Comparative evaluation of the CD4 +CD8 + and CD4 +CD8 − lymphocytes in the immune response to...

11
Comparative evaluation of the CD4 CD8 and CD4 CD8 lymphocytes in the immune response to porcine rubulavirus Jesu Âs Herna Ândez a,* , Yonathan Gar®as a , Alejandro Nieto b , Carmen Mercado c , Luis F. Montan Äo d , Edgar Zenteno e a Departamento de Bioquõ Âmica, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 14080 Me Âxico, Mexico b Facultad de Quõ Âmica, Universidad Auto Ânoma de Morelos, 68210 Me Âxico, Mexico c Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, 04510 Me Âxico D.F., Mexico d Departamento de Biologõ Âa Celular, Instituto Nacional de Cardiologia, 14080 Me Âxico D.F., Mexico e Laboratorio de Inmunologõ Âa, Departamento de Bioquõ Âmica, Facultad de Medicina, UNAM, 04510 Me Âxico D.F., Mexico Received 28 November 2000; received in revised form 26 February 2001; accepted 15 March 2001 Abstract The porcine immune system is unique in the expression of CD4 CD8 double-positive, DP) lymphocytes. These cells have been associated with immunological memory due to their gradual increase with age, the expression of memory phenotype and their ability to respond to recall viral antigen. This work analyzes the biological function of CD4 CD8 and CD4 CD8 lymphocytes in the immune response to porcine rubulavirus PRv). CD4 CD8 cells isolated from pigs 3 weeks after infection with porcine rubulavirus proliferated in response to homologous virus and generated lymphoblasts which were predominantly of the CD4 CD8 phenotype, whereas stimulation with mitogen induced proliferation but did not switch the phenotype. CD4 CD8 lymphocytes isolated after 10 weeks of infection proliferated in response to phytohemagglutinin PHA) but did not proliferate in response to homologous virus and did not change their phenotype, whereas CD4 CD8 lymphocytes proliferated in response to PHA and to viral antigen. The cytokine pro®le of both lymphocyte populations showed the presence of IL-2 and IL-10 transcripts, quantitation demonstrated that CD4 CD8 cells expressed mainly IL-10, whereas CD4 CD8 lymphocytes expressed primarily IL-2. Our results show that CD4 CD8 lymphocytes in the early phase of Veterinary Immunology and Immunopathology 79 2001) 249±259 * Corresponding author. Fax: 52-5665-4623/5623-2169. E-mail address: [email protected] J. Herna Ândez). 0165-2427/01/$ ± see front matter # 2001 Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII:S0165-242701)00259-8

Transcript of Comparative evaluation of the CD4 +CD8 + and CD4 +CD8 − lymphocytes in the immune response to...

��������� ������� �� �� �������� � ��������� ���������� � �� ����

���� � �� ����� ����������

����� �� �� ������ �� ���� ��� ���� !�"� ��� #��������� $������� %��� &' $� �� (��� )�*�� + � �

������������ � �� �������� �������� ������� � ���������� ������������� �����

������� ������ ������ � !�������� "��#����� $������ � ������ %�&�� ������� ������ ������ � ������� '���������� ( )������� "�$�� ��*�� ������ �+ +� �����

������������ � ���,��� -������� �������� ������� � -����,��� �����

������ �+ +� �����.�/����� � ������,���� ����������� � �� �������� ������ � ��������

"�$�� ��*�� ������ �+ +� �����

,��� -� #���� -.../ ���� � ���� ���� -0 &������ -..1/ ������ 12 $���� -..1

��������

3� ����� ���� ����� �� � �4� � �� 5������ �� �������� 6�����7������� �89

����������' 3�� ���� �� � ��������� :��� ���� ���*���� ����� �� �� ���� *������

� ���� :��� �*� �� 5������ �� ����� �� ���� � � ���� ������� �� ���� � �� ����� ����

� ��* ' 3��� :��; � ����� �� �����*���� �� ���� �� �������� � � �������� ���������� �

�� ���� ���� � �� ����� ���������� 68,9' �������� ���� ������� ���� ��*� < :;�

���� � ����� :��� ����� ���������� ���������� � ���� � �� ������*��� ���� � � * ����

������������ :���� :� ������ � ��� �� �� �������� �� ����� :���� ���������� :���

����* � ���� ����������� ��� ��� �� �:���� �� �� ����' �������� ���������� �������

���� 1. :;� �� � ����� ���������� � ���� � �� ��������**���� � 68�!9 ��� ��� ��

��������� � ���� � �� ������*��� ���� � � ��� �� ��� * ���� �� ����� :����

�������� ���������� ���������� � ���� � �� 8�! � � �� ���� � ��* ' 3� ����;� ��� �

�� ���� ��������� ��������� � ���:� �� ��� � �� =%7- � � =%71. ��� �������� 4�� �������

��� ������ ���� �������� ���� 5����� ��� �� =%71.� :���� �������� ����������

5����� ��������� =%7-' >�� ������ ���: ���� �������� ���������� � �� ���� ���� ��

?��� ��� =��� ���*� � � =��� ��������*�

@A 6-..19 -�AB-2A

� ������� �� * ������' &�5C �2-720027�0-<D20-<7-10A'�0���� �����C "���E�������'����'�5 6�' �� �� ��9'

.1027-�[email protected] B � ��� � ����� � -..1 )���� G�� � H'?' !�� ��*��� ����'

8==C G . 1 0 2 7 - � - @ 6 . 1 9 . . - 2 A 7 �

����� ���������� � ����� �� � �� ��� �� �����7������ ���� 5����� * =%71. � �

� ��* 7�� � � �� �� � � ���� �������� 37���� ��� � � ����� �� �� ��4��� ���'

� -..1 )���� G�� � H'?' !�� ��*��� ����'

1�(2��3 8���� ����������/ ,378�,/ 8���� 37����������/ 8���� �������� ����� 37����/ G:�

���� ���� �/ �������� 37����/ =%71.

