Laboratorio de Bioquímica 2015

Ponderación

Cuaderno

Procedimiento............................................2 punto

Propiedades Físicas..................................4 “

Reacciones.................................................4

TOTAL......................................................10 Puntos

Prelaboratorio 40 puntos

Reporte

Sumario..........................................................10 puntos

Marco Teórico ……………………………..10 puntos

Observaciones y Resultados...........................5 puntos

Discusión de Resultados................................20 puntos

Conclusiones....................................................5 puntos

TOTAL...........................................................50 Puntos

El día de Laboratorio entregar Prelaboratorio y Marco Teórico.

PRACTICA NO. 1

Difusión, Osmosis y Dialisis

Objetivo: Demostración de la Difusión ,Osmosis y Diálisis, 3 fenónemos que suceden

las células vivientes.

Prelaboratorio

1.Defina: Difusión.

2.Defina; Osmosis

3. Defina: Diálisis

4.Indique las diferencias en permeabilidad de las membranas plasmáticas.

5.Investigue sobre la relación de la presión osmótica y el hecho de que la savia llegue

hasta las partes mas altas de las plantas.

6.Investigue sobre si hay diferencia en la velocidad de difusión del ion plata y el ion

plomo.

7. Considera que van a variar las masas de los cubos de papa?. Explique.

8.En la diálisis, cuales materiales podrán difundirse y porque?. Explique.

Reactivos y Materiales

2 cajas de Petri con agar, por grupo 8 tubitos de ensayo por pareja

AgNO3 1M y 0.1 M en gotero regla

Pb(NO3)2 1 M y 0.1 M en gotero varilla de vidrio de 20 cm x 12 mm

Azul de Metileno Papel Celofán blanco

KMnO4 0.01M 1 beaker de 250 ml

Clara de Huevo y 1 papa traída por el alumno Tabla de cortar y cuchillo

NaCl 10% y 1M1 Beaker de 150 ml 3 por pareja)

Almidón al 1% 1 probeta de 100 ml

Fe(NO3)3 1M 4 Balanzas

Solución de Lugol Tubos de Diálisis ( 2 por pareja)

KSCN 0.1 M

Procedimiento

A. Difusiòn Se va a comparar la rapidez de difusión de unas sustancias iónica y otras

moleculares a través de un gel de Agar. Dos sustancias son coloreadas y se puede visualizar bien su movimiento, las otras son incoloras, sin embargo, cada una de ellas

forma un precipitado coloreado, lo que permite observar su difusión.

-1. Necesitará 2 cajas de Petri con Agar y usando un tubo de 1 cm de diámetro, haga

4 orificios, usando la boca de un tubo de ensayo pequeño

2. Tenga cuidado de no dañar las orillas de los hoyos y con una espátula levante el agar,

deshéchelo. Haga una incisión en la caja en uno de los orificios hechos en la caja 1.

Esto le servirá como referencia.

3. Ponga 3 gotas de AgNO3 1M en el primer hoyo, donde está la marca de referencia.

4. En el segundo hoyo, hacia la derecha del primero, coloque 3 gotas de AgNO3 0.1M.

5. En el tercero ponga 3 gotas de Pb(NO3)2 1M y

6. en el cuarto, 3 gotas de Pb(NO3)2 0.1 M.

7. En uno de los agujeros de la segunda caja, ponga 3 gotas de Azul de Metileno

8. En el segundo ponga 3 gotas de KMnO4 0.01M.

9. Tape las cajas y déjelas reposar media hora.

10. Mida el diámetro de cada zona de difusión en milímetros. Reporte los resultados en

un cuadro.

B. Osmosis

Se relacionarán las diferencias en presión osmótica con los cambios en la composición

protoplasmática.

Mediciòn de Presiòn Osmòtica

11. Obtenga una varilla de vidrio de mas ò menos 20 cm de largo y 12 cm de diámetro.

Cubra uno de los extremos con membrana plasmática y amárrelo muy apretado con un

Hule.

-12. Llene el tubo con clara de huevo hasta una altura de 5 cm.

13. Coloque el tubo en un beaker de 250 cm y llénelo con agua destilada hasta que el

nivel del agua sea el mismo que el nivel de la clara de huevo. Déjelo en reposo

60 minutos. Al final del tiempo levante el tubo y mida el nivel del líquido dentro.

Osmosis en Tejidos Vivos

14. Corte 2 cubos de papa de 2 cm por lado. Péselos uno por uno.

15. Coloque un cubo en un beaker de 150 ml conteniendo 50 ml de agua destilada.

Déjelo reposar reposar 30 minutos. Sáquelo, séquelo y péselo nuevamente.

16. Coloque el otro cubo en un beaker que contenga 50 ml de NaCl al 10%. Dèjelo

reposar tambièn 30 minutos. Luego sáquelo, séquelo y péselo nuevamente.

C. Diálisis

Dos diferentes mezclas serán colocadas dentro de membranas y serán dializadas contra

Agua pura.

Una de las mezclas se compone de Almidón y ion Fe+3.

La otra contiene Almidón y ion Cloruro

Un test específico para almidón y para cada uno de los iones permite determinar si se han difundido a través de la membrana

El almidón forma un complejo azul con el yoduro; el cloruro produce un precipitado blanco con el ion plata y la combinación de Fe+3 y SCN- da un color naranja rojizo.

17. Obtenga 2 pedazos de tubo de diálisis de 8 cm de largo. Remójelos en agua destila-

da hasta que estén suaves y flexibles. Luego haga un pequeño saco con cada uno,

amarrando uno de los extremos con hilo.

18. En un tubo de ensayo mezcle 9 ml de solución de Almidón y 10 gotas de Fe(NO3)3

1 M. Vierta 8 ml de la mezcla en uno de los sacos y el resto, divídalos en 2

porciones iguales.

A una porción agréguele 2 gotas de I2-KI y a la otra 2 gotas de solución de KSCN.

Anote los resultados.

19. De la misma manera llene el otro saco con 8 ml de la solución de almidón y 10

gotas de NaCl 10%, al resto hágale la prueba del Almidón con Lugol a una parte y a

la otra parte póngale 2 gotas de AgNO3. Anote los resultados

20. Lave por fuera los 2 sacos con agua del chorro y luego con agua destilada para

remover cualquier resto de soluciòn que pudiera haber en el exterior.

21. Ponga cada saco en un beaker de 150 ml conteniendo 50 ml de agua destilada.

22. Después de 5 minutos, tome 2 muestras del agua de cada uno de los beakers, y

hágales las 4 pruebas.

23. Espere 10 minutos mas y repita las pruebas.

24. Tome otras muestras a los 20 minutos ( a partir del inicio) y repita las pruebas.

25. Saque las bolsas de los beakers, perfórelas, vacíelas y deséchelas.

26. Reporte sus resultados en forma de cuadros.

Práctica No. 2

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS Y SU CAPACIDAD BUFFER

Objetivo:

Aprender a preparar soluciones buffers por 2 métodos, usando los conocimientos de Química Analítica

Prelaboratorio

1.Indique la ecuación de Henderson-Hasselbach

2.Componenetes de una soluciòn amortiguadora

3. Explique como va a determinar la capacidad buffer.

4. Explique como Ud va a saber que el buffer ha perdido su capacidad

amortiguadora.

