literatura nacional (ARMAS
et al., 2007; DORES et al., 2008; BRITTO et al., 2012).
O esgoto doméstico contém resíduos de excreções, produtos sanitizantes,
farmacêuticos, cosméticos, dentre outras substâncias. Todos apresentam elementos
contaminantes como metais pesados, antimicrobianos (medicamentos e
desinfetantes), hormônios, anti-inflamatórios, etc. (DAUGHTON; TERNES, 1999).
Essas substâncias são geralmente geradas a partir dos resíduos da cozinha,
lavanderia, banho e lavagem de roupas (MORIYAMA et al., 1988) e descartadas nos
cursos d’água, podendo contaminar solo, vegetais e sendo diretamente consumidos
por animais e humanos. Na revisão produzida por LIU; WONG, (2013), destaca-se
que, embora o risco de intoxicação aguda por produtos farmacêuticos e de cuidados
pessoais contaminando o ambiente seja baixa, casos de intoxicação crônica não
podem ser descartados e, pontuam ainda, a crescente detecção de resistência
bacteriana na China, tendo a contaminação ambiental como possível causa. A
presença de subdoses de antimicrobianos pode ocasionar a persistência e a
emergência de genes de resistência a antibióticos, fato este de grande interesse na
saúde pública humana e veterinária (WHO, 2018).
A atividade industrial também é responsável pela contaminação ambiental
pelos resíduos gerados em suas atividades. A presença de inúmeras substâncias
nocivas ao meio ambiente como metais, colocam em risco a manutenção do equilíbrio
ecológico. Na estimativa realizada em 2002, somente 22% do resíduo industrial
gerado no Brasil recebia o tratamento adequado, de forma que o restante era
34
acondicionado em aterros sanitários (CAMPANILI, 2002), representando risco ao meio
ambiente e aos seres humanos. Em 2001, adultos e crianças da cidade de Paulínia,
Estado de São Paulo, apresentaram, respectivamente, intoxicação crônica e altos
níveis de cádmio, alumínio, zinco, cobre, arsênio e manganês, após serem expostos
a resíduos de uma importante indústria química (GUAIME, 2001). Em 2002, o Brasil
se deparou com a contaminação de 314 crianças por chumbo devido a liberação deste
elemento pelas chaminés de uma fábrica de baterias automotivas (TOMITA; PADULA,
2005). Animais e produtos agrícolas e de origem animal também apresentaram-se
contaminados, gerando prejuízos à vida e a economia da região de Bauru, Estado de
São Paulo (ACEITUNO, 2002a, 2002b, 2002c). Estes fatos salientam a necessidade
de fiscalizações mais rigorosas quanto a produção e descarte de resíduos industriais
no ambiente.
A mineração também destaca-se como potencial fonte de contaminação
ambiental. Os resíduos de mineração geralmente apresentam grande quantidade de
componentes que em parte são re-extraídos e utilizados na indústria (AZAROVА;
USMANOVA; MEZHIBOR, 2018). Entretanto, os resíduos restantes ainda apresentam
elementos em altas concentrações, sendo considerados fontes de contaminação
ambiental. De maneira geral, podem apresentar metais nativos como ouro, além dos
elementos associados a óxidos, carbonatos e sulfatos que contém elementos
potencialmente perigosos, como arsênio, cobre, cádmio e chumbo (BINI, 2014; BINI;
MALECI; WAHSHA, 2017). Estima-se que a geração de resíduos é proporcional a
extração dos elementos (BINI; MALECI; WAHSHA, 2017). A depender da natureza do
mineral extraído, o resíduo pode ser recuperado em pilhas, montes ou barragens, mas
quando a construção e a manutenção destas não é realizada de maneira correta, todo
resíduo ali depositado pode ser liberado no meio ambiente, havendo danos para flora,
fauna e na vida das pessoas que habitam a região.
Problemas técnicos e estruturais de barragens brasileiras foram destaque na
mídia nacional e internacional, pois geraram consequências inimagináveis tanto pela
contaminação ambiental quanto pela morte de centenas de pessoas no Estado de
Minas Gerais. Em 2006, cerca de 400 milhões de litros de rejeito de lavagem de
bauxita foram vazados da barragem localizada no município mineiro de Miraí (à 335
km da capital Belo Horizonte). Em 2007, aproximadamente dois milhões de metros
cúbicos de lama armazenadas na mesma barragem foram novamente despejados no
meio ambiente, prejudicando a natureza e a estrutura do município, que ficou sem
35
abastecimento de água devido a contaminação do rio Muriaé (ACAYABA, C.;
BAPTISTA, R.; NOGUEIRA, 2007).
O município mineiro de Mariana foi severamente acometido pelo vazamento
de mais de 43 milhões de metros cúbicos de rejeito de minério de ferro devido ao
rompimento da barragem do Fundão (CARMO et al., 2017), em novembro de 2015. A
lama percorreu quase 670 km de cursos d’agua, ocasionando a poluição da bacia do
Rio Doce (chegando até o oceano Atlântico) e a destruição da vegetação nativa,
deixando cerca de 19 moradores mortos e centenas de desabrigados (G1, 2019). A
lama invadiu casas, comércios, escolas (Figura 1), além de destruírem propriedades
leiteiras e plantações localizadas na bacia do Rio Doce. Dois anos após o rompimento,
CARVALHO et al., (2017) analisaram a água da região e verificaram altas
concentrações de elementos como chumbo, arsênio, níquel, cobre, alumínio e
manganês, podendo estarem relacionados ao ocorrido em 2015. Assim, observa-se
que as consequências se mantêm por longos períodos, podendo impactar a saúde
humana e animal devido a exposição a longo prazo.
Figura 1 - Destruição de construções e evidências do acidente em árvores à beira do Rio do Carmo, provocadas pela lama despejada após o rompimento da barragem do Fundão em Mariana, Minas
Gerais, Brasil, 2020.
Fonte: Gaeta, N.C.; 2021
36
Embora o acontecido em Mariana seja considerado o maior desastre
ambiental do país, o ano de 2019 foi marcado pela morte de 259 pessoas, além de 11
desaparecidos após o rompimento de outra barragem em Brumadinho, Minas Gerais.
Catorze milhões de toneladas de lama e rejeitos de minério de ferro foram despejados
e percorreram o rio Paraopeba, contaminando solo, água, e destruindo tudo à sua
frente (RODRIGUES, 2019).
Esses acontecimentos evidenciam a situação frágil e de negligência quanto a
gestão dos resíduos de minério no Brasil. A contaminação ambiental, animal e
humana decorrente desses fatos pode levar a graves consequências a saúde devido
a presença de elementos tóxicos como os metais pesados.
2.2.1 Consequências da exposição prolongada a metais pesados
2.2.1.2 Modificação da microbiota animal e humana
A ingestão crônica de metais pesados pode levar a complicações a saúde
devido tanto ao seu efeito direto, quanto ao seu efeito acumulativo (JAISHANKAR et
al., 2014). Uma vez ingerido, o intestino absorve os elementos, que se depositam
principalmente no fígado. Entretanto, parte do ingerido permanece no lúmen intestinal,
podendo interferir no microambiente e no seu funcionamento (BRETON et al., 2013).
No estudo realizado por BRETON et al., (2013), a administração de chumbo
e cádmio modificou a microbiota intestinal de ratos. Por meio de sequenciamento do
gene 16S rRNA, observou-se a diminuição da abundância de Lachnospiraceaee e
aumento de Lactobacillaceae e Erysipelotrichaceacae. A baixa abundância de
Lachnospiraceae está associada a colite e inflamação intestinal (LEPAGE et al.,
2011). Ainda, ratos foram expostos a arsênio e cadmio por meio da água de bebida,
e os resultados indicaram que o cádmio foi responsável por modificação significativa
na microbiota intestinal destes animais, com diversidade microbiana mais baixa,
diferentemente do arsênio cuja diminuição da diversidade não foi significante. Ainda,
para ambos os tratamentos, houve diminuição de gêneros bacterianos, principalmente
daqueles produtores de butirato (LI et al., 2019). GUO et al., (2014) estudaram ratos
37
que receberam arsênio (3 mg/L em água), ferro (5 mg/L em água) e uma combinação
dos dois elementos por 90 dias e observaram que a abundância relativa de Firmicutes,
Tenericutes e Proteobacteria apresentaram-se mais elevadas nos três grupo,
enquanto que houve diminuição de Bacteroidetes e TM7. Acidobacteria e
Cyanobacteria apresentaram-se mais elevadas nos animais expostos somente ao
arsênio. Já na presença de ferro (sozinho ou em combinação), observou-se o aumento
na abundância de Verrucomicrobia. Em sua revisão, ROSENFELD, (2017) destaca a
variação dos resultados entre os estudos que avaliam a modificação da microbiota de
animais frente a ingestão contínua de metais pesados. A autora afirma que essa
diferença observada é multifatorial, havendo a interferência de diferentes
espécies/genótipos de ratos utilizados, diferentes agentes químicos, doses e períodos
e a utilização da água como única maneira de exposição aos agentes, mesmo a
comunidade científica sabendo da possibilidade de contato por meio de ingestão e até
via transdérmica.
No ambiente ruminal FORSBERG, (1978b) demonstrou que Bacteroides
succinogenses, Ruminococcus albus, Bacteroides amylophilus e Eubacterium
ruminantium foram sensíveis a elementos como cadmio, mercúrio, cobre, arsênio e
cromo. FORSBERG, (1978a), avaliou o efeito do arsênio no crescimento de algumas
bactérias residentes no rúmen e destacou o efeito inibitório no crescimento de
Selenomonas ruminantium e aumento no crescimento de Streptococcus bovis como
resposta a presença de arsenato de sódio. É sabido que os microrganismos residentes
no rúmen são responsáveis pela fermentação e produção de metabólitos importantes
que mantem a saúde do animal. Modificações em alguns componentes da microbiota
podem provocar disbioses e consequências negativas a saúde e produção dos
ruminantes. O resultado descrito por FORSBERG, (1978a) é particularmente
importante pois a presença de arsênio no rúmen (em alta concentração), pode
ocasionar quadros de acidose aguda, enfermidade relacionada ao predomínio de
bactérias produtoras de ácido láctico como S. bovis em detrimento a espécies
utilizadoras como S. ruminantium (KIM et al., 2020).
Em seres humanos, SHAO; ZHU, (2020) avaliaram a diversidade da
microbiota intestinal de homens e mulheres residentes em locais próximos a áreas de
mineração na China, estando expostos cronicamente a arsênio, cádmio, cobre,
chumbo e zinco. Os resultados indicaram alta abundância de Lachnospiraceae,
Eubacterium eligens, Ruminococcaceae UGG-
38
014, Erysipelotrichaceae UCG -003, Tyzzerella 3, Bacteroides, Slackia e Roseburia.
Ainda, a microbiota masculina apresentou-se mais uniforme e rica e estas
modificações estariam relacionadas a maior exposição desse gênero devido aos
hábitos diários como o trabalho direto na mineração. Crianças expostas a alta e baixa
concentração de arsênio foram estudadas em Bangladesh, e o sequenciamento do
gene 16S rRNA revelou elevada abundância de Proteobacteria nas crianças expostas
ao arsênio em elevada concentração (DONG et al., 2017). Este grupo ainda
apresentou cepas de Escherichia coli contendo operons de resistência ao arsênio se
expressando mais que no grupo controle.
2.2.1.3 Modificação do microbiota ambiental
A microbiota ambiental também sofre as consequências da exposição
prolongada a metais pesados, havendo a prevalência de bactérias resistentes a esses
elementos. Isso vem sendo comprovado por várias pesquisas como a realizada por
PEREIRA; VICENTINI; OTTOBONI, (2015), na qual estudaram amostras de solo e
drenagem de uma mina de cobre brasileira e observaram a dominância de bactérias
do gênero Meiothermus, geralmente presentes em ambientes termais (SIKORSKI et
al., 2010), nas amostras de drenagem e em ambos ambientes, observaram bactérias
heterotróficas, incluindo aquelas resistentes a metais pesados. CHEN et al., (2018b)
verificaram que a contaminação prolongada por mercúrio influenciou o microbioma
presente nos sedimentos do Rio Amarelo, localizado na China. Os filos
Proteobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes, apresentaram genes de resistência a este
elemento e foram os filos funcionais centrais nos sedimentos contaminados. A análise
dos componentes bacterianos e fúngicos de solos contaminados por mercúrio
indicaram que a exposição prolongada levou a modificação da estrutura da
comunidade desses dois grupos, quando comparado a solos não contaminados. O
estudo do efeito a curto prazo não evidenciou nenhuma modificação das comunidades.
Os autores observaram que a abundância do gene merA, importante redutase parte
do sistema que confere resistência ao mercúrio, era maior quanto maior a
concentração desse elemento no solo, independentemente do tempo de exposição.
39
É importante salientar que, embora o estudo da microbiota do solo não seja
parte do escopo deste trabalho, o conhecimento sobre sua modificação taxonômica e
quanto ao resistoma em decorrência da exposição aos metais pesados é de extrema
importância. Durante a pastagem, os ruminantes geralmente ingerem o solo com a
gramínea, havendo, portanto, a ingestão desses microrganismos resistentes e de
elementos nocivos à saúde.
2.2.2 Resistência a antimicrobianos
A ser considerada uma das principais causas de morte em seres humano em
2050 (WHO, 2015), a resistência a antimicrobianos é um dos tópicos mais estudados
no meio acadêmico, tanto pela medicina humana e veterinária quanto às ciências da
vida, com estudo de ambientes e organismos bióticos e abióticos. Hoje, é parte da
chamada Saúde Única (One Health), já que muitas bactérias antes consideradas
comensais estão sendo apontadas como agentes emergentes de enfermidades em
seres humanos (principalmente infecções nosocomiais). Ainda, a disseminação dos
genes de resistência pode ocorrer de bactérias com baixa virulência, para aquelas
consideradas altamente virulentas, causando dificuldades para o tratamento de
animais e seres humanos.
A resistência a antimicrobianos é um fato que ocorre naturalmente nos
microrganismos. No ambiente, muitos deles produzem substâncias antimicrobianas e,
para sobreviverem, necessitam de mecanismos que impeçam a ação dessas
substâncias. Estes convivem com outros microrganismos na comunidade, havendo,
portanto, troca de material genético (MUNITA; ARIAS, 2016). Entretanto, ações
antropomórficas são responsáveis pela maior pressão de seleção e,
consequentemente, rápido surgimento e disseminação de genes de resistência. O
esgoto (hospitalar, industrial, doméstico, e aquele produzido pela atividade agrícola) é
geralmente despejado em rios, lagos ou oceanos, cuja água pode ser utilizada para
irrigação, na produção animal ou para a pesca. Hortifrútis, produtos de origem animal
e até mesmo a água são vetores de disseminação desses genes ao ser humano e aos
animais (GWENZI; MUSIYIWA; MANGORI, 2020).
40
2.2.2.2 Origem e mecanismos
Os microrganismos podem apresentar inúmeros mecanismos de resistência a
antimicrobianos, cuja origem pode ser intrínseca ou adquirida.
Resistência de origem intrínseca é aquela em que é compartilhada com os
indivíduos da mesma espécie, independe de prévia exposição ao agente e não está
relacionada a transferência genética horizontal (MARTINEZ, 2014). Dentro deste
grupo, destacam-se dois mecanismos: i) limitação da captação da droga e ii) efluxo
ativo da droga. O primeiro mecanismo ocorre devido a permeabilidade da membrana
externa existente nas bactérias Gram-negativas, fina membrana que circunda uma
fina camada de peptideoglicanos. Essa membrana externa apresenta moléculas
chamadas de lipídio A, que estão covalentemente ligadas a polissacarídeos. Cada
molécula de lipídio A liga-se a várias cadeias de aminoácidos, de modo a contribuir
com o aumento do limite de permeabilidade (COX; WRIGHT, 2013). Isso permite que
várias bactérias Gram-negativas sejam intrinsicamente resistentes a inúmeros
princípios ativos, como ocorre com Pseudomonas aeruginosa (ANGUS et al., 1982)
(embora esta característica por si só não explique todo o fenótipo observado nesta
espécie). P. aeruginosa como outras, apresentam outros mecanismos intrínsecos
denominados Bombas de Efluxo Multidroga Resistentes (do inglês Multidrug
Resistance Efflux Pumps) (mecanismo de efluxo ativo da droga), cujos genes
codificadores estão presentes nos cromossomos (COX; WRIGHT, 2013). Essas
bombas de efluxo são classificadas em cinco tipos: ATP binding cassete (ABC), major
facilitator (MF), multidrug and toxic-compound efflux (MATE), small multidrug
resistance (SMR) e resistance-nodulation division (RND), sendo este o principal
relacionado a resistência intrínseca de Gram-negativas (COLCLOUGH et al., 2020).
Vale salientar que os mecanismos que conferem resistência intrínseca a
antimicrobianos são encontrados tanto em bactérias patogênicas quanto em
comensais e ambientais.
Microrganismos que inicialmente eram sensíveis a um determinado
antimicrobiano, mas que devido a i) mutação de genes cromossomais ou a ii) obtenção
de determinantes genéticos externos, apresentam mecanismos de resistência de
origem adquirida (MUNITA; ARIAS, 2016; C REYGAERT, 2018). A mutação de genes
41
cromossomais ocorrem geralmente pela presença de fatores estressantes como falta
de nutrientes, radiação ultravioleta, dentre outros, e está frequentemente relacionada
a genes específicos associados a dois outros mecanismos que conferem resistência,
denominados “modificação do alvo” e “inativação da droga”. Associados às mutações,
os genes externos são obtidos pelos microrganismos por meio da transferência
horizontal, seja por transformação, transposição e/ou conjugação, tendo os
plasmídeos sua principal rota de aquisição de material genético externo (VAN HOEK
et al., 2011; MUNITA; ARIAS, 2016; REYGAERT, 2018). Diferentemente da
intrínseca, a resistência adquirida ocorre devido ao uso de antimicrobianos, seja em
baixa dose ou dose sub-letal e até mesmo devido a exposição prolongada,
promovendo elevação da taxa de mutações pela seleção de indivíduos cada vez mais
resistentes (REYGAERT, 2018). O mecanismo de modificação do alvo ocorre, por
exemplo, em indivíduos Gram-positivos que apresentam proteínas ligantes de
penicilina (do inglês penicilin-binding proteins). A diminuição ou perda da habilidade
da droga em se ligar a essas proteínas está relacionada ao aumento no número de
proteínas presentes e na modificação de sua estrutura, como ocorre nos S. aureus
devido a presença do gene mecA (REYGAERT, 2009). Em Gram-negativas,
modificações na DNA gyrase (gene gyrA) e em precursores de peptideoglicanos (gene
van), são exemplos desse mecanismo de resistência (COX; WRIGHT, 2013).
