Genebank -Preparation of Culture Media - Genebank -Preparation of Culture Media -OP074

Genebank - Preparation of Culture Media -

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Genebank - Preparation

of Culture Media - OP074

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Date: 15-Apr-2014 13:05

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Table of Contents

1 INTRODUCTION ____________________________________________________________________ 5

2 SCOPE ___________________________________________________________________________ 6

3 SAFETY __________________________________________________________________________ 7

4 MATERIALS _______________________________________________________________________ 8

5 2. PROCEDURE ___________________________________________________________________ 11

6 Annex 1. Culture media formulation ____________________________________________________ 12

6.1 1. Potato culture media __________________________________________________________ 12

6.2 2. Sweetpotato culture media _____________________________________________________ 18

6.3 3. Bacterial Screening Medium ____________________________________________________ 23

7 Annex 2. Stock solutions _____________________________________________________________ 24

8 Annex 3. Preparation of solutions for pH adjustment _______________________________________ 27

9 Annex 4. pH measurement ___________________________________________________________ 28

10 Annex 5. Components of MS salts _____________________________________________________ 29

11 References _______________________________________________________________________ 30

12 INTRODUCCION ___________________________________________________________________ 31

13 ALCANCE ________________________________________________________________________ 32

14 SEGURIDAD ______________________________________________________________________ 33

15 MATERIALES _____________________________________________________________________ 34

16 2. PROCEDIMIENTO _______________________________________________________________ 38

17 Anexo 1. Formulación de medios de cultivo ______________________________________________ 40

17.1 1. Medios de cultivo de papa ______________________________________________________ 40

17.2 2. Medios de cultivo de camote ____________________________________________________ 46

17.3 3. Medio para detección de bacterias _______________________________________________ 51

18 Anexo 2. Soluciones Stock ___________________________________________________________ 52

19 Anexo 3. Preparación de soluciones para el ajuste de pH ___________________________________ 55

20 Anexo 4. Medición de pH ____________________________________________________________ 56

21 Anexo 5. Componentes de sales MS ___________________________________________________ 57

22 Referencia ________________________________________________________________________ 58


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TITLE Genebank - Preparation of Culture Media - OP074

OWNER * In vitro Conservation Curator

APPROVER * Head Genebank

APPROVAL DATE * Sep, 14th, 2012

ISSUE DATE Dec 05, 2013 11:20

CONTRIBUTORS * Vollmer, Rainer (CIP), ,Zea, Brenda (CIP) Panta, Ana (CIP)

CITATION * 074

KEYWORDS head_genebank, , procedure accredited

DOCUMENT ID * OP074

VERSION NUMBER 102

COMPETENT PERSONNEL *

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Version Date Author Comment

102 Dec 05, 2013

11:20

Hirahoka, Daniel

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101 Dec 05, 2013

11:20

Hirahoka, Daniel

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100 Dec 05, 2013

11:20

Hirahoka, Daniel

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99 Dec 05, 2013

11:20

Hirahoka, Daniel

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98 Dec 05, 2013

11:20

Hirahoka, Daniel

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1 INTRODUCTION

The use of an specific culture medium depends on the culture objective. In general, the mediain vitro

must contain a carbon source, mineral nutrients, vitamins, gelling agent (for semisolid media), growth

regulators substances and other components as antioxidant substances for example.

The preparation of culture medium is a critical step for the success of the culture. It is thereforein vitro

necessary to use reagents with a high quality of purity and distilled deionized water as solvent. The

procedure for the preparation of the culture media depends on the type of medium (semi-solid or liquid)

and the presence of thermolabile components.


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2 SCOPE

The procedure covers the preparation of potato and sweetpotato culture media that are used in

Genebank's conservation and multiplication activities.


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3 SAFETY

See ?Good practices during in vitro activities- OP106

See [CIP's Health & Safety Manual ]

https://research.cip.cgiar.org/confluence/display/gadc/Good+practices+during+in+vitro+activities

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/Good%20practices%20during%20in%20vitro%20bank%20activities_ap_14sep12.pdf?version=1&modificationDate=1347736243000&api=v2


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4 MATERIALS

Equipment

Autoclave Dispensing pump

pHmeter Analytical balance

Laminar flow chamber Magnetic stirrer

Refrigerator Microwave oven

Water destillator Vacuum pump

Sterifil aseptic system (MILLIPORE) Bottletop dispenser

Chemical fume hood

Materials

Glass test tubes (13x10 mm, 16x25mm,

18x150mm, 25x150mm)

Weighing boats

Test tube caps Autoclavable racks

Spatula Magenta vessels

Labels Plastic beakers

(1, 2 and 4 liters)

Autoclave indicator tape Plastic vials (2 and 20 ml)

Heat resistant glass bottles (1 liter) Sterile plastic pipets (1, 5 and 10 ml)

Disposable plastic petri dishes (100 x 15 mm) Plastic measuring cylinders

(100 ml; 500 ml; 1000 ml; 2000 ml)

Nitrocellulose membranes

(MILLIPORE, TYPE 0,22 um GSWP)

Prefiltres

(MILLIPORE, TYPE AP15, 47 mm)

Glass stirring stick Stirring bars

Plastic gloves Security glasses

Security mask Glass measuring cylinder (250 ml)

Rubber bulb (for pipettes)


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Chemicals Storage

temperature (**)

MS salts (*) 5±3 °C

Nicotinic acid Cool place

Pyridoxine-HCl Cool place

Gibberellic acid Cool place

Sucrose Cool place

Phytagel Cool place

Calcium pantothenate Cool place

Putrescine-HCl Cool place

6-Benzylaminopurine (BAP) Cool place

Ascorbic acid Cool place

Yeast extract Cool place

Glucose Cool place

Hydrochloric acid (37%) Cool place

Distilled deionized water Cool place

Myo-Inositol Cool place

Glycine-HCl Cool place

Thiamine-HCl Cool place

Sorbitol Cool place

Agar Cool place

Coconut water Cool place

Calcium nitrate Cool place

L-Arginine Cool place

Chlorocholine chloride (CCC) Cool place

Peptone Cool place

Sodium chloride Cool place

Meat extract Cool place

Sodium hydroxide Cool place


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Chemicals Storage

temperature (**)

Alcohol (96%) Cool place

(*) Murashige & Skoog basal salts (1962). Provider: Caisson

(**) According to Material Safety Data Sheet (MSDS)


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5 2. PROCEDURE

2.1 Prepare the culture medium according to its specific formulation (see Annex 1). Before starting verify

that all reagents have not expired.

2.2 In a clean heat-resistant plastic beaker place a stirring bar and add distilled deionized water to approx.

2/3 of the volume to be prepared. Place the beaker on a magnetic stirrer at a speed of approx. 50-100

rpm.

2.3 Ensure that the digital balance is levelled correctly. Tare weighing boat before each weighing process.

Weigh each of the ingredients in accordance to the specific culture media composition (see Annex 1).

2.4 Add ingredients to a plastic beaker, except the gelling agent, and wait until all ingredients are

dissolved.

2.5 Pour the culture media into a plastic measuring cylinder. Bring to the final volume with distilled

deionized water.

2.6 Measure the pH and adjust it with HCl (1N) and/or NaOH (1N) to the desired value (± 0.02) (see

Annex 3 and 4).