5. Como espera que sea el pH de los 7 diferentes tubos?.

6. Explique `porque el tubo 4 debe de titularse con HCl y con NaOH.

7. Indique el sistema buffer mas importante del organismo y como es su

funcionamiento.

Reactivos y Materiales:

Fosfato monoàcido de Potasio ò Sodio 8 balones de aforados de 100 ml

Fosfato diácido de Potasio ò Sodio Pipetas serológicas de 1 y 10 ml

HCl 1.0 y 2 N y conc. Probetas de 50 ml

NaOH 1.0 M y 6N y sólido 4 beakers de 30 ml

Buffer de Fosfatos pH 6.86 3 pHmetros

Buffer de Acetato pH 4.1 0.2 M 8 beakers de 50 ml

Acido Cìtrico 0.1 M Buretas de 25 ml y Pinzas

Citrato de Sodio 0.1 M

Buffers de pH 4 y 7

La capacidad amortiguadora ó de buffer, mide la capacidad de una mezcla bufferada de mantener el pH después de la adición de un ácido ó una base fuerte y se define como: “El número de moles/L de un monoácido ó base fuerte que se necesitan para el cambio de una unidad de pH”.

B = CA/ pH

En la región buffer, la fuerza es directamente proporcional a la concentración.

Este punto es el que debiera comprobarse en este experimento.

Procedimiento

1. A partir de las soluciones de Acido Acético y Acetato de Sodio 0.50 M, preparar las siguientes soluciones 0.050M

Buffer No. 1 2 3 4 5 6 7 8

Acido Cìtrico (ml ) 0.5 1.0 2.0 4.0 5.0 6.0 8.0 9.5

Citrato de Sodio (ml) 9.5 9.0 8.0 6.0 5.0 4.0 2.0 0.5

Medir las cantidades con pipetas y aforar a 100 ml. Mezclar bién.

CALIBRACIÓN DEL pH meter

2. Tenga a la mano 2 beakers pequeños, uno con buffer pH 6.86 y otro con buffer pH 4.1 y una piseta con agua destilada

3. Lave con la piseta el electrodo, no debe secarlo con Kimwipes porque se generan corrientes electrostáticas que dan lugar a lecturas erroneas, solo elimine la gota de lìquido de la punta, tocando ligeramente con el Kimwipies , introdúzcalo en el buffer de pH 6.86, si no diera la lectura correcta, avíselo para poder calibrarlo ó cambiarlo, lave con la piseta y seque como se le indicó e introdúzcalo en el otro buffer. Hágalo varias veces hasta asegurarse que está dando las lecturas correctas.

4. Coloque 25 ml de la solución buffer No. 1 en un beaker y un agitador magnético

agite unos segundos, pare y determine el pH.

5. Saque el pHmeter, agregue una gota de HCl 1.0 M, agite , pare y determine

nuevamente el pH.

6. Repita el procedimiento anterior 4 veces más. Tome en cuenta el delta pH al agregar cada gota.

7. Haga lo mismo con las soluciones buffer 2, 3 y 4..

8. La solución buffer no. 5 tiene que ser titulada 2 veces, una con HCl y otra con NaOH 1.0 M.

9. Las soluciones 6-8 deberán ser tituladas con NaOH 1.0. M.

10. Determine la capacidad buffer del agua, usando 25 ml de agua y gota de HCl y 25 ml de agua más 1 gota de NaOH.

Cálculos

11. . Determine el delta pH/gota para las 7 soluciones buffer y colóquelas en una

gráfica como la que a continuación se presenta.

12. Cálculo de la capacidad Buffer.

Es el inverso de la pendiente y se calcula como sigue:

Para el buffer No. 1:

pH = 3.40 y pH/gota =0.17 el inverso es 5.9 gotas (HCl) para cambiar

una unidad de pH ( para 25.0 ml de solución)

El volumen de una gota se calculó en 0.034 ml, por lo tanto:

5.9 gotas x 0.034 ml/gota x 1000 ml/L x 0.0080 mol/L

25.0 ml

para cambiar una unidad de pH.

13. Tratar las otras soluciones buffer de la misma forma y hacer una gráfica de pH

Versus capacidad buffer.

A. Preparación de la solución Amortiguadora según la ecuación de

Henderson-Hasselbach

14. Prepare 100 ml de una solución amortiguadora de Fosfatos pH 6.5- 7.5 0.2 M

Al comenzar el laboratorio se le indicará cual solución le toca.

Calcule el peso de acido débil y base conjugada necesario para obtener la

concentración y pH. Mida y pese los 2 reactivos con cuidado y exactitud.

15. Las sales disuélvalas en un beaker y después transfiéralas cuantitativamente a un balón aforado de 100 ml lave el beaker y afore con agua a 100 ml. Agite y confirme el pH.

B. Preparación de una solución amortiguadora usando el segundo método.

16. Calcule la cantidad de Acido débil necesaria para hacer 100 ml de una solución 0.2 M Pésela y disuélvala en 60 ml de agua en un beaker de 100 ml

17. Calcule el peso necesario para hacer una solución de NaOH 6 N .

18. Proceda a titular con NaOH de la forma siguiente :

Introduzca el pH metro dentro del beaker y tome el pH. Sáquelo y séquelo.

Para principiar, agregue 1 ml de NaOH 6N, agite y tome nuevamente el pH.

Continúe en esa forma hasta estar cerca del pH requerido, en ese punto, agregue

menos cantidad de NaOH..

19. Si por casualidad se le pasa del pH requerido, proceda a agregar HCl. 2N

20. Transfiera la solución a un balón aforado de 100 ml y complete con agua destilada,

Mezcle bién y confirme el pH.

Práctica No.3

Reacciones de los Aminoácidos y Propiedades quìmicas de las Proteinas

Objetivo: Conocer las pruebas generales y específicas para identificar aminoácidos y

proteinas

Prelaboratorio

1. Explicar la base de la Reacción de laNinhidrina

2. Explicar la base de la reaccion de Biuret.

3..Explicar la base organica de la reacción Xantoproteica y la razón del aumento de color cuando agrega NaOH.

4. Explique la base organica de la reacción con el HNO2 y que gas se produce.

5. Explique la base de la reaccion de Sakaguchi

6 .Indique 3 formas diferentes de hidrolizar una proteina con sus pros y contras.

7. Indique el tipo de hidrólisis a usaar.

8.Explique como se puede determinar si un aminoácido es L ‘o D `

9.. Indique la clase de isomeros que usamos los humanos y los que usan las bacterias.

10. Nombre las enzimas que se van a usar.

REACTIVOS Y MATERIALES

-Albúmina al 2%, Acetato de Plomo II 0.1 M 30 Tubos de ensayo por pareja

-Caseína al 2%, NaNO2 20% 1 Gradilla

-Gelatina al 2%, Ninhidrina al 10% Estufa

-Peptona al 2%, Acido Acético al 10% Beakers de 250 ml (2)

-Glicina al 2%,Fenilalanina 2% Baño de Maria

-Triptòfano 2%, Metionina 2%

- Fenilalanina 2%, Tirosina

- Cistina ò Cisteìna

-HNO3 conc.,

-Alfa Naftol al 5% en Etanol

-H2SO4 conc.

-Acido Tricloroacético al 10%

- HCl conc.

