ISOLASI/EKSTRAKSI DNA(1x) PEMOTONGAN DAN

PENYAMBUNGAN DNA (1x)DNA REKOMBINAN (1x)

Dr. Ir. Atra Romeida, M.Si.

ISOLASI DNA• Merusak/membuka sel /lysyis dinding sel (phisik

atau kimia)• Memisahkan lipid (membran sel) dengan penambahan

detergent (Buffer)• Mengeliminasi proteins dengan penambahan enzim

protease• Precipitasi DNA dengan alcohol — biasanya ethanol

or isopropanol yang didinginkan. Karena DNA tidak larut di dalam alcohols, maka akan mengumpul atau menjadi pelet bila disentrifugasi.

• Pemurnian dengan mengulang metode yang sama.• Larutkan dengan air atau buffer.• Jumlah DNA yang diekstrak : mg/ml atau ug/ml

DNA• Isolasi/ekstraksi DNA dari Jaringan/sel ( organel apa ?)

• Eliminasi RNA dengan enzyme RNA-se

• Kuantifikasi dengan spektrophotometer pada absobent 260 nm.

• DNA disimpan dan dapat digunakan sewaktu-waktu, disebut dengan template DNA

• Penyimpanan: 4oC, -20oC, atau -80oC (tergantung tujuan)

Metode Ekstraksi DNA

1.Metode CTAB2.Metode SDS

3.Metode DNAZole4.Metode KIT SIGMA5.Metode Modifikasi

Satuan pengukuran:• Kg gram mgram ugram nanogram (ng)• L ml ul • Berdasarkan standar kurva, bila pembacaan alat = 1, maka jumlah DNA adalah 50 g/ml. Harus memahami faktor pengenceran, yang dimasukkan dalam kuvet adalah 100 l.

• Berapa berat DNA dalam kuvet tersebut ?• Pembacaan alat X 50 ug/ ml X vol dalam kuvet = 1 X 50 ug/ ml X 0.1 ml = 5 ug

• Pembacaan alat adalah 0.5 dan total volume yang diperoleh adalah 2 ml. Berapa berat DNA?

0.5 setara dengan 25 ug/ml X 2 ml = 50 ug

CONTOH QUANTIFIKASI DNA

• Berdasarkan pengukuran spektrophotometer: Berdasarkan pengukuran spektrophotometer: bila pembacaan alat pada spektrum 260 nm bila pembacaan alat pada spektrum 260 nm = 1, maka jumlah DNA pada larutan adalah = 1, maka jumlah DNA pada larutan adalah 50 50 g/mlg/ml. Untuk mengetahui jumlah DNA, . Untuk mengetahui jumlah DNA, hasil ekstraksi diencerkan dari 1 hasil ekstraksi diencerkan dari 1 l l menjadi 100 menjadi 100 l, dan kemudian discan l, dan kemudian discan kedalam alat. kedalam alat.

• Hasil pengukuran menunjukkan 0.025. Bila Hasil pengukuran menunjukkan 0.025. Bila total volume ekstraksi adalah 40 total volume ekstraksi adalah 40 l, l, berapa berapa g total DNA yang diekstraksi.g total DNA yang diekstraksi.

1. Diketahui: Total Volume ekstraksi = 40 lPembacaan Alat = 0.025Jumlah DNA= 0.025/1 x 50 g/ml x 40 l = ………….. g

Penghitungan konsentrasi DNA• Alat: Spektrophotometer• Dasar penghitungan adalah nilai A 260 nm (nilai absorbsi). • dsDNA dengan konsentrasi 1 mg/ml mempunyai A260 sebesar 20• ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. • Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui

penentuan nisbah A260 terhadap A280 (absorpsi protein). • Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar

1,8. • Molekul ssRNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar

2,0. • Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai

A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein.

Kuantifikasi DNA

menggunakan spektrofotometer dengan membaca absorban pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Pembacaan A260 =1 berarti konsentrasi DNA yang didapat sebesar 50 g/ml. Konsentrasi DNA yang didapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: DNA (g/ml) = A260 x faktor pengenceran x 50

Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai rasio A260/A280. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler mempunyai rasio A260/A280 sekitar 1.8-2.0 (Sambrook et al., 1989).

Terima Kasih