2.7 To prepare semi-solid medium that does not contain thermolabile ingredients, add the gelling agent

and heat the medium in the microwave oven. For each liter of culture medium set the microwave for 10

minutes (100% of intensity) pausing after 7 minutes in order to stir. Avoid boiling of the solution.

Meanwhile place the desired type and quantity of test tubes in autoclavable racks. Dispense the medium

into test tubes using the dispensing pump: 2-3 ml per 13x100 mm test tube, 4-6 ml per 16x125 mm test

tube, 7-8 ml per 18x150 mm test tube and 10 - 12 ml per 25x150 mm test tubes. Cap the test tubes.

2.8 To prepare semi-solid medium that contains thermolabile ingredients, first put the gelling agent into a

heat resistant glass bottle and then pour the culture medium into the bottle. Don't close the bottle too

tightly in order to allow the steam to escape during autoclaving (otherwise the bottle could crack).

2.9 Record in the Genebank-database and the physical list for medium preparation the following

information: genus, technician, date, type of medium, medium, number of labels, volume and pH. Save

and print out the labels. Stick a label and a piece of autoclave tape on each of the autoclavable rack(s) or

bottle(s). Autoclave for 20 minutes at 122±2°C and 15 psi.

2.10 Medium without thermolabile ingredients: Let the medium cool down until it reaches room

temperature. Store the medium under refrigeration at 5±3°C (up to 1 month).

2.11 Medium with thermolabile ingredients: When autoclaving is finished close the bottle(s) completely

(within the autoclave). Transfer bottle(s) to a laminar flow chamber and let it/them cool down until a

temperature of 40-45°C is reached. Add the previously sterilized thermolabile ingredients (by a sterifil

aseptic system) to the medium using a sterile plastic pipette. Shake and dispense by hand in sterile

culture vessels (for petri dishes and magentas) or by sterile bottle top dispenser (for test tubes). Dispense

20-25 ml and 25-35 ml of culture media per petri dish and magenta vessel respectively. Store the medium

under refrigeration at 5±3°C (up to 1 month).


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6 Annex 1. Culture media formulation

6.1 1. Potato culture media

1.1 Propagation medium (MSA)

Components Concentration

MS Salts* 4.33 g/l

Gibberellic acid 0.1 mg/l

Glycine-HCl 2 mg/l

Myo-inositol 100 mg/l

Nicotinic acid 0.5 mg/l

Pyridoxine-HCl 0.5 mg/l

Thiamine-HCl 0.1 mg/l

Sucrose 25 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6

* Basal Salts of Murashige & Skoog (1962)

Supplier: Caisson

Preparation:

1. To prepare 1 liter of culture medium dissolve 4.33 g of commercial MS salts in approximately 600 ml of

distilled deionized water.

2. Add 25 g of sucrose and dissolve by stirring.

3. Add 1 ml of MSA-BASE 1 stock solution (see Annex 2) previously defrosted. Stir.

4. Bring to a final volume of 1000 ml with distilled deionized water.

5. Measure the pH and adjust it to 5.6 ± 0.02 (see Annex 3 and 4).

6. Add 6.5 g of agar. Dissolve agar using a microwave oven (100% of intensity for 10 minutes pausing after

7 minutes in order to stir the medium).

7. Dispense the medium into test tubes using a dispensing pump. Cap the test tubes. Autoclave tubes for 20

minutes (at 122±2°C, 15 psi). When magenta vessels or petri dishes are used, first autoclave the medium in

a heat resistant glass bottle, then dispense it into sterile magenta vessels or petri dishes (in a laminar flow

chamber). Cover them with their sterile caps (in a laminar flow chamber).

8. Store the medium under refrigeration at 5±3°C (up to 1 month).

1.2 In vitro introduction medium (MSA-INT)


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MS Salts* 4.33 g/l


Glycine-HCl 2 mg/l

Myo-Inositol 100 mg/l


Pyridoxine-HCL 0.5 mg/l


Sucrose 25 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:

1. To prepare 1 liter of culture medium dissolve 4.33 g of commercial MS salts in approx. 600 ml of distilled

deionized water.





6. Add 3 g of Phytagel. Dissolve phytagel using a microwave oven (100% of intensity for 10 minutes pausing

after 7 minutes in order to stir the medium).

7. Dispense the medium into test tubes using a dispensing pump. Cap the test tubes. Autoclave the tubes for

20 minutes (at 122± 2°C, 15 psi). When magenta vessels or petri dishes are used, first autoclave the

medium in a heat resistant glass bottle, then dispense it into sterile magenta vessels or petri dishes. Close

them with their sterile covers (in a laminar flow chamber).


1.3 Conservation medium I (S22)


MS Salts* 4.33 g/l

Glycine-HCl 2 mg/l




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Sucrose 20 g/l

Sorbitol 20 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.

2. Add 20 g of sucrose and 20 g of sorbitol. Dissolve by stirring.







20 minutes (at 122±2°C, 15 psi).


1.4 Conservation medium II (S32)


MS Salts* 4.33 g/l

Glycine-HCl 2 mg/l





Sucrose 20 g/l

Sorbitol 30 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6


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Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.








20 minutes (at 122±2°C °C, 15 psi).


1.5 Conservation medium III (S42)


MS Salts* 4.33 g/l

Glycine-HCl 2 mg/l





Sucrose 20 g/l

Sorbitol 40 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.







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20 minutes (at 122±2°C, psi).


1.6 Meristem culture medium (MCMP)


MS Salts* 4.33 g/l

Glycine-HCl 2 mg/l






Coconut water 20 ml/l

Sucrose 25 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.

2. Add 25 g of sucrose. Dissolve by stirring.




6. Add 3 g of phytagel into a heat resistant glass bottle. Pour the medium into the bottle.

7. Autoclave the medium for 20 minutes (at 122±2°C, 15 psi).

8. Let the medium cool down until a temperature of 40-45°C is reached (in a laminar flow chamber). Add 20

ml of coconut water previously sterilized by a sterifil aseptic system (in a laminar flow chamber).

9. Dispense the medium into sterile test tubes using a sterile bottletop dispenser (in a laminar flow chamber).

Cap test tubes with sterile caps (in a laminar flow chamber). When magenta vessels or petri dishes are

used, first autoclave the medium in a heat resistant glass bottle, then dispense it into sterile magentas or

petri dishes and cover them with their sterile tops (in a laminar flow chamber).



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1.7 Rapid propagation medium (RPMP)


MS Salts* 4.33 g/l


Glycine-HCl 2 mg/l





L-Arginine 4 mg/l

Calcium pantothenate 2 mg/l

Putrescine-HCl 10 mg/l

Sucrose 30 g/l


pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.

2. Add 30 g of sucros. Dissolve by stirring.

3. Add 1 ml of MSA-BASE 1 stock solution (see Annex 2) previously defrosted, 4 mg of L-arginine, 2 mg of

calcium pantothenate and 10 mg of putrescine HCl. Stir.



6. Pour the medium into a heat resistant glass bottle.




9. Dispense the medium into sterile test tubes or magenta vessels using a sterile bottletop dispenser (in a

laminar flow chamber). Cover vessels with sterile caps or tops (in a laminar flow chamber).


1.8 Microtuberization medium (MTMP)



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MS Salts* 4.33 g/l

6-Benzylaminopurine (BAP) 5 mg/l

Chlorocholine chloride (CCC) 500 mg/l


Sucrose 80 g/l

pH 5.6


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.