-NaOH 6N y O.1 N y 40 %

- Pepsina 0.5%

- Pancreatina 0.5%

-Reactivo de Biuret

Procedimiento

A. Reacciones de Color:

1. Reaccion de Sakaguchi

1.1. Ponga en tubos de ensayo 20 gotas de Albúmina, Caseìna, Peptona, Glicina, Tirosina Metionina y Arginina. , agregue 10 gotas de NaOH y 10 gotas de alfa-Naftol. Enfrie en hielo unos 2-3 minutos y después agregue unas gotas de NaOBr ‘o agua de Bromo. Agite unos segundos y observe. Un color rojo se considera positivo

2. Reacción Ninhidrina

2.2. Ponga en tubos de ensayo 20 gotas de las soluciones anteriores.

Agregue 5 gotas de Ninhidrina y caliente a ebullición durante 3 minutos. Enfrie y

Anote elcolor.

3. Reacción con HNO2

3.1. A 20 gotas de las soluciones anteriores agregue 10 gotas de NaNO2 y 5 gotas de

Acido Acètico al 10%, agite y observe si desprende algún gas.

4. Reacción de Biuret

4.1. En tubos de ensayo, colocar 0.5 ml de las soluciones proteicas y de los amino-

acidos siguientes: Glicina, triptòfano, Fenilalanina, Tirosina y Metionina

4.2. Agregar 2.0 ml del reactivo de Biuret. Agitar y dejar en reposo de 15-30 min.

4.3. Observar los cambios de color. Se considera la prueba positivo si hay cambio de

color en el rango de rojo a violeta. Comparar con el color original del reactivo.

5. Reacción Xantoproteica:

5.1. Colocar en otros tubos de ensayo, 2 ml de las soluciones anteriores.

5.2. Agregar 2 ml de HNO3 conc.

-5.3. Calentar a ebullición muy lentamente ó hasta que se disuelva el precipitado que

Se formó al agregar el ácido.

5.4. Enfriar y agregar NaOH 6n hasta que el color cambie de amarillo a anaranjado,

lo que se considera una prueba positiva.

6. Reacción de Molish

6.1. A 2ml de las soluciones proteicas y aminoàcidos, agregar 5 gotas de alfa Naftol

al 5% en Etanol y cuidadosamente y por las paredes, agregar H2SO4 concentrado

para formar 2 capas.

6.2. Se considera una prueba positiva, si aparece en la interfase un anillo de color rojo-

violeta.

7. Test del Sulfuro de Plomo

Preparar el reactivo mezclando 5 partes de NaOH 0.1 M con 2 partes de Acetato de

Plomo 0,1 M, hervir hasta que el precipitado de Pb(OH)2 se disuelva y se forme el

Plumbato de Sodio.

7.1. A 20 gotas de las soluciones proteicas y de los aminoácidos: Metionina, Cistina ò

Cisteìna y Tirosina, agregar 10 gotas de NaOH al 40 %.

7.2. Hervir en baño de Maria durante 2 minutos. Enfriar, agregar 10 gotas de Plumbato

De Sodio y agitar.

7.3. Un color café ó un precipitado café se considera una prueba positiva.

B. Hidrólisis de Proteinas

8. Prepare 7 tubos de ensayo con lo siguiente:

Tubo1: 3 ml de Albúmina + 3 ml de Pepsina

Tubo 2 3 ml de Albúmina + 3 ml de Pancreatina-Pepsina

Tubo 3 3 ml de Albúmina + 3 ml de Pancreatina + 2 gotas de HCl

Tubo 4 3 ml de Albúmina + 3 ml de Pepsina + 2 gotas de HCl

Tubo 5 3 ml de Albúmina

Tubo 6 3 ml de Pepsina

Tubo7 3 ml de Pancreatina

9. . Ponerlos en baño de Maria a 40ºC durante 45 minutos.

10. Sacarlos, enfriarlos a temperatura ambiente y agregarles 10 gotas del reactivo de

Biuret. Agite y deje reposar por 10 minutos.

11. Evalúe los resultados con los siguiente:

a) Color Azul( el del reactivo)…………….. No hidrólisis

b) Color Rosado…………………….Presencia de polipéptidos

c) Color violeta……………………..Presencia de Aminoacidos

.

C.Reacciones de Precipitación:

12. . Precipitación por Äcidos Débiles:

12.1. Poner 5 ml de las soluciones proteicas y Metionina en tubos de ensayo.

12.2. Agregar 2 ml de Äcido Tricloroacético al 10%

12.3. Observar si hay ó nó precipitado.

13. Precipitación por Ácidos Minerales Fuertes:

13.1. Colocar 3 ml de las soluciones proteicas y del aminoácido en tubos de ensayo.

13.2. Agregar HNO3 por las paredes para formar dos capas.

13.3. Observar si hay formación de precipitado en la interfase.

13.4. Repetir la prueba usando HCl concentrado.

14. . Precipitación por Calor

14.1. Colocar 3 ml de las soluciones proteicas en tubos de ensayo y colocarlas en baño

Maria hirviendo durante 5 minutos.

14.2. Observar si hay precipitado.

Práctica No. 4

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Desalinizaciòn de una Proteina

Objetivo: Conocer una de las mejores y útiles técnicas para la separación de proteínas

y otras macromoléculas, en base a las diferencias de tamaño, llamada también : Filtración en Gel ó Cromatografía de Tamiz Molecular. En esta técnica, la mezcla de proteínas disueltas en un buffer adecuado se dejan fluir por gravedad a lo largo de una columna empaquetada con un material formado de partículas hidratadas de geles muy especiales. Estos geles varían en su composición y porosidad para lograr que aún moléculas cuyo tamaño es relativamente parecido, puedan ser separadas mediante la adecuada selección del gel.

Prelaboratorio

1.En que se basa este tipo de Cromatografía?. Explique

2.Que significa que el gel a usar sea G-25?. Explique

3. Que significa: Daltons?

4. Para substancias de que número de Daltons se usa el Sephadex G-25?

5. Cual de las 2 substancias và a salir primero y porqué.? Explique

6. Como lo vá a comprobar?

7. Como và a comprobar que saliò la otra substancia.? Explique

8.Escriba la reacción del AgNO3 con la otra substancia.

Reactivos y materiales:

- Sephadex G-25 Beaker de 50 ml (2)

- Gelatina ( 50 mg/ 0.5 ml de agua) Bureta con punta desmontable de 25 ml

-Reactivo de Biuret Pinza para bureta

- NaCl 50 mg/0.5 ml de agua Pipetas Pasteur (2)

-Buffer de ¿’? Tubos de ensayo pequeños (30)

- Gradillas

Espectrofotómetro con tubos para leer

Procedimiento:

1. Suspender 3 g de Sephadex G-25 en 50 ml de buffer y dejarlo hinchar durante

3 horas. Durante ese tiempo, agitar la solución y remover las partículas pequeñas

flotantes por decantación. Evitar la agitación excesiva para evitar la fragmenta-

ción de las partículas

2. Preparar una columna de vidrio de 11 mm de diámetro, tapada en el extremo inferior con un pedazo de algodón. Agregarle buffer hasta una altura aproximada de 5 cm. Colocar la columna en posición vertical y verter en ella la suspensión del gel, dejando sedimentar completamente las partículas por acción de la gravedad,

manteniendo al mismo tiempo un flujo lento a través de la columna, hasta que la altura del gel llegue a 30 cm.

3. Abrir la llave y dejar correr el buffer hasta que penetre toda en el gel. NO DEJAR QUE SE SEQUE LA COLUMNA.

4. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, aplique 2 ml de la soluciòn que contiene gelatina (Colàgeno) y NaCl sobre la superficie de del gel. Abrir la llave para que la muestra penetre en el gel y al mismo comenzar a recolectar las fracciones.

