Mechanisms involved in the induction of apoptosis by T-2 and HT-2 toxins in HL-60 human...

17
Mechanisms involved in the induction of apoptosis by T-2 and HT-2 toxins in HL-60 human promyelocytic leukemia cells J.A. Holme 1 , E. Morrison 2 , J.T. Samuelsen 1 , R. Wiger 1 , M. La î g 1 , P.E. Schwarze 1 , A. Bernhoft 2 , M. Refsnes 1 1 Division of Environmental Medicine, Norwegian Institute of Public Health, Nydalen, Oslo; 2 National Veterinary Institute, Oslo, Norway Received 22 August 2002; accepted 27 August 2002 Keywords: apoptosis, caspase, HL-60 cells, HT-2 toxin, T-2 toxin, trichothecene mycotoxin Abstract T-2 and HT-2 toxins belong to a group of mycotoxins that are widely encountered as natural contaminants known to elicit toxic responses in hematopoietic cells. In the present study, HL-60 cells were used to characterize the apoptotic e¡ects of T-2 and a major metabolite, HT-2, and to examine the mechanisms involved. Apoptotic cells were identi¢ed microscopically by chromatin condensation and nuclear fragmentation, by £ow cytometric analysis, and by DNA gel electro- phoresis. T-2 and HT-2 induced concentration-dependent apoptosis after 24 h in HL-60 cells, starting at concentrations of 3.1 and 6.25 ng/ml respectively. An increased number of apoptotic cells could be observed 4^6 h after exposure to 12.5 ng/ml of toxin. Little cytotoxicity (plasma membrane damage) was observed even after exposure to concentrations of toxins (25^50 ng/ml) inducing apoptosis in 60^100% of the cells. The apoptotic process was almost completely blocked in the presence of the general caspase inhibitor zVAD.fmk. In contrast, no or only minor e¡ects were observed with the more speci¢c caspase inhibitors DEVD.CHO, IETD.fmk, and DEVD.fmk. As judged by Western blotting, the levels of several procaspases (-3, -7, -8, -9, but not -12) were reduced 3^6 h after exposure to toxin. Substantial increases in the presumed active form(s) of caspase-8 and -9 were observed. Furthermore, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) was already markedly cleaved 3 h after toxin treatment, indicative of active caspase-3 and -7. No or only minor changes in Bcl-2, Bcl-XL and Bax levels were observed. BAPTA-AM and ZnCl 2 blocked the degradation of procaspases, the fragmentation of PARP, and the induction of apoptosis. In summary, both T-2 and HT-2 induced apoptosis, with T-2 being somewhat more potent than HT-2. The divalent calcium concentration, [Ca 2+ ], appears to be involved in the activation of several caspases, resulting in DNA fragmentation, chromosomal condensation, and nuclear fragmentation. Abbreviations: AIF, apoptosis-inducing factor; BAPTA-AM, 1,2-bis( o-aminophenoxy)ethane- N,N,N' ,N' -tetraacetic acid tetra(acetoxymethyl) ester; DEVD.CHO, Ac-Asp-Glu-Val-aspartic acid aldehyde; DEVD.fmk, Ac-Asp-Glu-Val-Asp-£uoromethyl ketone; DMSO, dimethyl sulfoxide; ER, endoplasmatic reticulum; FBS, fetal bovine serum; Hoechst 33258, 2(2-(4-hydroxyphenyl)-6- benzimidazole-6-(1-methyl-4-piperazyl)benzimidazole hydrochloride); Hoechst 33342, 2' -(4- ethoxyphenyl)-2' ,5' -bis-1H-benzimidazole hydrochloride; HT-2, HT-2 toxin; zVAD.fmk, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-£uoromethyl ketone; IETD.fmk, Z-Ile-Glu (OMe)-Thr-As- p(OMe)-£uoromethyl ketone; [Ca 2+ ] i , intracellular concentration of Ca 2+ ; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase; PI, propidium iodide; T-2, T-2 toxin Cell Biology and Toxicology . 2003; 19: 53^68. # 2003 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands

Transcript of Mechanisms involved in the induction of apoptosis by T-2 and HT-2 toxins in HL-60 human...

��������� ����� �� ��� �� ������ �� ��������� �� ��� �� ���� ������ ������� ���� ������������ ������� �����

���� ����� �� �� ����� ���� ��������� ������ �� ��� � ���� ����� �� �� � ���!"��� ��!������������� �� �������� �� ��������� �������� ��� � � � �� ������ ���� �� �������� ����� �� �����!� ����� ��� � � �� ����� �����

�����#�$ �� �����" �%%�& ����'"�$ �( �����" �%%�

"������# �'�'"���� ���'��� ��)*% ����� ��)� "�+�� �)� "�+�� " ����"������ �,��"�+��

��������

�)� ��$ ��)� "�+��� -����� "� � � ��' �! �,��"�+��� "��" � � ��$��, ������"� �$ �� ��"� �����"������"� .���� "� �����" "�+�� ��'����� �� ����"�'���"�� ������ /� "�� ' ����" �"�$, ��)*%����� �� � ���$ "� ��� ��"� ��� "�� �'�'"�"�� �0��"� �! �)� ��$ � ��1� ��"�-���"� ��)� ��$ "��+����� "�� ���������� ��#��#�$� �'�'"�"�� ����� �� � �$��"�2�$ ��� ����'�����, -, �� ���"�����$����"��� ��$ ������ ! �����"�"��� -, 3�� �,"���" �� ����,��� ��$ -, 45� ��� ����" �)'�� ����� �)� ��$ ��)� ��$���$ ������" �"���)$�'��$��" �'�'"���� �!"� �6 � �� ��)*% ������"� "��� �" ������" �"���� �! 7� ��$ *��8 ��9�� ��'��"�#��,� �� ��� ����$ ���-� �! �'�'"�"������� ����$ -� �-�� #�$ 6:* � �!"� �+'��� � "� ��8 ��9�� �! "�+��� ��""�� �,"�"�+���", ;'��������- ��� $�����< ��� �-�� #�$ �#�� �!"� �+'��� � "� ������" �"���� �! "�+��� ;�8:8% ��9��<��$����� �'�'"���� �� *%:%%= �! "�� ������ ��� �'�'"�"�� ' ����� ��� �����" ���'��"��, -���.�$ ��"�� ' ������ �! "�� ���� �� ���'��� ����-�"� �>�4�!�.� /� ���" ��" �� � ���, ���� �0��"� �� ��-�� #�$ ��"� "�� �� � �'���2� ���'��� ����-�"� � 4�>4�?�@ /��4�!�. ��$ 4�>4�!�.� ��1�$��$ -,���"� � -��""��� "�� ��#��� �! ��#� �� ' ����'���� ;)7 )( )A )B -�" ��" )�< �� � �$���$7:* � �!"� �+'��� � "� "�+��� ��-�"��"��� ��� ����� �� "�� ' �����$ ��"�#� !� �;�< �! ���'���)A ��$)B �� � �-�� #�$� C� "�� �� � '��,;�4�) �-���< '��,�� ��� ;����< ��� �� ��$, �� .�$�,����#�$ 7 � �!"� "�+�� " ��"���" ��$���"�#� �! ��"�#� ���'���)7 ��$ )(� 5� � ���, ���� ��������� ��)� ��)D� ��$ �+ ��#��� �� � �-�� #�$� ����)�� ��$ E�?�� -���.�$ "�� $�� �$�"��� �!' ����'���� "�� ! �����"�"��� �! ���� ��$ "�� ��$��"��� �! �'�'"����� /� ����� , -�"� �)� ��$��)� ��$���$ �'�'"���� ��"� �)� -���� �������" �� � '�"��" "��� ��)�� ��� $�#����" �������������" �"��� F?��GH �''�� � "� -� ��#��#�$ �� "�� ��"�#�"��� �! ��#� �� ���'���� ����"��� �� 45�! �����"�"��� �� �������� ���$����"��� ��$ ������ ! �����"�"����

$������ ����# �/C �'�'"����)��$����� !��"� & ����)�� �)-��;�)�����'����+,<�"����)������)"�" ����"�� ���$ "�" �;���"�+,��"�,�< ��"� & 4�>4�?�@ ��)��')I��)>��)��'� "�� ���$��$��,$�& 4�>4�!�. ��)��')I��)>��)��')3�� ���"�,� .�"���& 4��@ $���"�,� ���!�+�$�& ����$�'�����"�� �"������& C � !�"�� -�#��� �� ��& ������" 77�8A �;�);6)�,$ �+,'���,�<)*)-������$�����)*);)��"�,�)6)'�'� ��,�<-������$����� �,$ ����� �$�<& ������" 7776� ��);6)�"��+,'���,�<)��8�)-��)�)-������$����� �,$ ����� �$�& ��)� ��)� "�+��& �>�4�!�.-���,��+,�� -��,�)>��)���)��')3�� ���"�,� .�"���& /��4�!�. E)/��)I�� ;@��<)�� )��)';@��<)3�� ���"�,� .�"���& F?��GH� ��" �������� ������" �"��� �! ?�

�G& ���� '��,;�4�) �-���<'��,�� ���& �/ ' �'�$��� ��$�$�& �)� �)� "�+��

%��� &������ ��� '�(�������� �%%7& � J 87:*A�� �%%7"���� $������� ���������) ��� �� �� �� �� �������

!���� ������

�)� ��$ ��)� "�+��� -����� "� � � ��' �!" ����"������ �,��"�+��� "��" � � ��$��,������"� �$ �� ��"� �� ���"������"� ;��@BB%<� � ����"������� � � ' �$���$ -, *���+��� ��$ , ������ �� �'����� �� ���� �� -,�"�� ���$� ;I �#� BB7 BB*<� �" ��"� ���,"��, ��#� � ������ �.���"�� "��" �����$�� �" ��,���� ��� �,�"�� ��$ � �7)�'�+�$� � ��';K���� ��$ ���� BB7<� �)� ��� -��������$� �$ "�� ���" "�+�� *��������"�-���"���$ �� ��� �! "�� ���" ��$��, �"�$��$ �,��"�+)���� /� �" ��'��" �" ��� -��� �������"�$ ��"��� ���� '�"��������� ��"- ��.� �� ������� ��$��"� � ����� !��$)-� �� "�+������ .���� ��������"� , "�+�� ����.�� ;���& ��0� BA7<���� �� ��� ��"� ���$ -, ��#� � ���.�'������"� $�'��"��� �! ������ ����� ��$ -����� �� �'����� ��3����"� , ������� ��$���� ���� �! "�� $����"�#� " ��"��)� ��, -� �,$ ��,��$ "� ��)� �� ��"� �

��$ �� L���.�, ��"�-�����$ "� ��)� �� ��� �)����� �! "�� ��#� .�$��, ��$ �'���� ������� �� ��-� �"� , ������� ;@�"� ��$ M���B((& K���� ��$ ���� BB7<� /� � �� #�, �!"�� ���� ���� �! ��)� �� 5� ������ �� ������)� ��� !���$ "� -� "�� �����$ ���"�-��$��" " ����"������ '� "����� �, !���$ "����"�����"� ��"� �� �$$�"��� "� -� ��, ��$����" ;������"� ��$ ���$-� ��" BBB<� ��)� ��� �� � �-��$��" "��� �)� ����� ��� ����-��� "�� ���� �� ���$�� ��$ �� ��"������;N�-�,� �" ��� �%%%& ��""� ���� BB8<� C� "�� )�� � � ����" �"�$, ��� ��$���"�$ "��" ��)� �������" �� "�+�� �� �)� "� ���� ;/���� �" ���BBA�<� /" �� "�� �!� � ��'� "��" "� !� "�� ��� ��"� ��� "�� "�+�� �0��"� �! ��)���)� ����� "� -� '� "����� �, "�+�� "� � ����

���"������ �� �� ���-� � �! $�#�$��� ������� �#�����, "�� �,"�"�+���", �! �)� ��� -������ ��"� ���$ �� '����������, �� ��� �"��������� ��$ .� ,� ��+�� �! ��"�#��, ' ���!� �")��� ����� �� -��� �� �� "�,��� ��$ �'����;M��� BAA<� �� � $�"����$ ��� ����'�� ��$

-���������� �+�����"���� �! "� ��" "������������" "��" �)� ��$���� �'�'"�"�� ���� $��"��� ��#� �� � ���� ���� �� �,�'���$ � ����;/���� �" ��� BBA-& �������.� �" ��� BB(<����"�'���"�� "������ ;�������.� �" ��� BBA<��#� ;/�� � �" ��� BB(< ��"��"���� � ,'"� ;�� �"��� BB(< ��$ �.�� ;��-� ��L�� �" ��� BBB<�4� ��� �'�'"���� �'���2� �� '���������

��$ -���������� !��"� �� � � �-�� #�$ $��"���"! �� '�"����������, $�2��$ ��� �"�� ���� $��"����� �� '����������, ��� ��"� ��"�� ���$����)"��� �! �� ���"�� �� "�� ������� �-�� #�$$� ��� �'�'"���� ��� �!"�� -��� ���.�$ "���"�#�"��� �! ?��G9���G)$�'��$��" ��$���'���)��"�#�"�$ 45�)��$���������;�<;�� ����� �" ��� BBB& ��-� "��� �" ��� �%%%&K�.�#��# �" ��� �%%%<� �����" �"�$��� ��#���$���"�$ "��" ������� �� �+�$�"�#� �" �����" �������� ������" �"���� �! �������;F?��GH�< ��� ��$ ��"�����$ ��� ���- ���'�"��"��� � � �!"�� ������ ��$��"� � �!���������, ��$���$ �'�'"���� ;��-� "��� ��$@ ����� �%%%< ��� ��� "�� ��)� !����, �!' �"���� �''�� � "� �' ����" ��'� "��" ���)��"� � �! "�� ' ����� ;4������ ��$ �� "�����%%%<� C� "�� �� � � ��� !� �)��� 5)"� �)���� .����� ;�5N< ��$ '7A ��"����)��"�#�"�$' �"��� .������ ;���N< ���'����"� �! ���������� �����$� "��" �����"�� ���� �� #�#��� $��"� �� ��'���� "� �" ��� ��� -���������"�$ ;5���"� ��$ ��$�.� � BBB<���� ����� ���.���� ���� ���� ��)*% ���

' �#�� "� -� � ���$ ��$�� !� �"�$,��� "���'�'"�"�� ' ����� ��$���$ -, �)� ;K������ �"��� BB*< ��$ �"�� ��"� ���, ���� ��� "�+�����$ ��������� ;����� �" ��� BB(& M��� �" ���BB8< �� �,�'���$ � ����� /� "�� ' ����" �"�$,"�� ��)*% ���� ���� ��� ���$ "� ��� ��"� ��� "���'�'"�"�� �0��"� �! �)� ��$ ��)� ��$ "��+����� "�� ���������� ��#��#�$�

86

��������� �� ���� �

%�������� ��� ���� ��� �� �����

�)-��;�)�����'����+,<�"����)������)"�" ����"�� ���$ "�" �;���"�+,��"�,�< ��"� ; ����)��< �4 BA%8B ��$ � �%�B% �� �'� �����$ ! �� ?��-������)5�#�-������?� '� �"��� �� ����� ?� M��� 4���"�,����!�+�$� ;4��@< �� �� �$��� '� �+�$���)���1���"�$ �" �'"�#�$�� 5���$�" �)6%������" 77�8A ;�;�);6)�,$ �+,'���,�<)*)-������$�����)*);)��"�,�)6)'�'� ��,�<)-������$����� �,$ ����� �$�<< ������" 7776�;��);6)�"��+,'���,�<)��8�)-��)�)-������$�)���� �,$ ����� �$�< �5��� � ;�8%%%<' �'�$��� ��$�$� ;�/< ' �"� ����� N;N�%7B%< � �"�� D)%% ��$ " ,'�� -��� �� ��-"����$ ! �� ����� ?������� ?��'��, �"������ �@ M��� 4)�5N/ ��� ! �� ���+�� ��������� ��� 4���� ?� M��� ���/*6% ���� ���"� � ��$��� ��"� � )���"�����!�"�� -�#��� �� �� ��$ ���"��,��� �� � ! ��I�-�� �� ������, MN� ��)��$ 8%%*' �"��� ����, ��� ! �� ��)��$ ��-� �"� ���/��� �� ����� ?� M��� 4����� �3�� �����$����"�"� ��� ! �� �������� � �-�� ������@� M��� ���N��I�I ��� ��� ��$ I�� �"� ������� ���$ ��� �"��� �� � �-"����$ ! �� C�? ��' �$��"� ���.���$ �� M�� ��$4�>4�?�@ 4�>4�!�. /��4�!�.�>�4�!�. ! �� ?���"��� ��-� �"� ��� /������� ��"� ?� M��� ��� �"�� ��������� �� �'� �����$ ! �� ����� ���� ��� ��� ��$ �� ��! ����,"���� � �$��

$� �������

���,������ �--�" ��"�-�$��� ����$ ������" ��)� ;�-)�& @������� ����� �� � �$��"�?��-������)5�#�-������< ��)D� ;?������������ ���������, /��� 5�� ������$ ����-� �"$ MN< �+ ���'���)7 )( )A ��$)� '��,;�4�) �-���< '��,�� ��� ;����&���"� ? �� ��"��������, /�� ?� M��<

��$ ���'���)B ;��� ������ ��� 4���� ?�M��< �� � ���$& �� �����$� , ��"�-�$, �� ��) �$��� '� �+�$���)���1���"�$ ���" ��"�) �--�"� ��"�)���" /�I ;�����< ��� �''���$�

%��� ��� ���

��)*% ����� ;'� �'�� �� -���$ ���.��,"�� ! ���� �$��" !����� ��"� ���"� ' ��,����,"�����.����< �� � '� �����$ ! �� "�� �� �'���?�����"��� �! ?��� ?��"� � ;�?�??< ?��������-� , ��"��� � ��6 @�I MN� ��� ������� � ���"�#�"�$ �� ���'������ �� ���/ *6%��"� � )���"����� ���� ���"� � ��$��� ��''��)���"�$ ��"� %= ���")����"�#�"�$ !�"�� -�#����� �� ;C �< ��$ 8% ��9�� ���"��,��� �� (8��� ���"� � #������ �"��$��� �' ���" �" 7(�? ��� ����$�2�$ �"���'�� � ��"� 8= ?@� �� �� ���� ����� �� � ��"����, .�'" �� "�� ���� �"����� ��"� '���� �" %�:%�B�%* �����9�� -, $���")��� ��"� ! ��� ��$��� �" ����" �#� , "�� $ $�,�C� ���������" �! "�+�� �0��"� ���'�������

�! ��)*% ����� ;%�8�%* �����9��< �� ����"� �$ �� ��"�� ���� ���"� � #������ � $��������� ��+" $�, ����� ;�'' �+���"��, %�7�%*

�����9��< �� � �+'���$ "� #� ���� ������" �)"���� �! "��" ��-�"����� �)� ��$ ��)� �� ��$$�$ �� �"����� ;2��� ������" �"����%��8=<� ����)�� ��$ "�� ���'��� ����-�)"� � �� � $�����#�$ �� 4��@ ;2��� ������" �)"��� %�7=< ��$ E�?�� �� ��@� �� ' �#�����, �������$�$ -, �"�� � "�� ����-�"� � �� ��''���$ � -�!� � �$$�"��� �! "��" ��-�"�������$ $� ��� �+'��� �� ?��" �� ���"� �� �� ��+'���$ "� �"����� ��$ 4��@�

�������-�� ����� ��.� ��� �� �/+01 �����

������ ���- ��� $����� ��$ ������� �������� �� '�����, �������"�$ ��"� ��� ������$ �'�'"���� �� � $�"� ����$ �!"� �"����������� ;%�7�%* �����9��< ��"� �/ ;% ��9��< ��$��"� ������" 7776� ;8 ��9��< !� 7% �������� � ��$� ! �� ��)*% ����� ���'��$�$ ��C � �� � �� )$ ��$ L���.�,� ?��� �� '�����,

88

;�'�'"���� ��$ ������� #��-���",< ��� �#����"�$����� � 5�.�� ����'�� � 6%% 3�� ���������� ����'�� ?���� ��"� $��"���" ���$����$������ ��� ���"�$ ������ ��$ �'�'"�"�� -�$����� � ����"�$ �� �'�'"�"�� ��$ �� �$�"� ����$ �� � ! ��"��� �! "�� "�"�� ���-� �! ������ 5���'�'"�"�� ����� �+���$��� �/ �� ���"��� ���$ �� #��-�� ������ ?���� ��"� ���$�� '�����, ��$ �/)�"����$ ������� �� �������$ �� ��� �"��� �+������� �! " ,'�� -������ ���� ���$ "� ������ ���� #��-���",� ?�����-�� #�$ �� - ���" ���$ ��$ �+���$��� " ,)'�� -��� �� � ����" ��� ����'� �� �$�"� ����$ �� �� ��� ��#��� �����9#��-�� ������� ������� �! 7%% ����� ��� ����"�$�

%���� ��.� ��� �� �/+01 ����� �� 2���� ��� �

��� 45� �! ��)*% ����� ��� �"����$ -,����-�"��� %�7�%* ����� �� ���"� � ��$������"������ %�= � �"�� D)%% ��$ �% ��������" 77�8A9�� !� 8 ���� ��� 3�� ��)����� ��� ����� �$ ����� �� � ��� %% 3���,"���"� ;�.�" �� ��� 5� ��,<� ��� '� )���"���� �! ����� �� "�� $�0� ��" '����� �! "������ �,��� �� � ��"���"�$ ! �� 45� �,"�� �������� "�� ���"��,��� � �� �� ;������+ C����,�"�� ��� 4���� ?� M��<� /" �� '����-�� "�$��"������� $�0� ��" ���� '����� �� ���� ���'�'"�"�� �����9-�$��� ��$ �����$� , ��� �"������� �� "�� -���� �! "��� 45� ���"��";������" 3�� �������< ��$ ���� ���� ;!� �� $����" ���""� < ;I� ��,�� �" ��� BB7& ���� �"��� BBA<� �'�'"�"�� ��$�+ ��� $�"� ����$ ��"�� '� ���"��� �! ������� -�"���� "�� I '��.��$ "�� ������� '���"����$ �" �%= �! "�� I

'��.�

��$ ��� ���� �-������ 3������ � ���4

��)*% ����� ;%�B�%*< �� � �+'���$ "� "��"��-�"���� ��$ " ��"�$ ���� $��� "� I� ��,����$ ��)�� .� � ;I� ��,�� �" ��� BB7< ��"����� ��$�2��"����� ��3, ����� �� �������" �"�$ -, ���" �!���"��� ��$ �����$ ��

� � ;��"���" ?��G ��$ ���G<� ?���� �� � ����'��$�$ �� %��8 �� �! � � ;68 ����9�� ��)-� �"� -�0� ����9� �4�� '� A�%<���"������ %��8= 5���$�" �)6% ��$ %� ��9���5��� ��$ ����-�"�$ �" 7(�? !� 7% ����� �"������ N ; ��9�� 2��� ������" �"���<��� �$$�$ ��$ "�� ���'��� �� � ����-�"�$!� �� �$$�"����� 7% ��� ' �� "� ��" ������" ��"���" ��$ �$$�"��� �! 8% �� ���$��� -�0� ;%�% �� ���9�� �� '� (�8& %�%6 �� %�8 ���9� �4�� '� (�8& %�8 �� ��,�� �� ;A8=<& %�A�� - ���'����� -���& ��$ ��@ "� ��<� ������'��� �� � ����-�"�$ �" *8�? !� % �������$��"��, ' �� "� �''����"��� "� "���� ����"�� ��� ��� ��� ;�8=<� 45� -��$�;45� ! �����"�"���< �� � #��������$ ��$� M> ����" �� ���� �� ��"� I���"� �� $��� �-�$�� "�� ����!��"� � O� ���" ��"���� ;C�?<�

5�� �� ��� ���

�!"� ����-�"��� ��"� � "��" ��-�"���� "�� �����;��%*< �� � �����$ �� � � ��$ $���"�$ �� 6"���� ���� #����� �! ���'�� -�0� ;�= �4�7�(8= �)�� ��'"��"����� %= ��,�� ��%�%%�= - ���'����� -��� %�%* ���9� � ��)�?� '� *�A<� �!"� -������ !� 8 ��� � �� �!���'�� ��� ' ���'�"�"�$ ��"� ���"���:��"� ����'��$�$ �� ���9� 5�@� ��$ ����,��$!� ' �"��� ���"��" -, ��)��$ 8%%%*� ���'����! �8 �� ' �"��� �� � ��'� �"�$ -, %= �=� 8 = �4�)��I� ;��� � �" ��� BB*<� ����)���� �����" �� .� � �� � �����$�$� ���' �"���� �� � ����" �" ���!� �$ "� ��" �)��������� ���- ���� ;���-�� �" ��� B(B< ��$�"����$ ��"� ������� �� ��"� ��"� �L���' �"��� ���$��� �� � ' �-�$ ��"� � �'���2�'��,������ ��"�-�$, �� = !�")! �� $ , ���.�#� ����" �" 6�? ��$ ����-�"�$ ��"� �� ��) �$��� '� �+�$���)���1���"�$ ��"�) �--�" � ��"�)���" /�I ;$���"�$ J% %%%<� ��� ���"� �-��"� �� � $�#���'�$ ����� "�� �?� �������)���������� �,�"�� ���� $��� "� "�� ����!��)"� � O� ���" ��"���� ;��� ���� ��-� �"� ��� ��.��������� � MN<�

8*

"������

�'�'"���� ��$���$ �� ��)*% ����� -, �)� ��$-, ��)� ��� $�"� ����$ -, 3�� ���������� ����', �� ����� ��"� ��� ����$ �� ���"�����$����"��� ��$ ������ ! �����"�"��� ;C��)� � <� C��� �,"���" �� ����,��� ���-���$ ��"���� ����'�� �+�����"��� ��� ' �#�����, -������$ "� �+����� ���������, ��$���$ ���� $��"���'�'"�"�� �����9-�$��� ��"� �$���$ ���� ������$ ���� 45� ���"��" "��� I ����� ��� -��-�� #�$� ?���� ��"� �� ��� 45� ���"��"��"��� � 45� ���"�� �� �� � ���� ����,��$��"� ��'��" "� ���� �,���� � ���� ��� ���� �� �'���� ��$ � ����� �$��"��� �! I�9� ������� � ���� �!"� * � �+'��� � "� ��8 ��9�� �)���$ ��$ �8 ��9�� ��)� ;C��� � <� �� �#����)"��� ����� $�"� ! �� ��#� �� ������" �"���� �!�)� � ��)� �#� � ���-� �! "��� '���"���$���"�$ "��" "�� "�+��� $�$ ��" ����� ��1� ������� �� "�� ���"�#� ���-� �! ����� �� I �� I�9� '����� $� ��� "�� 2 �" A � ;$�"� ��"�����<���� �'�'"���� ��$���$ -, �+'��� � "� �)�

��$ ��)� !� �6 � ��� ������" �"���)$�'��)$��"� �����2���" ��� ����� �� � �-�� #�$ �" 7���$ *��8 ��9�� ��'��"�#��, ;C��� � �<� �����! "�� �'�'"�"�� ����� ��$ "�.�� �' �/ ��$���")��� �����$� , $�#���'���" �! '��������- ��� $������ >� , !�� ��� �"�� ����� ;7:(=& ���$ �/)�"����$ ��$9� " ,'�� -���)�"����$ �����< �� � �-�� #�$ �#�� !���������+'��� � "� ������" �"���� �! "�+��� ����"����� *%:%%= �'�'"�"�� ����� ;�8:8% ��9��<�C��� �,"���" �� ����,��� �! ��)*% �����

�+'���$ "� ��� ������ ������" �"���� �! �)� � ��)� �#����$ ��� ����$ �����"� �! �'�'"�"�������9-�$��� ��"� ���� 45� 3�� �����"������� "��� I ����� ;C��� � �<� ��� ����"��� ��'��$ ���� ��"� "�� ���"�#� ���-� �!�'�'"�"�� ����� $�"� ����$ -, ��� ����'������,���� C��� �,"���" �� ����,��� �� � "�� �)!� � ���$ �� "�� !�������� �+'� ����"� ��$ "��2�$���� �� � ���2 ��$ -, ��� ����'������,����

�� ��� ���� �� "�� ���-� �! �'�'"�"�� �������� �-�� #�$ 6:* � �!"� �+'��� � "� ��8 ��9�� "�+��� ;C��� � 7<� ��� �0��"� �! "�+��)��$���$ �'�'"���� �� ��)*% ����� #� ��$ ����)���" $� ��� ���"� ��� ��$ -�"���� $�0� ��"-�"���� �! ����� ��$ �� �� ;��� ���� �����$� "�C��� � 8 ��$ B<� ����#� �� ���� �+'� ����"�)� ��� ����,� �� � '�"��" "��� ��)� ;C��� �7<� /� � $� "� �$��� ��, '����-�� ��$�)�0��"��! "�� #� ���� �$$�$ ����-�"� � � * � �+'��� �"��� ��� ������ !� !� "�� ��� ��"� ���"��� �!�)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"����� /����" �+'� ����"� "�� ���"�#� �����" �!�'�'"�"�� ����� �" "��� "��� '���" ��� �� "��� $� �! 7%:(%=� ��+�� ������" �"���� ����")��� �� �� �� �'�'"�"�� ��'����� ;�)� �" ��8��9�� � ��)� �" �8 ��9��< �� � ���$ "��+����� �0��"� �� ����� �����""�$ "� $�� -,�'�'"���������� ��� �! "�� -���������� ������ .� �!

�'�'"���� �� "�� ����#��� �! 45� ��"� ������)����� ! �����"� "�� �'�'"�"�� ' ������� �� ����� ��� ��"� ���$ -, 45� ��� ����" �'�� ������� �#�$��" �� C��� � 6 -�"� "�+��� �����$������" �"���)$�'��$��" ��� ����� �� "�� ! ��)���"�"��� �! 45� ! �� ��)*% ����� �+'���$!� * � �)� -���� �� � '�"��" "��� ��)���� �����$�"� "�� ��� �! ���'���� �� �)�)

��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"���� "�� ��)*% ����� �� � �+'���$ !� * � �� "�� ' ������ �!#� ���� ���'��� ����-�"� � ��$ ����,��$ -,3�� �,"���" ,� ��� �'�'"�"�� ' ����� ����� .�$�, $���,�$ -, "�� �$$�"��� �! "��- ��$)�'��" �� ���'��� ����-�"� �>�4�!�.;C��� � 8<� /� ���" ��" 4�>4�?�@/��4�!�. ��$ 4�>4�!�. �����"�#� ����-�"� ��! ���'���)7 ���'���)A ��$ -�"� ���'���)7��$ )A ��'��"�#��, �+� "�$ ���, ���� �0��"���>�4�!�. ���� ����-�"�$ �)�) ��$ ��)�)��$���$ 45� ! �����"�"��� ;C��� � *<�� ���"�� ���$����"��� ��$ ������ ! ����)"�"��� �� �#����$ -, ��� ����'�� ����,���;$�"� ��" �����<���� '����-�� ��"�#�"��� �! #� ���� ���'����

�� "�� �'�'"�"�� ' ����� ��� ����,��$ -,

8(

*���

��)M''� ��J�0��"��!�)���$��)���

��)*%������ '�����,�?������ �����-�"�$��"���""�+��� ��"�

�)�;��8��9��<� ��)�;�8��9��<!� *��"����$��"�

�/��$������"7776���$����,��$-,

3�� ���������� ����',;� �������

����2��"����

%%%<�?���������" �����"� �� �#����� ���������;��"� ���������,�"����$<��� ���

�����"� ���+'���$"��)���$��)���� �����-� �!�'�'"�"�������9-�$���;���

���������,���$����$��$9� ! �����"�$������<� ���������� ��J�0��"��!�)���$��)�

�������,���;I

�I�9�<��$�'�'"����;�'<����� �$-,

3���,"���" ,�?��

'�"� )$ ���"��)'� ���"� ����

�" ��$��'��,;��������#� ���45����"��"< �' ����"���

!� �� $����"���""� 3�� ��������!������"77�8A)�"����$������������"���0��"��!�+'��� �"��)�;��8��9��<� ��)�;�8��9��<!� *�����$�"��������'������!"��

�����,���� �"���������4

�!7�+'� ����"��

8A

*���

� )?�����" �"���)$�'��$��"��� �����!�)�)��$���$��$��)�)��$���$�'�'"�������)*%������� �����-�"�$��"�

�)���$��)�!� �6��"����$��"�

�/��$������"

7776���$����,��$-,

3�� ���������� ����',!� ��#��������;�<��$�'�'"�"��

�����; <&� �"����$��"�

������"77�8A��$� �"��D)%%

��$����,��$

!� �'�'"�"��

�����

�����3���,"���" ,;?<����$�"� �' ����""���������4

�!7:6�+'� ����"��

8B

������-��""���� C�������� �+'��� � "� -�"��)� ��$ ��)� "�� ��#�� �! ��#� �� ' ����'�������� �� ���"��"� ���'���)A ��$ )B ;-�" ��" )�<��$ �0��"� ���'����) 7 ��$ )( �� � �$���$�� � "���)$�'��$��" !������ ;C��� � (<� ���-�"��"��� ��� ���� �! "�� ' �����$ ��"�#�!� �;�< �! ���'���)A ��$ )B ;�''�� ���� �!�'���2� ' �"��� -��$;�< ��"� ���� ��< ����-�� #�$� ?��'���)7 ��$ )( � � �����$� �$ "�-� ��'����-�� !� ����#��� �! ���� "� �"���� ��"� ��"�� AB ��$ �( .4� ! �����"� �������� � �� .�$ "���)$�'��$��" ��� ���� ��"�� ����#��� �! ���� ��� ���� �!"� �+'��� �"� -�"� �)� ��$ ��)� ;C��� � (<�/� � $� "� �+����� � '����-�� ��� �! "��

��)� !����, �! ' �"���� �� "�� �'�'"�"��' ����� ��$���$ -, �)� ��$ ��)� ��)*% ������� � �+'���$ !� * � ��$ ' �"��� �+" ��"� �� �����,��$ -, ���"� � -��""���� 5� � ���,���� ������� �� "�� ��#��� �! "�� ��"�)

*���� 6) ����)��� �� �! �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$�'�'"����� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� ��8 ��9�� �)� � ��)� !� #� ���� "���� ��$ ����,��$ !� �'�'"�"�� ����� -, 3���,"���" ,� ��� $�"� �' ����" "�� �������4 �! 7 ����-�"���������" �"��� "�� #� ��"��� ��"��� ��� �+'� ����"�

*���� 7) 45� ! �����"�"��� �� ��)*% ����� �+'���$ "� �)� ��$ ��)�� ��� ��� ��� ����" �'�� ���� �! 45� ! �� ����� ����-�"�$��"���" "�+�� � ��"� #� ���� ������" �"���� �! �)� � ��)� !� * �� ��� ����"� ! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � � ������

*%

*���� 8) ��� �0��"� �! #� ���� ���'��� ����-�"� � �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"����� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� �)�;��8 ��9��& ����"��� �� *8��= �'�'"�"�� �����< � ��)� ;�8 ��9�� ����"��� �� 6A��8= �'�'"�"�� �����< !� * � �� "�� ' ������ � �-����� �! #� ���� ���'��� ����-�"� � ;�% ����9�< ��$ ����,��$ !� �'�'"�"�� ����� -, 3�� �,"���" ,� ��� ����-�"� � �� � �$$�$ �-�!� � �"� " �! �+'��� � "� "��" ��-�"������>����� � � �������4 �! 7:6 �+'� ����"��

*���� 0) ��� �0��"� �! "�� ���'��� ����-�"� �>�4�!�. �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ 45� ! �����"�"���� ��� ��� �������" �'�� ���� �! 45� ! �� ����� ����-�"�$ ��"���" "�+�� � ��"� ��8 ��9�� �)� � �8 ��9�� ��)� !� * � �� "�� ' ������ � �-����� �! �>�4�!�. ;�% ����9�<� ��� ����"� ! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � � ������

*

�'�'"�"�� ' �"���� ��)� ��$ ��)D� ��$ "��' �)�'�'"�"�� ' �"��� �+ �� � �-�� #�$;C��� � A<�?������ �� "�� F?��GH� ��$ ��"�#�"��� �!

