Co-localization of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and wild-type huntingtin in normal and...

10
Co-localization of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and wild-type huntingtin in normal and quinolinic acid-lesioned rat brain Francesca R. Fusco, 1 Chiara Zuccato, 2 Marzia Tartari, 2 Alessandro Martorana, 1,3 Zena De March, 1 Carmela Giampa Á, 1 Elena Cattaneo 2 and Giorgio Bernardi 1,3 1 Basal Ganglia Unit, Laboratory of Experimental Neurorehabilitation, Santa Lucia Foundation I.R.C.C.S, Via Ardeatina 306, Rome 00179, Italy 2 Department of Pharmacological Sciences and Center of Excellence on Neurodegenerative Diseases, University of Milano, Via Balzaretti 9, Milano 20133, Italy 3 Department of Neuroscience, University of Rome Tor Vergata, Via di Tor Vergata 135, Rome 00133, Italy Keywords: cortico-striatal inputs, ELISA, Huntington's disease, immuno¯uorescence Abstract Loss of huntingtin-mediated brain-derived neurotrophic factor (BDNF) gene transcription has been described in Huntington's disease (HD) [Zuccato et al . (2001) Science, 293, 493±498]. It has been shown that BDNF is synthesized in the pyramidal layer of cerebral cortex and released in the striatum [Altar et al . (1997) Nature, 389, 856±860; Conner et al . (1997) J. Neurosci., 17, 2295±2313]. Here we show the cellular localization of BDNF in huntingtin-containing neurons in normal rat brain; our double-label immuno¯uorescence study shows that huntingtin and BDNF are co-contained in 99% of pyramidal neurons of motor cortex. In the striatum, huntingtin is expressed in 75% of neurons containing BDNF. In normal striatum we also show that BDNF is contained in cholinergic and in NOS- containing interneurons, which are relatively resistant to HD degeneration. Furthermore, we show a reduction in huntingtin and in BDNF immunoreactivity in cortical neurons after striatal excitotoxic lesion. Our data are con®rmed by an ELISA study of BDNF and by a Western blot analysis of huntingtin in cortex of quinolic acid (QUIN)-lesioned hemispheres. In the lesioned striatum we describe that the striatal subpopulation of cholinergic neurons, surviving degeneration, contain BDNF. The ®nding that BDNF is contained in nearly all neurons that contain huntingtin in the normal cortex, along with the reduced expression of BDNF after QUIN injection of the striatum, shows that huntingtin may be required for BDNF production in cortex. Introduction Huntington's disease (HD) is an inherited neurodegenerative disease characterized by motor dysfunction, cognitive decline and emotional and psychiatric disorder (Bruyn & Went, 1986; Wilson et al., 1987). The striatum is the major site of HD degeneration (Vonsattel et al., 1985; de la Monte et al., 1988), where projection neurons massively die (Reiner et al., 1988; Albin et al., 1990a, b, 1992). The genetic mutation in HD has been identi®ed as an expansion of CAG repeats in the IT15 gene which encodes the 348-kDa huntingtin protein (The Huntington's disease collaborative research group, 1993). The muta- tion is localized at the 5 0 end of the HD gene and is characterized by a CAG expansion beyond the normal 10±35 repeat range (Albin & Tagle, 1995). Wild-type huntingtin is widely expressed in bodily tissues, where it may exert a protective activity against various insults (Rigamonti et al., 2000; Ho et al., 2001; Leavitt et al., 2001). In the brain, huntingtin is involved in the intracellular vesicular traf®cking (Li et al., 1993; DiFiglia et al., 1995; Trottier et al., 1995; Wood et al., 1996). Interestingly, huntingtin is not expressed in all of the striatal projection neurons, whereas neurons which project to the striatum, such as cortical cells of pyramidal layers III and V, are all rich in huntingtin (Fusco et al., 1999). This observation led to the hypothesis that HD mutation might render cortical neurons destructive for the striatum. The importance of trophic factors in HD has recently gained momentum, and neurotrophins produced by genetically modi®ed neural stem cells have been successful in preventing striatal degen- eration in animal models of HD (Martõ Ánez-Serrano & Bjorklund, 1996). A speci®c involvement of one particular neurotrophin, namely brain-derived neurotrophic factor (BDNF), has recently been demon- strated in the pathophysiology of the disease: a loss of huntingtin- mediated BDNF gene transcription has been observed both in a mouse model of HD and in HD patients (Zuccato et al., 2001). In fact, BDNF has been shown to be synthesized by cortical neurons and released in the striatum by cortico-striatal anterograde transport (Altar et al., 1997; Conner et al., 1997), as very low levels of BDNF mRNA have been demonstrated in the adult rat striatum (Salin et al., 1995). Because the mutation of huntingtin could lead to striatal degeneration through impairment of BDNF production, and normal huntingtin is proven to be, at least to some extent, necessary for corticostriatal neurons to express BDNF, we hypothesized that huntingtin and BDNF are con- tained in the same neurons. To test this hypothesis we investigated the cellular localization of BDNF among huntingtin-containing neurons in cortex and striatum of normal rat brain. European Journal of Neuroscience, Vol. 18, pp. 1093±1102, 2003 ß Federation of European Neuroscience Societies doi:10.1046/j.1460-9568.2003.02844.x Correspondence: Dr Francesca R. Fusco, as above. E-mail: [email protected] Received 15 January 2003, revised 8 May 2003, accepted 20 June 2003

Transcript of Co-localization of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and wild-type huntingtin in normal and...

������������� �� � ����� ���� �� � ����� ���� �������� �������� ����� � � ��� �� �������������������� � � ��

� ������ ! �����"# ���� � $�����"% &� ��� '� � �"% (������ � &� � ��"#") $�� �� &� ��"# �� ���� *�����+"#

,��� �����% ��� *�� ��� �� � ��#")������ ����� ��� ���������� �� ����������� ���������������� ����� ���� ��������� � ! " " � #� $������� %&' !���&&�() �����*+��������� �� ,������������ ������� ��� "����� �� ���������� �� �������������-� +������ ��-����� �� .���� #����/����� ) .���� *&�%% �����%+��������� �� ����������� ��-����� �� !��� 0�� #����� #� � 0�� #����� �%1 !��� &&�%% �����

��������2 ������3������� ����� ����$ 4�������5� ������ �����6����������

(�� ��

-��� �� ������������� � ����� ���� �� � ����� ���� ������ ��� ��� ���� ��� ��� ���� ���� � .����/� ��������.�� 0$����� �� ��! �%11#� �������" ���" 23)42356! 7 ��� ��� ���� �� ���� �� ��������� � �� �� ������ ���� �� �� �� ���� �8 �� ������� � �� � ���� 0(�� �� ��! �#339�����" ���" 5:;45;1< ��� �� ��! �#339� � ������ " ��" %%3:4%)#)6! .� � ������ �� ������� ���������� �� ���� � ������������ �� �� � � ��� � � ��< �� ������������ �����=�� ������ ��������� �� ����� �� ���� � � ��������� � �33> �� �� ������ �� �� �� ��� �� �8! 7 �� � ����" ����� ���8� ����� � 9:> �� �� �� ������ ����! 7 � ��� � ���� �� ���� ���� �� ���� �� ������ � ������ ��� �� � �?@������� �� �� ��" ����� � � �������� ����� � .� ����� ���! �� �� �� �" �� ����� ������ � ����� �� � ��������� ������� � �� ���� �� �� ��� � ���� �8����8�� �����! ?� ��� � � ��A ��� �� � ,-7@( ���� �� ���� �� �� �B��� ��� ������� �� ����� � �� �8 �� ������� ���� �CD7���������� �������� ��! 7 �� ������� � ������ ���� ��� �� ��� ���� ����������� �� ������ ��� �� ��" �� ����� ����� ���" ���� ����! '�� A��� �� ���� �� ������ � �� �� ����� �� �� ���� ����� � �� � ��� �� �8" ���� ��� �� ������ �8� ����� �� ���� ��� CD7� �E���� �� �� � ����"����� �� ����� ��� �� ���� �� �� ���� � ������ � �� �8!

