Gentechnik rnit Pflanzen

Von Peter Eckes, Giinter Donn und Friedrich Wengenmayer*

Professor Heinz Harnisch zum 60. Geburtstag gewidmet

Isolierung und Charakterisierung pflanzlicher Gene bereiten heute keine grundsatzlichen Schwierigkeiten mehr. Die Erkenntnisse iiber Struktur und Funktion der bisher sequenzier- ten Gene ermbglichen es bereits, die Genregulation in Pflanzen wenigstens in groBen Ziigen zu verstehen. In Verbindung mit den in letzter Zeit entwickelten Methoden des Gentrans- fers in pflanzliche Zellen ergibt sich der fur die Anwendung wichtigste Aspekt: die gentech- nische Gewinnung von Pflanzen rnit neuen Eigenschaften. Da die zu ubertragenden Gene aus beliebigen Pflanzen, ja sogar aus beliebigen Organismen stammen konnen, werden hier vollig neue Moglichkeiten fur die Pflanzenzuchtung erbffnet.

1. Einleitung

Vor zehn Jahren gelang die Isolierung des ersten Struk- tur-Gens eines pflanzlichen Enzyms[']. Seitdem hat sich auf dem Gebiet der pflanzlichen Molekularbiologie eine Entwicklung angebahnt, die Ergebnisse und Mdglichkei- ten fur die praktische Anwendung erkennen IaDt, die lange nicht vorstellbar waren.

Damals wurde das auf der DNA von Chloroplasten lo- kalisierte Gen der groBen Untereinheit des Enzyms iso- liert, das in Pflanzen fiir die Bindung von C 0 2 aus der Luft verantwortlich ist (Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase, auch Rubisco genannt). Heute ist beispielsweise bei Tabak sogar schon die gesamte DNA der Chloroplasten sequen- ziert"] - dies sind immerhin 155844 Basenpaare. Inzwi- schen stehen Methoden zur stabilen Ubertragung fremder Gene auf Pflanzen zur Verfugung; in zahlreichen Labora- torien konnten bereits ,,transgene Pflanzen" erhalten wer- den. In den USA wurden kunlich die ersten Freilandver- suche mit gentechnisch verlnderten Pflanzen genehmigt.

Das zunehmende Interesse an der Biochemie und Mole- kularbiologie der Pflanzen zeigt sich auch an der zuneh- menden Anzahl von Publikationen auf diesem Gebiet. Auch die Industrie hat begonnen, entsprechende Arbeits- gruppen aufzubauen, allerdings noch vorwiegend in den angelsachsischen Landern und in Japan (Tabelle 1).

Tabelle 1. Biotechnologie in der Landwirtschaft: Anzahl der auf diesem Ge- hiet tBtigen Firmen (aus [3]).

Land Anzahl

ltalien 1 Bundesrepublik Deutschland 2 Frankreich 5 Japan 12 GroDbritannien 15 USA 13

Die beeindruckenden Erfolge der letzten Zeit und das wachsende Interesse an der Biochemie und Molekularbio- logie der Pflanzen lassen sich auf mehrere Faktoren zu-

I*] Dr. F. Wengenmayer, Dr. P. Eckes, Dr. G. Donn Hoechst Aktiengesellschaft Postfach 8003 20, D-6230 Frankfurt am Main 80

392 0 VCH Verlagsgest-llschafl mbH. 0-6940 Weinheim. 1987

riickfiihren. Einer der wichtigsten ist dabei das wissen- schaftliche Interesse an der Genstruktur und Genregula- tion von Pflanzen. Gegeniiber dem Wissensstand bei Pro- karyonten oder tierischen Zellen ist hier noch ein erhebli- cher Nachholbedarf vorhanden.

Ein weiterer Grund fur das groDe Interesse an der Mole- kularbiologie der Pflanzen ist die enge Beziehung zwi- schen den erarbeiteten Grundlagen und den Anwendungs- mdglichkeiten in der landwirtschaftlichen Praxis. Prinzi- piell konnen Gene, die fur die Auspragung einer wichtigen Eigenschaft zustandig sind, aus einer beliebigen Pflanze oder einem beliebigen anderen Organismus isoliert und in Kulturpflanzen eingebaut werden. Damit werden Eigen- schaften ubertragbar, die bisher den klassischen Methoden der Pflanzenzuchtung nicht zuganglich waren. So kbnnten beispielsweise Resistenz-Gene aus exotischen Pflanzen isoliert und auf heimische Kulturen iibertragen werden. Bisher lieBen sich naturgemaB nur Gene und damit Eigen- schaften iibertragen, die bereits in den Elternpflanzen vor- handen waren. Diese Grenzen werden nun rnit Hilfe der Gentechnik durchbrochen.

Ein weiterer Grund fur die Beschlftigung zahlreicher Wissenschaftler rnit der Molekularbiologie der Pflanzen ist in der Aussicht zu suchen, auf diesem Weg einen wichtigen Beitrag zur Losung des Welthungerproblems leisten zu kdnnen. Die Weltbevblkerung wird nach neuesten Berech- nungen des Statistischen Amtes der USA bis zum Jahre 2000 von jetzt rund 4.9 auf 6.2 Milliarden Menschen an- wachsen.

Die beeindruckende Zunahme der Nahrungsmittelpro- duktion der letzten Jahnehnte beruht im wesentlichen auf folgenden Faktoren:

- Einfuhrung neuer, ertragreicher Sorten; - Einsatz von Diinge- und Pflanzenschutzmitteln; - zunehmende Mechanisierung in der Landwirtschaft.

Auch zukiinftig werden sich die ErtrSLge steigern lassen ~

allerdings nicht exponentiell, wie die Weltbevolkerung wachst. Die gegenwartigen hohen landwirtschaftlichen uberschiisse in der EG und in den USA stellen keine Lo- sung fur die SOYO der Weltbevolkerung dar, die im Jahre 2000 auBerhalb Europas, Nordamerikas und der Sowjet- union leben werden. Gerade fur die tropischen und subtro-

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pischen Lander kbnnten Pflanzen mit gentechnisch erzeug- ter Resistenz gegen Schadlinge, Krankheiten oder StreDbe- dingungen grol3e Bedeutung erlangen.

Weiterhin ist zu beriicksichtigen, daI3 im Laboratorium gewonnene, gentechnisch veranderte Pflanzen auch noch in Zuchtprogramme aufgenommen und gepriift werden mussen. Dieser ProzeD wird mehrere Jahre beanspruchen, so daD solche Pflanzen dem Landwirt erst ab Mitte der neunziger Jahre in ausreichender Menge zur Verfugung stehen werden. Daher ist bei der Bewertung der Maglich- keiten der Gentechnik fur die Landwirtschaft nicht vom jetzigen Nahrungsmittelbedarf auszugehen, sondern vom voraussichtlichen Bedarf im Jahre 2000. Selbstverstandlich kann das Problem des Hungers in der Welt nicht allein durch die Gentechnik gelbst werden; sie kbnnte jedoch in Form von ertragreichen und resistenten Pflanzen die ~echnischen Voraussetzungen" fur eine ausreichende Nahrungsmittelversorgung bereitstellen.

2. Pflanzen-Zellbiologie

Die Zellbiologie schafft mit der Entwicklung von Ver- fahren zur Regeneration von Pflanzen aus einzelnen Zellen und zur fjbertragung von Genen auf pflanzliche Zellen die

Grundlagen fur die Anwendung der Gentechnik. Vielfach konnen bestimmte Zuchtziele sowohl durch gentechnische Methoden als auch durch zellbiologische Selektionsverfah- ren erreicht werden. In diesem Abschnitt werden daher auch einige Aspekte der Zellbiologie betrachtet, die fur die Gewinnung von Pflanzen mit neuen Eigenschaften oder fur die Anwendung der Gentechnik von Bedeutung sind. Die Techniken der Pflanzenzellkultur sind bereits im letzten Jahrzehnt in den Blickpunkt des Interesses ge- riickt und in Ubersichten und Monographien beschrieben ~orden[~-'l.

2.1. Vegetative Pflanzeovermehrung

Pflanzen zeichnen sich durch ein grol3es Regenerations- vermbgen aus. Werden Pflanzensprosse oder SproDseg- mente unter geeigneten Bedingungen (hohe Luftfeuchtig- keit und Abwesenheit von Pathogenen) kultiviert, so be- wurzeln diese SproDteile. Diese aus der gartnerischen Pra- xis bekannte vegetative Vermehrungsweise laDt sich auf synthetischen Nahrmedien unter sterilen Bedingungen be- sonders effizient gestalten. Die Ntihrmedien enthalten im einfachsten Falle die zur pflanzlichen Emahrung notwen- digen Salze und Spurenelemente in einer ausgewogenen Mischung, dazu einige Vitamine und Saccharose['].

V

Abb. 1. Zellkulturtechniken zur Mutdntenselektion und Erzeugung transgener Pflanzen. SproOmenstcme (a), Stengelstacke (a), Blattfragmente (e) und Mesophyll- protoplasten (d) sind Explantate. die zur Etablierung von Zellkulturen und auch fOr Gentransfer-Techniken venvendet werden. Rotoplastenfusion fOhrt zu Hybridprotoplasten (e). Die Pflanzenregeneration kann entweder direkt iiber die Ausdifferenzierung von Spmssen an den Explantaten (I-b) stattfinden oder an Calluskulturen (i. k, 0 ) induziert werden, entweder Ober SproBbildung (4) oder Ober die Bildung somatischer Embryonen (I). Rotoplasten regenerieren eine Zellwdnd; durch Zellteilungen ( I ) entwickeln sich Mikrocalli (m), die als Suspensionskulturen (p) weiterkultiviert werden kBnnen und in denen die Bildung somatischer Embryonen induziert werden kann (u). Mikrocalli wachsen auf Agar-Medien zu Callus ( 0 ) heran, der wie oben geschildert zur Differcnzierung gelangt. Durch Zugabe von Pathogentoxinen, Antibiotica oder Herbiziden kBnnen vorzugsweise in den Stadien f - p Mutanten oder Transformanten in vitro sclektiert werden. SproDkulturen (a), sproobildende Calli (4) und Embryokulturen werden zur Vermehrung von Genotypen venvendet (s, v). Somatische Embryo- nen lassen sich zu artifiziellem Saatgut aufarbeiten (w).

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In einem phytohormonfreien Medium wachsen SproD- knospen oder Sproljmeristerne zu vollstandigen Pflanzen heran. Enthiilt das Kulturmedium allerdings Phytohormo- ne, so hangt die Reaktion der Explantate vom Verhaltnis der Auxin- zur Cytokinin-Konzentration im Medium abi9]. Sind beide Phytohormone in ausreichender Konzentration vorhanden, bildet sich typischerweise an den Wundran- dem des Explantats ein undifferenziertes Gewebe, welches als Callus bezeichnet wird. Dabei ist es gleichgultig, ob das Explantat ein Blattfragment, ein Stengelstuck oder eine Wunel ist. Wird ein solcher Primarcallus in regelmaDigen Abstanden auf frisches Medium transferiert, kann er unbe- grenzt lange vermehrt werden.

Uberwiegt Cytokinin im Medium, begiinstigt ein solches Medium die Bildung von SproSknospen, sowohl an Pri- marexplantaten als auch an bereits gebildeten Calli. Aller- dings hlngt die Fahigkeit zur SproBdifferenzierung stark vom Genotyp ab. Bei einigen Pflanzenarten, beispielsweise bei Tabak, gelingt die SproDregeneration und damit die Pflanzenregeneration praktisch mit jedem Explantat und selbst mit Callus, der bereits jahrzehntelang kultiviert wur- del’ol. Bei anderen Pflanzenarten, so bei der Sojabohne, ge- lingt die SproDregeneration aus etablierten Calluskulturen hingegen nicht.

Die SproBregeneration ist fur die Herstellung transgener Pflanzen nach den iiblichen Methoden (Abschnitt 3) eine notwendige Voraussetzung. Alternative Wege zur SproBre- generation sind in Abbildung 1 dargestellt. In vitro kulti- vierte Sprosse produzieren auf cytokininhaltigen Kultur- medien Adventivsprosse, so daD sich in kurzer Zeit aus ei- nem SproD Tausende von Individuen des gleichen Geno- typs produzieren lassen. Bisher ist diese Art der vegetati- ven Vermehrung aufgrund des hohen manuellen Aufwan- des nur bei wenigen Kulturen wirtschaftlich (Ornamental- pflanzen, Kartoffell’ ’]).

Bei einer Reihe von Nutzpflanzen, so auch bei Luzer- nel”], Sojabohne‘”] und Rapst141, kann in Zellkulturen die Bildung somatischer Embryonen induziert werden. Soma-

tische Embryonen entstehen im Gegensatz zu den zygoti- schen (sexuellen) Embryonen der Samen aus somatischen Zellen (Abb. 1 bis 3).

Somatische Embryonen lassen sich in beliebigen Men- gen in synthetischen Medien kultivieren. Im LabormaS- stab konnte bereits gezeigt werden, daR es moglich ist, so- matische Embryonen zusammen mit einem Nghrstoffvor- rat einzukapseln, kurze Zeit zu lagern und dann zum Aus- keimen zu bringen[”]. Solche biotechnisch erzeugbaren und in Polymerkapseln eingeschlossenen Hanzenembryo- nen werden als ,,artifizielles Saatgut“ bezeichnet. Bei wei- terer Vervollkommnung der Technik ist es denkbar, sol- ches artifizielles Saatgut wie herkommliches Saatgut auf das Feld auszubringen. Damit ware eine leistungsfahige und wirtschaftliche Form der vegetativen Vermehrung von Elitegenotypen moglich.

2.2. Protoplasten

Protoplasten sind zellwandlose pflanzlche EinzeheNen, die durch Verdauung der Zellwlnde mit hydrolytischen Enzymen (Pectinasen, Hemicellulasen und Cellulasen) aus Pflanzengewebe gewonnen werden konnen. Aus 1 g Blatt-

Abb. 3. Pflanzenregeneration aus Protoplasten der Luzerne (Medicago sail- ua). a) Frisch isolierte Protoplasten (Tag I ) : b) Vier-Zellen-Stadium (Tag 4): c) Mikrocallus (Tag I I ) : d) beginnende Embryogenese (dichtgepackte Zel- len im Zentrum des Mikrocallus) (Tag 14); e) Auskeimung der somatischen Embryonen (5. Woche): f) Regeneratpflanze (8. Woche nach Protoplasten- isolierung).

Abb. 2. Luzernecallus (weill) mi1 beginnender Ausdifferenzierung von soma- tischen Embryonen (grh) .

