ÍNDEX MEMÒRIA - UPCommons

- 1 -

ÍNDEX MEMÒRIA

Índex memòria..................................................................................................................1

Resum .............................................................................................................................5

Resumen ..........................................................................................................................5

Abstract ...........................................................................................................................6

Agraïments .......................................................................................................................7

Capítol 0: OBJECTIUS.........................................................................................................9

Capítol 1: Introducció ....................................................................................................... 10

1.1 Els Retrovirus ................................................................................................... 11

1.1.1 Definició....................................................................................................... 11

1.1.2 Estudi dels retrovirus ..................................................................................... 12

1.1.3 Classificació dels retrovirus ............................................................................. 13

1.2 El VIH/SIDA ..................................................................................................... 15

1.2.1 Definició del VIH/SIDA.................................................................................... 15

1.3 Història i Teories del VIH/SIDA............................................................................ 16

1.4 Tipus de VIH..................................................................................................... 19

1.5 Estructura general del VIH.................................................................................. 20

1.5.1 Genoma del VIH-1 ......................................................................................... 21

1.6 Estructura general de les cèl·lules T ..................................................................... 23

1.7 El VIH-1........................................................................................................... 23

1.7.1 Tipus de VIH-1 .............................................................................................. 24

1.7.2 Mecanisme d’acció del VIH-1 ........................................................................... 24

1.7.3 Passos del cicle vital del VIH-1 i possibilitats terapèutiques d’intervenció................ 24

1.7.4 Esquema del cicle vital del VIH ........................................................................ 28

1.7.5 Metàfora del tren ........................................................................................... 29

1.7.6 El VIH-2 ...................................................................................................... 30

1.8 Transmissió del VIH........................................................................................... 30

1.9 Evolució de la infecció ........................................................................................ 33

1.9.1 El sistema immunitari i el VIH......................................................................... 34

1.9.2 Infeccions oportunistes i SIDA ......................................................................... 37

1.10 Inhibidors del VIH/SIDA ..................................................................................... 39

1.11 Epidemiologia del VIH/SIDA................................................................................ 39

Arantxa Querol Serra & Paola Leal Servitje

- 2 -

1.11.1 Epidemiologia del SIDA a Europa ..................................................................... 39

1.11.2 Epidemiologia del SIDA a Espanya.................................................................... 41

1.11.3 Evolució de l’epidèmia a Espanya ..................................................................... 43

1.12 Medicaments antirretrovirals ............................................................................... 46

1.13 Umbral de minimització de resistències antirretrovirals ........................................... 46

1.14 Substàncies antirretrovirals ................................................................................ 47

1.14.1 Inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids................................. 48

1.14.2 Inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòsids ............................ 55

1.14.3 Inhibidors de la proteasa ................................................................................ 58

1.14.4 Inhibidors de la fusió...................................................................................... 62

1.15 Teràpies combinades ......................................................................................... 63

1.16 Potència dels antirretrovirals ............................................................................... 64

1.16.1 Indicadors canvi de teràpia ............................................................................. 66

1.16.2 Resistència als principals antirretrovirals ........................................................... 66

1.16.3 Efectes secundaris de l’ actual teràpia............................................................... 69

1.16.4 Són aquests medicaments una cura pel SIDA? ................................................... 70

1.16.5 I actualment que es fa? .................................................................................. 70

CAPÍTOL 2: INTRODUCCIÓ TEÒRICA A L’HPLC ..................................................................... 71

2.1 Mètodes de separació. Introducció ....................................................................... 71

2.1.1 Elució isocràtica vers elució amb gradient.......................................................... 73

2.2 Sistemes de bombeig......................................................................................... 74

2.3 Sistemes d’injecció de mostra ............................................................................. 75

2.4 Detecció........................................................................................................... 76

2.4.1 Detectors de Fluorescència.............................................................................. 76

2.4.2 Detectors de Índex de refracció ....................................................................... 76

2.4.3 Detectors Electroquímics................................................................................. 77

2.5 Columnes per a cromatografia de líquids............................................................... 77

2.5.1 Columnes analítiques ..................................................................................... 78

2.5.2 Precolumnes ................................................................................................. 78

2.5.3 Columnes termostatitzades ............................................................................. 78

2.6 Els mètodes cromatogràfics ................................................................................ 79

2.6.1 Cromatografia de repartiment.......................................................................... 79

2.6.2 Cromatografia d’adsorció ................................................................................ 81

2.6.3 Cromatografia d’exclusió molecular .................................................................. 82

2.6.4 Cromatografia d’intercanvi iònic....................................................................... 85

CAPÍTOL 3: PART EXPERIMENTAL....................................................................................... 87

Caracterització de profàrmacs antirretrovirals

- 3 -

3.1 FIA.................................................................................................................. 87

3.1.1 Reactius ....................................................................................................... 87

3.1.1 Fàrmacs ....................................................................................................... 88

3.1.1 Dissolucions.................................................................................................. 88

3.1.2.1 Dissolució mare dels fàrmacs ....................................................................... 88

3.1.2.2 Dissolució tampó àcid ................................................................................. 88

3.1.2.3 Dissolució neutralitzadora o valorant............................................................. 89

3.1.3 Instrumentació.............................................................................................. 89

3.1.3.1 Estudis d’ estabilitat ................................................................................... 89

3.1.3.2 Per les variacions espectrofotomètriques ....................................................... 89

3.1.4 Procediment experimental............................................................................... 91

3.1.4.1 Estudis d’estabilitat .................................................................................... 91

3.1.4.2 Valoracions espectrofotomètriques en continu ................................................ 92

3.1.4.3 Estudi dels diferents dissolvents per precipitar proteïnes del plasma ................. 93

3.2 HPLC ............................................................................................................... 97

3.2.2 Reactius ....................................................................................................... 97

3.2.2 Fàrmacs ....................................................................................................... 97

3.2.3 Preparació de les dissolucions mare dels fàrmacs ............................................... 98

3.2.4 Preparació del plasma .................................................................................... 99

3.2.5 Preparació de la fase mòbil ........................................................................... 100

3.2.6 Preparació de mostres .................................................................................. 100

3.2.7 Instrumentació............................................................................................ 105

3.2.7.1 Materials................................................................................................. 105

3.2.7.2 Condicions cromatogràfiques utilitzades ...................................................... 106

3.2.8 Injecció i obtenció del cromatograma.............................................................. 107

CAPÍTOL 4: RESULTATS EXPERIMENTALS.......................................................................... 109

4.1 Estudi de les condicions òptimes de treball .......................................................... 110

4.1.1 Preparació de les diferents mostres a analitzar................................................. 111

4.1.2 Estudi del Dissolvent a escollir ....................................................................... 112

4.1.3 Modificacions en el gradient .......................................................................... 115

4.1.4 Canvis de gradient i pH ................................................................................ 121

4.2 Recuperació de fàrmacs afegint 100%, 150% i 200% d’Acetonitril.......................... 130

4.3 Dilució amb aigua Milli-Q .................................................................................. 138

4.4 Estudi del inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids (NRTIs)......... 145

4.5 Validació del mètode........................................................................................ 148

4.6.1 Linealitat del mètode.................................................................................... 148


- 4 -

CAPÍTOL 5: CONCLUSIONS ............................................................................................. 155

CAPÍTOL 6: BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................. 158

- 5 -

RESUM

La finalitat d’aquest projecte consisteix en la caracterització de fàrmacs

antirretrovirals i s’ha dut a terme en el departament de Quimiometría de la

Universitat de Química de Barcelona (UB).

La caracterització s’ha realitzat mitjançant valoracions espectrofotomètriques

àcid-base, en solucions aquoses, utilitzant la tècnica de cromatografia líquida

d’alta resolució (HPLC).

Es fa una determinació quantitativa dels analits en plasma humà. S’estudien els

avantatges i inconvenients de la seva aplicació.

RESUMEN

La finalidad de este proyecto consiste en la caracterización de fármacos

antirretrovirales y se ha llevado a cabo en el departamento de Quimiometría de

la Universidad de Química de Barcelona (UB).

La caracterización se ha realizado mediante valoraciones espectrofotométricas

ácido-base, en soluciones acuosas, utilizando la técnica de cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC).

Se hace una determinación cuantitativa de los analitos en plasma humano. Se

estudian las ventajas e inconvenientes de su aplicación.


- 6 -

ABSTRACT

The purpose of this project consists of the characterization of anti-retroviral

medicaments and has been carried out in the Quimiometria’s department of the

Chemistry University of Barcelona (UB).

The characterization was performed using spectrophotometry valuations acid –

base in aqueous solutions, using the technique of high resolution liquid

chromatography ( HPLC).

A quantitative determination of the analytes is done in human plasma. The

advantages and inconveniences are studied.


- 7 -

AGRAÏMENTS

Aquest projecte ha pogut ser realitzat gràcies a l’ajuda de professors, familiars i

amics que ens han donat suport.

En primer lloc, donem les gràcies al Dr. Ramon Oliver per donar-nos l’

oportunitat de realitzar el projecte de final de carrera en el departament de

Quimiometría de la Universitat de Química de Barcelona (UB), per la seva ajuda,

per escoltar-nos i per tots els consells donats.

En segon lloc, donem també les gràcies al Dr. Santiago Hernández i al Dr. Xavier

Saurina per permetre’ns treballar en un dels seus departaments i per orientar-

nos i guiar-nos en el nostre projecte.

En tercer lloc, agraïments al Toni Checa per la seva paciència, la seva constància

i els seus savis consells. Gràcies a ell, els dubtes i qüestions que ens anaven

sorgint durant el projecte han pogut ser resolts.

Per acabar, agraïm a tota la gent que hem tingut al nostre costat. Els nostres

pares, amics, companys de laboratori, és a dir, a totes les persones que ens han

donat tot el seu amor i tota la seva amistat. A tots ells moltes gràcies per les

forces que ens heu donat quan ens ha fet falta.

Gracies a la nostres famílies, especialment als nostres pares que han sabut

comprendre’ns i que han estat en tot moment al nostre costat.

- 9 -

CAPÍTOL 0:

OBJECTIUS

L’objectiu principal d’aquest projecte és la caracterització de fàrmacs

antirretrovirals. Explorar les formes generals de prevenció del virus i les seves

conseqüències utilitzant diferents mètodes analítics com són: les valoracions

àcid-base i la tècnica de cromatografia líquida d’alta resolució.

Altres objectius:

• Reconèixer les funcions del sistema immunològic humà i al mateix temps,

veure com aquest és afectat per el Virus de Immunodeficiència Humana

(VIH). Conèixer que és el SIDA i el VIH.

• Comprendre les vies d’infecció del virus i les formes indirectes per a

contraure’l.

• Nocions bàsiques del espectre electromagnètic i comprendre els conceptes

relatius a la interacció entre la radiació electromagnètica i la matèria, en

els que es basen els mètodes espectroscòpics en general.

• Aplicacions de la espectrofotometria visible i ultravioleta.

• Anunciar la llei de Lambert-Beer, comprendre el significat de les

magnituds que intervenen en ella i interpretar la naturalesa de les

desviacions d’aquesta llei.


- 10 -

CAPÍTOL 1:

INTRODUCCIÓ

A finals de la dècada de 1960 es va reconèixer una classe de virus, els retrovirus,

que transportava la informació genètica en molècules d’ARN i contenien un tipus

d’enzima que era la transcriptasa inversa. Aquest tipus d’enzima és capaç de

sintetitzar un cadena d’ADN a partir d’ARN. Una altra característica d’aquests

virus és que aquest ADN s’integra en el genoma quedant latent i poden provocar

tumors.

El Virus de la Immunodeficiència Humana (VIH), és un d’aquests retrovirus i és

l’agent causal d’una de les malalties més terribles del nostre país: el Síndrome

de Immunodeficiència Adquirida (SIDA). Es tracta d’una malaltia mortal degut al

desenvolupament de la infecció, que degenera totalment el sistema immunitari

del malalt, així com la falta de tractament efectiu.

La llarga duració de la malaltia, la relativament facilitat de contagi i la falta de

tractament ha provocat una epidèmia mundial.

L' aportació dels nous medicaments antirretrovirals altament actius (disponibles

des de 1996) pel tractament de la infecció per VIH/sida ha suposat un canvi

fonamental en el patró de la malaltia, en l’impacta de la mateixa en la

supervivència dels pacients i en la seva qualitat de vida. La contribució de la

indústria farmacèutica basada en la investigació de nous fàrmacs més actius ha


- 11 -

estat clau i ho ha canviat tot en el panorama del VIH/sida en pocs anys. La

mortalitat ha caigut, en tot just 15 anys, un 50% en tot el món desenvolupat

així, una malaltia considerada fatal s' ha convertit en una malaltia crònica i

controlada.

1.1 Els Retrovirus

1.1.1 Definició

El virus del SIDA pertany a la família dels Retrovirus. Són virus esfèrics

d’aproximadament 100nm de diàmetre amb una càpside que envolta el seu

genoma. El seu material genètic està constituït per un àcid ribonucleic (ARN).

Aquest ARN és una molècula monocatenria de polaritat positiva que s’ha de

copiar en àcid desoxiribonucleic (ADN) bicaternari per a poder-se integrar en el

nucli d’una cèl·lula hoste.

Dels gens que codifica el ARN víric, els més importants i presents en tots els

retrovirus són:

• El gen gag, codifica tres o quatre proteïnes centrals.

• El gen pol, codifica la transcriptasa inversa i la integrasa.

• El gen env, codifica les dos glucoproteïnes de la càpside.

A més d’aquests gens, comuns a tots els retrovirus, el VIH en presenta d’altres

que codifiquen funcions importants per a la regulació del cicle de replicació del

virus.

El procés de conversió d’ARN a ADN es du a terme mitjançant accions

enzimàtiques seqüencials amb l’ADN polimerasa i una ribonucleasa.


- 12 -

Figura 1: Estructura genètica dels retrovirus.

1.1.2 Estudi dels retrovirus

Els virus de la SIDA pertanyen a una família de virus animals, els retrovirus.

Des de fa gairebé 100 anys es té el coneixement de que algun tipus de càncer

d’espècies animals (leucèmies, sarcomes) estan ocasionats per virus (agents

filtrables) provocant això un estímul durant moltes dècades per a la recerca

d’aquests virus pels viròlegs, especialment en la dècada dels 50-60 amb els

avanços en microscòpia electrònica i en la dels 70 amb la demostració de

l’existència de la transcriptasa inversa .

Com a conseqüència d’aquesta recerca es va aïllar en el 1.980 el primer

retrovirus humà descrit, el HTLV-I. Aquest virus ocasiona leucèmia en les

cèl·lules T de l’adult, malaltia que Takastsuki havia observat al Japó i que

presentava una distribució geogràfica que feia pensar en la possibilitat de que fos

causada per un agent transmissible. D’altra banda, el descobriment de la

interleucina 2 (IL-2) o factor de creixement de les cèl·lules T va permetre

mantenir-les en cultiu durant llargs períodes de temps. En el 1.982 es va aïllar

un altre virus relacionat, el HTLV-II, a partir d’un malalt amb leucèmia de

cèl·lules peludes.

Poc després, en el 1.983, l’equip de Montagnier va aïllar un altre retrovirus que

va denominar LAV, a partir d’un gangli limfàtic d’un pacient que presentava una


- 13 -

limfadenopatia persistent generalitzada, i en el 1.984 l’equip de Gall va descobrir

un altre retrovirus que van denominar limfotròpic humà de cèl·lules T i al qual

l’hi corresponia el numeral III (HTLV-III). Posteriorment, es va comprovar que

ambdós virus eren en realitat el mateix, i internacionalment es va acordar

denominar-lo virus de la immunodeficiència humana 1 o VIH-1 per a diferenciar-

lo d’altres retrovirus similars, com el aïllat al 1.986 que es va denominar VIH-2.

En el 1.987 es va descriure un retrovirus associat amb un subgrup de limfomes

cutanis de cèl·lules T, el HTLV-V (prèviament s’havia descrit el HTLV-IV que va

resultar ser una contaminació amb un retrovirus de la immunodeficiència dels

simis i que per tant, no s’accepta com a tal HTLV). En la present dècada s’han

aïllat altres retrovirus associats, possiblement, amb malalties autoimmunes com

la síndrome de Sjögren, la malaltia de Greus, l’esclerosi múltiple o el lupus

eritematós, però la relació etiològica no es coneix perfectament.

A més d’ocasionar malalties en humans i altres animals, encara que no tots ho

fan, són virus importants en biologia molecular, biotecnologia (producció de

ADNc a partir de ARNm) i en experimentació en teràpia genètica i producció

d’animals transgènics.

1.1.3 Classificació dels retrovirus

La seva classificació es basa en l’acció que exerceixen sobre les cèl·lules:

Retrovirus transformats. Grup especial de virus que quan infecten les

cèl·lules, tenen la capacitat d’alterar el seu cicle cel·lular induint el

desenvolupament de tumors. Els millor caracteritzats són els retrovirus, els

quals durant la infecció, integren el seu ADN al genoma de la cèl·lula hoste i

per un procés estrany de recombinació són escindits novament del genoma,

portant amb si un segment del ADN de la cèl·lula hoste. Si aquest segment

conté seqüències reguladores d’un pas crític de la divisió cel·lular, el virus al

infectar altres cèl·lules afectarà aquest procés fent que elles es divideixin

sense control i es generin tumors. Dintre dels oncovirus es troben els virus

Limfotròpics Humans del tipus I i II (HTLV-I i HTLV-II).

• Virus Limotròpic T Humà tipus I ( HTLV-I )


- 14 -

• Virus Limfotròpic T Humà tipus II ( HTLV-II )

• Tipus C dels mamífers

• Tipus C de les aus

• Virus de la Leucèmia Bovina ( BLV )

• Virus de la Leucèmia Felina

Retrovirus citoplasmàtics ( lentivirus ). Produeixen malalties d’evolució

lenta i irreversible amb afectació predominant del sistema immune i del

sistema nerviós. Lentivirus és un gènere de virus de la família Retroviridae,

caracteritzada per un llarg període d' incubació. Els lentivirus poden

incorporar una gran quantitat d’informació en l’ADN de la cèl·lula hoste, el

que constitueix un dels mètodes més eficients de propagació de vectors

vírics. Curiosament, els lentivirus són capaços d’infectar cèl·lules veïnes, en

contacte directe amb la cèl·lula hoste, sense necessitat de generar partícules

extracel·lulars. La família dels lentivirus inclou al virus de la

Immunodeficiència Humana tipus I i II (VIH I i II).

• Virus de la Immunodeficiència Humana tipus I ( VIH-I )

• Virus de la Immunodeficiència Humana tipus II ( VIH-II )

• Virus de la Immunodeficiència del Simis ( SIV )

• Virus de l’ Anèmia Infecciosa Equina ( EIAV )

• Virus de la Artritis i Encefalitis Caprina ( CAEV )

• Virus Visna

• Virus de la Immunodeficiència felina

Retrovirus espumavirus. Trobats pràcticament en totes les espècies.

L’efecte patogen que tenen encara no és conegut.


- 15 -

1.2 El VIH/SIDA

1.2.1 Definició del VIH/SIDA

VIH:

V- Virus- com tots els virus, és incapaç de reproduir-se per si sol. El VIH és

reprodueix només al envair cèl·lules humanes.

I - de Immunodeficiència- l’efecte d’aquest virus és crear un impediment al

funcionament apropiat del sistema immunològic del cos.

H- Humana- el virus només pot ser contret per éssers humans.

El VIH experimenta contínuament mutacions genètiques i pot infectar diferents

tipus de cèl·lules, però, té especial atracció pels limfòcits CD4 i els macròfags

dels teixits. Aquests s’anomenen així per que en la seva paret tenen una proteïna

anomenada CD4 (fa uns anys endarrere T4). Els limfòcits CD4 s’encarreguen de

defensar l’organisme de diferents tipus d’infeccions, especialment d’aquelles en

que els microbis s’introdueixen dintre de les nostres cèl·lules. Generalment, es

tracta d’infeccions latents. El que fan és impedir que els microbis despertin i

provoquin la malaltia. El VIH es troba actiu i es replica constantment; els

limfòcits CD4 lluiten contra aquesta proliferació viral. Es produeix entre ells una

batalla constant i com a resultat a aquesta guerra, el número de limfòcits CD4 va

disminuint progressivament. Al cap de 8-10 anys el número de limfòcits ha

disminuït de tal manera que el pacient pot patir problemes greus i seriosos.

SIDA:

Estat final de la infecció crònica produïda pel retrovirus VIH.

S – Síndrome - conjunt de síndromes i signes.

I – Immuno - relatiu a les defenses del organisme.


- 16 -

D – Deficiència - disminució, reducció.

A – Adquirida - fa referència al caràcter no hereditari. S’adquireix a causa de la

infecció per el virus.

Per altra banda, cal distingir la diferència entre portador i malalt:

Portador: persona infectada pel virus però sense cap manifestació clínica que

es pugui atribuir a la infecció, els nivells d’immunitat es mantenen en l’ interval

de valors normals i poden transmetre el virus a altres persones. Després de varis

anys poden desenvolupar la malaltia.

Malalt: persona en la que la infecció ja ha evolucionat durant anys. El número

de limfòcits CD4 és molt baix i pateixen malalties oportunistes (aquelles que

envaeixen el cos de les persones, que en les seves defenses hi ha poca

resistència a l’entrada d’infeccions o malalties) i tumors com ara el Sacroma de

Kaposi (inicialment, aquest afecta a la pell, produint-se l’aparició de unes taques

vermelloses o púrpures, que poden endurir-se i forma plaques).

1.3 Història i Teories del VIH/SIDA

La era de la sida va començar oficialment el 5 de juny de 1981, quan el “Center

for Disease Control and Prevention” (Centre per a la prevenció i control de

malalties) d' Estats Units va convocar una conferència de premsa on va descriure

cinc casos de pneumònia per Pneumocystis carinii a Los Àngeles . Al mes següent

es van constatar diversos casos de sarcoma de Kaposi, un tipus de càncer de

pell. Les primeres constatacions d’aquests casos van ser realitzades pel Dr.

Michael Gottlieb de San Francisco.


- 17 -

Malgrat que els metges coneixien tant la pneumònia per Pneumocystis carinii

com el sarcoma de Kaposi, l’aparició conjunta del tots dos en diversos pacients

els va cridar l' atenció. La majoria d’aquests pacients eren homes homosexuals

sexualment actius, molts dels quals també patien altres malalties cròniques que

més tard es van identificar com infeccions oportunistes. Les proves sanguínies

que se’ls hi va fer en aquests pacients van mostrar que mancaven del nombre

adequat d’un tipus de cèl·lules sanguínies anomenades T CD4+. La majoria

d’aquests pacients van morir en pocs mesos.

Per l’aparició d’unes taques de color rosat en el cos del infectat, la premsa va

començar a cridar a la sida «pesta rosa», a causa d’això es va confondre, i se li

va atribuir als homosexuals; tot i que al cap de poc temps es van donar compte

de que també la patien els immigrants haitians en EUA, els usuaris de drogues

injectables, els receptors de transfusions sanguínies i les dones heterosexuals. La

nova malaltia va ser batejada, oficialment en el 1982, com a Adquired Immune

Deficiency Syndrome (AIDS).

Fins el 1.984 es van sostenir diferents teories sobre la possible causa de la sida.

La teoria amb més suport plantejava que la sida era causat per un virus.

L’evidència que donava suport aquesta teoria era, bàsicament, epidemiològica.

En el 1.983 un grup de nou homes homosexuals amb sida de Los Àngeles, que

havien tingut parelles sexuals en comú, incloent a altre home a Nova York que

va mantenir relacions sexuals amb tres d’ells, van servir com base per a establir

un patró de contagi típic de les malalties infeccioses.

Altres teories suggereixen que la sida sorgeix a causa de l' excessiu ús de

drogues i de l’alta activitat sexual amb diferents parelles. També es va plantejar

que la inoculació de semen en el recte durant el sexe anal combinat amb l’ús de

inhalants amb nitrit (poppers), produïa supressió del sistema immune. Pocs

especialistes van acceptar aquesta teoria, encara que algunes persones encara la

promouen i neguen que el sida sigui producte de la infecció del VIH.

La teoria més reconeguda actualment, sosté que el VIH prové d’un virus

anomenat virus d’immunodeficiència en simis (SIV, en anglès), el qual és idèntic

al VIH i causa símptomes similars a la sida en altres primats. Aquest virus hauria

estat transmès a la població humana a Àfrica durant uns experiments amb


- 18 -

vacunes contra la polio en pobladors africans. També es creia que l’arribada de el

sida al món occidental era atribuïble a un home que va rebre el nom del «pacient

zero», un assistent de vol canadenc que hauria practicat el sexe amb més de mil

homes en diferents parts del món. Aquesta teoria, que fins i tot va ser plasmada

en una pel·lícula, és falsa.

En el 1984, dos científics, el Dr. Robert Gall als Estats Units i el professor Luc

Montagnier a França, van aïllar de forma independent el virus que causava el

sida. Després d’una llarga disputa, van accedir a compartir el crèdit pel

descobriment; el virus va ser denominat Virus d' Immunodeficiència Humana

(VIH) en 1986. El descobriment del virus va permetre el desenvolupament d’un

anticòs, el qual es va començar a utilitzar per a identificar dintre dels grups de

risc als infectats. També va permetre començar investigacions sobre possibles

tractaments i una vacuna.

En aquests temps les víctimes del sida eren aïllades per la comunitat, els amics i

fins i tot la família. Els nens que tenien sida no eren acceptats a les escoles a

causa de les protestes dels pares d’altres nens. La gent temia acostar-se als

infectats ja que pensaven que el VIH podia contagiar-se per un contacte casual

com donar la mà, abraçar-se, fer-se petons o compartir utensilis amb un

infectat.

Al principi, la comunitat homosexual va ser culpada de l’aparició i posterior

expansió del sida a Occident. Fins i tot, alguns grups religiosos van arribar a dir

que el sida era un càstig de Déu als homosexuals (aquesta creença encara és

popular entre certes minories de creients cristians i musulmans). Uns altres

assenyalen que l’estil de vida «depravat» dels homosexuals era responsable de

la malaltia. Tot i que és veritat que al principi la infecció es va expandir a través

de les comunitats homosexuals i això era causat , en part, perquè en aquells

temps no era comú l’ús del preservatiu entre homosexuals, ja que el condó es

considerava només un mètode anticonceptiu.

