Bacterial response to  

membrane‐active peptide antibiotics  

   

Dissertation to obtain the degree Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) 

at the Faculty of Biology and Biotechnology, International Graduate School Biosciences, 

Ruhr University Bochum  

at the department 

Microbial Biology   

submitted by 

Michaela Wenzel  

from Essen 

  

Bochum, April 2013    

 Advisor: Jun. Prof. Dr. Julia E. Bandow Second Advisor: Prof. Dr. Dr. Dr. med. habil. Hanns Hatt  

  

Bakterielle Antwort auf 

membranaktive Peptid‐Antibiotika  

   

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) 

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften, 

Ruhr‐Universität Bochum  

angefertigt am 

Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen   

vorgelegt von 

Michaela Wenzel  

aus Essen 

  

Bochum, April 2013    Referent: Jun. Prof. Dr. Julia E. Bandow Korreferent: Prof. Dr. Dr. Dr. med. habil. Hanns Hatt 

  

Vielen Dank… 

 

all denen, die zum erfolgreichen Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, insbesondere  

 

Frau  Jun. Prof. Dr.  Julia Bandow  für die Ermöglichung dieser Arbeit, die Bereitstellung des 

interessanten und ergiebigen Themas und ihr wissenschaftliches Engagement. 

Herrn  Prof.  Dr.  Dr.  Dr.  med.  habil.  Hanns  Hatt  für  die  freundliche  Übernahme  des 

Korreferats. 

meinen Kooperationspartnern Nils Metzler‐Nolte, Hans‐Georg Sahl, Dagmar Zweytick, Heike 

Brötz‐Oesterhelt, Ute Krämer, Ralf Erdmann, Dörte Becher, Caroline May, Ronald Gust, Ingo 

Ott  und  Suzana  Straus. Ganz  besonderer Dank  gilt  Iulia  Chiriac,  Bauke Albada  und Malay 

Patra. 

allen kollaborierenden TAs, insbesondere Petra Düchting, Monika Bürger, Stephanie Tautges 

und Pascal Prochnow. 

meinen Studenten Bastian Kohl, Jennifer Stepanek, Christoph Senges und Patrick Schriek für 

ihr erfolgreiches Mitwirken an dieser Arbeit und all den Unfug im Labor. 

allen Mitarbeitern des Zentralen Isotopenlabors,  insbesondere Stephan Spöllmann, Thomas 

Lenders und Michael Siewert,  für die exzellente  technische Unterstützung und amüsanten 

Flur‐Gespräche. 

allen  Mitarbeitern  des  Lehrstuhls  Biologie  der  Mikroorganismen,  insbesondere  der 

Mikrobiellen  Antibiotikaforschung,  für  das  angenehme  Arbeitsklima  und  die 

freundschaftliche  Atmosphäre.  Besonders  danken  möchte  ich  Jan  Lackmann  und  Nadja 

Raatschen für all die amüsanten Episoden im Labor und darüber hinaus. 

 

sowie all meinen Freunden und meiner Familie für ihren ständigen Rückhalt. 

   

I

  

The most exciting phrase to hear in science, the one that heralds new discoveries,  

is not 'Eureka!' but 'That's funny ...' 

‐ Isaac Asimov ‐ 

 

 

 

   

II

  

Contents 

Abbreviations                            1 

A  Introduction                           3 

  1  End of an era ‐ dawn of a new age of antibiotics               3 

2  Antimicrobial peptides ‐ ancient molecules to combat modern superbugs       4 

    2.1  Structural diversity of natural antimicrobial peptides           5 

  2.2  Synthetic antimicrobial peptides                 6 

  2.3  Organometal‐substituted peptidomimetics               8 

3  Mechanisms of action of membrane‐targeting antimicrobial peptides         9 

    3.1  Specific ion transport                    9 

3.2   Membrane interaction of RW‐rich antimicrobial peptides         11 

4  The Gram‐positive cell envelope                 15 

    4.1  The cell wall and its biosynthesis               15 

    4.2  The cytoplasmic membrane and membrane biogenesis         18 

    4.3  The physiological role of the bacterial membrane           20 

    4.4  Membrane stress response                 23   

5  Proteomics in antibiotic research                        23 

  6  Objectives                       25 

B  Proteomic  signature  of  fatty  acid  biosynthesis  inhibition  available  for  in  vivo 

mechanism of action studies                    27 

C  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects  differences  in 

interaction with the cytoplasmic membrane               35 

D  Modulating  the  activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing  antibacterial 

peptides with N‐terminal metallocenoyl groups               45 

E  An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins         58 

F  Influence  of  lipidation  on  the  mechanism  of  action  of  an  RW‐rich  antimicrobial 

peptide                        121 

G  Quantitative  tracing  of  ruthenocene  derivatives  for  subcellular  localization  of 

antimicrobial peptides in bacteria                 149 

H  Ferrocene‐  and  ruthenocene‐specific  modulation  of  the  mechanism  of  action  of 

metal‐substituted short antimicrobial peptides             167 

I  Analysis of the mechanism of action of potent antibacterial hetero‐tri‐organometallic 

compounds ‐ a structurally new class of antibiotics            201 

Contents

III

  

J  Structural  optimization  of  an  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compound: 

Identification  of  the  redundant  organometallic  moiety  required  for  antibacterial 

activity                        243 

K   Discussion                       288 

  1  Proteomic signatures                  288 

2  Mechanism of action of MP196, a short cationic antimicrobial peptide     293 

3  Bacterial stress adaptation to short cationic antimicrobial peptides     298 

4  MP196 derivatives: novel implications for antibacterial drug discovery     301 

5  Organometallic PNA derivatives: a novel antibiotic class         303 

6  Metal complexes in antibiotic drug discovery           307 

7  Antimicrobial peptides as therapeutics: possibilities and limitations     309 

L  Summary                       311 

M  Zusammenfassung                     312 

N  References                       314 

O  Publications                       330 

P  Appendix                       334 

  1  Catalog of proteomic response profiles to antibiotics         335 

  2  Curriculum vitae                   402 

3  Contributions to the integrated publications and manuscripts        403 

4  Erklärung                     405 

   

   

   

Contents

IV

  

Abbreviations 

Abbreviations used in the introduction and discussion are listed here. Specific abbreviations 

used  in  the  individual publications  and manuscripts  are explained  therein.  Standard units 

according  to  the  International  System  of  Units  (SI)  and  chemical  formulas  are  not  listed 

separately. The single or triple letter codes are used for designation of standard amino acids.  

Abu      2‐aminoisobutyric acid 

ACP      acyl carrier protein 

ATP      adenosine triphosphate 

CoA      coenzyme A 

CWB      cell wall biosynthesis 

Cyt c      cytochrome c 

Dha       2,3‐dehydroalanine 

Dhb       (Z)‐2,3‐dehydrobutyrine 

DNA      deoxyribonucleic acid 

ECF      extracytoplasmic function 

e.g.      exempli gratia 

et al.      et alii 

i.e.      id est 

FAB      fatty acid biosynthesis 

Fc      ferrocene 

FcPNA      ferrocene peptide nucleic acid 

GFP      green‐fluorescing protein 

LTA      lipoteichoic acid 

MRSA      methicillin‐resistant Staphylococcus aureus 

NAD(P)+    nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) 

PBP      penicillin‐binding protein 

PLB      phospholipid biosynthesis 

PNA      peptide nucleic acid 

Q      ubiquinone 

Rc      ruthenocene 

RcPNA     ruthenocene peptide nucleic acid 

Abbreviations

1

  

RNA      ribonucleic acid 

ROS      reactive oxygen species 

RSC      respiratory chain 

RW‐rich    arginine‐tryptophan‐rich 

SAR      structure‐activity relationship 

UDP      uridine diphosphate 

UDP‐GlcNAc    uridine diphosphate N‐acetyl glucosamine 

UDP‐MurNAc    uridine diphosphate N‐acetyl muramic acid 

WTA      wall teichoic acid 

 

   

Abbreviations

2

  

A  Introduction 

1   End of an era ‐ dawn of a new age of antibiotics 

Selman Waksman,  the  discoverer  of  streptomycin,  coined  the  term  antibiotic  for  a  low‐

molecular‐weight compound  that  inhibits growth of microorganisms at  low concentrations 

but does not inhibit growth of its producer [Waksman, 1947]. Already before, the concept of 

antibacterial therapeutic agents was established by Paul Ehrlich  in the  late 19th century.  In 

search for a “magic bullet” that kills pathogenic bacteria in the human body without harming 

the patient,  Ehrlich developed  the  synthetic  arsenic drug arsphenamin. Being  successfully 

applied  in  the  treatment of syphilis, arsphenamin sold under  the  trademark salvarsan was 

the first antibiotic agent  in clinical use.  It was followed by a variety of antibiotics produced 

by organisms from all domains of life as well as of synthetic origin. The discovery and clinical 

application  of  the  sulfonamides  and  penicillins  heralded  the  “golden  age  of  antibiotics”, 

revolutionizing treatment of infectious diseases [Amyes, 2001].  

The  biosynthesis  and  integrity  of  DNA,  RNA,  proteins,  and  the  cell  wall  constitute  the 

antibacterial targets most heavily exploited so far. Although functionality of these structures 

is  essential  for  viability,  the  remarkable  genetic  adaptability  of  bacteria  has  led  to  the 

development  of  antibiotic  resistances. Accumulation  and  spread  of  resistance  genes  gave 

rise  to multi‐resistant  bacteria,  so‐called  superbugs.  The most  prominent  superbug  is  the 

methicillin‐resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which  is  insensitive against a variety of 

antibiotic  classes  including  β‐lactam  antibiotics  [Waters  et al., 2011].  Infections with  such 

multi‐resistant strains are highly difficult to treat and constitute a serious challenge to public 

health.  The  number  of  newly  approved  antibiotic  agents  steadily  decreases  since  the 

1990ies, marking  the  end  of  the  golden  age  of  antibiotics  [Wenzel  and  Bandow,  2011]. 

Together,  increasing bacterial resistance and the decreasing number of antibiotic approvals 

have founded an urgent need for novel, resistance‐breaking antibacterial agents.  

Addressing  the bacterial  resistance problem, structurally novel antibiotic classes as well as 

compounds  with  novel  or  multiple  targets  are  highly  desirable  [Brötz‐Oesterhelt  and 

Brunner, 2008; Patra et al., 2012a]. Development of completely novel antibacterial agents, 

re‐evaluation of  so  far neglected compound classes, and alternative  therapeutic strategies 

might open up new avenues  in antibiotic  treatment and herald a new era of antibacterial 

therapy. 

A Introduction

3

  

2  Antimicrobial peptides ‐ ancient molecules to combat modern superbugs 

The antibiotic class of antimicrobial peptides often exhibits broad‐spectrum activity against 

both  Gram‐positive  and  Gram‐negative  bacteria.  Some  peptides  are  further  known  to 

inactivate viruses, fungi, protozoa, and even cancer cells [Guiliani et al., 2007]. Antimicrobial 

peptides naturally occur  in all domains of  life and constitute one of  the evolutional oldest 

host  defense  strategies.  In  vertebrates  they  are  part  of  innate  immunity.  They  inactivate 

pathogenic  microorganisms  and  modulate  the  immune  response  [Ganz,  2003].  In 

invertebrates and plants, both of which  lack adaptive  immunity, antimicrobial peptides are 

the major players  in host defense  [Fritig et al., 1998; Meister et al., 1997]. Bacteria mainly 

secrete  antimicrobial  peptides  in  order  to  inhibit  growth  of  competing microorganisms. 

Moreover,  bacterial  peptides  have  recently  been  shown  to  trigger  signaling  cascades  in 

plants and to induce plant resistance against virus infections [Henry et al., 2011, Desoignies 

et  al.,  2012].  Although  antimicrobial  peptides  have  been widely  distributed  in  nature  for 

millions of years, only very few resistances are known today [Huang et al., 2010]. Thus, they 

hold great promise as potential therapeutic agents.  

The first antimicrobial peptides attracting interest as antibiotics were the gramicidins, which 

were  isolated  from  the Gram‐positive  soil bacterium Bacillus brevis  [Hotchkiss and Dubos, 

1940a;  Hotchkiss  and  Dubos,  1940b].  They  were  the  first  antimicrobial  peptides 

manufactured  commercially  and  were  predominantly  administered  in  wound  treatment 

[Gause  and Brazhnikova, 1944]. Clinical  application of  gramicidin was  followed by  several 

peptide‐based antibiotics. One of these was the glycopeptide vancomycin, which has been 

the first‐line treatment for multidrug‐resistant S. aureus  infections for almost 30 years [Tan 

et al., 2000; Moellering RC Jr, 2006]. However, vancomycin‐resistant enterococci as well as 

vancomycin‐tolerant  and  ‐resistant  S. aureus  strains  started  to  spread  in  the  late 1980ies 

[Lütticken  and  Kunstmann,  1988;  Smith  et  al.,  1999].  Today,  the  cyclic  lipopeptide 

daptomycin is one of the last resort antibiotics against infections with vancomycin‐resistant 

Gram‐positive  bacteria  [Boucher  and  Sakoulas,  2007].  However,  even  tolerance  against 

daptomycin  has  been  described  for  S.  aureus  rendering  bacteria  also  cross‐resistant  to 

vancomycin and telavancin [Bertsche et al., 2011, Rose et al., 2012]. Further peptide‐based 

antibiotics are currently evaluated  in clinical studies hopefully giving rise to the resistance‐

breaking therapeutics of tomorrow [Butler and Cooper, 2011]. 

A Introduction

4

  

2.1   Structural diversity of natural antimicrobial peptides 

Antimicrobial peptides are structurally diverse. Their  length might vary  from 4 to over 100 

amino acids and their secondary structures can be characterized by linear, α‐helical, β‐sheet, 

or  complex  structures  [http://aps.unmc.edu/AP/main.php].  Organisms  might  genetically 

encode  antimicrobial  peptide  sequences  and  use  the  transcription  and  translation 

machineries  for  their  synthesis. Several microorganisms are known  to  synthesize peptides 

independently from the ribosome complex. Such peptides are referred to as non‐ribosomal. 

Their production requires complex biosynthesis machineries as non‐ribosomal peptides are 

often heavily modified containing e.g. cyclic structures, glycosylations, or lipid modifications 

[Samel  et  al.,  2008].  Vancomycin,  daptomycin,  and  the  gramicidins  belong  to  this  class 

[Caboche  et  al.,  2008;  http://bioinfo.lifl.fr/norine/].  However,  ribosomally  synthesized 

peptides might undergo heavy posttranslational modifications. The  lantibiotics, which hold 

great promise  for  clinical  and biotechnological  applications,  are  characterized by  complex 

secondary  structures.  They  contain  the  amino  acid  lanthionine, which  often  forms  sulfur 

bridges resulting in polycyclic peptide structures [Bierbaum and Sahl, 2009]. Lantibiotics can 

be  further  subdivided  into  class  A,  which  comprises  long  flexible  molecules  tending  to 

interact with  the  bacterial membrane,  and  class  B,  comprising more  globular molecules 

[Chatterjee et al., 2005]. The probably most prominent  lantibiotic  is  the  food preservative 

nisin, a typical class A member (Figure 1).  

 

 

Figure  1:  Structures  of  selected  cell  wall  biosynthesis‐inhibiting  lantibiotics.  Nisin  and 

gallidermin belong  to  the  lantibiotic class A and  integrate  into  the membrane. Mersacidin, 

more  globular  in  structure,  belongs  to  class  B  and  does  not  insert  into  the  lipid  bilayer. 

Structures were freely adapted according to Chatterjee et al., 2005, and Bonelli et al., 2006. 

Dha: 2,3‐dehydroalanine; Dhb: (Z)‐2,3‐dehydrobutyrine;  Abu: 2‐aminoisobutyric acid.  

A Introduction

5

  

Nisin  binds  to  the  cell wall  precursor  lipid  II  using  it  as  docking molecule  for  forming  an 

unselective  pore  [Reisinger  et  al.,  1980;  Brötz  and  Sahl,  2000;  Hasper  et  al.,  2004]. 

Gallidermin  and mersacidin  (Figure  1)  are  examples  for  lantibiotics,  which  are  currently 

examined for their potential applications. Similar to nisin, they  inhibit cell wall biosynthesis 

by  binding  the  peptidoglycan  precursor  lipid  II  [Schneider  and  Sahl,  2010].  Gallidermin 

integrates into the membrane and, depending on the phospholipid composition, forms nisin‐

like pores [Christ et al., 2008]. Class B lantibiotic mersacidin does not interact with the lipid 

bilayer [Brötz et al., 1998].  

Modifications  of  antimicrobial  peptides  such  as  the  sulfide  bonds  or  non‐proteinogenic 

amino acids within  the  lantibiotic  structure are known  to  confer higher  resistance against 

proteolysis [Bierbaum et al., 1996; Chatterjee et al., 2005]. In fact, proteolysis prevents oral 

administration  of  several  peptide  antibiotics,  strictly  limiting  their  applicability 

[Schellenberger et al., 1994]. Additionally, several peptides possess cytotoxic and hemolytic 

activity or might trigger  immune responses, possibly  leading to anaphylactic shock  [Polk et 

al.,  1991].  Toxicity  and  immunogenicity  thus  additionally  restrict  several  antimicrobial 

peptides to topical administration.  

2.2   Synthetic antimicrobial peptides 

To address these problems, a variety of synthetic peptides and peptide derivatives has been 

developed. Synthetic approaches often feature the naturally widely distributed amphiphilic 

peptide  archetype,  characterized  by  hydrophilic  amino  acids  such  as  tryptophan  and 

phenylalanine  and  cationic  side  chains  like  arginine  and  lysine.  Such  peptides  are  often 

simply referred to as cationic antimicrobial peptides. The amphiphilic amino acid pattern  is 

thought  to  facilitate  interaction  with  bacterial  membranes,  where  many  antimicrobial 

peptides act [Yeaman and Yount, 2003].  

Especially,  arginine‐tryptophan‐rich  (RW‐rich) peptides have been  extensively  investigated 

and a variety of both fully and semi‐synthetic peptides with excellent antibacterial activities 

has been developed  [Rathinakumar et al., 2008; Rathinakumar et al., 2009; Sharma et al., 

2010].  In an attempt  to  reveal  the minimal pharmacophore of short cationic antimicrobial 

peptides,  the hexapeptide RWRWRW‐NH2  (MP196, Figure 2) was developed.  It  represents 

the shortest alternating RW sequence possessing potent antibacterial activity [Strøm et al., 

2003]. 

A Introduction

6

  

 

 

Figure 2: MP196 and organometallic derivatives. Peptides of the MP series are typically N‐

terminally  amidated  or modified. Both  all‐L  and  all‐D  versions  of  the peptides  have  been 

synthesized, all of them displaying potent activity against Gram‐positive bacteria. Structures 

were kindly supplied by Bauke Albada. Rc: ruthenocene, Fc: ferrocene. 

 

Its short and simple sequence together with its high antibacterial and low cytotoxic activities 

[Albada et al., 2012b]  rendered MP196 an  ideal  lead  structure  for  chemical derivatization 

approaches. Earlier  reports on  chemical modification of other RW‐rich peptide  sequences 

revealed  potent  strategies  to  overcome  some  of  the  typical weaknesses  of  antimicrobial 

peptides. Thus, both acetylation and amidation of the peptide termini as well as introduction 

of  D‐  and  β‐amino  acids  have  been  shown  to  efficiently  enhance  resistance  against 

proteolysis [Raguse et al., 2002; Hunter et al., 2005; Nguyen et al., 2010].  

MP196  and  its  derivatives  usually  carry  a  C‐terminal  amide  group  or  other  C‐terminal 

modifications  to  provide  higher  stability.  In MP196‐based  derivatization  series,  aiming  at 

improved activity against  resistant bacteria,  lipid chains and organometallic moieties were 

introduced  to  the  hexapeptide  structure.  Lipidation  of  the  termini  with  acyl  chains  of 

different  lengths,  attached  by  an  additional  lysine  side  chain,  was  shown  to  enhance 

antibacterial activity, especially against Gram‐negative bacteria. However, at the same time 

it  featured hemolysis  [Albada et al., 2012a]. Systematic L‐ to D‐amino acid substitutions of 

such lipidated peptides have recently been shown to fully eliminate the hemolytic potential, 

while completely retaining antibacterial activity [Albada et al., submitted].  

Further,  MP196‐based  peptides  conjugated  with  organometallics,  precisely  metallocene 

residues featuring cobalt, iron, and ruthenium, were developed, two of which are displayed 

in Figure 2  [Chantson et al., 2005; Chantson et al., 2006; Albada et al., 2012b]. Especially 

ferrocene has been suggested  to award additional metal‐specific mechanistic  features due 

to  its potential  to participate  in electron  transfer. Despite possessing  the  same  structural 

features as ferrocene, ruthenocene does not seem to exhibit considerable redox properties 

A Introduction

7

  

[Dubar et al., 2011; Biot et al., 2012]. Substitution of the N‐terminal arginine of MP196 for 

the  respective  metallocene  moieties  resulted  in  modified  activities  ranging  from 

considerably  lowered  to  significantly  improved  antibacterial potency,  altered  antibacterial 

activity  spectra,  and modified  kinetic  properties  [Chantson  et  al.,  2005;  Chantson  et  al., 

2006; Albada et al., 2012b]. 

2.3   Organometal‐substituted peptidomimetics 

Another approach to developing peptide‐based antibiotics  is the substitution of amino acid 

side chains with diverse non‐peptidic structures. The resulting compounds are referred to as 

peptidomimetics and often exhibit higher serum stabilities [Haug et al., 2008; Liskamp et al., 

2011].  Diverse  peptidomimetic  classes  have  been  developed,  typically  displaying  a 

membrane‐related mode of action following the example of natural antimicrobial peptides. 

The  peptide  nucleic  acid  (PNA)  compounds  were  designed  as  peptidic  DNA  analogs  for 

antisense approaches and have  recently been employed as antibiotic agents  [Hatamoto et 

al.,  2010;  Bai  et  al.,  2012].  Derivatizing  the  PNA  backbone  structure  with  different 

organometallic moieties yielded tri‐organometallic PNA compounds  (Figure 3)  [Patra et al., 

2010]. 

 

 

Figure  3:  Structures  of  tri‐organometallic  compounds  with  PNA  backbones.  A  PNA 

backbone  was  combined  with  an  alkyne  side  chain,  a  cymantrene,  a  (di‐picolyl)Re(CO)3 

moiety,  and  a  ferrocene or  ruthenocene,  respectively.  Structures were  kindly  supplied by 

Malay Patra. 

 

The PNA backbone was complemented with an alkyne side chain, a manganese‐containing 

residue  (cymantrene), a  rhenium complex  (di‐picolyl)Re(CO)3), and either a  ferrocene or a 

ruthenocene. The resulting compounds, FcPNA and RcPNA, are structurally completely new. 

This might be a favorable feature in terms of resistance development. Such novel structures 

might circumvent already established resistances [Patra et al., 2012a]. However, such heavily 

A Introduction

8

  

modified  peptidomimetics  constitute  a  so  far  unprecedented  structural  class  and  could 

exhibit completely different modes of action. 

3  Mechanisms of action of membrane‐targeting antimicrobial peptides 

Although  antimicrobial peptides  are described  that  target  intracellular  structures,  such  as 

the  DNA  gyrase‐targeting  microcin  B17  [Parks  et  al.,  2007],  most  peptides  affect  the 

bacterial cell envelope, which consists of  the cytoplasmic membrane,  the cell wall, and,  in 

Gram‐negative bacteria, the outer membrane. Within the mechanistic subclass of envelope‐

targeting peptides different cell wall and membrane structures as well as their biosynthetic 

routes might be affected [Yeaman and Yount, 2003].  

3.1   Specific ion transport 

The most prominent mechanism of  action of  antimicrobial peptides  is based on  changing 

permeability of the cytoplasmic membrane for ions. Antibiotic‐mediated ion transport might 

be  highly  selective  for  one  or  few  ions  or  rather  unspecific  depending  on  the  individual 

molecular  translocation  mechanism.  Potassium  as  the  smallest  metal  ion  is  most  often 

described  to  be  transported.  Translocation  of  potassium  ions  across  the  bilayer  leads  to 

break‐down of the membrane potential, a widely distributed feature of peptide antibiotics. 

The mechanisms of  action of  the peptide  antibiotics  valinomycin,  gramicidin A, nisin,  and 

gramicidin S differ considerably and represent four typical ways of  ion translocation across 

biological membranes (Figure 4). 

