Efecto de 4 concentraciones de la fitohormona 2,4 diclorofenoxiacético

para producción de callos a partir de hipocotilos y hojas primordiales de

Chenopodium pallidicaule Aellen “kañiwa”

Condori Pacsi Sandro Jhonatan, Neira Peralta Noelia Liz y Pacheco Salas Huber Rodrigo

Laboratorio de Fisiología Vegetal, Curso de Crecimiento y desarrollo vegetal. Universidad

Nacional de San Agustín. Arequipa. Perú

RESUMEN

La Kañiwa es uno de los recursos filogenéticos de importancia en las zonas altoandinas, La

técnica del cultivo in vitro es una alternativa de producción que permite conservar el banco de

germoplasma de Kañiwa y su posterior propagación masiva del material vegetal, para

controlar la incidencia viral y el riesgo de ataque de plagas y enfermedades; de esta manera

brindando seguridad alimentaria. En ésta investigación se hizo uso de la auxina 2,4-D a

diferentes concentraciones debido a su conocida efectividad para la proliferación de callos, se

usaron hipocótilos y hojas primordiales como explantes. En el cultivo de hipocótilos en medio

MS no se tuvo éxito en la inducción a callos. En el cultivo de hojas primordiales se obtuvo un

porcentaje de supervivencia del 100% y una contaminación del 6%.

Palabras clave: 2,4D, kañiwa, hipocótilos y hojas primordiales

ABSTRACT

The Kañiwa is one of the important plant genetic resources in high Andean areas; The

technique of in vitro production is an alternative that preserves the kañiwa's gene bank and

their subsequent mass propagation of plant material to control the viral incidence and the risk

of pests and diseases, thus providing food security. In this investigation, we used 2,4-D auxin

at different concentrations because it is known to be the most effective for callus

proliferation, hypocotyls and primary leaves were used as explants. The cultivation of

hypocotyls on MS medium not succeeded in inducing callus. In the cultivation of primary

leaves was obtained a survival rate of 100% and a contamination of 6%.

Keywords: 2.4 D, kañiwa, hypocotyls and primary leaves

INTRODUCCIÓN

La Kañiwa es uno de los recursos

filogenéticos de importancia en las zonas

altoandinas, por su alto contenido en

proteínas vitaminas y fibras. Los elevados

costos de producción por el sembrío en

surcos hacen necesario gran cantidad de

semillas debido a su pequeño tamaño y la

pobre uniformidad en la producción. En la

actualidad el cultivo de tejidos tiene escasos

estudios en el campo de la producción

biotecnológica para esta especie. La Kañiwa

se ve en la necesidad de desarrollar

estudios de la composición del medio de

cultivo para establecer un protocolo

adecuado para la producción de callos.

Debido a su excepcional valor nutritivo de la

Kañiwa en carbohidratos, proteínas y alto

contenido de fibra, especialmente de fibra

insoluble y su gran adaptabilidad a

condiciones climáticas adversas como las

bajas temperaturas y las sequías, su cultivo

puede contribuir a solucionar parte de los

problemas de alimentación del poblador

andino.

La técnica del cultivo in vitro es una

alternativa de producción que permite

conservar el banco de germoplasma de

Kañiwa y la posterior propagación masiva

del material vegetal, para controlar la

incidencia viral y el riesgo de ataque de

plagas y enfermedades; de esta manera

brindando la seguridad alimentaria.

Sumando a un establecimiento del balance

hormonal adecuado para la morfogénesis

somática de Kañiwa permitirá la

propagación vegetativa como tecnología

moderna de regeneración y mejoramiento

genético, para la producción de plantas

uniformes en periodos cortos, así como su

disponibilidad para cualquier época del año.

Por lo tanto en el presente trabajo se

pretende determinar un protocolo

adecuado para el cultivo in vitro de la

Kañiwa, según sus requerimientos

hormonales de auxina utilizando 2,4 D a

diferentes concentraciones para la

formación de callos utilizando dos tipos de

explante (Hipocótilos y hojas primordiales).