Sendo provavelmente o mecanismo mais estudado, a modificação da droga
tem grande importância em bactérias comensais e patogênicas devido a sua alta
prevalência. A degradação da droga geralmente ocorre devido a atuação de enzimas,
como as beta-lactamases. A produção de beta-lactamases é o principal mecanismo
de resistência utilizada pelos indivíduos Gram-negativos contra a ação de
medicamentos beta-lactâmicos (C REYGAERT, 2018). Essas enzimas são
geralmente classificadas quanto a sua estrutura (AMBLER, 1980) e função (BUSH;
JACOBY, 2010). Em relação a estrutura, as beta-lactamases são classificadas em 4
classes (A, B, C e D), estando relacionadas a identidade da sequência de aminoácidos
(AMBLER, 1980). Quanto a função bioquímica, as beta-lactamases são classificadas
de acordo com a especificidade do substrato (cefalosporinases, serino-beta-
lactamases e metallo-beta-lactamases) (BUSH; JACOBY, 2010). Essas enzimas
podem ser tanto encontradas nos cromossomos quanto serem adquiridas via
transferência horizontal por meio de plasmídeos, ocorrendo principalmente nas
Enterobacteriaceae. A enzima AmpC (codificada pelo gene ampC), foi a primeira beta-
42
lactamase a ser descrita; é pertencente à classe C da classificação estrutural
(AMBLER, 1980) e cefalosporinase do grupo I, de acordo com a classificação
funcional (BUSH; JACOBY, 2010). O gene é codificado no cromossomo e a enzima
confere resistência a penicilinases, cefalosporinas de primeira geração e aztreonam
(MUNITA; ARIAS, 2016). Enzimas que conferem resistência a penicilinas, e
cefalosporinas de primeiras e última gerações são designadas “beta-lactamases de
espectro estendido” (do inglês extended-spectrum beta-lactamase – ESBL), que
podem pertencer às famílias TEM, SHV, CTX-M e OXA, todas codificadas pelo gene
bla. A família CTX-M é a mais numerosa, sendo amplamente detectada em humanos
(WOERTHER et al., 2013; SCHMITHAUSEN et al., 2019; WANG et al., 2019), animais
(SHIRAKI et al., 2004; MA et al., 2012; CUNHA et al., 2017; PALMEIRA et al., 2018;
CARVALHO et al., 2020) e no ambiente (KIM; KANG; LEE, 2008; MA et al., 2012;
ZURFLUH et al., 2013; AMOS et al., 2014). Os microrganismos produtores de ESBL
geralmente são sensíveis a inibidores de beta-lactamases como amoxicilina com ácido
clavulânico, piperaciclina com tazobactam e ampicilina com sulbactam (SCHULTSZ;
GEERLINGS, 2012). Por fim, as carbapenemases são classificadas em dois grupos:
Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs) e Enterobacteriaceae resistentes a
carbapenêmicos (ERC), cujas enzimas mais detectadas são IMP-1 (do inglês
imipenem resistance) e VIM-1 (do inglês Verona integron encoded metallo-beta-
lactamase). Uma nova metallo-beta-lactamase identificada foi a NDM-1 (do inglês
New-Delhi metallo-beta-lactamase). Microrganismos produtores de carbapenemases
são de grande importância clínica por serem resistentes a todos os medicamentos
beta-lactâmicos, e suas infecções são de difícil tratamento (BAJAJ; SINGH; VIRDI,
2016; CODJOE; DONKOR, 2017).
2.2.2.3 Resistência a metais pesados e a co-resistência
Além de poderem apresentar resistência a antibióticos, as bactérias podem
apresentar tolerância a inúmeros metais pesados. Bactérias isoladas de esgoto
hospitalar e de uma faculdade apresentaram tolerância a cromo (principalmente
Gram-positivas) e prata e mercúrio (Gram-negativas), sendo este último elemento com
a porcentagem de tolerância mais significante (LIMA E SILVA et al., 2012)
43
principalmente naqueles microrganismos recuperados de esgoto hospitalar. JARDINE
et al. (2019) estudaram bactérias isoladas de água e sedimento de águas termais na
África do Sul e detectaram indivíduos tolerantes ao menos a dois dos seguintes
elementos: alumínio, cromo, cobre, ferro, mercúrio, manganês, níquel e chumbo.
Microrganismos Gram-negativos de importância médica (E. coli, A. baumannii e P.
putida) obtidos de esgoto na Índia foram tolerantes a mercúrio, cádmio, cromo e cobre
(MANDAL; DAS; MANDAL, 2020).
Somado aos inconvenientes diretos relacionados à saúde humana e animal,
os metais pesados também possuem importante papel na co-seleção e disseminação
da resistência a antimicrobianos, estando associados a dois importantes mecanismos.
A co-resistência, é o mecanismo na qual dois ou mais genes de resistência se
localizam no mesmo elemento genético móvel (plasmídeo, integron, transposon)
(CHAPMAN, 2003; BAKER-AUSTIN et al., 2006) e, quando há transferência de um
gene, ocorre a transferência do outro gene. A resistência cruzada, no entanto, ocorre
quando dois ou mais antimicrobianos possuem o mesmo alvo de ação, compartilham
a mesma via de acesso ao seu alvo ou induzem o mecanismo de apoptose pela
mesma via (CHAPMAN, 2003; BAKER-AUSTIN et al., 2006) (Figura 2).
Figura 2 – Exemplos de mecanismos moleculares relacionados a co-seleção de metais e antibióticos
Fonte: Baker-Austin et al., 2006
44
Alguns mecanismos de resistência aos metais são amplamente estudados e
seus componentes conhecidos, como é o caso da resistência ao mercúrio, arsênio,
prata e cobre. A resistência ao mercúrio é conferida pelo trabalho de uma redutase e
um sistema de proteínas que transportam o íon para fora da célula. O operon de
resistência ao mercúrio é formado pelos genes merA (codificadora da enzima mercúrio
redutase, responsável por reduzir Hg2+ a Hg0), merB (codificadora da enzima liase
organomercurial – presença facultativa no operon, conferindo resistência ao mercúrio
orgânico), merP (codifica uma proteína periplasmática), merT, merC, merE, merF e
merG (codificam proteínas de membrana interna com a possibilidade da presença de
um ou mais genes – transportando Hg2+ para o citoplasma, onde será reduzido pela
redutase), merR e merD (proteínas regulatórias – possibilidade da presença de
somente um dos genes) (HOBMAN; CROSSMAN, 2015). A evidência indireta de co-
resistência entre mercúrio e antibióticos foi descrita por SUMMERS et al., (1993), os
quais demonstraram a transferência de resistência de mercúrio e antibióticos por
plasmídeo conjugativo. A partir disso, outros estudos indicaram a possibilidade de co-
resistência, como no conduzido por RASMUSSEN, L.D.; SORENSEN, (1998), que
descreveram uma evidência indireta de co-resistência a mercúrio e tetraciclina devido
a presença dos genes de resistência em plasmídeos conjugativos. Recentemente, o
transposon de resistência ao mercúrio Tn21-like foi descrito em várias bactérias Gram-
negativas (HOBMAN; CROSSMAN, 2015) e é considerado um dos melhores
exemplos de ligação genética entre metais e genes de resistência a antibióticos e
compostos de quaternário de amônio (PAL et al., 2015).
O mecanismo de resistência ao arsênio é outro sistema bem estabelecido,
sendo conferido pelo ars operon. O operon funcional mais simples é formado pelos
genes arsR (codificador de proteína repressora transcricional responsiva ao arsenito),
arsB (codificador de antiporter de arsenito) e arsC (codificador de arsenato redutase).
Alguns microrganismos apresentam genes adicionais, como arsD (codificador de uma
metalochaperona relacionada ao efluxo de arsenito associada a arsAB) e arsA
(codificador de ATPase, associada a proteína ArsB) (HOBMAN; CROSSMAN, 2015).
Ainda, é possível a presença do gene arsR, codificador de uma proteína
metaloregulatória (BEN FEKIH et al., 2018). Além destes genes presentes em
plasmídeos, um componente cromossômico já foi identificado em Alcaligenes faecalis
e Thiobacillus ferrooxidans (BUTCHER; DEANE; RAWLINGS, 2000; BEN FEKIH et
al., 2018).
45
A resistência a prata é geralmente conferida pelo sil operon, formado por
genes codificadores de proteínas regulatórias (silR e silS), ATPase (silP), sistema de
efluxo (silCBA), chaperona periplasmática (silF), proteína periplasmática ligante de
prata (silE). Resistência endógena também foi observada em bactérias Gram-
negativas, como E. coli, a partir da derepressão do sistema cromossomal Cus e perda
de porinas na membrana externa (LOK et al., 2008). Bactérias multidroga resistentes
e com diferentes sil genes foram isoladas de queimaduras e feridas de humanos e a
conjugação de plasmídeos permitiu a transferência da resistência a prata para as
bactérias transformantes (FINLEY et al., 2015; HOSNY et al., 2019). SÜTTERLIN et
al., (2017) detectaram alta frequência de genes de resistência a prata em isolados de
Enterobacter sp. e Klebsiella sp. e Escherichia coli.
Por fim, na resistência ao cobre, existem dois sistemas codificados por genes
presentes o cromossomo: cue e cus, os quais foram inicialmente identificados em E.
coli (BONDARCZUK; PIOTROWSKA-SEGET, 2013; HOBMAN, J.L.; CROSSMAN,
2015). O primeiro sistema tem sua expressão induzida por baixa concentração de
cobre e é composto pelo gene cueR (codificador de uma proteína reguladora), copA
(codificador de ATPase de efluxo de cobre) e cueO (codificador de uma oxidase multi-
cobre) (OUTTEN et al., 2001; HOBMAN, J.L.; CROSSMAN, 2015). Já o sistema cus,
cuja expressão é induzida por alta concentração de cobre, é formado por duas
proteínas regulatórias (CusRS – gene cusRS), uma bomba de efluxo da família
Resistance-Nodulation-cell division (CusCBA – gene cusCBA) e uma
metalochaperona periplasmática (CusF – gene cusF) (HOBMAN, J.L.; CROSSMAN,
2015). Outro mecanismo possível é o sistema pco, inicialmente detectado em E. coli
isolada a partir de amostras de efluentes suínos, cujos animais eram suplementados
com cobre (TETAZ; LUKE, 1983; BROWN et al., 1995). Este sistema é composto por
duas proteínas regulatórias (PcoRS – gene pcoRS), proteínas periplasmáticas (PcoA
– uma oxidase, PcoC – uma chaperona e PcoE – genes pcoA, pcoC e pcoE), uma
proteína de membrana externa (PcoB – gene pcoB) e interna (PcoD – gene pcoD).
RENSING; GRASS, (2003) afirmaram que, a presença de PcoC e PcoD é necessária
para a resistência ao cobre ser completa
46
2.3 DETECÇÃO DOS METAIS PESADOS
A análise de metais pesados é usualmente realizada por meio das técnicas
destrutivas de espectroscopia de massa por plasma indutivamente acoplado (do inglês
inductively coupled plasma – mass spectrometer -ICP-MS) ou espectrofotometria de
emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (inductively coupled plasma –
optical emission spectrophotometer – ICP-OES). As análises destrutivas geralmente
são mais acuradas e precisas, entretanto, necessita de processos de preparação das
amostras que podem introduzir contaminação e atrapalhar as análises (CHOI et al.,
2019).
A fluorescência de raio-X é uma ferramenta do tipo não destrutiva, cuja
introdução de contaminação não é um problema, já que geralmente não necessita de
prévia preparação de amostras, mas precisa de uma matriz de referência que pode
introduzir certa limitação quanto a acurácia das análises (CHOI et al., 2019). Esta
técnica é rápida e de análise quantitativa e qualitativa multi-elementar. Aqui, os átomos
presentes nas amostras são excitados pelo feixe de raio-X com alta energia, havendo
emissão de fótons cuja energia é determinada pelo número atômico do elemento
(STRELLI, C.; WOBRAUSCHEK, P.; KREGSAMER, 1999). As técnicas de
fluorescência de raio-X existentes atualmente são: Fluorescência de raio-X dispersivo
de comprimento de onda (do inglês Wavelengh dispersive x ray fluorescence -
WDXRF), Espectrometria de fluorescência de raio-X por dispersão de energia (do
inglês Energy Dispersive X-ray Fluorescence - EDXRF), Espectrometria
de fluorescência de raio-X com geometria cartesiana ( do inglês Cartesian Geometry
Energy Dispersive X-ray Fluorescence Spectrometer -NEX CG), Espectrometria de
fluorescência de raio-X por reflexão total (do inglês Total Reflection X-ray
Fluorescence Spectrometry - TXRF)
Espectrometria de fluorescência de raio-X com fonte de luz sincrotron (do inglês
Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence - SRXRF) e Espectrometria
de fluorescência de raio-X por indução de partículas (do inglês Particle-Induced X-ray
Emission - PIXE). Comercialmente, EDXRF, NEX CG e WDXRF são as técnicas mais
utilizadas. A WDXRF possui equipamento de bancada, facilitando sua utilização em
pequenos espaços. Ao iniciar a análise, o equipamento emite feixos de raio-X na
amostra, com produção de
47
fluorescência padrão para cada elemento químico. Cada fluorescência emitida é
difratada por um cristal analisador e captada por um detector (SCAPIN, 2003).
O WDXRF vem sendo utilizado na área médica para análise de elementos
traço presentes em sangue humano de pacientes com câncer (SINGH et al., 2018),
diabetes mellitus tipo 2 (DURAK et al., 2010) e em placenta (ÖZDEMIR et al., 2009).
Em animais, já foi utilizado para avaliar a composição de besouros d’agua (ERMAN,
2011), moluscos bivalves (COSTA et al., 2019), couro ovino e bovino (NEIVA et al.,
2018) e dentina bovina, suína e ovina (TERUEL et al., 2015). CARVALHO, (2019) foi
o primeiro a implementou uma metodologia para avaliação de elementos tóxicos em
soro de aves e ao nosso conhecimento, não existem trabalhos até o momento que
tenham utilizado esta técnica em soro de ruminantes.
2.4 SHOTGUN SEQUENCING
Técnicas cultivo-dependentes são frequentemente utilizadas como ferramentas
diagnósticas, mas são limitadas já que a maioria dos microrganismos são de difícil
cultivo e isolamento em laboratório (SHARPTON, 2014). O sequenciamento de nova
geração permitiu o estudo da microbiota presente numa amostra, incluindo espécies
de difícil cultivo. Diferentemente do sequenciamento do gene 16S rRNA (que fornece
apenas informações taxonômicas), o metagenoma (shotgun sequencing) é uma
ferramenta em cujo protocolo o DNA é cortado em pequenos fragmentos que,
sequenciados independentemente, permit a avaliação de comunidades bacterianas,
predição de genes, diversidade proteica, perfil funcional e o perfil de genes de
resistência a antimicrobianos (SHARPTON, 2014; QUINCE et al., 2017).
Esta ferramenta vem sendo amplamente utilizada na área veterinária para
estudo de dermatite digital em bovinos (ZINICOLA et al., 2015), metrite bovina
(BICALHO et al., 2017), predição de eficiência alimentar e consumo em bovinos
(DELGADO et al., 2019), mastite bovina (BHATT et al., 2012), resistoma em fezes
vacas leiteiras (LIU et al., 2019), dentre outros. Ainda, o shotgun sequencing também
vem sendo a ferramenta de escolha para o estudo da modificação do resistoma e do
48
microbioma de amostras ambientais em decorrência da presença de metais pesados,
como em solo agriculturável (SALAM et al., 2020), sedimento de lagos glaciais
(FILIPIC et al., 2020) e solos cronicamente poluídos (SALAM, 2020).
Atividades antropogênicas como a mineração são responsáveis pela deposição
de elementos tóxicos no ambiente (NGUYEN et al., 2019). Como já mencionado
anteriormente, em 2015 houve a ruptura da barragem do Fundão em Minas Gerais,
com a liberação de aproximadamente 45 milhões de metros cúbicos de rejeito de
minério de ferro no ambiente (SAMARCO, 2016; CARMO et al., 2017), afetando os
cursos d’água, flora e fauna da região. É importante ressaltar que a região apresenta
várias fazendas leiteiras que foram diretamente e indiretamente afetadas com o
acidente. Após dois anos do acontecimento, a análise da água da Bacia do rio Doce,
(utilizada para lazer, irrigação e água de bebida de animais de produção) revelou
níveis elevados de alumínio, níquel, arsênio. manganês, cobre e chumbo
(CARVALHO et al., 2017). Sabendo dos efeitos negativos na saúde e no microbioma
de animais e na disseminação de genes de resistência a antimicrobianos, fazia-se
necessário o estudo dos efeitos da exposição prolongada a metais pesados na saúde
dos bovinos leiteiros da região e na água do rio, utilizada diariamente como fonte de
água de bebida.
49
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar as consequências da
exposição prolongada de bovinos leiteiros a água da Bacia do Rio Doce, local com
atividade extrativista e histórico recente de acidente ambiental envolvendo resíduos
de mineração.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar exame físico dos bovinos estudados em Minas Gerais.
Determinar as funções renal e hepática no soro dos bovinos estudados
em Minas Gerais.
Determinar a concentração de metais pesados no soro dos bovinos
estudados em Minas Gerais.
Determinar a concentração de metais pesados na água de bebida dos
animais das regiões acometidas e não acometidas pelo acidente ambiental em Minas
Gerais, Brasil;
Avaliar por meio de antibiograma e testes moleculares, o perfil de
resistência aos antibióticos e metais pesados das bactérias presentes na água de
bebida dos bovinos das regiões acometidas e não acometidas pelo acidente ambiental
em Minas Gerais, Brasil;
Caracterizar, por meio do sequenciamento do genoma inteiro, a
presença dos genes de resistência a antimicrobianos (expressos ou não), genes de
virulência, plasmídeos, e outras características importantes de algumas bactérias com
perfil de resistência confirmado por testes fenotípicos e moleculares,
Avaliar por meio de sequenciamento do genoma inteiro (shotgun
sequencing), a microbiota e o resistoma intestinal, ruminal e respiratória dos bovinos
51
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 AMOSTRAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO
O teste para duas proporções foi utilizado para obter o número de animais a
serem estudados. Para o cálculo, considerou-se poder de 60%, significância 5%, a
proporção de linha de base (baseline proportion) 50% e a proporção de comparação
(comparison proportion) de 30%. Assim, 60 fêmeas bovinas leiteiras deveriam ser
estudadas, sendo 30 criadas na Bacia do Rio Doce, na região de mineração e
acometida pelo acidente ambiental e 30 criadas numa região não acometida pelo
acidente. Assim, o presente estudo foi realizado em duas propriedades situadas em
diferentes municípios do estado de Minas Gerais, Brasil.
A Bacia do rio Doce leva o nome de seu rio principal, o rio Doce, que apresenta
853 km de extensão, desaguando no oceano Atlântico, pelo litoral do estado do
Espírito Santo. O rio Doce é formado pelo encontro dos rios Piranga e Rio do Carmo
e tem como afluentes os rios Piracicaba, Santo Antônio, Suaçuí, Caratinga e
Manhuaçú. A fazenda 1 (F1) localiza-se em Paracatú de Baixo, subdistrito do
município de Mariana, às margens do rio Gualaxo do Norte (bacia do Rio Doce),
(Latitude: 20º 22' 40" S; Longitude: 43º 24' 58" W) (Figura 3). A F1 recebeu boa parte
dos rejeitos da mineração lançados durante o rompimento da barragem. Desde o
momento do acidente, os animais permanecem em constante contato com a água do
rio, utilizando-a como fonte de água de bebida, além de permanecerem deitados nos
bancos de areia que aparecem durante o período de estiagem no rio.
A fazenda 2 (F2) localiza-se no município de Caldas, Minas Gerais (Latitude:
21º 55' 25" S; Longitude: 46º 23' 10" W), a 535,5 Km de distância da bacia do Rio Doce
(Figura 3). O município faz parte da grande bacia leiteira existente no sul do estado e
não há registros de quaisquer acidentes envolvendo rejeitos de mineração. Estando
fora da região acometida pelos rejeitos, foi utilizada para comparação de resultados.
52
Figura 3 - Localização dos municípios de Mariana (fazenda 1) e Caldas (fazenda 2), em Minas Gerais, Brasil.
Fonte: GAETA, N.C., 2021
3.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Para serem incluídas no estudo, as fêmeas deveriam apresentar acima de 2
anos de idade (garantindo que estivessem na propriedade durante o acidente). F1 e
F2 deveriam apresentar manejo alimentar semelhante e estarem distantes em no
mínimo 100 quilômetros (evitando a presença de moléculas de metais pesados
levadas pelo vento).
3.3 EXAME FÍSICO
Previamente à obtenção das amostras, o exame físico foi realizado em todos
animais, segundo o preconizado por ROSENBERGER, (1993). Dados relacionados a
parâmetros vitais (frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e
movimento ruminal), grau de hidratação e coloração de mucosas, escore de condição
corporal (escala de 1 a 5, sendo 1 referente ao animal extremamente magro e 5 para
53
o animal extremamente gordo) (EDMONSON et al., 1989) e nível de consciência. Em
seguida, foi realizado exame físico específico dos seguintes sistemas:
Respiratório: avaliação da presença de tosse, corrimento nasal (e sua
característica), lesões de narina, odor nasal (e sua característica), fluxo de ar,
tipo respiratório, sons obtidos à percussão do gradil costal, ruídos obtidos à
auscultação pulmonar;
Reprodutivo: avaliação vulvar, observando presença de traumas, vesículas,
nódulos, sangue, pústulas, fezes e urina e secreção (e suas características) e
avaliação vaginal, observando posição, presença de lesões, coloração,
presença de edema e secreção (e suas características).
Digestivo: avaliação da simetria abdominal, apreensão do alimento, mastigação
e deglutição adequadas, estratificação ruminal, abomaso e alças intestinais,
presença de lesões em lábios e cavidade bucal e número de movimentos
ruminais.