Ionophores  transport  ions  across  the  membrane  and  consequently  disrupt  the 

electrochemical  gradient.  They  are  often  secreted  by  soil  bacteria  to  outcompete  other 

microorganisms.  The  divalent  cation  ionophores  ionomycin  and  calcimycin  have  been 

supposed  to  extract metal micronutrients  from  competing microorganisms making  them 

available  for  uptake  by  the  producer  [Raatschen  et  al.,  2013].  They  might  be  peptides 

(valinomycin,  gramicidin  A)  but  non‐peptidic  ionophores  are  common  (calcimycin, 

ionomycin). Ionophores are subdivided into carriers, such as the highly selective potassium‐

transpoting  valinomycin,  and  channels,  such  as  the  potassium/sodium‐transporting 

gramicidin A [Duax et al., 1996]. Carriers are mobile in the lipid phase. They bind ions on one 

side of the bilayer, diffuse through the membrane, and release them on the other side [Duax 

A Introduction

9

  

et al., 1996]. Channels might  reach  transport  rates up  to  four orders of magnitude higher 

than carrier ionophores [Haynes et al., 1974].  

While  ionophores  display  different  grades  of  ion  selectivity,  pore  formers  facilitate 

membrane  transport of any molecule  large enough  to pass  the pore. A well‐characterized 

example is the lantibiotic nisin, which forms unspecific membrane pores after initial binding 

to  the cell wall precursor  lipid  II. After  reaching a certain concentration  threshold, a nisin‐

lipid II pore is formed large enough to allow passing of ions and small amino acids [Reisinger 

et al., 1980; Hasper et al., 2004]. Thus, nisin displays a dual mechanism compromising cell 

wall  biosynthesis  and  forming  membrane  pores  [Brötz  and  Sahl,  2000],  a  feature 

contributing to low resistance development [Brötz‐Oesterhelt and Brunner, 2008]. A similar 

mechanistic duality is known for gallidermin. While nisin needs lipid II as a docking molecule 

and is able to form pores in different membranes, gallidermin might integrate independently 

from  lipid  II, but  its ability  to  form pores depends on membrane  thickness and  fatty acid 

branching [Christ et al., 2008].  

 

Figure 4: Mechanisms of action of potassium transport. Valinomycin is a potassium‐specific 

carrier,  gramicidin  A  a  channel  ionophore  transporting  potassium  and  sodium,  and  nisin 

forms  large unselective pores. Gramicidin S probably  induces clusters of negatively charged 

phospholipids.  The  exact  mechanism  of  potassium  translocation  by  gramicidin  S  is  yet 

unknown. 

 

Gramicidin  S  is  a  cationic  peptide  that  structurally  differs  from  the  channel‐forming 

gramicidins  A,  B,  and  C.  The  mechanism  of  membrane  interaction  of  gramicidin  S  still 

remains  to  be  fully  elucidated.  However,  it  was  reported  to  induce  formation  of 

A Introduction

10

  

phospholipid  domains.  It  has  been  proposed  that  its  two  positive  charges  trigger 

accumulation of negatively  charged phospholipids around  the peptide molecule. This  lipid 

de‐mixing  is believed  to  result  in  “frozen” membrane  areas  impairing  functionality of  the 

membrane  [Kaprel’iants  et  al.,  1977;  Vostroknutova  et  al.,  1981]. Gramicidin  S  facilitates 

transport of potassium  ions  [Katsu  et al.,  1989].  This might be  attributed  to  the distance 

between  its  two positive charges, which are  thought  to  force apart  the phospholipid head 

groups. It was further described to  inhibit components of the respiratory chain (RSC) [Mogi 

et al., 2008].  

The mechanisms  of  cationic  antimicrobial  peptides  in  general,  but  especially  of  RW‐rich 

peptides,  are  less well  characterized.  Forming pores  is most  frequently discussed  as  their 

mode of action, however different models of membrane interaction are proposed. 

3.2  Membrane interaction of RW‐rich antimicrobial peptides 

RW‐rich  short  cationic  peptides,  such  as  cathelicidins  and  lactoferricins,  are  consistently 

described  to  interact  with  and  typically  integrate  into  the  bacterial membrane.  Several 

peptides were shown to enhance membrane permeability for  ions and/or  larger molecules 

[Chan  et  al.,  2006].  Different  models  for  membrane  disruption,  i.e.  influencing  the 

membrane structure in a way leading to rupture of the bilayer, are currently discussed. Most 

models  were  established  to  describe  the membrane  interaction  of  α‐helical  amphiphilic 

peptide  structures  resulting  in  forming of pores or membrane holes  [Sato and Feix, 2006; 

Teixeira et al., 2012]. The prevailing models are the barrel‐stave, toroidal pore, and carpet 

mechanism models (Figure 5A‐D) [Costa et al., 2011].  

The barrel‐stave model proposes initial attachment of amphiphilic peptides to the surface of 

the  outer  membrane  leaflet  (Figure  5A).  Perpendicular  membrane  integration  leads  to 

organized, barrel‐like formation of a stable pore (Figure 5B). Peptides are packed parallel to 

the phospholipid chains resulting  in a pore fully  lined by the peptides themselves [Melo et 

al., 2009].  

In  contrast,  the  toroidal  pore  model  suggests  less  organized  but  still  perpendicular 

membrane  insertion  after  initial  surface  contact  (Figure  5C).  Thereby,  phospholipids  are 

forced into an altered alignment promoting the forming of a pore consisting of both peptide 

bundles and  lipids  [Melo et al., 2009]. This undefined conformation allows the peptides to 

disassociate from the pore and cross the membrane. Thus, the toroidal pore model provides 

A Introduction

11

  

explanation for cell penetration and leaves room for the binding of antimicrobial peptides to 

intracellular structures [van’t Hof et al., 2001].  

 

 

Figure 5: Models of the interaction of antimicrobial peptides with membranes. (A) Binding 

of  amphipathic  α‐helical  peptides  to  the  membrane  surface  (red:  hydrophilic,  blue: 

hydrophobic). (B) Barrel‐stave model (Melo et al., 2009), (C) toroidal pore model (van’t Hof 

et  al.,  2001),  (D)  carpet  mechanism  model  (Steiner  et  al.,  1988),  (E)  molecular 

electroporation model  (Miteva  et  al.,  1999),  (F)  sinking  raft model  (Pkorny  et  al.,  2002; 

Pkorny and Almeida, 2004), (G) interfacial activity model (Wimley, 2010). 

  

A Introduction

12

  

Recently, a modified toroidal pore model was established. According to this concept, a  less 

rigid  peptide  and  lipid  conformation  results  in  pores  lined mainly  by  phospholipid  head 

groups instead of the peptide helices [Leontiadou et al., 2006]. 

The  carpet  mechanism  resembles  detergent  behavior.  Peptides  bind  to  the  membrane 

surface and cause micellation of the  lipid bilayer  (Figure 5D). As a result,  lipid portions are 

removed from the membrane enhancing permeability up to the point of cell lysis [Steiner et 

al., 1988]. Although the carpet model has been established for α‐helical peptides,  it  is also 

applicable for small unstructured peptides. 

In  addition  to  these  “classical” models,  several  new  approaches  to  explain  antimicrobial 

peptide  action  have  been  developed  (Figure  5E‐F).  They  are more  applicable  to  smaller 

unstructured peptides, which do not adapt  α‐helical  conformations. However, all of  them 

propose membrane disruption and leakiness. 

In  the  molecular  electroporation  model  it  is  assumed  that  densely  charged  molecules 

binding  to  the membrane  surface  result  in  an  electrostatic  potential  across  the  bilayer. 

When this potential is strong enough (>0.2 V), molecular electroporation occurs resulting in 

membrane  pores.  Established  for  the  α‐helix‐rich  antimicrobial  protein  NK‐lysine,  the 

peptides’ secondary structures are irrelevant in this model as long as the molecule is densely 

charged. Moreover,  the molecular  electroporation model provides  an  explanation  for  cell 

penetration by peptides, which are small enough to enter the  induced pores [Miteva et al., 

1999].  

The  sinking  raft model  likewise works  for  small unstructured peptides. Here,  a  change of 

membrane  curvature  is  believed  to  occur  upon  peptide  binding  to  the  outer membrane 

surface. Possibly accompanied by sinking of peptides into the bilayer, a transient membrane 

pore is formed. The sinking of peptides into the bilayer furthermore explains the presence of 

small  cationic  peptides  in  the  inner membrane  leaflet  [Pkorny  et  al.,  2002;  Pkorny  and 

Almeida, 2004].  

The  interfacial activity model  is based on the  tumultuous chemical heterogeneity between 

the hydrocarbon (lipid) part of the membrane bilayer and the hydrophilic (head group) part 

[Wiener and White, 1992]. By accumulation  in  this  interfacial  zone, antimicrobial peptides 

are believed to deform the lipid bilayer. They promote a deeper, funnel‐like incursion of the 

phospholipid  head  groups  into  the  hydrocarbon  layer, which  perturbs  the  normally  strict 

separation  of  hydrophilic  and  hydrophobic  membrane  parts.  This  intermixture  allows 

A Introduction

13

  

shuttling of polar molecules  through  the bilayer  along  the peptide‐phospholipid  structure 

[Wimley, 2010]. Thus,  the  interfacial activity model does not propose an aqueous channel 

but rather a permeation pathway consisting of both peptides and lipids.  

The interfacial activity model ideally suits RW‐rich peptides due to the nature of tryptophan. 

Owing to its uncharged side chain, tryptophan is typically described as hydrophobic residue. 

However, the π‐electron system of the indole ring displays a significant quadrupole moment. 

Such  a quadrupole  can be  imagined  as  two negatively  charged electron  clouds  extending 

perpendicular  from  each  surface  of  the  positively  charged  ring  structure,  forming  two 

dipoles with the ring plane. It confers a certain polarity to the molecule, which manifests in 

the observation  that  tryptophan  residues do not  always  co‐localize with  the hydrocarbon 

region of  lipid bilayers [Dougherty, 1996; Chan et al., 2006]. Thus,  interfacial  localization of 

RW‐rich peptides  is a coherent deduction of  their structural properties, especially as short 

peptides often do not exhibit distinct secondary structures. 

Another  recently  discussed  hypothesis  proposes  that  the  occurrence  of  holes  in  the 

membrane  is  an  inherent  feature  of  the  dynamic  bilayer  structure  itself  [Fuertes  et  al., 

2011]. The  interaction of peptides with membranes  fosters  curvature  changes, promoting 

transient holes in the bilayer structure. The most important difference to the other models is 

that the peptide structures themselves do not  form the pore or contribute to  its structure 

but  rather  induce  transient  lipid‐lined  pores.  This mechanism  could  be  best  described  as 

“lipocentric pore model”. 

Antimicrobial peptides might also perturb  the phospholipid bilayer,  i.e.  interfering with  its 

architecture without membrane  rupture. So  far, no model describing a non‐disruptive but 

phospholipid  bilayer‐disturbing  interaction  between  antimicrobial  peptides  and  biological 

membranes has been established. 

In  contrast  to  the  huge  efforts  that  have  been  undertaken  to  describe  the  molecular 

interaction  of  antimicrobial  peptides  with  lipid  bilayers,  their  influence  on  bacterial 

physiology  is  not well  understood  yet.  The  cell  envelope  in  general  and  the  cytoplasmic 

membrane  in particular  are essential  cellular  structures. Disturbing  their  functionality has 

manifold different consequences on cellular physiology.  In  the  following,  the bacterial cell 

envelope, its biosynthesis, and its potential as antibiotic target will be described in detail for 

the soil bacterium Bacillus subtilis, a model organism for Gram‐positive bacteria. 

 

A Introduction

14

  

4  The Gram‐positive cell envelope 

Gram‐positive  pathogens  constitute  a  growing  threat  to  public  health. MRSA  is  the  best‐

known Gram‐positive  superbug but also other Staphylococci, Streptococci, and Enterococci 

are worth mentioning.  Gram‐positive  pathogenic  bacteria  obtain  their  perilousness  from 

their remarkable ability to develop and accumulate multiple resistances. Thus, they have at 

least  as much  impact  on  public  health  as  Gram‐negative  pathogens.  Those,  in  contrast, 

possess a notably high inherent antibiotic tolerance. This difference in inherent resistance to 

chemical agents is based on the different composition of their cell envelopes. Gram‐negative 

bacteria  possess  a  cytoplasmic membrane,  a  thin  peptidoglycan  cell  wall,  and  an  outer 

membrane.  Especially  the  outer  membrane  serves  as  very  efficient  barrier  for  larger 

molecules.  It prevents numerous chemicals from approaching the cell wall, the membrane, 

and the cytosol. Thus, it considerably restricts access to any structure that might be targeted 

by  antibiotics. Gram‐positive  bacteria  do  not  possess  an  outer membrane,  resulting  in  a 

higher  susceptibility  to  chemical  stress. Their  cell wall  is much  thicker  than  that of Gram‐

negative  bacteria  conferring  higher  resistance  to  physical  stress  like  osmotic  pressure 

[Madigan and Martinenko, 2006]. Gram‐positive bacteria are highly susceptible to cell wall‐

targeting antibiotics but rapidly develop β‐lactam resistance. 

4.1   The cell wall and its biosynthesis 

The bacterial cell wall serves as protective shield, molecular filter, and outer barrier limiting 

turgor‐dependent cell expansion. Figure 6 shows the cell envelope of Gram‐positive model 

organism B.  subtilis,  a  close  relative of  important pathogens  like  S. aureus. Gram‐positive 

bacteria  possess  a  thick  peptidoglycan  cell  wall  composed  of  multiple  layers  of  N‐

acetylmuramic acid  (MurNAc) and N‐acetylglucosamine  (GlcNAc). Peptide bridges between 

the sugar chains confer high stability to the cell wall structure. Their amino acid composition 

varies between different organisms, though typically D‐amino acids are prevalent [Madigan 

and Martinenko, 2006].  

The Gram‐positive  cell  envelope  further  contains  teichoic  acids.  B.  subtilis  possesses  one 

species  of  lipid‐anchored  teichoic  acids  (lipoteichoic  acids,  LTA)  and  two  wall‐anchored 

species  (wall  teichoic  acids,  WTA).  Lipoteichoic  acids  of  B.  subtilis  consist  of  a 

glycerolphosphate  chain, which  is attached  to a diaglycerol membrane  lipid. Wall  teichoic 

acid chains are mostly composed of sugar units and glycosidically bound to MurNAc. Teichoic 

A Introduction

15

  

acids are involved in cell division and cation homoeostasis and play an important role in cell 

envelope protection as they serve as mechanical barrier. Moreover, their modification with 

positively  charged  D‐alanine  restricts  accessibility  of  the  cytoplasmic  membrane  for 

positively charged antimicrobial peptides [Weidenmaier and Peschel, 2008].  

 

 

Figure 6: The cell wall of B. subtilis. The peptidoglycan layer consists of alternating MurNAc 

and GlcNAc subunits, peptide chains, and teichoic acids (modified according to Weidenmaier 

and Peschel, 2008). LTA: lipoteichoic acid; WTA: wall teichoic acid.  

 

Cell wall  biosynthesis  takes  place  in  the  cytosol  and  at  the  cytoplasmic membrane.  The 

peptidoglycan  precursor  molecule  uridine  diphosphate  (UDP)  MurNAc  pentapeptide  is 

synthesized in the cytosol in five steps from UDP acetylglucosamine. The successive cell wall 

biosynthesis  steps  are  located  at  the membrane.  These membrane‐bound  steps  are  also 

referred  to  as  the  lipid  II  cycle  (Figure  7). UDP MurNAc  pentapeptide  is  attached  to  the 

carrier  lipid  bactoprenol  phosphate  by  the MraY  enzyme  forming  lipid  I.  The  peripheral 

membrane  protein  MurG  converts  lipid  I  to  lipid  II  by  attaching  a  GlcNAc  moiety. 

Successively, the bactoprenol carrier flips across the membrane bilayer transporting the cell 

A Introduction

16

  

wall precursor to the outer membrane surface. Incorporation of the cell wall building block 

into the peptidoglycan layer is performed by penicillin‐binding proteins (PBPs).  

 

 

Figure  7:  The  lipid  II  cycle  in  B.  subtilis.  Intracellularly  synthesized  UDP‐MurNAc 

pentapeptide is converted to lipid II and transported across the membrane by flipping of the 

bactoprenolphosphate. Penicillin‐binding proteins (PBPs) incorporate the precursor into the 

peptidoglycan  layer and crosslink  the peptide chains  (modified according  to Schneider and 

Sahl, 2010).  

 

Penicillin‐binding proteins, which constitute one of the oldest and most successful targets in 

antibiotic  history,  possess  transglycosylase  function,  connecting  the  sugar  subunits,  and 

transpeptidase  function, building  the  interpeptide bridges.  In B.  subtilis,  the pentapeptide 

chain  is  composed of  L‐alanine1, D‐glutamic acid2, meso‐diaminopimelic acid3, and  two D‐

alanine4,5  units.  Direct  peptide  bridges  are  built  between  the  D‐alanine4  and  the meso‐

diaminopimelic  acid3  of  another  pentapeptide  chain,  thereby  cleaving  the  terminal  D‐

alanine5  [Warth  and  Strominger,  1971;  Scheffers,  2012].  In  S.  aureus,  the  pentapeptide 

chains are cross‐linked by a pentaglycine chain, which  is attached  to  the  immature  lipid  II 

molecule  by  the  additional  membrane‐bound  enzyme  complex  FemXAB  located  at  the 

cytosolic side of the lipid bilayer. The mature lipid II is then flipped across the membrane by 

A Introduction

17

  

the  bactoprenol  carrier  and  incorporated  in  the  cell  wall  by  penicillin‐binding  proteins 

[Schneider et al., 2010].  

Following lipid II delivery, bactoprenol pyrophosphate is converted into its mono‐phosphate 

form, which is able to flip back across the membrane, where it is available again for another 

lipid II cycle [Schneider and Sahl, 2010]. The same carrier is also involved in wall teichoic acid 

biosynthesis while  lipoteichoic  acids  are  synthesized  by  direct  addition  of  the  sugar  and 

glycerol components to diaglycerol lipids [Weidenmaier and Peschel, 2008].  

Several antimicrobial peptides are known  to  inhibit distinct  steps of cell wall biosynthesis, 

some of which are displayed  in Figure 7. Lysozyme, an antibacterial protein, enzymatically 

cleaves glycosidic bonds, thus digesting the cell wall [Rupley, 1967]. The β‐lactam antibiotics, 

comprising the penicillins and cephalosporins, are structurally based on a tripeptide and are, 

therefore, peptide antibiotics  in a broader sense. They prevent cross‐linking of the cell wall 

peptidoglycan [Fisher et al., 2005]. Several compounds like glycopeptide vancomycin or the 

lantibiotics  nisin,  gallidermin,  and  mersacidin  bind  to  the  precursor  molecule  lipid  II, 

inhibiting  its  incorporation  into the cell wall. The cyclic peptides bacitracin and friulimicin B 

prevent recycling of the bactoprenol carrier, thus inhibiting both lipid II and wall teichoic acid 

synthesis. Non‐peptidic tunicamycin competitively  inhibits MraY. Cytosolic steps of cell wall 

precursor  biosynthesis  are  inhibited  by  D‐cycloserine  and  the  non‐peptide  antibiotic 

fosfomycin  B  [Schneider  and  Sahl,  2010].  Several  of  these  compounds  are  currently 

employed  as  therapeutics  demonstrating  the  still  attractive  clinical  potential  of  cell wall 

biosynthesis inhibitors.  

4.2   The cytoplasmic membrane and membrane biogenesis 

The  cytoplasmic membrane  constitutes  the main  antibiotic  target  of most  antimicrobial 

peptides. Membrane  composition might  differ  considerably  even  between  closely  related 

bacterial species. Additionally,  it crucially depends on the growth conditions. The charge of 

the phospholipid head groups as well as  the  length and branching of  the  fatty acyl chains 

critically determines bacterial  susceptibility  to membrane‐active  compounds  [Christ  et al., 

2008; Cheng et al., 2011]. Although different B. subtilis membrane  lipid compositions have 

been  reported,  neutral  to  polar  lipid  ratios  in  the  range  of  30:70  are  most  frequently 

described  in the  literature. The main polar phospholipid species  is consistently reported to 

be phosphatidylglycerol  followed by phosphatidylethanolamine. Diaglycerol  lipids are most 

A Introduction

18

  

abundant among the neutral lipid portion [Bishop et al., 1967; den Kamp et al., 1969; Clejan 

et al., 1986; López et al., 1998; Seydlová et al., 2008].  

Membrane  biogenesis  consists  of  a  repeated  cycle  of  precursor  condensation,  reduction, 

dehydration, and a second  reduction step  (Figure 8).  In contrast  to e.g. Escherichia coli, B. 

subtilis is able to synthesize both straight and branched‐chain fatty acids by use of different 

precursors for the  initial condensation step [Fujita et al., 2007]. With over 90% of the total 

fatty  acids  being  branched,  B.  subtilis  displays  high  membrane  fluidity  under  standard 

growth conditions  [Clejan et al., 1986]. After completing  the condensation and elongation 

cycles,  fatty acids are attached to the phospholipid head groups and  incorporated  into the 

cytoplasmic membrane.  

 

 

Figure  8:  Composition  and  biogenesis  of  the  cytoplasmic membrane  of  B.  subtilis.  The 

amount of polar phospholipids (dark grey) predominates  in the B. subtilis membrane while 

fewer  lipids  feature  neutral  head  groups  (light  grey).  Branched  fatty  acyl  chains  clearly 

predominate. Fatty acyl branching is adjusted by initial condensation of different precursors 

during fatty acid biosynthesis (modified according to Fujita et al., 2007). CoA: coenzyme A.  

 

Fatty acid biosynthesis (FAB) has attracted interest as antibiotic target with the discovery of 

platensimycin  from  the  actinomycete  Streptomyces  platensis  [Wang  et  al.,  2006].  Both 

platensimycin and  long known cerulenin target the FabF enzyme, which  initiates  fatty acid 

elongation.  A  triple  inhibitor  of  FabF,  FabHA,  and  FabHB,  which  perform  the  initial 

condensing  steps  utilizing  different  precursors, was  found with  platencin  from  another  S. 

A Introduction

19

  

platensis  strain  [Wang et al., 2007]. The enoyl‐acyl  carrier protein  (ACP)  reductase FabI  is 

inhibited  by  triclosan, which  is  clinically  applied  in  skin  infections  and  is  further  used  in 

disinfectants and personal care products [von der Ohe et al., 2012]. So far, the only peptide 

antibiotic  described  to  target  fatty  acid  biosynthesis  is  andrimid,  which  was  already 

discovered  in the  late 1980ies [Fredenhagen et al., 1987]. Almost two decades  later,  it was 

found  to  inhibit  the  acetyl‐coenzyme  A  (CoA)  carboxylases  (AccABCD)  [Pohlmann  et  al., 

2005], which recently advanced as novel antibiotic targets [Freiberg et al., 2004; Freiberg et 

al., 2005].  

Fatty acid biosynthesis  is considered an attractive antibiotic  target pathway. Platensimycin 

and platencin display excellent antibacterial activity but are non‐toxic  for mammalian cells 

[Martens and Demain, 2011]. However, their in vivo activities are limited. Mainly attributed 

to poor pharmacokinetics,  this effect  started  a  controversy  about  the essentiality of  fatty 

acid biosynthesis  in bacteria during  infection. Brinster et al. provided evidence that several 

Gram‐positive pathogens might use  fatty acids  from  the blood stream rendering  fatty acid 

biosynthesis inhibitors ineffective [Brinster et al., 2009; Zlitni and Brown, 2009]. Balemans et 

al. indeed could show that this is not true for S. aureus [Balemans et al., 2010], which could 

recently be correlated with the absence of a feedback regulation mechanism [Parsons et al., 

2011]  suggesting  application  of  fatty  acid  biosynthesis  inhibitors  in  the  treatment  of  S. 

aureus infections. Recently, three novel FabI inhibitors, two of which based on the triclosan 

structure, entered phase I clinical trials [Butler and Cooper, 2011].  

While fatty acid biosynthesis inhibitors are limited to specific application in the treatment of 

S. aureus  infections,  the bacterial membrane  itself  is  an  attractive broad‐spectrum  target 

important for different cellular processes.  

4.3  The physiological role of the bacterial membrane 

The  cytoplasmic  membrane  acts  as  a  permeability  barrier  protecting  the  cytosol  from 

environmental  influences. While  the  cell wall  essentially  constitutes  a mechanical barrier, 

the  membrane  maintains  the  chemical  environment  in  the  cytosol,  restricts  access  for 

harmful  molecules,  and  maintains  the  cellular  milieu.  The  membrane  controls  the 

distribution of ions between the cytosol and the surrounding medium, which contributes to 

the membrane potential and  trans‐membrane  transport  [Lodish et al., 2000].  It harbors a 

A Introduction

20

  

variety of important cellular processes, probably the most important of which is respiration 

(Figure 9).   

Using  reduction  equivalents  derived  from  the  citric  acid  cycle,  electrons  are  transported 

from either complex I or II to ubiquinone, complex III, cytochrome c, and finally complex IV. 

