Cloning and functional expression of alkaline alpha-galactosidase from melon fruit: similarity to...

10
Cloning and functional expression of alkaline a-galactosidase from melon fruit: similarity to plant SIP proteins uncovers a novel family of plant glycosyl hydrolases Nir Carmi 1 , Genfa Zhang 1 , Marina Petreikov 1 , Zhifang Gao 1 , Yoram Eyal 2 , David Granot 1 and Arthur A. Schaffer 1, 1 Institute of Field and Garden Crops, and 2 Institute of Horticulture, ARO, the Volcani Center, Bet Dagan 50250, Israel Received 20 June 2002; revised 2 September 2002; accepted 27 September 2002. For correspondence (fax 972 3 9669642; e-mail [email protected]). Summary Raf®nose and stachyose are ubiquitous galactosyl-sucrose oligosaccharides in the plant kingdom which play major roles, second only to sucrose, in photoassimilate translocation and seed carbohydrate storage. These sugars are initially metabolised by a-galactosidases (a-gal). We report the cloning and functional expression of the ®rst genes, CmAGA1 and CmAGA2, encoding for plant a-gals with alkaline pH optima from melon fruit (Cucumis melo L.), a raf®nose and stachyose translocating species. The alkaline a-gal genes show very high sequence homology with a family of unde®ned `seed imbibition proteins' (SIPs) which are present in a wide range of plant families. In order to con®rm the function of SIP proteins, a representative SIP gene, from tomato, was expressed and shown to have alkaline a-gal activity. Phyloge- netic analysis based on amino acid sequences shows that the family of alkaline a-gals shares little homol- ogy with the known prokaryotic and eukaryotic a-gals of glycosyl hydrolase families 27 and 36, with the exception of two cross-family conserved sequences containing aspartates which probably function in the catalytic step. This previously uncharacterised, plant-speci®c a-gal family of glycosyl hydrolases, with optimal activity at neutral-alkaline pH likely functions in key processes of galactosyl-oligosaccharide meta- bolism, such as during seed germination and translocation of RFO photosynthate. Keywords: raf®nose oligosaccharides, galactosyl hydrolase, Cucurbitaceae. Introduction The raf®nose family of oligosaccharides (RFOs) are galac- tosyl-sucrose oligosaccharides containing a-type galacto- sidic linkages. The trisaccharide raf®nose, the lowest member of the family, as well as the tetrasaccharide sta- chyose are near ubiquitous in higher plants (Keller and Pharr, 1996). RFOs play an important role in photoassimi- late translocation in many diverse families (Zimmerman and Ziegler, 1975), including Arabidopsis (Haritatos et al., 2000). Stachyose and raf®nose, together with sucrose, are the major translocated sugars in the Cucurbitaceae (Mitch- ell et al., 1992; Schaffer et al., 1996) and are the predominant sugars arriving at the fruit sink, where they are rapidly metabolised, as indicated by the near absence of these oligosaccharides in fruit mesocarp tissue (Hubbard et al., 1989). In place of the RFOs, the monosaccharides glucose and fructose and the disaccharide sucrose predominate, depending on the stage of fruit development (Hubbard et al., 1989; Schaffer et al., 1996). RFOs also function as storage carbohydrate and as such are a major component of seeds in many botanical families, including the Leguminosae and Gramineae (Henry and Saini, 1989; Kuo et al., 1988; Peterbauer et al., 1999). During seed germination, the stored RFOs are rapidly metabolised and utilised for seedling growth (Kuo et al., 1988). The RFOs have also been associated with cold and dessication toler- ance (Keller and Pharr, 1996). The high levels of RFOs in legume seeds are responsible for ¯atus in animals, because the absence of a-galactosidase in the intestinal mucosa leads to their metabolism by lower intestine microbes, which is accompanied by the production of gases (Rackis, 1981). The initial enzymes in RFO catabolism are the a-galacto- sidases (a-gals, a-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22), which hydrolytically remove the terminal galac- tose moiety of RFOs. In addition, a-gals remove galactosyl moieties from stored galactomannan polysaccharides in The Plant Journal (2003) 33, 97±106 ß 2003 Blackwell Publishing Ltd 97

Transcript of Cloning and functional expression of alkaline alpha-galactosidase from melon fruit: similarity to...

������� ��� �������� ��� ����� � ������� �������������� ��� � ��� ���� ���������� �� ����� ������� ��� ���� �� � ��� � ����� � ����� �������� �������� �

��� ������� � �� ������ !����� � �� ������ ����� ����� "���� #���$� %���� ������� ��� &���� &' ���� �������������� ���� �� ��� �� ����� �� ���������� ������������ ���� ��� ������ ������� ��� ����� � �� � ������

�������� �� �� ����� ������ � �������� ����� �������� �� �������� �������� �� ���������� ���� ���� ��������� � ���! ��� ��"��!������# ��#����!$�

������

(�)��� ��� �������� �� *�+���� ���������������� �������������� � �� �� ����� ������� ,����

���� ��-�� ��� �� � ���� ���� �� ����� � �� �������������� ������������� ��� � � ���*������� ������ '

.� � ����� �� ��������� � ��*���� � *� �������������� � /�����0' 1 � ���� �� ������� ��� ��������

��� ����� � �� )��� � � �� ������ ��� ������� ������� �� ����� ������ ,��� ������� �2 ������

��� � ��� ��� /����� ��� 3'0� � ��)��� ��� �������� ������������� �� �� �' .� ������� ������ � � ���, � �� ���� � + �� �������� ,��� � ����� � �� )� � 4� � ��*�*����� ���� ���5 /����0

,���� �� �� � �� �� � ,�� ���� � ����� ����� �' �� ��� � �� ���)�� �� ������ � ��� ���� ���� �

� �� � ������ ��� � � � ��� ������� ,�� ��� �� � ��� ���,� �� ��� ������� ����� ��������' ������ �� ��� �������� *�� � �� ����� ���� � + �� � ���,� ���� �� ����� � ������� ������ ���� � ����� ������

��� ,��� �� ���,� ����������� ��� �������� ������ � �������� �������� ����� � $6 ��� 78� ,��� ��

�� ����� � �,� ����������� ���� �� � � + �� � ���������� �������� � ,���� ���*�*�� ������ �� ��

��������� �� �' .��� �� ������ �������� ��� �� �������� ��)� ����� ����� � �������� �������� �� ,���

������� �������� �� � ������������ �2 ��� �� ������� �� � � ���� �� � � ������������������������� � ���

*������ ��� �� ����� � � � ��������� ��� ������������� � (9: ������������ '

; �,����� ��)��� �������������� �� ���������� �������� � ���*���� � '

�����������

%&� ��'���� ����!( �� �!�#�����&� ���� ���)�$ � � #�!��

���(! �� ��� �!�#�����&� ���� ���������# � �(�� #�!����

����� !��*�#��� %&� � �����&� ��� ��'����+ �&� !�,���

����� �� �&� ����!(+ �� ,�!! �� �&� ��� �����&� ��� ���

�&(��� � � ��� ��-���� �� &�#&� �!���� �.�!!� ���

/&� + 0���$� ��)� �!�( �� ���� ���� �!� �� �&���������

!��� � ���!������� �� ���( ���� �� ����!��� �1���� ���

��� 1��#!� + 0��2$+ ���!���# ���!� ���� �3� ������ �� ���+

����$� ����&(��� ��� ��'����+ ��#��&� ,��& �� ���+ � �

�&� ��4� � ���!������ �#� � �� �&� 5� �������� �6���&

�!! �� ���+ 0���� ��&���� �� ���+ 0���$ ��� � � �&� � ���������

�#� � � ����# �� �&� � �� ���*+ ,&� � �&�( � � ����!(

������!����+ �� ��������� �( �&� ��� ������� �� �&���

�!�#�����&� ���� �� � �� ������ � ����� �3��� � �� ���+

0�7�$� 8� �!��� �� �&� ��)�+ �&� ��������&� ���� #!����

��� � ����� ��� �&� ������&� ��� �� ��� � ���������+

��������# �� �&� ���#� �� � �� ����!������ �3��� �

�� ���+ 0�7�� ��&���� �� ���+ 0���$�

��)� �!�� ������� �� ��� �#� �� ��&(� ��� ��� �� ��&

� � � ��4� ��������� �� ����� �� ���( ��������! ����!���+

���!���# �&� 9�#������� ��� : ������� �3�� ( ���

�����+ 0�7�� .� �� ���+ 0�77� /��� ��� �� ���+ 0���$� ; ��#

���� #� ��������+ �&� ��� �� ��)� � � ����!( ������!����

��� ��!���� �� ����!��# # �,�& �.� �� ���+ 0�77$� %&� ��)�

&��� �!�� ���� ���������� ,��& ��!� ��� ����������� ��!�

���� �.�!!� ��� /&� + 0���$� %&� &�#& !���!� �� ��)� ��

!�#�� ����� � � ��������!� �� <��� �� �����!�+ ������

�&� ������� �� � #�!���������� �� �&� ���������! �����

!���� �� �&�� ������!��� �( !�,� ��������� ��� ����+

,&��& �� ����������� �( �&� � ������� �� #���� ����*��+

0�70$�

%&� ������! ��=(��� �� ��) ������!��� � � �&� � #�!����

������� �� #�!�+ � ; #�!�������� #�!����&(� �!���+ >5

����0���$+ ,&��& &(� �!(����!!( ����� �&� �� ����! #�!��

���� �����( �� ��)�� 8� ��������+ � #�!� ����� #�!�����(!

