Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

KOTININ – EFEKTIVNÍ MARKER PRO KONTROLU

ABÚZU NIKOTINU

Bakalářská práce

v oboru zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce: Autor:

Mgr. Ondřej Wiewiorka Michaela Kulhavá

Brno, duben 2019

Jméno a příjmení autora: Michaela Kulhavá

Název bakalářské práce: Kotinin – efektivní marker pro kontrolu abúzu nikotinu

Pracoviště: Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Brno-Bohunice

Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Ondřej Wiewiorka

Rok obhajoby bakalářské práce: 2019

Souhrn: Bakalářská práce se zabývá kotininem, metabolitem nikotinu a jeho analýzou. Jako

materiál posloužily vzorky moče od 97 anonymních dárců, kteří současně vyplnili dotazník se

základními údaji, z nichž nejpodstatnější bylo množství vykouřených cigaret za týden.

Vzorky byly změřeny pomocí automatického analyzátoru cobas 8000 a LC-MS. Aby bylo

možné provést analýzu na LC-MS, musela být vyvinuta nová metoda měření. Výsledky

měření obou metod byly statisticky vyhodnoceny a porovnány.

Klíčová slova: kouření, nikotin, metabolity nikotinu, kotinin, diagnostika kuřáctví

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných

norem.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně pod odborným vedením Mgr. Ondřeje

Wiewiorky a uvedla jsem v seznamu všechny použité literární a odborné zdroje.

V Brně dne 30.4.2019 Michaela Kulhavá

Poděkování

Tímto bych chtěla poděkovat panu Mgr. Ondřeji Wiewiorkovi za jeho cenné rady, vynaložené

úsilí, čas a odborné vedení. Dále personálu Urologické kliniky FN Brno, který ochotně

pomáhal při sběru vzorků, jmenovitě panu MUDr. Aleši Čermákovi Ph.D., díky němuž se tato

spolupráce mohla uskutečnit. Rovněž Plicnímu oddělení nemocnice Kyjov, aktivně

zapojenému do sběru vzorků a nesoucímu svůj díl na tvorbě praktické části. Opomenout

nesmím ani rodinu, kamarády a ostatní účastníky studie, bez nichž by tato práce nemohla

vzniknout. Ctěné díky Všem jmenovaným.

Obsah

Obsah .......................................................................................................................................... 4

Použité symboly a zkratky .......................................................................................................... 7

Úvod ............................................................................................................................................ 9

1. Výrobky s obsahem nikotinu ................................................................................................ 10

1.1 Historie tabáku ............................................................................................................................. 10

1.2 Základní údaje o tabáku ............................................................................................................... 11

1.3 Druhy tabákových výrobků .......................................................................................................... 12

1.3.1 Cigarety ................................................................................................................................. 12

1.3.2 Doutníky, cigarilla, viržinky ................................................................................................. 14

1.3.3 Vodní dýmky ......................................................................................................................... 15

1.3.4 Elektronické cigarety ............................................................................................................ 15

1.3.5 Šňupací tabák ........................................................................................................................ 17

1.3.6 Žvýkací tabák ........................................................................................................................ 17

1.4 Užívání tabákových výrobků v České republice .......................................................................... 17

1.5 Škodlivost kouření ....................................................................................................................... 21

1.5.1 Kancerogenita tabákového kouře .......................................................................................... 21

1.5.2 Náchylnost k infekčním onemocněním ................................................................................. 22

1.5.3 Vliv na imunitní systém ........................................................................................................ 22

1.5.4 Vliv na endokrinní systém .................................................................................................... 23

1.5.5 Vliv na reprodukční systém .................................................................................................. 23

1.5.6 Riziko kardiovaskulárních onemocnění ................................................................................ 24

1.5.7 Chronická obstrukční plicní nemoc....................................................................................... 24

1.5.8 Další nepříznivé vlivy kouření na organismus ...................................................................... 25

2. Nikotin .................................................................................................................................. 26

2.1 Chemickofyzikální popis ............................................................................................................. 26

2.2 Účinek nikotinu na organismus .................................................................................................... 27

2.2.1 Vstup do organismu .............................................................................................................. 27

2.2.2 Distribuce v organismu ......................................................................................................... 27

2.2.3 Účinky nikotinu ..................................................................................................................... 28

2.2.4 Nikotin jako jed ..................................................................................................................... 28

2.2.5 Závislost na nikotin ............................................................................................................... 29

2.3 Metabolické přeměny nikotinu v těle ........................................................................................... 29

3. Kotinin .................................................................................................................................. 31

3.1 Chemickofyzikální popis ............................................................................................................. 31

3.2 Metabolismus kotininu ................................................................................................................. 31

3.3 Kotinin jako biomarker ................................................................................................................ 32

4. Biochemická analýza kotininu .............................................................................................. 33

4.1 Farmakokinetika ........................................................................................................................... 33

4.2 Metody biochemické analýzy kotininu ........................................................................................ 35

4.2.1 Kolometrie ............................................................................................................................ 35

4.2.2 Imunoanalýza ........................................................................................................................ 35

4.2.3 Chromatografie ..................................................................................................................... 35

4.2.4 Hmotnostní detekce (MS) ..................................................................................................... 37

5. Cíle práce .............................................................................................................................. 38

6. Metodika a materiál .............................................................................................................. 39

6.1 Sběr materiálu .............................................................................................................................. 39

6.2 Měření pomocí HPLC-MS ........................................................................................................... 39

6.2.1 Chemikálie, přístroje a pomůcky .......................................................................................... 39

6.2.2 Zpracování biologického materiálu – extrakce ..................................................................... 41

6.2.3 Podmínky HPLC ................................................................................................................... 42

6.2.4 Podmínky MS ....................................................................................................................... 42

6.2.5 Vyhodnocení ......................................................................................................................... 43

6.3 Měření na automatickém analyzátoru cobas 8000, modul c 502 ................................................. 43

6.3.1 Popis přístroje........................................................................................................................ 43

6.3.2 Chemikálie, přístroje a pomůcky .......................................................................................... 45

6.3.3 Podmínky pro měření na cobas 8000 .................................................................................... 45

6.3.4 Postup měření ........................................................................................................................ 47

6.3.5 Vyhodnocení ......................................................................................................................... 47

7. Výsledky a diskuze ............................................................................................................... 49

7.1 Výsledky z LC-MS ...................................................................................................................... 49

7.2 Výsledky z automatického analyzátoru cobas 8000 .................................................................... 49

7.3 Statistické porovnání metod ......................................................................................................... 49

7.4 Naměřené hodnoty kotininu vztažené na příjem tabákových výrobků ........................................ 52

7.4.1 Hodnocení dotazníku ............................................................................................................ 52

7.4.2 Vztah průměrných hodnot kotininu na množství vykouřených cigaret ................................ 53

7.5 Diskuze......................................................................................................................................... 53

7.5.1 Diskuze – porovnání metod .................................................................................................. 53

7.5.2 Diskuze – naměřené hodnoty kotininu vztažené na příjem tabákových výrobků ................. 55

8. Závěr ..................................................................................................................................... 56

Přílohy ....................................................................................................................................... 57

Zdroje ........................................................................................................................................ 68

Použité symboly a zkratky

AAA Aneurysma abdominální aorty

Abs. (A) Absorbance

ACTH Adrenokortikotropní hormon

ADHD Porucha pozornosti s hyperaktivitou

AIM Akutní infarkt myokardu

AUC Plocha pod křivkou

𝐶𝐵𝑆𝑆 Koncentrace látky v krvi v rovnovážném stavu

CB Koncentrace látky v krevní plazmě

CL Celková clearence

CO Oxid uhelnatý

COT Kotinin

CV Variační koeficient

D Dávka

DPH Daň z přidané hodnoty

E Rychlost eliminace

ELISA Heterogenní imunoanalýza

ESI Electrospray ionization

GC Plynová chromatografie

HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

CHOPN Chronická obstrukční plicní nemoc

Ig Imunoglobuliny

KVO Kardiovaskulární onemocnění

LC Kapalinová chromatografie

LD50 Střední letální dávka

MS Hmotnostní spektrometrie

NIC Nikotin

NO Oxid dusnatý

PAH Polycyklické aromatické uhlovodíky

psi Pounds per square inch

QC Konrola kvality

RIA Radioimunoanalýza

ROC Receiver Operating Characteristic

SD Směrodatná odchylka

SRM Single reactant monitoring

SZÚ Státní zdravotní ústav

t1/2 Poločas rozpadu

TLC Chromatografie na tenké vrstvě

Vd Distribuční šíře

VK Variační koeficient

WHO Světová zdravotnická organizace

�̅� Průměrná hodnota

9

Úvod

Užívání tabákových výrobků patří celosvětově k jedněm z nejčastějších neřestí, kterými si

i přes známý negativní dopad stále ještě spousta lidí vědomě ničí zdraví. Hlavní součástí

tabáku je rostlinný alkaloid nikotin, jenž se v organismu váže na nikotinové acetylcholinové

receptory, čímž vyvolává stav relaxace, stimuluje myšlení, pozornost a vyvolává extrémně

silnou závislost. Nikotin je v těle metabolizován jaterními enzymy na několik produktů, které

je možné velmi citlivými metodami detekovat například v moči, séru, či slinách. Zjištění

přítomnosti některého z těchto produktů svědčí o expozici nikotinu. Množství metabolitů

závisí na spoustě faktorů. Lze z něj tedy vyčíst a vyvodit mnoho informací týkajících se

kupříkladu doby, či druhu expozice, ale i údaje o procesech souvisejících s přístupem

organismu k cizorodé látce a jejího odbourávání. Proto stanovování hladin těchto metabolitů

může mít v budoucnu velký význam a široké uplatnění v praxi a mohlo by být řazeno mezi

standardní biochemická vyšetření. Nejvýznamnějším metabolitem se jeví kotinin, jehož

sledováním se v této práci budu zabývat.

10

Teoretická část

1. Výrobky s obsahem nikotinu

Kouření, v minulosti vnímáno jako trend, který udávala vyšší třída, a bylo symbolem

určité noblesy a společenského postavení, je dnes spíše v úpadku. V současné době

v civilizovaném světě je znám negativní vliv tabákových výrobků na zdraví a

už i na krabičkách cigaret nám bijí do očí varovné nápisy informující o jejich škodlivosti.

Přesto všechno však nedošlo během posledních pár let k rapidnímu poklesu kuřáků ve

společnosti, jak se můžeme dočíst v každoročních zprávách WHO, či SZÚ pro Českou

republiku. [1, 2] Tabákové výrobky, stejně jako jiné škodliviny, podléhají globálně vysokému

zatížení spotřební daní, čímž si státy aspoň částečně snaží kompenzovat náklady na léčbu

vynaloženou na nemoci spojené s užíváním těchto látek a také je činní méně dostupnými.

Velké procento populace se však této neřesti i nadále oddává.

1.1 Historie tabáku

První účinky tabáku okusila Evropa na přelomu 14. století, kdy jej ze své výpravy

k břehům Ameriky přivezla posádka lodí pod záštitou mořeplavce a kolonizátora Kryštofa

Kolumba. Semena byla přivezena až druhou Kolumbovou výpravou, a to z provincie Tabacco

na ostrově San Domingo. V předkolumbovské éře byl tabák výhradně záležitostí indiánů,

kteří jej užívali z náboženských a léčebných důvodů. [3]

Díky francouzskému velvyslanci Jeanovi Nicottovi, po němž dostala rostlina odborný

název Herba Nicotiana, se dostal tabák na francouzský královský dvůr, kde byl využíván

královskou rodinou k léčbě migrén, což výrazně prospělo jeho popularizaci a brzy se tak

rozšířil po celé Evropě. Lidé tabák užívali jako všelék na různé neduhy a jeho oblíbenost

vedla ke vzniku prvních manufaktur, později továren. V 17. století se již tabák pěstoval takřka

v každé evropské zemi. Bohatě zdobená dýmka či tabatěrka se šňupacím tabákem se postupně

stala nezbytnou součástí výbavy každého zámožného gentlemana. Ve 30. letech 19. století

začala výroba prvních cigaret, které díky své jednoduchosti, nízké ceně, snadné výrobě a

dostupnosti brzy ovládly tabákový trh. [3]

11

1.2 Základní údaje o tabáku

Tabákové produkty se vyrábí z listů rostlin rodu Nicotianae z čeledi lilkovitých

Solanaceae (do stejné patří i rajčata, papriky, brambory). Tento rod zahrnuje 67 druhů.

Typickým znakem, který spojuje všechny rostliny tohoto rodu, je obsah alkaloidu nikotinu

v celé rostlině. Průmyslově pěstovány za účelem zisku suroviny tabáku jsou však pouze dva

druhy, jejichž dlouholetým šlechtěním vzniklo několik set odrůd. [4]

Nejvyužívanější je druh Nicotiana tabacum (tabák viržinský), do kterého patří nejznámější

odrůdy Virginia, Burley či Oriental. Tento druh s největší pravděpodobností vznikl zkřížením

Nicotina sylvestris a Nicotina tomentosiformus. Jedná se o mohutnou až 2 metry vysokou

rostlinu s velkými zelenými oválnými listy a růžovými květy. [3]

Nicotiana rustica neboli tabák selský je průmyslově méně významný druh. Oproti

viržinskému tabáku dorůstá menších rozměrů (do 1,5 metru), má zelené řapíkaté listy,

žlutozelené květy a je mnohem odolnější vůči chladu. Využívá se především na výrobu

nikotinových postřiků, tabákových směsí do vodních dýmek a žvýkacího tabáku. Plodem

obou druhů jsou v porovnání s velikostí rostlin velmi malá semena. [3, 5]

Tabák je jednoletá rostlina původně z Ameriky, dnes již vysazována po celém světě. Jedná

se o teplomilnou rostlinu poměrně náročnou na pěstování. Vyžaduje optimální vlhkost,

lehkou hlinitopísčitou půdu a dostatek světla. Podmínky jsou odlišné dle účelu, za jakým je

tabák pěstován. Například doutníkový tabák potřebuje vyšší vlhkost a sklízí se později

než cigaretový, kterému stačí k dozrání 60­65 dní. S nižší vlhkostí stoupá v tabáku obsah

nikotinu. Sklizeň může probíhat jak ručně, tak mechanicky. [3, 6]

Jedině správným procesem sušení může být u tabáku dosaženo požadované textury, barvy,

chuti a celkové kvality. Typ sušení se volí dle odrůdy tabáku. Může probíhat přirozenou

cirkulací vzduchu, horkým vzduchem, sušením na slunci či ohněm. [3, 7]

Po usušení je tabák zpracováván dle typu koncového produktu. Dochází k míchání

jednotlivých odrůd, přídavku nejrůznějších aditiv a aróma pro dosažení vyvážené chuti.

Přesná receptura a postup je výrobním tajemstvím jednotlivých producentů. Velmi důležité

při výrobním procesu je sledování a zachování optimální vlhkosti. [8]

12

1.3 Druhy tabákových výrobků

Existuje několik způsobů, jak nikotin do těla vpravit. Jednotlivé typy výrobků se odlišují

způsobem podání, obsahem jednotlivých látek a bezpochyby také škodlivostí. Nejběžnější

ještě stále zůstává inhalační cesta, tedy prostřednictvím cigaret, dýmek či v dnešní době čím

dál více populárních elektronických cigaret. Do této skupiny můžeme zařadit také šňupací

tabák a nikotinové inhalátory. Přes sliznici gastrointestinálního traktu vstřebáváme nikotin

ze žvýkacího tabáku, nikotinových žvýkaček, pastilek a tablet. V neposlední řadě může být

nikotin do těla pozvolna uvolňován kůží z nikotinových náplastí. Ve své práci se zaměřím

na ty nejběžnější způsoby užívání (tabulka č. 1).