� ���� ������

8���� ���������� 68,9 �� ���� ���� ��� ��� � ����� � �:� � :����

����� �����*����� ����������� � � ��������� �������� 6$�� �7%��� � ��'� 1A�0/

,����� � ��'� 1AA@/ G���� � ��'� 1A��9' 3� ������� ���� � �� 5���� �����

� ���� ��*� �� � � ��� �� �� �� ���� ���**���� � 7 ����� ���� 6�#9

6�� �� �� � ��'� 1AA�9 :���� ���* ��� ���� ���� �����*� ������7�7-�<7������7���� ������� 6,��7%�� � ��'� 1AA<� 1AA@/ ?���"� � ��'� -...9' I ��

�������� ���: ���� �������� ����� �� � ����� ���� 68H$�9 �� 5���� �����

� ���� ��*� ��������� � �� <�� :; ����7� ����� � �� ��� � �� �� ����

� ��* � � ���� ��� ���������� ������������ ������ ���� �������� � �

�������� 6�����7������� �89 �� ���� 6�� �� �� � ��'� 1AA�9' !�����*� ��

������������ �� �� �������� ���������� � �� ���� ���� � �� �����

���������� :�� � ��������� ���� �� �������� ���� :�� � ���� 6�� �� �� � ��'�

1AA�9' #������� � ���� 5���� �� �� ���: ���� �8 ���� �� � * ����

���� � ��* 7��������� �������� ���������� 6+��;��� � � ����� � 1AA09�

� � ���� ��� ��������� �� � �� � ���� � �� ������*��� ���� ����� *

68������ � ��'� 1AA�9 ��� ���� �� ��� ������*��� ������� � ��* � 6=� ��;� � ��'�

1AA.9'

3� ��������� �� �������� ���������� � �������� ����� ���� :��� �*' = 17

�� ��7��� ��*��� ��� ���� � 1J �� ��� �������� ����� 37���� :��� � <7���7���

��*� ��� ���� � �� �� 0.J 68������ � ��'� 1A�2/ G�������� � ��'� 1A�A/ �� * � �

8��;����� 1AA09' 3�� ����� ������ ���� 5���� ��< 6�� * � � 8��;����� 1AA09

� � �����7== ������������������ � ��* � 6G�������� � ��'� 1AA19� ��� � � ��� �� ��

5���� ��1 6G�������� � ��'� 1A�A9' �������� ���������� 5���� � ��: � ���� ��

��� 6�����:9 6G�������� � ��'� 1A�A9� � � �� ��� � ��**��� ���� �� ��� ������

� ���� ��� ��������� �� ��� �� ��������� �� �� �7���� 6�� * � � 8��;����� 1AA@/+��;��� � ��'� 1AA�9' 8� ������ � ������ �� �������� ��� ������ �������

��� ������ ���� ����� ���D��� �8 ���������� 5����� �������� �� �����

� ��* 75��� �� ����� � � �� � ������ �� ���������� :��� ����� � ��* ' 3��

���� �� �� ���� � :��� �� ��������� ���� ���� ��������� � �:� � ����� �����D

������ 37���� 6+��;��� � � ����� � 1AA09' =� ��� ���� � ������� ���� �

� ���� ���� ������ !�"��;�� ����� ������ 37���� ������� :��� H7���� � ��

� ������7������� * ���� � 6>�� � ��'� 1AA�9' 3������ �� ��� �� ���� :��; :�� ��

���������� ����� �������� � � �������� ��� ��������� � � �� ����

���� � �� ����� ����������'

-2. 4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*:

� ��������� �� ����� �

&+�+ $������

G �������� ������� �:� 6%� ���� K� �����9 ������ ��*� 6L@ �� ���9 :�

����� � ���� � ��������� ����' 3� ���� �� ���� � ����� �� � �� �� ���� �:�

������ � � �����*���� � ������ �� �� ��*� ���:� ��� ��� � ���� �*������ �

�*�� �� !�"�;�M� ������ ��������� �:� ��� � � ����� ����������' 8�*� :�

5���� ����� � ���� �� � ��� ���� ���� �������� �� ����� ���������� 61.� 3�=�2.D

��9 �� �������� ������� 6�� �� �� � ��'� 1AA�9 � � ����� �� �� �� � �� ��

5���� � � �� �� �������� ������� �� �� >� � �� %��������� ! ���� ����

:���� �� ���� � ����� *����� �'