B. subtilis performs aerobic respiration transferring electrons to oxygen as terminal acceptor, 

which is thereby reduced to water [García Montes de Oca et al., 2012]. The complexes I, III, 

and  IV  contribute  to  proton  export.  The  resulting  electrochemical  gradient,  which  is 

composed  of  an  electrical  potential  (charge  separation)  and  a  chemical  concentration 

difference  (molecule  separation),  determines  the  membrane  potential  and  the  proton 

motive  force. The proton motive  force drives several cellular processes  such as adenosine 

triphosphate (ATP) synthesis by the H+‐ATPase. ATP is essential for energy transfer in almost 

all  cellular processes  including DNA, and RNA biosynthesis as well as active  transport and 

signal transduction by kinases. 

 

 

Figure 9: The  respiratory chain  in B. subtilis. The citric acid cycle  feeds electrons  into  the 

respiratory  chain  allowing  proton  translocation  over  the  membrane.  The  resulting 

electrochemical gradient drives ATP synthesis (modified according to García Montes de Oca 

et al., 2012). Electron transport is indicated by orange arrows. Proton transport and related 

processes are indicated by red arrows. Q: ubiquinone. 

21

  

The  proton motive  force  further  directly  drives motility  and  several  transport  processes. 

Therefore, disruption of  the  respiratory  chain  is  likely  to  result  in  impairment of multiple 

cellular processes. Such mechanistic multiplicity is favorable in terms of antibiotic resistance 

development [Brötz‐Oesterhelt and Brunner, 2008].  

Loss of the proton gradient and  in turn of the proton motive force  is not the only effect of 

respiratory chain inhibition. Impaired electron transport might also lead to improper delivery 

of  electrons  to  oxygen,  resulting  in  emergence  of  reactive  oxygen  species  (ROS)  like  e.g. 

superoxide  (O2∙‐),  the hydroxyl  radical  (HO∙), or hydrogen peroxide  (H2O2). Such are highly 

reactive molecules causing DNA, RNA, and protein damage [Mols and Abee, 2011]. Oxidative 

stress  might  constitute  an  additional  mechanistic  component  of  membrane‐targeting 

compounds affecting the respiratory chain and has been proposed to occur after treatment 

with bactericidal antibiotics [Hassett and Imlay, 2007; Kohanski et al., 2007; Foti et al., 2012]. 

However,  newer  studies  could  not  prove  a  correlation  between  bactericidy  and  ROS 

formation [Keren et al., 2013; Liu and Imlay, 2013]. 

Apart  from respiration,  further  important cellular processes are  located at the cytoplasmic 

membrane, which might also be affected by membrane‐active antimicrobial peptides. Thus, 

cell wall biosynthesis  seems not only  to be  inhibited by direct  interaction of a  compound 

with  involved  enzymes  or  precursor  molecules.  As  shown  for  daptomycin,  membrane‐

targeting  compounds might  also  induce  strong  cell wall  stress  responses,  although  direct 

interaction of daptomycin with the cell wall biosynthesis machinery was excluded [Wecke et 

al., 2009].  

Cell division is another important membrane‐associated process in bacteria. Inhibition of cell 

separation  is  not  lethal  as  was  demonstrated  by  highly  elongated  but  viable  B.  subtilis 

mutants  [Beall  and  Lutkenhaus,  1992;  Rabenau,  2010].  However,  several  cell  division 

proteins  seem  essential  for  viability  [Kobayashi  et  al.,  2003]  and  bactericidal  antibiotics 

targeting cell division have been found. The cephalosporin cephalexin, which  is successfully 

employed in treating several bacterial infections including pharyngitis, tonsillitis, respiratory, 

and  urinary  tract  infections  [http://www.drugs.com/monograph/cephalexin.html],  inhibits 

peptidoglycan biosynthesis during septum formation and causes rapid cell lysis [Chung et al., 

2009].  

Transport processes might also be affected by a disturbed phospholipid bilayer. Especially, 

mechanosensitive channels, which react  to alterations of membrane  tension  [Hoffmann et 

A Introduction

22

  

al.,  2008],  are  likely  influenced  by  compounds  that  perturb  the  membrane  structure. 

Further, uptake and export systems might be affected. 

4.4  Membrane stress response 

Bacteria  have  developed  several  adaptation  and  compensation  strategies  in  order  to 

overcome membrane stress. They e.g. can adapt their phospholipid composition. Under heat 

shock conditions membrane structures tend to melt, while under cold shock conditions they 

become  very  rigid  impeding  membrane‐located  processes.  Bacteria  adjust  membrane 

fluidity  towards  higher  rigidity  under  heat  shock  and  towards  higher  fluidity  under  cold 

shock  conditions.  Similarly,  low  osmolarity  requires  a  more  rigid  membrane  structure, 

whereas high osmolarity  is  antagonized by  adaptation  towards  lower membrane  viscosity 

[Šajbidor, 1997].  

Membrane integrity is also stabilized by protective membrane‐binding proteins, such as the 

B.  subtilis phage  shock protein A  (PspA). PspA was  shown  to protect membrane  integrity 

under  stress  conditions and  to prevent proton  leakage  [Kobayashi et al., 2007]. The PspA 

homolog LiaH displays  similar membrane‐stabilizing properties.  It  is part of  the LiaRS  two‐

component system, which is mainly responsive to membrane‐mediated cell wall biosynthesis 

inhibition [Wolf et al., 2010].  

In B. subtilis, the membrane and cell wall stress responses are regulated by alternative sigma 

factors, more precisely by  the extracytoplasmic  function  (ECF)  sigma  factors  σM, adjusting 

cell wall synthesis and cell shape, σW, responsible for detoxification, bacteriocin expression, 

and adaptation of  the membrane composition, and σX, adjusting  the cell envelope surface 

charge, but also by the general stress response‐controlling σB. Together with the LiaRS two‐

component  system,  the  ECF  sigma  factors  constitute  the  first  line  of  defense  against  cell 

envelope  damage  [Hecker  and  Völker,  2002;  Helmann,  2002;  Cao  et  al.,  2002;  Cao  and 

Helmann, 2004; Jordan et al., 2006; Eiamphungporn and Helmann, 2008]. 

5  Proteomics in antibiotic research 

B. subtilis is a model organism frequently employed for studying bacterial stress adaptation 

[Wolf et al., 2010; Winter et al., 2011]. The bacterial stress  response provides  insight  into 

bacterial  adaptation  to  different  environments  and  thus  of  basic  physiological  processes. 

Physical  and  chemical  stresses  such  as heat  and  cold  shock,  salt, and ethanol  stress have 

A Introduction

23

  

been  studied  using  comparative  proteomics  [Petersohn  et  al.,  2001;  Budde  et  al.,  2006; 

Hahne  et  al.,  2010].  Similarly,  the  acute  B.  subtilis  stress  responses  to  various  antibiotic 

agents with  different modes  of  action  has  been  extensively  investigated  by  2D  gel‐based 

proteomics (Figure 10) [Bandow et al., 2003].  

Radioactive  pulse  labeling  of  proteins  newly  synthesized  under  stress  allows  selective 

monitoring  of  the  acute  stress  reaction.  Studying  bacterial  adaptation  to  antibiotic  stress 

provides  insight  into how microorganisms  cope with antibacterial  compounds  secreted by 

competing  organisms  in  a  natural  habitat  like  soil  [Raatschen  et  al.,  2013].  It  also  allows 

insight  into how microbes might evade  immune responses  in the host and how they resist 

antibiotic  treatment.  Moreover,  the  stress  response  to  an  antibiotic  agent  is  typically 

indicative of  the  antibacterial mechanism of  action  [Raatschen  and Bandow,  2012].  Thus, 

proteomic response profiles can efficiently aid mode of action elucidation [Brötz‐Oesterhelt 

et al., 2005]. This  is particularly  facilitated by an  antibiotic  reference  compendium, which 

was  established  by  Bandow  et  al.  and  is  constantly  expanded  [Bandow  et  al.,  2003; 

Raatschen et al., 2013]. This library currently comprises proteome response profiles to more 

than 50 antibiotic agents, toxins, and genetic down‐regulation of target genes. It can be used 

to compare the response patterns of novel compounds with that of well‐known antibiotics. 

An overlapping stress response  is  indicative of a similar mechanism, allowing  fast mode of 

action diagnosis. 

 

 

Figure  10:  2D  gel‐based  proteomics.  Cytosolic  protein  extracts  are  separated  in  a  first 

dimension by isoelectric focusing and in a second dimension by SDS‐PAGE. Protein synthesis 

patterns of  the untreated  controls  are  false  colored  in  green  and  those of  the  antibiotic‐

treated  cultures  in  red.  Gel  images  of  antibiotic‐treated  cultures  are  overlaid with  their 

untreated controls. Proteome response patterns are then compared with reference profiles 

allowing mode of action diagnosis.  

 

A Introduction

24

  

Marker  proteins  overlapping  in  the  response  profiles  between  compounds  targeting  the 

same  pathway,  allow  establishing  of  so‐called  proteomic  signatures.  Such  signatures  are 

indicative of the inhibition of a target pathway or structure [van Bogelen et al., 1999]. They 

allow  fast  designation  of  novel  compounds  to mechanistic  classes.  In  particular,  they  are 

useful  for mode  of  action  validation  or  falsification  of  compounds  derived  from  known 

antibiotic structures or from molecular modeling approaches. Certainly, they also aid mode 

of action analysis of completely novel compounds.  

6  Objectives 

Two main objectives were pursued  in this work. On the one hand, the proteome response 

library was complemented with proteomic signatures for different aspects of cell envelope 

stress.  On  the  other  hand,  the mechanisms  of  action  of  novel  peptide  antibiotics  were 

investigated. 

A  proteomic  signature  for  inhibition  of  fatty  acid  biosynthesis was  established  by  use  of 

triclosan,  cerulenin,  platensimycin,  and  platencin.  The  newly  established  signature  was 

employed  for  mode  of  action  analysis  of  the  chromium  organometallic‐substituted 

platensimycin derivative PM47.  

The lantibiotics mersacidin, gallidermin, and nisin, each of which binds to cell wall precursor 

lipid  II  but  displays  different  stages  of  interaction with  the  cytoplasmic membrane, were 

employed  for  setting  up  signatures  for  cell  envelope  stress.  In  combination with  further 

reference  profiles  this  subset  of  lantibiotics  allowed  definition  of  distinct  signatures  for 

general cell envelope stress, membrane stress, and  inhibition of the membrane‐bound cell 

wall biosynthesis machinery.  

The  newly  established  signatures  served  as  basis  for  mechanistic  analyses  of  the 

antimicrobial hexapeptide MP196  (RWRWRW‐NH2).  Its antibacterial mode of action should 

be elucidated with  special emphasis on  its effects on bacterial physiology. Further,  insight 

into bacterial stress adaptation to membrane‐targeting antibiotics should be obtained.  

The antibiotic mechanism of lipidated MP196 derivatives was investigated and compared to 

that of MP196 by  comparative proteome  analysis.  To  this  end,  the most  active peptides, 

carrying  lipid  chains  of  8  C‐atoms  in  length  at  either  the  N‐  or  C‐terminus  (H15C7(O)C‐

KRWRWRW‐NH2  (N‐C8)  and  RWRWRWK‐C(O)C7H15  (C‐C8))  were  chosen.  To  evaluate  the 

effects  of  the  additional  lysine  residues  employed  for  attaching  the  lipid  tails,  the 

A Introduction

25

  

correspondent non‐lipidated peptides  (KRWRWRW‐NH2  (N‐C0) and RWRWRWK‐NH2  (C‐C0)) 

were included  in the study (see Appendix 1 for structures). 

The ruthenocene‐modified peptide MP276 (RcCO‐WRWRW‐NH2, Figure 1) was employed for 

studying  peptide  localization  in  vivo  by  electron  microscopy  and  atomic  absorption 

spectrometry‐based metal tracing.  

In order to monitor metal‐specific mechanistic differences, organometallic peptides carrying 

either ferrocene or ruthenocene were analyzed. Both all‐L and all‐D amino acid versions of 

MP276 and the ferrocene‐substituted MP66 (FcwRWRWRW‐NH2, Figure 1) as well as the all‐

L  cyclic MP66  derivative MP159  (FcCO‐G‐cCWRWRWRWC,  see  Appendix  1  for  structure) 

were investigated by proteomic profiling and compared to all‐L and all‐D MP196. The MP276 

mode of action was compared with that of MP196 in detail in order to evaluate the influence 

of metallocene derivatization on the molecular mechanism. 

The  completely  novel  antibiotic  class  of  organometallic  PNA  backbone  derivatives, 

represented  by  the  tri‐organometallic  compounds  FcPNA  and  RcPNA,  were  analyzed 

regarding  their  antibacterial  potency, mechanism  of  action,  and metal‐based mechanistic 

differences. A systematic structure‐activity relationship (SAR) study was conducted  in order 

to identify the essential organometallic moiety required for antibacterial activity.  

A Introduction

26

B 

 

Proteomic signature of fatty acid biosynthesis 

inhibition available for in vivo mechanism of action 

studies 

 

Michaela Wenzel, Malay Patra, Dirk Albrecht, David Y.‐K. Chen, Kyriakos 

C. Nicolaou, Nils Metzler‐Nolte, Julia E. Bandow  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2011 

 

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

27

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, June 2011, p. 2590–2596 Vol. 55, No. 60066-4804/11/$12.00 doi:10.1128/AAC.00078-11Copyright © 2011, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

Proteomic Signature of Fatty Acid Biosynthesis Inhibition Availablefor In Vivo Mechanism-of-Action Studies�

Michaela Wenzel,1 Malay Patra,2 Dirk Albrecht,3 David Y.-K. Chen,4 K. C. Nicolaou,5Nils Metzler-Nolte,2 and Julia E. Bandow1*

Ruhr University Bochum, Biology of Microorganisms, Universitatsstraße 150, 44801 Bochum, Germany1; Ruhr University Bochum,Bioinorganic Chemistry, Universitatsstraße 150, 44801 Bochum, Germany2; Ernst Moritz Arndt University Greifswald, Institute for

Microbiology, Friedrich-Ludwig-Jahn-Straße 15a, 17489 Greifswald, Germany3; Chemical Synthesis Laboratory@Biopolis,Institute of Chemical and Engineering Sciences (ICES), Agency for Science, Technology and Research (ASTAR), 11 Biopolis Way,The Helios Block, #03-08, Singapore 138667, Singapore4; and Department of Chemistry and The Skaggs Institute for

Chemical Biology, The Scripps Research Institute, 10550 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037,and Department of Chemistry and Biochemistry, University of California,

San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, California 920935

Received 19 January 2011/Returned for modification 14 February 2011/Accepted 24 February 2011

Fatty acid biosynthesis is a promising novel antibiotic target. Two inhibitors of fatty acid biosynthesis,platencin and platensimycin, were recently discovered and their molecular targets identified. Numerousstructure-activity relationship studies for both platencin and platensimycin are currently being undertaken.We established a proteomic signature for fatty acid biosynthesis inhibition in Bacillus subtilis using platencin,platensimycin, cerulenin, and triclosan. The induced proteins, FabHA, FabHB, FabF, FabI, PlsX, and PanB,are enzymes involved in fatty acid biosynthesis and thus linked directly to the target pathway. The proteomicsignature can now be used to assess the in vivo mechanisms of action of compounds derived from structure-activity relationship programs, as demonstrated for the platensimycin-inspired chromium bioorganometallicPM47. It will further serve as a reference signature for structurally novel natural and synthetic antimicrobialcompounds with unknown mechanisms of action. In summary, we described a proteomic signature in B. subtilisconsisting of six upregulated proteins that is diagnostic of fatty acid biosynthesis inhibition and thus can beapplied to advance antibacterial drug discovery programs.

Bacterial infections continue to be a challenge throughoutthe world, especially in light of increasing development anddissemination of multiresistant pathogens that are more andmore difficult to treat (33). Therefore, prudent use of approvedantibiotics and, more importantly, new antibiotics, preferablywith new mechanisms of action and low resistance develop-ment rates, are urgently required to restrain infectious dis-eases. Two main strategies for antibiotic development are be-ing pursued today: (i) identification of structurally novelantibiotics using screening approaches based on either naturalor synthetic compounds and (ii) chemical modification ofknown antibiotics aiming at improving their antibacterial orpharmacological properties or at circumventing existing resis-tance mechanisms.

Since the recent discovery of platencin and platensimycin,two potent natural inhibitors of bacterial growth from Strepto-myces platensis (15, 24, 31, 32), there is renewed interest in fattyacid biosynthesis as an antibacterial target. Platensimycin aswell as cerulenin, discovered in the 1960s, inhibit the 3-oxoacyl-acyl carrier protein (ACP) synthase II FabF (21, 32),whereas platencin inhibits both FabF and 3-oxoacyl-ACP syn-thases III FabHA and FabHB (15, 31). These enzymes catalyzethe initial condensation of acyl-ACPs and existing fatty acid

chains with malonyl-ACP, respectively (9). In contrast, tri-closan, another fatty acid biosynthesis inhibitor, discovered inthe 1970s, targets the second reduction step in the fatty acidchain elongating biosynthesis cycle, inhibiting the enoyl-ACPreductase FabI (11) (see Fig. 1 for an overview). Neither tri-closan nor cerulenin is used clinically as an antimicrobial agent.However, triclosan is used in consumer products, such astoothpaste (17, 29, 30), while cerulenin is currently being eval-uated as an antitumor therapeutic in combination therapies(10). Platensimycin and platencin showed efficacy in a Staphy-lococcus aureus mouse infection model (31). A number ofstructure-activity relationship (SAR) studies are being per-formed to identify lead structures for further development (14,16, 18, 20). In addition, the search for effective natural ana-logues continues (12, 35, 36).

Proteomic profiling can support antibacterial drug discoveryby contributing to target identification and mechanism-of-ac-tion studies (4, 7). We have previously established a compre-hensive proteomic response reference compendium using theGram-positive model organism Bacillus subtilis. It containsproteomic response patterns for over 40 antibacterial com-pounds (2). As the bacterial response to antibiotic treatmentmirrors the inflicted damage, it is highly specific and closelylinked to the antibiotic mechanism. Proteomic signatures in-dicative of the antibiotic mechanism of action can be estab-lished, if structurally different inhibitors of the same pathwayare available (28). Once they are established, these signaturescan aid in mechanism-of-action identification of structurallynovel compounds. For instance, the proteomic signature for

* Corresponding author. Mailing address: Ruhr-Universitat Bo-chum, Mikrobielle Antibiotikaforschung, Biologie der Mikroorganis-men, Universitatsstraße 150, Bochum 44801, Germany. Phone: 49-234-32-23102. Fax: 49-234-32-14620. E-mail: julia.bandow@rub.de.

� Published ahead of print on 7 March 2011.

2590

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

28

inhibition of translation identified peptidyltransferase inhibi-tion as the mechanism of action of the structurally novel com-pound Bay 50-2369 (2). The signatures can also serve asreferences to confirm the in vivo mechanism of action of SAR-derived compounds, provided the modified compound still hasthe same mechanism as the lead structure.

In this study we investigated the bacterial response to fattyacid biosynthesis inhibitors triclosan, cerulenin, platensimycin,and platencin. On the basis of the proteomic response profilesof B. subtilis, we were able to establish a proteomic signaturefor fatty acid biosynthesis inhibition. We then applied thenewly established signature to investigate the mechanism ofaction of the chromium bioorganometallic PM47, a compoundinspired by platensimycin, which displayed low activity againstGram-positive bacteria (19). On the basis of the findings ofproteome analysis, we could rule out fatty acid biosynthesis asits primary mechanism of action.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and growth conditions. Bacillus subtilis 168 (trpC2) (1) wasgrown at 37°C under steady agitation in a defined medium previously described(25). Cerulenin and triclosan were purchased from Merck KGaA, Darmstadt,Germany; platencin was synthesized by D. Chen; and platensimycin was providedby Merck & Co., Inc., Rahway, NJ. All antibiotic stock solutions were preparedin dimethyl sulfoxide (DMSO). MICs were determined in a test tube assay asdescribed previously (2). Two milliliters of defined medium was inoculated with

105 bacteria per ml, and the mixture was incubated at 37°C under agitation for18 h. The MIC was defined as the lowest concentration inhibiting visible growth.

In growth experiments, bacterial cultures were exposed to antibiotics at dif-ferent concentrations during early exponential growth phase after they reachedan optical density at 500 nm (OD500) of 0.35. An antibiotic concentration leadingto a reduction in growth rate of approximately 50 to 70% was chosen forproteomic profiling experiments.

Preparation of cytoplasmic L-[35S]methionine-labeled protein fractions. Forpulse-labeling experiments, 5 ml of a bacterial culture in early exponentialgrowth phase was exposed to 0.5 �g/ml triclosan, 5 �g/ml cerulenin, 5 �g/mlplatensimycin, 0.2 �g/ml platencin, or 25 �g/ml PM47 or was left untreated as acontrol. After 10 min of antibiotic treatment, cells were pulse-labeled radioac-tively with 1.8 MBq L-[35S]methionine (Hartmann Analytic, Braunschweig, Ger-many) for 5 min. Methionine incorporation was stopped by adding 1 mg/mlchloramphenicol and an excess of nonradioactive L-methionine (10 mM) and byimmediately transferring samples onto ice. Cells were harvested by centrifuga-tion and washed three times with 100 mM Tris–1 mM EDTA buffer, beforedisruption by ultrasonication in a VialTweeter instrument (Hielscher, Teltow,Germany) in 10 mM Tris buffer containing 1.39 mM phenylmethylsulfonyl flu-oride. The soluble protein fraction was separated from cell debris by centrifu-gation at 16.1 � g for 20 min. Protein concentrations were estimated using aBradford-based Roti NanoQuant assay (Roth, Karlsruhe, Germany).

2D-PAGE. Unless otherwise noted, chemicals for two-dimensional (2D) gelelectrophoresis were ordered from Sigma-Aldrich or Roth in electrophoresis-grade quality. Cytosolic proteins were solubilized in 400 �l buffer containing 7 Murea, 2 M thiourea, 6.5 mM 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-pro-panesulfonate, 0.5% Triton X-100, 1.04% Pharmalyte 3-10 (GE Healthcare,Uppsala, Sweden), and 50 mM dithiothreitol (DTT). Fifty or 300 �g of proteinfor radioactive analytical gels and for nonradioactive preparative gels (for pro-tein identification by mass spectrometry), respectively, was loaded onto 24-cmimmobilized pH gradient (IPG) strips, pH 4 to 7 (GE Healthcare), by passive

FIG. 1. Fatty acid biosynthesis in B. subtilis. Cerulenin, platensimycin, and platencin inhibit the 3-oxoacyl-ACP synthase FabF. Platencin targetsFabF and FabHA/HB. Triclosan inhibits the enoyl-ACP-reductase FabI. Proteins belonging to the FapR regulon are circled. Proteins induced byfatty acid biosynthesis inhibitors are placed inside boxes. Modified according to Fujita et al. (9) with permission of the publisher.

VOL. 55, 2011 FATTY ACID BIOSYNTHESIS PROTEOMIC SIGNATURE 2591

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

29

rehydration for 18 h. Isoelectric focusing was carried out using a Multiphor IIapparatus (GE Healthcare), applying the following gradient: 0 to 500 V for 1kVh, 500 V for 0.02 kVh, 500 to 3,500 V for 3 kVh, and 3,500 V for 57 kVh at20°C. Prior to SDS-PAGE, proteins were reduced and subsequently alkylated for20 min each in equilibration buffer (50 mM Tris, pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol,2% SDS) supplemented with 1% DTT and 2.5% iodoacetamide, respectively.IPG strips were placed onto 12.5% SDS-polyacrylamide gels (acrylamide, bisa-crylamide, 0.375 M Tris, 01.% SDS, 0.05% ammonium persulfate, 0.0138%N,N,N�,N�-tetramethylethylenediamine) and covered with 0.5% agarose in run-ning buffer (25 mM tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS). Electrophoresis was carriedout using an Ettan DALTtwelve system from GE Healthcare at 0.5 W/gel for 1 hto allow transfer of proteins from the IPG strip into the polyacrylamide gel,followed by 10 W/gel for protein separation using the above-described runningbuffer (2� buffer in the upper chamber, 1� buffer in the lower chamber).Proteins were stained with 0.003% ruthenium(II) Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenan-trolin disulfonate) (RuBPs) (22) and imaged using a Typhoon Trio� variable-mode imager (GE Healthcare) set at an excitation wavelength of 532 nm andusing a 610-nm emission filter. Analytical gels were dried on Whatman paper andexposed to storage phosphor screens (GE Healthcare). Screens were scannedwith the Typhoon Trio� imager at a 633-nm excitation wavelength and using a390-nm emission filter. Images were analyzed as described by Bandow et al. (3)using Decodon Delta 2D image analysis software (Decodon, Greifswald, Ger-many). Proteins found to be induced more than 2-fold in three independentbiological replicates are reported as marker proteins.