�������� � �� ��� �� #�!���������� ��!(����&� ���� ��

"�� #���� $����� �����$ 77+ ��?0��

� ���� @!��*,�!! /�!��&��# 9�� ��

#� �������# ����� �����+ 0�72$+ ��� ��� �� ��� �� �&��#�

�&� &��!�#���! � ��� ���� �� �&��� ���� ���� �!��� #��

�@!��� �� ���+ 0���$� ���� � #�!� ��� �!�� ����� �&�

�� ����! #�!�����(! �����( �� �&� �(�� @ �!��� �!�#����

�&� ���+ !�����# �� ��� �� ������ ���� �� �&� ��� ����#����+

���� ��! ���� �(�� ) �1& �� ���+ 0���$�

)� �&� ��� �� ����!��� �� #!(���(! &(� �!����+ �,�

����!��� ��� ��� ��$ � � �!����'�� �� � #�!�����������+ ,��&

����!( �� ���� ����# ���!����!( �*� (���� ��=(��� ���

����!( �� ���������# � ��� �!( � �*� (���� � #�!� �3�� �����

��� ����+ 0��2� 3�� �����+ 0��0� 5A1( ,������+

������� � � ��� B5A1CB$� %&� � #�!� � � �!�� �!����'�� ��

���� � �!*�!���+ ���� ���# �� �&� ������! �3 �� �&��

����������+ ��� ���� �� �&� �*� (���� � #�!� ������ �� ����

� � ������ � #�!�+ ,��& � ��� �3 ������ �� �&� ������ ��#�

�.�!!� ��� /&� + 0���$% A� �!*�!��� � #�! ,��& �� ������!

�3 �� �?��2 ,�� ������!!( ������� �� �� �����!��� !�����

�:�� ��!� ��� D���+ 0�7�$+ ��� ,�� ����-���!( �!��

���� �� �&� ����&(��� � ���!������# 9�������+ �&���

������� �@��&���� �� ���+ 0���$� %&��� �!*�!��� � #�!� ,� �+

&�,��� + �����'� �� ����&(��� ,��& !���!� &(� �!(��� �������(

��,� � ��'����� D� �����!( � �'�� ��� ��� ��� � ����!

�!*�!��� � #�! � �� ��!�� � ��+ ,&��& ��� &(� �!(�� ���&

��'���� ��� ����&(��� �:�� ��� ��&���� + 0���$� %&�

������� ( �� �&�� ��=(�� ��!� �&� ������ �� �&� ����

��!��� �� � ���!������ ��) �� �� ����� 3�,��� + �� #����

�� �!*�!��� � #�!� &��� ���� ��� ����

8� !�#&� �� �&� ���� ����� �� � #�! �� �� ��� � �� �:��

��� ��&���� + 0���� :�� �� ���+ 0���$ ��� ��) ������!��� ��

#��� �!+ ,� ��� ���* �� �!��� �&� �!*�!��� � #�! #��� � ��

��!�� � ��� 8� �&� � ����� ���� + ,� ��� � �&� �!����# ���

��������! ��� ������ �� �,� #���� �� �!*�!��� � #�!�E �&�

��!�� �������� � � �����!( �������'�� #!(���(! &(� �

!��� ����!( �� �!*�!��� � #�!�+ �������� � �� �&� � �����!(

�&� ���� ���� #!(���(! &(� �!��� ����!��� �� � #�!�� 8� ����

����+ � ��!�� �������( �� �!*�!��� � #�!� � # �� �� ��

�����'�� F���� ���������� � ������G ��8/�$+ ������!!( ��� ���

�� #� �������# �� !�( ���� ��� (�� �3��* �� ���+ 0��0$ ���

����-���!( ���� �� ��&� �!��� ����!���+ ���������# �&�

��-��( �� �&�� ��=(�� ����!(�

( ����

������ �� ��������������� A:A0 �� A:A� �����

H �� ����! ��-�����# �� �&� � �'�� �!*�!��� � #�! � �����

�:�� ��� ��&���� + 0���$ (��!��� �&� 0� ����� ����

��-���� %I:A:8%8�;AH9%I9:� ;�#��� ��� �� ,� �

��� ��� �� �!�#���!������� �������# �� �&� ���� �� �&��

��-���� ,� � �&�� ��� �� ���!��( �&� �� ����! 20 �� ��

�&� ���� #��� � �� (��# � �� �;HA �( ����� �� /5��

%&� ��-���� �� �&� /5� � ���� ,�� ��� �� ����#� �

�����'� �� ,� � �!�#���!������ � ��� �� �&� ����-���

/5� �!����#� A @9A�% ��� �& �� �&� 0� ����� ���� H

�� ���� �&�,�� &���!�#( �00 ��������! ����� �����$ ��

�� ��&� ���� ���� ���!� ���� � ����� �� ��� F�8/0 !�*�G

�A5�����7$+ ,&��& �� � � !�� �� �&� � ����(����! �� !�(

���� ���������� � ����� ����0+ 6����2$ ��� �� ���������!

&���!�#�� �8/0 !�*� � ������� 3���!�#( ���!(��� �� �&�

�8/ � ������ �&�,�� � ���� �� &�#&!( ����� ��� �#����+

���!���# �&� ��-���� 8;;:DJ ��&�,� �� ��# � 0$�

;�#��� ��� ��� �� � ��� � ����� �� 8;;:DJ ,� � ���+

��#��&� ,��& �&� �����'� H �� ����! � ��� + �� /5� �!���

��� ��-���� � ��� �� /5� � ���� ,&��&+ ��� ��-��

���#+ ,�� ���� �� ������ �� �&� H �� ����! ����� ����� ��

�&� � �'�� � #�! ��=(��� A �!! !��#�& �;HA+ ,��& �� ����

�����# � ��� �� ������ ,�� �!���� � �� (��# � �� �;HA

�( � ���� � �� 2� ��� �� �A5> ��� ,�� �� ��� ����'��

'�� � #�!����������0 ��'����+ ��# � 0+ ��������� ��

��������� ��� AC00�0��$�

8� � �� �� �������( ���������! ��� &���!�#�� �� ��!��

� �� �;HA+ ��#��� ��� �!�#���!������ � ��� � ,� �

����#��� �� ����� ��� �#���� �� �'���� ��� �&� �8/�E

DD6%J� ��� D5%D;A ���� ��# � 0$� %&� DD6%J�

��-���� �� ��� ����� ��� �� �&� ��'���� � ����&(���

�(��&��� #����+ ��� �&�� �!!�,�� �&� �����'� �!����# �� �

&(� �!���� A ��� �� /5� � ���� ����!������ �&� �!����# ���

��-�����# �� �� ���������! �!! !��#�& �;HA+ ����+ �( 2� ��� �� �A5>� �&�� ����!�� � ��0� �� )�� ���# � 0+ �����

���� �� ��������� ��� AC00�0�2$� %&� �,� #���� &���

5!���!D �0��$ �!���!� �!�#����� ��� �� �� 27 ��� 2� ��

;HA ��� � �����+ ���������!(� %&� �,� #���� ������ ��

� ������ �� �2� �6D 7����$ ��� ��� �� �6D 7� 2��$ ��

�'���� ��� �'����+ ���������!(� @��& ��!��!�

,��#&�� � � ���������� ,��& �&� ��� ������� 6D �� �&�

� #�! � ����� �:�� ��� ��&���� + 0���$� %&� ��!�!���� ���

�� �&� �,� ��=(��� ,� � ��������!E 2��0�

8� ��� � �(������� 5�A:A0 �� 5�A:A� ��

��������������� ��)*'� ����+��*

%� ���' � �&�� �&� �!���� �'��� #���� �� ���� ������ ��

�!*�!��� � #�!����������+ �&�( ,� � &��� �!�#��!(

��� ����� �� ,% ���� @���� �� � ����� ��� ,��& ���& ��

�&� �'��� #���� ��� ����� �&� ��������� � ����� ���# �

�$� A� ��������+ �&� 6D �� �&� A:A0 � ����� ,�� �!�#&�!(

!�,� �&�� �&�� �� A:A�+ ��� ���& ,� � ��� �������!(

7� *;�A+ �&� ��� ������� ��=� �� �&� � �'�� � #�! ��=(��+

,&��& �� ��� #!(���(!���� �:�� ��� ��&���� + 0���$�

>�=(�� ��� ���� �� ���& �� �&� �,� � ����� ��� ,% ���+ ��

,�!! �� �&� H� � �'�� 3�� ��##�� � ������+ �&�,�� � #�!