5. Despuès de que la muestra haya penetrado toda en el gel, lavar el interior de la columna con una pequeña cantidad de agua destilada y dejar que penetre también en el gel.

6. Agregar agua destilada al gel y fluir la columna con esta agua hasta recolectar 15 fracciones de 2 ml cada una. Numerar las fracciones recolectadas.

7. Preparar 15 tubos de ensayo y colocar en cada uno 1.0 ml de cada fracciòn. Agregar a cada una de los tubos 3 ml del reactivo de Biuret.

Agitar los tubos y dejarlos en reposo durante 10 minutos. Leer la absorvancia de

cada uno a 540nm, utilizando como blanco: 1.0 ml de agua destilada + 3.0 ml

de reactivo de Biuret.

8. Agregue 3 gotasa de AgNO3 al 1% a cada uno de los tubos que tienen el resto de las fracciones y observe en cual se produce precipitado, estimando su cantidad por medio de cruces.

9. Elabore una gràfica para representar la forma como fluyeron como eluyeron las 2 substancias, colocando en el eje de las abscisas los nùmeros de las fracciones y en el eje de las ordenadas , la absorvancia a 540 y el nùmero de cruces.

PRÁCTICA NO. 5

Precipitación Fraccionada y Cuantificación de Proteinas

Hidrosolubles

Objetivo :Se hará la extracción de las proteinas solubles de concentrados de perro,

gato, aves, roedores, “compost para vacas, caballos” etc. Se cuantificará el contenido por 2 métodos colorimétricos

Prelaboratorio

1¿Qué tipo de proteinas va a extraer con el buffer?

2. ¿Qué quiere decir “salting out y salting in “?

3. Con cual de los 2 métodos anteriores se vá a trabajar?. Explique

4.Que tipo de proteinas van a precipitar a 30 % de saturación?

5. Que tipo a 40 %?

6. Que tipo a 60 % ¿

7. ¿Cuál es la nomenclatura oficial de los aminoácidos?. Indíquela

8.¿Cuál es la diferencia en los diferentes métodos de cuantificación?.Aparte de los químicos.


- Concentrados

-Disoluciòn saturada de Sulfato de Amonio 100 % de saturaciòn

-PBS (l37 mM NaCl,2.6 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 y 1.8 mM KH2PO4 ; pH 7.2 )

-Buffer de Fosfatos pH 7

-Patrón de Proteinas 10 mg/ml y 5 mg/ml Celite, Gaza

-Reactivo de Biuret Hielera, Hielo

-Reactivo de Folin Lowry 20 Tubos de ensayo, gradillas

-SoluciónAlcalina ¿¿ Espectrofotómetro y celdas Espectrofotómetro Baño de Maria

Procedimiento

1. Extracciòn: Esta parte deberá hacerla el estudiante en su casa.

1.1. Muela 2.0 gramos del concentrado a usar hasta obtener una harina fina. Guarde

0.5 gramos

1.2. Al resto agréguele 10 ml de buffer de fosfatos (pH 7) , déjelo 12 horas con

Agitación ocasional. Filtre a través de gasa y Celite hasta que el filtrado estè

Claro.

Guarde 2-3 ml para otras pruebas.

1.3. Después de guardar (mínimo 1 ml), el resto de la solución se mide y llevan hasta un 30 % de saturación con la disoluciòn saturada de Sulfato de amonio aplicando la siguiente fòrmula:

V = V1 (S2- S1) / 1- S2

V= Volumen de la solución saturada

V1=Volumen inicial de la muestra

S2=Tanto por uno de la concentración de saturación a la que se quiere llevar la muestra

S1=Tanto por uno de la concentración inicial de la muestra

1.4. Agregar la cantidad de Sulfato de amonio calculada, agitar suavemente y poner en baño de hielo durante 10 minutos. Centrifugue 10 minutos, procure que siempre esté frío.

1.5. Pasar el sobrenadante a una probeta para medir el volumen

-1.6. Disolver el precipitado en 6ml de PBS, medir el volumen final. Esta es :

FRACCIÓN 1

1.6. El sobrenadante obtenido en el paso anterior, llevarlo a un 40 % de saturación con el Sulfato de amonio, agitar, enfriar 10 minutos en hielo y centrifugar 10 minutos frío.

1.7. Decantar el sobrenadante y medirlo. El precipitado disolverlo con 5 ml de PBS y se mide el volumen final. Esta es: FRACCIÓN 2.

1.8. El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 60% de saturación con el sulfato de amonio, se procede en igual forma, y se obtiene la FRACCIÓN 3.

Guardar las fracciones bien rotuladas para la siguiente parte.

2. Cuantificaciòn por Mètodos Colorimètricos

A la muestra inicial y a las fracciones, hágale las siguientes diluciones

Solución Inicial: 1:10, 1:100, 1:200

Fracción 1: 1:4, 1:8

FRACCIÓN 2: 1:30, 1:60

Fracción 3. 130, 1:60

2.1 Método de Biuret.

Usar un patron fresco de proteinas, Albúmina 10 mg/ml

- 2.0 ml de cada proteina

3.0 ml del reactivo de Biuret. Agitar

Poner en baño de maria a 37ºC durante 10 minutos

Leer a 540 nanómetros

Calcular la cantidad de proteinas en cada fracción.

2.2 Método de Folin-Lowry

Hacer un patrón fresco de proteinas de 0.5 mg/ml

-1.0 ml de cada proteina

5.0 ml de la solución alcalina

dejar reposar 10 minutos

Agregar 0.5 ml del reactivo de Folin diluido

Dejar reposar 30 minutos y leer a 600 nanómetros

Calcular la cantidad de proteinas en cada fracción

Práctica No. 6

Cuantificación de Proteinas Totales por el Método de Kjeldahl

Objetivo: Cuantificar el contenido de proteinas totales del la muestra que usó en la

práctica anterior que usó en la práctica anterior

Prelaboratorio

1.Indique el tipo de reacción que se vá a llevar a cabo.

2.Cual es la parte reactiva del acido sulfúrico y cual es su función?

3. Explique lo que le vá a pasar a la proteina durante el calentamiento con acido.

4. Explique con reacciones y palabras la función de NaOH.

5. Cual es la funciòn del Acido Bòrico?. Explìquelo con palabras y fòrmulas

6.Explique Porque al Acido Bòrico se le agregan 2 indicadores

7. Explique , que và a titular con el HCL.

8 Explique. porqué puede calcularse el contenido de proteina , a partir de los datos

obtenidos al titular con HCl

Reactivos

Ácido sulfúrico concentrado Erlenmeyer de 50 ml

Concentrados de la práctica anterior Probeta de 10, 50 ml

Hidróxido de sodio al 40% Estufa

Ácido bórico al 40% Kits de destilación

Rojo de Metilo Bureta y pinzas

HCl 0.005 M Beakers de 30 ml

Azul ó Verde de Bromocresol ó Balanza

Bromotimol

Peróxido de Hidrógeno al 30 %

Procedimiento:

DIGESTIÓN:

1. Pesar exactamente de 0.10 g a 0.25 g de la muestra, seca , sobre papel libre de nitrógeno, de acuerdo a su contenido de nitrógeno orgánico. Colocar la muestra ya pesada en el matraz de Kjeldahl.