Protein identification. Protein spots were excised from preparative 2D gelsand transferred into 96-well microtiter plates. Tryptic digestion with subsequentspotting on a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) target wascarried out automatically with an Ettan spot handling workstation (AmershamBiosciences, Uppsala, Sweden) as described by Eymann et al. (8).

MALDI-time of flight (TOF) measurements were carried out on a 4800MALDI TOF/TOF analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) designed forhigh-throughput measurements. The instrument allows automatic measurementof the samples, calibration of the spectra, and analysis of the data using 4000Explorer software, version 3.5.3. Spectra were recorded in a mass range from 900to 3,700 Da with a focus mass of 2,000 Da. For one main spectrum, 25 subspectrawith 100 shots per subspectrum were accumulated using a random-search pat-tern. If the autolytical fragment of trypsin with the monoisotopic (M�H)� m/zat 2211.104 reached a signal-to-noise (S/N) ratio of at least 10, internal calibra-tion was automatically performed as one-point calibration using this peak. Thestandard mass deviation was less then 0.15 Da. If the automatic mode failed (forless than 1% of samples), the calibration was carried out manually. After cali-bration, the peak lists were created by using the “peak-to-mascot” script of the4000 Explorer software, version 3.5.3, using the following settings: mass rangefrom 900 to 3,700 Da, peak density of 50 peaks per 200 Da, minimal area of 100,and a maximum of 200 peaks per spot. The peak list was created for an S/Nratio of 6.

The MALDI-TOF-TOF measurements were also carried out on the 4800MALDI TOF/TOF analyzer. The three strongest peaks of the TOF spectra weremeasured. For one main spectrum, 20 subspectra with 125 shots per subspectrumwere accumulated using a random-search pattern. Internal calibration was au-tomatically performed as one-point calibration, with the monoisotopic arginine(M�H)� m/z at 175.119 or lysine (M�H)� m/z at 147.107 reaching an S/N ratioof at least 5. The peak lists were created by using the script of the 4000 ExplorerSoftware, version 3.5.3, with the following settings: mass range from 60 to pre-cursor mass plus 20 Da, peak density of 5 peaks per 200 Da, minimal area of 100,and a maximum of 20 peaks per precursor. The peak list was created for an S/Nratio of 5. For database search, the Mascot search engine, version 2.1.04 (MatrixScience Ltd., London, United Kingdom), with a specific B. subtilis sequencedatabase was used.

RESULTS

Proteomic signature of fatty acid biosynthesis inhibition.Bacterial cells react quickly to subinhibitory concentrations ofantibiotics by adjusting their protein synthesis (2). In manycases, translation capacity is allocated to production of pro-teins that counteract the loss of function or the damage in-flicted by the antibiotic action. The cellular response is highlyspecific for each antibiotic compound, with some of the re-sponder proteins reflecting the antibiotic mechanism of action

and others being structure specific. Structurally different anti-biotics that cause the same physiological condition in the cellinduce the same responder proteins. Those responder proteinsindicative of the antibiotic mechanism constitute the antibioticproteomic signature.

To establish an antibiotic proteomic signature for fatty acidbiosynthesis inhibition, the protein synthesis patterns of tri-closan, cerulenin, platensimycin, and platencin were comparedto identify common responder proteins. Reproducibility of theproteome response patterns for each of the antibiotics is ab-solutely critical and highly dependent on reproducibility of thecellular growth and antibiotic treatment conditions. Differ-ences in antibiotic concentration, cell density, or incubationtime may have a significant impact on protein synthesis pro-files. This is of particular concern, when an antibiotic mode ofaction is known to shift in a concentration-dependent manner.Triclosan, e.g., inhibits fatty acid biosynthesis at low concen-trations but at higher doses also damages multiple cytoplasmicand membrane targets (23, 26, 27).

We first determined the MICs of the four antibiotics againstB. subtilis under growth conditions similar to those used forproteomic sample generation. The MICs in defined mediumwith cells aerated during overnight incubation were 0.1 �g/mlfor triclosan, 0.2 �g/ml for platencin, 1 �g/ml for platensimy-cin, and 5 �g/ml for cerulenin. Growth experiments with dif-ferent antibiotic concentrations added to the cultures in earlyexponential growth phase were then performed to identify aconcentration that inhibited bacterial growth visibly withoutkilling the cells. A growth rate reduction of 50 to 70% in theexponential growth phase compared to the untreated controlgrowth had previously proven useful for proteome analysis (2).In order to generate the desired growth inhibition, concentra-tions of up to five times the MIC were used to treat thecultures. Representative growth curves of B. subtilis culturesexposed to fatty acid biosynthesis inhibitors at concentrationsselected for proteome analyses are shown in Fig. 2.

Once a suitable antibiotic concentration was found, pulse-labeling experiments with L-[35S]methionine were per-formed to specifically label those proteins newly synthesizedduring the 5-min pulse either after treatment with a fattyacid biosynthesis inhibitor or under control conditions.Highly reproducible protein expression profiles were ob-tained from three biological replicate experiments for eachantibiotic following a standardized protocol for protein sep-aration and gel image analysis. Marker proteins reproduc-ibly induced at least 2-fold for each antibiotic are listed inTable 1. All fatty acid biosynthesis inhibitors tested inducedsix common marker proteins (Fig. 3). These six markersmake up the proteomic signature for fatty acid biosynthesisinhibition. All of them are involved in fatty acid biosynthe-sis. Indirectly contributing to fatty acid or phospholipid bio-synthesis is PanB, an enzyme of the pantothenate biosyn-thesis pathway. Pantothenate is a precursor of the cofactorof ACP and a precursor of coenzyme A (CoA). Coenzyme Ais essential for fatty acid biosynthesis, as the condensationcycle always starts with acetyl-CoA or branched-chain CoAs(Fig. 1) and chain elongation requires malonyl-CoA. Theother five marker proteins are involved directly in fattyacid biosynthesis. The 3-oxoacyl-ACP synthases FabHA,FabHB, and FabF initiate the condensation reaction with

2592 WENZEL ET AL. ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

30

different substrate preferences, whereas enoyl-ACP reduc-tase FabI catalyzes the second reduction step of the con-densation cycle. PlsX starts the conversion of fatty acids tophospholipids. On the transcriptional level in B. subtilis, allfive enzymes are negatively controlled by the FapR repres-sor and are therefore part of the same regulon (Fig. 1).

Platensimycin exclusively induced the marker proteins of theproteomic signature for fatty acid biosynthesis inhibition. Tri-closan, cerulenin, and platencin each induced some additionalmarker proteins specific for each compound (Table 1). Some

FIG. 3. Details of 2D gels depict the six marker proteins (markedby arrowheads) making up the proteomic signature of fatty acid bio-synthesis inhibition under control conditions as well as triclosan,cerulenin, platensimycin, and platencin treatment. Induction factorsdisplayed in the lower right reflect averages over three biologicalreplicates.

FIG. 2. Antibiotic concentrations leading to approximately 50%growth reduction. B. subtilis was grown in defined medium to expo-nential phase and treated with platensimycin (5 �g/ml) (A), platencin(0.2 �g/ml) (B), cerulenin (5 �g/ml) (C), and triclosan (0.5 �g/ml) (D).The time point of antibiotic addition is marked by arrowheads.

TABLE 1. Marker proteins induced by fatty acid biosynthesis inhibitors

Marker proteinaInduction factor

Protein function PathwayPlatensimycin Platencin Cerulenin Triclosan

FabHA 5.1 5.2 4.3 7.2 3-Oxoacyl-ACP synthase III Fatty acid biosynthesisFabHB 17.6 18.6 14.2 20.0 3-Oxoacyl-ACP synthase III Fatty acid biosynthesisFabF 2.6 3.7 4.2 3.7 3-Oxoacyl-ACP synthase II Fatty acid biosynthesisFabI 12.7 3.7 6.7 6.2 Enoyl-ACP reductase Fatty acid biosynthesisPlsX 3.1 4.0 3.2 2.6 Putative glycerol-3-phosphate

acyltransferase PlsXPhospholipid biosynthesis

PanB 2.8 4.7 3.0 3.9 3-Methyl-2-oxobutanoatehydroxymethyltransferase

Pantothenate biosynthesis

CP_1 7.0 5.4 Protein not identifiedYkrS 2.6 Methylthioribose-1-phosphate isomerase Amino acid metabolismSerA 3.5 D-3-Phosphoglycerate dehydrogenase Amino acid metabolismPlc_3 3.1 Protein not identifiedPlc_4 4.0 Protein not identifiedAld 2.6 Putative alanine dehydrogenase Amino acid metabolismCer_1 4.4 Protein not identifiedYurP 2.8 Similar to glutamine–fructose-6-phosphate

transaminaseAmino acid metabolism

Cer_4 2.3 Protein not identifiedPdhC 4.3 Pyruvate dehydrogenase subunit E2b Acetyl-CoA, branched-chain

CoA metabolismTrc_2 3.9 Protein not identifiedSucD 2.3 Succinyl-CoA synthetase subunit alpha Citric acid cycleTrc_4 2.6 Protein not identified

a Cer, unidentified protein induced by cerulenin; CP, unidentified protein induced by cerulenin and platencin; Plc, unidentified protein induced by platencin; Trc,unidentified protein induced by triclosan.

b This subunit is also part of branched-chain alpha 2-oxoacid dehydrogenase.

VOL. 55, 2011 FATTY ACID BIOSYNTHESIS PROTEOMIC SIGNATURE 2593

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

31

of these proteins are related indirectly to fatty acid biosynthe-sis, as they are involved in acetyl-CoA production. Cerulenin-induced Ald is a putative dehydrogenase forming pyruvatefrom L-alanine, while triclosan-induced PdhC is a subunitof pyruvate dehydrogenase as well as branched-chain alpha2-oxoacid dehydrogenase, which generate acetyl-CoA andbranched-chain CoAs, respectively.

Some of the marker proteins, such as platencin-inducedYkrS involved in the methionine salvage pathway, could not beconnected directly to fatty acid biosynthesis. Others could notbe identified by mass spectrometry due to a lack of proteinaccumulation. However, these protein signals defined by theircoordinates on the 2D gel map still serve as antibiotic-specificmarkers, as they are reproducibly induced after antibiotictreatment.

Proteomic analysis of platensimycin analogue PM47. Patraet al. synthesized different organometallic platensimycin deriv-atives aiming to preserve the steric properties while at thesame time simplifying synthesis and potentially improving an-tibacterial properties (19). One of these compounds is thechromium bioorganometallic PM47 (Fig. 4), which shows lowactivity against Gram-positive bacteria and has a MIC of 80�g/ml against B. subtilis (19).

The proteomic response of B. subtilis to 25 �g/ml PM47 wasinvestigated to test whether PM47 still inhibits fatty acid bio-synthesis or has another mechanism of action. Induction of the

marker proteins belonging to the proteomic signature for fattyacid biosynthesis inhibition would be expected if the mecha-nism of action were preserved.

The proteomic responses to PM47 and platensimycin werecompared, as the latter induced exclusively the proteins be-longing to the fatty acid biosynthesis inhibition signature (Fig.5). None of the six signature markers nor any of the com-pound-specific marker proteins were induced by PM47, indi-cating that PM47 does not inhibit fatty acid biosynthesis. Sev-enteen proteins were significantly upregulated upon PM47treatment. The comparison of the proteomic response toPM47 with the proteomic profiles in the reference compen-dium (2) did not yield a close match, although some of thePM47 marker proteins are also induced by membrane-activeantibiotics (data not shown). There was further evidence thatplatensimycin derivative PM47 has another mechanism of ac-tion than its lead compound. In contrast to bacteriostatic plat-ensimycin, PM47 was shown to be bacteriolytic at higher doses.

DISCUSSION

Bacteria respond to antibiotic treatment in a highly specificway. The proteome mirrors the physiological impairmentcaused by the antibiotic. Due to this tight connection betweenmechanism of action and proteomic response, we can use pro-teomics to support mechanism-of-action studies in antibacte-rial drug discovery programs (2, 5, 6). To this end, we estab-lished a reference compendium of proteome response profilesfor over 40 antibiotics, including almost all clinically relevantantibiotic classes. Recently, the discovery of novel inhibitorswith antibacterial activity sparked renewed interest in fattyacid biosynthesis as an antibiotic target (34). The comparisonof proteomic responses to four different inhibitors of fatty acidbiosynthesis allowed the description of a proteomic signaturediagnostic of fatty acid biosynthesis inhibition consisting of sixupregulated proteins connected to the target pathway. Thisproteomic signature, together with the signatures already avail-able in the reference compendium, serves to classify structur-

FIG. 4. Structures of platensimycin (structure 1) and PM47 (struc-ture 2). The tetracyclic cage of platensimycin was replaced by anorganometallic core. Me, methyl.

FIG. 5. The protein expression profiles of B. subtilis in response to treatment with 5 �g/ml platensimycin (A) and 25 �g/ml PM47 (B) do notshare marker proteins. In panel B, unidentified marker proteins of PM47 are indicated by arrowheads, while boxes indicate the locations of fattyacid biosynthesis marker proteins. Pulse-labeled cytosolic proteins were separated by 2D PAGE. Red false-color images representing proteinbiosynthesis after antibiotic treatment were warped onto green false-color images showing protein synthesis under control conditions. Antibiotic-induced proteins appear red, repressed proteins appear green, and proteins synthesized at equal rates under both conditions appear yellow.

2594 WENZEL ET AL. ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

32

ally novel synthetic or natural compounds with regard to theirmechanisms of action. Proteome analyses of the bacterial re-sponse to different fatty acid biosynthesis inhibitors revealedthat five enzymes regulated by fatty acid biosynthesis repressorFapR are induced regardless of the molecular target in thepathway. They are directly involved in fatty acid or phospho-lipid biosynthesis (Fig. 1). For the four enzymes directly in-volved in fatty acid biosynthesis, FabI, FabF, FabHA, andFabHB, Hutter et al. previously reported induction of tran-scription by fatty acid biosynthesis inhibitors cerulenin andtriclosan (13). Malonyl-CoA sterically inhibits FapR (9). It canbe expected that this precursor of fatty acid biosynthesis accu-mulates upon fatty acid biosynthesis inhibition, causing dere-pression of the fatty acid biosynthesis enzymes. The sixthmarker protein of the proteomic signature, PanB, is involved inthe biosynthesis of coenzyme A, an essential cofactor for fattyacid biosynthesis, as the condensation reaction always startswith acetyl-CoA or branched-chain CoAs. None of the sixsignature proteins were induced by any of the antibiotics withmechanisms other than fatty acid biosynthesis inhibition testedso far.

Beside the six proteins induced by all inhibitors tested, someadditional proteins are upregulated in response to one or twoof the antibiotics. Some of these are connected to fatty acidbiosynthesis as they contribute to the acetyl-CoA metabolism.Others may be induced as a result of compound-specific reac-tions.

The newly established proteomic signature for fatty acidbiosynthesis inhibition was used to evaluate the mechanism ofaction of a compound derived from an SAR program aroundthe lead structure of platensimycin. Chromium-containing or-ganometallic analogue PM47 showed low antibacterial activity(19) against Gram-positive pathogens. PM47 treatment did notinduce fatty acid biosynthesis enzymes, proving that the in vivomechanism of action is not inhibition of fatty acid biosynthesis.This finding is interesting, as in silico docking studies indicatedthat the compound fits well into the same binding pocket asplatensimycin (19). However, a different mechanism of actionis in concordance with the observation that, unlike fatty acidbiosynthesis inhibitors, PM47 is bacteriolytic at higher doses.Interestingly, the entire reference compendium does not con-tain a proteomic signature or protein response profile match-ing that of PM47, pointing to an unprecedented mechanism ofaction. There is some overlap in marker proteins with mem-brane-active antibiotics. Further studies would be necessary toelucidate the mechanism of action. However, PM47 showscytotoxicity against mammalian cells at sub-MICs (19), sug-gesting a nonspecific, toxic mechanism.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, for providing platensi-mycin. We further thank Elmar Langenfeld, formerly of the Medizinis-ches Proteom-Center, Ruhr University Bochum, for helping us withRuBP synthesis and Lars I. O. Leichert from the same institution forcritically reading the manuscript. We are also grateful for the superbtechnical support by our colleagues at Rubion.

This work was financially supported by a startup grant from theRuhr University Bochum and a grant from the state of North Rhine-Westphalia (NRW), Germany, and the European Union, EuropeanRegional Development Fund, Investing in your future, to J.E.B.

REFERENCES

1. Agnostopoulos, C., and J. Spizizen. 1961. Requirements for transformationin Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81:741–746.

2. Bandow, J. E., H. Brotz, L. I. Leichert, H. Labischinski, and M. Hecker.2003. Proteomic approach to understanding antibiotic action. Antimicrob.Agents Chemother. 47:948–955.

3. Bandow, J. E., et al. 2008. Improved image analysis workflow for 2D gelsenables large-scale 2D gel-based proteomics studies—COPD biomarker dis-covery study. Proteomics 8:3030–3041.

4. Bandow, J. E., and M. Hecker. 2007. Proteomic profiling of cellular stressesin Bacillus subtilis reveals cellular networks and assists in elucidating antibi-otic mechanisms of action. Prog. Drug Res. 64:79, 81-101.

5. Beyer, D., et al. 2004. New classes of bacterial phenylalanyl-tRNA synthetaseinhibitors with high potency and broad-spectrum activity. Antimicrob.Agents Chemother. 48:525–532.

6. Brotz-Oesterhelt, H., et al. 2005. Dysregulation of bacterial proteolytic ma-chinery by a new class of antibiotics. Nat. Med. 11:1082–1087.

7. Brotz-Oesterhelt, H., J. E. Bandow, and H. Labischinski. 2005. Bacterialproteomics and its role in antibacterial drug discovery. Mass Spectrom. Rev.24:549–565.

8. Eymann, C., et al. 2004. A comprehensive proteome map of growing Bacillussubtilis cells. Proteomics 4:2849–2876.

9. Fujita, Y., H. Matsuoka, and K. Hirooka. 2007. Regulation of fatty acidmetabolism in bacteria. Mol. Microbiol. 66:829–839.

10. Haase, D., et al. 2010. Fatty acid synthase as a novel target for meningiomatherapy. Neuro. Oncol. 12:844–854.

11. Heath, R. J., Y. T. Yu, M. A. Shapiro, E. Olson, and C. O. Rock. 1998. Broadspectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acidsynthesis. J. Biol. Chem. 273:30316–30320.

12. Herath, K. B., et al. 2008. Structure and semisynthesis of platensimide A,produced by Streptomyces platensis. Org. Lett. 10:1699–1702.

13. Hutter, B., et al. 2004. Prediction of mechanisms of action of antibacterialcompounds by gene expression profiling. Antimicrob. Agents Chemother.48:2838–2844.

14. Jang, K. P., et al. 2009. Isoplatensimycin: synthesis and biological evaluation.Bioorg. Med. Chem. Lett. 19:4601–4602.

15. Jayasuriya, H., et al. 2007. Isolation and structure of platencin: a FabH andFabF dual inhibitor with potent broad-spectrum antibiotic activity. Angew.Chem. Int. ed. Engl. 46:4684–4688.

16. Krauss, J., V. Knorr, V. Manhardt, S. Scheffels, and F. Bracher. 2008.Synthesis of platensimycin analogues and their antibiotic potency. Arch.Pharm. (Weinheim) 341:386–392.

17. Moran, J., M. Addy, R. G. Newcombe, and I. Marlow. 2001. A study to assessthe plaque inhibitory action of a newly formulated triclosan toothpaste.J. Clin. Periodontol. 28:86–89.

18. Nicolaou, K. C., G. S. Tria, D. J. Edmonds, and M. Kar. 2009. Totalsyntheses of (�/�)-platencin and (�)-platencin. J. Am. Chem. Soc. 131:15909–15917.

19. Patra, M., et al. 2009. Synthesis and biological evaluation of chromiumbioorganometallics based on the antibiotic platensimycin lead structure.ChemMedChem. 4:1930–1938.

20. Patra, M., et al. 2010. Synthesis and biological evaluation of ferrocene-containing bioorganometallics inspired by the platensimycin lead structure.Organometallics 29:4312–4319.

21. Price, A. C., et al. 2001. Inhibition of beta-ketoacyl-acyl carrier proteinsynthases by thiolactomycin and cerulenin. Structure and mechanism. J. Biol.Chem. 276:6551–6559.

22. Rabilloud, T., J. M. Strub, S. Luche, A. van Dorsselaer, and J. Lunardi.2001. A comparison between SyproRuby and ruthenium II Tris (batho-phenanthroline disulfonate) as fluorescent stains for protein detection ingels. Proteomics 1:699–704.

23. Russell, A. D. 2004. Whither triclosan? J. Antimicrob. Chemother. 53:693–695.

24. Singh, S. B., et al. 2006. Isolation, structure, and absolute stereochemistry ofplatensimycin, a broad spectrum antibiotic discovered using an antisensedifferential sensitivity strategy. J. Am. Chem. Soc. 128:11916–11920.

25. Stulke, J., R. Hanschke, and M. Hecker. 1993. Temporal activation of beta-glucanase synthesis in Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen.Microbiol. 139:2041–2045.

26. Suller, M. T. E., and A. D. Russell. 1999. Antibiotic and biocide resistance inmethicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant entero-coccus. J. Hosp. Infect. 43:281–291.

27. Suller, M. T. E., and A. D. Russell. 2000. Triclosan and antibiotic resistancein Staphylococcus aureus. J. Antimicrob. Chemother. 46:11–18.

28. vanBogelen, R. A., E. E. Schiller, J. D. Thomas, and F. C. Neidhardt. 1999.Diagnosis of cellular states of microbial organisms using proteomics. Elec-trophoresis 20:2149–2159.

29. Van Loveren, C., J. F. Bujis, and J. M. ten Cate. 1999. Protection of dentinby triclosan toothpaste in a bacterial demineralization model. Eur. J. OralSci. 107:114–120.

30. van Loveren, C., J. F. Bujis, and J. M. ten Cate. 2000. The effect of triclosan

VOL. 55, 2011 FATTY ACID BIOSYNTHESIS PROTEOMIC SIGNATURE 2595

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

33

toothpaste on enamel demineralization in a bacterial demineralizationmodel. J. Antimicrob. Chemother. 45:153–158.

31. Wang, J., et al. 2007. Discovery of platencin, a dual FabF and FabH inhibitorwith in vivo antibiotic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104:7612–7616.

32. Wang, J., et al. 2006. Platensimycin is a selective FabF inhibitor with potentantibiotic properties. Nature 441:358–361.

33. World Health Organization. 2005. Containing antimicrobial resistance.World Health Organization, Geneva, Switzerland.

34. Wright, H. T., and K. A. Reynolds. 2007. Antibacterial targets in fatty acidbiosynthesis. Curr. Opin. Microbiol. 10:447–453.

35. Zhang, C., et al. 2010. Isolation, structure and biological activities of platen-cin A(2)-A(4) from Streptomyces platensis. Bioorg. Med. Chem. 18:2602–2610.

36. Zhang, C., et al. 2008. Isolation, structure and fatty acid synthesis inhibitoryactivities of platensimycin B1-B3 from Streptomyces platensis. Chem. Com-mun. (Camb.) 5034-5036.

2596 WENZEL ET AL. ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.

B Fatty acid biosynthesis inhibition signature

34

C 

 

Proteomic response of Bacillus subtilis to 

lantibiotics reflects differences in interaction with 

the cytoplasmic membrane 

 

Michaela Wenzel, Bastian Kohl, Daniela Münch, Nadja Raatschen, H. 

Bauke Albada, Leendert Hamoen, Nils Metzler‐Nolte, Hans‐Georg Sahl, 

Julia E. Bandow  

 

 

 

 

 

 

 

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012 

 

C Lantibiotic stress response

35

Proteomic Response of Bacillus subtilis to Lantibiotics ReflectsDifferences in Interaction with the Cytoplasmic Membrane

Michaela Wenzel,a Bastian Kohl,a* Daniela Münch,b Nadja Raatschen,a H. Bauke Albada,c Leendert Hamoen,d Nils Metzler-Nolte,c

Hans-Georg Sahl,b and Julia E. Bandowa

Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Bochum, Germanya; Medical Microbiology, Immunology and Parasitology, Pharmaceutical Microbiology, Universityof Bonn, Bonn, Germanyb; Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Bochum, Germanyc; and Centre for Bacterial Cell Biology, Institute for Cell and MolecularBiosciences, Newcastle University, Newcastle-upon-Tyne, United Kingdomd

Mersacidin, gallidermin, and nisin are lantibiotics, antimicrobial peptides containing lanthionine. They show potent antibacte-rial activity. All three interfere with cell wall biosynthesis by binding lipid II, but they display different levels of interaction withthe cytoplasmic membrane. On one end of the spectrum, mersacidin interferes with cell wall biosynthesis by binding lipid IIwithout integrating into bacterial membranes. On the other end of the spectrum, nisin readily integrates into membranes, whereit forms large pores. It destroys the membrane potential and causes leakage of nutrients and ions. Gallidermin, in an intermedi-ate position, also readily integrates into membranes. However, pore formation occurs only in some bacteria and depends onmembrane composition. In this study, we investigated the impact of nisin, gallidermin, and mersacidin on cell wall integrity,membrane pore formation, and membrane depolarization in Bacillus subtilis. The impact of the lantibiotics on the cell envelopewas correlated to the proteomic response they elicit in B. subtilis. By drawing on a proteomic response library, including otherenvelope-targeting antibiotics such as bacitracin, vancomycin, gramicidin S, or valinomycin, YtrE could be identified as the mostreliable marker protein for interfering with membrane-bound steps of cell wall biosynthesis. NadE and PspA were identified asmarkers for antibiotics interacting with the cytoplasmic membrane.

