GUIA DE PRACTICAS DE INTERP. ANALISIS CLINICOS 2015-II (1)

3B-2

Unidad académica: EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA

INTERPRETACIÓN DE ANÁLISIS CLÍNICOS

Autor: Dr. Juan Manuel Parreño Tipian

2015 II

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

INTRODUCCIÓN

El laboratorio clínico dispone de los métodos de análisis clínicos, que estudia los diversos procesos utilizados en la exploración clínica y hace la interpretación bioquímica y patológica de los resultados. Por su amplitud y por la evolución vertiginosa de especialización se ha dividido en: hematología, inmunohematología, bioquímica clínica, microbiología clínica, parasitología clínica y líquidos biológicos.


PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICASSeman

a Practica Contenido

1 1Toma de muestra Sangre total. Plasma. Sangre desfibrinada. Reconocimiento de elementos formes. Resistencia globular.

2 2Hematimetría. Recuento de glóbulos rojos. Dosaje de hemoglobina.Hematocrito. Microhematocrito.

3 3Leucometría. Recuento de glóbulos blancos.Hemograma de Schilling.Velocidad de sedimentación globular.

4 4Recuento de plaquetas.Recuento de reticulocitos.Recuento de eosinófilos.

5 5Tiempo de coagulación.Tiempo de Sangría.Retracción de coagulo.Dosaje de fibrinógeno.

6 6Grupos sanguíneos. Sistema ABO, Factor Rh. Prueba de Coombs-Variante Du.

7 7

Aglutinaciones TO, TH, PA, PB y B Pruebas Serológicas: VDRL. RPR.Crioaglutininas.Antiestreptolisinas OPrueba de Proteína C Reactiva. Prueba de látex.

8 Primer examen (E1)

9 8Examen de orina completa:Examen físico. Examen químico. Examen microscópico.Espermatograma.- Examen físico.- Químico y citológico.

10 9

Urocultivo. Coloración Gram. Pruebas bioquímicas. Antibiogramas.Estudio de las Heces. Examen parasitológico. Método Directo. Método de Faust.Técnica de Graham.


11 10Dosaje de glucosa. Determinación de Colesterol total. Determinación de Triglicéridos.

12 11Determinación de GOT y GPT. Curva de calibración.Determinación de fosfatasa alcalina. Determinación de Amilasa. Determinación de Lactato deshidrogenasa.

13 12Determinación de Bilirrubinas totales, directa e indirecta.Determinación de proteínas totales y fraccionadas.

14 13Determinación de urea. Determinación de creatinina.Determinación de calcio. Determinación de magnesio.

15 14Determinación de T3 y T4. Determinación de HCG sub unidad beta cualitativo y cuantitativo.

16 Segundo examen (E2)

PRÁCTICA No. 1: TOMA DE MUESTRA PARA LOS DIVERSOS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS. SANGRE TOTAL, SUERO, PLASMA, SANGRE DESFIBRINADA. RECONOCIMIENTO DE ELEMENTOS FORMES EN SANGRE FRESCA Y COLOREADA. RESISTENCIA GLOBULAR

1.1 Marco TeóricoLa toma de muestra de sangre o de cualquier fluido biológico tiene importancia en la buena determinación de los análisis clínicos ya que constituyen el primer paso en todo el proceso dependiendo de una serie de factores. El reconocimiento de los elementos formes nos informa acerca de las características y diferenciaciones en una muestra de sangre fresca y sangre coloreada.

Líquidos Biológicos:

1. Sangre 2. Orina 3. Esputo 4. Jugo Gástrico 5. Contenido Duodenal 6. Líquido Cefalorraquídeo 7. Liquido sinovial 8. Lìquidos serosos (pleural, peritoneal, articular) 9. Líquido amniótico y seminal 10. Heces


Las determinaciones hematológicas y bioquímicas pueden realizarse en sangre total, suero o plasma.

1.2 Competencias

1.-Distingue los diversos métodos para la toma de muestra de los diversos líquidos biológicos2. Explica las diferencias entre los líquidos de sangre total, plasma y suero sanguíneo.3. Identifica los diversos elementos formes 4. Diferencia los elementos formes en sangre fresca y coloreada.

1.3 Materiales y Equipos

Materiales1. Agujas descartables 20 G x 1 ½2. Algodón 3. Alcohol4. Tubos de ensayo5. Viales con anticoagulantes6. Perlas de vidrio7. Matraz8. Pipetas

Reactivosa. Anticoagulantes: De Wintrobe:

Oxalato de Amonio ------ 1.2 gr.Oxalato de Potasio ------ 0.8 gr.Agua destilada ------ 100 mL.Formol al 40% ------ 1 mL.

Haskins Trotman: Oxalato de potasio al 2% Citrato Trisódico al 3.8% Oxalato de Sodio al 1.34% Heparina al 0,75% EDTA

1.4 ProcedimientoA. Toma de muestra. SANGRE VENOSA:1. El paciente permanecerá sentado con el brazo extendido reposando sobre la mesa apoyado sobre una almohadilla.2. Se colocará una ligadura de goma a unos 7 cm. por encima del codo, teniendo la precaución de no comprimir fuertemente. Esta ligadura colocada más de 2' provoca una hemoconcentración con acumulaciones subproductos metabólicos.


Se elige la vena más prominente sobre la superficie de flexión del codo (VENA MEDIANA CEFALICA)3. Se desinfecta la región con una torunda de algodón empapada al alcohol yodado.4. Se atraviesa la piel con la aguja manteniendo el bisel hacia arriba directamente sobre la vena penetrando en ella.5. Una vez lograda la cantidad de sangre necesaria se afloja la ligadura mientras la aguja permanece aun en la vena.6. Se saca la aguja y se aplica una torunda ligeramente humedecida en alcohol flexionando el codo.7. Para efectuar los frotises se tomará una gota de sangre tomada directamente de la aguja antes de mezclarla con el anticoagulante sobre para objetos desengrasados y secos. En niños que no son muy palpables las venas se tomará la sangre de la vena yugular.

SANGRE CAPILAR:Se obtiene por punción cutánea y se utiliza cuando se requieren pequeñas cantidades de sangre.Debe utilizarse una lancetaEn la yema del dedo. En los niños en el lóbulo de la oreja o bien en el talón dilatado y la sangre fluya espontáneamente.

Obtener los siguientes componentes:

1. SANGRE TOTAL Y PLASMAEn une vial con anticoagulante colocar 5 ml. de sangre, Mezclar Colocar en un tubo de ensayo y centrifugar 10 minutos a 1500 rpm.

2. SUEROEn un tubo de ensayo colocar 5 mL. de sangreCentrifugar 10 minutos a 1500 rpm.

3. SANGRE DESFIBRINADAEn un vaso pequeño o matraz que contiene perlas de vidrio, colocar 3 a 5 mL. de sangre sin anticoagulante. Se agita durante 15 minutos. La FIBRINA se deposita sobre estos cuerpos en forma de filamentos elásticos y blancos.

El líquido que queda se denomina sangre desfibrinada y está constituida por suero y glóbulos que se puede confirmar por centrifugación.La fibrina es de color blanco y se observa lavando con agua destilada.

RECONOCIMIENTO DE ELEMENTOS FORMES:a. EN MUESTRA FRESCA

b. EN MUESTRA COLOREADA1. Colocar 1 gota de sangre en un porta-objeto se coloca un cubreobjeto y observar.


Elementos de forma discoidea de color amarillo: eritrocitos unidos formando pilas por el fenómeno de la tensión superficial, estos discos se observan de color rosado.Elementos transparentes e incoloros: Leucocitos.Plaquetas: no se visualizan por ser muy pequeños.Tamaño: eritrocitos: 7.2 u

leucocitos: 5 a 20 uplaquetas: 2 a 4 u

2. Otro portaobjeto: 1 gota en uno de los extremos y con otro portaobjeto haciendo un ángulo de 45 grados hacer un frotis. Secar al medio ambiente.Se lleva a colorear con colorante Wright: con 10 a 12 gotas cubriendo el frotis. Mezclar soplando por 30 segundos.Se adhiere agua destilada, nuevamente se sopla mezclando.Dejar en reposo por 10 minutos.Lavar con agua de caño escurrir la lámina en forma vertical.Una vez seco se coloca 1 gota de aceite de cedro, elevar el condensador y observa con objetivo de inmersión.Se observa: Eritrocitos en forma discoidea con un halo en la parte central

Leucocitos: Mononucleares: Monocito 16 a 22 uLinfocito 7 a 10 u

Polimorfonucleares: Neutrofilos, Eosinófilos, Basófilos: 9 a 12 u

1.5 ResultadosLos alumnos reportaran en su informe los resultados obtenidos en ésta práctica.

1.6 Cuestionario1. ¿Qué diferencia encuentra Ud. entre sangre capilar, sangre venosa y sangre

arterial?2. ¿Cómo se obtiene la sangre desfibrinada?3. ¿Cuál es la composición química del anticoagulante de Wintrobe y como

actúa en la sangre evitando la coagulación de la misma?4. ¿Qué diferencias existen entre suero y plasma?5. ¿Cómo se observan los elementos formes en sangre fresca y sangre

coloreada? Dibuje utilizando colores.

1.7 Fuentes de información1. Bernard J, Lévy JP. Manual de Hematologia. 7a ed. Barcelona: Toray Masson

S.A; 2001.2. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3a ed.

Buenos Aires: El ateneo; 1985.3. Robbins S, Cotran R, Kumar V, Collins T. Manual de patología estructural y

funcional. 6a ed. Madrid: Mc Graw-Hill Interamericana; 1999.4. Wintrobe M, Maxwell M. Hematología clínica. 6a ed. Buenos Aires:

Interamericana; 1999.


PRÁCTICA No.2: HEMATIMETRIA. RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS.DOSAJE DE HEMOGLOBINA.HEMATOCRITO. MICROHEMATOCRITO.

A. HEMATIMETRIA: RECUENTO DE GLÓBULOS ROJOS.

2.1 Marco teóricoLa hematimetría es un método para contar los glóbulos rojos de la sangre. La hemoglobina es una proteína que se encuentra en el interior de estos elementos y su función fundamental es la de transportar el O2 y el CO2. El concepto de anemia descansa sobre la determinación de estos componentes. Estas pruebas se realizan habitualmente como parte del hemograma completo.

2.2 Competencias1. Reconoce la cámara de Neubauer y los campos donde se efectúan los contajes

correspondientes de los elementos formes. 2. Opera con destreza el proceso del recuento de glóbulos rojos.

2.3 Materiales y equipos

MaterialesCamara de NeubauerPipeta de Thoma para glóbulos rojos

ReactivosLIQUIDO DE DILUCIÓN:Las más conocidas son las de GOWER, HAYEM y MARCANO

SOLUCIÓN DE GOWER:Sulfato de Sodio ........ 12,5 gr.Acido Acético Glacial …. 33,3 mLAgua destilada csp ....... 200 mL.

2.4 Procedimiento1. Aspirar sangre hasta 0.5 ó 1 según la dilución 1 en 200 ó 1 en 100.2. La sangre que moja la superficie externa de la pipeta se limpia rápidamente con

papel especial o con gasa.3. Si la sangre pasa la marca de 0.5 ó 1 se retira por capilaridad tocando la punta

de la pipeta con gasa o algodón.4. Completar con el líquido de dilución hasta la marca de 101.5. Mientras se aspira el líquido de dilución, se hace girar la pipeta entre el pulgar y

el índice de la mano derecha.6. Retirando la boquilla se imprimen movimientos durante 1 ó 2 minutos.7. Desechar las primeras gotas y sin perdida de tiempo tocar con una gota pequeña

el borde de la superficie pulimentada en que están en contacto la cuadricular de la cámara y el portaobjeto.


8. Esta gota se insinúa por debajo del cubreobjeto por capilaridad.9. La suspensión no debe escurrirse en los surcos laterales ni debe formarse

burbujas de aire.10.Dejar transcurrir 3 minutos para que se depositen los glóbulos.11.Llevar la cámara a la platina del microscopio. Iluminar bien. Comprobar si hay

uniforme distribución de hematíes.12.Efectuar el recuento con el objetivo de gran aumento, manteniendo el

condensador bajo y el diafragma parcialmente cerrado, nunca se tocara el cubreobjeto con la lente, ello induce a groseros errores al modificar la posición de los corpúsculos.

Para evitar toda confusión al contar los glóbulos, se incluyen los hematíes que tocan las líneas divisorias izquierda y superior como si estuviera dentro de los cuadrados, los que tocan los lados derecho e inferior no se toman en cuenta.No debe haber diferencia de más de 18 unidades de número de glóbulos rojos entre los 5 cuadrados.

Cálculos:Con la dilución al 1 en 200 contar los glóbulos comprendidos en 5 grupos de 16 luego se aplica la siguiente fórmula: (Cálculo razonado)N x 10 x 200 x 400------------------------- = Hematíes por mm3 de sangre. 80De donde:

N: número total de hematíes en 80 cuadraditos.10: altura de la cámara. Para referir a 1mm3 de sangre diluida.200: dilución de la pipeta para referir al 1 m3 de sangre sin diluir.400: número total de cuadraditos.80: para referir al número de cuadraditos en el que se ha llevado acabo el

recuento.O también: los glóbulos rojos de los 5 cuadrados se le agregan 4 ceros

Cifras normales:En estado de salud existe aproximadamente 5’000,000 de hematíes por mm3 de sangre.El número es un poco menor en las mujeres 4’500,000 por mm3.

Interpretación:La disminución de hematíes se denomina ANEMIA u OLIGOCITEMIA y se da también en leucemia y después de hemorragias.El aumento se denomina POLICITEMIA o POLIGLOBULIA.Hay poliglobulia en el recién nacido hasta 7!000,000 y va descendiendo gradualmente para llegar al del adulto hacia los 15 años.La policitemia carece de importancia y en patología es infrecuente.



2.6 Cuestionario1.¿Cuál es el fundamento del proceso de la hematimetria?2.¿Cuál es la composición química de los líquidos de Hayem y Marcano en hematimetría?3.Explique mediante un esquema el reticulo de Thoma4.Explique por que en las personas que habitan en alturas se encuentra Policitemia.

2.7 Fuentes de información1. Bernard J, Lévy JP. Manual de Hematologia. 7a ed. Barcelona:

Toray Masson S.A; 2001.2. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su

interpretación. 3a ed. Buenos Aires: El ateneo; 1985.3. Robbins S, Cotran R, Kumar V, Collins T. Manual de patología

estructural y funcional. 6a ed. Madrid: Mc Graw-Hill Interamericana; 1999.4. Wintrobe M, Maxwell M. Hematología clínica. 6a ed. Buenos

Aires: Interamericana; 1999.

B. DOSAJE DE HEMOGLOBINA (Hb)

2.1 Marco teóricoLa Hemoglobina es una molécula formada por 2 estructuras el grupo Hemo y la Globina. Todas las moléculas de Hb se encuentran en el interior de los glóbulos rojos y su función fundamental es la de transportar el O2 y el CO2. La determinación de Hb en sangre es un parámetro que nos ayuda en el diagnóstico de una anemia.

2.2 Competencias1. Explica bioquímicamente el proceso para la determinación de la hemoglobina.2. Determina en el laboratorio el dosaje de hemoglobina.


MaterialesPipeta de Sahli

Tubos de ensayos

Equipos Espectrofotometro

Reactivosa. REACTIVO DE DRABKIN:o Bicarbonato de Sodio 1 gr.o Cianuro de Potasio 50 mg.o Ferricianuro de potasio 200 mg.o Agua destilada csp 1000ml.


o Guardar en frasco oscuro, la solución de es de color amarillo pálido. Es un reactivo tóxico.

b. SOLUCIÓN STANDARD:o Solución de cianometahemoglobina titulada según las recomendaciones del

Comité Internacional para Estandarizar de Hematología. Contiene preservantes.

2.4 ProcedimientoMETODO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA:

1. Rotular dos tubos con Problema y banco. Deben estar bien secos.2. Agregar a cada uno de ellos 5ml de reactivo de Drabkin.3. Adicionar al tubo Problema con la Pipeta de Sahlí 20µl de sangre (capilar o

venosa)

4. Mezclar y dejar en reposo por espacio de 10 minutos.5. Realizar la lectura del tubo Problema ajustando el instrumento a 0 de densidad

óptica o el tubo Blanco.6. La lectura obtenida llevar a la curva de calibración o multiplicar por el factor

para hallar la concentración de hemoglobina.7. Leer al espectrofotómetro con filtro verde ó 540 nm.

CALCULOS:FACTOR= 15 / Absorbancia del StandardHb (g/100ml) = Absorbancia de la muestra x FACTOR

FACTOR DE CALIBRACION:Se sigue el siguiente cuadro:TUBO# STANDARD SOL. DRABKIN CONCENTRACIÓN (mL) (mL) (gr %)

1 6.0 0.0 20 2 4.5 1.5 153 3.0 3.0 104 1.5 4.5 5Blanco 0.0 6.0 0

El quinto tubo sirve para llegar a 0 con el espectrofotómetro. Aplicando la fórmula de concentración sobre lectura para cada tubo y sacando el promedio tenemos el factor % en vista de que el standard viene en g %.SE realizan 4 divisiones y luego se obtiene el factor promedio, que en este caso es factor por 100.

VALORES NORMALES:Nacimiento 14 - 24 g/100 mL3 meses 10.5 - 14.5 g/100 mL

Adulto sexo femenino 12-16 g/100 mL sexo masculino 14-18 g/100 mL


INTERPRETACIÓN:AUMENTO: hipercromemia: niños recién nacidos, personas que viven en

altura, procesos hematopoyéticos.

DISMINUCION: Hipocromemia u oligocromemia: anemias


2.6 Cuestionario1. Explique el fundamento del dosaje de Hemoglobina2. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de la hemoglobina?3. ¿Cómo se puede hallar el valor del hematocrito a partir de la determinación de la

hemoglobina?

2.7 Fuentes de información1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 7ª ed. Buenos Aires: Panamericana; 1997.2. Gradwhol. Métodos y diagnóstico del laboratorio clínico. 8ª ed. Buenos Aires:

Médica Panamericana; 1986.3. Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.

Buenos Aires: Librería El Ateneo; 1985.4. Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México DF: Manual

Moderno S.A.; 1986.

C. DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO Y MICROHEMATOCRITO

2.1 Marco teóricoEl hematocrito (Hc) es otra de las pruebas de laboratorio que ayuda en el diagnóstico de las anemias corroborando los otros parámetros como el recuento de glóbulos rojos y la hemoglobina.

2.2 Competencias1.- Determina los valores del hematocrito por el método correspondiente.2.- Realiza el procedimiento en el laboratorio del hematocrito.


MaterialesTubo de Wintrobe

Equipos Centrifuga para capilares

ReactivosAnticoagulante de Wintrobe


2.4 ProcedimientoA. Toma de muestra. SANGRE VENOSA:

La Sangre venosa obtenida y que se encuentra mezclada con el anticoagulante de Wintrobe llenar con la pipeta capilar el tubo de Hematocrito hasta la marca 10.Centrifuga a 3,000 rpm durante 30 minutos.

Cálculos:Para calcular el Hc la altura de la columna de hematíes sedimentados dado en mm se multiplica por 10.Valores normales:

Mujeres: 42 mL%Hombres: 45 mL%

InterpretaciónEstán disminuidas en las anemias, en los casos de hemodilución tales como la hidremia fisiológica (exceso de agua en la sangre) del embarazo.Es alto en las poliglobulias genuina a una hemoconcentración debida a considerables perdida de agua como en la deshidratación, quemaduras y schock.

SANGRE CAPILAR:

MICROHEMATOCRITO: Método de Guest-WichsebaunEn pediatría se esta difundiendo el uso del microhematocrito que utiliza sangre obtenida por punción digital.

MATERIALES Y REACTIVOSTubos capilares de 7 cm de largo por 1mm de diámetro interior cubiertos interiormente con heparina al 1/1000 se tapona con arcilla moldeable (plastilina).