2. Agregar 3.0 a 6.0 mL de ácido sulfúrico concentrado.

3. En la campana de extracción, calentar a 100°C durante 30 minutos, girándolo ocasionalmente, continúe el calentamiento durante 45 minutos más a 200°C..

4. Al terminar el tiempo de digestión la muestra deberà estar completamente clara,

Sin ninguna turbidez, aunque tenga un ligero color verde ò amarillo pàlido.

5. Adaptar el matraz a un sistema de destilación que tiene en la salida del refrigerante un Erlenmeyer que contenga 20 mL de ácido bórico al 4% .El ácido deberá tener un indicador ácido y uno básico.

DESTILACIÓN:

Prepare un beaker con 15 ml de acido Bòrico al que se leha agregado unas gotas de Rojo de Metilo y de Azul ò Verde de Bromotimol

6. Estratificando lentamente, añadir al matraz Kjedahl la muestra y 5 mL de hidróxido de sodio al 40% por cada mL de ácido sulfúrico concentrado empleado para realizar la digestión. Conectar RÁPIDAMENTE el sistema de destilación y agitar suavemente mientras se calienta. Destilar hasta obtener el doble del volumen de ácido bórico.

TITULACIÖN:

Titular con la solución de HCl 0.05 N hasta obtener el color inicial del acido bórico.

Usando estequiometría, calcular los gramos de proteína en la muestra inicial.

Comparar la cantidad de proteinas totales con las solubles.

PRÁCTICA NO. 7

AISLAMIENTO Y PROPIEDADES QUÍMICAS DE LA HEMOGLOBINA

Objetivo: Conocer los diferentes tipos de Hemoglobina y su toxicidad.

1. La toxicidad por el CO, en la que se forma Carbonil-Hb ó Carboxihemoglobina.

2.La oxidación de la Hemoglobina a Metahemoglobina la que llevarse a cabo en

presencia de Nitritos. La reducción de NO3- a NO2- en el tracto digestivo, puede dar

lugar a Metahemoglobinemia, enfermedad peligrosa especialmente en niños.

Prelaboratorio

1. Explique que es el Hem.

2.. Explique que aminoácido es determinante para la síntesis del Hem.

3. Cual es el nùmero de Coordinación que tiene el Fe.?. Explique

4. Que son ligandos? Que ligandos tiene el fe en la hemoglobina?

5. Fórmulas de: Hemoglobina, Carboxihemoglobina, Metahemoglobina, Oxihemoglobi-

na , Deoxihemoglobina y Nitrosilhemoglobina.

6. Explique bioquimicamente el cambio en la molécula de Hb, agregar reactivo de

Stockes amoniacal.

7. Explique bioquimicamente el cambio en la molécula de Hb al agregar Ferricianuro

de potasio.

8. Explique la importancia bioquímica del estado de oxidación del Hierro en la

molécula de Hb.

.


-Sangre con anticoagulante Tubos Vacutainer

- NaCl 1.2 % Embudo de decantación de 50 y

-Acido Ascórbico 125 ml

-NaCl al 0.6,0.8, 1.0, 2.0, 6.0 10.0, 16.6 y 20.0 % Centrífuga

en agua destilada. Pipetas Pasteur de vidrio y bulbos

-Reactivo de Stokes. Prepararlo antes de usarlo. 30 Tubos de ensayo

Disolver 20 g de FeSO4.7 H2O y 30 g de Ácido Gradilla

Tartárico en agua destilada y aforar a 1 Litro.

-Reactivo de Stokes Amoniacal, hacerlo en el

momento de usarlo, colocar en un tubo de

ensayo 2 ml del reactivo anterior y agregar

NH4OH gota a gota hasta que cambie a

color verde .

-NH4OH conc.

-Ferricianuro de Potasio al 10 % y al 0.2 %

- Buffer de Acetato 0.5 M, pH 4.5 (Ac. Acético y

Acetato de Sodio)

-Äcido Ascórbico 0.5 M en buffer de acetato.

-Buffer de Fosfato 0.2 M, pH 7.0

-Sangre completa

-Anticoagulante (Heparina)

-Tolueno

- NaNO2 al 10 % en buffer de acetato.

Procedimiento

I. Preparación de la Solución Concentrada de OXIHEMOGLOBINA:

1.1.-Centrifugar 50 ml de sangre con anticoagulante para sedimentar los eritrocitos.

1.2.Decantar y lavar los eritrocitos con un volumen igual de NaCl 1.2 %,mezclando

cuidadosamente por inversión.

1.3.Centrifugar y descartar el sobrenadante. Repetir este paso hasta que el sobrenadante

se vea incoloro .

1.4.Hemolizar las células del sedimento, agregando 1.2 volúmenes de agua y 0.4 volú-

menes de Tolueno, mezclar vigorosamente en un embudo de decantación y dejar en

reposo a temperatura ambiente durante una hora.

1.5Al finalizar la hora, descartar la capa de Tolueno, la que contiene material lipídico.

1.6.Centrifugar la capa acuosa durante 15 minutos y descartar el precipitado.

Si el sobrenadante no fuera claro, repetir la centrifugación a mayor revoluciones ó

más tiempo. La solución resultante es la SOLUCIÓN CONCENTRADA DE

OXIHEMOGLOBINA.

2.- Examen cualitativo de Hemoglobina:

2.1.Solución Diluida de Oxihemoglobina

.A 0.5 ml de la solución concentrada de Oxihemoglobina, agregar 20 ml de

agua destilada, mezclar hasta obtener una solución homogénea. Poner 4 ml

de ésta solución en un tubo de ensayo, el que se usará como control en las

pruebas posteriores.

2.2..Preparación de Deoxihemoglobina:

Colocar en un tubo de ensayo, 4 ml de la solución diluida de Oxihemoglobina,

Agregar gota a gota el reactivo de Stokes amoniacal hasta observar cambio de

Color.

2.3.. Preparación de Metahemoglobina:

Colocar 4 ml de solución diluida de Oxihemoglobina en un tubo de ensayo, agregar

gota a gota Ferricianuro de Potasio , mezclando constantemente hasta observar cam-

bio de color.

En otro tubo de ensayo colocar 2 ml de la solución diluida de Oxihemoglobina,

agregar 3 ml de Ferricianuro de K, deslizándolo por las paredes con suficiente rapidez

para que no se mezclen NO MEZCLAR. Inclinar el tubo y observar como se libera el

oxígeno de la hemoglobina.

2.4.Preparación de Nitrosilhemoglobina:

En un tubo de ensayo, colocar 4 ml de la solución diluida de Oxihemoglobina,

agregar 0.1 ml de Acido Ascórbico en buffer de acetato y 1 gota de NaNO2 en el

mismo buffer.

3.-. Espectros de Absorción:

Preparar una solución de Oxihemoglobina cuya absorvancia a 500 nm sea de 0.5.

Esta solución se usará para realizar las determinaciones siguientes.

Usar agua destilada como blanco.

3.1.Espectro de la Oxihemoglobina:

Tomar 5 ml de la solución de Oxihemoglobina y agregar 1 ml de agua destilada, medir

La absorvancia de esta solución en el rango de 450 a 650 nm, cada 10 nm. Usar agua

destilada como blanco.