El sida va poder expandir-se ràpidament al concentrar-se l’atenció només en els

homosexuals, això va contribuir que la malaltia s’estengués sense control entre

heterosexuals, particularment a Àfrica, el Carib i després a Àsia.


- 19 -

Gràcies a la disponibilitat de tractament antirretrovirals, les persones amb VIH

poden dur una vida normal, la corresponent a una malaltia crònica, sense les

infeccions oportunistes característiques del sida no tractat. Els antirretrovirals

estan disponibles majoritàriament en els països desenvolupats. La seva

disponibilitat en els països en desenvolupament està creixent, sobretot a Amèrica

Llatina; però a Àfrica, Àsia i Europa Oriental moltes persones encara no tenen

accés a aquests medicaments, és per això que desenvolupen les infeccions

oportunistes i moren alguns anys després de la seroconversió.

1.4 Tipus de VIH

Es tracta d’un virus de tipus citopàtic amb un ARN de dues cadenes, que es

caracteritza per presentar una gran variabilitat genètica i per produir una

malaltia lenta i irreversible, afectant als sistemes immunològic i nerviós.

Actualment, es coneixen dos tipus de VIH: VIH-I i VIH- II. El VIH-I es manifesta

a tot el món i el VIH-II principalment a l’ Àfrica i països amb llaços històrics i

comercials en aquesta regió, tot i que s’han trobat casos aïllats en els EUA,

principalment en individus amb viatges a zones d’alta prevalença. Tots dos

ocasionen una malaltia clínicament indistingible, però si que es diferencien en la

seqüència de ARN i en la seva virulència. Els genomes del VIH-I i VIH-II

s’assemblen en només un 40-50% en la seqüència del seu ARN. El VIH-II

presenta una homologia del 75% amb el Virus de la Immunodeficiència dels

Simis ( SIV ).


- 20 -

1.5 Estructura general del VIH

El virió del VIH és una partícula esfèrica amb diàmetre de 80-110nm. Té un nucli

de material genètic rodejat per una capa protectora anomenada càpside. Es

poden considera 3 capes concèntriques.

La càpside interna és la càpside o core. Està formada per la proteïna p24 o p25 i

té forma de con troncat. En el seu interior es troba el ARN viral (àcid ribonucleic)

i les enzimes virals: transcriptasa inversa (RT, p66-p51), integrasa (IN, p34) i

proteasa (PR, p10). El ARN viral està protegit per una nucleocàpsida icosaèdrica

formada per molècules de p7 o p9, que constitueixen la capa intermèdia. La capa

externa o embolcall consta de:

• Una bicapa lipídica derivada de la cèl·lula hoste que conté una altra

concentració de proteïnes cel·lulars.

• Una glicoproteïna (gp120) que s’uneix als receptors DC4, responsables de

la unió del virus a la cèl·lula.

• Una glicoproteïna (gp41), que es troba a la bicapa lipídica i serveix

d’àncora per la gp120.

• Una proteïna p17, també anomenada p18, que es troba a la part interna

de la membrana i sembla tenir una gran importància durant la integració.

Figura 2: Esquema del VIH.


- 21 -

1.5.1 Genoma del VIH-1

El genoma del VIH-1 és un ARN de cadena única constituït per 2 brins idèntiques

de 9,8 kb i de polaritat positiva que posseeix diferents gens encarregats de

codificar diferents proteïnes.

Existeixen gens encarregats de codificar els components de la partícula vírica

(gens estructurals) i de regular l’expressió dels mateixos (gens reguladors).

Els tres gens principals, que codifiquen les proteïnes respectives corresponents

als antígens interns, són comuns a tots els retrovirus i són els que es denominen

gag (de grup), pol (polimerases) i env (embolcall). Dels gens estructurals el

gen gag codifica les proteïnes del core; el gen pol codifica, fonamentalment, els

enzims com la transcriptasa inversa i la proteasa, i el gen env les proteïnes de

l’embolcall víric.

Entre les funcions principals del gag es troba la de constituir la major part de

l’estructura del virió participant en la síntesi de ADN i la seva integració, a més

de contribuir en l’acoblament de les partícules víriques i la seva sortida de la

cèl·lula. El pol participa en la síntesi de ADN i la seva integració en el genoma

cel·lular, mentre que el env participa en l’associació i entrada del virus en la

cèl·lula pel que es considera com l’antigen d’entrada.

En contraposició amb altres retrovirus, com els HTLV que només posseeixen tres,

els VIH posseeixen almenys 7 gens reguladors que entre altres funcions tenen la

d’expressar el material genètic viral integrat en la cèl·lula, el que els uneix d’una

manera important amb la latència del virus en aquesta. Entre les proteïnes

reguladores les més importants són les Tat i Rev que són essencials per a la

replicació del virus; la Tat actua com transactivadora de totes les proteïnes i la

Rev com processadora del ARNm i el seu transport selectiu en el citoplasma. En

general, els gens reguladors tenen el mateix nom que la proteïna que codifiquen,

el gen s’escriu amb minúscules (per ex. tat) i la proteïna amb la primera lletra en

majúscula (Tat). Entre els altres gens estructurals el vpr actua com accelerador

del cicle de replicació; el nef es pensa que pot tenir una acció reguladora

negativa i fer un paper no molt ben conegut en la patogenicitat del virus; el vif

s’associa a la infecciositat dels virions extracel·lulars i no és essencial per a la


- 22 -

replicació; el vpn pot facilitar la sortida dels virions i reduir la formació de sincitis

i està relacionat amb la mort dels CD4, i el tev que és activador dels tat i rev.

En la taula adjunta es recullen d’una manera resumida els principals gens del VIH

i funcions de les proteïnes que codifiquen.

Gen Proteïna Funció

gp160 Precursor

gp120 Proteïna de l’embolcall

gp41 Interacció amb receptors i correceptors.

Fusió de membranes

p55 Precursor

p24 Proteïna de la nucleocàpsida

p17 Proteïna de la matriu

p9 Ribonucleoproteïnes associades al ARN viral.

p6

Transcriptasa inversa

Retrotranscripció del genoma viral

Integrasa Activitat RNAsa H

Proteasa Integració del genoma viral retrotranscrit

Processament de les proteïnes virals que formen l’ estructura del virió.

Tat Tat Transactivació

Rev Rev Regulació del transport i processament d’ARN

Nef Nef Retrotranscripció. Infectivitat

Vif Vif Infectivitat viral

Vpr Vpr Transactivador

Vpu Vpu Alliberació de virions

Tev Tev Activador tat i rev

Env

Gag

Pol

Taula 1: Principals gens del VIH i funcions de les proteïnes que codifiquen.

En la forma de provirus el genoma del VIH està limitat per les anomenades

seqüències repetitives llargues (LTR) que li permeten la integració en el genoma

de la cèl·lula hoste. Un dels principals elements que intervenen en la regulació de

la inducció és l’anomena’t factor nuclear kappa beta (NF-kB), que són una família

de proteïnes que regulen la transcripció de diversos gens cel·lulars implicats en

els processos d’activació i reconeixement immunes. Aquest factor no existeix en

forma activa en els limfòcits CD4 en repòs i és induït només en els processos

d’activació immune.


- 23 -

Figura 3: Esquema del genoma del VIH.

1.6 Estructura general de les cèl·lules T

Les cèl·lules T tenen un nucli que conté material genètic en forma de ADN (àcid

desoxiribonucleic). L’ADN conté tota la informació necessària per al

funcionament de la cèl·lula. Una part important és el receptor CD4 que es tracta

d’una proteïna de superfície de la cèl·lula T. L’antigen gp120 del virus és la

imatge idèntica del CD4. Quan el VIH xoca amb una cèl·lula T, el gp120 del virus

es connecta al receptor CD4 de la cèl·lula T. Per això, el CD4 s’anomena punt

receptor del VIH.

La diferència entre l’ARN i l’ADN és que el primer és un sol fil de material genètic

i el segon és un doble fil.

1.7 El VIH-1

Una de les característiques fonamentals del VIH-1, és la seva variabilitat

genètica.


- 24 -

1.7.1 Tipus de VIH-1

Aquest virus inclou tres grups: M (major), N (nou) i O (outlier) que difereixen

entre elles en un 35 %. El grup M es divideix en 10 subtipus diferents des del

punt de vista genètic: A, B, C, D, E, F, G, H, I i J i és el més freqüent. Cada un

d’aquests subtipus pot diferir en propietats biològiques.

1.7.2 Mecanisme d’acció del VIH-1

Són quatre les fases en que es pot dividir el mecanisme d’acció: FIXACIÓ,

INTEGRACIÓ, LATÈNCIA i ACTIVACIÓ.

En la fixació, el VIH-1 s’uneix al receptor CD4 dels limfòcits CD4 mitjançant la

seva proteïna gp120. En la integració, el virus penetra dins la cèl·lula. L’ARN del

virus ha d’entrar al nucli de la cèl·lula, però, per a que això passi, ha de tenir lloc

una transformació important. El ARN per entrar i poder llegir el nucli ha de

convertir-se en ADN de doble fil i, és la transcriptasa inversa la que permet a

l’ARN agafar material de la cèl·lula i escriure al revés un doble fil d’ADN. A la

latència, el virus en forma d’ADN present en el genoma cel·lular queda inactiu,

sense capacitat de síntesi d’antígens virals. En la fase d’activació, és quan el

virus es replica donant lloc a noves partícules virals. A partir d’aquí, si la cèl·lula

T és activada, no funcionarà com és degut, sinó com a una fàbrica de nous virus.

Aquestes partícules surten de la cèl·lula per gemmació a la vegada que

destrueixen limfòcits CD4.

1.7.3 Passos del cicle vital del VIH-1 i possibilitats terapèutiques

d’intervenció

Els passos de la replicació del virus i possibilitats d’intervenció són:


- 25 -

Pas 1. ACOPLAMENT I FUSIÓ DE LA MEMBRANA

S’ha de produir una fusió entre la membrana viral i la cel·lular. Una cop el virus

està a prop d’un limfòcit CD4, el VIH reconeix la molècula receptora CD4 i s’uneix

a ella a través de la seva glicoproteïna d’embolcall Env o gp160, formada per 2

subunitats: la gp120 (proteïna recoberta de sucres que interactua amb el

receptor CD4) i la gp41 (proteïna que ancla la gp120 a la membrana). Només les

cèl·lules que presenten aquest receptor CD4 en la seva superfície poden ser

infectades per el VIH.

El receptor específic és la molècula CD4. Per tant, el VIH té proteïnes que

atrauen als receptors superficials i es filtra amb les seves glicoproteïnes (gp) de

superfície, permetent la unió gp120-CD4 als limfòcits o la gp120-fusina a les

cèl·lules del “epiteli rectal” .

Una vegada unides les proteïnes CD4 i gp120, es produeix la fusió de les

membranes. Com a resultat, el virió perd la seva integritat i la seva morfologia

característica. L’ARN genòmic dintre del centre viral, que inclou la transcriptasa

inversa, és alliberat cap al citoplasma. Aquests procés rep el nom de “uncoating”

o procés de “despullament viral”, en que el virus perd el seu embolcall i la seva

membrana nuclear.

S’estan estudiant els inhibidors de fusió. Aquests poden impedir l’acoblament del

virus a les cèl·lules humanes. Es pensa que l’existència al virió o partícula viral

d’alguns enzims com la ciclofilina, permet la interacció amb les proteïnes de la

càpside facilitant el despullament viral, per això, s’han assajats derivats de la

cicloserina A sense acció immunosupressora, que exerceixen acció contra la

ciclofilina, com a possibles antirretrovirals.

Pas 2. TRANSCRIPCIÓ INVERSA

La síntesi d’ADN víric comença en el citoplasma. Primer, es produeix una cadena

negativa degut a l’acció de la transcriptasa inversa, i abans de que es completi,

s’inicia la síntesis de la cadena d’ADN positiva. Quan es completa la síntesis de la

cadena negativa, la part d’ARN que encara està lligada al ADN és degradada per

la ARNasa H.


- 26 -

La transcriptasa inversa és l’enzima fonamental per aquest procés. Aquesta

enzima, està codificada per el gen pol (enzima multi funcional) en la que cada

funció es du a terme per parts independents de la enzima, amb les activitats:

• ADN polimerasa ARN- dependent: sintetitza una cadena d’ADN positiva

complementaria del motlle, com extensió del ARNt unit al motlle que

funciona com a cebador.

• ADN polimerasa ADN- depenent: construeix una cadena d’ADN positiva

complementaria de la cadena recent produïda, donant lloc a un hèlix

d’ADN bicaternaria.

• ARNasa H: degrada la cadena d’ARN a híbrids ARN-ADN, deixant un

oligonucleòtid com a cebador per a la síntesis de la cadena d’ADN positiva

i, escriu el ARNt cebador.

• Integrasa: integra l’ADN víric bicaternari en ADN cel·lular.

Aquesta transcriptasa es pot bloquejar, ja que el nou ADN compost per

nucleòsids pot incorporar nucleòsids anàlegs als que els falten propietats

bioquímiques concretes per conduir la síntesi de l’ADN. De manera que, amb la

administració d’inhibidors de transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids (NTRIs)

i no nucleòsids (NNTRIs) es poden intervenir una nova classe d’inhibidors

nucleòsids de la transcriptasa inversa (NTRIs) que afectaria al procés de

transcripció.

Pas 3. INTEGRACIÓ

Una vegada format l’ADN viral, es dirigeix al nucli de la cèl·lula, on l’enzima viral

integrasa pot ocultar-ho al citoplasma de la cèl·lula sense integrar-se dins del

genoma cel·lular (estat de latència). Així, quan la cèl·lula intenta crear noves

proteïnes, forma també ADN viral.

La integració de l’ADN al genoma cel·lular, pot dependre de l’estat d’activació de

la cèl·lula. L’activació cel·lular pot ser deguda per antígens, miògens, citoquines

o virus heteròlegs.

La integració es pot bloquejar amb inhibidors de la integrasa.


- 27 -

Passos 4 i 5. TRANSCRIPCIÓ I TRADUCCIÓ.

La transcripció suposa la síntesis d’ARN viral a partir d’ADN pro viral integrat en

la cèl·lula. Els filaments de l’ADN viral es separen i els enzims especials creen un

filament complementari del material genètic anomenat ARNm. Si el procés de

replicació viral segueix, l’ARNm passa per a que es processi finalment a filament i

es creen cadenes de proteïnes.

La transcripció es pot bloquejar amb inhibidors de transcripció, una altre nova

classe de medicaments contra el SIDA que es troben en una primera fase

d’investigació.

Pas 6. ENSAMLLADURA VIRAL o ASSEMBLING Y BUDDING: síntesis de proteïnes

en virus complet.

L’ ensamblatge del core es dóna en la membrana cel·lular i sembla començar

amb l’associació de la proteïna p17 de la matriu amb el domini citoplasmàtic de

la proteïna gp41. La síntesi de proteïnes d’embolcall del virus, es produeix en la

retícula endoplasmàtica de la cèl·lula a partir de la gp160; aquesta és

hidrolitzada per una proteasa a l’aparell de Golgi per produir gp120 i gp41 abans

de transportar-les a la superfície de la cèl·lula. El virió madur està compost per

una membrana, que inclou les proteïnes que no són empaquetades en els virons

i només actuen en els passos que precedeixen a l’alliberament dels virons. Una

vegada muntades les noves partícules virals, aquestes passaran a formar noves

cèl·lules infectades. Cada cèl·lula infectada podrà produir nous virus.

El procediment es dur a terme mitjançant una proteasa vírica i aquest procés es

pot evitar amb inhibidors de proteasa (IPs).

Pas 7. SORTIDA DE VIRONS.

Una vegada el virió és madur, aquest es desprèn de la cèl·lula hoste quedant

lliure. La vida lliure dels virons és molt curta, és d’ aproximadament 0,3-0,5 dies,

és a dir, de 8 a 12 hores, i que en 2,6 dies (52 hores) es realitza el cicle viral


- 28 -

complet amb la sortida des de la cèl·lula infectada, infecció productiva, infecció

d’un altre limfòcit, replicació i sortida de nous virons.

S’ha d’actuar durant la replicació ja que quan aquesta fase es completa, no hi ha

forma de parar la infecció.

Pas 8 i 9. GERMINACIÓ I ALLIBERACIÓ DEL VIRUS IMMADUR.

Un virus immadur brota de la cèl·lula emportant-se part de la membrana

cel·lular.

El virus immadur s’allibera de la cèl·lula infectada.

Pas 10. MADURACIÓ O SPLICING.

Les cadenes de proteïnes de la nova partícula viral són tallades per l’enzim

proteasa en proteïnes individuals que es combinen per formar un virus funcional.

1.7.4 Esquema del cicle vital del VIH

Figura 4: Cicle vital del VIH.


- 29 -

1.7.5 Metàfora del tren

La variabilitat en la rapidesa de la progressió de la infecció VIH es pot explicar

al·ludint a la metàfora d’un tren (segons Ho. citant al retroviròleg Coffin).

En ella, la infecció VIH és el propi tren, la quantitat de virus que existeix (càrrega

viral) és la velocitat que porta el tren i els rails que composen el trajecte són els

limfòcits CD4 que té el pacient. L’estació final és el desenvolupament del SIDA

cap a la que el tren avança, però, necessitarà un temps per a recorre to el

trajecte.

A similitud de limfòcits CD4, el temps dependrà de la quantitat de virus

(velocitat) i per tant, quan més baixa sigui més temps tardarà en recorre’l; si la

càrrega viral és indetectable, la velocitat del tren serà pràcticament nul·la, però

fins ara només es coneix que el tren no para del tot, sembla com si existís una

lleugera pendent cap avall i és per això que no arriba a frenar.

Quan la càrrega viral sigui similar, el temps depèn de la distància que hagi de

recorre. Si el sistema immunitari esta conservat, el trajecte és molt llarg, li

costarà més temps arribar al destí, però, conforme la xifra de CD4 cau, el

recorregut és menor i a igual velocitat, el temps utilitzat en recorre’l serà menor.

La xifra de Limfòcits CD4 es redueix entre 50-80 cèl·lules/mm3 al any tot i que

diversos factors, per exemple, la presència de cepes inductores de sincitio, poden

ocasionar pèrdues majors amb càrrega viral relativament estable.

El punt de partida d’aquest tren el constitueix la primoinfeccó; si aquesta és

simptomàtica en general es pensa que els valors de virèmia seran

moderadament elevats i es mantindran en els períodes posteriors en absència de

tractament.

Si acceptem aquesta metàfora del tren podem comprendre les guies actuals de

tractament antirretroviral: tractar lo més aviat possible i lo més dur possible.

Així, es redueix la replicació viral a nivells baixos a la vegada que preservem el

sistema immunitari (en la metàfora, disminuïm la velocitat del tren i augmentem


- 30 -

el trajecte a recorre; queda per saber si arribem a una infecció crònica, a la

curació o què pot passar en estacions intermèdies).

1.7.6 El VIH-2

Igual que el VIH-1, el VIH-2 és un lentivirus. El seu genoma està compost per 2

cadenes simples de ARN de polaritat positiva, i també conté l' enzim RT, qui

permet la integració del material genètic del virus, com a forma de provirus en el

genoma de la cèl·lula que infecta, que són generalment els limfòcits T CD4+.

Comparteix amb el VIH-1 un 40-50% de homologia genètica, el que fa necessari

disposar de tècniques de biologia molecular específiques per a diagnosticar la

infecció per VIH-2. El mecanisme de transmissió és igual que el VIH-1.

1.8 Transmissió del VIH

Fluids infecciosos:

El VIH es transmet d’una persona infectada a una altre no infectada a través dels

següents fluids:

• Sang (conté la concentració més alta de virus)

• Semen

• Secrecions vaginals

• De la mare al fill a través de la llet materna

• Fluid pre-jaculatori

No es pot afirmar amb seguretat que el fluid pre-jaculatori transmeti el VIH ja

que aquest no prové dels testicles sinó de les glàndules seminals. No obstant,


- 31 -

aquest fluid pot contenir petites quantitats de semen i glòbuls blancs que aquests

si que poden transmetre el VIH.

El VIH no es pot transmetre mitjançant:

• Saliva

• Llàgrimes

• Orina

Vies de Transmissió:

Pot succeir principalment de tres formes:

• sexe sense protecció

• per contacte sanguini directe

• de la mare al fill (abans o durant el naixement, o a través de la llet

materna)

El VIH pot infectar al organisme per ferides obertes o al infectar directament les

membranes mucoses.

Rutes sexuals de transmissió:

• Coit sexual anal o vaginal: el VIH pot infectar les membranes mucoses

directament o per ferides.

• Sexe oral

Algunes pràctiques sexuals segons el seu risc:

- Risc molt alt:

Penetració vaginal

Penetració anal

- Risc possible:


- 32 -

Fellaico ( buco-genitals )

Cunnuillingus ( buco-genitals )

- Absència de risc:

Carícies i petons íntims en la boca

Masturbació recíproca

Transmissió No sexual:

• Compartir xeringues: pràctica habitual entre toxicòmans.

• De mare a fill: hi ha dos vies de contagi entre mare i fill. Per una banda, al

entrar el fetus en contacte amb la sang de la mare a través de la placenta.

I l’altre via és al amamantar el fill amb la llet materna que pot o no estar

infectada per el virus.

• Inseminació artificial.

Principals manifestacions són:

• Augment del volum dels ganglis, dura més de tres mesos, en diferents

llocs del cos.

• Pèrdua de pes superior al 10% del pes corporal

• Febre

• Suor nocturna

• Forma greu de herpes

• Diarrea persistent


- 33 -

1.9 Evolució de la infecció

La infecció del VIH es caracteritza per quatre fases:

• Primoinfecció (Estadi 1): Fase de propagació del virus. A les poques

setmanes de l’entrada del virus en l’organisme, aquest comença a fabricar

anticossos que es fan detectables de 3 a 6 mesos després de la infecció.

Apareixen símptomes semblants als de la mononucleosis i a vegades,

també es poden detectar símptomes semblants als de la grip en el dies

posteriors al contagi.

• Fase latent: la seva duració pot anar de mesos a anys. La mitja

estadística és de 8-10 anys per els adults i de mesos a setmanes en la

infecció prenatal. El organisme durant varis anys roman en una situació

d’aparent equilibri, sense símptomes. Es poden detectar anticossos

específics contra el VIH a partir de la tercera setmana.

• Complex pre-SIDA (Estadi 2): resultat de la continuada destrucció dels

limfòcits CD4 cooperadors i la proliferació del sistema limfàtic, com a

mecanisme compensador. Els limfòcits CD4 disminueixen en sang,

produint-se una debilitació molt a poc a poc de les defenses.

• SIDA avançat (Estadi 3): el 50% o més de les persones infectades el

desenvolupa. Aquestes presenten diferents símptomes com els comentats

anteriorment i a més a més, també apareixen les malalties oportunistes i

tumors.


- 34 -

Gràfica 1: Curs típic de la infecció per VIH. En blau, evolució del recompte de limfòcits T CD4+. En vermell, evolució de la càrrega viral.

Durant l’etapa asimptomàtica, cada dia es produeixen diversos milers de milions

de virus VIH, la qual cosa s’acompanya d’una disminució de les cèl·lules T CD4+.

El virus no només es troba en la sang, sinó en tot el cos, particularment en els

ganglis limfàtics, el cervell i les secrecions genitals.

El temps que demora el diagnòstic de sida des de la infecció inicial del virus VIH

és variable. Alguns pacients desenvolupen algun símptoma de immunosupressió

molts pocs mesos després d’haver estat infectats, mentre que uns altres es

mantenen asimptomàtics fins a 20 anys.

La raó per la qual alguns pacients no desenvolupen la malaltia i per que hi ha

tanta variabilitat interpersonal en l’avanç de la malaltia, encara és objecte

d’estudi. El temps, terme mitjà entre la infecció inicial i el desenvolupament del

sida, varia entre vuit a deu anys en absència de tractament.

1.9.1 El sistema immunitari i el VIH

La interacció entre el VIH i el organisme és enormement complexa i no coneguda

perfectament a nivell dels mecanismes immunopatogènics de la infecció. El VIH

ocasiona un quadre paradoxal ja que junt a la destrucció massiva i mantinguda


- 35 -

de limfòcits CD4 ocasiona fenòmens d’activació limfocitària (activació de limfòcits

B, de limfòcits CD8+, producció anormal de mesuradors solubles, etc.) en tots

els estadis evolutius de la infecció.

El VIH infecta fonamentalment a les cèl·lules T CD4 que són essencials en la

resposta immunitària i a més, presenta estratègies de fuga que actuen amb

gran eficàcia (variabilitat genètica, latència – reactivació, etc.).

Es sap que la destrucció dels limfòcits no explica de manera satisfactòria la

immunodeficiència que es planteja des dels moments inicials de la malaltia i tot i

que la presència de fenòmens com la interferència en la presentació d’antígens,

activació limfoide per productes del virus o la producció anormal de citoquines

són altres mecanismes que poden contribuir al deteriorament del sistema

immunitari (SI), en l’actualitat es desconeix la totalitat dels mecanismes

immunopatogènics que condueixen a la immunodeficiència severa del SIDA.

“In vivo” el VIH té dos cèl·lules diana principals: els limfòcits CD4 i els macròfags

dels teixits. Els CD4 de sang perifèrica es troben infectats en una proporció petita

mentre que en els ganglis limfàtics existeix una alta proporció de cèl·lules

infectades, tot i que, només una part mínima replica activament el genoma

proviral que conté. Aquesta petita proporció de CD4 infectats donaria lloc a la

producció diària de 1010 virions que ocasionaria la destrucció de 108 CD4 cada 36

hores per un efecte citopàtic directe i la infecció d’un número similar de cèl·lules,

especialment limfòcits destinats a restituir els limfòcits destruïts. El percentatge

de macròfags infectats és baix, s’estima que en els òrgans limfoides pot oscil·lar

entre 1/15.000 a 1/100.000. El VIH combina per tant, la presència de formes

latents del virus en els CD4 i macròfags (ja que una cèl·lula infectada latentment

escapa sempre a la vigilància del SI perquè no expressa productes virals en la

seva membrana) i la reactivació cel·lular probablement en el context d’una

resposta immunitària que produeix les proteïnes necessàries per a iniciar la

transcripció del genoma viral. En general, durant l’evolució de la infecció durant

la fase primària s’assisteix a una alta replicació en la que la resposta immune

encara no s’ha constituït i per tant, no existeix cap control immunològic; en la

fase de cronicitat existeix una resposta immune eficaç possiblement tant

humoral (clàssicament s’ha considerat que la existència d’anticossos

neutralitzadors és l’element protector per excel·lència davant a la infecció per


- 36 -

VIH) com a cel·lular, en la que els limfòcits CD8+ juguen un paper important no

només com a cèl·lules T citotòxiques sinó amb la producció de diferents

quimioquines, però, aquesta resposta no és capaç d’eradicar al VIH del

organisme i la persistència de la replicació viral, encara a baix nivell, condueix a

un esgotament de la capacitat de regeneració del SI que és progressivament

destruït; en la fase final, com en la primoinfecció, no existeix control

immunològic.