7 ������

����������� ���� ��� � �� �������� ���������������� ����

������������ �� ����� ���������� ��������� ������ �� ���������

�� ���������� ����� ����� � ����� � !"# ����� �� ��$� � !%�$

&�� ������� � ��� ��'�� ��� �� �� ����������� (������� �� ��$�

� !)# � �� *���� �� ��$� � !!�� +���� ���'������ ������ �������

�� ,����� �� ��$� � !!# -���� �� ��$� � .�� �� � /�$ &�� �������

�������� �� �� �� ���� �����0� � �� �1������ �� 2-3 ������ ��

��� 4&�) ���� +���� ����� ��� 56!78�� ���������� ������� &��

����������� ���� ������������� ������� ������ � 5�$ &�� ����7

���� � �������� �� ��� )� �� �� ��� �� ���� �� � ������������ �� �

2-3 �1������ ����� ��� ������ �.95) ������ ����� -���� �

&����� � )�$ ���7���� ���������� � +���� �1���� �� �����

����� +���� �� ��� �1��� � ���������� �������� ������ ������ �����

,�������� �� ��$� /...# �� �� ��$� /..�# :������ �� ��$� /..��$ 4� ���

������ ���������� � ������� �� ��� ������������� �������� ����0�8���

:� �� ��$� � 5# ��;����� �� ��$� � )# &������� �� ��$� � )# ��� �� ��$�

� "�$ 4������������ ���������� � ��� �1���� �� ��� �� ��� �������

���'������ ������� +����� ������ +���� ���'��� �� ��� ��������

��� � �������� ���� �� �������� ����� 444 �� (� ��� ��� ���� ��

���������� ;��� �� ��$� � �$ &�� ���������� �� �� ��� ��������

���� �� �������� ����� ����� �������� ������ ��������� ��� ���

�������$

&�� ���������� �� ������� ������ �� �� �� �������� �����

��������� �� ������������ ������ �� ����������� ���0�

������ ��� ���� ���� ���� ������� �� ���������� ������� ����7

������� �� ������ ���� �� �� *���<=���7>������ � �'��8����

� "�$

- ����0� ����������� �� ��� ���������� ������������� ������

�����7����� ������������ ������ ��?;�� �� �������� ���� ����7

����� �� ��� �������������� �� ��� ����@ � �� �� ����������7

������ ��?; ���� ������������ �� ���� ������ ���� �� � ����

���� �� �� �� �� �� ������� A������ �� ��$� /..��$ 4� ����� ��?;

�� ���� ��+� �� �� �������� �� �������� ������ �� ������ ��

��� ������� �� �������7������� ���������� �������� -���� �� ��$� � %#

2����� �� ��$� � %�� � ���� ��+ ����� �� ��?; �,?- ���� ����

��������� �� ��� ���� ��� ������� >���� �� ��$� � )�$ ������ ���

�������� �� ���������� ���� ��� �� ������� ����������� �������

���������� �� ��?; ���������� �� ������ ���������� � ������ ��

��� �� ���� �� ��� �1����� ������� ��� �������������� ������ ��

�1��� ��?;� +� ���������� ���� ���������� �� ��?; ��� ���7

����� �� ��� ��� ������$ &� ��� ��� �������� +� ���������� ���

�������� ������������ �� ��?; ����� ����������7���������� ������ ��

�����1 �� ������� �� ������ ��� �����$

������ ������ �� ����������� ���� ��� � ���������� ���� � ��������� �� ������ ���������� ���������

��@�.$�.6"B'$�6".7 )"!$/..5$./!66$1

�����������@ �� ;������� ,$ ;���� � �����$

C7����@ �$����D����������$��

����� �� �! �����" ����� �� ���� � #�" ����� ������� �� ��� ����

&�� E��������� ��� FG4?� ������� ����� �� ������ �� �� � ��������

��� ���� �� ��� ��� �� ������ �� � ������� �1����� ��� ����������� ��

������� ���'������ ������ ������� �� ��� ����� ���� ���� �� ��$�

� !"# -���� �� ��$� � .�� �# ���� �� ��$� � �# ,����� �� ��$� � 5#

;�������72����� �� ��$� � 6� � %� � !�$ &� ������ ������� ���

����������� ���+��� ���������� �� ��?;� �� �� ���������� ���

������ ��������� �� ����� �1������ �� � �������� +���� ��� �������

� ��������� ������������ +� ���� ��� �������� ���������� ��

���������� �� ��?; �� ��� �������� �����1 ����� FG4? �����$

H�� ���7����� ������I��������� ��� +� ����������� �� �

E����������� ������ �� ���� ��?; �� ���� �� ������7���8�

������������ ��� C:4>-� �� ���������� �� ���� �� ������

�������� ������E��$ *�������� +� ���� ��� �1������ �� ��?;

����� � �������� ���������� +���� ������ ��� �1������1�� �������

������������ �$�$ ��� ����������� �����������$

&�� ���� �� ������

������������ �������

*��� ����� ��� *����� >$ J��� ��C���� ,C� 4����� +��� �� ��� ���

���$ -����� ��������� ������ +����� /..9//. � +��� �������

�������� +��� ��������$ -�� ���� +��� ������� �� ���������

+��� C������� 2��������� 2������ ��������� �� /6 ?������� � !"

!"B". BCC2�$

������

&�� ������� �������� �� FG4? ��'������ +� �������� �������� ��

��� �������� ������ �� ;�������72����� �� ��$� � 6�$ ����I��

�. ������ +��� ����� ����������� +��� � ��1���� �� 8�������

.$""�:B8�� �� 1������� .$�"�:B8�� ��������� �����������7

������� �� ����� �� � ���� K��� 4�������� &�'����� 2-�

�������1�� �������� �K ..�$ FG4? �..�*# >����� >� :����

*H� G>-� +� ��'���� �� � ������ �� ��: ���� ��� ����� ������� ��

��� �����+��� ���������@ ��������������� �.$%# ����7�������� �5$.#

���7�������� �)$.��$ ;��� ��� +��� ����� ����������� ��

���7������� �� �� �� � �������$ -���� ��������� ������ +���

���� ��������� +��� ���� ���� �� ��� �� +���� �� ��$���% ���

"+��8$

����� ����������

>�1 +��8 �����+��� FG4? ��'������� ����� ��� �+� ������ ��������

�+� ���7������� �� ���� FG4?7������� +��� ������������ ������

���� ��� ��������� +��� ".�: �� ����� ������� ����������

.$.)�: �������� �����+� �� /..�: �� 6L �������������� �� �����

�������$ &�� ����� +��� ������ �� ���01� ��������� �� �6 �2������������� �� �.L ����� �� /.L �������� �� .$�* ��������

������ J�� +��� ���� ���� .$./L ��� 6! � �� 6 �2$ ����� +���

������� ������ �� � ����� ��������� �� 6.�� ����8��$

>�1 FG4?7������ ������ �� ����� ������� +��� ������� ����7

������� �� ���������$ ����� +��� ������ �� ����� ������� ��

������ ������ �� ���� ���������$ >������� ���� ����� +��� ������

������ �� ��E�� �������� ��� C:4>- �������� �� ������ ��������$

������������ ��� ������������������ ���������� �� ����������� ��� �������� ������

?�� ������� +��� 2���� (����� +� �������� �� � ���� �� ������

���� ���� ���$ >�����7����� �������� ������ ?�G?� ������I���7

������ +� �������� �� � ������� ���� ���� ���� ��� �� ��

��� �������� ���� ����� �� �������� ����� 5� ) �� " �� ���� ���7

������� �� FG4?7������ ������$ ����I�� ������ +��� ��������

+��� � ���� ?�G? ������� 2�������� &�������� 2-� G>-� �� �

� @ /.. ������������� �� .$�* J� ���������� &����� M7�..� .$5L ��

���� ����� .$./L ��� %/ � �� 6 �2$ >���E������� ������ +���

���� ����� ���� ��� �)��� �� .$�* J� �� ���� �������� +���

�������� ������� / 2�/�7���'����� ������� ������� ��� / � ��

���� �����������$ &��� +� ������ �� �������7����� ����

���������� +��� 3C:7*HG?&&* �� �1����� ���� �� ���7����7

�������� I��������� ��������� A�� -1��8�� /�� �� � ��������

���� ������� ��������� 2:>*# A�� :>* )�.� +� �� ��

��E���� ��� �����$

;����������� �����7����� ������������������ +��� �� ���� ���7

����7 �� ������ -*J7�������� ������������� +��� � ���������

+����� �� 5/ 8�� �-,JJ75/� ������� +� �������� ��� ���

���������� �� ��� ������� FG4? ����� *���<=���7>������ � �'��8����

� "�$ &�� ��������������9����������1��� ������E�� +�

������� � ��������� ������ ;��� �� ��$� /..��$ ����I�� ������

+��� �������� +��� � ���������� ������� ������� ������ �-,JJ7

5/ �� � � @ /.. ������������� �� .$�* J� ���������� &����� M7�..�

.$5L �� ���� ����� .$./L ��� %/ � �� 6 �2$ >������ +��� ����

���� ����� ���� ��� �)��� �� ���� �����������$ >������ +���

���E������ �������� �� ���� ����������� ������� ������� �� �

� @ ). ������� �� .$�* J� ���������� &����� M7�..� .$5L �� ����

����� .$./L ��� 5 � �� ���� �����������$ >������ +��� ���� +���

�� J� �� �������� �� � ��1���� �� ����� �� ������ (�������� -�2

K��� (������ ����������� 2-� G>-� ���� �� � � @ �.. ������� �� .$�*

J� ���������� &����� M7�..� .$5L �� ���� ����� .$./L ��� .���

�� ���� �����������$ -���� +����� �� J�� ������ +��� �������� �� �

J� ������� ���������� �������������� �� ���� ��� �.��� �� ����

�����������$ -���� ������ ���� �� J�� ��� ������� ���� +�

������ �� �������7����� ���� ������� �� ���������� +���

C�8��� H$ K����� 3��� � 2�� ;�������� 3�������$

�������������������

;�� ���� ���������� �� ��?; ��������� ������� ������ ��������

������ ���� �� ������ ���� ������� �� ��������� ����

������� +��� �� �� ���0�� ��� ����0���� �� ��� ����������7

�������� ���������$ >������ +��� �������� +��� � ���8���� �� ����

�������������� ��� /�""# 2�������� &�������� 2-� G>-� �� ������

����7��?; >���� 2���� >���� 2���� 2-� G>-�# ��� ������ +���

�������� +��� � ���8���� �� ���� ����������� ������ ���������

2�-&� ��� 5.) 2�������� �� ������ ����7��?; �� ��� ���

���������� �� ��?; ����� ����������� ������������ �� � ���8����

�� ���� ���������� �1�� ������ ?H>� 2�������� �� ������

����7��?; �� ��� ��� ���������� �� ��?; �� ��� ����������9

����������� N9?H>7���������� ����������� ����$ *�������� ��

������� ��?; ��������������� �� ������� ����������� �� ���� ��

���'������ ������� +� �������� ��� ���� +��� � ���8���� �� ������

����7��?; >���� 2���� �� ���� ������������ 2-:�� >�����$

-�� ������� ������� +��� �� �� � � @ /.. ������������� �� .$�* J�

���������� &����� M7�..� .$5L �� ���� ����� .$./L ��� %/ � ��

6 �2$ >������ +��� ���� ���� ����� ���� ��� �)��� �� ���� ���7

��������� �� ���E������ �������� +��� � ���8���� �� ���� ����������

2�/7���'����� ������� ������� �� ��8�� �������� �����������

�������� ������������� &,4&2�7���'����� ������� �������

���� O��8�� 4������������� ��� 3����� J-� G>-� ��� / � �� ����

�����������$ >��� ������ +��� ������ �������� �� ��� �������

����� �����0������ ����� &>-&*� ?C?� ������ *-� G>-�$

����I�� ����� ��� ���������� +��� ������� �������� ������ +��� ����

����� ���� ��� �)��� �� .$�* &��9�2�� ��%$)� .$�)* ?�2�� .$.)L

&+���� /. &?&� ������ �� �������� +��� �������� �����������

������� �������� � @ �.. �� .$�* &��9�2�� .$�)* ?�2� ��

.$)L ����8��� ������� &?�� ������ ��� ".��� �� ���� �����������$

>���E������� ������ +��� ���� ����� ���� ��� �)��� �� &?&

������� ���� �������� +��� �����������9�������� ����1���

�. 6 ;$ ,$ ;��� �� ���

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

����� � @ �.. �� &?� ������ �����+� �� ����� ���� �� &?&# ������

+��� ���� �������� +��� � @ �. +��8��� ������� I��������� �������

�� �����0������ �������� ���� �� &?& ����� ���� ��� �)���� �� ����

�������� +��� � @ ). ���� ���������� 2�/ ��� / � �� ���� �����������$

&��� +� ������ �� �������7����� ���� ���������� +���

3C:7*HG?&&* �� �1����� ���� �� ���7������������ I����7

����� ��������� A�� -1��8�� /�� �� � 2:>* A�� :>* )�.�

+� �� �� ��E���� ��� ��� �����$

����������� �� ����� �������

:���� ���� ������ ���� +��� ������� �� ��� ������ �������� ��

��������� �.L# &��9�2�� /)�*� ��%$)# ?�2�� �).�*# &����� M�..�

�L# C�&-� )�*# C3&-� ��*# ���������� +��� �������������7

�������� I����� J*>;�� �..�*# �:7������������� �&&�� ��*# ��

������� ��������� ���8����� � @ �.. >�����$ ;�� ������ �� ���� �����

�.�: �� ��� ������ +� ��$ >����� +��� ���������� �� ��� ����

������� �� ���������� /.��� �� 6 �2 ��1 ��� ��������$ &��

���������� +��� �������� �� ������� ������������� �������� ����

��� ������ ������� ��� ������$ >����� +��� ���� �� �!. �2$

����� ������������� �� !"

>����� +��� ����������� ������� �� ���������� �)��� �� 6 �2��1 ��� ��������$ &�� ���������� +��� �������� �� ���� ��

�5. �2$ >����� +��� ���� ��� ��?; ������� +��� ��� ��?;

��������� ���� J�������$ -�� +��� �������� � ������

�� ��� ������������$

#������ $�������

CE��� ������ �� ������� �..��� +��� ������� �� "L >�>7J-3C

�� ��������� �� �������������$ ���� +��� ���E������ ����8� ��

)L ���7��� ��� ���8 �� &��7������� ����� +��� &+��� /. &�>7&@

&��� /.�*� ��%$)# ?�2�� )..�*# &+��� /.� .$.�L� ��������� ��

6 �2$ ���� +��� ���� �������� ��� 5 � �� ���� ����������� �� �������

������� �������������� ���/�"" ������� � @ )...�$ -���� +�����

+��� &�>7&� �������� +��� �1��� �� �������� ����1���7

���'����� ������� ������� ��� � � �� ���� �����������$ -���7�7������� >����� +� �� � � ������� ��� ������ �� ��� ���$ 4������7