3. Add 0.4 mg of thiamine-HCl, 5 mg of 6-benzylaminopurine (BAP) and 500 mg of Chlorocholine Chloride

(CCC). Stir.



6. Pour the medium into a heat resistant glass bottle.


8. Let the medium cool down until a temperature of 40-45°C is reached (in a laminar flow chamber).

9. By hand dispense 20 ml of medium per sterile magenta vessel (in a laminar flow chamber). Cover vessels

with sterile tops (in a laminar flow chamber).


6.2 2. Sweetpotato culture media

2.1 Medium for in vitro introduction and micropropagation (MPB)


MS Salts* 4.33 g/l


Calcium nitrate 100 mg/l

L-Arginine 100 mg/l

Ascorbic acid 200 mg/l

Putrescine HCl 20 mg/l

Gibberellic acid 10 mg/l


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Sucrose 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7

* Basal salts of Murashige & Skoog (1962)

Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.


3. Add 5 ml of MPB-BASE stock solution (see Annex 2) previously defrosted. Stir.

4. Add 5 ml of gibberellic acid stock solution (see Annex 2). Stir.



7. Add 3 g of phytagel. Dissolve phytagel using a microwave oven (100% of intensity for 10 minutes pausing



20 minutes (at 122±2°C,15 psi). When magenta vessels or petri dishes are used, first autoclave the medium

in a heat resistant glass bottle, then dispense it into sterile magenta vessles or petri dishes (in a laminar flow

chamber). Cover them with their sterile tops (in a laminar flow chamber).


2.2 In vitro recovery medium for plantlets with low viability (MPB2)


MS Salts* 4.33 g/l

Calcium Pantothenate 2 mg/l

Calcium Nitrate 100 mg/l

L-Arginine 100 mg/l



Gibberellic acid 20 mg/l


Sucrose 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7


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Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.



4. Add 10 ml of gibberellic acid stock solution (see Annex 2). Stir.



7. Add 3 g of phytagel into a heat resistant glass bottle. Pour the medium into the bottle.

8. Autoclave the medium for 20 minutes (at 122±2°C °C, 15 psi).



10. Dispense the medium into sterile test tubes or petri dishes using a sterile bottletop dispenser (in a

laminar flow chamber). Cover the vessels with their sterile caps or tops (in a laminar flow chamber).


2.3 Medium for the distribution (MCB) and conservation (MPB-cons) in vitro


MS Salts* 4.33 g/l


Calcium Nitrate 100 mg/l

L-Arginine 100 mg/l



Sucrose 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.






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6. Add 3 g of phytagel. Dissolve phytagel using a microwave oven (100% of intensity for 10 minutes pausing


7. Dispense the medium into test tubes using a dispensing pump. Cap the test tubes.Autoclave the tubes for

20 minutes (at 122±2°C, 15 psi). When magenta vessels or petri dishes are used, first autoclave the medium

in a heat resistant glass bottle, then dispense it into sterile magenta vessels or petri dishes (in a laminar flow

chamber). Cover them with their sterile tops (in a laminar flow chamber).


2.4 Meristem culture medium I: First Phase (MMB1)


MS Salts* 4.33 g/l



L-Arginine 100 mg/l



Gibberelic acid 20 mg/l


Sucrose 30 g/l

Agar 6 g/l

pH 5.7


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.


3. Add 1 ml of the following stock solutions: calcium pantothenate, calcium nitrate, L-Arginine and putrescine

HCl (see Annex 2). Add 0.5 ml of ascorbic acid stock solution (see Annex 2). Stir.



6. Add 6 g of agar into a heat resistant glass bottle. Pour the medium into the bottle.


8. Let the medium cool down until a temperature of 40-45°C is reached (in a laminar flow chamber).Add 10

ml of coconut water and 10 ml of gibberelic acid stock solution, both previously sterilized by a sterifil aseptic

system (in a laminar flow chamber).

9. Dispense the medium by hand into magenta vessels or petri dishes (in a laminar flow chamber).To


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dispense the medium into test tubes a bottletop dispenser is used (in a laminar flow chamber). Cover

vessels with their sterile caps or tops (in a laminar flow chamber).


2.5 Meristem culture medium II: Sub-culture (MMB2)


MS Salts* 4.33 g/l



L-Arginine 100 mg/l



Gibberelic acid 10 mg/l


Sucrose 30 g/l

Agar 6 g/l

pH 5.7


Supplier: Caisson

Preparation:


deionized water.


3. Add 1 ml of the following stock solutions: calcium pantothenate, calcium nitrate, L-Arginine and putrescine

HCl (see Annex 2) . Add 0.5 ml of ascorbic acid stock solution (see Annex 2). Stir.



6. Add 6 g of agar into a heat resistant glass bottle. Pour the medium into the bottle.



ml of coconut water and 5 ml of gibberelic acid stock solution, both previously sterilized by a sterifil aseptic

system (in a laminar flow chamber).

9. Dispense the medium by hand into magenta vessels or petri dishes (in a laminar flow chamber).To

dispense the medium into test tubes a bottletop dispenser is used (in a laminar flow chamber).Cover vessels

with their sterile caps or tops (in a laminar flow chamber).



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6.3 3. Bacterial Screening Medium

Nutritive Broth (NB)


Peptone 5.0 g/l

Yeast extract 2.0 g/l

Glucose 10.0 g/l

Sodium chloride 5.0 g/l

Meat extract 1.0 g/l

pH 7.0

Preparation:

1. Weigh 5.0 g of peptone, 2.0 g of yeast extract, 10.0 g of glucose, 5.0 g of Sodium chloride and 1.0 g of

meat extract.

2. Dissolve these compounds in approx. 600 ml of distilled deionized water. It is recommended first to

dissolve the meat extract in 1-2 ml of distilled water before pouring it into the solution.




20 minutes (at 122±2°C, 15 psi).



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7 Annex 2. Stock solutions2.1 MSA-BASE 1:


Gibberellic acid 0.1 mg/ml

Glycine-HCl 2 mg/ml

Myo-inositol 100 mg/ml

Nicotinic acid 0.5 mg/ml

Pyridoxine-HCl 0.5 mg/ml

Thiamine-HCl 0.1 mg/ml

Preparation:

1. Dissolve 500 mg of Glycine HCl, 125 mg of Nicotinic acid, 125 mg of Pyridoxine-HCl and 25 mg of

Thiamine-HCl in approx. 150 ml of distilled deionized water. Stir.

2. Add slowly 25 g of myo-inositol. Stir.

3. Dissolve 25 mg of gibberellic acid in 2 ml of etanol (96%). Add dissolved gibberellic acid to the

myo-inositol solution. Stir.

4. Bring to a final volume of 250 ml with distilled deionized water. Stir.

5. Dispense 2 ml of MSA-Base 1 stock solution per plastic vial. Cap vials.

6. Label vials correctly (name of solution, solution concentration [mg/ml], date of preparation).

7. Store the solution in freezer (up to 3 months at -20°C ).

2.2 MSA-BASE 2:


Glycine-HCl 2 mg/ml

Myo-inositol 100 mg/ml

Nicotinic acid 0.5 mg/ml

Pyridoxine-HCl 0.5 mg/ml

Thiamine-HCl 0.1 mg/ml

Preparation:

1. Dissolve 500 mg of Glycine HCl, 125 mg of Nicotinic acid, 125 mg of Pyridoxine-HCl and 25 mg of

Thiamine-HCl in approx. 150 ml of distilled water. Stir.