Des d’una visió merament descriptiva davant al VIH es produeix una resposta

humoral i una resposta cel·lular, ambdues amb efectors específics i inespecífics.

La infecció VIH indueix una resposta intensa d’Ac (immunitat humoral específica)

davant a les proteïnes estructurals i regulador del virus. Alguns dels Ac tenen

caràcter neutralitzant i es pensa que podrien exercir un efecte protector davant a

l’evolució progressiva de la malaltia (Ac front gp41 i gp120), però, en

contraposició, també s’han descrit Ac davant a la embolcall del VIH que tindrien

la missió de facilitar els seus fagocitosis per les cèl·lules del sistema monocito-

macròfag lo que pedagògicament contribueix a afavorir la infecció dels macròfags

i facilitar la infecció de noves cèl·lules per el VIH. Inespecíficament es produeix

complements i interferons que poden afavorir la inhibició del VIH. Des del punt

de vista de la resposta cel·lular en els pacients seropositius existeix una forta

expansió clonal de limfòcits T CD8+ amb activitat citotòxica dirigida davant a

proteïnes estructurals i reguladores del VIH, especialment davant a les proteïnes

del core viral; per tant, la resposta cel·lular específica és citotòxica (CTL) a

càrrec dels CD8+ mentre que la inespecífica també tenen aquell caràcter de

citotoxicitat però és mesurada per CMCDA (citotoxicitat cel·lular dependent de

Ac) i per cèl·lules Nk. A més, es produeixen diferents factors solubles, com

algunes quimioquines, amb activitat supressora CD8.

D’aquest manera, després del contacte amb el VIH la evolució de la resposta

immune es tradueix en la producció d’Ac específics detectables a les 4-12

setmanes de la exposició i una activitat citotòxica dels CD8+ que tot i que frenen

la replicació del VIH no són capaços de contenir-la en la seva totalitat;

probablement tant la resposta humoral com la cel·lular col·laboren en aquest

control de la infecció, però, les dades immunològiques que es tenen suggereixen

que la resposta cel·lular dels limfòcits CD8+ davant al VIH es produeix de forma

més precoç i és més eficaç enfront al virus que la producció d’Ac, a més el efecte


- 37 -

antiviril dels CD8+ no es deu només a un fenomen de citotoxicitat específica ja

que la intervenció inhibidora de certes quimioquines tindrien un efecte

competidor amb els cor receptors cel·lulars del VIH; malgrat tot, el procés que es

pugui prolongar durant anys arriba a un final de la infecció en el que decreixen

els Ac neutralitzadors i la activitat i el número dels CD8.

1.9.2 Infeccions oportunistes i SIDA

Des de que s’adquireix el VIH transcorren uns quants anys abans de que

comencin a aparèixer complicacions o quadres clínics, molts dels quals són de

naturalesa infecciosa, és a dir, produïts per microorganismes, ja siguin bactèries,

paràsits, fongs o virus. Estiguin o no incloses entre les situacions clíniques

diagnosticades de SIDA, les infeccions són el reflexa del deteriorament del

sistema immunitari del pacient VIH+.

Entre els marcadors biològics de progressió, el recompte de limfòcits CD4 en

sang perifèrica “mesura” de manera aproximada el estat immunitari i es

correlaciona amb el risc infecciós del pacient. En la gràfica es pot observar

aquesta associació.

Les infeccions oportunistes en els pacients VIH+ poden tenir el seu origen en:


- 38 -

- Reactivació d’una infecció latent adquirida abans. És la causa més freqüent.

En la majoria dels casos la primoinfecció va se asimptomàtica. Estan

produïdes per microorganismes intracel·lulars com la M. Tuverculosis,

T.gondii, P. Carinii i virus del grup herpes.

- Infecció exògena. Es pot adquirir infeccions per els mateixos mecanismes que

en el hoste immunocompetent. S’adquireixen, per exemple, per via digestiva

les infeccions per Isospora belli i Cryptosporidium, i per via respiratòria la

criptococosis.

- Sobre creixement de microorganismes saprogits de la pell i les mucoses. La

candidiasis oral, esofàgica i vaginal és el exponent més característic d’aquest

mecanisme.

Poden existir factors exògens determinants de les infeccions. Certes infeccions

s’associen amb més freqüència amb el hàbits d’alguns grups de pacient VIH+;

per exemple, les endocarditis amb els que consumeixen drogues parenterals, la

tuberculosis amb els que estan a les presons i la infecció per Cytomegalovirus

amb el barons homosexuals. Moltes vegades responen a les peculiaritats de

l’àrea geogràfica on viu el pacient o on hagi viscut o viatjat.

Les manifestacions clíniques de les infeccions oportunistes en el SIDA tenen

sovint una presentació atípica, amb freqüència pateixen disseminació, poden ser

molt virulentes, moltes vegades coexisteixen varies infeccions i algunes d’elles

recidiven.

La resposta al tractament de la fase aguda d’aquestes infeccions acostuma a ser

bona; no obstant, donat que pot persistir una immunodepressió cel·lular

profunda i degut a les característiques d’aquest tipus de microorganismes, la

taxa de recidives és alta i això obliga, en general, a efectuar un tractament de

manteniment de per vida. La gravetat i importància de les infeccions

oportunistes en el SIDA queda remarcada per el fet de que a prop del 90% de les

morts en el SIDA es poden atribuir a elles.


- 39 -

1.10 Inhibidors del VIH/SIDA

Inhibidors que actualment poden fer front a la infecció del VIH:

ETAPES INHIBIDORS

Unió del VIH a la membrana cel·lular Sulfat de dextrano

Fusió de membranes Hipericina

Entrada del virus al citoplasma cel·lular

Despreniment de l’embolcall proteic

Transcripció inversa Inhibidors de la transcriptasa

Integració del provirus al genoma cel·lular Inhibidors de la integrasa

Període de lactància

Transcripció de ARN missatger Riboenzims

Síntesis de proteïnes virals Inhibidors de la proteasa

Ensamblatges de virions

Sortida del virus Interferó α i β

Virus al corrent sanguini Immunomoduladors

1.11 Epidemiologia del VIH/SIDA

1.11.1 Epidemiologia del SIDA a Europa

La detecció dels primers casos de SIDA a Europa va ser bastant primerenca, tot i

que, avui en dia no és un del continents més afectats. El número de persones


- 40 -

infectades per el VIH a Europa és de uns 510.000 i d’aquests, uns 250.000

adults han desenvolupat la malaltia.

Globalment, la incidència de SIDA és ascendent, tot i que aquests ascens tendeix

a suavitzar -se , el ritme d’ascens es frena.

La infecció per el virus VIH en els països de l’est d’ Europa, és relativament

recent i les seves taxes de incidència de SIDA són baixes. No obstant, els canvis

socials i la depressió econòmica de molts d’aquests països, facilitant la

propagació del VIH.

A Europa, les vies de transmissió més freqüents són:

• Relacions sexuals en barons homosexuals/bisexuals.

• Relacions sexuals en relacions heterosexual.

• Intercanvi de xeringues entre els toxicòmans.

Des de 1990, el número de casos de SIDA deguts a intercanvi de xeringues

superen als deguts a pràctiques homosexuals.

Figura 5: Casos/milió de SIDA a Europa.


- 41 -

1.11.2 Epidemiologia del SIDA a Espanya

Al 1986, totes les comunitats autònomes d’ Espanya havien presentat algun cas

de SIDA. No obstant, les característiques socials i demogràfiques, les diferents

conductes de risc i els diferents instants en que la epidèmia va interrompre en

cada lloc, han provocat diferències geogràfiques en la incidència de la malaltia.

Les comunitats que presenten majors taxes són Madrid, Catalunya, País Basc i

Balears.

CC.AA. TAXA CC.AA. TAXAAndalusia 119,08 Com. Valenciana 104,49Aragó 79,57 Extremadura 86,08Astúries 97,68 Galicia 124,83Balears 224,85 Madrid 281,45Canàries 98,39 Murcia 107,01Cantàbria 102,77 Navarra 129,57Castella i Lleó 102,82 País Basc 204,38Castella La Mancha 69,22 La Rioja 170,72

Catalunya 200,48 Ceuta i Melilla 483,23

Taula 2: Taxes de SIDA per milió d’habitants segons CCAA de residència.

Dintre de la mateixa comunitat autònoma, existeixen diferencies en les taxes

provincials. Les províncies més afectades són Ceuta, Madrid, Balears, Alava,

Biscaia, Barcelona i Girona i totes elles sobrepassen els 200 casos nous per milió

d’habitants.

Figura 6: Epidemiologia del SIDA a Espanya.


- 42 -

Categories de transmissió , edat i sexe:

Gràfica 2: Nous casos anuals segons vies transmissió, edat i sexe.

Com es pot observar en la Gràfica 2, els primers casos de SIDA en persones que

havien rebut transfusions de sang infectades es van diagnosticar al 1983.

El primer cas de transmissió perinatal va aparèixer al 1984 mentre que, el primer

cas per transmissió heterosexual no es va detectar fins el 1985.

Els casos de SIDA en receptors de homoderivats i transfusions sanguínies van

augmentar fins aconseguir les majors xifres en el 1989 i 1991 i des de llavors, el

seu número ha disminuït.

Els casos en nascuts de mare infectada suposen un petit percentatge (menys del

2% del total). A Espanya, aquests casos van augmentar fins arribar a les majors

xifres entre el 1988 i 1991. Des de llavors, el número s’ha estabilitzat i fins i tot

ha començat ha disminuir.

Els casos de SIDA deguts a transmissió per contactes heterosexuals van

aparèixer relativament tard. En el 1994 la transmissió heterosexual es va

convertir en la segona via de transmissió que ha originat més casos de SIDA.

El SIDA a Espanya afecta a una proporció major de homes que de dones. La

explicació d’aquesta situació radica en que el consum de drogues per via


- 43 -

intravenosa és molt més freqüent en homes que en dones i les pràctiques

homosexuals tenen risc quan passen entre barons. Quatre de cada cinc casos de

SIDA s’ha produït en joves entre els 20 i 30 anys.

Gràfica 3: Quantitat d’infectats segons edat.

1.11.3 Evolució de l’epidèmia a Espanya

Gràfica 4: Casos d’infecció per VIH anuals entre 1980 i 1998 a Espanya.


- 44 -

Gràfica 5: Número total de persones infectades per VIH vives entre 1980 i 1998.

Pel que es refereix a la incidència de sida, aquesta xifra també va augmentar

molt en els anys vuitanta a Espanya, i fins i tot fins a mitjans dels anys noranta,

provocant un nombre total acumulat d’afectats vius, creixent i testificant la

renovada necessitat de mesures per a pal·liar la situació.

Afortunadament, com es mostra en la gràfica 6, des de 1996, i sobretot en el

1997, any en que hi va haver una reducció dels nous casos de sida diagnosticats

de gairebé un 30%. Com ja hem vist, l’aparició d’una nova era de medicaments

més actius pel VIH, els antirretrovirals altament actius, i el seu millor ús en

associació, ha afavorit que cada vegada menys persones infectades pel VIH

desenvolupin sida i que les que ho desenvolupen triguin més temps. Aquest

mèrit, sense dubte atribuïble als nous medicaments que van apareixen al 1996,

ha suposat un canvi dràstic en el patró epidemiològic de la malaltia en el seu

conjunt.

Gràfica 6: Diagnòstics de SIDA anuals entre 1980 i 1998 a Espanya.


- 45 -

No obstant això, com es mostra en la gràfica 7, la prevalença de la sida no ha

deixat d’augmentar. Això és degut, fonamentalment, a l’augment de l’esperança

de vida aconseguit amb els nous medicaments antirretrovirals. Encara que cada

vegada menys persones amb VIH desenvolupen sida, de les que ho fan, cada

vegada sobreviuen més persones, pel que el nombre total acumulat de persones

vives amb sida creix any a any.

Gràfica 7: Número total de persones diagnosticades de SIDA vives entre 1980 i 1998 a Espanya.

Respecte a les vies de contagi, a Espanya la primera via de transmissió del VIH,

tant entre els homes com entre les dones, és la utilització de xeringues per a

drogues injectables, seguida de les relacions heterosexuals i, en el cas dels

homes, de les relacions homosexuals, com es mostra en la gràfica 8.

Gràfica 8: Distribució de les vies de transmissió del VIH a Espanya al 1999 per sexe.


- 46 -

1.12 Medicaments antirretrovirals

Les substàncies antirretrovirals disponibles actualment, es basen en dificultar o

impedir l’acció de les enzimes. Permet bloquejar les etapes de la reproducció del

virus que passen dintre de la cèl·lula infectada. Si s’utilitzen substàncies que

bloquegen a una sola de les tres enzimes, el efecte de bloqueig és transitori ja

que no evita del tot la replicació viral, llavors, els virus que poden escapar

acabaran per desenvolupar variables resistents a aquests medicaments. En

canvi, si es combinen dos o tres tipus de substàncies, que bloquegen dos o tres

enzimes, o bé, a una mateixa enzima de dos maneres diferents, les probabilitats

de detenir la reproducció del virus en la cèl·lula infectada són molt altes. De fet,

això és lo que s’aconsegueix actualment amb les combinacions de substàncies,

en la majoria de les persones, en un termini de temps bastant curt (2 o 3

mesos), fent descendir el valor de la càrrega viral en un 99%. L’objectiu és

mantenir els valors de la càrrega viral en aquests mínims durant tot el temps que

es pugui, com a mínim, un any.

Existeixen dos tipus de cèl·lules en lo que es refereix a la velocitat amb la qual,

el virus es reprodueix, les ràpides i les lentes. El estat actual de les coses és que

amb teràpies combinades de tractaments antirretrovirals es pot aconseguir

impedir la reproducció del virus en les cèl·lules ràpides. En canvi, les cèl·lules

lentes, semblant ser més difícils d’arribar per els antirretrovirals actualment

disponibles.

1.13 Umbral de minimització de resistències

antirretrovirals

Referent a la sensibilitat del VIH als efectes de la medicació antirretroviral, es

podria parlar de dos tipus de VIH, el primer és el “ virus silvestre “ que compren


- 47 -

els tipus o mutacions del VIH que no han desenvolupat adaptació als

medicament perquè, o bé, estan en cèl·lules lentes, on la medicació arriba amb

molt menys potència, o bé són virus que estan en una persona que mai ha rebut

tractament, aquests virus són més fàcils de eradicar amb la medicació

antirretroviral si s’aconsegueix que estiguin exposats a ella. I, en segon lloc,

estan els virus que han estat sota els efectes de la medicació, i que són, per

tant, més propicis a desenvolupar resistències a la mateixa.

Els virus que es produeixen en les cèl·lules ràpides han estat sotmeses durant

molt de temps als efectes dels antirretrovirals i mentre major sigui el seu

número, més probabilitat hi ha de que aconsegueixin desenvolupar resistències.

Els virus restants procediran de les cèl·lules de replicació lenta i seran, en la seva

immensa majoria, virus silvestres, de manera que, quan intentin replicar -se en

cèl·lules ràpides, al ser molt més susceptibles als antirretrovirals, serà molt més

difícil tot i que aconsegueixin proliferar; d’aquesta manera, les possibilitats de

que apareguin resistències que facin augmentar de nou la càrrega viral i, per

consegüent, reacceleren la infecció per VIH. A aquesta condició de càrrega viral

molt baixa, menor de 25, se la denomina Umbral de minimització de resistències

virals. Mantenir a una persona en aquestes condicions de les majors garanties

per a que la eficàcia dels antirretrovirals es prolongui durant molt de temps.

1.14 Substàncies antirretrovirals

Inicialment, el tractament pels individus infectats consistia en l' administració

d'un sol fàrmac, però l' aparició de noves soques víriques resistents ha obligat a

substituir la monoteràpia per la combinació de 3 o més fàrmacs coneguda com a

HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy). Com a resultat d' aquesta

implantació, s'ha pogut observar un descens dràstic en la mortalitat dels

pacients.


- 48 -

En l' actualitat es disposa de diferents classes de fàrmacs aprovats per la FDA

(Food and Drug Administration) per a combatre la infecció del VIH.

Aquests fàrmacs antirretrovirals es poden classificar segons la seva estructura i

la enzima vírica a la que inhibeixen. Segons això tenim:

• Inhibidors de la Transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids (NRTIs)

• Inhibidors de la Transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòsids (NNRTIs).

• Inhibidors de la proteasa ( PI).

• Inhibidors de la fusió.

Figura 7: Dianes terapèutiques dels antiretrovirals en les diferents etapes del cicle de

vida del VIH.

1.14.1 Inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids

La primera classe d’agents antirretrovirals que es va desenvolupar van ser els

inhibidors de la transcriptasa invera anàlegs dels nucleosídics.

La transcriptasa inversa és l' enzim responsable per la conversió de la

monocadena d'ARN viral en una doble cadena d'ADN. Degut a la importància

d'aquesta informació i al fet de que no hi participin enzims endògens, la


- 49 -

transcriptasa inversa ha estat una de les principals dianes en el

desenvolupament de fàrmacs contra el VIH.

Figura 8: Mecanisme d' acció dels inhibidors nucleòsids.

Aquests compostos són anàlegs de nucleòsids i es caracteritzen per la manca del

grup hidroxil en la posició 3', de manera que un cop convertits a la forma activa

trifosfat i incorporats a la cadena d'ADN, aturen el procés de polimerització.

Tot i que els NRTIs són capaços de disminuir els nivells d'ARN viral del plasma

fins a quantitats gairebé negligibles, la toxicitat a nivell mitocondrial i

l'emergència de soques de virus resistents són alguns dels inconvenients

associats a aquest tipus de fàrmacs.

Els actuals inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsids són:

Retrivir:

- Nom del compost: zidovudina, azidotimina.

- Abreviatura: AZT, ZDV.

- Tipus de substància: anàleg de timidina.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: 60% en

tabletes.

- Protecció del sistema nerviós: bona penetració de la barrera

hematoencefàlica.


- 50 -

- Metabolisme: per glucurónit del AZT.

- Efectes secundaris: supressió de la activitat de la medul·la òssea, disminució

en la producció d’algunes cèl·lules sanguínies: neutròfils i hematies – glòbuls

vermells – (anèmia). Intolerància gastrointestinal i insomni.

- Interaccions amb altres substàncies: potencien la seva activitat contra el

VIH: el dipiridamol, el aciclovir, el ddi, el ddc, el fosfonoformato, el interferó

alfa i la gm-csf. Disminueixen la seva activitat contra el VIH: el ganciclovir i la

ribavirina. Dificulten el seu metabolisme en el ronyó o en el fetge ( fan menor

la seva concentració en sang ): la metadona, el àcid valproic, el cloranfenicol,

el probenecida, i la cimetidina. Acceleren el seu metabolisme: la rifampicina.

Augmenten la seva toxicitat sobre la medul·la òssea: alfa interferó,

ganciclovir, pirimetamina i sulfonamides.

- Com afecta a altres substàncies: el AZT pot potenciar la toxicitat hepàtica del paracetamol.

Videx:

- Nom del compost: didanosina, dideoxiinosina.

- Abreviatura: ddi.

- Tipus de substància: anàleg de la inosina.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: 30%.

- Protecció del sistema nerviós central: baixa, només el 21% de la quantitat

que està en la sang arriba al sistema nerviós central (SNC).

- Metabolisme: poc conegut, hepàtic. Un 53% s’elimina per el ronyó.

- Efectes secundaris: intolerància gastrointestinal, insomni, pancreatitis,

neuropaties perifèriques i nàusees.

- Interaccions amb altres substàncies: el videx pot augmentar la

neurotoxicitat (neuropaties perifèriques ) de altres antirretrovirals i


- 51 -

antibiòtics: hivid, vincristina, yodequinol, ribavirina, or isocianida, glutetimida,

dapsona, cloramfenicol, etc. Degut a que conté uns excipients que li permeten

no ser destruït per els àcids del estómac, el ddi ha de prendre’s al menys amb

una hora i mitja o dos de diferencia amb respecte a altres medicaments.

Hivid:

- Nom del compost: zalcitabina, dideoxicitidina.

- Abreviatura: ddc.

- Tipus de substància: anàleg de citidina.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: 85% .

- Protecció del sistema nerviós: baixa.

- Metabolisme: poc conegut, es realitza a escala cel·lular ( limfòcits ). Un 50%

s’elimina per via renal.

- Efectes secundaris: neuropaties perifèriques que afecten a un 20-23% de les

persones i que poden arribar a ser greus en persones amb pocs CD4,

pancreatitis en un 1% dels usuaris. En menys del 1% úlceres en el esòfag i

miocardiopaties.

- Interaccions amb altres substàncies: s’ha d’evitar el ús simultani del hivid

amb altres fàrmacs que poden potenciar neuropaties , en particular el videx o

ddi. Alguns fàrmacs com la amfotericina i el foscanrnet poden augmentar la

concentració de hivid en la sang i potenciar la seva toxicitat.

Zerit:

- Nom del compost: estavudina.

- Abreviatura: d4t.

- Tipus de substància: anàleg de timidina.


- 52 -


- Protecció del sistema nerviós: baixa.

- Metabolisme: 45% en excreció renal i 55% metabolisme hepàtic.

- Efectes secundaris: neuropaties perifèriques, pancreatitis i alteracions

hepàtiques. A més, pot passar, amb menys freqüència, els següents

problemes: nàusees, vòmits, diarrea, estrenyiment, febre i suor, mal de cap,

canvis d’humor, etc.

- Interaccions amb altres substàncies: el dd4 pot potenciar la acció

antirretroviral del ddi.

Epivir:

- Nom del compost: lamivudina.

- Abreviatura: 3tc.

- Tipus de substància: anàleg de citosina.



hematoencefàlica.

- Metabolisme: en excreció renal, la meitat del epivir s’elimina sense

modificacions.

- Efectes secundaris: en molt pocs casos es produeixen rampejos en l’estòmac,

vòmits i nàusees deguts a una possible pancreatits. Amb menys freqüència es

produeix dolor, inflament de les parpelles, la cara i el llavis i erupció de la pell,

anèmia i molèsties gastrointestinals.

- Interaccions amb altres substàncies: s’ha d’evitar el cotrimoxasol di es

pren epivir. El ciprofloxacin i la pentamidina redueixen la activitat del 3tc


- 53 -

contra el VIH. La combinació del 3tc amb el AZT potencia els efectes

antirretrovirals de ambdós.

- Efectes contra el virus de la hepatitis b: el epivir té efectes contra el virus

de la hepatitis b. Al suspendre la presa del 3tc podria produir-se un rebrot

d’aquesta hepatitis.

Abacavir:

- Nom del compost: abacavir.

- Abreviatura: 1592u89.

- Tipus de substància: anàleg de nucleòtid.


hematoencefàlica.

- Metabolisme: sense dades de biodisponibilitat ni de vies metabòliques.

- Efectes secundaris: trastorns gastrointestinals.


- 54 -

Taula 3: Inhibidors nucleosídics de la transcriptasa inversa aprovats per la FDA.

S’ha demostrat que els medicaments d’aquest grup augmenten la supervivència i

disminueix la freqüència i la severitat de les infeccions oportunistes en els

pacients que tenen avançada la seva infecció per el VIH; també disminueix la

progressió de la infecció per el VIH en els pacients en fase inicials amb recompte

basals de CD4 inferiors a 500 cèl·lules/mm3. No obstant, és possible que els

beneficis en aquest últim grup puguin ser relativament breus ja que si

s’endarrereix la progressió a SIDA el benefici disminueix amb el pas del temps.

Diferents estudis han demostrat que els membre d’aquest grup de medicaments

són menys efectius en monoteràpia que quan es combinen entre ells i que inclús

els efectes de la monoteràpia són superiors quan es combinen els diferents

inhibidors de la transcriptats inversa.


- 55 -

1.14.2 Inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòsids

L' altre gran grup de fàrmacs que actuen inhibint la transcriptasa inversa està

format pels derivats no nuclosídics que basen el seu mecanisme d' inhibició en la

unió al·lostèrica a una cavitat hidrofòbica i asimètrica.

Figura 9: Mecanisme d'acció dels inhibidors no nucleosídics.

Els NNRTI tenen una estructura química heterogènia; actuen d’una manera no

competitiva sobre la transcriptasa inversa a diferència dels anàlegs dels

nucleosídics, causant un trencament en el lloc catalitzador de l’enzima.

Aquesta classe d’inhibidors bloqueja directament la reacció amb la transcriptasa

inversa per interacció específica i per aquesta raó, no competeixen amb els

NRTIs podent-se així combinar.

Alguns dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de no nucleòsids:

Viramune:

- Nom del compost: nevirapina.

- Abreviatura: nvp/ bi-rg-587.

- Tipus de substància: derivat de les piridobenzodiacepinones.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: major del 90%.


hematoencefàlica.


- 56 -

- Metabolisme: en el fetge: metabolitzada per el citocrom p 450.80% excretada

en la orina.

- Efectes secundaris: produeix Rash, un tipus de irritació de la pell. Aquest

efecte tendeix a desaparèixer segons passa el temps.

- Interaccions amb altres substàncies: indueix les enzimes del citocrom

p450. Les següents substàncies podrien tenir interaccions amb la nevirapina,

per lo qual es fa necessària una vigilància quan siguin utilitzades: rifampin,

rifabutin, anticonceptius orals i inhibidors de la proteasa.

Rescriptor:

- Nom del compost: mesilato de delacirdina.

- Abreviatura: dlv.

- Tipus de substància: derivat piperacínic


- Metabolisme: en el fetge, per citocrom p450. 51% excretada per l’orina.