&+&+ $���/���

3� �����:� * ����� 7���� � ���� �� ���� �� � ������� 6�!�9 :� * B

������ ������ �� ��' $' 8������ 6= ��� � N ������� = ��� ������ NG!9C � ��7���

6��� @�'1-'�� =*�-�9� � ��7��� 6��� @0'-'11� =*�-�9 � � � ��7�� ���� 6���

�!$<0!� =*�19' 3� ���� ���� �� ��� �!� ��� � ������� �������� 68������

� ��'� 1A��9' &������� ���������� �� 6&=3�97����� ��� � ��7���� =*�-� � �

����������� 68)97����� ��� � ��7���� =*�-� :� ���� G���� %��' 6>5�����

) *�� �9'

&+>+ ?20��� ����(���

&�� ����� ����O��������� � ������� ���� :� � ������ :��� 1. �� �� � ��7��� � �1. �� �� � ��7��� �� ���� �� � ������ ��� 12 �� �� ��� �����:� �� � ������� :���

���� &=3�7 � � 8)7�� "�*��� ������7���� � ��� � �������' !�� � ������� � :�

������ ��� �� ��� ��� 12 �� ' ���� :� :���� :��� .'1 $ 8HG� �� @'-� �� ��� � *

.'<J ��� ���� ������ 6HG!9' G��� � ���� :� � ����� �� ����O��������

6&!�G )5�������� H��� P ���;� �� � $�� ��� ?�:� �!� NG!9'

&+�+ ����������0����#��� ���� �����, � ?0���� ��/0���������

�������� � � �������� ���������� :� ������� �� �:�7����� &!�G'

$������* ���� �� ��� � * 1.@ *����7���� � ���7����� �������� ����� �� �7

����� ���� � ����� 8HGDHG!� :� � ������ :��� � ��7��� � � � ��7���' !��� �

12 �� � ������� � ��� ���� :� :���� :��� 8HG � � ����� :��� &=3�7����� ���

� ��7���� =*�-�� � � :��� 8)7����� ��� � ��7���� =*�-� ��� 12 �� ' !��� � ��

:���� ���� :� ���� �� �� 1.@D�� � 8HG � � ����� � �� �������� � �

�������� ��������� �' 3�� :�� � ������� ��: �� �:� ����� ������� �� ��

���;� �� ����O��������� � ������ �� ��� ����� ��������� ' G��� � � ����� � �

� ���� � ���� ��� �� �� ����� �� �� ������� ���� �� �� ����� � � �� ���� � ��

���������� '

4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*: -21

&+*+ ������� � ����,�� ���������, �����

! �� *� ��� ���� ��� �� 8H$� :�� ���� � :��� 1.. �� �� �!$<0!� ����

� ��7��* �� ����� �� ���� �� � ������ �� ��� ��� 12 �� ' ���� :� :���� :���

.'1 $ 8HG� �� @'-� � � .'<J HG! � � � ������ :��� � ��� � ��7����

���� �*������ 7����� ��* ��� �������� 6$!�G� $��� �� H���� = �'� G� ����

�!� NG!9 ��� 12 �� �� ���' 3� ������ �� �� ����� ���� :�� �� ��� �� O�:

�������� � � :�� LA0J'

&+%+ .(��8����������� ����(

8H$� :� ������� ���� :��� ����� �� &�����7����4� 6$� �78���3$ ,���7

� * $����� =�# 8�������������9 *���� � � �����*���� ' &!�G7����� 37��� ���7

��������� � ���� ������ � � � ���� ��*� �� ����� � ���� ���� � ����� :� �������

�� -�2� 1.2D:�� � ����� A0 :�� ��� � ������ ����� � -.. �� �� �)8)G7������,8$=710�. ������ ������ ������ �� :��� -� 1.�2 $ -7���������� ��� - �$

������ ������� - �$ %7*������ � 1 �*D�� * ������ � � � 1.J ���� ���� ����

6G�*�� ��������� G�' %����� $>9' %��������� :� ��������� :��� 1. �*D:�� ������ � ��* ��� 2 ���� � � ������ � � ������� :��� 2J �>- �� <@� � �� ��� � ��.�-2� 1.2 ������*��� � ��* ��� �� * ���� 6!8�9' ?���� � ��* �� ����� ��

���� ��� �� �� � ���� ��* ;�� � 68Q9 ���� � �����*� �� 1..�...� , ��� � � �� ���� ���� �����*� .'�2 �� ����� �� ���4���� � � ����� �� �@.�� � ��� ��' $����

���� ����; :�� *��: � ?�� ���� ��� � ���� � $)$ ����� ������ �� :��� -J

���� ���� ���� � � 2. �*D�� * ������ ' 8���� �� � ������ � �� ���� ��� � ��

��� ������� :�� ����� � �� �� ����� �� H������� 61A@09 � � ���4���� :�

��"���� �� � �� � ������ �� -. �*D��' H��� ��� �� ���� ��� � ���4��� :�� ���

� ������� � � :�� ��� �� � 1C1.. ������� 6�� �� �� � ��'� 1AA�/ +��;���

� � ����� � 1AA09' ��� ������� :������ ���������� :� ��� �� *��� �� ����'

8����� ���� � �� ����� �� ����� �� ���������� :��� �� 37��� ����* � ������7

��**���� � 68�!9 6� �*D��9 6�����9' !�� 5���� �� :� ������� � ���������'