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gewebe konnen mehrere Millionen Mesophyllprotoplasten freigesetzt werden. 1971 ist es erstmals gelungen['61, aus Mesophyllprotoplasten des Tabaks Pflanzen zu regenerie- ren. Inzwischen sind Regenerationsmethoden fur eine Reihe von Nutzpflanzen ausgearbeitet worden, so fur

Kartoffel1"I, T ~ m a t e ~ ' ~ ~ , LuzemeIz0l und Reis12'I. Abbildung 3 zeigt die Entwicklung von Luzemeprotopla- sten zur vollstandigen Pflanze. Protoplasten sind beson- ders interessant, weil sie Makromolekule wie aber auch Zellorganellenizsl und Chromo~omen~*~~ aufnehmen konnen. Aufbauend auf diesen schon langer zuriickliegen- den Beobachtungen wurde in den letzten Jahren ein Ver- fahren zum direkten DNA-Transfer in Protoplasten ent- wickelt (siehe Abschnitt 3).

2.2.1. Protoplastenjksion

Pflanzliche Protoplasten kbnnen unter verschiedenen Bedingungen fusionieren; dazu gehoren die Anwesenheit von Ca*+-Ionen und pH-Werte uber 9.5Iz5] sowie die An- wesenheit von Polyethylenglyco11261 oder Dimethylsulf- o ~ i d l ~ ~ l . Auch kurze elektrische Spannungsimpulse1281 wir- ken fusionsauslosend. Es ist moglich, Protoplasten beliebi- ger Pflanzen zu verschmelzen. Im allgemeinen sind die Fu- sionsprodukte aus Protoplasten unterschiedlicher Pflan- zengattungen sehr schwer regenerierbar. Nur in wenigen Fallen ist bisher die Regeneration von Gattungshybriden moglich gewesen, die allerdings nicht fertil waren129.301. Ein bekanntes Beispiel ist die Tomatoffel. Diese somatische Hybride ist von groBer theoretischer Bedeutung, zeigt sie doch, daB uber Protoplastenfusionen Hybride erhalten werden kbnnen, die auf sexuellem Wege nicht zuganglich sind. Fertile Hybridpflanzen sind durch Verschmelzung der Protoplasten nahe verwandter Pflanzen erhaltlich, auch wenn sich diese nicht sexuell kreuzen la~sen[~". Sind in den Genomen der beiden zu fusionierenden Protopla- sten unterschiedliche selektierbare Marker-Gene vorhan- den, konnen die somatischen Hybriden leicht in einem Se- lektionsmedium getrennt werden. In jungster Zeit erlangt ein Verfahren der Protoplastenfusion starkere Beachtung, dessen Prinzip bereits 1980 beschrieben wurde~"I. Donor- protoplasten, deren Genom durch starke Rbntgenstrahl- ung fragmentiert wurde, werden mit unbestrahlten Emp- Wngerprotoplasten fusioniert. In einigen Hybridprotopla- sten werden dabei Fragmente des Donor-Genoms in das Acceptor-Genom integriert. Enthalt das Donor-Genom Gene, deren Aktivitat sich in der Auspragung von Resi- stenzen manifestiert, ist es moglich, diese Rekombinanten zu selektieren. Auf diesem Weg ist es gelungen, ein Chro- mosomenfragment aus Karotten, auf welchem ein Resi- stenz-Gen gegen das Antibioticum Methotrexat lokalisiert ist, in Tabakprotoplasten zu iibertragen. Die aus den Hy- bridprotoplasten regenerierten Pflanzen ahneln Tabak- pflanzen und weisen neben der iibertragenen Methotrexat- resistenz noch einige weitere Karotten-Gene in ihrem Ge- nom auf["]. Die Pflanzen sind fertil, d. h. sie produzieren Samen und vererben die Methotrexatresistenz ihren Nach- kommen. Diese Methode der asymmetrischen Protopla- stenfusion konnte ein Weg sein, auch mehrere oder gar un- bekannte Gene iiber die Artgrenzen hinweg zu iibertragen, ohne gentechnische Methoden anzuwenden.

2.3. Mutantenselektion in vitro

Durch Protoplastenisolation ist es moglich, bei vielen Pflanzenarten groDe Populationen homogener, diploider, totipotenter Zellen zu gewinnen und wieder zu Pflanzen zu regenerieren. Schon friih bei der Entwicklung der Proto- plastentechnologie wurde versucht, Protoplastenpopula- tionen zur Mutantenselektion zu verwendenl3'1. Immerhin kbnnen sich in einer Petrischale 1-5 Millionen Protopla- sten und damit potentielle Pflanzen befinden. Gelingt es, in dieser Zellpopulation Mutationen auszuldsen und die Mutanten anschlieBend zu selektieren, sollte es moglich sein, Pflanzen mit neuen Eigenschaften zu regenerieren.

Allerdings sind Protoplasten keine Vorbedingung fur die Mutantenselektion; jede gut regenerierbare Pflanzenzell- kultur eignet sich hierfur. Inzwischen gibt es Berichte, die eine erfolgreiche Selektion von Mutanten aus Pflanzenzell- kulturen beschrieben, darunter pathogenresistente Pflan- Zen (Tabelle 2) und herbizidresistente Pflanzen (vgl. Ta- belle 5). In erster Linie wurden auf diesem Weg Mutanten oder Varianten gefunden, die durch einen Selektionsdruck - Zugabe von Enzyminhibitoren, Pathogentoxinen oder Herbiziden zum Zellkulturmedium - bereits auf dem Zell- niveau selektiert und isoliert werden konntenisol. Auffallig ist, daB diese Varianten auch in Experimenten gefunden wurden, bei denen die Mutationsrate nicht durch chemi- sche oder physikalische Mutagene erhoht wurde.

Tabelle 2. Regeneralion pathogenresistenter Nutzpflanzen aus Zellkulturen (modifizien nach 1351).

Kulturpflanze Pathogen Lit.

a ) nach in-uitro-Selektion auf Pathogentoxinreristenz Tabak Pseudomonas tabaci (Nicotiana tabacum) Alternarra solani Kartoffel Phyrophtora infestans (Solanurn luberosum) Fusarium oxyspomm

Tomate Fusarium oxysponim (Lycopersicon esnrlen- rum) Raps Phoma lingam (Brassica napus) Luzerne Fusarium oxysponim (Medicago sariua) Verticillium alboatmm Mais Helminthosporium maydis (Zea mays)

Erwinia carotouora

1411

b) an Regeneratpfanzen beobachtere ResistenZen ohne uorausgegangene in- uifro-Selektian

Kartoffel

Tabak Tomate

Alternaria solani Phytophtora infestans Kartoffel-y-Virus Kartoffel-Blattroll-Virus Tabak-Mosaik-Virus Tabak-Mosaik-Virus

2.3.1. Somaklonale Variation

Die beschriebene hohe Variabilitat scheint durch den ProzeD der in-vitro-Kultur selbst ausgeliist zu werden, be- sonders dann, wenn die Zellkulturen langere Zeit als un- differenzierte Zellen kultiviert werden. Unter solchen Be- dingungen konnen Chromosomenmutationen besonders leicht akk~mulieren[~". Allerdings kann nur ein Teil der beobachteten Variabilitat durch den Verlust einzelner

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Chromosomen oder durch iiberzlhlige Chromosomen er- klart werden. Fur diese durch die Zellkultur selbst ausgelo- ste Variabilitat wurde der Ausdruck ,,somaklonale Varia- tion'' gepragt15*]. Es liegt nahe, diese Variabilititsquelle fur Ziichtungsprogramme zu n u t ~ e n [ ~ ~ ] . Inzwischen gibt es zu- nehmend Hinweise, daR unter dem StreR der in-vitro-Kul- tur Mechanismen in Pflanzenzellen aktiviert werden, die zur Umorganisation des Genoms fiihren['41. Beim Mais ist beispielsweise nachgewiesen worden, daR ,,springende Gene" durch die in-vitro-Kultur aktiviert werden kon- nen~"].

2.4. Bedeutung der Zellbiologie fur die Gentechnologie

Der Beitrag der Pflanzen-Zellbiologie fur die Gentech- nologie besteht darin, kompetente, d. h. transformierte Pflanzenzellen bereitzustellen, DNA zu iibertragen und aus den transformierten Zellen Pflanzen zu regenerieren. Bei wichtigen Kulturpflanzen wie Sojabohne, Baumwolle und den Getreidearten mit Ausnahme von Reis sind diese Voraussetzungen bisher noch nicht im notigen Umfang ge- geben. Die Zellkultursysteme solcher schwierig regenerier- baren Arten miissen somit weiter verbessert werden. Ideal ware es, Protoplasten auch dieser Kulturpflanzen regene- rieren zu konnen, da Protoplasten zur direkten Aufnahme und Integration von Fremd-DNA fahig sind.

Eine Hoffnung, daR Fortschritte auch bei den Getreide- arten moglich sind, gibt die von drei Arbeitsgruppen kiirz- lich mitgeteilte erfolgreiche Regeneration von Reispflan- zen aus Protoplasten[2'1. Dieser Durchbruch gelang, nach- dem embryogene Suspensionskulturen als Ausgangsmate- rial zur Isolierung von Protoplasten verwendet wurden.

3. Transfer von DNA

3.1. D as Agrobactenum-tlrmefaeiens-System

3.1.1. Turnorbildung

Bis vor kunem war es nicht moglich, fremde Gene in pflanzliche Zellen zu transferieren. DNA konnte zwar aus

HZN.

Pflanzen isoliert und charakterisiert werden; die Funktio- nen bestimmter DNA-Sequenzen waren aber wegen der mangelnden Transfermoglichkeit nur schwer zu analysie- ren. Ein Ausweg aus diesem Dilemma ergab sich uber- raschenderweise bei Untersuchungen zur Entstehung pflanzlicher Tumoren, der Wurzelhalsgallen (,,crown galls"). Dies sind undifferenzierte Zellwucherungen, die nach Infektion einer Pflanze durch das gram-negative Bo- denbakterium Agrobacterium tumefaciens entstehen (Abb. 4). Es stellte sich namlich heraus, daR die Bildung der Tu- moren durch Einschleusung bakterieller DNA in pflanzli- che Zellen verursacht

Abb. 4. Undifferenziert wachsendes Tumorgewebe (Wurzelhalsgalle) am Stengel einer Tomate nach lnfektion der Wundstelle mit Agrobacterium rume- faciens.

Agrobacterium tumefaciens ist ein Bodenbakterium, das eine groI3e Anzahl dikotyler Pflanzen wie Tabak, Tomate, Karotte und Kartoffel nach Verwundung infizieren kann"']. An

Octopln-Famllle 'c-NH-(CHJ-CH-COOH H,N-(cH,),-CH-COOH I I I I

H N~ NH NH

H3C-CH-COOH H,C-CH-COOH

Octopin Lysopin

der Infektionsstelle setzt ein starkes undiffe-

H,N-(CH,),-CH-COOH HN'+H,-CH-COOH I

Y H I t N Y H H ~ C - ~ H - C O O H H~C-CH-COOH

Octopinsaure Histopin

H O H , C - ( C H O H ) ~ - C H ~ HOH,C-(CHOH),-CH~ HOH,C-(CHOH),-CH, HOHZC-(CHOH)3

I I I NH NH

( CH ,) ,- CON H, I I HOOC-CH-(CH,)2-CONH, HOOC-CH-(CH,),-COOH

Agropln-Famllle

0

Ag ropi n Mannopin Mannopinsaure Agro pin sau re

Abb. 5. Chemische Struktur der Opine (Daren aus [61]). Eine vierte Klasse. die Agrocinopine, sind phosphorylierte Zucker unbekannter Struktur.

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renziertes Zellwachstum ein, das zu den oben genannten Gallentumoren fiihrt. Die Tumoren k6nnen auch in Abwe- senheit von Agrobakterien wei te r~achsen~~"~. Zwei Eigen- schaften des Tumorgewebes sind besonders hervorzuhe- ben: Der Tumor proliferiert ohne Zugabe von Pflanzen- hormonen (Auxinen und Cytokininen) auf sterilen Nahr- medien definierter Zusammensetzung, wohingegen diese Hormone fur das Wachstum normalen Zellgewebes essen- tiell ~ ind~ '~ ] . AuBerdem synthetisiert der Tumor spezifische Metabolite, die in anderen Pflanzengeweben nicht vor- kommen: die Opine sind Aminosaure- oder Zuk- kerderivate, die nur von Agrobakterien als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle genutzt werden konnen, fiir Pflanzen je- doch nicht verwertbar sind159,601. Die in Pflanzentumoren bisher gefundenen Opine werden in vier Klassen unterglie- dert: Nopaline, Octopine, Agropine und Agrocinopine (Abb. 5)16".

Ein Agrobakterienstamm kann, mit gewissen Abwei- chungen, nur Opine der Klasse venverten, deren Synthese er in der Pflanze induziert. So kann ein Bakterium, das Nopalin induziert, kein Octopin metab~lisieren~~'~. Ent- sprechend den Opinen wurden auch die Agrobakterien in Klassen unterteilt; hierbei sind die Nopalin- und Octopin- klassen am besten charakterisiert.

3.1.2. Das Ti- Plasmid als tumorinduzierendks Prinzip

Das hormonunabhangige Wachstum der Gallentumoren ohne Agrobakterien und die Opinbiosynthese fiihrten zu

1 kb l-4

LB

dem SchluD, daD das Agrobakterium ein ,,tumorinduzie- rendes Prinzip" auf die Pflanze ubertragen miisse1'*]. Auf der Suche nach diesem Prinzip wurde entdeckt, daB infek- tiose Bakterien ein ca. 200 Kilobasen (kb) grol3es Mega- plasmid enthalten, das Ti-Plasmid (Ti = Tumor induzie- rend)1631. Wurde das Plasmid aus Agrobucteriurn furnefu- ciens entfernt, verloren die Agrobakterien ihre Fahigkeit, Pflanzentumoren zu induzieren. Nach Wiedereinschleusen des Plasmids waren sie aber wieder dazu imstande. Das Plasmid wurde als das gesuchte ,,tumorinduzierende Prin- zip" identifiziertlwl. Auf diesem Ti-Plasmid fand man so- wohl die Gene, die ein hormonunabhangiges Wachstum des Tumors bewirken, als auch die an der Opinbildung und -verwertung beteiligten Gene (Abb. 6)160,65-681.

Vom gesamten Ti-Plasmid wird nur ein relativ kleiner Bereich stabil in das Pflanzen-Genom integriertt70-721. Der Transfer von DNA in Pflanzenzellen ist also ein natiirli- cher ProzeB, den Agrobacteriurn turnefaciens schon seit Ur- zeiten praktiziert. Der integrierte DNA-Bereich, die ,,T- DNA", urnfafit ca. 20 kb. Auf der T-DNA sind sowohl die fiir die Opinbiosynthese als auch die fiir das Tumorwachs- tum maBgeblichen Gene lokali~iertl~~. '~~.