PROCEDIMIENTO:1. Se llena con sangre por capilaridad las tres cuartas partes del capilar. 2. Centrifugar en la microcentrifuga y leer sobre los normogramas que viene en cada equipo.Cuando no se dispone de dicho equipo se pone el tubo dentro de un tubo de ensayo y se centrifuga por 10 minutos a 2000 rpm. Luego se aplica la siguiente formula:a- x 100 = ml%ba= longitud de la columna roja en mlb= longitud total de sangre que llena el tubo capilar100= para referirse al Hc en mL%



2.6 Cuestionario1. ¿Qué diferencias en los valores se pueden dar entre el microhematocrito y el

hematocrito de Wintrobe?2. ¿Qué diferencias existen entre la eritrosedimentación y el hematocrito?3. ¿Cómo se hallan las constantes corpusculares. Explique las fórmulas correspondientes?

2.7 Fuentes de información1. Bernard J, Lévy JP. Manual de Hematologia. 7a ed. Barcelona: Toray Masson S.A;

2001.2. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3a ed.




PRACTICA No. 3: LEUCOMETRIA: RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

3.1 Marco teóricoLa leucometría es una de las técnicas para realizar el recuento de los leucocitos, que corresponde al número de elementos celulares por unidad de volumen presente en una muestra de sangre después de provocar la lisis de los hematíes. Diversas son las causas o patologías que pueden aumentar (Leucocitosis) o disminuir (Leucopenia) los glóbulos blancos e influenciar en el diagnostico clínico.

3.2 Competencias1. Conoce el procedimiento para el recuento de glóbulos blancos.2. Diferencia los recuentos de glóbulos blancos y rojos.3. Aplica formulas para el recuento de glóbulos blancos.

3.3 Material y equipos

Materiales Pipeta de Thoma para el recuento de Leucocitos

ReactivosLíquido de Turck: Violeta de genciana ...1 mL. Ácido Acético glacial .. 3 mL.


Agua destilada csp. ...100 mL.

3.4 Procedimiento1. Aspirar sangre hasta 0.5 ó 1 (1:20 ó 1:10) según la dilución en la pipeta de

Thoma. Limpiar la punta para eliminar el exceso de sangre.2. Completar con diluyente hasta 11, haciendo 9 girar la pipeta.3. Dejar en reposo de 5 a 15 minutos para la completa destrucción de los

hematíes y perfecta tinción de los núcleos leucocitarios.4. Cargar la cámara cuenta glóbulos, esperar 5 minutos para que se depositen

los leucocitos sobre el retículo.5. Llevar a la platina del microscopio, comprobar con débil aumento la

uniforme distribución celular y verificar el recuento.Con el objetivo de menor aumento contar los leucocitos contenidos en los 4 campos cuadrados situados en las esquinas de retículo.Se consideran los elementos que se encuentran en los interiores de la derecha y de arriba, pero se omiten las que se hallan sobre la línea de izquierda. Se volverá a repetir el procedimiento si la diferencia entre 2 cuadrados sea mayor de 8 células.

Cálculos:La cantidad encontrada en los 4 cuadrados se divide entre 2 y al resultado se añade 2 ceros (o se multiplica por 50)También:N x 10 x 20 = Leucocitos por mm3 de sangreN = Total de leucocitos en 4 cuadrados dividido entre 4 10 = par referir al mm3

20 =.dilución cuando se aspira sangre hasta 0.5Valores normales:6,000 a 9.000 por mm3 de sangre.Interpretación:La disminución de leucocitos se denomina LEUCOPENIA y se presenta en algunas enfermedades infecciosas como ocurre en la angina agranulocítica o granulocitopenia idiopática, anemia perniciosa, clorosis, mala nutrición, fiebre tifoidea, malta, virales: rubéola, sarampión, hepatitis, parotiditis, etc.El aumento de denomina LEUCOCITOSIS:Existe una leucocitosis fisiológica con neutrofilia entre 12,000 y 14,000 en el recién nacido, durante el embarazo en el 9º mes, durante el parto, durante la digestión.De orden patológico: la leucocitosis se debe a la quimiotaxis y al estimulo de los órganos hematopoyéticos (la quimiotaxis es la propiedad que tiene ciertos agentes de atraer o repeler células vivas) Una inflamación tiene poder quimiotáctico de atraer muchos leucocitos, lo mismo ocurre con las bacterias y alguno tóxico se que atraen leucocitos a la circulación general.



3.6 Cuestionario1. ¿Cuál es el fundamento del reactivo de Turck en el recuento de leucocitos?2. Indique que otros líquidos de dilución se emplean para el recuento de leucocitos

y su composición química.3. ¿Qué importancia clínica tendría el recuento de leucocitos?

3.7 Fuentes de información1. Bernard J, Lévy JP. Manual de Hematologia. 7a ed. Barcelona: Toray Masson S.A;

2001.2. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3a ed.




FÓRMULA LEUCOCITARIA. HEMOGRAMA DE SCHILLING

3.1 Marco teórico Es el método analítico más frecuentemente solicitado en la práctica médica diaria, no solo para el diagnóstico, valoración y seguimiento de las diversas patologías hematológicas, sino también de las que no lo son, pero que curan con alguna alteración valorable del mismo. Su facilidad de realización y rápida modificación en muy diversas circunstancias fisiológicas y patológicas hacen también de él un método analítico de práctica casi obligada. El hemograma incluye la cuantificación de los elementos formes que contiene la sangre por unidad de volumen, recuento porcentual de los leucocitos(habitualmente compuestos sólo por linfocitos, monocitos, y granulocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos), además informa sobre valores o índices relacionados con el contenido hemoglobínico de los glóbulos rojos y el tamaño de éstos y el de las plaquetas. La formula leucocitaria indica la presencia relativa de los diferentes tipos de leucocitos en la sangre periférica y se expresa en porcentajes sobre el total.

3.2 Competencia1. Utiliza el colorante adecuado para la identificación de los elementos formes en

sangre coloreada.2. Identifica los diversos tipos de leucocitos de acuerdo a su forma, tamaño y color.3. Aplica el método más conveniente para el recuento de los diversos tipos de

leucocitos.


MaterialesLaminas portaobjetos


ReactivosColorantes:En general los colorantes hematológicos que más se utilizan son los derivados de Rowanowsky, entre los que tenemos el de Giemsa, Leishman, Wright y Hastings.

Colorante de Wright:Es una combinación especial a base de azul de metileno y eosina que, para los trabajos de rutina da excelentes resultados.Pesar 0,4g. de colorante Wright en polvo, agregar 194 mL de alcohol metílico libre de acetona, añadir 6 ml. de glicerina. Agitar enérgicamente. Conservar en frasco oscuro agitando un minuto diario durante una semana. Finalmente filtrar cada vez que ha de usarse, después de cumplida la semana. Dura seis meses.

3.4 Procedimiento

ESTUDIO CITOMORFOLOGICO DE EXTENDIDOS COLOREADOS:Métodos para el examen del extendido sanguíneo en el recuento diferencial:

a. Observación reglada en 4 camposb. Observación reglada en dos campos

En indispensable para obtener el porcentaje de cada tipo de leucocito que estos se hallen uniformemente distribuidos en el extendido sanguíneo. Como los granulocitos generalmente están en los márgenes del extendido y los linfocitos en el centro, se recomienda el método aconsejado por Schilling, que consiste en tomar 4 puntos marginales distintos recorriendo el campo en zigzag desde el borde hacia la parte central y contar 25 o 50 elementos en cada uno de los 4 puntos. Debe anotarse el tamaño celular; en el núcleo: forma, posición, color, estructura de la cromatina, membrana nuclear, presencia o ausencia de nucleolos; en el citoplasma: cantidad relativa(cociente núcleo citoplasma), color, presencia o ausencia de zona perinuclear clara y características de los gránulos: número, color, tamaño y distribución, granulación tóxica, vacuolas o degeneración del citoplasma.

FORMULA LEUCOCITARIALa formula leucocitaria permite conocer la cantidad de cada tipo de célula, y para ello se procede a contar un número determinado de leucocitos (100-200 ó más), en un frotis bien coloreado, anotando por separado cada variedad celular. Procediendo en estar forma, la llamada FORMULA RELATIVA, o sea el porcentaje de cada tipo de leucocitos.La condición indispensable para justipreciar el porcentaje de cada tipo de leucocitos más bien en la mitad de la extensión la técnica más recomendable para obviar el inconveniente anotado, es de recorrer el preparado en la forma que aconseja SCHILLING, siguiendo el método serpenteando los cuatro campos.

HEMOGRAMA DE SCHILLING


El hematólogo Von Schilling establecio un cuadro para el recuento diferencial de leucocitos. Clasifica además a los neutrófilos en dos grupo fundamentales: neutrófilos no lobulados e incompletamente lobulados y neutrófilos completamente lobuladados (2 ó más lóbulos).El hemograma normal según Schilling es el siguiente:

Tipo de leucocitos

Porcentajes

Neutrófilos Mielocito 0Metamielocito 0-1Núcleo en cayado 3-5Núcleo segmentado 55-65

Eosinófilos 2-4Basófilos 0-1Linfocitos 20-30Monocitos 4-8

3.4 INTERPRETACION:Se denominarán los aumentos de los tipos de leucocitos denominándose eosinofilia, basofilia, linfocitosis, monocitosis.Según Arneth se habla de desviación hacia la izquierda del hemograma cuando aumentan las formas no segmentadas o inmaduras de los neutrófilos; y se dice que hay desviación hacia la derecha, cuando aumentan las células maduras o adultas..


3.6 Cuestionario:1. Dibuje y coloree los diferentes tipos de leucocitos.2. ¿En que patologías se presentan linfocitosis, monocitosis, neutrofilia, eosinofilia

y basofilia?3. ¿Cual es la diferencia entre el Hemograma de Schilling y el Esquema de Arneth?

3.7 Fuente de información:1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica

panamericana; 1999.2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio

clínico. 2a ed. Barcelona: Masson; 2005.3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y

citológicos. Madrid: Masson; 2005.4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier;

2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos.

México D.F.: Manual moderno, 2006.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

6. Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 3a ed. Madrid: Elsevier-Masson; 2006.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

3.1 Marco teórico Prueba de laboratorio inespecífico importante para evaluar el curso de una enfermedad; es inespecífico porque no sirve para el diagnóstico etiológico de una enfermedad.Esta sencilla prueba es utilizada como índice de la presencia activa de enfermedades diversas

3.2 Competencias1. Utiliza con precisión el tubo de Wintrobe para la lectura del hematocrito y la

eritrosedimentación. 2. Realiza la lectura de la velocidad de sedimentación utilizando la escala

adecuada.


MaterialesTubo de Wintrobe


3.4 ProcedimientoA. METODO DE WINTROBE Y LANDSBERG

La eritrosedimentación se determina con el tubo de Wintrobe en la siguiente forma:Recoger 5 mL. de sangre con anticoagulante.Llenar el tubo de Wintrobe hasta la marca "O" de sangre utilizando la pipeta de Wright y antes de que la muestra tenga más de dos horas de extraída.Mantener el tubo en posición vertical tapar con un capuchón de goma y esperar UNA HORA para hacer una sola lectura o con intervalos frecuentes para expresar en gráficas.VALORES NORMALES:Hombre: 1 - 11 mmMujeres1 - 15 mmDeterminada la velocidad de sedimentación puede centrifugarse a 3000 rpm durante 30 minutos para comprobar el volumen globular.En esta forma se corrige la eritrosedimentación si existen alteraciones ocasionadas por anemia.En el mismo tubo puede medirse el volumen de leucocitos, plaquetas y el índice

ictérico.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

B. METODO DE CUTLERSe emplea el tubo de sedimentación de Cutler que tiene 1 ml. de capacidad, 5mm de diámetro interno y está graduado en 40 divisiones con el "O" a nivel del "Y que representan milímetros.Procedimiento:Llenar el tubo con sangre con anticoagulante. Colocar en posición vertical y hacer la lectura a la hora, cada 5 minutos para construir la gráfica.Es mejor trabajar con sangre citratada en la siguiente forma:Con una jeringa de 2 mL. aspirar 0.1 mL. de solución de citrato de sodio al 3.8 g % y completar a 1 mL con sangre venosa.Mezclar llenar el tubo de Cutler, tapar con un tapón de goma y mantener en posición vertical.En el nuevo tubo modificado de Cutler, se deposita 0.5 ml de anticoagulante citrato de sodio 3.8% y se completa a 5ml con sangre venosa en la marca "O". la cantidad insuficiente de citrato aumenta la VSG y un exceso disminuye o retarda.Valores normales:Las cifras normales a la hora de lectura son de:2 - 10 mm para mujeres2 8 mm para hombres.Estas cifras deben estar en líneas casi horizontal cuando se gráfica a intervalos de 5 minutos.El carácter de la curva en estado patológico se interpreta según su forma:Si la línea es diagonal, apartándose ligeramente de la curva normal, indica proceso leve o en quietud.Cuando la curva sigue diagonal con gran descenso indica estado morboso activo o recaídas de mucho cuidado.Si la curva es caso vertical se trata de una enfermedad muy grave.Se debe indicar el método, tiempo en minutos, índice de sedimentación en mm y el carácter de la gráfica.

INTERPRETACION CLINICA:Prescindiendo del embarazo, la determinación de la VSG.Está aumentada en los estados patológicos mas dispares, sin ser esto específico de ninguno en particular.La VSG aumenta sobre todo, cuando existe un foco inflamatorio en estrecha conexión con el árbol vascular; por ello son especialmente aceleradores los focos vecinos a las serosas (Infarto al miocardio, focos pulmonares, etc.)

Todas las infecciones generales de cierta intensidad, salvo raras excepciones evolucionan con VSG aumenta principalmente cuando coinciden los períodos de fiebre y anemia.En las inflamaciones locales agudas (por ej. apendicitis) la velocidad no esta alterada, sobre todo en las fases iniciales.Las neoplasias malignas al principio no modifican la eritrosedimentación, pero si la aceleran cuando hay lísis de los tejidos derivados de la proliferación neoplásica.


La VSG está más o menos aumentada en todos los tipos de anemias. En el curso del embarazo la VSG se acelera, debido a una hemodilución de la sangre circulante.En la mujer normal la menstruación produce variaciones muy ligeras de la velocidad.Por último los focos sépticos muy aislados del torrente sanguíneo (caries dentarias, sinusitis, amigdalitis crípticas) apenas aumentan la VSG.


3.6 Cuestionario1.- ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de la velocidad de

sedimentación?2.- ¿Qué diferencias existen en la utilización de los diversos métodos para

determinar la eritrosedimentación?3.- ¿Cuál es el fundamento físico químico de la eritrosedimentación?4. ¿Por qué la diferencia de valores en la eritrosedimentación en varones y en

mujeres?

3.7 Fuentes de información1. Bernard J, Lévy JP. Manual de Hematologia. 7a ed. Barcelona: Toray Masson

S.A; 2001.2. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3a ed.


funcional. 6a ed. Madrid: Mc Graw-Hill Interamericana; 1999.4. 4.Wintrobe M, Maxwell M. Hematología clínica. 6a ed. Buenos Aires:


PRÁCTICA No. 4: RECUENTO DE PLAQUETAS, RECUENTO DE RETICULOCITOS Y RECUENTO DE EOSINÓFILOS

RECUENTO DE PLAQUETAS

4.1 Marco teórico El recuento de plaquetas es el número de esos elementos (Trombocitos) por milímetro cúbico de sangre. La actividad plaquetaria esencial es la de conformar el tapón hemostático primario en los mecanismos de la coagulación (Hemostasia). La visualización de una extensión de sangre permite descubrir ciertas alteraciones de la serie plaquetaria y su cuantificación para determinar si existe una disminución (Trombocitopenia) ó un aumento (Trombocitosis).

4.2 CompetenciasF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

1.- Distingue los métodos directos e indirectos para el recuento de plaquetas 2.- Aplica el método más conveniente para el recuento de plaquetas


MaterialesPipeta de Thoma para glóbulos rojosCamara de NeubauerLaminas portaobjetos

Reactivos1. Reactivo de Sulfato de Magnesio al 14%2. Colorante de Wright3. Reactivo de Rees-Ecker:

Citrato de sodio 3.8 gr. Formaldehído al 40% 0.2 mL.4. Azul brillante de cresil 0.05 gr.

Los métodos para el recuento se pueden clasificar en:METODOS INDIRECTOS:Se basa en determinar la relación entre plaquetas y eritrocitosM. de FonioM de ClefM. de DemeshekMETODOS DIRECTOS:Se basa en contar directamente las plaquetas de la sangre diluida en una cámara hemocitométrica.M. Rees - EckerM. Wright

4.4 ProcedimientoMETODO DE FONIO:1. Sobre la yema del dedo limpio, seco y desinfectado colóquese una gota grande de solución esterilizado de sulfato de magnesio al 14% para que la sangre no tome contacto con el aire. A través de la gota puncionar la piel con una lanceta de tal manera que salga espontáneamente una pequeña gota de sangre a razón de 1:5 aproximadamente.2. Mezclar con el borde de un portaobjeto para homogeneizar e impedir la aglutinación de las plaquetas.3. Con la misma lanceta llevar una gota de la suspensión sobre un portaobjetos y verificar el frotis como si tratara de sangre sola.Al sacar la preparación toma un brillo aterciopelado y casi incoloro al trasluz, teñir con Wright en la forma habitual dejando actuar el colorante un tiempo mayor de dedicado a la formula leucocitaria.4. Con objetivo de inmersión y aceite de cedro contar en varios campos simultáneamente los glóbulos rojos y las plaquetas hasta completar 1000 a 2000 hematíes.CALCULOS


Para los cálculos se multiplica el número de plaquetas, contadas en el frotis, por el número de hematíes por mmc. y dividir entre el número de eritrocitos contadas en la extensión.

Hematimetria: 4'8000,0000 por mm3 de sangre.

50 x 4'800,000----------------- = 240,000 plaquetas por mm3. 1000

METODO DE REES-ECKER:Se debe operar con suma rapidez y limpieza para evitar la aglutinación y para no confundir impurezas con los trombocitos.1. Aspirar líquido de dilución hasta la marca de 0.5 con la pipeta para glóbulos

rojos 2. Llenar con sangre capilar hasta completar con líquido de dilución hasta la

marca de 101.3. Dejar en reposo por espacio de 5 minutos.4. Cargar la cámara cuenta glóbulos y dejar en reposo de 15 a 20 minutos

para que sedimente las plaquetas.5. Con el objetivo potente contar en todo el cuadrado central de retículo para

hematíes (25 cuadrados de 16 cuadraditos cada uno)CALCULOS: N X 10 x 200 = plaquetas por mm3.N : numero de plaquetas en el mm central de retículo10 : para referir al 1 mm3

200 : dilución cuando se toma sangre hasta 0.5Las plaquetas se presentan redondeadas, ovales, alargadas, en forma de cono o poliédricas e irregulares.Se las ve muy refringentes, plateada, veces de color lila.CIFRAS NORMALES: 50,000 a 400,000 plaquetas por mm3 de sangre

INTERPRETACION:Las variaciones fisiológicas se presentación la ingestión de alimentos, actividad muscular, menstruación, etc.

TROMBOPENIAS: Por debajo de 30,000 dan manifestaciones hemorrágicas. Estados alérgicos, anemia aplástica, leucemia linfática, intoxicaciones crónicas, atrofia de la medula ósea, púrpura trombopénica esencial.TROMBOSIS O TROMBOCITOSIS: (escasa significación clínica)hemorragias copiosas, anemia poshemorrágica, después de las intervenciones quirúrgicas, anemia hemolítica, policitemia genuina, leucemia mieloide crónica, traumatismo, esplenomegalia, infecciones crónicas, fiebre reumática.



4.6 Cuestionario:1. Mencione los principales métodos directos e indirectos para el recuento de

plaquetas.2. Explique el fundamento del método de fonio y mencione los valores normales.3. Explique el fundamento del método de Rees-Ecker

4.7 Fuentes de información:1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica panamericana;

1999.2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed.

Barcelona: Masson; 2005.3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos.

Madrid: Masson; 2005.4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual

moderno, 2006.6. Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 3a ed.

Madrid: Elsevier-Masson; 2006.

RECUENTOS DE RETICULOCITOS

4.1 Marco teórico Son hematíes jóvenes inmaduros pero de tamaño superior (macrocitos),

reconocibles en las extensiones de sangre por tinción especial, se observa en las anemias hemorrágicas y hemolíticas.

4.2 Competencias1. Utiliza el método en forma conveniente para el recuento de reticulocitos2. Realiza el recuento de reticulocitos y aplica los cálculos correspondientes.