��� ����������� :�� ������ �� �� ������� �� 2. ��D:�� �� ������ �����

�� ��� � * 1 ��� �� �����7<�7������� 6#: ) *�� � #������ ���� � ������� 2- ��D

����9 ���� * �� ���� 10B1� � �� ������' ���� :� ������ � �� *���� �� ���

���� :��� � ��� ������� � � � ��������� ������������ :�� ������ � � H�;��

%G0... G)7��� �� 6H�;�� � &������ � �!9' ,����� �� 5����� �� �� ��� ��

�� �� �� ����� � ��� ���� ������ �� ��������� �������' = ��� 5���� ��� ��

������ �� 5����� �� ���������� � �5 6G=9 ���� ���� �� ����� � ��: ��

��� ���� ��������� ������� �� �� ���;*��� � ��� ����� �� ��� ���� � 7

��������� �������'

&+9+ ��$ ���������

3���� ,#! :�� 5������ ���� ���� ����� ��� * 3,=��� 6�����9 ������� * �� ��

�� ��������M� ��������' ,#! :�� ���� �� � -. �� �� �����7��� :��� �� ��� � *

.'.-J 6:D9 �� ������ ��������� �� 6G�*��9' 3���� ,#! :�� 4�� �� � ��� * �

-2- 4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*:

�������������� �� >�-0. � � �� ������ :�� ������ �� ����� � * �� >�-0.D>�-�.

�����' !�� ������ ��� >�-0.D>�-�. ������ ��� 1'A'

&+�+ �?0@-� ����(

,�� ��� �������� � � 8�, ������ � :� ������� � � 3������: � ������

3����� ����� 6������� %� �� � ) *�� �9' ,�� ��� �������� �� ,#! � �� ��#!

:�� ������� � � 1. �� ���� �� � ��5��� �� ��� � * 1 �* �� ����� ,#!� .'.@- �*�� ���*� 6�391-B1�/ 1'- �$ �� ��� ��5� ������� ����������� 6�#389� 1� ���

��� �������� ����� 6-. �$ 3���B���� �� �'�� 2. $ Q��9� 0'. �$ �� $*��-/ � �$ ��

�33� A'0 N �� ,#��� � �������� � � �� N �� $7$%? ��� ��� �������� 6����� H,%9'

3� ������ ��5��� :�� � ������ �� �-�� ��� 0. �� ' 3� ���*� ������� ������ ���

��� �� ������ �� ��#! ���� � �� ����� � ����;� � =%7- 6�� <<@9� =%7� 6�� <-<9�

=%71. 6�� ��09� =&#7� 6�� �1.9 � � �7���� 6�� -<@9 �� � �� ��������� 5�����

R����;�� *M * � �� � �������� ������ 6������ � ��'� 1AA@9' 3� 12 �� 8�,�� ��� � < �� �� ��� ���� � ��#! ������ ��5���� 1. �$ �� ������� ����� ��� � �

1'-2 N �� 3�4 �#! �������� 6����� H,%9' !��� � � ����� � �������� ��� �� A������ 2 �� � ����� * �� ����� � :� A��� ��� 2. �� 2��� ��� 2. �� @-�� ��� 2. � � � ����

@ �� �� @-��' ,����� �������� :� ����������� � 1'-J 3H) �*���� *��' ���

:� ���� � :��� ������� ������'

&+:+ ������������ ����0 �����A����� � @-� ������

3� ������ �� ����� �,#! 5������ �� ���� ��� ������ �� 8�, ��������

�� �� ����� � ����;� � ���� :� 4�� �� � ������� * ���� � � ���� ���

6���*� * � � � ������ ����� N?8M� ��G7�... 8�7���� �����9 �� ����� � ��

� ��������� � ������� :��� ���� �� �� ��� ������� �� �� �7���� * :���� :�

�� ����� �� �� ��� � ���' 3� ������ �� ��� �� �� � ����� � � ���� ����� ��

�� ����;� ,378�, ������� �� �� ������� �� * �7���� ,378�, �������� � � ��

����� �� � 5������ ��: ��������� ���7��������� � :�� 5����� �� �

��� ��*'

� �������

>+�+ -���-��� �� -���-��� �(��8�(��� �� ������� � ������ ��/���#����

����O��������� � ������ �� ����� �������� � � �������� ���������� ���:�

������ *���� ��� A�J � ��� 5���� ��' G��� � * �� �� ����� ��� ���7��������� �

:��� ���� � �� ���� �� � ������� ��� �� ������ ���� ���� � �� ���� � ��* ��

����* �� ������� �� � ����� ���� � �� 27��� ����������� ����� 6���� �� ���: 9'

3� ����������� ������ :� ������� :��� ����� ��� ��������� � ����� � ���� ��*�

5���� ����� � ���� :��� ����� ���������� 68,9' �������� ����������

������� ���� 8,7� ���� ��*� � �� <�� :; ����7� ����� ���������� � ���� �

�� ���� � ��* 6@ � .�..1/ &�*' 1�9� �� ������ �� �������� ���������� :���� ���

4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*: -2<

�� ���� � 6@ � .�1/ &�*' 1�9' I� �� ���������� ���� � :�� ������ 1. :;�

����7� ����� � �������� ���������� ��� �� ���� � 6@ � .�1/ &�*' 1�9� :���� ���������� ���� ���� �� 6@ � .�..1/ &�*' 1�9' 3� ������� ���� � :�� � �����

���� �� ��� ������ �� �� ���� ���� ����� ���������� ����� � ���� � �����

����������7 �� ��* ��� �� ���� � �� ���������� :��� 8, � ��* 6���� �� ���: 9'

3� ���� ���� �� �� ���� � :�� ��� ������ �� �� ���; �� ���������� ���� �

:��� ����� ���� � ��� �� 5���� �� 6&�*' 1�B�9' �������� � � �������� ���

��������� � ���������� � ���� � �� 8�!� ��:�� �� ��* ���� �� �� ����������

���� � �� �� �������� ���� :�� 20J ��:� 6@ � .�.19 6G= � �.9 ��� ���� ��

�������� ���� 6G= � @-9 ���� < :;� �� � ����� � � � �� ������� ���� 1. :;� ��

� ����� 6G= � �2 ���� G= � �A� ��������9'

>+&+ -���-��� ����� ��� ,������� �� #��� /( -���-��� ����,��0�����A� ����������

3� ����� �� 8,7���� � �������� ���������� ����� � * ���� � �����

�������� ���������� :� ������� < :;� ���� 8,7� ����� �� ��*� � � :�

��������� :��� ���� � ��* � �� ��� � �� � ��* ��� �� * ���� ��� 2 ����'

8�������� � �� ���� * 6����� ����������9 � � ������� 6������������9 ���� :���� �

������ :� ������� �� ���� ������������� ��*�� ������� * ��� � � � � �����' 3�

&�*' 1' &!�G ����� �������� �� �������� ��������� 6-�2� 1.2D:��9 ������� ���� � ���� �����

���������� �:� ' %��������� :� ��������� :��� 1. �*D:�� �� 8, 6���� ���9 �� 1. �*D:�� �� ��������� 6���� ���9 ��� 2 ����' !�����*��� !8� 6.�-2� 1.29 :� ���� �� ����� ��� ��������� �' 8����������

:�� ������ �� <�7������� � ���������� ���� * �� ���� 1� � �� ������' ?���� �� 5����� ��

�� � ��� ���� ������ �� ��������� ������' �@ � .�..1' �� ���� 5���� �� :� ������� :��� � 7

��������� ���� 6���� ���9'

-2� 4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*:

��� ��* �� ����� �������� ���������� ���� ���������� :��� 8�! ���� � ������

������� ������� �� � ��������� �� ����� 61 ���� <J9 6&�*' -� � � �9� :���� ���� ���

��������� � ����� �� �J �� ���������� :��� 8, 6&�*' -�9' 8�! �� 8,7���������

�������� ���������� ���:� � � ���� � �� ��� ��* �� ������������� ��� ����

������� ���� �����5������ 2.J �� �� ������������ � 8,7��������� ������� ����

��� ��� <J �� �� 8�!7��������� ����� ��� � �������� �� ���� 6&�*' - � � �9'

�������� ���������� ��������� :��� 8, �� 8�! ��� �� ��� * ���� �� ����

6���� �� ���: 9'

>+>+ -���-��� �� -���-��� �(��8�(��� �� �8� ��,������ � ������

������ �������

3� ����;� ��� � �� ����� � � � 78�!7 �� 8?�7��������� ����� ��������

� � �������� ���������� ����� � ���� <. :;� �� � ����� :�� � 7��������

������� : � ����� ���������� ���� 1. :;� �� � ����� ' 3� ������ ���:�

��� ������� ��� =%7- � � =%71. 6&�*' <!9' 3� � � ���� ��� 6� G���� -9 ��� �7���� :�� -�2 � ���� ��� ��������� �� � � �� ����� � � ���� ����� ��� =%7- � ���� ���

��������� � :�� ������� 61�� ���� 1-�9' = ����� *��� �� ����� � � ���� ����� ��� =%7

1. :�� A� ��� �� �������� ���������� ���� -.. ��� �� ����� ������ ����

6&�*' <H9' I ��� �� ���� 5������ �� =%7� � � =&#7� � ���� �������� ��

�������� ����������'

&�*' -' 3:�7����� ����O��������� � ������ �� &!�G7���� � ����� ���������� ���� ���������� :��� 8�!

�� ����� ���� � ��* ' %��������� ���� � ���� ����� ���������� �:� :� ��������� :��� 1. �*D:�� ��8, ��� 2 ���� �� � �*D�� �� 8�! ��� < ����' ����� ����O��������� � ������ :� ������� ��� * &=3�7

� ��7��� � � 8)7� ��7��� �� ���� �� � ������'

4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*: -22

� ����������

3� � ������ �� ����� 37��� ��������� ���7��������� � ��� ���� �� �

� ����� * ���� ���*���� ������� �������� � �� �������� � � �������� ���7

��������� �' H��� ��������� � ������*� ������� � �� � :��� 6��� ������ �� ���;���

$��7== ��������� 9 6�� * � � 8��;����� 1AA0� 1AA@/ G�������� � ��'� 1AA1� 1A�A/

+��;��� � ��'� 1AA�9 ���: ��� ����� ��� ���� �� ��*� 5������ � @2J ��

�������� ���������� �� �� ����� ���;� ��-A �� ������ �� � �� -2J �� ��

�������� ���� 6+��;��� � � ����� � 1AA09' = ���� :��;� : ���� �� ��������

�� ��� �� �� �������� � � �������� ���������� � �� ���� ���� � �*�� ��

����� ����������' >�� ������ ���:� ���� ����� �� �� ������ ����� �� ��� ��

������� � ���� ������*���� ����� �� ��: ���� ��� ��������� �' > ��

�������� ���������� ���������� � � ��� ���� ���� � �� � � �� ��� :;�

�� � ����� � :���� �� ��� ������ :�� � � �� � �������� ���� ���� 1.