2. Add slowly 25 g of myo-inositol. Stir.


4. Dispense 2 ml of MSA-Base 1 stock solution per plastic vial. Cap vials.


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6. Store the solution in freezer (up to 3 months at -20°C ).

2.3 MPB-BASE:


Calcium pantothenate 0.4 mg/ml

Calcium nitrate 20 mg/ml

L-Arginine 20 mg/ml

Ascorbic Acid 40 mg/ml

Putrescine-HCl 4 mg/ml

Preparation:

1. Prepare the following 5 stock solutions:

(a) : Dissolve 200 mg of calcium pantothenate in approx. 60 ml of distilledCalcium pantothenate (2 mg/ml)

deionized water. Stir. Bring to a final volume of 100 ml with distilled deionized water. Stir.

(b) Dissolve 10 g of calcium nitrate in approx. 60 ml of distilled deionized water.Calcium nitrate (100 mg/ml):

Stir. Bring to a final volume of 100 ml with distilled deionized water. Stir.

(c) Dissolve 10 g of L-Arginine in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.L-Arginine (100 mg/ml):

Bring to a final volume of 100 ml with distilled deionized water. Stir.

(d) Dissolve 20 g of ascorbic acid in approx. 60 ml of distilled deionized water.Ascorbic Acid (200 mg/ml):


(e) Dissolve 2 g of putrescine-HCl in approx.60 ml of distilled deionized water.Putrescine-HCl (20 mg/ml):


2. Dispense 4 ml of each stock solution into a 20 ml plastic vial. Cap vials.


4. Store solution in freezer (up to 3 months at -20°C ).

2.4 Calcium pantothenate (2 mg/ml):

1. Dissolve 200 mg of calcium pantothenate in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.


3. Dispense solution into 20 ml plastic vials. Cap vials.


5. Store the solution under refrigeration (up to 1 month at 5±3°C ).

2.5 Calcium nitrate (100 mg/ml):

1. Dissolve 10 g of calcium nitrate in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.





2.6 L-Arginine (100 mg/ml):

1. Dissolve 10 g of L-Arginine in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.


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2.7 Ascorbic Acid (200 mg/ml):

1. Dissolve 20 g of ascorbic acid in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.





2.8 Putrescine-HCl (20 mg/ml):

1. Dissolve 2 g of putrescine-HCl in approx. 60 ml of distilled deionized water. Stir.





2.9 Gibberellic acid stock solution (2000 ppm):

1. Weigh 0.2 g of gibberellic acid.

2. Dissolve in approx. 5-10 ml of etanol (96%). Bring to a final volume of 100 ml with distilled deionized

water. Stir.

3. Dispense into 20 ml plastic vessels.

4. Label vessels correctly (name of solution, solution concentration [mg/ml], date of preparation).

5. Store stock solution under refrigeration at 5±3°C (up to 1 month).


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8 Annex 3. Preparation of solutions for pH

adjustmentGeneral Precautions:

Wear security mask, gloves and glasses.

Prepare the HCl (1N) and NaOH (1N) solutions in a chemical fume hood.

Open, close and handle concentrated solutions carefully (specially the concentrated HCl solution

[37%]).

Always use a pipette with a bulb. Never pipet by mouth.

While preparing the solutions have towel paper close to you.

HCl 1N:

Using a pipette with rubber bulb, dispense 16,5 mL of hydrochloric acid (37%) into a 250 ml glass

beaker with 100 ml of distilled deionized water. Mix with a glass stirring stick.

Bring to a final volume of 200 ml with distilled deionized water (using a 250 ml glass measuring

cylinder).

Pour the solution into a dark glass vessel of 250 ml. Cap the glass vessel carefully.

Label correctly (name of solution, solution concentration [N], date of preparation).

Store the solution at room temperature.

NaOH 1N:

Dissolve 8 g of sodium hydroxide (F.W. 40.00) in approx. 100 ml of distilled deionized water. Take

care when adding the NaOH to the water (exothermic reaction that releases energy in form of heat).

Mix with a glass stirring stick.

Bring to a final volume of 200 ml with distilled deionized water (using a 250 ml glass measuring

cylinder).

Pour the solution into a dark glass vessel

Label correctly (name of solution, solution concentration [N], date of preparation ). Cap the glass

vessel carefully.

Store the solution at room temperature.


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9 Annex 4. pH measurementGeneral indications :

Before immersing the pH-meter probe in a culture medium, storage or calibration solution, always

rinse it with distilled deionized water and carefully wipe it with a clean tissue paper.

When the probe is not in use it has to be stored in its specific storage solution.

The pH probe is daily calibrated by a trained technician (2-point calibration with pH 4.01 and 7.01

buffer solutions). The following information is recorded: date of calibration, name of technician who

performed the calibration, conformity.

Stir the solution while performing the pH measurements (magnetic stirrer). Take care that the probe

doesn't get in touch with the stirring bar.

To increse the pH of the culture medium to be adjusted add NaOH (1N) drop by drop. To lower the pH

of the solution to be adjusted add HCl (1N) drop by drop.

Specific indications :

More detalled information about pH measurement, calibration and maintenance of the pHmeters can be

found in its user manuals [see and ]inoLab pH 720 (brand: WTW) HI 255 (brand: HANNA Instruments)

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/pHmeter_InoLab%20pH%20720_english.pdf?version=1&modificationDate=1300984538000&api=v2

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/pHmeter_HANNA%20HI%20255_english.pdf?version=1&modificationDate=1300977584000&api=v2


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10 Annex 5. Components of MS salts


Ammonium Nitrate (NH NO )4 3 1650 mg/l

Boric Acid (H BO )3 3 6.2 mg/l

Calcium Chloride, Anhydrous (CaCl )2 332.2 mg/l

Cobalt Chloride, Hexahydrate (CoCl .6H 0)2 2 0.025 mg/l

Cupric Sulfate, Pentahydrate (CuSO .5H O)4 2 0.025 mg/l

EDTA, Disodium, Dihydrate (C H N Na O .2H O)10 14 2 2 8 2 37.26 mg/l

Ferrous Sulfate, Heptahydrate (FeSO .7H O)4 2 27.8 mg/l

Magnesium Sulfate, Anhydrous (MgSO )4 180.7 mg/l

Manganese Sulfate, Monohydrate (MnSO .H O)4 2 16.9 mg/l

Molybdic Acid Sodium Salt, Dihydrate (Na MoO .2H O)2 4 2 0.25 mg/l

Potassium Iodide (KI) 0.83 mg/l

Potassium Nitrate (KNO )3 1900 mg/l

Potassium Phosphate, Monobasic, Anhydrous (KH PO )2 4 170 mg/l

Zinc Sulfate, Heptahydrate (ZnSO .7H O)4 2 8.6 mg/l


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11 ReferencesMurashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue

cultures. Plant Physiology. 15: 473-479


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12 INTRODUCCION

La utilización de un medio de cultivo específico depende del objetivo de cultivo . Generalmentein vitro

contienen los medios una fuente de carbono, nutrientes minerales, vitaminas, agente gelificante (para el

caso de medios semisólidos), sustancias reguladoras de crecimiento y otros compuestos como por

ejemplo sustancias antioxidantes. La preparación de los medios de cultivo constituye un paso crítico para

el éxito del cultivo . Es necesario utilizar reactivos de alto grado de pureza y agua destiladain vitro

desionizada. El procedimiento para la preparación de los medios depende del tipo de medio (semisólido o

líquido) y de la presencia de compuestos termolábiles.