Die T-DNA-Bereiche der Octopin- und Nopalinbakte- rien haben neben auffalligen Gemeinsamkeiten auch meh- rere signifikante Unterschiede. Wahrend die Nopalin-T- DNA ein einzelnes, ca. 23 kb groBes DNA-Fragment auf dem Ti-Plasmid ist und auch als solches ubertragen wird, ist die Octopin-T-DNA in zwei benachbart liegende Berei- che von ca. 14 kb (,,left T-DNA', TL) bzw. ca. 7 kb (,,right

Octopin-TL- DNA TR - DNA

Tumorbildung 1__

RB

.Y Aux Cyt / _Iy

Tumorbildun g

, \ Nopalin-T-DNA

Vir Nopalin - Ti - Plasmid l c a . 2 0 0 k b l

Noc

Rep Inc

Abb. 6. Genetische Organisation eines Ti-Plas- mids. Unterer Teil: Funktionell charakterisierte Bereiche eines Nopalin-Ti-Plasmids. Tra: Funk- tionen zum Transfer des Plasmids zwischen Bak- terien; Noc: Nopalin-Katabolismus; Rep: Funk- tionen zur Replikation des Plasmids in Agrobak- terien; Inc: Funktionen, die die lnkompatibilitlt von zwei verschiedenen Ti-Plasmiden in einer Agrobakterienzelle bewirken. Ein Nopalin- und ein Octopin-Ti-Plasmid k h n e n 2.B. nie in der gleichen Zelle vorkommen; Vir: Virulenzbereich; T-DNA: in das Pnanzen-Genom integrierter DNA-Bereich. - Oberer Teil: Vergleich der T- DNA von Nopalin- und Octopin-Ti-Plasmiden. Polyadenylierte Transkriptc sind mit Pfeilen bzw. Balken gekennzeichnet, j e nachdem, ob die Transkriptionsrichtung bekannt ist oder nicht. Die Nomenklatur der Transkripte richtet sich nach [69]. Die in beiden T-DNA-Sequenzen ho- mologen Bereiche sind geschwlrrt. nos: Nopa- lin-Synthase-Gen; ocs: Octopin-Synthase-Gen; acs: Agrocinopin-Synthase-Gen; Aux: Gene der Auxinbiosynthese; Cyt: Gen der Cytokininbio- synthese; RB: Rechte Bordersequenz; LB: Linke Bordersequenz.

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T-DNA", TR) ~nter te i l t [~~. '~] . TL und TR werden unab- hangig voneinander an verschiedenen Stellen des Pflan- Zen-Genoms integriert[7s.761. TL-DNA und Nopalin-T- DNA enthalten einen sehr homologen, ca. 9 kb langen Nucleotidbereich, auf dem die Gene 5, 2, 1, 4, 6a und 6b lokalisiert sind["] (Abb. 6). Die Funktion der bekannten Gene ist in Tabelle 3 zusammengefafit. Zumindest drei die- ser Gene (1,2 und 4) sind fur das Tumorwachstum infizier- ter Pflanzen zustandig. Da in Wildtyp-Agrobakterien alle drei Gene aktiv sind, werden sowohl Auxine als auch Cy- tokinine gebildet, was zu Tumoren rnit vollig undifferen- ziertem Wachstum fuhrt (vgl. Abb. 4). Agrobakterien mit inaktiviertem Gen 4 (viel Auxin, kein Cytokinin) induzie- ren das Wurzelwachstum der Tumoren. Gen 4 verhindert somit die Ausdifferenzierung von Wurzeln (,,roi gene: root inhibition gene"). Durch Inaktivierung der Gene 1 und 2 (viel Cytokinin, kein Auxin) wird die SproDbildung indu- ziert. Die Gene 1 und 2 verhindern also die Bildung von Sprossen (,,shi genes: shoot inhibition gene^‘‘)[^'^*^^.

Tabelle 3. Funktionen der T-DNA-Gene. Die Funktionen der zusPtzlich in Abb. 6 aufgefohrten Gene sind noch unklar.

Gen Funktion Protein Lit.

1 Auxinbiosynthese Tryptophan-2-Monooxygenase I771

2 Auxinbiosynthese Indolacetamid-H ydrolase I781

nos Nopalinbiosynthese Nopalin-Synthase I791

ocs Octopinbiosynthese Octopin-Synthase I801

4 Cytokininbiosynthese Isopentenyl-Transferase I811

5 Tumorwachstum I781 6a Opinsekretion (821 6b Tumorwachstum I831 0' Umwandlung von I841

I ' Mannopinbiosynthese (841

2' Mannopinbiosynthese (841

Mannopin in Agropin

T-DNA-Gene sind demnach fur das Tumorwachstum verantwortlich. Fur die eigentliche Pflanzeninfektion und fur die Integration der T-DNA in das pflanzliche Genom sind sie aber nicht erforderlichlS6l. Durch Deletionen von Bereichen des Ti-Plasmids wurde gezeigt, daD nur zwei Be- reiche fur die Infektion und Integration notwendig sind. Dies sind zum einen die Virulenzregion (,,Vir") und zum anderen die Randregionen der T-DNA (die sogenannten ,,Borders"). Die Borders bestehen aus zwei je 25 Basen- paaren (Bp) langen, fast ubereinstimmenden Nucleotidse- q ~ e n z e n l ~ ~ . ~ ~ ~ , die bei allen T-DNA-Typen sehr stark kon- serviert sind (Abb. 7). Beliebige, bis zu 50 kb lange DNA-

GCTGG TGGCAGGATATATTG TG GTGTAAAC AAATT

GTGTT TGACAGGATATATTG GC GGGTAAAC CTAAG

Nopalin LB

Nopalin RB i n AGCGG CGGCAGGATATATTC AA TTGTAAAT GGCTT Octopin LB (TL-DNA) I I I I

TGAGC Octopin RB (TL-DNA)

Abb. 7. Vergleich der stark konservierten Bordersequenzen von Nopalin- und Octopin-T-DNA-Bereichen. Homologe Sequenzabschnitte sind eingerahmt. RB: Rechte Bordersequenz: LB: Linke Bordersequenz.

Sequenzen, die zwischen diese Borders inseriert werden, konnen in das Pflanzen-Genorn eingebaut ~erdenl '~]. Der Mechanismus dieses Integrationsprozesses ist noch nicht aufgeklart. Man konnte allerdings zeigen, daD die T-DNA wahrend einer Infektion aus dem Ti-Plasmid ausgeschnit- ten und uber diese 25 Bp langen Randsequenzen zu insta- bilen Intermedilrprodukten zirkularisiert wird["].

Die DNA der ca. 40 kb grol3en Virulenzregion wird selbst nicht in das Pflanzen-Genom integriert17s1. Die Viru- lenz-Gene bewirken aber die Infektiositat der Agrobakte- rienI9l1. Die Vir-Region besteht aus mindestens sechs ver- schiedenen K~mplementationsgruppen~~'.~~~. Zur Bestim- mung einer Komplementationsgruppe wurde eine Muta- tion, die Avirulenz hervorruft, in die Vir-Region einge- fuhrt. Dann wurde versucht, die Virulenz dadurch wieder- henustellen, daB man eine zweite Vir-Region rnit einer Mutation an anderer Stelle in das Bakterium einschleuste. Lagen beide Mutationen in derselben Komplementations- gruppe, blieben die Bakterien avirulent, lagen sie auf ver- schiedenen Gruppen, komplementierten die Gruppen ein- ander, und das Bakterium wurde wieder virulent. Jede Komplementationsgruppe entspricht einer Transkriptions- einheit. Zwei dieser Transkripte werden konstitutiv expri- miert, die restlichen vier werden nur in Anwesenheit von Pflanzenzellen indu~iert~~''. Der Mechanismus der Virulenz- induktion ist ebenfalls noch nicht im Detail erforscht. Da Agrobakterien in der Natur nur verwundete Pflanzenzellen infizieren, wurde vermutet, daB von diesen Pflanzenzellen bestimmte Stoffe synthetisiert werden, auf die die Bakte- rien ,,reagieren". Zwei dieser Verbindungen, Acetosyrin- gon 1 und a-Hydroxyacetosyringon 2, konnten bisher iso- liert werden (Abb. 8). Diese phenolischen Verbindungen

oq ,CH3 F

CHPOH 00 / F

H3C0 Q O C H 3 OH H 3 c o G OH OCH,

1 2

Abb. 8. Die beiden bisher identifizierten Verbindungen. die von verwundeien Pflanzenzellen synthetisiert werden und die Virulenzregion aktivieren: Ace- tosyringon 1 und a-Hydroxyacetosyringon 2.

treten mit den Produkten der beiden konstitutiv exprimier- ten Virulenz-Gene in Wechselwirkung und regen so die Aktivitat der vier anderen Vir-Loci an[93.941. Neben den Borders und der Vir-Region des Ti-Plasmids existieren in Agrobakterien noch mindestens zwei chromosomale Loci, die fur die Anheftung der Bakterien an die Pflanzenzell- wande maRgeblich ~ i n d ' ~ ~ . ' ~ ] .

3.1.3. Agrobacterium tumefaciens als Genvektor

Die Kenntnis dieser fundamentalen Prozesse bei der In- fektion von Pflanzenzellen durch Agrobacterium tumefa- ciens fuhrte zur Etablierung von prinzipiell zwei Metho- den, fremdes genetisches Material in eine Pflanze einzu- schleusen: entweder rnit ,,integrativen Vektoren" oder mit ,,binaren Vektoren". Bei der Konstruktion der jntegrati- ven Vektoren" macht man sich zunutze, daD die tumorin- duzierenden Gene nicht fur die eigentliche Infektion notig

398 Angew. Chem. 99 (1987) 392-412

sind, und daB beliebige DNA-Sequenzen, die zwischen die beiden Border-Sequenzen inseriert werden, auch in Pflan- Zen ubertragen werden. Bei diesen integrativen Vektoren wurden z. B. die Tumor-Gene der T-DNA durch Sequen- Zen des E.-coli-Klonierungsvektors pBR 322 ersetzt1"I. Fremde DNA, die in das Pflanzen-Genom integriert wer- den soll, wird einfach in E. coli in einem pBR-Vektor klo- niert und dann durch homologe Rekombination iiber diese pBR-Sequenzen in das Ti-Plasmid inseriert (Abb. 9).

A. fumefaciens IpGV 38501 l R i f R . CorbRl

Einfoches "crossover 'I X

Selektion auf R i f R ; CorbR ; SmR ; SpR

Abb. 9. Schemazeichnung der Einriihrung eines pBR-Vektors aus E. coli in ein modifiziertes Ti-Plasmid von Agrobacterium rumefaciens (modifizien nach [SSl). Antibiotica: Carb = Carbenicillin; Rif = Rifampicin; Sm = Strep- tomycin: Sp = Spektinomycin. am = pBR 322-Sequenzen; I P transferiertes Fremd-Gen X ; s = Border-Sequenzen.

Bei der Konstruktion der ,,binlren Vektoren" wird die Tatsache ausgenutzt, daD die Vir-Region und die ,,Bor- ders" auf zwei getrennten Plasmiden lokalisiert sein kon- nen, ohne daD die Infektiositat der Agrobakterien beein- fluBt wirdI9'l. Demzufolge wurden die T-DNA-Borders auf ein Plasmid iibertragen, das sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien repliziert werden kann. Diese Plasmide konnen sehr vie1 kleiner sein als das Ti-Plasmid (ca. 10-20 kb)["I, und die einzelnen Klonierungsschritte konnen leicht in E. coli durchgefiihrt werden. Liegt die in FYlanzen zu transferierende DNA auf einem solchen Plasmid klo- niert vor, wird dieses Plasmid in einen Agrobakterien- stamm iiberfiihrt, der schon ein Ti-Plasmid hat, das zwar noch eine Vir-Region, aber keine T-DNA mehr enthalt. Agrobakterien mit diesen beiden Plasmiden sind ebenfalls imstande, die zwischen den Borders gelegene DNA stabil in das Pflanzen-Genom zu integrieren.

3.1.4. Methoden des Centransferrs mk Agrobacterium tumefaciens

Voraussetzung fur einen DNA-Transfer von Agrobacte- rium turnefaciens in Pflanzen ist eine Infektion von Pflan-

zenzellen durch das Bakterium. Die Infektion von Pflan- zengeweben mit Agrobacterium tumefuciens ist relativ ein- fach durchzufiihren. Im einfachsten Falle werden Pflanzen mechanisch, z. B. rnit einem Skalpell, verwundet, und auf die Wundstelle wird eine Agrobakteriensuspension appli- ziert.

Bessere Transformationseffizienzen werden durch Inku- bation von Gewebeteilen rnit Agrobakterien und anschlie- Dende Kultivation des Gewebes auf synthetischen Nlhr- rnedien erreicht. So werden bei der ,,leaf disc"-Methode kleine Blattstiicke in eine Bakteriensuspension getaucht und danach weiterkultiviert[wl. Wird durch die Agrobakte- rien ein selektierbares Marker-Gen, z. B. das Resistenz- Gen gegen das pflanzentoxische Antibioticum Kanamycin, iibertragen (siehe Abschnitte 3.3 und 4.1), lassen sich auf kanamycinhaltigen Nahrmedien nur aus transformierten Zellen der Blattstucke neue Pflan/en t cgenerieren (Abb. 10).

Abb. 10. Gewinnung einer transgenen Pflanze durch Ubertragung eines Resi- stenz-Gens gegen das pflanzentoxische Antibioticurn Kanamycin. a) Blatt- fragmente nach Transformation mit Agrobacterium tumefaciens. Transfor- mierte (rechts) und nichttransformierte Blattfragmente (links) werden auf ka- namycinhaltiges NIhrmedium gelegt. Nur an den transformienen Blattstfik- ken ktinnen sich Sprosse bilden. b) Aus einem SproD regenerierte transgene Tabakpflanze (nchts) und nichttransformierte Tabakpflanze (links) auf ka- namycinhaltigem NIhrmedium. Nur die transformierte Pflanze Obcrlebt.

Auch die als Cokultur bezeichnete Inkubation von Pflanzenprotoplasten mit Agrobakterien und anschlie- Dende Regeneration der behandelten Protoplasten zu Pflanzengewebe oder intakten Pflanzen fuhrt zu guten Transformationsausbeuten' 'Ool.

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Den Vorteilen des Agrobakterien-Systems, z. B. einfache Transformationstechnik und gute Transformationsfre- quenz, steht allerdings ein grorjer Nachteil gegeniiber: der eingegrenzte Wirtsbereich des Agrobakteriums. Zwar sind sehr viele dikotyle und auch einige monokotyle Pflanzen der Familie der Liliaceue, z. B. Asparagus officinalis (Spar-

und Chlorophytum capense (Griinlilie)['o'bl, suszep- tibel fur eine lnfektion; bei den okonomisch wichtigen Gramineen konnte aber rnit Ausnahme von Mais[Ioz1 bisher keine Suszeptibilitat fur Agrobacterium tumefaciens nach- gewiesen werden.