Se sabe que los requerimientos hormonales

para la iniciación del callo dependen del

origen del explante, en los trabajos de

Dodds y Roberts (1995) afirma que los

explantes que contienen células del

cambium pueden formar callos sin adición

de reguladores de crecimiento. Los efectos

más importantes de las auxinas para el

cultivo de tejidos son el crecimiento y la

elongación celular. Algunos tejidos sólo

forman callos en respuesta a una auxina en

particular, siendo necesario utilizar altas

concentraciones de auxina para la iniciación

del callo. Siendo la auxina 2,4-D más

efectiva para la proliferación de callos,

usándose a concentraciones entre 10-7 a 10-5

M. tal como afirma Yeoman y Forche

(1980). Entonces la inducción a formación

de callos de la especie altoandina Kañiwa en

condiciones controladas y en una solución

nutritiva Murashige Skoog con diferentes

soluciones de fitohormona 2,4 D (0,5 , 1 2, 4

ppm) influirá de manera diferencial, en la

callogénesis de hipocótilos y hojas

primordiales de Kañiwa in vitro.

OBJETIVO GENERAL de 4 concentraciones de la fitohormona 2,4 diclorofenoxiacético para producción de callos a partir de hipocótilos y hojas primordiales de Chenopodium pallidicaule Aellen “Kañiwa”

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Evaluar el efecto de 2,4 D con las concentraciones (0,5 , 1 2, 4 ppm) en medio Murashige Skoog para la inducción a callos con el explante de hipocótilos de Chenopodium pallidicaule Aellen “Kañiwa”

Evaluar el efecto de 2,4 D con las concentraciones (0,5 , 1 2, 4 ppm) en medio para la inducción a callos con el explante de hojas primordiales de Chenopodium pallidicaule Aellen “Kañiwa”

Comparar el mejor explante para la inducción a callos de Chenopodium pallidicaule Aellen “Kañiwa” con las concentraciones de 2,4 D (0,5 , 1 2, 4 ppm)

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención hojas primordiales de Kañiwa

Se procedió a preparar cuatro macetas de

plástico de 10cm de alto x5cm de diámetro

(1kg de capacidad) con sustrato el cual

contenía arena y musgo en una relación 3:1,

se mezclando ambos componentes, se,

esparció una porción de semillas

seleccionadas de Kañiwa luego se añadió

finamente un poco de sustrato mezclado,

humedeciendo el medio evitando

anegamiento, se colocó los baldes en una

cámara semi hermética dentro del

sombreadero, regando cada día

dependiendo de la humedad presente,

después de presentar 3-5cm de alto, se

procedió a ralear cuidadosamente las

plántulas facilitar el crecimiento entre cada

plántula obtenida. (Ver anexo I)

Preparación de medio salino para la

germinación de las semillas de Kañiwa

Se mezcló en matraz con capacidad de

500ml, los siguientes 3 ingredientes de forma

ordenada, 150ml de agua destilada, 50ml de

solución Hougland (Hougland ¼) y 2.5gr de

Agar y se homogeneizó, colocando en

microondas por 3 minutos, sin que llegue al

punto de ebullición, se retiró y movió hasta

disolver lo más posible. Se repitió el proceso

hasta disolver completamente (coloración

semi translúcida).

Se vació 20ml por cada frasco de Gerber agitando antes y después de echar en cada frasco para que haya una distribución uniforme de los nutrientes. Se llevó a esterilización en autoclave a 120°C 15 libras de presión, por espacio de 15min. (Ver anexo II)

Obtención de los hipocótilos de Kañiwa

Se cortó discos de papel filtro de un tamaño

considerable que se pudiera introducir por la

boca del frasco. Se llevaron a esterilización

en seco en horno Pastur a 180°C por 20min

en una placa Petri de vidrio.