?��G9���G)$�'��$��" ��$���������;�< ��,��#� ���" �� ���;�< �� "�� �'�'"�"�� ' �������)�)��$���$ �� ���� �� ��)�)��$���$ �'�')"���� ����� �$ -, 3�� �,"���" , ��� -���.�$-, "�� ����).���� �����"� �! ��" �������� ?��G ����)�� ;C��� � B<� ���� E�?��.���� "� ����-�" ?��G9���G)$�'��$��" ��$�)��������;�< -���.�$ "�� ��$��"��� �! �'�'"����;C��� � B<� ��� ' ������ �! ����)�� ��$E�?�� ���� ����-�"�$ "�� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ 45� ! �����"�"��� ;C��� � %<�� ���"�� ���$����"��� ��$ ������ ! �����)"�"��� �� �#����$ -, ��� ����'�� ����,���;$�"� ��" �����<� /" �� ��"� ��"��� "� ��"� "��""�+��)�+'���$ ����� " ��"�$ ��"� E�?���''�� �$ "� -� � ��"�$ �� �� �, �"���� �!�� ���"�� ���$����"��� �� �#����$ -,�"������ ��"� ������" 7776� ;$�"� ��" �����<��� !� "�� �����$�"� '����-�� ����������

��#��#�$ �� "�� ����-�"� , �0��"� �! ����)�� ��$ E�?�� �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"���� "�� �0��"� �! "�������'���$� �� "�� ����#��� �! ���'���� ��$���� �� � �+�����$� C��� � ����� "��"-�"� ����)�� ��$ E�?�� ����-�"�$ "�� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ ����#���� �!���'���)( )A )B ��$ �����

#���������

����� " ����"������� ��#� -��� �������"�$ ��"�!��$)-� �� "�+������ ��#��#��� "�� �������,�"�� �� ������� ��$ ������ "�� � ��� -������� ��"� ��" �� ��� ��"� ����� "�� ������)"�+�� �0��"� �! �)�� ��� ��� "�� �'�'"�"���0��" �! �)� �� �'�$�, ' ���!� �"��� �,�'���$����� ��� -��� �! �'����� ��"� ��" ���� �� .�����! "�� "�+�� �0��"� �! "�� ��"�-���"� ��)�� /�"�� ' ����" �"�$, �� ���2 � "�� 2�$���� �!�"�� � "��" �)� ������ � ������� ��$ ���'��"�

*���� 9) �+' ������ �! #� ���� ���'���� ��$ ���� !���������)� ��$ ��)� �+'��� �� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� � ��"���" �)� ;��8 ��9��< � ��)� ;�8 ��9��< !� 7 * � % ��?������ ' �"��� �+" ��"� �� � ����,��$ -, ���"� � -��""������� ����"� ! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � � ������

*���� :) �+' ������ �! ��)� ��)D� ��$ �+ !�������� �)���$ ��)� �+'��� �� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� � ��"���"�)� ;��8 ��9��< � ��)� ;�8 ��9��< !� 7 * � % �� ?������ ' �"��� �+" ��"� �� � ����,��$ -, ���"� � -��""���� ��� ����"�! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � � ������

*�

*���� ;) ��� �0��" �! ����)�� ��$ E�?�� �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"����� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� �)� ;��8��9��& ����"��� �� 6��(= �'�'"�"�� �����< � ��)� ;�8 ��9�� ����"��� �� �A�8= �'�'"�"�� �����< !� * � �� "�� ' ������ � �-����� �! ����)�� ;�8 ����9�< � E�?�� ; ����9�< ��$ ����,��$ !� �'�'"�"�� ����� -, 3�� �,"���" ,� >����� � � �������4 �! 7�+'� ����"��

*���� �1) ��� �0��" �! ����)�� ��$ E�?�� �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ 45� ! �����"�"���� ��)*% ����� �� � ����-�"�$��"� � ��"���" ��8 ��9�� �)� � �8 ��9�� ��)� �� "�� ' ������ � �-����� �! ����)�� ;�8 ����9�< � E�?�� ; ����9�< !� * ���$ �-�� #�$ !� 45� ! �����"�"��� -, ��� ��� ��� ����" �'�� ���� �! 45�� ��� ����"� ! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � �������

*7

�'�'"�"�� ' ����� �� ��)*% ����� ;M��� �" ���BB8& K������ �" ��� BB*< �� 1�$��$ -, ��� �)���'�� ����,��� ��$ 3�� �,"���" , �� ���� ��-, 45� ! �����"�"���� �'�'"���� ��� ������$���$ -, ��)� ��"����� ��)� ��� ����)���" ���� '�"��" "��� �)�� ����� 2�$���� � � ���� �����" ��"� 2�$���� �! /���� ��$ ��)�� .)� � ;/���� �" ��� BBA�<� ���, !���$ "��"��"�-���� ���#� ���� �! �)� "� 7�)�,$ �+,)�)�"�+�� $�$ ��" $������� "�+���", ��� ��� �,$ �)�,��� �! �)� � 7�)�,$ �+,)�)� "� ��)� ��$ 7�)�,$ �+,)��)� ��'��"�#��, �����$ ���� 45�! �����"�"��� �� ��#� �� � ���� �!"� �� ����"�+�� �+'��� ��C��� �,"���" �� ����,��� ��$���"�$ "��" �)�

��$ ��)� ��$���$ �'�'"���� �� "�� ��)*% �����"� � �� � � ���� ������ $�� �� �" ��� '����� ��"�� ���� �,��� ��"� "�� '����-�� �+��'"��� "��"����� �� I�9� '���� �� � �������" �� �

' ��� ;C��� � ��$ $�"� ��" �����<� ����2�$��� ����� "� -� �� ���" �$��"��� "� "��������"��� "��" �)� "�+�� �� '� "����� �, "�+��"� ��"�#��, ' ���!� �"��� ����� ;����� �� � '����<���� �� "���� �� -��� �� �� "�,��� ��$�'���� ;M��� BAA<� /�"� ��"����, �)� ��$���$�'�'"���� �� "�� ��#� ����� �� ��" �����$� �$�� �� � ��� ��"� �� �� ���-� � �! ' ���!� �"�������� ��� ��� �� "�+�� �0��"� �! �)� �� ��-�� #�$ �� ���� "����� ;/�� � �" ��� BB(<�C� "�� �� � ������" �"���� �! �)� �' "� 8%��9�� $�$ ��" ��$��� �'�'"���� � ����� ��,�� .�$ ����-�"��� �! ���� ' ���!� �"��� �� ������ �'�"������ ���� ���� ���� ;�86B �����&$�"� ��" �����<� ��.�� "���"�� "���� 2�$����������" "��" "�� "�+�� '�"���, �! �)� ��$ ��)��''�� � "� -� ���� ",'�)�'���2� �"�� "��� �����,���)�'���2����� ���'���� � !����, �! ��" ��������

�,�"���� ' �"����� ��#� -��� ����� "� '��, �'�#�"�� ��� �� "�� ���"��"��� ��$ �+���"��� �!�'�'"���� ��$���$ -, #� ���� �"����� ;�� �)���� �" ��� BBB<� ����#� �'�'"���� ��� ����-��� ������"�$ "� ���� #�� ��'���)��$�'��)$��" ���������� ;/��,�")������� �" ��� �%%%<�?��'���� � � �,�"������$ �� ���"�#��, ����"�#��,������ "��" -����� ��"�#�"�$ -, ���0��$)��$��"�$ " ���)��"�#�"��� � -, ����#��� #���'�" ��� ' �"����� �� �� ��" �������� �����$��?��'���� '��, �� ��"�� �� '� " �! "�� $��"�)��$����� ��������� �� ���'"� )��$��"�$�'�'"���� ��� ��� "��, �''�� "� ��" �� � ���+���"���� � �� ���������, ��$���$ �'�'"����;��� �" ��� BBB<� ���� �����'" �� ��''� "�$ -,"�� ' ����" ����"� �� ����� ���, "�� ���� �����'��� ����-�"� �>�4�!�. �� .�$�, �$���$� $���,�$ �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$�'�'"����� /� ���" ��" �� � ���, ���� �0��"��� � ���� ��"� "�� �"�� �� � �'���2� ����-�)"� � 4�>4�?�@ /��4�!�. ��$ 4�>4�!�.������"��� "��" "�� ���"��"��� ������;�< ��"�#�"���#� �� ���'��������"� � ����,��� �#����$ "��" "�� ��#��� �!