Druh Skupina Podskupina

cigarety

doutníky

doutníčky

tabák ke kouření určený k ručnímu balení cigaret

dýmkový

určený pro vodní dýmky

bezdýmný šňupací

žvýkací

určený k orálnímu užití

nový tabákový výrobek ke kouření

bezdýmný

Tabulka č. 1: Druhy tabákových výrobků a jejich členění na skupiny a podskupiny dle přílohy

č. 1 k vyhlášce 261/2016 Sb.[9]

1.3.1 Cigarety

Cigareta je tvořená provazcem jemně řezané tabákové směsi obalené v cigaretovém

papírku. Prodávají se buď průmyslově zkompletované, nebo jednotlivé součásti zvlášť

k domácímu balení. Na výrobu cigaretových papírků se využívá speciální lněný nebo

konopný, vysoce kvalitní celulózový papír s přídavkem různých chemických látek. Jedním

z aditiv je například uhličitan vápenatý zvyšující poréznost a hořlavost, oxid titaničitý, který

zběluje popel, či dusičnan draselný podporující hoření a soudržnost popelu. Běžnou součástí

dnešních cigaret je také filtr vyrobený z acetátu celulózy, bílé netoxické látky, bez chuti a

13

zápachu. Filtr drží pohromadě tzv. roubíkový papír. Důležitou vlastností filtru i papírku je

porozita udávaná v jednotkách Coresta. Úroveň porozity vypovídá o záchytu škodlivin. Jedna

Coresta odpovídá množství vzduchu v ml, které projde 1cm2 při podtlaku 10 mm vodního

sloupce. Dle směrnic Evropské unie musí všechny cigarety splňovat LIP (Low Ignition

Propensity) – nižší náchylnost k vzplanutí, kterou zajišťuje páskovaný cigaretový papír,

fungující jako zpomalovací prahy a snižující rychlost hoření. [3, 7]

Tabulka č. 2 uvádí pro příklad informace o množství dehtu, oxidu uhelnatého a nikotinu

vztažené vždy na jednu cigaretu různé značky. Tyto údaje jsou z roku 2013, aktuálnější

bohužel nejsou k nalezení. Může za to Směrnice Evropského parlamentu z dubna 2014

zakazující výrobcům uvádět tyto informace na balení cigaret i na webových stránkách, jelikož

mohou být údajně zavádějící pro spotřebitele, neboť ho mají vést k domněnce, že některé

cigarety jsou méně škodlivé, než ostatní. [10]

Značka cigaret Množství dehtu

v cigaretě

Množství CO

v cigaretě

Množství nikotinu

v cigaretě

Camel Silver 4 mg/cig.

5 mg/cig. 0,3 mg/cig.

LD Pink Superslims 3 mg/cig. 2 mg/cig. 0,3 mg/cig.

Moon Bright Blue

Slims

3 mg/cig. 2 mg/cig. 0,3 mg/cig.

Phillip Morris

Yellow

4 mg/cig. 4 mg/cig. 0,4 mg/cig.

L&M Silver Label 4 mg/cig. 5 mg/cig. 0,4 mg/cig.

Moon Original Blend 7 mg/cig. 7 mg/cig. 0,5 mg/cig.

Marlboro Gold

Touch

6 mg/cig. 6 mg/cig. 0,5 mg/cig.

Viceroy Special Blue 7 mg/cig. 8 mg/cig. 0,6 mg/cig.

Marlboro Gold

Original

8 mg/cig. 9 mg/cig. 0,6 mg/cig.

L&M Blue Label 8 mg/cig. 9 mg/cig. 0,6 mg/cig.

Viceroy Fresh Mint 7 mg/cig. 8 mg/cig. 0,6 mg/cig.

Camel Blue 8 mg/cig. 9 mg/cig. 0,6 mg/cig.

RGD Blue 100’s 8 mg/cig. 9 mg/cig. 0,7 mg/cig.

14

Sparta Classic 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,7 mg/cig.

Davidoff Platinum 8 mg/cig. 8 mg/cig. 0,7 mg/cig.

RGD Red 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,8 mg/cig.

Phillip Morris Red 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,8 mg/cig.

Chesterfield Red 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,8 mg/cig.

Lucky Strike

Original Red

10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,8 mg/cig.

Ronson London Red 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,9 mg/cig.

Steels Red 100s 10 mg/cig. 10 mg/cig. 0,9 mg/cig.

Rothmans King Size

Blue

10 mg/cig. 9 mg/cig. 0,9 mg/cig.

Tabulka č. 2: Příklad obsahu dehtu, oxidu uhelnatého a nikotinu u určitých značek cigaret

[11]

1.3.2 Doutníky, cigarilla, viržinky

Pod pojmem doutník rozumíme tabákový smotek obsahující výlučně přírodní tabák,

zabalený v krycím a vázacím listu. Venkovní obvod smotku by měl mít nejméně v jedné

třetině délky minimálně 34 mm. Jednotková hmotnost bez filtru nebo náustku se musí

pohybovat mezi 2,3 g až 10 g. Krycí list se vine ve tvaru spirály kolem celého doutníku

v ostrém úhlu k podélné ose smotku. Doutník obsahuje trhanou tabákovou náplň definovanou

jako částice odžilovaného tabákového listu o velikosti od 6,35 mm do 12,7 mm. Barva

doutníku je závislá na barvě krycího listu, rozlišuje se 7 základních barev a 60 odstínů.

Velikost se udává v palcích nebo milimetrech. Dle tvaru doutníky dělíme na dvě základní

skupiny, parejos, rovné doutníky, a figurados, nepravidelné. [3, 9]

Cigarilla jsou strojově vyráběné, krátké, úzké doutníčky o hmotnosti nejvíce 3 g, obalené

v tabákových listech a prodávané v krabičkách jako cigarety. [9]

Viržinky si již nedrží takovou popularitu jako za první republiky a dnes jsou známy spíše

od kníratých gentlemanů z černobílých filmů. Jedná se o výrobek z tabákových listů

namotaných okolo žitného, nebo pšeničného stébla, které se před zapálením vytahuje.

Do viržinky bývá zapuštěna plastová trubička. Můžeme tedy říct, že to jsou vlastně duté

doutníčky. [3, 7]

15

1.3.3 Vodní dýmky

Vodní dýmka funguje na principu filtrace a ochlazování tabákového kouře přes vodní filtr.

Skládá se z karafy, která se naplňuje vodou, těla tvořeného dvěma částmi, z nichž jedna část

vede kouř z korunky do karafy a druhá od karafy ke šlauchu. Šlauch je hadice, kterou uživatel

nasává kouř z těla dýmky. Korunka se naplní tabákem, překryje pravidelně proděravělým

alobalem a na něj už se mohou dávat uhlíky. [12, 13]

Do vodních dýmek slouží speciální směs tabáků druhu Nicotiana rustica naložená

do melasy nebo medu a smíchaná s vysušenou ovocnou drtí. Drť dodává tabáku příchuť podle

její hlavní složky. Na trhu jsou k naleznutí příchutě jako jablko, banán, ananas, citron, mango,

meruňka, datle, broskev, meloun, třešně, kokos a mnohé další. Ne vždy musí být příchuť

ovocná. Existují rovněž příchutě jako vanilka, máta, karamel, pistácie, jasmín, káva, lékořice,

či kola. [12, 13]

Mnozí lidé věří mýtu, že vodní dýmka je zdravější než klasické kouření, jelikož se

škodliviny zachytávají ve vodě, kterou kouř prochází. Výzkumy dokazují, že jak tabákové

směsi připravované pro vodní dýmky, tak i uhlí, na kterém je směs zahřívána, jsou zdrojem

mnoha škodlivých chemických látek, jako jsou polycyklické aromatické uhlovodíky,

respirabilní prachové částice, oxid uhelnatý, těkavé sloučeniny či benzen. Při kouření vodní

dýmky kuřák přijme až pětkrát více oxidu uhelnatého a až dvakrát více dehtu než u klasických

cigaret. U uživatelů se po požití nachází v krvi velké množství karboxyhemoglobinu. Složení

dehtu se liší hlavně díky rozdílné teplotě spalování, která u klasických cigaret dosahuje

až 900°C, kdežto u vodních dýmek pouhých 450°C. Ochlazený kouř z dýmky se také dostává

hlouběji do plic a je tedy mnohem nebezpečnější. Ve vyšších hodnotách než u cigaret

naměříme také těžké kovy, arzen, nikl, kobalt, chrom a olovo. Příjem nikotinu, i přes jeho

částečnou filtraci vodou v karafě, dosahuje hodnot kolem 2 mg, což je dvojnásobek toho,

kolik jej přijmeme vykouřením jedné klasické těžké cigarety. [12, 13]

1.3.4 Elektronické cigarety

Elektronickou cigaretu bereme za alternativu klasické cigarety a je tedy definována v § 2

písm. e) zákona č. 65/2017 Sb., o ochraně zdraví před škodlivými účinky návykových látek,

jako „výrobek, který lze použít pro užívání výparů obsahujících nikotin nebo jiných výparů

prostřednictvím náustku, nebo jakákoliv součást tohoto výrobku, včetně náhradní náplně,

zásobníku, nádržky i zařízení bez nádržky nebo zásobníku; elektronické cigarety mohou být

16

jednorázové, opětovně naplnitelné pomocí náhradní náplně nebo nádržky nebo opakovaně

použitelné pomocí jednorázových zásobníků“. Pro její účinnost jsou podstatné tři funkční

části: baterie, atomizér a patrona (cartrige) s náplní (e-liquid). Pomocí atomizéru dochází

v patroně k zahřívání kapalné náplně a tvorbě páry (aerosolu), která je vdechována

uživatelem. Složení náplní se liší dle receptury výrobce. Obecně však platí, že směsi

obsahující 0,1 – 1 % hmotnosti nikotinu jsou podle konvenční výpočtové metody

klasifikovány jako zdraví škodlivé a od 1 % do 7 % brány za toxické a jako takové podléhají

kontrole orgánům na ochranu veřejného zdraví. Množství nikotinu se na náplních uvádí

v miligramech na mililitr. Uživatel si může zvolit různou sílu náplně od 0 mg/ml – 24 mg/ml.

Náplň o 24 mg/ml odpovídá 35 a více klasickým cigaretám. Dalšími složkami mohou být

propylenglykol, rostlinné oleje, glycerol, aromatické látky, voda, alkohol či různé organické

kyseliny. [14, 15]

Mezi elektronické cigarety můžeme zařadit také poměrně novou technologii zahřívání

tabáku, se kterou jako první přišla na trh společnost Philip Morris International. IQOS,

obchodní název jejich zařízení, zahřívá tabák na teplotu přibližně 300 °C, díky čemuž se

z cigarety uvolňuje chuť a nikotin bez zplodin vznikajících při spalování. [16]

Graf procentuálního zastoupení uživatelů elektronické cigarety z celkového počtu

dotazovaných v průzkumu SZÚ na užívání tabáku v České republice v roce 2013 – 2017 je

uveden na obrázku č. 1. [2]

Obrázek č. 1: Graf ­ Uživatelé elektronické cigarety z celkového počtu dotazovaných

v průzkumu SZÚ [2]

3,53,9

2,3

5,75,2

0

1

2

3

4

5

6

2013 2014 2015 2016 2017

Uživatelé elektronické cigarety

(denní i příležitostní, v %)

17

1.3.5 Šňupací tabák

Šňupací tabák je nadrcený tabák ve formě prášku nebo granul, který je speciálně upravený,

aby mohl být šňupán, a nelze jej kouřit. Jedním šňupnutím dostane uživatel do těla přes nosní

sliznici přibližně stejné množství nikotinu jako po vykouření jedné cigarety. Výhodou je, že

nikotin do těla proniká sliznicí daleko rychleji než při klasickém kouření a má silnější

stimulační účinek. Zároveň se však konzument vyhne škodlivým látkám jako je dehet, či oxid

uhelnatý, jelikož při užívání nedochází ke spalování. [3]

1.3.6 Žvýkací tabák

Žvýkací tabák se prodává jako svitky, tyčinky, pruhy, plátky, krychličky či hranolky

speciálně upravené pro žvýkání. Pro tyto účely se využívá výhradně duh Nicotiana rustica.

Uživatel jej dává pod spodní ret či cucá v ústech a občasným žvýkáním se z tabáku uvolňuje

nikotin a charakteristická chuť. Šťávy vzniklé při žvýkání uživatel odplivuje, nikotin se

vstřebává ústní sliznicí. Stejně jako u šňupacího tabáku nevznikají při užívání zplodiny

spojené se spalováním a nedochází k průchodu přes dýchací cesty, čímž se snižuje

pravděpodobnost výskytu rakoviny plic oproti klasickému kouření. [3]

Existuje i orální tabák, tzv. snus, který se od žvýkacího liší absencí potřeby tabák žvýkat,

jelikož se z něj nikotin a další látky uvolňují samovolně. Tento druh tabáku je dle směrnice

Evropské unie 2001/37/ES zakázán ve všech evropských zemích, výjimkou Švédska a

Dánska, kvůli údajnému vyššímu riziku rakoviny dutiny ústní. Komise WHO však studie

prokazující vyšší škodlivost později zpochybnila. [3]

1.4 Užívání tabákových výrobků v České republice

Kouření je považováno za nejrozšířenější preventabilní příčinu úmrtí a různých

chronických onemocnění na celém světě. Stojí za celou řadou kardiovaskulárních,

nádorových a respiračních chorob. Jeho popularita v dané populaci má vliv na celkovou

mortalitu a míru nemocnosti. Léčba nemocí spojených s užíváním tabákových výrobků

představuje velkou ekonomickou zátěž pro zdravotnictví jednotlivých států. Světová

zdravotnická organizace (WHO) vypracovala strategii, jak účinně proti tabákové závislosti

bojovat. Základem jejich programu, kterým se řídí už většina evropských zemí včetně České

republiky, tkví v šesti hlavních bodech – MPOWER (Monitoring, Protect, Offer, Warn,

Enforce, Raise).[1, 2, 17]

18

Prvním z bodů je monitoring užívání tabáku a politika prevence. Pro monitorování

jednotným a porovnatelným způsobem po celém světě, byl ve spolupráci WHO a Center

pro kontrolu nemocí a prevenci (CDC) vytvořen Globální systém surveillance tabáku (GTSS)

v rámci něhož probíhají studie zaměřené na různé věkové skupiny prostřednictvím dotazníků.

Hlavním cílem populačního výzkumu je především stanovení podílu zdravotně rizikového a

škodlivého užívání tabáku a určení demografických a sociálních znaků ohrožené populace.

Data o kouření v ČR jsou sbírány každoročně už od roku 1997. Prevalence kuřáctví se

u nás dlouhodobě (rozmezí minimálně 5 let) pohybuje okolo 28 až 32 %. V roce 2017 klesla

na hodnotu 25,2 %. Průzkumy z roku 2017 také ukazují, že mezi kuřáky patří výrazně více

mužů než žen (obrázek č. 2). Ze 74,8 % současných nekuřáků uvedlo 18,4 % respondentů, že

jsou bývalí kuřáci, z toho 9,0 % denní a 9,4 % příležitostní. Z průzkumu také vyplynulo, že

česká populace kouří převážně cigarety a podíl jiných tabákových výrobků je v porovnání

s nimi zanedbatelný. Nejvyšší prevalence kuřáctví byla zjištěna ve věkové skupině 15 – 24 let

(35,6 %), dále klesá na 27,4 % ve věkovém rozpětí 25 – 44 let, 26,2 % ve skupině 45 – 64 let

a na 14,9 % u osob ve věku 65 let a více (obrázek č. 3). Dle vzdělání je procento kuřáků

nejnižší u vysokoškolsky vzdělaných, v porovnání s respondenty se základním a středním

vzděláním. Mezi kouřením tabákových výrobků ve městech a na venkově naopak žádný

významný rozdíl není. Spotřeba cigaret (komerčně vyráběných a ručně ubalených) na jednoho

kuřáka dosáhla v tomtéž roce průměru 12,3 kusů cigaret za den. Třetina kuřáků, především ze

skupiny nejmladších kuřáků (15 – 24 let), také uvedla, že se v průběhu roku 2017 pokusila

přestat kouřit. S přibývajícím věkem u kuřáků úsilí přestat kouřit klesá. Průzkum mimo jiné

také zjišťuje, jaký vliv mají varování a obrázky na krabičkách cigaret či postoj k zákazu

kouření v restauracích, hospodách a barech. [2]

19

Obrázek č. 2: Graf ­ Prevalence kuřáctví v ČR v letech 2012 – 2017 – dle pohlaví (včetně

trendu) [2]

Obrázek č. 3: Graf ­ Kuřáci jakéhokoliv tabákového výrobku dle věkových skupin [2]

Druhým bodem je ochrana (protect) lidí před tabákovým kouřem, tedy před pasivním

kouřením. Pro kouření na veřejnosti vznikají čím dál přísnější pravidla. Největší posun, který

Česká republika zaznamenala, představuje zákon č. 65/2017 Sb., o ochraně zdraví

před škodlivými účinky návykových látek, který vyšel v platnost 31. 5. 2017 a zakazuje

36,5 36,4 37,4

27,3

35

30,8

26,323,7

25,8

2122,5

19,9

0

5

10

15

20

25

30

35

40

2012 2013 2014 2015 2016 2017

Kuřáci tabákových výrobků dle pohlaví (v %)

Muži Ženy

20

kouření v restauracích, hospodách a barech. V roce 2017 s tímto zákonem vyjádřilo

spokojenost 61,4 % dotazovaných, nesouhlas 22,2 % a zbytek respondentů svůj názor

na danou problematiku neuvedl. [2]

Třetí bod (offer - nabídka), představuje pomoc při odvykání kouření, kterou zajišťují různé

kampaně a centra léčby závislosti na tabáku. K pomoci při odvykání u silných dlouholetých

kuřáků přispívá tzv. náhradní nikotinová léčba, která pomáhá při překonání fyzické závislosti

na nikotinu. Tato léčba spočívá v podávání přípravků s obsahem nikotinu, jako jsou náplasti,

žvýkačky, pastilky, mikrotablety, inhalátory a nosní spreje. Tyto přípravky nahrazují dávku

nikotinu přijatou cigaretou a pacient se tak vypořádává především s psychickou závislostí

na kouření. Dávky nikotinu se postupně snižují, dokud není možné nikotin vysadit úplně. [18]

Čtvrtou strategií je varování před škodlivostí kouření. Varovné nápisy a odstrašující

obrázky jsou k vidění na tabákových výrobcích již ve většině vyspělých zemí a mají státem

nařízenou podobu, rozměry a obsah sdělení. V České republice varovný nápis, psaný v češtině

černě tučně fontem Helvetica a na bílém pozadí, povinně nosí všechny tabákové výrobky

od roku 2004, kdy vstoupila v platnost vyhláška Ministerstva zemědělství č. 344/2003 Sb.