3.2.Espectro de la Deoxihemoglobina:

Preparar la muestra y el blanco simultaneamente

BLANCO: a 5 ml de agua destilada agregar 1 ml de Reactivo de Stokes diluido, el que

se prepara agregando a 1 ml del reactivo de Sokes amoniacal, 1 ml de agua

MUESTRA: A 5 ml de la solución de Oxihemoglobina, agregar 1 ml del reactivo de

Stokes amoniacal diluido.

Tapar los tubos con parafilm y dejar en reposo durante 30 minutos.

Medir la absorvancia de esta solución en un rango de 450 a 650 nm, cada 10 nm.

3.3.ESPECTRO DE LA METAHEMOGLOBINA

Preparar el blanco y la muestra simultáneamente.

BLANCO: A 5 ml de agua destilada, agregar 1 ml de solución de Ferricianuro de K al

0.2 %.

MUESTRA: A 5 ml de la solución de Oxihemoglobina, agregar 1 ml de Ferricianuro de K al 0.2 %

Mezclarlos bién y leer la absorvancia de esta solución en el rango de 450 a 650 nm, cada 10 nm.

Práctica No.8

Pruebas para Caracterizaciòn de Azùcares

Objetivo: Conocer las pruebas generales y específicas para identificar carbohidratos

simple y compuestos.

Prelaboratorio:

1¿En que se basa la prueba de Molish y de Fehling?

2. Si al acetaldehído se le hace la prueba de Molish. Va a dar positiva ó negativa?

Explique.

3. . Al hacerle la prueba de Fehling al Acetaldehido, va a dar positiva ó negativa?

Explique.

4. Explique la base de la prueba de Seliwanoff y cuales van a dar positivo

5. . Explique la base de la prueba de Barfoed y cuales van a dar negativo

6. Explique la base de la prueba de la Anilina. Y cuales van a dar negativo

7 La sacarosa y el almidón. Dan positivas las pruebas para azucares reductores .

Explique.

8. Explique el efecto del ácido y la base sobre el almidón y la sacarosa

Reactivos y Materiales:

-Sacarosa,

- Glucosa, Frustosa, Maltosa, Acetaldehido

-Arabinosa ó Xilosa 30 |Tubos de Ensayo

-Almidón Gradilla

-Alfa Naftol( 50g/L de Etanol) Estufa

-Ac. Sulfúrico Conc. Baeker de 400 ml

- CuSO4 Papel filtro

-Tartrato de Na y K

-Reactivo de Barfoed (33 g de Acetato de Cobre

En 500 ml de agua, filtrar y agregar 5 ml

De Ac. Acético)

-Resorcinol- HCl 6 M

-Orcinol

-HCl conc.

-Reactivo de Anilina prepararlo antes de usarlo

(9 ml de agua, 4 ml de Ac. Acético glacial y

5 ml de Anilina)

-HCl 3N

-NaOH 3 N

Procedimiento

Pruebas Generales y Especìficas

1. Prueba de Molish para todos los Carbohidratos:

1.1 En diferentes tubos de ensayo coloque 20 gotas de glucosa, fructosa, maltosa, almidon

sacarosa y acetaldehido

-1.2gregue 5 gotas de alfa naftol( 50g/l de etanol)

1.3. Agregue unas 20 gotas de acido sulfúrico conc., agréguelo por las paredes a manera de

formar 2 capas. NO AGITE. Observe la interfase de las 2 capas. Un anillo violeta se

considera una prueba positiva

¿Qué compuesto se forma, que dá el color violeta?. Todas las soluciones la dieron? Explique.

2. Test de Fehling para Compuestos Reductores:

El reactivo de Fehling consta de 2 soluciones: Solución A, formada de CuSO4 y la solución B

Formada de Tartrato de NaK y NaOH. Al momento de trabajar mezclarlas en volúmenes iguales.

2.1.En diferentes tubos de ensayo poner 20 gotas de las soluciones anteriores

2.2.Agregar 2 ml de Reactivo de Fehling y calentar en baño de maria a ebullición durante 2 minutos.

2.3Se considera una prueba positiva, cuando el reactivo cambió de color, desde un color verdoso hasta un precipitado rojo.

-¿A que se deben esos cambios de color?, ¿que compuestos se forman? ¿todas las substancias se

comportaron igual?. Explique

3. Prueba de Barfoed para distinguir Monosacáridos de Disacáridos

Reactivo de Barfoed: Disolver 33 g de Acetato de Cu(II) en 500 ml de agua, filtrar y agregar 5

ml de ácido acético.

Usar las mismas soluciones

3.1.Poner 2 ml de cada una de las soluciones en tubos separados

3.2Agregar 2 ml del reactivo de Barfoed, calentar en baño de maria durante30 minutos, anotar el tiempo en que aparece un precipitado rojo, lo que se considera positivo.

4. Test de Seliwanoff para Cetosas

Reactivo: Disolver 0.15 gr de 1,3 dihidroxibenceno(resorcinol) en 300 ml de HCl 6 M.

4.1.En 3 tubos , colocar 20 gotas de fructosa, glucosa y ribosa.

4.2.Agregar 3 ml de reactivo de Seliwanoff y poner en agua hirviendo durante 15 minutos

4.3.Anotar los colores. Un color rojo intenso se considera positiva.

5. Test de Bial para Pentosas

Reactivo: Disolver 0.6 g de 1, metil,3,5,dihidroxibenceno(orcinol) en 200 ml de HCl concentrado y agréguelo lentamente a 100 ml de agua.

Use soluciones diluidas de fructosa, glucosa y xilosa.

5.1.Ponga 10 gotas de cada solución

5.2.Agregue 3 ml del reactivo de Bial y caliente en agua hirviendo durante 15 mutos.

5.3.Anote los colores durante el tiempo de calentamiento, las hexosas dan colores de amarillo

a café y las pentosas dan colores azules brillantes.

6. Test de Acetato de Anilina para distinguir Pentosas de Hexosas

Reactivo: A 9 ml de agua, agregar 4 ml de Acido Acético glacial y 5 ml de Anilina. Prepararlo

Justo antes de usarlo.

Usar los mismos azúcares del experimento 5

6.1.Poner 20 gotas de cada uno de los azúcares en tubos de ensayo

6.2.Agregar 1 ml de HCl concentrado , colocarlos en agua hirviendo y poner en la boca de cada tubo una pieza de papel filtro impregnada con el reactivo.

6.3.Un color rojo brillante se considera positivo para pentosas.

7.Efecto del Acido y Alcali sobre el Almidon y Sacarosa

7.1.Prepare 10 tubos pequeñitos de ensayo con 1 gota de lugol + 3 gotas de HCl 3 N

-7.2.En otros tubos de ensayo coloque lo siguiente:

Tubo 1: 5 ml de Almidon + 0.5 ml de HCl 3N

Tubo 2: 5 ml de Almidón + 0.5 de NaOH 3N

Tubo 3: 5 ml de sacarosa + 0.5 ml de HCl 3N

Tubo 4: 5 ml de Sacarosa + 0.5 ml de NaOH 3N

-7.3Colóquelos en un baño de agua hirviendo. A intervalos de 3 minutos, tome 1 gota de los tubos 1 y2 y agréguela en los tubitos con yodo. Observe el color y anótelo

7.4.Cuando el tubo 1 ya no muestre coloración, saque los tubos del agua.

-7.5Prepare otro tubito solo con yodo y haga la prueba con 1 gota del tubo 2. Anote las observa-

ciones. Ahora agregue 3 gotas de HCl al tubito y observe.