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13 ALCANCE

El presente protocolo describe la preparación de los medios de cultivo de papa y camote utilizados en las

actividades de conservación y multiplicación. del Banco de Germoplasma


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14 SEGURIDAD

Ver ?Good practices during in vitro activities- OP106

Ver [Manual de Salud y Seguridad del CIP ]

https://research.cip.cgiar.org/confluence/display/gadc/Good+practices+during+in+vitro+activities

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/Buenas_practicas_banco_in_vitroAgosto2012_ap_Sep14.pdf?version=1&modificationDate=1347736350000&api=v2


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15 MATERIALES

Equipos

Autoclave Bomba dosificadora

pH-metro Balanza analítica

Cámara de flujo laminar Agitador magnético

Refrigerador Microondas

Destilador de agua Bomba de vacio

Sistema sterifil (MILLIPORE) Dispensador de botella

Campana extractora

Otros materiales

Tubos de ensayo (13x100 mm, 16x125 mm,

18x150 mm, 25x150mm)

Platillos para pesar

Tapas para tubos de ensayo Gradillas autoclavables

Espátulas Magentas

Etiquetas Vasos de precipitación de plástico (1, 2 y 4 litros)

Cinta indicadora de autoclave Viales de plástico (2 y 20 ml)

Botellas de vidrio autoclavables (1 litro) Pipetas de plástico estériles (1, 5 y 10 ml)

Placas petri descartables (100 x 15 mm) Probetas de plástico

(100 ml; 500 ml; 1000 ml; 2000 ml)

Membranas de nitrocelulosa

(MILLIPORE, TYPE 0,22 um GSWP)

Prefiltros (MILLIPORE, TIPO AP15, 47 mm)

Bagueta de vidrio Magnetos rotatorios

Guantes de plástico Lentes de seguridad

Máscara de seguridad Probeta de vidrio (250 ml)

Bulbo de hule (para pipetas)

Compuestos químicos Temperatura de

almacenamiento (**)

Sales MS (*) 5±3 °C


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Compuestos químicos Temperatura de

almacenamiento (**)

Ácido nicotínico Lugar fresco

Piridoxina-HCl Lugar fresco

Ácido giberélico Lugar fresco

Sacarosa Lugar fresco

Phytagel Lugar fresco

Pantotenato de calcio Lugar fresco

Putrescina-HCl Lugar fresco

6-Bencilaminopurina (BAP) Lugar fresco

Ácido ascórbico Lugar fresco

Extracto de levadura Lugar fresco

Glucosa Lugar fresco

Ácido clorhídrico (37%) Lugar fresco

Agua destilada desionizada Lugar fresco

mio-Inositol Lugar fresco

Glicina-HCl Lugar fresco

Tiamina-HCl Lugar fresco

Sorbitol Lugar fresco

Agar Lugar fresco

Agua de coco Lugar fresco

Nitrato de calcio Lugar fresco

L-Arginina Lugar fresco

Cloruro de clorocolina (CCC) Lugar fresco

Peptona Lugar fresco

Cloruro de sodio Lugar fresco

Extracto de carne Lugar fresco

Hidróxido de sodio Lugar fresco

Alcohol (96%) Lugar fresco


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(*) Sales basales de Murashige & Skoog; Proveedor: CAISSON

(**) Conforme la hoja de Datos de Seguridad de Materiales (ingl.: MSDS)


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16 2. PROCEDIMIENTO

2.1 Preparar los medios de cultivo de acuerdo a su composición específica (ver Anexo 1). Antes de

iniciar, verificar que todos los compuestos químicos no han expirado.

2.2 En un vaso de precipitación de plástico limpio y resistente al calor, colocar un magneto rotatorio y

agregar agua destilada desionizada hasta aprox. 2/3 del volumen a preparar. Colocar el envase sobre un

agitador magnético a una velocidad de aprox. 50 a 100 rpm.

2.3 Asegurar que la balanza analítica está nivelada adecuadamente. Tarar el platillo para pesar antes de

cada pesada . Pesar cada uno de los componentes de acuerdo a la composición específica del medio de

cultivo (ver Anexo 1).

2.4 Agregar los ingredientes al vaso de precipitación, excepto el agente gelificante. Esperar hasta que

todos los ingredientes se disuelvan completamente.

2.5 Enrasar con agua destilada desionizada al volumen indicado (usando una probeta de plástico).

2.6 Medir el pH y ajustar con soluciones de NaOH (1N) y/o HCl (1N) hasta alcanzar el valor deseado (±

0.02).

2.7 Para la preparación de los medios semisólidos que no contienen compuestos termolábiles, agregar el

agente gelificante y calentar el medio en el microondas. Calentar el medio por 10 minutos para cada litro

(100% de intensidad) haciendo una pausa a los 7 minutos para agitar el medio. Evitar el hervido del

medio de cultivo. Mientras, colocar en gradillas autoclavables el tipo y cantidad deseados de tubos de

ensayo. Dispensar el medio de cultivo en tubos de ensayo utilizando la bomba dosificadora: 2-3 ml por

tubo de 13x100 mm, 4-6 ml por tubo de 16x125 mm, 7-8 ml por tubo de 18x150 mm y 10-12 ml por tubo

de 25x150 mm. Tapar los tubos con sus tapas correspondientes.

2.8 Para preparar medios de cultivo que contengan sustancias termolábiles, primero colocar el agente

gelificador en una botella de vidrio autoclavable para luego vaciar el medio de cultivo en la botella. No

cerrar la botella completamente para que pueda salir el vapor de agua desde la botella al autoclavar (de

otra manera la botella podría quebrarse).

2.9 Registrar en la base de datos del Banco de Germoplasma y la lista física de preparación de medio los

siguientes datos: género, técnico, fecha, tipo de medio, medio, número de etiquetas, volumen y pH.

Grabar e imprimir las etiquetas. Pegar una etiqueta y un trozo de cinta autoclavable encima de cada

gradilla y/o botella autoclavables. Autoclavar por 20 minutos a 122±2°C y 15 psi.

2.10 Medio de cultivo sin ingredientes termolábiles: dejar enfriar el medio a temperatura ambiente.

Almacenar el medio en el refrigerador a 5±3°C (hasta por 1 mes).

2.11 Medio de cultivo con ingredientes termolábiles: habiéndose terminado el proceso de autoclavado ,

cerrar la(s) botella(s) por completo (dentro del autoclave). Transferir las botella(s) hacia una cámara de

flujo laminar y dejarla(s) enfriar a una temperatura de 40-45 ºC.

Agregar con una pipeta estéril de plástico los ingredientes termolábiles, que previamente fueron

esterilzados con un sistema sterifil. Agitar y dispensar el medio de cultivo a mano en placas petri


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descartables o magentas estériles o vía un dispensador para botellas en tubos de ensayo estériles.

Dispensar 20-25 ml y 25-35 ml de medio de cultivo por placa petri y magenta respectivamente. Almacenar

el medio en el refrigerador a 5±3°C (hasta por 1 mes).