En condiciones asépticas se introdujo los

discos de papel filtro dentro de cada frasco

con medio Hoagland ¼ ya estéril

Se colocó una pequeña cantidad de semillas

en una media de nylon y se procedió a su

desinfestación, sumergiéndola en alcohol al

70% por 30 segundos, luego en hipoclorito

de sodio al 5% por 3 minutos, y tres

enjuagues con agua estéril por 5 minutos

cada una; posterior a la desinfestación. se

procedió a colocar las semillas en la solución

Hoagland ¼ encima de los disco de papel

filtro. Se esperó la germinación de las

semillas para la obtención de los hipocótilos.

(Ver anexo III)

Preparación del medio de cultivo MS con

diferentes concentraciones de 2,4 D.

Se preparó el medio Murashige y Skoog

1962 (MS) el cual constituye de

macronutrientes, micronutrientes y

vitaminas, se preparó 1 litro de medio MS.

Agregando 100ml de cada macronutriente y

10 ml de cada micronutriente agregando las

vitaminas Tiamina, Ac. Nicotinico, Piridoxina,

Glicina y Mio-inositol. (Ver anexo IV, Tabla 1)

ajustando el pH a 5,75. Se dividió en 4

matraces a los cuales se adiciono las

concentraciones de hormona 2,4D (0.5,1,2,4

ppm).Finalmente se agregó Fitagel en cada

matraz.

Se repartió en 16 frascos por cada

concentración y se tapó con papel aluminio.

El medio se esterilizó en autoclave a 121 °C y

15 libras de presión a por espacio de 20

minutos. (Ver anexo IV)

Cultivo de los hipocótilos y hojas primordiales en el medio de cultivo MS con diferentes concentraciones de 2,4 D

Una vez ya solido el medio MS, se procedió a

cultivar los explantes (hojas primordiales e

hipocótilos) de la kañiwa en la cámara de

cultivo en condiciones asépticas.

Para el caso de hipocótilos se tomó los

hipocótilos de las semillas germinadas en

solución Hougland 1/4. Se cortó los

hipocótilos en una placa estéril, pasando los

cortes de hipocótilos con ayuda de una pinza

sobre el medio MS con las respectivas

concentraciones de 2,4 D. (Ver anexo V)

Para el caso de hojas primordiales Una vez

crecidas se seleccionaron las hojas

primordiales de las plántulas que tuvieron

buenas características se procedió a su

desinfestación, lavándolas 10 minutos en

agua destilada con una gota de detergente

enjuagando 3 veces con agua corriente y

luego con agua destilada; posteriormente se

les sumergió en alcohol al 70% por 1 minuto,

luego en hipoclorito de sodio al 5% por 10

minutos, y tres enjuagues con agua estéril

por 5 minutos cada una; posterior a la

desinfestación en condiciones asépticas se

procedió a cortar la hoja en dos mitades y

pasarlas con ayuda de una pinza sobre el

medio MS con las respectivas

concentraciones de 2,4 D. (Ver anexo VI)

Evaluación de la formación de callos

A los 29 días se procederá a evaluar, utilizando la descripción de la escala de Santana Descripción de la escala empleada por Santana (1982): 0 – no formación del callo. 1 – ligera formación del callo (se observó una débil proliferación en zonas del borde del explante). 2 – formación del callo (hay proliferación de células por todos los bordes del explante, sin llegar a formar una masa). 3 – abundante formación del callo (formación de una masa voluminosa de callos). Para calcular el porcentaje de callos formados, se empleará la siguiente fórmula:

( ) ( )

Para aquellos obtenidos en el grado 3 se les tomará de la coloración.

Se empleará un diseño completamente aleatorizado con un arreglo factorial 2x4 con 3 repeticiones donde el primer factor con dos niveles serán los hipocótilos y las hojas primordiales que serán sometidas a el segundo factor con cuatro niveles serán cuatro diferentes concentraciones de la hormona 2,4D (0,5 , 1 2, 4 ppm). El procesamiento estadístico de los datos se llevara a cabo en los callos pertenecientes al grado 3 de la escala de Santana (1982), para lo cual se realizara un ANOVA y al existir diferencias entre las medias se les aplicara la prueba de Tukey al 1%. Se utilizará el paquete estadístico SSPS y Sigma Plot.