�������( �� �3 7�� ,��& �&� � ��'���! ���� ��� � ��� ��&���!

� #�!������ ��H/�:�!$� %&� ��� ����� A:A0 � ����� �&�,

�� ����#��'���� �������( ,��& �&� ��!!�,��# � ��� ��&��(!

���� ���� �0� �6$+ ,&��& ,�� ���������� ,��& ��� �!� �� ��

� #�!����������E �H/�:�!+ �H/ �:!+ �H/ �:!+ �H/ �6��+

�H/ �6��+ �H/ ��+ �H/ HA:A� %&� ��� ����� � #�!

�7 -�� ���'� �� �!�

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

��=(��� ,� � ���� ������ ,��& �H/ �:�! �� �&� ��� �!

�!*�!��� ��#� �� �3 ��2?7�2+ ��� &�#& �������( ,�� ����

������ �� �3 ��� ���# � �$+ ����!� �� �&� � �'�� ��!��

��=(�� �:�� ��� ��&���� + 0���$� %&� ����� �� �

������� � �� �&�,�� ������! �������( ���,��� �� ���

���5+ ��� ���!���� �&� �!( �� ���5 ���� �&�,�$+ �!�� ����!�

�� �&� ��!�� ��=(��� %&� ��=(�� ,�� ��!� �� &(� �!(��

����&(���+ ��'���� ��� ��!������ �� �37��� A������( ,��

&�#&� ,��& ����&(��� ��� ��'���� ��� !�,��� �������( ,��

,��& �&� ������&� ��� ��!������ �%��!� 0$+ ����!� !( �� �&�

9��� �' �8/� � � �!*�!��� � #�!������������ �A$59K�%A9D &���!�#( ���!(��� �� �&� �,��!���� �% '�� �!*�!��� � #�!� ��'����� �� ������� �� ��������� AC00�0��� �'����� �� ������� �� ��������� AC 00�0�2$ ��� �,� �� ���������� �8/ � ������ ��� !�(+ 3��8/0+������ ��� ���!� ����+ A��8/+ H/L0�2���$�%&� &���!�#( ���!(��� ,�� �� �� ��� �� �����! �� ��#&� �!*�!��� � #�!�B�8/�+ ,&��& �� �&� ��*� �� �!� ��( � � ��� �!! � �������� %&���-����� ����� �� ���!���+ �� �������� ���&� �� � ������� &� �+ �������� �������� �8/�M�����$+ ���!� ���� �8/ �5A@��0��$ .*����/���� ���������' �����!��� ��-���� ����� ���� �� A�20�2��$ ��� #����� �'������� �8/�5A@����2$� %&� # �( ����� �������� ���������� ����� ��� �� �!! ��#&� �!*�!��� � #�!�B�8/��%&� �� * # �( �&���� 0� ����� ����� �� �&� H �� ���� �� �'���� �������� �&� ��-���� ���&� � ����� � ������ 5���� ��� ��-����� ����� �&� ����#� �� ��#��� ��� � ��� � �� �&� /5��!����# �� �&� ��� #���� ��'����+ H �� �� �� ��� 8;;:DJ� �'����+ D5%D; ���6%J�6$ � � ��������� �( ���&�� !���� ������&� ��-������ %&� ��� !���� ��-����� �A ���@$ � � �&� � #�! ���� ����!( ����� ��� �������� ������� �� ��# � �� %&� ����!(��� ��� �;$ �������� @ �3� � �� ���+ ����$ �� ��������� �( �&� �N$�(���!�

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

������ �� �������� �(������� ��0����� �/�������� ��� ��

������ ��!�� ��=(��� %&� 1� ��!�� �!�� �&�,�� � &�#&�

��'���( �� �&� ��=(�� �� �&� !� #� ����&� �����

�/�������� ��� ����+��* �� !����* ��� �

%&� &�#& &���!�#��� ���,��� �&� �,� ��!�� �'��� ���

�&� 2�# #���� �� ��#!( �##����� �&�� �&� �8/� � � �!*�!���

� #�!�� ����� �&� ' �� �8/ � ����� ,�� ��� ��� �� �� &

#� �������# �� !�( ��� (��+ ,� �������#���� ,&��&� �&��

����� &�� �!*�!��� � #�! �������(� ; ( �� !�( ��� (�� ���

������� � �&�,�� � #�! �������( ��!( �� ������ �3� A��� ��

& �� ���������� �� ���5+ �&� ������� ��� (� ���������

�!*�!��� � #�! �������(+ ,&� ��� �&� ������� � �&�,�� ��!(

������ � #�! �������( ���# � �$� %&�� �� �&� ' �� ��� � �� ��

�!*�!��� � #�! �������( �� �� !�( ����� ��� ���� �� �&�

������'������ �� �&� � ����(����! �8/ �� �� �!*�!��� � #�!�

,(������� �'�� 2�#

8� � �� �� ���' � �&�� �8/� ������ �� �!*�!��� � #�!+ ,�

��� ����� � 2�# #��� � �� ������ �%8:� �������� >�%

�!��� �9>%�7�0�+ 5!����� :������� 8�������+ 5!�����+

H5+ K�A+ ����!��� ��-���� ��������� �� A�20�2��$� %&�

��� ����� � ����� &(� �!(��� �H/�:�! ,��& ������

�������( �� �3 ��2 ��# � �+ ���������# �&�� �&� &���!�#��

�8/� � � �!*�!��� � #�!��

�'������ 3��� ���� �/����

D� ����� �� �&� � ����� ��-����� �� �&� �!*�!��� � #�!�+

�8/�+ ��'���� ��� ����&(��� �(��&���� ��� � ���� ��

*��,� � #�!� � �� �!���� ��� ����� ��� %&� �&(!�#������

�!����'������ �� �&� �!*�!��� � #�!�B�8/� ���# � 2$ �!���� �&�

�!*�!��� � #�!�B�8/� �� � �!��� �&�� �� �&(!�#�������!!(

�������� � �� ���& �&� �*� (���� ��� �&� � �*� (���� � #�!�

�� ����!��� �� ��� �� �� �&� #!(���(! &(� �!����� %&� �!*�

!��� � #�!� � � �!���!( �!���� �� �&� # �� �� ��)

�(��&����� %&� &���!�#��� ����# �&� �!��� �� � #�!�B

�8/� � � �� �&� ��#� �� 5!���!D ��� �� �� 2�?��+ ,&�!� �&�

&���!�#��� �� �&� � #�!�B�8/� �� �&� ��) �(��&���� � � ��

9��� $' / ����� #�! �&�,��# �&� ��� ����� ���� ��� ���� #��� � � ����� %&� �,� ��� ��� �#&� !���� ������� � �� ��� ���� � �� ,% ���� ����� ��� ,��& ���& �� �&� �,� �'��� #����� F5G �� ������ �&� ��� ���� �� ,% ��� � ����� ��� ,��& �&� ���� �! �!������ %&� H� � ����� 3�� ��##�� ��� ���� � � �&�,� �� �&� �,� ��� ��� !��� !����� A �,� �� �&� �#&� ����� �� �&� ��� #��� � ����� ���& �� � �� ��� ���� ��� �� � ������ ������ A �,� �� �&� !��� �������� �&� ��!��!� ,��#&�� �� �&� �� *� � ������� / ������ ,� � ���� ���� �� � 0�O /A:> �;� #�!+ �� �� :�� �����&���� �0���$�

9��� 7' �'A:A #��� � ����� �&�, �!*�!��� � #�! �������(� >����� �� �3 ���������( �� �&� ��� ����� �'��� ��� .�2�# #��� � ������ A������( ,������ �� ,��& 0��6 �H/� #�! ���� ���# �� :�� ��� ��&���� �0���$�

.�*� � A!*�!��� � #�!���������� �������( �� ��� ������'���0 ,��& ����&(���+ �������� ��� ��!������+ �3 ��2� %&�#�!������ � ���� ,�� ����(�� �� �� ��=(�� !��*�� ����( ������ ���� �� :�� ��� ��&���� �0���$

���� ��� 1� ��6$A������( ,��& 0� �6 ���� �������! �#�0 � ����� ����0$

����&(��� 0�� ��2��������� 0�7 �7�6�!������ ��� 0��

9��� <' 8������ �� !�( ��� (�� ����!�� �!*�!��� � #�! �������(� >�� (��� �� � ( ��� �� & ������� �� !�( ����� ,� � ��� ����� ��� � #�! �������(,�� ����(�� ���� ���# �� :�� ��� ��&���� �0���$�

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

0�� -�� ���'� �� �!�

�&� ��#� �� ��?��� %&� �!*�!��� � #�! # ��+ �� ,�!! �� �&�

��) �(��&����+ ����� � �� �� �!��� �����'�+ ����� �� ���

�� ��! � ��� �!��� �*� (���� #���� ,��& ��#��'���� &���

!�#��� �� �&�� # �� &��� ���� ��� ��� �� �&� H5@8 ����

�����

%��������

D� �!���� �,� �!*�!��� � #�! #���� � �� ��!�� � �� �;HA

�� �&� ����� �� �&� ��-����� H �� ����! �� ���� �� �&�

� �'�� �!*�!��� � #�! � ������ %&� �!���� �'���� #���

������� �� �&� ��-����� H �� ���� �� �&� � �'�� �!*�

!��� � #�! �&�� ,�� � �����!( ��� ��� �:�� ��� ��&���� +

0���$+ ��� �&� ��� ����� � ����� &�� �!*�!��� � #�! �������(

,��& �&� ���� ������ ����!� �� �&� � �����!( ���� ����

��=(��� %�#��&� + �&��� �,� ������ �� �������� �������(

�&� #��� � ���� ,��& �&� � �����!( �&� ���� ���� ��!��

� �� ��=(���

%&� �� ��# &���!�#��� ���,��� �&� �,� ��!�� � ��

�'��� ��� �&� 2�#� !�*� #���� �� ��#!( �##��� �&��

�&� �8/0 � ������ � � �!�� �!*�!��� � #�!�� D� ��� �����

��� �� �&� &���!�#�� �8/�+ � �� ������+ ��� �&�,�� �&��

�� ������� �� � � ����� ,��& �!*�!��� � #�! �������(� )

���� ������ �&�� �� !�( ���� ��� (�� ����!�� �!*�!��� �

#�! �������( ��!!�,��# ���������� � �&� ���� �� �&� ����

���( �� �&� ' �� ��� ��� ���� ���������� � ����� �3��* �� ���+

0��0$ �� �� �!*�!��� � #�!� )�&� �������'�� ��� �����

#���� &��� ���� �� ��� 2�# !�*�+ �� �&� ����� �� ��-����

&���!�#( �� �&� �� !�( #���+ ��� �&� &�#& &���!�#(

����# ����� � �� �&�� ����!( �!!�,� �&�� �!����'������

�� �!*�!��� � #�!�� %&� �&(!�#������ ���!(��� ��������� �&��

�&� � ��( �� � ���!! #��� ����!( �� �&� �!*�!��� � #�!�

9��� =' /&(!�#������ � �� ����� �� ����� ���� ��-����� �&�,��# �!������&��� ���,��� �!*�!��� � #�!�B�8/�+ ��) �(��&���� ��� �� ���������� � #�!� ��#!(���(! &(� �!��� ����!��� �� ��� ��� /&(!�#������ ���!(��� ,�� �� �� ��� �( 5!���!D ��� �&� � ����� � �� ,�� � �,� ,��& ,��& �&� %�>>���, 0�� ����,� ���������(�=��!�#(�#!�����*B ��B� �����,�&��!$� ) #����� ��� ��������� ���� E �0$ ���!� ���� �������� H/L0�2���+ ��$ ����'�� '�� � #�!���������� 8AC00�0��+ ��$ .*�������� ���������' A�20�2��+ ��$ ����'��'�� � #�!���������� 88 AC00�0�2+ �2$ #����� �'������� 5A@����2+ ��$ �% �������� 5A@��0��+ ��$�������� �������� M�����+ �7$ �� ��' +������ ������+ ��$ #���' ����+�' 5A5�7���+ �0�$ ����� ��������� 5A@�����+ �00$ �% �������� AA;���2�+ �0�$ �%�������� @A@002�2+ �0�$ ����'�� ����+�� >02���+ �0�$ 4��������� +������ @AA����0+ �02$ �' ������� /���7�+ �0�$ 2������'*��� ����+����� /��7��+ �0�$����������� ����� 5A@�����+ �07$ �% �������� 5A@7����+ �0�$ �% �������� 5A5�7���+ ���$ .*�������� ���������' AA���2�0+ ��0$ ��� ���!��� J���2�+ ���$�*�'���� ��������!� /0����+ ���$ ��*���� '�( AAA�����+ ���$ �������� ���������'������ AA;��272+ ��2$ �������� ��� ����� @A@�2���+ ���$ ,% ���/�����+ ���$ 2���������� '����� /���2�+ ��7$ #� ������ ���������� 5AA�����+ ���$ ����������� ����� F5G �� �*� (���� !�*�$ A�207��� %&� ���!� ����� ������ 00 ��� 0� � � !����� &� � �� ����&(��� ��� �������� �(��&����+ ���������!(+ ����� �� �&� ����!� ��( �� �&� ���������� �������� �(��&��� ��� ����&����(��&��� ��-�����+ ���������!(� ����!( �� ���!��� �&� �*� (���� ���� � #�!�� %&� ����� �� N07?�� �� ����!( �� � � �!��� #����� ���!� �� ��������� ����������!� �� ��0 ����������� �� �����

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

������ �� �������� �(������� ��0����� �/�������� ��� 0�0

���� ����# �,� ��# ���+ 5�A:A0 ��� 5�A:A� �(���

6�!�� ��� ���!� ���� &��� �,� �!*�!��� � #�! #���� ���&

��� �&� �������# �8/� ��� �� �!����'�� ���� ��� �� �&���

�,� ��# ���� %&� ������ �8/ ��!!� ��� �&� 5�A:A0

�(�� ,&�!� �&� ��&� �8/� �&�,� �� ��# � 2 � � �� � �!���!(

�!���� �� �&� 5�A:A� �(���

%&�+ �&� � ����� ���( &�� ����!�� � ��, �!��� ��

#!(���(! &(� �!���� ? �&� �!*�!��� � #�!� ? �� ,&��& �&�

# �� �� �������'��2�# #���� ��!��#� A!*�!��� � #�!� ��(

�� ��-���� �� �&� �!��� *��#���+ ����� �&��� � ������ � �

� ����� �� � � ��� ��#� �� �!��� ����!���� >�� ����� 2�#

#���� &��� ���� ��� ��� �� ���� �� : ������ �#� �����

��# �� !�( �����+ 6����2� ��� ����+ @>���0��� �� #&�

����!��#�+ @:������$+ 9�#������� �#� �������# �����

�����+ A��0��7+ M�27�2$+ 5 ���� �� ����!� ���� ����

!��#�+ A�02���7� �������� �������� ����!��#�+ M�����$+

5� �������� ���!�� � ��+ �&�� ���� + ,��� ��!�� ����

!��#�+ AA����7�$ ��!������� ������� � ��+ %5������ ������

��� �+ @:�7����$ ��� 9� ����� �������� � �� ������ �+

A0��0�7$� 8� ���� �� �&��� ������+ �&� � � � ������ �!��

�� � #�! �� ��) &(� �!(���+ ���&� �� ���� #� �������� �

������!��� �� � ���!������ �&���������!����� �� �����!�+

����� �� �&� : ������ ��� 9�#������� ��� � ��)� ,&��&

��� �� ��4� �� ��&(� ��� ��� ��� � �� #� �������� �.�

�� ���+ 0�77$� ���!� ���� ����!��#� &��� �����!( ����

�&�,� �� � ���!����� ��'���� �3� ������ �� ���+ ����$�

8� !�#&� �� �&� ������'������ �� �8/� �� �!*�!��� � #�!�+

�� ����������� � �� �� !���� '�� �!��� ����!��� � � ��,

�&�,� �� &��� ���& �!*�!��� ��� ���� � #�!� �: ������

��� !�(+ �8/E 6����2+ ����E C0�7�7$+ 9�#�������� ������+

�8/E M�27�2+ ����E 6����! ��� �&� ��+ 0��0$+ 5� ��������

���!��+ �!*�!���E �&�� ���� + ����E :�� ��� ��&���� + 0���$

��!������� �������+ �8/E %5�����+ ����E �� ���� �� ���+

���0$ ��� 5 ���� �� ����!� ����+ �8/�E AA57����+

5A@��0��+ ����E 5A@7����$$� 8� �� �&� !�*�!( �&�� �&� ��

��������� �� ���& ���� ��� �!*�!��� � #�!� ,�!! ��� �� ����

�� �� �� ������� ��� ���� �� �&� �!��� *��#���+

���!�#�� �� �&� ������������ � ������ �� ���� ��� �!*�

!��� ���� �����

%&� ����� ��# �3 ������ �� �&� �,� �!����� �� ��=(���

�##���� �������� ��!!!� ��� ����� ����� ����������E

�!��� ����!� ��� ����!����� �3 � � #��� �!!( ������

,&� ��� �(����!�� �3 �� #��� �!!( ��� �! �!*�!���� � �&�

�!����# ��� ����� ����� ��� ������ ������ �� ���������!