:;� �� � ����� ' G������ ������ �� � ����� � !�"��;�M� ����� :��

&�*' <' ����;� 5������ � �������� � � �������� ����� ����������' 6!9 3� ������� ,#! ����

�������� � � �������� ����� ���������� :�� ����� � �� ,378�, �� ����� ����;� 5������ '

3� 8�, �������� :� ����������� � 1'-J 3H) �*���� *��' %� 1 �� ��� � ������ ��� �7���� � =%7-�� � =&#7�� �� - �� ��� � ������ ��� =%7� � � =%71.' 6H9 � ��������� ���74�� ������ � ������ �� ,378�,�������� �� �������� 6���� ���9 �� �������� ���������� 6���� ���9� :�� �� �� ������� � G���� -'

-20 4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*:

�������� ���������� ���������� � �� ���� ���� � 6+��;��� � � ����� �

1AA09 � � �������� ���� *�* � ����� ���� ���� ��' 3� ����� ��

��-A��*�� � �� ���� ������� ��������� :��� � �����D������ �������� �� ������ ��

�� ������ :���� �� ��-A��: 6+��;��� � � ����� � 1AA0/ G���� �� � ��'�

1AA09'

3� ���������� ��: �� ������ � �� �������� ���������� � � �*

6G�������� � ��'� 1A�A9� �� ���� ��� � ���� � � ����� 6�� �� �� � ��'� 1AA�9

������ �� ������������ �� � ��* ���������� � �� � ������ �� ��� ����' >��

������ ���: ���� ���� � ���� �� 8�! ��� �� ������ �� �� ���� �� �������� � �

�������� ����������/ ��� :� �������� ���� :� ��������� :��� ���� � ����

: ����� �� ������ � �� ������������ :��� �� �������� �� ����� � � �������

�� � �� ������ ������ 6+��;��� � � ����� � 1AA09' =� ��� � ����� ����

���� �������� ���������� �� * ���� ���� �������� ���� ��������� :���

����* �� ����� ��* � �� ��� � �� 5�* ��� =%7�� :���� �� �� ��� ��� ��

��� ��� �� ��������� �� �� :�� ����� �������� ���� 68������ � ��'� 1A��/ H���

� ��'� 1AA.9' >�� � ���� ������ ��**�� ���� ����� �������� ���������� �� ��

�4��� ���� � � ����;� �� * ��� ����� ������ ����� ������*� : �� �� 5����

���� � �4���� � � �� �� � �� �4� � �� �� ������ � ����� � � �� � O��������

������ ���� ���' =� �� ������� ���� ��75������ �� ��� � � ��� ������� � �

����� ��� �� �� �� ������ �� �� 3�, :��� ��� ���*� ���� ����� �� ����� * ��

������� � �� � ���������� ��* ��� ��� ������� �������� 6H��� � ��'� 1A�A9' 3���

������ �� �� :���� ��������� �� �������� �� ����� ����� ������ ���� � ��

��� � �� ��: � ��* �� � ������ �'

> �� �� ��� �� ���� � �� ����� ���� �� �� ������� ���� � �� � : ����

��� �� �� ����� * ����;� � 6����� � ��'� 1AA�9� ���� ���� O�������� 63�1

��� �C =&#7�� 3#&7S� =%7-9 �� � ����� �� � ��������� � � ������� ���� ���� �

63�- ��� �C =%7�� =%72� =%7A� =%71.� =%71<9 6$���� � ��'� 1A�09' >�� ������ ���:�

���� �� ��� ����� �� =%71. :� �� �������� ����������' 3��� ����;� �

���*� ���� �� ����� �� � � ������� �� 3�1 ����;� �� ���� ��� 37����� ��������*��

� � � ��* ��� �� * ���� 6&��� �� � � ��'� 1A�A/ $��� � ��'� 1AA<9' #�:����� =%71.