Os sistemas tegumentar e nervoso e a glândula mamária foram
especificamente avaliados quando da presença de alguma alteração visível.
3.4 AMOSTRAS
3.4.1 Sangue total
Amostras de sangue total foram obtidas a partir da punção das veias coccígea
ou jugular utilizando sistema vacutainer. As amostras foram acondicionadas em tubo
seco com ativador de coagulação (para o estudo dos perfis renal e hepático) (BD,
EUA) e em tubos Trace Metals (BD, EUA) para o estudo dos metais. Posteriormente,
os tubos foram mantidos em repouso até a completa retração do coágulo. Os soros
obtidos foram acondicionados em microtubos e mantidos a -40ºC.
54
3.4.2 Água
Com o objetivo de avaliar a presença de bactérias resistentes a
antimicrobianos na água do rio, foram obtidos 500 ml de água de oito pontos da Bacia
do Rio Doce (Figura 4), os quais foram acondicionados em garrafas plásticas
previamente auto clavadas e que foram abertas somente quando já em contato com
a água do rio. Para tal, ao serem obtidas, as amostras foram imediatamente resfriadas
e assim permaneceram até o momento do processamento. Para o estudo da presença
dos metais pesados, foram obtidos 20 L de água de quatro pontos da Bacia do Rio
Doce e um ponto da propriedade controle.
Figura 4 - Pontos de colheita de água na Bacia do Rio Doce. Letras indicam amostras para detecção de bactérias resistentes. Asteriscos indicam amostras obtidas para estudo dos metais pesados. A: Gualaxo; B: Paracatu; C: Campinas/Pedras; D: Gesteira; E: Barra Longa urbano; F: Barra Longa
rural; G: Rio do Carmo; H: Rio Doce.
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
3.4.3 Swab fecal
Os swabs foram introduzidos no reto dos animais e rotacionados durante 15
segundos. Para o estudo do metagenoma, os swabs foram imediatamente colocados
em criotubos e acondicionados em nitrogênio líquido.
55
3.4.4 Swab nasal profundo
A amostra foi obtida somente de uma das narinas, que foi inicialmente limpa
com papel para remoção de muco e sujidades. Em seguida, um swab de
aproximadamente 90 centímetros de comprimento, contendo uma proteção de
plástico para a ponta de algodão (Provar, São Paulo, Brasil), foi introduzido na narina
até que uma resistência fosse detectada. Nesse momento, a ponta de algodão foi
removida da proteção de plástico e, em contato com a mucosa respiratória, pelo
menos dez movimentos de “vai e vem” foram realizados. Em seguida, a ponta foi
reintroduzida na camisa de plástico e o swab foi removido da narina do animal e
imediatamente acondicionado em nitrogênio.
3.4.5 Conteúdo ruminal
Para a obtenção do líquido ruminal, uma sonda plástica foi introduzida pela
boca do animal e, por sistema à vácuo, o conteúdo foi obtido e imediatamente
acondicionado em nitrogênio líquido. Entre cada colheita, o sistema era limpo com
água e álcool 70%.
3.5 ANÁLISES LABORATORIAIS
3.5.1 Determinação da concentração de metais pesados
A análise da concentração de metais pesados foi realizada por meio do
equipamento de fluorescência de raio-X (WDXRF) - Supermini 200 (Rigaku, Japão) -
pertencente ao Laboratório de Geoprocessamento do Instituto de Oceanografia da
Universidade de São Paulo.
56
Para a determinação dos elementos potencialmente tóxicos no soro dos
bovinos, utilizou-se o protocolo descrito por Carvalho, (2019), no qual 50 µL de cada
amostra foram depositados em filtros tipo Microcarry (Rigaku, Japan) (Droplet Method)
(MORIYAMA, T.; MORIKAWA, 2017). Em seguida, os filtros foram inseridos no
equipamento e a leitura realizada em “atmosfera de vácuo”, como aconselhado pelo
fabricante. A metodologia foi validada para a determinação de alumínio (Al), cromo
(Cr), cobalto (Co), ferro (Fe), cobre (Cu), arsênio (As) e mercúrio (Hg). Os resultados
obtidos foram expressos em miligramas por litro (mg/L).
Para a determinação dos elementos potencialmente tóxicos na água, dez
litros de cada amostra foram concentrados em estufa a 50ºC até atingirem o volume
de 10 mL. Em seguida, o mesmo protocolo descrito acima foi realizado.
3.5.2 Perfis renal e hepático
As concentrações séricas foram determinadas por meio dos kits comerciais
da Labtest (Minas Gerais, Brasil) para Creatinina (Cód. 96-300), proteínas totais (Cód.
99-250), bilirrubina direta (Cód. 93-1/104) e bilirrubina total (Cód. 94-1/104) e da
Biosystems (Barcelona, Espanha) para Ureia (Cód. 11541), ALT (Cód. 11568), AST
(Cód. 11531) e GGT (Cód. 11520). Todos os kits foram validados para o equipamento
Labmax-240 (Labtest Diagnostica SA), rotineiramente empregado no Laboratório
Clínico do Departamento de Clínica Médica/Hospital Veterinário – FMVZ-USP.
3.5.3 Estudo das bactérias resistentes na água
As amostras de água obtidas ao longo do Rio Doce em F1 e F2 foram
processadas pelos métodos de centrifugação e filtração, para que houvesse a maior
chance de se obter o isolamento bacteriano.
No primeiro método, 40 mL de água foram transferidos para tubos tipo Falcon
estéreis e centrifugados à 5000 rpm por 30 minutos (Eppendorf ®). Em seguida, mais
40 mL de água foram adicionados ao tubo e centrifugados novamente. Por fim, o pellet
57
formado foi suspendido em três mililitros de caldo Brain Heart Infusion (BHI)
(Acumedia®) e incubados à 35 ºC - 37 ºC, em shaker, por 24 horas. Os crescimentos
bacterianos foram mantidos em geladeira até o processamento. No segundo método,
100 mL de água foram filtrados utilizando filtros de 0,45 µm (Merck Millipore ®). Em
seguida, os filtros foram colocados em tubos tipo Falcon contendo cinco mililitros de
caldo BHI ® e incubados à 35 ºC - 37 ºC, em shaker, por 24 horas. Os crescimentos
bacterianos foram mantidos em geladeira até o processamento.
3.5.4 Determinação de bactérias resistentes à antibióticos
A pesquisa de bactérias resistentes à antibióticos foi realizada no crescimento
bacteriano proveniente do processamento da água (centrifugada e filtrada).
Inicialmente, as amostras foram semeadas em placas de ágar MacConkey
(Acumedia®) suplementadas com 2,5 µg/mL de ceftriaxona (CRO) e 3,0 µg/mL de
polimixina B (POL), as quais foram incubadas à 35 ºC - 37 °C por 24 horas. As colônias
observadas foram identificadas quanto a fermentação de lactose e características
morfológicas e estocadas em meio Triptone Soy Agar (Acumedia®) semi-sólido, à
temperatura ambiente. Vale ressaltar que somente uma colônia de cada espécie
observada foi estocada, a fim de que os testes subsequentes sempre fossem
realizados com os clones da espécie selecionada.
A triagem de bactérias resistentes à antibióticos foi realizada por meio do
método de disco difusão ou disco aproximação (Kirby-Bauer), de acordo com as
diretrizes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). O teste inicia-
se com a preparação do inóculo, utilizando de três a cinco colônias de um cultivo
fresco (com 18 - 24 horas de crescimento). Estas foram colocadas em caldo Mueller
Hinton (BD, New Jersey, USA), cuja turbidez foi ajustada de modo a obter uma
turbidez óptica semelhante à solução de McFarland na escala 0,5 (108 UFC/mL). Em
seguida, mergulhou-se um swab de algodão estéril na suspensão ajustada e o
excesso de inóculo foi removido da ponta de algodão após girá-lo e pressioná-lo
algumas vezes na parte interna do tubo. O inóculo, então, foi semeado em placas de
petri de 140mm X 15 mm contendo ágar Mueller Hinton (BD, New Jersey, USA),
atentando-se para semear toda a superfície do ágar. O procedimento é repetido pelo
58
menos três vezes, girando a placa em aproximadamente 60°, assegurando a
distribuição uniforme do inóculo. Após a diminuição de umidade da placa (três a cinco
minutos à temperatura ambiente), os discos de antibiótico foram distribuídos com
auxílio de uma pinça estéril (Figura 5). As placas foram incubadas à 35 ºC - 37 ºC por
18 a 24 horas. Após esse período, o diâmetro dos halos de inibição de crescimento foi
medido.
Os discos de antibióticos utilizados (DME, São Paulo, Brasil) e suas
respectivas concentrações (microgramas) estão a seguir: Aztreonam 30 (ATM),
Sulfazotrim 25 (SUT), Ertapenem 10 (ETP), Ceftriaxona 30 (CRO), Ácido Nalidíxico
30 (NAL), Imipenem 10 (IMP), Ceftazidima 30 (CAZ), Amoxicilina com ácido
clavulânico 30 (AMC), Cefotaxima 30 (CTX), Cefoxitina 30 (CFO), Meropenem 10
(MER), Cefepime 30 (CPM), Ciprofloxacina 05 (CIP), Amicacina 30 (AMI) e
Gentamicina 10 (GEN).
Figura 5 - Disposição dos discos de antibióticos na placa de petri contendo ágar Mueller Hinton.
Fonte: GAETA, N.C., 2021
Para identificação dos genes codificadores dos padrões de resistência
detectados na análise fenotípica, o DNA bacteriano total foi extraído (CHAPMAN et al.
2001). A bactéria foi semeada em caldo LB estéril e incubado em shaker à 37°C por
18 a 24 horas à 150 rpm. Após o período de incubação, dois mililitros da cultura foram
transferidos para um microtubo e centrifugados à 5000 rpm por 15 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o pellet pesado. O ideal é obter no mínimo 0,05 g de
células. Em seguida, o pellet foi ressuspendido na quantidade de água
correspondente ao peso do pellet. Em seguida, a suspensão foi colocada em banho-
maria seco à 100 °C por 10 minutos e, então, em gelo por cinco minutos. Por fim, a
59
suspensão foi centrifugada 9000 rpm por 15 minutos e 100 µL do sobrenadante,
contendo o material genético bacteriano, foram transferidos para um microtubo estéril
e armazenados à -20° C.
A reação da polimerase em cadeia (PCR) do tipo convencional foi realizada
para detecção do gene de resistência presente na bactéria. Devido ao perfil de
resistência encontrado em algumas cepas, realizou-se a detecção do gene CTX-M
(blaCTX-M), de acordo com BONNET et al. (2001), incluindo a detecção de CTX-M-2
(blaCTX-M2) (DROPA et al. 2015) e CTX-M-15 (blaCTX-M15) (MUZAHEED et al., 2008),
oligonucleotídeos iniciadores disponíveis para uso no laboratório (Tabela 1).
Tabela 1 - Sequência de oligonucleotídeos iniciadores para detecção de genes codificadores de ESBL.
Grupo Sequência dos iniciadores (5’-3’) T°Ca Pbb
Referência
blaCTX-M
F: CGCTTTGCGATGTGCAG
R: ACCCGCGATATCGTTGGT 55 550 BONNET et al., 2001
blaCTX-M2
F: GACTCAGAGCATTCGCCGC
R:TCAGAAACCGYGGGTTACGA
55
870
DROPA et al., 2015
blaCTX-M15
F: CACACGTGGAATTTAGGGACT
R:GCCGTCTAAGGCGATAAACA
56
995
MUZAHEED et al.,
2008
T °Ca: temperatura de anelamento; Pbb: pares de base. Fonte: Gaeta, N.C., 2021
As reações foram elaboradas para um volume final de 25 µL, constituída por:
2,5 µL de tampão para PCR (10X PCR Buffer + Mg2+) e 0,25 µL de Taq Polimerase
5U/ µL (Sinopse™); 2,5 µL de solução de deoxiribonucleotídeos (200 µM); 0,5 µL de
cada oligonucleotídeo iniciador (25 pmol) e 1 µL de DNA cromossomal. As condições
para as reações de amplificação foram: 1) Desnaturação inicial à 94 °C durante cinco
minutos; 2) Ciclo inicial de desnaturação à 94 ºC durante um minuto, anelamento dos
iniciadores à 56 ºC para blaCTX-M e blaCTX-M15 e à 58 ºC para blaCTX-M2, durante um
minuto e extensão à 72 ºC por um minuto; 3) Repetição da etapa 2 por 29 vezes; 4)
Extensão final à 72 ºC durante cinco minutos. Os amplificados obtidos pela PCR foram
60
separados por eletroforese em gel de agarose 1,0%, com 0,5 µg/mL de brometo de
etídeo, utilizando tampão tris-acetato-EDTA (TAE) e marcador de peso molecular de
100pb DNA Ladder (Invitrogen™). A visualização dos produtos foi realizada sob luz
ultravioleta por meio do Transiluminador Vilber Lourmat®.
O teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para ceftriaxona, de acordo
com o preconizado pelo CLSI (2013) nos isolados ESBL positivos.
3.5.5 Sensibilidade bacteriana à metais pesados
Para este estudo, as amostras foram semeadas em meio MacConkey
(Acumedia®) suplementadas com metais pesados. A fim de saber qual a
concentração dos elementos a ser adicionada ao meio, determinou-se a concentração
inibitória mínima (CIM) de cada elemento escolhido frente a estirpes-padrão, bem
como controles positivos contendo alguns genes de resistência para metais pesados.
Foram utilizados cinco metais pesados disponíveis no laboratório (Tabela 2)
e 13 bactérias, sendo 11 cepas-padrão: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli
ATCC 8739, Escherichia coli J53, Escherichia coli C600, Enterobacter aerogenes
ATCC 13048, Salmonella ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e duas
cepas disponíveis no banco genético do laboratório, apresentando genes de
resistência para metais pesados: KPN 535 - Klebsiella pneumoniae contendo arsA-D
e arsH (genes de resistência ao arsênio), merA-C (genes de resistência ao mercúrio),
pcoA-E e pcoR-S (gene de resistência ao cobre), silR-S, silC e silE (gene de
resistência ao prata) e nikA-E (gene de resistência ao níquel) e KP 171 – Klebsiella
pneumoniae contendo arsA-B e arsH (genes de resistência ao arsênio), merC (gene
de resistência ao mercúrio), pcoC-D e pcoR (gene de resistência ao cobre), silR-S,
silC e silE (gene de resistência ao prata), nikA-E (gene de resistência ao níquel) e zntA
(gene de resistência ao zinco).
61
Tabela 2 - Metais pesados utilizados na padronização do teste de concentração inibitória mínima. São Paulo. 2019.
Metal
Símbolo
Marca
Peso molecular
(g/mol)
Arsenito de sódio AsNaO7 Baker & Adamson, USA 129,90
Cloreto de mercúrio
HgCl2
Mallinckrodt, UK 271,52
Sulfato de cobre
CuSO4. 5H2O
Synth, Brasil 249,68
Nitrato de prata
AgNO3
Merck, Alemanha 168,89
Cloreto de cobalto
CoCl2
Baker & Adamson, USA 287,95
Dicromato de potássio
K2Cr2O7
Vetec, Brasil 294,18
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Para a realização do teste da CIM, uma colônia de cada espécie foi semeada
em tubos contendo dois mililitros de Mueller Hinton Broth estéril (BD, New Jersey,
USA) e incubadas em shaker à 35 °C – 37°C durante quatro a seis horas, momento
no qual atingiram a fase Log de crescimento. No momento da realização do teste,
soluções de 10 mL à 0,1 M de cada elemento foram preparadas utilizando água Milli
Q estéril (Tabela 3). Em seguida, soluções de trabalho foram preparadas, garantindo
que a concentração desta apresentasse uma diluição acima daquela inicial a ser
utilizada na placa (Tabela 4). As soluções foram acondicionadas em tubos tipo Falcon
envoltos em papel alumínio, garantindo que os metais não tivessem contato com a luz
e não fossem inativados.
62
Tabela 3 - Concentração das soluções estoque e trabalho, e a diluição inicial utilizada no teste para determinação do CIM para cada elemento. São Paulo. 2019.
Elemento
Concentração da
solução estoque
(µg/mL)
Concentração
da solução de
trabalho
(µg/mL)
Diluição inicial na placa
para a CIM
(µg/mL)
AsNaO7 12990 2048 1024
HgCl2 27152 128 64
CuSO4. 5H2O 24970 2048 1024
AgNO3 16987 128 64
CoCl2 28795 4096 2048
K2Cr2O7 29418 4096 2048
Fonte: Gaeta, 2021
Após o preparo das soluções, 100 µL de Mueller Hinton Broth cátion ajustado
estéril (BD, New Jersey, USA) foram distribuídos em placas estéreis de 96 poços com
fundo U. Em seguida, 100 µL da solução de trabalho foram distribuídos na primeira
coluna da placa e, com auxílio de uma pipeta multicanal, fez-se diluições seriadas com
fator 2 até a coluna 10. Posteriormente, os inóculos crescidos foram ajustados de
modo a obter uma turbidez óptica semelhante à solução de McFarland na escala 0,5
(108 UFC/mL), utilizando o espectrofotômetro (Quimis®), realizando a leitura no
comprimento de onda 624 nm. Após o ajuste, 100 µL desta nova suspensão foram
adicionados em 900 µL de Mueller Hinton Broth cátion ajustado estéril (BD, New
Jersey, USA) em microtubos estéreis. Finalmente, cinco microlitros de cada
suspensão foram adicionados em cada linha, até a coluna 11 (Figura 6). As placas
foram incubadas à 35 °C – 37 °C e a leitura realizada após incubação por 18 a 24
horas. A CIM é definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento
bacteriano visível (Figura 6). Para a padronização, o teste para cada metal foi realizado
em triplicada.
63
Figura 6 - Esquema da placa utilizada para determinação do CIM.
Fonte: GAETA, N.C., 2021
Após a determinação da CIM, placas de ágar MacConkey (Acumedia®) foram
preparadas e suplementadas com os metais pesados. Em seguida, os crescimentos
bacterianos provenientes do processamento da água (centrifugada e filtrada) foram
semeados. As placas foram incubadas à 35 °C – 37 °C por 24 horas. As colônias
obtidas foram caracterizadas quanto sua morfologia e fermentação de lactose e
estocadas em TSA semi-sólido à temperatura ambiente. Posteriormente, para cada
estirpe isolada, a CIM dos metais estudados foi determinada utilizando a metodologia
descrita anteriormente. Para este caso, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC
13883 e K. pneumoniae 535 foram utilizados como controle.
3.5.6 Identificação das espécies bacterianas
As espécies bacterianas foram identificadas por meio do Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (Maldi-Tof).
64
3.5.7 Sequenciamento de cepas representativas
O sequenciamento de cepas representativas foi realizado por meio da MiSeq
Platform (Illumina Inc., San Diego, CA) a 300 × 300 bp. As reads foram trimadas e
filtradas utilizando TrimGalore v.0.6.5 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore).
Em seguida, a montagem de novo foi realizada por meio do Unicycler v.1.2.10
(https://github.com/rrwick/Unicycler) (WICK et al., 2017). A sequência obtida foi
anotada utilizando o Rast: Rapid Annotation Using Subsystem Technology (www.
http://rast.nmpdr.org/) (AZIZ et al., 2008). Resistoma (genes de resistência a
antimicrobianos, mutações presentes em cromossomos pontuais e genes de
resistência a metais pesados), genes de virulência e plasmídeos foram determinados
utilizando Abricate (https://github.com/tseemann/abricate) com os bancos de dados
ResFinder (ZANKARI et al., 2012), MegaRes 2.0 (DOSTER et al., 2019) e BacMet
(banco de dados de aminoácidos) (PAL et al., 2014), Virulence Finder Database
(CHEN et al., 2016) e PlasmidFinder (CARATTOLI et al., 2014), respectivamente.
Multilocus Sequence Typing, Plasmid Multilocus Sequence Typing e sorotipos foram
identificados utilizando os serviços MLST 2.0.4, pMLST 0.1.0 e SeroTypeFinder 2.0.1,
respectivamente, disponíveis no Center for
Genomic Epidemiology (http://genomicepidemiology.org/). Para as cepas de E. coli,
os filogrupos foram determinados, in silico, por meio do ClermonTyping (BEGHAIN et
al., 2018). Para cepas pertencentes ao K. pneumoniae species complex, utilizou-se o
Kleborate (https://github.com/katholt/Kleborate). Para o isolado de K. variicola, o ST
foi caracterizado pelo laboratório de resistência bacteriana do instituto Nacional de
Salud Pública de Cuernavaca, Mexico. Como critério de aceitação para a presença
dos genes, considerou-se cobertura igual ou acima de 95% e identidade igual ou
acima de 85%.