������� ��� +��� ������ ���� ��� ������� ����������������

���� C2: -������� �������� �� ��� ������������� ����������$

%������������ �� ��$�� ��$������

&�� �����7������� ���� +� �� �� �������� ��� ���������� ��

��?;7�������������� ������ ���� +��� ������� ��� ���������� ��

�����1 �� �� ������� �� ������� ���� �� �� �����1 �� ��� FG4?7

������ ���$

;�� ��� ����������9��?; ��� ��������� �� �����1 �� ������� ����

�������� ������ �� ����� 5� ) �� " +��� ������ �� ���� ���������

�� ���� �� ����� �$.7��7E���� �������� ��������� 0�� �� ���� ��

���� �$ >�����7����� ������I��������� ��� ��?; �� �����1 �� ������ ��� �����$ 2������� ���� ������� ��������� 2:>*� �����$ -� - ��+ ��+�������0������ ����7�����1 �����$ �� 2������� ����� 59) ��+ ��� ������ ������ ���������� ������������� ��� ��?; �� ��� �������� ������$

���� �$ ��?; �� ���������� ��������������� �� �����1 �� ������� �� ������ ��� �����

,�����

��?;7�������������

��?;����������������

����������7�������������

��������������������������

��?;� �������������������������� L�

2������� ����� 5 66! ��� 65" ��� %$52������� ����� ) 6) ��� 6)) ��� $�2������� ����� " 5)/ ��� 56! ��� !$ >������� %�/ �� )5% �� %)$6

2���@ �������� ����� �� ������ ��� ��/$ 4������� �� �������@ ��� ������� �������# ���� ����� �������$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��?; �� ���������� ��7������������ �� ��� ����� �. )

�+� ������ ���� �1 ���$ &�� �������� ����� �� ��������������

������ ��� ��/ +� ��� �������$ 4� ��� ��� ���� ������� ���������

��� ���������� �� ��?; +� �1����� �� ����� ������� E����

�������� ��������� 0�� ��� ���7�������� ��� ������� �� ���

������ ���� �$.�� ��� �� ���� �� �� ��� ����� �� ���� �� �����

������������ ���� ������# ��� ������ �� ���������� ������

������� ��� ��?;� �� ���� �� ��� +��� ������$

- E����������� ���������� �� ��?; �� ���������� ����� ���������

�� ���� �� ���������� �� ������� ������ +� ��� �������� �� ���

FG4?7������ ������ �� ������� ������ �� ��� ���� ��+ ����������

������������� ������$

4���� ������ �� ��?; �� ����������� �� ?H> ����������� ��

2-:� ���'������ ������ +� �������� �� ���� �� ��� A��

�������� ��������� :>* ���+��� �� �������� ��� �������� ��

I�������� ��?; ��������������� �� ". 2�-&7��������������

������� ". ?H>7�������������� ������ �� �� ". �����7���

2-:�7�������������� ������� ����������� ������ �� �+� �E�����

���� 0�� �� ���� ��������� �� ���� �� ����� ������������ ����

������ �� ���� �� 0�� �������$

����������� ��������

;�� ��� ��������� �� �������� ����� ���+��� ������� �� ������� ��

FG4?7������ ������� ��� ������ �� ���� ����� ������� ���� ��

����� ���������� FG4?7������ ���� �� ����� ���������� +��� ���7

���� �� ���� �� -?H(- +��� &�8��� ��� &�� ������ �� ���� ��

>J>> ��������� ���+��� ��� ����+� ������ $.$�� ������ '� .$..)$

;�� ��� ������ �� ��� ����������9��?; �����7����� ������7

I��������� ���� ��� ����� ������ �� ������ �� ���� 0�� +�

���� /$ 4�����I��������� ��������� ��� �����7����� ������������ ������ ��?;� �� ���������� ��� �� ��� ��?; �� 2�-& �� ������ ��� �����$ 2:>* �����$ -92� 2������� �������� ������ ���� ������ �1��� ���� ��?; �������� �� ����� I��������� ���� 2�/ ���������� �� ���������� �������� �� ��I��������� ���� ��������9&>- ��������$ �9;� - 0�� �� ���� ������� +��� ���� �����7��� ������ ������������ ��?; �� ����������$ ?��� ���� ������� �� ��?;7������� ������ ��� ���� �� ���������� ����+�$ 394� ������7����� ������I��������� ��� ��?; �������� �� ����� I��������� +��� 2�/�������� �� 2�-& �������� �� �� I��������� +��� &,4&2 �������� � ��+� �� � ���� �����0������@ � ����� ����������� ����������� � ������� ��� ��?;$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

�. " ;$ ,$ ;��� �� ���

������� ���� ��� 0�� �� ������ �� ������� ����� �� � ���� ������

�� ����������7�������������� ������ ������������ �� ��� ���������7

��� ��?;$ �� ������� ��� �+� ���� ����� �� ������ ����������

�$ ��� ���������� ��?; +��� >������ �7���� ������ '� .$..)$

&�� ��� ������� �� ����� ������ �� ��?; ��������������� ��

��� ���� �� ������� ����������� �� �� ��� ���'������ ������ +���

������� �� ���� �� -?H(-+��� &�8��� ��� &�� ������ �� ����

�� >J>> ��������� ���+��� ��� ����+� ������ $.$�� ������

'� .$..)$

&�� ��������� ������ �� C:4>- �� ��?; �� ������� �� FG4?7

������ ������ +� �������� ���� � ���7+�� -?H(- �� ���� ��

>J>> ��������� ���+��� ��� ����+� ������ $.$�� ����� �������

������ '� .$..)$

�����

4� ������ ��� ������ ��� ������I��������� ���� ��+� ���� ����

��?; �� ���������� ������� +��� ������ ���������� ��� ��������

�����1 �� ������� &���� ��$ ��?; ��+� ����8����� ������������

+��� � ����� �������������� ������ �������� ���������� ����

�������� ��� �1������ ��� ���� ������ ;��$ ��$ ��?; ��� ������

� ����� �� ����� ��������������� �� ��� ��������$ &�� ����������

���������������� ������� +� 0���� �������� �� �������� ���� ���

����8����� �������� �� ���1���� ������$ >������ ��������� ���7

���� +��� ������ +��� ���� ��� �����7����� ������I���������

����� ���� 2�/7 �� &,4&27���'����� ������� ������� �� ���

&>- ����� �����+� �� ���������� +��� 2�/7���'����� �������

�������$

>�������� �� ��?;� ������ +��� ���� �� ���������� ����������7

������$ - ������� ��?; ��������������� +� ������ �� ����� �� /

�� 6 �� ����� ��������� �����1� +����� ����� 5� ) �� " ��+� �

������� �� ���� ��?; ��������������$ 4������������ ��� ������7

���� +� �������� �� ���� �� ����������$ 4� ����� +� ���� ���� ������ ���

�������� �������� ������ �� ����� 5� ) �� " ��7�������� ����������

�� ��?; &���� �# ;��$ /-92�$ ;����������� �������� ���� ����

������ ��+ �� ������� ��������� ��� ��?; �� ��� �����1 ���

��+� � �� ������ ������� ��� ����������$ 4� �������� ����� 5� ) ��

" +� ������ ���� %$5� $� �� !$ L� ������������ �� ����

���������� ��?; ��� �������� ���������� '� .$..� �� ��� �����

������$

4� ��� ������� ������� +� ������ �������� �� ���� ��?; �������

�� ���� ������� ������������ �� ��� ���� ������$ 4� ��� ����� ��?;

+� �������� �� ������ �� ������ ���� ���� �� +���� %)$6L�

�������� ����������� +���� ��� ��������� /6$"L +��� ���� ��

���������� ;��$ /�9;� '� .$..�� �H?; �������������� ������

���������� �$ ��� ���������� �����������$ 4������������ ��?; ����7

������ +��� ���������� �� ��� �����7��� ������� ������ ��������7

����� ��� 2�-&$ ?����� ��� $�/L� 2�-&7������������� ������

�� ��� ������� +��� ��� ������� ��� ��?; ;��$ /394� '� .$..��

2�-& �������������� ������ ���������� �$ ��� ���������� �������7

����� +����� ����� ����� E������ %"$5L� �� ��� ?H>7��������7

����� ����������� �������� ��?; ;��$ 5� '� .$..�� ?H>

�������������� ������ ���������� �$ ��� ���������� �����������$

4���� ������ �� ��?; ��������������� ���0��� ���� �����������

����������� +��� ���� �������� ����� ��� ��?; '� .$..�� ����

��� ����� ���� ��� ������� ��� 2-:� ;��$ 6�# ��� +� ����� �� �

���� �1����� ��� ?H> ������������ �������� ��� ��������� �� �����7

���� �������� ������� �� ���� �� ����� ���� ������ +� ���

����������� ����0����$

&�� �1���� �� ������� ����� +� �������� �� �-,JJ75/ �����7

������� ���� ;��$ )-� � +��� � �� ?��7����� ������$ ?��

������� �� ��� �������� �����1 ���7 �� ������������� �� ��� FG4?