-7.6Agregue 5 gotas de yodo a 1 ml de la solución de almidón.Lleve a ebullición y observe. Enfrie y observe.

7.7. Agregue a todos los tubos solución de Fehling , proceda como lo hizo anteriormente y observe.

PRÁCTICA NO. 9

LÍPIDOS: SALES BILIARES Y ACIDOS GRASOS

Objetivo: Introducción al tema de los Lípidos, conocer sus componentes e

identificarlos.

Prelaboratorio

1.Indique la composición de la Bilis.

2.Indique el nombre común y químico de los Acidos Biliares de los que se derivan las sales biliares.

3.¿Cuál es la parte hidrofóbica de las sales biliares?

4. Indique los principales componentes de la Lecitina

5. Que es el Glicerol?, donde se encuentra?

6. A que se debe la coloraciòn con el alfa naftol

7. Defina: Emulsión


Aceite de comer ó de cocinar 30 Tubos de ensayo

Bilis 0.1 M Gradillas

Lecitina de Huevo ó de Soya Probetas de 10 ml

Colato ó Desoxicolato de Sodio 0.1 N Pipetas Pasteur plásticas

Alfa Naftol al 5% Sonificador

Hipoclorito de Sodio al 2% Espectrofotómetro y Celdas

HCl concentrado

H2SO4 conc.

PROCEDIMIENTO

I. Emulsión de Grasas

En 2 tubos de ensayo, coloque lo siguiente:

1.1. 1.0 ml de Agua+ 2 gotas de Aceite de comer ó cocinar, tapar, agitar y observar.

1.2. 1.0 ml de una solución de Bilis 0.1M + 2 gotas de aceite, tapar, agitar y observar.

II. Solubilización de Lecitina

2.1. Pese 0.2 de Lecitina de Huevo ó de Soya y colóquela en un erlenmeyer

2.2. Agregue 25 ml de agua destilada

2.3. Disperse la mezcla por medio de un Sonificador

2.4. Ponga una muestra de esta suspensión en una celda de espectrofotómetro y mida la absorvancia. Regrese el contenido de la celda al erlenmeyer

2.5. Agregue 100 mg de Bilis y agite magnéticamente durante 2 minutos

2.6. Tome una muestra y lea nuevamente la absorvancia.

2.7. Siga agregando bilis , agitando y midiendo la absorvancia, hasta los valores estén casi en cero.-Haga una gráfica de turbidez (Abs) versus concentración de

sales biliares.

III. Test Colorimètrico para Glicerol

3.1. En distintos tubos de ensayo coloque loa siguiente :

Agua, Glicerol, Acido oleico, Acido esteàrico, Aceite de oliva, aceite mineral y

Alguna semilla previamente machacada. Mas ò menos 1 ml y 0.05 g.

3.2. Agregue a cada tubo 1 ml de soluciòn de HIPOCLORITO, mezcle y deje reposar

durante 5 minutos.

3.3. Agregue a cada tubo 4 gotas de de HCl y caliente a ebulliciòn durante 1 minuto.

3.4. Agregue 0.5 ml de alfa Naftol y 4 ml de H2SO4 concentrdo. Cuidadosamente agite los tubos y observe si hay coloraciòn verde que se considera como positiva para glicerol.

Práctica No. 10

LÍPIDOS: Hidrólisis Enzimática de un Aceite.

Objetivo: Hidrolizar un aceite vegetal en sus acidos grasos por medio de una

enzima de origen animal (Pancreatina)

Prelaboratorio

1. Indique los principales acidos grasos saturados que tiene el aceite de oliva.

2. Indique los principales acidos grasos insaturados que tiene el aceite de oliva.

3. Indique la composición de la Pancreatina.

4. Explique porqué se usa el buffer de amonio y el pH de 8.

5. Indique el nombre de la enzima y a que clasificación pertenece

6. Explique para que va a usar el KOH..

7. Como espera que sea la hidrólisis? Parcial, total, etc. Explique.

8. Explique para que se agrega el CaCl2.

9. En el organismo, quien hace esa función?

10. Defina Número ó Indice de Saponificación e indique el valor teórico del

Aceite de Oliva.

11. Indique el pK de la Fenolftaleina.


Detergente 2% Probeta de 10, 50 ml

Buffer NH4Cl-NH4OH 0.05 M (pH 8) Beakers de 100, 600 ml

CaCl2 0.1M Balanzas

Aceite vegetal Erlenmeyer de 125 ml

Fenolftaleína 1% Nucleos de ebullición

Etanol-eter (9:1) Bureta y pinza

KOH 0.02N

NH4OH 5N

Pancreatina

Bilis Sintética

Procedimiento:

1.-Preparación de la Enzima:

Agregue 1 g de Pancreatina seca a 50 ml de la solución buffer de amonio 0.05 M, agíte y centrifugue. Descarte el material insoluble y el sobrenadante manténgalo a 0°C hasta el momento de usarlo.

2.- Ensayo Enzimático:

2.1.Pese exactamente 0.5 g de aceite de oliva en un erlenmeyer de 125 ml.

Agregue 5 ml de bilis artificial , 1 ml de detergente y unas perlas de ebullición.Entibie la solución en un baño de vapor.

2.2.Tape el erlenmeyer herméticamente y agítelo vigorosamente hasta obtener una emulsión homogénea.

2.3.Enfríe la mezcla a temperatura ambiente mientras agita suavemente el erlenmeyer. Agregue 10 ml del buffer de amonio gota agota, agitando después de cada adición.

2.4.Agregue 10 ml de una solución de CaCl2 0.1M de la manera anterior.

2.4.Agregue 1 ml de fenolftaleína y 4 ml de agua mientras agita la solución y lleve la mezcla a 37°C.

2.5.Finalmente agregue 4 ml de Pancreatina al 2%. Mezcle la solución e inmediatamente tome una alícuota de 5ml.

2.6.Titule esta muestra inmediatamente como se le indica más adelante.

2.7.Mantenga la solución restante a 37 °C , agitando ocasionalmente y manteniendo un pH favorable (la solución deberá estar de color rosado), agregando pequeñas cantidades de NH4OH 5. Durante la incubación las sales de calcio de los ácidos grasos liberados se precipítarán.

2.8.Tome alícuotas de 5 ml, a los 15, 30, 45 y 90 minutos de incubación

Titùlelas omo sigue:

2.9.TITULACIÖN:

A cada alícuota agregue los siguiente:

75 ml de etanol (95%)-eter (9:1)

Titule con solución de KOH 0.02N previamente estandarizada.

Cálculos: A cada titulación réstele la cantidad de NH4+ presente en la mezcla .

Este valor se obtiene de la titulación en el punto cero. Exprese estos datos gráficamente ploteando la cantidad de NH4+ presente ó la cantidad de ácidos grasos liberados versus tiempo.

Investigue el índice de saponificación del aceite usado, para calcular el porcentaje de hidrólisis del aceite , después de 90 minutos de hidrólisis enzimática.

Práctica No. 11

FOTOSÍNTESIS

Objetivo:

Hace fotosíntesis in vitro, con cloroplastos provenientes de Acelga y comprobar la necesidad de las diferentes frecuencias de la luz solar.

Prelaboratorio

1. Explique brevemente en que consiste la fotosínteis.

2. Explique brevemente la fase fotosintética de la fotosíntesis

3. Cual es la función de la sacarosa? (apoyado en bibliografía)

4. Cual es la función del 2,6-Diclorofenolindofenol?

5. Al forrar con papel verde el tubo de ensayo, que color(es) se está permitiendo

pasar y cual(es) no.