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17 Anexo 1. Formulación de medios de cultivo

17.1 1. Medios de cultivo de papa

1.1 Medio de propagación (MSA)

Componentes Concentración

Sales MS* 4.33 g/l

Ácido giberélico 0.1 mg/l

Glicina-HCl 2 mg/l

mio-Inositol 100 mg/l

Ácido nicotínico 0.5 mg/l

Piridoxina-HCl 0.5 mg/l

Tiamina-HCl 0.1 mg/l

Sacarosa 25 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6

* Sales basales de Murashige y Skoog (1962)

Proveedor: CAISSON

Preparación:

1. Para preparar 1 litro de medio de cultivo disolver 4.33 g de sales MS comerciales en aprox. 600 ml de

agua destilada desionizada.

2. Agregar 25 g de sacarosa y agitar hasta disolver.

3. Agregar 1 ml de la solución stock MSA-BASE 1 (ver Anexo 2) previamente descongelada. Agitar.

4. Enrasar con agua destilada desionizada a 1000 ml.

5. Medir el pH y ajustarlo a 5.6 ± 0.02 (ver Anexo 3 y 4).

6. Agregar 6.5 g de agar. Disolver el agar en caliente (en horno microondas: 100% de intensidad por 10

minutos, haciendo una pausa a los 7 minutos para agitar el medio).

7. Dispensar el medio en tubos de ensayo utilizando la bomba dosificadora. Tapar los tubos de ensayo con

sus tapas respectivas. Autoclavar los tubos por 20 minutos (a 122±2°C, 15 psi). Si se utiliza magentas o

placas petri, se autoclava primero el medio en botellas autoclavables para luego dispensarlo en magentas o

placas petris descartables estériles (en la cámara de flujo laminar). Taparlos con sus respectivas tapas

estériles (en la cámara de flujo laminar).

8. Conservar el medio bajo refrigeración a 5±3°C (hasta 1 mes)

1.2 Medio para la introducción in vitro (MSA-INT)


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Sales MS* 4.33 g/l


Glicina-HCl 2 mg/l





Sacarosa 25 g/l

Phytagel 3 g/l

PH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:

1. Para preparar 1 litro de medio de cultivo disolver 4.33 g de sales MS comerciales en aprox. 600 ml de

agua destilada desionizada.

2. Agregar 25 g de sacarosa y agitar hasta disolver.




6. Agregar 3 g de phytagel. Disolver el phytagel en caliente (en horno microondas: 100% de intensidad por

10 minutos, haciendo una pausa a los 7 minutos para agitar el medio).



placas petri, se autoclava primero el medio en botellas autoclavables para luego dispensarlo en magentas o

placas petris descartables estériles (en la cámara de flujo laminar). Taparlos con sus respectivas tapas

estériles (en la cámara de flujo laminar).


1.3 Medio de conservación I (S22)

Componentes Concentratión |

Sales MS* 4.33 g/l

Glicina-HCl 2 mg/l



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Sacarosa 20 g/l

Sorbitol 20 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:

1. Para preparar 1 litro de medio disolver 4.33 g de sales MS comerciales en aprox. 600 ml de agua

destilada desionizada.

2. Agregar 20 g de sacarosa y 20 g de sorbitol. Agitar hasta disolver.

3. Agregar 1 ml de la solución stock MSA-BASE 2 (ver Anexo 2) previamente descongelada. Agitar

4. Enrasar con agua destilada desionizada a 1000 ml .





sus tapas respectivas. Autoclavar los tubos por 20 minutos (a 122±2°C, 15 psi).


1.4 Medio de conservación II (S32)


Sales MS* 4.33 g/l

Glicina-HCl 2 mg/l





Sacarosa 20 g/l

Sorbitol 30 g/l

Agar 6.5 g/l


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pH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:










sus tapas respectivas.

8. Autoclavar los tubos por 20 minutos (a 122±2°C, 15 psi).


1.5 Medio de conservación III (S42)


Sales MS* 4.33 g/l

Glicina-HCl 2 mg/l





Sacarosa 20 g/l

Sorbitol 40 g/l

Agar 6.5 g/l

pH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:






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sus tapas respectivas.

8. Autoclavar los tubos por 20 minutos (a 122±2°C, 15 libras de presión).


1.6 Medio para el cultivo de meristemos (MMP)


Sales MS* 4.33 g/l

Glicina-HCl 2 mg/l






Agua de coco 20 ml/l

Sacarosa 25 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:



2. Agregar 25 g de sacarosa. Agitar hasta disolver.




6. Agregar 3 g de phytagel en una botella de vidrio autoclavable. Verter el medio en la botella.

7. Autoclavar el medio por 20 minutos (a 122±2°C, 15 psi).

8. Dejar enfriar el medio a una temperatura de 40-45 °C (en la cámara de flujo laminar). Agregar 20 ml de

agua de coco previamente esterilizada vía un sistema sterifil estéril (en la cámara de flujo laminar).

9. Dispensar el medio con un dispensador de botella estéril en tubos de ensayo estériles (en la cámara de

flujo laminar). Tapar los tubos de ensayo con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo laminar).


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Si se utiliza magentas o placas petri, se autoclava primero el medio para luego dispensarlo en magentas o

placas petris descartables estériles (en la cámara de flujo laminar). Taparlos con sus tapas estériles

respectivas (en la cámara de flujo laminar).


1.7 Medio de propagación rápida (MPR)


Sales MS* 4.33 g/l


Glicina-HCl 2 mg/l





L-arginina 4 mg/l

Pantotenato de calcio 2 mg/l

Putrescina HCl 10 mg/l

Sacarosa 30 g/l


pH 5.6


Proveedor: CAISSON

Preparación:




3. Agregar 1 ml de la solución stock MSA-BASE 1 (ver Anexo 2) previamente descongelada, 4 mg de

L-Arginina, 2 mg the pantotenato de calcio y 10 mg de putrescina-HCl. Agitar.



6. Agregar 3 g de phytagel en una botella de vidrio resistente al calor. Verter el medio en la botella.



agua de coco previamente esterilizada vía un sistema sterifil estéril (en la cámara de flujo laminar).


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9. Dispensar el medio con un dispensador de botella estéril en tubos de ensayo estériles (en la cámara de

flujo laminar). Tapar los tubos de ensayo con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo laminar).


1.8 Medio de inducción de microtuberización (PTM)


Sales MS* 4.33 g/l

6-Benzilaminopurina (BAP) 5 mg/l

Cloruro de Clorocolina (CCC) 500 mg/l


Sacarosa 80 g/l

pH 5.6

* Sales basales de Murashige y Skoog (1962).

Proveedor: CAISSON

Preparación:




3. Agregar 0.4 mg de tiamina-HCl, 5 mg de 6-bencilaminopurina (BAP) y 500 mg de cloruro de clorocolina

(CCC). Agitar hasta disolver.



6. Verter el medio a una botella de vidrio autoclavable.

7. Autoclavar el medio por 20 minutos (a 122±2°C, 15 libras de presión).

8. Dejar enfriar el medio a una temperatura de 40-45 °C (en la cámara de flujo laminar).

9. Dispensar a mano 20 ml de medio por magenta estéril (en la cámara de flujo laminar). Tapar las

magentas con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo laminar).