(v roce 2016 nahrazena vyhláškou č. 261/2016 Sb.). Skládá se z obecného varování „Kouření

může zabíjet“, nebo „Kouření vážně škodí Vám i lidem ve Vašem okolí“ a jednoho z mnoha

dodatečných varování. Odstrašující obrázky byly jako první povinně zavedeny v Kanadě. U

nás jsou k vidění na všech krabičkách cigaret od září roku 2016. [9]

Předposlední bod je zaměřený na zákaz prosazování reklam na tabákové výrobky, jejich

propagaci a sponzorství. [9]

Nezbytně nutným a pro státy asi nejvýhodnějším opatřením je vysoké zatížení tabáku a

výrobku z něj spotřební daní, která se při použití minimální sazby daně vypočítá jako součin

minimální sazby daně a počtu kusů cigaret se stanovenými parametry. Připočteme-li ještě

DPH, získáme celkovou daň dosahující téměř 83 % na jednu krabičku cigaret. [19]

Dle zákona č. 65/2017 Sb. o ochraně zdraví před škodlivými účinky návykových látek je

prodej tabáku omezen věkovou hranicí 18 let. Tento zákon omezuje mimo jiné prodej

i kouření na akcích určených osobám mladším 18 let, ve školách a školních zařízeních,

v nemocnicích a zdravotnických zařízeních a dalších prostorách tak, aby došlo

k minimálnímu vystavení pasivnímu kouření a ohrožení mravní výchovy mládeže. [20]

21

1.5 Škodlivost kouření

S masivním rozšířením kouření koncem 19. století začaly brzy vycházet na světlo

negativní účinky tabáku. Závislost na tabáku, diagnóza F17, je chronické, recidivující, letální

a pravděpodobně světově nejrozšířenější onemocnění. Odhaduje se, že zhruba 15 % všech

kardiovaskulárních onemocnění, kolem 80 % chronických plicních onemocnění (tj. především

CHOPN) a 20 – 30 % všech nádorových onemocnění zapříčiňuje kouření. Užívání tabáku má

na svědomí ročně nejméně 18 000 úmrtí v České republice, což představuje přibližně 17 %

z celkové mortality státu. [17]

Cigaretový kouř obsahuje více než 4000 chemických substancí, z nichž většina z nich

vzniká v průběhu hoření nebo se vytváří v důsledku vzájemných interakcí. Minimálně 50

z nich má prokazatelně karcinogenní účinek. Mezi prokázané kancerogeny patří například

arzén, dibenzantracen, hydrazen, benzo-a-pyren, dimetylnitrosamin a vinylchlorid. Tabákový

kouř je tvořen z 90 % plynnou fází, zbytek představují pevné částice. Plynnou část tvoří oxid

uhelnatý, oxid uhličitý, oxidy dusíku, amoniak, kyanovodík, těkavé sloučeniny síry, těkavé

uhlovodíky, těkavé N-nitrosaminy, těkavé nitrily, alkoholy, aldehydy, ketony. Hlavní složkou

pevné fáze je nikotin. Za ním následují další alkaloidy tabáku, netěkavé N-nitrosaminy,

aromatické aminy, alkany, alkeny, izoprenoidy tabáku, benzeny, naftaleny, polycyklické

aromatické uhlovodíky, N-heterocyklické uhlovodíky, fenoly, karboxylové kyseliny, kovy,

pesticidy, insekticidy a další. Kouř a jeho chemické složení se tvoří procesy hydrogenace,

pyrolýzy, oxidace, dehydratace, dekarboxylace, destilace, chemické kondenzace a sublimace.

Obsah kouře se mění především v závislosti na teplotě. Důležitým parametrem také je, zda se

jedná o hlavní (vdechovaný kuřákem) nebo vedlejší proud kouře (pasivní kouření). [21]

1.5.1 Kancerogenita tabákového kouře

Díky řadě experimentálních, klinických a hlavně epidemiologických dokladů byla

jednoznačně prokázána kancerogenita tabákového kouře. Nejvíce je kouření spjato se

zvýšeným rizikem rakoviny průdušek a plic. Prokazatelně vyšší výskyt u kuřáků pozorujeme

i u dalších zhoubných nádorů, například dutiny ústní, hrtanu, jícnu, žaludku, ledvin, slinivky

břišní, močového měchýře, gynekologických malignit a leukémií. Významnou skupinu

sloučenin s kancerogenními účinky jsou tzv. tabákově specifické nitrosaminy vzniklé

zpracováním, fermentací a spalováním z nornikotinu, nikotinu a atanabinu. Polycyklické

aromatické uhlovodíky (PAH) vznikají jako produkty nedokonalého spalování. Náš

22

organismus je těmito karcinogeny zatěžován neustále. Hlavním zdrojem PAHů jsou lokální

topeniště, průmyslové podniky, spalovací motory. Bohužel, těmto producentům se v dnešní

společnosti nedá vyvarovat. Dalšími zdroji znečištění, na kterých již jednotlivec může sám

zapracovat, jsou kouření, tepelná úprava potravin (grilování, uzení, smažení) či zapalování

svíček. Účinek jmenovaných i mnohých dalších karcinogenů je kumulativní a jejich vlivy

na mutace v genomu se sčítají. Zda dojde k vývoji nádorového onemocnění, závisí na mnoha

faktorech, znečištění prostředí, životním stylu, genetické predispozici, účinnosti reparativních

systémů těla. [21–23]

1.5.2 Náchylnost k infekčním onemocněním

Bakteriální flóra je jedinečná u každého člověka a mění se v průběhu života vlivem

vnějších a vnitřních faktorů. Roli v šíření infekce hrají vlastnosti bakterií, jako jsou virulence,

invazivita, tvorba enzymů a toxinů, stupeň adherence, citlivost a rezistence k antibakteriálním

látkám. K snadnému šířené infekce napomáhají rizikové faktory ze strany pacienta, chronické

onemocnění, imunitní oslabení a vlivy vnějšího prostředí, jako je užívání drog, alkoholu,

kouření, nezdravý životní styl. Změny bakteriálního osídlení v dutině ústní a dýchacích

cestách následkem kouření výrazně přispívají ke vzniku infekčních onemocnění těchto

prostor. Vlivem tabákového kouře na plicní tkáň dochází k poklesu α1-antitrypsinu, pohybu

řasinek, vitální kapacity plic a imunoglobulinů A a G, což má za následek zhoršenou

schopnost pročišťování plic, sníženou humorální odpověď a ohrožení tkáně trypsinem.

Zároveň dochází k vzestupu toxických mediátorů, které představují nebezpečí pro tkáň,

zvýšené tvorbě hlenu v důsledku zmnožení pohárkových buněk, inhalaci znečišťujících částic

a lepší adherenci bakterií. [22, 24]

1.5.3 Vliv na imunitní systém

Kouření, ať už aktivní nebo pasivní, má výrazný vliv na imunitní systém, což se promítá

především do oblasti vzniku respiračních, kardiovaskulárních i gastrointestinálních chorob.

Pro imunitní systém jsou významné především tyto látky cigaretového kouře: CO, oxidy

dusíku, glykoproteiny, vinyl chlorid, tabákově specifické nitrosaminy, kyanidy a jiné

ciliotoxické látky, PAH, těžké kovy. U jednotlivých složek lze spolehlivě dokázat negativní

vliv na jednotlivé komponenty imunitního systému. Akutní expozice kouři vyvolává

krátkodobé zvýšení obranyschopnosti, ale dlouhodobé vystavování těmto vlivům může vést

až k trvalému snížení imunitní odpovědi. Vlivem kouření dochází k poklesu syntézy

23

imunoglobulinů IgG, IgM, IgA a naopak ke zvýšené produkci IgE, které jsou spojovány se

vznikem alergií. Mimo jiné byla prokázána souvislost mezi kouřením a nárůstem

autoprotilátek, například u revmatoidní artritidy nebo Crohnovy choroby. Buněčná složka

imunity také nezůstává bez odezvy. V krevním obrazu kuřáků je k vidění nárůst leukocytů,

které však mají sníženou aktivitu a proliferační schopnost. [22, 24]

1.5.4 Vliv na endokrinní systém

Kouření postihuje regulační funkce prakticky všech endokrinních žláz. U zdravé štítné

žlázy má kouření zanedbatelný účinek. Škodlivé působení se nejvýrazněji projeví u snížené

funkce, kdy kouření zhoršuje primární i sekundární hypotyreózu a pacienti kuřáci by měli

podstupovat substituční léčbu hormony thyroidní žlázy. Působením na imunitní systém složky

kouření zhoršují riziko Gravesovy hypertyreózy a endokrinní oftalmopatie. [22, 25]

Nikotin má výrazný vliv na hypotalamo-hypofyzární systém, čímž ovlivňuje sekreci a

sérovou hladinu několika dalších hormonů. Jedním z těchto hormonů je i ACTH

(adrenokortikotropní hormon), který působí stimulačně na činnost kůry nadledvin. Zvyšuje

tak především syntézu kortikoidů a androgenů. Na druhou stranu kouření snižuje reakci

nadledvin na stresové podměty. Akutní odpovědí vlivu na renin-angiotenzin-aldosteronový

systém je zvýšení diastolického i systolického tlaku a tachykardie. Nikotin stimuluje taktéž

dřeň nadledvin. Hlavním důsledkem je zvýšený výdej katecholaminů, což je další faktor

vedoucí ke zvýšení krevního tlaku a srdeční akce. [22, 25]

Kouření také podněcuje narušení glukózového metabolismu. Existuje mnoho dokladů

o korelaci mezi kouřením a inzulinovou rezistencí, porušenou glukózovou tolerancí, vyššími

hladinami inzulinu v krvi a negativním vlivu na β-buňky pankreatu. [22, 25]

Kalciofosfátový metabolismus podílející se na stavu kostí je narušen sníženou produkcí

parathormonu a dalších hormonů (např. estrogenu), které mají na hospodaření s kostní tkání

vliv. Proto jsou kuřáci až dvakrát náchylnější k frakturám a osteoporóze. [22, 25]

1.5.5 Vliv na reprodukční systém

Škodlivým účinkům cigaretového kouře se nevyhne ani reprodukční systém. Zatímco

mužská fertilita, spermiogeneze a sekrece testosteronu je poměrně rezistentní, biosyntéza

ovariálních steroidních hormonů u žen kuřaček je prokazatelně snížená. Nižší hladina

24

estrogenů u žen může mít za následek poruchy menstruačního cyklu, problémy s otěhotněním

a dřívější nástup menopauzy. Progesteron pod normálovou hodnotou zase způsobuje

předčasnou ztrátu plodu již v raném stádiu těhotenství. U mužů kuřáků bývá snížená motilita

spermií a jejich celkové množství. Naopak počet morfologicky abnormálních forem se

zvyšuje. Studie rovněž dokazují, že mezi kuřáky najdeme větší procento mužů s erektilní

dysfunkcí až impotencí. [22, 26]

Kouření žen během těhotenství představuje velké riziko pro matku i plod. Je zvýšená

pravděpodobnost komplikací jako abrupce placenty, placenta praevia (vcestné lůžko),

předčasný porod, nízká porodní váha novorozence, intrauterinní růstová retardace,

malformace plodu, perinatální úmrtí plodu a další. Děti narozené matkám, které během

těhotenství od zlozvyku neupustily, jsou až třikrát více ohrožené tzv. syndromem náhlého

úmrtí novorozence. Dále je u nich pozorován vyšší výskyt nádorových onemocnění,

respirační problémy (chronické záněty, astma), obezita, diabetes mellitus 2. typu, ale i

psychiatrické problémy jako ADHD, emocionální nevyrovnanost, poruchy chování,

antisociální chování, abúzus návykových látek a rychlejší vznik závislosti na nikotinu. [22, 26]

1.5.6 Riziko kardiovaskulárních onemocnění

Kouření až dvakrát zvyšuje riziko vzniku kardiovaskulárních onemocnění, jako jsou akutní

infarkt myokardu, náhlá smrt srdeční, onemocnění periferních tepen, aneurysma abdominální

aorty, ischemická či hemoragická cévní příhoda mozková nebo subarachnoideální krvácení.

Dále zesiluje trombogenicitu, snižuje variabilitu tepové frekvence a úspěšnost bypassů

dolních končetin. Na mechanismu vzniku se podílí celá řada faktorů. U kuřáků dochází

k narušení vazomotorické funkce a struktury endotelu, ztrátě poddajnosti cévní stěny, častěji

probíhají zánětlivé změny a infekce ve stěnách cév. V krvi najdeme více volných radikálů,

patologické spektrum lipidů, trombocyty s narušenou funkcí, zvýšenou koncentraci

fibrinogenu a leukocytů, naopak sníženou hladinu antioxidantů a syntézu NO. [21, 22, 27]

1.5.7 Chronická obstrukční plicní nemoc

Pod názvem chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) se skrývá frekventované,

preventabilní, léčitelné onemocnění charakterizované trvalým omezením proudění vzduchu

v dolních cestách dýchacích. Obstrukci způsobuje abnormálně zesílená chronická zánětlivá

odpověď dýchacích cest a plic na inhalaci škodlivých částic nebo plynů. Ze 70­80 % toto

neinfekční perzistující onemocnění zapříčiňuje aktivní kouření. V celosvětovém měřítku tato

25

choroba představuje čtvrtou nejčastější příčinu úmrtí. Je typická především pro pacienty

nad 65 let a projevuje se různým stupněm dušnosti. [22, 28]

1.5.8 Další nepříznivé vlivy kouření na organismus

Kouření prokazatelně zvyšuje riziko tuberkulózy, roztroušené sklerózy, nespecifických

střevních zánětů i mnohých dalších onemocnění a výrazně zhoršuje jejich průběh. Zpomaluje

hojení ran. Způsobuje žlutavě nahnědlé zbarvení prstů, nehtů a zubů. Přitěžuje

dermatologickým chorobám, například lupénce, palmoplantární pustulose, akné, a urychluje

stárnutí kůže. Řada studií opakovaně dokazuje vyšší prevalenci zubního kazu, nemoci

paradontu a ztráty zubů. Nepříznivě ovlivňuje oko a vidění. Může mít vliv na rozvoj

psychiatrického onemocnění a poruch spánku. [22, 29]

26

2. Nikotin

Nikotin, (-)-Methyl-2-(3pyridyl)pyrrolidine, sumární vzorec C10H14N2, je vysoce toxický

rostlinný alkaloid. Představuje asi 90 % obsahu celkových alkaloidů obsažených v tabáku.

Mezi jeho další doprovodné alkaloidy patří především nornikotin, nicotirin, anatabin,

anatallin či anabasin. Množství nikotinu v tabáku kolísá dle typu tabáku (Nicotiana tabacum

0,6 % ­ 6 %, Nicotiana rustica 10 % i více), způsobu jeho pěstování, sušení a další úpravy.

Tvoří se v kořenech, odkud se distribuuje do celé rostliny. Největší množství nikotinu se

nachází v listech rostlin rodu Nicotianae. V rostlině je vázán na kyselinu jablečnou, vinnou a

citrónovou. Jeho producentům slouží k obraně proti požírání zvěří. [3, 7, 23]

Obrázek č. 4: Strukturní vzorec nikotinu [30]

2.1 Chemickofyzikální popis

Alkaloidy můžeme popsat jako složité dusíkaté organické sloučeniny zásaditého

charakteru. Zpravidla bývají rostlinného původu, kde vznikají metabolismem aminokyselin.