65
3.5.8 Análise do microbioma e resistoma bovino
4.5.8.1 Extração de DNA
Antes da extração do DNA genômico, todos os swabs foram pré-processados
para a obtenção da máxima concentração de DNA possível. Um mililitro de tampão
PBS 1X (pH: 7.4) foi adicionado às amostras e todas foram homogenizadas por 30
minutos. Os swabs foram removidos e as amostras centrifugadas a 14 000 rpm por 30
minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet suspendido em 300 µl de PBS 1X.
A extração do DNA foi realizada utilizando MagMAXTM CORE Nucleic Acid
Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), de acordo com as
instruções do fabricante. Brevemente, as placas referentes as soluções de lavagem 1
e 2 foram preparadas com a adição de 500 µl de cada reagente em placas de 96
poços. A solução de Bead/proteinase K foi preparada por meio da adição de 20
µl/amostra de MagMAXTM CORE Magnetic Beads e 10 µl/amostra de MagMAXTM
CORE proteinase K em um tubo estéril de 50 mL. A solução de lise/ligação foi
preparada por meio da adição de 350 µl/amostra de MagMAXTM CORE Lysis Solution
e 350 µl/amostra de MagMAXTM CORE Binding Solution em um tubo estéril de 50 mL.
Após estas etapas, a placa de amostras foi preparada por meio da adição de 200 µl
de cada amostra nos poços correspondente e 30 µl da suspensão bead/proteinase K
em cada poço. A placa de amostra foi vigorosamente agitada por dois minutos. Então,
700 µl da solução de lise/ligação foi adicionado a cada poço. Finalmente, a placa de
eluição foi preparada por meio da adição de 90 µl de MagMAXTM CORE Elution Buffer
em cada poço de uma placa padrão. Cada placa foi colocada no equipamento e o
protocolo apropriado selecionado. Após a extração, a concentração de DNA foi obtida
por meio de espectrofotômetro (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
MA).
66
3.5.8.1 Shotgun Sequencing
Shotgun whole metagenome sequencing foi realizado no Genome Sciences
and Bioinformatics Core, Penn State College of Medicine, Hershey, PA, USA. Dez
nanogramas de cada DNA genômico quantificados pelo Qubit foram fragmentados
utilizando Covaris E220, instrumento operando SonoLab v6.2.6, gerando fragmentos
de aproximadamente 300 bp. Entre 10 e 100 ng do DNA fragmentado foram
processados em kit Illumina compatível para preparo da biblioteca, usando sparQ DNA
Library Prep Kit (Quantabio). A cada biblioteca foram adicionados barcodes
(sequências de índice duplo exclusivas) (NEXTFLEX® Unique Dual Index Barcodes,
BioO Scientific). Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip foi utilizado para confirmar o
tamanho e a quantidade da biblioteca. Os produtos de PCR foram limpos utilizando
AMPure XP beads. Bibliotecas equimolares foram adicionadas e o pool formado foi
submetido a sequenciamento Illumina NovaSeq 6000 a 2x150 bp (Illumina).
Illumina bcl2fastq (versão 2.20.0.422) foi utilizado para a extração das reads
demultiplexadas.
3.6 ANÁLISE
3.6.1 Variáveis clínicas e laboratoriais
As variáveis clínicas e laboratoriais (perfis renal e hepático) foram
comparadas entre as fazendas por meio do teste Wilcox Sum Rank Test com correção
de continuidade. As medianas e o intervalo inter-quatil foram utilizados para a
demonstração dos resultados. Todos os cálculos foram realizados no RStudio v.4.0
(RTEAM, 2020).
67
3.6.2 Microbioma
Os arquivos fastq demultiplexados foram carregados no servidor MG-RAST
(KEEGAN; GLASS; MEYER, 2016), concatenados e submetidos a pipeline padrão a
fim de determinar a abundância relativa da microbiota presente nas amostras fecais,
ruminais e nasais. No MG-RAST, as sequências foram submetidas a controle de
qualidade, havendo remoção de sequências espécie-específicas do hospedeiro (Bos
taurus, UMD v3.0), filtragem de bases ambíguas e filtragem por tamanho de reads. Os
fragmentos obtidos foram mapeados contra o banco de dados não-redundantes (N5nr)
e para a determinação da abundância dos organismos, utilizou-se os parâmetros
default (e-value máximo = 1x10-5, ponto de corte mínimo de identidade d
= 60% e ponto de corte para tamanho de alinhamento mínimo = 15).
Após completar a pipeline, os resultados foram baixados, transferidos para
uma planilha, na qual a abundância relativa de cada taxa foi calculada. A normalidade
dos dados foi avaliada por meio do Shapiro-Wilk test (SHAPIRO; WILK, 1965). As
variâncias foram analisadas pelo Bartlett’s test (BARTLETT, 1937). A abundância
relativa de cada nível taxonômico foi analisado por meio do Wilcoxon rank-sum test
(WILCOXON, 1945) de acordo com a fazenda (F1 e F2). Os resultados foram descritos
por mediana (M) e intervalo interquartil (IIQ). Todas as análises estatísticas foram
realizados no R software v. 3.6.0 (RSTUDIO TEAM, 2020). Variáveis com P < 0.05
foram consideradas significativas.
3.6.3 Resistoma
Inicialmente, a qualidade das reads foi acessada a partir de um subconjunto
aleatório de 10 amostras, utilizando FastQC (ANDREWS, 2010). As reads foram
trimadas utilizando o software Trimmomatic, para um tamanho mínimo de 50bp
(BOLGER; LOHSE; USADEL, 2014). As paired-end reads foram fundidas (merged)
utilizando FLASH e convertidas em arquivos tipo FASTA por meio do Seqkit (SHEN et
al., 2016). As reads foram alinhadas a uma base de dados customizada com genes
de resistência a antimicrobianos, construídas no BLAST (ALTSCHULet al., 1990), a
partir do banco de dados de resistência antimicrobiana MEGARes 2.0, disponível
68
publicamente. O MEGARes 2.0 é um banco de dados que incorpora genes disponíveis
no CARD, ARGANNOT, AMRFinder, NCBI, ResFinder, BacMet, Lahey e Resfinder,
num total de 7,868 genes ou operons, que conferem resistência a metais, biocidas,
drogas, ou resistência multi-níveis (DOSTER et al., 2019). Os genes contaminantes
foram detectados e removidos por meio do pacote “decontam”, disponível no software
R, baseando-se nas amostras de controle negativo da extração de DNA (n=1) (DAVIS
et al., 2017). Uma amostra tipo “mock community” (Zymo Research, USA) foi utilizada
como controle positivo durante as etapas de extração, PCR e sequenciamento para
controle de qualidade.
A contagem de genes foi normalizada e estes dados foram convertidos para
abundância relativa, a amostra com a maior contagem normalizada de genes foi
classificado como 1. Os dados foram apresentados como a média da presença dos
genes ou abundância relativa média. Os dados estavam fortemente distorcidos em
zero e essa distribuição não foi corrigida pela transformação de variáveis, portanto,
testes não-paramétricos foram usados para comparações de pares. Os limiares de
significância foram definidos em False Discovery Rate corrigida P <0,05 (BENJAMINI,
Y.; HOCHBERG, 1995). Comparações foram feitas para tipo de resistência, classe,
mecanismo e grupo. As comparações entre as fazendas foram realizadas por meio do
Wilcox Rank-Sum test, com ajuste de False Discovery Rate para comparações
múltiplas. As comparações entre locais anatômicos em cada fazenda foram feitas por
meio do teste de Kruskal-Wallis com ajuste de False Discovery Rate para
comparações múltiplas.
3.6.4 Anotação funcional do metagenoma
A anotação funcional do metagenoma foi realizada com o objetivo de se
discutir os mecanismos funcionais mais importantes na população bacteriana de cada
fazenda no momento do estudo, e como a potencial contaminação ambiental pelo
acidente com o rejeito de minérios poderia influenciar nos padrões encontrados.
O Mi-faser (pipeline para análise de metagenoma de alta precisão) (ZHU et
al., 2018) foi utilizado para determinar se F1 apresentava mais funções que
promoveriam resistência a antimicrobianos e metais pesados. Os arquivos tipo fastq
69
foram submetidos online (https://services.bromberglab.org/mifaser/submit) e antes do
mapeamento das sequências à base de dados, realizou-se controle de qualidade
utilizando o fastp (qualidade phred = 20, tamanho de read = 40), na própria pipeline.
Os arquivos resultantes da análise pelo mi-faser apresentavam números de enzimas
catalogadas (E.C.), anotação funcional e contagem de sequências por anotação. Para
comparação entre fazendas e sítios anatômicos (amostras), utilizou-se o Wilcox rank-
sum test. As sequências foram normalizadas de acordo com a contagem total de reads
de cada metagenoma individual. Estes dados e informações importantes como
“identificação de amostra”, “fazenda” e “sítio anatômico” foram importadas para o
software Waikato Environment for Knowledge Analysis (WEKA) (FRANK et al., 2016),
que calculou o valor relativo de cada E.C. medindo o ganho de informação a respeito
de três classes nominais: 1) “fazenda” (dois níveis), 2) “sítio anatômico” (três níveis) e
3) classe composta por “fazenda por sítio” (seis níveis). Os dados foram reduzidos
pela seleção dos 10 principais E.C.s de cada classe, para mapeamento de vias
utilizando o Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Mapper (KANEHISA;
SATO, 2020).
Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio do software RStudio
(v. 3.6.0) (RSTUDIO TEAM, 2020).
70
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERÍSTICAS DAS PROPRIEDADES ESTUDADAS
Das 60 fêmeas que deveriam ser estudadas, foram colocadas 58 fêmeas
bovinas leiteiras no estudo, sendo 28 pertencentes à F1 e 30 fêmeas pertencentes à
F2. Devido ao risco para a segurança dos animais e dos pesquisadores, dois animais
de F1 não foram avaliados.
A F1 apresentava 30 fêmeas em lactação, em sistema de criação do tipo semi
- extensivo. Os animais pastejam à beira do rio durante a noite, momento no qual
ingerem a água do Rio do Carmo e durante o dia, ingerem água de uma nascente.
Além da pastagem, os animais são suplementados com soja, trigo, fubá e sal mineral.
O rebanho é vacinado contra raiva e febre aftosa. Os animais adquiridos são
quarentenados por pelo menos 30 dias, mas nenhum exame laboratorial para
detecção de patógenos é realizado. Os bovinos têm contato com cães, gatos, aves
(galináceos e silvestres), caprinos e ovinos. Não havia anotações quanto ao uso de
antimicrobianos nos animais e o funcionário, por ser recente na função, não soube dar
maiores informações.
A F2 apresentava 70 fêmeas lactantes em sistema de criação do tipo semi-
extensivo. Os animais permanecem no pasto a maior parte do tempo, sendo
suplementados com concentrado, silagem e sal mineral. Ingerem água de um rio
próximo ou de um lago, a depender do piquete em que se encontram. O rebanho é
vacinado contra leptospirose e febre aftosa. Os animais doentes são alocados em
local próprio, com outros doentes. O funcionário não soube informar sobre a realização
de exames antes da aquisição de animais. Os bovinos têm contato com cães, gatos e
aves (galináceos e silvestres). Não havia anotações quanto ao uso de antimicrobianos
nos animais e o funcionário não soube dar maiores informações.
71
4.2 PARÂMETROS CLÍNICOS DOS ANIMAIS
Muitos animais apresentavam-se agitados devido a presença dos
pesquisadores e das condições climáticas do dia. Em Mariana, a temperatura média
e a umidade relativa do ar durante o período de coleta foram respectivamente 30º C
e 60%. De maneira semelhante, a temperatura média e a umidade relativa do ar em
Caldas, durante o período de coleta, foram respectivamente 30° C e 65%. Os
resultados obtidos durante o exame físico dos animais estão descritos na tabela 4.
Tabela 4 - Frequência dos parâmetros clínicos gerais obtidos das fêmeas bovinas pertencentes à
fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de Minas Gerais, Brasil.
Fazenda
Parâmetros Fazenda 1 % (N/T)
Fazenda 2 % (N/T)
Nível de consciência
Alerta 100 (28/28) 100 (30/30)
Grau de hidratação
Normal 71,4 (20/28) 93,3 (28/30 Leve desidratação 14,3 (04/28) 03,3 (01/30)
Sem dados 14,3 (04/28) 03,3 (01/30)
Frequência cardíaca (bpm)
60-80 92,9 (26/28) 30,0 (09/30) >80 07,1 (02/28) 60,0 (18/30)
Sem dados 00,0 (00/00) 10,0 (03/30)
Frequência respiratória (mrpm) 10-30 60,7 (17/28) 26,7 (08/30) >30 35,7 (10/28) 60,0 (18/30)
Sem dados 03,6 (01/28) 13,3 (04/30)
Temperatura (°C)
37,5-39,3 85,7 (24/28) 80,0 (24/30) >39,3 03,6 (01/28) 06,7 (02/30) Sem dados 10,7 (03/28) 10,0 (03/30) N: número de manifestações observadas; T: total de animais; bpm: batimentos por minuto; mrpm:
movimentos respiratórios por minuto; mrm: movimentos ruminais por minuto. Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Particularmente durante a avaliação do sistema respiratório, alguns animais
apresentaram sons alterados à auscultação como crepitação grossa, crepitação fina,
ronco e sibilo (Tabela 5).
72
Tabela 5 - Frequência de parâmetros clínicos específicos do sistema respiratório obtidos das
fêmeas bovinas pertencentes à fazenda 1 (Mariana) e fazenda 2 (Caldas), localizadas no estado de
Minas Gerais, Brasil.
Fazendas
Parâmetros Fazenda 1 % (N/T)
Fazenda 2 % (N/T)
Tosse
Ausente 96,4 (27/28) 100 (30/30)
Exsudato nasal
Normal 64,3 (18/28) 40,0 (12/30) Seroso 35,7 (10/28) 56,7 (17/30)
Sem dados 00,0 (00/00) 03,3(01/30)
Tipo respiratório
Costoabdominal 92,8 (26/28) 93,3 (28/30) Abdominal 00,0 (00/00) 03,3 (01/30)
Sem dados 07,2(042/28) 03,3(01/30)
Percussão torácica
Claro 92,9 (26/28) 86,7 (26/30) Maciço/submaciço 00,0 (00/00) 00,0 (00/00)
Sem dados 07,2(02/28) 13,3(04/30)
Auscultação pulmonar
Normal 82,1 (23/28) 80,0 (24/30) Alterado 10,7 (03/28) 10,0 (03/30)
Sem dados 07,2(02/28) 10,0 (03/30)
Crepitação grossa 66,6 (02/03) 66,6 (02/03) Crepitação fina 33,3 (01/03) 33,3 (01/03)
Ruídos anexos
Presentes 10,7 (03/28) 06,6 (02/30) Ausentes 89,3 (25/28) 93,4(28/30)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Durante a avaliação do sistema reprodutivo das fêmeas, observou-se que
grande parte dos animais apresentavam vesículas na mucosa vulvar (F1=32,1%;
F2=53,3). Por fim, não foram observadas alterações no sistema gástrico e na glândula
mamária das fêmeas avaliadas.
73
4.3 CONCENTRAÇÃO DE METAIS PESADOS NO SORO DOS BOVINOS
Pela técnica de WDXRF, houve detecção de alumínio nos soros bovinos das
duas fazendas. O alumínio foi detectado em 58,6% (17/29) das vacas de F1 (Média:
0,00824 mg/L, desvio padrão 0,0038) e em 40% (12/30) de vacas de F2 (Média:
0,00570 mg/L, desvio padrão 0,0030). Observa-se que a média é numericamente mais
elevada em F1 (P = 0,07, t-test).
4.4 PERFIL RENAL E HEPÁTICO DOS BOVINOS
Com a avaliação do perfil renal e hepático dos bovinos leiteiros, observou-se
que os níveis de AST, creatinina e bilirrubina total estavam mais elevados nos animais
da fazenda 1 (P < 0.05). Entretanto, os níveis de ureia e proteína estavam mais
elevados na fazenda 2 (P < 0.05) (Tabela 6).
Tabela 6 - Comparação de médias entre as variáveis estudadas em bovinos leiteiros das fazendas 1
e 2, localizadas nas cidades de Mariana e Caldas, respectivamente, Minas Gerais, Brasil. Valores em
negrito indicam significância estatística no teste Wilcox Sum Rank com Correção de Continuidade (P
< 0.05).
Variáveis FAZENDA 1
(Mediana ±IIQ)
FAZENDA 2
(Mediana ±IIQ) P-valor
AST (U/L) 36,20±8.9 31,4±7,35 0.008 GGT (U/L) 9,70±3,7 10,0±5,28 0,096 Ureia (mg/dL) 11,70±3,5 42,4±25,1 <0.001 ALB (g/L) 2,74±0,33 2,74±0,308 0,93 Proteína (g/L) 7,75±0,83 8,440±0,81 <0.001 Creatinina (mg/dL) 1,12±0,3 0,945±0,205 0,002 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,06±0,03 0,050±0,027 0,266 Bilirrubina total (mg/dL) 0,16±0,08 0,115±0,10 0.010
Fonte: Gaeta, N.C.; 2021
74
4.5 METAGENOMA BOVINO
O estudo do metagenoma bovino foi realizado com 90 amostras, sendo 31
swabs fecais (F1=16; F2=15), 28 fluidos ruminais (F1=15; F2=13) e 30 swabs nasais
(F1=16; F2=14).
4.5.1 Microbiota
A análise das amostras fecais revelou 28 filos presentes em todas as amostras,
com três grupos predominantes: Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria (Figure
13a). Dos cinco filos mais abundantes, Bacteroidetes foi maior em F1 (P = 0.01) e
Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria foram mais abundantes em F2 (P < 0.05)
(Figura 7).
Figura 7 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras fecais de
bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho
(P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C.,2021
75
A análise a nível de gênero revelou 20 gêneros dominantes na microbiota fecal
dos bovinos, particularmente Bacteroides, Clostridium e Escherichia. Dos dez gêneros
mais prevalentes (Figura 8), Bacteroides (P = 0.03), Escherichia (P = 0.03),
Parabacteroides (P = 0.02) e Alistipes (P = 0.04) foram mais abundantes em F1 (P <
0.05). Já Clostridium (P = 0.02), Eubacterium (P = 0.04), Bacillus (P = 0.004),
Ruminococcus (P = 0.008) e Enterococcus (P = 0.03) foram mais abundantes em F2
(P < 0.05). Outros gêneros importantes como Butyrivibrio e Shigella também foram
detectados nas amostras das duas propriedades (Figure 13b).
Figura 8 -. Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas amostras fecais de
bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho
(P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Ao nível de filo, a análise de amostras ruminais revelou a presença de 28
grupos, destacando-se Bacteroidetes e Firmicutes (Figura 13a). Dos cinco filos mais
frequentes, Proteobacteria (F1: MD = 0.08; IIQ = 0.01; F2: MD = 0.06; IIQ = 0.01) e
Fibrobacteres (F1: MD = 0.01; IIQ = 0.007; F2: MD = 0.005; IIQ = 0.002) (P < 0.05)
foram mais abundantes em F1 que F2 (Figura 9).
76
Figura 9 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras ruminais de
bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho
(P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
A análise de gêneros presentes nas amostras ruminais revelou a
predominância de 20 grupos, com destaque para Bacteroides, Prevotella e Clostridium
(Figura 13b). Prevotella (MD=0.18; IIQ = 0.04; MD = 0.23; IIQ=0.009) foi mais
abundante em F2 (P < 0.05), enquanto que Fibrobacter (MD=0.01; IIQ = 0.007; MD =
0.005; IIQ=0.002) foi mais abundante em F1(P = 0.004) (Figura 10). Bacteroides foi
numericamente mais abundante de F2 que em F1 (P > 0.05). Outros gêneros
comumente presentes no fluido ruminal bovino, tais como Ruminococcus,
Eubacterium, Clostridium, Butyrivibrio, Enterococcus e Parabacteroides foram
detectados nas duas propriedades.