��#� �� ' ����'���� ���� �� ���"��"� ���'���)A��$ )B ��$ �0��"� ���'���)7 ��$ )( �� �

*���� ��) ��� �0��" �! ����)�� ��$ E�?�� �� "�� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ ������� �� "�� �+' ������ �! #� �������'���� ��$ ����� ��)*% ����� �� � ����-�"�$ ��"� � ��"���" �)� ;��8 ��9��< � ��)� ;�8 ��9��< �� "�� ' ������� �-����� �! ����)�� ;�8 ����9�< � E�?�� ; ����9�<!� * �� ?������ ' �"��� �+" ��"� �� � ����,��$ -, ���"� �-��""���� ��� ����"� ! �� ��� �' ����"�"�#� �+'� ����" � �������

*6

�$���$ �� � "���)$�'��$��" !������ !���������+'��� � "� -�"� �)� ��$ ��)�� C� "�� �� �� ��-�"��"��� ��� ���� �! "�� ' �����$ ��"�#�!� �;�< �! -�"� ���'���)A ��$ )B ��� �-�� #�$;��� �" ��� BBB<� ���� ��, ��$���"� "��"�'�'"���� $�� "� -�"� "�� ������ �! �,"�)�� ��� � ! �� ��"�����$ �� "� "�� �,"����;��"�#�"��� �! ���'���)B ��$ ���'���)7< ��$ ���'"� )��$��"�$ �'�'"���� ;��"�#�"��� �! ���)'���)A< � � ��#��#�$ �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"����� /�"� ��"����, �� ��"�#�"����! ���'���)7 ��$ ���'���)B �� �)�)��$���$�'�'"���� ��� ����"�, ������"�$ -, 5�������$ ��)�� .� � ;5����� �" ��� �%%< ��� ���"�� C��9C�� �����$ '�"���, $�$ ��" �''�� "�-� ��#��#�$ �� �)�)��$���$ �� ���� "�,���,"��'�'"���� ;�� ���$�� �" ��� �%%%<� ��� ��$�)'������ �"������ ;��< '��,� �� ��'� "��" ��� �� "�� �,�"����� �! ' �"���� �� ���� �� �� �����"��� �! ?��G ������"����� /" ��� ����"�,-��� ��'���$ "��" ��, ������� �����" "��"������ ' ������$ �� �" ��� ��, ��$��� �'�')"���� "� ���� ���'���)()��$��"�$ ���'���)���"�#�"��� ;��� �" ��� �%%<� ����#� �� $�$��" ��� ������� �� "�� ��#�� �! ' ����'���)� � �"� $�� �$�"��� ' �$��"� ;��"�#� ���'����< ��"��� �"�$, ��"����� �� $�$ �-�� #� � $�� ������ "�� ��#�� �! ' ����'���)(�@��� ��"�#�"�$ ���'���� ����#� � #� ��", �!

��" �������� '�'"�$�� �����$��� ��1� �" ��"� �� ������"� �! "�� �,"�'���� ��$ "��������� � ���-� �! ' �"��� .������ ��$���'����"� ��#��#�$ �� 45� ��"�-�����45� �'�� ��$ �� ���"�� �" ��"� � ���� ������ ;�� ����� �" ��� BBB<� ?��'���)7 ��$)( � � �����$� �$ "� -� ' ��� ��, ��'����-��!� ����#��� �! ���� "� �"� ��� ��"� ��"�� �(��$ AB .4� ! �����"� �� ������ C���������+'��� � "� -�"� �)� ��$ ��)� � �� .�$"���)$�'��$��" ��� ���� �� "�� ����#��� �!���� ������"� "��" ' ����'���)7 ��$ )( � �����#�$ "� "��� ��"�#� !� �� !� "�� ��''� ")��� "�� #��� "��" ��#� �� ���'���� � � ��"�#�"�$$� ��� -�"� �)�)��"�#�"�$ ��$ ��)�)��"�#�"�$�'�'"�����

��"�����$ �� '��, � ��1� ��� �� �'�'"����" ���� �$ -, ���, ��������� ;��-� "��� ��$@ ����� �%%%<� ���, ��" ���, ��� $���"� ���)'��� ��"�#�"��� "� ���� "�� ������ �! �,"�)�� ��� � �� � ����" �! "�� ��"� ��"�����$ ������- ��� -������� '� ���-�� -�" "��, ������"�� �"� ������� "� ���� "�� ��)� ' �"���!����, ;4������ ��$ �� "���� �%%%<� ��� ��)� ���"�$ ' �"���� ��#��� ��"�� ��"�)�'�')"�"�� � ' �)�'�"�"�� !���"���� � � ��'�-�� �!'�,������, ��"� ��"��� ��"� ���� �"�� "� ���� ����'��+ ��"�� . �! ����) ��$ ��"� �$��� ���$ � � �����"�$ -, �,"�.���� ��$ �"�� $��"�)�� #�#�� ������� �" $�0� ��" ��#��� ;�$��� ��$?� , BBA<� ��)� ��)D� ��$ �+ � � ���)��$� �$ "� -� "�� "� �� -��")��� ��"� ���$ ���)-� � �! "�� ��)� !����, ��$ "�����" ���#��" ��"� �� �! ���������, ��$���$ �'�'"���� ;��-� ")��� ��$ @ ����� �%%%<� /� "�� ' ����" �"�$,�� $�, ��, ������� �� "�� ��#��� �! "�� ��"�)�'�'"�"�� ' �"���� ��)� ��$ ��)D� ��$ "��' �)�'�'"�"�� ' �"��� �+ ����$ -� �-�� #�$!�������� �+'��� � "� �)� � ��)�� ����#� ������� ��$���$ �� "�� ��" �������� ��������"����! ��)� ��)D� ��$ �+ $�� "� '���'�� ,��)"��� ;��"��� �" ��� �%%< � �"�� ���!� ��)"����� ������� ;I�'��� �" ��� BBA< ��#� ����"�, -��� ������"�$ "� -� ��'� "��" !� �'�'"����� ���� �� 2�$���� $� ��" �+���$�'����-�� ��#��#����" �! ��)�)!����, ' �"������ �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"������ ��� !� ���N �� �'�'"���� ���"��"�$ -,

���� " ����"������ "�+��� ��� -��� ������"�$;���! �� ��$ ��$� ��� BBB<� ����#� ��$��)"��� �! �5N $��� ��" �''�� "� -� ���$�"� ,!� �)�)��$���$ �'�'"���� ;���! �� ��$ ��$� )��� BBB<� /� "�� ' ����" �"�$, �� !���$ "��""�� �5N ����-�"� 4)�5N/ ; ����9�< "�����N9��N .����� ����-�"� �4 BA%8B ;�8����9�< ��$ "�� '7A ���N ����-�"� � �%�B% ;8 ����9�< ��$ �� �� .�$ �0��"� ��"�� "�+��)��$���$ �'�'"���� ;$�"� ��" �����<������"��� "��" ���N ��"�#�"��� '��, � ���� ��� �� �)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�')"���� �� ��)*% ������

*8

��#� �� �#��"� ��, -� �! ��'� "���� !� ���"��"��� �'�'"�"�� ���� $��"� �� ��)*% ������/���-�"��� �! ' �"��� �,�"����� -, -��$��� "� �-������ ;���"� �" ��� B(8< ��� -���������"�$ "� -� �����"��� "� "�� "�+�� �0��"� �!�)� �� ���� ����� ;M��� BA(& M��� �" ���B(7<� ����#� ����-�"��� �! ' �"��� �,�"�������� ��" �-�� #�$ �� ��)*% ����� " ��"�$ ��"��' "� %% ��9�� �)� "�+�� !� � � � ��'��"�#��! ��$���$ �'�'"���� ;K������ �" ��� BB*<� ���� � ����-�"� , �0��"� �! ��"��+�$��"� ���� ��#�"���� ? #�"���� � ��$ �������� �� "���,"�"�+�� �0��"� �! �)� ��#� -��� �'� "�$;���. � �" ��� �%%%< ��''� "��� "�� ������"���"��" �0��"� �� "����)���,��� �� �! ��'� "����;���� BA7<�� " ������" ���#�"��� �! F?��GH� ��� -���

������"�$ "� -� �� �� �, �#��" �� �)�)��$���$�'�'"���� ;K������ �" ��� BB*<� ���� �� ������ $���� ��"� � $� ��" �0��" �! �)� ��������� ���- ���� � �� ����-�"��� �! "����)���"������ ���,��� �����$��� "�� ��"�����)$ ��� '� ���-���", " ����"��� '� � ;������� �"��� BB(<� ��� ��� #� ���� '�,�����������"����� ��� ���� F?��GH� ��$ "�� �-, ��$���������� ��'����� � �� .�$ ��$ �!"�� ���)"����$ ���#�"��� �! F?��GH� ��� -��� �������"�$��"� �'�'"���� ;5���"� � ��$ @ ����� BBA<��� .�$ ���#�"���� �! F?��GH� � � .���� "���"�#�"� �,$ ��,"�� ���,���& "�� ���� ������������$� ' �"����� ��������� ��$ ��'�����?��G9���G)$�'��$��" ��$���������;�< ��#����� -��� �����$� �$ ��'����-�� !� 45�$�� �$�"��� �������"�$ ��"� �'�'"���� ;5���)"� � ��$ @ ����� BBA& K�.�#��# �" ��� �%%%&E��#�"�#�., �" ��� BB6<� /� "�� ' ����" �"�$,�� ���� "��" "�� �$$�"��� �! ����)�������" ���'��"��, -���.�$ "�� ��$��"��� �!�'�'"���� -, �)� �� ���� �� -, ��)�$�"� ����$ -, ��� ����'�� ����,��� 3�� �,"�)��" , ��$ 45� ��� ����" �'�� ����� ����)�� ���� -���.�$ "�� ! �����"�"��� �! ����������� "��" "�� �0��" ��� ��" �����, $�� "� ������-�"��� �! ?��G9���G)$�'��$��" ��$�)��������;�<� C� "�� �� � ����� ����)��

�$���$ "�� $�� �$�"��� �! ���'���)( )A ��$)B "�� ����-�"� , �0��" �! ����)���''�� � "� -� �� �� �, �#��" �� "�� "�+��)��$���$ �'�'"���� �'�" ��� �! ���'��� ��"�#�)"���� ��� ������"��� "��" �)� ��$���� ���-�����"��� �! ?��G ! �� ��" �������� ?��G

�"� �� ���� �� �� ��$ ��"�����$ �� ����''� "�$ -, "�� ' ����" 2�$����� C� "�� )�� � ������ ���������� ���� ���� "� -���#��#�$ �� "�� ��$��"��� �! �'�'"���� -, ��)��/" ��� -��� ������"�$ "��" E��G ' �#��"�

45� ! �����"�"��� �� ���, ���� ����� �� '� "-, ����-�"��� "�� ?��G9���G)$�'��$��" ��$�)��������;�< ;?���� ��$ 4�.� BA6<� �� � ����" �"�$��� ��#� ��$���"�$ "��" E��G ��������-�"� ���'���)7 ;�� , �" ��� BB(< ��$'���'��"���� ;���� ��$ ?���� �%%< ��$��� ��"��+�$��" ' �'� "��� ;�� �" �" ��� BB(<�/� "�� ' ����" �"�$, �� ���� "��" E��G �-��)����$ �)�)��$���$ �� ���� �� ��)�)��$���$�'�'"���� $�"� ����$ -, 3�� �,"���" , ��$45� ! �����"�"���� E��G ���� ' �#��"�$ "�����$����"��� �! �� ���"�� ��$ !� ��"��� �!�'�'"�"�� -�$��� �� �������$ -, 3�� ���������� ����',� C� "�� �� � E��G ����-�"�$ "������#��� �! ���� ��$ ���'���)( )A ��$ )B��''� "��� "�� #��� "��" �"� ����-�"� , �0��" ��"�+��)��$���$ �'�'"���� �� � ����" �! �"� ��"�)�+�$��" �0��"�� /" �� ��"� ��"��� "� ��"� "��"!�������� "�� �$$�"��� �! "�+�� ��$ E��G "���� ���"�� �� ��� �, ��� ����� ��� �������"���$����$ ;$�"� ��" �����< ������"��� "��""��, �� � � ��"�$ �� �� �� �, �'�'"�"�� �"����� ������ � ��" �� �� �� �, �'�'"�"�� �"��� ���' �#�����, -��� �'� "�$ �!"� �+'��� � "� ����������" �"���� �! ��������� ���� �� "�� ��"� ��"���� �D ;�� �"����" �$�" �" ��� BB(<�/�"� ��"����, "�� " �������"��� �! �'�'"����)��$����� !��"� ;�/C< ! �� ��"�����$ �� "�"�� ������ ��$���� �� ��)����� 45� ! �����"�)"��� ��$ ���"��� �� ���"�� ���$����"��� ;�"���/< ;����� �" ��� �%%%<� � '����-�� ��� �! �/C ���)�)��$���$ ��$ ��)�)��$���$ �'�'"���� �� ������ $���� ��"� ����" 2�$���� ������� "��"' �" ��"���" �! E��G �- ���"�$ "�� �$#����$

**

������ ���$����"��� �� �� � ��$)��-����� ��$45� ��$$� ��� -�" ��" "�� !� ��"��� �! ����)�������� )�����" 45� ! �����"� �� �IC)�)��$���$ �'�'"���� �� ��'�"��,"�� ;/��,�")���)���� �" ��� �%%<�/� ���������� -�"��)� ��$ ��)� ��$��� ����

$��"� �� ��)*% ����� �����, "� ���� �'�')"���� ��"� �)� -���� �������" �� � '�"��""��� ��)�� ��� ����"� ������" "��" �)� ��$��)� -�"� " ���� � �������)$�'��$��" ������;� �������< "��" ��"�#�"�� ��#� �� ���'���� ����"��� �� � ���'��"� �'�'"�"�� ' ������

�����$�� %���

��� 5� ������ ����� �� ?������ �����''� "�$ "��� �"�$,� ��� "�������� �����"�����! ���� �.� �� �� #� , ���� �'' ����"�$� ������ "���. 4 � � �. 4,-��� !� #����-��������"� �� "�� ������ �'"�

"���������

�$��� �� ?� , �� ��� ��)� ' �"��� !����,J � -�"� � �! ������ #�#��� �������� BBA&�AJ7��:*�

��-� ��L�� �� �������.� � /����"� � 5�.�,��� � 4��N� �)� "�+��)��$���$ ���"� �.�� ������� �� ���"� )$� �#�$�,'�" ����"�� � 59/��)�" �"�� ���"�� ���"�'�"���� BBB&6J77(:6��

?���� �� 4�.� �?� I������ "����$ ��"�#�"��� �! � �������)$�'��$��" ��$��������� �� "�,���,"� ������ ���$� "� ����$��"�� � /������� BA6&7�J7A:6��

4������ � �� "���� �?� ��"�����$ �� �� "�� ���" �� ���" ��'���" �! �'�'"����� � ��$� ?��� ���� �%%%&%J7*B:((�

�� ����� �? �� "��� �� N��!���� ��� ������������'����J �" ��"� � ��"�#�"��� ��-�" �"�� ��$ !���"����$� ��� �'�'"����� ���� ��# ������� BBB&*AJ7A7:6�6�

I�'��� /� I ��� � ��#��� �5 �" ��� ������"�$ "� ��"��� �! �D "� ��"�����$ ��� � ?��� ���� BBA&67J�%(:8�

I� ��,�� � I��� � � $��" � ������ C 4� �,�.������ E���� ���� �,��� ���"�$ $�0� ����� �� �����'"�-���", �! ��)*%����� "� �'�'"���� ��$���$ -, #� ���� ��"�"��� ����"��?���� ���� BB7&87J7A*:B��

I �#� �C� ��� ��,���� � ���"�������� 5�" � �$ ��'� BB7&%J6�B:6A�

I �#� �C� 5��)��� ��,���� " ���"������� �� " �� � �� ?���@ � 5�" � �$� BB*& *BJ:(%�

����� �� ���� � ������� �N ��$� ���$ � ��-� � I4,-��� �� ?��� $��"� #�� ��"� �"���� �! ����"� ��"� 45�

�$# ����� ?��� ���� �$#����� �� �������� ��$ ?��� �����,� BB(& �%J68:A��

���� �? ?���� II� 4�0� ��"��"��� �! "�� ����)-��$������������ !� ��������� ��� ��"�#�"��� ��$ ���� �������-�"��� �! ����� '�����"�� ��.����� '���'��"���� � �"������� �%%&%J76:68�

/�� � � ������"� � ��.�1��� � @.��� � � K������ 5M��� K� �'�'"�"�� ������� $����� �� ���� �!"� �)� "�+��)��$���$ ���"� "�+������� 5�"� �� ��+���� BB(&8J6:8�

/��,�")������� �� ��I������� �� ��������� � ���$)�" �� � ���� 4� ?��'���)$�'��$��" ��$ )��$�'��$��"���������� �� �'�'"���� ��$���$ -, �,$ �L������ ��$��"����� ��"�-���"�� �! ���+�' �$� �� ��)*% ������ ?��� ��� /�"� ��"� �%%%&�AJ8:*7�

/��,�")������� �� ?���� I� ?��� N� � ��'' ����� �! "�� ��� �! E��G �� �IC)�)��$���$ �'�'"���� �� ' ��� ,��'�"��,"��� ?��� ��� ��+����� �%%&8 J7A:(�

/���� E 5����� � @"� � M�$� � K�������� � ��.�"� 5��" ��"� �:!���"��� ���"������' �! �)� "�+�� ��$ �"� ��"�)-���"�� �� ��$����� "�,��� �'�'"���� �� ���� �� ����� ����� ��"������ ������� BBA�&*�J6B�:(�

/���� E 5����� � K�������� � K������� N ��.�"� 5� �)�"�+�� ��$���� "�,��� �'�'"���� �� ���� �� ����� ��+���� �''���� ������ BBA-&6AJ�%8:6�

��0� �E� ��#� �����"�� ���$�"���� ���$���#� "� *������"�+�� !� ��"��� ������� �� ���� ��"- ��.� �� ������� ��$����>�" ��� ?������ BA7&(JA(:B7�

N�-�,� � C��� P,�� � �����"� �� ��� ",'� �! ",'� � ��$ " ���"������� �� "�� ��"�������� �� ���� ��"� �� �� ����$����" � �%%%&8%J88:*%�

��� � � ���� � ��������� ���" ��� �+' ������ �! ?K�� ��! ����, �����"�$ ��$ ' ���!� �"��� ���"� �� �! �'�"������ �"���� ������ �+' ���� ���� BB*&��J*�(:6B�

������"� � ���$-� ��" �� ��� ���� ���� �! ��)� "�+�� ��$�"�� " ����"������� �� 5� ������ �� ����� �,��'�"����)���� BBB&6(J8(:*8�

�� I �������.� � M�"��.� N 5�.�,��� � 4�� N� �)� "�+��)��$���$ �'�'"���� �� ��"��"���� � ,'" �'�"������ ����� �! ������+' ��+���� ��"���� BB(&6BJ66(:8%�

�� �"����" �$�" M���� � ��-� � I ������� �N �������� �'�'"���� �� ��)*% ����� ��$���$ -, 7)���� �)6);$�)���� ���"�,�<)8)�,$ �+,)�F8�H)!� ����� ;�D<� ?��� ���/�"� ��"� BB(&%*JAB:%(�

�� ���$�� �� 5����� �K��������� ��.�"� 5���,���,"��'�'"���� -, �)� "�+�� �� ���� �� ���� �� ��$�'��$��" �! C��9C�� �����$ �,�"��� ����� ��"������ ������� �%%%&*6J�%:7�

5����� � ���� �� �������� � K�������� � ��.�"� 5��'�'"���� ��$��"��� -, �)� "�+��J ��"�#�"��� �! ���'���)B���'���)7 ��$ 4CC)6%9?�4 "� ���� �,"������ ������ �!�,"��� ��� � �� ��)*% ������ ����� ��"������ ��������%%&*8J(6:(�

5���"� K ��$�.� � N� ��L�� ����" �! ��"�#�"��� �! �5N ��$'7A !� ��#� �����"�� �" ���)��$���$ � ,"� ��$ $�0� ��"��)"��� ��$ �'�'"���� ��$ �! ����-�"��� �! ��N !� �'�'"����� ���$� BBB&B6JA87:*7�

5���"� � � @ ����� �� ��� ��� �! ������� �� �'�'"����� ?���?������� BBA&�7J(7)A%�

*(

@�"� � M��� K� ��"�-����� �! " ����"������ �,��"�+���� � ������ ;��.,�<� B((&A�J8B:A�

���� �I� �0��" �! �)� �,��"�+�� �� �" ��#� ��"�����$ ������" �� " ���'� " �,�"��� ��+����� BA7&�J*(8:A%�

�� �" �@ ����� $ �� �����" � ��$1� ? C�#�� � ���� �?�E��� ��$ 45� ! �����"�"��� �� .� �"����,"� �'�'"����J �"�����-�"� , �0��" �� M> � �$��"�$ ������ � ���"��������"�-��� � BB(&7(J%:*�

��"��� 5 ����)���'� ? N�"�$� � ���$� � ���$ �?���� �"�-���)"� ��"��� $ ��� ��$��� ��)� '���'�� ,��"�����$ �������"��� ��"� ���� 5��'������ �%%&7J(%:B�

�� , 4N ��,"� �� �"�����.� �� �" ��� E��� �� � '�"��"����-�"� �! "�� �'�'"�"�� ' �"���� ���'���)7� � ��#��"� ��" !� ���� �� "�� ����-�"��� �! �'�'"����� � ��� ?����BB(&�(�JA87%)7�

��""� ���� �� C��� ��� "�+�� ���� �� �� ���$��� � �� ("�I� ��� �� .���' ���$-��!� ����� >��.�� �$� ��$� )��!"� BB8&8�

��� �> �� ��� � ?��" �)@- ���� � �" ��� ?��'���� ��$�)'������ �"������ �" ��� "� "�� ���� $��"� ' �� ��� ������)��� �! ���'��� ��"�#�"���� � ��� ?���� �%%&�(*J77A*B:(6�

��-� "��� �4 @ ����� �� �������� ���������� �! �'�'"������$���$ -, �,"�"�+�� ���������� ? �" ��# ��+����� �%%%&7%J*%B:�(�

��-� "��� �4 @ ����� � E��#�"�#�., � ��#���J ������ �#��"� �� �'�'"����� � �" ��" ���� �%%%&�BJ76*:8A�

���! �� >/ ��$� ��� �� � ����"������ �,��"�+��� " ���� � �-�"�+�� �" ��� ��'���� "��" ��"�#�"�� �)��� 5)"� �����.����� ��$ '7A ��"����)��"�#�"�$ ' �"��� .����� ��$ ��)$���� �'�'"����� � ��� ?���� BBB& �(6J7BA8:B��

�������.� � �� I N��"�'�""�����.�� � M�"��.� N 5�.�,�)�� � 4�� N� �)� "�+��)��$���$ �'�'"���� �� �,�'���$� ���� �! ����� �+' ��+���� ��"���� BB(&6BJ7A(:B��

�������.� � ����.� � 5������ 5 �" ��� �)� "�+��)��$���$�'�'"���� �� ����"�'���"�� "������ �! ����� ��+���� ��"����BBA&�*J*(6:A�

���. � C ���$� � � I�� ������� � I����)N����� � �� ���� � ����-�"� , �0��"� �! ��"��+�$��"� �� �,"�"�+���", �! �)�"�+��� ��+������,� �%%%&6*J(:*�

���"� N� ?����� � ?��$��0� �� /���-�"��� �" "�� ���"��"�����#�� �! ��.� ,�"�� ' �"��� �,�"����� -, �)� "�+��� C� ���""� B(8&8%JA:��

��� D� ���C� ���� � E����� � ���! I ��� 4�?���� I�� 4��"���" ���'��� �����$�� � � ���"��"�$ �� ���'"� )��$��"�$ ��$ ��������)��$���$ �'�'"���� � � ���?���� BBB&�(6J8%87:*%�

����� �� 4����� � ��#����� � �" ��� ��� $��"���" '�"���,����$��� "� ������ �'�'"����� � �+' ��$� �%%%&B�J8(:A%�

���-�� � �"������� � I� $�� �� ����" �'�� �"�� " ���!� �!' �"���� ! �� '��,�� ,����$� ���� "� ��" ���������� ����"�J' ���$� � ��$ ���� �''����"����� � �� 5�"� ���$ ��� M���B(B&(*J678%:6�

M���K� � ���"������� �� !��$� /�J N ��� � �$� �,��"�+���� ��!��$� 5�� K� .J ���$���� � ���& BA(J�7:6(�

M��� K� ��+������, �! " ����"������ �,��"�+���� /�/ �"��� �!�������� ��� �������,� BAA&�J�:6�

M��� K 5�.�1��� � ��.�� N /���� N ��"� 5� ?��'� �"�#�"�+������, �! " ����"��� �,��"�+���J ����-�"��� �! ' �"����,�"����� �� ������ ������ � ������ ;��.,�<� B(7&(6J�A8:B*�

M��� K M���� � N 5���� � �" ��� /�$��"��� �! �'�'"���� -,�)� "�+�� ��$ �"�� ��"� �� "�+��� �� ��)*% ����� ' ��,�)��"�� ���.���� ������ 5�"� �� ��+���� BB8&7J�B:7(�

������� N ����� �� ��$�� � >� ?� "�'���� I ����� 4����"�����$ ��)��$��"�$ ���� ��1� ,� �,�'����� �#� #����C��$�� �''� ��+����� BB(&7AJ�7:7(�

��@� �����"�$ �,��"�+���& ��� �"�+��� " ����"���������� ��"J ��� ��� ��$ ���� ����� ��#� �� ����"� ? �"� ���BB%&%8JB�:7�

���� � ����� �� ������� �N �" ��� ������)�" ��$ - ��.����� �,��� � ��" ��$ �'�'"���� �� ��)*% ��$ ��?�N ������+'���$ "� �)$�- ���)7)���� �' �'���� ?��� ��� ��+�����BBA&6J�*(:A��

K���� ���� �� ��"�-����� ��$ '�� ����.���"��� �! �)�"�+�� ��$ ���"�$ " ����"�������� 4 �� ��"�- ��#� BB7&�8J�A:7�7�

K�.�#��# �I ���� I �"���� � �" ��� � ��� �! "�� ?��G9���G)$�'��$��" ��$��������� �� �'�'"���� ��$ �"� ����-�)"��� -, '��,;�4�) �-���< '��,�� ���� � ��� ?���� �%%%&�(8J�7%�:A�

K������ 5 ��.����� � �.�-� � �" ��� � ������" ���#�"��� �!��" �������� ������� ��� ��#��� �� �� �� �, �#��" �� �)�"�+��)��$���$ �'�'"���� �� ����� ' ��,���"�� ���� ������)*%� 5�"� �� ��+���� BB*&6J�76:6�

E��#�"�#�., ��$� 4 5���"� � � @ ����� �� ���� �!��������� �� �'�'"����� /�" � �� ���� �, /������� BB6&%8J777:A�

$����� �� ����-�������# 4 � �P � �� ����� 4�#����� �!��#� �����"�� ��$����� 5� ������ /��"�"�"� �! ��-�������"� ��@� �+ 66%6 5,$���� 5)%6%7 @��� 5� ��,��)����J1� �������Q!�����

*A

Reproduced with permission of the copyright owner. Further reproduction prohibited without permission.