�!��� ������� ,�!! &�!� �� ���� ���� �&� �&(���!�#���! �!��

�� �&��� ����� ��� ��=(���� 8� �&� ���� �� �� ���� ��

,&��& ���� ����� ����� ���� ������ &�� ����!����+

�&(���!�#���! ��#��'����� &�� ���� ��� ����� �� �&� �!*�

!��� �������( �� �� ���!� � �� �����!�+ �!*�!��� �������(+ ���

��� ���� �������(+ �� �!���� ����� �!!( ,��& ����!�������!

� ��������� ��& �� �&� !��� ���* �� �� �� � �������� �/&�

��� ���+ 0�7�$� ������!!(+ ��!( �&� �!*�!��� �������( �� �

!���� ,��& ����&(��� !���!� �!��# �&� ����� ������!

�/&� ��� 3��� �+ 0���$� / �����!(+ ,� �&�,�� �&��

(��# ��!�� � �� ��� ���+ �� �&� ������� �� ��!!�������+

��&������ ����� ���������� �� �&� �!*�!���+ �� ��� �� �&�

���� � #�!� �:�� �� ���+ 0���$�

%&� �!*�!��� � #�!�B�8/� �&�,�� � ������!!( �� &���!�#(

,��& �&� ��&� �,� � #�! #!(���(! &(� �!��� ����!���� ����

�&�!���+ ,� ���� �,� ����� ��� ������� ���# � �$� %&�

����� ������ �� ��-����� ���,��� �&��� �&(!�#�������!!(

������� # ��� ��!�+ �&� ��� �+ �� �� ( ���! �� ���� ���

��# ��������! ��#��'�����+ ���!���# �&� ������'������ ��

��������� ������ ������

%&� ������ ���� �� � ����!( �� ���� � #�! ,�� � ������� ��

������� �,� �� ���(! # ��� �6��&�, ��� @�!��� ���

����+ 0�7�$+ ��� �� ���# �� �&� ����!(��� ��!���&�!� ���

�&� ��&� �� �&� ����!(��� � �������� #��� �! ����� %,� ���

�� ��������� �.�;���;;�:B5$D$����� ���#�����+,&��&

���� �&� �& �� �������� # ��� �� ��=(��� ���# � ��+�$�

%&� .�; ����� ��� ����� ����� � � �� � �� �&� �����!(

���� ���� C9.C;H5 �@9)5. 8/@���000;� 3���*��� �� ���+

9��� 8' 6����� ����� ��� ���,��� �&� �& ��� #�! ����!��� � ������� �� ��# � �� ;����� A�������� �&� ����� ��� ;;�D ������ ������ @�������� �&� ����� ��� .�; ������ %&��� �� ����� �� �&� �!*�!��� � #�!�B�8/�B��) �(��&�������!( � � ����� �� ��# � 0� %&� �� ������������-����� � � ���� �� �� ��# � 2� �� ��! !�,�E 5�A:A� N�+ 3��8/0 N7+ 5�A:A0 N�+5���� N0�+ /���� N�+ 5� N�0+ 5� N��+ A� N07+A� N0�+ �� N0�+ >� N��+ @� N��+/� N�7+ @& N�2�

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

0�� -�� ���'� �� �!�

����$ ����� ��� ��-���� �� �&� ����!( �� � #�!�+ �&� ���

�;$ �� ,&��& &�� ���� �&�,� �� �� �&� ����!(��� ��!���&�!�

�� �&� #����������� ���*������' ��=(�� �3� � �� ���+

����$� ����� �&�� ����� �� ����� ��� ���,��� ����!���+ �� ��

!�*�!( �&�� �&� � ������ ����!(��� ���&����� �� �&� ����!(

�� ��=(��� � ������� ��� ���&����� ( �� �&� �#!(����$ ���

�� �������� �� �&� ��&� ����!��� �� ,�!!�

%&� ����� ��� ����� ;;�:B5$D �� �� � �� �&� ���#������

����� �� � #�!� �/ ����� /;)5������ @9)5. 8/@���000@�

3���*��� �� ���+ ����$� 8� �� �������!� �� &(���&����� �&��

��� ��� � �� �&� ����� ��� ���?��� ��� �� �&� ;;�5B:$D

����� �������� �� �&� ����B���� ����!(��� %&� !������ ��

�� �� ���� ����!( ����� ��� ��-����� ,��& �� ���(!

# �� ��� � #! �>$ ������ ��#��'����!( �� �,� �&�

�&���� �� ������!� ���������� �� �&� �*��,� ����!(���

�� ���(! # ��� � �&� �� �+ 6��&�, ��� @�!��� ���

���� �0�7�$ � ������ �&�� � &(� ��&���� � � �D$+ ��4�����

�� ��� �� �&� �� ���(! # ��� �������� �� ����������# �&�

����!(��� ��� �� � � �������� ������ A!�&�#& ���& ��������!

����!( &�� ��&� ����� ��� ��� ��� #! ����� �����+ �&�

� ��� ����!( ����� ������ �� �&� ��� �� �&� ;;�D+ ��#��&�

,��& �&� ����� ��� ��4����� � �+ ��*�� �� � � ��� ���������

�� �&� ����!(��� ��������

8� �������� �� �&� ����� ��� � � ���������!( ��4����� ��

�&� ���?��� ��� �� �&� ���#������ �����+ �!! �&� � #�!� �!��

&��� �� !���� ��� ����� ��� � � !������ ��?�� ����� �����

��� ��� �� �&� ���?��� ���# � ��$� ������!(+ �&��

��� ��� � � �� �&� ����!( �� ������ ���� ���� � #�! ,��

�&�,� �� �� ��������! �� �������( ��� ��!� �� ��������!!(

��!���� ��!( �( �&� � ������ ����� �����+ �&� � �(

�6� ����!!� ��� 1&+ ����$� %&�� � � ��( �� ������!!( 4���

����� �� � ������( �� �&� ���?���+ ���� �����# �� �&�

&(� ��&���� ��� ��!����� ������� ( �� �&� � ���������

�� �&� ��� �� ���(! # ��+ �� ���!� !( �� ��� ������ �3�

A!�� ������!(+ �&� ����� ��� � � ��!� ������� �� &(� �

�&���� ���� ��� ������# �� �&� #!(���(! �!�#�����&� ����+

�� �&�,� �� � #!�������� �3 ���� �� ���+ 0��7$�

%&� �!*�!��� � #�!� � � �!���!( �!���� �� �&� �!��� ��

��'���� ��� ����&(��� �(��&��� ��=(��� ���# � 2$�

%&��� &���!�#��� � � �� �� ���!� ���� ���+ ����� �&�

&(� �!(��� #�!���������� ������� �� ��� �&� ��� �� �� �&�

�(��&���� ��������� %&� !���� � � � ���#!(���(!����� ���

����� �&�� �� #�!������! �#�!������ �������! ������&� ���$ ��

�&� #�!������ ���� ��� �� ��� � ��'���� �� �&� #�!��

���� ������� �.�!!� ��� /&� + 0���� /��� ��� �� ���+

0���+ ����$� %&��� &���!�#��� � �+ &�,��� + ��� ���

������ ����� ���& �&� &(� �!��� ��� �&� � ����� ��� ���

����� ��#�� ,��& �&� �����! �� � �� ����! #!(���(!� 8� �&�

���� �� �&� � ����� ���+ � ����&� ��� ? ��'���� � �� ��� ?

�������� �� �&� ������� ��!��!� ,&� ��� �� �&� ���� ��

�&� &(� �!��� �&� � ����� �� �� ,��� + ��� �� (��!�� � ��

#�!������� A��!�#�� �!������&��� ���,��� &(� �!����

��� � ����� ���� &��� ���� ���� ����+ �� �����!�+ ��

�&� � ����(! � ����� ���� ,��& � � ���� ���������� ����

�� 6�� �� ���+ 0��7$ ��� �(!�#!��� ����� ����� ���� ,��&

#!(���(! &(� �!��� ����!( 0� �3�� ����� �� ���+ ���0$�

������!(+ /��� ��� �� ��� �����$ �&�,�� �&�� �&� ����&(���

�(��&��� � �� ��� ���� �!�� &�� !�, &(� �!��� �������( ��

,�!! �� !�, #�!������! ����������� � ����� ��� �������( ,��&

����&(��� �� ���� ���� %&� &�#& �������( �� �&� �!*�!��� �

#�! �� �� ��� ���* ������ ������!( ������!�=��# ���� ���

��)�+ �� ���� ���� �����+ ������ �� �&� �!� �� �&�� ��=(��

�� �&� &(� �!(��� �������� )� �� ���!� ���� ��� � � �&���

�� ����� �� �&� � ����� �&�� � � �����'��!!( ����� ��� ��

��!( ��� �� �&��� # ���+ �� �&��� � � !�*�!( �� &��� ���

�����! ��#��'����� �� ���� �����# ���� ��� �����'���( ���

,&��&� �&� ��=(�� �������� �� � � ����� ��� � � &(� �

!���� D� ��!���� ��& � ����������� �� ��� �� �&� �!����# ��

�'����+ ���# �&� �!*�!��� � #�! �����'� ��-����

DD6%J� ,&��& �� ��!( �� ���!!( ����� ��� �� �&� ��)

�(��&�����

8� ���� (+ � � ����� ���( &�� ����!�� � &��&� ��

��&� ���� ���� ����!( �� #!(���(! &(� �!����+ ,&��& ��(

�� ��-���� ��+ �� ,�!! �� !������ ��+ �&� �!��� *��#���� 8�

�� !�*�!( �&�� ���( ��&� �!���� ,�!! �� ���� �� ������� ���&

���� ��� �!*�!��� � #�! #���� ��� ��=(���� %&� ������� (

�� �&� #���� ,&��& ������ �� �&� ' �� ���� �� #�!�����(!