ReactivosSegún el método humedo en tubo:

Azul brillante de cresil 0.25 gr.Citrato de Sodio 0.1 gr.Formol al 40% 0.05 mL.Soluc. Fisiológica cps. 25 mL.

Según El método de Wolfer:Azul cresil brillante.... 0.5 gr.Alcohol absoluto........... 100 mL

4.4 ProcedimientoF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

METODO HUMEDO EN TUBO:En un tubo de Kahan se mezclan 2 gotas de sangre venosa o capital y 2 gts del reactivo.Se tapa el tubo y se mantiene a la temperatura ambiente por el término de 2 a 30 minutos.Luego se extrae 1 gota de la mezcla y se hace un frotis delgado, se seca al aire y se práctica el recuento.Cálculos:Se cuentan 1000 hematíes anotando todos los que tienen filamentos azules de reticulos.Dividir por 10 para obtener el porcentaje.Ej. 20/10 = 2%

METODO DE WOLFERProcedimiento:1. Sobre portaobjetos hace extensiones de la solución de azul cresil brillante.

Secar al aire.2. Depositar 1 gota de sangre capilar y hacer un frotis sobre el cresil, cuyo

alcohol se ha evaporado. Dejar en reposo 10 minutos.3. La sustancia retículo gránulo filamentoso de los reticulocitos se tiñe de

azul claro con este colorante supravital y ofrece el aspecto de madeja.4. Mientras mas tenues son las capas de la solución alcohólica y de las

sangres mejor será la lectura.5. Después del desecado las muestras son ligeramente teñidas por Wright6. Se observa con objetivos de inmersión.Valores NormalesAdultos: 0.5 -2.5%Niños: 5-10%

Interpretación:Aumento:Recién nacidos hasta 2 a 5 días después del nacimiento. Anemias

hemolíticas constitucionales Anemias que evoluciona con regeneración por tratamiento específico de vit. B 12 en la anemia perniciosa, Acido fólico en anemia megaloblásticas del sprue Hierro, anemia microcítica e hipocrómica ferroprivas. Anemia hemolítica hereditaria (10-20%). Cuando la sangre se regenera rápidamente después de una hemorragia (aumenta hasta constituir el 50% de hematíes)

Disminución Anemia aplástica (falta absoluta) anemias que evolucionan con insuficiencia e hiperactividad funcional de la medula ósea (anemia perniciosa muy avanzada)


4.6 Cuestionario1. ¿Cuál es la importancia clínica del recuento de reticulocitos?


2. ¿Describa las características de un reticulocito. Tipos de reticulocitos.3. Mencione y explique el fundamento de los métodos para el recuento de

reticulocitosis.

4.7 Fuentes de información:1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 7ª ed. Buenos Aires: Panamericana; 1997.2. Gradwhol. Métodos y diagnóstico del laboratorio clínico. 8ª ed. Buenos Aires:



Moderno S.A.; 1986.

RECUENTO DE EOSINOFILOS

4.1 Marco teóricoSerie celular que pasa por las mismas etapas que la serie neutrófila polimorfonuclear. El recuento es de importancia clínica para determinar las eosinofilias características en enfermedades alérgicas y parasitarias.

4.2 Competencias1. Desarrolla el método de Dunger para el recuento de eosinófilos.2. Efectúa los cálculos correspondientes para el recuento de eosinófilos


MaterialesCámara de NeubauerPipeta de Thoma para glóbulos blancos

ReactivosREACTIVO DE DUNGER

Solución acuosa de Eosina al 2% ------------- 15 mL.Acetona -------------------------- 10 mL.Agua destilada csp. ----------------------- 100 mL.

Debe conservarse bien tapado y a baja temperatura.

La solución de Dunger lisa los hematíes y leucocitos pero los eosinófilos son más resistentes.La eosina tiñe de amarillo brillante los gránulos eosinófilos y la acetona disminuye la tendencia de los eosinófilos a romperse.El líquido puede conservarse durante dos semanas en la nevera.

4.4 ProcedimientoF-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

METODO DE DUNGER:Seguir la misma técnica que para el recuento de Leucocitos con dilución 1/20 (marca 0.5) y los cálculos son iguales.CIFRAS NORMALES:Hasta 500 eosinófilos EOSINOFILIA:En infestaciones parasitarias y afecciones alérgicas, asma bronquial, urticarias se llegan a contar hasta 3000 eosinófilos raramente puede encontrarse cifras mayores de 10,000 por mm3.EOSINOPENIA:Provocada por la hormona adrenocorticotrofica (ACTH), ciertosesteroides de la corteza suprarrenal y la adrenalina.La misión exacta de los eosinófilos en la reacción inmunológica alérgica no está determinada. Se supone que los complejos Ag-Ac o la histamina que están implicados en estas reacciones, atraen los eosinófilos por quimiotactismo.

4.5 Resultados:Los alumnos reportaran en su informe los resultados obtenidos en ésta práctica.

4.6 Cuestionario1. Explique el fundamento del recuento de eosinófilos?2. ¿Cuál es la interpretación clínica de los eosinófilos?3. ¿En que casos se solicita un recuento de eosinófilos por parte del profesional

médico?








PRÁCTICA No. 5: TIEMPO DE COAGULACIÓN, TIEMPO DE SANGRIA, TIEMPO DE PROTROMBINA, DOSAJE DE FIBRINÓGENO

5.1 Marco teórico Debido a la enorme complejidad de todos los procesos que intervienen en el hecho hemostático, resulta imposible determinar la verdadera capacidad hemostática in vivo de un individuo mediante la realización de pruebas en el laboratorio, llevada acabo, además bajo condiciones artificiales. Sin embargo, la realización y valoración de unas cuantas técnicas puede ser suficientes muchas veces para presuponer, con un alto margen de seguridad, la existencia, o no de un riesgo hemorrágico. Atendiendo a los puntos fundamentales de la fisiología de la coagulación de la sangre, se deduce que la valoración rutinaria de la hemostasia debe englobar por lo menos la prueba de Quick, el tiempo de coagulación sanguínea, cuantificación del fibrinógeno y de las plaquetas.

5.2 Competencias1. Aplica las técnicas apropiadas para determinar el tiempo de coagulación, tiempo

de sangría y de protrombina.2. Hace la interpretación clínica y correlacionar las coagulopatias.3. Utiliza el método espectrofotométrico para el dosaje de fibrinógeno.


MaterialesLaminas portaobjetosCronometroTubos capilaresTira de papeles secantesTubos pequeñosTubo cónico graduado

EquiposEspectrofotometro


Reactivo de Tromboplastina

5.4 Procedimiento

1. TIEMPO DE COAGULACIÓN:A. METODO DE BURKER: 2' - 8' 1. En una lámina portaobjeto colocar 2 gotas de sangre2. Dejar en reposo 3'. Con el estilete a la 1ra. gota levantar c/ 30". Hasta

formar la FIBRINA.F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

3. Luego de 30" pasar a las 2da gota. Levantar hasta formar la FIBRINA.4. Anotar dicho tiempo.NOTA: El índice de coagulación está dado por el tiempo trascurrido entre colocar la gota y la formación de fibrinaB. METODO DE SABRAZE: 3' - 8'1. 3 tubos capilares (8 en. de largo)2. Obtener sangre capilar detectar la 2 primeras gotas en la 3ra cargar los

capilares.3. Se deja en reposo 3'. Luego romper su trozo c/ 30' hasta que al romper se

forme un filamento de FIBRINA. Toma el tiempo.C. METODO DE LEE Y WHITE: 5' - 10'1. Sangre venosa (3,5 ml) verter en 2 tubos 1 mL de sangre.2. Anotar el tiempo cuando la sangre entra en la jeringa.3. La indica uno de los tubos c/ minuto. ángulo de 45° hasta que la sangre

coagulada no se desplace. Anotar el tiempo.4. Para el otro tubo hacer la misma operación. Anotar el tiempo, se

recomienda reportar la lectura del 2do tubo, porque la agitación y manipulación aceleran la coagulación.

2. TIEMPO DE SANGRIA O DE HEMORRAGIAMETODO DE DUKE:1' - 3'1. Desinfectar el lóbulo de la oreja y pinche con una profundidad de 3 mm.2. C/30" límpiese con papel de filtro la gota de sangre que fluye el papel no

debe rozar la piel.3. Cuando ya no haya hemorragia toma el tiempo no debe haber menos de

2 manchas ni más de 6.4. Se recomienda hacer 2 determinaciones.

NOTA: El lapso transcurrido entre la aparición de la 1ra. gota y la toma de la última es el tiempo de sangría.

3. TIEMPO DE PROTOMBINAMETODO ORTHO-BRAIN 1. En un tubo de prueba de 13 x 100 mm colocar 0,5 ml de solución de

oxalato de sodio 0.1 M y adicionar 4.5 mL de sangre venosa recién obtenida, mezclar y separar el plasma mediante centrifugación.

2. En otro tubo de 13 x 100 mm depositar 0.2 ml de tromboplastina activada + cloruro de calcio 0.02 M.

3. Incubar los tubos del plasma y del reactivo a 37oC por 2'.4. Con una pipeta terminal de un mL graduada en décimos, medir 0.1 mL de

plasma oxalatada y agregar rápidamente al tubo que contiene el reactivo de tromboplastina, el agregado debe hacer desde una distancia de 2 cm. soplando el contenido, simultáneamente poner en marcha el cronómetro, el contenido debe mezclarse por movimientos laterales del tubo dentro del agua a 37oC.

5. Observar la formación de una masa de coagulo que es el final de la reacción de protrombina.

Valores normales: 10 segundos a 12 segundos4. VALOR PROTOMBINICO O INDICE PROTROMBINICO


Se obtiene dividiendo el Tiempo de Protrombina Normal entre el tiempo de Protombina encontrado y multiplicado por 100.

V.P. = T.P.N. x 100 T.P.E.

4. TIEMPO DE RETRACCION DEL COAGULOLa retracción del coagulo es la contracción espontánea de la sangre total, obteniéndose una masa sólida con todo los componentes sanguíneos y la exudación de suero; dicha actividad es función retráctil de las plaquetas y del Fibrinógeno para formar fibrina.METODO DE MAC FARLAND.El método utiliza un tubo de centrífuga graduada en divisiones de 0.1 mL; un alambre de 1 mm de espesor, 12 cm. de longitud con un ensanchamiento en forma de botón de 1.2 cm. de diámetro en un extremo; un corcho que se adapta a la boca del tubo, el corcho debe tener un orificio para dar paso al alambre del extremo opuesto al botón.

1. En un tubo de centrífuga graduado depositar 5 mL de sangre venosa recién extraída.

2. Colocar la varilla de alambre de modo que quede el ensanchamiento dentro de la sangre, adopte el corcho en la boca del tubo.

3. Llevar el tubo a un baño de agua a 37oC y observar de tiempo la coagulación de la sangre.

4. Permanezca el tubo dentro del agua a 37oC por una hora después de la formación del coagulo.

5. Con cuidado retirar el alambre con el coagulo hacia arriba, dejar escurrir el suero dentro del tubo por 1 ó 2 minutos.

6. Leer el volumen del suero que ha quedado en el tubo sobre la escala graduada.

Cálculos:El tiempo de retracción del coagulo se expresa en función del volumen del suero obtenido, multiplicado por 100 y dividido entre el volumen de sangre total obtenido.Ejemplo:Se ha obtenido 5 ml de sangre venosa y después de coagular ha dejado 3 ml de suero, la retracción porcentual será: 3 x 100 = 60% 5Valores normales: De 44 - 67%Interpretación Clínica:Está aumentada en las anemias por disminución del volumen celular, en la trombocitopenia, eritremia y en enfermos con defectos en la coagulación.

5. DOSAJE DE FIBRINOGENOConstituye el 5% de las proteínas plasmáticas.


Es una proteína soluble en el plasma sanguíneo muy lábil debido a su punto isoeléctrico (pH 6,6 - 7). Un litro de plasma contiene 4 g de fibrinógeno.Precipita por el calor de 52 a 56 oC y por solución de cloruro de sodio al 0,85% a semisaturación. El fibrinógeno se origina en el hígado y en todo el sistema reticuloendotelialSe relaciona estrechamente con todo el proceso de la coagulación de la sangre.

METODO DE GORNALL - BARDAWILL Y DAVIDFundamento:Por este método se determina dosando proteínas totales séricas en el plasma y el suero, la diferencia de ambas proteínas totales corresponde a la cantidad de fibrinógeno.1. Reactivo de Gornall: (Biuret)Sulfato de cobre con 5H2O . . . . . . . . . . . . . 1,5 g.Tartrato de sodio y potasio . . . . . . . . . . . . 6.0 g.Disolver en 500 mL de agua destilada, agregar 300 mL de hidróxido de sodio al 10%, enfriar y completar a 1000 mL con agua destilada.

2. Solución del Cloruro de sodio al 0.85%PROCEDIMIENTO:En tres tubos de prueba limpios y secos membretar y colocar:

S P BSuero Problema 0.1 mL - -Plasma Problema - 0.1 mL -Cloruro de Sodio al 0.85% 1.9 mL 1.9 mL 2 mL.Reactivo de Gornall 8 mL 8 mL 8 mL.

Mezclar por inversión y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente.

Leer a 540 nm. contra el blanco del reactivo. Cálculos. Por ejemplo si las lecturas para proteína totales en el plasma es de 130 y para el suero de 125, ambos se multiplican por el factor de proteínas (0.060), luego los resultados obtenidos se restan obteniéndose mg. % de fibrinógeno.


Proteínas totales en el plasma: 130 x 0.060 = 7.80 g -Proteínas totales en el suero: 125 x 0.060 = 7.50 g = 0.30 gO sea: 300 mg. %Valores normales: 200 - 400 mg. %METODO DE STIRLAND:FUNDAMENTO:Se basa en la propiedad del fibrinógeno de coagular a 56 oC mientras que las demas proteínas plasmáticas solo coagulan por encima de los 60 oCEl fibrinógeno se precipita con solución de Cloruro de Sodio al 0.85% La intensidad del enturbamiento es proporcional a la concentración de fibrinógeno.PROCEDIMIENTO:1.En un vial con anticoagulante obtener 5mL de sangre venosa.2.Transferir a un tubo y centrifugar por 5 minutos a 3000rpm3.En 2 tubos P y B depositar 0.6ml de plasma y agregar 6ml de ClNa al 0.85%4.Mezclar ambos tubos.5.El tubo P se pone en Baño Marìa a 56 °C por 15 minutos6.el tubo B se deja a temperatura ambiente y sirve para llevar a “O” de D.O. 7.Retirar el tubo del baño y enfriar a temperatura ambiente.8.Lectura: Se lee el enturbamiento al espectrofotometro a 660 nm.9.Dicha lectura se lleva a la curva de enturbamiento del Timol. Cada unidad de

enturbamiento equivale a 29.5mg% de Fibrinógeno.INTERPRETACIÓN:Cifras altas: Hiperhinosis: Neumonía, Embarazo normal, TBC pulmonar, hepatitis tóxica, fiebre reumática, artritis reumatoidea, nefritis, tumores malignos, septicemia.Disminución: Fibrinopenia: desnutrición, fiebre tifoidea, Anemia intensa, lesiones difusas de las células hepáticas, intoxicaciones por fósforo y cloroformo.


5.6 Cuestionario1. ¿Cuál es el fundamento del tiempo de coagulación?2. ¿Cuál es el fundamento del tiempo de sangría?3. ¿Cuál es el fundamento bioquímico del proceso de retracción del coagulo?4. ¿Cuál es el fundamento del dosaje de fibrinógeno?



Barcelona: Masson; 2005.3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos. Madrid:

Masson; 2005.4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Edit.

Manual moderno, 2006.6. Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 3a ed.



PRÁCTICA No. 6: DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS: SISTEMA ABO, VARIANTE DU y PRUEBA DE COOMBS.

DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS: SISTEMA ABO Y FACTOR RH.

6.1 Marco teórico:El polimorfismo mas significativos de los eritrocitos depende de las características inmunológicas, basándose en la presencia o ausencia de las propiedades químicas en la superficie de los hematíes que permiten diferenciarlos y clasificarlos en un gran número de grupos sanguíneos bien definidos por sus reacciones con las hemaglutininas específicas.

6.2 Competencias: 1.-Distingue los diversos grupos sanguíneos del sistema ABO 2.- Diferencia el Rh positivo del negativo 3.-Aplica la Variante Du para la comprobación del Rh negativo.


MaterialesLaminas de porcelanaTubos de ensayo


6.4 Procedimiento

Método Indirecto de Beth Vincent: 1. Colocar una gota de sangre en un portaobjeto.2. Agregar 1 gt. del suero tipificado anti-A y 1 gt. del suero tipificado anti-B,

mezclar y observar.Si no hay aglutinación el grupo será CERO.Si hay aglutinación en la gota de sangre con el suero anti-A será GRUPO ASi hay aglutinación en la gota de sangre con el suero anti-B: grupo B.Si hay aglutinación en ambos el grupo será AB.FACTOR Rh .- En un porcentaje se coloca 1 gota de sangre mas 1 gto. del anti-Rho (D). Mezclar y

observar.Si hay aglutinación es Rh positivo.


VARIANTE Du DETERMINACION DEL ANTIGUO Rho DEBIL O D 6.1 Marco teórico


El término Du se refiere a la expresión débil del antígeno D normal es decir, la menor concentración del antígeno D por glóbulo rojo esta es una característica heredada. Como entre los anti-D existen ligeras diferencias la potencia de la reacción de los eritrocitos Du varia con el suero utilizado.

6.2 Competencias1. Aplicar la variante Du para la comprobación del Rh negativo.2. Realiza el proceso para la determinación de la variante Du

6. 3 Materiales y equipos

MaterialesTubos de ensayo

ReactivosSuero antihumano de Coombs

6.4 Procedimiento

1. Hacer una suspensión globular al 2% en SSF.2. En un tubo pequeño depositar:

1 gota de suero anti-Rh + 2 gotas de la suspensión globular al 2%.3. Incubar a 37 oC por 60 minutos para sensibilizar a las células.4. Sacar el tubo de la incubadora y lavar las células 3 veces en tubo de ensayo

llenos de solución salina hasta cerca del borde del tubo.Decantar completamente después del último lavado, acercando a la boca

del tubo un papel de filtro para absorber el líquido. (centrifugación a 2,000rpm por 5 minutos)

5. Agregar 2 gotas del suero antihumano de Coombs. Agitar bien el tubo para homogenizar.

6. Centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto.7. Retirar el tubo y suspender nuevamente las células empaquetas mediante

agitación moderada y examinar si existe aglutinación o no.Si hay aglutinación: Du es Rh positivoSi no hay aglutinación: Du es Rh negativo

PRUEBA DE COOMBS

6.1 Marco teóricoSe basa en que los dos anticuerpos llamados incompletos pueden encontrarse revistiendo los eritrocitos o bien estar en suspensión en el plasma,. Como corresponden a la fracción gammaglobulínica de las proteínas séricas, un suero antigamaglobulina humana de conejo (suero de Coombs) aglutinan directamente los eritrocitos cuando están revestidos, pero no cuando los anticuerpos están en suspensión. De esta diferencia surgen dos tipos de pruebas de Coombs: la directa y la indirecta.

6.2 Competencias1. Diferencia las pruebas de Coombs directa e indirecta2. Emplea las técnicas adecuadas para determinar los anticuerpos incompletos.



MaterialesTubos de ensayo

EquiposCentrifuga

Reactivos1. Suspensión globular al 2%2. Solución salina fisiológica3. Suero antihumano de Coombs

6.4 Procedimiento

A. PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA:Se emplea para detectar isoanticuerpo circulantes en el suero que cubren pero no aglutinan a los glóbulos suspendidos en solución Salina fisiológica.La aglutinación solo se produce al tratar los glóbulos recubiertos con suero de Coombs.

1. Prepara suspensión globular al 2% en solución salina fisiológica de la sangre del grupo O Rh positivo.

2. En un tubo de ensayo: 2 gotas de la solución preparada + 2 gotas del suero de la madre

3. Incubar en B.M. a 37 oC por 60 minutos.4. Llenar con solución salina fisiológica. Mezclar. Centrifugar a 2000 rpm por 5

minutos.5. Decantar el sobrenadante. Repetir por 3 veces dicho lavado. Absorber con papel

filtro.6. Al sedimento que queda agregar 2 gotas del suero antihumano de Coombs.7. Mezclar.8. Centrifugar a 1000 rpm por 1 minuto.9. Retirar el tubo y agitar moderadamente a las células.