Vzácně jsou obsaženy také v tělech některých obojživelníků a hub. Do skupiny alkaloidů patří

mimo jiné látky jako kofein, kokain, atropin, morfin, kodein či lisergid (LSD). Nikotin je

odvozen od aminokyseliny ornitinu, která se v několika krocích přeměňuje na N-

methylpyrroliniový kationt. Následně dochází ke kondenzaci s kyselinou nikotinovou, čímž

vznikne alkaloid nikotin. [7, 31]

Ze strukturního vzorce nikotinu 3-[(2S)-1-methylpyrrolidin-2-yl]pyridin vyplývá, že se

jedná o šestičlenný uhlíkatý heterocyklus s jedním atomem dusíku zvaný pyridin, který má

na sebe navázaný pětičlenný methylpyrrolidinylový zbytek rovněž s jedním heteroatomem

dusíku. Jeho molekulární hmotnost se rovná 162.23 g/mol. Za normálních podmínek má

27

podobu bezbarvé nebo lehce nahnědlé viskózní těkavé hygroskopické kapaliny bez zápachu.

Po zahřátí je cítit po rybách. Za normálního atmosférického tlaku varu dosahuje při 247°C,

teplota tání je stanovena na -79°C a hustota tekutiny se rovná 1,01 g/cm3. Tenze par při 20°C

je 0,08 mm Hg. Teplota vzplanutí se pohybuje kolem 95°C a od 240°C může dojít k jeho

samovznícení. Nikotin je lehce rozpustný ve vodě. Je fotosenzitivní, na světle a vzduchu

hnědne a stává se viskóznějším. [32, 33]

2.2 Účinek nikotinu na organismus

Nikotin patří do skupin xenobiotik, což jsou látky tělu cizí a jako takové podléhají

specifickým procesům metabolismu, biotransformace a eliminace v organismu. Tyto procesy

jsou závislé na mnoha faktorech, proto je složité odhadnout, jaký přesně účinek na jednotlivce

bude látka v konkrétním množství mít. [34]

2.2.1 Vstup do organismu

Cesty průniku nikotinu do organismu jsou různé, vstřebání kůží, sliznicemi zažívacího

traktu, dutiny ústní či nosní. Nejběžnější však zůstává průchod látky sliznicí dolních cest

dýchacích, především alveolů, při kouření. Tabák v cigaretách je kyselý a nikotin se tak

dostává do těla v podobě solí, které se hůře vstřebávají ústní sliznicí, takže pokud nejsou

inhalovány, jsou ve velké míře vydechovány. Naproti tomu doutníkový kouř je zásaditý a

obsahuje nikotinové báze dobře vstřebatelné i sliznicí v ústech. K vniknutí látky do těla a

krevního oběhu dochází v řádech několika sekund. U bezdýmných tabákových výrobků je

průnik do cirkulace o něco pomalejší. [22, 23, 35, 36]

2.2.2 Distribuce v organismu

Po kouření, koncentrace nikotinu v oběhu kolísá díky neustálé rozsáhlé absorpci tkáněmi.

Může dosahovat hodnot kolem 100 ng/ml. Nicméně v mozku nabývá koncentrací až třikrát

takových. Nikotin snadno prochází membránami, včetně hematoencefalické a placenty. Míra

absorpce je závislá na hodnotě pH. Do 10 sekund po vdechnutí cigaretového kouře se nikotin

dostává do mozku. Po dosažení maximální koncentrace v mozku, dochází k jeho redistribuci

z mozku do krevního řečiště a odtud do dalších orgánů těla, například do kosterní svaloviny.

Tento způsob rychlé absorpce a tkáňové distribuce vede ke kolísání hladin nikotinu v rychle

perfundovaných orgánech, jako je mozek. Poločas eliminace nikotinu v těle se pohybuje

28

kolem 2-3 hodin. Důsledkem pravidelného kouření hladiny v krvi stoupají po dobu 8-12

hodin a přetrvávají, i když osoba spí. [7, 36]

2.2.3 Účinky nikotinu

Nikotin v nejvyšší míře působí na nervový a kardiovaskulární systém. V mozku se váže

na nikotinové acetylcholinové receptory, napodobuje tedy účinek endogenního

neurotransmiteru acetylcholinu. Krátkodobě vyvolává stav relaxace, stimuluje myšlení,

pozornost, paměť i schopnost učení, snižuje dráždivost a agresivitu. Nikotin je výrazným

aktivátorem hypotalamo-hypofizárního systému, což se projevuje účinky na endokrinní

systém a zvýšenou sekrecí některých hormonů. Nikotinové receptory se mimo jiné nacházejí

také v kosterní svalovině, kde nikotin vyvolává jemný svalový třes, ve větších dávkách

až těžké křeče. [7, 23, 31, 35]

Účinkem na vegetativní nervstvo stimuluje sympatická a parasympatická ganglia. Jedním

z projevů je zvýšená sekrece slin a aktivita trávicího traktu v důsledku zrychlení střevní

peristaltiky a intenzivnějšího uvolňování žaludečních šťáv. Dále působí stažení cév, nárůst

krevního tlaku a zrychlení srdeční činnosti. Dochází také k překrvení vnitřních orgánů včetně

srdce. Nikotin má rovněž vliv na hladiny některých hormonů, ať už svým působením

na hypothalamo-hypofyzární systém nebo na konkrétní endokrinní žlázy. Zvyšuje sérové

koncentrace katecholaminů, kortizolu, prolaktinu, endorfinů, antidiuretického hormonu a

ACTH. Naopak může vést ke snížení až blokaci syntézy estrogenu a inzulinu. Podporuje

katabolické procesy vedoucí k odbourávání glykogenu a uvolňování mastných kyselin.

Snižuje pocit hladu. [7, 17, 31, 35]

2.2.4 Nikotin jako jed

Dle velikosti střední letální dávky LD50, která se pohybuje v rozmezí 40 – 60 mg (5

mg/kg), se nikotin řadí mezi extrémně toxické látky. Vykouřením jedné cigarety o obsahu

nikotinu 10 mg (1 %) ho kuřák přijme dle způsobu kouření 1 až 3 mg. V dostatečném

množství (LD50) působí jako velmi silný neurotoxický jed. Při akutní otravě postižený

nejdříve pociťuje nevolnost, zvracení, svalový třes a křeče. K smrti může dojít už do 10 minut

po intoxikaci v důsledku periferního ochrnutí dýchacího svalstva. [23, 31, 32, 35]

29

2.2.5 Závislost na nikotin

Nikotin je silně návykovou látkou. Závislost je dvojího charakteru, psychická i fyzická.

K fyzické závislosti dochází na základě zmnožení nikotinových receptorů po opakovaném

přijímání nikotinu. Ve vzniku závislosti hraje roli také vyplavování endorfinů a

katecholaminů, které jsou zodpovědné za subjektivně příjemné pocity. Mezi nejběžnější

abstinenční příznaky patří silná touha po cigaretě, podrážděnost, úzkost, bolesti hlavy,

neschopnost koncentrace, deprese, nespavost, zácpa, zvýšení srdeční frekvence.

Pro hodnocení se používá Fagerströmův test nikotinové závislosti. [23, 31]

2.3 Metabolické přeměny nikotinu v těle

Část nikotinu, 5­10 %, se vylučuje v nezměněném stavu močí.[37] Pokud je pH moči vyšší

než 6, dochází k jeho reabsorbci zpátky do krevního oběhu. K metabolickým přeměnám

dochází v játrech. Nikotin v nízké dávce indukuje, ve vysoké naopak inhibuje, enzymatický

aparát podílející se na jeho biotransformaci. Přeměny probíhají za účasti cytochromu P450

2A6, což je jaterní enzym kódovaný genem CYP2D6. Tento enzym, společně s dalšími

z rozsáhlé skupiny cytochromů P450 s hemovou prostetickou skupinou, zastává klíčovou roli

v metabolismu xenobiotik. Biotransformace xenobiotik probíhá ve dvou fázích. V první fází

probíhá oxidace, redukce nebo hydrolýza. Druhá fáze je konjugační, při níž může dojít

ke spojení s kyselinou glukuronovou, sulfátovým, acylovým či methylovým zbytkem,

případně k tvorbě derivátu kyseliny merkapturové. Konečným výsledkem biotransformace

bývá vždy buď detoxikace (snížení toxicity), nebo aktivace (zvýšení toxicity). 70 – 80 %

nikotinu je metabolizováno na biologicky inaktivní kotinin, hlavní metabolit nikotinu rovněž

vylučovaný močí. Vedle kotininu jsou v nepatrném zastoupení i další metabolity, například

nornikotin, nikotin-N´-oxid, pyridin-isomethoniový ion, 2´-OH-nikotin (obrázek č. 5). [22, 38]

V metabolismu nikotinu hraje roli spousta vnějších a vnitřních vlivů. Fyziologicky má

na jeho přeměnu vliv pohlaví, věk, rasa, spánek, strava či těhotenství. Na enzymy katalyzující

přeměnu xenobiotik působí indukčně i inhibičně některé léky, například hormonální

antikoncepce, kumariny, fenobarbital, pyrazol a další. Patologicky snížený metabolismus

nikotinu bývá u poškození jater (jaterní cirhóza, hepatitida A) a selhání ledvin. [39]

30

Obrázek č. 5: Schéma metabolismu nikotinu [40]

31

3. Kotinin

Kotinin, (S)-1-Methyl-5-(3-pyridyl)-2-pyrrolidinone, sumárním vzorcem C10H12N2O, je

minoritním alkaloidem tabáku, avšak majoritním metabolitem nikotinu a díky svým

vlastnostem, dostupnosti, specifitě a senzitivitě stanovení je vhodným ukazatelem aktivního i

pasivního kouření a expozici nikotinu vůbec. Jakým způsobem dochází k transformaci

nikotinu na kotinin je zobrazeno na obrázku č. 6. Přeměna je katalyzována jaterním enzymem

cytochrom P450 2A6 a cytoplazmatickou aldehydoxidázou. [41]

Obrázek č. 6: Schéma biotransformace nikotinu na kotinin [41]

3.1 Chemickofyzikální popis

Kotinin, S-1-metyl-5-(3-pyridyl)-2-pyrolidinon, je chemická sloučenina s molární

hmotností 176,219 g/mol. Varu dosahuje při 250 °C/ 0,2 bar. Bod tání je stanoven v rozmezí

40­42 °C. K vzplanutí u něj dochází při teplotě nad 110 °C. V přirozeném stavu jde o tuhou

jemně krystalickou látku, lehce nažloutlé barvy. Od nikotinu se metabolit liší přítomností

karbonylové skupiny, která zvyšuje jeho polaritu a snižuje rozpustnost v tucích a bazicitu.

Je mísitelný s vodou. [38, 42]

3.2 Metabolismus kotininu

Osud kotininu v organismu může být dvojí. Část (cca 15 %) je vylučována v nezměněném

stavu močí. Zbytek se transformuje do 6 hlavních metabolitů. Majoritním metabolitem

kotininu v moči je 3´-OH-kotinin. V menším zastoupení se pohybuje jemu podobný 5´-OH-

kotinin. Dále v moči můžeme naleznout kotinin-N-oxid a nornikotin vzniklý demethylací

kotininu. V nepatrném množství jsou k naměření kotinin-methionový ion a

kotininglukuronid. [39]

32

3.3 Kotinin jako biomarker

Biomarkery jsou obecně látky, struktury nebo procesy, které lze měřit v těle a jeho

produktech, mající vypovídající hodnotu o fyziologických i patogenních procesech a

farmakologických interakcích v organismu. Jedná se o téměř jakékoliv měření odrážející

vzájemné působení mezi biologickým systémem a potenciálním nebezpečím chemického,

fyzikálního či biologického charakteru. Laboratorní biomarkery musí být objektivní

kvantifikovatelné znaky, které nám umožňují reprodukovatelně měřit a získávat výsledky

relevantní s klinickými obrazem. Zároveň se bere v potaz ekonomické i časové zatížení a

dostupnost měřících metod. [43]

Nikotin není vhodným biomarkerem pro průkaz abúzu, jelikož ve velké míře podléhá

biotransformaci, má krátký eliminační poločas (2-3 hodiny) a jeho hladina během dne značně

kolísá. Navíc může u analyzovaného vzorku dojít ke kontaminaci z ovzduší. Další specifické

alkaloidy, například anabasin a anatabin, se v tabáku vyskytují jen ve stopovém množství a

jejich stanovení v biologickém materiálu vyžaduje citlivou, náročnou a drahou analytiku.

Vyšetření nespecifických složek tabáku, tabákového kouře a metabolitů z nich vzniklých

(oxid uhelnatý, thiokyanát, karboxyhemoglobin) je hrubě orientační, protože se jedná o látky,

u nichž dochází k expozici i v běžném prostředí. [21, 22, 44]

Kotinin má oproti tomu hned několik výhod, díky nimž je hodnocen jako nejvhodnější,

vysoce specifický, senzitivní biomarker aktivního i pasivního kouření. Prvně výrazně delší

poločas rozpadu pohybující se kolem 20 hodin. V biologickém materiálu se také vyskytuje

ve vyšších koncentracích než samotný nikotin. Maximální koncentrace v plazmě (i slinách)

dosahuje po 1­2 hodinách od poslední dávky nikotinu. U kuřáků při spotřebě 4­5 cigaret

za den dosahuje vyrovnané plató hladiny. Analýzu lze provádět z libovolného biologického

materiálu: plazma, sérum, moč, sliny, vlasy, mateřské mléko, smolka, různé tkáně. V moči ho

lze prokázat několik dní dle závislosti na přijatém nikotinu, rychlosti metabolismu či

senzitivitě analytické metody. Nejkratší doba pro detekci je 36 hodin od posledního kouření,

ale testování pro ověření abstinence se doporučuje provádět až po 7 dnech od poslední dávky.

Navíc koncentrace ve vzorku není ovlivněna kontaminací z vnějšího prostředí, protože jeho

valná většina vzniká výhradně metabolickou přeměnou v játrech. Do jeho exkrece také méně

zasahuje pH moči v porovnání s nikotinem, který se při zásaditém pH reabsorbuje zpět

do organismu. [22, 37, 41]

33

4. Biochemická analýza kotininu

4.1 Farmakokinetika

Pro uskutečnění analýzy a dosažení správného validního výsledku je potřeba důkladně znát

farmakokinetiku stanovované látky. Farmakokinetika matematicky popisuje, jak tělo nakládá

s cizorodou látkou, tedy její absorpci, distribuci, metabolismus a exkreci. Tento termín

zahrnuje poločas rozpadu, distribuční objem a clearance. Biologický poločas (t1/2)

představuje čas, za který tělo eliminuje 50 % látky z těla. Distribuční objem (Vd) je většinou

uváděn v litrech nebo litrech na kilogram tělesné hmotnosti a jeho hodnotu lze určit poměrem

množství léčiva v organismu k jeho koncentraci v krevní plazmě. Clearence popisuje rychlost

eliminace xenobiotika z krve za jednotku času. Celková clearence (CL) je součtem hodnot

clearence ve všech eliminačních orgánech (ledviny, játra, střevo, plíce).[45] Rychlost

vylučování xenobiotika z těla (E), je množství vyloučené látky za jednotku času, počítáme

pomocí clearence a koncentrace látky v krvi (CB) následujícím vzorcem: 𝑬 = 𝑪𝑳 × 𝑪𝑩.