����&� ��� ������!��� ����!�� � �� �&�� !�#&� �� �&�

�!�����!( ��� !( ��� ����� �&�������� �� ������!���

�!�����# ��� �� ��������# �� �&� ���� ���� �� ��� ����!(+

�� ,�!! �� �� �&� ������! ���#�� �� ���� #� �������� ��

��� �� �!��� ������� ��� �� ��!! ,�!! ������!���� %&�

������� ( �� � ��, ����!( �� �!*�!��� � #�!� ��( �!�� ���

� ���� �� ���� ���� ���&��!�#���! ���!�������� �� � #�!��

#�� ��� ���� ���� �� �

#����� ���������� �� -/���'���� ��5�������

A!*�!��� � #�! ,�� � �'�� �� ���� ���� � �����!(+ ��� �&� � ��������� � �� �&� �;� /A:> #�! �:�� ��� ��&���� + 0���$ ,�� �!������� � /I;� ���� ��� �8�����!�� 5;+ 6�!!��� � 5��$ ,��& � @�� ����!�����# ���� ���� %&� � ����� ���� ��������� �2 �6 % ��+0�� �6 #!(����+ ��O ���&���! ��� ��0 �6 ����� �&��#!(��!����%&� H �� ����! ����� ���� ��-���� �� �&� � �'�� �!*�!��� � #�!,�� ���!(��� �� ���!( � �� �&� /I;� ���� ��� ,��& �� A���������-���� �A��!��� @���(�����$ �� �&� %��&���� / ����� A��!(���9��� ��� ( �3����+ 8� ��!$+ ���� ���# �� �&� ������� � G� ���� � ������

�-� �������� ���� ����� ��-� �*������� �� ���,

%���! �HA � �� ��!�� � ��� �� ���� �! ����� ��� ����!�������!���#�� ,�� ��� ����� ,��& �&� >1 �HA 8��!����� .�� �@��!�#���!8���� ��� 5� 9��+ @�� 3����* 8� ��!$ ���� ���# �� �&� ������ � � G� � �����!+ ,&��& �� � ����!������ �� �&� ���&�� �� 5&��� =(��*� ��� ����&� �0�7�$+ ����� �� ��� ����� �� ��!!� �� �#������ �&���(�����B���� #��� ��!����+ ��!!�,�� �( � #������� ������+ 9�5! ��� �!��&�! � ����������� �� �&� �HA ��� � �������,��& ;H���� %���! �HA ,�� ��� �� � ����!��� �� ' �� �� ���

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

������ �� �������� �(������� ��0����� �/�������� ��� 0��

�;HA �(��&���� ,��& �&� ��� �� ��� �� ��� 88 ��� �� � ���� �������:���� @�9 9��� %��&��!�#���+ K.$� �� �� �� ��� �;HA �(��&����,�� �� �� ��� �( �����# 0 �# �� �HA ,��& �!�#� �%+ � �� � 2� �6A�% ���� ���!�'������ �� ���� ���� ��A5>$ �;HA �(��&�����!�#���!������ � ��� � �5!�����&+ /�!� A!��+ 5A+ K�A$ ��� ��� ����� ,��& �% �������� 6�� �:���� @�9 9��� %��&��!�#���+ K.$�

������ �� ��5����� ����*��� ��0����� 5�A:A0 ��

5�A:A� ��-�

8� � �� �� �!��� �&� �!*�!��� � #�! #���+ ,� ��� � /5� �!����#�� ���#(� 8� � �� �� � �� � � �����'� ��� ��� � ��� �� �&�#��� ��� ����� �� ��!�� � ��+ ,� �!���� �&� 20 �� ;HA ��-�����&�� ������� �� �&� 0� ����� ���� H �� ����� ;�#��� ��� �!�#� ��!������ � ��� � ,� � ����#��� �&�� �� �������� �� �&������ ���� ��-����� %I:A:8 �2 A5�:%H::H:5H::�A% �+����� � ���������$ ��� H9%I9: �2 H55CAA8A58:%CAA�%% �+ ���� ����� � ���������$� %&� ���!�'������ �������� ,� � �� �� ��� ���� �������� �&� ���(�!� �6���� �(�!� # ������+ >������ �+:� ���($ ,��& � �&� ������!� A������#� � ;HA ��!(�� ����5!�����&+ /�!� A!��+ 5�!��� ���+ K�A$ ,��& �&� �;HA ���� ��������� ��� �� � ����!���� %&� /5� �(�!�� ���� ����E ��� �(�!� �����5 �� 0 ���� �� �(�!�� �� ���5 �� 02 ���+ ���5 �� 0 ��� ��� ���5�� 0� ����

/5� ,��& � ����� � ��������� � ��� ����#��� � �� ,��&�� �&������'� 20 �� H �� ����! ��-���� �2� AA%%A5%A%5%55:A%:5 :AA%%%: ��$ ��� �� ��������� ��,��� ��� ��#��� ��� � ��� ����#��� ���� ���# �� �&� ����� ��� ��-���� 8;;:DJ �2 C%:5 5AH55�%5�%5;A% ��$ ����!������ �&� �!����# ��� ��-�����# �� ���� �� /5� � ����� %&� /5� �(�!�� ,� �E ��� �(�!� �� ���5 �� 0 ���� ��� �2 �(�!�� �� ���5 �� 02 ���+ 2��5 0 ��� ��� ���5 �� 0 ���

%&� �!! !��#�& ��-���� �� �'���� ,�� �������� ,��& �&� �� �A5> ��6A�% �A5> �;HA A��!�'������ .��+ 5!�����&+ /�!� A!��+5A+ K�A$ �( ���# �&� ��!!�,��# #��� �����'� � ��� �E 2� :%:::%:5%::A%5A:A%55%% �� ������$+ 2� A55A%%A5%%A%: 5A:%5AA:%5%: �� ������ ������$ ��� �&� ���������

�� �A5> �;HA �(��&���� �!�#���!������ � ��� �5!�����&+ /�!�A!��+ 5A+ K�A$� %&� /5� �(�!�� ,� �E ���5 �� 0 ���� ��� �2 �(�!���� ���5 �� �� ���� ���5 �� �� ��� ��� �7�5 �� � ��� K��� ��-�� ���# �� �&� �A5> � ����+ � �!! !��#�& �!*�!��� �'���� �;HA�!��� ,�� �������� �( /5� ,��& �&� ��!!�,��# �!�#���!������� ��� �E

2� A%:A5::%%::%:5%::AA%%A5%A%5%55:A% �� ������$2� %5A%A:%%5AA%%5%%A%A%555AAA::%A:AA5%5 �� ����� �����$�%&� /5� �(�!�� ,� �E ��� �(�!� �� ���5 �� 0 ���� �� �(�!�� ��

���5 02 ���+ �7�5 �� � ��� %&� !��� ���!�'������ �������� ,� ��� �� ��� �( ���# >� %�- ��!(�� ��� �%�*� �+ ����$� %&���-�����# ��!�� �� �&� /5� � ���� ����!�� �� ���� �����#� ��� �� ���� ��� %&� ������ ����� ����� ������� �( �&� �;HA��-���� ���!��� �&� H �� ����! ��-���� �� �&� � �'����=(���

������ �� ��5����� ����*��� ��0����� 5�A:A�

��-�

@���� �� �&� ����� ��� ��-����� ���,��� �&� 2�#� ��� �&��'���� #��� ,� ����#��� ��#��� ��� �!�#���!������ � ��� ��&�� ��!� �� ���! �� �!����# ���������! �'��� #���� � �� �&���!�� � �� �;HA� A /5� � ���� ,�� �������� �( ���# ��#�� � ��� �!�#���!������ � ��� � �� ��������# �� �&� ����� �������� �����+ DD6%J� ��� D5%D;A ���� ��# � 0$� DD6%J�

�� ����� ��� ��!( ����# �&� �8/� �� ��� ����# �&� ��) �(��&���� ������� ;�#��� ��� � ��� � ,� � 2� %::%::A%:A5H5A�6: �� ������$ ��� 2� :5�%555AH:%65A55A �� ����������$+ ��� �&����!�'������ �������� ,� � �� �� ��� ,��& >� %�- ��!(�� ����%�*� � ����$ �� ��!!�,�� /5� �(�!��E ���5 �� 0 ���� ��� �2 �(�!���� ���5 �� �� ���+ �7�5 �� �� ���+ ��� �7�5 �� 0 ���� )� �&� ������� �&� �� ���! ��-���� �� � ��� �� /5� � ����+ ,� ����#����!�#���!������ � ��� � �� 2� ��� �� �A5> �� ��!!�,�� �� ��

�A5>E 2� ::A :A: 5AA ::: %AA 5:A %:: A: �� ������$+ ,��&/5� �(�!�� ���� ����# ��� �(�!� �� ���5 �� 0 ���� ��� �2 �(�!�� �����5 �� 02 ���+ ���5 �� 0 ���+ ��� �7�5 �� � ��� �� 2� �A5>E 2� A5:A:%AA:%:%AA555%:55A5%: �� ����������$+ ,��& /5��(�!�� ���� ����# ���5 �� 0 ���� ��� �2 �(�!�� �� ���5 �� �� ���+ ���5 �� �� ���+ ��� �7�5 �� � ���

�!! !��#�& �!*�!��� �'���� �;HA ,�� �������� �( /5� ���#�&� ��!!�,��# �!�#���!������ � ��� �E 2� A%:A5::%5A5A55 :AAAA%%%5%:% �� ������$�

2� :55%55A55A%A5A5A%%5A%%:5%5 �� ����������$+ ,��& /5��(�!�� ���� ����# ��� �(�!� �� ���5 �� 0 ���� ��� �7 �(�!�� �� ���5�� 02 ���+ ���5 �� 0 ���+��� �7�5 �� � ��� ��-�����# ��!�� ���&� /5� �A5> � ����� ����!�� �� ���� �����# � ��� ����0� ���

,(������� ���'!����� 5�A:A0 �� 5�A:A�

�������

%&� �����# ��-����� �� �!*�!��� �'���� ��� �'���� ,� ����!�'�� �( /5�+ �!���� ���� � �:>6 % ����� �/ ���#�+ 6��� ���+ D8+ K�A$ ��� ���!���� ��� H�� 8 ��#������ ���� � /8I> ������ ������ ����� �������# �� H �� ����! 3�� ������ ����&�+6���&���+ :� ���($� >�� ������ �!������ ���������# �'���,� � �� � ����� ��� ,��& � �!����� ���������# �&� ��6 #��������# �� ��HA A # A:ABA:: �*���!( � ������ �( /� @�*�!+ ���@ ��*���� �� ���+ 0�7�$ ���� ,% ��� @9�0 �;>�$ 9(�> ��!!� �;��� �� �� ��� ����� + 0��0$� @���� ��! ��!����� ,� � # �,� �� � 2� �!<��* ���������# 0��! �� 9@ ����� �� �� ); �� ���+ ������ �� ��� ������ ,��& ��� �6 �� 8/%:+ ��� &� ������ ���� � & �(���� ��#����� �� ���� � �� 0� ���� 5�!!� ,� � !(��� �( � ����� ���� �� ��2 �! ��� ������ ���� ��� �6 �&���&��� ���� �3 7+0 �6 >;%A �3 7+ 2�� �6 H�5!+ ��0O % ���� M0��+ ��2 �6 ;%%+0 �# �!�0 !(��=(��$ �� 0 & �� ��5+ ��� ���&�����!!( �� �� ,��&� ��!! ��� ;HA ��� ��� ���!��� �@�����+ 8������ K���� ���(+@!�����#���+ 8H+ K�A$� 5 �� ��!�!� � ����� ��� ��� ,���������� ���� ���� ��#����� �� 02 ��� � �� ����� �� ��5 �����!!������ �� �&� ��!�!� � �������

#��������� ���'!����� A:A0 �� A:A�

%&� 3�� ��##�� ���������� �!*�!��� � #�!����������� ,� � � �'�� �� ,% ��� � �� � ����� ��� ��� �( ���*�! ���� ��'���( �& � ����# ��&( �8���� �#�� 9��� %��&��!�#���$� ����� ,�� � ��� �� �(,��&��# '�� ����� ,��& ,��&��# ���� �2� �6 H�3�/)� �3 7+��� �6 H�5!+ �� �6 �����=�!�$� A �2� �! -�����( �� ���� ,������� ,��& �2� �! �� ,% ��� � ����� ��� ��� �� � ��� ��� ���������� ��5 �� 0 &+ ,��& �&�*��# ���� �$� %&� ���� ,�� !����� �� ���!�� ��� ,��&�� �& �� ����� ,��& 0 �! ,��&��# ���� ��� �&���!��� �& �� ����� ,��& �!���� ���� �2� �6 H�3�/)� �3 7+��� �6 H�5!+ �2� �6 �����=�!�$�

,�)*'� ����+��* ����*

>�=(�� �������( ,�� ���� �� ,��& ���&� � ��� ��&���! �(��&�������� ���� ���#��+ ��� 9���+ 6)+ K�A$ � �&� ��� �! ����&� ���

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

0�� -�� ���'� �� �!�

���� ���� ����&(���+ ��'���� ��� ��!������ ���#��$ �� � � ����!( ���� ���� �( :�� ��� ��&���� �0���$� %&� ����( �� &(� �!(��� �� ��� �! ����&� ��� ���� ���� ,�� ����� �� �&����� ����� �� �!����� #�!������ �( ���# #�!������ �� &(� � #����� ���#��$ �� �� ��=(�� !��*�� ����(+ ���� ���# �� ��� � ���/&� �0�7�$� 1� ��!�� ,� � ���� ����� �� �&� ��� � �'�� ,% ������ ��� ����� �������( ,�� !��� � ��# �&� H� � �'������ ����� H��������( �� �&� ��� � ����� ��� ,% ��� ���� �! ��� ���� ,������ ��� ,��& �&� ��� �! ����&� ��� ���� ���� �����&(���+ ��' ���� ��� ��!������$� ���� ��� �����'���( ,��& �&� �(��&���� ��� � �&���! ���� ���� ,�� ������!!( �������� �( ���# �&� � ��� ����� ��� ��� ��� � ����� ��� ,% ��� ��� ����� 3(� �!(��� ���H/�:�! ,�� ���� ��� ,��& �&� ��� � ����� ��� ���� �! ,% �����&� ��� �+ ,� ���� �� �������( ,��& �&�� ���� ��� �( ���# �&�H� � �'��+ 3�� ��##�� ���������� � �����+ ,&��& �&�,�� ���������( ,��& �&� �H/�:�! ���� ��� �� �&�,�� �������( ,��&�H/�:�!�

�����* ��� ���'������ �� ��)*'� ����+��*

�� �&� ����( �� � #�! �������( �� �� !�( ��� (� ��� ������� �+��� �������!( �� ����� ���� 3���!�(�$ ,� � ������� �� �����'!�� ���� �� �� & �� �2�5� %&� ����� ,� � �&�� ��������� ������ ��� �&� ��� (� � �� �&� ������� �+ ��� ���& �� ����,�� ���������!( � �=�� �� !�-�� H� H�� ������� � ( �����,� � ����!� !( � ��� ��� / ����� ��� ������ ��� ��=(�� ����(,��& �H/�:�! ,� � �� �� ��� ���� ���# �� :�� ��� ��&���� �0���$�

,(������� �'�� 2�#

>�% �!��� �9>%�7�0� ,�� �������� � �� 5!����� :�������8������� �5!�����+ H5+ K�A$� %&� �!��� ,�� ����!���!( ��- ����� ���������� �� ��������� ��� A�20�2��$+ �!����+ ��� �������� �������( ���� �� �� ���� ���� ����� �� �&� ��!�� #�����

&����,� �� � ���

%&� ��&� � ,��& �� �&��* ; 9��� C���!��� ��� 6 �&��! �&���� ���&����! ���������� ��� / ������ � ���&� >�#!� �+ 6��&�@� C����+ 6�� >��!��� ��� C� �� .��!��* �� ����,��# �&������ ���� 5��� ������ � �� �&� A# ��!� �! ����� �& ) #��� ������+ �&� I�!���� 5���� + @�� ;�#��+ 8� ��!� H�� 00�B��+

( � �� �

>�������� !'� !���� � �' ��� ; �� �� 9' �0���$ 6�����!��� �� �&� ��'���� ����!( �� �!�#�����&� ���� �� !����� ���&��� ������� 9���!� ���!�������+ � ���!�������+ ��� ���* �� �� �� � ���������;������ ( �� � �&��� �!��#����� �(����� #���� #�*���% �?=+0��2?0��2�

>��������� @'� !��� �� ('#' ��� >�� �� �' �0�7�$ 3�#& !���!��� ������ �� #���� �� ,���������� ��� �� ��������� �� �&�����!���!��( �� �&� ��6 #��� � ����� ����+ A=+ 0��?00��

>����� �'B'� ���� �� !'C'� C ����� (' ��� @�� �,���� %'(' �0���$;���!������ �� � ������&��!�#���! � ����� �� �&� ����'�������� #�!���������� ��!(�� � ,��& �!��� � #�!������������ ���!/�* % #�*'% �$+ 022?0�7�

�����D������ �' ��� ������� �' �0�7�$ ���#!� ���� ���&�� �� �HA���!����� �( ���� #������ �&���(����� �&���! �&!� ��� ���� ������� ����% �����'% �8$+ 02�?02��

%* ����� C'1' ��� ���� �' 9'1' �0��0$ 5��� �!!��# ����!��� ������ �� ������!� %� ��� ������ �(���� �( �!��*��# �&��� #�� %� � ����� ,��& !�� �� ���� � $% 4�% ���% $�E+ �2?2��

9 ������ C'&'� >����� !' ��� > ,� �� C'%' ����0$ %&� �!����# ����&� ���� �=����� �� � #�!���������� � ����� � ��# ��� ��!!�,��##� �������� �� ������ �.*�������� ���������' 6�!!�$ �����$,� =$+ 0���?0����

���� '� � �� ����� !'� ������ #' ��� ���� �� &'&' �0���$ 5� �� &(� ��� ������!��� � ��# �� !( � �� ����!������ �� �,�����!�� �����'�� '��$� #�*���% #����� �?8+ 0?7�

���� ' ��� ���� �� &'&' �0���$ A ����! � #�!���������� � ����!�� � �� ,��& ���� ��� � ��� ���� �� ��'����� #���� #�*���%��E+ ���?�77�

���� ���� �'(' ��� 1 **� C'&' �0�7�$ A!*�!��� � #�!���������� ��!����� �� �����!��� ���� #���� 2��% .���% $<+ �70?�77�

2��������� #'� ! ����� � (' ��� .�� ��� (' �����$ 6��� ������ �� � ��� �#� � ����� � �� ���!� ���� ��������� #�����+$��+ 0�2?000�

2���� %':'� 2 � �'� ������ �'C'� 1��� ��� �'�'� ����� �'9'�'� ��������!'3' ��� >�� �� 2' �����$ 8�����'������ �� A�� 0�� �� �&�����!(��� ��!���&�!� �� �&� ���� � #�!���������� � �� #�����/������ ���*������'+ � ����!( �� #!(���(! &(� �!���� ��/���'����*+ 7E+ �7��?�7���

2 ��� �'('� %��� ��� �' ��� 2�� .'�2'%' �0��0$ 5!����# ��� �&� ���� �=����� �� � #��� ���0 ���������� ,��& ���� ���������� ���� !�(� ;� ��� ��������� �� #��� ���*+ 6����2�

2 ����� C'�'� �� � � #'&'� �� �������� �' ��� 2 ����� �' �����$8�� ����� ���� �#� �� � ����� ����!��� ,��& �&� @!��*� ���������� �� �� -���% ��� � ���% $A+ ��7?����

2 �������� >' �0��0$ A �!����'������ �� #!(���(! &(� �!���� ������� ����� ���� ��-���� ����!� ������ �����'% $% $A?+ ���?�0��

2 �������� >'� �������� �'!' ��� %��� �� �'C' ����0$ A ����� ���� ��&(� ��� ������ ��=(��� �� �&� #����� �� ���!� ������������� #���� 4�% ���% <6+ 22?���

2 �������� >' ��� (�� � &' �0��2$ ����!���+ ��� ����!��� ���������!��� �� #!(���(! &(� �!����� �����'% $% 7��+ �20?�2��

2 ���� ('C' ��� ������ 2'�' �0�7�$ 5&� ���� �=����� �� �� ��! �#� ���� )!�#�����&� ����� ������ ���'% 88+ ���?��2�

2������ !'� !���� ���� #'&'� >� ��� �'� �� ,���� #'C' ��� 9���� ���'>' �0��7$ ���� ��� ������# ��� ����!(��� ���&����� �� ��� !�( � ; #!�������B�0+�$ � ; #!��� ���&(� �!���� $��+ $67+000��?000���

2**���� �'3'� 2* �� �'�' ��� ������ %'!' �0�7�$ �� ��� �&�� �&��� �(��&��� ��� ���� ���� ���� �� ���� ������� �� �� ���������� ����� �� ����!����# ��*��!�� � ���� #���� #�*���% E�+02��?02���

; �� �� 9' ��� ������ !' �0���$ 6�����!��� �� �� ��&(� ���� �����*� ��� �� ���E #�!�����(! �� ��� �!�#�����&� ����� 8�#������'����� ������!���� �� #����� �� ���� �1���*�+ >���� ��&���� + A�A�+ ���$� H�, C� *E 6� ��! ;�**� + ��� 02�?07��

;�� .'!'� ���!���� �,����� C'C' ���1��� 1'C' �0�77$ 5������ �� ��'���� �!�#�����&� ���� ��� �� ��� �� �� ��� �!��� ������ $%���% � ���'% 78+ ��?���

!�������� � #' ��� �� &' �����$ A��������� �� ����� ���� �� ��������� �� � (����&�� 0� �� � #�!����������� ,��% $% �����'%$86+ 0��2?02�0�

!��� ,� �'%' ��� >����*��������� ;' �0�7�$ 6��&����� �������� �� � #�!����������� #�*����'����*+ $8+ 0���?0����

��� � � ! �� �'!'� ;����� &'C'� 2��� ��� C'�' ��� ��� .�� �� &'C'�0��7$ 5!����# �� �&� � ���� ����(��&���� ���&,�( �� � ��!��� ���&�*�� #���� $% �=+ �7�?2���

!���� ��� %'#'� ����� !'B' ��� !���� � !' �0���$ /���� �� ��������!��� � ������� ��� � ���!������� �� ��*��!�� �����/'�� '�� 9�$� #���� #�*���% EE+ �2�?��2�

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

������ �� �������� �(������� ��0����� �/�������� ��� 0�2

!������ "' ��� ������� �'>' �0��0$ ;���!������ �� � #�!���������������=(��� �� �&��*��� ������ #���� 2��% 66+ 072?0���

� � �*� �� .'� !���� C'� !���� 3' ��� (���� �� &' �����$ 5&����!��#����� �� ��'���� �� ��� ������ 8��!�����+ �&� ���� �=�������� ��!��!� �!����# �� � �!����������! ��=(�� ����!(= ��# �&� �(��&���� �� ����&(��� ��� �� �������� $��+ $66+0��?����

� � �*� �� .'� !���� C'� !�� �� @'� ����� !'� ����� �� C' ���(���� �� &' �0���$ ����&(��� �(��&���� �� ����� �� ��=*� ���������� ���������$E ��!��!� �!����# ������� ��� ������ ��� �&(��� �(��&���� #���� $% $?+ 2��?207�

������ %'!' ��� 2**���� �'3' �0���$ 6�!���E ����&�����! ����&(���!�#���! ���� �! �� �#� ����!������,��*���� �� �����2��% 7+ �2?���

������ %'!' ��� ���� 2'�' �0�7�$ 5&��#�� �� �� ��&(� ��� �����=(�� !���!� � ��# �&� ���* �� �� �� � �������� �� !����� ������'�� ����+��� 9�+ � ����*(��� � ���!����� � #���� 2�� .���% 7=+07�?0���

(������ C' �0�70$ �!��!���� ����� �( ��( ��� ��� ���� �! �& �#&� �������#� $% �'% ��� ���'% =A+ 2��?2���

( ��� C'�'�' �0�72$ :�!������������ 8� �����'����* 2��������!�* ����� �� ����� #����� �;�(+ /�6� ��� ;����+ ��A�+ ���$�9�����E A������� / ���+ ��� ��2?�77�

���� �� &'&'� ������ %'!' ��� !���� � !' �0���$ 5� ����� 8�#������'����� ������!���� �� #����� �� ���� �1���*�+ >� �����&���� � A�A�+ ���$� H�, C� *E 6� ��! ;�**� + ��� ���?�2��

������ #'3' ��� ������ %'!' �0�7�$ 5&� ���� �=����� �� � #�!���� ������ � �� ����� !������ #���� #�*���% 88+ ��0?����

�� &'� 3 ��� 3'� !������� �'� ����� '9'� 2���� ('� 3 ���� 3' ��������� ��� C' �0���$ 5&� ���� �=����� �� ���������� � #�!���� ������ �� �� �� �� ������ ���� � �� �!��� # �� @ �� ) ��&��� � (�& ��(���� ����% �����'% ����*�% 7$6+ ���?����

��� ����� !'2' ��� � �� �� 2' �0��2$ 9��� �� �#� � ��� �#� �!�&�&�!� �� ����� ��� �������� 8� ,��*���� �� #����#�*����*+ B��' � �1���� ���+ 6�3� ��� 6�!� �+ �A�+ ���$�@� !��E �� ��#� I� !�#+ ��� �7�?2���

� @!��*,�!! /�!��&��# 9��+ "�� #���� $������ �����$+ 77� ��?0��

0�� -�� ���'� �� �!