3.2. Direkte Transformation von Pflanzenzellen mit isolierter DNA

Wegen des begrenzten Wirtsbereiches der Agrobakterien wurde parallel nach anderen Methoden gesucht, um gene- tisches Material in Pflanzen einzuschleusen. Als erfolg- reichste Methode erwies sich dabei bisher die Transforma- tion von Pflanzenprotoplasten rnit isolierter DNA["'* wie sie schon bei Bakteried"'] und tierischen Zellen[1061 praktiziert worden war. Dabei wird die Fremd-DNA in die Pflanzenzellen ohne Benutzung eines natiirlichen pflan- zeninfektidsen Systems wie Agrobacterium tumefaciens ubertragen. Die zu transformierenden Zellen werden zu- sammen mit der DNA lediglich in einer geeigneten Lirsung inkubiert und bestimmten Verfahren unterworfen, die auch schon in der mikrobiologischen Forschung zur ubertra- gung fremden genetischen Materials verwendet wurden. Dazu gehoren insbesondere Behandlungen rnit Polyethy- lenglycol sowie Hitze- und Elektroschocks (Elektropora- tion). Bei der Elektroporation werden durch kune Elektro- pulse kleine Poren in der Zellmembran erzeugt, durch die DNA in die Zelle eindringen kann['04.'071. So einfach die- ses Verfahren auch scheinen mag, die Schwierigkeiten lie- gen im Detail, da die Versuchsparameter fur jede Pnanzen- spezies optimiert werden miissen.

Die direkte Transformation hat den unbestrittenen Vor- teil, darj sie bei allen protoplastierbaren Pflanzen ange- wendet werden kann. Dazu gehoren neben vielen dikoty- len Pflanzen auch einige Gramineen. So gelang es bisher unter anderem, Fremd-DNA in Protoplasten von Reis (Or- yza satiua)['081, Mais (Zea mays)['0g1 und Weizen (Triticum monococum)l'lol einzuschleusen.

Ein Nachteil der direkten Transformation von Protopla- sten gegeniiber der Transformation mit Agrobacterium tu- mefaciens ist jedoch, daB die Regeneration von intakten Pflanzen aus Protoplasten sehr vie1 langer dauert als die Regeneration aus Gewebeteilen. Der groBte Nachteil der direkten Transformation besteht allerdings darin, daR trotz intensivster Forschung bei den Getreiden bisher nur der Reis aus Protoplasten zur intakten Pflanze regeneriert wer- den konnte[*'I.

3.3. Andere Methoden des Gentransfers

Da bei den bisher diskutierten Transformationsmetho- den die erwahnten Nachteile (enger Wirtsbereich der Agrobakterien, mangelnde Regenerationsflhigkeit der wichtigsten Nutzpflanzen) noch nicht in befriedigender Weise iiberwunden werden konnten, wurden auch andere

Transformationsmethoden erforscht. Dazu gehort das Ein- schleusen von genetischem Material durch pflanzenpatho- gene Viren. Die meisten Pflanzenviren gehoren zwar zur Gruppe der RNA-Viren, da aber das molekularbiologische Arbeiten mit RNA ungleich schwieriger ist als rnit DNA, wurde hauptsachlich rnit DNA-Viren experimentiert. Bis- her sind erst zwei Klassen von pflanzenpathogenen DNA- Viren bekannt, die als DNA-Vektoren verwendet werden konnten: die Gemini- und die Caulimoviren["ll. Das mit Abstand am besten charakterisierte DNA-Virus, das zur Klasse der Caulimoviren zahlende ,,Cauliflower Mosaic Virus" (CaMV), wurde schon zur Ubertragung von Gen- material in Pflanzen benutztf"2'. Bei CaMV ist es aber auf- grund der besonderen Genomstruktur des Virus nur mog- lich, sehr kleine, bis ca. 500 Nucleotide lange DNA-Stucke in das Virus-Genom zu integrieren. Zudem ist CaMV we- gen des engen Wirtsbereichs (nur Pflanzen der Familie der Brassicaceae) und der Tatsache, darj Virus-DNA nicht sta- bil in das Pflanzen-Genom eingebaut wird, kein universel- les Transformationssystem.

Zur Umgehung der bei vielen Arten immer noch schwie- rigen Regeneration von Protoplasten wurde versucht, DNA direkt in bestimmte Gewebe zu transferieren. So wurde von mehreren Autoren beschrieben, darj nach lnku- bation von Pollen mit Fremd-DNA und anschlierjender Bestaubung von Pflanzen mit diesen Pollen transformierte Nachkommen erhalten worden seien" 1 3 . I 141 . All erdings konnten diese Beobachtungen bisher nicht reproduziert werden" 15].

Die Mikroinjektion von DNA in Zellkerne rnit einer sehr feinen Kaniile ist eine bewahrte Methode zur Genma- nipulation in tierischen Zellen[' 16] . Auch zur Transforma- tion von Pflanzenzellen wurde diese Mikroinjektion ange- ~ende t [ "~ ] . In Anbetracht der sehr groeen pflanzlichen Zellvakuole und des kleinen Zellkerns, in den die DNA injiziert werden muR, ist diese apparativ aufwendige Me- thode aber nicht sehr effizient.

Auch die Injektion von DNA in reproduktive Pflanzen- organe wird praktiziert. Ein Durchbruch scheint hier durch die Injektion von DNA in junge Infloreszenzen von Roggenpflanzen gelungen zu sein['Is1. Nach Injektion eines Resistenz-Gens gegen das pflanzentoxische Antibioticum Kanamycin konnten zum ersten Ma1 resistente, transfor- mierte Roggenpflanzen regeneriert werden.

4. Genexpression in Pflanzen

4.1. Regulationsbereiche pflanzlicher Gene

Die ersten erfolgreichen Versuche, fremde DNA rnit Hilfe des Ti-Plasmids in Pflanzen einzuschleusen, wurden mit den bakteriellen Resistenz-Genen gegen die Antibio- tics Streptomycin und Kanamycin durchgefiihrt[''9s831. Die Gene wurden in die T-DNA inseriert und so in das Pflan- Zen-Genom eingeschleust. Eine Transkription konnte aller- dings nicht festgestellt werden. Das gleiche wurde z. B. auch bei einem Alkohol-Dehydrogenase-Gen aus Hefe['201 und einem b-Globin-Gen['211 aus Saugetierzellen beobach- tet: Die Gene wurden zwar integriert, waren aber in der Pflanze nicht aktiv. Deshalb wurde vermutet. darj be-

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Translations- Beginn startcodon mRNA S'-Bereich

Translations- stopcodon (TAA) Polyadenylierungs-

Ex1 Intl Ex2 IntZ Ex3 - c 4 - Verstarker- element (organspezifitat, Promotor Terminatorbereich Transkriptions- (Eindung RNA- lbeendet Tran- verstirk,,ng) Polymerase I1 an skriptionl

Struktur-Gen - (transkribierter Bereichl

TATA-Box, Licht- regulation in Callus)

Abb. I I . Schemdtischer Aufbau eines pflanzlichen Gens am Beispiel eines sslubisco-Gens. VerstBrker-, Promotor- und Terminator- elemente regulieren die Expression des Struktur-Gens. Das gesamte Struktur-Gen wird transkribiert. Nach dern anschlieoenden Herausschneiden der Introns (Int) werden die als Exons (Ex) bezeichneten Bereiche zur fertigen mRNA zusammengesetzt. un nicht- translatierte Bereiche der mRNA; I translatieate Bereiche der mRNA. Zur nlheren Erkllrung der hier venvendeten Begnffe wird auf (1241 venviesen.

stimmte pflanzenspezifische Transkriptionssignale zur Gen- aktivierung notwendig sind. Aus dem Studium tierischer Systeme war schon einiges iiber den Aufbau funktioneller eukaryontischer Gene bekannt1'221; Pnanzen-Gene zeigen prinzipiell die gleiche S t rukt~r r '~~] . Ein typisches Pflanzen- Gen ist in Abbildung 11 dargestellt. Im nichttranskribier- ten 5'-Bereich eukaryontischer Gene befindet sich eine als Promotor bezeichnete DNA-Sequenz. An die Promotorse- quenz, speziell an eine ca. 10 Bp lange, Adenin-Thymin- reiche Region, die TATA-BOX['~~], bindet das Enzym RNA- Polymerase 11, das die Synthese polyadenylierter eukary- ontischer Transkripte (messenger-RNA) katalysiert. Pro- motorsequenzen sind demnach fiir die korrekte Initiation des Transkriptionsvorgangs zustindig. Die Transkription wird durch DNA-Sequenzen im 3'-Bereich, also am Ende des Gens, beendet. Diese Terminatorsequenzen sind auf bisher noch nicht genau geklarte Weise am Abbruch der Transkription und an der Anheftung der Poly-A-Sequen- zen an die entstandenen RNA-Ketten (Polyadenylierung) beteiligtI'z61. Zur- Expression fremder Gene in Pflanzen wurde daher versucht, Promotor- und Terminatorsequen- zen von solchen Genen zu benutzen, von denen bekannt war, daR sie in allen Pflanzengeweben aktiv sind. Das be- ste Gen hierfiir war damals das Nopalin-Synthase-Gen aus Agrobacteriurn rurnefaciens. Es war i~oliert '~~' , es hatte eu- karyontische Promotor- und Terminatorsequenzen und es wurde, wie aus Transformationsexperimenten mit Wild- typ-Agrobakterien bekannt war, unter anderem auch in pflanzlichem Callusgewebe exprimiert. Die Fusion der Promotor- und Terminatorbereiche an das bakterielle Gen der Chloramphenicol-Acetyltransferase (Resistenz gegen Chloramphenicol) fiihrte dann auch zur ersten Expression eines zusammengesetzten fremden Gens in Pflanzenzel-

Zur Expression von Genen in Pflanzenzellen sind also bestimmte Regulationsbereiche notwendig, die bei der spateren funktionellen Analyse pflanzlicher Gene immer wieder gefunden wurden (Abb. 11).

In der folgenden Zeit wurde hauptsachlich daran gear- beitet, Resistenz-Gene gegen pflanzentoxische Antibiotica als selektierbare Marker in FTlanzen zu exprimieren, um transformierte und nichttransformierte Pflanzenzellen un- terscheiden zu konnen. Es gelang, unter der Kontrolle der Nopalin-Synthase-Regulationssequenzen, bakterielle Resi-

stenz-Gene gegen Kanamycin 3, Hygromycin und Metho- trexat in call6sem Pflanzengewebe zu exprimieren['281. Da- bei beruht 2.B. die Resistenz gegen Kanamycin auf einer Phosphorylierung und damit einer Inaktivierung des Anti- bioticums durch die Expression des transferierten Gens der Neomycin-Phosphotransferase (Abb. 12).

Abb. 12. Chemische Struktur des pflanzentoxischen Antibioticums Kanamy- cin 3 [129]. Die mit einem Pfeil gekennzeichnete OH-Gruppe wird durch das Enzym Neomycin-Phosphotransferase phosphoryliert. Dies fuhrt zur Inakti- vierung des Antibioticums.

4.2. Differentielle Genexpression

Nachdem nun bewiesen war, daB fremde Gene in das Pflanzen-Genom eingeschleust und auch exprimiert wer- den konnen, wurde begonnen, komplexere Regulationsme- chanismen pflanzlicher Gene auf molekularer Ebene zu untersuchen. Zu diesem Zweck muBten aber erst die inte- grativen und binaren Vektorsysteme entwickelt werden, bei denen die Ti-Plasmid-codierten Tumor-Gene deletiert wa- ren (siehe Abschnitt 3.1.3). Erst mit diesen Systemen war es mtiglich, nach der Transformation normal differenzierte Pflanzen zu regenerieren.

Zwei entwicklungsbiologische Phanomene werden der- zeit besonders intensiv untersucht, da ihre Parameter rela- tiv leicht zu definieren sind: zum einen die lichtspezifische und zum anderen die organspezifische Aktivierung be- stimmter Gene.

Die lichtinduzierte Genexpression wird hauptslchlich an den Genen untersucht, die fur die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRubisco)

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und fur das Chlorophyll-a/b-bindende Protein (CAB) co- dieren. Rubisco und CAB sind Schlusselenzyme bei der CO,-Fixierung bzw. bei der Photosynthese der Pflan- ~ e n [ " ~ ] .

Auch die organspezifische Genexpression wird an den erwahnten Genen untersucht, die, neben ihrer lichtabhan- gigen Expression, nur in Chloroplasten enthaltenden Ge- weben (2.B. Blatt und Stengel) aktiviert werden. Eine an- dere wichtige Klasse der spezifisch exprimierten Gene co- diert fur die ernahrungsphysiologisch wichtigen Speicher- proteine'"'! So sind 2.B. die Zein-Gene des Mais (Zea mays) oder die Legumin-Gene der Erbse (Pisum sativum) nur in Samen aktiv, in anderen Organen wie Blatt oder Wurzel jedoch nicht.

Im folgenden sollen einige grundlegende Versuchsan- satze zur Erforschung von Genregulationsmechanismen rnit DNA-Transfermethoden am Beispiel von ssRubisco beschrieben werden.

Das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase macht ca. 50% des loslichen Pflanzenproteins aus und ist somit das haufigste auf der Erde vorkommende Protein. Es setzt sich aus acht identischen groBen Untereinheiten (M, 56 000 Dalton, LS-Rubisco) und acht identischen kleinen Untereinheiten ( M , 14000 Dalton, ssRubisco) zusammen. Wahrend das Gen der grol3en Untereinheit im Chloropla- sten-Genom lokalisiert ist, wird die kleine Untereinheit vom Zellkern codiert. Die ssRubisco-Untereinheiten wer- den im Cytosol gebildet und gelangen nach proteolytischer Abspaltung eines etwa 6000 Dalton groBen Transit-Pepti- des in das Stroma der Chloroplasten. Hier lagern sie sich rnit den in den Chloroplasten gebildeten LS-Rubisco-Un- tereinheiten zum funktionellen Holoenzym zusammen.