Ustálený stav se týká situace, kdy je koncentrace cizorodé látky v krvi (odrážející množství

xenobiotika v těle) stabilní, protože míra absorpce nebo příjem látky (D) se rovná rychlosti,

při které je látka eliminována, což můžeme vyjádřit vztahem: 𝑫 = 𝑬 = 𝑪𝑳 × 𝑪𝑩𝑺𝑺, kde 𝐂𝐁𝐒𝐒

představuje koncentraci látky v krvi v rovnovážném stavu. [37]

Studium farmakokinetiky nikotinu a kotininu většinou probíhá formou experimentu

na dospělých lidech, za příjmu známého množství nikotinu. Předpokládá se, že inhalovaný

nikotin se po vstupu do krevního řečiště chová stejně jako nikotin podávaný intravenózně (má

stejný poločas eliminace). U inhalovaného nikotinu se však nedá spolehlivě odhadnout přesná

absorbovaná dávka. Hladina kotininu u kuřáků (4 ­ 5 cigaret denně) během dne dosahuje

ustáleného stavu. Kvůli relativní stabilitě hladiny kotininu v krvi v průběhu času je

upřednostňovaným měřítkem pro odhad expozice nikotinu z tabáku. Farmakokinetika

nikotinu a kotininu je obdobná u kuřáků i nekuřáků, což vyplývá ze studie zaznamenané

v tabulce č. 3, která pracovala s intravenozně podávaným deuteriově značeným L-nikotinem a

L-kotininem. [37] Existují však studie, které uvádějí, že eliminační poločas je u kuřáků kratší

než u nekuřáků (stejně tak je tomu u některých léčiv). [46] Nutno podotknout, že experimenty

dokazující delší eliminační dobu nikotinu a kotininu u kuřáků obsahují metodologické

nepřesnosti, jelikož autoři pracují s racemickou směsí malého množství nikotinu, ačkoli

34

při kouření do těla vstupuje pouze L-nikotin a nedostatečné množství ohrožuje analytickou

citlivost. [37]

Nikotin Kotinin

Kuřáci

(n = 11)

Nekuřáci

(n = 11)

Kuřáci

(n = 20)

Nekuřáci

(n = 6)

𝑥* SD 𝑥* SD 𝑥* SD 𝑥* SD

t1/2

(min) 157 78 122 45 1047 304 1012 259

Vd (litr) 196 74 185 63 54 16 58 12

CL

(ml/min) 1085 282 1319 567 40,6 11,1 45,1 15,7

*Průměrná hodnota zjištěná po intravenozní infuzi deuteriově značeného L-nikotinu (d2) a deuteriově značeného

L-kotininu (d4)

n = počet testovaných osob

SD = směrodatná odchylka

𝑥 = průměrná hodnota

Tabulka č. 3: Farmakokinetika nikotinu a kotininu u člověka [37]

Existují určité individuální rozdíly v kvantitativním vztahu mezi hladinami kotininu (COT)

a příjmem nikotinu (NIC). Má to hned několik příčin. Různí lidé transformují odlišné

procento nikotinu na kotinin (obvyklý rozsah 55 ­ 92 %). Dále také rozdílně metabolizují

kotinin (obvyklý rozsah clearence kotininu 19 ­ 75 ml/min). [47] Matematicky lze vyjádřit

vztah mezi nikotinem a kotininem následujícím vzorcem (založený na expozici v ustáleném

stavu):

𝑷ří𝒋𝒆𝒎 𝑵𝑰𝑪 = (𝑪𝑳𝑪𝑶𝑻

% 𝒃𝒊𝒐𝒕𝒓𝒂𝒏𝒔𝒇𝒐𝒓𝒎𝒂𝒄𝒆 𝑵𝑰𝑪 𝒏𝒂 𝑪𝑶𝑻) × 𝑪𝑩𝑺𝑺

. [37]

K přepočtu hladiny kotininu v krvi na odhadnutý denní příjem nikotinu, využíváme

konverzní faktor (K). Ten sahá u dospělých kuřáků průměrně na hodnotu 0,08 (mg

/24h/ng/ml), (rozsah 0,05 ­ 0,10 mg; VK 21,9 %). Takže hladina kotininu 300 ng/ml (typická

pro kuřáky) odpovídá dennímu příjmu 24 mg nikotinu. Stejný převodní faktor můžeme použít

pro výpočet i u nekuřáků, předpokládáme-li, že mají stejnou farmakokinetiku nikotinu a

kotininu jako kuřáci. Jelikož je konverzní faktor variabilní (rozdílnost biotransformace

diskutována výše), hladina kotininu pouze přibližuje příjem nikotinu. Stupeň variability (VK

21,9 %) není ve srovnání s variabilitou clearance většiny ostatních xenobiotik zvlášť výrazný.

Proto se dá očekávat, že i při tomto nevyhnutelném stupni nepřesnosti budou hladiny kotininu

u velké skupiny subjektů odrážet průměrnou expozici nikotinu. [37]

35

Hladina kotininu v rovnovážném stavu v krvi může být odhadnuta z koncentrace v moči

pomocí známých farmakokinetických hodnot renální clearence (𝐶𝐿𝑅𝐶𝑂𝑇), dle vzorce:

𝐶𝐿𝑅𝐶𝑂𝑇=

𝐶𝑈𝐶𝑂𝑇 × 𝑉

𝐶𝐵𝑆𝑆

,

kde 𝐶𝑈𝐶𝑂𝑇 reprezentuje hladinu kotininu v moči, V představuje objem vyloučené moči a 𝐶𝐵𝑆𝑆

koncentraci kotininu v krvi v rovnovážném stavu. [37]

4.2 Metody biochemické analýzy kotininu

Kotinin lze prokázat a kvantifikovat celou řadou metod. V laboratorní praxi se využívají

především kolorimetrické, chromatografické nebo imunochemické metody.

4.2.1 Kolometrie

Kolometrie patří mezi optické metody založené na porovnávání intenzity zbarvení roztoku

o neznámé koncentraci s roztokem téže látky o známé koncentraci. Tyto metody jsou rychlé,

jednoduché, levné, ale málo specifické, jelikož intenzitu zbarvení můžou ovlivňovat další

faktory (léky, vlastní zabarvení moče). Naměřené hodnoty kotininu bývají vyšší

než u ostatních metod právě díky interferencím. [22]

4.2.2 Imunoanalýza

Imunochemické metody fungují na principu specifické reakce mezi antigenem a

protilátkou za vzniku imunokomplexu. Dříve se využívaly diagnostické polyklonální

protilátky proti kotininu. Tyto protilátky však nejsou dostatečně specifické, jelikož reagují i

s dalšími metabolity nikotinu. Nahradily je kvalitní monoklonální protilátky, jejichž

nevýhodou je však vysoká cena. Moderní imunoanalýzy jsou citlivé, přesné, poměrně

jednoduché (jen RIA metody jsou náročné na vybavení a provoz), lze je provádět hromadně

v sériích o velkém počtu vzorků, ale i jednoduše individuálně ze slin přímo v ambulanci. Jsou

nenáročné na množství vzorku a manipulaci s biologickým materiálem. Mezi nejběžněji

využívané metody patří ELISA či RIA. [22, 48]

4.2.3 Chromatografie

Chromatografie patří mezi separační a současně i analytické metody. Funguje na principu

rozdílné distribuce mezi dvě nemísitelné fáze: mobilní a stacionární. Dle způsobu provedení ji

dělíme na kolonovou (sloupcovou), plošnou (planární) a tenkovrstevnou (TLC). Podle povahy

36

užité mobilní fáze na plynovou a kapalinovou. Principy separace se různí, existuje

chromatografie rozdělovací, adsorpční, gelová, iontoměničová a afinitní. [49]

4.2.3.1 Plynová chromatografie

Plynový chromatograf (GC) využívá jako unášející mobilní fázi plyn a i sám vzorek musí

být před aplikací převeden do plynného stavu. Stacionární fází může být pevná látka nebo

kapalina. Touto chromatografií lze dělit všechny látky, které je možné po zahřátí kolony (až

na 400°C) převést bez rozkladu do plynného stavu. [49–51]

Vzorky se nastřikují pomocí přesného autosampleru přes silikonové septum

do zplyňovače. To je vyhřívaná trubička, ve které dochází k okamžitému zplynění vzorku.

Páry vzorku jsou poté unášeny nosným plynem, zpravidla dusík nebo argon, do vyhřívané

kolony. Během průchodu kolonou dochází k dělení přítomných látek na principu adsorpční

nebo rozdělovací chromatografie. V poslední fázi procházejí jednotlivé složky separovaného

vzorku detektorem, který zachycený signál převádí do grafického výstupu.[49–51]

4.2.3.2 Kapalinová chromatografie (LC)

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) v klinických laboratořích představuje

nejvyužívanější chromatografickou techniku vůbec. Mezi její hlavní výhody patří

aplikovatelnost na široký rozsah látek, rychlost, citlivost a vysoká přesnost. Principy separace

jsou různé, dle povahy fází a náplní kolony. [49]

Kapalinový chromatograf se skládá z několika základních součástí, vysokotlaké pumpy,

injektoru, dělící kolony, detektoru a vyhodnocovacího zařízení. Peristaltická pumpa díky

vysokému tlaku zajišťuje plynulý konstantní průtok mobilní fáze i přes malé částice náplně

kolony. Injektor se používá pro nástřik vzorku. Mechanickým pootočením jej lze odpojovat

od dělící kolony. Ta může být různé délky, průměru a náplně. Na konci se separované složky

vzorku setkávají s detektorem. Detektory pracují na různých principech. UV/VIS detektor

měří absorbanci záření, fluorescenční se využívá pro přirozeně fluoreskující látky,

elektrochemický je vhodný pro látky, které vykazují elektrickou aktivitu. V neposlední řadě

se využívají hmotnostní detektory. [49]

37

4.2.4 Hmotnostní detekce (MS)

Trh nabízí různé druhy detektorů lišící se principy, přesností, citlivostí, rychlostí a cenou.

Hmotnostní spektrometrie (MS) je jednou z nejpřesnějších analytických metod. Pomocí

hmotnostního spektrometru lze zjistit molekulovou hmotnost jednotlivých složek vzorku,

na základě čehož je možné provést jejich identifikaci. Principem je ionizace chemických

sloučenin ve vysokém vakuu tak, že dostaneme molekuly se stejným nábojem. Tento proces

se uskutečňuje například pomocí vysokého elektrického potenciálu, jenž způsobí náhlé

odpaření a ionizaci vzorku (metoda ESI – electrospray ionization). Ionty poté procházejí

elektrickým polem, kde se urychlují, a kolmo působícím magnetickým polem, ve kterém

dochází k jejich vychýlení na základě molekulové hmotnosti. Vychýlení a množství iontů

zaznamenává detektor, z jehož výstupu dostaneme kvalitativní i kvantitativní rozbor vzorku

na základě vypočítaného poměru hmotnosti (m) a náboje příslušných iontů (z) ­ m/zi.

Kombinace GC-MS či HPLC-MS představuje v současné době špičku analytické chemie. [49,

51]

38

5. Cíle práce

• Ucelený přehled o problematice užívání tabákových výrobků, nikotinu a jeho

metabolismu.

• Zavedení metody měření kotininu pomocí LC-MS.

• Porovnání měření kotininu na modulu c 502 automatického analyzátoru cobas® 8000

a pomocí hmotnostní spektrometrie.

• Stanovení referenčních hodnot pro kotinin vztažených na množství užívaných

tabákových výrobků.

39

6. Metodika a materiál

6.1 Sběr materiálu

Sběr vzorků probíhal v období od 15. 2. 2019 do 1. 4. 2019. Jako testovaný materiál

posloužily vzorky ranní moči od 97 subjektů, z nichž 46 uvedlo, že pravidelně aktivně kouří,

4 se považují za příležitostní kuřáky, 46 za nekuřáky a 1 přijímá nikotin formou žvýkacího

tabáku. Sběr probíhal po domluvě na urologické odběrové ambulanci FN Brno Bohunice,

na plicním oddělení Nemocnice Kyjov a z řad dobrovolníků z rodiny, přátel, kolegů a

známých. Účast na projektu byla zcela dobrovolná a údaje anonymizovány, což bylo

subjektům předem sděleno a svůj souhlas ještě písemně stvrdili (viz příloha č. 1). Mimo

podepsání informovaného souhlasu a poskytnutí vzorku bylo požadováno vyplnění krátkého

dotazníku, v němž respondenti uvedli svůj věk, pohlaví, výšku, váhu, typ užívaného

tabákového výrobku, jeho značku, týdenní spotřebu, dobu po jakou je užíván a také přijdou-li

do styku s pasivním kouřením (viz příloha č. 2).

Soubor byl tvořen 50 ženami a 48 muži věkového průměru 48,33 let a mediánu 46.

Nejmladší účastník dosáhl 21 let a nejstarší 90 let.

První ranní moč byla odebrána do plastové zkumavky a transportována do laboratoře, kde

byla uchována v chladu a temnu a nejpozději do 24 hodin od odběru zamražena při -20°C.

Rozmražení probíhalo za laboratorní teploty. Před samotným testováním byly vzorky

centrifugovány 5 minut při 2500 RCF. Pokud bylo vzorku malé množství, byl zředěn 1:1

s deionizovanou vodou.

Přístroje:

­ centrifuga MPW 351 (MPW Med Instruments, Varšava, Polsko)

6.2 Měření pomocí HPLC-MS

6.2.1 Chemikálie, přístroje a pomůcky

Chemikálie:

­ Standard kotininu (Sigma Aldrich, St. Louis, USA, čistoty ≥ 98,5 %).

­ Kyselina mravenčí (Sigma Aldrich, St. Louis, USA, čistoty ≥ 98 %)

­ Mravenčan amonný (Honeywell Fluka, Seelze, Germany, čistota p.a.)

­ Amoniak 28% (VWR Chemicals, Radnor, USA, množství nečistot 5 ppm)

­ Metanol (VWR Chemicals, Radnor, USA, množství nečistot 3 ppm)

40

­ Dichlormetan (Merck, Darmstadt, Germany, čistota p.a.)

­ Vorikonazol (Honeywell, Seelze, Germany, čistota 99,9 %)

­ DRI Cotinine High Control 736 ng/ml (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Low Control 371 ng/ml (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Calibrator Kit (0; 100; 250; 500; 1000; 2000 ng/ml) (B•R•A•H•M•S,

Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Assay Kit (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

Přístroje:

­ TSQ Quantum Access MAX (Thermo Fisher Scientific, Walthman, USA)

­ vortex Biovortex V1 (Biosan, Riga, Litva)

­ třepačka Vibramax 110 (Heidolph, Schwabach, Germany)

­ odpařovací pec Vacutherm (Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Germany)

­ centrifuga MPW 351 (MPW Med Instruments, Varšava, Polsko)

­ pipetory (Eppendorf, Hamburg, Germany)

­ kolona C18 (4,6×150 mm; 5 μm) (Chromsystems, Gräfelfing, Germany).

Software

­ Thermo Xcalibur verze 2.1.0.1139 (Thermo Fisher Scientific, Walthman, USA)

­ MedCalc verze 9.3.2.0 (MedCalc Software, Ostend, Belgium)

­ Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, USA)

Pomůcky:

­ skleněné zkumavky

­ vialky

­ inserty

­ stojánek na zkumavky

Pro přípravu kalibrátorů a kontrol byl použit analytický standard kotininu (Sigma Aldrich, St.

Louis, USA, čistoty ≥ 98,5 %).

Zásobní standard kotinin 100 mg/l (100 000 ng/ml): 5 mg kotininu rozpuštěného v metanolu

v odměrné baňce 50 ml.

Kalibrátory:

Kalibrátory byly vytvořeny doplněním přídavku zásobního standardu kotininu do odměrné

baňky 25 ml močí nekuřáka dle následujícího schématu:

41

1) 2000 ng/ml → 500 μl + dolít močí do 25 ml

2) 1000 ng/ml → 250 μl + dolít močí do 25 ml

3) 500 ng/ml → 125 μl + dolít močí do 25 ml

4) 250 ng/ml → 62,5 μl + dolít močí do 25 ml

5) 100 ng/ml → 25 μl + dolít močí do 25 ml

Kontroly

­ Kontroly byly připraveny v jiný den z jiného zásobního standardu kotininu.

1) K1 kontrola s nízkou hladinou 340 μg/l

2) K2 kontrola s vysokou hladinou 3400 μg/l

Roztoky:

­ Mobilní fáze A: 1 mmol/l mravenčanu amonného v 50:50 metanolu:H2O

­ Mobilní fáze C: 10 mmol/l mravenčanu amonného v metanolu

­ Extrakční pufr: 10 mmol/l mravenčanu amonného v H2O upraveného na pH 7,77

amoniakem a kyselinou mravenčí

­ Vnitřní standard: 1 mg/l roztok vorikonazolu v metanolu

­ Extrakční činidlo: dichlormetan

6.2.2 Zpracování biologického materiálu – extrakce

I. Do skleněných zkumavek bylo napipetováno 1,5 ml kalibrátoru / kontroly / vzorku.

II. Do zkumavky bylo přidáno 20 μl vnitřního standardu.

III. Poté byl materiál promíchán na vortexu.

IV. Bylo přidáno 1,5 ml extrakčního pufru.

V. Poté byl materiál opět promíchán na vortexu.

VI. K promíchanému materiálu bylo přidáno 1,5 ml extrakčního činidla.

VII. Materiál byl ponechán 10 minut na třepačce při 1700 otáčkách za minutu.

VIII. Proběhla centrifugace 10 minut při 4000 otáčkách.

IX. Po centrifugaci byl opatrně odpipetován 1 ml extrakčního činidla s extrahovaným

kotininem.

X. Extrakt byl sušen 10 minut za proudu dusíku při 50°C a sníženého tlaku 0,1 baru.

XI. Odparek byl resuspendován v 350 μl mobilní fáze A, napipetován do vialky s insertem

a uzavřen víčkem se septem.

42

6.2.3 Podmínky HPLC

I. Nástřik na kolonu 25 μl kalibrátoru / kontroly / vzorku.

- průtok: 400 μl/min

­ 0 – 4 min mobilní fáze A

­ 4 – 5 min graduální přechod mobilní fáze A:C na poměr 5:95

­ 5 – 11 min mobilní fáze A:C mobilní fáze 5:95

­ 11 – 13 min mobilní fáze A

6.2.4 Podmínky MS

K měření bylo využito přístroje TSQ Quantum Access MAX (Thermo Fisher Scientific,

Walthman, USA) s hmotnostní detekcí se systémem ESI. Separace byla provedena na koloně

s reverzní fází C18 (4,6×150 mm; 5 μm).