Over the last decades, bacteria have demonstrated their im-pressive ability to adapt to changing environmental condi-

tions by rapidly developing and accumulating antibiotic resis-tances. Helped by an extensive use of antibiotics in health care andagriculture, multidrug-resistant strains, so-called superbugs, arespreading with a remarkable impact on human health. Recentstatistics of the World Health Organization show that even indeveloped countries, infectious diseases are back among the topfive causes of death, with the majority of deaths being attributed tobacterial infections (49). At the same time, approval rates of newantibiotic agents have been steadily decreasing since their apex inthe 1980s (5). In view of these developments, in addition to im-proving hospital hygiene and to devising and implementing strat-egies to preserve effectiveness of available antimicrobial agents, areinvigoration of antibiotic research and development is urgentlyneeded to meet the superbug challenge.

One of the promising antibiotic classes for treatment of infec-tions caused by multidrug-resistant pathogens are antimicrobialpeptides, which occur naturally as components of the host defenseand typically target the bacterial cell envelope. The peptide sub-class of lantibiotics, which are produced by Gram-positive bacte-ria, is characterized by containing the nonproteinogenic aminoacid lanthionine and often also other unusual amino acids. How-ever, the group of lantibiotics is structurally and mechanisticallydiverse and can be further divided into class A, comprisingstretched, flexible peptides, and class B, with more globular struc-tures. The majority of peptides in both classes have been shown toinhibit cell wall biosynthesis. In contrast to class B members, someclass A lantibiotics are also capable of integrating into the bacterialmembrane and of pore formation, a process facilitated by bindingof cell wall precursor lipid II (7, 13). This mechanistic dualitydepicts an interesting advantage of lantibiotics over conventionalsingle-mechanism antibiotics. It was shown for various antibacte-

rial compounds that inhibit targets encoded by multiple genesthat resistance development is much slower than for antibioticsinhibiting a single target of a specific metabolic pathway (11, 32).As two essential complex targets, the cell wall biosynthesis ma-chinery and the cell membrane, need to be altered to preventcellular damage by dual-mechanism lantibiotics, resistance de-velopment by target mutation and stress adaptation is effec-tively deferred (10, 32). Such properties highlight antimicro-bial peptides as attractive antibacterial agents.

Here, we investigate three different lantibiotics. Nisin, the firstlantibiotic ever described, belongs to class A. The bactericidal ef-fects of nisin involve two distinct mechanisms. At lower concen-trations, nisin forms aggregates with lipid II, thereby preventingthem from participating in cell wall biosynthesis (23, 35). Afterreaching a certain concentration threshold, complexes of 8 nisinand 4 lipid II molecules are formed that integrate into the bacterialmembrane. They form pores large enough for ions and smallamino acids to pass through (9, 23). Structurally similar gallider-min also belongs to class A and inhibits cell wall biosynthesis bylipid II binding. Potassium leakage indicating pore formation wasobserved in some but not all bacteria (8); however, B. subtilis wasnot tested. Christ et al. were able to correlate pore formation with

Received 6 July 2012 Returned for modification 28 July 2012Accepted 16 August 2012

Published ahead of print 27 August 2012

Address correspondence to Julia Bandow, julia.bandow@rub.de.

* Present address: Bastian Kohl, Biochemistry II—Biomolecular Spectroscopy, RuhrUniversity Bochum, Bochum, Germany.

Copyright © 2012, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

doi:10.1128/AAC.01380-12

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

36

membrane thickness and fatty acid branching, suggesting that thissecond mechanism of action of gallidermin is dependent on mem-brane composition (16). In contrast to nisin, which needs to dockto lipid II for membrane integration and pore formation, gallider-min shows very high association and low dissociation constantsfor binding phospholipid bilayers, indicating that it readily inte-grates into the membrane independently of lipid II binding. Theinsertion of gallidermin into the bilayer already influences mem-brane properties without a necessity for pore formation (16).Class B lantibiotic mersacidin is structurally and mechanisticallydifferent from nisin or gallidermin. More globular in structure, itis not able to integrate into the membrane or to form pores, so itsantibacterial activity is based solely on inhibition of cell wall bio-synthesis by binding to lipid II. In contrast to vancomycin, a gly-copeptide which does not integrate into the membrane either,mersacidin does not seem to bind the amino acid tail of lipid II.Rather, it binds to the disaccharide headgroup of the lipid II mol-ecule and additionally interacts with the pyrophosphate, suggest-ing that lipid II-bound lantibiotic molecules are localized near theouter layer of the cell membrane (6, 14).

These three lantibiotics were chosen to investigate the pro-teomic response of B. subtilis to cell wall biosynthesis inhibition bylipid II binding coupled with different levels of interference withmembrane integrity. The physiological response of B. subtilismanifest in the proteome after antibiotic stress was previouslyshown to correlate with the antibacterial mechanism (2, 4, 47) andcontributed to elucidating the antibacterial mechanisms of novelantibiotic compounds (12, 48). Proteomic profiles of B. subtilistreated with several cell wall biosynthesis inhibitors have beenreported (4, 39, 46), but proteomic signatures indicative of spe-cific aspects of cell wall biosynthesis inhibition have not yet beendescribed. Utilizing lantibiotics, which range in mechanism fromjust binding lipid II to binding lipid II and forming large pores,and by further drawing on an extensive library of proteomic re-sponse profiles previously described (4), we identified responderproteins indicative of the different lantibiotic mechanisms. Todirectly correlate the proteome profiles with the influence of mer-sacidin, gallidermin, and nisin on B. subtilis, the impact of thelantibiotics on membrane integrity was studied in this model or-ganism. Lantibiotic interference with cell wall biosynthesis wasexamined microscopically, looking at cell shape after methanol-acetic acid fixation. Potassium efflux measurements served to in-vestigate pore formation. And finally, the influence of lantibioticson the membrane potential was studied microscopically with thehelp of a green fluorescent protein (GFP)-MinD fusion protein.MinD is a cell division protein requiring an intact membrane po-tential for localization at the cell poles and the cell division plane(41). Based on the correlation of these physiological experimentswith the proteomic response, marker proteins for different mech-anisms of membrane interference could be proposed.

MATERIALS AND METHODSAntibiotics. All antibiotic stock solutions were prepared at 10 mg/ml.Nisin was dissolved in 0.01 M HCl, gallidermin in double-distilled water(both were purified according to Bonelli et al. [8]), and mersacidin(Sanofi-Aventis, Paris, France) in methanol. Valinomycin and gramicidinA were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and bacitracin was dis-solved in double-distilled water (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Vancomycin (Applichem, Darmstadt, Germany) was dissolved in DMSO.Gramicidin S was synthetized and purified according to Wadhwani et al.(45) and dissolved in DMSO.

Bacterial strains and growth conditions. Bacillus subtilis 168 (trpC2)(1) was grown at 37°C under steady agitation in Belitzky minimal medium(BMM) (42). MICs were determined in a modified MIC test describedpreviously to match the growth conditions of the proteome experiment,specifically using chemically defined medium and supplying sufficientoxygen (48). Briefly, in a test tube, 2 ml of defined medium was inoculatedwith 5 � 105 bacteria per ml and incubated with different lantibioticconcentrations at 37°C under steady agitation for 18 h. The MIC wasdefined as the lowest concentration inhibiting visible growth. In growthexperiments, bacterial cultures were treated with different antibiotic con-centrations in mid-exponential phase after reaching an optical density at500 nm (OD500) of 0.35. For physiological stress experiments, includingproteomic studies, antibiotic concentrations were chosen that reducedgrowth rates to approximately 50 to 70% compared to that of the un-treated control culture.

Light microscopy. B. subtilis 168 cultures were grown in BMM to anOD500 of 0.35 and subsequently treated with 0.75 �g/ml nisin, 6 �g/mlgallidermin, 30 �g/ml mersacidin, 10 �g/ml valinomycin, 0.025�g/ml gramicidin A, 1.5 �g/ml vancomycin, 12 �g/ml bacitracin, or 1�g/ml gramicidin S. After 15 min of antibiotic exposure, 200 �l of bacte-rial culture were immediately fixed in 1 ml of a 1:3 mixture of acetic acidand methanol. Five microliters of fixed cells were immobilized in 5 �lBMM containing 0.5% low-melting agarose at 40°C. Cells were observedwith an Olympus BX51 microscope using a U-UCD8 condenser and aUPlanSApo 100XO objective. Pictures were taken using a CC12 digitalcolor camera and cell imaging software (all components by Olympus,Hamburg, Germany).

GFP-MinD localization. B. subtilis 1981 GFP-MinD (41) was grownovernight in BMM. Cells were then inoculated to an OD500 of 0.1 inmodified BMM containing xylose instead of glucose to induce expressionof the GFP-MinD fusion protein. After reaching an OD500 of 0.35, cellswere exposed to antibiotics at concentrations described above. After 15min of antibiotic stress, 5 �l of the bacterial culture was withdrawn andthe nonfixed, nonimmobilized samples were imaged immediately in fluo-rescent mode using the described equipment with a U-LH100HGAPOburner and a U-RFL-T power supply (Olympus, Hamburg, Germany).

Potassium release. Potassium efflux experiments were performed us-ing a microprocessor pH meter (pH 213; Hanna Instruments, Kehl, Ger-many) with an MI-442 potassium electrode and MI-409F reference elec-trode. The electrodes were preconditioned by immersing both thepotassium selective and the reference electrodes in choline buffer (300mM choline chloride, 30 mM MES, 20 mM Tris, pH 6.5) for at least 1 hbefore starting calibration or measurements. Calibration was carried outprior to each determination by immersing the electrodes in fresh standardsolutions containing 0.01, 0.1, or 1 mM KCl in choline buffer. B. subtilis168 was grown in BMM and harvested at an OD500 of 1.0 to 1.5 (3,300 �g, 4°C, 3 min), washed with 50 ml cold choline buffer, and resuspended inthe same buffer to an OD500 of 30. The concentrated cell suspension waskept on ice and used within 30 min. For each measurement, the cells werediluted in choline buffer (25°C) to an OD500 of about 3. Antibiotics wereapplied at the concentrations described above. Calculations of potassiumefflux were performed according to the equations established by Orlov etal. (31). Antibiotic-induced leakage was monitored for 3 min with read-ings taken every 10 s and expressed relative to the total potassium releaseinduced by nisin.

Proteome analysis. Protein extracts for 2D-PAGE were prepared asdescribed previously (48). In short, 5 ml of a bacterial culture in earlyexponential growth phase were exposed to 6 �g/ml gallidermin, 30 �g/mlmersacidin, 10 �g/ml valinomycin, or 1 �g/ml gramicidin S or left un-treated as the control. When B. subtilis cultures were treated during expo-nential growth, nisin exhibited a very narrow window of concentrationsthat solicit a stress response without causing massive cell lysis. Addressingthis problem, concentrations from 0.25 to 1.25 �g/ml of nisin were usedin parallel for each of the replicate labeling experiments. For the pro-teomic analysis, only those cultures were processed that showed growth

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

37

inhibition but no extensive cell lysis. Cultures treated with 0.75 �g/ml(replicates one and two) and a culture treated with 0.5 �g/ml nisin (rep-licate three) were chosen for proteome analysis based on the impact ofnisin on the growth rate. After 10 min of antibiotic stress, proteins werepulse labeled with [35S]methionine for 5 min. Incorporation of radio-active methionine was stopped by adding 1 mg/ml chloramphenicoland an excess of cold methionine. For nonradioactive preparative gels,cells were treated with antibiotics for 30 min to allow sufficient proteinaccumulation for mass spectrometry. Cells were harvested by centrif-ugation, washed three times with Tris buffer, and disrupted by ultra-sonication.

Two-dimensional (2D) gels were prepared as described previously(48). In short, 55 �g of protein for analytical and 300 �g for preparativegels were loaded onto 24-cm immobilized pH gradient (IPG) strips, pH 4to 7 (GE Healthcare), by passive rehydration for 18 h followed by isoelec-tric focusing. After reduction and alkylation, proteins were separated in asecond dimension by SDS-PAGE using 12.5% acrylamide gels. Imageswere analyzed as described by Bandow et al. (3) using Decodon Delta 2D4.1 image analysis software (Decodon, Greifswald, Germany). Proteinsfound to be induced more than 2-fold in three independently performedbiological experiments were defined as marker proteins.

Protein spots were excised from preparative 2D gels and transferredinto 96-well microtiter plates. Tryptic in-gel digest and subsequent spot-ting of extracted peptides with matrix on a matrix-assisted laser desorp-tion ionization (MALDI) target was carried out automatically with theEttan spot handling workstation (Amersham Biosciences, Uppsala, Swe-den) as described by Eymann et al. (20). MALDI-time of flight (TOF) aswell as MALDI-TOF/TOF (consecutive TOF analysis) measurementswere carried out on a 4800 MALDI-TOF/TOF analyzer (Applied Biosys-tems, Foster City, CA). For database searches, the Mascot search engine2.1.04 (Matrix Science Ltd., London, United Kingdom) with a specific B.subtilis sequence database was used as described previously (48).

RESULTS

In order to obtain specific marker proteins that allow delineationof different mechanisms of action affecting the cell envelope, weinvestigated a set of lantibiotics, which inhibit bacterial cell wallbiosynthesis while exhibiting different degrees of interferencewith the bacterial membrane. Mersacidin binds to lipid II withoutintegrating into the cytoplasmic membrane, gallidermin binds tolipid II and can disrupt the structure of the membrane by inser-tion, and nisin binds to lipid II, integrates into the membrane, andleads to pore formation.

To find appropriate conditions for proteome analyses and thecharacterization of the effects of lantibiotics on the cell envelope,MICs of the lantibiotics were determined under conditions re-sembling those of the proteome experiment, using the chemicallydefined medium and incubation under steady agitation. TheMICs were 30 �g/ml for mersacidin, 6 �g/ml for gallidermin, and5 �g/ml for nisin. Based on these MICs, growth experiments wereperformed to identify antibiotic concentrations that reducegrowth rates without causing massive cell lysis or completely stop-ping bacterial metabolism. This is essential, as proteomic experi-ments require a stress level high enough to induce a proteomicresponse but at the same time allowing protein biosynthesis tocontinue. While for mersacidin and gallidermin the MICs wereoptimal stressor concentrations, nisin caused massive cell lysiswhen applied at concentrations near the MIC during exponentialgrowth. However, cells surviving the acute nisin shock resumedgrowth after some time (data not shown), explaining why the MICis significantly higher than the acutely tolerated concentration.We determined the optimal stressor concentration for nisin to be0.75 �g/ml (Fig. 1).

Characterization of the impact of lantibiotics on the B. sub-tilis cell wall. All tested lantibiotics were expected to influence cellwall integrity, as they prevent incorporation of cell wall precursorsby binding lipid II. Their impact on cell wall integrity was inves-tigated by microscopic examination of the cell shape after aceticacid-methanol fixation (Fig. 2, top) using a method described bySchneider et al., who investigated cell wall biosynthesis inhibitorsvancomycin and plectasin (36). Upon inhibition of cell wall bio-synthesis, small holes occur in the peptidoglycane layer, wherenew cell wall material is no longer incorporated. When the perfo-rated cells are then fixed in a 1:3 mixture of acetic acid and meth-anol, the cytoplasmic membrane extrudes through holes in the cellwall, appearing as bubbles on the cell surface. To ensure that thisphenomenon occurs specifically upon impairment of cell wall in-tegrity and does not occur after treatment with agents impairingmembrane integrity or simply as a result of sample handling, weused untreated, valinomycin-treated, and gramicidin A-treated B.subtilis cultures as negative controls. Valinomycin is a cyclic pep-

FIG 1 Effects of lantibiotic treatment on B. subtilis growth. B. subtilis wasgrown in defined medium to an OD500 of 0.35. Cultures were split and eithertreated with lantibiotics or left untreated. (A) Mersacidin, 30 �g/ml; (B) gal-lidermin, 6 �g/ml; and (C) nisin, 0.75 �g/ml. The time points of antibioticaddition are marked by arrowheads.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

38

tide carrier ionophore that selectively transports potassium ionsacross the bacterial membrane, while peptide channel ionophoregramicidin A transports monovalent cations (18). Neither the un-treated controls (Fig. 2A) nor the valinomycin or gramicidin A-treated cultures (Fig. 2B or C, respectively) displayed any mem-brane extrusions. As expected, all lantibiotics led to membraneextrusions (Fig. 2E, F, G), demonstrating their influence on cellwall biosynthesis in B. subtilis. Further, we tested the cyclic peptideantibiotic gramicidin S (Fig. 2D), which served as a positive con-trol for depolarization experiments. Gramicidin S had been sug-gested to affect membrane-bound processes indirectly by causingdelocalization of membrane-associated enzymes (25, 26, 44, 55).Indeed, after gramicidin S treatment, cells also showed membraneextrusions, corroborating an effect of gramicidin S on cell wallbiosynthesis.

Lantibiotics’ influence on B. subtilis membrane potential. Inaddition to cell wall biosynthesis inhibition, gallidermin and nisinare expected to influence membrane integrity due to integrationinto the membrane and pore formation, respectively. Therefore,we investigated the influence of lantibiotics on the membranepotential monitoring microscopically the localization of a GFP-MinD fusion protein (Fig. 2, central and bottom panels). MinD ispart of the cell division regulation machinery of B. subtilis. As longas the membrane potential remains intact, MinD is attached to themembrane and localizes at the cell poles and in the cell divisionplain. It was shown that MinD localization is altered by mem-brane-depolarizing agents like valinomycin or proton ionophorecarbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), due to theinterruption of electrostatic interactions between MinD and themembrane surface (41). This phenomenon was employed here toinvestigate depolarizing properties of antibiotic agents. As de-scribed by Strahl and Hamoen (41), valinomycin was used as apositive control, as it causes rapid depolarization (Fig. 2B). Dis-ruption of the membrane potential results in delocalization ofGFP-MinD, which appears in fluorescing spots irregularly distrib-

uted throughout the cells. Nisin and gallidermin (Fig. 2E and F,respectively) exhibited the same GFP-MinD distribution patternas valinomycin, indicating the collapse of the membrane potential(Fig. 2). In contrast, mersacidin did not disturb the polar andseptal localization of GFP-MinD (Fig. 2G). These findings suggestthat nisin and gallidermin but not mersacidin cause membranedepolarization in B. subtilis. Delocalization of GFP-MinD was alsocaused by the membrane-integrating antimicrobial peptide gram-icidin S (Fig. 2D), which is neither an ionophore nor a pore former(25, 44).

Lantibiotics’ ability to form pores in the B. subtilis mem-brane. In order to investigate the ability of mersacidin, gallider-min, and nisin to form pores in B. subtilis, we measured the lan-tibiotic-induced potassium release using a potassium-sensitiveelectrode (Fig. 3). Consistent with the literature, pore-forminglantibiotic nisin led to strong, immediate potassium release,

FIG 2 Influence of mersacidin, gallidermin, and nisin on B. subtilis cell wall integrity and membrane potential. (Top) Light microscopy images of B. subtilis fixedwith acetic acid-methanol and immobilized with low-melting agarose show the influence of lantibiotics and comparator compounds on cell wall integrity.(Center) Fluorescence microscopy images of nonfixed cells show GFP-MinD localization after treatment with envelope-targeting agents. Cultures of B. subtilis168 or B. subtilis 1981 GFP-MinD were grown until early exponential phase, divided into aliquots, and stressed with antibiotics for 15 min: (A) untreated control;(B) valinomycin (10 �g/ml); (C) gramicidin A (0.025 �g/ml); (D) gramicidin S (1 �g/ml); (E) nisin (0.75 �g/ml); (F) gallidermin (6 �g/ml); (G) mersacidin (30�g/ml); (H) bacitracin (12 �g/ml); (I) vancomycin (1.5 �g/ml). (Bottom) Corresponding light microscopy pictures of the B. subtilis GFP-MinD cells shownabove. Note that B. subtilis GFP-MinD mutants typically grow longer than wild-type B. subtilis due to MinD overexpression.

FIG 3 Potassium release from B. subtilis induced by mersacidin, gallidermin,nisin, and valinomycin. Potassium efflux from living cells was monitored witha potassium-sensitive electrode. Ion leakage is expressed relative to the totalamount of potassium released after addition of the pore-forming lantibioticnisin (100% value). Antibiotics were added at 50 s and applied at the sameconcentrations as for proteome analysis: 0.75 �g/ml nisin, 6 �g/ml gallider-min, 30 �g/ml mersacidin, and 10 �g/ml valinomycin. The symbol-free solidline represents the baseline without antibiotics.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

39

whereas the potassium ionophore valinomycin (positive control)led to release of the same amount of potassium, following a slowerkinetic characteristic for carrier ionophores. In contrast, as de-scribed previously, mersacidin did not cause an increase in extra-cellular potassium levels (6, 9, 14, 23). Gallidermin, which had notyet been tested regarding its ability to form pores in B. subtilis,caused only a minor potassium release of up to 20% compared tonisin, suggesting that it does not effectively form pores in B. sub-tilis under the tested conditions.

Proteomic response to lantibiotic treatment. Comparativeproteome analyses were carried out to investigate whether or notthe proteomic response would reveal marker proteins for the lan-tibiotic mechanism of action of cell wall biosynthesis inhibition bylipid II binding and how far it could provide insights into addi-tional membrane-impairing properties of lantibiotics. To thisend, B. subtilis was grown to early exponential phase and stressedwith the appropriate concentrations of lantibiotics. [35S]-L-methi-onine pulse labeling was used to label selectively those proteinsnewly synthesized under antibiotic stress. This procedure allowsmonitoring of the acute bacterial stress response with exquisitesensitivity. The soluble intracellular protein fraction was then sep-arated by 2D-PAGE. Representative proteome expression profilesof mersacidin, gallidermin, and nisin are shown in Fig. 4. Proteinsinduced at least 2-fold are referred to as marker proteins. Theymirror the physiological stress conditions the cells are facing andproved valuable for studying antibiotic mechanisms of action.

Twenty-five (25) marker protein spots were induced by treat-ment with gallidermin, 13 by mersacidin, and 8 by nisin (Table 1).Using MALDI-TOF/TOF, we were able to identify 13, 7, and 6protein spots, respectively. The remaining protein spots wereclearly visible on autoradiographs reflecting protein synthesis af-ter antibiotic treatment but did not accumulate to any appreciableextent. Although these unidentified protein spots do not allowrational insights into the antibiotic mechanism, they still serve asantibiotic-specific markers, as they are reproducibly induced aftertreatment.