Das Enzym Rubisco kann nur im Gewebe belichteter Pflanzen nachgewiesen werden; im Dunkeln hort die Syn- these des Enzyms nach kurzer Zeit a ~ p ' ~ ' ] . Da bei den ins Dunkle gebrachten Pflanzen keine Rubisco-spezifische mRNA mehr nachgewiesen werden kann, wird die Genak- tivitat auf der Ebene der Transkription r e g ~ l i e r t [ ' ~ ~ ] . Zur Transkription eines Gens ist die Bindung der RNA-Poly- merase I1 an die entsprechende Promotorsequenz ndtig. Deshalb wurde vermutet, daB in diesem Promotorbereich eine spezifische Sequenz existiert, die in irgendeiner Weise rnit der lichtabhangigen Expression zusammenhangt. An diese Sequenz konnten z. B. Faktoren binden, die eine Bin- dung der Polymerase an die DNA begunstigen oder inhi- bieren['341. Eine Moglichkeit, diese Hypothese zu untersu- chen, besteht darin, solche DNA-Bereiche zu isolieren und mit Strukturbereichen geeigneter Marker-Gene zu fusio- nieren. Die differentielle Expression dieser chimaren Gene konnte dann in transgenen Pflanzen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein direkt vor der Transkriptions- startstelle eines ssRubisco-Gens liegender, ca. 1000 Nucle- otide langer Bereich dem Gen der bakteriellen Chloram- phenicol-Acetyltransferase vorgeschaltet. Die Expression dieser Konstruktion wurde in transformierten Tabakzellen lichtabhangig reguliert und schien damit die oben ge- nannte Hypothese zu be~tatigen['~']. Mittlerweile konnte durch ahnliche Versuche gezeigt werden, daD ein nur 33 Basenpaare langer DNA-Bereich fur die lichtspezifische Regulation eines ssRubisco-Gens in Callusgewebe aus- r e i ~ h t " ~ ~ ] . Durch diesen Bereich konnte aber keine normal starke Expression des Gens erreicht werden; die Genakti-

vitat war um ein Vielfaches geringer. Daraufhin wurde ein weiteres ,,Verstarkerelement" (siehe Abb. 11) von ca. 250 Bp Lange entdeckt, das - unabhangig von seiner Orientie- rung - die Aktivitat eines sonst konstitutiv wirkenden Pro- motors lichtabhangig verstarkte[""].

Die bisher isolierten pflanzenspezifischen Promotoren konnen in drei Kategorien eingeteilt werden: lichtabhan- gige Promotoren, gewebespezifisch regulierte Promotoren wie diejenigen der Samenspeicherprotein-Gene aus Mais, Weizen, etc., sowie Promotoren konstitutiv exprimierter Gene. Die Expressionshohe transferierter Gene ist in transgenen, d. h. transformierten Pflanzen meist geringer als in den Pflanzen, aus denen die Gene isoliert wur- den[1371. Deshalb sucht man speziell nach Promotoren von Genen, die an sich schon sehr hoch exprimiert werden. Ei- ner der starksten Promotoren, der bisher in Versuchen zur Pflanzentransformation eingesetzt wurde, ist viralen Ur- sprungs. Es ist der konstitutiv wirkende Promotor des 35s- Transkripts des pflanzenpathogenen Cauliflower-Mosaic- Virus, von dem berichtet wurde, er sei ungefahr 30mal star- ker als der Nopalin-Synthase-Promotor[''81. Auf der Suche nach weiteren induzierbaren Genen wurden noch durch Hitze[I3'], Dunkelheit[14"] und Nitrat ind~zierbare l '~ ' ] Gen- sequenzen isoliert.

Promotoren dikotyler Pflanzen scheinen die Expression eines Gens in anderen dikotylen Pflanzen korrekt zu regu- lieren. So wurde, neben vielen anderen Beispielen, ein or- ganspezifisch exprimiertes Samenspeicherprotein-Gen aus der Sojabohne nach dem Transfer in Tabakpflanzen exakt nach dem gleichen zeitlichen und gewebespezifischen Mu- ster exprimiert wie in der S ~ j a b o h n e [ ' ~ ~ ] .

Uber die Funktion von Promotoren monokotyler Pflan- Zen in dikotylen Spezies gibt es hingegen sehr wider- spriichliche Aussagen. Ein CAB-Gen aus Weizen wurde in Tabakpflanzen korrekt t ran~kr ib ie r t [ '~~] , wahrend ein ss- Rubisco-Gen aus Weizen in Tabak nicht aktiv war[1441.

Neben der Starke eines Promotors spielen noch andere Faktoren fur die Expressionshohe eines transferierten Gens eine wichtige Rolle. So wird beim Gentransfer oft- mals nicht nur eine einzige Genkopie in das Pflanzen-Ge- nom integriert; es konnten schon mehr als funf Kopien ei- nes transferierten Gens im Genom transgener Pflanzen nachgewiesen ~ e r d e n " ~ ' ] . Aber selbst bei Beriicksichti- gung der unterschiedlichen Genkopienzahl wird eine groBe Variabilitat in der Expression bei den transgenen Pflanzen eines Transformationsexperimentes beobachtet. Dieses Phanomen wird meist rnit dem Positionseffekt er- klart['451. Bei den Integrationsstellen von transferierter DNA im Pflanzen-Genom ergaben sich bisher bezuglich der Nucleotidsequenz noch keine offensichtlichen Ge- meinsamkeiten; diese Stellen scheinen vollkommen zufal- lig zu sein[1461. Deshalb kann es vorkommen, daR Gene in mehr oder weniger stark transkribierte DNA-Bereiche in- tegrieren und dadurch unterschiedlich stark exprimiert werden. Wegen dieser Variabilitat in der Expressionshohe ein und derselben Genkonstruktion mussen aus einer An- zahl transgener Pflanzen eines Transformationsversuchs diejenigen ausgewahlt werden, welche die gewunschte Ei- genschaft im erforderlichen MaDe auspragen. 1st ein Gen allerdings erst einmal in das Pflanzen-Genom eingebaut, wird es nach den Mendelschen Gesetzen stabil von Gene- ration zu Generation ~ e i t e r g e g e b e n ~ ' ~ ~ ] .

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5. Ziele der angewandten Gentechnik mit Pflanzen

Einige der wichtigsten Ziele der Gentechnik rnit Pflan- Zen sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die erwahnten Ziele sind lediglich Beispiele, die ausgewahlt wurden, um die vielfachen Moglichkeiten des Gentransfers auf Pflan- Zen zu verdeutlichen. Vollstandigkeit wurde nicht ange- strebt.

Tabelle 4. Gentechnik mit Pflanzen ~ mbgliche Anwendungen.

I . Resistenzerzeugung gegen Herbizide Viruserkrankungen pilzliche Erkrankungen Schldlinge Mikroorganismen StreBbedingungen

Veranderung der Aminoslurezusammense~ung oder des F'roteingehalts Verhderung der Zusammensetzung pflanzlicher a le , Kohlenhydrate oder Metabolite Beeinflussung von Inhaltsstoffen, die far Verarbeitung, Lagerung oder TrdnSpOrt von Bedeutung sind

Beeinflussung der Photosynthese undloder Photorespiration

2. Beeinflussung pflanzlicher lnhaltsstoffe

3. Beeinflussung pfianzenphysiologischer Vorgange

4. Beeinflussung der Stickstoflixierung 5. Gentechnik als Hilfsmittel fur die PnanzenzDchtung

Diagnose von Krankheiten Gen- und Genotypencharakterisierung

5.1. Eneugung resistenter Pflanzen

5.1. I . Herbizidresistenz

Der Anbau von Pflanzen, die eine Resistenz gegen Her- bizide aufweisen, gehort seit langem zur landwirtschaftli- chen Praxis, da ,,selektive Herbizide" breite Anwendung finden. Diese Herbizide werden in bestimmten Kultur- pflanzen metabolisch so verandert (z. B. durch Hydroxylie- rung, Konjugation mit Kohlenhydraten oder Glutathion, Desmethylierung), dal3 die herbizide Wirkung verloren geht. Beispiele hierfiir sind Mais rnit Resistenz gegen Atra- in"^'], Weizen rnit Resistenz gegen Di~lofop-Methyl~ '~~~, Zuckerriiben mit Resistenz gegen Phenmedipham~'sol oder Getreidearten mit Resistenz gegen Chlorsulfuron. Die ge- nannten Kulturen haben folglich eine physiologisch be- dingte, naturliche Herbizidresistenz, die vom Landwirt ausgenutzt wird.

Haufig ist beim landwirtschaftlichen Anbau die Anwen- dung mehrerer Herbizide oder die Verwendung von Herbi- zidmischungen erforderlich, da nur so alle auftretenden Unkrauter bekampft werden konnen. Bei Einfuhrung einer Resistenz gegen ein nichtselektives Herbizid kann wahr- scheinlich auf die Anwendung mehrerer Herbizide verzich- tet werden.

Pflanzen rnit einer Resistenz gegen nichtselektive Herbi- zide werden voraussichtlich zu den ersten landwirtschaft- lich nutzbaren Ergebnissen der Gentechnik rnit Pflanzen gehoren. Bei den meisten modernen Herbiziden ist der Wirkort bekannt und biochemisch charakterisiert. Dies ist in der Regel die Voraussetzung fur die Entwicklung von Strategien zur Erzeugung herbizidresistenter Pflanzen mit der Gentechnik. Dieses Ziel erscheint in mehreren Fallen durch die Ubertragung nur eines Gens oder weniger Gene

erreichbar. Weitere Griinde fur die intensive Bearbeitung der Herbizidresistenz sind in den Vorteilen zu suchen, die resistente Pflanzen dem Landwirt bieten:

Bei Anbau resistenter Kulturen wird eine vorbeugende Herbizidanwendung uberflussig. Der Landwirt hat nun die Moglichkeit, das Herbizid erst bei Bedarf einzusetzen, namlich nur dann, wenn die Verunkrautung ein ertriigli- ches MaO ubersteigt. Dies steht im Gegensatz zu der jetzt meist ublichen Praxis, bei der auf eine vorbeugende Herbi- zidanwendung nicht verzichtet werden kann.

Auch die Bodenerosion kann bei Verwendung herbizid- resistenter Pflanzen herabgesetzt werden, denn durch den nun moglichen spiteren Herbizideinsatz laOt sich das Auf- treten freiliegender Flachen verhindern. Es sei erwahnt, daO herbizidresistente Kulturen auch fur das Direktsaat- verfahren["l1 gut geeignet sind. Wegen der moglichen An- wendung von Herbiziden nach dem Schadschwellenkon- zept und des Ersatzes mehrerer verschiedener Herbizide durch ein nichtselektives Herbizid ist langerfristig zu er- warten, dal3 durch herbizidresistente Kulturen der Gesamt- verbrauch an Herbiziden vermindert wird. Hierin ist auch, neben der vereinfachten Anwendung, der wirtschaftliche Vorteil fur den Landwirt zu sehen.

Auch durch Methoden der klassischen Zellbiologie (siehe Abschnitt 2.3) konnen herbizidresistente Pflanzen erhalten werden. Der Zusatz eines Herbizids zum Medium pflanzlicher Zellkulturen ermoglicht die Selektion resisten- ter Calli, aus denen spater herbizidresistente Pflanzen ge- wonnen werden konnen"52. 1531. Am Beispiel einiger neue- rer Herbizide sollen Moglichkeiten zur Gewinnung herbi- zidresistenter F'flanzen durch Zellbiologie und Gentechnik diskutiert werden (Tabelle 5) .

Tabelle 5. Beispiele einiger Herbizide, gegen die eine Resistenz in pflanzli- chen Zellen erzeugt wurde.

, , P C O G C H J 0 QCHJ e

L ~ & ~ ~ - N H - L N H - - ' T (Ho),P-CH,-NH-Cil,-CoOH N"

4 CH3

6

,,-..ic"gh

'+k._yN.6~ H,C-P-3H2-CHZ-~H-C33H

>4H2 t4-CH(LHJ2 Ijn

5 r i$ 7

Herbizid Wirkstoff- Wirkort oder Lit. klasse Wirkmechanismus

4 Sulfometuron- Sulfonyl- methyl harnstoff

5 Imazapyr Dihydro-

6 Glyphosate Aminoslure- imidazolon

Derivat

7 Phosphino- Aminoslure- thricin Derivat (Glufosinate)

Hemmung der Aceto- lactat-Synthetase, da- durch Verhinderung der Biosynthese ver- zweigter Aminosauren wie bei 4

Hemmung der 5-Enol- pyruvylshikimis8ure-3- phosphat-Synthase, da- durch Verhinderung der Biosynthese aro- matischer Aminosau- ren Hemmung der Glut- amin-Synthetase, da- durch Anstieg der in- trazellularen Ammoni- akkonzentration und Hemmung der Protein- biosynthese

1154. 1561

[155. 1571

1153. 159, 1611

[160, 1621

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Relativ neue Herbizide stammen aus den Verbindungs- klassen der Sulfonylharnstoffe und Dihydroimidazolone. Diese Herbizide wirken durch Hemmung des Enzyms Ace- tolactat-Synthetase, das an der Biosynthese der verzweig- ten Aminosauren Leucin, Isoleucin und Valin in Pflanzen beteiligt ist11S4. IJS1. Bei den Sulfonylharnstoffen Chlorsulfu- ron und Sulforneturon-methyl konnten durch Selektion ge- gen diese Herbizide resistente Pflanzen erhalten wer- den['s61. Auch bei den Dihydroimidazolonen gelang die Se- lektion resistenter Pflan~en['~'], die wegen des gemeinsa- men Wirkortes auch Kreuzresistenz gegen Sulfonylharn- stoffe aufweisen.

In beiden Fallen scheint die Ursache der Resistenz ent- weder eine oberproduktion des Enzyms oder eine Muta- tion des Gens zu sein. Beide Moglichkeiten konnen rnit der Gentechnik nach Isolierung des Gens der Acetolactat-Syn- thetase leicht uberpriift und nachvollzogen werden.

Uber die Gentechnik konnen folgende Wege zu herbi- zidresistenten Hanzen fuhren (Wirkort ist in diesen Fallen ein Enzym):

- Veranderung des Wirkortes durch Mutation (2.B. Gly-

- Erhohung der Konzentration des Wirkortes (z.B. Gly-

- Einfuhrung metabolisierender Enzyme.

pho~atel '~*~);

phosate['S91, Phosphinothricinflm1);

Zur Auswahl der gunstigsten Strategie sind genaue Kenntnisse uber den Wirkort und das Abbauverhalten des Herbizids notwendig. Meistens konnen mehrere der ange- gebenen Wege zur Eneugung einer Herbizidresistenz fuh- ren.

Das Herbizid Glyphosate verhindert in pflanzlichen Zel- len die Synthese aromatischer Aminosauren durch Hem- mung des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimisaure-3-phosphat- Synthase (EPSP-Synthase)[l6I1. Glyphosate ist eines der am weitesten verbreiteten nichtselektiven Herbizide. Resi- stente pflanzliche Zellkulturen konnten durch Selektion in Anwesenheit von Glyphosate erhalten werden. Ursache der Resistenz ist eine Erhohung der Konzentration des Wirkorts, die auf einer Zunahme der Genzahl (Genampli- fikation) b e r ~ h t ~ ' ~ ~ ~ . Bei der gentechnischen Eneugung to- leranter Pflanzen wurde eine ahnliche Strategie verfolgt. Das Gen der EPSP-Synthase, des Wirkortes, konnte aus Zellkulturen von Petunia hybrida isoliert werden. Die verstarkte Bildung des Enzyms in Pflanzen wurde durch den Austausch des Promotors des Gens der EPSP-Syn- thase gegen den konstitutiv wirkenden 35s-Promotor des Cauliflower-Mosaic-Virus (Abschnitt 4.2) erreicht. Nach Wiedereinfiihrung dieser Hybridkonstruktion in Petunien- zellen konnte eine um das 40fache erhohte Enzymaktivitat in Pflanzencalli nachgewiesen werden, die als Ursache der zu beobachtenden Toleranz angesehen ~urde[ '~ ' ] . Aus die- sen Calli konnten tolerante Pflanzen erhalten werden.