Examinar el Tubo: Si hay aglutinación POSITIVO (contiene anticuerpos anti-Rh incompleto o bien anticuerpos cuya especificidad y nombre está determinado por la calidad de glóbulos empleados).No hay aglutinación NEGATIVO.

B. PRUEBA DE COOMBS PRUEBA DIRECTA:Es empleada para detectar anticuerpos que se han fijado en los glóbulos del paciente in vivo, por ejemplo en la eritroblastosis hemolítica del recién nacido, en ciertas anemias hemolíticas auto-inmunes y pacientes que hay recibido transfusiones incompatibles.En los niños no tratados de eritoblastosis fetal, la reacción positiva persiste durante varias semanas, mientras que en las exanguineo - transfusión va seguida de una negativización a los pocos días.1. En un tubo de ensayo se colocan 5 gotas de la sangre en estudio y se llena con solución fisiológica.2. Mezclar invirtiendo el tubo varias veces, y centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos. Decantar el líquido sobrenadante.


3. Repetir el lavado dos veces, retirando cada vez todo el líquido remanente.4. Luego se prepara una suspensión de hematíes al 2% en SSF.5. En un tubo se coloca: 1 gota de susp. Globular + 1 gota del suero antiglobulínico 6. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y observar si hay aglutinación.La aglutinación en el tubo contenido los hematíes problemas y su ausencia en el tubo testigo evidencia su sensibilización.Esta prueba es utilizada para el diagnóstico de la eritroblastosis fetal (ictericia hemolítica del recién nacido).Se estudia la sensibilización de los eritrocitos de la sangre umbilical.Como profilaxis de la enfermedad, se buscan los Anticuerpos antes del parto en el suero de la madre mediante la prueba indirecta.También se emplea para el diagnóstico de algunos tipos de anemias hemolíticas.


6.6 Cuestionario1. ¿Cuándo se solicita una determinación de la Prueba de Coombs Indirecta?2. ¿Porque es importante la determinación de la Variante Du?3. ¿Cuál es la importancia clínica de la prueba de Coombs Directa.4. ¿Cuál es la importancia clínica de la prueba de Coombs Indirecta.

6.7 Fuentes de información1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica panamericana;


Barcelona: Masson; 2005.3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos. Madrid:

Masson; 2005.4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual



PRACTICA No 7: PRUEBAS SEROLÓGICAS: DETERMINACIÓN DE FIEBRE TIFOIDEA, PARATIFOIDEA, MALTA, SIFILIS

AGLUTINACIONES

7.1 Marco teóricoLas pruebas inmunológicas son muy útiles para el diagnóstico de muchas patologías a través de los métodos cualitativos y cuantitativos.Los antígenos febriles se utilizan para efectuar diagnósticos rápidos de las fiebres tificas, paratificas y brucellosis. Se utilizan en la prueba rápida de aglutinación en lámina mediante la reacción antígeno-anticuerpo con el objeto de detectar la presencia en suero de anticuerpos que los pacientes producen durante las enfermedades mencionadas.


7.2 Competencias1. Realiza las determinaciones inmunológicas de las pruebas de aglutinaciones.2. Explica los resultados obtenidos a través de las pruebas cualitativas y cuantitativas.


MaterialesLamina de vidrio

Reactivosa. Antígenos febriles

o Suspensiones de cepas bacterianas estabilizadas y standarizadas: tifico O, tifico H, paratífico A, paratífico B y brucella abortus.

7.4 Procedimiento

Las determinaciones comprenden dos etapas:1. Prueba presuntiva:Con una pipeta serológica o una micropipeta depositar una gota de suero problema en cada cuadrado.A cada gota de suero se le añade una gota de cada antígeno previa agitación.Mezclar con un palillo mondadientes para cada cuadrado y leer en el término de uno a tres minutos.Lectura: La reacción es positiva cuando aparece aglutinación en uno de los 5 cuadrados.2. Prueba de titulación:Se preparan 5 cuadrados limpios y con una pipeta depositar en cada uno el volumen de suero:0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0,005 mL de suero respectivamente.Los títulos serán: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.Agregar a cada suero una gota del antígeno. Mezclar.Luego hacer la lectura.Los resultados se expresan en términos de la más alta dilución que presenta aglutinación.


7.6 Cuestionario1. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de las aglutinaciones?

2. ¿Cómo se relacionan los valores positivos de las aglutinaciones con el Hemograma de Schilling?

7.7 Fuente de información1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica panamericana;

1999.


2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed. Barcelona: Masson; 2005.

3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos. Madrid: Masson; 2005.

4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual



DIAGNÓSTICO DE SIFILIS

7.1 Marco teóricoLa sífilis es una enfermedad de transmisión sexual causado por una bacteria espiritada, el Treponema pallidium. Para el diagnóstico se emplean pruebas serológicas treponémicas y no treponémicas, dentro de las no treponémicas: VDRL y RPR.

7.2 Competencias1. Determina los anticuerpos del Treponema pallidium a través de los métodos

serológicos no treponémicas.2. Realizar una correcta interpretación de los resultados de las pruebas serológicas.



EquiposRotador eléctricoMicroscópioBaño María

Reactivos1. Solución antigénica de VDRL 2. Solución salina al 0,9%3. Sueros controles

7.4 ProcedimientoA. MÉTODO DE VDRL

VDRL CUALITATIVO EN SUERO1. Numerar los anillos de la lámina2. Cargar 0.05mL de los surcos control reactivo y no reactivo al primer y tercer

anillo respectivamente3. En el segundo anillo cargar la muestra problema.4. Añadir con la micro pipeta 0.05mL de solución antigénica preparada sobre el

suero contenido en cada uno de los anillos de la lámina.5. Colocar la lámina serológica con las muestras en un rotador a 1800 rpm

por 4 min.6. Terminada la rotación examinar la lámina inmediatamente usando un

microscopio con objetivo de 10x. LECTURA E INFORME


1. Reactivo (R)- grumoso grandes y medianos2. Reactivo débil (RD) grumos pequeños3. No reactivo (NR) sin grumos.

VDRL CUANTITATIVA EN SUERO1. Colocar 0.05ml de solución salina al 0.9% a 6 anillos de la lámina

serológica2. Añadir 0.05ml de suero problema en el anillo 1. 3. Mezclar la solución salina y el suero del anillo uno y transferir de este

anillo, 0.05mL al anillo dos.1. Mezclar el contenido del anillo dos y transferir 0.05ml al anillo tres.2. Y asi sucesivamente hasta el anillo seis.3. Añadir con una micropipeta 0.05 mL de la solución antigénica sobre el

contenido de cada anillo de la lámina serológica. Del anillo 1 al 6.4. Colocar la lámina con las muestras sobre el rotador a 180 rpm por 4 min. o

rotarlo manualmente.5. Examinar al microscopio con objetivo de 10x. 6. De obtener reactivo sobre el título del sexto anillo continuar con las

diluciones.7. Los títulos correspondientes serán 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 y así

sucesivamente.LECTURA E INFORME Se considera positiva el título que da la máxima precipitación.

B. MÉTODO DE RPR Es una prueba serológica plasmática de floculación macroscópica

RPR CUALITATIVO EN PLASMA1. Colocar 0.05ml de los sueros a evaluar o una gota utilizando el aplicador

del kit no olvidar colocar los sueros control.2. Con ayuda del aplicador extender la muestra dentro del círculo sin salir del

margen.3. Agregar 0.017ml del antígeno con micropipeta o una gota con el gotero del

kit sobre la muestra a evaluar.4. Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador, por 8 min a 100 RPM,

o hacerlo manualmente.5. Luego de los ocho minutos hacer la lectura con ayuda de la lámpara de luz.6. - LECTURA E INFORME7. Reactivo.-(R) Grumos grandes medianos, o pequeños pero definidos8. No reactivo (NR) Sin grumos si se observa grumos definidos o pequeños

debe realizarse la prueba cuantitativa.de igual manera que para VDRL .


7.6 Cuestionario1. ¿En que se diferencian las pruebas de VDRL y RPR?

2. ¿Cuáles son las pruebas confirmatorias de un VDRL positivo? 3. ¿Cómo se relaciona el Hemograma de Schilling con un VDRL positivo?

7. 7 Fuentes de información


1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica panamericana; 1999.

2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed. Barcelona: Masson; 2005.

3. Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos. Madrid: Masson; 2005.

4. Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5. Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual



DETERMINACIÓN DE CRIOAGLUTININAS

7.1 Marco teóricoLas crioaglutininas son anticuerpos que en el suero son capaces de causar la aglutinación de sus propios eritrocitos (autoaglutininas), asi como las de otras personas (isoaglutininas), a una temperatura comprendida entre o y 5 oc. Estos anticuerpos que también se les conoce con el nombre de crioaglutininas se hallan presentes en títulos muy bajos en las personas sanas.La aglutinación es de carácter reversible, es decir que desaparece a 37 oc y reaparece a baja temperatura. Este es un buen procedimiento para detectar una aglutinación auténtica al frío.

7.2 Competencias1.Determina el proceso para la determinación de crioaglutininas2.Interpreta los resultados encontrados en la prueba de crioaglutininas

7.3 Materiales y equipos Materiales

Tubos de ensayo

Reactivos:Oxalato de Potasio al 2%

Solución de citrato de sodio al 3,8%Solución de cloruro de sodio al 0,85%

7.4 Procedimiento MÉTODO DE AIQUEL

1. Extraer 10 mL de sangre: colocar 4,5mL en un tubo que contiene 0,5mL de anticoagulante y el resto de sangre colocar en otro tubo sin anticoagulante.

2. A los dos tubos llevar a la temperatura de 37 oC los dos hasta que la sangre del segundo tubo coagule.

3. Centrifugar el tubo que contiene el coagulo, a fin de separar el suero.4. Del tubo con anticoagulante tomar una cantidad determinada y lavar los

eritrocitos por 3 veces con SSF.5. Después de eliminar el líquido del último lavado preparar una suspensión al

2% en SSF.TITULACION:


6. En 8 tubos de ensayo colocar en el primer tubo o,8mL de SSF y a los demás 0,5mL luego se agrega 0,2 mL de suero se mezcla y se pasa 0,5mL al 2do tubo y así sucesivamente hasta el séptimo tubo de donde se extraen 0,5ml que se desechan. El tubo octavo sirve de testigo.

7. Se agregan a todos los tubos 0,5mL de la suspensión de hematíes. Las diluciones serán:

8. 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640.9. Colocar los tubos en la heladera a 4º hasta el día siguiente.10. Hacer las lecturas.MÉTODO DE TRÖNBERG:1. Obtener 6 mL de sangre, mezclar con 1,5mL de citrato de sodio al 3,8%2. Centrifugar a 2,000rpm durante 5 minutos.3. Separar el plasma en un tubo de ensayo.4. Con el paquete de glóbulos rojos preparar una suspensión de hematíes al

0,5% (0,05ml de glóbulos rojos y completar a 10mL de SSF)TITULACIÓN:

5. En 6 tubos de ensayo colocar en cada uno 0,3mL de SSF6. Al primer tubo colocar 0,3mL del plasma, mezclar y pasar al segundo tubo y

así sucesivamente hasta el sexto tubo del cual se desecha 0,3mL7. Las diluciones serán: ½, ¼ , 1/8, 1/16, 1/32 y 1/64.8. Adicionar 0,3mL de la suspensión de hematíes al 0,5% a cada uno de los

tubos.9. Colocar en una gradilla y llevar a refrigeración (2-5 oC por 24 horas).10. Examinar todos los tubos balanceándolos o girando ligeramente para

apreciar la intensidad de aglutinación en caso de ser positiva se considera al de mayor dilución y son negativas cuando no existe aglutinación.

SIGNIFICANCIA CLÍNICASe asocia con el síndrome clínico de la neumonía atípica primaria causado por el Micoplasma pneumoniae, así mismo en la anemia hemolítica adquirida y congénita, en el falciformismo, en la tripanosomiasis, algunas hepatitis se pueden encontrar títulos elevados.

ANTIESTREPTOLISINAS O (ASTO o AS0)

7.1 Marco teórico La antiestreptolisina “o” prueba que a menudo se designa el nombre de asto , es útil para el diagnóstico y tratamiento de la fiebre reumática , la glomérulo nefritis aguda y otras infecciones por estreptococo beta hemolítico.Un título alto de antiestreptolisina o significa infección estreptocócica sobrepasada o actual y concretamente debido a estreptococos beta – hemolíticos del grupo serológico A (excepcionalmente de los grupos C y D de la clasificación de lancefield) amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela etc. Pero tienen especial interés en los procesos estreptocócicos que aparecen como segunda enfermedad: fiebre reumática y glomérulo nefritis aguda. No es por, lo tanto una prueba específica de fiebre reumática, pero apoya su diagnóstico cuando la historia y los signos clínicos la sugieren.

7.2 Competencias1.Explica el fundamento de la determinación de antiestreptolisina. 2.Realiza el proceso para determinar antiestreptolisina.3.Interpreta los resultados cuantitativos para un ASTO positivo.



Materiales Tubos de ensayo

Pipetas automáticas Reactivos

1. Suspensión de eritrocitos humanos lavados dos veces con solución fisiológica y una con solución buffer de ASTO, se suspende al 5% en este buffer.

2. Buffer de ASTO, cloruro de sodio 7.40 g, fosfato monopotásico 3.17g , fosfato disódico anhidro 1.81g, se disuelve c.s.p 1000cc con agua destilada conservar en heladera.

3. Antígeno de estreptolisina “O” 4. Suero del paciente no hemolizado ni contaminada debe ser inactivada a 56

oCx 30min ó 60 oC x 10min.

7.4 Procedimiento 1. Se hace una dilución del suero 1/202. En ocho tubos numerados del 1 al 8 colocar 0.20mL de buffer de ASTO. 3.En el primer tubo colocar 0.20mL del suero diluido 1/20 se mezcla bien y

de el se toma 0.20mL y pasar al siguiente tubo y así sucesivamente hasta el séptimo tubo eliminando finalmente 0.20mL del tubo siete el octavo sirve de control.

4.De esa manera obtenemos las siguientes diluciones 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560.A los ocho tubos se coloca 0.10 mL de antígeno y se incuban en baño maría a 37 oC durante 15 minutos, luego añadir 0.10 ml de las suspensión de eritrocitos al 5% en buffer de ASTO. Se agita para homogenizar y se incuba nuevamente a baño de agua a 37 oC por 45min.VALORES NORMALES. Por este método los valores normales van de 1/40 a 1/60 unidades Todd.INTERPRETACIÓN. La presente determinación es útil para el diagnóstico y tratamiento de la fiebre reumática y sirve para la comprobación serológica de las antitoxinas de defensa contra las toxinas bacterianas, es decir para la comprobación de una infección existente o pasada por estreptococos beta hemolítico de los grupos serológicos humanos A, C y G.


7.6 Cuestionario1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de ASTO? 2. Mencionar los estados fisiológicos y medicamentos que interfieran con la

prueba de antiestreptolisina.3. ¿Cómo se determinan las pruebas de PCR y LATEX?4. ¿Qué importancia clínica tienen las determinaciones de PCR y LATEX?


7.7 Fuentes de información1. Davidson I, Bernard J. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 9a ed.

Barcelona: Salvat Editores S.A.; 2001.2. Deska K, Pagana T. Guía de pruebas diagnósticas y de

laboratorio. 8a ed. Barcelona: Elsevier España SL; 2008. 3. Henry J. El laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: Marbán

libros s.l.; 2007.4. Platt W. Atlas de hematología en color. 4a ed. Barcelona: JIMS;

1992.5. Talaska F. Manual de pruebas diagnósticas. 7a ed. México D.F.:

McGraw –Hill Interamericana; 2002.

PRACTICA Nº 8: EXAMEN DE ORINA COMPLETA: EXÁMEN FÍSICO, QUÍMICO y MICROSCÓPICO

8.1 Marco teóricoLa utilidad del análisis de orina tiene una doble vertiente: por un lado, permite la valoración directa del propio aparato urinario, por otra, más indirecta, resulta ser un reflejo de determinadas situaciones bioquímicas de la sangre. A estas ventajas hay que añadir, además la facilidad de su recogida, que habitualmente no representa ninguna molestia valorable para el paciente .el examen de orina completa significa que se realizara varias pruebas física (densidad, pH, color. Etc.), bioquímicas (glucosa, proteínas, nitritos, pigmentos biliares, etc.) Y microscópicas del sedimento urinario (leucocitos, hematíes, cilindros, bacterias ,cristales, etc.)

8.2 Competencias1.Aplica el proceso físico-químico para el examen de orina2.Identifica los diversos elementos en el examen microscópicos de la orina3.Explica la interpretación clínica de los resultados del examen de orina


Materiales Tubos de ensayo Equipos Microscopio Centrifuga Urodensimetro

Reactivos Tiras reactivas para determinaciones bioquímicas en orina

8.4 ProcedimientoSegún la finalidad del análisis y no mediando indicaciones especiales del médico se instruirá al paciente acerca de como procederá para la recolección de muestra de orina, teniendo en cuenta:


Par los exámenes de rutina, es suficiente una muestra de reciente micción salvo en los casos en que se necesario practicar determinaciones casos es preciso realizar los exámenes en un muestra correspondiente a la mezcla de la orina total de 24 horas, es decir que compensa el metabolismo de un almuerzo o de una cena. Para reunir esta muestra, el paciente iniciará la recolección a las 8 a.m. vaciando la vejiga y desechando esa primera micción. Luego las distintas micciones se recogerán en un recipiente de boca ancha y perfectamente limpio incluyendo la micción de las 8 de la mañana del día siguiente.El recipiente conteniendo la muestra deberá conservarse en un ambiente fresco como para impedir la descomposición prematura de la orina.Para el examen microscópico del sedimento, se utiliza preferentemente una muestra de reciente micción y en especial la obtenida por la mañana al levantarse el paciente.Se prefiere las primeras muestras de la mañana, que suelen ser las más concentradas.

En todo examen de orina se tomará en cuenta:1. EXAMEN FISICO:

CantidadColorOlorEspumaReacciónDensidad

2. EXAMEN QUIMICO:Determinación de:acidez total proteínascloruros glucosafosfatos cuerpos cetónicosurea pigmentos biliaresurobilinógeno hemoglobina

Hoy en día existe en el mercado la utilización de papeles o tiras reactivas para el análisis de orina que facilita la determinación cualitativa y cuantitativa de los componentes químicos de la orina.

3. EXAMEN MICROSCOPICO DE SEDIMENTO:El sedimento se obtiene centrifugando 10 ml. de orina a 1500rpm durante 5 minutos, transcurrido dicho tiempo se vuelca el líquido sobrenadante y se suspende el sedimento en el liquido remanente o sea que queda adherido a las paredes del tubo de centrífuga. Se coloca entre porta y cubreobjetos se observa al microscopio con objetivo de menor aumento y luego con el de mayor aumento.Los constituyentes del sedimento urinario pueden agruparse dentro de 3 grupos: no organizados, organizados y cuerpos extraños.

Sedimento no organizado:En la orina normalmente no hay cristales y su presencia en orina no tiene significado clínico salvo si se trata de cristales de oxalato, uratos o de cistina.Sedimento organizado:

Células epitelialesEscamosas o pavimentosas


Células redondas o poliédricasCélulas de transiciónCilindrosCilindroidesLeucocitos y PiocitosEritrocitos


8.6 Cuestionario1. ¿Cuales son las condiciones para una buena toma de muestra de orina?2. ¿En que casos se presentan proteínas positivas en un examen de orina?3. ¿En que procesos patológicos se presenta Thevenon positivo?4. ¿Cuáles son las pruebas bioquímicas que se utilizan para el examen de orina?5. ¿Cual es la importancia clínica de encontrar piocitos en una muestra de orina?.

8.7 Fuentes de información1.Aiquel f. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos aires: médica panamericana;

1999.2.Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed.

Barcelona: Masson; 2005.3.Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos.

Madrid: Masson; 2005.4.Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5.Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual

moderno, 2006.6.Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 3a ed.