RESULTADOS Y DISCUSION

Obtención hojas primordiales de Kañiwa

Se logró obtener exitosamente hojas

primordiales de Kañiwa, observando un

crecimiento de 3cm de las plántulas con

sus hojas cotiledóneas a los 7 días; a los 15

días se observó un crecimiento de 5cm con

brote de la yema apical. A los 17 días se

observó las primeras hojas primordiales. Se

mantuvo una humedad constante y

adecuada para no ahogar las semillas.

La utilización de hojas primordiales como

explante inductor a formación de callos en

comparación con las hojas cotiledóneas,

radico en que las hojas primordiales poseen

un patrón de desarrollo mientras que las

hojas cotiledóneas han perdido dicho

patrón, esta afirmación es corroborada por

Flick et al. 1983; Murashige 1974; Evans et

al. 1981; la cual afirman que todas las

partes de la planta se han utilizado como

explantes para iniciación de un callo, sin

embargo los tejidos juveniles poseen un

alto grado de actividad meristemática y

tienen más plasticidad in vitro.

Figura 1. Crecimiento de hojas primordiales de Chenopodium pallidicaule.

Obtención de los hipocótilos de Kañiwa

Las semillas de Kañihua sembradas medio

Hoagland permitió la obtención de en los

hipocótilos como explantes asépticos en un

tiempo de 24 horas; la utilización de dos

estructuras diferentes morfológicamente

como explante se vasa en la variación en las

respuestas, Flick et al. 1983; Murashige 1974

indica que el conocimiento de la morfología

de las especies usadas es de mucho

provecho para identificar los explantes

potencialmente morfogenéticos.

Cultivo de los hipocótilos y hojas primordiales en el medio de cultivo MS con

diferentes concentraciones de 2,4 D.

El cultivo de hipocótilos en medio MS con diferentes concentraciones de 2, 4 D se obtuvo un porcentaje de contaminación de hongos y bacterias del 100% ello este condicionado mal esterilización de los instrumentos usados en el cultivo. De modo que no se tuvo éxito en la inducción a callos en hipocótilos. (Ver anexo VII).

El cultivo de hojas primordiales en medio MS con diferentes concentraciones de 2, 4 D se obtuvo un porcentaje de supervivencia del 100% y un porcentaje de contaminación de 25% para el tratamiento de con 4ppm de concentración de 2, 4 D, en consecuencia se tuvo un porcentaje de contaminación en total del 6%.(Tabla 1)

Tabla 1. Porcentaje de formación de callos y contaminación

Concentraciones VS formación de callos

Concentración de 2, 4 D (ppm)

0.5 1 2 4

Repeticiones 4 4 4 4

Porcentaje de supervivencia (%)

100 100 100 100

Porcentaje de contaminación (%)

0 0 0 25

Callos viables 4 4 4 3

En la evaluación realizada a los 12 días después de haberlos colocados los explantes en el medio de inducción a callos se observó que el porcentaje de inducción en todos los tratamientos fue del 0%.( Fig. 2) Sin embargo aún se encuentran en observación. (Ver anexo VII).

La inducción a callos con la fitohormona 2,4 D a diferentes concentraciones y una combinación vitamínica no ofreció buenos resultados, sin embargo el medio de cultivo propuesto por Gin L. 2002 utiliza un suplemento vitamínico de Kao Michayluck para Kañiwa.

Figura 2. Inducción de callos en hojas

primordiales de Chenopodium pallidicaule.

BIBLIOGRAFIA

Bidwel, RG (1979) Fisiología Vegetal. Primera

Edición en Español, P. 784

Dodds JH, Roberts LW (1995). Experiments in

Plant Tissue Culture, 3rd rev ed. Cambridge

University Press, Cambridge.

Evans, D. A.; Sharp, W. R. y Flick, C. E. 1981.