Auch uber Mutanten rnit verandertem Wirkort fur das Herbizid Glyphosate lassen sich tolerante Pflanzen erhal- ten. Nach Mutagenese von Salmonella typhimurium konnte ein Stamm gewonnen werden, dessen EPSP-Synthase un- empfindlich gegen Glyphosate war. Die Resistenz beruhte auf dem Austausch einer der insgesamt 421 Aminosauren des Enzyms aus Salmonella['5n1. Das mutierte Struktur-Gen

wurde isoliert, rnit Regulationselementen versehen, die in Pflanzen erkannt werden, und anschlieBend in das Genom von Tabakpflanzen eingebaut. Mit diesem aus Bakterien stammenden Resistenz-Gen gelang es ebenfalls, tolerante Pflanzen gegen Glyphosate zu erhalten['a!

Als letztes Beispiel sol1 auf das Herbizid Phosphinothri- cin eingegangen werdenI'621, das die Metabolisierung von Ammonium-Ionen in pflanzlichen Zellen durch Hemmung des Enzyms Glutamin-Synthetase verhindert. Dieses En- zym katalysiert die Reaktion

Glutamat + NHZ + ATP + Glutamin + HzO + ADP + Pi

Auch hier konnten resistente Zellkulturen erhalten werden. Als Ursache der Resistenz wurde eine Genamplifikation und dementsprechend eine erhohte Konzentration des En- zyms Glutamin-Synthetase (Wirkort des Herbizids) festge- stellti1601. Eine solche resistente Zellinie diente wegen der erhohten Kopienzahl des Gens als Ausgangspunkt fur die Isolierung des Gens der Glutamin-Synthetase aus Luzer- ne[1651. Kurzlich gelang die Expression des Gens einer pflanzlichen Glutamin-Synthetase in einer E.-coli-Mutan- te, die uber keine eigene Glutamin-Synthetase mehr ver- fiigte['661.

5.1.2. Yinrsresistenz

Bei der gentechnischen Erzeugung virusresistenter Pflanzen konnten kiirzlich beachtliche Erfolge erzielt wer- den. Ausgangspunkt war die seit langem bekannte Beob- achtung, dal3 Pnanzen nach einer Infektion rnit einem schwach pathogenen Virus keine Befallsymptome mehr entwickeln, wenn sie anschlieBend rnit einem virulenten Stamm infiziert werden. Teilweise wird diese Eigenschaft bei der Anzucht von Tomaten oder Kartoffeln genutzt. Der molekulare Mechanismus einer solchen ,,Kreuzresistenz" ist bisher noch nicht aufgeklart; mehrere teilweise kontro- verse Theorien warten noch auf experimentelle Bestati- gung. Ausgehend von der Uberlegung, da13 eine Kreuzresi- stenz moglicherweise auch durch Expression einzelner Gene eines Virus erzeugt werden kann, transferierten Beachy et al.11671 das Gen fur das Hullprotein des Tabak- mosaikvirus (TMV) rnit Agrobacferium tumefaciens auf Ta- bakpflanzen. Tatslchlich wies ein hoher Prozentsatz der transformierten Pflanzen, die nun das Hullprotein des Vi- rus bilden, nach einer kunstlichen Infektion rnit TMV keine Symptome auf. Im Gegensatz dazu war bei allen Kontrollpflanzen nach drei bis vier Tagen eine deutliche Infektion zu erkennen.

Dieser sehr wichtige Erfolg bei der Erzeugung virusresi- stenter Pflanzen ermoglicht gezielte Untersuchungen zum Phlnomen der Kreuzresistenz, da offensichtlich dazu le- diglich die Expression eines einzelnen Gens notwendig ist, und eroffnet die Moglichkeit, virusresistentes Saatgut her- zustellen.

Mbglicherweise hlngt die jnduzierte Resistenz" auch rnit der Bildung von ,,Pathogen Related Proteins'' (PR- Proteins) zusammen. Mehrere Pflanzen bilden nach Infek- tion rnit Viren, Viroiden, Bakterien oder Pilzen bestimmte Proteine, deren Auftreten mit der Bildung einer Resistenz gegen weitere Infektionen korreliert werden kann['"]. Die

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Konzentration der PR-Proteine steigt bei Beginn einer In- fektion bis zum IOOfachen des Au~gangswertes['~~. I7O1; sie treten vorwiegend extrazellular auf und sind weitgehend proteaseresistent. Durch Kreuzung verschiedener Tabak- sorten, die nach Induktion mit einem Pathogen das gleiche PR-Protein bilden, konnten Hybriden erhalten werden, die konstitutiv dieses PR-Protein bilden. Diese Hybriden zeig- ten eine deutlich erhdhte Resistenz gegen Virusinfektio- nen1'7'1. Weitere Untersuchungen zu den bisher noch unbe- kannten Funktionen dieser Proteine versprechen ein besse- res Verstandnis der Resistenzmechanismen bei Pflanzen.

Da Gensequenzen einiger dieser Proteine bereits klo- niert ~ i n d l ' ~ ~ ] , erscheint auch die praktische Nutzung dieser Resistenzmechanismen in absehbarer Zukunft moglich. Auch die Untersuchung der Promotoren der PR-Protein- Gene eroffnet zahlreiche wissenschaftliche und praktische Moglichkeiten, da sie durch eine Infektion induziert wer- den und die PR-Proteine (es sind bis zu zehn identifiziert worden) hochstwahrscheinlich unterschiedliche Promoto- ren aufweisen. Die Uberexpression einiger dieser Proteine konnte spezifische Schutzmechanismen aktivieren.

51.3. Resistenz gegen pildiche Erkrankungen und Mikroorganismen

Die durch Pflanzenkrankheiten verursachten Schaden sind auch heute trotz des Einsatzes von Pflanzenschutzmit- teln noch sehr hoch. Fur 1976 wurde der weltweite Emte- verlust durch Krankheiten - im wesentlichen Pilzerkran- kungen - auf 50 Milliarden US-Dollar g e s c h a t ~ t ~ ' ~ ~ ] . Ahn- lich wie bei den meisten der vorherigen Beispiele kann die gentechnische Auspragung von Resistenzen gegen Krank- heiten auf der Ausnutzung naturlicher Abwehrmechanis- men beruhen, die entweder verstiirkt oder via Gentechnik zwischen bisher nicht kreuzbaren Pflanzen ubertragen wer- den. Xhnlich wie bei Virusinfektionen tritt auch bei Pilz- und Bakterieninfektionen eine ,,induzierte Resistenz" auf, deren Ursache noch nicht geklart werden k ~ n n t e l l ~ ~ ~ . Pflanzen verfiigen uber mehrere unterschiedliche Abwehr- mechanismen gegen Infektionen:

- Erhohte Ligninbildung an der Zellwand und dadurch besserer Schutz gegen Eindringlinge;

- Bildung von Hydrolasen, deren Funktion die Auflbsung von Polysacchariden in der Zellwand eindringender Pilze sein kann;

- Bildung niedermolekularer, sekundilrer Stoffwechsel- produkte, die toxisch fur infizierende Organismen sein konnen ;

- Bildung von ,,Hydroxyprolin Rich Proteins" unbekann- ter Funktion, die in der Zellwand von Pflanzen auftreten und deren Konzentration nach einer Infektion stark an- steigen kann;

- Bildung infektionsspezifischer Proteine ungekllrter Funktion, die wahrscheinlich bei der Abwehr von Infek- tionen eine wichtige Rolle pi el en"^^^.

Fur die gentechnische Erzeugung von Resistenzen gegen Pilze oder Mikroorganismen bieten sich folgende Ansatze an, die in mehreren Laboratorien gepriift werden :

I. Die Induktoren und die Mechanismen, die zur Auspra- gung der Abwehrreaktionen bei Pflanzen erforderlich sind,

mussen aufgeklart werden. Es lieBen sich bereits mehrere Ausloser fur Abwehrreaktionen (Elicitoren) identifizieren. AuBerdem gelang es, die Gene wichtiger Proteine, deren Expression bei einer Infektion stark ansteigt, zu charakte-

2. Zahlreiche Pflanzen enthalten das Enzym Chitinase, dessen Aktivitat bei einem Pilzbefall stark ansteigt'I7'l. Chitin (POly-N-aCetyl-D-glUCOSamin) tritt in pflanzlichen Zellen nicht auf, ist aber ein wichtiger Bestandteil der Zell- wand von Pilzen. Es wird daher angenommen, dal3 die bei einer Infektion gebildete Chitinase die Funktion hat, pilzli- che Zellwande zu hydrolysieren und damit einen Pilzbefall abzuwehren. Mehrere Chitinase-Gene konnten bereits iso- liert ~ e r d e n ~ ' ~ ' ] . Der nachste Schritt ware nun, gentech- nisch eine verstarkte Bildung der Chitinase bei Pilzbefall zu erzeugen. 3. Oftmals kommen in wildlebenden Verwandten unserer Kulturpflanzen wichtige Resistenz-Gene vor. Nicht in al- len Fallen kiinnen diese Resistenz-Gene uber Kreuzungs- experimente in Kulturpflanzen ubertragen werden. Hier konnte die Gentechnik zu einem wichtigen Werkzeug fur den Ziichter werden. Ein Beispiel ist das Auftreten von Rost in Soja (Glycine m a ) , der durch Phakospora pachy- rhizi verursacht wird und hohe Verluste erzeugen kann. Resistenz-Gene sind in entsprechendem Zuchtmaterial nicht gefunden worden. In anderen Arten der Gattung Gly- cine sind allerdings Resistenz-Gene vorhanden, deren gen- technische Ubertragung auf Soja einen erheblichen wirt- schaftlichen Nutzen bedeuten ~ i i r d e ~ l ' ~ ~ . 4. Bei einigen pflanzenpathogenen Organismen wurde festgestellt, daB nahe verwandte Stamme haufig keine In- fektion in Pflanzen mehr verursachen konnen. Da bei Mi- kroorganismen molekularbiologische Untersuchungen leichter durchzufuhren sind als bei Pflanzen, wird vielfach auch versucht, die Gene zu charakterisieren, die fur die ,,Erkennung" der anfalligen Wirtspflanzen und fur den Be- ginn der pflanzenpathogenen Reaktion zustandig sind1'80,'811. Wenn diese Mechanismen verstanden werden, lassen sich im Gegenzug weitere gentechnische Strategien entwerfen, um eine Resistenz gegen diese Pathogene her- vorzurufen.

riSierenI17% 1761

5.1.4. Resistenz gegen Schidlinge

Ahnlich wie bei den bisher diskutierten Beispielen wird vermutet, daD Pflanzen auch Abwehrmechanismen gegen Insekten entwickelt haben; wahrscheinlich sind Bruch- stucke der Zellwand (Oligosaccharide) die auslosenden F a k t ~ r e n " ~ ~ . la2! Ein moglicher Abwehrmechanismus ge- gen tierische Schadlinge besteht in der Bildung von Protea- se-Inhibitoren als Reaktion auf Verletzungen der Pflan-

Diese Inhibitoren sind Proteine und wirken als po- tente Hemmstoffe fur Serin-Proteasen, die am Verdau- ungsprozel3 von Insekten beteiligt sind1la3]; die Inhibitoren kiinnten daher eine FraBhemmung hervorrufen. Da es sich um Proteine handelt, erm6glicht die Gentechnik durch Uberexpression der entsprechenden Gene eine verstlrkte Bildung dieser Inhibitoren, moglicherweise spezifisch in Bliittern oder Friichten. Die Genstruktur und -sequenz ei- nes solchen 'Inhibitors wurde kurzlich ver6ffentlicht"s41.

Die Ubertragung von Genen fur insektentoxische Pro- teine bietet eine weitere MLIglichkeit zur gentechnischen

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Erzeugung insektenresistenter Pflanzen. Ein Beispiel fur ein solches Protein ist das Toxin aus Bacillus thuringiensis. Bakterien, die dieses Toxin produzieren, werden seit Jahr- zehnten zur biologischen Bekampfung bestimmter Raupen eingesetzt. Allerdings fanden die Bakterien keine breite Anwendung, weil sie langsamer als chemische Pflanzen- schutzmittel wirken. Kurzlich gelang es, das entsprechende Gen zu isolieren und in Tabakpflanzen ein~ubauen['"~. Uber die Insektenresistenz einer derart verlnderten Pflanze laBt sich noch nichts aussagen. Eine wirksame Ab- wehr kann z.B. auch in der Bildung niedermolekularer Substanzen bestehen, deren Konzentration bei mechani- scher Schadigung oder bei Insektenbefall stark zunimmt und die zumindest fraBhemmend Diese Verbindungen konnen den unterschiedlichsten chemischen Klassen angehoren und sind haufig sekundare Stoffwech- selprodukte: Phytoalexine, Tannine und sogar Substanzen, die bei Insekten eine Hormon- oder Signalwirkung aus- iiben (Ecdyson, Pheromone und Analoga des fur die Ent- wicklung von Insekten wichtigen Juvenilhormons). Die gentechnische Ausnutzung dieser Abwehrstrategie er- scheint problematisch, da einerseits an der Biosynthese dieser Verbindungen zahlreiche Enzyme (und Gene) betei- ligt sind und andererseits die Verbindungen haufig auch unangenehme Nebenwirkungen fur den Menschen aufwei- sen.

5. I . 5. Srre$?resistenz

Viele Umweltfaktoren wirken streI3erzeugend auf Pflan- Zen: Hitze, Trockenheit, Staunasse, hoher Salzgehalt des Bodens usw. Als Abwehr gegen diese StreDbedingungen leitet die Pflanze Gegenreaktionen ein, deren Bedeutung noch nicht vollstlndig erkannt ist. Beispielsweise werden als Antwort auf einen Hitzeschock unter anderem Proteine synthetisiert, deren genaue Funktion man noch nicht kennt. Sie sind aber sicher an der Bildung eines Schutzme- chanismus beteiligt und werden teilweise zu den Chloro- plasten transportiert['881 und dort inkorporiert.

Unter anderen StreDbedingungen bilden sich haufig die gleichen Proteine wie unter den Bedingungen des Hitze- schocks, allerdings in geringerem A ~ s m a D [ ' ~ ~ ] . Oft treten auch streobedingte Schwankungen des Aminosauregehalts auf; so kann' der Prolingehalt in Pflanzen stark zuneh- men["'1.