Parametry přístroje:

­ typ detekce SRM (single reactiont monitoring) total ion count (TIC)

­ napětí ESI: 4500 V

­ teplota vaporizéru: 350°C

­ sheath gas pressure: 10 psi

­ ion sweep gas pressure: 0 psi

­ aux gas pressure: 5 psi

­ teplota kapiláry: 270°C

­ kladná polarita iontů

Měření kotininu:

­ rodičovský ion: 177,128 m/z

­ produktový ion: 80,199 – 80,201 m/z

­ kolizní energie: 22 V

­ tube lens: 92 V

­ tlak kolizního plynu: 1,5 mTorr

­ detekce: 3 ­ 6 minuta

­ retenční čas: 4,5 min

­ skimmer offset: -10°C

Měření vnitřního standardu vorikonazolu:

­ rodičovský ion: 350,000 m/z

­ produktový ion: 127,099 – 127,101 m/z

­ kolizní energie: 30 V

43

­ tube lens: 109 V

­ tlak kolizního plynu: 1,85 mTorr

­ detekce: 8 ­ 11 minuta

­ retenční čas: 9,4 min

­ skimmer offset: -10°C

6.2.5 Vyhodnocení

Vyhodnocení bylo provedeno pomocí softwaru Xcalibur. Typický průběh analýzy je

zobrazen na obrázku č. 7. Výpočet koncentrace kotininu byl proveden vztažením plochy pod

křivkou kotininu k ploše pod křivkou interního standardu.

Obrázek č. 7: Typický záznam pozitivního záchytu kotininu – horní graf kotinin, dolní

vorikonazol

6.3 Měření na automatickém analyzátoru cobas 8000, modul c

502

6.3.1 Popis přístroje

Japonský analytický systém výrobce Hitachi do České republiky dodávaný firmou Roche

je určen pro laboratoře s požadavkem na zpracování velkého množství vzorků. Skládá

z několika modulů, díky nimž lze uskutečnit fotometrické, imunoturbidimetrické,

elektrochemiluminiscenční a elektrochemické měření. Umožňuje tak kvantitativní stanovení

široké škály látek v séru, plazmě, moči a jiných tělních tekutinách.

Primárním modulem je tzv. Core unit. Hlavním úkolem této jednotky je zapínání a

vypínání přístroje cobas 8000, řízení vstupu a výstupu vzorkových stojánků, načítání barkódů,

vstup STAT vzorků, transport vzorků do dalších modulů dle měřeného analytu a metody

stanovení.

44

c 502 modul má kapacitu 600 vzorků za hodinu. Může pracovat až s 60 různými

reagenciemi umístěnými v kazetách, které si přístroj sám propichuje, což zajišťuje jejich

dlouhodobou stabilitu. Reagenční kazety jsou opatřeny štítkem s barkódem, v němž jsou

uloženy informace o reagencii a příslušném testu a přístroj tedy provádí automatickou

identifikaci. Reagenční kruh obsahuje 160 kyvet vytemperovaných ve vodní lázni na 37°C.

Pipetovací systém pracuje s objemem vzorku 1,5 – 35 μl a 5 – 180 μl reagencie. Reakční čas

se pohybuje mezi 3 – 10 minutami. Modul je opatřen detekcí hladiny, detekcí sraženiny,

nárazovým detektorem, mycí a sušící stanicí. Dále je vybaven bezkontaktním ultrazvukovým

mícháním. Jeho měřící fotometrický systém složený z halogenové lampy (12 V / 50 W) a

fotometru využívajícího detektor diodového pole umožňuje monochromatické a

bichromatické měření až ve 12 vlnových délkách. Měřící rozsah fotometru je 0 – 3,3

absorbance. Linearita je zachována do 2,5 absorbance. [52]

Další parametry přístroje:

­ 200 fotometrických aplikací

­ 3 sérové indexy

­ Rozměry c 502: 1500 × 1300 × 1140 mm 535 kg

­ Průtok vody: 30 l/hod.

­ Kvalita vody: do 1 uS/cm

­ Spotřeba proudu:

o Core: 1 kVA

o c 502: 2,5 kVA

­ Reakční objem: 100 – 250 μl

­ Detekce sraženiny: tlakový senzor

­ Detekce hladiny: měření kapacitance

­ Analytické metody:

o End Point – 1 Point, 2 Point End

o Kinetické – 2 Point Rate, Rate A, Rate B

­ Vlnové délky: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 nm

­ Čas pipetování reagencií: 3 možné časy (R1: 3,6 s; R2: 113,4 s; R3: 307,8 s)

­ Kalibrace:

o Lineární dvoubodová

o Nelineární RCM

o Nelineární RCM2T1

45

o Nelineární RCM2T2

o Nelineární Spline

o Line Graph

6.3.2 Chemikálie, přístroje a pomůcky

Chemikálie:

­ Standard kotininu (Sigma Aldrich, St. Louis, USA, čistoty ≥ 98,5 %).

­ DRI Cotinine High Control 736 ng/ml (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Low Control 371 ng/ml (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Calibrator Kit (0; 100; 250; 500; 1000; 2000 ng/ml) (B•R•A•H•M•S,

Hennigsdorf, Germany)

­ DRI Cotinine Assay Kit (B•R•A•H•M•S, Hennigsdorf, Germany)

Pomocné roztoky – c 502 modul:

­ NaCl 0,9 %

­ NaOH-D

­ Ecotergent

­ SMS

­ Sample Cleaner

­ SI2

­ Deionizovaná voda (< 1 uS)

Přístroje:

­ cobas 8000 modul c 502 (Hitachi, Tokio, Japonsko)

­ centrifuga MPW 351 (MPW Med Instruments, Varšava, Polsko)

­ pipetory (Eppendorf, Hamburg, Germany)

Software

­ Thermo Xcalibur verze 2.1.0.1139 (Thermo Fisher Scientific, Walthman, USA)

­ MedCalc verze 9.3.2.0 (MedCalc Software, Ostend, Belgium)

­ Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, USA)

6.3.3 Podmínky pro měření na cobas 8000

Měření kotininu:

­ Chemická analýza

­ Test: KOTIN

­ Typ materiálu: Urine (moč)

46

­ Rate A – 2 Point (41, 47)

­ Čas měření 10 min

­ Vlnová délka: primární 340 nm, sekundární 415 nm

­ Objem vzorku:

o Normální 13,9 μl

o Snížený (ředění) 13,9 μl + 13,9 μl vody

o Zvýšený 27,8 μl

­ Reagent Pack ID: 777773

­ Reagent Pack Configuration:

o R1: M 165 testů 19,5 ml objem

o R2: S 165 testů 0 ml objem

o R3: S 165 testů 18 ml objem

­ Absorbanční limit: 32000 (vzrůstající)

­ Cell Detergent: Detergen1

­ Stirring level: 2

­ Stirring 46etting:

o Up: Stirring

o Low (M1): Stirring

o M2: Stirring

o M3: Stirring

­ Kalibrace:

o Limit Value:

▪ SD Limit: 999

▪ Duplicate Limit: 99 %; 32000 Absorbance

▪ Sensitive Limit: -99999 – 99999

▪ S1 Abs. Limit: -32000 – 32000

o Kalibrační metoda:

▪ Typ: RCM

▪ Point: 6

▪ Span: 6

▪ Weight: 0

▪ RCM Weight: 0,000

▪ Update type: Difference

▪ Update point: 1; 5

47

­ Rozsah (Range):

o Application Code: 316

o Jednotka: ng/ml

o Decimal Places: 0

o Automatic Rerun

o Control Interval: 0

o Automatic QC On Board Stability Time: 1

o Technical Limit: -99999 – 99999

o Repeat Limit: -99999 – 99999

­ Standardy:

1 2 3 4 5 6

Kód kalibrátoru 00925 00926 00927 00928 00929 00930

Koncentrace 0 100 250 500 1000 2000

Objem vzorku (μl) 13,9 13,9 13,9 13,9 13,9 13,9

Zředěný objem vzorku 0 0 0 0 0 0

Objem diluentu 0 0 0 0 0 0

Tabulka č.4: Nastavení kalibrace na analyzátoru cobas 8000

6.3.4 Postup měření

I. Do softwaru cobas 8000 byly zadány požadavky na provedení vyšetření kotininu

v moči na konkrétní pozici stojánku pro každý vzorek.

II. Kalibrační roztoky / kontroly / supernatanty centrifugovaných vzorků byly

nepipetovány do čistých plastových zkumavek a vloženy do pětimístného stojánku.

Pokud bylo vzorku malé množství, byl zředěn 1:1 deionizovanou vodou.

III. Následně byla spuštěna analýza, která probíhá u tohoto přístroje autonomně dle

zadaného programu, viz kapitola 6.3.3.

6.3.5 Vyhodnocení

Vyhodnocení bylo provedeno pomocí softwaru cobas 8000. Typický průběh analýzy je

zobrazen na obrázku č. 8. Výpočet koncentrace kotininu byl proveden na základě rozdílu 2

bodů dle šestibodové kalibrační křivky.

48

Obrázek č. 8: Typický záznam pozitivního záchytu kotininu.

Sig

nál

det

ekto

ru

Cyklus analyzátoru

49

7. Výsledky a diskuze

7.1 Výsledky z LC-MS

Základní analytické vlastnosti metody stanovení kotininu pomocí LC-MS byly určeny

měřením připravených standardů. Variační koeficient opakovatelnosti (n=10 pro každou

hladinu) byl 8,66 % (250 μg/l) a 3,26 % (2500 μg/l). Hodnota bias byla rovna -4 % (340 μg/l)

a -17 % (3400 μg/l).

Pomocí LC-MS bylo nalezeno 46 pozitivních vzorků, nejnižší hodnota 82 μg/l, nejvyšší

hodnota 2652 μg/l, aritmetický průměr 1062 μg/l, medián 955 μg/l.

7.2 Výsledky z automatického analyzátoru cobas 8000

Základní analytické vlastnosti metody stanovení kotininu pomocí cobas 8000 byly určeny

měřením připravených standardů. Variační koeficient opakovatelnosti (n=10 pro každou

hladinu) byl 6,42 % (253 μg/l) a 2,37 % (2413 μg/l). Hodnota bias byla rovna 9,3 % (360

μg/l) a 1,1 % (796 μg/l).

Pomocí analyzátoru cobas 8000 bylo nalezeno 46 pozitivních vzorků, nejnižší hodnota

63 μg/l, nejvyšší 2758 μg/l, aritmetický průměr 1039 μg/l, medián 996 μg/l.

7.3 Statistické porovnání metod

Statistické porovnání metod bylo provedeno na souboru 46 pozitivních vzorků (>50 μg/l

kotininu). Rovnice regrese (obr. č. 10) je 1,0381 x – 48,32. 95% interval směrnice zahrnuje 1

a 95% interval úseku zahrnuje 0. Cusumův test neprokázal odchylku od linearity na hladině P

> 0,1. Průměrný rozdíl metod je 22,6 μg/l. Z Bland-Altmanova grafu (obr. č. 9) je patrné, že

rozdíly jsou závislé na koncentraci – se vzrůstající koncentrací narůstají i rozdíly mezi

výsledky metod. Vážená kappa statistika kvadratická vyšla 0,958, vážená kappa lineární

0,898 a standardní kappa 0,787 (tabulka č. 6). Způsob provedení kappa statistiky je uveden

v tabulce č. 5. ROC křivka slouží k zobrazení vztahu mezi specifitou a senzitivitou obou

metod. Modrá křivka ukazuje plochu pod křivkou (AUC = 0,957) pro cobas 8000 a červená

křivka plochu pod křivkou (AUC = 0,951) pro LC-MS. Senzitivita a specifita, hodnocena

na základě dotazníků a výsledků měření při cut-off hodnotě 50 μg/l, byla 91,5 % (n=47).

50

Falešně negativní vzorky byly dle obou metod totožné. Specifita pro Cobas 8000 byla 95,6 %

a pro LC-MS 97,8 % (n=45) a lišily se u jednoho vzorku.

Obrázek č. 9: Bland-Altmanův graf porovnávající hodnoty naměřené na LC-MS a cobas 8000

Obrázek č. 10: Porovnání metod LC-MS a cobas 8000 Passing-Bablock lineární regrese

51

Obrázek č. 11: Porovnání metod LC-MS a cobas 8000 Passing Bablock Residuals

Kategorie* cobas 8000 0 1 2 3 4

LC-MS Počet vzorků v kategorii 52 14 10 13 10

0 53 52 1 0 0 0

1 11 0 11 0 0 0

2 13 0 2 8 2 1

3 11 0 0 2 7 2

4 11 0 0 0 4 7

* 0 …… 0 – 50 μg/l

1 …… 50 – 500 μg/l

2 …… 500 – 1000 μg/l

3 …… 1000 – 1500 μg/l

4 …… > 1500 μg/l

Tabulka č. 5: Kappa statistika výsledků

Vážená kappa

kvadratická 0,958

Vážená kappa

lineární 0,898

Standardní

kappa 0,787

St. chyba

(Kw = 0) 0,1

St. chyba

(Kw = 0) 0,077 St. chyba 0,053

St. chyba

(Kw > 0) 0,012

St. chyba

(Kw > 0) 0,024 95 % interval 0,684 – 0,890

Tabulka č. 6: Výsledky kappa statistiky

52

Obrázek č. 12: ROC křivka měření kotininu pomocí spektrofotometrické metody (modrá

křivka; AUC = 0,957) a LC-MS (červená křivka; AUC = 0,951)

7.4 Naměřené hodnoty kotininu vztažené na příjem

tabákových výrobků

7.4.1 Hodnocení dotazníku

Soubor dotazovaných tvořilo 50 žen a 47 mužů věkového průměru 48,33 let a mediánu 46

let. Nejmladší účastník dovršil 21 let a nejstarší 90. Ze vzorku respondentů dále 46 uvedlo, že

jsou nekuřáci, 46 kuřáci, 4 příležitostní kuřáci a 1 přijímá nikotin formou žvýkacího tabáku.

Z poměru kouření a jiných způsobů vpravení nikotinu do těla (50:1) jasně vyplývá, že

cigaretový kouř nadále zůstává nejběžnějším způsobem užívání této látky. Ze 4 osob, které se

označily za příležitostní kuřáky, byla pouze 1 pozitivní (63 μg/l kotininu u fotometrické

detekce, 164 μg/l u LC-MS) a zbytek negativní (0 μg/l oběma metodami). Charakteristika

všech měřených vzorků je uvedena v příloze č. 4. Další popis je zaměřen pouze na osoby,

u kterých byl pozitivní nález kotininu v moči.

Kuřaček bylo testovaných 32. Jejich věkový průměr byl 48,63 let (medián 49 let).

Průměrné BMI se rovnalo 25,25, což znamená lehkou nadváhu. 1 žena měla podváhu, 23

normální váhu, 4 nadváhu a 4 obezitu 1. nebo 2. stupně. Ženy kuřačky uvedly, že vykouří

průměrně 41 cigaret týdně, množství se však individuálně velmi lišilo.

53

Mužů kuřáků bylo mezi respondenty 19. Jejich věkový průměr byl 47,68 let (medián 45

let). Průměrné BMI se rovnalo 25,26, což znamená rovněž lehkou nadváhu stejně jako u žen.

6 mužů mělo normální váhu, 9 nadváhu a 4 obezitu 1. nebo 2. stupně. Muži kuřáci uvedli, že

vykouří průměrně 43 cigaret týdně, množství se však individuálně velmi lišilo.

7.4.2 Vztah průměrných hodnot kotininu na množství vykouřených

cigaret

Vztah naměřeného kotininu na množství vykouřených cigaret za týden uvedeném

v dotaznících je znázorněno v grafu na obrázku č. 13. Demingova rovnice regrese s počátkem

v 0 má hodnotu y = 9,9273x při R2 = 0,4726.

Obrázek č. 13: Graf závislosti průměrné hodnoty naměřeného kotininu na uvedeném množství

vykouřených cigaret za týden

7.5 Diskuze

7.5.1 Diskuze – porovnání metod

Při porovnávání metod bylo dle Demingovy regresní rovnice dospěno k závěru, že

průměrný bias je blízky 0, což ukazuje na nízkou systematickou chybu. Nicméně rozdíly

jednotlivých vzorků, obzvláště ve vyšších hodnotách, ukazují na nedostatky jedné nebo obou

metod. Nedostatky by mohly být způsobeny interferencemi každé z metod. Přístroj cobas

y = 9,9273x

R² = 0,4726

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 50 100 150 200 250 300 350

Koti

nin

(μ

g/l

)

Množství cigaret za týden (ks)

54

8000 měření uskutečňuje pomocí homogenní imunoanalýzy s využitím myších protilátek.