17.2 2. Medios de cultivo de camote

2.1 Medio para la introducción in vitro y micropropagación (MPB)


Sales MS* 4.33 g/l

Pantotenato de Calcio 2 mg/l

Nitrato de Calcio 100 mg/l


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L-Arginina 100 mg/l

Ácido ascórbico 200 mg/l


Ácido Giberélico 10 mg/l

Sacarosa 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7


Proveedor: CAISSON

Preparación:




3. Agregar 5 ml de la solución stock MPB-BASE (ver Anexo 2) previamente descongelada. Agitar.

4. Agregar 5 ml de solución stock de ácido giberélico (ver Anexo 2). Agitar.

5. Enrasar a con agua destilada desionizada a 1000 ml .






placas petri, se autoclava primero el medio en botellas autoclavables para luego dispensarlo a mano en

magentas o placas petris descartables estériles (en la cámara de flujo laminar). Taparlos con sus

respectivas tapas estériles (en la cámara de flujo laminar).


2.2 Medio para recuperación de plántulas in vitro con baja viabilidad (MPB2)


Sales MS* 4.33 g/l



L-Arginina 100 mg/l



Ácido Giberélico 20 mg/l


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Sacarosa 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7


Proveedor: CAISSON

Preparación:





4. Agregar 10 ml de la solución stock de ácido giberélico (ver Anexo 2). Agitar.



7. Agregar 3 g de phytagel en una botella de vidrio autoclavable. Verter el medio en la botella.



agua de coco previamente esterilizada con un sistema sterifil estéril (en la cámara de flujo laminar).

10. Dispensar el medio con un dispensador de botella en tubos de ensayo o placas petri estériles (en la

cámara de flujo laminar). Tapar los contenedores con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo

laminar).


2.3 Medio para la distribución (MCB) y conservación (MPB-cons) in vitro


Sales MS* 4.33 g/l



L-Arginina 100 mg/l



Sacarosa 30 g/l

Phytagel 3 g/l

pH 5.7


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Proveedor: CAISSON

Preparación:









7. Dispensar el medio en tubos de ensayo. Tapar los tubos de ensayo con sus tapas respectivas. Autoclavar

los tubos por 20 minutos (a 122±2°C, 15 psi). Si se utiliza magentas o placas petri, se autoclava primero el

medio en botellas autoclavables para luego dispensarlo a mano en magentas o placas petris descartables

estériles (en la cámara de flujo laminar). Taparlos con sus respectivas tapas estériles (en la cámara de flujo

laminar).


2.4 Medio para cultivo de meristemos I: fase inicial (MPM1)


Sales MS* 4.33 g/l


Nitrato de calcio 100 mg/l

L-Arginina 100 mg/l



Ácido giberélico 20 mg/l


Sacarosa 30 g/l

Agar 6 g/l

pH 5.7


Proveedor: CAISSON

Preparación:




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3. Agregar 1 ml de las soluciones stock de pantotenato de calcio, nitrato de calcio, putrescina HCl y

L-Arginina. Agregar 0.5 ml de la solución stock de ácido ascórbico (ver Anexo 2). Agitar.

4. Enrasar a con agua destilada desionizada a 980 ml.


6. Agregar 6 g de agar en una bottela de vidrio autoclavable. Verter el medio en la botella.



agua de coco y 10 ml de ácido giberélico previamente esterilizados con un sistema sterifil estéril (en la

cámara de flujo laminar).

9. Dispensar el medio en tubos de ensayo o placas petri estériles (en la cámara de flujo laminar). Tapar los

contenedores con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo laminar.


2.5 Medio para cultivo de meristemos II: Sub-cultivo (MPM2)


Sales MS* 4.33 g/l


Nitrato de calcio 100 mg/l

L-Arginina 100 mg/l



Ácido giberélico 10 mg/l


Sacarosa 30 g/l

Agar 6 g/l

pH 5.7


Proveedor: CAISSON

Preparación:




3. Agregar 1 ml de las soluciones stock de pantotenato de calcio, nitrato de calcio, putrescina HCl y

L-Arginina. Agregar 0.5 ml de la solución stock de ácido ascórbico (ver Anexo 2). Agitar.




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6. Agregar 6 g de agar en una bottela de vidrio autoclavable. Verter el medio en la botella.



agua de coco y 5 ml de ácido giberélico previamente esterilizados con un sistema sterifil estéril (en la

cámara de flujo laminar).

9. Dispensar el medio en tubos de ensayo o placas petri estériles (en la cámara de flujo laminar). Tapar los

contenedores con sus tapas estériles respectivas (en la cámara de flujo laminar).

10. Conservar el medio bajo refrigeración a 5±3°C (hasta 1 mes).

17.3 3. Medio para detección de bacterias

Caldo Nutritivo(CN)


Peptona 5.0 g/l

Extracto de levadura 2.0 g/l

Glucosa 10.0 g/l

Cloruro de sodio 5.0 g/l

Extracto de carne 1.0 g/l

pH 7.0

Preparación:

1. Pesar 5.0 g de peptona, 2.0 g de extracto de levadura, 10.0 g de glucosa, 5.0 g de cloruro de sodio, y 1.0

g de extracto de carne.

2. Disolver estos compuestos en aprox. 600 ml de agua destilada desionizada. Se recomienda disolver el

extracto de carne primero en 1-2 ml de agua antes de agregarlo a la solución.



5. Dispensar en tubos de ensayo. Tapar los tubos de ensayo con sus tapas respectivas. Autoclavar el caldo

por 20 minutos (a 121 °C, 15 psi).

6. Conservar el caldo bajo refrigeración a 5±3°C (hasta 1 mes).


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18 Anexo 2. Soluciones Stock2.1 MSA-BASE 1:


Ácido giberélico 0.1 mg/ml

Glicina-HCl 2 mg/ml

mio-Inositol 100 mg/ml

Ácido nicotínico 0.5 mg/ml

Piridoxina-HCl 0.5 mg/ml

Tiamina-HCl 0.1 mg/ml

Preparación:

1. Disolver 500 mg de glicina, 125 mg de ácido nicotínico, 125 mg de piridoxina HCl, y 25 mg de tiamina en

aprox. 150 ml de agua destilada desionizada. Agitar.

2. Agregar lentamente 25 g de myo-Inositol. Agitar.

3. Disolver 25 mg de ácido giberélico en aprox. 2 ml de etanol (96%). Agregar el ácido giberélico disuelto a

a la solución de mio-inositol. Agitar.


5. Dispensar 2 ml de la solución stock de MSA-BASE 1 por vial de plástico de 2 ml. Tapar viales.

6. Etiquetar los viales correctamente (nombre de solución, concentración de solución [mg/ml], fecha de

preparación)

7. Almacenar los viales en la congeladora (-20°C) por un tiempo máximo de 3 meses.

2.2 MSA-BASE 2


Glicina-HCl 2 mg/ml

mio-inositol 100 mg/ml

Ácido nicotínico 0.5 mg/ml

Piridoxina-HCl 0.5 mg/ml

Tiamina-HCl 0.1 mg/ml

Preparación:

1. Disolver 500 mg de glicina, 125 mg de ácido nicotínico, 125 mg de piridoxina HCl, y 25 mg de tiamina en

aprox. 150 ml de agua destilada desionizada. Agitar.

2. Agregar lentamente 25 g de myo-Inositol. Agitar.



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4. Dispensar 2 ml de solución stock de MSA-BASE 2 por vial de plástico de 2 ml. Tapar viales.

