Effective infection, apoptotic cell killing and gene transfer of human hepatoma cells but not...

10
Effective infection, apoptotic cell killing and gene transfer of human hepatoma cells but not primary hepatocytes by parvovirus H1 and derived vectors Markus Moehler, 1 Boris Blechacz, 2 Nancy Weiskopf, 1 Maja Zeidler, 1 Wolfgang Stremmel, 2 Jean Rommelaere, 3,4 Peter R. Galle, 1 and Jan J. Cornelis 3,4 1 Department of Internal Medicine, University of Mainz, Mainz D-55101, Germany; 2 Department of Gastroenterology, University Hospital Heidelberg, Heidelberg D-69115, Germany; 3 Deutsches Krebsforschungszentrum, Applied Tumor Virology Department F0100, Heidelberg D-69120, Germany; and 4 Institut National de la Sante  et de la Recherche Me Âdicale Unite  375, Heidelberg D-69120, Germany. Autonomous parvoviruses preferentially replicate in and kill in vitro ± transformed cells and reduce the incidence of spontaneous and implanted tumors in animals. Because of these natural oncotropic and oncolytic properties, parvoviruses deserve to be considered as potential antitumor vectors. Here, we assessed whether parvovirus H1 is able to kill human hepatoma cells by induction of apoptosis but spares primary human liver cells, and whether the former cells can efficiently be transduced by H1 virus ± based vectors. Cell death, infectivity, and transgene transduction were investigated in Hep3B, HepG2, and Huh7 cells and in primary human hepatocytes with natural and recombinant H1 virus. All hepatoma cells were susceptible to H1 virus ± induced cytolyis. Cell death correlated with H1 virus DNA replication, nonstructural protein expression, and with morphological features of apoptosis. H1 virus ± induced apoptosis was more pronounced in p53 - deleted Hep3B and p53 - mutated Huh7 cells than in HepG2 cells which express wild - type p53. In Hep3B cells, apoptosis was partially inhibited by DEVD - CHO, a caspase - 3 inhibitor. In contrast, H1 virus ± infected primary hepatocytes were neither positive for nonstructural protein expression nor susceptible to H1 virus ± induced killing. Infection with a recombinant parvovirus vector carrying the luciferase gene under control of parvovirus promoter P38 led to higher transgene activities in hepatoma cells than in the hepatocytes. Taken together, H1 virus kills human hepatoma cells at low virus multiplicity but not primary hepatocytes. Thus, recombinant H1 viruses carrying antitumor transgenes may be considered as potential therapeutic options for the treatment of hepatocellular carcinomas. Cancer Gene Therapy ( 2001 ) 8, 158 ± 167 Key words: Autonomous parvovirus; apoptosis; human; hepatocellular carcinoma; hepatocytes. H uman hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies and causes, with increas- ing incidence, an estimated 1 million deaths per year worldwide. 1,2 Unfortunately, surgical resection or liver transplantation, which can be curative for HCC, is appro- priate treatment modality for only a minority of selected patients. None of the established medical options, such as percutaneous ethanol injection, transcatheter arterial che- moembolization, or systemic chemotherapy, has signifi- cantly improved the prognosis of patients with unresectable HCC. 2,3 These discouraging results have necessitated the search for new therapeutic strategies. The development of gene transfer techniques for cancer therapy is a rapidly expanding field: for HCC, different recombinant viruses have been assessed to transfer (a) suicide genes that convert inactive prodrugs into cytotoxic compounds; (b) cytokine genes that enhance immunogeni- city of tumors; or (c) tumor-suppressor genes to block tumor cell proliferation. 4±9 Several of the viral delivery systems are limited by pathogenic or immunogenic side effects. 10,11 We have considered the possibility of using autonomous parvoviruses as alternative vectors for tumor cell±targeted gene therapy, in particular because of their oncotropic and oncolytic activities. 12 Parvoviruses are a group of small, nonenveloped viruses replicating in the nucleus containing a linear single - stranded DNA molecule about 5 kb long and bracketed by nonidentical palindromic hairpin loops. 13 Autonomously growing parvoviruses of rodent origin, hereafter referred to as parvoviruses, are seldom pathogenic to their natural adult hosts. 14 The rat virus H1 infects humans without any apparent clinical consequences. 12,15 The low genetic com- plexity of autonomous parvoviruses renders their replication tightly dependent on cellular S - phase ± associated factors. 13 The H1 virus has two overlapping transcription units. 13 Transcripts from the left - handed promoter (P4) are translated into the nonstructural proteins NS1 and NS2. The right-hand P38 promoter directs the synthesis of the Received June 2, 2000; accepted January 5, 2001. Address correspondence and reprint requests to Dr. Markus Moehler, I. Department of Internal Medicine of Johannes- Gutenberg University of Mainz, Langenbeckstr. 1, Mainz 55101, Germany. E-mail address: moehler@1 - med.klinik.uni - mainz.de D 2001 Nature Publishing Group 0929-1903/01/$17.00/+0 www.nature.com/cgt 158 Cancer Gene Therapy, Vol 8, No 3, 2001: pp 158±167

Transcript of Effective infection, apoptotic cell killing and gene transfer of human hepatoma cells but not...

��������� �������� ������� �� �� ��� ��� ������������ � ����� ������� �� � ��� �� ����������������� �� ��������� �� ��� ������� ������

������ ��� ��� ���� � ������� ����� �������� �� � !��� ��� � ����� "������ �

#��� $��� ����%& '���� $( )� �� ��� #�� #( *��� ��%&

���������� � ����� �������� ��������� � ����� ���� �������� ������� ���������� ���������� ��� ��������� ������ ����� ���� ����� ��� ��!"���� ������� #��$���%��&�� �����%$������$�� '�� ��� ($�� )�� �� ��������� *����� ����� ��� ��!"���� ������� ��+�����$� ,���� �� � -���. �� �� � /��%���%� ��.���� � ����. #0�� ����� ��� ��!"���� ������1

���������� ������� � � � ������ ����� �� �� ���� �� ������������ � � ��� �� ��� �� ����� �� �� ������ ��� ��

������ � ����� �� ������ � ��� �� �� � ���� ��������� �� ��������� ��� �� �� ������� � � � � �� � ������ � �

��� ���� ������� � ����� � � � �� �� � �� �� ������� �� �� �� �� ���� ���� � ���� � ��� �� ��������� �� ��������

��� �� � ���� ���� ��� � ���� �� �� �� �� ��� � ��� �� ����� ���� � ������ � �� �� ������� � � ����� � ��

� ��� ��� �������� �� ���� � ���������� � ��� ����� � �� � ���� � � !� �� ���" � ��� �� �� ���� ����

� ������ � ���� ���� �� �������� �� ����� ��� � ���� � ��� � ���� ����� �� �� ����� ����� � ��������� � �� � ��

�� �� � ���� �� ���� #$� ��������� ���������� ��� �� %� ������ �� ���� ����������� � �� � �� ��������� �� �����

����� � �������� �� �� ������� � �� �&�'� � � � � ��� �� �&�'���� � ���" � ��� ��� �� � � ! � ��� ����� %� ��

����' ��� �&�� (� � ��� � ���� �������� �� ������ ������� � �� #)*#'��+� ���� '� ��������� (� ������� �� �����

��� �� � ���� � ������ � � � ��� ������� �� ���������� ��� �� %� ����� �� ���� ����� �� �� ����� ����� � ��������

(�� ����� ���� �������� ������� � ��� ����� �� ����� � � � ��� ������ �� ������� ����� ,�- � � �� ����

���� � ������� � �� � ���� � ��� ��� �� �� � ������ �� .� � ��� �� � �� ���� ����� ���� � ���� � ��� � ��� ����

������������ ��� ��� ���� � ������ �� .���� �������� �� ���� � ����� ������� ���� � � �� � ������ � �

��� ���� �� � ���� ������� �� �� � �� �� �� � ���� ���� �������� ������ ���� ����� � ���� �� �������

��� ����� ��� ����� ����������� ���������� ���� � �������������� ����� ���� ������������

����� ����������� �� ����� ����� �� �� � ���� ���� ������������ ��� ������� ��� ��� ����

��� ���������� �� ������� � ������ ����� �� ��� � ���������� ��� ������� �� ����� ������ ���� ����������� ����� ��� �� �� ���� � ���� �� ��� �� ��� ����� ������ � ��� � ��� �� � �������������� �� � �� ���������� ������� ����� ���� ���� ������� ����� ��!����� �������� � � ��� ����������"���� ������� ������ ���� ��� ������������� ��� ��� �� � ����� � ������ ��� �� ��������������# $���� ����� ����� ����� ���� ���������� ����� �� � ��� �� ������ � �������$�� ��������� � ���� ����� �����%��� � �����

�� ��� �� � ������ �&������� �����' � ���� ����� �� �������� �� ���� ���� ���� �������� ����� ���������� ����� �� ���� ������� � � ��� �� ��&��

�������( ��� ��)��� ����� �� ������� ������������� � �� �( ��� �� ����� ��� ����� ���)�� ���� � ���� ����*+, -��� �� � �� �� �� ������ ������� � � ������ �� �������� ���������� ������������.��� /� ���� ������ �� �� ��������� � ����������� �� ��� ���� �� ��� ����� ��� � � �� ����+ � ���� ���� �� ���� �� �� ����� ������� � ��� �� ��� ��� ������ �����������

0� ��� ���� � � � � �� � ������ ���������� �� ���� ��������� �� �� ������� �������� � ����� �������� �����1 2 ������� ��� 3 )� ��� ��� � ��)��� ������������ ������ ��� ��� ��� �����# 2�������� ���� �� ��� ���� � ��� ����� �� ���� ��� �� �� �� ��� ����� � � ����� �������� ��� ��� �� ���������* $�� � �� �� �� ������ ������ ���� ������� �� �������� ����%�����������3 $�� �� ������ ������&�� � ������ �� ��� ���� ���� � ��� ������������� �������� � ������� -������+�������� ��� ���#

$�� �� �� �� ��� � �� ������� ���� ���� ������#

$ ���� ��� � � �� ��� ������� � �� �0*� � � ������� �� �� ��� ��� �� � ���� -� ��� -��$�� ��� ����� 0#4 � �� �� ��� �� �������� � ��

/������� 2$� �� ����� �������� 2�$��� �� ����1

'������ ���������� �� ������ ��3$���� � ��1 ���4$� ��% ��� �1

��������� � ����� ������� � 2%��� ��$�� ��� ��������� �

����� 5��� ��4���1 �� ���� ������ ������1 6���� �������7

��% ��8�����14 ��41$� �����1��

����� ,��$�� 9$ ��%�� ��$� �"�"��"�#:��:;�01��:<�===1��$��1��:���

��� ���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�0 �� �&-��1"

������ � ���� �50�� -� �� � ������������ ������ ������ ��� ������� �� �� �� �� 1 2 �������� ������ ������� � �� 0#4 � �� ��# $�� -� � ��� ����&�� ��� �� ����� �� ���� � �� � �� ���� ������6��7 ��� ��� ���� ���� �� � ������ �� ���� ��� ��� ���� ������� ��� �� ��� �� �� ��� �� ����� ����� �� ��� �� 8�,��4+�� 9�� �������� ���� ��� ���� ����� �� �� � ���� ��� �� �� �� � ��� �������� ������� �� ��� )��� ������� ���� ��� ��� �� ��� ���� ����� �� ���� ���������# : ��� � ����� �� �� ����� ��� �� �� �� ������ �� ��������� � �������� ������������� ������� �� � �� ��� � � ���������� ;� �� �� �� �� �� �� ����� �� ���� ������ ������ ������� ���� ������� �� ������������� ���������*��3 $�� ���� ��������� �� ��� �� ���) �� � ����� ��� ����� � �� ���� � ���� �� �� ����� � �� ��1 2� ��&�� �� �� - � ���� ���� �� � ����� ���� ������ : ��� � ���� ��� ����� ������� � � ��� �� ����� ������������ -��������� &������7 $����������� � �� �� ����� ��� ���� �3# �� �� ������� ��� � ����� ��� � � ��� ������� ������������ �� �� ��+������� )������� ��������� �� �� ������� ��� ���� ����� � �� -������ ����� � ����� �� ��� �� �� �� �� ������ � ����� ������ �� ��� �� ���������6

- �� � ��� � ��� ������ ���� ���������� �������������� � � �� ��� � ����� �� ����� �� ����� � ��� ���� ����� �� �� ��+������� &������*��7��4 2��� ��� �� �������� �� � �� ���� �� � �� ����� �� ��� � ���� � � ������ � � ������ ������� ������� ����� ���������� �� ��� �� �������� � � ������� � ��� �� ���� ����� ���� ���� �������� ����� ����)������� ��� �� ��� �������� ���� ��������� -������������ � � ��� ����� ����� �� ��� �� ������� ������ ������ �� �� � � �����) � �� ��� � �� ��� �� ��� ��� ����� ����� �� � ��� ����� ������ ������ ������$�� �� �� �� ��� ����� ����� �� �� �� ��� ����� ���)��� ������ ���� �� ������ ��� ����� ��� ����������� ��� �� � ����� �� ������� � ������� /�� ��� � �� ������� �������� ��� � ���� �� ����� �� ������ ��� �"�� �� ����� � �� �� �� ������� � � ��� ������ ���� ������ ����� � ���� � ���������� ��� ���� �� �� �� � � �� � ����� �� � �������� ������� � ���� �� �� ��+����� ��� � ���������� ������� ��� ������� �� ���� �� ���� ����� ��� ��� ��� � ����� ���������

��������� ��� ��� !��

����� ��� ��� ������� ���� �������

���7 ��� ���#8 ����� �� � �� ���� � � ����� ��������<� ����� � � � ����� ������������, ���7 ������<� �� � � ������ �� 1������=� ������� >����=������� �?��� $���������� @� �� ���� <� ����� ������#8 �� >����=� ������� �������� ������ �>� ���A�������� <� ����� � ��� ����� ����������� ��� �.B���� ���� �� �� �;�-�� 3 ���C? ��������� �.. ��C�?����������� ��� 3 �� C? �������, $�� ������ �� �� *. + ���� ��� ���� � ����� )����� ���� ���� � 8�>� ���� ������ �� ������� �������� ������ �?��� $������

���� � ��� 3B ���� ���� �� ��� 3 ���C? ��������� ����.. ��C�? ������������� >&��������� � ���� ���� ��

������ �� ������ ��������� � �� ������� �������� ������ ������ � ���� �� � ����� � � ��� �� � ����� �� ���� �� �����

������� �� ������� !"#� $!"#%&�� �� '���� �( � �( �& � ) � *����

���� +���� �� ,-� ./� �,, ��� �.� ����� ��� ������� ���� ��0����

������� 1�� ��������+� � �������� �� �2������� �� ��� ������� � ���������� �����+ ����� 0 ����������� ����0��� $���� � �, ������ �� �����

��� �2��������� ) �

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337 ��"

�� � ���� � ��� �&�� ������ 0 ��� � ����� ���� ������� � � ��� �� � � ������ ���� ����� ������ �� ��������� �� �� �� $�� ���� ��� ��� ��� �� �� >���������� � �� :������ ;����� � �� �������� ������ ���� ����� �� � ������ �� ���� �����#. 8 ������ �� ������ ����� � ���� ��� �� ����� ��� � ��� �� ������� �� ���� 1������=� ������� >����=� ������� ��� ��� ���/������=� ������ > �/:>� �������� .�.3B ������������� 3 ���C? �������� ���� ��������� ��� ���� �� � ���� ���"�� ������ �� ���� ��� ������� /:> ��������3B ���� ���� �� ��� ��� ������ � � ������ � ���.3 ����������� C��� � ������������ ���� � ������� :����� ���������� .�3 � ��� ������ ��� ��� � ��� �� ���� � ; ��������������� /:> ��� ����� ����������� ��� .�.66���C? �������� .�� ���C? �������� .�� ���C? ����� ����� 3 ��� C? ��������� #7 ���C? ��������. ��C�? ���������� �.. ��C�? ����������� ��� �.���C? ������#.

����� �������� ���������� ��� ����������

�� �� �� ��� � ������ �� 8�> ����� ��� �� ����� �� ������ ��� ��� � ������ �� ���� ���� �� ��� ��� /������� ��� �� � ��� �� ���%�� ����� ��� �� � ������ ���� ��������� �������� $�� ���������� �������� �:D9� �� ����� �� �� ����� � ���%���� ���� ���� ����� �������� �� ����� ; �� �� ���������� �&��������� � ���� ���� �� � ������ ��� 8�> ����� �� � ������� � � �� � ����� �� :D9������� �� � ���� �� � �� 4 ���� ��������� ����� � �2� ������� �� ��� ��������� � �� �� �� ��5� ������ ��� �34 ��� �7. EC��( �� ����� �.�7� ������� �� ������ � �������� ��&����� ��� �� �� 1 2 ��������� A�������� �� ��� ���� �� � �� �� ��������� ���� ��� ���"��� ������ ��� �&� ����� �� �������� ���� �A�� �� �������� �#� ; � �� �� ������ ��� A� ������ � � ������ �

����������� ����� ����������

�� �� ��+������� ����� �� � ������ ��� � ���� ���� � �. ������� ������ ���� ��� ������������� �� �������08-�� ��� �� �� ���� $�� � �� �������� ��� ������ ��� ����� � ��� ������� �� �� ������ ������ � ����� �� ��� ��� ����� ����� �33. ��� � ��������������$� ��������� ���� ���� �� �� �� ��"�������)������������ ���� � $ ����� �� � �� ����� ���������� ����� � �� �� ������ � ���� ������� ������� �� ���������� � �� ��� � �&�� ���� ��������&� �� � � ����� ��� �� ���� ����& � ��� . �������� C ���� ��� � $ ��������� �� �� ��+���������&���� �� � ��� � ����� ��������� 6��.* ���� ����� �� � ������ � ������ ������ � �* �� �� �� �� ��+������� �:D9F3 ���C���� � � ��� ���� �� � 3 ���� ����2�� ��������� ���� ����� � �� � ����� ����� ��������� � 2������� � ���� �������� ��"����� ��������� �� ����� ���� ����������� ����� ���� ��� ���������� ������ �� � ��� ����� �� ���� ����� � ���������� �:D9F3 ���C���� � ��� ��������� � ��� � ���� ����� ��� ���� �� ���������� � �� <� ��� -���� ��������� ������ ��

������ ��������

2��� �� �� �� ��+������� ������ ����� �:D9F�. ���C���� � �� � ��������� ��� .��3B ����� ��� ������������� �� ��� ������� � 4..�� ���� ��� ����������� �� �� ���� �� ������ ���� ��� 08-� ��� ��������� � ������ ����� ��� 2���&�� 5 �8��� 1��)������������� �� <� ����� � ;�� ������� ��� ����� �� ��� �������� � �.�... ����� � ���� ������ �� � ;2�-������ ���� �� ���� �������� �� �� �������� � �8��� 1��)����� � 1�� �������� ��� �� � ��� ������� � ���� G��� �8��� 1��)����� � ; ��������#�������� ������� �.. �: 2��1>51���D �, ��� �����

������ �� !�������+�� ������� � �� ������� �������� ������ 345#

�������+ � ���������� ��� �� ����� ������� �� � � �� ������ �� �� � ���� � �� � ��� ����� �� �� ����� $��(��&&) � 4��� ��0 , ���� $!"#%� �� '���� ) � ��������� �������������

��+��������� � ��� �������� ��� �������� � ��������� �����

���� ����� ���� �

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

��� 2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337

�� ���� ���� �� 6 �� � ��� � ��� � �� ��� �� �� ��������� ��� ����� �� � ���!���� ;2�- ���������

���� ������� ������

: �������� ������ �� � �� � ��� �� �� ���� �������� H*��6������������������ � ����� �1209� � 8�� ���� �<� ����I ��� �������� �� ��� ���� �� ������ �������� � ��� � �������� � �� 4 ���� ���� ; 1209�������� ����� �� � ����� � ��� ������ ��&�� �� ������� �. ������ ��� ������ �� � 3������ �������� �������� 2�� 1209 �������� ����� �� � ������ ���� ���08- ��� �� �� �����, $�� ��� ����� �� � ������ ���� ���� ������� ��� ���� �J����� E���� <� ����� �

����� !� ������������ ��� ������ ��������

; -��� � ������ ����� �� � �� �� ��+������� � �:D9 � 3 ���C���� ��� �� � �������� � .� *� #.� ��� 6.�� �� ?��������� ������ 1 2 ��� �����������& ���� ����� � ������� �� � ���� ��#� 8 ������ �� ���������� ����� �� � ��������� �� ����� ����� H.�6B ����������� ������ �-1-�� �. ���C? $ ��+���� .�� ���C?>1$2I� 2�� 1 2 � ��������� �� ���� ���� ��� ���� ��� �.. ��C�? A ��� 2 ��� ��� �.. ��C�?� ������ @� �� �& ��� �� � ���� ��� �� ��� ������ �� ����� ����� �� ���� ���� ��� ������� ������� K ���� ���� �2�� ���� 0�� ����� 8�����; ���� �� <� ������ ��� ��� ���"�� ������ � ��)�+���

������ �� #�������� � ��������� �� �� ������� �������� ������ �����+���� �� 4���2�� 6 $78� �) � ����� � � ���� �� � ��� ����� ����� � � ���������� �������� ��� ����� �� ������ ����� �� ����� ������� ����� �� ������ ������ ����� 4����������0� �� ����� ������� ����� ����� $��0

�) ���� �������� ���� ������� � �������� 3�63 *�" $ ������ ���� ) � 4��� �� ����� �������� $!"#%�&) � �������� ����� ���� ������� ����

4���2�� 6 ��� ��9����� �� 74*:��� ����0���� �� 74*:��� ���� ����0��� � ���������� $*�������( *) � �� ����� ������� $6����( 6) � ��� ��

����� �������;3�63 *�" �������� �� ����� $��0 �) � ����� ��� ����� ����� $��0 /) � 8����+ ����� $����� ���(� ) ������� ��+����� ��4���2�� 6 ��� ��������� ������( ��������� ����� $���< ���( � ) ���� 4���2�� 6 �������� �� ��������� ������ ��+�����( �������� ����� $+��0

���( ) ������� �������� �� 4���2�� 6 ��� ��������� ��������

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337 ���

������ #�0� ������� �� �� �� 1 2 � ���#� :��� ������ � ������ ���� ������ � ����� ������� ��� ��� ���� ������; � ��� ��������� ��� ����� �� � �� �� ��+������� �

� :D9 � 3� 2�� ������� ��� 08-� ����� �� � ����� ��A902 ����� ��. ���C? $ ��+���� �3. ��� C? ����� ��� C? >1$2� �B ���� 0�*.� .�3B �������&������� 3B -1-� �������� � ���� ������ ��0 ��� ����� ���� �� � ��� ����� �� 8��A��� ��� ����� �8��A��� :������ <� ����� � ;������ � ��� � �� � ���� ��� ������ �� �� �%���

������ ���!���� -1- ����� ������� ��� ���� ��� ����� ��� ����� �� � � �� �������� ���� ����2�� ���� 0�� ����� 8����� � ��������� ����������� �� � ���)�� �� ��������� � � �� � �� 08-�������� �.B ����� ���) ���� ��� .��B $������. �-����� 1���������� <� ������ 8� �������� ����� � ��� ��� � ���� �������� ������ -04 �� ���������� �� �&��� ����� ������� � -��#� 8�� �� ��� �� �������� ��� �� ��� ���� �� &��������!����������� ��� � ������ ��� �������� ����������������� �2�� ���� 0�� ����� 8����� �

"��#����� ������ ��� ������� ��������

$� �������� �� ��� ���� �� � ����� 9� ��������6..���� � �� 50�������� ����� �� � ��������� �� ���� ����� � �� �� ���� ������ ���� $����� ���� ��� � ����� � ��� �������� �� �� ������ ������ ���� ���� �����#� $�� ����� ���������� �� �0*���� �� ��� �� ������ ����������� �� � �������� �&� ����� �� �� ���� �� �� �� �� 0* � �� ������ ���� �� :�&���� � ���## A�������� �� ���� �� �� ����� �� �,#$ ����� �� � ������ - ��� - ���50 � ���� �� �����#��## 9� �������� �� �� ��)�� ��� �� ��������� ��� ���� ��� .�.�B� ; �������&� ����� ������� �������� ��� �� -��������� 0*������ �� -�� ������ �����6..��� �� �� �� � �� � ���� � �� � � :D9 � �.�� ���C����� ;������� ����� �� ��� ����� � ���� �+3 ���� �� �� �����"� �������������� ?����� ��� �������� �� � ��� ����� *4 ��� ,6�� � ���� ��� � ?������� �?���( 8� ���� 8��

������ �� �� ����� 3�4 ������������ �� �������� ������ ������

������ ����� ��� �� � ����� ���� �� ����� ������� $!"#%= �� '

���� ) ��� +���� �� ,� �&� ��� /& ����� ���� 1���� 3�4 ��� �2������������������� 0 +�� ���������������� ��� �0����>�� ���� � ��5 ������

�: ������� ����� *������� $*) ���� ���������� ����� +���� �� /&

������ 1�� �� ����� 3�4 ����������� �� ������������ 0 �������

����� �������� $�?7) � ������� ���+�� ����� �������� $�?7) ���� ��� ���+��0 ����� ���+�� �������� ����������� ���� $��?7) �

4��������+������ �2������� �/ ����� ����

������ �� �� ����� ���������� �� �������� ������ ����� $� ) �

����� $� ) � ���� $� ) � ��� �� � $� ) ���� �������� $=��&= ����� )���� ����� ������� $!"# � �&�� �� '���� ) ��� +���� �� = ��0��

6���� ���������� ��� ���������� 0 ���@�� ����0�� 6���� A6����������� ���������0 ���<�� ����� ���������� �� ��� �������� �����

$���� ��� �����) �

������ �� 5��������� � ���������� ������������� �������� �� �����

������� �������� ������ ������ ������ ����� ��� �� � ����� ����

�� ����� ������� $!"#%= �� '���� ) ��� +���� �� ,� -� �� �/ ������4��� �0��� ���� ?#54 ���� =& �+ � ����� �������� ��� �@����0 �������

��� ��������� �� :3: ���0���0������ +�� ���������������� 7��

��������� � �:� ��������� ���� ���� �������� ���� ���0������ �:� ������� �����������& �:�B� �0�����������0����� ��� � �:�( *�

���������� ���������

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

�� 2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337

/������� <� ����� ��� �&� ����� �� ������ ���� �����A?���

���#���

$% ����� ����������� �������� �� ���������� ������������ �� ���� ������ ���

$�� � �� � �� �� ��+�������� ���#8� ���7� ���<����� 8�> �� � ����� ��� ��� �� �� �������� �������� �� 4 ���� ���� �;�� �� � 2 ���������� :D9��������� ������ � ���� �� ����� ��� ��� ��� � ��� ���������� ���� �� ���� �� ��� ��� ��������� �� ���2����� ����� ����� �� ��������� �� � ��� ��� ������������ ����� �� ��� �� �� � ���� ����� ��� 4 ����� ���������� � ������� ����� �:D9F�. ���C���� � ������ ����� ���� ��� �.B � �� ��������� �� ������<� ����� �� � ���� ���������� �� �� ��+�������)������ ��� ���#8 ��� ���7 ����� � ��� :D9� ����� 8�> ����� ���� � ������� �� �� �� � ����� ����� ��� ���� ���������� �5 � ������ � �� �� �� ���������������� �� ��&�� ������ �� ��� ���� ����� ���� ������ � $ �����"� �� ��� � ���� ����� � ������������� �� �� �� ��+������� ������ ����� �� � �� ����������� �� 1209 ������� �;�� �� � -� ��� � ��� ����� ��� 6 ����� ������� ���� ���� �� ��������� ����� ����� � � �� � ����� ��� ������ �� �������������� � �������� � �� ������� ��� � ����� ����� ������ 8������ ��� ���� � ������ ��������� � ����� ���� �� ����� ������� �� ����� ���� ���� ���� � ��� ����#* ;2�-��� ���2���&�� 5 ��� � ������ ����� ������� � ��� ������������� ����� ��� �� � ��� %������ �� � � �� ������ ����$� ��� �� ������ 9� ��� ����� ��� ���������� ������ � ��� ���� �� �� ����� � ������ ����������� ��� ������ �� �� �� �� � ��� �+3 ���� 2 ���� #��� 6� �� �� ��+������� �3#������� ���#8 ��� �3#������ ���7 ����� � ������ �� 3.B ����� ���������� ;2�-��� �������� �;�� #� 2 ��� 8�� ���<� ����������� �&� ��� � �3#� �� � ���� ���������� �� �� ��+������� ������ ��� ���� ����� �� ��� ���� � ��� ������� ��� �� �� �� �������� �;�� #� � ��� 1��;� �� � �� �� ��������# ������ 1>51���D �������� �� ��+������� ������ �� �3#��������� ���#8 ������;�� #1�� ����� � �� �� �� ��+������� ���� )������ �����7 ��� ���<� ����� ��� ��� ������� ���������� ��1>51���D ���� � ������9� �� ������� �� � ���� � �� �� �� �������� ��

� � ������ �� ��� �� 1 2 ����������� ��� �&� ����� ��� ��&�� -� � ��� �� � �����"�� �� ���������������� ������ 9�� ����"�� �� �� �� �� ����� �� ��

������ �� ����� � �� ����� ��������� � ������0 �������0���� ������� � ���������� ��� �� ������� ������0 �������0���� 5�����0

�������0��� $/��&, ����� ) ���� �� ����� ������� $!"#%= �� '

���� ) ��� ������� = ��0� ���� ����+ � �����0������� $�����+� � ���

�2���������� :3 +���� ���) � �� ��>0����� ���������� �� ������ �������������������� 1�� ����� ������� ��>0��� �������������� �������

��� $� ) ��� ������������ ���������� $� ) ��� ������� ���0���

+����� $� ) ���� �������� �� �������� ����� ���� 0 ��>0�� ���<��

����������0 � ���� ����� � �� ������� $������ �0����) ������������� $���� �0���� ) ��������� �����������0� � 5����

�������� ��� 345# �������+ � ���������� $*������� ) ��� �����

������� ������0 �������0��� $��&&) �

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337 ��$

�������� ������� ��� �� ���� �������� ����� 1 2 ������ �� �� � ������� ����� ���� �� ���������� � ��A;�� $�� �A; 1 2 �� ��������� ������ ��� ��� ����� ���� � ����� �������� ��A;� � ����� �� �� ��������� � �� �������� � � ���� ��1 2��# 2� ������ ;��� � *� ���� �� �� 1 2 ��������� ��� ������� �� �� ���� �� ��� ������� ������ ������ ������ �� ��� ����� ��� �� ������� 8�> ������ 2 ����� ��� ���� ���������� 1 2 ��������� ��� ������� ��� ��� ����� ��� �� �� � �+# ���� ���� �� ��� ������� ������ 9� ���<������� ��� ������ � �� �� 1 2 �� � ������ �� ���� ����� ���7 ��� ���#8 ����� �;�� *� � ;� �� � �� ��

� ����� � �������� �� �� ��� ��� %�������� �� ���%�������� � 8�> ������ ����� �;�� 3� � 1����� �� ��� ���� � �� ������ ���� ����� ����� � ������� ������ �� ��� �� � ������� &���� ���� �� ��� �� 8�> �������� ������ � �������� �� �� ������ ��� �� �%������� �� ��� ��� ������ ��� �� ��� ������ D� �� �� � �� �5��������� � �� �� �� �� ������� ���)�� �� 1 2 �������� ��� �� �� � ����� �� ��� �&�� ����� ���� ������ �/�� ���� ��� ������ ����� � -� �� � ������ ��

�� �� ��� ������� ������ ����� �� ������ �� ��������������� �;�� 6� � $�� ����� � -� � ��� ������������ ���#8 ��� ���7 ����� �� � ����� ��� �� ���<� ������ ����� ����� ��� �� �������� ������ � �� �� 1 2��� ������� ������ �� �� ����� �;�� *� � $�� ������ -� ������ �� � ������ �� �� 8�> ������ )��� ���� � ���������� �� �� ��+������� ��&�������

������� ������� �� ��� ������#� �� $% �����&����� �� '������

9� �� ����� ��� �� �&�� ����� ���� ���� ����� �� ��� ���� ������� ��� ���������� �� � ����� ������ � ��� ������ ��������� $�� �������� �� � �� ��� ��������:D9F3 ���C���� � ��� �� ����� � ������ ����� ������ �� �� ���� $�� ����� � ������ ����� � � ���� ��+������� ��� � � ��)� ������� ���� �� ��� ������ ������������ � ��� ���� ���� �����"��� ��������� ���� �� �� ��� � )��� � ��� � �������� �����������&��� �;�� 72�� 8������ �� -������ ��� �� �� ������� �� �� ��� ���� ������� ��� �&� ��� &�� ��������# ������ �� ��� �� �� � ��� � �������� � � ���� �� ��� �� -������ �� ������ ������ ���� �� ���� �������� �����#3�#6 $ ���� � �� ���� �� ���) � ���������� ��&���� � ��� � ���� ������ �� ������ ��������� �� ����� ���� ����������� ����� ���� �������� ����� ������ ��� ��� ����� �� ����� ���� ����� ������ ����� ����� ������ �� �� ��+������� ����� � ���� ����� �� � ��� ��� �;�� 78�� 0���� �� ����� ���� ��� 1209 ������� � ������� ��� ���������� ��� � �������� ��� � ����� ��� � �������������� ����� 3 ���� ����� � ���� ��������� �� � ���

������ �� �� ����� ���� ���������� ����� �������� ��� �����+��������������� �� �������� ����� ��� ������0 �������0���� � :��� ����� ������������ � +����� ��+���>����� � �� �� ����� �������

���������� �������� 1�� ���+�� �������� �� �� ����� +����� ��

����� ���� �������� ������� ���������� ��� ��������� 5, ��� 5�-���� ���� ��� �����+ ��+���� �� �:�'� ��� 65�'�� #� �� �����

����������� 5,��� ��� �����/&&���� ���< ��� �������� ���

������>����� � ��� ��� +��� ����� ������� � ��� �������� �����

��������� 5, ��� 5�-� �����������0� �� � 1����+��� ������������� ����������� �� ����� �������� ���� ��� ������0 �������0����

������ ������ ����� ��� �� � ����� ��� ������0 �����

�������0��� $���� =��&= ����� ) ���� ������� ���� ������������ ������� $!"#%�&� � ?A'���� ) ��� ���������� � ��� ����������

5,��� $+��0 ���( ) ��� �����/&&��� $���< ���( � ) �������

���� �������� �� ��� ���� �0����� ���� � $����� �) ��� , ��0� ����

$����� *) � �� 8�������� �������0 ��� �������� �� ��� ���� �0����� ��?8A $���� � ��2 ����������� ������������� � ��+������� ����

��������) �

�

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

��% 2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337

���� ����� � � ������ �� �� ��+������� )������ ���� ���&�� ������ ������� ���� �;�� 7�� � 9� ��������� ��� �� 1 2 �������� ��� �&� ����� � �� ��&�� -� � ��� �� � �����"�� �� ���� 9� �� �� �� � �������� ����� �����"��� ����� �� �� �� 1 2 ������������ ������� � � ����� � �� ��� �� ��� ��� ��� ���� ���� �� ������ �� �� �� �� ��+��������� ���� ��� �������� ���� � ����� � $���� ������� �&��� �� �� ��� ������ � �� �� �� ����������� ������

(������ �� ����������� #� ���� �� ���#���������������� �� ������ ��� #�� ��� �� ������� �������

$�� ��� ���� ���� ���� ������ �� �� �� �� ��� ���� ����� � ��� �������� � ���� $���� �� ���� �������� �� ��� � �� ����� � ���� �� � �������� ����� )���� ��� ������ $�� �� �� �� �� ��+������� ���� ����� ��� �������� ����� � ����� �� �� �� ��+�� ���� �������� �� ��� ����� �� �� ���� �� ������ ����������� �� � ���� � $� � � ���� ���� �� �� � ��� �� ��� �� � �� 0* �0*���� ���� �� �� �� �� -�� ���������� ����� �� �� � �� �#4������6..���� � $�� � �������� �� ���� � � ������������� ������� �� ;��� � 42� $�� �����6..��� ��� �� ��� �� �� ��� �� ���� ������� �� �� �� - � �������� ���� ��� ��������� ������ �� �������� �� ���� ���������� ������#� �� �� ��+������� �������� � �� $� ���� ��� ��� �� �� ��� ������ �� ������ ��������� �� �� ������� ���� �& ��� �;�� 4� 8 ��� ���1����� �� ��� �� �� ������������ � �� �� ������� �� ��� � �� ����.�� A�C���� � � ���� ������ ��� �������� �� ������ �� �� �� ������ ����� ��� �� ���� � �������� �� �� ����� $�� ����� ��������+�����������6..��� �� �� ����� ������������ ����� ������ ��������� ��� �� -��������� 0*��� �� �� ������� � ��������� � ���������� �� �� �� ����� ��� ������ � -� ��������� �� 0#4 � �� � 2�� � ���) � ��� � �����;�� 48� � ������ ��� ������ ��� ������ �� ������� ���� �� * ���� ���� �;�� 4�� � 9� ��� ����� ��� ��� ������� ������ ����� �� �� 1 2 �������� ������ ��� ��� � ��� ������������ �� ��� ������� ��&���� �� ��� �� �� ����� ����� ���#8 ��� ���7 ����� ��������� ����� ������ ����������� ��� ���<� ������ ������ �� ������������������ � ����� ��� �� ������� ������������ ���� ��+������� )������� 9� �� ��� ������ ��� ������ ������ �� �� �������� �����6..���� ������� � ��� ������ �������� � ��� * ���� ���� ��� ������������ ������������ ��� �� ������� �������� �������� �� �������� ����� �;�� 4� 8 ��� ���

����#���!�

9� ��� ����� �� ��� ��� �"�� � �� ����� ������ ��������� ��� � ��� � �������� � ��� ������������ ���� �� ������� ��� ���� )������� ��� �� �������� ��� ���������� ���� ����� ��� �������� �� ��� ���������� 9� �� ����� ��� ��� ���� ������ ������ ��� � ������������ �� �� ��+������� ���� )������ � �����

��� �� ������� � �� �� ����� ������ �� ��� �� 1 2������������ -� � ��� �&� ������ �������3��7�����#

-����� ��� �� �� �� ��+������� )������ � ����� ����������� ��� �������� � �� :D9� ��� � ����� ��� ��1 2 �������� ��� -� � ��� �&� ����� ������� ���� �� ��� ��� ���� ������ � � ����� ���� ���� ������� ������ ������ �� � ��� ���� � �� ���� ������� �� �� ���� ��� �� ������4��,�#3�#7

9� ���� �� ������ �� ����� �� � � � �������� ���������� &���� ��� ��� �� ���� ��� �� �����������������# $���� ����� ������ ����� ������ ���������� ����� �� ����� � �������� )������ �� �� �� ������ �� �������� �� �� ���� ���� �� � �� �� � ��� ����������� $�� � ��� � ����� ���� ����� �� � � ����������� � � ����� �� ����� ���� �� $�� �������� � ������������ �� �� ��+������� ���� )������ ���� �������� � ����� ��� ���������� ���� ������� ��� ��� ��� �� �� -������ ���� �� ���� � ������������#.�#6�#4 ����� �� � � � �%����� � �� ������� ��� ����� ���������# 9 ��� �� � ���� �� ���� ������� ��� � �� �� ��� ���� ����� ��� ���� ������ � � �� � � ��� �� �������� � ��� �� ����� �� ��� ���������� ����� � � ����� ������ � ��� ��� ��� �� �� ����� � � ����� �� ������ ���� �� ��� ������� �� ���� �� ��� �� � �������� � ��� �������7��4 ����������� ���� �� ����� �� � ���������� �� �� �� ���������� � ��� ����������� �� �� ����� ������ -����� ��������� �� �� *.+ ���� ��� ����� ��� ����� �������������� �� ������� ��� � ��� ��� ��� ���"������� ;� �� � �� �� >85� ���� ��� �������� �������� ��������� �� �� �� 1 2 ��������� ��� ��� ����� ���� ���� ���� �������� �� �������� ���� � ���� ���� ���� � ������1����� �� ��� �� �� ��� � �� � �� �� �������

������ � � ���� ���� ������� �� �� ���� �� ������� � ���� ���� ����� �� �� ��� ��� ������� �� ����)������� -������ ��� � ���� �� �3#� ������ 2� ��� A02� � ������� �� �� ������� � �� ��� �� 1 2 �����������6�#, 9� ��� ����� �� ���� � ���� ��� � ����������� �� �� �� �������� ������� ���������� ��������� ����� ��� �� ��������� � � �3#� ��� ���� ���� ��� ����� ������ �3# �� ����� ��� ���� �&� �������� ������� �������� ���������� )��������6 9������ � ��� �� ��+ ������ �� ��� ����� ����� @- ����� �� ������� � � �� �� �� ��+���������� ����� �3#��������� �� ���)���� ���� ���� @36�� @- ����� ����� �� ����� � � �� �� ���� ����� �� ��� �&� ����� � � �3# ��� �� � ������ ������� ������ �� �������� ����� �����-����� ��� � ��� � ��� ������ ����� �� �&� ��������� �3# � ���� �� � � � �������� �� �� ��������� ��� �� �� ���� �������6 9� � �&�� ������������ ����� ���� �� �� �3#� ����� �� ���#8 ��� ���7����� �� � � � ���������� �� 1 2 �������� ��� ���� ��+������� ������ ��� �� � �3# �&� ������ ���<������� : ��� � ������ � ���#8 ����� ��� ������ ���� ��������# ������ 1>�1���D� ��������� � ���� ��+������� ��������#+�������� � � ����� ���������9 �� �� ��� � �� � � ���� ���� �� ��� ��� �����

���������� )��� �������� �������.��� D� ��� � ����

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337 ���

������ �� �������� �� ��� ���� ��� ��������� � ��� ����� ����� � �� ����� � �����8������ �� �������� �� ��� ���� ���� �� ��� ������� � �� � ������ ������ �� ���������� ������� �������� ��� � ����� �������� �&������� ������� � ��������� 2 ��������������� �� �� �� ��� ��� �����6..��� ��� ��� �� �� �������� �� ��� ��� ����� ������� ���� �&� ����� ������ � �� �� &���� �� -� � ��� ��� � �� �������� ������� ��)������� �� �����3+, $��� ��� ��� ����� �������� �� � ��� ������ ���� �� �� �� ��+����� ��� � � �������6..��� ���� ����� �� � ��)��� ����� ���-5�) ���� ���� �� � � �� 0#4 � �� � ��� ��� ��� ���*.+*� $�� ��)���� ��������� �� ��� ���� �� ����� � ���� �� � ���� ��)��� ������ �� ��?� ����� ��� ���� ������������ ��� 9?�� �� �� ��� ���� �� ����� � ���� �� ���� �����*�

9� ����� �� �� ���� ���� �� � �� �� �� �������������� �� �� �� �� �� ����� �� ��&�� � ����������� ����� ��� �� �������� �� �� ���� ���� � ����������� ������� �������� �� ���� ������ 8������ ��� ������ ����� � �� �� �� �������� ���� �� ��� ����� � ��� � ����� ���� ����� � ����� ��� �� �� �� �&����� �� ���� ���� �� ���� � � ��� � �������� � ��� ����������� ����� � � ������� �� �� ���� ���� � ����� ���������� :� ��� ����� � ����� � ���������� �� �3#� ����� �� ���� �� �� ����� ���� � � � ������ ��� �� �� ����� �� ������� �� ��� ���� ����*#+*3 $���� �� �3# ���������� �� �� � ��������� �������� ������ ������ ������ ��� ���� ������ �� ���� �� ���� ������������ �� ��� �������� ���������*6 ������ �� �� ������ ������ ��� �� ��+����� �������� ��� � �� ���� ������� ����� ��)����� ����� ��� ��� �� ��� �� �� �������� ���������� ������ ��� ��� ��� �� �� �������� ���� � �������� �� ���� �� ������������ �� �������� �� �����*6�*7

��&�!'���������

/� ���) 2� 1��� ��� :� -���� � �&������ ����������������� ��� � <� 8����� � � ������ �� ���������� �� ����� /� � � ��� ������� �� 1���� � 2� ����� E�@���� � -� - ���� ��� :� 5�)���� � ��������� ���� ����� ����������� $��� � ) ��� ���� �� �� � ��� � ��� 8���� 0 � �� � �� >� ���� ���� ��� �� 8�*��$,7���67� ��� �� 8����������� ��� ��L 8�������/����������� ; ������ ��� $��������� <� �����

��(�������

�� 9��� � /���� EA� $�� ��� ������ ��������� � ����������� �� ������ , 6� 2 ���� �,,,(#*.'7*3+73.�

�� 8 ��& E� $ ����� � ����������� �� ������ ����� ����,,7(�3'�3,+�6��

#� -�� @>� 2���� 2E� E��)��� A?� ����������� �� ����� ���� ����� -���� 0 ����� ���� ��� ����� ����� ����� ������ >����� �,,6(77'���7+�����

*� :� � AA� -� �� �>� �����) A� ����� 2� 1����� ������� �� ��� ������� � ������ �� ����������� �� ����� ����� ��� 2���3# ������ ����� ��� �...(#�'443+44,�

3� 8�� ?2� 8�� ����� ?�� @�� EM� � ��� � ��� �� ��� ������������ �� ����� ��� � �� ��������� ������ ����� �&� ������ ��� ���)�� ��� �$� ��� (%��� �,,7(4'��7#+��4��

6� @� ����� -� :���� @� @�)�)��� :� � ��� ������ �� � ����������� �� ��� ����������� �� ����� �� ���������� �� ������ ��!����� � � �� ���� �� ���� �� �� ��� ������&�� �� �������� )����� ����� ��� (%��� �,,,(6'3�3+3##�

7�/���� @ � ����� /:� �� �� :0� � ��� <��� �� ��� � ����������� �� �����' ������������� ���� �� �� ������� �� �������� ����� � �� �-5�� �������� )���������� >���� ��� (%��� �,,3(�'�,�+�,7�

4� :� ?� -���)� � -� M� -�@� � ��� <��� �� ��� ������������ �� ����� � ���� ��� � ��� �� ���� ���� �������� �� ����� � �� 6��%����%�� � � �� ��� �������������� ����� ����� ����� ��� �...(#�'6.6+6�*�

,� �� <� @� ����� -� 1� 0� � ��� ������ �� ����� ����������� �� ��� ����������� �� ����� �� � ��� �� ��� ��� ��� ����� ���� ����� � ��������� ��� �,,7(���'3.�+3�.�

�.� A��" E� G��� �� 0 �� E� <��� �� ��� � ���� �� �' � ��������� ��� ����������� �������� �,,4(3,�-���� ��',�+,6�

��� 2� :� ��������� /�� ?��� ��� ���� ���� �� ���' �������� �� ��� �� �� � ��������� ��� �������� ������� 2����� � �,,3(�#'7*6+734�

��� A������ � E� � ����� EE� 2���������� ������ � �� ���� ����� 2 )�� ���%��� �,,�(##'�##+�3��

�#� 8� �� @9� 0� ��� ����' �� �� ���� ��� ��� ��������� 9�';����� 8 � @���� 1:� ����� 0:� ���� )�� ��� # � ���0�����������' ?������ A����( �,,6(��7#+��,7�

�*� E���� A�� 8��� �<� ��� 9E� 8�������� 1<� � ��� A����� ��� ���� ��������� 5� '�� -��� �,,6(*6'#7.+#4.�

�3� 1�� ���� $� ?� ����� 2� E���� � � ��� 0���� 9 �������� ����� �� ������� ��� � �� �� ��� �� �� ����� ������ ��%9������$� ?�4�%�� � ���� A��� � ;?� ����� �.+�*��,,#� ����+6� 2�� ���

�6� ������ �;��%�� 0� 0� � :� 8 ������� �� 2� -������� � 0�A������ � E� 0 � ����� )������ � ����� ����� �� ����� ��� ��������� ���� � �� ��� �� ����� ������� ��� ��� ��� ����� 6�@A 2� �,,.(,'�,4,+�,,3�

�7� :���� -� D��� �� � M� ������ �;��%�� 0� A������ � E� $����&���� � �� ������ �� ��� �� ����� �� �� ����� ��� ��� �� � ���� �� ;A#$# � ����� ������� ������� �&� ������ 2 )�� � �,,*(64'6**6+6*3#�

�4� A��� 8� ?��"�<�� � E�2� A������ � E� 1���� ��9������ � � � ����� ���� ���� �� �� ��� �� �� �� �,#7�����' ������� ��� �� $ ;�� ���������� ������� 2 )�� ��,,4(7�'44,#+4,.#�

�,� D������ $� 9���� :� ��� M� � ��� 9������ � ������ ����� ��� � ��� �� �� �� ��� �� �������� 2 �� )�� ��,,4(7,'#.67+#.7��

�.� : �� 2?� ;� ���� 1E� ;������ @2� �� �� ��� �� ���� ��� ���� � �� �� � ��� � � ������� ��� �� ��� �� 8�, �����' �������� � ���� ���� �� ������� 2 9��% � �,,#(�6,'��#+��.�

��� :��� -� M������� � $��� @� $���)� � -����� � @������ �� ��� �� 8�, ��� ��� �� � -�� � ��� ������������� �� � �� �� ������� ������ 2 )�� � �,,4(7�'#.�4+#.�4�

��� ���� MG� �� ; ��� ;� �� ��� E� � ��� -������� )������ ������� �� �� *.+ ���� ��� ����� ��� ����� �� �� ��� ����� >���� /��� �,46(*6'#37*+#37,�

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

��� 2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337

�#� � ����� EE� 8�%�� 0� 1������� � � ��� $ ���� ���� ������ ��� ����� �� ���"��� ������� � �������� �� ������ ������ �� �� *. � ����� ��� �� ��� ���� �� ������������ �� ������ �� ��� ���� �� �� �� ��� ����� �� �� ������ 2 )�� � �,44(6�'�67,+�646�

�*� 1�� ���� $� 5����)� E:� � ����� EE� 1������� �A������ � E� 9������� �� �� ��� �� �� � �� � ���� ��� � �� ���� ���� ��� ������ � ���� �� ���� ��� ���������� � ��������� ������ >���� /��� �,4,(*,'#�.#+#�.4�

�3� ;���� -� <��� � 1� 8���� 2� � ��� 1�� ��������� �� ����� � ��?� ����+�� ���� �� � �� -�91 ���� ��� �� ��� �� �� �������� �� 2 >����� �,,4(73'34*+7334,�

�6� $��� ��� 2� $����� :� 1�� ���� $� � ��� 2 ���� � �� ���� ����� ����� �� �� ��� ��� 9�� ,�� '��� -�� �-'��,,#(,.'47.�+47.6�

�7� 5�� 0���� ��)� �� $����� :� ���� E0� ?������� � ?�?� ���� 1� A������ � E� 0� ��� �� �� ������� � �� ��� � � � �� ��� ���� �� � � ��� ����� � ��������� ��� �� 2 >����� �,,#(33'67�+677�

�4� -� J� ?� J� <� ?� � ��� 9����� � ����� � �� ��� �� �� ����� �� ����� �� ����� ���� ��� ������ -�� -���,44(#�'6,+4.�

�,� :���� :� - ��� -� ��� �� � ��� 1 ��� ������� ������ �������� ����� �� ������� �� �� �1,3 �20D��C;�� � ���� C ������ ����� ��� ������� ������� � ���� � ����3#� 2 > � ������ �,,7(,,'*.#+*�#�

#.� <���� 0A� ��������� E� @��� ��� 8� � ��� � �����&�� ������ ������� � � ��� � ����� �������� ���������� 8 �� ��� ��������� ��� �,,*(�.6'66*+67#�

#�� @���� E� ��� 8� - ��� -� � ��� >�� �%�� ����� � ���������� � ����� � �������� 1 2 ��� � ����� ������� �� ��� ����� �$� ��� (%��� �,,,(�.'�6�,+�6#��

#�� ;���� -� ;���� -A� 1�� ���� $� � ��� 9����� � � ������������� �� ��� � �� ��� �� �� ���������� �� ����� �� ��� �� ����� ������ 2 )�� � �,,3(6,'#,33+#,34�

##� :�&����� 9�� :�&���� ;� A��� -? � ��� A�������� ?�999������ �� ��� �� �� � ������ ��������� ��� � ����� ������ �$� ��� (%��� �,,#(*'**�+*3.�

#*� 5� ��� 9� ������ �� A���������� �� �� ;�� ���� � ������ ���� ����� 2 ���$ ���%��� �...(�*#'�67+�,.�

#3� <���� 0A� ������ /E� /���"�) �� � ��� 9�������� � ���1,3 �20D��C;�� � ���� ��� ������ �� ���� ������� 26B� ���� �,,3(�4�'���#+��#.�

#6� ��������� E� ;�����!�� ;� - ����� /� <���� 0A� ������������� ���)� � ������� 8 �� �� �� � ��� � �������������� )�� ��� �,,7(��,'�,�+�,*�

#7� <���� 0A� @ ���� 0�� �1,3� ������� ������ �� ��������� �������� -��� 5���� ���� �,,4(�4'�*�+3��

#4� < ��� 0� 1� �� $��"� � � ��� ������� 8 �� �� ������� ����� ����� �������� ���� �� �� �� � ������ � �����������&���� 2 )�� � �,44(6�'*�#6+*�*#�

#,� 8���� $ � ���� A� A������ � E� /������� @� ������ 2������� �� 1 2 ����� ��� 1+�������� �������������� � � ����' � �� ��� �� 1 2 �������� ����� 9��,�� '��� -�� �-'� �...(,7'33��+33�7�

*.� A������ -E� 8 ������� �� 2� ;������� �?� ������ :@�A������ � E� $ ���� ���� ��������� �&� ����� � ��� ����)�� ����� ������ �� �� � �������� �� ��� ��� 2 )�� ��,,�(66'�4��+�4�4�

*�� 1��� ;� 2������ 8� @� �� 2� � ��� $�� ��������� ���� �������� ��� ���� )������ ��� �� �� ��� �������� ��� �� ������ ��� � ��� (%��� �...(7'7,.+7,6�

*�� ���� 2� :���� 0� 5�� 1���� E� 1���� �� A������ � E�� ����� EE� ������ �������� �������� ��� �&� ����� ���)��� ����� �� ����� �� ����� �� ����� � �������� ��� �� ��� �( ���� ��� � ����� ������� �� ������� ����� �$� ��� (%��� �...(��'3,7+6.,�

*#� 5�)���� :� ������ /E� :���� :� � ��� �3# �� ��&� ����� �� � �%��� �� >� ���� ����������� �� �������� �� ���� ���������� � �� ��� �*, � �� ������A����� �,,*(,'�,3+�.*�

**� -�� �� $�)�� � -� @!��� @� 8���� $� ;������ -� $�������������� � �3# ������ �� �� ������ � �� �������������� � ��� �� ����������� �� ������� -$�� (�����,,,(�,'4*,+433�

*3� ��� ��� $���� �E� ?�� 0?� ?�� 0�� 0��� -M� >&� ����� ��3# ���� �� �4* ������� ����������� �� ������' ��������� ��� �� � �� ��� ������������� >���� /����,,#(3#'*6,�+*6,*�

*6� �� �1�� � /-� A�� � ������� �� �������� ��� )������ ������� �� ������ ������ >$�� A�� A� � �,,7(,'7,+47�

*7� - ��� -� ������ /E� ��� �� � ��� ?������� ������������� �� �1,3 �20D��C;�� � ��������&� ������ �� ������ 2 ��������� � ������ ������N ,�� ���� �,,6(�'�#6�+�#66�

���� �� � ����� *�� -� $� �� !//�

2+)�3)4� �3)����5� 6)(78+,9� ). �30 ,�4*+*(4:7 �� ($ �:2�$ �),�.+2� �)337 ���