Der gentechnische Ansatz zur Erhohung der StreDresi- stenz konnte in der ldentifizierung und lsolierung der wichtigsten am Schutz vor StreDbedingungen beteiligten Gene liegen, die anschlieDend von resistenten auf emp- findliche Pflanzen ubertragen werden.

5.2. Beeinflussung pflanzlicher Inhaltsstoffe

Mehrere Beispiele, die in Abschnitt 5.1 unter dem Ge- sichtspunkt einer Resistenzerzeugung diskutiert wurden, betreffen bereits die verstarkte Bildung pflanzlicher In- haltsstoffe. Es sollen nun weitere Moglichkeiten zur ,,Ver- besserung" der Eigenschaften eines Erntegutes erwahnt werden. Unter anderem lassen sich durch die Gentechnik sowohl die Gewinnung und Verarbeitung von Nahrungs- rnitteln als auch die Erzeugung pflanzlicher Rohstoffe fur die Industrie beeinflussen.

Die Samen von Getreide- und Gemusepflanzen sind auch wegen des hohen Protein- und Aminosauregehaltes ein wichtiger Faktor fur die Ernahrung von Mensch und Tier. Die Zusammensetzung der Inhaltsstoffe dieser wich- tigen Nahrungsquelle entspricht allerdings nicht immer den Bedurfnissen, da haufig essentielle Aminosauren nicht in den notwendigen Anteilen vorhanden sind. Mais enthalt z. B. nur wenig Lysin und Tryptophan. Aus diesem Grund wird bei Verwendung von Mais als Tierfutter in der Regel Sojamehl zugesetzt, das wiederum defizient an der Amino- saure Methionin ist. Eine langerfristige Aufgabe der Gen- technik konnte es nun sein, den Aminosauregehalt der Speicherproteine wichtiger Pflanzen so zu verandern, daO eine ausgewogene Zusammensetzung entsteht. Uber die klassische Zuchtung konnten bei Mais bereits Sorten ent- wickelt werden, die einen hoheren Lysingehalt aufweisen. Allerdings waren damit unerwunschte Merkmale wie ge- ringer Ertrag, geringer Proteingehalt oder Anfalligkeit ge- gen Krankheiten v e r b ~ n d e n [ ' ~ l ~ . Die gentechnische Bear- beitung eines solchen Projektes ist nicht leicht, da die Spei- cherproteine in der Regel durch umfangreiche Genfami- lien codiert werden. Die verstarkte Expression eines ein- zelnen Gens durfte daher kaum einen nennenswerten Bei- trag zum gesamten Arninosauregehalt leisten. Hier gilt es nun, entweder uber die Gentechnik den Stoffwechsel im Samen so zu beeinflussen, daB der Gehalt an einer be- stimrnten freien Aminosaure stark zunimmt, oder mehrere, giinstig veranderte Gene einzufuhren. Weitere Moglichkei- ten zur Steigerung der Qualitat von Pflanzensamen werden in der Literatur d i s k ~ t i e d ' ~ ~ ] .

Neben der gentechnischen Veranderung pflanzlicher Er- zeugnisse, die fur die Nahrung verwendet werden, ist si- cher auch die Verstarkte'Bildung bestimmter Inhaltsstoffe wichtig, die in der Medizin oder als industrielle Rohstoff- quellen genutzt werden konnen['Y31. Als Beispiel sei die Be- einflussung von olpflanzen (z. B. Soja, Raps, Sonnenblu- me) genannt, mit dem Ziel, die Olzusammensetzung zu verandern. Es ist vorstellbar, daD durch Transfer geeigne- ter Gene innerhalb gewisser Grenzen einheitliche Olfrak- tionen erhalten werden, die rnafigeschneidert fur eine in- dustrielle Verwendung sein konnten. Selbstverstandlich ist hierfur noch intensive biochemische und molekularbiolo- gische Grundlagenforschung notwendig. Die Maglichkei- ten, die sich sowohl fur die Landwirtschaft als auch fur die Industrie eroffnen, scheinen aber einen solchen Einsatz durchaus zu rechtfertigen.

5.3. Beeinflussung pflanzenphysiologischer Vorgange

Ribulose-l,5-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) ist ein Schlusselenzym der Photosynthese, da es fur die Fixierung von Kohlendioxid aus der Luft verantwortlich ist (siehe Abschnitt 4.2). Neben Kohlendioxid bindet dieses Enzym auch Sauerstoff und iibertragt ihn auf Ribulose- 1,S-bis- phosphat ; dadurch entstehen unerwunschte Nebenpro- dukte. Diese als Photorespiration bezeichnete Reaktion verrnindert die Effizienz der Photosynthese.

Wegen der grundlegenden Bedeutung der Photosynthese und der Photorespiration hat es nicht an Versuchen ge- fehlt, durch Mutationen Enzyme zu erzeugen, bei denen die Photorespiration vermindert ist. Bisher konnten aller- dings keine praktisch nutzbaren Ergebnisse erzielt werden.

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In letzter Zeit haben sich die Chancen hierfur deutlich ge- bessert, da es gelungen ist, die Gene fur die beiden Unter- einheiten von Rubisco aus photosynthetischen Bakterien zu isolieren und auf E. coli zu ubertragen. In E. coli bildete sich dann ein aktives E n ~ y m [ ' ~ ~ I . Weiterhin wurde kurzlich die dreidimensionale Struktur des Enzyms aus dem Bakte- rium Rhodospirillum r u b r ~ m [ ' ~ ~ ' ] und Alcaligenes eutro- p h ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ aufgeklart.

Dariiber hinaus ist es sogar gelungen, in E. coli durch Gentransfer ein Hybrid-Enzym von Rubisco zu erzeugen, das aus der gronen Untereinheit von Cyanobakterien und der kleinen Untereinheit aus Weizen zusammengesetzt ist["']. Dieses Enzym ist aktiv. Damit sind die Vorausset- zungen geschaffen, um durch gezielte Mutagenese rnit syn- thetischen Genabschnitten nahezu jede beliebige Amino- saure zu verandern und anschlieoend den Effekt auf die enzymatische Aktivitat untersuchen zu konnen. Die grol3e Bedeutung eines Enzyms, da13 durch eine erhahte Fixie- rungsrate fur Kohlendioxid eine effizientere Photosyn- these bewirkt, braucht sicher nicht betont zu werden.

5.4. Beeinflussung der Stickstoffixierung

Zunachst sei festgestellt, daB die gentechnische Gewin- nung stickstoffixierender Pflanzen vor der Jahrtausend- wende unwahrscheinlich sein durfte. Dies ist aber auch die ,,Maximalforderung" ; Teilerfolge konnten sehr wohl in den nachsten Jahren erreicht werden. In Tabelle 6 sind mehrere Moglichkeiten aufgefiihrt, die Stickstoffixierung gentechnisch zu beeinflussen. Zahlreiche bodenlebende Mikroorganismen wie Azotobacter, Azospirillum, Klebsiella oder Rhizobium sind imstande, Stickstoff aus der Luft zu fixieren und Ammoniak zu bilden. Durch ihren Stoffwech- sel tragen diese Bakterien zur Stickstoffdungung bei. Diese ,,biologisch fixierte" Menge an Stickstoff ist erheblich - weltweit betragt sie ein Vielfaches der Menge des industri- ell erzeugten Ammoniak~~'~ ' ' .

Stickstoffixierende Mikroorganismen k6nnen in zwei grol3e Gruppen eingeteilt werden: Freilebende Fixierer und symbiontische Fixierer. Letztere benotigen die Part- nerschaft rnit Pflanzen, haufig mit Leguminosen. In dieser Partnerschaft stellen die Mikroorganismen der Pflanze das Produkt der Stickstoffixierung zur Verfiigung und erhalten im Austausch von der Pnanze Assimilate aus der Photo- synthese. Der Anteil des symbiontisch fixierten Stickstoffs ist dabei weit hoher als der durch freilebende Mikroorga- nismen gebundene Stickstoff.

Struktur und Funktion der an der Stickstoffixierung be- teiligten Gene wurden bisher am genauesten bei Klebsiella pneumoniae, einem freilebenden Fixierer, und Rhizobium meliloti, der eine Symbiose rnit Luzerne eingeht, unter- sucht119~. 1991

Tabelle 6. Stickstoffixierung: Maglichkeiten der Gentechnik.

a) Fixierung durch bodenlebende Mikroorganismen:

b) Syrnbiose Legurninose ~ Mikroorganisrnus: Optirnierung der Fixierungsreaktionen

ErhOhung der Effizienz (Anzahl der KnOllchen. Regulation) Erweiterung des Wirtsspektrums innerhalb der Leguminosen uhertragung der Fehigkeit, Symbiosen einzugehen, auf Nicht-Legurnino- sen

c) Stickstomxierung in Pflanzen

Abb. 13. Wurzel einer Ackerbohne rnit deutlicher Kn6llchenbildung. die durch Symbiose rnit Bakterien verursacht wird. In den Knollchen wird Stick- stoff aus der Luft fixiert.

In K . pneumoniae werden die spezifisch an der Stick- stoffixierung beteiligten Enzyme durch einen Block von 17 zusammenliegenden Genen codiert. Die groBe Anzahl der an diesem ProzeB beteiligten Gene ist eine der Schwierig- keiten, die bei ihrer Ubertragung auf Pflanzen uberwunden werden mul3. Bei all diesen Genen miissen die Kontrollre- gionen (Promotoren) geandert und auf die Bedingungen in der Pflanze abgestimmt werden. Zusatzliche Schwierigkei- ten treten durch die Sauerstoffempfindlichkeit der Nitro- genase auf, des Enzyms, das Stickstoff reduziert, und durch den hohen Energiebedarf des gesamten Prozesses der Stickstoffixierung und Assimilation. Sowie genugend Ammonium-lonen in der Umgebung vorhanden sind, stel- len freilebende Fixierer die energieaufwendige Stickstoff- fixierung ein, da der Bedarf nun durch Aufnahme von Am- monium-Ionen gedeckt werden kann. Diese Regulation wird durch bestimmte Gene erreicht, die in Anwesenheit von Ammonium-Ionen die Bildung der fixierenden En- zyme verhindern. Fur die landwirtschaftliche Anwendung kann die Gewinnung von Stammen, bei denen diese Regu- lation durchbrochen ist, ein wichtiger Beitrag zur Verbes- serung der Stickstoffversorgung darstellen.

Die symbiontische Stickstoffixierung von Rhizobien fin- det nach Bildung typischer Wurzelknollchen statt (Abb. 13). Die Entstehung einer Symbiose hangt von zahlreichen komplexen Schritten ab: Wechselseitiges Erkennen zwi- schen Mikroorganismus und Pflanze, Infektion der Wur- zel, Bildung der Knollchen und schliel3lich die eigentliche Stickstoffixierung sowie der Austausch von Molekulen zwischen Pflanze und Mikroorganismus. Von der Pflanze sind rund 40 Gene an Bildung und Funktion der Knoll- chen beteiligt, sogenannte Noduliner2"01. Grundsiltzlich er- offnet jeder der erwahnten Schritte mehrere Moglichkeiten fur eine gentechnische Beeinflussung. Am wechselseitigen Erkennen und a n der Bildung der Knollchen sind nieder- molekulare Substanzen (Flavone) beteiligt, die von der Pflanze ausgeschieden werden[2011. Durch Anderung von

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Art und Menge der biosynthetisierten und ausgeschiitteten Flavone kann moglicherweise die Anzahl der gebildeten Knollchen erhoht und damit einhergehend die Stickstoff- fixierung verstarkt werden. Die Auffindung von Sojapflan- Zen, die mehr Knollchen aufweisen als die Wildtyppflanze, 1aBt diese Moglichkeit vielversprechend erscheineniZoz1.

Die symbiontischen Rhizobiensttimme haben eine aus- gepragte Spezifitat fur bestimmte Wirtspflanzen. Je nach Bakterienstamm treten dabei deutliche Unterschiede im Wachstumsverhalten und in den Fixierungsraten auf. Es erscheint durchaus realistisch, das Wirtsspektrum der be- teiligten Rhizobien zu verbreitern. Dadurch ware die M6g- lichkeit gegeben, bei Leguminosen, die bisher nur eine Symbiose mit langsam wachsenden Rhizobien eingehen konnen, die Stickstoffversorgung deutlich zu verbessern.

Mehrere der Genprodukte, die an Bildung und Funktion der Knollchen beteiligt sind, treten auch in Pflanzen auf, die keine Symbiose eingehen konnen. Es kann daher gen- technisch einfacher sein, diese Pflanzen zur Symbiose ge- eignet zu machen, als ihnen die Fahigkeit zu iibertragen, den Stickstoff direkt zu fixieren.

5.5. Gentechnik als Hilfsmittel fur die Pnanzenziichtuag

Molekularbiologische Methoden kiinnen genaue Infor- mationen iiber die Anwesenheit bestimmter Gene in Pflan- zen liefern. Die Empfindlichkeit solcher Techniken wurde soweit erhoht, daB sie sich mit weniger als zehn pflanzli- chen Zellen durchfiihren l a ~ s e n ' ~ ~ ~ ~ . Daraus ergeben sich zahlreiche Anwendungsmoglichkeiten fur die Pflanzen- zucht: Rasche Uberpriifung der Nachkommen von Kreu- zungsversuchen und unbekannter Genotypen auf die An- wesenheit bestimmter Gene, Charakterisierung eigener Sorten durch Aufstellung charakteristischer DNA-Banden- muster (RFLP: Restriction Fragment Length Polymor- phism)[2041, Aussagen iiber die Verwandtschaft bestimmter Sorten sowie Tests auf Anwesenheit von Viren in Saatgut oder Zuchtmaterial. Der Vergleich molekularbiologischer Tests rnit entsprechenden serologischen Tests auf Anwe- senheit von Viren ergab, daD die durch Hybridisierung mit DNA erhaltenen Befunde zuverlassiger und aussagekrtifti- ger ~ i n d [ ~ ~ ~ ] .

6. Sorgen und Gefahren

Die in Abschnitt 5 beschriebenen Ziele der Gentechnik rnit FYlanzen werden kaum Anla5 zu Sorgen geben. Es ist nicht anzunehmen, daB ernsthafte Einwande gegen die Entwicklung resistenter oder ertragreicher Sorten gemacht werden kannen, da dies bereits seit vielen Jahrzehnten die Ziele der klassischen Pflanzenziichtung sind. Im Falle der Herbizidresistenz erscheint allerdings eine Diskussion niitzlich, um MiDverstandnissen vorzubeugen. In diesem Abschnitt wird daher neben den hypothetischen Gefahren, die durch gentechnisch veranderte Pflanzen verursacht werden konnen, auch das Thema Herbizidresistenz disku- tiert.