DISCUSSION

In this study, we set out to characterize the stress response of B.subtilis to three different lantibiotics with gradually differentmechanisms of action regarding interactions with the cytoplasmicmembrane but each inhibiting cell wall biosynthesis by binding toprecursor lipid II. It was previously described that mersacidin actssolely on cell wall biosynthesis, whereas gallidermin is able to in-tegrate into the membrane, although pores are formed only insome bacterial species and not others (8, 16). Nisin was shown tointegrate into the membrane upon lipid II binding, forming poresof 2 to 2.5 nm in diameter (50), if concentrations exceed a certainthreshold (8, 38). In preparation of the proteomic study, we testednisin, gallidermin, and mersacidin for their effects on the B. sub-tilis cell envelope under growth conditions matching those of theproteomic profiling analysis. As expected, all lantibiotics signifi-cantly affected cell wall integrity as shown microscopically (Fig. 2).Protein localization studies using GFP-labeled MinD showed pro-tein delocalization after treatment with nisin and gallidermin, in-dicating disruption of the membrane potential. Mersacidin testednegative for MinD-GFP delocalization. Significant potassium re-lease demonstrating pore formation was observed only for nisinbut not gallidermin or mersacidin (Fig. 2 and 3). Taken together,these results suggest that in B. subtilis, both nisin and gallidermin

FIG 4 Differential proteome analysis of B. subtilis 168 in response to mersaci-din (A), gallidermin (B), and nisin (C). 2D gel-based protein synthesis profilesof the controls false colored in green were overlaid with those of the antibiotic-treated samples false colored in red. In the overlays, downregulated proteinsappear green, upregulated proteins appear red, and proteins expressed at equalrates appear yellow. Unidentified proteins are labeled as follows: M, inducedby mersacidin; G, induced by gallidermin; N, induced by nisin; NGM, inducedby nisin, gallidermin, and mersacidin.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

40

effectively depolarize the membrane, with only nisin formingpores. Our results indicate that the GFP-MinD delocalization ob-served for gallidermin may be due to membrane depolarizationcaused by the lantibiotic integrating into the membrane ratherthan to pore formation. As Christ et al. demonstrated, galliderminleads to effective pore formation in lipid bilayers containingmainly acyl chains up to 15 C atoms in length. Limited pore for-mation is observed in membranes composed predominantly of 17C lipid tails (16). Consistently, Bonelli et al. reported pore forma-tion for Staphylococcus simulans and Micrococcus flavus (both 15C) but not for Lactococcus lactis (17 C) (8). Additionally to themembrane thickness, a large amount of branched-chain fatty ac-ids in the membrane seems to negatively affect pore formation bygallidermin (16). The B. subtilis membrane consists mostly of 15 Clipid chains but at the same time possesses about 80% branched-chain fatty acids (17). Therefore, it is likely that gallidermin is notable to form pores in this organism due to membrane densityrather than thickness. However, integration of gallidermin intothe membrane might affect the physicochemical properties of themembrane, resulting in depolarization and consequently MinD-GFP delocalization. Similar effects have already been described forcationic antimicrobial peptide gramicidin S, a depolarizing agent.At sublytical concentrations, gramicidin S seems to disturb themembrane structure leading to dysfunction of membrane proteincomplexes. It uncouples electron transport by inhibiting cyto-chrome bd quinol oxidase and consequently disrupts the electro-chemical gradient (25, 30, 44, 55). Gramicidin S also affects cell

wall integrity (Fig. 2), potentially also due to disturbing the mem-brane-bound cell wall biosynthesis machinery by integrating intothe membrane. There are also reports that gramicidin S increasesmembrane permeability for potassium ions (26), which might bethe effect rather than the cause of membrane depolarization (30).

Based on their common mechanism of inhibiting cell wall bio-synthesis by binding lipid II, the three lantibiotics were ideallysuited for comparative proteomic studies aimed at describing pro-teomic signatures for cell wall biosynthesis inhibition. At the sametime, this collection of lantibiotics in combination with the exist-ing library of proteomic response profiles could be used to corre-late the differences in the proteome according to the differences inmembrane interaction. Many of the identified marker proteins areknown to be upregulated in response to cell envelope stress (Table1). YvlB, for instance, belongs to the SigW regulon induced by cellenvelope stress. Taking into account the lantibiotic proteome pro-files as well as previously published reference patterns of an exten-sive antibiotic proteome response library (4), we delineated threegroups of marker proteins (Table 2, Fig. 5): those indicative of cellwall biosynthesis inhibition, those indicating membrane stress,and those induced in response to general envelope stress.

Markers for interference with cell wall biosynthesis by lipidII binding. Four proteins, namely, LiaH, YtrE, and TrmB, as wellas unidentified protein NGM1, were induced by all tested lantibi-otics. LiaH belongs to the LiaRS regulon. It forms multimericringlike structures consisting of 36 identical subunits that protectcell envelope integrity probably by binding to the membrane upon

TABLE 1 Responder proteins induced by nisin, gallidermin, and mersacidin

Responderprotein

Induction factora

Protein name Function RegulatorNisin(25% inhibition)

Nisin(50% inhibition) Gallidermin Mersacidin

LiaH 6.6 19 86 92 Modulator of liaIHGFSR operonexpression

TrmB 3.4 2.8 9.1 8.6 tRNA [guanin-N(7)]methyltransferaseYtrE 1.6 2.1 21 14 Similar to ABC transporterNGM1 1.6 2.5 13 8.5 Not identifiedPspA 1.8 5.5 6.4 Phage shock protein A Protection against cell envelope

stressSigW

NadE 1.6 2.3 6.7 NAD synthetase Energy limitation-mediated stressresponse

SigB

YceC 13 4.2 Similar to tellurium resistance protein Stress response SigW/SigBYceH 5.8 2.4 Similar to toxic anion resistance protein Stress response SigW/SigBYtrB 14 9.8 Similar to ABC transporter Putative ABC transporter ATPase

subunitYtrA

GM1 7.9 8.3 Not identifiedGM2 8.6 6.7 Not identifiedSerA 1.2 2.6 D-3-Phosphoglycerate dehydrogenase Serine biosynthesis/oxidative

stress/NADH regenerationN1 1 13 Not identifiedDltA 4.2 D-Alanyl:D-alanine carrier protein ligase Modification of lipoteichoic acids SigXYvlBa 3.6 Unknown Stress response SigWYvlBb 7 Unknown Stress responsePbpC 27 Penicillin binding protein 3 Cell wall biosynthesisRpsB 4.1 Ribosomal protein S2 TranslationG1 7.2 Not identifiedG2 3 Not identifiedG3 3.9 Not identifiedG4 2.4 Not identifiedG5 3.3 Not identifiedG6 47 Not identifiedG7 5.8 Not identifiedG8 2.8 Not identifiedG9 11 Not identifiedYqiG 5 NADH-dependent flavin oxidoreductase Electron transportM1 7.3 Not identifiedM2 7.2 Not identifiedM3 3.2 Not identified

a Bold numbers indicate reliable marker proteins, more than 2-fold induced in three independent biological replicates.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

41

cell wall stress (51). LiaRS has been shown before to be induced byvarious cell wall biosynthesis inhibitors, such as bacitracin, nisin,ramoplanin, and to a lesser extent vancomycin, measuring liaI-lacZ reporter gene activation (29). Further, the LiaRS system was

induced after severe secretion stress, suggesting that protein accu-mulation in the cell envelope may also trigger LiaH induction(24). Besides the three lantibiotics investigated here, two inhibi-tors targeting membrane-bound steps of cell wall precursor syn-thesis were previously analyzed using proteomic profiling. Vanco-mycin prevents transglycosylation by binding to the amino acidside chain of lipid II, while bacitracin prevents recycling of thebactoprenol carrier that transports cell wall precursor moleculesthrough the membrane (15). LiaH was upregulated in response toall lantibiotics, as well as bacitracin and gramicidin S, but notvancomycin. A possible explanation might be that the lipid IIbinding site of vancomycin is the amino acid chain of lipid II,which is remote from the membrane (15), while for all other com-pounds, the lipid II binding sites are in close proximity to themembrane.

YtrE and YtrB, which are upregulated by all investigated cellwall biosynthesis inhibitors with the exception of nisin, are en-coded in the ytrABCDEF operon and form two cytoplasmicATPase subunits of a putative ABC transporter (52). Earlier stud-ies by Yoshida et al. demonstrated impaired acetoin import inytr-deficient knockout mutants (53). However, it should be notedthat the YtrF substrate recognition subunit shares homology withboth antimicrobial peptide efflux systems and the FtsX permeaseinvolved in cell division. Delayed spore formation was observed inthe absence of FtsX (21) as well as in ytr-deficient mutants (53),possibly indicating similar functions of both proteins. Although itis yet unclear how YtrE/YtrB induction might be connected to theantibiotic mechanism, they serve as specific markers for cell wallbiosynthesis inhibition. YtrE is the only marker protein shared byall lantibiotics, vancomycin, and bacitracin. It is not induced byother antibiotics tested and is, therefore, the most reliable markerfor inhibition of a membrane-bound step of cell wall biosynthesis.

TrmB is a tRNA-modifying [guanine-N(7)-]-methyltrans-ferase involved in tRNA maturation (54). What role it might playin the response to lantibiotic treatment remains unclear. LikeLiaH, unidentified NGM1 is induced by all lantibiotics and baci-tracin but not vancomycin, demonstrating a different cell re-sponse to vancomycin.

Likewise, the response pattern induced by the lipopeptide fri-ulimicin B differs from that of cell wall biosynthesis-targeting an-tibiotics that bind proximal to the membrane. In contrast to thelipid II-binding lantibiotics tested here, friulimicin B binds to bac-

TABLE 2 Marker proteins for antibiotics targeting membrane integrity and/or cell wall biosynthesis correlated with influence on cell envelope integrityc

Compound Mode of actionCell wallintegrity

MinDdelocalization

Potassiumleakage NadE PspA YceC YceH TrmB LiaH YtrE YtrB NGM1

Valinomycinb Carrier ionophore � � � x x x xGramicidin Aa Channel ionophore � � � x x xGramicidin Sb Membrane integration � � � x x x x x xNisin Pore formation and cell wall

biosynthesis� � � x x x x x x

Gallidermin Membrane integration and cellwall biosynthesis

� � � x x x x x x x x x

Mersacidin Cell wall biosynthesis � � � x x x x x x xBacitracina Cell wall biosynthesis � � � x x x x xVancomycina Cell wall biosynthesis � � � x x xa Previously published (4).b 2D gel images not shown.c �, envelope functionality as measured in cell wall integrity assay, MinD delocalization assay, or potassium release assay was impaired; �, control-like envelope functionality; x,marker protein upregulated at least twofold in response to antibiotic treatment.

FIG 5 Details of autoradiographs of 2D gels depicting the specific markerproteins for cell wall biosynthesis, membrane stress, and general cell envelopestress. Induction factors are displayed in the lower right corner as the averageover three independent biological replicates.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

42

toprenol monophosphate, thus inhibiting carrier recycling. As aresult, cell wall biosynthesis and biosynthesis of wall teichoic acidsand carbohydrate-containing capsular material are impaired, andcell envelope modification reactions such as glycosylations are in-hibited. All these pathways depend on bactoprenol-mediatedbuilding block shuffling to the outside (37). As expected for anantibiotic interfering with cell wall biosynthesis, friulimicin Bleads to membrane extrusions in the methanol-acetic acid assay. Itdoes not depolarize the bacterial membrane in the GFP-MinDassay (data not shown) and does not cause potassium leakage (37).Friulimicin B shares a high mode of action similarity with bacitra-cin, which binds to bactroprenol pyrophosphate. However, whilebacitracin induces all cell wall biosynthesis marker proteins, fri-ulimicin B induces only the unidentified marker proteins NGM1and GM1 but not LiaH or YtrE (data not shown). In a previousstudy, Wecke et al. further showed induction of YceC and YceH(46), which in the present study were upregulated in response toseveral of the cell envelope-targeting antibiotics but were not cor-related strictly with either interference with the membrane or withcell wall biosynthesis.

A clear distinction based on the proteome response can bemade between inhibition of membrane-bound steps of cell wallbiosynthesis and inhibition of either intracellular or extracellularsteps. This could be shown using D-cycloserine or methicillin, re-spectively. D-Cycloserine, which inhibits alanine racemase, andD-alanine:D-alanine ligase, two intracellular enzymes of the path-way (28, 43), elicit a completely different proteomic response withno marker proteins overlapping with any of the other investigatedcell wall biosynthesis inhibitors (4). Methicillin inhibits penicil-lin-binding protein 2 (PBP-2), a membrane-anchored transpep-tidase and transglycosylase (33); however, the methicillin bindingsite is not located near the membrane anchor, and a direct inter-action of methicillin with the cytoplasmic membrane has not beenreported. For this compound in B. subtilis, no acute stress re-sponse at all was observed on the proteome level (4), suggestingthat B. subtilis cells do either not sense the consequences of meth-icillin action and/or are unable to react to them. Based on theseresults, differences in the proteomic response to cell wall biosyn-thesis inhibition relating to the localization of the steps inhibitedand potentially even the proximity of the antibiotic binding sitesto the bacterial membrane can be observed.

Marker proteins for interference with membrane integrity.PspA and NadE are both induced by nisin and gallidermin as wellas gramicidin A, gramicidin S, and valinomycin. Among all agentstested so far, only compounds acting on the bacterial membraneled to induction of these two proteins, supporting that they arespecific marker proteins for membrane stress.

Interestingly, upregulation of PspA and NadE was observedonly at higher nisin concentrations, leading to approximately 50%growth inhibition, while the cell wall biosynthesis-specific mark-ers LiaH and TrmB were upregulated already under moderatestress conditions, causing approximately 25% growth inhibition(Table 1). This is in line with a two-staged mechanism of action ofnisin, which is characterized by lipid II complexation at lowerconcentrations and pore formation above a threshold concentra-tion (9, 23). PspA, like LiaH, forms homomultimeric ringlikestructures (22). Although Standar et al. showed that those 36-mersare able to form large scaffolds (40), more recent studies demon-strated localization of PspA at midcell and at the cell poles by useof a GFP fusion (19). It was shown that PspA is able to bind to

membrane phospholipids and prevent proton leakage. It isthought to counteract external membrane damage and to stabilizethe membrane during membrane transport (27). Structural ho-mology between PspA and LiaH suggests similar functions in sta-bilizing the cell envelope by binding to the membrane surface.Our results indicate that PspA is responsive to membrane damage,while LiaH is induced by lipid II-mediated cell wall stress. How-ever, the different triggers inducing both stress proteins remain tobe identified (51).

NAD synthase NadE, which catalyzes the final step in NADsynthesis, is regulated on the transcriptional level by the house-keeping sigma factor SigA and by the alternative sigma factor SigBcoordinating the general stress response in B. subtilis in responseto environmental stress and energy limitation. As a consequenceof antibiotic-related impairment of membrane integrity evi-denced by the disturbed membrane potential, energy limitation isa possible explanation for NadE upregulation.

Differentiation between pore formation by nisin and mem-brane integration by gallidermin could not be securely establishedbased on specific marker proteins. This may be due to rapid killingof cells once nisin concentrations reach the necessary thresholdfor pore formation, hardly leaving a chance for a coordinatedstress response. For this reason, pore formation might be difficultto distinguish from other forms of membrane stress by proteomeanalysis alone. However, monitoring concentration-dependentkilling kinetics already allows differentiation between compoundsthat integrate into the membrane and those that form pores.Rapid bacteriolytic pore formers leave only a very narrow concen-tration window for proteomic profiling experiments and shouldinduce the membrane stress-specific marker proteins PspA andNadE at the appropriate antibiotic concentrations.

Marker proteins for envelope stress. Putative tellurium resis-tance protein YceC, induced by gallidermin and mersacidin, wasalso induced by several of the envelope-targeting compounds inour proteomic response library, namely, valinomycin, gramicidinS, bacitracin, and vancomycin, and can therefore serve as a generalmarker for envelope stress. Putative anion resistance proteinYceH was also upregulated in response to gallidermin, mersacidin,valinomycin, gramicidin S, and gramicidin A. YceC and YceH areunder the dual control of SigW and SigB, but to our knowledgetheir functions are yet unknown.

In conclusion, using lantibiotics and a number of other antibi-otics with different targets related to the cellular envelope, wedescribed marker proteins correlating with cell wall biosynthesisinhibition, membrane stress, and general cell envelope stress. Theestablished marker proteins can now be used to characterize newantibiotic agents, particularly lantibiotics, with regard to their an-tibacterial mechanisms.

ACKNOWLEDGMENTS

Mersacidin was provided by Sanofi-Aventis (formerly Hoechst AG). Wegratefully acknowledge Jia Yii Airina Lee from Pennsylvania State Univer-sity as well as Christoph H. R. Senges (Ruhr University Bochum) forassistance with the bubble and MinD-GFP assays. We are also grateful forexcellent support by the technical staff at Rubion, Ruhr University Bo-chum, and to Michaele Josten, University of Bonn, for purifying nisin.

This work was financially supported by “Innovative Antibiotics fromNRW,” a grant from the state of North Rhine-Westphalia (NRW), Ger-many, and the European Union, European Regional Development Fund,“Investing in Your Future,” to J.E.B. and H.G.S.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

43

REFERENCES1. Anagnostopoulos C, Spizizen J. 1961. Requirements for transformation

in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81:741–746.2. Bandow JE. 2005. Proteomic approaches to antibiotic drug discovery.

Curr. Protoc. Microbiol. 1:1F.2.3. Bandow JE, et al. 2008. Improved image analysis workflow for 2D gels

enables large-scale 2D gel-based proteomics studies—COPD biomarkerdiscovery study. Proteomics 8:3030 –3041.

4. Bandow JE, Brötz H, Leichert LI, Labischinski H, Hecker M. 2003.Proteomic approach to understanding antibiotic action. Antimicrob.Agents Chemother. 47:948 –955.

5. Bandow JE, Metzler-Nolte N. 2009. New ways of killing the beast: pros-pects for inorganic-organic hybrid nanomaterials as antibacterial agents.Chembiochem 10:2847–2850.

6. Barrett MS, Wenzel RP, Jones RN. 1992. In vitro activity of mersacidin(M87-1551), an investigational peptide antibiotic tested against Gram-positive bloodstream isolates. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15:641– 644.

7. Bierbaum G, Sahl HG. 2009. Lantibiotics: mode of action, biosynthesisand bioengineering. Curr. Pharm. Biotechnol. 10:2–18.

8. Bonelli RR, Schneider T, Sahl HG, Wiedemann I. 2006. Insights into invivo activities of lantibiotics from gallidermin and epidermin mode-of-action studies. Antimicrob. Agents Chemother. 50:1449 –1457.

9. Breukink E, et al. 2003. Lipid II is an intrinsic component of the pore inducedby nisin in bacterial membranes. J. Biol. Chem. 278:19898–19903.

10. Brötz-Osterhelt H, Sass P. 2010. Postgenomic strategies in antibacterialdrug discovery. Future Microbiol. 5:1553–1579.

11. Brötz-Osterhelt H, Brunner NA. 2008. How many modes of actionshould an antibiotic have? Curr. Opin. Pharmacol. 8:564 –573.

12. Brötz-Oesterhelt H, et al. 2005. Dysregulation of bacterial proteolyticmachinery by a new class of antibiotics. Nat. Med. 11:1082–1087.

13. Brötz H, Sahl HG. 2000. New insights into the mechanism of action oflantibiotics— diverse biological effects by binding to the same moleculartarget. J. Antimicrob. Chemother. 46:1– 6.

14. Brötz H, Bierbaum G, Leopold K, Reynolds PE, Sahl HG. 1998. Thelantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipidII. Antimicrob. Agents Chemother. 42:154 –160.

15. Bugg TDH, Braddick D, Dowson CG, Roper DI. 2011. Bacterial cell wallassembly: still an attractive antibacterial target. Trends Biotechnol. 29:167–173.

16. Christ K, et al. 2008. Membrane lipids determine the antibiotic activity ofthe lantibiotic gallidermin. J. Membr. Biol. 226:9 –16.

17. Clejan S, Krulwich TA, Mondrus KR, Seto-Young D. 1986. Membranelipid composition of obligately and fakultatively alkalophilic strains ofBacillus spp. J. Bacteriol. 168:334 –340.

18. Duax WL, et al. 1996. Molecular structure and mechanisms of action ofcyclic and linear ion transport antibiotics. Biopolymers 40:141–155.

19. Engl C, et al. 2009. In vivo localizations of membrane stress controllersPspA and PspG in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 73:382–396.

20. Eymann C, et al. 2004. A comprehensive proteome map of growingBacillus subtilis cells. Proteomics 4:2849 –2876.

21. Garti-Levi S, Hazan R, Kain J, Fujita M, Ben-Yehuda S. 2008. The FtsEXABC transporter directs cellular differentiation in Bacillus subtilis. Mol.Microbiol. 69:1018 –1028.

22. Hankamer BD, Elderkin SL, Buck M, Nield J. 2004. Organization of theAAA� adaptor protein PspA is an oligomeric ring. J. Biol. Chem. 279:8862– 8866.

23. Hasper HE, de Kruijff B, Breukink E. 2004. Assembly and stability ofnisin-lipid II pores. Biochemistry 43:11567–11575.

24. Hyyryläinen HL, Sarvay M, Kontinen VP. 2005. Transcriptome analysisof the secretion stress response of Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Bio-technol. 67:389 –396.

25. Kaprel’iants AS, et al. 1977. Membranes of bacteria and mechanism ofaction of the antibiotic gramicidin S. Biokhimiia. 42:329 –337.

26. Katsu T, et al. 1989. Mechanism of membrane damage induced by theamphiphilic peptides gramicidin S and melittin. Biochim. Biophys. Acta983:135–141.

27. Kobayashi R, Suzuki T, Yoshida M. 2007. Escherichia coli phage-shockprotein A (PspA) binds to membrane phospholipids and repairs protonleakage of the damaged membranes. Mol. Microbiol. 66:100 –109.

28. Lambert MP, Neuhaus FC. 1972. Mechanism of D-cycloserine action:alanine racemase from Escherichia coli W. J. Bacteriol. 109:1156 –1161.

29. Mascher T, Zimmer SL, Smith TA, Helmann JD. 2004. Antibiotic-

inducible promotor regulated by the cell envelope stress-sensing two-component system LiaRS of Bacillus subtilis. Antimicrob. Agents Che-mother. 48:2888 –2896.

30. Mogi T, Ui H, Shiomi K, Omura S, Kita K. 2008. Gramicidin S identifiedas a potent inhibitor for cytochrome bd-type quinol oxidase. FEBS Lett.582:2299 –2302.

31. Orlov DS, Nguyen T, Lehrer RI. 2002. Potassium release, a useful tool forstudying antimicrobial peptides. J. Microbiol. Methods 49:325–328.

32. Peschel A, Sahl HG. 2006. The co-evolution of host cationic antimicro-bial peptides and microbial resistance. Nat. Rev. Microbiol. 4:529 –536.

33. Pinho MG, de Lencastre H, Tomasz A. 2001. An acquired and a nativepenicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:10886 –10891.

34. Rabilloud T, Strub JM, Luche S, van Dorsselaer A, Lunardi J. 2001. Acomparison between SyproRuby and ruthenium II Tris (bathophenanth-roline disulfonate) as fluorescent stains for protein detection in gels. Pro-teomics 1:699 –704.

35. Reisinger P, Seidel H, Tschesche H, Hammes WP. 1980. The effect ofnisin on murein synthesis. Arch. Microbiol. 127:187–193.

36. Schneider T, et al. 2010. Plectasin, a fungal defensin, targets the bacterialcell wall precursor lipid II. Science 328:1168 –1172.

37. Schneider T, et al. 2009. The lipopeptide antibiotic friulimicin B inhibitscell wall biosynthesis through complex formation with bactoprenol phos-phate. Antimicrob. Agents Chemother. 53:1610 –1618.

38. Schneider T, Sahl HG. 2010. An oldie but a goodie— cell wall biosynthe-sis as antibiotic target pathway. Int. J. Med. Microbiol. 300:161–169.

39. Singh VK, Jayaswal RK, Wilkinson BJ. 2001. Cell wall-active antibioticinduced proteins of Staphylococcus aureus identified using a proteomicapproach. FEMS Microbiol. Lett. 199:79 – 84.

40. Standar K, et al. 2008. PspA forms large scaffolds in Escherichia coli. FEBSLett. 582:3585–3589.

41. Strahl H, Hamoen LW. 2010. Membrane potential is important for bac-terial cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 27:12281–12286.

42. Stülke J, Hanschke R, Hecker M. 1993. Temporal activation of betaglu-canase synthesis in Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen.Microbiol. 139:2041–2045.

43. Vicario PP, Green BG, Katzen HM. 1987. A single assay for simultane-ously testing effectors of alanine racemase and/or D-alanine:D-alanine li-gase. J. Antibiot. (Tokyo) 40:209 –216.

44. Vostroknutova GN, Bulgakova VG, Udalova TP, Sepetov NF, Sibel’dinaLA. 1981. Localization of gramicidin S on the cytoplasmic membrane ofBacillus brevis and its effect on the activity of membrane enzymes. Biokh-imiia 46:657– 666.

45. Wadhwani P, Afonin S, Ieronimo M, Buerck J, Ulrich AS. 2006. Opti-mized protocol for synthesis of cyclic gramicidin S: starting amino acid iskey to high yield. J. Org. Chem. 71:55– 61.

46. Wecke T, et al. 2009. Daptomycin versus friulimicn B: in-depth profilingof Bacillus subtilis cell envelope stress responses. Antimicrob. Agents Che-mother. 53:1619 –1623.

47. Wenzel M, Bandow JE. 2011. Proteomic signatures in antibiotic research.Proteomics 11:3256 –3268.

48. Wenzel M, et al. 2011. Proteomic signature of fatty acid biosynthesisinhibition available for in vivo mechanism-of-action studies. Antimicrob.Agents Chemother. 55:2590 –2596.

49. WHO. 2012. The evolving threat of antimicrobial resistance—options foraction. World Health Organization, Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2012/9789241503181_eng.pdf.

50. Wiedemann I, Benz R, Sahl HG. 2004. Lipid II-mediated pore formationby the peptide antibiotic nisin—a black lipid membrane study. J. Bacte-riol. 186:3259 –3261.