6. Explique también cuando se usa papel rojo.

7. Lo mismo con papel azul.

7. Cual es el color del 2,6-DCPIP reducido y oxidado?

8. En el tubo envuelto con papel de aluminio, espera que haya actividad de

fotosíntesis?. Explique

9. Como se le llama a la molécula de Clorofila sin el metal?

Materiales

Hojas de acelga proporcionadas por el estudiante Tablas de picar

2,6-Diclorofenolindofenol al 0.025 % (p/v) en agua Cuchillos

Buffer de Homogenización para 250 ml: Balanza

0.7 g de Na2HPO4, , 1.6 g de KH2PO4, Papel parafinado

27.5 g de Sacarosa y 1.03 g de KCl. Embudo der plástico

Gasa

Pipetas de 2 y 5 ml

Tubos de ensayo

Gradillas

Bombillas de 100 wats

Espectrofotómetro y celdas

Papel Aluminio

Papel celofán rojo, verde,azul

PROCEDIMIENTO:

I. Aislamiento de los Cloroplastos

1.1.Lavar 2 hojas de Acelga en agua, quitarles las venas gruesas y cortarlas en

pedazos pequeños.

1.2.Pesar 5 gramos y triturarlos en un ,mortero con 25 ml de buffer de homogenización previamente enfriado. Filtrar a través de una doble capa de gaza, previamente mojada con el buffer.

II.Optimizaciòn de las Condiciones de Ensayo

Con la finalidad de conocer cual será la cantidad de cloroplastos mas adecuada

para realizar los experimentos, se preparan los siguientes tubos de ensayo:

Tubos Suspensión de Cloroplastos (ml)

Buffer Homogenizador (ml)

1 0.00 4.50

2 0.10 4.40

3 0.20 4.30

4 0.30 4.20

5 0.40 4.10

6 0.50 4.00

2.1.Agregar a cada uno 0.5 ml del reactivo de 2,6-DCPIP, mezclar bien, ponerlos delante de una fuente de luz de 100 W a unos 25 cm de distancia. Tomar el tiempo en que tarda en desaparecer el color azul del rectivo y en volver el color verde inicial.

2.2.Para los estudios posteriores, interesa utilizar la cantidad de Cloroplastos que haya necesitado de 15-20 minutos en volver a la coloración verde inicial.

III. Efecto de la Longitud de Onda sobre la Capacidad Reductora de los

Cloroplastos

3.1.La Clorofila que es el pigmento mayoritario del cloroplasto, es capaz de absorver luz visible de longitudes de onda correspondientes a los colores violeta, amarillo y parte del rojo, es la razón por la que los cloroplastos presentan color verde (complementario al color absorbido). Otros pigmentos también participan en las fotosíntesis y absorven luz a diferentes longitudes de onda.

Con el objeto de estudiar, cuales de las diferentes longitudes de onda que componen la luz visible presentan mayor rendimiento fotosintético, se usarán tubos de ensayo envueltos en papel celofán azul, verde y rojo, además otro tubo será envuelto en papel de aluminio para simular la oscuridad y un tubo transparente que será el control.

3,2,Una vez seleccionada la cantidad adecuada de la suspensión de cloroplastos, se

multiplica por 13 y se coloca en un beaker. Mezclarlo bién porque tiende a sedimentar.

3.3.Se trata de medir la absorvancia (color, estado reducido del reactivo) en función del tiempo, cada 3 minutos durante 18 minutos y con luz de diferentes longitudes de onda.

Con la finalidad de hacerlo mas eficiente, se debe de trabajar con los 5 tiubos de la siguiente manera:

3.4Poner 6 ml de la suspensión en una celda de espectrofotómetro para ajustar el

cero.

3.5. Una vez calibrado el espectrofotómetro, agregar al resto de la solución, 7 ml de 2,6-DCPIP, mezclar bien y colocar 6 ml en los tubos conpapel celofán verde, azul, rojo y los tubos con papel de aluminio y que queda sin envolver.

3.6. Se lee la absorvancia del tubo con papel de aluminio antes de ponerlo en la oscuridad y se comienza a contar el tiempo.

3.7.A los 30 segundos, colocar el tubo transparente enfrente de la fuente de luz,así sucesivamente, cada 30 segundos se van colocando los otros tubos.

3.7.Un minuto después de haber colocado el tubo envuelto con papel rojo enfrente

de la fuente de luz, se lee nuevamente la absorvancia del tubo que ha estado en la oscuridad 3 minutos, retornarlo a la oscuridad inmediatamente.

3.8.A intervalos de 1 minuto se procede a leer la absorvancia de los demás tubos.

3.9.El proceso se repite a los 6,9,12,15 y 18 minutos con el objeto de conocer el valor de la absorvancia en cada tiempo en los diferentes tubos..

3.10.Hacer gráficas para cada uno de los tubos, poniendo los valores d la absorvancia en la ordenadas y los minutos en las abscisas.

3.11.Discuta los resultados.

Práctica No. 12

ACIDOS NUCLEICOS. Extracción de ADN de Tejidos

Vegetales

Objetivo: Extraer el ADN de una cebolla.

Prelaboratorio

1. Mencione el nombre de las bases Púricas y Pirimídicas

2. Indique cuales de las anteriores tiene el ADN

3. ¿Qué tipo de enlace mantiene unidas a las hélices?

4. ¿Que tipo de Azucar tiene el ADN?

5. Investigue el método de la Difenilamina para identificación de ADN.


Etanol frío Probeta de 10,25,50 y 100 ml

NaHCO3 Beaker de 250 ml

Detergente tipo Ivory Licuadora

Acetato de Sodio 3 M Hielo en hielera

Cebolla traída por el alumno Varilla de vidrio

Difenilamina Tubos de ensayo y de centrífuga

Procedimiento:

Ponga a enfriar 100 ml de etanol en hielo

Solución de Extracción

1. Prepare una solución buffer de carbonato, disolviendo 1.5 g de NaCl,

5.0 g de NaHCO3 y 2 ml de detergente (tipo Ivory) en 120 ml de agua

destilada.. Enfríe también ésta solución.

2. .Tenga a la mano 2 ml de Acetato de Sodio 3M.

Extracción de ADN

3. Coloque 50 g de cebolla en 60 de agua destilada en una licuadora. Haga un puré del material usado pulsando las cuchillas varias veces durante 20-30 segundos.

4. Agregar a la mezcla, un volumen igual de solución buffer preparada anteriormente, agitando con varilla durante 2 minutos.

5. Transferir la mezcla a uno ó varios tubos de centrífuga y centrifugar por 3 minutos.

El material denso se irá al fondo del tubo, dejando al DNA en el sobrenadante.

Precipitación de ADN

6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo, agregue 10 gotas de la solución de acetato de sodio 3 M y agite suavemente la solución.

7. Poniendo el tubo inclinado y con mucho cuidado, agregue 10 ml del etanol frío a

manera de formar 2 capas. El DNA aparecerá en la interfase.

8. Si se obtiene un polímero largo, use una varilla ó una pipeta Pasteur para enrollarlo a manera de espagueti y sacarlo de la solución.

Identificación:

Por el método de la Difenilamina.

Laboratorio de Bioquímica 2015

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