5. Etiquetar los viales correctamente (nombre de solución, concentración de solución [mg/ml], fecha de

preparación)


2.3 MPB-BASE


Pantotenato de calcio 0.4 mg/ml

Nitrato de calcio 20 mg/ml

L-Arginina 20 mg/ml

Ácido ascórbico 50 mg/ml

Putrescina-HCl 4 mg/ml

1. Preparar las siguientes 5 soluciones stock:

(a) : Disolver 200 mg de pantotenato de calcio en aprox. 60 ml de aguaPantotenato de calcio (2 mg/ml)

destilada desionizada. Agitar. Enrasar con agua destilada desionizada a 100 ml. Agitar.

(b) Disolver 10 g de nitrato de calcio en aprox. 60 ml de agua destiladaNitrato de calcio (100 mg/ml):

desionizada. Agitar. Enrasar con agua destilada desionizada a 100 ml. Agitar.

(c) Disolver 10 g de L-Arginina en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada.L-Arginina (100 mg/ml):

Agitar. Enrasar con agua destilada desionizada a 100 ml. Agitar.

(d) Disolver 20 g de ácido ascórbico en aprox. 60 ml de agua destiladaÁcido ascórbico (200 mg/ml):


(e) Disolver 2 g de putrescina-HCl en aprox. 60 ml de agua destiladaPutrescina-HCl (20 mg/ml):


2. Dispensar 4 ml de cada solución stock en un vial de plástico de 20 ml. Tapar viales.

3. Etiquetar correctamente (nombre de solución, concentración [mg/ml], fecha de preparación).


2.4 Pantotenato de calcio (2 mg/ml)

1. Disolver 200 mg de pantotenato de calcio en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar

2. Enrasar con agua destilada desionizada a 100 ml. Agitar.

3. Dispensar la solución en viales de plástico de 20 ml.


5. Conservar la solución bajo refrigeración a 5±3°C (hasta 1 mes).

2.5 Nitrato de calcio (100 mg/ml)

1. Disolver 10 g de nitrato de calcio en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar




5. Conservar la solución bajo refrigeración a 4 °C (hasta 1 mes).


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2.6 L-Arginina (100 mg/ml)

1. Disolver 10 g de L-Arginina en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar





2.7 Ácido ascórbico (200 mg/ml)

1. Disolver 20 g de ácido ascórbico en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar





2.8 Putrescina-HCl (20 mg/ml)

1. Disolver 2 g de putrsecina-HCl en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar





2.9 Ácido giberélico (2 mg/ml)

1. Disolver 200 mg de ácido giberélico en aprox. 60 ml de agua destilada desionizada. Agitar






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19 Anexo 3. Preparación de soluciones para el

ajuste de pHPrecauciones generales:

Utilizar guantes, máscara, y lentes de seguridad.

Preparar las soluciones HCl (1N) y NaOH (1N) bajo una campana extractora.

Abrir, cerrar y manipular las soluciones concentradas con mucho cuidado (especialmente la solución

concentrada de HCl [37%]).

Siempre utilizar una pipeta con bulbo de hule. Nunca pipetear directamente con la boca.

Tener papel toalla a mano durante la preparación de las soluciones.

HCl 1N:

Con una pipeta con bulbo de hule dispensar 16.5 ml de ácido clorhídrico concentrado (37 %) sobre

aprox. 100 ml de agua destilada desionizada (en un vaso de precipitación de vidrio de 250 ml).

Enrasar con agua destilada desionizada a 200 ml (utlizando una probeta de vidrio de 250 ml)

Verter la solución en un vaso de vidrio oscuro de 250 ml. Tapar el vaso con su tapa.

Etiquetar correctamente (nombre de solución, concentración [N], fecha de preparación).

Almacenar la solución a temperatura ambiental.

NaOH 1N:

Disolver 8 g de hidróxido de sodio (F.W. 40.00) en aprox. 100 ml de agua destilada desionizada (en

un vaso de precipitación de vidrio de 250 ml). Tener mucho cuidado al agregar el NaOH (reacción

exotérmica que libera energía en forma de calor). Agitar con una barrita de vidrio.

Enrasar con agua destilada desionizada a 200 ml (utlizando una probeta de vidrio de 250 ml)

Verter la solución en un vaso de vidrio oscuro de 250 ml. Tapar el vaso con su tapa.

Etiquetar correctamente (nombre de solución, concentración [N], fecha de preparación).

Almacenar la solución a temperatura ambiental.


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20 Anexo 4. Medición de pHIndicaciones generales:

Antes de sumergir la sonda del pHmetro en un medio de cultivo o solución de

calibración/almacenamiento enjuagarla con agua destilada desionizada y secarla cuidadosamente

con un limpio pliegue de papel toalla.

Si la sonda no se encuentra en uso, almacenarla en su solución de almacenamiento específica.

La sonda de pH se calibra diariamente por un técnico capacitado (calibración de 2 puntos con

soluciones buffer de pH 4.01 y 7.01). Registrar la siguiente información: fecha de calibración, nombre

del técnico que realizó la calibración, conformidad.

Mantener el medio de cultivo bajo agitación mientras se realiza la medición de pH (agitador

magnético con magneto rotatorio). Tener cuidado que la sonda no entre en contacto con el magneto

rotatorio.

Para incrementar el pH del medio de cultivo a ajustar agregar NaOH (1N), gota por gota. Para bajar

el pH del medio de cultivo a ajustar agregar HCl (1N), gota por gota.

Indicaciones específicas:

Información detallado sobre la medición de pH, calibración y mantenimiento del phmetro puede ser

encontrada en los manuales de usuario de los pHmetros y inoLab pH 720 (marca:WTW) HI 255 (marca:

.HANNA Instruments)

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/pHmetro_InoLab%20pH%20720_espa%C3%B1ol.pdf?version=1&modificationDate=1301090522000&api=v2

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/pHmetro_HANNA%20HI%20255_espa%C3%B1ol.pdf?version=1&modificationDate=1301090557000&api=v2

https://research.cip.cgiar.org/confluence/download/attachments/6783064/pHmetro_HANNA%20HI%20255_espa%C3%B1ol.pdf?version=1&modificationDate=1301090557000&api=v2


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21 Anexo 5. Componentes de sales MS


Nitrato de Amonio (NH NO )4 3 1650 mg/l

Ácido Bórico (H BO )3 3 6.2 mg/l

Cloruro de Calcio, Anhidro (CaCl )2 332.2 mg/l

Cloruro de Cobalto, Hexahidratado (CoCl .6H 0)2 2 0.025 mg/l

Sulfato de Cobre, Pentahidratado (CuSO .5H O)4 2 0.025 mg/l

EDTA, Disodium, Dihidratado (C H N Na O .2H O)10 14 2 2 8 2 37.26 mg/l

Sulfato Ferroso, Heptahidratado (FeSO .7H O)4 2 27.8 mg/l

Sulfato de Magnesio, Anhidro (MgSO )4 180.7 mg/l

Sulfato de Manganeso, Monohidratado (MnSO .H O)4 2 16.9 mg/l

Molibdato Sódico, Dihidratado (Na MoO .2H O)2 4 2 0.25 mg/l

Yoduro de Potasio (KI) 0.83 mg/l

Nitrato de Potasio (KNO )3 1900 mg/l

Fosfato de Potasio, Monobásico, Anhidro (KH PO )2 4 170 mg/l

Sulfato de Zinc, Heptahidratado (ZnSO .7H O)4 2 8.6 mg/l


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22 ReferenciaMurashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue

cultures. Plant Physiology. 15: 473-479

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