�� � �� � � ��7� O�������� �* � ������ * �� *��� �����; �� 3�1 � � 3�-

���� �� 6$������ � � %�� 1AA�9' =�� ����� ��� ���� 37���� � �����

������������ � ������� ��� ��� ���� 6�� 4�� � ��'� 1AA<9� � � �� �� � �� ��

*��:��� ����� ������ � � ������5�� �������� �� ��� � � #Q ���� 6�� � � +��� �;�

1AA1/ ����� � ��'� 1AA29' =� ���� � ���� �� 5������ �� $�� ����� == ������� �

H7���� � � �� �� ���� *��:�� � � ����� ������ � ������� �� ����� * ��� ����

��������� � �� *��� �� � ��� 6%� � � H����� 1AA�9' 3�; ��*���� ��� ������

�� �� ���� � :��� �� ��������� ���� �� � ��* � ���� �������� ���7���������

��� ��� �� ����� ���� 6+��;��� � 1AAA9 :���� �����*� =%71. ��������� ���

���������� � � ������ ��������� 6>�� � ��'� 1AA�9� �*���� � O�������� �� � �

���� �� ������5�� ���� � � ���������� � ����� ' = �������� ��� :��; ���:� ����

�� ����� ���������� ��������� �� ���� � �� �������� ����������� :����

5���� =%7- � � =%71.� � � ���� ���� ��� ��������� * ���� ���� � �����

�������� ���������� :���� 5���� =%71. � � 6�� � ���� 5� �9 =%7-� �����

�*����� * ���� ��� ��������� � � � �� ���� ���� � �*�� �� �� ����'

4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*: -2@

�������� �������

3�� ;� �� �� �� ,��� #��� 6=#),9 P ����� $���T� � 6N#!$9 ��� ��� ����

������� �' 3��� :��; :�� �������� � ���� �� �>#!��3 [email protected] $9� � � ��!8!

68!8==37=#--�2A�9 N#!$'

����������

H���� H')'� G��;�� � H'8'� ,�� ���;�� G')'� H���;���� G'�'� 1A�A' 3� �����*�� ���� �� ��-� ���� � � ��� �

37��� �������� ' ! ' ,' =��� ��' @� 2@AB2AA'

H�������� $'$'� 1A@0' ! ����� � � � ���� ����� ��� 4�� ������� �� �����*��� 4�� ����� �� ����� �

������� * �� ��� ���� �� ����� ��7�� �� *' ! ��' H�����' @-� -��B-2�'

H���� G'!'� 8��� $'� H "��� � 8'� ��O�� �'!'� 1AA.' &�4� �� � ������ �� ���� ���� 37���� ��� � :���

=%7� ���' =��� ��' 1@2� �-0B�<0'

����� � I')'� %� ��� � $'�'� H�������� ,'� %� ��� $'� 3� � �'�'� ����� �'�'� #������ G'� ����*����� $'!'�

1AA2' 3� �� ���� �� �������������� �� � ����;� 71. ������ 5������ � ���� ������ ;����� ����'

H���� �2� <2@@B<2�2'

�� � I'&'� +��� �;� !'� 1AA1' =%71.C � �� ������5�� 37��� ����� ������ ������' �' =��� ��' 1�@�

2-�B2<0'

������� �'$'� >�:���� )'� ������� #'� G����� � �'8'� &���������� �'$'� >�:���� ='8'� 1AA@' ! ���

��� �������� 7�������� ���� ������ ����� �� � ���� ����� ����;� * 5������ ' ?�' =��� ��'

=��� �������' 2�� -�@B<..'

����� � ,'I'� H������ %'$'� G:�� � G'%'� 1AA�' 37��� �����' ! ' ,' =��� ��' 10� -.1B--<'

&��� �� �� �'&'� H� �� $'I'� $���� � 3','� 1A�A' 3:� ���� �� ���� ���� 37���' =?' 3�- ��� � ���� �

������ ���� � ������ ����;� ��������� �� 3�1 ��� �' �' )5�' $�' 1@.� -.�1B-.A2'

�� �� ��� �'� ,��7%��� �'� + � �� ,'� ,������ �'� + � �� )'� 1AA�' =��� ��� �� ����� ����������

� ����� � ����� ��*�' ?�' =��� ��' =��� �������' 0�� <0@B<�1'

=� ��;�� �'� ��������� Q'� %� �� �'Q'� 1AA.' 8������� ����� �� � ����� ��� ������ ���� * ?���8������

�������� � ����� � ��*�' ,�' ?�' G��' �A� A-BA@'

�� 4�� � 3'� %��� � �'�'� ����� H'� $���������� Q'� 3������78��� � Q'� 1AA<' ���� =%71. �� �

������������ � ��� ���� 37���������� � � � � ������� �� =%7�7� ���� ���� 37��������� ��*����� '

�' =��� ��' 121� �2�2B�221'

%�� �'� H����� �'�'� 1AA�' = ����;� 71. �� �� ��� �� ��� ���� �� *��� �� � �� H7���� �� � ������

�� �� ���7- ����� ' �' ��� ' = ��' A<� �-�B�-�'

$���� Q'I'� >M������ !'� � I��� $������ ,'� ?����� 8'� $���� � 3','� 1AA<' = ����;� 71.' ! ' ,'

=��� ��' 11� 102B1A.'