- Efectes secundaris: Rash, un tipus de irritació en la pell. Aquesta irritació

tendeix a desaparèixer amb el temps.

- Interaccions amb altres substàncies: inhibeix les enzimes del citocrom

p450.

Loviride:

- Nom del compost: loviride

- Abreviatura: lvd

- Tipus de substància: derivat de les benzeodiacepines

- Efectes secundaris: el més important descrit són les diarrees.


- 57 -

Sustiva:

- Nom del compost: efivarenz.

- Abreviatura: dmp-266.

- Metabolisme: en el fetge, biliar, activa el citocrom p450.

- Efectes secundaris: Rash, un tipus de irritació en la pell. Aquesta irritació

tendeix a desaparèixer amb el temps.

- Interaccions amb altres substàncies: fa disminuir els nivells de indinavir en

sang fins en un 30%.

Taula 4: Inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de no nucleòsids aprovats per la FDA.

No obstant, s' ha observat que el tractament amb aquesta classe d' inhibidors

condueix ràpidament a l'aparició de resistència a aquest tipus de fàrmac. A més

a més, s' ha detectat que una sola mutació en la transcriptasa inversa sovint

comporta la resistència a un gran nombre d' inhibidors no nucleòsids.

Els NNRTI no són eficaços com a monoteràpia ja que es desenvolupen

ràpidament resistències i només s’han aprovat per a ús clínic en combinació amb

altres antirretrovirals. La seva utilització simultània amb els inhibidors de la

proteasa és, en alguns casos, problemàtica ja que comparteixen el seu

metabolisme hepàtic per la via del citocrom P4503A.


- 58 -

1.14.3 Inhibidors de la proteasa

Per si sols els inhibidors de la proteasa (IP) no eliminen completament el VIH del

organisme. No obstant, amb aquest tipus de medicament, s’ha observat que

poden reduir la quantitat del VIH fins a un 99% tot i que alguns siguin latents

dintre de les cèl·lules infectades.

Al produir-se nous virus defectuosos s’aconseguiria que al menys la infecció per

el VIH no es propagues dintre del organisme amb la mateixa rapides que ho fa

en l’actualitat i teòricament es podria arribar a una cronoficació de la infecció del

VIH ja que, al haver-hi menys virus, menys cèl·lules CD4 s’infectarien i la

persona infectada podria combatre millor les infeccions i viure durant més temps.

El genoma del VIH es pot dividir en tres gens principals: gag, pol i env. El

producte del gag és una poliproteïna que conté les proteïnes estructurals de la

matriu, la càpside i la nucleocàpside juntament amb altres pèptids que participen

en l' ensamblatge del virió i en la morfogènesi. El gen pol conté seqüències pels

tres enzimes virals (la transcriptasa inversa, la proteasa i la integrasa) que són

traduïts en forma de complex poliproteïc. La proteasa té la funció d’ escindir

aquests fragments per formar les corresponents proteïnes funcionals, procés

d’elevada importància per la maduració dels nous virions.

Figura 10: Mecanisme d'acció dels inhibidors de proteasa.


- 59 -

Aquesta classe d' inhibidors de la proteasa són uns dels protagonistes principals

de la teràpia antiviral.

Alguns fàrmacs que pertanyen a aquest grup:

Invirase/ Fortovase:

- Nom del compost: saquinavir mesilat.

- Abreviatura: sqv.Ro3t-8959.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: escàs, un 4%.

- Metabolisme: en el fetge, biliar. Citocrom p450/ 3a4.

- Efectes secundaris: distorsió del sentit del gust, increment en els triglicèrids

en sang, elevació de les transaminases, elevació dels nivells d’àcid úric.

Intolerància gàstrica, nàusees i diarrees.

- Interaccions amb altres substàncies: inhibeix el citocrom p450 saquinavir.

Potencia la activitat del AZT, el ddc i el ritonavir.

Crixivan:

- Nom del compost: indinavir sulfat.

- Abreviatura: idv.Mk-639.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: del 30 al 60%.

- Metabolisme: en el fetge, biliar. Citocrom p450 3a.

- Efectes secundaris: nefrolitiasis ( pedres en el ronyó ), intolerància

gastrointestinal, incrementa la bilirubinèmia ( nivells de bilirubina en la sang )

indirecta.

- Interaccions amb altres substàncies: inhibeix el citocrom p450.


- 60 -

Norvir:

- Nom del compost: ritonavir.

- Abreviatura: rtv.Abt-538.

- Tipus de substància: derivat piperacínic


- Metabolisme: en el fetge, biliar, citocrom p450 3a4, 2d6,2c9 i 2c10.

- Efectes secundaris: apareixen només en determinades ocasions i en un

número molt petit de persones: mal de cap, astènia, visió borrosa, erupcions

cutànies ( rash ), sabor metàl·lic en la boca, intolerància gàstrica, diarrea

nàusees, vòmits, parestèsies en les extremitats i altes zones del cos.

- Interaccions amb altres substàncies: inhibeix de manera potent el citocrom

p450. Incrementa els nivells de múltiples fàrmacs que no es recomanen

utilitzar simultàniament: alprazolam, amiodarona, astemizol, bepridil,

bupropion,clorazepato, etc. La didanosina ( videx ) redueix la absorció de

ritonavir a menys que es prengui amb dos hores de separació. Ritonavir

disminueix els nivells en sang de: etinil estradiol, teofil·lina, zidovudina (AZT),

claritromicina, sulfametoxazole i teofil·lina. A més, també ajuda a una millor

absorció del saquinavir, augmentant la seva eficàcia.

Viracept:

- Nom del compost: nelfinavir Mesilat.

- Abreviatura: nfv ag-1343.

- Tant per cent de la quantitat presa que arriba a la sang: del 20 al 80%.

- Metabolisme: en el fetge, biliar, a través del citocrom p450 3a4.

- Efectes secundaris: mal de cap, eleva les transaminases.


- 61 -

- Interaccions amb altres substàncies: inhibeix el citocrom p450. Els nivells

de nelfinavir en sang es redueixen per: rifampin i rifabutin. Fa disminuir els

nivells de: etinil estradiol i norethindrona. Incrementa els nivells de:

ketoconazol. No es recomanen per a ús simultani: rifampin, triazolam,

alcaloide, terfenadina, astemizol i cisapride.

Vertex:

- Abreviatura: 141w94/vx-478.

- Efectes secundaris: erupcions en la pell i mal de cap en un percentatge petit

de les persones sota tractament.

- Sense informació sobre biodisponibilitat, vida mitja, vies metabòliques ni

contraindicacions.

Taula 5: Inhibidors de proteasa aprovats per la FDA.


- 62 -

La seva utilització en combinació amb altres antirretrovirals ha demostrat que els

inhibidors de la proteasa poden:

1) Reduir la quantitat del VIH en sang (mesurat per càrrega viral).

2) Augmentar el número de limfòcits CD4, fins i tot quan són molt baixos.

3) Prolongar el temps d’aparició de la primera malaltia de SIDA o mort.

4) Ajudar a que es desenvolupin menys infeccions oportunistes.

5) Possiblement reduir el risc de transmissió del virus.

6) Possiblement preservar la funció del sistema immunitari.

1.14.4 Inhibidors de la fusió

Aquests ataquen al virus abans de que aquest penetri en les cèl·lules sanes

evitant així, el que seria el primer pas de la infecció.

L' entrada del virus és un procés complex que com ja s'ha comentat

anteriorment es divideix en 3 etapes: adhesió, interacció amb el coreceptor i

fusió.

Figura 11: Mecanisme d'acció dels inhibidors de la fusió.

Cadascuna de les tres etapes ofereix una aproximació terapèutica diferent. L' any

2003, la FDA va aprovar el primer inhibidor de fusió, l'Enfuvirtide (ENF) o

FuzeonR. Es tracta d' un pèptid sintètic de 36 aminoàcids que conté una

seqüència derivada de al regió HR2 de la glicoproteïna gp41.


- 63 -

El mode d' inhibició d' aquest fàrmac consisteix en minimitzar la regió HR2 i unir-

se a la regió HR1 impedint que s' uneixi al HR2 viral. D' aquesta manera es

forma una agrupació de 6 hèlixs deficient que no permet l' entrada del virus. Tot

i l' elevada potència d' aquest fàrmac, el seu cost extremadament elevat i la

baixa biodisponibilitat, justifiquen la recerca de nous inhibidors d' aquest tipus.

1.15 Teràpies combinades

La única manera d’aconseguir amb els antiretrovirals una reducció de la càrrega

viral fins a nivells indetectables és combinant l’acció d’aquestes substàncies

sobre almenys dos de les tres enzimes fonamentals del virus. D’aquesta manera,

aquells virus que aconsegueixin saltar -se l’acció, per exemple, dels inhibidors de

la transcriptasa, es trobaran en que no podran acabar la seva reproducció ja que

tindran que fer front a l’acció dels inhibidors de la proteasa. Les combinacions

possibles han d’incloure sempre inhibidors de la transcriptasa i inhibidors de la

proteasa. Les combinacions més habituals tenen dos inhibidors de la

transcriptasa inversa anàleg de nucleòtids més un inhibidor de la proteasa.

Cada vegada és més freqüent el ús de combinacions que inclouen inhibidors de la

transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòtids i combinacions de quatre

substàncies que inclouen, per exemple, tres de la transcriptasa i un de la

proteasa o bé dos de cada tipus.

Els inhibidors de la transcriptasa anàlegs de nucleòtids serveixen per a tractar

algunes infeccions oportunistes.

Les combinacions més efectives:

Qualsevol d’aquestes combinacions de inhibidors de la transcriptasa anàlegs de

nucleòtids amb qualsevol dels inhibidors de la proteasa poden servir com a

primer tractament o com a tractament de recanvi. No obstant , és preferible

evitar les combinacions amb 3TC com a tractament inicial i utilitzar-les més


- 64 -

endavant per a mantenir controlada la càrrega viral degut a la rapidesa amb la

qual poden aparèixer resistències al 3TC.

Combinacions:

• AZT + ddI.

• d4T + ddI.

• AZT + ddC.

• AZT + 3TC.

• d4T + 3TC.

Les següents combinacions es poden utilitzar com a tractament en alguns casos

de nens i en adults amb més de 500CD4:

• AZT + ddI.

• AZT + ddC.

• d4T + ddI.

• AZT + 3TC.

• d4T + 3TC.

Cal esmentar que les dos últimes combinacions únicament seran aplicades a

nens.

1.16 Potència dels antirretrovirals

La potència dels antirretrovirals es mesura en funció de la seva capacitat per a

reduir la càrrega viral i això, es mesura en logaritmes. Així doncs, la reducció de

la càrrega viral en 3 log significa a un valor mil vegades menor al seu valor inicial

i si és de 2log, serà 100 vegades menor.


- 65 -

Els retrovirals més potents dintre del cos humà són el abacavir, el 3TC, el d4T, el

indinavir, el nelfinavir, el adefovir dipivoxil, el ddI, els no anàlegs de nucleòtid

com la nevirapina, el AZT, el ddC i el saquinavir.

NOM GENÈRIC FAMÍLIA NOM COMERCIAL

DOSIS HABITUALS

EFECTES ADVERSOS MÉS FREQÜENTS

Zidovudina ITI anàleg 250 mg/12 h. Supressió medul·la óssea.

AZT, ZDV nucleòtid 200mg/8 h. Insomni.300 mg/12 h.

ITI anàleg 200 mg/12 h Pancreatitis.nucleòtid 125 mg/12 h Neuropatia perifèrica

(< 60 Kg) Diarrea.Nàusea.

ITI anàleg Neuropatia perifèrica.nucleòtid Estomatitis.

40 mg/12 h30 mg/12 h(< 60 Kg)

Lamivudina 3TC ITI anàleg nucleòtid

Epivir 150 mg/12 h Escassos.

ITI anàleg No 200 mg/24h/ Rash.nucleòtid 15 dies, després - GGT

200 mg/12h

Nevirapina Viramune

Estavudina D4T ITI anàleg nucleòtid

Zerit Neuropatia perifèrica.

Retrovir

Didanosina DDI Videx

Zalcitabina DDC Hivid 0,75 mg/8 h

Taula 6: Inhibidors de transcriptasa.

Taula 7: Inhibidors de proteasa.

NOM GENÈRIC NOM COMERCIAL

DOSIS HABITUALS EFECTES ADVERSOS MÉS FREQÜENTS

Crixivan 800 mg/8 h Nefrolitiasis.(caps. 200mg) 1 hora abans ó 2 Intolerància GI.

després dels menjars HiperbilirrubinèmiaSabor metàl·lic.

Norvir 600 mg/12 h Intolerància GI.(caps. 100 mg) amb menjar. Parestèsies circunorals.

Guardar en frigorífic. Hepatitis. Alteració del gust.- triglicèrids.- CPK- Àcid úric

Invirase Intolerància GI Cefalea(caps. 200 mg) - transaminases

750 mg/8 h1250 mg/12 hamb menjar

Diarrea

Saquinavir 600 mg/8 h amb menjar

Nelfinavir Viracept (tauletes 250 mg)

Indinavir

Ritonavir


- 66 -

Taula 8: Possibilitats de tractament combinat.

1.16.1 Indicadors canvi de teràpia

Fallo de tractament, definit per un augment de la càrrega viral plasmàtica de

ARN-VIH, fracàs en aconseguir el nivell desitjat de reducció de càrrega viral.

Toxicitat descens de la xifra de CD4. Progressió clínica de la malaltia. Ús de

règims que s’ han demostrat subòptims.

1.16.2 Resistència als principals antirretrovirals

AZT

La resistència a la zidovudina es va descriure en el 1.989 i es va correlacionar

amb la duració del tractament i el estat evolutiu de la infecció VIH (malaltia

avançada i alts nivells de replicació vírica). Aproximadament als 6 mesos de

tractament pot aparèixer un percentatge variable de cepes VIH-1 parcial o

totalment resistents i la resistència és pràcticament constant a partir dels 2 anys

de tractament.

La velocitat d’aparició de resistències pot ser menor quan el tractament s’ha

iniciat en pacients que estaven asimptomàtics.

S’han descrit diverses mutacions en el gen de la transcriptasa inversa de les

quals les que afecten al codó 215 semblen ser les més crítiques per al

desenvolupament de resistència d’alt nivell. Presenta resistència creuada (la

resistència al fàrmac implica la resistència a altres del seu grup o de grups

diferents) amb altres NRTI, especialment amb els que contenen el grup 3’-àcid.

D4T + DDI Inhibidor de proteasaD4T + 3TC óAZT + DDI Inhibidor de transcriptasaAZT + 3TC no nucleòtid AZT + DDC


- 67 -

Didanosina, zalcitabina i estavudina

La seva resistència d’alt nivell depèn de diferents mutacions caracteritzades en

diferent treballs amb assajos feno-genotípics; no obstant, la transcendència

clínica d'’questes mutacions segueix incerta.

En pacient que han rebut zidovudina durant períodes prolongats i després se’ls hi

a administrat didanosina s’ha observat l’aparició de resistències a aquest tot i

que en un grau menor a les de la AZT. Les variants VIH-1 resistents a la AZT i a

la ddI són sensibles a d4T tot i que també s’han detectat resistències creuades

entre AZT i d4T.

Didanosina i zalcitavbina presenten resistència creuada. Zalcitabina també pot

presentar resistència creuada amb la Lamivudina.

Lamivudina

La resistència a la lamivudina passa ràpidament in vitro i in vivo; està associada

amb una mutació en el codó 184 que li confereix resistència creuada amb la

didanosina, tot i que sembla impedir el desenvolupament o revertir la resistència

del VIH a AZT, conferit per la mutació 215, per un mecanisme que és

desconegut.

Saquinavir

In vitro, les mutacions acostumen a suposar una disminució entre 3 i 10 vegades

en la susceptibilitat global del VIH-1 al fàrmac. Les principals mutacions descrites

són la G48V i la L90M; si ambdues es donen simultàniament poden produir-se

disminucions de la susceptibilitat majors de 100 vegades (resistència d’alt nivell).

S’ha observat que la resistència ha estat percentualment menor quan s’ha

utilitzat en teràpies de combinació que quan s’ha utilitzat com a monoteràpia;

igualment les resistències semblen ser menors quan s’aconsegueix una forta

inhibició de la replicació amb dosis de 7.200 mg/dia del medicament.

Indinavir

Tot i que s’han demostrat diferents mutacions, sembla ser que cap d’elles per si

sola és capaç de produir resistència d’alt nivell a aquest fàrmac. Els nivell més

alts de resistència s’han associat amb canvi en les posicions 46 i 82 i la


- 68 -

substitució en aquesta última prediu la resistència creuada amb ritonavir. Dades

d’estudis clínics han demostrat el major percentatge de resistències obtenint

amb dosis subòptimes o monoteràpia.

Tot i que s’ha observat que al suprimir el fàrmac, després de l’aparició de

resistències, condueix en poc temps al aïllament de la cepa salvatge sensible al

fàrmac, quan aquest es torna a donar reapareixen ràpidament les mutacions

resistens.

Ritonavir

Les resistències segueixen un model semblant al del indinavir; s’ha demostrat la

ràpida emergència de cepes resistents amb monoteràpia o dosis subòptimes.

Sembla ser que la principal mutació implicada és la V82. Les dades actuals

indiquen que l’ús simultani o seqüencial de indinavir i ritonavir no és adequat.

Nelfinavir

La principal mutació implicada es troba en la substitució d’aminoàcids en la

posició 30; aquest mutació no sembla conferir resistència creuada amb els altres

integrants del grup.

Les mutacions més importants, 48, 82 i 90, per a la resta del grup passen

escassament amb nelfinavir lo que pot ser tingut en compte en les teràpies

combinades de 2 IP.

Nelfinavir

La resistència pot passar ràpidament quan s’utilitza com a monoteràpia; s’han

observat casos en la primera setmana de tractament. No obstant, tot i la

presència de VIH-1 resistent a la nevirapina alguns pacients mantenien la

reducció dels nivells plasmàtics del ARN del virus. El desenvolupament de

resistències a la nevirapina pot atenuar-se quan la triple teràpia (AZT + ddI+

nevirpaina) es dona a pacients que no han estat prèviament tractats. L’anàlisi

genotípic revela que les mutacions en el gen de la transcriptasa inversa en els

codons 181 i/o 106 confereixen resistència d’alt nivell a la nevirapina. També

s’han vist mutacions en els codons 103, 108, 188 i 190.


- 69 -

Delavirdina

L’anàlisi genotípic revela que les mutacions en el gen del transcriptasa inversa en

els codons 103 i/o 181 confereixen resistència d’alt nivell a delavirdina. També

s’han vist mutacions en altres codons, del 183 al 190. La mutació del codó 236

sembla augmentar, in vitro, la sensibilitat a la nevirapina, tot i que es desconeix

si té transcendència clínica. La resistència apareix ràpidament quan s’utilitza com

a monoteràpia.

En general per a tots els NNRTI es pot dir que la resistència creuada és probable

entre tots els component del grup; és possible amb els NRTI i improbable amb

els IP perquè les drogues treballen sobre enzims diferents.

1.16.3 Efectes secundaris de l’ actual teràpia

En quan a efectes secundaris, el més important és la toxicitat mitocondrial

associada als NRTIs. Els mitocondris són els orgànuls subcel·lulars responsables

de la generació de l' energia requerida per a la cèl·lula. Les possibles alteracions

en aquest orgànul comporten resultats catastròfics quan la demanda d' energia

és més gran que la que es pot subministrar. L' efecte al fetge o al pàncrees pot

arribar a ser mortal.

Un altre efecte secundari és el síndrome de redistribució del greix o lipodistròfia.

Aquest síndrome es manifesta amb una pèrdua o redistribució del greix corporal,

la qual cosa condueix a canvis en l' aparença i destorbs en el metabolisme dels

lípids i la glucosa, que pot comportar una resistència a la insulina o diabetis.

Als primers mesos després de l' aplicació de la HAART, el nivell de virus en

plasma es veu reduït a nivells gairebé indetectables. Tot i així, tècniques de

detecció més sensibles han demostrat que mitjançant el HAART no

s'aconsegueix suprimir totalment la reproducció viral. Les diferents mutacions

que pateix el virus fan que els fàrmacs puguin esdevenir en un futur inactius.

La identificació de mutacions específiques causades arrel dels fàrmacs actuals

pot ajudar a identificar les combinacions de fàrmacs apropiades i a definir les

especificitats desitjades en la propera generació de fàrmacs.


- 70 -

1.16.4 Són aquests medicaments una cura pel SIDA?

La prova de la càrrega viral s’utilitza per a mesurar la quantitat de virus a la

sang. Les persones amb càrregues virals més baixes es mantenen saludables per

molt més temps.

La càrrega viral d’algunes persones, és tant mínima, que no poden mesurar -se

per les proves existents. Aquesta càrrega viral “ indetectable” no significa que no

hi hagi més virus.

Cada medicament contra el VIH té efectes secundaris. Algunes combinacions de

medicament són més fàcil de tolerar que d’altres i són millors. La prova de la

càrrega viral s’utilitza per a veure si els medicaments contra el VIH funcionen. Si

la càrrega viral no és baixa, o si baixa però torna a pujar, podria ser el moment

de canviar de teràpia.

1.16.5 I actualment que es fa?

S’estan desenvolupant nous medicaments de totes les classes mencionades

anteriorment. A més, els investigadors estant tractant de desenvolupar nous

tipus de medicaments que funcionin en altres etapes del cicle de vida del VIH, i

medicaments per enfortir les defenses del cos.

- 71 -

CAPÍTOL 2:

INTRODUCCIÓ

TEÒRICA A L’HPLC

2.1 Mètodes de separació. Introducció

Des del segle passat les separacions analítiques es duen a terme per mètodes

clàssics com són la precipitació, destil·lació i extracció. Els esforços per a

conèixer més sobre la composició i funció de les proteïnes han obligat als

científics a buscar tècniques, cada vegada, més precises.

Per escollir una tècnica de separació, a part de valorar els criteris econòmics i

d’accessibilitat, s’ha de tenir en compte dos tipus de consideracions: unes tenen

que beure amb les propietats físiques i estructurals de les molècules que es

pretenen separar; altres deriven dels objectius del anàlisi (sensibilitat, resolució,

temps d’anàlisi i necessitat d’una detecció específica).

Les tècniques analítiques més utilitzades en l’actualitat poden englobar-se en

dos grans grups: tècniques de separació i tècniques espectroscòpiques. Les

tècniques espectroscòpiques proporcionen, per a cada compost analitzat, una

informació complexa, relacionada amb les seves característiques estructurals

específiques, per altre banda, les tècniques de separació s’utilitzen per a resoldre


- 72 -

els components d’una mescla i la senyal obtinguda pot utilitzar-se amb fins

analítics quantitatius o qualitatius.

Actualment, les separacions analítiques es realitzen fonamentalment per

cromatografia i electroforesis. Mitjançant mètodes cromatogràfics es poden

separar molècules en funció de la seva càrrega, mida i massa molecular, a través

de la polaritat dels seus enllaços, els seus potencials redox, etc.

La cromatografia permet a part de la separació dels components, la seva

identificació i quantificació. L’anàlisi qualitatiu esta basat en la mesura de

paràmetres cromatogràfics (temps i volums de retenció) mentre que l’anàlisi

quantitatiu esta basat en la mesura de l’alçada o àrees de pics cromatogràfics.

En totes les separacions cromatogràfiques la mostra es desplaça amb una fase

mòbil, que pot ser un gas, un líquid o un fluid supercrític. La fase mòbil pot

passar-se a través d’una fase estacionaria, amb la que és immiscible i que es

fixa a una columna o a una superfície sòlida. Les dos fases es trien de tal manera

que els components de la mostra es distribueixen de forma diferent entre la fase

mòbil i la estacionaria. Aquells components que són fortament retinguts, per la

fase estacionaria es mouen lentament amb el flux de la fase mòbil;

contràriament, els components que s’uneixen feblement a la fase estacionaria, es

mouen amb rapidesa. Com a conseqüència de la diferent mobilitat, els

components de la mostra es separen en bandes o zones discretes que poden

analitzar-se qualitativa i/o quantitativament. Aquests resultats es recullen en

forma de gràfics anomenats cromatogrames.

Els mètodes cromatogràfics es poden classificar segons la forma en que la fase

mòbil i la fase estacionaria es posen en contacte.

Les tres classes de cromatografia des d’un angle més general són cromatografia

de líquids, cromatografia de gasos i cromatografia de fluids supercrítics.

La tècnica més utilitzada és la cromatografia líquida d’alta resolució, HPLC per la

seva sensibilitat, fàcil adaptació a les determinacions quantitatives exactes, la

seva idoneïtat per a la separació d’espècies no volàtils o termolàbils i la seva

aplicació a substancies d’interès en la industria, com els aminoàcids, proteïnes,

hidrocarburs, carbohidrats, etc.


- 73 -

Figura 12: Mètodes i aplicacions de la cromatografia de líquids.

2.1.1 Elució isocràtica vers elució amb gradient

En la HPLC isocràtica el compost passa per la columna cromatogràfica a través

de la fase estacionaria mitjançant el bombeig de líquid a alta pressió a través de

la columna. La mostra a analitzar s’introdueix en petites quantitat i els seus

components es retarden diferencialment depenen de les interaccions químiques o

físiques amb la fase estacionaria a mesura que passen per la columna. El grau de

retenció dels components de la mostra depèn de la naturalesa del compost, de la

composició de la fase estacionaria i de la fase mòbil. El temps que tarda un

compost a ser eluït de la columna s’anomena temps de retenció i es considera

una propietat identificativa característica d’un compost en una determinada fase

mòbil i estacionaria. La utilització de pressió en aquest tipus de cromatografia

incrementa la velocitat lineal dels compostos dintre de la columna reduint així la

seva difusió dintre d’ella millorant la resolució de la cromatografia. Els

dissolvents més utilitzats són l’aigua, el metanol i el acetonitril.

Una millora introduïda a la tècnica d’HPLC descrita és la variació en la composició

de la fase mòbil durant el anàlisi, coneguda com elució en gradient on s’utilitzen


- 74 -

dos o tres dissolvents de diferent polaritat i es vaira la composició de forma

continua i mitjançant etapes esglaonades.

Figura 13: Elució isocràtica vers elució en gradient.