������� ����� � ��� ��+ ��� ������ ��������� �� ��� ��������

���� 5$ ����7����� ������I��������� ��� ��?; �� ?H> �� ��� ������ ��� �������$ 2:>* �����$ -� ��?; ������������� �������� �� ����� I������������� 2�/�# �� ?H> ��������������� �������� �� �� I��������� +��� &,4&2 ��������$ 2� *���� 2:>* �����$

���� 6$ �������� ��+��� ��� �������� �� ��?; ������I����������� ����������� ����������� 2�-&� ������� �� 2-:�7������������� ��7���7��� ���� ���'������ ������ '� .$..�� -?H(-� �� �� ?H>7������7������� ����������� ?H>�$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��?; �� ���������� ��7������������ �� ��� ����� �. %

������ ������� �� ��� ���7������� ������ ;��$ )�9��$ H��

���� ����� �������� �� ?�G�7�������������� �������� ���0���

��� ����������$ 4� ����� +� ������ �� ����������� ����0����

��������� �� ��� �������� �������� ����� ���+��� ��� ������� ��

������� �� ������ �� ������������� �� ���������� �� ��� FG4?

������ ;��$ "�$

H�� ���7����� ���� �� ���������� �� ��?; �� �������� �����1

�� FG4?7������ ��� ��+� ����� �� ��� ���������� �����1� +����

��?; ��������������� +� ���� ������� ���� ������ ���������� ����7

������������ +� ���������$ &�� ������ �� ���������� +� �������7

����� ������ �� ����� ) �� " �� ��������� �����1� ���� ���� ���������

���'��� �� ��� �������� �� �� � ���� �1���� �� ����� 5 ;��$ %�9;�$ &��

���������� �� ��������������� �� ��� ������������� �����1 +� ���7

������ ����������� ��� ��� �� ������� ��� ;��$ %-92�$

H�� �����7����� ������I��������� ���� �� ��?; �����

����������� ������������ ������� ��� 2�-&� �� ��� FG4?7������

������ ������� ���� ���� �������� ����������� �������� � �������

������ �� ��?; ;��$ %394�$

H�� ��� +��� ���0��� �� ��� C:4>- ��� �� ��?; ��������

��������� ������� �� FG4?7������ ������ ;��$ !�$ &�� ���

��+� ����� �� ��� �����1 ���������� �� ��� FG4?7������ ��������

���� )$ -� :�+7��+�� ����� �� � +���� FG4?7������ ��� ����� ������� �-� ������������������ ��� �-,JJ75/ ��+��� ��� �1���� �� ��� ������� �����$ ?������� ��� ���� +���� ���8 �� ��� ���� +� ��� �� � ����� +���� +� ������ ��������� �� ����� ��� ��������� ������������� �� ��� FG4? ��'������$ �9��&�������� ����� ��������� ����� ��+��� ��� ?��7����� �����1 �� ���7������� ��� ��� �� FG4?7������ ��� ������������� 2� �� ���������� �����1 ��@ ����������� �� �������� ����� �� ��� ������� � ������$

���� "$ �������� ��+��� �������� ����� �� �������� ����� 5� ) �� "������ �� ���� ����� �� ?�G?7������������ ����$ :��� �� ����� ��������� ���7������� �� FG4?7��'���� ��� +��� �������$ ?� ���������������0���� ��������� +� ������ -?H(-�$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

�. ! ;$ ,$ ;��� �� ���

��?; ����� +��� ����0������ ��+�� ���� �� ��� ������������� �����1

'� .$..)�$ &�� ����� �� ��?; �� ��� �����1 �� ������� ������ +���

������ �� ��� ��� ������ �� ��� ������� ������������� �� ��� �����

�� FG4?7������ ��� ��� ��� ��+��$

&�� ������ �������� ������ ��+� ���� ���������� +� �����

�� ��� ��� ������� ���������� �� ��� FG4? ����� �� ���� ������ &���� /

�� ;��$ �$

���������

J������ 0���� ���� ��+� ���� ��?; � ������ �1���� �� �����1

������7�'��'���� �� ��$� � )# -���� �� ��$� � %�� �������� �����

����������� ���� ��+� ���� � ������� �� ��+ ��?; �����������7

���� �� ��� ����� +��� � ��������� �� ��� �������� �������� �� ��?;

����� �������� ����� 2����� �� ��$� � %�$ H�� ��� ��+ �

+������ ��� ������ ��?; ���������� �� ��� �����$

�� ������ � ������ ������ ��?; �������������� �� ��� ���7

����� ������ �� ����� 5� ) �� "� +����� ��� ����� ����� ����� �

������� �������$ 4� ����������� ��� � ��� 0�� ��� �� ��+� �� � �������

������ ��� ���1������ �� ���������� �� ��?; �� ��� �����1$ >���

���������� ������ ������� ������� ���� ������ ���������� � ����7

��� ��� ��?; ��������� �� ��� �����1� �� ���� �� �� ��?;� ���

��������� �� +���� �� �� ���� ������� ������ �� ����������� ���

����� �� ��� ���� 2������� �� ��$� /..��$ &�� ��������� �� ������

����� ���� ��?; �� ���������� ����� ������� �� ��� �1������1��

����� �� �� �� ��8�� ���� ������� ,������ � !�$ &�� ����������

���� %$ -9;� ����7����� ������I��������� ��� ��?; �������� �� ����� I��������� ���� 2�/ ���������� �� ���������� ��# �������� �� �� I������������� ��������9&>- �������� �� ��� �����1 ����� ������� FG4? ��'������ ���+� +��� 2:>*$ -92� &�� ��������� ������������� �� ��� FG4? �����# �9;� �������� �����1 ���������� �� ��� ��'������$ ?���� �� C� ��� ������� ����������� �� ���������� ���������$ 394� ����7����� ������I��������� ��� ��?; �������� ������� I��������� ���� 2�/ ���������� �� 2�-& �������� �� �� I��������� +��� &,4&2 �������� �� ��� FG4?7������ �������$ ?��� ���� ��� 2�-&7������������� ������ ��� ��������� ������� ��� ��?;$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��?; �� ���������� ��7������������ �� ��� ����� �.