$�� �7%���� �'� �����7���� � 8'� $���� �� !'� )������ � !'� 1A�0' �������������� �� � ������5�����

������� ���� �� ���� �� � ��*�� � $5���' !���' ?����' A1� --1B-<1'

$���� � 3','� ���:� �;�� �'� H� �� $'I'� ����� � $'!'� ������ � ,'%'� 1A�0' 3:� ���� �� ���� ����

37��� ��� ' =' � ���� ������� * �� ��� �� �� ������;� �������� � � ����� ����� �' �' =��� ��'

1<0� -<��B-<2@'

$������� )'� %�� >'� 1AA�' ,����� * �� 3�1D3�- ������*�' G�� �' �' =��� ��' �@� 1BA'

>��� H'3'� G���� ��� !'� $����� *�� �'� I�������� Q'�'� �� *� �'� 8����� )'� G��������� !'� ,����� �'�'�

1AA�' ?���� 7� ����� ���������� ����7���� �� 5��������� �������� ����� 37���� ���� �

�:� ' �' ?����' @-� ��00B��@<'

8������� K'� $�� "�� ,'I'� � ?���� �')'� G����� �'� 1A��' � ����;� 7� ������ ��� � ������ � ����

���� 37��� ��� �' #���� <22� 0�-B0��'

8������� $'�'� %� �� �'Q'� G����� �'�'� 1A��' 8�������� � � �������������� �� �� ���� �� � �������

����� :��� ����� 8H%' �' =��� ��' 1<<� <0�B<@2'

8������� $'�'� %� �� �'Q'� G����� �'�'� 1A�2' $��� � ��7�:� 3� � � 3� �� ���� �� � �������C

����������� � � ����� � ���������� � � ������5�� 37����' �' =��� ��' 1<�� <@B��'

-2� 4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*:

8������� $'�'� G�;�������� !'�'� ������ �'!'� ������ � ,'�'� +��;��� � &'!'� 1AA�' 8���� ��������

����� ����D���� ���� 5����� * 37����' ?�' =��� ��' =��� �������' �<� 2<B0-'

,������ $'�'� �� � ��7����*��� 8'� ,��7%��� �'� + � �� )'� $�� �7%���� �'� Q ��� G'� 1AA@'

%��� � � �� ��������� ����� �� ����� 5���� ����� � ���� :��� ����� ����������' �' ����' 8�����'

11@� -<@B-2-'

,��7%��� �'� )��� ���� H'� �� � ��� �'� + � �� ,'� ?���"�� ?'� �� � ��7����*��� 8'� + � �� )'�

1AA@' #�!�7�7-�<��� *������ "�*�� 5������ ����� ��� ��� ������������� �� �� ����� ����������%8$?' ����' H�����' 8������' 11�H� <-@B<<-'

,��7%��� �'� �� � ��7����*��� 8'� $� �� (�� %'&'� + � �� )'� 1AA<' 3� ����� ������5����� %8$

���� ����� ���* �� ������ 6�7-�<9 ������7�� ��� � ���������' !���' ?����' 1<<� 1A2B-..'

G��������� !'� ����� I'� ,������ $'�'� 1A�A' 8� ������ �������� ���� ��: ������ � � 5���������

�������� � � �������� ����� 37����������' )��' �' =��� ��' 1A� -.11B-.10'

G��������� !'� I��� �� &'� ,������ $'�'� 1AA1' ,��� * ����� 37���������� 5����� * ����� == ��"��

������������������ � ��* �' =��� ������*� 1�<� 1.-B11�'

G���� � �'!'� ���� �'$'� ,������ 3'�'� 1A��' ) �������������� ��������� ������ � � ��� �� �������

6��� �9 � ��*�� ��������� :��� � ������5����� � ����� ' ?�' ,�' 1--� 0B1.'

G���� ��� !'� ,����� �'�'� G��������� !'� 1AA0' &� ���� �� �������������� �� ����� ��������

5��������� 37����������' ���' =��� ��' 10�� -A1B-A0'

?���"�� ?'� ,��7%��� �'� �� �� ��� �'� ,������ �'� ��� ��� 8'� + � �� )'� -...' ����� ���� 5������

�� ������ ���� � ����� ��*� � ���� * �� ��������� ������' ����' H�����' 8������' H H�����' $��'

H���' 1-0� �12B�-�'

�� *� �'� 8��;����� ,'$'� 1AA0' 8� ������ ������ ����� �� ����� ��������� ���7��������� � � ����� � �

�������� ������' =��� ���*� �A� @0B�<'

�� *� �'� 8��;����� ,'$'� 1AA@' ����� ���� 5������ �� ��� ������ ��� *�� ����� ���7������

�� ���� �� ��������� ������' =��� ���*� A-� �2B2-'

+��;��� � &'!'� 1AAA' )5��������� ���D��� �����7������ 37����' ?�' =��� ��' =��� �������' @-� 22B

00'

+��;��� � &'!'� ����� � ,'�'� 1AA0' &� ���� �� � � �� ������ � ������ �� ����� �������� ����� ���D

��� �����7������ 37����' =��� ���*� �@� 2..B21-'

+��;��� � &'!'� 8������� $'�'� !����� H'� ���� *��� �'� 3�������;�� ='� #��;�� H'� ?�������� ='�

#��� � �'� !� � G'� G����� �'�'� %� �� �'Q'� H���� 8'� I��;�� �'� %� ,'� ����� I'�'� H������� =','�

G��������� !'� 1AA�' ,���� � �� � ����� �� �!� ����� :��� ����� ��� ��� �� ��� � � �� ���� ��

�:� �� :��;����' ?�' =��� ��' =��� �������' 0.� -A1B<.<'

4+ 5�������6 �� ��+ 7 '��������( ������,( �� ��������8�,( 9: ;&���< &�:=&*: -2A