2.2 Sistemes de bombeig

Els requisits o aspectes més importants que ha de reunir una bomba o sistema

de bombeig són:

• Ha de produir pressions estables fins a 6000psi.

• Mantenir el flux lliure de pulsacions.

• Generar intervals de cabals de flux (0,1 a 10ml/min).

• Components de la bomba resistents a la corrosió.

Les bombes que s’utilitzen en HPLC es poden classificar segons el seu

funcionament i disseny en:

• Mecàniques:

- Recíproques

- De desplaçament continuo

• Neumàtiques


- 75 -

Figura 14: Esquema de funcionament d’una bomba recíproca.

2.3 Sistemes d’injecció de mostra

Aquests sistemes han variat al llarg del temps; en un principi s’utilitzava la

injecció de la mostra amb xeringues d’alta pressió, no obstant, aquestes ja no

s’usen. Avui en dia, s’utilitza el sistema de vàlvules injectores.

Figura 15: Vàlvula d’injecció amb bucles de mostra.


- 76 -

2.4 Detecció

L’eficàcia d’un detector cromatogràfic depèn de la relació entre la quantitat física

mesurada i la composició del efluent i de les característiques de la senyal

transferida.

Els tipus de detectors es classifiquen en:

• Detectors basats en una propietat de la fase mòbil.

Ex: Detector d’Índex de refracció

• Detectors basats en una propietat de la substància a separar.

Ex: Detector de Fluorescència, Detector Ultravioleta

2.4.1 Detectors de Fluorescència

Aquests detectors només poden detectar compostos que tinguin fluorescència

nativa o induïda per derivatització. La fluorescència es detecta mitjançant un

detector fotoelèctric col·locat perpendicularment respecte el feix d’excitació. És

més sensible que el detector d’absorbància.

2.4.2 Detectors de Índex de refracció

En ells, el dissolvent passa a través de la meitat de la cubeta i el eluent de la

cubeta passa per l’altra meitat. Els dos compartiments estan separats per una

placa de vidre muntada a un angle tal que si les dos dilucions difereixen en el

índex de refracció es produeix una desviació del feix incident respecte a la

superfície fotosensible del detector que provoca un canvi en la senyal de sortida.


- 77 -

Figura 16: Funcionament detector índex de refracció.

2.4.3 Detectors Electroquímics

S’utilitzen en les espècies que contenen grups funcionals orgànics amb intervals

de potencial en els que poden tenir oxidació o reducció.

Figura 17: Funcionament detector electroquímic.

2.5 Columnes per a cromatografia de líquids

Normalment són tubs d’acer inoxidable que suporten pressions de fins a

1.000psi. No obstant, alguna vegada es pot trobar com a columna un tub de

vidre amb parets resistents (pressions fins a 600psi).


- 78 -

2.5.1 Columnes analítiques

Característiques:

• Rectes, de 10 a 30cm de longitud.

• Estendre acoblant columnes addicionals.

• Diàmetre intern: de 4 a 10mm

• Mida de les partícules de farciment: de 5 a 10μm

• Estàndard: 25cm de longitud; 4,6mm diàmetre; 5μm partícules; N= 40 a

60 plats/metre (avantatge: rapidesa i mínim consum de dissolvent).

2.5.2 Precolumnes

Característiques:

• Eliminen la matèria en suspensió i components de la mostra que s’uneixen

irreversiblement a la fase estacionaria.

• Composició similar a la columna analítica (CA). S’utilitza per a millorar la

vida de la CA.

• Es canvia quan es contamina.

2.5.3 Columnes termostatitzades

• La majoria de les aplicacions no requereixen control de la temperatura i es

treballa a temperatura ambient. No obstant, a T constant es millora el

cromatograma.

• Els instruments moderns tenen control de temperatura des d’ambient a

100-150ºC.


- 79 -

2.6 Els mètodes cromatogràfics

La cromatografia la podem diferencia en quatre grups:

• Cromatografia de repartiment: separa els soluts basant-se en la solubilitat.

• Cromatografia d’adsorció: es basa en l’afinitat d’adsorció.

• Cromatografia d’exclusió: separa els soluts segons el pes molecular.

• Cromatografia d’intercanvi iònic: separa els soluts segons càrrega iònica.

2.6.1 Cromatografia de repartiment

És la cromatografia de líquid més utilitzada. Aquesta està formada per la

cromatografia líquid-líquid i la cromatografia unida químicament. Aquestes

tècniques es difereixen en la forma en que es reté la fase estacionaria sobre les

partícules del suport de farcit. Es distingeixen dos tipus de cromatografia de

repartiment: de fase normal i de fase inversa.

a) Cromatografia de fase normal:

La cromatografia de fase normal o “Normal phase HPLC” (NP-HPLC) va ser el

primer tipus de sistema HPLC utilitzat en el camp de la química, i es caracteritza

per separar els compostos en base a la seva polaritat. Aquesta tècnica utilitza

una fase estacionaria polar i una fase mòbil apolar, i s’utilitza quan el compost

d’interès és bastant polar. El compost polar s’associa i és retingut per la fase

estacionaria. La força d’adsorció augmenta a mesura que augmenta la polaritat

del compost i la interacció entre el compost polar i la fase estacionaria polar

augmenta el temps de retenció.

La NP-HPLC es va començar a deixar de utilitzar als anys setanta amb el

desenvolupament del HPLC de fase inversa o Reversed-phase HPLC degut a la

falta de reproductibilitat dels temps de retenció donat que els dissolvents prótics

canviaven el estat d’hidratació de la silica o alúmina de la cromatografia.


- 80 -

b) Cromatografia de fase inversa:

L’HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consisteix en una fase immòbil apolar i una

fase mòbil de polaritat moderada. Una de les fases estacionaries més comuns

d’aquest tipus de cromatografia és la silica tractada amb RMe2SiCl, on R és una

cadena alquil tal com C18H37 o C8H17 . El temps de retenció és major per a les

molècules de naturalesa apolar, mentre que les molècules de caràcter polar

elueixen més ràpidament.

La cromatografia de fase inversa es basa en el principi de les interaccions

hidrofòbiques que resulten de les forces de repulsió entre un dissolvent

relativament polar, un compost relativament apolar, i una fase estacionaria

apolar. La força conductora en la unió del compost a la fase estacionaria és la

disminució de l’àrea del segment apolar del analit exposat al dissolvent. Aquest

efecte hidrofòbic està dominat per a la disminució de l’energia lliure de l’entropia

associada amb la minimització de la interfase compost- dissolvent polar. L’efecte

hidrofòbic disminueix amb l’addició de dissolvent apolar a la fase mòbil. Això,

modifica el coeficient de participació de forma que el compost es mou per la

columna i elueix.

A part de la hidrofobicitat de la fase mòbil, altres modificacions de la fase mòbil

poden afectar la retenció del compost; per exemple: l’addició de sals

inorgàniques provoca un augment lineal en la tensió superficial, i com que

l’entropia de la interfase compost- dissolvent està controlada per la tensió

superficial, l’addició de sals tendeix a augmentar el temps de retenció.

Figura 18: Resultats cromatografia de repartiment.


- 81 -

2.6.2 Cromatografia d’adsorció

La cromatografia d’adsorció o líquid-sòlid és la forma clàssica de la cromatografia

líquida. Ha patit algunes transformacions que l’han convertit en un mètode

important de l’HPLC.

Les úniques fases que s’utilitzen en aquest tipus són la silici i la alúmina, sent la

primera la preferida.

És adequada per a compostos no polars probablement amb masses moleculars

inferiors a 5.000. Els mètodes de la cromatografia d’adsorció i repartiment

tendeixen a ser complementaries, tot i que en alguns casos es superposen. En

general, la cromatografia líquid- sòlid és més adequada per a mostres que són

solubles en dissolvents no polars i per això, tenen solubilitat limitada en

dissolucions aquoses que són les que s’utilitzen en cromatografia de repartiment

en fase inversa. En quest tipus de cromatografia també es pot separar

compostos amb diferents grups funcionals. Una característica particular d’aquest

mètode és la seva capacitat per a diferenciar compostos isòmers en mescles.

En ella, l’ordre dels temps de retenció són:

Olefines< hidrocarburs aromàtics< halurs, sulfurs< èters< nitroderivats< esters<

aldehids, cetones< alcohols, amines< sulfones< sulfòxids< amides< àcids

carboxílics.

Es varia la composició de la fase mòbil per ajustar k’ i α (s’utilitza la força del

eluent, en lloc de la polaritat com a guia de la força dels dissolvents). S’escollen

dos dissolvents compatibles, un que és massa fort i l’altre massa dèbil. Variant la

relació de volums es pot obtenir un valor adequat de K’. Quan es produeix el

solapament de pics, el canvi de dissolvent fort per altre, permetrà canviar els

valors de α i augmentar la resolució.


- 82 -

Figura 19: Exemple de cromatografia d’adsorció.

2.6.3 Cromatografia d’exclusió molecular

La cromatografia d’exclusió molecular, també coneguda coma a cromatografia de

filtració en gel o cromatografia de penetrabilitat sobre gel, separa les partícules

de la mostra en funció de la seva mida.

El temps d’elució és proporcional al pes molecular dels mateixos. Aquest tipus de

separació per dimensions difereix de les altres tècniques en que no existeix

interaccions físiques o químiques entre l’analit i la fase estacionaria. És una

tècnica reproduïble, escalable i ràpida.

Generalment, es tracta d’una cromatografia de baixa resolució de forma que

s’acostuma a utilitzar en els passos finals dels procés de purificació. També és

molt útil per a la determinació de la estructura terciària i la estructura

quaternària de les proteïnes purificades.

La fase fixa està formada per partícules polimèriques o de silici que contenen una

xarxa uniforme de porus per els que poden penetrar les molècules de petites

mides. Les molècules més grans s’exclouen totalment i són eluïdes en primer

lloc, mentre que les petites tenen accés a tot el volum porós i són les últimes que

s’elueixen.


- 83 -

Figura 20: Corba de calibrat en una columna d’exclusió per dimensions.

Per tant, les molècules s’elueixen per la seva dimensió decreixent. En resum, els

factors que determinen la separació de les molècules són les dimensions del

porus, les dimensions de la partícula i el flux d’elució.

Les diferents partícules utilitzades han de ser estables, mecànica i químicament,

tenir baix contingut en grups iònics, uniformitat de porus i dimensions.

Hi ha diferents mides de partícula per a un gel: a menor dimensió major

resolució i menor gasto de la columna.

Farcits de columna per a la cromatografia d’exclusió molecular:

Figura 21: Propietats dels farcits comercials típics.


- 84 -

Silica:

- Avantatges: gran rigidesa, major estabilitat i estable a T elevada.

- Inconvenients: tendeix a retenir soluts per adsorció, pot catalitzar la

degradació del solut.

Polimèriques:

- Avantatges: control de les dimensions del porus controlant el grau

d’encreuament. Polímers hidrofòbic i hidrofílics.

- Inconvenients: deformable (limita la pressió).

Aplicacions de la cromatografia d’exclusió:

a) Cromatografia de filtració sobre gel: dissolvents aquosos i farcits

hidrofílics per a mostres hidrosolubles.

b) Cromatografia de penetrabilitat sobre gel: dissolvents no polars i

farcits hidrofòbics per a substàncies solubles en dissolvents no polars.

Avantatges i inconvenients de la seva aplicació:

- Avantatges:

• Temps de separació curts i ben definits.

• Bandes estretes.

• No hi ha pèrdua de mostra (els soluts no interaccionen amb la fase

estacionaria).

• No es desactiva la columna degut a l’absència d’interacció del solut amb el

farcit.

- Inconvenients:

• Només es pot acomodar un numero limitat de bandes (escala de temps

curta).

• No és aplicable a mostres de similars dimensions, es necessita una

diferència d’ almenys 10% en els pesos moleculars.


- 85 -

2.6.4 Cromatografia d’intercanvi iònic

La cromatografia d’intercanvi iònic està basada en l’atracció entre ions del solut i

punts carregats que existeixen en la fase estacionaria. En el cas

d’intercanviadors aniònics, grups carregats positivament en la fase estacionaria

atreuen anions del solut. Els intercanviadors catiònics contenen punts carregats

negativament que atreuen cations del solut.

Els intercanviadors iònics es classifiquen en àcids o bàsics forts o dèbils. Les

resines àcides fortes segueixen inclús en dissolucions molt àcides, en canvi, les

resines àcides dèbils es protonen a un pH pròxim a 4 i perden la seva capacitat

d’intercanvi catiònic. Els grups molt bàsics d’amoni quaternari segueixen sent

catiònics a qualsevol valor de pH. Els bàsics dèbils d’amoni terciari es

desprotonen en dissolucions moderadament bàsiques i perden llavors la seva

capacitat.

Figura 22: Processos d’intercanvi iònic.

Les resines d’intercanvi iònic tenen aplicació en estudis on intervenen molècules

petites (PM=500) que poden penetrar en els porus petits de la resina. Els

intercanviadors iònics de poliestirè són tant grans que les macromolècules molt

carregades, com les proteïnes, es poden enllaçar irreversiblement a ells. Els de

cel·lulosa serveixen per a intercanvi iònic de macromolècules. Els gels

d’intercanvi iònic s’usen en el cas de molècules grans com són les proteïnes.

Quan les separacions exigeixen condicions químiques fortes s’utilitzen

intercanviadors iònics inorgànics.


- 86 -

Taula 9: Eluents típics.

Analits Sense supresió Amb supresió

AnionsNa BenzoatKH Ftalat

NaOHNa2CO3

NaHCO3

CationsÀc. BenzoicÀc. Ftàlic

HClH2SO4

CH3SO3H


- 87 -

CAPÍTOL 3:

PART EXPERIMENTAL

3.1 FIA

3.1.1 Reactius

Àcids i bases:

o Àcid Clorhídric al 37% (HCl) (Merck, r.a.)

o Hidròxid de sodi (NaOH) (Merck, r.a.)

o Clorur de Sodi (NaCl) (Merck, r.a.)

Dissolvents:

o Àcid tricloroacètic (TCA)

o Dimetilsulfòxid (DMSO)

o Metanol (MeOH)

o H2O destilada Milli-Q


- 88 -

3.1.1 Fàrmacs

o Efavirenz ( C14H9ClF3NO2 )

3.1.1 Dissolucions

Les dissolucions que es preparen són les següents:

o Dissolució mare del fàrmac

o Dissolució tampó àcid

o Dissolució neutralitzada o valorant

3.1.2.1 Dissolució mare dels fàrmacs

Es prepara la dissolució mare de concentració d’analit entorn de 10-3 M. El pes

de fàrmac necessari, el volum de dilució i la concentració final de la dissolució

s’indica en la taula següent:

Fàrmac Pes molecula(g/mol)

Volum real (mg)

Volum final (ml)

Concentració(M)

Efavirenz 315,675 5 5 2,80E-03

Taula 10: Pes molecular, pesades i concentració real de la dissolució mare del fàrmac.

Una vegada realitzada la pesada, es prepara la dissolució en un matràs aforat de

10ml, enrassat amb aigua Milli-Q. Després passem la solució a tubs de vidre, per

tal de facilitar-ne la manipulació i conservació en nevera, evitant així possibles

degradacions.

3.1.2.2 Dissolució tampó àcid

Es prearen 500 ml de dissolució tampó àcid. Es tracta d’una mescla d’ àcids amb

la qual es pot regular el pH durant les valoracions espectrofotomètriques en un


- 89 -

ampli interval. La composició molar de l’ esmentada dissolució és la següent:

0,06 M HCl + 0,02 M Na CH3COO + 0,02 M H3BO3 + 0,02 M NA2HPO4.

Taula 11: Composició de la solució amortidora.

3.1.2.3 Dissolució neutralitzadora o valorant

Per a neutralitzar progressivament les diferents substàncies presents en la

dissolució valorant, s’utilitza una solució de NaOH 1,5 M.

3.1.3 Instrumentació

3.1.3.1 Estudis d’ estabilitat

Per a realitzar les mesures espectrofotomètriques d’estabilitat s’ha emprat l’equip

següent:

• Espectrofotòmetre UV PERKIN- ELMER λ 19, controlat per ordinador.

• Cubeta de quars HELMA QS amb 1cm de camí òptic i cares paral·leles

esmerilades.

3.1.3.2 Per les variacions espectrofotomètriques

En les valoracions espectrofotomètriques àcid-base s’ha emprat la següent

instrumentació:

PRODUCTE PES REAL (g)

CONCETRACIÓ(M)

Acetat de sodi 0,82 0,02Àcid Bòric 0,62 0,02

Hidrogenfosfatde sodi 1,42 0,02

Àcid Clorhídric 2,5ml 0,06


- 90 -

• Espectrofotòmetre UV PERKIN- ELMER λ 19, controlat per ordinador.

• Cubeta de quars HELMA QS adaptada pel flux continu amb un volum intern

de 60 µl, camí òptic de 1cm i cares paral·leles esmerilades.

• pH –metre ORION Research EA 920, amb un elèctrode de referència de

Ag/AgCl.

• Agitador magnètic SBS A-163 i amb un nucli magnètic d’agitació.

• Pipetes automàtiques de volum variable NICHIRYO DE VOLUMS 0,5-10,

10-100, 100-1000 i 1000 1000-5000 µl.

• Bomba peristàltica WATSON-MARLOW 505 DU.

• Tubs de bombeig de Tygon estàndard.

A la figura 23 es mostra un esquema del muntatge realitzat per a dur a terme les

valoracions espectrofotomètriques àcid-base i a la figura 17 una fotografia del

mateix.

Figura 23: Esquema del muntatge utilitzat en les valoracions espectrofotomètriques.


- 91 -

Figura 24: Fotografia de l’equip emprat, realitzada al laboratori del departament de Química Analítica de la Facultat de Química (UB).

3.1.4 Procediment experimental

La caracterització del fàrmac analitzat en l’assaig de FIA es realitzarà de dues

formes diferents:

Mitjançant estudis espectrofotomètrics d’estabilitat.

Mitjançant valoracions àcid-base en continu amb detecció

espectrofotomètrica per l’estimació dels valors de pKa del fàrmac.

3.1.4.1 Estudis d’estabilitat

Per dur a terme tant les proves d’estabilitat com les valoracions pròpiament

dites, s’ha de posar en marxa l’espectrofotòmetre uns minuts abans perquè

s’estabilitzi. Després s’ajusten les condicions de treball a l’ordinador: mesura

d’absorbància de 0 a 1 (eix d’ordenades), longitud d’ona inicial 400 nm, i final,

200 nm (eix d’abscisses) i la velocitat d’escombrada de l’espectrofotòmetre 240

nm/min.

Abans d’iniciar les mesures de les mostres, es fa un blanc amb aigua Milli-Q,

pressionant la tecla A d’autozero. A continuació, s’introdueix la mostra a la

cubeta i s’enregistra l’espectre. En la primera sèrie es pretén determinar

l’estabilitat del fàrmac poques hores després de la seva dissolució, o just després


- 92 -

de la seva preparació. I En la segona sèrie, es vol determinar com afecta al

fàrmac el pas del temps de forma més àmplia.

Per dur a terme el procés es prepara, a partir de la dissolució mare, la dissolució

del fàrmac amb aigua Milli- Q fins arribar al volum desitjat:

Volum Final

(ml)

EFEVIRENZ 0,17 10 5 X 10-3

FÀRMACVolum solució

mare (ml)Concentració

(M)

Taula 12: Dissolucions preparades per l’estudi d’estabilitat del fàrmac.

3.1.4.2 Valoracions espectrofotomètriques en continu

La caracterització del fàrmac estudiat també es du a terme mitjançant

valoracions àcid-base amb recirculació, enregistrant i/o prenen mesures

espectrofotomètriques amb l’objectiu de poder calcular finalment els valors de

pKa de la substància analitzada.

S’ha estudiat un ampli interval de PH en un ampli interval, aproximadament de

pH 1,5 a pH 12; en un interval de longituds d’ona de 200 a 400 nm.

Abans d’iniciar cada valoració es realitza el calibratge del pH-metre, mitjançant

dues solucions tampó estandarditzades de pH 7,00 ± 0,01 i pH 4,00 ± 0,01.

Aleshores, es comprova el calibratge mitjançant una solució de hidrogenftalat de

potassi 0,1 M (pH= 4,01) i una solució de tetraborat de sodi 0,1 M (pH= 9,21).

Després, es connecta la bomba per tal de recircular les dissolucions a través del

sistema tancat. Primer es recircula el blanc, és a dir, el volum de dissolució

tampó àcid (80,06 M HCl + 0,02 M NaCH3COO + 0,02 M H3BO3 + 0,02 M Na

HPO4) a través dels tubs de tefló que estan connectats a tot el sistema. La

composició de la dissolució a valorar es descriu en la taula següent:


- 93 -

Volum Final

(ml)

EFEVIRENZ 0,17 10 5 X 10-3

FÀRMACVolum solució

mare (ml)Concentració

(M)

Taula 13: Volum necessari i concentració final de la dissolució el l’efavirenz.

A continuació, s’enregistra l’espectre del blanc pressionant la tecla A d’autozero.

A partir de la dissolució mare del fàrmac, es prepara la dissolució corresponent al

fàrmac en medi àcid aquós amb una molaritat al voltant de 5 x 10-5, el que

permetrà que a les longituds d’ona de treball l’absorció sigui moderada.

Seguidament, s’introdueix un volum determinat de dissolució mare del fàrmac,

prèviament temperat fora de la nevera, al vas de valoració que conté un nucli

magnètic amb el qual es mantindrà la solució agitada durant tota la valoració.

Una vegada activat l’agitador magnètic, també s’introdueix l’elèctrode del pH-

metre al vas de precipitats vigilant de no tocar les parets. Quan s’observa que la

lectura de pH s’estabilitza, s’enregistra el primer espectre i s’anota

correlativament la primera mesura de pH. A continuació, es va afegint un volum

determinat de NaOH 1,5 M (addicions entre 5 i 40 μl, depenen del punt de

valoració, intentant obtenir un elevat número de mesures en la zona pròxima al

punt d’equivalència), s’agita i es deixa recircular uns minuts perquè

s’homogeneïtzi la solució. Seguidament, es mesura el pH i s’enregistra l’espectre.

Es repeteix aquest procediment successivament amb noves addicions de valorant

fins arribar a un pH 12, aproximadament, situació en la qual es dóna per

acabada la valoració. Aquest procediment el repetim tres vegades.

Entre espectre i espectre s’ha d’esperar aproximadament uns 5 minuts, perquè

els valors de pH mesurats amb el pH-metre s’estabilitzin. D’aquesta forma, es

registra per a cada valor de pH un espectre.

3.1.4.3 Estudi dels diferents dissolvents per precipitar proteïnes del plasma


- 94 -

El següent estudi realitzat amb FIA ha estat la valoració dels diferents dissolvents

per precipitar les proteïnes que conté el plasma, a més a més de la dissolució

transportadora més favorable pel procés.

S’ han preparat diferents dissolucions transportadores que es mostren a la taula

següent, a més a més d’aigua Milli-Q que també utilitzarem:

Dissolucions Molaritat (M)

Volum afegit

Volum Final (ml)

HCl 0,3 2,55 ml 100NaOH 0,3 1,2 gr 100NaCl 0,2 1,16 gr 100

Taula 14: Dissolucions transportadores a utilitzar

Preparades les dissolucions transportadores, el següent pas realitzat és la dilució

del plasma amb diferents dissolvents que es mostren a la taula següent:

Dissolvents Dilució amb plasmaDMSO 1:2ACN 1:2

MeOH 1:2TCA 1:1

Taula 15: Dissolvents a utilitzar.

Fem les dilucions esmentades en diferents tubs de precipitats i els introduïm a la

centrífuga a 4600rpm i durant 15 minuts per tal de que precipitin millor les

proteïnes del plasma i no quedi sobrenedant.

Canviem les dissolucions obtingudes després de centrifugar a un altre tub de

precipitats i ja podem injectar.

Primer utilitzem com a dissolució transportadora Aigua Milli-Q i la fem passar pel

microtúbol del espectrofotòmetre, tot seguit injectem les diferents dissolucions

preparades. Les gràfiques obtingudes són les següents:

Aigua Milli-Q


- 95 -

Figura 25: Pics de TCA + plasma i de MeOH +plasma.

Figura 26: 2 Pics de ACN + plasma i l’últim de DMSO+plasma.

Canviem la dissolució transportadora després de injectar els quatre

dissolvents, i es decideix prescindir del DMSO ja que el temps que està

dins de la cel·la és molt gran i, per tant, com podem comprovar que el

temps necessari per obtenir tot el pic és de 200 segons.

A continuació es mostren els cromatogrames dels altres dissolvents:

HCl

Figura 27: Per ordre d’aparició=> pic de TCA+plasma, pic de MeOH+plasma i pic de ACN+plasma.


- 96 -

NaCl


NaOH


S’imprimeixen els cromatogrames i calculem amb una regla, el temps

necessari per poder veure tot el pic i l’absorbància de cada un.


- 97 -

Després de l’estudi realitzat, concloem que el millor agent per precipitar

les proteïnes del plasma és l’ ACN, doncs comparat amb els altres és el

que ens dona una millor pic en un temps menor (60s).

A partir de 2AU l’absorbància ja no és lineal, per això seleccionem un

agent precipitant que a més de retindre’s un temps baix a la cel·la,

proporciona una baixa senyal del blanc. S’ha comprovat que les millors

condicions són l’ACN com a dissolvent juntament amb HCL com a

dissolució transportadora.

3.2 HPLC

3.2.2 Reactius

Àcids i bases:

o Àcid acètic (HAC)

o Amonìac (NH3)

Dissolvents:

o Àcid tricloroacètic (TCA)

o Dimetilsulfòxid (DMSO)

o Metanol (MeOH)

o H2O destilada Milli-Q

3.2.2 Fàrmacs


- 98 -

FÀRMACS COMPOSICIÓ CASA COMERCIAL

Zalcitabina (ddC) C9H13N3O3 FluckaDidadosina (ddI) C10H12N4O3 Flucka

Emtricitabina (FTC) C8H10FN3O3S Bristol-Meyers SquibbEstavudina (d4T) C10H12N2O4 Sigma, r.aZidovudina (AZT) C10H13N5O4 Sigma, r.aNevirapina (Nev) C15H14N4O Boehringer Ingelheim r.aDelavirdina (DLV) C22H28N6O3S Pfizer

Indinavir (IDV) C36H47N5O4 MerckSaquinavir (SQV) C38H50N6O5 RocheLopinavir (LPV) C37H48N4O5 Abbot Lab.Ritonavir (RTV) C37H48N6O5S2 Abbot Lab.Nelfinavir (NFV) C32H48N4O5 Pfizer

Taula 16: Fàrmacs i casa que els fabrica.