77
Figura 10 - Boxplot evidenciando os cinco gêneros mais abundantes presentes nas amostras ruminais de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco
vermelho (P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
A análise das amostras nasais profundas, ao nível de filo revelou a presença
de 30 filos nas amostras respiratórias, sendo estas dominadas por Proteobacteria,
Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes (Figura 13a). A abundância relativa do filo
Proteobacteria foi maior em F1 (MD = 0.297, IIQ = 0.13) que F2 (MD = 0.195, IIQ =
0.084) (P = 0.001). Já o grupo Bacteroidetes foi mais abundante em F2 (MD = 0.120,
IIQ = 0.059) que em F1 (MD = 0.053, IIQ = 0.035) (Figura 11).
78
Figura 11 - Boxplot evidenciando os cinco filos mais abundantes presentes nas amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais, Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um
asterisco vermelho (P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Por fim, a análise das amostras nasais profundas ao nível de gênero, revelou
10 grupos mais frequentes, principalmente Escherichia, Eubacterium, Acinetobacter,
Streptococcus, Bacillus e Bacteroides (Figura 13b). Eubacterium foi mais abundante
em F1 (F1: MD = 0.121; IIQ = 0.077/. F2: MD = 0.040; IIQ = 0.143). Bacteroides (F1:
MD = 0.022; IIQ = 0.011/ F2: MD = 0.051; IIQ = 0.025) e Clostridium (F1: MD = 0.021;
IIQ = 0.020/ F2: MD = 0.058; IIQ = 0.024) foram mais abundantes na F2 (P = 0.0002;
P = 0.0003, respectivamente). Pseudomonas (F1: MD = 0.013; IIQ = 0.005/ F2: MD =
0.007; IIQ = 0.006) e Enterobacter, (F1: MD = 0.0008; IIQ = 0.000/ F2: MD = 0.0005;
IIQ = 0.001) no entanto, foram mais abundantes em F1 (P = 0.01; P = 0.02,
respectivamente) (Figura 12).
79
Figura 12 - Boxplot evidenciando os dez gêneros mais abundantes presentes nas amostras nasais profundas de bovinos leiteiros da fazenda 1 e fazenda 2, localizadas em Mariana, Minas Gerais,
Brasil. Variáveis significativas (Wilcoxon Sum test com correção de continuidade) apresentam um asterisco vermelho (P<0.05)
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
80
Figura 13 – Abundância relativa de filos e gêneros entre fazendas e sítios anatômicos. Heatmaps demonstrando a abundância relativa dos filos (A) e
gêneros (B) mais abundantes determinados nas amostras fecais, ruminais e nasais de bovinos leiteiros das fazendas 1 e 2.
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
4.5.2 Resistoma
Após a filtragem dos dados, 549 grupos de resistência antimicrobiana, formados
por genes e operons foram detectados em todas as amostras. Os genes apresentaram
distribuição heterogênea entre as amostras, de forma que a maioria dos genes foram
detectados em poucas delas.
A fazenda 1 apresentou maior abundância relativa e maior prevalência de
resistência de drogas, biocidas, metais e multi-compostos que a fazenda 2. A alta
prevalência de genes de biocidas em F1 decorreu-se da presença das bombas de efluxo
ATP-Binding Cassette (ABC) de resistência multi-biocida (F1: média = 1,375; F2: média
0,628) e Resistance Nodulation Division (RND) (F1: média = 3,5; F2: média 1,581). Em
relação aos metais, a alta prevalência foi conferida pela resistência ao telúrio e por
resistência multi-metal, com destaque para a bomba de efluxo de resistência multi-metal
RND (F1: média = 0,438; F2: média 0,047). Genes caracterizados como de resistência
multi-composto para drogas e biocidas incluíram bombas de efluxo tipo RND e Major
Facilitator (MFS), os quais estiveram quase totalmente ausentes nas amostras de F2.
Mecanismos de resistência a aminoglicosídeos, beta-lactâmicos, glicopeptídeos,
macrolídeos e tetraciclinas foram mais abundantes na F1.
Em relação aos sítios anatômicos, as fezes apresentaram a maior diferença em
relação a abundância e prevalência de genes quando comparado às amostras ruminais
e nasais (estas apresentando a menor quantidade de genes) (P < 0.05).
4.5.3 Anotação funcional
A tabela 7 apresenta a mediana das funções únicas identificadas mi-faser para
cada sítio anatômico. O maior número de funções únicas foi identificado nas amostras
fecais de F2 (P = 0.05), mas nenhuma diferença na anotação funcional foi identificada
nas sequências do rúmen e nas amostras nasais entre as fazendas.
82
Tabela 7 - Número médio de funções únicas identificadas por fazenda e sítio anatômico (fezes, rúmen e swab nasal). IIQ: Intervalo interquartil.
Fazenda Fezes Rúmen Swab Nasal Mediana IIQ Mediana IIQ Mediana IIQ Fazenda A 765.50 152.25 693.50 101.50 109.50 127.50 Fazenda B 922.00 154.50 703.00 208.00 164.00 391.50
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Os 10 mais importantes E.C.s para cada classe nominal, foram estratificados por
fazenda e sítio anatômico. A tabela 8 apresenta a contagem normalizada das sequências
dos 10 E.C.s mais informativos nas fazendas, sendo esses mapeados em relação a vias
KEGG e funções biológicas, como metabolismo microbiano, síntese de
lipopolissacarídeos e receptor de sinalização de células T (Tabela 8). De maneira geral,
as enzimas descritas foram mais prevalentes na fazenda 2.
Tabela 8 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe
e via metabólica (KEGG), em relação às fazendas 1 e 2.
E.C. Classe Via Metabólica Fazenda 1
Fazenda 2
1.1.1.49
Oxidoreductase
Fosfato pentose; Metabolismo de glutationa; Vias metabólicas; Biosíntese de metabólitos secundários, Metabolismo microbiano em diversos ambientes
0
5.9
2.7.7.7 Nucleotidiltransferase DNA-directed DNA polymerase1 797 1010 2.8.4.3 Methilsulfanil transferase Envolvido na metilação do tRNA 343.5 403
6.3.5.5
Carbon-nitrogen ligase Metabolismo de pirimidina, alanina, aspartato e glutamato; Vias metabólicas
167.9
123.2
2.5.1.7
Alkiltransferase Metabolismo de amino açúcar e nucleotide açúcar; Biosíntese de peptideoglicano; Vias metabólicas
289.2
413.6
2.1.1.74 Methiltransferase Flavoproteina envolvida na modificação pós-tradução1
222.5 253
3.1.3.16
Phosphoric-monoester hidrolase
Sinalização de receptor de células T; Expressão e checkpoint de PD- L1 em câncer; Diferenciação de células Th1e Th2
3.4
6.5
2.3.1.191 Aciltransferase Biossíntese de lipopolisacarideo Vias metabólicas
6.6 6.5
2.7.7.8 Nucleotidiltransferase Polyribonucleotideo nucleotidyltransferase1
867.5 1065.4
2.4.2.14
Pentosiltransferase Metabolismo de purina; Metabolismo de alanina, aspartato
e glutamato; Vias metabólicas;
199.1
202.4
83
Biossíntese de metabólitos secundários
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
Os 10 E.C.s mais informativos em relação aos sítios anatômicos, os foram
mapeados em diversas vias KEGG, como metabolismo microbiano, metabolismo de
metano e degradação de parede de células vegetais (Tabela 9). De maneira geral, houve
diferença entre os sítios anatômicos, sendo as amostras de swab nasal, aquelas com
menores informações obtidas.
Tabela 9 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe
e via metabólica (KEGG), em relação aos sítios anatômicos
E.C. Classe Vias metabólicas Fezes Rúmen SNP
1.5.1.43 Oxidoreductase Metabolismo de arginina e prolina; Vias metabólicas
17.4 60.7 0
3.1.1.73 Carboxilic-ester
hidrolase Auxilia na quebra da hemicelulose da parede das células vegetais
46.7 717.5 0
1.1.1.271
Oxidoreductase
Metabolismo de frutose e manose; Metabolismo de amino açúcar e nucleotídeo açúcar; Vias metabólicas
104.9
265.2
0
5.4.2.11
Fosfotransferase
Glicólise/Gliconeogenese; Metabolismo de glycina, serina e treonina; Metabolismo de metano; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários; Metabolismo microbiano em diversos ambientes
33.1
287.7
247109
5.1.3.11 Epimerase Catalisa a interconversão entre D- glicose e D-manose1
45.5 190.6 0
1.1.1.192 Oxidoreductase Degradação de ácidos graxos 53.9 120.8 0 3.2.1.80 Glicosilase Metabolismo de frutose e manose 18.2 84.9 0
2.5.1.47
Alkiltransferase
Metabolismo de cisteína e metionina; Metabolismo de enxofre; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários; Metabolismo microbiano em diversos ambientes
652.1
1104.1
0
4.2.1.45
Liase Metabolismo de amino açúcar e nucleotídeo açúcar; Vias metabólicas
31.7
92.1
0
1.11.1.22 Peroxidase Protege as células da peroxidação lipídica
15.8 180 0
Fonte: Gaeta, 2020
84
Por fim, os 10 E.C.s mais informativos para a composição fazenda X sítio
anatômico, foram mapeados para metabolismo microbiano, metabolismo de
aminoácidos, reparo de DNA, checkpoints de expressão gênica e degradação de parede
de células vegetais (Tabela 10).
Tabela 10 - Contagem normalizada de sequências (mediana) dos principais E.C.s identificados pela classe e via metabólica (KEGG), em relação a composição fazendas e sítios anatômicos
Fazenda 1 Fazenda 2
E.C. Classe Vias metabólicas Fezes Rúmen SNP2 Fezes Rúmen SNP2
1.4.7.1
Oxidoreductase
Metabolismo de glioxilato e dicarboxilato; Metabolisdo de nitrogênio; Metabolismo microbiano em diversos ambientes
214.9
770.2
0
123.3
744.2
377.4
6.5.1.2 DNA ligase Forma ligações fosfodiester, reparo de quebras em DNA simples fita1
529.4 363.9 0 613.2 348.5 327.1
6.3.5.4
Carbon-Nitrogen ligase
Metabolismo de alanina, aspartateo e glutamate; Vias metabólicas; Biossíntese de metabólitos secundários
85.4
452.3
0
21.33
524.4
0
3.6.1.27 Hidrolase Biossíntese de peptidoglicano 81.3 34.5 0 73.8 32.4 0
27.1.162 Fosfotransferase Degradação de lacto-N-biose/galacto-N-biose em Bifidobacterium longum1
145.3 51.4 0 178.1 24.8 0
4.2.2.23 Carbon-oxygen
liase Degradação de rhamnogalacturonan em Bacillus subtilis e Aspergillus aculeatus1
22.1 300.2 0 52.8 303.6 0
3.2.1.156 Oligosaccharide
reducing-end xilanase
Envolvido na quebra de hemicellulose na parede celular vegetal1
17.0
89.5
0
233.0
69.4
0
3.4.21.116
Peptide hidrolase Checkpoint regulatório de expressão gênica essencial na horação de esporos resistentes ao calor1
135.7
23.9
0
160.6
23.4
0
1.5.1.43 Oxidoreductase Metabolismo de arginina e prolina; Vias metabólicas
18.0 56.1 0. 13.6 66.3 0
3.1.1.96 Carboxilic-ester
hidrolase Cliva tRNAAla com carga incorreta; implicado na tolerância ao etanol 11
89.4 71.4 0 100.5 54.7 0
Fonte: Gaeta, N.C., 2021
86
4.6 ANÁLISE DA ÁGUA
4.6.1 Detecção de elementos tóxicos
A detecção dos metais pesados foi realizada em quatro pontos da bacia do
Rio Doce (incluindo a F1) e em um ponto na F2 (Tabela 11). O alumínio foi identificado
em todos os pontos avaliados. O ferro foi detectado somente nos dois primeiros pontos
da bacia do Rio Doce e na F2. Por fim, o mercúrio foi detectado somente na F2.
Tabela 11 - Tabela X. Detecção de alumínio (Al). Cromo (Cr), ferro (Fe), cobalto (Co), arsênio (As),
mercúrio (Hg) e cobre (Cu) em quatro pontos da bacia do Rio Doce (incluindo a fazenda 1) e a fazenda 2, utilizando WDXRF. Valores precedidos pelo sinal < significam que estão abaixo do limite
de quantificação da técnica.
Local Al
mg L-1
Cr
mg L-1
Fe
mg L-1
Co
mg L-1
As
mg L-1
Hg
mg L-1
Cu
mg L-1
Gualaxo 0,056 < 0,0003 0,039 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003
Fazenda 1 0,072 < 0,0003 0,015 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003
Campinas 0,006 < 0,0003 < 0,0007 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003
Gesteira 0,010 < 0,0003 < 0,0007 < 0,0002 <0,0036 <0,0015 < 0,0003
Fazenda 2 0,095 < 0,0003 0,006 < 0,0002 <0,0036 0,003 < 0,0003
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
4.6.2 Detecção de bactérias resistentes a antibióticos na água
Após a triagem das amostras de água da Bacia do Rio Doce, houve o
isolamento de 31 cepas. Destas, 14 cepas apresentaram-se sensíveis a todos os
princípios testados. Das cepas que apresentaram resistência a algum dos antibióticos
testados (N=17), 64,7% (11/17) foram resistentes a sulfazotrim, 53,0% (09/17) a
ceftriaxona, 47,0% (08/17) a cefotaxima, 47,0% (08/17) a cefoxitina, 41,2% (07/17) a
ácido nalidíxico, 29,4% (05/147) a amoxicilina com ácido clavulânico, 17,6% (03/17) a
aztreonam, 17,6% (03/17) a cefepime, 11,8% (02/17) a gentamicina e 5,9% (01/17) a
ciprofloxacina. Três cepas apresentaram resistência a quatro classes de antibióticos
87
diferentes, sendo elas B2-C (cefalosporinas, penicilinas, monobactâmicos e
aminoglicosídeos), C2-C (monobactâmicos, aminoglicosídeos, sulfonamidas e
cefalosporinas) e F3-F (cefalosporinas, quinolonas, sulfonamidas e penicilinas),
caracterizando-se como multirresistentes (Figura 14).
Dois isolados de E. coli (B2-C e C3-F) e um isolado de K. variicola (C2-C)
apresentaram detecção fenotípica de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL)
com detecção molecular do gene blaCTX-M. Com os primers disponíveis no
laboratório no momento deste estudo, os genes blaCTX-M2 e blaCTX-M15 foram detectados
nas cepas B2-C e C2-C, respectivamente. Não foi possível confirmar a variante do
gene CTX-M presente na cepa C3-F (E. coli), indicando a presença de uma outra
variante. Estas três cepas foram submetidas ao sequenciamento do genoma inteiro e
os resultados são descritos mais adiante.
A triagem das amostras de água da F2 resultou no isolamento de quatro
cepas, sendo que três delas apresentaram resistência a algum antibiótico. A cepa C3
foi a única que apresentou perfil multirresistente (resistência a sulfazotrim, quinolonas,
cefalosporinas e monobactâmicos) (Figura 14).
88
Figura 14 - Perfil de resistência a antibióticos dos isolados obtidos nas amostras de água de oito pontos ao longo da Bacia do Rio Doce (incluindo F 1) e da F2, localizadas no estado de Minas
Gerais, Brasil. Três isolados apresentando perfil de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) estão assinalados com um asterisco
ATM: Aztreonan; ETP: Ertapenen; IPM: Imipenem; CIP: Ciprofloxacina; GEN: Gentamicina; AMI: Amicacina; MER: Meropenen; CAZ: ceftazidima; CFO: Cefoxitina; NAL: Ácido nalidíxico; SUT: Sulfazotrim; AMC: Amoxicilina + Ácido clavulânico; CTX: cefotaxima, CRO: ceftriaxona, COM: Cefepime. ESBL: Extended-spectrum beta-lactamase; GNNF: Gram-Negativa não fermentadora; Enterobactéria: cepas cujas espécies ou gêneros não foram detectados; R: resistente; I: intermediária; S: Sensível. **Localização da Fazenda 1.
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
4.6.3 Detecção de espécies resistentes a metal pesado na água
A CIM para os elementos tóxicos foi realizada em triplicata para a
determinação das concentrações a serem utilizadas nas placas de ágar MacConkey,
as quais foram 1024 µg/mL de arsenito de sódio, 4 µg/mL de cloreto de mercúrio, 2048
µg/mL de sulfato de cobre, 4 µg/mL de nitrato de prata, 512 µg/mL cloreto de cobalto
e 256 µg/mL de dicromato de potássio. Após o pré-processamento da água, foram
obtidos 74 isolados provenientes da água da Bacia do Rio Doce (incluindo F1) e 13
isolados de F2. Em relação às amostras da bacia do Rio Doce, foram obtidos mais
isolados provenientes da semeadura em placas com mercúrio (27,0%; 20/74) seguido
por arsênio (25,7%; 19/74), prata (24,3%; 18/74), cobalto (17,5%; 13/74), e cromo
89
(5,4%; 04/74). Na água de F2, foram obtidos isolados de placas com mercúrio (39%;
05/13), seguido por prata (23%; 03/13), arsênio (15%; 02/13), cobalto (15%; 02/13) e
cromo (08%; 01/13). Não foram obtidos isolados em placas contendo cobre.
Em todos os testes, ATCC 25922 (E. coli), ATCC 13883 (K. pneumoniae) e KP
535 (K. pneumoniae -controle positivo) foram utilizados como controles, a fim de que
se pudesse determinar quais cepas poderiam ser consideradas resistentes ao
elemento testado. Foram consideradas resistentes (ou candidatas à resistência) as
cepas que apresentassem CIM para As ≥ 1024 µg/mL, Hg ≥ 8 µg/mL, Cu ≥ 5096
µg/mL, Co ≥ 2048 µg/mL, Cr ≥ 1024 µg/mL e Ag ≥ 8 µg/mL.
Das 74 cepas testadas (bacia do Rio Doce, incluindo a fazenda 1), 47,3%
(35/74) apresentaram resistência a pelo menos um metal pesado (Tabela 13). Cerca
de 91,4% das cepas (32/35) apresentaram resistência a somente um elemento, sendo
84,4% (27/32) à As e 16,6% (05/32) à Hg. Três cepas apresentaram resistência a As
e Hg simultaneamente (Tabela 12).
Quanto às fazendas, 14 cepas foram isoladas a partir da água na região de F1,
sendo que somente seis apresentaram resistência a pelo menos um elemento tóxico.
Cerca de 83,3% (05/6) apresentaram resistência a As, e 16,7% (01/6) à As e Hg. Já
na água de F2, 13 cepas foram isoladas, das quais somente duas apresentaram
resistência à arsênio (Tabela 12).
90
Tabela 12 - Relação de cepas isoladas da água da Bacia do Rio Doce e a fazenda 2, apresentando resistência a ao menos um elemento tóxico estudado de acordo com o teste padronizado.