Growth and behavior of cell cultures:

Embryogenesis and organogénesis. En:

Thorpe, T. A. (ed.). Tissue culture: Methods

and applications in agricultura. Academic

Press, Nueva Yorck. 45-113 Pp.

Flick, C. E.; Evans, D. A. y Sharp, W.R. 1983.

Organogenesis. En: Evans, D. A.; Sharp, W.R.;

Ammirato, P.V. y Yamada, Y, (eds.).

Handbook of plant cell culture. MacMillan

Puplishing, Nueva York. V. 1. 13-81 Pp.

Gin L. 2002. Comportamiento de la Kañiwa

(Chenopodium pallidicaule, Aellen) en cultivo

IN VITRO. Universidad Técnicas de Oruro.

Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuarias.

Molina, L, Escalona M, Rodríguez R y Jihad A

(2003) Efecto de la luz en el cultivo

fotomixotrófico de la Piña (Ananas comosus

(L.) Merr.) en Biorreactores de Inmersión

Temporal. Memorias del Taller Internacional

de Biotecnología Vegetal (BioVeg 2003)

Centro de Biotecnología de las Plantas

(Bioplantas). Ciego de Ávila, Cuba

Murashige, T (1992) Uso del cultivo de

anteras en el mejoramiento genético del

arroz. Paper present in the International

Workshop of Anther Culture for Rice

Breeders, pp. 205-303

Murashige, T y Skoog F (1962) A revised

medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue culture. Physiol. Plantar 15:

473-497

Santana, NB (1982) Determinación de un

medio adecuado para la obtención de callos

en variedades de caña de azúcar (Saccharum

spp) in vitro. Cultivos Tropicales. 4 (3): 48-52

Yeoman, M. M. and Forche, E. (1980). Cell

proliferation and growth in callus cultures.

International Review of Cytology, S11 A: 1–

24.

ANEXO I

ANEXO II

ANEXO III

ANEXO IV

Tabla 1.Composición y preparación de stocks del medio de cultivo Murashige & Skoog (1962)

SOLUCIÓN SALES CONCENTRACIÓN DEL STOCK EN g/l

CONCENTRACIÓN final en el medio mg/l

cantidad de stck para un litro de medio

A NH4NO3 82.5 1650 20ml

B KNO3 95.0 1900 20ml

C CaCl22H2O 88.0 440 5ml

D KH2PO4 34.0 170 5ml

E

H3BO3

Na2MoO42H2O

CoCl26H2O KI

1.24 0.05 0.005 0.166

6.2 0.25 0.025 0.83

5ml

F

MgSO47H2O

MnSO44H2O

ZnSO47H2O

CuSO45H2O

74.0 3.45 1.72 0.005

370.0 22.3 8.6 0.025

5ml

G Na2EDTA(*)

FeSO47H2O

7.46 5.57

37.3 27.8

5ml

H

TIAMINA(**) AC. NICOTINICO PIRIDOXINA GLICINA MIO-INOSITOL

0.02 0.1 0.1 0.4 20

0.1 0.5 0.5 2.0 100

5ml

De las soluciones ya preparadas de macronutrientes 10X se tomó 100ml y

micronutrientes 100X se tomó 10ml.

De las soluciones madre de 100ppm de las vitaminas tiamina , Ac Nicotinico, Piridoxina,

glicina y mio-inositol se tomó 1ml,5ml, 20ml, 100ml respectivamente. Todas solución se

completo a 1 litro

ANEXO V

ANEXO VI

ANEXO VII

Desenvolvimiento de las hojas primordiales en medio MS con 2,4D 0,5 ppm

Desenvolvimiento de las hojas primordiales en medio MS con 2,4D 1 ppm

Desenvolvimiento de las hojas primordiales en medio MS con 2,4D 2 ppm

Desenvolvimiento de las hojas primordiales en medio MS con 2,4D 4 ppm

Contaminación de las hojas primordiales en medio MS con 2,4D 4 ppm

Contaminación del medio Hougland ¼ antes colocar las semillas de kañiwa