51. Wolf D, et al. 2010. In-depth profiling of LiaR response in Bacillus subtilis.J. Bacteriol. 192:4680 – 4693.

52. Xiao Z, Xu P. 2007. Acetoin metabolism in bacteria. Crit. Rev. Microbiol.33:127–140.

53. Yoshida KI, Fujita Y, Ehrlich SD. 2000. An operon for a putative ATP-binding cassette transport system involved in acetoin utilization of Bacil-lus subtilis. J. Bacteriol. 182:5454 –5461.

54. Zegers I, et al. 2006. Crystal structure of Bacillus subtilis TrmB, the tRNA(m7G46) methyltransferase. Nucleic Acids Res. 34:1925–1934.

55. Zhang L, Dhillon P, Yan H, Farmer S, Hancock REW. 2000. Interactionsof bacterial cationic peptide antibiotics with outer and cytoplasmic mem-branes of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44:3317–3321.

on October 31, 2012 by U

NIV

ER

SIT

AT

BO

CH

UM

http://aac.asm.org/

Dow

nloaded from

C Lantibiotic stress response

44

D 

 

Modulating the activity of short arginine‐

tryptophan containing antibacterial peptides with 

N‐terminal metallocenoyl groups 

 

H. Bauke Albada, Alina Iulia Chiriac, Michaela Wenzel, Maya Penkova, 

Julia E. Bandow, Hans‐Georg Sahl, Nils Metzler‐Nolte  

 

 

 

 

 

 

 

 

Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2012  

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

45

1753

Modulating the activity of short arginine-tryptophancontaining antibacterial peptides with N-terminal

metallocenoyl groupsH. Bauke Albada1, Alina-Iulia Chiriac2, Michaela Wenzel3, Maya Penkova1,

Julia E. Bandow3, Hans-Georg Sahl2 and Nils Metzler-Nolte*1

Full Research Paper Open Access

Address:1Inorganic Chemistry I – Bioinorganic Chemistry, Faculty of Chemistryand Biochemistry, Ruhr University Bochum, Universitätsstraße 150,44801 Bochum, Germany, 2Institute for Medical Microbiology,Immunology, and Parasitology, Pharmaceutical Microbiology Section,University of Bonn, Meckenheimer Allee 168, 53115 Bonn, Germanyand 3Microbial Biology, Faculty of Biology and Biotechnology, RuhrUniversity Bochum, Universitätsstraße 150, 44801 Bochum, Germany

Email:Nils Metzler-Nolte* - nils.metzler-nolte@rub.de.

* Corresponding author

Keywords:antimicrobial peptides; arginine; medicinal organometallic chemistry;metallocenoyl; peptides; tryptophan

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.doi:10.3762/bjoc.8.200

Received: 14 July 2012Accepted: 06 September 2012Published: 15 October 2012

This article is part of the Thematic Series "Antibiotic and cytotoxicpeptides".

Guest Editor: N. Sewald

© 2012 Albada et al; licensee Beilstein-Institut.License and terms: see end of document.

AbstractA series of small synthetic arginine and tryptophan containing peptides was prepared and analyzed for their antibacterial activity.

The effect of N-terminal substitution with metallocenoyl groups such as ferrocene (FcCO) and ruthenocene (RcCO) was investi-

gated. Antibacterial activity in different media, growth inhibition, and killing kinetics of the most active peptides were determined.

The toxicity of selected derivatives was determined against erythrocytes and three human cancer cell lines. It was shown that the

replacement of an N-terminal arginine residue with a metallocenoyl moiety modulates the activity of WRWRW-peptides against

Gram-positive and Gram-negative bacteria. MIC values of 2–6 µM for RcCO-W(RW)2 and 1–11 µM for (RW)3 were determined.

Interestingly, W(RW)2-peptides derivatized with ferrocene were significantly less active than those derivatized with ruthenocene

which have similar structural but different electronic properties, suggesting a major influence of the latter. The high activities

observed for the RcCO-W(RW)2- and (RW)3-peptides led to an investigation of the origin of activity of these peptides using several

important activity-related parameters. Firstly, killing kinetics of the RcCO-W(RW)2-peptide versus killing kinetics of the (RW)3

derivative showed faster reduction of the colony forming units for the RcCO-W(RW)2-peptide, although MIC values indicated

higher activity for the (RW)3-peptide. This was confirmed by growth inhibition studies. Secondly, hemolysis studies revealed that

both peptides did not lead to significant destruction of erythrocytes, even up to 500 µg/mL for (RW)3 and 250 µg/mL for RcCO-

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

46

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1754

W(RW)2. In addition, toxicity against three human cancer cell lines (HepG2, HT29, MCF7) showed that the (RW)3-peptide had an

IC50 value of ~140 µM and the RcW(RW)2 one of ~90 µM, indicating a potentially interesting therapeutic window. Both the killing

kinetics and growth inhibition studies presented in this work point to a membrane-based mode of action for these two peptides, each

having different kinetic parameters.

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1754

IntroductionNew antibacterial agents need to be discovered since estab-

lished antibiotics are increasingly losing ground against resis-

tant bacteria and at the same time the pipeline that is supposed

to produce new antibiotics is running dry [1]. For example, the

number of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

infections in hospitals are still very high and new infectious

agents like Acinetobacter baumannii are on the rise, both

leading to increased numbers of mortality. In view of this, the

discovery of host-defense and antimicrobial peptides with

bacteria-specific membrane targeting modes of action (MOA)

to which resistance cannot easily develop has led to high expec-

tations in the treatment of bacterial infections [2-4]. Whereas

host-defense peptides are found in many multicellular organ-

isms as part of their innate immune system, the name “anti-

microbial peptides” (abbreviated as AMPs) defines a larger

group of peptides that also encompasses synthetic peptides, and

peptidomimetics, for example. Among these, synthetic peptide-

based antimicrobial agents are especially interesting because

isolation and/or synthesis of traditional organic molecules is

often time-consuming and costly [3,5]. In fact, already in World

War II, peptides belonging to a certain group of antimicrobial

peptides, i.e., the gramicidins, found application in the treat-

ment of gunshot wounds [6]. Unfortunately, their general

toxicity prevented widespread systemic administration in the

clinic. However, during the past couple of decades a large

number of peptides with very potent antimicrobial activity and

lower general toxicity were discovered [7].

Inspired by these antimicrobial peptides, many synthetic deriva-

tives of naturally occurring antimicrobial peptides have been

studied [5]. In addition, chemical syntheses of a large number of

peptides that do not have natural counterparts have furnished

promising synthetic antimicrobial peptides (synAMPs) [8]. For

example, peptide-dendrimers [9-13], lipidated short peptides

[14], trivalent lipidated short peptides with antifungal activity

[15], peptoids [16], peptides containing D-amino acids [17], and

foldamers based on β-amino acid residues with antibacterial

activity [18] have been described. Whereas nature has to stick

to products compatible with biosynthetic pathways, the syn-

thetic chemist is free to apply all available compounds and tech-

niques, thereby introducing even the most exotic molecular

entities. The most recent and exotic additions are conjugates of

metallocenes with short synthetic antimicrobial peptides [19-22]

and organometallic derivatives of platensimycin [23-28].

Among the synAMPs known to date, those based on arginine

(Arg or R) and tryptophan (Trp or W) residues are amongst the

smallest peptides that still possess significant antibacterial

activity. For example, Strøm et al. [29] described short

RW-based synAMPs with different N- and C-terminal

substituents, which showed low micromolar antibacterial

activity against various strains of Gram-positive bacteria and

moderate activity against Gram-negative bacteria. Interestingly,

head-to-tail cyclized RW-based synAMPs with clustered func-

tionalities increased the activity against Gram-negative

Escherichia coli much more than against Gram-positive

Bacillus subtilis [30,31], and only slightly increased the

hemolytic activity [32]. Moreover, the alkylation of tryptophan

residues by tert-butyl groups resulted in increased activity and

low hemolytic activity of the constructs [33]. Our group has

previously shown that the covalent attachment of metal

complexes to RW-based synAMPs yields more active deriva-

tives with a changed activity profile for Gram-positive and

Gram-negative bacteria. In this work, the attachment of the

neutral ferrocenoyl group (ferrocene: dicyclopentadienyl iron,

Cp2Fe; ferrocenoyl: FcCO) was beneficial over the presence of

the monocationic cobaltocenium (Cc+CO) fragment [20].

To gain a better understanding of the origin of the activity of

these RW-based synAMPs and of the effect exerted on it by a

metallocene moiety, a set of peptides was synthesized and

tested for antimicrobial activity. In this paper we add another

metal to the spectrum of existing organometallic synAMPs and

we provide a detailed assessment of the kinetic parameters of

this peptide. Specifically, we describe the effect of the introduc-

tion of ruthenocenoyl (ruthenocene: dicyclopentadienyl ruthe-

nium, Cp2Ru; ruthenocenoyl: RcCO), an organometallic moiety

that is almost isostructural to ferrocenoyl (FcCO) but has

different electro- and physicochemical properties [34]. For

example, the more extended d-orbitals of Rc form stronger

hydrogen bonds with OH or NH groups than Fc [35]. The

activities of the synAMPs (MIC values) were compared to those

of GS(K2Y2) (Y = D-tyrosine), a gramicidin S analogue, and

vancomycin, one of the last lines of defense against Staphylo-

coccus infections. From the antibacterial activity screening, the

two most active peptides were selected for further analysis, i.e.,

H-Arg-Trp-Arg-Trp-Arg-Trp-NH2 (referred to as (RW)3), and

RcCO-Trp-Arg-Trp-Arg-Trp-NH2 (referred to as RcCO-

W(RW)2). For these peptides, toxicity against three human

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

47

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1755

Figure 1: Structures of the most active peptides that have been used in this study. The top row shows two representative structures of the Arg-Trpbased peptides (left) and their metallocene-derivatives (right); the lower row shows the structure of pore-forming gramicidin S derivative GS(K2Y2)(left) and lipid II-binding cell wall biosynthesis inhibitor vancomycin (right).

cancer cell lines was assessed, followed by determination of

their killing kinetics and growth inhibition potential. Please note

that underlined one-letter codes of the amino acid residues

represent D-amino acids, not underlined one-letter codes of the

residues are L-amino acids.

ResultsSynthesis of the synAMPsAll peptides described in this study were prepared according to

established or recently published procedures [36]. In short,

Fmoc-protected amino acids were coupled in a solid-state syn-

thesis scheme using HOBt, TBTU, and DiPEA under

microwave irradiation. Using suitably protected amino acids,

i.e., Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, and Fmoc-

Lys(Boc)-OH, and polystyrene-based resin decorated with

Fmoc-protected Rink linkers, a set of peptides were prepared

(Table 1 and Figure 1). These peptides were obtained after

acidic cleavage of the resin-bound protected precursors, puri-

fied by preparative HPLC, and the fractions containing the

desired compound in high purity were lyophilized from the

prep-HPLC buffers. All these peptides were obtained in high

yields and close to 100% HPLC purity.

Table 1: Overview of the studied sequences and analysis thereof(retention times and m/z values). Underlined amino acids are D-enan-tiomers, not underlined residues are L-enantiomers; FcCO refers toferrocenoyl and RcCO to ruthenocenoyl (Figure 1).

entry sequence tR(min)

m/z found(calcd for [M + H]+)

1 H-RWRWRW-NH2 17.2 1044.25 (1044.58)2 H-RWRWRW-NH2 17.2 1044.27 (1044.58)3 RcCO-WRWRW-NH2 20.1 1146.27 (1146.44)4 RcCO-WRWRW-NH2 20.1 1146.11 (1146.44)5 FcCO-WRWRW-NH2 20.2 1100.36 (1100.47)6 Ac-RWRWRW-NH2 17.6 1086.45 (1086.59)7 Ac-RWRWRW-NH2 17.6 1086.37 (1086.59)8 FcCO-RWRWRW-NH2 19.0 1256.48 (1256.57)9 FcCO-RWRWRW-NH2 19.0 1256.46 (1256.59)10 H-KWKWKW-NH2 16.7 959.43 (959.55)11 vancomycina 11.7 1448.56 (1448.44)12 GS(K2Y2)b 25.0 1201.46 (1201.73)

aVancomycin was obtained from Sigma-Aldrich Fluka and purified bypreparative HPLC using a C18-reversered phase column; bGS(K2Y2) =cyclo([Pro-Val-Lys-Leu-D-Tyr]2) was prepared according to [37].

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

48

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1756

Table 2: Minimum inhibitory concentrations (µM) in the cell culture medium of the synAMPs described in this study (according to CSLI guidelines).Peptides have C-terminal carboxamides and are not derivatized on the N-terminus except where noted, i.e., with acetyl (Ac), FcCO or RcCO. Valuesin brackets are determined in Mueller–Hinton (MH) medium. More details on the bacterial strains can be found in the experimental section.

synAMP Gram-negative Gram-positiveE. coli A. baumannii P. aeruginosa B. subtilis S. aureus S. aureus

(MRSA)

(RW)3 21 21 n.a. 1.3 11 (11) 5.3 (11)(RW)3 21 21 n.a. 1.3 5.3 5.3(KW)3 n.a. n.a. n.a. 11–5.7 n.a. n.a.Ac(RW)3 45 – – 45 – –Ac(RW)3 90 – – 90 – –FcCO-(RW)3 20 – – 20 – –FcCO-(RW)3 20 – – 5 – –RcCO-W(RW)2 47 23–12 n.a. 2.9 5.8 (5.8) 5.8 (5.8)RcCO-W(RW)2 23 23–11 93 1.5 2.9 1.5FcCO-W(RW)2 >96 – >96 12 – 48vancomycin 76–38 38 n.a. 0.3 0.3 0.6GS(K2Y2) 22–11 2.8–1.4 n.a. 1.4 1.4 2.8

Biological activityMinimum inhibitory concentrationThe antibacterial activity of the peptides was first assessed by

determining their minimum inhibitory concentration (MIC)

value. This MIC value represents the lowest concentration of

the antibacterial agent that is needed to hinder the growth of the

bacteria [38]. For this, six standard bacterial strains – among

them three Gram-negative and three Gram-positive pathogens –

were incubated with increasing concentrations of the antibacte-

rial peptide (Table 2). In order to put the activities of these

RW-based synAMPs and their organometallic conjugates into

perspective, two reference peptides were included, i.e.,

membrane-targeting gramicidin S derivative GS(K2Y2) and cell

wall precursor lipid II-targeting vancomycin.

For the calculations of the MIC values in µM, molecular

weights of the peptides together with one TFA-counterion for

each basic amino acid residue were used. ‘n.a.’ means ‘not

active’ (MIC > 100 μM), ‘–‘ indicates that these MIC values

were not determined.

In general, the activity of these synAMPs against Gram-nega-

tive bacteria is lower than against Gram-positive pathogens.

Even if differences can be seen in the Gram-negative values,

none of the RW-peptides was very active. Unfortunately, none

of the peptides showed significant activity against

Pseudomonas aeruginosa, a prominent pathogen that causes

infections in e.g., cystic fibrosis patients. However, activities of

the synAMPs against Gram-positive bacteria are only slightly

lower than those of gramicidin S derivative GS(K2Y2), a

peptide that contains twice as many amino acids as RcCO-

W(RW)2. Interestingly, the replacement of the acetyl-group in

Ac(RW)3 with the ferrocenoyl moiety results in more active

peptides, which is most likely due to the increased hydropho-

bicity of the FcCO-peptide (tR 17.6 min (for Ac(RW)3) vs

19.0 min (for FcCO-(RW)3). Although hydrophobicity seems to

be important for the activity of these synAMPs, it is not the

dominant factor in the organometallic derivatives. For example,

replacement of the ruthenium atom with iron, going from RcCO

to FcCO, results in a 4-fold and 8-fold drop in activity against

B. subtilis and S. aureus (MRSA), respectively, even though

their hydrophobicity is very similar. Since Rc is slightly larger

than Fc – i.e., metal–carbon bonds in the first are 221 ppm

whereas those in the latter are 204 pm [39,40], a difference of

about 0.17 Å – the difference in size of the two metallocene

derivatives could contribute to the significant difference in

activity. In addition, it has been described that ruthenocene is a

stronger hydrogen bond acceptor than ferrocene [37], which

originates from more extended d-orbitals of the Rc when

compared to Fc [41].

The comparable activities of (RW)3 and RcCO-W(RW)2 are

especially remarkable since the peptides have very different

properties, i.e., the first peptide has four positive charges and

three units of lipophilic bulk (tR = 17.2 min) whereas the second

peptide has only two positive charges and four units of

lipophilic bulk (tR = 20.1 min). Whereas it is known that trypto-

phan residues function as membrane anchors [42], details of the

interaction between metallocene derivatives and bacterial

membranes are far from being understood. Importantly, the

activity of these peptides was comparable in two different

media, namely the bacterial Mueller–Hinton (MH) and in the

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

49

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1757

Table 3: Detailed assessment of the MIC values (in µg/mL) of both L- and D-versions of the (RW)3 and RcCO-W(RW)2 synAMPs against severalGram-positive bacterial strains. More details on the bacterial strains can be found in the experimental section.

strain (RW)3 (RW)3 RcCO-W(RW)2 RcCO-W(RW)2

S. aureus (133) 2.1 ± 0.7 2.1 ± 0.7 3.3 ± 1.4 6.7 ± 2.9S. simulans (22) 5.0 ± 0.0 3.3 ± 1.4 5.0 ± 0.0 6.7 ± 2.9S. aureus (SG511) 6.7 ± 2.9 4.2 ± 1.4 4.2 ± 1.4 8.3 ± 2.9B. subtilis 3.5 ± 1.8 3.8 ± 1.8 3.8 ± 1.8 3.8 ± 1.8B. megaterium 0.8 ± 0.7 0.5 ± 0.2 1.9 ± 0.9 2.5 ± 0.0M. luteus 0.6 ± 0.0 0.6 ± 0.0 0.9 ± 0.4 1.9 ± 0.9

richer cell culture medium. Interestingly, replacement of the

arginine residues with lysine residues resulted in an almost

completely inactive (KW)3 peptide [43]. Although the center of

the positive charge in both residues is found at five atoms from

the backbone, the different structures of the functional groups

and the hydrophobicity of the side chain seem to cause a signifi-

cant difference in activity [44,45].

From the initial screening, four peptides were selected for

further biological characterization. In view of the mentioned

differences in structure, including the addition of a novel metal

core in one of them, but rather similar activity the (RW)3 and

RcCO-W(RW)2 peptides were chosen. Since both L- and

D-amino acid versions of the (RW)3 and RcCO-W(RW)2

peptides are comparable in activity and represent the most

promising synAMPs (Table 2), we next determined the MIC

values of these four peptides against other Gram-positive

bacteria in order to expand the panel of test strains (Table 3).

As can be inferred from this table, the L- and D-amino acid

versions of these two synAMPs show comparable activity

although small differences can be observed. For example,

RcCO-W(RW)2 is almost twice as active against S. aureus

(SG511) as the D-amino acid isomer RcCO-W(RW)2, a differ-

ence that can be seen as a tendency against all but one of the

bacterial strains. Since the biological world is chiral, it is not

surprising to see some small differences between both chiral

forms of the synAMPs. Similar differences in the interaction

with chiral molecules and biological membranes have been

described before [46-48], although only in a few examples and

not without exceptions [49]. An opposite trend is seen for the

(RW)3-peptides, where the D-peptides show higher MIC values

than the L-peptides. These values could have been corroborated,

however, by preferential proteolytic degradation of the

N-terminally unprotected (RW)3-peptides [50].

In order to obtain more information on the antibacterial prop-

erties of these four peptides, we performed killing kinetics and

growth inhibition studies. Finally, we assessed the selectivity of

the RcCO-W(RW)2 and (RW)3 peptides towards bacteria by

determining their activity against human red blood cells and

several human cancer cell lines.

Killing kineticsKilling kinetics experiments show the rate at which bacteria are

killed over time and indicate whether an antibacterial agent has

a bacteriostatic or bactericidal activity. The killing kinetics of

the L-amino acid containing (RW)3- and RcCO-W(RW)2-

peptides were determined against S. aureus and B. megaterium

(Figure 2).

For this, peptides were added in various concentrations to bacte-

rial cultures at the optical densities of 0.1 at OD600. Aliquots of

the mixture were taken at given time points, plated in duplicate

on MH agar and incubated at 37 °C. Then, the number of

colony forming units (CFU) was counted (see Experimental

section for details).

The addition of the (RW)3 peptide to the bacterial culture

resulted in a strong inhibition and in an immediate reduction of

CFUs by a factor of 103 after 1 min, for both S. aureus and

B. megaterium. Similarly, treatment with RcCO-W(RW)2 also

decreased the number of CFUs and has shown increased

potency since only one dose at the MIC value was needed to

decrease the CFUs by 2–3 log units, whereas 5 × MIC of (RW)3

was required for a similar drop of CFUs. The immediate drop in

CFUs highlights the bactericidal nature of these synAMPs and

typically occurs with membrane acting compounds [51,52].

Growth inhibitionWhereas the killing kinetics studies determine the number of

viable cells as a function of time and thereby classify a com-

pound as bacteriostatic or bactericidal, monitoring the optical

density of a treated culture may give hints as to the lytic activity

of a compound.

In this work, the growth inhibition of Bacillus megaterium was

determined under the influence of the same four peptides used

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

50

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1758

Figure 2: Bactericidal activity of (RW)3 against S. aureus 133 (panel A and D) or B. megaterium (panel B) and of RcCO-W(RW)2 (panel C) against S.aureus 133. Panel D shows the experiment on S. aureus 133 (as in panel A) using short-term intervals for sample collection (note that the time-scaleis given in minutes). The first points in each graph are obtained after 1 min. Concentrations are denoted by: grey squares (for the control), blacktriangles with dotted line (only in panel C, 0.5 × MIC: 1.0 µg/mL for RcCO-W(RW)2), black circles with narrow line (1 × MIC: 0.8 µg/mL for (RW)3 and1.9 µg/mL for RcCO-W(RW)2), black diamonds with thick line (5 × MIC: 4 µg/mL for (RW)3, only in panels A, B, and D).

in the killing kinetics studies described earlier (Figure 3).

To determine this, B. megaterium was grown in half

Mueller–Hinton (MH) medium and stressed with peptides

(RW)3 or RcCO-W(RW)2 in their exponential growth phase.

Three concentrations were used: 2 × MIC, 4 × MIC and 8 ×

MIC. As a positive control the potent naturally occurring pore-

forming lantibiotic nisin was included.

At twice the MIC value, both of the D-amino acid containing

derivatives are slightly inferior for inhibiting growth than the

L-amino acid variants and the RcCO-W(RW)2-peptides are

more active than the (RW)3-peptides (Figure 3). This is in line

with our earlier observation, i.e., that the interaction of the

bacterial target and D-peptides is slightly less favorable than

that with L-peptides. Interestingly, the growth inhibition is more

efficient with the RcCO-W(RW)2 peptides than with the (RW)3

peptides (Figure 3, panel A), although the cells treated with the

RcCO-W(RW)2 peptide recover faster than those treated with

the (RW)3 peptide. This is also reflected in the similar MIC

values observed. It appears that the RcCO-W(RW)2 peptides

are faster acting than the (RW)3 peptides but may produce

cellular stress that can be better overcome by survivors in the

course of an MIC determination experiment (which takes about

18 h). This difference in growth inhibition between the meta-

lated and non-metalated peptide is even more pronounced at

four times the MIC value. At this concentration it seems that the

Rc-derivatized synAMPs are much more active than the non-

derivatized counterparts (Figure 3, panel B). Moreover, at this

concentration the RcCO-W(RW)2-peptides display the same

inhibition potency as nisin whereas the (RW)3 peptides are

much less active. At eight times the MIC value the bacterial

growth inhibition was accompanied by cell lysis. For all com-

pounds, the effect was equally strong so that a clear distinction

could not be observed anymore and all the peptides exhibited

the same effect on bacterial growth as nisin (Figure 3, panels C

and D). These findings are in agreement with the killing

kinetics in that RcCO-W(RW)2 is faster in killing than (RW)3.

Hemolytic activity against human red blood cellsAfter this, we assessed the hemolytic properties of these four

most active peptides (Table 4). Although an HC50 value was

reported for (RW)3 [53], neither the D-amino acid peptide nor

the organometallic derivatized peptides were studied with

respect to their hemolytic capacity. Therefore, all peptides were

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

51

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1759

Figure 3: Growth kinetics of B. megaterium under the influence of different amounts of synAMP (red: (RW)3; orange: (RW)3; green: RcCO-W(RW)2;blue: RcCO-W(RW)2), nisin (magenta), and a control (black). With 2 × MIC (1.6 µg/mL for (RW)3 and 3.8 µg/mL for RcCO-W(RW)2 panel A), 4 × MIC(3.2 µg/mL for (RW)3 and 7.6 µg/mL for RcCO-W(RW)2; panel B, note: The green line for RcCO-W(RW)2 is under the blue line for RcCO-W(RW)2),and 8 × MIC (6.4 µg/mL for (RW)3 and 15.2 µg/mL for RcCO-W(RW)2; panel C and D). Gridlines at 0.2, 0.4, 0.6, and 0.8 normalized OD600 areshown.