6.1. Gefahren durch gentechnisch veranderte Pflanzen

Die Gentechnik ermoglicht die Isolierung von Genen aus den verschiedensten Organismen und den Einbau die-

ser Gene in Pflanzen. Mit den heutigen Methoden konnen stets nur einige Gene iibertragen werden. Dabei handelt es sich um charakterisierte Gene, deren Funktion bekannt ist. Hypothetische Gefahrenquellen sind

a) Entstehung einer wildwuchernden, sich unkontrolliert

b) Ubertragung der transferierten Gene von Kulturpflan-

c) Bildung toxischer Substanzen in den gentechnisch ver-

vermehrenden Pflanze (Unkraut);

Zen auf Unkrauter durch Fremdbefruchtung;

anderten Pflanzen.

Erstens sei festgestellt, daD die Freisetzung gentechnisch veranderter Pflanzen weit weniger problematisch als die Freisetzung veranderter Mikroorganismen oder Tiere ist, denn unerwiinschter Manzenwuchs kann notfalls rnit Her- biziden oder mechanisch bekampft werden; dies gehort zur taglichen Praxis des Landwirtes.

Zweitens werden gentechnisch veranderte Pflanzen vor einer Freilandpriifung zunachst unter Laborbedingungen und in Gewachshausern erprobt. Wahrend dieser Phase konnen unerwiinschte oder schadliche Eigenschaften einer Pflanze erkannt werden.

Drittens haben Pflanzenziichter seit Jahrhunderten rnit gutem Erfolg die verschiedensten Kreuzungen durchge- fiihrt, unter anderem auch Kreuzungen, die ohne mensch- liches Zutun nie zustandegekommen waren. Bei solchen Versuchen werden zehntausende verschiedener Gene neu kombiniert; bisher sind dadurch keine ernsten Gefahren entstanden. Auch durch zellbiologische Methoden wurden Genkombinationen in neuen Pflanzen erzeugt, die unter natiirlichen Bedingungen nie entstanden waren. Es sol1 hier an die Protoplastenfusionen erinnert werden, die zur Bildung der ,,Tomatoffel" fiihrted3''. Selbst bei kritischer Betrachtung konnte hier keine Gefahr erkannt werden. Es ist daher auch nicht denkbar, daB bei der Ubertragung we- niger Gene durch gentechnische Methoden eine gefahrli- che Situation entstehen konnte.

Viertens ist zu erwahnen, daB Eigenschaften wie schnel- les und unkontrolliertes Wachstum (Verunkrautung) nur durch eine grone Zahl von Genen, die aufeinander abge- stimmt sein miissen, erreicht werden kann. Aus diesem Grunde ist es auch nicht vorstellbar, daB durch Gentech- nik rnit P!lanzen unbeabsichtigt neue Unkrauter entste- hen.

Funftens konnen Eigenschaften, die unbeabsichtigt auf andere Pflanzen iibertragen werden (z. B. Unkrauter), sich nur halten und verbreiten, wenn ein entsprechender Selek- tionsdruck vorhanden ist. Dies ist fur eine zufallige Uber- tragung einzelner Gene nicht anzunehmen, wenn die ubli- chen Regeln guter landwirtschaftlicher Praxis befolgt wer- den (z.B. Rotation der Kulturen und der Herbizide). Zu- dem sind nur in wenigen Fallen Kulturpflanzen und nahe verwandte Unkrauter kreuzbar.

Sechstens kann bei der klassischen Zuchtung nicht mit letzter Sicherheit ausgeschlossen werden, daB die Konzen- trationen pflanzeneigener toxischer Substanzen durch Kreuzung erhaht werden. Ein Beispiel hierfiir ist die Ent- wicklung von Kartoffelsorten, die einen unangenehmen, brennenden Geschmack infolge einer erhohten Konzentra- tion an Glycoalkaloiden aufweisen1206". Dies war kein sehr iiberraschendes Ergebnis, da viele Wildsorten der Kartof-

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fel, auf die zur Entwicklung neuer Sorten haufig zuriickge- griffen wird, bereits hohe Konzentrationen dieser Glycoal- kaloide enthalten. Auch hier ist daher nicht anzunehmen, daB der gezielte Transfer einiger weniger Gene ahnliche Effekte verursacht. Zudem lassen sich toxische Nebenpro- dukte leicht durch entsprechende Analysen und Testver- fahren erkennen.

Zusammenfassend f2llt es schwer, eine konkrete oder potentielle Gefahr durch gentechnisch veranderte Pflanzen zu erkennen.

6.2. Freisetzung gentechnisch veranderter Pflanzen

Gentechnisch veranderte Organismen durfen in der Bundesrepublik Deutschland nicht im Freiland erprobt oder freigesetzt werden. Das Bundesgesundheitsamt kann auf Antrag und nach Anhorung der ,,Zentralen Kommis- sion fur Biologische Sicherheit" im Einvernehmen mit den zustandigen biologischen Bundesanstalten Ausnahmen zu- la~sen'*"'~. Bisher wurden unseres Wissens keine derartigen Versuche durchgefiihrt.

Kiirzlich war aus der Presse zu entnehmen, dafi in den USA zwei Feldversuche rnit gentechnisch verlnderten Ta- bakpflanzen von den zustandigen Behorden genehmigt wurden. Es handelt sich dabei um Pflanzen, die ein zusatz- liches Gen aus Hefe enthalten (das Gen der Alkohol-De- hydrogenase), und um F'flanzen, denen das Toxin-Gen aus Bacillus thuringiensis eingebaut wurde. Mit den Tests sol1 hauptsachlich nachgewiesen werden, daB ein zusltzliches Gen unter Freilandbedingungen das Wachstumsverhalten nicht verandert. Im zweiten Fall wird zusltzlich eine Resi- stenz gegen Raupen unter Feldbedingungen erprobt.

Innerhalb Europas bestehen noch sehr unterschiedliche Voraussetzungen und Regelungen fur Freilandversuche mit gentechnisch veranderten Organismen. Sowohl vom Standpunkt der Sicherheit als auch vom Standpunkt der Konkurrenzfahigkeit der beteiligten Unternehmen und Forschungsinstitute ware eine einheitliche Regelung, zu- mindest innerhalb Europas, auBerst mnschenswert.

6.3. Herbizidresistenz

Die wichtigsten Vorteile des Anbaus herbizidresistenter Pflanzen werden nochmals zusammengefaat :

- Einsatz von Herbiziden erst bei Bedarf, daher keine vor-

- erhohte Wirtschaftlichkeit fur den Landwirt; - verstlrkte Anwendung iikologisch gunstiger (rasch ab-

- verminderte Bodenerosion durch Verhinderung des Auf-

- Ersatz von Herbizidmischungen durch ein nichtselekti-

beugende Anwendung mehr notwendig;

baubarer) Herbizide zulasten llterer Produkte;

tretens freiliegender Fllchen;

ves Herbizid.

Diesen Vorteilen werden potentielle Nachteile sowie Be- furchtungen gegeniibergestellt:

- Schaffung okologischer Probleme beim Anbau herbizid- resistenter Kulturen durch verstirkte Anwendung von Herbiziden;

- Entstehung herbizidresistenter Unkrauter; - weitere Einschrlnkung der Sortenvielfalt.

Bei der Diskussion uber herbizidresistente Pflanzenr2"*] sollte nicht ubersehen werden, daB bereits langiahrige Er- fahrungen mit der Anwendung selektiver Herbizide in der Landwirtschaft vorliegen. Die resistenten Kulturen haben Stoffwechselwege, die einzelne Herbizide unwirksam machen. Dadurch ist eine natiirliche Herbizidresistenz gegeben, die nur fur die jeweilige Kultur gilt. Die An- wendung dieser selektiven Herbizide bei den Kulturen mit natiirlicher Resistenz unterscheidet sich nicht von der Anwendung nichtselektiver Herbizide bei den entspre- chenden gentechnisch erzeugten herbizidresistenten Kultu- ren.

Wegen der Moglichkeit, Herbizide erst bei Bedarf einzu- setzen, d. h. erst dann, wenn der Unkrautbefall ein ertrlgli- ches MaO iibersteigt, und wegen des Ersatzes vieler ver- schiedener selektiver Herbizide durch ein nichtselektives Herbizid ist anzunehmen, daB die Herbizidresistenz den Einsatz dieser Wirkstoffe vermindern wird.

Bei der Entwicklung von Resistenz gegen langlebige Herbizide kann nicht ausgeschlossen werden, daB sich im Laufe der Jahre das Herbizid im Boden anreichert und da- mit iikologische Probleme verursacht. Die bei allen For- schungsinstituten zu beobachtende Tendenz, Resistenzen bei Pflanzen nur gegen iikologisch gunstige Herbizide zu entwickeln, ist daher zu begriiBen. Hierdurch wird deut- lich, daB die spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Herbizids die entscheidenden Faktoren bei der Diskussion der Herbizidresistenz sind (Abbau, Umweltverhalten, Toxizitat, Moglichkeiten der Anreicherung usw.). Deshalb ist eine getrennte Diskussion fur jedes Herbizid notwen- dig.

Die mogliche Bildung herbizidresistenter Unkrauter bei Verwendung nichtselektiver Herbizide ist wahrscheinlich kein groDeres Problem. So sind z. B. trotz uber zwolfjahri- ger Anwendung des Herbizids Glyphosate bisher keine Schwierigkeiten durch Bildung von Resistenzen entstan- den. Sollten tatsachlich herbizidresistente Unkrauter ent- stehen, konnten sie durch Herbizide rnit anderen bioche- mischen Wirkorten jederzeit bekampft werden.

Es ist anzunehmen, daB eine Herbizidresistenz fur eine bestimmte Sorte eine wichtige Eigenschaft sein wird, ge- nauso wie beispielsweise Krankheitsresistenz, Standfestig- keit oder hoher Ertrag. Keine dieser Eigenschaften wird aber alleine ausschlaggebend sein, um andere Sorten in der Anbaufllche nennenswert zuriickzudrangen. Es ist da- her unwahrscheinlich, daB durch die Herbizidresistenz die existierende Sortenvielfalt starker eingeschrgnkt werden wird als durch die anderen erwahnten Zuchtziele. In die- sem Zusammenhang sei noch betont, daB fur die gentech- nische Veranderung von Pflanzen die Erhaltung maglichst vieler Arten von besonderer Bedeutung ist, da nur so auf eine breite Vielfalt naturlicher Gene zuriickgegriffen wer- den kann.

Die Herbizidresistenz dtirfte eines der am leichtesten er- reichbaren Ziele der Gentechnik rnit Pflanzen sein. Die hier gewonnenen Erfahrungen lassen sich anschliefiend bei der Losung komplexerer Probleme, z. B. der Erzeugung von Resistenzen gegen Virusinfektionen, tierische Schld- linge oder Pilzkrankheiten, anwenden.

Angew. Chem. 99 (1987) 392-412 409

7. Zusammenfassung und Ausblick

Bei einer Reihe von Nutzpflanzen konnen aus Einzelzel- len und Protoplasten Pflanzen regeneriert und mit Zellkul- turtechniken in beliebiger Menge vermehrt werden. Solche regenerierfahigen Zellkulturen werden sowohl zur Selek- tion von Mutanten als auch zu DNA-Transformationsver- suchen herangezogen. Der DNA-Transfer mit gentech- nisch modifizierten Ti-Plasmiden von Agrobacterium tume- faciens ist inzwischen bei einer rasch groDer werdenden Zahl von dikotylen Kulturpflanzen eine etablierte Tech- nik.

Der Beweis der Transformierbarkeit aller Getreidearten durch Agrobakterien steht noch aus; daher wurden alter- native Verfahren fur den DNA-Transfer entwickelt. Als universe11 einsetzbar hat sich der direkte Gentransfer in Protoplasten erwiesen. Transformierte Getreidezellkultu- ren sind aus DNA-behandelten Protoplasten routinemBBig zuganglich. Das Dogma, Getreide-Protoplasten seien gene- re11 nicht regenerierbar, ist durch die erfolgreiche Pflan- zenregeneration aus Reis-Protoplasten zu Fall gebracht worden.

GroRe Anstrengungen werden unternommen, um den Gentransfer unabhangig von Zellkulturmethoden zu ma- chen. Beispielsweise wird versucht, sowohl durch Pollen- transformation als auch durch direkte DNA-Injektion in junge Infloreszenzen fremde D N A in reproduktive Zellen zu ubertragen.

Die Zahl der isolierten pflanzlichen Gene nimmt rasch zu. Durch die Analyse der Regulationssequenzen dieser Gene werden DNA-Segmente zuganglich, die eine gewe- bespezifische oder durch Umweltreize induzierbare Ex- pression von Genen in Pflanzen verursachen.

Erste Gene, die wirtschaftliche Bedeutung fur die Pflan- zenziichtung und den Pflanzenschutz haben konnen, sind bereits in Pflanzen iibertragen worden. D a m gehoren Gene, die eine Virus-, Insekten- oder Herbizidresistenz in den Transforinanten bewirken.

Die weitere Entwicklung der Biochemie und Molekular- biologie von Pflanzen laRt vermuten, daR in Zukunft auch die molekularen Mechanismen bisher noch nicht verstan- dener Pflanzenkrankheiten aufgeklart werden. Hier sind beispielsweise Pilz- und Viroidinfektionen zu nennen. Ob- wohl bei einigen Viroiden bereits die vollstandige Sequenz der infektiosen RNA aufgeklart ist[2091, besteht noch keine Klarheit iiber den Mechanismus und die Ursachen der Pflanzenschadigung.

Das Ergebnis der gentechnischen Bemiihungen werden resistentere und leistungsfahigere Pflanzen sein. Solche Pflanzen werden dem Landwirt in den neunziger Jahren zur Verfiigung stehen. Einerseits ist dies ein wichtiger Bei- trag zur Losung des Welthungerproblems, andererseits er- schlieet der Anbau maRgeschneiderter Rohstoffe fur die Industrie der Landwirtschaft in den technisierten Landern zusatzliche Markte. Es kann sogar daran gedacht werden, aus Wildpflanzen neuartige Kulturpflanzen mit vorteilhaf- ten Eigenschaften (2 . B. Salztoleranz, hohe Biomassepro- duktion, gute Proteinqualitat im Erntegut) unter Einsatz zuchterischer und gentechnischer Methoden zu schaf- fen['"'].

Die enge Zusammenarbeit von Biochemikern, Zellbiolo- gen, Molekularbiologen, Pflanzenpathologen und Pflan-

zenziichtern ist dringend notwendig, um das Ziel beson- ders leistungsfahiger, hoch anpassungsfahiger und wenig krankheitsanfalliger Nutzpflanzen zu erreichen.

Fur die Anfertigung der lichtmikroskopischen Aufnahmen danken wir H . Drager. Fur wertvolle Hive bei der Fertigstel- lung des Manuskripts danken wir B. Diehls und P. Spone- mann.

Eingegangen am 26. Januar 1987 [A 6181

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