Local Placa ID Espécie CIM (µg/mL)
As Hg Cu Co Cr Ag
A As A2-F C. freundii ≥1024 1 2048 1024 256 4
A As A3-C S. marcensis ≥1024 2 2048 1024 512 4
A Hg A1-C A. caviae 256 16 2048 512 128 0.25
B Ag B4 E. coli ≥1024 1 >1024 512 128 4
B As B1-F E. asburiae ≥1024 1 2048 512 256 8
B Hg B1-C E. coli ≥1024 8 2048 512 128 4
C As C4-C P. monteilii 512 16 1024 1024 128 4
C Ag C6-C A. caviae ≥1024 1 2014 512 128 2
C Ag C4-F E. coli ≥1024 1 1024 512 256 4
C Co C2-F S. marcensis ≥1024 1 >1024 1024 256 4
D Co D1-C S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 512 4
D Co D2 C. freundii ≥1024 1 >1024 512 256 4
D As D3-F S. marcensis ≥1024 1 2048 512 256 2
D As D4-C R. ornithinolytica ≥1024 1 2048 1024 512 4
D As D2-F Enterobactéria ≥1024 1 2048 1024 512 4
D As D3-C R. ornithinolytica 512 16 2048 512 256 4
E Co E2-C S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 256 8
91
E As E1-F S. marcensis ≥1024 1 2048 1024 512 4
F As F6-C P. putida ≥1024 1 2048 512 128 1
F Cr F2-C Enterobactéria ≥1024 1 512 512 128 1
F Ag F5-F R. ornithinolytica ≥1024 1 2048 512 64 0.5
G As G5-C K. pneumoniae 512 8 >1024 512 128 4
G Ag G4-F K. pneumoniae ≥1024 1 2048 512 64 2
G Ag G6-C K. pneumoniae ≥1024 1 2048 512 128 4
G Co G1-F S. marcensis ≥1024 2 >1024 1024 512 8
G Hg G3-C E. asburiae ≥1024 8 2048 512 256 4
H Ag H5-F E. coli ≥1024 0,5 1024 1024 128 4
F1 As H3-F P. putida ≥1024 0.5 1024 1024 512 0.5
F1 Ag H5 E. coli ≥1024 0.5 1024 1024 128 4
F1 Co H2-C S. marcensis ≥1024 1 >1024 1024 512 4
F1 Co H1-C S. marcensis ≥1024 0.5 1024 1024 128 8
F1 Cr H3-C S. marcensis 512 32 2048 512 512 8
F1 Hg H9-F P. mosselii ≥1024 32 2048 512 256 8
F2 As Cont1-F E. coli ≥1024 0.25 1024 512 <4 2
F2 Ag Cont2-C A. baumanii ≥1024 0.5 1024 256 128 2
25922
C -
E. coli
32
1
1024
512
128
4
13883 C - K. pneumoniae 64 1 1024 512 256 4
92
535 C + K. pneumoniae ≥1024 8 2048 512 128 4
ID: identificação; Ferm: Fermentação de lactose; CIM: concentração inibitória mínima; As: arsênio; Hg: mercúrio; Cu: cobre; Co: cobalto; Cr: cromo; Ag: prata.
Em negrito: CIM semelhantes ao controle positivo.
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
93
Por fim, observou-se que cepas resistentes a arsênio foram detectadas
principalmente naquelas placas contendo arsênio, seguida de cobalto, prata e cromo.
Cepas resistentes a arsênio+mercúrio foram isoladas de todas as placas. Não houve
crescimento bacteriano nas placas suplementadas com cobre (Figura 15).
Figura 15 - Frequência de detecção de cepas resistentes a metais pesados (isoladas de amostras de
água) em relação a seleção utilizando placas suplementadas com os elementos tóxicos.
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
94
4.6.4 Presença concomitante de resistência a metais pesados e antibióticos
nos isolados
A figura 16 descreve a avaliação da presença concomitante de resistência a
metais pesados e antibióticos (7). Os isolados obtidos após a triagem para bactérias
resistentes a antibióticos (1) foram submetidos ao teste de sensibilidade a antibióticos
pela técnica de disco-difusão (2). Aqueles resistentes foram submetidos à
determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para metais pesados (3).
Concomitantemente, os isolados obtidos após a triagem para bactérias resistentes a
metais pesados (4) foram submetidos à determinação da CIM para metais (5). Aqueles
resistentes, foram submetidos ao teste de disco-difusão (6).
Figura 16 - Esquema demonstrando a sequência de etapas para estudo da presença concomitante de
resistência a antibióticos e metais pesados nos isolados de água.
Fonte: Gaeta, N.C.20201
Dos 38 isolados resistentes aos metais pesados, 60,5% (23/38) apresentaram
resistência a ao menos um antibiótico (Tabela 13). A maioria dos isolados resistentes
95
a arsênio, apresentaram resistência a CFO, AMC e CTX. Já a maioria daquelas
resistentes a mercúrio, também foram resistentes a NAL, CFO e AMC. A cepa B1-C
(Hg), resistente a mercúrio e arsênio, apresentou perfil ESBL, com detecção molecular
do gene blaCTX-M-2.
Notou-se que, das quatro cepas com perfil ESBL, 25% (01/04) apresentaram
resistência à As, 25% (01/04) à Hg e 50% (02/04) não apresentaram resistência a
nenhum dos elementos testados.
96
Tabela 13 - Presença concomitante do fenótipo de resistência a elementos tóxicos e antibióticos dos isolados obtidos a partir da triagem de amostras de
água da Bacia do Rio Doce (incluindo Fazenda 1) e Fazenda 2, Minas Gerais, Brasil.
Local ID Espécie Perfil Metal Perfil ATB Perfil ESBL
A A3-C (As) S. marcensis As AMC NEG
A A1-C (Hg) A. caviae Hg NAL, CFO, AMC NEG
A A2-F (As) C. freundii As AMC, GEN (I), CFO, AMP NEG
B B1-F (As) E. asburiae As CFO, AMC NEG
B B1-C (Hg) E. coli As, Hg CRO, CTX, GEN POS
B B2-C E. coli Hg GEN, SUT, ATM, CTX, CRO, CPM, CAZ (I) POS
C C2-F (Co) S. marcensis As AMC, CTX (I), CFO (I) NEG
C C4-C (As) P. monteilii Hg ATM (I), CFO, AMC, NEG
C C4-F (Ag) E. coli As CTX (I) NEG
C C2-C K. variicola NDN GEN, SUT, ATM, CTX, CRO, CPM, CAZ (I) POS
C C3-F E. coli NDN CTX, CRO, CPM, ATM (I) NEG
C C4-F P. mosselii As SUT, CIP, NAL, CTX, CFO POS
C C6-C (Ag) A. caviae As CFO, NEG
D D1-C (Co) S. marcensis As AMC, NEG
D D2-F (Ag) Enterobactéria As AMC, NEG
D D3-F (As) S. marcensis As CFO, AMC NEG
E E1-F (As) S. marcensis As AMC NEG
G G3-C (Hg) E. asburiae As, Hg NAL, CFO, AMC, NEG
G G5-C (As) K. pneumoniae Hg CTX (I) NEG
97
H H3-F (As) P. putida As SUT, ATM, NAL, CRO, CFO, CTX, CAZ (I) NEG
H H2-C (Co) S. marcensis As AMC NEG
H H1-C (Co) S. marcensis As AMC (I) NEG
H H3-C (Cr) P. aeruginosa Hg SUT, NAL, CRO, CFO, CTX, AMC NEG
H H9-F (Hg) P. mosselii As, Hg SUT, ATM, NAL, CRO, CFO, CTX, NEG
Ctrl 2-C (Ag) A. baumanii As ATM, CRO, CFO, CTX, CAZ, NEG
ATM: Aztreonan; ETP: Ertapenen; IPM: Imipenem; CIP: Ciprofloxacina; GEN: Gentamicina; AMI: Amicacina; MER: Meropenen; CAZ: ceftazidima; CFO:
Cefoxitina; NAL: Ácido nalidíxico; SUT: Sulfazotrim; AMC: Amoxicilina + Ácido clavulânico; CTX: Cefotaxima, CRO: Ceftriaxona, CPM: Cefepime. ESBL:
Extended-spectrum beta-lactamase; GNNF: Gram-Negativa não fermentadora; Enterobactéria: cepas cujas espécies ou gêneros não foram detectados; I:
intermediária; Ag: Prata, As: Arsênio, Hg: Mercúrio; Faz1: Fazenda 1; Faz2: Fazenda 2.
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
98
4.7 ANÁLISE GENÔMICA DE CEPAS REPRESENTATIVAS
O sequenciamento do genoma inteiro foi realizado em cinco cepas
representativas (B2-C(CRO), C3-F(CRO), C2-C(CRO), B1-C(Hg) e C4-F(As),
utilizando as plataformas Miseq e NextSeq Illumina.
4.7.1 Escherichia coli
A análise da cepa B2-C (CRO) revelou esta pertencendo ao ST219, sorogrupo
O-:H16 e filogrupo E. A presença do gene blaCTX-M-2, foi confirmada, bem como a
presença de genes de resistência a tetraciclina, sulfonamidas e aminoglicosídeos
(fenótipos confirmados com teste de disco difusão). Quanto a outros antimicrobianos,
a análise genética revelou a presença de genes de resistência a metais pesados e
biocidas, tais como operon de resistência ao mercúrio, níquel, cobre, arsênio, zinco,
biocidas e metais, e multi-metal. O gene qacE∆1 também foi detectado. Vale ressaltar
que os genes blaCTX-M-2, tetAR e sul1, qacE e àqueles relacionados a resistência
ao mercúrio encontram-se próximos e presentes no mesmo contig (contig 36), assim
como um elemento genético móvel (ISEc58). Ainda, plasmídeo de incompatibilidade
(IncF) também foi detectado, sendo o IncFII presente no contig 36. Importantes genes
de virulência, tais como aqueles relacionados a Salmochelina, Colicina V, Fimbria Tipo
1, Receptor de membrana heme/hemoglobina, Sobrevivência no soro, invasão,
Hemolisina E, enterotoxina-1 calor resistente, e pilus comum de E. coli (Tabela 14)
também estão presentes.
A cepa B1-C (Hg) apresenta características muito semelhantes a cepa B2-C
(CRO). Entretanto, em B1-C foi detectado o gene arsA e somente os genes de
resistência a tetraciclina, beta-lactâmicos e mercúrio estão presentes no mesmo
contig (Contig 42), assim como o plasmídeo IncFII. Já os genes relacionados a
resistência a sulfa e a quartenário de amônio estão juntos em outro contig (contig 61).
A análise da cepa C3-F revelou que esta pertence a ST155. Confirmou-se a
presença do gene CTX-M, sendo esta da variante CTX-M-55. Detectou-se a presença
de genes de resistência a níquel, arsênio cobre, zinco e teilurito. Foram detectados 2
99
plasmídeos, IncFII(pHN7A8) e Col440II. Observou-se a presença dos genes
blaCTXM-55 e blaTEM-141 presentes no mesmo contig (contig 45), assim como um
elemento genético móvel (IS26). Das cinco cepas sequenciadas, esta foi a única em
que o processo de conjugação foi possível, havendo a transferência do perfil ESBL
para a bactéria receptora.
Por fim, a cepa C4-F revelou a inexistência de quaisquer genes de resistência
a antibiótico, característica observada pelo fenótipo. Ainda, nenhum plasmídeo foi
observado nesta cepa. Mutação cromossômica pontual foi detectada no gene parE
(Tabela 15). Os genes de resistência ao arsênio arsABCDR foram detectados,
confirmando-se o fenótipo observado no teste de sensibilidade a antimicrobianos pelo
método de microdiluição em caldo (MIC).
100
Tabela 14 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST e sorotipo de alguns isolados de E. coli obtidos a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas Gerais, Brasil.
ID Antibióticos CPM Genes metais
pesados
Outros
compostos Virulência Plasmídios pMLST MLST Sorotipo Filogrupo
FimH/
FumC
B2-C
(CRO)
blaCTX-M2,
tetAR, sul1,
aac(3)-VIa
None
merRTPCAD,
nikBCDE,
pcoABCDER,
cusABCFRS, cueOR,
copA, silABCEFRS,
arsRBC, zntA, zitB,
zraPRS, tehAB
qacE
IronBCDEN,
FimH, astA,
ecpBCDER,
gadX, mchF,
traT, sitA
IncF
(FII e FIB)
F24:A-:B1
ST219
O_:H16
E
FimH370
FumC53
B1-C
(Hg)
CTX-M2,
tetAR, sul1,
aac(3)-Via,
None
merRTPCAD,
nikBCDE,
pcoABCDR,
cusABCFRS, cueOR,
copA, silABEFPRS,
arsABC, zntAR, zitB,
zraPRS, tehA,
qacE
IronBCDEN,
FimH, astA,
ecpABCDER,
sitA traA,
chuA,
IncFIB
F24:A-:B1
ST219
O_:H16
E
FimH370
FumC53
C3-F
CTX-M55
None
arsRBC, cueR, copa,
cusABCFRS,
nikBCDE, zntA,
zraPRS,
None
FimH, lpfA,
traT
IncFII,
Col440I,
Col440II
F33:A-:B-
ST155
H51:O86
B1
FimH32
FumC4
C4-F
None
parE,
arsRDABC,
nikBCDE, nikBCDE,
cusABCFRS,
None
chuA,
FimH,
ompT, sitA
None
None
ST10284
O22b:H49
D
FimH54
FumC302
102
4.7.2 Klebsiella pneumoniae Complex
Uma cepa pertencente ao Complexo Klebsiella pneumoniae foi sequenciada
para análise genética mais aprofundada.
A cepa C2-C, pertencente à espécie K. variicola subsp. variicola apresentou
12 genes de resistência a antibióticos, sendo o gene blaLEN16 presente em todas as
espécies do complexo. Para os antibióticos não testados anteriormente, cujos genes
de resistência foram detectados, o fenótipo foi posteriormente confirmado pelo teste
de disco-difusão. Mutações pontuais em cromossomos (acrR, ompK36 e ompK37)
foram detectados e a cepa, ainda, apresentou plasmídeos dos grupos IncF e IncH
(Tabela 15). Por fim, vale ressaltar que os genes aac(3)-IId, tet(D), blaCTX-M-15 e
blaTEM-1B estão no mesmo contig (contig 36). Já no contig 40, estão sul1, aadA2,
ere(A) e dfrA32. Os genes blaLEN16, fosA, oqxAB, estão nos contigs 6, 14 e 2,
respectivamente. Esta cepa foi classificada como ST 175, sendo um novo Sequence
Type.
103
Tabela 15 - Resistoma, viruloma, plasmídios, pMLST, MLST, wzi, e k_O locus da cepa C2-C (K. variicola subsp. variicola) obtida a partir da análise da água da Bacia do Rio Doce, Minas Gerais, Brasil.
ID
Genes
antibióticos
Chromosomal
point
mutation
Genes
metais
pesados
Genes
outros
compostos
Plasmídio
pMLST
MLST
WZI
K_O
locus
C2-C
blaCTX-M-15,
blaTEM-1B,
blaLEN16,
fosA, oqxA,
oqxB, aac(3)-
IId, tet(D),
sul1, aadA2,
ere(A), dfrA32
acrR, ompK36,
ompK37
arsB,
copa,
terABCDE,
CusA,
CusR
qacE∆,
qacF
IncFII_1pKP91,
IncFIB(K)_Kpn3,
IncHI1B_1_pNDM-MAR,
IncFIB(Mar)_1_pNDM-
Mar
IncF
[K25:A-:B-]
175
161
KL13_O5
*Locus non detected.
Fonte: Gaeta, N.C. 2021
.
104
5 DISCUSSÃO
No presente trabalho avaliou-se as consequências da exposição prolongada de
bovinos leiteiros a água da bacia do Rio Doce, impactada por elementos tóxicos devido
a atividade extrativista constante, ao histórico recente de acidente ambiental e ao
despejo de resíduos agropecuários e domésticos. Para isso, os animais foram
avaliados fisicamente, e deles, obteve-se dados quanto as funções renal e hepática e
concentração sérica de metais pesados, microbiota e resistoma em amostras nasais,
ruminais e fecais. Além disso, fez-se a avaliação da água de bebida dos animais (rio)
como potencial veículo de contaminação por metais pesados e disseminador de
bactérias resistentes a antimicrobianos. Pela metagenômica, observou-se diferenças
na composição bacteriana dos animais e maior abundância e prevalência de genes
de resistência a antimicrobianos nos bovinos de Mariana. Por técnicas cultivo-
dependentes, bactérias resistentes a antibióticos e metais pesados foram identificadas
principalmente na bacia do Rio Doce. Ainda, alumínio e ferro foram detectados na
água de bebida e alumínio no soro dos animais, porém em baixas concentrações.
5.1 SAÚDE BOVINA
É sabido que a região da bacia do Rio Doce apresenta alta concentração de
arsênio naturalmente devido a presença de rochas que hospedam depósitos auríferos
sulfetados (BORBA et al., 2004; SANTOLIN, 2015). Mesmo assim, este elemento
apresentou-se em baixa concentração no soro dos animais, utilizando a técnica de
fluorescência de raio-X. Este dado, somado a ausência de manifestações clínicas de
qualquer intoxicação por metais pesados, indica que, no momento deste estudo, esses
elementos não estavam sendo ingeridos em quantidade e concentração tais que
levem a intoxicações bovinas de caráter agudo. Para determinar a presença do
processo de bioacumulação (principal responsável pela concentração de elementos
tóxicos nas células animais) (ALI; KHAN, 2019) e a possibilidade de ocorrência de
intoxicações crônicas, seria necessária a detecção destes elementos em tecidos
bovinos (como o fígado). Esta etapa, no entanto, é suplementar a este trabalho, e, por
105
isso, ressalta-se a necessidade de novos estudos na área. Vale ressaltar que um dos
objetivos da presente pesquisa era implementar para bovinos, uma nova metodologia
recentemente utilizada para soro de aves para identificação de elementos tóxicos
utilizando WDXRF. Esta técnica de fluorescência de raio-X, embora utilizada na área
da geologia, é pouco utilizada na área médica (CUSTÓDIO et al., 2005). Ao nosso
conhecimento, ainda não havia sido utilizada na área veterinária para a detecção de
elementos tóxicos em amostras clínicas bovinas. Dado as suas vantagens (ausência
de resíduos químicos, ausência de perda de amostra e resultados obtidos
rapidamente), esta técnica deve ser mais explorada como uma alternativa na
ocorrência de situações onde rápidas respostas são necessárias, como em acidentes
ambientais envolvendo elementos nocivos à saúde.
A análise do perfil renal e hepático dos bovinos também foi realizada, de modo
a complementar os achados observados no exame físico e no WDXRF, e se os
animais apresentam indícios de mau funcionamento e/ou lesão hepática e renal. No
presente trabalho, AST (0-132 U/L), creatinina (1,0-2,0 mg/dL) e bilirrubina total (0,01-
0,5 mg/dL) apresentaram-se mais elevadas nos animais da fazenda 1, e ureia (23-58
mg/dL) e proteína mais elevadas na fazenda 2, embora dentro dos valores
considerados normais para a espécie. A enzima aspartato aminotransferase (AST) é
liberada na corrente sanguínea devido a lesão na membrana de células do fígado,
músculos esqueléticos, coração, rins, cérebro e hemácias (CONSTABLE et al., 2017).
Estando presente em tantos tecidos, a utilização desta enzima como parâmetro para
avaliação do funcionamento hepático só é válida quando da presença dos resultados
de outras enzimas mais específicas. Vale a pena ressaltar que em bovinos adultos,
outras enzimas como gama glutamiltransferase, são úteis na detecção de animais com
doença hepática crônica. Uma das possíveis causas de aumento da bilirrubina total, é
a obstrução canalículo biliar (CONSTABLE et al., 2017). Ureia e creatinina são
metabólitos que podem ser utilizados para avaliar a função renal. A ureia, por si, é o
produto final do metabolismo proteico que é excretado pelos rins e que também pode
ser utilizado para verificar o aporte proteico da dieta. Como já descrito, todos os
parâmetros enzimáticos e metabólicos avaliados apresentaram-se dentro da
normalidade para a espécie. Uma limitação deste estudo foi a não verificação da
concentração desses elementos no solo e na alimentação dos animais. No entanto,
omado a concentração dos elementos tóxicos no soro e a avaliação física, observa-
106
se que, no momento da amostragem, os animais não apresentaram nenhuma
evidência de intoxicação.
5.2 MICROBIOMA, RESISTOMA E ANOTAÇÃO FUNCIONAL
A exposição prolongada a metais pesados aparenta interferir na microbiota fecal
dos bovinos leiteiros ao nível “filo”. Firmicutes é descrito como o filo mais abundante
em amostras fecais de vacas leiteiras em diversos estudos não relacionados a
contaminação com elementos tóxicos (LIU et al., 2016; XU et al., 2017; HAGEY et al.,
2019). Entretanto, no presente trabalho este filo foi o mais abundante em F2. De
maneira geral, pesquisas descrevem gêneros como Clostridium, Bacteroides,
Ruminococcus, Prevotella, Enterococcus spp., dentre outros, como os mais
abundantes nas amostras fecais (Dowd et al., 2008). Na presente pesquisa,
Bacteroides, Escherichia, Clostridium, Prevotella, Bacillus, Eubacterium e
Ruminococcus, foram os gêneros mais abundantes em ambas fazendas, dos quais
Clostridium, Bacillus Eubacterium, Ruminococcus e Enterococcus foram mais
presentes na fazenda 2. Utilizando roedores como modelo experimental, BRETON et
al., (2013) demonstraram que a microbiota desses animais foi modificada após a
exposição a metais pesados, provavelmente pela ação dos elementos não absorvidos.