Problematika interferencí myších protilátek u lidí s protilátkami proti myším komponentům

byla dříve popsána. [53] Chyby spektrofotometrických metod mohou být také způsobeny

zákalem moči a přítomností jiných interferentů. Na příbalovém letáku výrobce je uvedeno, že

měření kotininu touto metodou je pouze orientační a výsledky by měly být konfirmovány

pomocí GC-MS nebo LC-MS.

Metoda LC-MS byla nově vyvinuta speciálně pro tuto práci, tudíž ještě nebyla testována

na interferující látky, kterých může být v moči velké množství, a mohly by rovněž výsledky

zkreslovat. Navíc, proces extrakce kotininu je velice obtížný a manuálně náročný, takže nelze

vyloučit ani chybu lidského faktoru či metodologické nepřesnosti. Odborná literatura

poskytuje řadu postupů pro měření kotininu metodou LC-MS, například článek „A simple,

fast, and sensitive method for the measurement of serum nicotine, cotinine, and nornicotine

by LC-MS/MS“, u kterého však probíhá analýza ze vzorků séra. [54] Vyšší přesnosti metody

by bylo jistě dosaženo např. použitím deuterovaného vnitřního standardu a extrakcí na pevné

fázi (SPE), které je využito také ve studii „Determination of nicotine, cotinine, and related

alkaloids in human urine and saliva by automated in-tube solid-phase microextraction coupled

with liquid chromatography-mass spectrometry.“[55] O možnostech různých modifikací LC-

MS metody svědčí velké množství článku zabývajících se touto tématikou, například využití

chromatografie hydrofilních interakcí v kombinaci s tandemovou MS (HILIC-MS/MS) a

podobně. [56]

Dle Cohenovy Kappa statistiky, která se používá pro hodnocení semikvantitativních metod

(kategorické hodnocení), vyšla výrazná shoda metod na rozdíl od porovnání dle Passing-

Babloka a Bland-Altmana. Z toho vyplývá, že by pro vyšetření kotininu těmito metodami

bylo vhodnější uvádět semikvantitativní hodnocení namísto kvantitativního. ROC křivky

ukazují, že obě metody dokážou spolehlivě odlišit kuřáky od nekuřáků.

K podobným závěrům dospěla studie Dixona a Dasgupty z roku 2016, kde byl srovnán

imunochemický kit stejného výrobce jako v této studii jejich LC-MS metodou. Autoři v ní

považují imunochemickou metodu za vhodnou k odlišení pozitivních od negativních vzorků,

nikoli však k dostatečně přesné kvantifikaci kotininu. [57]

55

7.5.2 Diskuze – naměřené hodnoty kotininu vztažené na příjem

tabákových výrobků

Vztah kotininu v moči na množství vykouřených cigaret vyšel velmi volně na 10 μg/l

na každou vykouřenou cigaretu týdně (viz obr. č. 13). Rozptyl hodnot kotininu v moči kuřáků

je však tak rozsáhlý (R2=0,4726), že je třeba tuto hodnotu brát s rezervou. Koncetrace

kotininu v moči je značně ovlivněna dávkou nikotinu před odběrem (nárazové kouření např.

o víkendu, v určité společnosti apod.), biologickou variabilitou jeho přeměny na kotinin skrze

cytochromu P450 2A6, stavem renálních funkcí, způsobem kouření, typem tabákového

výrobku a dalšími faktory. Tuto značnou proměnlivost dokazují i rozdílné cut-off hodnoty

v různých studiích. Pro příklad v práci „Overview of Cotinine Cutoff Values for Smoking

Status Classification“ jsou uvedeny cut-off odlišných autorů mající jiné hodnoty: 55 μg/l, 50

μg/l, 200 μg/l, 550 μg/l, 31,5 μg/l, 53 μg/l, 164 μg/l . [58] Profesor Patočka zase ve svém

článku uvádí cut-off hodnotu pro rozlišení nekuřáka od slabého kuřáka 11 μg/l. [59] Jiná

literatura uvádí cut-off už dokonce od 2,74 μg/l. [60]

Stanovení exaktnějšího vztahu množství nikotinu přijatého obvyklým způsobem

na koncentraci kotininu v moči by si vyžádalo rozsáhlejší soubor osob participujících ve

studii, přesnější informace o přijatém nikotinu, stavu organismu a preciznější analytické

metody.

56

8. Závěr

Stanovení kotininu, jako hlavního metabolitu nikotinu v moči, představuje analytickou

metodu pro odlišení kuřáku a nekuřáků. Abychom k tomuto tvrzení došli, byl proveden sběr

97 vzorků moče kuřáků i nekuřáků společně s dotazníky podávajícími základní informace

o účastnících studie, zejména tedy o počtu vykouřených cigaret. Nasbírané vzorky byly poté

podrobeny měření pomocí dvou analytických metod, homogenní imunoanalýzy se

spektrofotometrickou detekcí na přístroji cobas 8000 a LC-MS. Jelikož metoda na LC-MS

nebyla na daném pracovišti zavedena, musela být námi vyvinuta. Výsledky obou metod byly

následně porovnány mezi sebou a vyhodnoceny ve vztahu k množství užívaných tabákových

výrobků za týden. Přestože se ukázalo, že ani jedna z metod neposkytuje důvěryhodné

kvantitativní výsledky, obě se dají spolehlivě použít k odlišení kuřáků a nekuřáků. Vztah

spotřeby tabákových výrobků ke kotininu v moči je ovlivněn množstvím externích

environmentálních faktorů a biologickou variabilitou, které nebyly v rámci tohoto projektu

podchyceny a proto je zjištěný vztah vykouřených cigaret k množství kotininu pouze

orientační.

57

Přílohy

Příloha 1: Informovaný souhlas

Informace pro pacienty

Název projektu

Efektivní markery pro kontrolu abúzu nikotinu

Vážená paní / vážený pane,

rádi bychom Vás pozvali k účasti v projektu, který se zabývá sledováním hladin ukazatelů užívání

nikotinových výrobků.

Než se rozhodnete ke své účasti, je důležité, abyste porozuměl (a), proč tento projekt probíhá a co

vše zahrnuje. Věnujte, prosím, pozornost následujícím informacím. Zeptejte se, pokud je v textu

cokoliv nejasného či pokud budete požadovat více informací.

Po přečtení a případném dalším objasnění Vás požádáme o rozhodnutí, zda budete souhlasit se

svou účastí či nikoliv. Pokud se rozhodnete k účasti na projektu, vyjádříte souhlas podpisem na konci

tohoto dokumentu.

Jaký je účel tohoto projektu?

Užívání tabákových výrobků je stále běžnou součástí moderního života. Nevhodné je ovšem kouření u

pacientů s plicním či kardiovaskulárním onemocněním, jejíž terapie užívání tabákových výrobků

kontraindikuje. Cílem tohoto výzkumu je rozšíření možností detekce kouření u pacientů s takovouto

terapií nebo u pacientů zapojených do odvykací léčby a umožnit tak ošetřujícím lékařům s těmito

pacienty správně pracovat.

Proč bych se měl účastnit projektu právě já?

Pro přehled užívání tabákových výrobků potřebujeme dobrovolníky z řad kuřáků i nekuřáků. Díky

Vámi vyplněnému dotazníku budeme moci odhadnout množství spotřebovaných tabákových výrobků

dle hladiny sledovaných ukazatelů v moči.

Musím se projektu zúčastnit?

Účast v projektu je zcela dobrovolná. I pokud se rozhodnete k účasti, máte kdykoliv možnost z

projektu odstoupit bez udání důvodu. Rozhodnutí o účasti či odmítnutí účasti na tomto projektu

nikterak neovlivní Vám poskytovanou budoucí lékařskou péči.

Co pro mě účast v projektu znamená?

Společně s rutinním vyšetřením vašeho vzorku moče bude stanoven kotinin, případně jiné metabolity

nikotinu. Dále vyplníte anonymní dotazník, kde uvedete svůj věk, pohlaví, výšku, váhu, užití

tabákových výrobků (typ, značka, množství/týden), pasivní kouření (pracoviště/domácnost). Vyplněný

58

dotazník vložíte do obálky, zalepíte a předáte ošetřujícímu personálu, který jej doručí do laboratoře ke

zpracování.

Účast v projektu neznamená, že by se nějakým způsobem změnila Vaše léčba, pokud nějakou

podstupujete.

Jaký prospěch budu mít z projektu?

Žádný hmotný prospěch z účasti na tomto projektu neplyne. Výsledky budou zveřejněny v bakalářské

práci „Kotinin – efektivní marker pro kontrolu abúzu nikotinu“ na webu Masarykovy Univerzity.

Budou údaje získané v projektu utajeny?

Všechny informace, které během sledování nashromáždíme, budou drženy v přísném utajení.

Identifikace na základě osobních údajů bude schopen řešitelský tým, tzn. studentka zpracovávající

bakalářskou práci a její vedoucí. Protokoly budou zpracovávány anonymně a budou respektovány

všechny legislativní podmínky ochrany osobních údajů.

Co se stane se získanými výsledky?

Výsledky sledování budou publikovány ve formě bakalářské práce, případně v odborných časopisech,

a to anonymně, tj. žádné zprávy či publikace nebudou obsahovat jakékoliv údaje, které by mohly vést

k identifikaci Vaší osoby.

Kontakt pro další informace

V případě, že budete mít další dotazy, neváhejte kontaktovat níže uvedenou osobu.

V případě, že souhlasíte s účastí v popsaném projektu, prosíme o podepsání informovaného

souhlasu. Jedna kopie tohoto dokumentu zůstane u zpracovatelů projektu a jedno vyhotovení obdržíte

Vy.

Děkujeme, že jste si udělal (a) čas na přečtení těchto informací.

Kontaktní osoby:

Řešitel projektu

Mgr. Ondřej Wiewiorka

Tel: 532233150

Email: wiewiorka.ondrej@fnbrno.cz

Adresa: Fakultní nemocnice Brno;

Oddělení klinické biochemie

Jihlavská 20

62500 Brno

59

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Informovaný souhlas

Přečetl (a) jsem si informace pro dobrovolníky projektu. Měl (a) jsem možnost položit otázky ohledně

této studie a všechny mé dotazy byly dostatečně zodpovězeny. Obdržel (a) jsem dostatek informací

ohledně této studie. Chápu svou účast jako dobrovolnou a vím, že mám možnost kdykoliv z projektu

odstoupit bez udání důvodů. Souhlasím s účastí v tomto projektu.

Jméno účastníka: .............................................................................................….........

Podpis …………............................................................. Datum: ................

Jméno řešitele projektu: Michaela Kulhavá

Podpis …………............................................................. Datum: ................

Pracoviště:....................................................................................................................

60

Příloha 2: Dotazník

Projekt: Efektivní markery pro kontrolu abúzu nikotinu

Dotazník Vážená paní/Vážený pane, velmi děkujeme za čas, který věnujete vyplnění

tohoto dotazníku.

Věk Pohlaví Výška [cm] Váha [kg]

.......... let M Ž

Pokud užíváte tabákové výrobky, vyplňte prosím následující tabulku:

Typ tabákového

výrobku

Značka Množství za týden Jak dlouho už

užíváte tabákové

výrobky?

Cigarety

................. ................. .................

Elektronická

cigareta ................. ................. .................

Doutníky,

doutníčky, cigarilla ................. ................. .................

Žvýkací tabák

................. ................. .................

Šňupací tabák

................. ................. .................

Jiné (uveďte)

................. ................. ................. .................

Pokud tabákové výrobky neužíváte, proškrtněte prosím tabulku nad tímto textem

a podtrhněte, zda se nedostáváte do styku s tabákovým kouřem pasivním

způsobem (v domácnosti / na pracovišti / jiným způsobem ................................).

Pokud kouříte příležitostně (1 cigareta za týden nebo méně) uveďte prosím, před

kolika dny to bylo naposledy ...........

Po vyplnění dotazníku jej prosím vložte do obálky a předejte ošetřujícímu

personálu.

Velmi děkujeme za Vaši účast na tomto projektu. Za řešitelský tým,

Mgr. Ondřej Wiewiorka

61

Příloha 3: Schválení etické komise FN Brno

62

Příloha 4: Výsledky dotazníků a měření

vzo

rek

K /

N /

P

věk

pohla

ví

výšk

a (c

m)

váh

a (k

g)

typ t

abák

ovéh

o v

ýro

bku

znač

ka

množs

tví

/ tý

den

doba

uží

ván

í (r

oky

)

pas

ivní

kouře

ní

koti

nin

(μ

g/l

) -

Cobas

koti

nin

(μ

g/l

) -

LC

-MS

1 N 32 muž 183 96 - - - - N 0 0

2 N 41 žena 158 53 - - - - N 0 0

3 K 56 žena 152 56 IQOS Heets 70 38 N 488 802

4 N 40 muž 184 86 - - - - N 0 0

5 N 49 žena 160 59 - - - - N 22 0

6 N 66 žena 160 108 - - - - N 0 0

7 N 50 žena 168 60 - - - - N 0 0

8 N 68 muž 173 100 - - - - N 0 0

9 N 68 muž 184 95 - - - - N 0 0

10 K 53 muž 184 88 cig. B&H 70 30 N 1490 1840

11 N 80 muž 172 73 - - - - N 4 0

12 N 25 žena 171 69 - - - - N 62 0

13 N 78 muž 175 85 - - - - N 0 0

14 N 90 muž 164 64 - - - - N 3 0

63

15 K 43 muž 158 80 cig. B&H 140 25 A 1750 2652

16 N 70 muž 169 90 - - - - N 0 0

17 N 72 žena 172 62 - - - - N 0 0

18 N 28 žena 164 68 - - - - N 0 0

19 K 68 žena 160 82 cig. neví 56 10 A 364 505

20 N 74 muž 181 85 - - - - N 0 0

21 K 63 žena 155 52 cig. neví 70 30 N 1639 2295,6

22 K 75 žena 168 72 cig. neví 14 60 N 365 239,5

23 N 89 muž 172 80 - - - - N 12 0

24 N 78 muž 174 68 - - - - N 0 0

25 K 51 žena 170 75 cig. P&S 21 20 N 716 711

26 N 37 muž 185 88 - - - - N 22 0

27 N 68 muž 178 96 - - - - N 0 0

28 N 66 muž 185 90 - - - - N 0 0

29 K 72 muž 167 90 cig. neví 70 57 N 1185 2079

30 N 77 muž 174 64 - - - - N 0 0

31 N 76 muž 175 81 - - - - N 0 0

32 N 82 muž 169 69 - - - - N 0 0

64

33 N 75 muž 176 90 - - - - N 0 0

34 N 75 muž 183 95 - - - - N 0 0

35 N 68 muž 169 99 - - - - N 0 0

36 N 58 muž 189 110 - - - - N 0 0

37 N 73 muž 180 87 - - - - N 0 0

38 K 27 muž 178 80 cig. Winston

Heets 160 5 N 443 386

40 K 71 muž 86 92 cig. Chest. 82 50 N 916 931,3

41 N 26 žena 158 62 - - - - N 0 0

42 N 43 žena 170 62 - - - - A 1565 634,3

43 N 21 muž 185 71 - - - - N 10 0

44 P 23 muž 175 75 cig. různě - - N 0 0

45 P 21 žena 180 70 cig. různě - - N 0 0

46 K 27 žena 168 80 cig. Chest. 105 10 N 22 0

47 K 30 muž 185 85 cig. neví 53 12 N 315 360

48 K 60 muž 180 80 cig. neví 105 10 N 1247 1462,4

49 N 21 žena 170 60 - - - - N 0 0

50 P 27 muž 206 118 vodní

dým. různě - - N 0 0

51 K 51 žena 170 70 cig. Camel 105 5 N 1293 1000,1

65

52 K 40 muž 180 90 cig. Marl. 120 20 N 1869 1617

53 K 53 žena 165 105 cig. B&H 30 20 N 0 0

54 N 28 muž 175 70 - - - - A 0 0

55 K 22 žena 168 62 cig. neví 18 2 N 125 168,7

56 N 22 žena 159 62 - - - - A 0 0

57 N 24 žena 155 60 - - - - N 0 0

58 N 23 žena 163 59 - - - - N 0 0

59 K 44 žena 170 62 cig. L&M 78 27 N 744 729

60 N 21 žena 175 58 - - - - N 0 0

61 N 24 žena 164 60 - - - - A 0 0

62 N 26 žena 168 65 - - - - A 0 0

63 N 26 muž 192 84 - - - - A 2 0

64 K 39 žena 177 66 cig. Vic. 88 16 N 2192 1181,9

65 K 21 žena 173 59 cig. Vic. 20 6 N 410 372,5

66 K 45 žena 168 69 cig. P.M. 35 3 N 97 127

67 K 46 žena 185 85 cig. Vic. 35 20 N 224 353

68 K 50 žena 168 58 cig. David. 120 30 N 919 940,5

69 K 54 žena 162 80 cig. Bacco 80 39 N 846 1242

66

70 K 43 žena 170 65 cig. Camel 30 10 N 36 0

71 P 29 žena 177 74 cig. různě 2 11 A 63 164

72 K 61 žena 173 70 cig. Vic. 20 35 N 1161 1911,2

73 K 54 žena 168 84 cig. L&M 4 5 N 352 406,9

77 K 70 muž 175 70 cig. Winston 100 5 N 2201 1460,5

78 K 70 žena 165 65 cig. P&S 10 50 N 0 0

79 K 71 žena 160 54 cig. Vic. 50 40 N 1010 897,2

80 K 67 žena 158 53 cig. Chest. 130 35 N 1278 1028,3

81 K 72 muž 170 83 cig. Chest. 140 40 N 1112 1469

82 K 22 žena 167 60 cig. L&M 20 7 N 154 210,5

83 K 40 žena 165 58 cig. Camel

L&M 70 10 N 947 697,9

84 K 67 žena 156 60 cig. P&S 70 50 N 513 896,6

85 N 22 žena 176 66 - - - - A 2 0

86 N 21 žena 169 54 - - - - A 0 0

87 K 62 žena 165 62 cig. Winston 50 20 N 805 820

88 K 36 muž 190 75 cig. Chest. 105 17 N 1438 1106,1

89 K 29 muž 183 102 cig. Camel 300 15 N 2349 2133

90 K 29 muž 185 89 cig. Camel 210 15 N 767 1020,5

67

91 K 25 muž 176 70 cig L&M 140 7 N 1372 1702,2

92 K 39 muž 190 115 cig. L&M 200 26 N 1427 1314

93 K 39 žena 174 108 cig. HB 60 22 N 1681 1886

94 K 28 žena 171 54 cig. P&S 98 10 N 2158 1586

95 K 50 žena 172 65 cig. LD 50 30 N 983 969

96 K 52 muž 182 83 cig. Vic. 50 37 N 1043 1354

97 N 25 muž 161 56 - - - - N 0 0

98 N 46 muž 178 85 - - - - N 0 0

99 K 37 žena 170 63 cig. LD 105 20 N 301 588,6

100 Ž 22 muž 184 92 žvýk.