EXAMEN DEL LÍQUIDO SEMINAL

8.1 Marco teóricoEl análisis de semen es uno de los aspectos más importantes de la investigación de la fertilidad, ya que la causa de incapacidad femenina para concebir radica con frecuencia en el varón. Un análisis simple de esperma, sobre todo si indica infertilidad no es concluyente, ya que el recuento de espermatozoides varía de unos días a otros..El análisis de semen debe repetirse al menos dos veces. Además de su importancia en el estudio de la fertilidad, el análisis de semen también es útil para documentar la esterilización adecuada tras la vasectomía.

8.2 Competencias1. Adquiere experiencia en el manejo de otros líquidos biológicos.2. Identifica elementos anormales en una muestra de semen.


Materiales1. Gradillas


2. Tubos de ensayo3. Baguetas4. Pipeta de Thoma para glóbulos blancos5. Camara de Neubauer6. Microscopio

8.4 ProcedimientoRecolección

Los médicos que solicitan el examen del semen en el estudio de la esterilidad deben respetar el código moral que su religión impone a cada paciente.

De no haber dificultades desde el punto de vista religiosos, se instruye al paciente para que recoja la muestra con no menos de cuatro días de abstinencia sexual.

El procedimiento de obtención del material por masturbación, o bien con preservativo, debe desecharse categóricamente por antinatural.

Además, las muestras recogidas en preservativos no son satisfactorias, aun cuando éstos fueran lavados previamente, ya que corrientemente se los trata con sustancias químicas (polvo, licopodio, talco, etc), de energía acción espermicida y que, además, deforman las imágenes del semen durante su observación posterior.

El procedimiento aconsejable para la obtención del material es por relación sexual normal, de tal modo que una vez producida la eyaculación y la más mínima parte del semen haya impregnado la vagina, se recoge el resto en un frasco bien limpio, seco, de boca ancha , con tapa de vidrio de cierre esmerilado y preferentemente de color caramelo, en el que se pegará un rótulo con la siguiente información, que el paciente llenará:

Nombre y apellidos del pacienteEdad y forma que se obtuvo el material (eyaculado)Día y hora de la eyaculación.Día de abstención sexual.

Una vez obtenida la muestra, el paciente debe llevarla al laboratorio, lo más pronto posible (de preferencia antes de una hora), poniéndola en contacto con su cuerpo durante este tiempo, a fin de evitar que la temperatura descienda mucho.

Notas.- El protocolo se debe registrar: a) abstinencia previa; b) la hora de la eyaculación, y la hora de recepción en el laboratorio.

Con referencia al recipiente donde se recibe la muestra, debe ser de boca ancha para que no surjan inconvenientes al recoger el eyaculado. En ambientes hospitalarios, generalmente se usan frascos de crema o desodorante, por lo que es importante que estén bien lavados con agua caliente y detergente, pues los restos de estas sustancias poseen una acción negativa sobre la motilidad.


Lo mismo acontece si no están secos, pues el agua, además de aumentar el volumen de la muestra, modifica la tonicidad de la misma alterando la motilidad.

Debe descartarse totalmente el seco de envases térmicos para el traslado del material, ya que esto contribuye a que los espermatozoides consuman las sustancias nutritivas.

EXAMEN FISICOVOLUMEN

El volumen de una eyaculación depende, ante todo, de la secreción prostática y de las vesículas seminales, ya que la fracción segregada por las glándulas de Cowper y el epidídimo es pequeña y menor aún, el testicular.Normalmente, el volumen oscila entre 2 y 6ml, aproximadamente, después de tres días de abstinencia como mínimo.Para determinar el volumen, se pasa la totalidad del mismo a una probeta graduada de 10 ml y se lee el volumen con una aproximación de 0,1 ml.Cuando el volumen es muy pequeño se informa sin medirlo: “menos de 0,5 ml” o “ unas pocas gotas”.

Interpretación

A los fines de la fertilidad masculina se catalogan como “dudoso” los sémenes con concentración espermática, morfología y motilidad normales pero cuyos volúmenes son inferiores a 1,5 mL.

La falta de semen se denominan aspermia. Cuando es menor de 1,5 ml se denominas hipospermia.

Es frecuente el hallazgo de volúmenes aumentados de semen. Se catalogan como “sospechosos” los sémenes con volúmenes mayores de 5 mL, siempre que la concentración espermática esté por debajo de 60 millones por ml.

Aspecto

Normalmente es homogéneo y opaco.

Interpretación

El aspecto es heterogéneo cuando se observan restos groseros de material sin licuar.

Es traslúcido cuando hay pocos espermatozoides y no hay células de la espermatogénesis, leucocitos, hematíes o gérmenes.

Color


Normalmente es blanco grisáceo, opalescente. Puede presentar un tinte ligeramente amarillento después de una prolongada abstinencia sexual. Interpretación

Un color amarillo (amarillo canario intenso) se observa en los casos que hay pus (piospermia). Generalmente no hay relación entre la cantidad de leucocitos y la intensidad del color amarillo del semen. La causa se debe a procesos infecciosos de las vías seminales.

Un color herrumbre se debe a sangre hemolizada como se observa en casos de vesiculitis seminal o prostatitis.

Un color rojo se debe a la presencia de sangre (hemospermia) que se observa en casos de prostatitis o traumatismo.

Un color verdoso se debe a infecciones con bacilo piociánico.

ViscosidadEl líquido seminal normal presenta una considerable viscosidad recientemente eyaculado, pero inmediatamente comienza su licuación que se completa a los 15-30 minutos.

El semen recién eliminado suele mostrar granos espesos de mucus que decantan por reposo; posteriormente y debido al fenómeno de mucólisis, toma un aspecto uniforme y poco denso con escasas partículas visibles en suspensión.

La viscosidad, según Hotchkiss, tiene cierta importancia sobre todo el cuidado las espermatozoides presentan vitalidad y movilidad inferior a lo normal.

Este auto recomienda un método sencillo para su estimación. Consiste en agitar vivamente el semen con una varilla de vidrio, colocando 2 mL de la muestra, temperatura ordinaria, en un tubo de ensayo de 10cm de largo por 1,5 cm de diámetro aproximadamente, retirando luego con suavidad la misma. En condiciones normales, cuando el extremo inferior de la varilla llega al borde del tubo de ensayo, ya se habrá cortado el filamento del semen. En condiciones de viscosidad elevada se comprobará la integridad de éste.

Otro procedimiento consiste en introducir la varilla de vidrio en el semen contenido en el frasco y se la retira suavemente, observando si hay formación de filamento de semen. En este caso se acepta como valor normal una filancia de 2 a 5 mm.

La licuación depende de la fibrinolisina potente presente en condiciones normales.

Interpretación

La viscosidad disminuida se observa generalmente en sémenes con muy poco espermatozoides.


La viscosidad aumentada según algunos autores puede interferir el movimiento de los espermatozoides in vitro. Es común observar viscosidad aumentada en prostatitis crónica y en vesiculitis seminales.

Reacción

El pH del semen recién eyaculado es alcalino, oscilando entre 7,3 y 7,5.En contacto con el medio ambiente se va alcalinizando a medida que transcurre el tiempo por escape de anhídrido carbónico, pudiendo alcanzar un pH de 8.

Examen microscópico directoExaminar entre porta y cubreobjetos después de la fluidificación. Apreciar el número por campo microscópico de: leucocitos, hematíes, células epiteliales y de espermatozoides. Hace constar la presencia o no piocitos y de cristales.

Recuento celular

El recuento se efectúa en la misma forma que para los glóbulos sanguíneos. Puede utilizarse cualquiera de los líquidos de dilución que se mencionan.

Técnica. Con una pipeta para glóbulos blancos se aspira semen hasta la marca 0,5, y luego, el líquido de dilución hasta la marca 11 (dilución 1: 20). Si el número de espermatozoides es muy bajo, conviene aspirar semen hasta la marca 1 de la pipeta. Se agita vigorosamente la pipeta hasta que el líquido en la porción ampular sea homogéneo. Se desechan las dos primeras gotas y se carga la cámara cuenta glóbulos y se cuentan los espermatozoides en 1 mm2; para el cálculo se multiplica por la dilución y por la altura de la cámara (X10) para obtener la cifra por mm3 y finalmente por 1000 para obtener la cifra por mililitro.

Notas. En el líquido de Macomber y Sauders, el bicarbonato de sodio provee un medio alcalino en el cual se solubilizan las proteínas del semen permitiendo obtener una distribución homogénea de los espermatozoides en la pipeta cuentaglóbulos. El formol los mata, inmovilizándolos.

Antes de cargar la pipeta cuentaglóbulos, la muestra debe homogenizarse perfectamente puesto que en el semen hay espermatozoides móviles e inmóviles, sedimentado estos últimos en el frasco. La homogeneización debe hacerse por rotación cuidadosa, evitando la formación de espuma.

Cuando los sémenes son muy viscosos es necesario rotar mucho la muestra para homogenizar lo mejor posible y cargar dos pipetas promediando los resultados.

Interpretación

Resulta conveniente familiarizarse con la terminología que hace a las cifras de espermatozoides del eyaculado en distintas situaciones, propuestos por la mayoría de los autores que se han ocupado del tema:


Normospermia: Corresponde a cifras comprendidas entre 60 y 90 millones por mililitro.

Hiperespermia: Por arriba de 90 millones /mL.Hipospermia: por debajo de 60 millones /mL.Oligospermia: Cifras menores de 30 millones / mL.

MOVILIDAD

Tiene muchísima importancia comprobar el grado y duración de la movilidad de los espermatozoides. Para ello, se hacen preparaciones húmedas entre porta y cubreobjetos, de hora en hora, durante 5 ó 6 horas, manteniendo la muestra a la temperatura ambiente.

El porcentaje de espermatozoides móviles se establece fácilmente, si se coloca un disco de papel negro en el ocular del microscopio después de haber practicado un pequeño cuadrado en el centro de aquél, de tal modo que sólo permita ver un cuarto del campo microscópico.

La apreciación del número de espermatozoides móviles se hace contando en el cuarto del campo microscópico, durante 10 segundos, todos los espermatozoides activos e inactivos, multiplicando los resultados por 4 para determinar la cantidad que corresponde a todo el campo.

Interpretación

Normalmente, antes de las dos horas de la eyaculación se encuentra una gran movilidad en el 70% de los espermatozoides, con desplazamiento progresivo.

Una buena muestra seminal mantiene una considerable actividad, aún al cabo de 5 ó 6 horas de permanencia a la temperatura ambiente.

Cuando la motilidad es elevada pero está reducida a espermatozoides móviles “in situ” (1 +) o traslativos lentos (2+), no existiendo espermatozoides traslativos rápidos (3 ó 4 +), el semen no tiene capacidad fecundante y se habla de una astenozoospermia absoluta.

Se habla simplemente de astenozoospermia cuando el porcentaje de espermatozoides de movimiento traslativo rápido (4+) se encuentra disminuido en valores menores a un 30%.

La ausencia e motilidad se conoce con el nombre de adrozoospermia.

MORFOLOGIA

Es estudio morfológico tiene por objeto comprobar la presencia de espermatozoides anormales y establecer su porcentaje en relación a los normales.

La siguiente técnica de coloración permite diferenciar claramente la cabeza, sección media y la cola.


Se cuentan de 100 a 200 espermatozoides, que no este método de coloración se presentan con el núcleo azulado y el citoplasma rojizo.

Se establece el porcentaje de formas anormales con respecto al tamaño, forma y disposición nuclear.

Notas. También puede teñirse el preparado con May-Grünwald-Giemsa empleado agua tamponada a pH 7-7,2 y dejando actuar el colorante de Giemsa durante 20 minutos.

Como se ha manifestado en un comienzo, el frotis debe ser bien delgado para que se seque rápidamente; si el frotis es grueso, tarda mucho en secar produciéndose alteraciones morfológicas

de los espermatozoides, que en ocasiones son difíciles de evaluar. No debe emplearse calor para secar el preparado, pues se producen morfológicos de las colas (se enroscan).

InterpretaciónNormalmente no deben encontrarse anomalías morfológicas (doble cabeza, macerocefalia, microcefalia, cabezo priforme, cuerpo o cola defectuosos, etc) en más de 25% de espermatozoides, no debiendo hallarse más de 2 células de la espermatogénesis cada 100 espermatozoides.

PRUEBA DE LA VITALIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES INMOVILES

Método de Hurgop y Di Paola

Se basa en la propiedad de la eosina de colorear únicamente las células muertas y no las vivas.

ReactivoEosina azul ........................................................... 0,5 g.Solución fisiológica............................................... 100 mL

TécnicaEn un portaobjetos se coloca una gota de semen y una gota del reactivo. Se mezcla y se deposita en un cubreobjetos. La observación microscópica se hace dentro de las dos primeras horas.

Se cuentan 200 elementos, teniendo en cuenta las tres categorías siguientes:

1. Espermatozoides muertos coloreados.2. Espermatozoides vivos inmóviles no coloreados.3. Espermatozoides vivos móviles no coloreados.

InterpretaciónLos diversos autores dan como valores normales las siguientes cifras:

1. Espermatozoides muertos coloreados: 0 a 5%2. Espermatozoides vivos inmóviles no coloreados: hasta un 40%.


3. Espermatozoides vivos móviles no coloreados: hasta un 60%.

Nota. En lugar de la eosina azulada puede utilizarse una solución de pirrol o azul cresil al 0,5%.

Una vez mezclado el semen con el reactivo, se espera 5 minutos y se observa al microscopio. La observación corresponderá a:

1. Espermatozoides muertos coloreados.2. Espermatozoides vivos inmóviles no coloreados.3. Espermatozoides vivos móviles no coloreados.

Test de WilliamsEste test permite también distinguir los espermatozoides muertos (necrospermia) de los espermatozoides vivos (astenospemia): los primeros se colorean con una solución de eosina – nigrosina , mientras que los segundos permanecen incoloros.

Reactivos

1. Solución acuosa de nigrosina al 10%.2. Solución acuosa de eosina al 5%.

Técnica.

Sobre un portaobjetos se colocan separadamente; en un extremo 1 gota de la solución de nigorsina y en el optar; 1 gota de la solución de eosina y 1 gota de semen o esperma.

Mezclar la gota de semen con la de eosina, y luego la gota de nigrosiana con la mezcla precedente. Se opera con rapidez (15 a 20 segundos ). Hacer un extendido, secar rápidamente al calor y examinar al microscopio.

Interpretación

Sólo se colorean de rojo los espermatozoides que estaban muertos en el momento de la mezcla.

8.5. Resultados

Los alumnos reportaran en su informe los resultados obtenidos en ésta práctica.

8.6 Cuestionario1. Explique Ud. Los diferentes métodos que se emplean en la actualidad para

descartar infertilidad en el hombre.2. En que casos se puede solicitar la prueba de la determinación de líquido

seminal3. ¿Qué factores alterarían la prueba del espermatograma?

8.7. Fuentes de información


1. Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México D.F.: Manual moderno S.A; 1986.

2. 2,Lluis VJ. Manual de técnicas de laboratorio. Hematología. 2ª ed. Barcelona: Masson S.A.; 1997.

3. 3.Instituto Nacional de Salud. Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio. Lima. Impresora Amarilys e,i,r,l,; 1997.

4. 4.San Miguel JF y Sanchez-Guijo F. Cuestiones en hematología, 3ª ed. Madrid: Harcourt Brace S.A.; 1997.

5. 5.Pagana-Pagana. Pruebas diagnósticas y de laboratorio. 2da. ed. Barcelona: Mosby- Doyma Libros, SA; 1996.

PRÁCTICA No. 9 : UROCULTIVO: COLORACIÓN GRAM, PRUEBAS BIOQUÍMICAS, ANTIBIOGRAMA.

9. 1 Marco teórico El urocultivo es uno de los métodos de análisis microbiológico de suma importancia para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas del tracto urinario y asi dar un tratamiento adecuado y oportuno

9.2 Competencias1.Aplica técnicas de laboratorio para la determinación del urocultivo y coprocultivo.2.Utiliza los medios de cultivo adecuado para el desarrollo de los microorganismos3.Interpreta los hallazgos de laboratorio


Materiales Tubos de ensayo

Asa de Kole Placas Petri

Reactivos1. Colorante Gram

Cristal violeta alcalino: Sol. A: cristal violeta 1g. Agua destilada csp. 100 mL.Sol. B: bicarbonato de sodio 5g. Agua destilada csp 100mL.Sol. De yodo 1g. Ioduro de potasio 2g. Agua destilada csp 200mL.Sol. Decolorante: eter 1 vol. Acetona 3 vol.Colorante de contraste: safranina 0.5g agua destilada csp 100 mL.

2. Medios de cultivo:Agar Mac Conkey ó EMBAgar Azida SangreAgar Chapman

3. Coloración de Ziehl-Nelsen (bacilos ácido-resistente)4. Sol. A: fucsina básica 0.3g alcohol de 95º. 10ml.


5. Sol. B: fenol 5ml. Agua destilada csp. 95ml.6. Mezclar las soluciones a y b 7. Sol. Alcohólica de ácido clorhídrico8. Sol. De azul de metileno

12.4 ProcedimientoRECOLECCION DE MUESTRAS:1. La muestra para cultivo debe ser material del verdadero sitio de infección

y debe recogerse con un mínimo de contaminación de tejidos, órganos o secreciones adyacentes.

2. Establecer periodos óptimos para la recolección de muestras a fin de tener la mejor oportunidad de aislar los microorganismos causantes.

3. Obtener suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo las técnicas de cultivo solicitada.

4. Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y medios de cultivo adecuados para asegurar el óptimo aislamiento de microorganismos.

5. Siempre que sea posible obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.

6. El envase recolector de la muestra debe estar correctamente rotulado.

UROCULTIVO:Primer Día: Recolección de la muestra.

- Examen de orina completo: físico, químico, microscopio, sedimento.

- Coloración Gram del sedimento.- Sembrar en: Agar Mac Konkey ó EMB

Agar Azida Sangre Agar Chapman

- Si el sedimento se observará además de leucocitos, bacilos y en la coloración estos últimos aparecen teñidos, entonces se práctica una coloración de Ziehl-Neelsen (bacilos ácido-resistente)

Segundo día: Lectura del recuento microbiano. Si hay mas de 100 colonias. No existe infección. Si hay entre 10 a 1000 colonias realizar nuevamente la

técnica. No. de colonias X 1000 = bacterias / mL de orina

1.Crecimiento en agar Mac Conkey:Coloración gram negativoSiembra en diferenciales: LIA,TSI,CS,SIM-INDOL, UREA.Siembra en agar MH o TSA por diseminación general.(usar discos antibióticos para gram negativos)

2. Crecimiento en Agar Azida SangreColoracion gram positivoObservar si hay hemolisis.

Observar si hay crecimiento en Agar Chapman (Positivo) Si hay crecimiento en Azida Sangre y Agar Chapman es: Stf sp (si las colonias son amarillas son Stf aureus) Si hay crecimiento en Azida Sangre y no en Agar Chapman: existe


hemólisis, puede ser Stp. (puede demorar 36 a 48 horas).Resembrar (cuarta parte) en agar Chapman colonias sospechosas del Azida Sangre.Diferenciales para Stp:Resembrar (en la cuarta parte) de colonias sospechosas: por diseminación y colocar discos de Optoquima y Bacitracina. Observar a las 24 horas.Sembrar por diseminación en Agar MH o TSA y usar discos de antibióticos para gram positivos.Tercer día:

1. Lectura de diferenciales: identificacion de Enterobacterias2. Lectura: sensible a la optoquima: Stp pneumoniae

Sensible a la bacitracina:Stp tipo A.3. Sea 1 o 2 leer antibiograma y definir

ANTIBIOTICOS: A: SENSIBLEB: MEDIANAMENTE SENSIBLEC: RESISTENTES


9.6 Cuestionario1. ¿Cuáles son los medios de cultivo utilizados en la identificación de

microorganismos gram negativos?2. ¿Desarrolle un mapa conceptual de un urocultivo.3. ¿Cómo es el proceso para la toma de muestra de un hemocultivo?4. ¿Qué importancia tiene el antibiograma?5. ¿Qué importancia tienen los medios de enriquecimiento en un coprocultivo?

9.7 Fuentes de información1. Davidson I, Bernard J. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 9a ed. Barcelona:

Salvat Editores S.A.; 2001.2. Deska K, Pagana T. Guía de pruebas diagnósticas y de laboratorio. 8a ed.