�� � ������������ �� ������� ��?; ���������������� �� ��� �����1

+��� ���������� ������� � ������ ���������� ����� FG4? ����� ����

��� �� �1������ �� ��� ������� ����������� �� ����� ������$ &��

�������� �� ��� ��� ��?; ���� � ���� ���� ������1@ ���� )� �1����� ���8� �� ������� �������� �� ��� 5� �1�� ����� ��� ��?;

������� &����8 �� ��$� � 5�$ &��� �������� ��� ������������� ���

���������� � ����7����0� &����8 �� ��$� � )� �� ������7

����� *��� �� ��$� � 5� ������� �� ��?; �1������$

H� ��� ����� ���� +� ���� ��� �������� ���� ��� �+�7����������

�� ���������� ������ ���� �� ��?; �� ��� FG4?7����� ����� � ���

���������� ����� "+��8 +��� ��� �������� ��+ ��� ������ �� ���

������� ��$

��+����� ���� �� ��� ���������� �� ���������� �+�7����������

�� ��?; �� ���������� ����� FG4? ����� � ��� �� �� ����� ��

������� ����������� ������� ��� ���� ��+� ���� ���������� �

������� ��� ��?; �1������ 2������� �� ��$� /..�# A������ �� ��$�

/..��$

4� ��� ����� �� ���� ��� �������� ���� ������ ���������� �����

����� ��� �������������� ������ ��������� ��� ��� ������� ��� ����

�������� ;��� �� ��$� � �$ *����� ����������� ���������� ������

�� ��� ������ ����� �� ��$� � )� �� �������� �� �������� ����

���'������ �� ��� �������� +��� �� ������ �� ��0������� �������� ���

�1������ �� ��?; �� ���� ����

��� �� ��� ����� +��� ��� FG4?7������ ���� +� ���� ���7

����� ���� � �� �� ���������� �� ��� �����1� �� �� ������� ������������

+��� ������ ��� �1������ �� ��?; �� �������� ������� +����

+��� ����� �� � ������ ������ �� ��?; �� ��� ������� +����� �

�� � ������ ������� +��� ����� ������� ���� ���� ����������$

���� +� ��������� ���� ��?; � +������ �� �������� ��� ����

����� ���'������ ������ ��� ��� ����� ����������� ���� ������ ��

��$ H�� ���7����� ��� ��� 2�-& �� ��?; ������� ���������

���� ����������� ����������� ������� ��?;$ ���������� ����������

+��� ��?; �� �����7��� ������� ������ +���� +� �����0� �

�����������$ 4� �� ��������� ���� ��+� ���� ���������� � ��������

�� ��� ��� ��'����� �� 2�-&7������������� ������� +����� ���

����� ���������� �� �����7��� ������� ������ �������������� ���

������������ �������� ���� ������ ���������� ;��� �� ��$� � �$

2���������� ����������� ��� ���������� ������� �� �� ������������

������ ���� ��������� �� ���� ���� ���� �� ��� ���� �� � � �� �

���� �1���� ���� ����� ������� �������� ���������� ;������� �� ��$�

� !%�� �# -���� �� ��$� � .�� �� �� �� FG4? ����� ����� �

,������ � !!# ;�������72����� �� ��$� � !�# ���� ������ ���

���� ���� �� ���������� ��� � +� ��+ �� ��� ���� �� ��?;$ ��

��������� ���� �������� ����������� ������ ����� FG4? ����� ��

��� ������� ������� � ������� ������ �� ��?;$ &��������� ��� � �

������� ������� ���� ���8 �� ��?; ���� �����1 �� ��� ������ ����

���� !$ ��?; C:4>- ��� �� ����� ���� �����1 �� FG4?7������ ���$ ������� ��?; ����� +��� ���� �� ������� ���������� �� ��� ����� �� ��� ��� ����������$ 4��������� �����1 ������ � ��+� �� ����8� ������������� �����1 ����� � ��+� �� ����$ &�� ������ �� ��?; � �1���� � ��B�� �� �����$ '� .$..)�-?H(-$

���� $ ������ ���� ������������ �� ���������� �� ���������� ,� �� ���7���������� :� �����1 �� � FG4?7������ ���$ &�� �������� �� ��� �������������������������� ��� +� ��������� �� ��� �7������� ������� ��+� �� �����+�� ��1�$

���� /$ ������������ ������ �� ���������� ��������� ���� ��� �7������� ��

�����1 �� FG4?7������ ���

,��

����������B������� L��� ������� ��������� ���� �����1�

����������B������� L �� �������� �� ��������������� ����� �����1�

,� �.. !$ ,/ �.. �!$",5 �.. 5%$%,6 �.. )�$5,) �.. 65$%," �.. 6%$.

���� ��� �1���� � � ���������� �� ������� ������������� �����1�$

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��.. ;$ ,$ ;��� �� ���

������������ ������� �� ��?;$ 2���������� ����������� ���� ���

��+� �� �� ���� �� �������� ����� :����� �� ��$� � /�$ :����

������ �� ��?; �� ����������� ������ ���� �� ����������

�� ���� ������� ��� ����� �������� �� �����������$ ��+����� �����

�� �� ��� 8��+����� �� ������� �� ��?; �,?- �� ��� �����������

������ ������� �� ��$� � ��$ �� ��� �������� ���� � ����� ������

� ��8��� �� ����� ���� ������ ����������� ������ ���� ������� ��� �

���� ���������� �� ��� ������� ����� �� ���� �� ����������� ��0���� ��

��+ �� +������ � �����7���� ����� ��� � ��� �����7���� ,&7J2,

;��� �� ��$� � �$ -������������� � ������� �� ��$ � �� �������7

���� ��?; ���� �� ��8�� �� �� �1�� �������� �� �����������

��������� ���8 �� ��� ���� ��� � ������� ��� ?3; >��+�� �

&������� � %%�$ ,������ �� ��� ��� �� ������� �������� ��?;

������� ���� �� ���� �� ��� �������� ���� ����� �����������

������ ������� �� ����������� �� �� �� �� ����� �1������1��

�����$

H�� ��� � ��� 0�� �� ��+ ���� ?H>7������������� �����7

��� ����������� ������� ��?;$ &� ��� 8��+����� ��� �������

�� ��?; �,?- �� ��� ���� ����������$ &��������� ����������

����� ��� ��� �� ������ ����� ������ �$ ��������� ��������� ��

��?; �� ��� ����������� ������ �� ��� ���$ C��� �� ��� ��������

�� ��?; � ��� � ���� � �� ����������� ������� +� ���� ��������

���� ��?; ���� ���� � ���� �� ���������� ���� ������ +���� ��

���� ��+�� �� �� ;������� �� ��$� � !%�� ��$

H�� ��� �� ��?; ���������� ����� �������� ������ �� FG4?7

������ ��� ������� ������� ���� �������� ������ �� ����� 5� ) ��

" �� ��������� �����1� +���� ��� ������� +��� ���������� �� ������ ���

�� �� ��� �����1 ������������� �� ��� ������ � ��� ��E���� ����������

���������������$ ����� ���� �� ��� ���� ������� ������� ���

������� �� � ��������� ����������� �� �����1 �� �� 2�8�+���

� K�+���� � .�� �� ��� ����� ��� �� �����0� ��� �1������ �� ��

����������� ���+��� ���������� �� ��?;$

�� ������ � ����������� ����0���� �������� �� �������� ��?;

����� ������� FG4? ����� ������������ � ���� ������ ������ ��

���������� ����������������$ &�� � �� ������� +��� ������� 0����

2���� �� ��$� /..�� +���� ��+ �� ������� �1������ �� ��?; ��

�������� ������ ����� ��� �����$ - ������ �1��������� ���� ��

���� �� ��� ����7����� �� ���� ������� ����� ��� �����# +� ��+�

��� � �������� ����� "+��8� +����� ��� ������������� ���

������ � ������� �� 5 ��$ &��������� ���� ������� �� ������

��?; ���� �� ���� �� ��� �����$ >��� � ����� ���� ����� +��� ��

�����1������ � � ����� ������ �� ������� ��� �����1 ����� �� ��

������� ������� �� �� +��� � ������ ��?; ��������� � �� ������

�� ��� ������� �������� �� ����������$

&�� �� �� ��� ��� ����� ���� ���� ������������� �� �������

���'������ ������ � ��� ������� ������ �� �������� ���������� ���7

����� ��� ���� �� �������� ����������7������ ������ �� ��?;$

��������� �� ��?; �� ���������� ��� ��� ������ +��� ��

����������$ ��� �� ��� �������� �� ��8��� ���� ������� ����

���� +���� ��+ ���� ������� �� ��?; ������ ���������������

������ �������� �� ��$� � # 3������ �� ��$� /..��� �� �������� ��

�� ���������� ����������� �� ���������� �� ��������� ��������� >������

�� ��$� /..�� �� ������ ���� ������� ������7:��� �� ��$� /...��

���� ��� �� �����8��� ��� ������ �� ������ ���������� �� ��

��������� ��� �������� ����� �� ��?;$

(�F����������

&�� ��� +� ������� �� ����� �� ,2.�2 �� ,2./2 ����*������� ����>����� 4������ ���������� �� ������� �� 3$�$# &������� ��$ !6.� 4�����# �������������� ����� >������ �� -������ �$�$>$-$� ?�+ N��8�� �� *�����������G��������� � ���� ,������ >������0�� 4����� *��� ��$ **."/%!!6 9..)�

�� C$2$ �� ��� �������� �� �� ������� *������ ��� ��������� ������ �� ��J������ O$ �$ :����� O�$� ��� ���� ������$

(�� �������

��?;� �����7����� ������������ ������# 2-:�� ��������# 2�-&� ������������� ���������# 2:>*� �������� ���� ������� ���������# 2�/� �������/# �-,JJ75/� �������7 �� ������ -*J7�������� ������������� +��� ���������� +����� �� 5/ 8��# �&&� �:7�������������# C:4>-� ������7���8������������� ���# ��� ����������� ����# ?�G?� �������� ������ ����7���# ?H>� ������ �1�� ������# J�� �������� ������# J*>;� �����������7���������� I�����# FG4?� E��������� ���# &?�� ������@ .$�* &��9�2� ��%$)�� .$�)* ?�2�� .$.)L ����8��� �������# &?&� ������@ .$�* &��9�2� ��%$)�� .$�)* ?�2�� .$.)L &�CC?� /.# &,4&2� ����������� ���������������������# &>-&*� ������� ����� �����0������ �����$

��� ����

-����� ,$:$� ,������ -$� -������ K$�$� ����� :$>$� �������� �$� �������� ,$��������� �$H$ O�� J������ O$�$ � N����� -$�$ � /� J����������� �� ��������7�1������ ������� ���'������ ������ �� ������������� ���������������� (� ������� ��� ��������

-����� ,$:$� N����� -$�$� J������ O$�$� �������� �$� �������� ,$� -������K$�$� *��8��� �$>$� &������������ �$�$ � ,������ -$ � .�� -������������� ������� ���'������ ������ �� ?7������7�7�������� �������� �� ���7���������� ����������� ����� � �)�� �� #���� ���� ������

-����� ,$:$� ,������ -$� -������ K$�$� J������ O$�$ � N����� -$�$ � .��>������� �� ������ ������ ������������ �� ���� ����������� ����@����������� ��� ��� ���������� ������� �� ������ �� �������9�8������(� ������� ��� ����� ��

-����� ,$:$ � &����� �$-$ � )� 3������ �� ��������� ������� �� ���7�������� ����� *���� ��������� ��� ���

-����� 2$-$� 2��� ?$� ������� &$� O����� *$� 2������ O$*$� -������ -$:$�:����� ,$*$ � ������� >$O$ � %� -��������� �������� �� �����7����� ������������ ������ �� �� ���� �� ��� ������ ������ ���� �� �� ��

������7:���� -$2$� ,���� J$� ?������ J$� ��������� J$� :���������� O$J$�������� 2$� ������ >$� 3����� ($� *����� J$� ���� �$� ����� *$;$�3���������� &$� O���� ,$� ����������� J$� ������ �$3$� ����� O$�$� :��7��8�� ;$� C���� -$*$� J������� C$� 2����� J$� ��������� J$ � J�����8�� *$ /...� *���� �� ��������� ����������� �� ������� +��� ��������������� ����� ������ ��������������� +����� ���� �����

����� *$;$� ;�������� ,$O$� >+����� K$O$ � K�+���� ?$�$ � �� 2������E��������� ��� ����� �� ��� ������ ������� ����������� ������� ��������� ��� �� ��

����� *$;$� K�+���� ?$�$� C������ �$�$� *�����8� *$;$� >+����� K$O$ �*������O$�$ � !"� ,���������� �� ��� ������������� ������������� �� ��������������� �� E��������� ���� ������ ���� ����

��������� -$J$� ��������� J$� J������ :$� ������� 4$� 2����� J$ � *������ O$ � � �����7����� ������������ ������7������ ���������� �� ������������� �� �� �1������1�� ��� ���� �� ����������� ����� � ���������� ��������� ���� �������� ,�%� -��� *&���� �� �������

������ �$-$� 3������� K$:$� ������� O$2$ � 2�����8� :$,$ � )� &�������0������ �� � ���������� ������� ������������ ����� �� ��� �������������� �������� .��� ���� #��� .��� ����� ��� �����

������ 3$�$ � ����� :$?$ � !"� ����������� ������� �� ������� ����������� ���� � ��� ��!� "�#� $%&!'� ,��$��/ �� ������� ������)"�%�!�(���� )*!+��&�*� ,,� � �����

2����� O$*$� 2����� ?$� *����� >$� -8���� J$� *������ -$� J����7?������� C$�&����� C$� -����� C$ � -������� O$ /..�� C1������ �� �����7����������������� ������ �� �������� ������ � �������� �� ������� ������ ������� ��������� ��� �����

2�������� C$� ,��������� �$� 3������� �$� A������� 2$� >E�������� ;$ � >�������>$ /..�� :� �� ������ ���������� ��������@ ��+ ���������� �� ���7�������� ���� �������� *���� ��������� �� ������

2������ O$*$� :���������� O$2$� N��� F$� 3���� 2$*$ � (����� >$ � %������������ �� �����7����� ������������ ������ ��?;� ������� �� �,?-�� ��� ������ ���� ��� 2?>@ ������� ��� ���������� �1���� ����������� ��������� ��� ��������

2�8�+���� *$ � K�+���� ?$�$ � .� ������������ �� �������� ���'������������ �� ����������� ���� �����1� (� ������� ��� ��������

������ >$�$ � ,������ J$O$ � !!� >������ �� ����������� ������ �����+���E��������� ��� ����� �� ��� ��� �������� ����������� ��� ������

��;������ *$� >���� C$� 2���� K$� >��+���� 2$� *������ -$� N����� 2$� *������C$� (�������� O$J$� 2����+��� ,$ � ,����� >$-$� � )� ���������� � �

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��?; �� ���������� ��7������������ �� ��� ����� ��.�

���������� ������� ������� +��� ������ �� ����� �� ��� ����� ������� ����� �� �������

������7�'��'����� *$*$� J������� 2$� 4���� ;$� H��+�� ;$� ������ �$,$�������� &$:$� �������� 3$:$ � ������ ;$ � )� 4����������������������������� �� �����7����� ������������ ������ �� ��� ��� ������ ���� �� ��������� �� ������

;�������� ,$O$� K�+���� ?$�$� ����� *$;$� *������ O$�$� ���� C$�$ � ,��������C$J$ O� � !%�� *���������� �� ������������ ������������� �� � �������� �� ������� ������ �� ����������� ����� �� ������&��� �0� ������� �� �����

;�������� ,$O$� ����� *$;$� K�+���� ?$�$� ,�������� C$J$ O� � *������ O$�$ � !%�� >������ �� ������������������7���������� ������� ������ �� ���7�������� ����� .��� ����� ��� �� �

;�������72������ 3$� -������ K$�$� 2���� F$� (������� 2$:$ � ,������ -$ � 6� ,������� ������� �� ������� ���'������ ������ �� ����������� ����������������� ��'������ �� E��������� ��� �� ���� �0� ������� ���� ���� �

;�������72������ 3$� 2���� F$ � ,������ -$ � %� -��7������� �����7���� �� ������� �� ������� ����������7?JN7?-�J�7��������7�������7��� ����������� ���� ������� ���'������ ������ ����� ������������ ��'�������� E��������� ��� �� ���� �0� ������� ��� ��������

;�������72������ 3$� ������ 2$:$� -������ K$�$ � ,������ -$ � !�,������� �������� �� ������� ������ ���������� �������� �� ����������� ��E��������� ���7������ �1������1����� ������� �� ����� ������� ����������� �0� ������� ��� �� �����

;���� ;$,$� 2���� F$� :�������1� �$O$� ;�������72������ 3$� O���� N$�2������� O$-$� >�������� �$O$� ������ *$3$� 2�����8� :$,$ � ,������ -$ � � 2������� ������������ �� ���������� �� ������� �� �������� ������ �����@ ���8 �� ����������� +��� �������� ������������� �� ����������� ������� ��������� ��� ������

;���� ;$,$� (������ *$&$� �������� 3$ � *��������� *$ /..�� :������������� ���1��7/ +����� ��� ���������� �����1 �� ��� ���� .���� ���� .����� �����������

3������� C$� J����7?������� C$� &����� C$� -����� C$ � -������� O$ /..��?�������������� �� ������� ������ 8������ �1������1����� �� �������������� 3�?; ������ ������� �� ��������� ��� ����� �

��� :$�$� ���+�� ,$� *�1+���� *$� ����������� -$ � ,���������� �$2$ /..����� ���� ���������� ����� ��� �������� ��1����� �� ������ ������������ ��������� ���� ���� �� ����������� ����� �� #��� -����� �����������

:������ >$,$� >����� N$� >��8��� -$;$� J������ -$ � ������ O$J$ � /� 2������������ �� �����������7�������������� ������� �� ��� ������� �� ��� E���������8��� .��� ����� ��� �������

:������� �$,$� 3������� O$-$� ������ O$3$� K����� 3$�$� >������'�� ,$� (����-$�$ � ������ *$,$ /..�� ���7���� ���������� ����� ��� ����������1����� �� ������ ���������� �� ����� (%� �� ,�%� -����� ��� �������

:�� >$�$� >��������� 3$� N����� �$>$ 444� :�� M$O$� *������� ,$:$� >����� H$2$�������� *$($� -������ *$�$� ;����� *$:$ � ,����� ?$3$� � 5� ���7�������� ���� ���� 4&�)� � +���� �1���� �� ����� �� ��� ����� ����� ��� �����

*���<=���7>������� -$ � �'��8���� -$ � "� J��������� �� ��� ���������������� �1������1�� ����� �� ������������7��������� ����������� ���0������� ��� ����� �� ��������� ��� � ���� �

*���� *$� &����8� &$� -����� C$ � J����� �$ � 5� ������������ ���� ���������� �����7����� ������������ ������ �������� �� ��� ��� ����� �����+7��� �������� ����������� '���� ���� (���� ���� 1�(� �� �������� �

� �� *����� >$*$� (�������� O$J$ � ,�������� C$J$ O� � !!� *���������������������� �� �������� ������ �� ��� �������� �����1� +���� ������� ��

���������� �� ����������� ����� �� ������&��� �0� ������� ��� �����

,������ -$� -����� ,$:$� -������ K$�$� ��-����� 2$O$� J������ O$�$ � N�����-$�$ � !!� ������������ �� �� ������� ���'������ ������ �� ��������������� '���� ��� (���� ���� 1�(� ��� ����������

,������ 4$O$ � !� 4������������ ������� �� ��������@ �������� ������7���� �� �1������1�����P '��)� .��� ����� ���� ��������

,��������� �$� ������ O$�$� �� ;��'�� 2$� 2����� :$� >������� >$� >�������� 2$�2�������� C$� ���8��� -$� ������ *$,$� :�� N$� 2������ O$K$� ,�� 2$-$�3������ >$� (������� 2$ � 2�������� C$ /...� ���7���� ���������� ����������� ������� ������� �� �����75� �� ��������� �� ���������

,������ ,$2$� -��� -$� >+����� K$O$� ����� *$;$ � ��;������ *$ � 5�4����������� ��'������ �� E��������� ��� �� 8����� ���@ ����������� ��������� ���� ������� �� ��� ������ �� ��� ������ �� �������� �0� ������� �����������

>����� &$� *��� 3$� O����� M$�$� &����8� &$� *���� *$ � ��������� ?$ � )� G�7���������� �� ��8� �,?- �1������ �� ��� ��� ������� ������������ �������� +����� ��� �����

>��+��� *$ � &������� �$ � %%� >�������� ����7������� ��������� �� ��������1�� ����� ��������� �1���� �������� �� ���������� ���������� �����@ ���������� +��� ����� ���+�� ������� .��� ����� ���� �������

>������� -$� :���� ,$� :����� 3$� J������� O$� �����7������ *$K$� ������ ;$G$�:������� �$ � ���8��� C$C$ /..�� 3���������� �������� � ���� ���8������ �� ������� ���������� ����������� �� � ���� ������� ���� ������������� ����� ,�%� #��� -����� �� �������

&�� ����������� ����� 2������������ ,������ 3����$ � 5� - ����� �������������� � ������������ ������ ���� � �1���� �� ������� �� �������7���� ���� ���������$ ����� ��� %�9 !5$

&����8� &$� ��������� ?$� *���� *$ � J����� �$ � 5� ������� ���������������� �������� �1������ �� ������������76 �,?- �� ��� ������� ���������� ����� ���� �� ��������� �� ��� ��

&����8� &$� :������ G$� ;���8���� �$� -����� C$� J����� �$ � *���� *$ � )� 4����0������ �� �����7����� ������������ ������ �������� �������������� ����7����0�� �1����� �� �������� ��������7����� �1�������� ��������� ����� �� ���� .����� ���� ����

&�������� N$� ����� �$� 4������ 3$� >����� ;$� -�� 4$� :���� N$� ������ 2$� -���N$� ������ C$2$ � *����� O$:$ � )� 2������� ������������ �� ��� ���7�������� ���� ������� �� ������������ �� ��� ������ �� ������ ����� ����� -����� �� �����

(�������� O$J$� *���� ,$�$� >������ &$O$� ;�������� ,$O$� ���� C$�$ �,�������� C$J$ O� � !)� ?���������������� ����0������ �� ���������������� �� ������&��� �0� ������� � �������

�������� 2$� 2��� N$�$� J�������� ,$;$ � H���� :$ � �� �����7����������������� ������@ ���������� �������������������� �� �������������������� � �������� +��� ����7������ ��������� '���� ��� (���� ����1�(� ��� ��������

������ ,$>$� 2���� J$3$� 3������ �$2$� K��+��� �$:$� ����� -$ �K��+��� �$ � !%� *����� ������� �� ����������� ����� �� ���� �0� �����"�&������ ������

���� O$�$� *��*������ O$2$� ������� J$>$� :�+������� J$,$ � O���� -$:$ � "� J������ ��������������� �� ������ ���������� �� �������� ����������� ��� ���������� ����������� �� ���������� �� ������ ���� �� ��� ������,�%� #��� -����� �� �������

A������� 2$� 2�������� -$� ,��������� �$� :������� �$,$� 3������� �$� 2�����:$� *�������� *$C$� ;��������� ,$*$� >������ ($� ������*$,$� &����8�&$� >������� >$ � 2�������� C$ /..�� :� �� ����������7������ ��?;���� ������������ �� ����������� ����� ������� ���� ������

� /..5 ;�������� �� C������� ?���������� >�������� ������ ������ �� ����������� ��� �. 59��./

��./ ;$ ,$ ;��� �� ���