3.2.3 Preparació de les dissolucions mare dels fàrmacs

Es preparen les solucions mare de cada fàrmac de concentració 1mg/mL:

FÀRMAC ABREBIAVIÓ PER REAL (mg) VOLUM FINAL CONCENTRACIÓ (mg/ml)

Zalcitabina ddC 5,04 5 1,04Nevirapina Nev 5,65 5 1,04Emtricitabina FTC 5,09 5 1,09Didadosina DdI 4,88 5 0,98Zidovudina AZT 5,07 5 1,07Lamivudina 3TC 5,01 5 1,01Estabudina d4T 5,11 5 1,11Indinavir IDV 4,88 5 0,98Delavirdina DLV 5,02 5 1,02Saquinavir SQV 5,27 5 1,04Ritonavir RTV 5,03 5 1,03Lopinavir LPV 4,48 5 0,88Nelfinavir NFV 5,49 5 1

Taula 17: Solucions mare preparades.

El procediment a seguir és:

• Pesar en una balança analítica 5mg de cada fàrmac.


- 99 -

• Enrasa-los en matrassos aforats de 5mL que ens permet saber-ne la

concentració exacta.

• Tots es dissolen en H2O doblement desionitzada (Milli-Q) excepte la

Nevirapina que es dissol en Metanol.

A partir de les dissolucions mare de cada fàrmac es preparen les dissolucions de

treball per simple dilució amb H2O i també preparem la mescla problema.

En el nostre cas, la mostra problema és de 7 fàrmacs que corresponen als

inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòtids (NNRTIs) i als

inhibidors de la proteasa (IP):

1) 100μl de cada fàrmac:

NVP + SQV + IDV + NFV + RTV + EFV + LPV

2) 700μl mescla + 300μl metanol

Algunes de les solucions de treball ja estan preparades i són estables en el temps

però, d’altres no són estables i per això les hem de prepara de nou.

3.2.4 Preparació del plasma

En el cas del plasma una forma simple de pretractament és la precipitació de la

proteïna seguit de centrifugació per a aconseguir un sobrenedant clar per el

anàlisi.

El plasma està congelat en tubs de plàstic de 5mL. Primer hem de descongelar el

plasma posant-lo uns minuts en bany d’ultrasons. Un cop descongelat hem de fer

precipitar les proteïnes per evitar que aquestes interfereixin en la determinació.

El procediment per fer la precipitació de proteïnes és:

1) En un tub posem:

- Doble de DMSO que de plasma


- 100 -

- Doble de ACN que de plasma

- Doble de MeOH que de plasma

- Igual TCA que de plasma

2) Precipitem i posem al centrifugador a 4.600rpm durant 15min.

NOTA:

Si el sobrenedant, que és el que ens interessa, queda com a brut, ho tornem a

posar a la centrifugadora a 10.000rpm durant 12min.

3.2.5 Preparació de la fase mòbil

La fase mòbil consta de 2 fases: - orgànica: acetonitril

- aquosa: àcid acètic al 1% a pH≈ 3,5

Aquesta última fase (aquosa) es prepara de la següent manera:

• En un vas de precipitats de 1.000mL, dissolem 10mL d’àcid acètic en

990mL d’aigua Milli-Q.

• Calibrar el pHmetre amb les dissolucions de pH 7 i 4.

• Ajustar el pH a 4,5 aproximadament amb NH3concentrat.

• Agitar per homogeneïtzar la dissolució.

• Filtrar mitjançant un Kit de filtrat de 0,45μm.

3.2.6 Preparació de mostres

Per a la determinació dels diferents experiments, és necessari fer dos tipus de

tractaments diferents sobre la mostra. Aquests tractaments són:


- 101 -

1) Afegir una quantitat de fàrmac coneguda abans del tractament de la mostra:

• En un tub de plàstic apta per a centrifuga, pipetejar Xμl de la solució stock

(aquesta conté tots els fàrmacs a analitzar) i afegir Yμl de plasma,

prèviament descongelat.

• Agitar la mescla en un vortex durant 30 segons.

• Afegir Xμl d’ACN, en funció del anàlisi a determinar, per a la precipitació de

les proteïnes del plasma.

• Tornar a agitar la mostra durant 30 segons per a que quedi ben

homogènia.

• Centrifugar a 10.000rpm durant 12min.

• Injectar el líquid sobrenedant per HPLC.

2) Afegir una quantitat de fàrmac coneguda després del tractament de la mostra:

• En un tub de plàstic apta per a centrifugar, pipetejar Xμl de plasma

descongelat i afegir Yμl d’ACN.

• Agitar la mescla durant 30 segons per a afavorir la seva homogeneïtzació.

• Centrifugar a 10.000 rpm durant 12min.

• Agafar Yμl del líquid sobrenedant i afegir Xμl de la solució stock de tots els

fàrmacs a analitzar.

• Agitar la mescla en vortex i injectar la solució per HPLC.

Mostres realitzades:

10/03/08


- 102 -

NomA.1A.2A.3A.BB.1B.2B.3B.BC.1C.2C.3C.BD.1D.2D.3E.1E.2E.3F.1F.2F.3

MOSTRA BLANC437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

Solució437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugarMOSTRA BLANC

437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

MOSTRA BLANC437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

Taula 18: Mostres preparades el 10/03/08.

17/04/08

Nom1.11.22.12.23.13.24.14.2 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

Solució475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

Nom5.15.26.16.27.17.28.18.2

Solució490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar


490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar



- 103 -

05/05/08

Nom2.32.44.34.41.A1.B2.A2.B3.A3.B4.A4.B5.A5.B6.A6.B7.A7.B8.A8.B

200microL 4.4 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)200microL 4.3 + 200microL. Milli-Q (1:1)

200microL 4.4 + 400microL. Milli-Q (1:2)

200microL 4.4 + 200microL. Milli-Q (1:1)200microL 4.3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 4.4 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 4.3 + 400microL. Milli-Q (1:2)

200microL 2.4 + 200microL. Milli-Q (1:1)200microL 2.3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.4 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.3 + 400microL. Milli-Q (1:2)200microL 2.4 + 400microL. Milli-Q (1:2)

200microL 4.3 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)

Solució475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar



200microL 2.3 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)200microL 2.4 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)


13/05/08

Nom2.52.C2.D3.C3.D4.C4.D

Solució475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

200microL 2.5 + 200microL. Milli-Q (1:1)200microL 2.5 + 200microL. Milli-Q (1:1)

200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 400microL. Milli-Q (1:2)200microL 2.5 + 400microL. Milli-Q (1:2)


18/05/08 i 19/05/08


- 104 -

Nom2.52.6123456

1.DP2.DP3.DP4.DP5.DP6.DP


475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)

Taula 22: Mostres preparades el 18/05/08i el 19/05/08.

30/05/08

A: 0,16ppm = 50microl Fàrmacs 16ppm + 4950microl plasmaB: 0,4ppm = 125microl Fàrmacs 16ppm + 4875microl plasmaC: 0,8ppm = 250microl Fàrmacs 16ppm + 4750microl plasmaD: 2ppm = 100microl Fàrmacs 100ppm + 4900microl plasmaE: 5ppm = 250microl Fàrmacs 100ppm + 4750microl plasmaF: 8ppm = 400microl Fàrmacs 100ppm + 4500microl plasmaBL: Blanc plasma

NomA1A2A3B1B2B3C1C2C3D1D2D3E1E2E3F1F2F3

BL1BL2BL3

250microL de B +500microL d'ACN (1:2)250microL de B +500microL d'ACN (1:2)250microL de C +500microL d'ACN (1:2)250microL de C +500microL d'ACN (1:2)250microL de C +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)

250microL de BL +500microL d'ACN (1:2)

Solució250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de B +500microL d'ACN (1:2)

250microL de E +500microL d'ACN (1:2)250microL de E +500microL d'ACN (1:2)250microL de E +500microL d'ACN (1:2)


250microL de F +500microL d'ACN (1:2)250microL de F +500microL d'ACN (1:2)250microL de F +500microL d'ACN (1:2)




- 105 -

3.2.7 Instrumentació

3.2.7.1 Materials

• Agitador vortex Vibramix Ovan

• Agitador magnètic SBS A-163 i nucli magnètic d’agitació

• Centrifuga Rotenta 460 RS

• Columna per a cromatografia: (phenomenex) singergy Hidro-RP

• Cromatògraf Agilent HP 1100 series DAD/FLD

• pHmetre ORION Research EA 920, amb un elèctrode de referència de

Ag/AgCl

• Pipetes automàtiques de volum variable NICHIRYO de volums 0,5-10, 10-

100, 100-1.000, 1.000-5.000 μl

• Tubs de plàstic per a la centrífuga

• Kit de filtrat en buit amb filtres de 0,45 μl


- 106 -

Figura 30: Fotografia de la HPLC utilitzada.

3.2.7.2 Condicions cromatogràfiques utilitzades

• Fase mòbil: - fase aquosa: solució tampó de NH4Ac. a pH 3,5

- fase orgànica: acetonitril

• Cabal: 0,5ml/min.

• Gradient:

Temps (min) % A % B

0 25 751 55 45

4,5 55 455,5 80 208 80 20

Taula 24: Gradient utilitzat.

• Post run: 4 minuts

• Run time: 8 minuts

Dissolvents

Desgasificador

Bomba i

vàlvula purga

Detector UV (DAD)

Detector FLD


- 107 -

• Detector UV: λ= 240nm, λ= 260nm, λ= 280nm

• Loop: 20μl

3.2.8 Injecció i obtenció del cromatograma

Els passos a seguir són:

- Omplir les ampolles amb la fase mòbil acabada de filtrar i amb la fase

orgànica.

- Comprovar que la fase aquosa està connectada al canal A i la fase orgànica

al canal B.

- Encendre l’aparell HPLC.

- Purgar el sistema durant 5 minuts fent passar la fase mòbil i posem el

gradient de mescla tampó- acetonitril de tal forma que als 0, 1, 4.5, 5.5 i 8

minuts tinguin els % d’acetonitril a 25, 55, 55, 80 i 80 respectivament.

Quan purguem, la vàlvula de purga ha d’estar oberta evitant així que la

pressió augmenti trencant-se la columna. Purgant ens assegurem que no

quedin restes d’altres substàncies en la columna que puguin contaminar la

mostra.

- Un cop passats els 5 minuts, tanquem la vàlvula de purga i fixem el cabal

de pas de circulació pels conductes a 0,5ml/min i la velocitat de flux ha

d’augmentar en 0,15ml/min fins arribar al cabal desitjat (0,5ml/min).

- Fixar el % de compost de cada canal.

- Un cop l’aparell està apunt, hem d’injectar la mostra però abans s’ha de

rentar la xeringa d’injecció varies vegades amb H2O Milli-Q per evitar

contaminacions.

- Fer un autozero del sistema.


- 108 -

- Injectar la mostra. Per a realitzar la injecció s’ha de posar el punt d’injecció

en Load, injectar i girar la vàlvula a Inject quedant així la mostra introduïda

en el sistema.

- Un cop injectada la mostra, hem d’esperar uns 15 minuts per a que puguin

aparèixer els pics ja que al passar la mostra per el detector, es modifica la

línia base obtenint -se unes senyals que són els pics. L’àrea dels pics és el

valor que utilitzem per a quantificar les mostres.

- Un cop transcorreguts els 15 min, hem d’esperar uns 6min més abans de

poder fer una altra injecció ja que durant aquests 6 min la columna tona a

les condicions inicials establertes de forma gradual.

- Un cop finalitzades les injeccions ha fer, hem de netejar el cromatògraf fent

circular un 100% de B a cabal 0,5ml/min durant 20 minuts.

NOTA:

Els compostos que han travessat la fase estacionaria són transportats per la fase

mòbil a un detector que els registra en forma de corbes gausianes (forma de

campana). Aquest pics i la línia base registrats formen el cromatograma.


- 109 -

CAPÍTOL 4:

RESULTATS

EXPERIMENTALS

Utilitzant el mètode HPLC, hem realitzat diferents proves amb la finalitat de

veure sota quines condicions podem obtenir un millor percentatge de recuperació

de fàrmacs.

Nosaltres hem treballat amb alguns fàrmacs de la família Inhibidors de la

transcriptasa inversa no anàlegs nucleòsids (NNRTI’s) i amb alguns de la família

Inhibidors de la Proteasa (IP).


- 110 -

4.1 Estudi de les condicions òptimes de treball

Les condicions òptimes són aquelles que ens permeten observar en els

cromatogrames, obtinguts per HPLC, una separació de fàrmacs correcte, és a dir,

que no hi hagi solapacions dels pics.

Els analits interaccionen amb la columna de manera que uns queden menys

retinguts i altres més surtin així aquests últims més tard.

El temps de retenció (tR ) pot ser modificat variant:

a) El cabal: a més cabal → més ràpid surten els pics.

b) La columna: com més llarga → tR més llargs.

c) % fase aquosa i % fase orgànica.

Per a trobar les condicions òptimes del nostre estudi, el que hem fet és

modificar:

1) El pH: afecta a la hidrofobicitat del compost.

2) El gradient: separa els components de la mostra com a una funció de la

afinitat del compost per la fase mòbil utilitzada respecte a la afinitat per la

fase estacionaria.

3) Dissolvent que fa precipitar les proteïnes del plasma.

Per dur a terme aquest estudi hem utilitzats els següents fàrmacs:

- Efavirenz (EFV)

- Nevirapina (NVP)

- Indinavir (IDV)

- Nelfinavir (NFV)

- Ritonavir (RTV)


- 111 -

- Saquinavir (SQV)

- Lopinavir (LPV)

Abans de començar l’estudi, cal esmentar que el Lopinavir sempre donarà els

pitjors resultats en totes les condicions ja que la seva absorbància és molt petita

i és per això que és molt difícil de detectar.

4.1.1 Preparació de les diferents mostres a analitzar

27/02/08

Preparació Mescla 1:

1) 100μl de cada fàrmac (total 700μl mescla fàrmacs) + 300μl H2O Milli-Q

2) 500μl mescla 1) + 4500μl H2O Milli-Q = MESCLA 1 (M1)

11/03/08


1) 100μl cada fàrmac (total 700μl) + 300μl H2O Milli-Q

2) 100μl mescla 1) + 900μl H2O Milli-Q = MESCLA 2 (M2)


1) 100μl cada fàrmac (total 700μl) + 300μl H2O Milli-Q

2) 100μl mescla 1) + 900μl Acetonitril = MESCLA 3 (M3)

19/03/08


1) 100μl cada fàrmac (total 700μl) + 300μl Metanol = MESCLA 4 (M4)


- 112 -

4.1.2 Estudi del Dissolvent a escollir

Aquest estudi consisteix en realitzar diferents experiments per tal d’escollir aquell

dissolvent que deixi el plasma més net, sense interferències, és a dir, aquell que

fa que precipitin totes o la gran majoria de proteïnes contingudes en el plasma.

Els dissolvents utilitzats són:

- Dimetil sulfòxid (DMSO)

- Acetonitril (ACN)

- Cloroform (TCA)

- Metanol (MeOH)

Per tal d’escollir el més adequat, les condicions de treball han de ser iguals en

totes les injeccions ja que sinó el resultat obtingut no seria fiable. Com la mostra

només està feta de plasma + el dissolvent a estudiar, l’únic que haurem de fixar

serà el gradient i aquest serà igual a:

Temps (min) % A % B

0 25 752 25 754 25 757 80 2010 80 20

Taula 25: Gradient utilitzat.

Les injeccions realitzades són:

03/03/08 i 04/03/08

03 i 03 ( nº injecció segons el dia): Plasma + DMSO


- 113 -

m in0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

DAD1 A, Sig=260,10 Ref=500,100 (ARANTXA\03030803.D)

0.4

65

0.51

6 0

.63

3

1.1

31

1.5

01

1.8

24 2

.027

2.4

02

2.6

51

3.0

16

3.7

85

4.7

89

6.4

31

6.8

72

7.1

49

7.2

49

7.3

98 7

.60

6 7

.776

7.9

41 8

.130 8

.29

3 8

.40

2

8.7

21 8

.870

9.0

24

9.3

33

9.6

51

9.8

47

10.

611

10.

971

11

.257

11

.490

12

.034

Figura 31: Cromatograma Plasma + DMSO.

Observant el cromatograma podem veure que hi ha un gran nombre

d’interferències, per tant, descartem el DMSO com a dissolvent a utilitzar ja que

busquem aquell reactiu que doni menys nombre de pics i aquests, com més

petits millor.

04 i 02: Plasma + ACN

m in0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350


0.4

05

1.5

17

1.8

10

2.3

79

6.4

22

6.8

58

7.2

69

7.4

01 7.5

56

7.8

12

7.9

16

8.2

94 8

.39

0 8

.65

3

9.3

23

9.6

51 9

.85

2

10.

265

10.

592

11.

250

11

.532

12.

036

12.

588

13.

055

Figura 32: Cromatograma Plasma + ACN.

Observant el cromatograma podem veure que l’ACN és un bon candidat a

utilitzar ja que deixa la matriu molt neta, és a dir, reacciona amb la gran majoria

de proteïnes del plasma. Podem apreciar alguna interferència però aquesta és

tant petita que és poc probable que afecti a la matriu.


- 114 -

05 i 08: Plasma + MeOH

m in0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


0.4

40

0.6

75

0.7

51

1.1

33

1.5

27

1.8

49

2.4

14 2

.673

3.0

28

4.6

04

6.4

22

6.8

68

7.1

35 7

.283 7

.566

7.8

06

8.1

41 8

.295 8.4

00

8.6

58 8

.843

8.9

59

9.3

37

9.6

57

9.8

62

10.

618

11.

271

11.

528

12

.064

Figura 33: Cromatograma Plasma + MeOH.

Mirant el perfil cromatogràfic del Metanol podem dir que aquest va millor que el

DMSO però, si el comparem amb el perfil cromatogràfic del ACN veiem que les

interferències són més apreciable en el MeOH, per tant, com hem de descartar,

ens quedem amb el ACN que dona millors resultats.

06 i 00: Plasma + TCA

m in0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

400


0.3

90 0.4

93 0

.59

7

1.5

74

1.9

04

2.0

76

2.4

37

2.6

90

3.1

39

3.5

42

5.6

32

6.4

14

6.8

63

7.0

15

7.1

10

7.2

57

7.3

97 7

.569

7.8

00

8.1

47

8.2

79

8.4

37

8.7

49

8.8

17

9.0

39

9.3

28

9.6

57

9.94

1

10.

367

10

.630

10

.972

11

.422

11.

856

12.

253

12.

476

12.

830

13.

486

13.

936

14.

454

14.

705

Figura 34: Cromatograma Plasma + TCA.

El Cloroform seria un altre bon candidat, no obstant, preferim l’ACN ja que el

TCA presenta interferències al voltant dels 9-10 minuts que si podrien afectar a

la matriu (plasma).


- 115 -

Basant-nos en els diferents experiments, creiem que el dissolvent que reacciona,

és a dir, que precipita la gran majoria de proteïnes és l’ACN ja que pràcticament

no s’observen pics en el cromatograma i això és el que interessava torbar en

aquest estudi. Les mostres ha realitzar en el següents estudis, estaran totes

fetes amb acetonirtil (ACN) assegurant-nos així un elevat percentatge de

recuperació de fàrmacs.

4.1.3 Modificacions en el gradient

Canviant el gradient, el que intentem aconseguir es poder veure tots els fàrmacs

separats sense que es solapin entre ells. Modificant el gradient el que

aconseguim és variar el tR de cada un d’ells de manera que si en un determinat

gradient un parell de fàrmacs surten solapats aquests els podem arribar a

separar arribant a així a veure’ls tots.

Sovint fa falta realitzar una sèrie de proves per tal d’optimitzar el gradient de

forma que permeti una bona separació dels compostos.

Per a la realització d’aquest estudi fixem del HPLC les següents condicions:

Fase mòbil A: Àcid acètic (HAc) al 1%; pH= 4,5 amb NH3.

Fase B: ACN

Cabal (Q)= 0,5ml/min

Experiments:

28/02/08

Els gradients utilitzats són:


- 116 -

G ra d ie n tsNum e ro T e m p s %B N um ero T em ps % B

0 40 0 3 01 4 40 4 4 3 0

7 80 7 8 01 0 80 10 8 02 40 2 2 5

2 5 80 5 4 2 57 80 7 8 0

1 0 80 10 8 00 40

3 3 807 80

1 0 80

Taula 26: Gradients utilitzats.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3

Gradient 4

Gradient 5

cc

Gràfica 9: Comparació gradients.


28020800: M1 i Gradient 1 → s’observen 6 fàrmacs.

28020801: M1 i Gradient 2 → 6 fàrmacs.





- 117 -

m in0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80


0.0

66 0.3

66

0.4

92

0.8

02

1.4

99

2.4

16

2.6

69

3.3

34

3.6

78

6.8

34

7.1

36

7.4

92

7.8

73

8.3

21 8

.43

1

8.8

64

9.1

37

9.4

08

9.6

27

10.

50

6

109

56

Figura 35: Cromatograma tipus dia 28/02/08.

En tots ells s’observen 6 fàrmacs, per tant, cap del anteriors gradients serveixen

ja que dels 7 analits presents en la mescla només se’n observen 6.

03/03/08


GradientsNumero Temps %B

2 251 4 25

7 8010 80

2 252 5 80

7 8010 80

0 253 3 80

7 8010 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3

Taula 27: Gradients utilitzats. Gràfica 10: Comparació gradients.






- 118 -

Els cromatogrames obtinguts no són gens coherents, els perfils cromatogràfics

tenen una forma molt rara i això ens fa pensar que la columna està infectada,

per tant, s’ha de canviar la columna ja que els resultats que obtindríem en un

futur no serien raonables ni fiables.

A partir d’ara, utilitzarem una columna de la mateixa casa comercial però de

mida més petita. El fet de que sigui més curta la columna afectarà al temps de

retenció dels fàrmacs sent aquests més curts.

11/03/08

El gradient utilitzat és:


2 251 5 80

7 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 1

Taula 28: Gradient utilitzat. Gràfica 11: Gradient 1.



m in0 2 4 6 8 10

mAU

- 40

- 20

0

20

40

60

80

100


0.3

78 0

.566

1.00

9

1.3

14

1.7

89

2.7

53

2.9

80

3.5

34

4.4

26

5.0

59

5.3

47

5.6

12

5.9

30 6

.130

6.2

99 6

.404

6.6

06 6

.769

6.8

69

7.25

9

7.6

09 7

.804

8.1

10

8.5

09

8.8

67

9.3

38

9.7

32

10.

039

10.

353

10.

572

10.

688

11.

191

Figura 36: Cromatograma dia 11/03/08.


- 119 -

L’ordre de sortida dels medicaments és:

- 1r pic: Nevirapina

- 2n: Indinavir

- 3r: Saquinavir

- 4t: Ritonavir

- 5è: hauria de ser el Lopinavir

- 6è: hauria de ser l’Efavirenz

- 7è: hauria de ser el Nelfinavir

En totes les injeccions fetes fins ara només apareixen 6 analits, per tant, hem de

seguir buscant ja que segurament el Lopinavir surt solapat. El fet de que en cap

moment s’hagi pogut veure una separació correcte de tots els fàrmacs de la

mescla ens fa plantejar que el Lopinavir s’ha degradat amb el temps.

Per a poder veure que és el que falla, el que fem és diluir la mostra mare de

Lopinavir amb aigua i injectar-la al cromatograma.

11030801: Lopinavir i Gradient 1.

m in0 2 4 6 8 10

mAU

- 40

- 30

- 20

- 10

0

10

20

30


0.1

80

0.3

76 0

.56

1

1.3

27

1.8

19

4.4

27

5.0

70

5.6

18

6.1

30 6

.248

6.4

00

6.8

15

7.3

10

7.6

27

7.8

36

8.5

62

8.9

15

9.3

82

11.

443

Figura 37: Perfil cromatogràfic del Lopinavir.

El fet de que aparegui un pic als 6minuts ens fa descartar la idea de que la

mostra mare de Lopinavir està degradada, per tant, encara no hem trobat les

condicions òptimes i hem de seguir investigant.


- 120 -

12/03/08



2 251 5 80

7 8010 80

2 252 7 80

8 8010 80

2 253 4 80

7 8010 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3






m in0 2 4 6 8

mAU

- 40

- 20

0

20

40

60

80


0.3

82

0.5

65

1.0

06

1.3

24

1.8

21

2.8

12

3.5

60

5.5

13

5.9

27

6.1

18 6

.229

6.3

71

6.6

97

6.9

25

7.1

76 7

.318

7.5

41

7.8

63

8.2

97

8.4

70

8.7

99

9.1

17

9.3

05

Figura 38: Cromatograma tipus dia 12/03/08.


- 121 -

Per molt que variem la mescla i el gradient, no aconseguim la separació correcte

de fàrmacs, per tant, hem d’adoptar un altre camí a part dels fets fins ara ja que

variant únicament el gradient, no és suficient.

4.1.4 Canvis de gradient i pH


19/03/08

Fase mòbil A: HAc 1%; pH= 4,5 amb NH3.