Barcelona: Elsevier España SL; 2008. 3. Henry J. El laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: Marbán libros s.l.;

2007.4. Platt W. Atlas de hematología en color. 4a ed. Barcelona: Editorial JIMS; 1992.5. Talaska F. Manual de pruebas diagnósticas. 7a ed. México D.F.: McGraw –Hill


ESTUDIO DE LAS HECES: EXÁMEN PARASITOLÓGICO. METODO DE FAUST

9.1 Marco teórico


En la patología parasitaria tiene importancia la investigación de los parásitos intestinales en las heces, utilizando técnicas del laboratorio más usadas como las del método directo, método de concentración de faust,, jarabe fenolado, willis, método de sedimentación de teleman, etc. De esta manera se contribuye al mejor conocimiento de la sintomatología, diagnóstico, tratamiento y prevención de la parasitosis intestinal.

9.2 Competencias1. Identifica los parásitos mas frecuente en muestro medio utilizando las

técnicas de examen directo y concentración2. Relaciona el parásito hallado con el fármaco a utilizar para el tratamiento

9.3 Materiales y equiposCONSERVADORESCuando las muestras provienen de lugares lejanos o no van a ser examinados inmediatamente, se aconseja conservarlos mediante diversas formas:Conservación por el frío.Son para huevos de helmintos y quiste de protozoarios, así podemos mencionar:a. Solución fijadora y conservadora por el agua formolada.

La aplicación y conservación de esta solución, varía según las consistencia de las heces, así por ej:Las heces duras emplean agua formolada al 5%.Las heces pastosas emplean agua formolada al 10%Las heces conteniendo huevos de helmintos muy resistentes, emplean agua formolada al 20%. La cantidad que se utiliza para cualquiera de las 3 formas volúmenes de agua formolada por 1 volumen de muestra de heces.

b. Líquido de Deschiens:Glicerina 100 mL.Formaldehído al 40% 100 mLAgua destilada 800 mL

c. Solución de De la Plaza:Formaldehído al 40% 12.5 mLGlicerina 12.5 mLSol. de Ringer o sol. fisiológica 250 mLSol. de Ringer > ClNa 6 gClK 75 gCl2Ca 100 mgHCO3Na 100 mgAgua destilada csp 1000 mL

Existe otros conservadores tales como: Sol. MIF (Mertiolato-Yodo-Fromaldehido) de Sapreso y Lawles.Sol de PVa (Alcohol Polivinilico)

REACTIVO DE FAUST:Sulfato de Zinc al 33% (D>1,180)

REACTIVO DEL JARABE FONOLADO:


Reactivo: Azúcar granulada 400 gAgua destilada 300 mLFenol 1 gDisolver el azúcar en agua caliente de 80 a 90 oC (No debe hervir) hasta consistencia de jarabe y añadir 1g de fenol como conservador.

9.4 ProcedimientoEl estudio debe identificarse en las heces:

Las formas vegetativasHuevosLarvasQuiste de los parásitos.

RECOLECCION DE LAS MUESTRASEl paciente colocará la primera deposición sin mezclar con la orina en un recipiente de vidrio de boca ancha limpia y seca, rotulará su nombre y será remitido inmediatamente al laboratorio cerrándole herméticamente, no debe utilizar recipientes porosos; ya será de papel o de cartón.Cuando se quiere investigar protozoarios en su forma vegetativa se requiere muestra fresca. Las muestras formadas son mejores para encontrar quiste, en cambio las líquidas nos permite identificar trofozoitos y deben se examinadas de inmediato o pueden ser conservadas.Ciertos parásitos para ser investigados requieren procedimientos especiales, por ej. Por el método de Graham (cinta adhesiva) para Enterobius vermicularis.En todo examen de heces para la búsqueda de parásitos deben considerarse el siguiente orden:1. EXAMEN MACROSCOPICO:Este examen consiste en buscar por simple observación visual y minuciosa la consistencia de las heces, mucus, sangre y formas adultas de parásitos tales como: Enterobius vemincularis, Tenias, Ascaris Lumbricoides, Ancylostoma duocenales, Trichuris trichiura, etc.Cuando las heces son blancas o líquidas, las larvas o formas adultas de los parásitos pueden encontrarse ocultos en medio de la masa fecal, en esta caso se filtrarán la muestra a través de un tamiz y se hará la observación.2. EXAMEN MICROSCOPICO:En este examen parasitológico obligatoriamente debe realizarse dos procedimientos:1.Examen por el método directo de heces frescas, empleando sol. de lugol parasitológico y sol fisiológica de cloruro de sodio.2.Examen por el Método de Concentración, empleando un método de rutina.METODO DIRECTOPermite encontrar mayoría de los parásitos, quiste de protozoarios con núcleos teñido de amarillo, las vacuolas de color pardo, larvas y huevos de helmintos.En dos láminas portaobjetos limpios y secos, colocar en uno de ellos dos gotas de sol. de lugol, en la otra lámina 2 gotas de sol. fisiológica y con la ayuda de un mondadientes colocar una porción de muestra a ambas láminas preparadas, mezclar homogéneamente, cubrir con un cubreobjeto y observar al microscopio con objetivo de menor y mayor aumento.METODO DE CONCENTRACION:Tiene por objeto reunir en un pequeño volumen a los elementos parasitarios inicialmente dispersos en una gran masa de heces.Los métodos de concentración son muy numerosos, clasificándose en dos grupos:I. METODOS FISICOS:


A. Por sedimentación y por flotación.Método de FaustMétodo del Jarabe FenoladoMétodo de Willis

B. Método de sedimentación de Teleman METODOS DIFASICOS:Comprende dos etapas:a. Fases de separación residuos mas voluminososb. Fase de concentración y enriquecimiento de los elementos parasitarios:

Método de RitchieMétodo de Carles-Barthelemy

METODOS DE SEDIMENTACION Y FLOTACION:METODO DE FAUST:1. En un recipiente adecuado, se prepara una suspensión de materia fecal

mezclado una parte de heces con 10 partes de agua tibia.2. Filtrar la mezcla sobre una gasa en 4 dobleces colocado en un embudo y se

recoge 10 ml en un tubo de centrifuga.3. Centrifugar a 2000 rpm durante 2 minutos, retirar de la centrifugadora y

decantar el liquido sobrenadante.4. Al sedimento obtenido agregar 3 ml de agua tibia, mezclar bien.5. Centrifugar y decantar el líquido sobrenadante repitiendo la operación por 3

veces hasta que el agua del sobrenadante permanezca límpida.6. Después de la centrifugación se decanta el líquido sobrenadante, y añadir 3 a 4

ml. de; la sol de sulfato de zinc al 33% agitar bien durante un minuto y centrifugar al 2500 rpm durante 1 o 2 minutos.

7. Con el asa de platino recoger la película superficial donde se encuentra flotando los quistes de protozoario y huevos de helmintos colocar sobre un portaobjeto limpio y seco agregar una pequeña gota de lugol parasitológico y efectuar el examen al microscopio.

METODO DEL JARABE FENOLADO (Flotación)1. En un vial colocar el jarabe fenolado hasta la mitad y agregar con una bagueta

unos 2 g de heces.2. Mezclar bien las heces con el jarabe fenolado hasta observar uniforme la

suspensión.3. Adicionar mas jarabe fenolado hasta el borde del vial4. Al borde del vial aplicarle un portaobjeto y dejar en reposo por 20 minutos como

tiempo mínimo.5. Retirar el portaobjeto y sobre la muestra aplicarle un cubreobjeto efectuar el

examen microscópico.Por este método se observan larvas y huevos de los helmintos.


9.6 Cuestionario1.¿En que consiste la Técnica de Graham ?2.¿Cuales son las condiciones para la toma de muestra de heces para un paciente

que se sospecha parasitosis?3.¿Desde el punto de vista patológico como se adquiere una tricuriasis?4.¿Cuál es el fundamento del Método del jarabe fenolado?


9.7 Fuentes de información1.Davidson I, Bernard J. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 9a ed. Barcelona:

Salvat Editores S.A.; 2001.2.Deska K, Pagana T. Guía de pruebas diagnósticas y de laboratorio. 8a ed.

Barcelona: Elsevier España SL; 2008. 3.Henry J. El laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: Marbán libros s.l.; 2007.4.Platt W. Atlas de hematología en color. 4a ed. Barcelona: JIMS; 1992.5.Talaska F. Manual de pruebas diagnósticas. 7a ed. México D.F.: McGraw –Hill


PRACTICA No. 10: DOSAJE DE GLUCOSA, PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA, GLUCOSA POST PRANDIAL.

10.1 Marco teórico La determinación de glucosa sérica es útil para el diagnostico de numerosas enfermedades metabólicas (diabetes mellitus). Los niveles séricos, de glucosa deben interpretarse de acuerdo con la hora, día en la que se tomo la muestra. La concentración de glucosa en los líquidos extracelulares se mueve en una banda de tolerancia que es regulada a la baja de insulina (acción hipoglucemiante y la alza mediante el glucagón, cortisol, catecolaminas y hormona de crecimiento).las determinaciones de glucosa en pacientes recientemente diagnosticados de diabetes se deben realizar con frecuencia para controlar de cerca la dosis de insulina que debe administrarse.

10.2 Competencias1. Utiliza métodos bioquímicos para la determinación de la glucosa en sangre2. Interpreta los resultados y correlacionarlos con otras determinaciones

solicitados en análisis clínicos

10.3 Materiales y equipos Materiales

1. Gradillas2. Tubos de ensayo3. Pipetas volumétricas4. Pipetas automáticas5. Baguetas6. Centrifuga7. Espectrofotómetro

Reactivos1. Reactivo enzimático2. Standard de glucosa: una solución de glucosa 100mg/dl que contiene

preservantes y estabilizadores. Mantener en refrigeración.

10.4 ProcedimientoMETODO ENZIMÁTICO COLORIMÉTRICO:


Preparar 3 tubos y agregar en ellos:BLANCO STANDARD MUESTRA(mL) (mL) (mL)

Standard - 0.01 -Suero - - 0.01Reactivo constituido 1.0 1 .0 1.0

Mezclar suavemente.Incubar por 5 minutos a 37oCLeer absorbancia a 505nm contra el blanco. El color es estable por 1 hora.Cálculos:Glucosa (mg/dL) = 100 --------------------- x A muestra problema

A standard

A= valor de absorbancia obtenido.VALORES:Suero o plasma: 65 – 110 mg/dL


10.6 Cuestionario1. ¿En que consiste la prueba de la tolerancia a la glucosa?2. ¿En que consiste la prueba de la hemoglobina glicosilada?3. ¿Cuál es el fundamento del método enzimático para determinar glucosa en

sangre ?

10.7 Fuentes de información 1.Deska K, Pagana T. Guía de pruebas diagnósticas y de laboratorio. 8a ed.

Barcelona: Elsevier España SL; 2008. 2. Davidson I, Bernard J. Diagnóstico clínico por el laboratorio. 9a

ed. Barcelona: Salvat Editores S.A.; 2001.3. Guerci A. Laboratorio métodos de análisis clínicos y su

interpretación. 3a ed. Buenos Aires: El ateneo; 1985.4. Kumar V, Cotran R, Robbins S. Patología humana. 7a ed.

Madrid: Elsevier; 2004.5. Widmann F. Interpretación clínica de las pruebas de laboratorio.

4a ed. Barcelona: JIMS; 1997.6. Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en

hematología. 3a ed. Madrid: Elsevier-Masson; 2006.

COLESTEROL TOTAL


10.1 Marco teórico El colesterol es un esteroide muy abundante en las células de los animales en los que se desarrolla diversas funciones, como componte estructural fundamental de las membranas celulares, contribuyendo a sus propiedades fisicoquímicas, como precursor de las hormonas sexuales y de la corteza suprarrenal, participa en la síntesis de ácidos biliares, de hecho, la bilis es la única vía de eliminación del colesterol. El colesterol circula en la sangre unido a las lipoproteínas de manera las de bajo densidad (LDL) transportan el 70%, las de alta densidad (HDL) el 15 y 20 % y el resto circula unida a las de muy baja densidad (VLDL) y a los quilomicrones. Por ello es el principal lípido relacionado con la enfermedad vascular arteriosclerótica.

10.2 Competencias 1. Determina e interpreta las pruebas de función lipídica en muestras de suero

o plasma utilizando las técnicas de laboratorio para su análisis, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.

2. Determina el colesterol por métodos espectrofotométricos conociendo sus propiedades físico-químicas, a partir de una muestra de sangre (suero sanguíneo)


Materiales1. Pipetas automáticas2. Tubos de ensayo3. Gradillas4. Centrifuga5. Espectrofotómetro

METODO ENZIMATICO COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACION EN SUERO

Reactivos1. REACTIVO ENZIMATICO:2. Mantener en congelación hasta el momento de su reconstitución.

3. El reactivo, después de reconstruirse contiene:4. 4- amino-antipirina 0.40 mmol/L, colesterol esterasa = 2,000 U/L,

activadores, estabilizadores y buffer.

5. VIAL x 10

6. Reconstruir cada vial con 10.5 mL de Buffer Reconstituyente. Para esto ir agregando el buffer al vial hasta alcanzar el volumen indicado. Mezclar suavemente hasta disolver. Dejar a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Este reactivo reconstituido es estable por 30 días a 4° C y debe ser protegido de la luz.

7. VIAL x 20


8. Reconstituir cada vial con 21 mL de Buffer reconstituyente. Para esto ir agregando el buffer poco a poco al vial, vertiendo el contenido en una probeta hasta alcanzar el volumen deseado. Mezclar suavemente hasta disolver. Dejar de usar. Este reactivo reconstituido es estable por 30 días a 4°C y debe de ser protegido de la luz.

9. BUFFER RECONSTITUYENTE10. Solución de fenol bufferada. Contiene perseverantes y estabilizadores.

Mantener en refrigeración.

11. STANDARD DE COLESTEROL12. Contiene 200 mg/dL de colesterol en etilen glicol mono metileter y

surfactantes. Refrigerar (2-8°C).

10.4 Procedimiento

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE COLESTEROL EN SUERO

Blanco Standard Muestra (mL) (mL) (mL)

Standard --------- 0.01 --------Suero --------- ---------- 0.01Rvo. Reconstituido 1.0 1.0 1.0

Mezclar suavemente.Incubar por 5 minutos a 37°C.Leer la absorbancia a 500 nm contra el blanco.El color es estable por una hora.

CALCULOS A Suero

Colesterol (mg/dL) = --------------------- x 200 A Standard

A= Valor de absorbancia obtenido

MANEJO DE LA MUESTRA Y REACTIVOS El reactivo reconstituido es estable por 30 días a 4°C y debe ser protegido de

la luz. En caso que se requiera obtener un volumen final mayor de 1.0 ml, se puede

agregar inmediatamente antes de realizar la lectura, hasta 1.2 ml de agua destilada en todos los tubos, incluyendo el blanco.

El método es lineal hasta 500 mg/dL.Menos de 200 mg/dL. Valor deseable200 a 239 mg/dL. Valor fronteraMayor de 240 mg/dL. Valor alto



10.6 Cuestionario1.¿Cómo se explica las reacciones que ocurren en la determinación de colesterol

total por el método enzimático?2.¿Qué precauciones se debe tener con respecto a los reactivos que intervienen

en esta prueba enzimático?3.¿Qué lipoproteínas transportan al colesterol?4.¿Por qué es importante la determinación de colesterol en una persona de edad

avanzada?

10.7 Fuentes de información 5. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 7ª ed. Buenos Aires: Panamericana; 1997.6. Gradwhol. Métodos y diagnóstico del laboratorio clínico. 8ª ed. Buenos Aires:



Moderno S.A.; 1986.

TRIGLICERIDOS

10.1 Marco teóricoLos triglicéridos están formados por la esterificación de la glicerina con tres ácidos grasos. Se depositan en el tejido graso, desde donde constituyen una reserva importante de energía. Su síntesis se produce a partir de diversas fuentes: una erógena, constituida por la dieta, y otra endógena que corresponde a su formación hepática. Los primeros se vehiculizan por la sangre por medio de los quilo micrones; los segundos se transportan mediante las lipoproteínas de muy baja densidad .Cuando los niveles sanguíneos son excesivos, los triglicéridos se depositan en el tejido graso. La determinación de triglicéridos forma parte del perfil lipídico, El perfil lipídico se emplea para evaluar el riesgo de enfermedad coronaria y vascular periférica.

10.2 Competencias 1. Determina e interpreta las pruebas de función lipídica en muestras de suero o

plasma utilizando las técnicas de laboratorio para su análisis, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.

2. Determina los triglicéridos por métodos espectrofotométricos conociendo sus propiedades físico-químicas, a partir de una muestra de sangre (suero sanguíneo).


Materiales1. Pipetas automáticas2. Tubos de ensayo3. Gradillas4. Centrifuga5. Espectrofotómetro


METODO ENZIMATICO COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

ReactivosMantener en congelación hasta el momento de su reconstrucción.

VIAL X 10Reconstruir cada vial con 10.5 mL de agua destilada.Mezclar suavemente hasta disolver. Este reactivo reconstruido es estable por 15 días a 4°C. No reconstituido congelar el reactivo reconstituido.

VIAL x 20Reconstituir cada vial con 21 mL. de agua destilada.Mezclar suavemente hasta disolver. Este reactivo reconstituido es estable 15 días a 4°C. No congelar el reactivo reconstituido.

STANDARD DE TRIGLICERIDOSSolución a base de glicerol, equivalente a 200 mg/dL de trioleína. Contiene perseverantes y estabilizadores. Conservar en refrigeración.

10.4 Procedimiento

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

Blanco Standard Muestra (mL) (mL) (mL)

Standard --------- 0.01 ----------Suero --------- ---------- 0.01Rvo. Reconstituido 1.0 1.0 1.0

Mezclar suavemente.Incubar por 5 minutos a 37°CLeer la absorbancia a 520 nm contra el blanco. El color es estable por 1 hora.

CALCULOS A Suero

Triglicérido (mg/dL) = ---------------- x 200 A Standard

A = valor de absorbancia obtenido.

MANEJO DE LA MUESTRA Y REACTIVOS

En caso que se requiera obtener un volumen final mayor de 1.0 mL, se puede agregar inmediatamente antes de realizar la lectura, hasta 1.2 mL de agua destilada en todos los tubos incluyendo el blanco.


La coloración rosa del reactivo reconstituido es normal. Reactivos con blancos hasta 0.4 unidades de absorbancia puede ser empleados.

Si se desea que el blanco del reactivo reconstituido imprescindible mantenerlo bajo refrigeración (2-8°C) el mayor tiempo posible.

Debido a que con el transcurrir del tiempo el reactivo reconstituido va oscureciéndose ligeramente, es importante que siempre se realicen las lecturas contra el blanco de reactivo.

El método es lineal hasta 700 mg/dL.

VALORES NORMALESMenores de 30 años 10 – 140 mg/dLEntre 30 y 39 años 10 – 150 mg/dLEntre 40 y 49 años 10 - 160 mg/dLDe 50 años a más 10 – 190 mg/dL


10.6 Cuestionario 1. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de los triglicéridos? 2. ¿Cómo trabajaría Ud. Un suero lipémico, para la determinaciones bioquímicas?3. ¿Qué recomendaciones daría Ud. al paciente para obtener una buena muestra

de sangre?4. ¿Cuál es el fundamento de la determinación de triglicéridos?







PRACTICA No 11 ENZIMAS

TRASAMINASAS – GOT Y GPT

11.1 Marco teóricoLas transaminasas forman un importante eslabón entre el metabolismo de los prótidos y el de los glúcidos y se hallan ampliamente distribuidos en todos los tejidos. La alanina- transaminasa (TGP) y la aspartato- transaminasa existen normalmente en el plasma, bilis, LCR y saliva, pero no en la orina. El mecanismo de


excreción es desconocido. La aspartato- trasaminasa (TGO) es más abundante en todos los tejidos humanos que la alanina –trasaminasa, la TGO del suero están elevadas en las enfermedades hepatobiliares y cardiovasculares, en las miopatías y en otras afecciones diversas. Los niveles de TGP se encuentran elevados en suero de enfermos hepáticos. Estas enzimas canalizan reacciones de transaminación de tipo reversible.

11.2 Competencias 1.Determina e interpreta las pruebas de función hepática en muestras de suero o

plasma utilizando las técnicas de laboratorio para su análisis, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.