tabák Siberia 26 1,3 N 2758 2514,6

K – kuřák

N – nekuřák

Ž – žvýkací tabák

A – ano

N – ne

cig. – cigarety

vodní dým. – vodní dýmka

žvýk. tabák . – žvýkací tabák

B&H – Benson&Hedges

Chest. – Chesterfield

P.M. – Philip Moris

Marl. – Marlboro

Vic. – Viceroy

David. – Davidoff

68

Zdroje

[1] ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ. WHO report on the global tobacco

epidemic, 2017: monitoring tobacco use and prevention policies. 2017. ISBN 978-92-

4-151282-4.

[2] SOVINOVÁ, Hana a Ladislav CSÉMY. Užívání tabáku v České republice 2017.

nedatováno, 30.

[3] KUBÁNEK, Vladimír. Tabák a tabákové výrobky. Brno: Tribun EU, 2009. ISBN 978-

80-263-0158-5.

[4] STOLLÁROVÁ, Viera a František MERCEL. Systematická botanika. Nitra: Fakulta

agrobiológie a potravinových zdrojov SPU v NR, 2009. ISBN 978-80-552-0286-0.

[5] Tabák selský - Nicotiana rustica. AtlasRostlin.cz [online]. 2013 [vid. 2019-03-14].

Dostupné z: http://kvetiny.atlasrostlin.cz/tabak-selsky

[6] Tabák virginský - Nicotiana tabacum - AtlasRostlin.cz [online]. 2013 [vid. 2019-03-

14]. Dostupné z: http://kvetiny.atlasrostlin.cz/tabak-virginsky

[7] PIPKOVÁ, Renata. Měření celkových alkaloidů v tabáku [online]. Brno, 2011.

Diplomová práce. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická. Dostupné

z: https://www.vutbr.cz/www_base/zav_prace_soubor_verejne.php?file_id=36664&fbc

lid=IwAR3HeTI43GHF4xLWM3X4wWSeZB9NntBLOGwpScL92wQ0AFIK26PK7S

Z3PbQ

[8] British American Tobacco Czech Republic - Výroba tabáku: od semínka ke kouři

[online]. [vid. 2018-12-10]. Dostupné

z: http://www.batczech.cz/group/sites/BAT_A66HPK.nsf/vwPagesWebLive/DOA44H

BK

[9] Vyhláška o tabákových výrobcích [online]. [vid. 2019-01-04]. Dostupné

z: https://www.zakonyprolidi.cz/cs/2016-261/zneni-20160907

[10] Directive 2014/40/EU of the European Parliament and of the Council of 3 April 2014

on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions of the

Member States concerning the manufacture, presentation and sale of tobacco and

related products and repealing Directive 2001/37/EC [online]. [vid. 2018-12-10].

Dostupné z: https://eur-lex.europa.eu/eli/dir/2014/40/oj

[11] Cigarety a škodliviny - Přehled značek cigaret [online]. [vid. 2018-12-10]. Dostupné

z: http://www.cigarety.wz.cz/cigarettes.php?sort=nicotine

[12] HRUBÁ, D. a A. PEŘINA. Vodní dýmka není bezpečnou alternativou klasických

cigaret! The water pipe isn’t secure alternative to classical cigarettes! 2015, 70(4),

220–222. ISSN 00692328.

[13] POVOVÁ, J., A. DALECKÁ, L. HÝVNAROVÁ, H. TOMÁŠKOVÁ, P. AMBROZ,

K. VAŘECHA a V. JANOUT. Srovnání rizika z kouření cigaret a vodní dýmky.

69

Comparison of risks from smoking cigarettes and water pipe. 2015, 95(3), 127–130.

ISSN 00326739.

[14] Elektronická cigareta: Škodí více než klasické kouření? / Lékarnické kapky [online].

[vid. 2018-12-10]. Dostupné z: http://www.lekarnickekapky.cz/leky/zdravotnicke-

pomucky/elektronicka-cigareta-skodi.html

[15] Informace ministerstva zdravotnictví k uvádění elektronických cigaret na trh [online].

[vid. 2018-12-10]. Dostupné z: http://www.mzcr.cz/obsah/tabak-a-elektronicke-

cigarety_2989_1.html

[16] IQOS – nové bezkouřové elektronické zařízení od PMI | IQOS | PMI [online].

[vid. 2018-12-10]. Dostupné z: https://cz.iqos.com/cs

[17] KALINA, Kamil a KOLEKTIV. Klinická adiktologie. 1. Praha: Grada Publishing, a.s.,

2015. ISBN 978-80-247-4331-8.

[18] ATKINS, Simon. První krok z kouření. 1. Uhřice: Doron, 2014. ISBN 978-82-7297-

112-1.

[19] Zákon o spotřebních daních [online]. jaro 2018. Dostupné

z: https://www.podnikatel.cz/zakony/zakon-c-353-2003-sb-o-spotrebnich-

danich/f2462146/

[20] Zákon o ochraně zdraví před škodlivými účinky návykových látek [online].

3. březen 2017 [vid. 2019-01-04]. Dostupné z: https://www.zakonyprolidi.cz/cs/2017-

65

[21] PROVAZNÍK, Kamil a A KOLEKTIV. Manuál prevence v lékařské praxi: souborné

vydání. Souborné vydání. Praha: Státní zdravotní ústav: Nakladatelství Fortuna, 2004.

1.-5. díl. ISBN 80-7168-942-4.

[22] KRÁLÍKOVÁ, Eva a KOLEKTIV. Závislost na tabáku - epidemiologie, prevence,

léčba. Břeclav: ADAMIRA, 2013. ISBN 978-80-904217-4-5.

[23] HNILIČKOVÁ, Petra. Toxikologie kouření [online]. Hradec Králové, 2011. Diplomová

práce. Univerzita Karlova v Praze, Katedra farmakologie a toxikologie. Dostupné

z: https://dspace.cuni.cz/handle/20.500.11956/32722

[24] PETANOVÁ, Jitka. Kouření a imunita. Časopis lékařů českých. 2017, 2017(1), 6–8.

[25] STÁRKA, Luboslav, Martin HILL a Eva KRÁLÍKOVÁ. Kouření a endokrinní systém.

Diabetologie, metabolismus, endokrinologie, výživa - časopis pro postgraduální

vzdělávání. 2005, 8(4), 179–185.

[26] ŠÍDOVÁ, M. a L. ŠŤASTNÁ. Kouření v těhotenství. Adiktologie. 2015, 15(2), 164–

172.

[27] GOLÁŇ, Lubor. Vliv kouření na morfologii a funkci kardiovaskulárního aparátu.

Interní medicína pro praxi. 2007, 2007(9), 9, 386–388.

[28] POTREPČIAKOVÁ, S. CHOPN – novinky v diagnostice a léčbě. Geriatrie a

Gerontologie. 2017, 2017(4), 172–175.

70

[29] RESL, V. Kouření a kůže. Praktický lékař. 2007, 87(4), 222–223.

[30] File:Nicotine.svg [online]. nedatováno [vid. 2019-01-17]. Dostupné

z: https://en.wikipedia.org/wiki/File:Nicotine.svg

[31] VĚTROVSKÁ, Eva. Rostlinné alkaloidy a jejich účinky na lidský organismus [online].

Praha, 2013. Bakalářská práce. Univerzita Karlova v Praze, Katedra biologie a

enviromentálních studií gie. Dostupné

z: https://dspace.cuni.cz/bitstream/handle/20.500.11956/56314/BPTX_2012_2_11410_

0_290327_0_130116.pdf?sequence=1&isAllowed=y

[32] POHANISH, Richard P. Sittig´s Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and

Carcinogens. Sixth edition. Oxford, UK: Elsevier, 2012. L­­­­-Z. ISBN 978-1-4377-

7869-4.

[33] PUBCHEM. Nicotine [online]. [vid. 2019-01-07]. Dostupné

z: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/89594

[34] DOBROTA, Dušan a A KOLEKTIV. Lekárska biochémie. druhé. Martin: Osveta,

2016. ISBN 978-80-8063-444-5.

[35] HIRT, Miroslav a A KOLEKTIV. Toxikologie a jiné laboratorní metody ve forenzní

praxi. Brno: Masarykova univerzita, 2011. ISBN 978-80-210-5477-6.

[36] ADLKOFER, Franz a Klaus THURAU. Effects of nicotine on biological systems.

Birkhauser Verlag Basel: Springer Basel AG, 1991. ISBN 978-3-0348-7459-5.

[37] BENOWITZ, Neal L. Cotinine as a Biomarker of Environmental Tobacco Smoke

Exposure. 1996, 1996(Vol. 18, No. 2), 188–204.

[38] HURYCHOVÁ ŠRAIBROVÁ, Adéla. Stanovení kotininu v biologickém materiálu

jako marker kouření. Hradec Králové, 2015. Univerzita Karlova v Praze,

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové.

[39] ZLOCH, Z. Metabolismus nikotinu člověka. In: [online]. Ústav hygieny LF UK Plzeň.

Dostupné z: mefanet.lfp.cuni.cz/download.php?fid=155

[40] File:Nicotine metabolism.png [online]. 2017 [vid. 2019-01-17]. Dostupné

z: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=File:Nicotine_metabolism.png&oldid=79

4156190

[41] MASSADEH, A. M., A. A. GHARAIBEH a K. W. OMARI. A Single-Step Extraction

Method for the Determination of Nicotine and Cotinine in Jordanian Smokers’ Blood

and Urine Samples by RP-HPLC and GC-MS. Journal of Chromatographic Science

[online]. 2009, 47(2), 170–177. ISSN 0021-9665, 1945-239X. Dostupné

z: doi:10.1093/chromsci/47.2.170

[42] (−)-Cotinine C5923. Sigma-Aldrich [online]. [vid. 2019-01-22]. Dostupné

z: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c5923

[43] STRIMBU, Kyle a Jorge A. TAVEL. What are Biomarkers? Current opinion in HIV

and AIDS [online]. 2010, 5(6), 463. Dostupné z: doi:10.1097/COH.0b013e32833ed177

71

[44] BENOWITZ, Neal L. a P. JACOB III. Metabolism of nicotine to cotinine studied by a

dual stable isotope method. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 1994, 483–493.

[45] MARTÍNKOVÁ, Jiřina a KOLEKTIV. Farmakologie pro studenty zdravotnických

oborů. 1. Praha: Grada Publishing, a.s., 2007. ISBN 978-80-247-1356-41.

[46] KYEREMATEN, G. A., M. D. DAMIANO, B. H. DVORCHIK a E. S. VESELL.

Smoking-induced changes in nicotine disposition: application of a new HPLC assay for

nicotine and its metabolites. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 1982, 32(6),

769–780. ISSN 0009-9236.

[47] COULTAS, D. B., C. A. STIDLEY a J. M. SAMET. Cigarette yields of tar and

nicotine and markers of exposure to tobacco smoke. The American Review of

Respiratory Disease [online]. 1993, 148(2), 435–440. ISSN 0003-0805. Dostupné

z: doi:10.1164/ajrccm/148.2.435

[48] DASTYCH, Milan, Petr BREINEK a KOLEKTIV. Klinická biochemie. 2. Brno:

Masarykova univerzita, 2015. ISBN 978-80-87192-18-4.

[49] DASTYCH, Milan a KOLEKTIV. Instrumentální technika. 2. Brno: Masarykova

univerzita, 2014. ISBN 978-80-210-7103-2.

[50] KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2. 2003. ISBN 80-86369-07-2.

[51] Chromatografie - 10. cvičení z Lékařské chemie [online]. B.m.: Biochemický ústav LF

MU. 2016. Dostupné

z: https://is.muni.cz/auth/el/1411/podzim2016/BLLC0111c/um/10_cviceni-16.pdf

[52] Uživatelská příručka Cobas 8000 modulární řady. B.m.: Roche Diagnostic

[53] KRICKA, L. J., D. SCHMERFELD-PRUSS, M. SENIOR, D. B. GOODMAN a P.

KALADAS. Interference by human anti-mouse antibody in two-site immunoassays.

Clinical Chemistry. 1990, 36(6), 892–894. ISSN 0009-9147.

[54] YUAN, Chao, Justin KOSEWICK a Sihe WANG. A simple, fast, and sensitive method

for the measurement of serum nicotine, cotinine, and nornicotine by LC-MS/MS.

Journal of Separation Science [online]. 2013, 36(15), 2394–2400. ISSN 1615-9314.

Dostupné z: doi:10.1002/jssc.201300220

[55] KATAOKA, Hiroyuki, Reiko INOUE, Katsuharu YAGI a Keita SAITO.

Determination of nicotine, cotinine, and related alkaloids in human urine and saliva by

automated in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-

mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [online]. 2009,

49(1), 108–114. ISSN 0731-7085. Dostupné z: doi:10.1016/j.jpba.2008.09.044

[56] LI, Mingxin, Qian WANG, Jing ZHU, Lin REN, Li YONG a Xiaoli ZOU.

[Determination of nicotine and cotinine in urine by hydrophilic interaction

chromatography-tandem mass spectrometry]. Se Pu = Chinese Journal of

Chromatography [online]. 2017, 35(8), 826–831. ISSN 1000-8713. Dostupné

z: doi:10.3724/SP.J.1123.2017.05019

[57] DIXON, R. Brent a Amitava DASGUPTA. Comparison of SemiQuantitative Cotinine

Values Obtained by the DRI Immunoassay and Values Obtained by a Liquid

72

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry-Based Method: The DRI Immunoassay

is Suitable for Screening Purposes Only Because Semiquantitative Values May Be

Unreliable. Journal of Clinical Laboratory Analysis [online]. 2016, 30(6), 1106–1109.

ISSN 1098-2825. Dostupné z: doi:10.1002/jcla.21988

[58] KIM, Sungroul. Overview of Cotinine Cutoff Values for Smoking Status Classification.

International Journal Of Environmental Research And Public Health [online]. 2016,

13(12) [vid. 2019-01-22]. ISSN 1660-4601. Dostupné

z: http://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&db=mdc&AN=27983665&site=

ehost-live

[59] Toxicology - Prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc - Kotinin a kotininový test [online].

[vid. 2019-04-26]. Dostupné

z: http://www.toxicology.cz/modules.php?name=News&file=article&sid=206

[60] BALHARA, Yatan Pal Singh a Raka JAIN. A receiver operated curve-based evaluation

of change in sensitivity and specificity of cotinine urinalysis for detecting active

tobacco use. Journal of Cancer Research and Therapeutics [online]. 2013, 9(1), 84–89.

ISSN 1998-4138. Dostupné z: doi:10.4103/0973-1482.110384