Fase B: ACN

Q= 0,5ml/min

Injecció Mostra Gradient19030800 M3 119030801 M3 219030802 M3 3

Taula 28: Injeccions realitzades el 19/03/08


0 251 1 50

10 50

0 252 1 55

10 55

0 253 1 60

10 60 0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3

cc



- 122 -

tRINJECCIO NVP IDV SQV RTV LPV EFA NFV19030800 1,81 3,14 4,42 5,11 5,66 6,2 7,6219030801 1,81 2,96 3,93 4,15 4,42 4,9 5,8419030802 1,8 2,81 3,52 3,52 3,82 4,17 4,76

ÁreaINJECCIO NVP IDV SQV RTV LPV EFA NFV19030800 1423,6 190,7 413,2 77,6 52 521,6 823,619030801 1450,9 182,3 424,8 70,7 40,1 555,3 857,519030802 1442,4 178,5 432,3 432,3 42,8 555 874,5

Longitud base (min)INJECCIO NVP IDV SQV RTV LPV EFA NFV19030800 0,48 0,2 0,39 0,34 0,34 0,5 0,8519030801 0,44 0,19 0,26 0,21 0,22 0,34 0,5219030802 0,6 0,2 0,3 0 0,2 0,3 0,6

Taula 31: Àrea i longitud de la base de les injeccions del 19/03/08.

m in0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m A U

- 5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

D A D 1 A , S ig = 2 6 0 , 1 0 R e f= 5 0 0 , 1 0 0 ( T O N I \ 1 9 0 3 0 8 0 0 . D )

0.3

00 0

.37

8 0.5

76

1.0

11

1.4

09

1.8

1

2.2

00

2.3

98

2.7

55

2.8

80

3.1

36

3.5

13

3.7

46

3.9

98

4.4

25

5.1

11

5.6

60

6.2

01

7.6

17

Figura 39: Cromatograma injecció 19030800.

m in0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m AU

- 50

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

DAD 1 A , S ig = 2 6 0,1 0 R e f= 5 0 0,1 00 (T O NI \1 90 3 0 80 1 .D)

0.3

89 0

.58

8

1.0

27

1.4

06

1.8

1

2.3

63

2.6

91

2.7

87

2.9

59

3.2

03

3.3

94

3.6

08

3.9

32

4.1

46

4.4

62

4.9

08

5.8

43

7.5

95

9.6

60



- 123 -

m in0 2 4 6 8

m A U

- 5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0


0.1

62 0

.38

3 0.5

81

1.0

19

1.4

11

1.8

0

2.3

28

2.6

13

2.8

18

3.0

02

3.1

57

3.2

62

3.3

54

3.5

29

3.8

22

4.1

74

4.7

62

5.7

58

6.1

54

8.2

57

8.9

20


Observant els diferents cromatogrames obtinguts veiem que treballant a pH= 5,5

apareixen els 7 pics corresponen a cadascun dels fàrmacs. Per tant, podríem dir

que és més apropiat treballar a aquest pH que a pH=4,5.

En quan el gradient, hem de descartar el número tres ja que al haver-hi més %

d’ACN el Saquinavir i el Ritonavir es solapen obserbant-se només un pic. Aquest

gradient no interessa perquè a l’hora de calcular el % de recuperació de fàrmacs

no podrem treure’n cap resultat.

28/03/08


Fase B: ACN

Q= 0,5ml/min

Injecció Fàrmacs Gradient28030800 M3 128030801 M3 128030802 M3 228030803 M3 3

Taula 32: Injeccions realitzades el 28/03/08.


- 124 -


0 251 1 50

10 50

0 252 1 55

10 55

0 253 1 60

10 60

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 1

Gradient 2

Gradient 3

Taula 33: Gradients utilitzats. Gràfica 14: Comparació dels gradients.

tRINJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA28030800 1,81 2,61 3,19 3,51 5,31 6,03 6,4328030801 1,81 2,63 3,21 3,55 5,33 6,04 6,4228030802 1,82 2,54 2,98 3,25 4,28 4,69 5,0628030803 1,89 2,47 2,82 3,04 3,67 3,92 4,25

ÀreaINJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA28030800 733,6 93,7 229 226,5 52,2 10,5 370,828030801 751,8 99,9 243,2 230,7 63,9 9,5 398,728030802 748,8 96,7 237 223,2 63,3 16,2 40128030803 751 93,6 234,4 228,2 65,5 16 413,5

Longitud baseINJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA28030800 0,34 0,2 0,17 0,24 0,4 0,2 0,5228030801 0,34 0,2 0,2 0,25 0,37 0,28 0,5728030802 0,34 0,17 0,2 0,2 0,3 0,25 0,3828030803 0,4 0,17 0,2 0,2 0,24 0,18 0,34

Taula 34: tR, Àrea i longitud de la base de les injeccions del 28/03/08.


- 125 -

m in0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m AU

- 40

- 20

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

DAD 1 A , S ig = 2 6 0,1 0 R e f= 5 0 0,1 00 (T O NI \2 80 3 0 80 0 .D)

0.0

89

0.1

42

0.2

04

0.3

75

0.5

63

0.9

94

1.2

97

1.4

13

1.8

1

2.6

18

2.8

47

2.9

65

3.0

74

3.1

87

3.5

13

3.9

63

4.3

36

4.7

38 5.3

13

6.0

27

6.4

28

7.9

74


m in0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

DAD1 A, Sig=260,10 Ref=500,100 (TONI\28030801.D)

0.3

75

0.5

63

0.9

97

1.3

01 1

.433

1.8

15

2.4

02

2.6

32

2.8

64 2

.979

3.2

16

3.5

50

3.9

64

4.3

35 5.3

36

6.0

47

6.4

26


m in0 2 4 6 8

mAU

-40

-20

0

20

40

60

80

100


0.3

74

0.5

62

0.9

95

1.3

04

1.4

53

1.8

25

2.5

42

2.7

46 2

.827

2.9

83

3.2

49

3.6

04

3.8

54

4.2

82

4.6

88

5.0

68

7.0

87

8.1

43

9.7

78



- 126 -

m in0 2 4 6 8

mAU

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120


0.3

76

0.5

64

0.9

06 0

.997

1.4

49

1.8

09

2.4

66

2.6

51 2

.709

2.8

22

3.0

43

3.3

35

3.5

05

3.6

74

3.9

25

4.2

51

6.0

14

7.3

27


A pH= 3,5 s’obtenen uns resultats molt bons. A tots tres gradients s’observa una

separació bona dels 7 fàrmacs i això és el que ens interessa per a poder seguir

endavant en el nostre estudi. Aquest pH és el més adequat no tan sols perquè

separa els diferents analits sinó també perquè ens permet identificar el Lopinavir

tot i sabent que té una absorbància molt baixa.

Per acabar d’ajustar les condicions òptimes en quan a pH-gradient, realitzem un

altre experiment però només modificant el gradient. El pH trobat és perfecte per

el nostre estudi però volem trobar un gradient que permeti obtenir una millor

forma dels pics en els cromatogrames ja que llavors serà més fàcil calcular l’àrea

de cada fàrmac fent que el càlcul del percentatge de recuperació sigui més vàlid.

02/04/08


Fase B: ACN

Q= 0,5ml/min

NomC.1F.1

Solució437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar



- 127 -

Injecció Solució Gradiento2040800 AB => Plasma + ACN (1:1) 2o2040803 C1 => Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs després de centrifugar 2.1o2040804 C1 => Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs després de centrifugar 3.1o2040805 F1 => Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs abans de centrifugar 2.1o2040806 F1 => Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs abans de centrifugar 3.1

Taula 36: Injeccions realitzades el 02/04/08.


0 252 1 55

10 55

0 251 55

2.1 4,5 555,5 808 80

0 251 60

3.1 4,5 605,5 808 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15

%B

Temps (min)

Gradient 2Gradient 2.1

Gradient 3.1

Taula 37: Gradients utilitzats Gràfica 15: Comparació dels gradients

m in0 1 2 3 4 5 6 7

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0


0.3

9

1.1

01

2.5

58

2.7

99

2.9

18

3.8

24

4.2

77

4.4

28

5.0

31

5.3

20

6.9

46

7.1

31

7.8

67

7.9

76



- 128 -

m in0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350


0.4

08

1.5

25 2.5

47

2.7

62

3.0

04

3.2

53

3.5

59

3.8

25

4.2

55

4.6

41

4.9

92

6.8

07

7.0

05 7

.098

7.9

40


m in0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350


0.401

1.5

22 2.477

2.705

2.847

3.051

3.315

3.497

3.6

87

3.929

4.225

5.016

5.325

5.666

5.967

6.964

7.531


m in0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

100

200

300

400


0.402

1.560 2.548

2.757

3.006

3.256

3.557

3.817

4.256

4.640

4.988

6.826

7.000

7.104

7.942



- 129 -

m in0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

100

200

300

400

500


0.397

1.561 2.478

2.691

2.849

3.053

3.310

3.482

3.686

3.927

4.221

5.027

5.329

5.699

5.953

6.959

7.527


Els cromatogrames obtinguts no presenten gairebé cap diferència, per tant,

qualsevol dels tres gradients serviria, tot i així, nosaltres decidim utilitzar en els

següents estudis el gradient 2.1 ja que pensem que utilitzant aquests obtindrem

una forma més ben definida dels pics.

CONCLUSIÓ:

Després de realitzar diferents experiments hem arribat a la conclusió que les

condicions òptimes per a treballar amb l’ HPLC per a poder detectar tots els

fàrmacs i calcular-ne el seu percentatge de recuperació són:

- Fase mòbil A: HAc al 1% a pH 3,5

- Dissolvent per a precipitar les proteïnes: Acetonitril (ACN)

- Gradient 2.1:

Temps (min) % B0 251 55

4,5 555,5 808 80

Taula 38: Gradient 2.1


- 130 -

4.2 Recuperació de fàrmacs afegint 100%,

150% i 200% d’Acetonitril

En el següent estudi, igual que en el anterior, treballem amb alguns fàrmacs de

la família d’Inhibidors de transcriptasa inversa no anàlegs i alguns de la família

d’Inhibidor de la proteasa. L’experiment consisteix en afegir diferents quantitats

d’Acetilontril sobre la matriu (plasma) amb l’objectiu de veure quina quantitat

mínima d’aquest reactiu és suficient per a precipitar totes les proteïnes del

plasma obtenint així un elevat % de recuperació dels fàrmacs.

Els fàrmacs utilitzats en aquest estudi són:

- Efavirenz (EFV)

- Nevirapina (NVP)

- Indinavir (IDV)

- Nelfinavir (NFV)

- Ritonavir (RTV)

- Saquinavir (SQV)

- Lopinavir (LPV)

El volum d’Acetonitril a afegir en el procediment equival a un 100%, 150% i

200% sobre el volum final de la mostra.

L’ús d’acetonitril per a la precipitació de les proteïnes del plasma millora el perfil

cromatogràfic ja que els petits pics que es poden observar no interfereixen en la

identificació dels fàrmacs.

En la preparació de les mostres observem que al afegir un 100% d’acetonitril el

color rosa pàl·lid que es veu en el líquid sobrenedant (just després de la

centrifugació de la mostra) és més visible que al afegir un 150% o un 200%, on

el líquid sobrenedant és més transparent. Possiblement, això és degut a que


- 131 -

afegint un 100% d’acetonitril no és suficient quantitat per a precipitar totes les

proteïnes contingudes en el plasma.

Abans d’injectar les mostres preparades s’injecta un blanc de plasma. Aquest

blanc es prepara utilitzant el mateix procediment del tractament de la matriu

però sense afegir cap quantitat de fàrmac.

Figura 51: Blanc plasma amb Acetonitril.

El que interessa d’aquest estudi és obtenir el major percentatge de recuperació

de cada fàrmac. Aquest percentatge es calcula tenint en compte l’àrea que ens

dona cada pic corresponent al seu fàrmac al afegir la quantitat coneguda abans

del tractament de la mostra (plasma) i després, és a dir:

% Recuperació= ∑ Àrees afegit abans x 100

∑ Àrees afegit després

El líquid sobrenedant que queda després de la centrifugació de la mostra és lo

que injectem per cromatografia líquid (HPLC).

Per a poder treure alguna conclusió d’aquest estudi hem realitzat les següents

mostres i injeccions utilitzant les condicions òptimes trobades en el estudi

anterior.

min0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700


0.4

1

1.7

59

2.5

40

2.7

43

2.8

20

3.0

70

3.3

76

3.6

53

4.0

38

4.2

79

5.0

31

7.1

21

7.4

11

7.9

59


- 132 -

Fase mòbil A: Hac 1%; pH= 3,5 amb NH3.

Fase B: ACN

Q= 0,5ml/min

Gradient: 2.1

1r grup de mostres:

NomA.1A.2A.3A.BB.1B.2B.3B.BC.1C.2C.3C.BD.1D.2D.3E.1E.2E.3F.1F.2F.3

MOSTRA BLANC437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

Solució437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugarMOSTRA BLANC

437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

MOSTRA BLANC437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

437,5microL. Plasma + 500mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar437,5microL. Plasma + 750mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

437,5microL. Plasma + 1.000mircoL ACN + 62,5mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

Taula 39: Primer grup de mostres diluïdes amb ACN i fàrmacs afegits


- 133 -

Injecció Gradiento8040800 2.1o8040801 2.1o8040802 2.1o8040803 2.1o8040804 2.1o8040805 2.1o8040806 2.1

ÀreaINJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAo8040800 - 156,2 334,4 205,1 38 14,4 295,9o8040801 - 155,3 342,4 214,5 38,2 14,6 318,9o8040802 - 144,3 371,11 228,4 36,4 10,5 345,5o8040803 - 127 344,3 227,5 39,9 13,2 332,9o8040804 - 146,2 352,6 221,6 38,7 8,9 326,2o8040805 - 162,4 291 172,6 31,9 7,9 257,2o8040806 - 158,6 295,6 175,1 24,9 9,1 260,4

Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAA - 145,7 348,05 218,875 38,125 13,175 323,3D - 155,73 313,07 189,77 31,83 8,63 281,27

Recuperació (%) - 106,884008 89,9497199 86,7024557 83,4885246 65,5028463 86,9996907

Solució

A1 => Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs després de centrifugar

D3=> Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs abans de centrifugar

A1 => Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs després de centrifugar

A2 => Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs després de centrifugarA3 => Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs després de centrifugarD1=> Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs abans de centrifugarD2=> Plasma + ACN (1:1) + Fàrmacs abans de centrifugar

Taula 40: Àrees de les injeccions de dilució 1:1 (els anàlegs) i % de recuperació.

Injecció Gradiento9040800 2.1o9040801 2.1o9040802 2.1o9040803 2.1o9040804 2.1o9040805 2.1o9040806 2.1

ÀreaINJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAo9040800 - 92,6 235,3 147,3 22,8 5 210o9040801 - 91 105,8 58,6 6,5 2,1 83,9o9040802 - 85,9 238,2 159 29,8 10,3 228o9040803 - 97,3 275,3 172,8 34 7,3 238,6o9040804 - 100,1 251,3 161,2 30,6 11,1 227,9o9040805 - 103,4 261,4 161,3 34,2 10,3 219,4o9040806 - 114 258,8 156,7 33,1 11,3 237,1

Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAB - 91,93 249,6 159,7 28,87 7,53 225,53E - 105,83 257,17 159,73 32,63 10,9 228,13

Recuperació (%) - 115,1202 103,032853 100,018785 113,0239 144,754316 101,15284

B2 => Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs després de centrifugar

SolucióB1 => Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs després de centrifugarB2 => Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs després de centrifugarB3 => Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs després de centrifugar

E1 => Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs abans de centrifugarE2=> Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs abans de centrifugarE3=> Plasma + ACN (1:1,5) + Fàrmacs abans de centrifugar

Taula 41: Àrees de les injeccions de dilució 1:1,5 (els anàlegs) i % de recuperació.


- 134 -

Injecció Gradient10040800 2.110040801 2.110040802 2.110040803 2.110040804 2.110040805 2.1

INJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA10040800 - 50 210,7 135,4 23,7 7,6 202,410040801 - 59 198,3 126,5 19,9 4,7 188,210040802 - 59,5 216,6 142,2 22,7 9,8 206,310040805 - 64,8 194,5 130 22 2,6 193,4

Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAC - 56,17 208,53 134,7 22,1 7,37 198,97F - 64,266667 211,766667 166,5 23,2666667 5,33333333 202,133333

Recuperació (%) - 114,41457 101,552135 123,608018 105,279035 72,3654455 101,589854

Solució

Área

F3=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs abans de centrifugar

F1=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs abans de centrifugarF2=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs abans de centrifugar

C1=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs després de centrifugarC2=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs després de centrifugarC3=> Plasma + ACN (1:2) + Fàrmacs després de centrifugar

Taula 42: Àrees de les injeccions de dilució 1:2 (els anàlegs) i % de recuperació.

2n grup de mostres:

Nom1.11.22.12.23.13.24.14.2

Nom5.15.26.16.27.17.28.18.2


Solució490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar



490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar


Solució475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar


Taula 43: Segon grup de mostres diluïdes amb ACN i fàrmacs afegits.


- 135 -

Injecció Gradient1804080018040801 2.118040802 2.118040803 2.118040804 2.118040805 2.118040806 2.118040807 2.118040808 2.1

3.2=> 475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar2.1=> 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar2.2=> 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

4.1=> 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

Solució

1.1=> 475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar1.2=> 475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

3.1=> 475microL. Plasma + 712,5mircoL ACN (1:1,5) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

4.2=> 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

MESCLA MARE DE FÀRMACS

Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA1 - 63,2 88,5 81,27 23,42 4,2 171,953 - 60,61 66,38 55,82 14,21 3,51 123,31

Recuperació (%) - 104,273222 133,32329 145,592977 164,813512 119,65812 139,4453


Recuperació (%) - 63,9065382 508,807829 509,728033 569,59707 163,473054 672,48501

Taula 44: Àrees de les injeccions de 5ppm i dilució 1:1,5 i 1:2 amb ACN i % de recuperació (Els anàlegs entre sí).

Injecció Gradient21040800 2.121040801 2.121040802 2.121040803 2.121040804 2.121040805 2.121040806 2.121040807 2.1

Solució5.1=> 490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar5.2=> 490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

8.1=> 490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar8.2=> 490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

6.1=> 490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar6.2=> 490microL. Plasma + 980mircoL ACN (1:2) + 10mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar

7.1=> 490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar7.2=> 490microL. Plasma + 735mircoL ACN (1:1,5) + 10mircoL. Fàrmacs després de centrifugar

INJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA21040800 - 69,08 8,5 14,43 3,4 1,3 37,6221040801 - 79,83 13,78 7,09 - - 16,1721040802 - 15,44 26,55 13,54 4,3 - 29,1821040803 - 23,7 33,15 18,84 10,07 3,33 40,1521040804 - 77,88 16,01 7,58 3,19 - 19,5821040805 - 27,85 39,22 25,6 8,63 1,88 52,2521040806 - 18,17 30,64 16,8 5,11 0,61 32,4621040807 - 22,11 30,94 20,19 5,72 1,22 41,85

Área


Recuperació (%) - 140,817099 40,33309196 64,8583484 57,5296108 69,1489362 74,8608018


Recuperació (%) - 97,1698113 96,94706073 87,5608437 132,472325 168,181818 93,2723358

Taula 45: Àrees de les injeccions de 2 ppm i dilució 1:1,5 i 1:2 amb ACN i % de recuperació. (Els anàlegs entre sí).


- 136 -

Aquestes injeccions no serveixen perquè donen resultats incoherents, per tant,

s’han de tornar a fer les mostres de nou i injectar-les.

INJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA29040800 - 69,72 104,88 104,3 30,8 7,3 225,6429040801 - 66,91 123,19 110,21 35,1 8,96 236,2129040802 - 30,22 69,93 58,77 17,64 2,7 129,0429040803 - 31,27 70,51 59,89 20,01 2,71 131,9629040804 - 30,98 37,51 50,19 14,22 2,52 104,9229040805 - 30,63 61,74 50,72 12,38 2,82 104,5129040806 - 15,56 27,04 13,31 3,18 0,82 28,2129040807 - 15,57 28,22 14,85 4,51 0,82 33,7629040808 - 23,16 24,33 12,32 2,21 - 26,5829040809 - 65,95 9,41 5,2 - - 13,4429040810 - 28,5 43,15 27,41 7,01 0,92 57,5129040811 - 31,6 44,94 26,71 8,24 0,95 59,2929040812 - 22,96 39,29 26,3 4,45 1,2 51,0329040813 - 20,32 42,02 25,06 8,34 54,9129040814 - 55,55 74,3 60,75 18 3,95 128,5629040815 - 54,04 70,83 58,11 16,22 2,51 121,7129040816 - 48,58 75,08 61,73 17,48 2,1 127,3729040817 - 49,95 75,48 62,33 17,83 3,23 132,4829040818 - 33,51 41,73 25,72 7,01 1,8 49,329040819 - 36,02 38,52 24,04 5,2 1,2 51,17

Área

5 ppm, 1:1.5Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA

1 - 49,265 75,28 62,03 17,655 2,665 129,9253 - 54,795 72,565 59,43 17,11 3,23 125,135

Recuperació (%) - 89,9078383 103,741473 104,374895 103,185272 82,5077399 103,8278659

5 ppm, 1:2Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA

2 - 31,175 57,18 48,73 15,55 2,725 100,9354 - 30,775 59,9225 54,8925 16,0625 2,6875 117,6075

Recuperació (%) - 101,299756 95,423255 88,7735119 96,8093385 101,395349 85,82360819

2 ppm, 1:2Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA

6 - 18,0966667 26,53 13,4933333 3,3 0,82 29,516666678 - 20,14 30,79 18,495 5,415 0,915 37,155

Recuperació (%) - 89,8543529 86,1643391 72,956655 60,9418283 89,6174863 79,4419773

2 ppm, 1:1,5Àrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA

5 - 34,765 40,125 24,88 6,105 1,5 50,2357 - 25,845 42,35 26,37 7,01 0,7675 55,685

Recuperació (%) - 134,513446 94,7461629 94,3496397 87,0898716 195,439739 90,21280417

Taula 46: Repetició injeccions de 2ppm i 5ppm diluïdes 1:1,5 i 1:2 amb ACN. Àrees i % de recuperació.


- 137 -

Cromatogrames obtinguts:

m in0 1 2 3 4 5 6 7

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

7 0 0

8 0 0


0.4

0

1.0

79

1.7

12

2.2

55

2.5

75 3

.03

7

3.3

58

3.5

42

3.7

96

4.0

07

4.2

58

4.6

46

4.9

70

6.8

02

6.9

86

7.0

83

7.3

80

7.7

79

7.9

14

Figura 52: Cromatograma tipus adició 100% Acetonitril.

m in0 1 2 3 4 5 6 7

m A U

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0


0.4

1.6

98

2.5

64

3.0

35

3.3

61

3.7

70

3.9

51

4.2

52

4.6

35

4.9

38

6.9

78

7.0

79

7.3

61

7.7

56

7.9

00



min0 1 2 3 4 5 6 7

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350


0.3

9

1.6

98

2.5

61

2.7

44

3.0

36

3.3

55

3.7

73

4.2

63

4.6

55 4.9

70

7.1

03

7.7

93

7.9

37


- 138 -

Observant els cromatogrames veiem que no s’aprecien gaires diferències. En tots

ells podem veure la separació dels analits per ordre d’elució.

En tots els grups de mostres i injeccions el pic que segueix sense veure’s és la

Nevirapina. És per això que ens plantegem la realització de l’estudi 4.3 (diluir

amb aigua Milli-Q) ja que suposem que hi ha accés d’acetonitril.

CONCLUSIÓ:

- Es confirma que al addicionar acetonitril en la preparació de les mostres

obtenim millor resultats excepte en la Nevirapina.

- Analitzant els percentatges de recuperació concloem que la millor proporció

per adicionar acetonitril sobre el plasma és la del 200% ja que el seu perfil

cromatogràfic és millor i la recuperació dels fàrmacs és d’un 86-101%.

4.3 Dilució amb aigua Milli-Q

Per poder obtenir un millor pic de la Nevirapina, que ens ha donat problemes en

quant a la seva forma al utilitzar ACN com a fase orgànica, decidim fer una

dilució amb aigua Milli-Q en totes les mostres, per tal de reduir l’efecte negatiu

del ACN sobre la Nevirapina.

Per dur a terme aquest procediment s’ha realitzat un estudi de la proporció de la

dilució de les mostres amb aigua Milli-Q:

Es preparen quatre eppendorfs amb mostra inicial seguint les condicions òptimes

a les que hem decidit treballar, dilució 5ppm, 1:2 plasma i ACN.

Fem diferents dilucions amb aigua Milli-Q tal com mostrem a la taula següent:


- 139 -

PREPARACIÓ NOVES MOSTRES:

Nom2.32.44.34.41.A1.B2.A2.B3.A3.B4.A4.B5.A5.B6.A6.B7.A7.B8.A8.B 200microL 4.4 + 400microL. Milli-Q (1:2)




Solució475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs abans de centrifugar



200microL 2.3 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)200microL 2.4 + 100microL. Milli-Q (1:0,5)

Taula 47: Mostres realitzades el 05/05/08.Dilució amb aigua Milli-Q.

D’aquestes mostres es procedeix a injectar, primer totes les A que

contenen fàrmacs abans de centrifugar (extretes de la dilució 2.3) i les

seves anàlogues B q se’ls hi afegeix els fàrmacs després de passar per la

centrífuga (extretes de la dilució 4.3).

Taula de les àrees calculades:

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:0.5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.1.A 144,245 30,9 49,485 37,82 13,025 2,545 87,865 365,8855.A 100,64 21,64 33,475 27,135 8,13 2,53 63,79 257,34

Rendiment (%) 143,327703 142,791128 147,826736 139,377188 160,209102 100,592885 137,741025 142,179607

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.2.A 88,385 21,63 28,06 23,695 6,36 1,71 49,255 219,0956.A 89,035 21,67 30,78 25,425 8,19 1,785 55,485 232,37

Rendiment (%) 99,26995 99,815413 91,1630929 93,1956735 77,6556777 95,7983193 88,7717401 94,2871283

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.3.A 83,77 19,965 30,83 23,195 8,08 2,16 53,3 221,37.A 86,73 20,85 30,6 24,68 8,125 2,24 54,365 227,59

Rendiment (%) 96,5871094 95,7553957 100,751634 93,9829822 99,4461538 96,4285714 98,041019 97,2362582

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:2 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.4.A 75,435 15,975 27,87 21,82 6,325 1,12 46,775 195,328.A 81,125 19,16 28,19 23,49 7,035 1,305 50,385 210,69

Rendiment (%) 92,9861325 83,3768267 98,8648457 92,8905917 89,9076048 85,8237548 92,8351692 92,7049219

Taula 48: Àrees dels cromatogrames A.


- 140 -

En aquesta prova descartem els resultats obtinguts en la dilució amb

aigua Milli-Q 1:0,5, ja que no és raonable una recuperació del 142%; pot

ser que això sigui degut a un error en el procediment de preparació de

mostres, o bé, perquè la columna no estava del tot neta, malgrat haver

fet la purga i l’estabilització.