2. Determina las transaminasas por métodos espectrofotométricos conociendo sus propiedades físico-químicas, a partir de una muestra de sangre (suero sanguíneo).


Materiales1. Gradillas2. Pipetas automáticas3. Tubos de ensayo4. Centrifuga5. Espectrofotómetro

METODOS COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRANSAMINASAS GOT Y GPT EN SUERO

Reactivos

1. SUSTRATO GOTUna solución de ácido DL – aspartato y ácido alfacetoglutárico bufferada

a pH 7.4 Contiene estabilizadores y perseverantes.2. SUSTRATOS GPT

Una solución de DL – alanina y ácido alfa-cetoglutárico bufferada a pH 7.4. Contiene estabilizadores y perseverantes.

3. DESARROLLADOR DE COLORUna solución de 2,4 – dinitrofenilhadrazina en ácido clorhídrico diluido. Esta solución es corrosiva y debe conservarse en lugar oscuro.Conservar el frasco lejos del reactivo de NaOH pues los vapores pueden contaminar los reactivos.

4. STANDARD DE CALIBRACIONUna solución de ácido pirúvico bufferada al pH 7.4. Contiene estabilizadores y perseverantes.

5. HIDROXIDO DE SODIO 0.4 N (10x)Una solución de NaOH 4N. Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco 1 en 10 para sí alcanzar la concentración requerida de NaOH 0.4 N.Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco de plástico y no de vidrio.Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los vapores pueden contaminar ambos reactivos.


11.4 ProcedimientoPROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION

Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de calibración par GOT y otra para GPT, de acuerdo a las siguientes indicaciones.Pipetear en dos series de tubos:

Tubo Agua Sustrato Standard de GOT GPT # destilada * calibración

mL) (mL) (mL) U/mL U/mL1 0.2 1.0 0.0 0 02 0.2 0.9 0.1 22 253 0.2 0.8 0.2 55 504 0.2 0.7 0.3 96 825 0.2 0.6 0.4 150 1256 0.2 0.5 0.5 212 -----

Utilizar sustrato GOT para la curva de calibración de GOT y GPT para la curva de calibración de GPT, respectivamente.

Agregar 1mL de desarrollar de color.Mezclar y esperar 20 minutos a temperatura ambiente. Agregar 10 mL de hidróxido de sodio 0.4N (NaOH 4N diluido con agua 1 en 10).Mezclar y esperar 15minutos a temperatura ambiente antes de leer.

Leer las transmitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El color es estable durante sólo 30 minutos.

Graficar en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical, y en el eje horizontal las U/mL, GOT o GPT según sea el caso, que se indica en la tabla superior.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TRANSAMINASA GOT EN SUERO1. Pipetear 0.5 mL de sustrato GOT en un tubo de prueba.2. Incubar a 37ªC durante 5 minutos.3. Agregar 0.1 mL de suero. Comenzar a controlar el tiempo inmediatamente.4. Incubar a 37ºC. Durante 60 minutos, exactamente.5. Al cumplirse los 60 minutos, agregar 0.5 mL de desarrollador de color.

Mezclar y esperar 20 minutos a temperatura ambiente.6. Agregar 5 mL de Hidróxido de Sodio 0.4N (NaOH)4N diluido 1 en 10). Mezclar

y esperar 15 minutos antes de leer.7. Leer la absorbancia a 505 nm usando agua destilada como blanco. Tener en

cuenta que el color es estable durante 30 minutos solamente.8. Obtener el valor de Unidades/mL de GOT a partir de la curva de GOT de

calibración, graficada según instrucciones previas.

Nota: El tiempo de incubación referido en el punto 4 podrá reducirse a 30 minutos, si la cantidad de suero que se agrega (ver punto 3) es de 0.2 mL

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TRANSAMINASA GPT EN SUERO.


1. Pipetear 0.5 mL de Sustrato GPT en un tubo de prueba.2. Incubar a 37ªC. Durante 5 minutos.3. Agregar 0.1 mL de suero. Comenzar a controlar el tiempo inmediatamente.4. Incubar a 37ª C durante 30 minutos, exactamente.5. Al cumplirse los 30 minutos, agregar 0.5 mL de desarrollador de color.

Mezclar y esperar 20 minutos a temperatura ambiente.6. Agregar 5 mL de hidróxido de sodio 0.4 N (NaOH 4N diluido 1 en 10). Mezclar

y esperar 15 minutos a temperatura ambiente.7. Leer la absorbancia a 505 nm usando agua destilada como blanco. Tener en

cuenta que el color es estable durante 30 minutos solamente.8. Obtener el valor de Unidades/mL de GPT a partir de la curva GPT de

calibración, graficada según instrucciones previas.


11.6 Cuestionario1. ¿Cuáles son las denominaciones que tienen la GOT y GPT ?2. ¿En qué patologías se incrementan las transaminasas?3. ¿Cuáles son las condiciones de un paciente que se les va a determinar

transaminasas? 4. Explique el fundamento bioquímico para determinar transaminasas.







FOSFATASA ALCALINA

11.1 Marco teóricoLas fosfatasas son enzimas de especificidad relativamente amplia que son capaces de reaccionar sobre un cierto número de sustratos de estructura relacionada, como son la fosfatasa alcalina, que actúa en medio alcalino, su determinación es importante en pacientes con enfermedades hepáticas y óseas. La fosfatasa ácida conocida como fosfatasa ácida prostática se encuentra en la próstata, se utiliza para diagnosticar y determinar el estadio de carcinoma prostático.La prueba de determinación sérica de la amilasa se lleva a cabo con facilidad y rapidez y se usa con frecuencia para diagnosticar la pancreatitis y realizar el seguimiento del tratamiento de este trastorno. La lactato deshidrogenasa, se encuentra en las células de muchos tejidos del organismo, especialmente en corazón, hígado, hematíes, riñones, músculo


esquelético, cerebro y pulmones. Dado que la lactato deshidrogenasa está ampliamente distribuida por el organismo, el nivel totalde esta enzima no es un indicador específico de una enfermedad concreta que afecte a un único órgano.

11.2 Competencias1. Determina e interpreta las pruebas enzimáticas en muestras de suero o plasma.2. Utiliza las técnicas de laboratorio para su determinación, cumpliendo y haciendo

cumplir las normas de bioseguridad y ética


Materiales1. Gradillas2. Tubos de ensayo3. Pipetas automáticas4. Centrífuga5. Espectrofotómetro

METODO COLORIMETRICO PARA LA DETERMINACION DE FOSFATASA SERICAS ALCALINA.

Reactivos1. SUSTRATO DE FOSFATASA

A. VIAL x 20Reconstruir cada vial de sustrato p-nitrofenilfosfato con 11 ml de agua destilada y separar en alicuotas de 1 ml en viales o tubos con tapa.Después de reconstituido, el sustrato es estable hasta 6 meses en congelación.

B. VIAL x 5Reconstruir cada vial de sustrato p-nitrofenilfosfato con 2.7 mL de agua destilada. Después de usar, el sustrato reconstruido sobrante se puede guardar en congelación. En condiciones de congelación .el sustrato es estable durante 6 meses.

2. BUFFER ALCALINOSolución de glicina, MgCl 2, pH 10.5 con preservadores. Refrigerar.

3. NaOH 0.02 N (10 x)Solución de hidróxido de sodio 0.2. Diluir 1:10 (100 mL NaOH 0.02 N(10 x) + 900 ml de agua destilada ó 20 mLLNaOH 0.02N (10 x) + 180 mL de agua destilada). Conservar en frasco de plástico a temperatura ambiente.

4. STANDARD DE CALIBRACIONSolución de p-nitrofenol. Refrigerar.

5. BUFFER ACIDOSolución de ácido cítrico en HCl, pH 4.8 con preservadores y estabilizadores.

Refrigerar.6. BUFFER TARTARO

Solución de ácido tratárico en citrato pH 4.8 con preservadores y estabilizadores. Refrigerar.

7. NaOH 0.1 (10x) (Fosfatasa x 20)Solución de hidróxido de sodio 1NDiluir 1:10 (50 ml de NaOH 0.1N (10x) + 450 ml de agua destilada). Conservar en frasco de plástico a temperatura ambiente.


8. NaOH 0.1 N (5x) (Fosfatasas 20x)Solución de hidróxido de sodio 0.5NDiluir 1:5 (20 ml de NaOH 0.1N (5x) + 80 ml de agua destilada). Conservarse en frasco plástico a temperatura ambiente.

11.4 ProcedimientoPROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACIÒN

Pipetear 0.25 mL de Standard de fosfatasas y completar a un volumen de 50mL con NaOH 0.02N. Mezclar bien.Este constituye el Standard diluido, el cual es estable únicamente por 24 horas. Con la Standard diluido Pipetear en una serie de tubos:

Tubo Standard NaOH 0.02N Fosfatasa Fosfatasa # diluido Acida Alcalina (mL) (mL) (U/mL) (U/mL)

1 0.5 5.0 0.28 12 1.0 4.5 0.56 23 2.0 3.5 1.12 44 3.0 2.5 1.68 65 4.0 1.5 2.24 86 5.0 0.5 2.80 10

Leer la absorbancia a una longitud de onda de 410 nm vs el blanco de agua destilada.Graficar al absorbancia vs las Unidades de Fosfatasa ácida o de fosfatasa alcalina, según sea el caso.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR FOSFATASA ALCALINA EN SUERO Blanco Muestra

(mL) (mL)________________________________________________________________________

Sustrato de fosfatasas 0.25 0.25Buffer alcalino 0.25 0.25Suero ------ 0.05

Incubar en un baño de agua a 37°C. Durante 30 minutos.Agregar:

NaOH 0.02 5.0 5.0Suero 0.05 ------

Leer la absorbancia a 410 nm vs el blanco.Buscar el valor de la Fosfatasa Alcalina usando la curva Standard correspondiente.

DETERMINACIÓN FOTOMÉTRICA DE LA AMILASA EN SUERO

REACTIVOSConservados entre 2° y 8°C. y protegidos de la luz, estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.Componentes del reactivo:


Buffer MES pH 6,0 +/- 0,1CNP-G3 1,8 mMCloruro de Sodio 350 mMAcetato Calcio 6 mMTiocianato de Potasio 900 mMAzida de Sodio 0,01%Preparacion del Reactivo de Trabajo: los reactivos se proveen listo para su uso. Descartar el reactivo si su absorbancia es mayor de 0.6 a 405 nm. contra blanco de agua y paso de luz de 1 cm o presenta turbidez.MUESTRASuero o plasma heparinizado libre de hemolisis. La amilasa es estable por 7 dias conservada entre 18 y 25oC. y 2 meses a 4°C.

TECNICALlevar el reactivo a la temperatura de reaccion (37° C.) y poner el espectrofotometro en cero contra blanco de agua destilada.Reactivo de trabajo (ml) 1.0Volumen de muestra (ml) 0.025Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotometro . Incubar 60 segundos a la temperatura de reaccion. Leer la absorbancia inicial (A1) a 405 nm. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos, hasta por dos minutos.

CALCULOSDetermine el cambio de Absorbancia por minuto (DA/min)Actividad a-amilasa (UI/L) = DA/min x 3178Factor = Vt x 1000 = 3178SCNP 405 x P x VmVt = Volumen total de reaccionSCNP405= Coef. de extincion milimolar del CNP a 405 nm.=12,9P = Espesor del paso de luz en la cubeta (1 cm.)Vm = Volumen de muestra utilizadoRANGOS DE REFERENCIALos rangos de referencia que se enumeran a continuacion están tomados de la bibliografia existente.25 a 125 U/L


11.6 Cuestionario1.¿Explique que otras pruebas bioquímicas corroboran los resultados elevados de

fosfatasas acidas? 2.¿Qué precauciones debemos tener con la muestra sanguínea (suero) cuando

realizamos las pruebas de fosfatasa tanto alcalina como ácida?3.¿Qué otras pruebas de laboratorio corroboran una amilasa aumentada?4.¿Cuál el procedimiento para la determinación de la lactato deshidrogenasa?5.Indique los valores normales de la lactato deshidrogenasa.

11.7 Fuentes de información


1. Angel G, Angel M. Interpretación clínica del laboratorio. 7a ed. Bogota: Médica panamericana; 2001.

2. Balcells A. La clínica y el laboratorio. 19a ed. Barcelona: Masson s.a.; 2001.3. Diccionario Médico Biológico University. 3a ed. México D.F.: Panamericana; 1998.4. Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.


Moderno S.A.; 1986.

PRÁCTICA No 12 PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA

A. DETERMINACION DE BILIRRUBINAS:

12.1 Marco teóricoLa bilirrubina es producida por la destrucción de la hemoglobina por las células del sistema reticuloendotelial. En condiciones normales la concentración de bilirrubina en la sangre es baja, un incremento ocurre en los casos de ictericia.. Varía son las causa de este incremento, fundamentalmente cuando el hígado no es capaz de depurar la bilirrubina producida en grandes cantidades, sobre todo cuando hay daño del parénquima hepático., en otros casos se debe a una obstrucción del tracto biliar. La bilirrubina directa o conjugada y la bilirrubina total, se determinan por una serie de métodos, cuyo fundamento principal es la formación de un complejo azobilirrubina.

12.2 Competencias1. Determina e interpreta las pruebas de función hepática en muestras de suero

o plasma 2. Utiliza las técnicas de laboratorio como la espectrofotometría para su

determinación, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.


Materiales1. Gradillas2. Tubos de ensayo3. Pipetas automáticas4. Centrifuga5. Espectrofotómetro

Reactivos

12.4 Procedimiento


METODO DE JENDRASSIK GROF MODIFICADO1. Fundamento.-Este método permite determinar la bilirrubina directa

o conjugada y la bilirrubina total. La bilirrubina directa es más soluble en el agua que la libre ,y reacciona relativamente más rápido, en solución acuosa directamente con el diazoreactivo, toda la bilirrubina presente en la sangre reacciona formando un complejo de color rojo violáceo de azobilirrubina, cuya máxima absorción se da a una longitud de onda de 530 nm. La forma libre es menos soluble en el agua y no reacciona en una solución acuosa.

2. Reactivos: Solución de cafeína 50g/L y benzoato de sodio 75g /L en acetato

de sodio. Mantener estable a temperatura ambiente Reactivo de ácido de ácido sulfanílico al 0.5 x litro en agua destilada

que Contiene 15 mL de HCL concentrado. Refrigerar Nitrito al 1% en agua destilada. Refrigerar Standard de bilirrubina, es una solución patrón de bilirrubina

equivalente a 2 mg/dL calibrada y estabilizada. Conservar bajo refrigeración y

protegida de la luz. Diazorreactivo, se prepara al momento de usar, agregando una gota

de nitrito de sodio por cada 1.5 mL de ác. Sulfaníco.

3. Equipos: 1. Espectrofotocolorimetro , centrìfuga.

12.4 ProcedimientoA. Factor de calibración: Antes de utilizar el kit, es necesario proceder a

la calibración como Sigue :a. En una gradilla colocar dos tubos y luego pipetear:

Blanco de St Standard mL. mL

Standard 0.2 0.2 Agua destilada. 2.4 -- Desarrollador. -- 2.4 Reactivo sulfanilico. 0.2 -- Diazorreactivo. -- 0.2

b. Mezclar dejar en reposo durante 5 minutos a la temperatura ambiente.

c. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm. Factor = 2 Absorbancia del St.

B. Para determinar bilirrubina en suero.


a. Colocar en una gradilla tres tubos de prueba y luego proceder como sigue:

Blanco de la Bilirrubina Bilirrubina Muestra mL. directa mL. total mL.

Suero 0.2 0.2 0.2 Agua destilada. 2.4 2.4 -- Desarrollador --- --- 2.4 Reac. Sulfanílico 0.2 --- -- Diazorreactivo -- 0.2 0.2

b. Mezclar suavemente todos los tubos.c. A los 5 minutos exactamente, leer la absorbancia de las muestras

directa y total, frente al blanco, a una longitud de onda de 530 nm

d. Cálculos: mg/dL Bilirrubina directa = Absorbancia de bilirubina directa

x factor. Mg/dL Bilirrubina total = Absorbancia de bilirrubina total x

factor.

e. Valores normales: Bilirrubina total. 0.3 a 1.3

mg/dL. Bilirrubina directa. 0.1 a 0.4

mg/dL Bilirrubina indirecta 0.2 a 0.8

mg/dL.

12.5 Resultados


12.6 Cuestionario1. ¿Qué métodos existen para la determinación de bilirrubina? .2. ¿Cuál es la importancia clínica de las bilirrubinas directa o conjugada y la

indirecta no conjugada ?.3. En la ictericia hemolítica cuál de las bilirrubinas se encuentra alterada y porqué?4. ¿En una anemia hemolítica cual de las bilirrubinas se encuentra alterada y por

qué?5. ¿Qué importancia clínica tiene en las pruebas hepáticas completas la

determinación de proteínas totales y colesterol?

12.7 Fuentes de información1. Angel G, Angel M. Interpretación clínica del laboratorio. 7a ed. Bogota: Editorial

médica panamericana; 2001.2. Balcells A. La clínica y el laboratorio. 19a ed. Barcelona: Masson s.a.; 2001.3. Diccionario Médico Biológico University. 3a ed. México D.F.: Panamericana; 1998.4. Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.

Buenos Aires: Librería El Ateneo; 1985.


5. Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México DF: Manual Moderno S.A.; 1986.

B. DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONADAS

12.1 Marco teóricoEl hígado juega un papel importante en la producción de proteínas plasmáticas. La determinación de proteínas totales y fraccionadas, a menudo es una información muy útil en el tratamiento de las enfermedades crónicas del hígado. En etapas avanzadas de la enfermedad, se produce una disminución de la albúmina con incremento de la globulina, de tal manera que se produce una inversión de la relación A/G. En la fase temprana de la hepatitis, pueden encontrarse concentraciones normales de proteínas. El método más exacto para la determinación de proteínas es el método de Kjeldahl.La determinación de sólo proteínas totales, tiene poco valor como prueba aislada, debido a que la alteración en una de sus fracciones puede ser balanceada por una alteración opuesta de otra fracción, por lo que es importante determinar también sus fracciones, albúmina y globulina.

12.2 Competencias1.Determina e interpreta las pruebas de función hepática en muestras de suero

o plasma.2.Utiliza las técnicas de laboratorio como la espectrofotometría para su

determinación de las proteínas totales y fraccionadas., cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.


Materiales1. Gradillas2. Baguetas3. Tubos de ensayo4. Pipetas automáticas5. Centrifuga6. Espectrofotómetro

Reactivos

12.4 ProcedimientoMETODO DE BIURET PARA DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES

a. Fundamento. Las proteínas debido a sus enlaces peptídico reaccionan, en medio alcalino con el ión cúprico del Reactivo de Biuret, estabilizado con el tartrato, formando un complejo de color violeta. La intensidad del color es proporcional a la concentración de proteicas existentes en el suero, la absorbancia se mide a longitud de onda de 555 nm.

b.Reactivos: 1.Reactivo de Biuret para proteínas. 2. Standard de proteínas 3.4 g/dL

c. Equipos: 1. Espectrofotocolorimetro.


Disponer en una gradilla tres tubos de prueba y trabajar como sigue:

Blanco Standard Muestra mL. mL. mL.

Suero --- --- 0.05 Standard --- 0.05 --- Biuret. 2.5 2.50 2.50

1. Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos.2. Leer la absorbancia de la muestra y del standard a una longitud de

onda de 55 5nm.3. Cálculos:

g/ dl de proteinas = A. de la muestra x 3.4 A del standard.

A= absorbancia


12.6 Cuestionario1. ¿Cuál es el fundamento para la determinación de las proteínas?2. ¿Qué métodos existen para determinar proteínas totales y fraccionadas?3. ¿Utilizar un standard de proteínas con una concentración por debajo de las

cifras normales, lleva a resultados poco exactos.4. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas totales?5. ¿En que casos se solicitan determinación de proteínas en orina?

12.7 Fuentes de información1. Angel G, Angel M. Interpretación clínica del laboratorio. 7a ed. Bogota: Médica

panamericana; 2001.2. Balcells A. La clínica y el laboratorio. 19a ed. Barcelona: Masson s.a.; 2001.3. Diccionario Médico Biológico University. 3a ed. México D.F.: Panamericana;

1998.4. Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.


Moderno S.A.; 1986.