Ainda, a avaliação das consequências da exposição prolongada a metais pesados
revelou a diminuição da diversidade de espécies e da população de bactérias
probióticas presentes na microbiota intestinal de Bufo raddei (sapo mongol) (ZHANG
et al., 2016). Nossos dados sugerem que a exposição prolongada a água contaminada
com elementos tóxicos também pode interferir na microbiota de bovinos leiteiros ao
nível “gênero”, provavelmente devido a presença de grupos bacterianos mais ou
menos sensíveis aos elementos.
Com a análise do fluido ruminal ao nível “filo” verificou-se que Bacteroidetes e
Firmicutes foram os mais abundantes. A microbiota ruminal é geralmente composta
principalmente por bactérias Gram-negativas quando os animais são alimentados com
dietas ricas em forragem. (HUNGATE, 1966) e os resultado do presente estudo
confirmam este dado, já que aos animais de ambas fazendas, era fornecida uma dieta
baseada em forragem. Fibrobacter succinogenes (gênero Fibrobacter) são bactérias
107
produtoras de butirato que estão presentes no rúmen e o gênero Fibrobacter estava
mais presente nos bovinos de F1 que F2. Prevotella e Bacteroides foram os gêneros
mais abundantes em todas as amostras deste estudo. Prevotella tem sido reportada
como o gênero mais abundante no rumen (CHAUCHEYRAS-DURAND; OSSA, 2014;
JAMI; WHITE; MIZRAHI, 2014; LIMA et al., 2015; TONG et al., 2018), cujas espécies
estão relacionadas a degradação de amido, hemicellulose e proteína (HENDERSON
et al., 2015). Prevotella, que também já foi positivamente correlacionada a produção
de leite, apresentou-se mais abundante na F2. Neste trabalho, Ruminococcus foi mais
abundante na F1 e Eubacterium na F2, embora não significantes. Tong et al., (2018)
demonstraram elevadas abundâncias de Ruminococcus 2 e Eubacterium
coprostanoligenes em vacas de alta produção. Eubacterium já foi associado a baixo
consumo residual de ração (ELOLIMY et al., 2018), e esse gêneros estão relacionados
a degradação de celulose no rumen e algumas espécies, na síntese de butirato (FLINT
et al., 2007), fonte de energia para os bovinos. Aqui, se hipotetizou que a baixa
abundância de Eubacterium e Prevotella na F1 pode estar contribuindo para a baixa
produção leiteira reportada na F1, na qual, antes do acidente, produziam-se 250 L
leite/dia e, mais recentemente 200 L leite/dia.
Pesquisas com amostras da nasofaringe são frequentemente conduzidas para
entender a doença respiratória bovina ou para verificar as mudanças na microbiota
dessa região anatômica de bovinos confinados. Este é o primeiro trabalho que
comparou a microbiota nasal de vacas leiteiras criadas em um ambiente
potencialmente contaminado com metais pesados e um não contaminado, utilizando
animais sem manifestações de doenças respiratórias. Ao nível “filo”, observou-se
Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, e Bacteroidetes como os grupos mais
abundantes. Resultados similares foram descritos por LIMA et al., (2016) e GAETA et
al., (2016), em cujos estudos o filo Proteobacteria foi o mais abundante tanto em
animais sadios quanto àqueles com doença respiratória bovina. Em relação aos
gêneros, Eubacterium, Streptococcus, Acinetobacter e Bacillus foram os principais
grupos observados no presente estudo. Esses achados estão de acordo com o que
tem sido reportado na literatura, sendo o Acinetobacter comumente detectado na
microbiota nasofaringea de bovinos (GAETA et al., 2016; HOLMAN et al., 2017;
ZEINELDIN et al., 2017). O gênero Streptococcus (em particular a espécie S.
pneumoniae) é comumente relacionado a pneumonia em humanos (JAIN et al., 2015),
e tem sido detectado no trato respiratório bovino (KLIMA et al., 2019). Bacillus são
108
bactérias presentes no ambiente que podem ser inaladas pelos bovinos e, portanto,
detectadas no trato respiratório Algumas espécies deste gênero produzem peptídeos
antimicrobianos (SHELBURNE et al., 2006) que inibem o crescimento in vitro de P.
multocida, M. haemolytica, e H. somni (Xie et al., 2009), patógenos importantes
relacionados a doença respiratória bovina. A presença de Bacillus como um dos
gêneros mais abundantes na região nasofaringea dos bovinos estudados nesta
pesquisa, pode estar relacionada a baixa abundância de Pasteurella, Mannheimia, e
Histophilus e, consequentemente, pode ter contribuído para a ausência de animais
com manifestações clínicas de acometimento do sistema respiratório.
A persistência prolongada e a continua deposição de metais pesados no
ambiente (ex. fonte de água e solo) permite a interação microbiana e a transferência
de genes de resistência, potencializando o aparecimento de bactérias resistentes a
antimicrobianos nos animais de produção e o aumento da exposição humana a estes
genes de resistência por meio da cadeia de produção (produção primária, indústria de
alimentos e ambiente doméstico) (ONICIUC et al., 2019; PÉREZ-RODRÍGUEZ;
MERCANOGLU TABAN, 2019). Bombas de efluxo são sistemas de proteínas
relacionadas a resistência cruzada (BAKER-AUSTIN et al., 2006; MARTINEZ et al.,
2009), já que diversas moléculas de antimicrobianos (como metais pesados e
antibióticos) são lançadas para fora da célula pelo mesmo sistema. Em bactérias
Gram-negativas (como E. coli, C. jejuni e P. aeruginosa), os sistemas proteicos de
importância clínica são membros da superfamília RND. Já nas bactérias Gram-
positivas e micobactérias, como S. aureus, Bacillus spp. e M. tuberculosis, os sistemas
são principalmente das superfamílias Major Facilitator Superfamily (MFS) e ATP-
Binding Cassettes (ABC) (PIDDOCK, 2006; ROUTH et al., 2011). Os resultados do
presente trabalho sugerem que tanto os mecanismos de resistência cruzada quando
de co-resistência podem estar ocorrendo mais em F1 devido à alta prevalência das
bombas de efluxo (incluindo multi-metal resistance RND e multi-biocide resistance
ABC), além de proteínas conferindo resistência a diversas classes de antibióticos,
elevados possivelmente pela contaminação ambiental. Ainda, a detecção de vários
mecanismos de resistência alerta para a possível presença de bactérias multidroga
resistentes nas fezes e rúmen podendo contaminar o leite cru (AMAGLIANI et al.,
2012; RIBEIRO et al., 2019), carcaças, superfícies de abatedouros, profissionais e
consumidores, fatos que estão bem documentados na literatura (MCEVOY et al.,
2003; SCHLEGELOVÁ et al., 2004; ATNAFIE et al., 2017; SAVIN et al., 2020).
109
O desenvolvimento de resistência a antimicrobianos é um evento natural que
pode ser exacerbado pela administração terapêutica, como metafilaxia, profilaxia e/ou
de promotores de crescimento (PÉREZ-RODRÍGUEZ; MERCANOGLU TABAN,
2019). No presente trabalho, verificou-se que as fezes apresentaram a maior presença
de genes de resistência quando comparado às amostras de fluido ruminal e nasal,
implicando na amostragem de futuros trabalhos que utilizarão shotgun sequencing.
A relação simbiótica entre as comunidades bacterianas ruminais é responsável
pela produção de proteína microbiana pela utilização de amônia. A assimilação de
amônia ocorre principalmente por duas vias, as quais a participação da enzima
glutamato sintetase é fundamental. Esta enzima é classificada de acordo com o
doador de elétrons: dependente de DADH e dependente de NADPH e esta enzima é
comumente encontrada em várias bactérias. A glutamato sintetase dependente de
ferredoxina é detectada em cianobactérias (PENGPENG; TAN, 2013). No presente
trabalho, os resultados mostraram que a glutamate sintetase dependente de
ferrodoxina (E.C. 1.4.7.1) estava super-representada no rúmen das amostras de
ambas fazendas, e nas amostras nasais, na F2. Cyanobacteria estava super-
representada em duas amostras na F2 o que pode explicar o resultado observado
nesse sítio anatômico. A enzima asparagine sintetase dependente de glutamina (E.C.
6.3.5.4), e que também é identificada na via de utilização de amônia nas bactérias
ruminais (PENGPENG; TAN, 2013), estava super-representada na F2, nas amostras
ruminais. Ainda, com a concomitante presença de glutamato sintetase dependente de
ferrodoxina, sugere que a produção de proteína microbiana no rúmen dos bovinos
leiteiros da F2 está aumentada
A 2,3-difosfoglicerato dependente de fosfoglicerato mutase (E.C. 5.4.2.11)
estava super-representada no rúmen quando comparado as amostras fecais, mas sua
presença estava notadamente mais evidente nas amostras nasais, e provavelmente
independente da fazenda. Esta enzima independente de metal, que está presente em
vertebrados, leveduras e diversas bactérias, como Haemophilus influenzae, participa
dos processos de glicólise e gliconeogênese e metabolismo de metano (JEDRZEJAS,
2000). Ainda, a enzima DNA ligase (E.C. 6.5.1.2) estava presente nas amostras fecais
e ruminais, mas super-representada nas amostras nasais da F2. Esta enzima,
comumente encontrada em bactérias, participa na replicação de DNA pela formação
de pontes fosfodiester e na reparação do DNA. Já a enzima glicose 6-fosfato
dehidrogenase dependente de NADP (E.C. 1.1.1.49), que apresentou-se super-
110
representada na F2 participa da via fosfato pentose que produz, principalmente,
NADPH e ribose-5-fosfato, um precursor dos ácidos nucleicos (STANTON, 2012).
Finalmente, a DNA polimerase DNA direcionada (E.C. 2.7.7.7), também apresentou-
se super-representada na F2 e é responsável pela síntese de novas fitas de DNA pela
adição de nucleotídeos (ROETTGER, M.P.; BAKHTINA, M.; KUMAR, S.; TSAI, 2010),
e também está implicada no reparo de DNA. Assim, esses achados permitem inferir
que as vacas da F2 apresentam replicação bacteriana mais ativa que na F1 e as
bactérias da F1 são mais suscetíveis a mutação e morte celular, já que nelas a
habilidade de manutenção da integridade do DNA está diminuída. Assim, mais
pesquisas são necessárias para entender as diferenças no metabolismo bacteriano e
o comportamento em vacas de regiões potencialmente contaminadas e não
contaminadas com elementos tóxicos. É importante mencionar que as amostras
nasais se caracterizaram pela alta variação na anotação funcional, a qual pode ser
relacionada a baixa qualidade do DNA e dificuldade de extração de DNA dos swabs.
Para melhor entender o que está ocorrendo no ambiente nasofaríngeo, amostragens
e protocolos de extração precisam ser otimizados para obtenção de amostras mais
representativas.
5.3 ELEMENTOS TÓXICOS NA ÁGUA
O Conselho Nacional do Meio ambiente (CONAMA) determina que rios
semelhantes àqueles que compõe a bacia do Rio Doce apresentem como valores
máximos: 0,2 mg L-1 para o alumínio, 0,033 mg L-1 para o arsênio, 0,2 mg L-1 para
cobalto, 0,013 mg L-1 para cobre, 0,05 mg L-1 para cromo, 5,0 mg L-1 para ferro e 0,002
mg L-1 para mercúrio, dentre outros elementos (CONAMA, 2005). No presente
trabalho, os limites de detecção para cada um dos elementos na metodologia
padronizada (WDXRF) e utilizada foram: 0,0005 mg L-1 alumínio, 0,0036 mg L-1 para
arsênio, 0,0003 mg L-1 para cromo, 0,0002 mg L-1 para cobalto, 0,0007 mg L-1 para
ferro, 0,0003 mg L-1 para cobre e 0,0015 mg L-1 para mercúrio. Estes limites de
quantificação estão bem abaixo dos limites estabelecidos CONAMA, garantindo a
segurança dos resultados. No presente trabalho, as concentrações de alumínio
detectadas em todos os pontos estão abaixo dos limites estabelecidos pelo CONAMA.
111
Nossos resultados são mais baixos que aqueles descritos por CARVALHO et al.,
(2017), os quais analisaram a água da Bacia do Rio Doce após 2 anos do acidente,
utilizando espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS).
Os autores verificaram alta concentração de chumbo (0,013-0,097 mg L-1), arsênio
(0,012-0,911 mg L-1), níquel (0,051-1,078 mg L-1), alumínio (0.465-9,432 mg L-1), cobre
(0,062-1,427 mg L-1) e manganês (0,041-1,638 mg L-1), muitos deles acima dos limites
estabelecidos pelo CONAMA.
De acordo com o Nutrient Requirements of Dairy Cattle (NRC, 2001), existem
concentrações de alguns elementos potencialmente tóxicos e contaminantes na água
oferecida aos animais que são consideradas seguras para os bovinos, sendo eles
alumínio (0,5 mg L-1), arsênio (0,1 mg L-1), cromo (0,1 mg L-1), cobalto (1,0 mg L-1) e
mercúrio (0,01 mg L-1). No presente trabalho, o limite de detecção para esses
elementos é mais baixo que os valores limites, indicando a segurança desta técnica.
Utilizando o WDXRF, as amostras colhidas em 2018 apresentaram alumínio, porém
em concentrações mais baixas que os valores estabelecidos pelo NRC. Vale ressaltar
que, os bovinos da F1 estão no rebanho desde o acidente, de modo que houve
provável ingestão de água com alta concentração desses elementos tóxicos ao longo
dos anos, principalmente em períodos próximos ao momento do acidente.
5.4 BACTÉRIAS ISOLADAS DA ÁGUA DE BEBIDA
O estudo da água de bebida dos animais foi fundamental para avaliação desta
como fonte e veículo de transmissão de bactérias resistentes a antimicrobianos a
todos os seres vivos que dela se utilizam. Para isso, utilizou-se métodos de cultivo e
isolamento de bactérias Gram-negativas aeróbias. Pela presença da membrana
celular externa, este grupo bacteriano é geralmente mais resistente a antibióticos que
o grupo das Gram-positivas (EXNER et al., 2017). Ressalta-se, ainda a grande
importância de algumas espécies Gram-negativas na saúde pública (BREIJYEH;
JUBEH; KARAMAN, 2020), como, por exemplo, E. coli, K. pneumoniae and A.
baumannii.
Na presente pesquisa, microrganismos resistentes a sulfonamidas, beta-
lactâmicos, aminoglicosídeos e/ou fluoroquinolonas foram isolados em ambas
112
regiões, entretanto, o número de bactérias resistentes a antibióticos isolados na água
obtida na bacia do Rio Doce (incluindo F1) foi maior que naquela obtida na F2. Em
2019, outro acidente envolvendo rompimento de barragem de mineração ocorreu na
cidade de Brumadinho, Estado de Minas Gerais (há 127 km de Mariana/MG)
espalhando milhões de metros cúbicos de rejeitos e lama no meio ambiente e no rio
Paraopeba. Ao estudar amostras de solo, sedimento e água dessa região (em áreas
acometidas e não acometidas pelo acidente), por meio de PCR em Tempo Real,
FURLAN et al.,(2020) detectaram 29 genes de resistência a beta-lactâmicos,
quinolonas, aminoglicosídeos, tetraciclinas, sulfonamidas, fenicóis, macrolídeos,
glicopeptídeos, além de genes relacionados ao perfil de beta-lactamase de espectro
estendido. Os autores ressaltaram ainda, que a abundância dos genes de resistência
a antibióticos foi maior nos locais acometidos pelos rejeitos e concluíram que o
acidente resultou no aumento da quantidade e da abundância desses genes no
ambiente. Na presente pesquisa, não foi possível obter amostras de regiões não
acometidas pelos rejeitos de minério na bacia do Rio Doce, mas utilizou-se uma
amostra do mesmo estado, cuja região não apresenta nenhum histórico de
contaminação por metais pesados. A partir dos nossos resultados, sugere-se que,
apesar do desenvolvimento de resistência a antimicrobianos ser um processo natural
dos microrganismos, o contínuo despejo de esgoto doméstico, resíduos
agropecuários, resíduos de mineração de ouro, somado aos milhões de metros
cúbicos de rejeito de minério de ferro despejados após o rompimento da barragem do
Fundão, em 2015, esteja relacionado a este maior número de bactérias resistentes
detectadas na bacia do Rio Doce. Como outra evidência para este fato, os dados do
resistoma bovino indicaram maior prevalência e abundância de genes de resistência
a antimicrobianos nas amostras fecais, ruminais e nasais dos bovinos de Mariana/MG.
Aos microrganismos adquiridos por meio da alimentação, ar inalado e por meio da
lambedura da pele, a água mostrou-se uma importante fonte direta de bactérias
resistentes a antimicrobianos.
A análise da sensibilidade dos isolados a metais pesados também foi realizada.
Ao nosso conhecimento, o presente trabalho é primeiro que objetivou este estudo na
região de Mariana, Minas Gerais, Brasil. Vários isolados apresentaram CIM para
mercúrio e arsênio, igual ou maior que o controle positivo, sendo considerados,
portanto, tolerantes a estes elementos. A exploração de ouro, hoje realizada de
maneira menos acentuada, foi uma atividade muito exercida durante a ocupação da
113
região. Sabe-se que para tal, o mercúrio (em sua forma metálica – metilmercúrio) é
ainda muito utilizado pelos garimpeiros na separação do minério dos demais
sedimentos do rio (ROESER; ROESER, 2010), mesmo com a publicação do Decreto
N°97 507/1989, que veta o uso deste elemento na extração do ouro, exceto em
atividade licenciada. Ainda, como citado anteriormente, já é sabido que a região
apresenta naturalmente níveis maiores de arsênio devido a presença de rochas que
hospedam depósitos auríferos sulfetados (BORBA et al., 2004; SANTOLIN, 2015).
Assim, a detecção de bactérias tolerantes a estes elementos já era esperada. Em um
trabalho semelhante realizado na Bacia do Araçá, no Estado de São Paulo, a maioria
dos isolados apresentaram elevado CIM para Cr (400 - 3200 µg/mL), seguido de Zn
(25-1600 µg/mL), Cd (12,5-400 µg/mL) e Cu (25-1600 µg/mL) (ZAMPIERI et al., 2016),
únicos metais estudados neste trabalho. A bacia do Araçá é uma área que apresenta
ocupações irregulares, contínuo despejo de esgoto proveniente da cidade de São
Sebastião e o terminal aquaviário da Petrobrás. Os isolados do presente trabalho
apresentam valores de CIM para Cr menores (64-512 µg/mL) e semelhantes para o
Cu (1204-2048 µg/mL) quando comparados àqueles obtidos no trabalho citado acima.
Padrões semelhantes são encontrados quando os resultados do presente trabalho
são comparados com àqueles já existentes na literatura (MALIKI, A.; JAISWAL, 2000;
WANG et al., 2015; SAIR; KHAN, 2018). Bactérias capazes de crescer em altas
concentrações de arsênio já foram obtidas a partir de esgoto (ABBAS et al., 2014),
solo utilizado na agricultura (BACHATE; CAVALCA; ANDREONI, 2009) e sedimentos
de lago (PEPI et al., 2007).
A fim de obter indícios da ocorrência do processo de co-resistência, optou-se
por determinar a CIM dos metais estudados para os isolados resistentes a antibióticos
e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados resistentes a arsênio e
mercúrio. Nossos resultados fenotípicos indicaram a presença simultânea de
resistência a ATB e algum dos elementos tóxicos estudados. Verifica-se, portanto, que
a maior pressão ambiental somado ao processo natural de desenvolvimento de
resistência a antimicrobianos provavelmente contribuiu para a exacerbação da
resistência bacteriana a estes elementos na região de Mariana. Vale ressaltar que
este trabalho contribui com novas diretrizes para o estudo da sensibilidade microbiana
aos metais pesados, haja vista a ausência de protocolos padronizados.
114
5.5 CEPAS SEQUENCIADAS – CARACTERÍSTICAS E IMPLICAÇÕES
O sequenciamento do genoma inteiro foi realizado para cinco cepas, sendo
quatro de E. coli (B2-C, B1-C, C3-F e C4-F) e uma de Klebsiella variicola subsp.
variicola (C2-C), todas isoladas a partir de amostras de água da bacia do Rio Doce.