Tot seguit, es procedeix a injectar les mostres B , que són de proporcions

diluïdes exactes a les A, però provenen de diferents eppendorfs (del 2.4 i

del 4.4).

També es calcula el % de recuperació, aplicant la fórmula ja esmentada:

% Recuperació= ∑ Àrees afegit abans x 100

∑ Àrees afegit després

Les àrees obtingudes són les següents:

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:0.5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.1.B 134,61 31,505 43,875 34,775 10,695 2,395 75,98 333,8355.B 138,74 31,415 44,27 37,785 11,415 2,975 78,34 344,94

Rendiment (%) 97,0232089 100,286487 99,1077479 92,0338759 93,6925099 80,5042017 96,9874904 96,7805995

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.2.B 104,715 27,455 33,45 26,91 8,05 2,295 53,84 256,7156.B 109,865 27,76 35,995 29,98 8,7 2,395 63,965 278,66

Rendiment (%) 95,3124289 98,9012968 92,9295736 89,7598399 92,5287356 95,8246347 84,171031 92,1248116

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.3.B 85,6 22,12 29,0833333 23,3733333 6,71666667 1,95666667 50,24 219,097.B 87,27 21,83 30,42 25,715 6,885 2,15 54,45 228,72

Rendiment (%) 98,0863985 101,328447 95,605961 90,8937715 97,5550714 91,0077519 92,2681359 95,7896118

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:2 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA sumatori À.4.B 79,76 20,57 27,855 20,895 6,445 1,335 45,945 202,8058.B 82,515 21,595 28,45 22,505 6,775 1,395 47,89 211,125

Rendiment (%) 96,6612131 95,2535309 97,9086116 92,8460342 95,1291513 95,6989247 95,9386093 96,0592066

Taula 49: Àrees dels cromatogrames B.

En aquest cas veiem que els resultats en dilució 1:0,5 amb aigua Milli-Q

són coherents i sí es poden tenir en compte.


- 141 -

Tot i això, veiem que les àrees obtingudes no tenen una evolució normal, doncs

com més aigua hi afegim, més petita hauria de ser l’àrea obtinguda amb

l’espectre; també han de ser més grans aquestes àrees quan s’afegeix el fàrmac

després de centrifugar.

Degut a que hem obtingut dades molt irregulars, pot ser que sigui perquè la

columna estigui bruta o per mala estabilització de la màquina, decidim repetir les

mostres , però eliminant la dilució 1:0,5, ja que es pot intuir que ens donarà uns

resultats poc útils.

A la següent taula s’exposen les diferents mostres realitzades:


Nom2.52.C2.D3.C3.D4.C4.D

200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 400microL. Milli-Q (1:2)200microL 2.5 + 400microL. Milli-Q (1:2)


200microL 2.5 + 200microL. Milli-Q (1:1)200microL 2.5 + 200microL. Milli-Q (1:1)

Taula 50: Repetició de mostres.

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA Sumatori: Diferència:

2.C i 2.D 90,84 17,785 30,8125 26,3025 8,285 1,95 51,86 227,8353.C i 3.D 75,945 14,2225 24,725 21,7325 6,0675 1,705 40,1225 184,52 43,3154.C i 4.D 56,105 10,9575 19,7425 17,26 4,5775 1,005 32,0825 141,73 42,79

Taula 51: Àrees obtingudes de les últimes mostres.

Ara sí veiem que tenim un gradient coherent de les àrees obtingudes i,

per tant, del % de recuperació.

Arribem a la conclusió que la dilució correcta que ens pot donar major %

de recuperació dels fàrmacs i uns valors raonables en tot moment, és

5ppm, 1:2 dilució plasma amb ACN i, finalment, diluït amb aigua Milli-Q

1:1,5.


- 142 -

Tot seguit es mostren uns cromatogrames d’aquesta part de l’estudi, en

el cas de la dilució escollida per treballar:

Figura 55: Cromatograma tipus adició 150% Aigua Milli-Q i Fàrmacs abans de centrifugar.

Figura 56: Cromatograma tipus adició 150% Aigua Milli-Q i Fàrmacs després de centrifugar.

Per fer un estudi més extens de la dilució escollida, es procedeix a fer

unes noves mostres, 6 amb l’adició de fàrmacs abans de centrifugar i 6

amb adició fàrmacs després.

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140


0.4

17

0.5

53

1.1

12 1.7

88

2.5

87

2.7

58 3.0

86

3.3

77

3.5

70

4.3

47

4.7

45 5.0

45

m in0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100

120


0.4

17

0.5

57

1.1

36

1.8

02

2.5

90

2.7

60 3.0

86

3.3

79

3.5

70

4.3

49

4.7

42 5.0

41


- 143 -


Nom2.52.6123456

1.DP2.DP3.DP4.DP5.DP6.DP

200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.6 + 200microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)


475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2) + 25mircoL. Fàrmacs després de centrifugar200microL 2.5 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Taula 52: Mostres finals de la dilució escollida

Tot seguit, s’injecten aquestes mostres, i tornem a fer una estudi del %

de recuperació de fàrmacs comparant les àrees abans i després de

centrifugar, per tal d’assegurar-nos que la dilució escollida és la correcta.

Com no disposem de molt temps, injectem primer de la 1 a la 3 tant

abans com després; sempre és aconsellable injectar els anàlegs seguits, i

així comparar les àrees el mateix dia i evitar resultats anòmals per

condicions diferents de la màquina o la columna.

Al dia següent s’injecten les altres 6 (de la 3 a la 6 abans i després) i

obtenim les següents taules de valors:

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA Sumatori1 al 3 104,743333 22,0033333 37,62 33,8 10,03333333 2,16 68,0666667 278,426667

1.DP- 3.DP 129,783333 24,7766667 43,0133333 40,98 11,34 3,28666667 76,3266667 329,506667Rendiment (%) 80,7063054 88,8066729 87,4612523 82,4792582 88,47736626 65,7200811 89,1780942 84,4980375

5 ppm 1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA Sumatori4 al 6 107,14 22,2066667 38,4666667 33,4866667 9,38 3,21333333 66,1266667 280,02

4.DP-6.DP 132,656667 25,5566667 43,29 40,48 9,81333333 3,29 76,8 331,886667Rendiment (%) 80,7648818 86,8918743 88,8580889 82,7239789 95,5842391 97,6697062 86,1024306 84,3721752

Taula 53: Promitjos de les Àrees obtingudes amb la dilució final


- 144 -

Es pot afirmar, que després d’aquest últim estudi realitzat, la dilució tractada

dóna una recuperació dels fàrmacs al voltant del 90% i les àrees obtingudes en

les mostres a les que hem afegit els fàrmacs després de centrifugar, són més

grans que les d’abans.

L’únic medicament que presenta uns resultats poc fiables, doncs té una

absorbància mínima per poder arribar a alguna conclusió, és el Lopinavir. Però

s’ha pogut comprovar que aquest problema existeix en totes les proporcions de

dilució.

Espectres obtinguts en les mostres definitives:

Figura 57: Cromatograma dilució 1:1,5 amb aigua Milli-Q (fàrmacs abans).

Figura 58: Cromatograma dilució 1:1,5 amb aigua Milli-Q (fàrmacs després).

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100


0.4

18

0.5

66

0.6

87

1.1

46

1.7

73

2.5

71

2.7

68

3.0

69

3.3

48

3.5

74

3.8

70

4.2

99

4.5

69

5.0

23

5.5

69

m in0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100


0.419

0.567

0.691

1.137

1.758

2.567

2.768

3.064

3.341

3.567

4.285

4.561

5.015


- 145 -

4.4 Estudi del inhibidors de la transcriptasa

inversa anàlegs de nucleòsids (NRTIs)

Hem realitzat un petit estudi dels NRTIs , dins d’aquest grup es troben diferents

compostos, però només hem analitzat amb HPLC quatre:

o Retrivir (AZT) => Nom del compost, zidovudina o acidotimina

o Videx (ddI) => Nom del compost, didanosina o dideoxiinosina.

o Hivid (ddc) => Nom del compost, zanzitabina o dideoxicitidina

o Epivir (3tC) => Nom del compost, lamivudina

Les característiques de tots ells estan redactades a la introducció (Punt 1.14.1)

Tot seguit es mostra una taula amb les injeccions realitzades:

MOSTRA 2.7 475microL. Plasma + 950mircoL ACN (1:2)

Injecció21050800210508012105080221050803210508042105080521050806210508072105080821050809 BLANC 200microL 2.7 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Mescla de Fàrmacs ddcMescla de Fàrmacs ddIMescla de Fàrmacs ddI

BLANC 200microL 2.7 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Mescla de Fàrmacs AZTMescla de Fàrmacs AZT

SolucióMescla de Fàrmacs 3TCMescla de Fàrmacs 3TCMescla de Fàrmacs ddc

Taula 54: Mostres injectades de NRTIs.


- 146 -

S’han injectat cada un d’aquets compostos i també un blanc de la solució de

plasma amb ACN i després amb aigua, de proporcions descrites a la taula

anterior, i tot seguit detallem els espectres que obtenim de cada un d’ells:

Figura 59: Cromatograma de la injecció 21050800 (3TC).

Figura 60: Cromatograma de la injecció 21050802 (ddc).

Figura 61: Cromatograma de la injecció 21050804 (ddI).

min0 0.5 1 1.5 2 2.5

mAU

0

50

100

150

200

250

300


0.216

0.280

0.405

0.583

0.791

2.796

m in0 0.5 1 1.5 2 2.5

mAU

0

100

200

300

400


0.390

0.468

0.604

2.766

m in0 0.5 1 1.5 2 2.5

mAU

0

100

200

300

400

500


0.422

0.552

0.605

2.775


- 147 -

Figura 62: Cromatograma de la injecció 21050806 (AZT).

Figura 63: Cromatograma de la injecció 210508008 (Blanc).

Podem veure que tots els compostos es detecten, que tenen un temps de

retenció més petit que els NNRTIs estudiats, no passa més de un minuts en

poder veure els cromatogrames. Això és degut a que són fàrmacs més polars i

treballen en fase inversa en cromatografia de líquids, pel que es retenen menys.

El blanc s’injecta per poder comparar i contrastar qualsevol pic que pugui crear

confusions en els cromatogrames obtinguts.

min0 0.5 1 1.5 2 2.5

mAU

0

50

100

150

200

250


0.372

0.474

0.549

0.802

2.773

m in0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

50

100

150

200


0.419

0.556

1.150

2.545

2.756

2.833

3.099

3.571

4.021

5.041


- 148 -

4.5 Validació del mètode

4.6.1 Linealitat del mètode

Per tal de fer una validació del nostre estudi, decidim realitzar una recta de

calibratge concentració versus àrees, amb la qual podrem crear un mètode per

poder saber la concentració de qualsevol fàrmac a través de l’àrea obtinguda

amb l’espectre.

Per arribar al nostre objectiu, hem de preparar diferents dilucions dels fàrmacs

estudiats a partir de la mostra mare. Seguim els passos següents:

1. A partir de la mostra mare dels fàrmacs de 1000ppm, preparem 0,3ml de

cada fàrmac (0,3ml x 7 fàrmacs = 2,1ml) amb 0,9ml de MeOH per fer un

total de 3ml. Amb això obtenim una dissolució dels fàrmacs de 100ppm.

2. Preparem una dissolució de 16ppm dels fàrmacs => 0,5ml de la mostra

de 100ppm + 2,5ml de MeOH = 3ml.

3. Tot seguit diluïm amb plasma en les proporcions següents:

A: 0,16ppm = 50microl Fàrmacs 16ppm + 4950microl plasmaB: 0,4ppm = 125microl Fàrmacs 16ppm + 4875microl plasmaC: 0,8ppm = 250microl Fàrmacs 16ppm + 4750microl plasmaD: 2ppm = 100microl Fàrmacs 100ppm + 4900microl plasmaE: 5ppm = 250microl Fàrmacs 100ppm + 4750microl plasmaF: 8ppm = 400microl Fàrmacs 100ppm + 4500microl plasmaBL: Blanc plasma

Taula 55: Dilucions amb plasma a diferents concentracions.

Omplim 3 eppendorfs de cada proporció, amb la qual cosa tenim 21 mostres

en total.

A continuació es fa la dilució 1:2 amb ACN i les introduïm a la centrífuga a

10000rpm i durant 12 minuts. Aquest pas es realitza dos vegades amb la

finalitat d’obtenir una millor precipitació del plasma.


- 149 -

A la taula següent es detallen les mostres centrifugades:

NomA1A2A3B1B2B3C1C2C3D1D2D3E1E2E3F1F2F3

BL1BL2BL3

250microL de E +500microL d'ACN (1:2)250microL de E +500microL d'ACN (1:2)250microL de E +500microL d'ACN (1:2)


250microL de F +500microL d'ACN (1:2)250microL de F +500microL d'ACN (1:2)250microL de F +500microL d'ACN (1:2)


250microL de C +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)250microL de D +500microL d'ACN (1:2)


Solució250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de A +500microL d'ACN (1:2)250microL de B +500microL d'ACN (1:2)250microL de B +500microL d'ACN (1:2)250microL de B +500microL d'ACN (1:2)250microL de C +500microL d'ACN (1:2)250microL de C +500microL d'ACN (1:2)

Taula 56: Preparació de mostres diluïdes amb ACN.

Arribat a aquest punt, es fa l’ última dilució amb aigua Milli-Q 1:1,5 i ja

tindrem les mostres finals que hem d’injectar:

Nomo206000 a1o206001 a2o206002 a3o206003 b1o206004 b2o206005 b3o206006 c1o206007 c2o206008 c3

Solució200microL A1 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL A2 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL A3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL C2+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL C3+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL B1 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL B2 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL B3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL C1+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Taula 57: Injeccions realitzades el 02/06/08 (Mostres anteriors diluïdes amb Aigua Milli-Q 1:1,5).


- 150 -

Injecció NOMo40600 d1o40601 d2o40602 d3o40603 e1o40604 e2o40605 e3o40606 f1o40607 f2o40608 f3o40609 bl1o40610 bl2o40611 bl3200microL BL3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL F1+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL F2+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL F3+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL BL1+ 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL E1 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL E2 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL E3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL BL2 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

200microL D1 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)200microL D2 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Solució

200microL D3 + 300microL. Milli-Q (1:1,5)

Taula 58: Injeccions realitzades el 04/06/08 (Mostres anteriors diluïdes amb Aigua Milli-Q 1:1,5).

Cromatogrames obtinguts:

Figura 64: Cromatograma de la dilució a.

Figura 65: Cromatograma de la dilució b.

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


0.417

0.557

1.140

1.773

2.565

2.785

2.856

3.140

3.390

4.384

4.505

5.202

6.949

m in0 1 2 3 4 5

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160


0.4

20

0.5

61

1.1

27

1.7

59

2.5

56

2.7

60 2

.839

3.1

10

3.3

57

3.8

42

4.0

57

4.2

95

4.4

87

5.0

43


- 151 -

Figura 66: Cromatograma de la dilució c.

Figura 67: Cromatograma de la dilució d.

Figura 68: Cromatograma de la dilució e.

min0 1 2 3 4 5

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


0.3

12

0.4

16

0.5

57

1.1

13

1.752

2.5

71

2.762

3.1

09

3.3

58

3.5

83

4.0

40

4.3

00

4.5

67

4.697

5.0

41

m in0 1 2 3 4 5

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


0.4

16

0.5

52

1.0

98 1.7

28

2.5

65

2.7

58

3.0

72

3.3

42

3.5

75

3.8

35

4.0

22

4.2

90

4.5

88 4

.692 5.0

44

m in0 1 2 3 4 5

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160


0.4

17

0.5

55

1.1

10

1.7

47

2.5

72

2.7

66 3.0

76

3.3

50

3.5

81

3.8

44

4.0

20

4.2

99

4.5

91 4

.698 5

.041


- 152 -

Figura 69: Cromatograma de la dilució f.

Es pot veure que les àrees van augmentant a mesura que la mostra conté

fàrmacs més concentrats.

Taula de les àrees obtingudes:

INJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAo206000 - - - - - - -o206001 12,46 14,12 8,05 1,47 - 0,48 7,22o206002 11,17 15,35 8,18 1,89 - - 8,17o206003 18,22 17,18 9,98 3,96 - - 8,78o206004 19,03 16,04 10,05 3,66 - 1,38 8,91o206005 17,57 17,35 10,15 3,24 - 1,24 8,37o206006 26,31 18,35 12,74 6,15 0,6 2,14 12,57o206007 25,51 18,47 12,03 5,67 0,52 2,05 11,86o206008 26,85 18,5 11,71 5,78 0,49 2,68 12,65

1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA Sumatori

0,16ppm A 11,82 14,74 8,12 1,68 - - 7,70 -0,4ppm B 18,27 16,86 10,06 3,62 - - 8,69 -0,8ppm C 26,22 18,44 12,16 5,87 0,54 2,29 12,36 77,88

Área

INJECCIO NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFAo50600 75,25 25,7 24,85 20,52 4,28 3,3 40,97o50601 78,84 26,71 24,72 20,93 5,38 2,88 40,96o50602 78,82 27,3 25,65 21,7 5,33 3,13 42,41o50603 122,86 39,55 38,53 36,2 9,73 4,04 73,35o50604 122,63 40,43 38,16 35,52 10,45 3,96 72,81o50605 123,44 39,76 38,38 36,42 11,36 4,09 74,11o50606 157,21 42,03 45,52 46,65 13,93 4,26 92,3o50607 159,11 42,32 46,34 48,74 14,66 4,57 93,14o50608 160,33 43,09 46,2 48,08 13,55 4,44 92,56

1:2 amb ACN, 1:1,5 amb MilliQÀrea NVP IDV SQV NFV RTV LPV EFA Sumatori

2ppm A 77,64 26,57 25,07 21,05 5,00 3,10 41,45 199,885ppm B 122,98 39,91 38,36 36,05 10,51 4,03 73,42 325,268ppm C 158,88 42,48 46,02 47,82 14,05 4,42 92,67 406,34

Área

Taula 59: Àrees obtingudes amb les diferents concentracions

min0 1 2 3 4 5

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175


0.4

21

0.5

59

1.1

37

1.7

79

2.5

81

2.7

81 3.0

81

3.3

60

3.5

87

3.8

58

4.0

56

4.3

17

4.7

15 5.0

57


- 153 -

Les dissolucions que contenen fàrmacs 0,16ppm (a), 0,4ppm (b) i 0,8ppm (c)

ens donen unes àrees realment molt petites, però utilitzarem les dades de les

que es puguin integrar per poder traçar la recta amb més punts, i així ampliem el

camp d’especificació de la recta.

Per traçar la recta necessitem diferents concentracions de cada fàrmac i les

diferents àrees obtingudes:

Linealitat del mètode

y = 19,051x + 17,356R2 = 0,9532

020406080

100120140160180

0 2 4 6 8 10

Concentració

Àre

a Serie1Lineal (Serie1)

Gràfica 16: Recta de calibratge de la Nevirapina.

Com podem observar els tres primers punts surten alineats entre sí, i els tres

últims entre ells. Això és degut a que es van injectar en diferents dies, la qual

cosa pot haver provocat un canvi en les condicions de l’assaig.

Si linealitzem per separat aquests punts trobem un millor ajust de la recta:


y = 22,244x + 8,6867R2 = 0,993

0

50

100

150

200

0 2 4 6 8 10

Concentració

Àre

a Serie1

Lineal (Serie1)

Gràfica 17: Recta de calibratge de les concentracions 0,16ppm, 0,4ppm i 0,8ppm.


- 154 -


y = 13,541x + 52,127R2 = 0,9955

020406080

100120140160180

0 2 4 6 8 10

Concentració

Àre

a Serie1

Lineal (Serie1)

Gràfica 18: Recta de calibratge de les concentracions 2ppm, 5ppm i 8ppm.

En tots dos casos el coeficient de correlació ens dóna molt proper a 1, amb

el que probablement el canvi de dia pot haver provocat una variació en les

condicions de l’assaig.


- 155 -

CAPÍTOL 5:

CONCLUSIONS

A partir dels resultats obtinguts en els diferents estudis, arribem a la conclusió

que:

Les condicions òptimes, per a dur a terme els nostres estudis, són les

següents:

- HAc al 1% a pH 3,5

- Gradient:

Temps (min) % B0 251 55

4,5 555,5 808 80

- Reactiu: Acetonitril

Hem realitzat diferents experiments per tal d’arribar a aquesta conclusió.


- 156 -

El gradient separa els components de la mostra en funció de la finalitat per la

fase estacionaria. Quan el gradient és H2O/ACN; els compostos més

hidrofílics eluiran a major concentració d’aigua mentre que, els compostos

més hidrofòbics eluiran a concentració elevada d’acetonitril.

La utilització de dissolvents més polars en la fase mòbil disminueix el tR dels

compostos mentre que, els dissolvents més hidrofòbics tendeixen a

augmentar el temps de retenció.

El temps de retenció augmenta amb l’addició de dissolvent polar a la fase

mòbil i disminueix amb la introducció de dissolvents més hidrofòbics.

El mètode d’HPLC desenvolupat dóna bons resultats en quant al percentatge

de recuperació de fàrmacs. L’agent utilitzat per a la precipitació de proteïnes

és el acetonitril. Utilitzem aquest dissolvent perquè en el estudi anterior és el

que donava un menor nombre de pics, és a dir, menys interferències deixant

així la matriu (plasma) neta. En quant a la proporció plasma acetonitril, hem

demostrat que a un 200% d’ACN sobre el volum final de la mostra, el % de

recuperació dels diferents analits és d’un 86-101%.

Després de realitzar diferents dilucions amb aigua Milli-Q per tal de millorar el

pic de la Nevirapina, que és el que dóna problemes en quant a la seva forma

al utilitzar ACN com a fase mòbil orgànica, es pot afirmar que la dilució més

favorable és 1:1,5, donant una recuperació dels fàrmacs al voltant del 90% .

L’únic medicament que presenta uns resultats poc fiables, doncs té una

absorbància mínima per poder arribar a alguna conclusió, és el Lopinavir.

Però s’ha pogut comprovar que aquest problema existeix en totes les

proporcions de dilució.

Hem realitzat un petit estudi dels NRTIs , dins d’aquest grup es troben

diferents compostos, però només hem analitzat amb HPLC quatre:

o Retrivir (AZT) => Nom del compost, zidovudina o acidotimina

o Videx (ddI) => Nom del compost, didanosina o dideoxiinosina.

o Hivid (ddc) => Nom del compost, zanzitabina o dideoxicitidina


- 157 -

o Epivir (3tC) => Nom del compost, lamivudina

Es comprova que tots els compostos es detecten, que tenen un temps de

retenció més petit que els NNRTIs estudiats, no passa més de 1 minut en

poder veure els cromatogrames i per tant no interferiran en la detecció dels

altres.

Això és degut a que són fàrmacs més polars i treballen en fase inversa en

cromatografia de líquids, pel que es retenen menys.

Per tal de fer una validació del mètode, es realitza una recta de calibratge

concentració versus àrees, amb la qual podrem crear un mètode per poder

saber la concentració de qualsevol fàrmac a través de l’àrea de pic

obtinguda.

Es comet l’error d’injectar tres mostres de diferents concentracions un dia i

tres més al dia següent, ens trobem amb una bona linealitat entre mostres

injectades el mateix dia, però no entre dies diferents.

En tots dos casos el coeficient de correlació ens dóna molt proper a 1, amb

el que probablement el canvi de dia pot haver provocat una variació en les

condicions de l’assaig.


- 158 -

CAPÍTOL 6:

BIBLIOGRAFÍA

Suport bibliogràfic:

o Albert L.Lenninger; David L.Nelson; Michael M.Cox. “Principios de

Bioquímica” . Ed. OMEGA, S.A., 3ª edición, 2001.

o B. Cloret, J. Martínez-Picado, L.Ruiz, C. Tural. “Resistencias a los

fármacos antirretrovirales”. Publicaciones Permanyer, S.L. Edició 2000

o J.M. Gatell, B. Clotet, D. Podzamezer, J.M. Miró, J. Mallolas. “ Clínica,

diagnóstico y tratamiento”. Ed. Masson, S.A. Edición 2000

o B. Clotet, L. Menéndez-Arias, L. Ruiz, C. Tural, F. Brun-Vezinet, C.

Loveday, D. Burger, J. Schapiro, Ch. A. Boucher, R. D’ Aquila, D. Richman.

“guia para el manejo de las resistencias en la infección por el VIH

y de la farmacocinética de los retrovirales”. Edición 2003 Editorial

TAISA

o Ignasi Arnaus Subirana i Pere Surribas Balduque. “Caracterització dels

fàrmacs antirretrovirals emtricitabina i Tenofovir” . Projecte final de

carrera. Escola d’Enginyeria Tècnica Industrial de Barcelona (2006)

o Miguel Ángel Conesa Cervera. “Estudi experimental de la

caracterització de profàrmacs antirretrovirals” . . Projecte final de

carrera. Escola d’Enginyeria Tècnica Industrial de Barcelona (2007)


- 159 -

Suport virtual

o http://Bvs.sld.cu/revistas

o http://journal.paho.org

o http://usuarios.lycos.es

o http://www.aidsmeds.com

o http://www.aidsinfo.nih.gov

o http://www.asociacionamoc.com

o http://www.causaencantada.org

o http://www.chemexper.com

o http://www.comercialgodo.com

o http://www.ctv.es

o http://www.drugabuse.gov

o http://www.echinachem.com

o http://www.elmundo.es

o http://www.farmaindustria.es

o http://www.gtt-vih.org

o http://www.hivmedicationguide.com

o http://www.interaccioneshiv.com

o http://www.iriscaixa.org

o http://www.italcoalition.org

o http://www.laguna.fmedic.unam.mx

o http://www.msc.es

o http://www.mtas.es/insht/ipcsnspn/nspnsyn.htm

o http://www.nlm.nih.gov

o http://www.redpoll.pharmacy.net

o http://www.seqchem.com

o http://www.sfaf.org

o http://www.stjude.com

o http://www.tododrogas.net

o http://www.uia.mx

o http://www.uma.es

ÍNDEX MEMÒRIA - UPCommons

Documents

Transcript of ÍNDEX MEMÒRIA - UPCommons