C. DETERMINACION DE ALBUMINA CON EL VERDE DE BROMOCRESOL

12.1 Marco teórico


Fundamento. Las proteínas debido a sus enlaces peptídico reaccionan, en medio alcalino con el ión cúprico del Reactivo de Biuret, estabilizado con el tartrato, formando un complejo de color violeta. La intensidad del color es proporcional a la concentración de proteicas existentes en el suero., la absorbancia se mide a a longitud de onda de 555 nm.

12.2 Competencia1. Conoce el método de laboratorio para determinar de albúminas2. Explica el procedimiento para la determinación de albúminas

12.3 Materiales y equiposa) Reactivos: Reactivo de albúmina de verde de bromocresol en buffer de

succinato pH 4,2 , estabilizado.b) Standard de albúmina de 3.2 g/dL. Refrigerar.c) Equipos: Espectrofotómetro.

12.4 Procedimiento 1. Disponer en una gradilla tres tubos de prueba y proceder como sigue:

Blanco Standard Muestra mL. mL. mL

Suero --- --- 0.02 Standard --- 0.02 --- R. de Albúmina 2.5 2.50 2.5

2. Mezclar y dejar en reposo durante 30 minutos.3. Leer la absorbancia de la muestra y del standard a una longitud de onda de 630.4. Cálculos :

g/dl de albúmina = A de la muestra x 3.2

A del standard

5. Valores Normales: Albúmina De 3.5 a 5.5 g/dL. Globúlina De 1.5 a 3.0 g/dL


12.6 Cuestionario1. ¿Considera que las globulinas pueden interferir el dosaje de albúmina por el

Método de verde de bromocresol?.2. ¿Cómo se determinan las globulinas en el laboratorio. A su criterio cual es el

mejor método para determinar globulinas?.3. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de las globulinas?

12.7 Fuentes de información1.Angel G, Angel M. Interpretación clínica del laboratorio. 7a ed. Bogota: Médica

panamericana; 2001.


2.Balcells A. La clínica y el laboratorio. 19a ed. Barcelona: Masson S.A. 2001.3.Diccionario Médico Biológico University. 3a ed. México D.F.: Panamericana;

1998.4.Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.

Buenos Aires: Librería El Ateneo; 1985.5.Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México DF: Manual

Moderno S.A.; 1986.

PRACTICA No. 13 PRUEBAS DE FUNCION RENAL

A. DETERMINACIÓN DE UREA

13.1 Marco teóricoUna de las pruebas mas comunes para determinar la función renal en pacientes que padecen de alguna patología renal ya sea de tipo ambulatorio como hospitalizado es la Urea y Creatinina en sangre. La Urea es el producto final del catabolismo de las proteínas, tras sintetizarse en el, hígado, la urea pasa a la sangre y de aquí es eliminada finalmente por el ríñanla concentración de urea en el filtrado glomerular es idéntica a la del plasma, dado que se filtra libremente por los glomérulos y que el riñón es su único punto de eliminación. La creatinina que es el producto resultante del catabolismo muscular, formándose a partir del fosfato de cretina que contiene el músculo, tras pasar a la sangre se elimina en su mayoría por el riñón. Las causas de aumento de estos dos parámetros que miden la función renal, nos darán una clara idea como esta funcionando el riñón, o también nos permitirá monitorizar drogas nefrotoxicas.

13.2 Competencias1. Determina e interpreta las pruebas de función renal en muestras de suero o plasma Y orina utilizando las técnicas de laboratorio para su análisis, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.2. Permite al estudiante la oportunidad de aplicar sus conocimientos y practicar con muestras clínicas la monitorización de algunos fármacos nefrotóxicos.

13.3 Material y equipos Gradillas Pipetas automáticas Baguetas Centrifuga Espectrofotometro

a.Material biológico: Suero obtenido estando el paciente en ayunas.

b.Reactivos:

1. Solución de ácido picríco al 0.05M. Estable a temperatura ambiente2. Solución de hidróxido de sodio al 0.75 N.


3. Standard de creatinina 2 mg/dL . Refrigerar.

13.4 Procedimiento

DETERMINACION DE CREATININA EN SANGRE1. En un tubo de prueba colocar 0.75 ml de suero y 3.75 ml de Reactivo.2. Mezclar por inversión y dejar en reposo durante 10 minutos. Centrifugar a

3000 g durante 5 minutos.3. Colocar en una gradilla tres tubos y proceder como sigue

Blanco Standard Problema mL. mL. mL.

Centrifugado - - 3 Standard. - 0.5 - Agua. 1.25 0.75 - Reactivo 1 1.75 1.75 - Reactivo 2 0.50 0.50 0.50

4. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.5. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm. 6. Cálculos:

mg/dL de creatinina = A de la muestra x 2 A del standard


13.6 Cuestionario1. ¿Cuál es el fundamento para la determinación de la Urea por el método de la ureasa?2. ¿Qué otros métodos existen para determinar urea?3. ¿Qué relación hay entre la urea y la creatinina?

13.7 Fuentes de información1.Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica panamericana;

1999.2.Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed.

Barcelona: Masson; 2005.3.Muñoz J. Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos.

Madrid: Masson; 2005.4.Merck Sharp Dohme. El Manual Merck.11a ed. Madrid: Elsevier; 2007.5.Turgeon ML. Hematología clínica. Teoría y procedimientos. México D.F.: Manual

moderno, 2006.6.Vives JLL, Aguilar JLL. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 3a ed.



B. DETEREMINACION DE CREATININA

13.1 Marco teóricoLa creatinina es un producto de desecho, del metabolismo de la creatina, cuya valoración es una medición de gran importancia y un índice excepcionalmente útil de la función renal.En condiciones normales, la cantidad diaria de creatinina producida es prácticamente constante y depende del índice metabólico y del tamaño corporal. Tan pronto se forma la creatinina se difunde pasivamente en el torrente sanguíneo, de donde es extraída por la filtración glomerular del riñón, luego pasa a través del sistema tubular, de donde una pequeñísima cantidad es reabsorbida a través de los túbulos renales. La prueba de depuración de la creatinina tiene la ventaja sobre la depuración de urea, en que la de creatinina es afectada muy poco por la ingesta dietética y porque su excreción se hace totalmente por filtración glomerular, sin una contribución celular de valor, de tal manera que la filtración glomerular refleja la concentración sérica de creatinina.

13.2 Competencias 1. Determina e interpreta las pruebas de función renal en muestras de suero

o plasma Y orina utilizando las técnicas de laboratorio para su determinación, cumpliendo y haciendo cumplir las normas de bioseguridad y ética.

2. Permite al estudiante la oportunidad de aplicar sus conocimientos y practicar con muestras clínicas la monitorización de algunos fármacos nefrotóxicos.

13.3 Material y equiposPara realizar la depuración se requiere:

a) Material biológico : 1. Orina de 5 o 24 horas según indicación médica

2. Suero obtenido estando el paciente en ayunas. b) Reactivos:

1. Solución de ácido picríco al 0.05M. Estable a temperatura ambiente

2. Solución de hidróxido de sodio al 0.75 N. 3. Standard de creatinina 2 mg/dL . Refrigerar.

c) Equipos: 1. Espectrofotometro. 2. Centrifuga.

13.4 Procedimiento1. Se pide al paciente que vacié totalmente la vejiga descartando la orina

eliminada, luego se anota la hora , comenzando a partir de esta hora a recolectar toda la orina por un período de 24 hrs, o por el tiempo que indique el médico.

2. Durante el período de recolección y encontrándose el paciente en ayunas, se le extrae sangre


3. Finalizada la recolección, se mide el volumen total de la orina y se obtiene el volumen minuto de orina , aplicando la siguiente fórmula:

V= mL. de orina recolectados Tiempo de recolección en minuto

4. Luego se determina tanto en orina como en suero mg/dL de creatinina en orina y suero.

5. Cálculos

ml, creatinina depurados por minuto = U x V x 1.73 P

U = mg/dL de creatinina en orina. V = volumen minuto de orina. P = mg/dL de creatinina en sangre. 1.73 = superficie corporal standard.

6. Valores Normales: Hombres 140 + 27.2 mL/ min. Mujeres: 112 + 20.2 mL/min.

Leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm

7. Cálculos:

mg/dL de creatinina en orina = Absorbancia de Muestra x 1000 Absorbancia del standaard13.5 Resultados


13.6 Cuestionario 1. ¿Qué tipo de muestras biológicas se requieren para la depuración de

creatinina?2. ¿Porqué la orina se diluye previamente al 1/10 con agua destilada ?3. ¿Cuál es la interpretación clínica y los valores normales de la depuración de

cratinina?4. ¿Cuál es la interpretación clínica del incremento de la creatinina?

13.7. Fuentes de información1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica

panamericana; 1999.2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed.






ELECTROLITOS: CALCIO Y MAGNESIO A. CALCIO

13.1 Marco teóricoLa determinación del calcio sérico se utiliza para evaluar la función paratiroidea y el metabolismo del calcio mediante análisis directo de la cantidad total de calcio en la sangre. Cuando el nivel sérico de calcio esta elevado en al menos tres determinaciones separadas, el paciente tienen hipercalcemia. Sabemos que el calcio existe dentro de la sangre en forma libre (calcio ionizado) y ligado a proteínas (con albúmina).La determinación del calcio sérico mide ambas formas.La mayor parte del magnesio del organismo se encuentra en el interior de las células, y aproximadamente la mitad se localiza en el tejido oseo. El magnesio está mayoritariamente ligado a una molecula de ATP y es importante en la fosforilación de esta molécula. Por otra parte este electrolito interviene en casi todos los procesos metabólicos.

13.2 Competencia1. Determina e interpreta las pruebas por espectrofotometría de los principales

electrolitos en muestras de suero, plasma y orina.2. Analiza e interpreta los resultados relacionando con las diversas

enfermedades que se presentan cuando hay disminución o incrementos.


Materiales1. Gradilla2. Tubo de centrifuga3. BAguetas4. Centrifuga5. Espectrofotometro

13.4 Procedimiento

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE CALCIO EN SUERO

REACTIVOSConservados entre 15° y 25°C. y protegidos de la luz, estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.-Buffer Alcalino: 2-Amino-2-Metil-1-Propanol 350 mMCianuro de Potasio 2 mMEstabilizantes e ingredientes no reactivos c.s.-Reactivo CFC: o-Cresolftaleína complexona 0.05 mM8-Hidroxiquinolina 5 mMPreparación del Reactivo de Trabajo: Mezclar 1 ml. de Buffer Alcalino con 1 gota (50 ul) de Reactivo CFC. Estable por 24 horas protegido de la luz. Para mayores volúmenes, preparar manteniendo la proporción de los componentes.


MUESTRAUtilizar suero o plasma heparinizado. El uso de otros anticoagulantes puede interferir con el ensayo. Obtener la muestra evitando estasis venosa. El uso de torniquetes puede arrojar resultados más elevados.De preferencia el paciente debe encontrarse en ayunas..TECNICATECNICA CON BLANCO TUBOCalibrador MuestraReactivo de Trabajo (ml) 1.00 1.00Mezclar y leer para cada tubo las absorbancias A1 contra blanco de agua.

Calibrador (ml) 0.01 ---Muestra (ml) --- 0.01Mezclar e incubar a lo menos 60 segundos y leer para cada tubo las absorbancias A2 contra blanco de agua. El color resultante es estable por a lo menos 1 hora.TECNICA SIN BLANCO TUBOBlanco Calibrador MuestraCalibrador (ml) --- 0.01 ---Muestra (ml) --- --- 0.01Reactivo de Trabajo (ml) 1.00 1.00 1.00Mezclar e incubar a lo menos 60 segundos y leer las absorbancias contra blanco de reactivos. El color resultante es estable por a lo menos 1 hora.Adaptaciones para la aplicación de este reactivo en autoanalizadores están disponibles a solicitud. Es responsabilidad del laboratorio validar esta aplicación.CALIBRACION• La calibración con el Standard acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos. En la calibración serecomienda utilizar calibrador sérico VALTROL-C proceder de igual forma que con las muestras.

CALCULOSTECNICA CON BLANCO TUBOFactor = ____Concentración Calibrador_______(Abs.2 Calibrador - Abs.1 Calibrador)Calcio (mg/dL)= Factor x (Abs. 2 Muestra – Abs. 1 Muestra)TECNICA SIN BLANCO TUBOFactor = _Concentración Calibrador_Abs.CalibradorCalcio (mg/dL)= Factor x Abs. MuestraEn el caso de las muestras de orina, multiplicar el resultado por el factor de dilución. Si la muestra es de 24 horas multiplicar además por el volumen total expresado en litros y luego por 10.

RANGOS DE REFERENCIASuero o plasma:Adulto : 8.8 a 10.7 mg/dLNiño (*) : 10.0 a 12.0 mg/dL(*) El rango de referencia para los niños es levemente más elevado que el de los adultos, y decrece lentamente con el crecimiento.Orina : 50 a 400 mg/24 h.



13.6 Cuestionario 1-¿Cuáles son los electrolitos más comunes que se solicitan al laboratorio de análisis clínicos? 2.-¿Qué recomendaciones se le debe hacer al paciente antes de la toma de muestra para determinar electrolitos?

4.-¿Qué papel cumplen los electrolitos en la sangre y que relación tienen con las hormonas?

5. ¿Cómo se determina Magnesio en suero y que importancia clínica tiene?

13.7 Fuentes de información1.Angel G, Angel M. Interpretación clínica del laboratorio. 7a ed. Bogota: Médica

panamericana; 2001.2.Balcells A. La clínica y el laboratorio. 19a ed. Barcelona: Masson s.a.; 2001.3.Diccionario Médico Biológico University. 3a ed. México D.F.: Panamericana;

1998.4.Guerci A. Laboratorio. Métodos de análisis clínicos y su interpretación. 3ª ed.

Buenos Aires: Librería El Ateneo; 1985.5.Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México DF: Manual

Moderno S.A.; 1986.

PRACTICA Nº 14 HORMONAS

A. DETERMINACIÓN DE T3 y T4 por ELISA

14.1 Marco teóricoLa glándula tiroides segrega dos hormonas la tiroxina y la calcitonina , la de

importancia de esta radica en que la primera regula el metabolismo basal y están involucradas la Triyodotironina(T3) que representa el2% de la hormona tiroidea presente en la sangre .Solo la quinta parte procede del propio tiroides, ya que la mayoría se forma en los tejidos a partir de la T4.Sin embargo, es cinco veces más activa que la T4.No es un buen parámetro de estimación de la función tiroidea, ya que su concentración en sangre depende de múltiples circunstancias cuyo origen no es tiroideo .Una parte de la T3(solo el 0.4%) esta libre (no unida a proteínas ) y es por lo tanto, la fracción metabólicamente activa ,La T3 inversa T3 es otro metabolito histico de la T4,pero inactivo. Parece ser que la T4 se metaboliza, bien hacia T3 (Forma activa)o T3( forma inactiva) dependiendo de diversas circunstancias .Las causas de aumento es que la T3 puede ser alta si hay un aumento de la concentración de globulina fijadora (Para mantener normal la cifra de T3 libre, aumenta en enfermedades con destrucción y en la insuficiencia hepática y renal.

14.2 Competencia1. Profundiza sus conocimientos de esta patologías de tipo hormonal, referidas a

las hormonas tiroideas.2. 2. Determina por métodos de ELISA el análisis e interpretación de los

resultados.


14.3. Materiales y equipos Se trabajara con bibliografía actualizada, revistas con trabajos de investigación sobre esta patología referida a la tiroides, y sus hormonas.

14.4 ProcedimientoSe realizara según la técnica de ELISA indicada por el laboratorio de procedencia del set de reactivos.


14.6 Cuestionario 1. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio para determinar hormonas T3 y T4?2. ¿Qué pruebas se utilizan para determinar el perfil tiroideo?3. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de TSH?.

14.7 Fuentes de información 1. Aiquel F. Manual de análisis clínicos. 6a ed. Buenos Aires: Médica

panamericana; 1999.2. Gónzales De Buitrago JM. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2a ed.

Barcelona: Masson; 2005.3. Kumar V, Cotran R, Robbins S. Patología humana. 7a ed. Madrid: Elsevier;

2004.4. Widmann F. Interpretación clínica de las pruebas de laboratorio. 4a ed.

Barcelona: JIMS; 1997.

DETERMINACIÓN DE HCG: PRUEBA DE EMBARAZO MONOCLONAL

B. PRUEBA DIRECTA EN LAMINA PARA LA DETECTACION ESPECIFICA DE HCG EN ORINA O SUERO

14.1. Marco teóricoLa prueba inmunológica, se basa en la presencia en la orina o en suero de la mujer embarazada de gonadotrofina coriónica humana(HCG), que estimula la producción de anticuerpos específicos demostrables en vivo. Se han descrito diversas pruebas inmunológicas., y actualmente se dispone de preparados comerciales para detectar la HCG urinaria. Se basan en la inhibición de la aglutinación de las partículas de látex, que recubiertas con HCG sirven como antígeno capaz de reaccionar con un suero inmune anti-HCG (de conejo).

14.2 Competencias1. 1.Utiliza los diferentes métodos de detección para el diagnostico de embarazo

adquiriendo destreza.2. 2.Analiza e interpreta los resultados obtenidos.



Materiales

Laminas de fondo oscuroPipetas volumetricasMicropipetas

Reactivos

1. LATEX ANTI – HCGPartículas látex recubiertas covalentemente con anti – HCG de origen

monoclonal. Refrigerar.

14.4 ProcedimientoMETODO CUALITATIVO PARA EL DOSAJE DE HCG EN ORINA O SUERO

1. Colocar 80 pl (0.08 mL) de orina o suero en el centro de uno de los anillos de una lámina de vidrio.

2. Agregar 1 gota de Látex anti – hCG sobre la gota de suero u orina de la lámina.

3. Mezclar bien usando el extremo plano de la varilla y ladear la lámina lenta y suavemente por no más de 2 minutos.

4. Examinar presencia o ausencia de aglutinación usando una luz apropiada.

Interpretación.-

POSITIVO AglutinaciónNEGATIVO no aglutinación

METODO SEMI – CUANTITATIVIO PARA EL DOSAJE DE HCG EN ORINA

1. Cuando la colección de orina de 24 horas es completa, se mide el volumen total (V).

Se mezcla bien la muestra y se separa una alícuota de aproximadamente 2mL.

2. Preparar diluciones progresiva de la orina usando suero salino (ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, etc).

2. Realizar una prueba cualitativa (en lámina) en cada una de las diluciones.3. El punto final se determina como la mayor dilución que dé resultado

positivo (es decir la última dilución que da aglutinación).

La cantidad de HCG es derivada de la fórmula siguiente:

Ul /mL = S x D

Donde:S = sensibilidad de la prueba (0.02 Ul/ mL).D = Inversa de la dilución que produce un resultado positivo (1/ dilución).


Ejemplo:S = 0.20D = 16 (dilución 1:16)HCG Ul/mL. = 0.20 x 16 = 3.2 Ul/mL

Si se desea estimar el nivel en 24 horas añadir el volumen urinario en 24 horas a la ejecución:

Ul/ 24 horas = S x D x V

Ejemplo:Ul/24 horas = 0.20 x 16 x 1,500 = 4,800 Ul/24 horas

14.5 Resultados Los alumnos reportaran en su informe los resultados obtenidos en ésta práctica.

14.6 Cuestionario1. ¿Qué métodos conoce Ud. para la determinación de HCG?2. ¿Qué otras patologías se puede diagnosticar con la determinación de la HCG?3. ¿Cómo es el proceso para la determinación de HCG cuantitativo?.

14.7 Fuentes de información 1. Krupp M. Manual de diagnóstico clínico y de laboratorio. México D.F.: Manual

moderno S.A; 1986.2. Lluis VJ. Manual de técnicas de laboratorio. Hematología. 2ª ed. Barcelona:

Masson S.A.; 1997.3. Instituto Nacional de Salud. Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de

laboratorio. Lima. Impresora Amarilys e,i,r,l,; 1997.4. San Miguel JF y Sanchez-Guijo F. Cuestiones en hematología, 3ª ed. Madrid:

Harcourt Brace S.A.; 1997.5. Pagana-Pagana. Pruebas diagnósticas y de laboratorio. 2da. ed. Barcelona:

Mosby- Doyma Libros, SA; 1996.


GUIA DE PRACTICAS DE INTERP. ANALISIS CLINICOS 2015-II (1)

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