Todos os isolados sequenciados (exceto C4-F), apresentaram variantes da beta-
lactamase CTX-M, que, assim como TEM e SHV são beta-lactamases de espectro
estendido (ESBL) pertencentes a classe A das β-lactamases (BUSH; JACOBY, 2010). A
enzima CTX-M, entretanto, é aquela com maior número de variantes descritas
(CANTÓN; GONZÁLEZ-ALBA; GALÁN, 2012). No presente trabalho, as variantes
CTX-M-2, CTX-M-15 e CTX-M-55 foram detectadas nas amostras da Bacia do Rio
Doce. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho que descreve a presença
de bactérias com perfil ESBL nessa região. Genes referentes às beta-lactamases de
espectro estendido foram detectados em amostras de Brumadinho, Minhas Gerais,
após o acidente ambiental (FURLAN et al., 2020). Em países como Reino Unido
(AMOS et al., 2014), Coreia do Sul (KIM; KANG; LEE, 2008) e Suíça (ZURFLUH et
al., 2013) essas enzimas foram detectadas em rios que continuamente recebem ou
receberam esgoto doméstico e industrial em grande quantidade. Em uma pesquisa
geográfica e temporal com isolados de hospitais e infecções comunitárias, BEVAN;
JONES; HAWKEY, (2017) verificaram que a variante CTX-M-2 é mais prevalente na
América do Sul, enquanto que a CTX-M-15 tornou-se importante em quase todos
países e a CTX-M-55 com relevância no leste asiático.
Klebsiella variicola foi descrita pela primeira vez em 2004, após ser isolada a
partir de bananas (ROSENBLUETH et al., 2004) e, em 2014, foi isolada a partir de
leite proveniente de animais com mastite (PODDER et al., 2014). É uma bactéria
oportunista considerada patógeno emergente na medicina humana (IMAI et al., 2019;
RODRÍGUEZ-MEDINA et al., 2019), e que vem adquirindo importância para a saúde
pública. Recentes pesquisas indicam esta espécie como potencial agente responsável
por enfermidades do sistema urinário (POTTER et al., 2018). Sendo um potencial
reservatório de genes que conferem resistência a vários antibióticos (RODRÍGUEZ-
MEDINA et al., 2019), sua importância clínica veterinária e humana é ainda maior. A
multirresistência a antibióticos foi observada nos resultados do presente trabalho, já
que a cepa C2-C apresentou os genes blaCTX-M15, blaTEM-1B, blaLEN16, fosA,
115
oqxA, oqxB, aac(3)-IId, tet(D), sul1, aadA2, ere(A), dfrA32. Genes de resistência a
metais pesados também foram identificados, embora a resistência não fora
demonstrada pelos testes fenotípicos. Klebsiella variicola, ainda, caracteriza-se pela
resistência intrínseca a ampicilina, conferida pelo gene LEN (RODRÍGUEZ-MEDINA
et al., 2019), como observado na cepa C2-C. Recentemente observou-se que cepas
de K. variicola podem ser tão virulentas quanto cepas de K. pneumoniae produtoras
de ESBL e causar infecções invasivas, com mortalidade similar às cepas de K.
pneumoniae (LONG et al., 2017). Assim, a detecção desta espécie multirresistente na
água da bacia do Rio Doce serve de alerta para profissionais da saúde quanto a
possibilidade de infecções de difícil tratamento em humanos e animais da região.
Na China, a variante CTX-M-55 tornou-se, pela primeira vez, a mais prevalente
entre os isolados clínicos humanos (ZHANG et al., 2014). Embora seja menos comum
na América do sul, a CTX-M-55 também já foi identificada no Equador (DELGADO et
al., 2016) e no Brasil (CUNHA et al. 2017), países que apresentam importantes
relações comerciais com a China, fato esse que pode ter contribuído para a
disseminação desta variante no continente sul-americano. Esta variante é
extensivamente detectada em animais de companhia e de produção, principalmente
em território asiático, sendo a segunda variante mais detectada em animais de
produção saudáveis na China (MA et al., 2012; ZHENG et al., 2012). Esses fatos
sugeriram que a disseminação da CTX-M-55 ocorreu dos animais para os seres
humanos. Ao nosso conhecimento, esta pesquisa é a primeira a identificar CTX-M-55
em um isolado de E. coli (C3-F) obtida a partir de água de rio brasileiro. A presença
desta cepa na bacia do Rio Doce também deve alertar pesquisadores e profissionais
da saúde para sua possível disseminação para a população, seja de maneira direta,
pelo uso dos rios como lazer, ou indireta, por meio da cadeia de produção de
alimentos. De maneira geral, CTX-M-55 e os genes fos são carreados em plasmídeo
tipo IncF, pertencentes ao subgrupo F33:A-:B-, considerado um vetor eficiente para
carrear e disseminar genes de resistência com relevância clínica (CUNHA et al., 2017;
CHEN et al., 2018a). A cepa C3-F apresenta este plasmídeo carreando somente o
gene blaCTX-M-55. Esta cepa pertence a ST155, cuja presença já foi descrita em
amostras de esgoto na India (SALIM et al., 2019) e E.coli isolada de galinhas (YANG
et al., 2017; ADZITEY et al., 2019), suínos (CHEN et al., 2018a) e fezes de cavalos
(SADIKALAY et al., 2018). A cepa C3-F pertence ao grupo filogenético B1, que é
particularmente detectada em animais, embora já tenha sido identificado em humanos
116
(STOPPE et al., 2017), porém com menor importância. No estudo realizado por
CARLOS et al., (2010), este filogrupo foi identificado principalmente em fezes bovinas,
ovinas e caprinas, quando outras fontes de contaminação como fezes humanas,
aviárias e suínas também foram estudadas. Este achado é particularmente importante
já que com livre acesso dos bovinos ao rio da região estudada, as fezes bovinas são
continuamente ali despejadas. Este filogrupo tem sido largamente identificado em
herbívoros (CLERMONT et al., 2011), já tendo sido presente em E. coli patogênicas
isoladas de búfalos com diarreia (COURA et al., 2019). Ainda, obteve-se sucesso no
processo de conjugação da cepa C3-F, com transferência do fenótipo ESBL e de
resistência ao arsênio para a bactéria receptora. Diante de todas essas evidências
acima descritas, sugere-se que esta cepa está presente na água do rio provavelmente
devido a presença de bovinos na região e caracteriza-se como potencial
disseminadora de genes de resistência clinicamente importantes para cepas
patogênicas para humanos e animais.
A variante CTX-M-2, antes de grande importância em quase todos os
continentes, hoje apresenta-se mais relevante na América do sul (BEVAN; JONES;
HAWKEY, 2017). Em revisão feita até 2012, as variantes CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-
M-9, CTX-M-74 e CTX-M-75, eram as mais prevalentes no Estado de Minas Gerais
(SILVA; LINCOPAN, 2012). Na área veterinária e ambiental, o gene blaCTX-M2 já foi,
por exemplo, detectado em E. coli isoladas de fezes e carcaças bovinas no Japão
(SHIRAKI et al., 2004), Indonésia (SUDARWANTO et al., 2016), França (HARTMANN
et al., 2012) e Brasil (PALMEIRA et al., 2018) e em água de rio na Áustria (ZARFEL
et al., 2017). As cepas B2-C e B1-C apresentaram o gene blaCTX-M-2, sendo este
carreado pelo plasmidio IncF subtipo F24:A-:B1. Este plasmídeo já fora identificado
na mesma espécie bacteriana isolada de suínos e de humanos com septicemia
(SUNDE et al., 2015). Os autores citam que este subtipo pode ser um plasmídeo de
sucesso, com grande disseminação entre as E. coli, sejam elas patogênicas ou
comensais. O plasmídeo IncF subtipo F24:A-:B1 conjugativo, carreador do gene CTX-
M-2 já foi detectado em cepa de E. coli isolada de gaivotas (Laurus dominicanus) na
Argentina (LIAKOPOULOS et al., 2016). No presente trabalho, entretanto, não se
obteve sucesso no processo de conjugação de B2-C e B1-C, mas havendo a
descrição anterior do sucesso na conjugação deste plasmídeo, a importância desse
elemento genético móvel como disseminador dos genes de resistência torna-se ainda
maior. Ambas cepas pertencem a ST219, já identificada um gato na França (MELO et
117
al., 2019) e cidadãos tunisianos (BEN SALLEM et al., 2012). O banco de dados
Enterobase (https://enterobase.warwick.ac.uk/), ainda, apresenta E. coli ST219
isoladas de animais de produção, galinhas e de amostras ambientais. O filogrupo E
(ao qual B1-C e B2-C se encaixam), já fora detectado tanto em búfalos diarreicos
quando saudáveis (COURA et al., 2019) e, assim como o filogrupo B1, fora associado
a E. coli isoladas de bovinos (COURA et al., 2015).
A resistência a metais pesados é geralmente conferida por sistemas de bombas
de efluxo (IANEVA, 2009). Algumas dessas proteínas tem papel fundamental no
desenvolvimento do fenótipo de resistência, de modo que a ausência dos genes que
codificam essas proteínas confere a ausência do fenótipo. Nas cepas sequenciadas,
houve detecção dos ars operons arsRDABC e arsABC (em C4-F e B1-C,
respectivamente), o operon arsRBC (em C3-F e B2-C) e o gene arsB (em C2-C). O
ars operon é o sistema mais conhecido que confere resistência a arsenito e arsenato.
Existem três operons mais conhecidos atualmente, sendo eles arsRBC, arsRABC
e arsRDABC (ARGUDÍN; HOEFER; BUTAYE, 2019). Os genes arsA e arsB codificam
uma ATPase e uma proteína de efluxo, respectivamente. Quando interagem entre si,
essas proteínas formam uma bomba de efluxo para arsenito cuja energia para
funcionamento provém da hidrolise de ATP. É dessa maneira que explica-se mais
recentemente, que bactérias que apresentam estes dois genes simultaneamente são
geralmente mais resistentes ao arsênio do que aquelas que apresentam somente o
gene arsB (ROSEN, 1999; YANG et al., 2012).
O fenótipo de resistência ao mercúrio é conferido pelo mer operon, formado por
genes que codificam uma oxiredutase (merA), uma liase, que não ocorre em todos as
cepas (merB), ao menos uma proteína de membrana (merT, merC merE, merF merP
e MerG) e ao menos uma proteína regulatória (merR e merD) (BARKAY; MILLER;
SUMMERS, 2003; BOYD; BARKAY, 2012). Duas cepas (B1-C e B2-C) apresentaram
o operon merRTPCAD, com a tolerância sendo confirmada pelo teste de sensibilidade
pelo método de microdiluição em placa. As cepas sensíveis, por sua vez, não
apresentaram genes de resistência a este elemento. Bactérias resistentes ao mercúrio
já foram isolados a partir de água (KANNAN; KRISHNAMOORTHY, 2006) e
sedimentos de lago (PEPI et al., 2011) e estuário (CHIU et al., 2007) locais
contaminados por esse elemento. Vale ressaltar que a detecção de bactérias
resistentes ao mercúrio era esperada, já que a região é reconhecida pela mineração
de ouro desde o século XVIII (MAY et al., 2019).
118
Por fim, é importante destacar que para as cepas que apresentaram genes
codificadores do sistema pco (para resistência ao cobre), o fenótipo não foi observado,
mesmo estas cepas apresentando os genes pcoC e pcoD, considerados essenciais
para a completa resistência a este elemento (RENSING; GRASS, 2003). A cepa
controle negativas e positivas e as cepas estudas apresentaram a mesma CIM para o
cobre e sugere-se que, nas cepas estudadas, a ausência do gene regulatório pcoS
possa ser responsável pela ausência do fenótipo de resistência, enquanto que os
genes pcoC e pcoD estão ausentes na cepa controle. A determinação da CIM para
uma cepa com o sistema completo seria fundamental para confirmar esta hipótese.
No presente trabalho, as cepas B2-C e B1-C apresentaram-se produtoras de
ESBL, somado a resistência a tetraciclina, sulfametoxazol+trimetoprim e gentamicina
(aminoglicosídeo), além de tolerância a arsênio (somente B1-C) e mercúrio (ambas).
A cepa C3-F foi produtora de ESBL e tolerante ao arsênio e perfil ESBL. A co-
ocorrência de resistência a mercúrio e/ou arsênio e antibióticos em E. coli tem sido
amplamente descrita na literatura e os resultados assemelham-se aos descritos no
presente trabalho. Resistência a quinolonas, tetraciclina e sulfametozazol+trimetoprim
foi detectada em cepas resistentes ao arsênio obtidas em ambientes marinhos
(AVILÉS et al., 1993). Resistência a mercúrio foi observada associada a tetraciclina e
sulfametoxazona+trimetoprim em cepas de Enterobacteriaceae isoladas a partir de
amostras obtidas em plantas de tratamento de esgoto (FERREIRA DA SILVA et al.,
2007) Resistência a mercúrio, quinolonas e fluorquinolonas, somado a alta
prevalência de genes associados ao perfil ESBL foram detectados em isolados obtidos
em um hospital na Algéria (ANSSOUR et al., 2016). Sugere-se, portanto, uma possível
associação entre a resistência a esses elementos tóxicos e as classes de antibióticos
acima descritos, provavelmente devido ao processo de co-seleção.
A co-seleção ocorre devido a mecanismos fisiológicos (resistência cruzada) e
genéticos (co-resistência). A co-resistência está relacionada a ligação genética de dois
ou mais genes de resistência (CHAPMAN, 2003), sendo que com a ativação de um
gene, há a ativação do outro. Ainda, a presença destes genes no mesmo elemento
genético móvel (transposons, plasmídeos), permite a disseminação dos genes. No
presente trabalho, B2-C, B1-C e C2-C apresentaram genes de resistência a
antibióticos e metais no mesmo contig. A cepa C3-F (que apresenta os genes CTX-
M-55 e blaTEM-141 presentes no mesmo contig), por sua vez, foi a única em que a
conjugação foi possível, de modo que o fenótipo ESBL foi transferido para a
119
transconjugante, indicando a possibilidade de transmissão horizontal dos genes no
meio ambiente.
A água contaminada por resíduos derivados de quaisquer atividades
antrópicas e sua associação com a emergência e disseminação de resistência
bacteriana já foi descrita Brasil, nas regiões de Brumadinho (FURLAN et al., 2020) e
na Bacia do Araçá (ZAMPIERI et al., 2016). Fora do Brasil, esse fato foi descrito na
Índia (RAHMAN; SINGH, 2018), China (HUANG et al., 2019), Espanha (SIDRACH-
CARDONA et al., 2014; RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2015) e Estados Unidos
(STORTEBOOM et al., 2010). Vale ressaltar que a disseminação do gene New Delhi
metallo-ß-lactamase-1 (NDM-1) deu-se por água de bebida (WALSH et al., 2011). O
presente trabalho é o primeiro que apresenta resultados que indicam que a água de
diferentes pontos da bacia do Rio Doce é uma importante fonte de contaminação de
bactérias resistentes dentro atividade leiteira. Esse resultado, somado a presença de
inúmeros genes de resistência nas fezes, rúmen e nasofaringe de bovinos (detectados
pelo metagenoma), sugere a ocorrência da passagem desses genes e bactérias do
ambiente aquático para o terrestre. Este fato alerta-nos para a possibilidade de haver
transferência desses genes ao longo da produção de alimentos, com possíveis
consequências nocivas para o ser humano. Estudos futuros são necessários para
determinar se esses genes e microrganismos detectados na região da bacia do Rio
Doce estão sendo transferidos através da cadeia de alimentos da região.
A presença de bactérias resistentes a antimicrobianos e a possível presença
de mecanismos como a co-resistência implicam em dificuldades no uso de antibióticos
na medicina humana e animal, com especial importância para aquelas bactérias
consideradas de alta virulência e patogenicidade, sendo, portanto, uma emergência
na questão da saúde única e saúde global (One Health e Global Health). A saúde
única está relacionada a emergência, disseminação da resistência a antimicrobianos
e, consequentemente, em intervenções locais que visem a redução do problema. A
saúde global, por sua vez, se atenta para as condições que facilitam a disseminação
da resistência em vários países, de modo a implementar políticas de intervenção em
caráter global (HERNANDO-AMADO et al., 2019). As infecções relacionadas têm se
tornado uma emergência global que exige ações de prevenção a crise no uso de
antibióticos. O Grupo de Coordenação Interinstitucional de Antimicrobianos advertiram
que caso nenhuma ação seja tomada, doenças resistentes a drogas antimicrobianas
serão a causa mortis de aproximadamente 10 milhões de mortes/ano
120
até 2050, assim como um dano na economia. Atualmente 700,000 pessoas/ano
morrem devido a doenças resistentes a drogas (IACG, 2019). Em uma rápida tentativa
de impedir estas consequências catastróficas, alguns países adotaram um plano
contra a resistência antimicrobiana. O Plano Global para a Resistencia Antimicrobiana
(WHO, 2015), o plano de ação de 5 anos para a resistência a antimicrobianos do Reino
Unido 2019-2024 (DHSC, 2019), Plano de Ação Antimicrobiana da Nova Zelândia
(NEW ZEALAND, 2017), Plano de Ação da Resistência Antimicrobiana dos EUA
(USDA, 2014) e o Plano de Ação Plano de Ação da Resistência Antimicrobiana da
Escócia 2014-2018 (ScotMARAP2) (SCOTTISH GOVERNMENT, 2014) são alguns
exemplos. O Brasil apresenta o Plano de Ação Nacional de Prevenção e Controle da
Resistência aos Antimicrobianos, no âmbito da Agropecuária, em vigência desde 2018
(2018-2020) (BRASIL, 2018).
Metais pesados já foram identificados em produtos de origem animal como
peixes (MAHBOOB et al., 2016), crustáceos (VIRGA; GERALDO; SANTOS, 2007;
KUMAR et al., 2015), leite e derivados (ZIARATI, et al., 2018) e carnes (DI BELLA et
al., 2020). Embora os bovinos estudados nesta pesquisa não tenham apresentado
evidências clínicas de intoxicação por metais pesados, existe a possibilidade da
presença desses elementos em tecidos, tornando-se particularmente importante
quando estes são relacionados ao consumo humano. Para isso, uma etapa
complementar a este estudo é fundamental para a verificação da bioacumulação dos
metais no tecido de bovinos da bacia do Rio Doce.
Os resultados da presente pesquisa somado àqueles já descritos na literatura,
indicam que a contaminação por esgoto de variadas fontes e resíduos de mineração
podem interferir no microbioma e resistoma animal e na abundância de bactérias
resistentes na água. Salienta-se que, em relação à mineração, ações ambientais como
construção e manutenção adequadas de barragens, buscas por métodos de extração
mineral menos danosos e com menor produção de rejeitos, adequado tratamento de
rejeitos e avaliação continuada da presença e disseminação de genes de resistência
são necessárias e urgentes. Essas ações são fundamentais para garantir a proteção
ambiental, animal, e do sistema de produção de alimentos, das consequências
perigosas decorrentes do alto despejo de contaminantes.
121
6 CONCLUSÃO
Neste trabalho, os animais não apresentaram manifestações clínicas
compatíveis com quadros de intoxicação aguda ou crônica por metais pesados. Houve
detecção de baixas concentrações de metais pesados no soro dos bovinos. Os valores
para cada componente dos perfis renal e hepático mostraram-se abaixo dos valores
de referência para a espécie, nas duas fazendas.
Observou-se, também, diferenças na microbiota ruminal e fecal e demonstrou-
se que os bovinos criados em Mariana, Minas Gerais, apresentaram maior prevalência
de genes de resistência a biocidas, antibióticos e metais pesados quando comparados
aos animais criados na região sul do mesmo estado.
A análise da presença de metais pesados na água do rio indicou a presença de
elementos em concentrações abaixo dos níveis máximos de segurança indicados
pelos órgãos reguladores.
No estudo microbiológico da água, foram isoladas inúmeras bactérias
resistentes a antibióticos e/ou metais pesados como o arsênio e o mercúrio. Ressalta-
se o primeiro isolamento de cepas de Escherichia coli produtoras de ESBL e tolerantes
a mercúrio e/ou arsênio e uma cepa de Klebsiella variicola subsp. variicola
multirresistente, na bacia do Rio Doce. Houve sucesso na conjugação de uma cepa
de Escherichia coli, com transferência horizontal de genes de resistência aos beta-
lactâmicos e ao arsênio.
122
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