Table 4: Hemolytic activity of both L- and D-peptides of the (RW)3 andRcCO-W(RW)2 synAMPs against human red blood cells (hRBCs).

synAMP hemolytic activity

(RW)3 17% hemolysis at 500 µg/mL (333 µM)(RW)3 0% hemolysis up to 500 µg/mL (333 µM)RcCO-W(RW)2 64% hemolysis at 263 µg/mL (192 µM)RcCO-W(RW)2 68% hemolysis at 263 µg/mL (192 µM)

tested in parallel to obtain HC50 values under identical condi-

tions.

As can be seen from these results, none of these peptides is

strongly hemolytic. For example, each of the two (RW)3

compounds showed less than 50% hemolysis up to 500 µg/mL

(333 µM). This value is higher from what has been reported

before by Liu et al. (who reported 50% hemolysis at ~250 µM

[53]). In fact, only the L-amino acid peptide (RW)3 showed

weak hemolysis at 333 µM with 17% of the hRBCs being

destroyed as compared to Triton X-100. These low hemolytic

properties for both (RW)3-peptides, even up to 500 µg/mL, did

not allow us to calculate their HC50-values.

The high concentrations of the ruthenocene derivatives required

50% DMSO/PBS-buffer mixtures for solubility. Using the

appropriate blanks we found that >60% of the hRBCs were

lysed using 195 µM of the peptide, with RcCO-W(RW)2 being

more active than its L-amino acid counterpart. Using these

directly observed values, approximate HC50 values of 153 µM

(or 210 µg/mL) and 143 µM (or 196 µg/mL) were calculated

for RcCO-W(RW)2 and RcCO-W(RW)2, respectively.

Thus, the organometallic ruthenocenoyl-conjugated synAMPs

are more hemolytic than the parent (RW)3-peptides. Moreover,

whereas the L-amino acid version of (RW)3 was more active

that the peptide containing only D-amino acids, the opposite

was observed for the two RcCO-W(RW)2 peptides. Neverthe-

less, none of the obtained values showed strong hemolytic

activity of either of these peptides. This encouraged us

to go ahead and test the activity of these peptides against

several human cancer cell lines in order to assess in vitro cell-

toxicity.

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

52

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1760

Toxicity against human cancer cell linesFinally, to determine whether the peptides are selective for

bacterial cells, we tested the toxicity against mammalian cells

using three malignant cell lines: human liver carcinoma

(HepG2), human colon adenocarcinoma grade II (HT29) and

human breast adenocarcinoma (MCF7) cell lines (Table 5).

Table 5: IC50 values (in µM) of both (RW)3 and RcCO-W(RW)2 againsthuman liver carcinoma (HepG2), human colon cancer (HT29) andhuman breast cancer (MCF7) cell lines.

synAMP HepG2 HT29 MCF7

(RW)3 143 ± 21 132 ± 12 159 ± 7RcCO-W(RW)2 92 ± 5 94 ± 6 90 ± 1

In general, we consider a peptide with an IC50 value higher than

100 µM to be inactive. As can be seen from Table 5, the

peptides with the highest activity against Gram-positive bacteria

are not toxic against the three selected human cancer cell lines.

Based on average values from these cell lines, i.e., 142 μM for

(RW)3 and 92 μM for RcCO-W(RW)2, a potential therapeutic

window of about 7 and 4 can be calculated for Gram-negative

pathogens using (RW)3 and RcCO-W(RW)2, respectively.

Concerning the threatening Gram-positive S. aureus strains an

even better window of >13 is calculated for (RW)3 and RcCO-

W(RW)2. Interestingly, again the ruthenocenoyl-derivatized

synAMP is more active than the (RW)3 model peptide, as was

seen in both the antibacterial and hemolysis studies.

DiscussionRuthenium is one of the most promising metals in anticancer

drug candidates [54-57], with two Ru-compounds even in clin-

ical trials [58-62]. Surprisingly however, its potential in antibac-

terial research has not been explored so far. In this paper, we

present the effects of the attachment of the organometallic

ruthenocene (Rc) moiety to RW-based synthetic antimicrobial

peptides (synAMPs). A comparison of the MIC values from a

first screening of peptides that were N-terminally derivatized

with a ruthenocenoyl (RcCO) group with that of the ferro-

cenoyl (FcCO)-derivatized peptides showed superior properties

of the Rc-conjugated synAMPs (Table 2). Although both metal-

locenes have very similar hydrophobic properties, as confirmed

herein again by their almost identical retention times on a C18-

column during HPLC-analysis, they have slightly different

dimensions and very different physicochemical and electro-

chemical properties. Firstly, ferrocene derivatives have redox

potentials that are within the realm of biological systems, but

ruthenocene derivatives do not [41]. Secondly, while most

ferrocene derivatives exhibit a reversible one-electron oxi-

dation, ruthenocene and its derivatives typically undergo irre-

versible two-electron redox chemistry. Whether this difference

in redox chemistry of the two metallocenes could interplay with

the piezoelectric properties of phospholipid membranes [63]

remains to be determined.

Ruthenocene is known to have more extended d-orbitals and is

a stronger hydrogen-bond acceptor than ferrocene. In addition,

ruthenocene is slightly larger than ferrocene, which might result

in a possibly more disruptive interaction with bacterial

membranes.

Small differences between the L- and D-amino acid versions of

the peptides could be observed in their MIC values (Table 3)

and within growth inhibition studies (Figure 3). Examples for

this difference were found in other systems (see above) and

points to a delicate contribution of the chirality of the peptides

used. This effect was not observed in the first MIC values deter-

mined (Table 2), which indicates that this is a very subtle factor.

Indeed, the quantification requires a more sophisticated

analysis. This can be done using sensitive biophysical model

systems like those used in quartz crystal microbalance (QCM)

studies. This information can then be used to further optimize

an active synAMP.

Fortunately, while retaining antibacterial activity in cell culture

medium, the cellular toxicity of both the (RW)3 and the RcCO-

W(RW)2 peptides is low, and only high peptide concentrations

cause significant hemolysis. Apparently, these peptides have a

strong preference for prokaryotic membranes over eukaryotic

membranes, e.g., erythrocytes (Table 4 and Table 5). Neverthe-

less, it remains to be seen to what extent these short synAMPs

can be used in vivo.

Concerning the antibacterial effect of these peptides, the killing

kinetics showed rapid bactericidal properties of both the (RW)3

and RcCO-W(RW)2 peptides, and the growth kinetics showed

growth arrest and also indicated bacteriolytic properties.

Naturally occurring AMPs such as nisin and magainin typically

have >20 amino acids and often have a specific target, like

nisin, or are long enough to penetrate the membrane, like maga-

inin. For these long peptides descriptions of their action mode

with the “carpet-model”, the “toroidal pore model” or the

“barrel stave model” [64] are quite suitable. Considering the

rapid upon-contact killing and bacteriolytic properties, it

appears that the small synAMPs studied herein interact with the

bacterial membrane as well. The monomers of these peptides

are, however, too short to penetrate a bacterial membrane in

order to form pores, and therefore, probably act slightly

different from the more or less well-established mechanisms for

longer AMPs. We are currently undertaking efforts to uncover

more details on the mode of action. Specifically, proteomic

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

53

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1761

analysis of the changes in the bacterial proteome as result of

exposure to these synAMPs, and prokaryotic and eukaryotic

membrane model systems will be used to precisely determine if

it is simply a membrane-based mechanism or if there are more

factors. While we attempt to elucidate the mode of action of

these synAMPs, we are also interested in a detailed under-

standing of the effects of the organometallic fragment on the

activity – for example by determining the contributions of

hydrogen-bond forming processes in membrane environments –

and the effect of the redox potential on the activity. We assume

that the application of model systems will help us to determine

the extent in which differences in chirality of the amino acids

used to construct the peptides result in more or less favorable

interactions.

ConclusionWe have shown that the replacement of the N-terminal arginine

residue in non-toxic and non-hemolytic (RW)3 peptides can

modulate the kinetics of the peptide’s antibacterial activity.

Acetylation completely suppresses this activity. In comparison,

replacement of the N-terminal arginine residue with the

organometallic ferrocenoyl moiety reduces the activity only

5- to 10-fold, whereas the replacement with ruthenocene

completely restores the level of activity. In summary, the data

supports a metal-specific activity-enhancing effect of the added

organometallic moiety. This effect is most likely due to the

added lipophilic bulk together with intricate contributions from

the electro- and physicochemical properties of the

organometallic fragment. None of these peptides is hemolytic

and both are hardly toxic against human cancer cell lines.

Thereby, they represent an interesting group of synthetic anti-

microbial peptides to be used in a therapeutic setting. Analysis

of the antibacterial properties of these peptides showed that they

are rapidly bactericidal and also bacteriolytic. Even though both

peptides have similar MIC values, RcCO-W(RW)2 is acting

faster than (RW)3, but is losing activity after 100–200 min,

which is significantly faster compared to (RW)3. Future studies

on these peptides are directed towards a better understanding of

their mode of action and attempts are being made for the

improvement of their activity to increase the therapeutic

window of these compounds.

ExperimentalMinimal inhibitory concentration (results areshown in Table 2)The minimal inhibitory concentrations (MIC) were tested

against Escherichia coli DSM 30083, Acinetobacter baumannii

DSM 30007, Pseudomonas aeruginosa DSM 50071, Bacillus

subtilis DSM 402, Staphylococcus aureus DSM 20231 (type

strain), and Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) in a

microtiter plate assay according to CLSI guidelines [65].

E. coli, A. baumannii, S. aureus, and B. subtilis were grown in

Mueller–Hinton (MH) broth, P. aeruginosa in cation adjusted

Mueller–Hinton II. Peptides were dissolved in DMSO to give

10 mg/mL stock solutions. Serial dilution in culture media was

carried out automatically with the Tecan Freedom Evo 75 liquid

handling workstation (Tecan, Männedorf, Switzerland) from

512 to 0.5 µg/mL. Peptide dilutions were inoculated with

105 bacteria/mL taken from late exponential cultures grown in

the same media in a total volume of 200 µL per well. Cells were

incubated for 16 h at 37 °C. The lowest peptide concentration

inhibiting visible bacterial growth was taken as MIC.

For MIC determination in cell culture broth, the peptides were

diluted manually in DMEM high glucose (with 4.5 g/L glucose,

no penicillin). Only S. aureus DSM 20231 and ATCC 43300

were capable of growing in cell culture broth and were used for

MIC determination. Cells were grown in DMEM until late

exponential phase before using them for inoculation. Peptide

concentrations, inoculation and incubation were performed as

described above.

Minimum inhibitory concentration (results areshown in Table 3)Determination of MIC values was performed in 96-well

polypropylene microtiter plates (Life Technologies) in order to

reduce the AMP binding [66]. A series of 2-fold dilutions of the

peptides was prepared directly in the plate in half-concentrated

MH broth. The tested strains were grown to an optical density

(600 nm) of 0.5 in half-concentrated MH broth and diluted

1:105 using the same medium. Then, 100 µL of this suspension

was mixed with 100 µL of the peptide solution already prepared

in the wells of the microtiter plate as mentioned earlier. After

incubation for 18 h at 37 °C, the MIC value was read as the

lowest concentration of antimicrobial agent that resulted in

complete inhibition of visible growth. The results given are

mean values of three or more independent determinations.

Killing kineticsThe cells were grown in half-concentrated MH broth up to an

optical density of 0.5 and diluted in fresh medium to an optical

density of 0.1. Peptides were added in concentrations corres-

ponding to 0.5 to 5 × MIC. The viable count was monitored up

to 18 h. Aliquots were taken at defined time intervals, diluted in

10 mM potassium phosphate buffer, and 100 µL of several

decimal dilutions were plated in duplicate on MH agar. The

plates were incubated at 37 °C and the plates containing 30–300

colony forming units (CFU) were counted after 24 h.

Kinetic growth inhibitionGrowth kinetic experiments were performed in microtiter plates

using 200 µL half concentrated MH broth. The cells were

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

54

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1762

grown to an optical density of up to 0.5 and diluted in fresh

medium to an optical density of 0.25. After this, peptides were

added in concentrations corresponding to 2 × MIC, 4 × MIC,

and 8 × MIC and the optical density was registered for 8 h using

a multichannel absorbance plate reader (SunriseTM, Tecan).

Hemolysis and in vitro cell toxicity studiesAfter drawing whole blood into anticoagulant containing tubes

(BD Vacutainer®, K2 EDTA 3.6 mg, Ref 368841, Lot

1248213), its fractionation was executed with one volume

whole blood added to nine volumes sterile 0.9% NaCl and

centrifugation (800g, 10 min, 4 °C). Subsequently, the lowest

fraction containing all hRBCs was washed twice with nine

volumes 1 × PBS (PAA), triturating carefully. The concen-

trated hRBCs were re-suspended with 1 × PBS to an erythro-

cyte concentration of 5% (v/v). Wells of a 96-well plate were

filled with 100 µL of the appropriate peptide solutions: The

peptides were dissolved in 1 × PBS and DMSO (5% for (RW)3

and 50% for RcCO-W(RW)2). These were mixed with 100 µL

of the 5% hRBCs solution and incubated under agitation on a

flat shaker (170 rpm, 30 min, 37 °C). After sedimenting all

probes under centrifugation (800g, 10 min, 4 °C), all super-

natants were transferred into a clean 96-well plate. The release

of hemoglobin was monitored by measuring the absorbance of

the supernatant at 550 nm using an automated 96-well plate

reader. Controls for 0 and 100% hemolysis consisted of hRBC

5% (v/v) suspended in PBS containing DMSO in appropriate

concentrations and 1% Triton X-100, respectively. Toxicity on

human cancer cell lines was determined according to previ-

ously described procedures [67,68].

AcknowledgementsWe thank Annegret Knüfer for determining the IC50 values of

the RcW(RW)2 and (RW)3 peptides. We also thank Vera

Eßmann for preparing GS10(K2Y2), and Hung Bahn and Damla

Yaprak for determining the MIC values of Ac(RW)3 and

Fc(RW)3.

References1. Wenzel, M.; Bandow, J. E. Proteomics 2011, 11, 3256–3268.

doi:10.1002/pmic.2011000462. Hancock, R. E. W.; Lehrer, R. Trends Biotechnol. 1998, 16, 82–88.

doi:10.1016/S0167-7799(97)01156-63. Hancock, R. E. W.; Chapple, D. S. Antimicrob. Agents Chemother.

1999, 43, 1317–1323.4. Hancock, R. E. W.; Sahl, H.-G. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 1551–1557.

doi:10.1038/nbt12675. Findlay, B.; Zhanel, G. G.; Schweizer, F.

Antimicrob. Agents Chemother. 2010, 54, 4049–4058.doi:10.1128/AAC.00530-10

6. Gause, G. F.; Brazhnikova, M. G. Nature 1944, 154, 703.doi:10.1038/154703a0

7. Zasloff, M. Nature 2002, 415, 389–395. doi:10.1038/415389a

8. Fjell, C. D.; Hiss, J. A.; Hancock, R. E. W.; Schneider, G.Nat. Rev. Drug Discovery 2012, 11, 37–51. doi:10.1038/nrd3591

9. Kadam, R. U.; Bergmann, M.; Hurley, M.; Garg, D.; Cacciarini, M.;Swiderska, M. A.; Natici, C.; Sattler, M.; Smyth, A. R.; Williams, P.;Cámara, M.; Stocker, A.; Darbre, T.; Reymond, J.-L.Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 10631–10635.doi:10.1002/anie.201104342

10. Appelt, C.; Schrey, A. K.; Söderhäll, J. A.; Schmieder, P.Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 2334–2337.doi:10.1016/j.bmcl.2007.01.075

11. Young, A. W.; Liu, Z.; Zhou, C.; Totsingan, F.; Jiwrajka, N.; Shi, Z.;Kallenbach, N. R. Med. Chem. Commun. 2011, 2, 308–314.doi:10.1039/c0md00247j

12. Johansson, E. M. V.; Kadam, R. U.; Rispoli, G.; Crusz, S. A.;Bartels, K.-M.; Diggle, S. P.; Cámara, M.; Williams, P.; Jaeger, K.-E.;Darbre, T.; Reymond, J.-L. Med. Chem. Commun. 2011, 2, 418–420.doi:10.1039/c0md00270d

13. Stach, M.; Maillard, N.; Kadam, R. U.; Kalbermatter, D.; Meury, M.;Page, M. G. P.; Fotiadis, D.; Darbre, T.; Reymond, J.-L.Med. Chem. Commun. 2012, 3, 86–89. doi:10.1039/c1md00272d

14. Makovitzki, A.; Avrahami, D.; Shai, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2006, 103, 15997–16002. doi:10.1073/pnas.0606129103

15. Arnusch, C. J.; Albada, H. B.; van Vaardegem, M.; Liskamp, R. M. J.;Sahl, H.-G.; Shadkchan, Y.; Osherov, N.; Shai, Y. J. Med. Chem. 2012,55, 1296–1302. doi:10.1021/jm2014474

16. Chongsiriwatana, N. P.; Patch, J. A.; Czyzewski, A. M.; Dohm, M. T.;Ivankin, A.; Gidalevitz, D.; Zuckermann, R. N.; Barron, A. E.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008, 105, 2794–2799.doi:10.1073/pnas.0708254105

17. Oren, Z.; Shai, Y. Biochemistry 1997, 36, 1826–1835.doi:10.1021/bi962507l

18. Tew, G. N.; Scott, R. W.; Klein, M. L.; DeGrado, W. F. Acc. Chem. Res.2010, 43, 30–39. doi:10.1021/ar900036b

19. Chantson, J. T.; Verga Falzacappa, M. V.; Crovella, S.;Metzler-Nolte, N. J. Organomet. Chem. 2005, 690, 4564–4572.doi:10.1016/j.jorganchem.2005.07.007

20. Chantson, J. T.; Verga Falzacappa, M. V.; Crovella, S.;Metzler-Nolte, N. ChemMedChem 2006, 1, 1268–1274.doi:10.1002/cmdc.200600117

21. Fränzel, B.; Frese, C.; Penkova, M.; Metzler-Nolte, N.; Bandow, J. E.;Wolters, D. A. J. Biol. Inorg. Chem. 2010, 15, 1293–1303.doi:10.1007/s00775-010-0689-z

22. Patra, M.; Gasser, G.; Metzler-Nolte, N. Dalton Trans. 2012, 41,6350–6358. doi:10.1039/c2dt12460b

23. Patra, M.; Gasser, G.; Pinto, A.; Merz, K.; Ott, I.; Bandow, J. E.;Metzler-Nolte, N. ChemMedChem 2009, 4, 1930–1938.doi:10.1002/cmdc.200900347

24. Patra, M.; Gasser, G.; Wenzel, M.; Merz, K.; Bandow, J. E.;Metzler-Nolte, N. Eur. J. Inorg. Chem. 2011, 3295–3302.doi:10.1002/ejic.201100497

25. Patra, M.; Gasser, G.; Wenzel, M.; Merz, K.; Bandow, J. E.;Metzler-Nolte, N. Organometallics 2010, 29, 4312–4319.doi:10.1021/om100614c

26. Wenzel, M.; Patra, M.; Albrecht, D.; Chen, D. Y.-K.; Nicolau, K. C.;Metzler-Nolte, N.; Bandow, J. E. Antimicrob. Agents Chemother. 2011,55, 2590–2596. doi:10.1128/AAC.00078-11

27. Patra, M.; Gasser, G.; Wenzel, M.; Merz, K.; Bandow, J. E.;Metzler-Nolte, N. Organometallics 2012, 31, 5760–5771.doi:10.1021/om201146c

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

55

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1763

28. Patra, M.; Merz, K.; Metzler-Nolte, N. Dalton Trans. 2012, 41, 112–117.doi:10.1039/c1dt10918a

29. Strøm, M. B.; Haug, B. E.; Skar, M. L.; Stensen, W.; Stiberg, T.;Svendsen, J. S. J. Med. Chem. 2003, 46, 1567–1570.doi:10.1021/jm0340039

30. Junkes, C.; Wessolowski, A.; Farnaud, S.; Evans, R. W.; Good, L.;Bienert, M.; Dathe, M. J. Pept. Sci. 2008, 14, 535–543.doi:10.1002/psc.940

31. Wessolowski, A.; Bienert, M.; Dante, M. J. Pept. Res. 2004, 64,159–169. doi:10.1111/j.1399-3011.2004.00182.x

32. Dathe, M.; Nikolenko, H.; Klose, J.; Bienert, M. Biochemistry 2004, 43,9140–9150. doi:10.1021/bi035948v

33. Haug, B. E.; Stensen, W.; Kalaaji, M.; Rekdal, Ø.; Svendsen, J. S.J. Med. Chem. 2008, 51, 4306–4314. doi:10.1021/jm701600a

34. Schatzschneider, U.; Metzler-Nolte, N. Angew. Chem., Int. Ed. 2006,45, 1504–1507. doi:10.1002/anie.200504604

35. Shubina, E. S.; Krylov, A. N.; Kreindlin, A. Z.; Rybinskaya, M. I.;Epstein, L. M. J. Mol. Struct. 1993, 301, 1–5.doi:10.1016/0022-2860(93)80225-K

36. Kirin, S. I.; Noor, F.; Mier, W.; Metzler-Nolte, N. J. Chem. Educ. 2007,84, 108–111. doi:10.1021/ed084p108

37. Wadhwani, P.; Afonin, S.; Ieronimo, M.; Buerck, J.; Ulrich, A. S.J. Org. Chem. 2006, 71, 55–61. doi:10.1021/jo051519m

38. Mosby’s Medical Dictionary, 8th ed.; Elsevier: 2009.39. Zanello, P. Inorganic Electrochemistry, theory, practise and

applications; Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK, 2003;pp 159–203.

40. Elschenbroich, C. Organometallchemie; B. G. Teubner Verlag:Wiesbaden, Germany, 2008; pp 457–458.

41. Mutoh, H.; Masuda, S. J. Chem. Soc., Dalton Trans. 2002, 1875–1881.doi:10.1039/B111486G

42. Schibli, D. J.; Epand, R. F.; Vogel, H. J.; Epand, R. M.Biochem. Cell Biol. 2002, 80, 667–677. doi:10.1139/o02-147

43. Gopal, R.; Kim, Y. J.; Seo, C. H.; Hahm, K.-S.; Park, Y. J. Pept. Sci.2011, 17, 329–334. doi:10.1002/psc.1369

44. Su, Y.; Doherty, T.; Waring, A. J.; Ruchala, P.; Hong, M. Biochemistry2009, 48, 4587–4595. doi:10.1021/bi900080d

45. Kyte, J.; Doolittle, R. F. J. Mol. Biol. 1982, 157, 105–132.doi:10.1016/0022-2836(82)90515-0

46. Nandi, N. J. Phys. Chem. A 2003, 107, 4588–4591.doi:10.1021/jp030076s

47. Pathirana, S.; Neely, W. C.; Myers, L. J.; Vodyanoy, V.J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1404–1405. doi:10.1021/ja00030a041

48. Alakoskela, J.-M.; Sabatini, K.; Jiang, X.; Laitala, V.; Covey, D. F.;Kinnunen, P. K. J. Langmuir 2008, 24, 830–836.doi:10.1021/la702909q

49. Alakoskela, J.-M.; Covey, D. F.; Kinnunen, P. K. J.Biochim. Biophys. Acta 2007, 1768, 131–145.

50. Nguyen, L. T.; Chau, J. K.; Perry, N. A.; de Boer, L.; Zaat, S. A. J.;Vogel, H. J. PLoS One 2010, 5, e12684.doi:10.1371/journal.pone.0012684

51. Pag, U.; Oedenkoven, M.; Sass, V.; Shai, Y.; Shamova, O.;Antcheva, N.; Tossi, A.; Sahl, H.-G. J. Antimicrob. Chemother. 2008,61, 341–352. doi:10.1093/jac/dkm479

52. Sass, V.; Pag, U.; Tossi, A.; Bierbaum, G.; Sahl, H.-G.Int. J. Med. Microbiol. 2008, 298, 619–633.doi:10.1016/j.ijmm.2008.01.011

53. Lui, Z.; Brady, A.; Young, A.; Rasimick, B.; Chen, K.; Zhou, C.;Kallenbach, N. R. Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 597–603.doi:10.1128/AAC.00828-06

54. Page, S. M.; Ross, S. R.; Barker, P. D. Future Med. Chem. 2009, 1,541–559. doi:10.4155/fmc.09.25

55. Schluga, P.; Hartinger, C. G.; Egger, A.; Reisner, E.; Galanski, M.;Jakupec, M. A.; Keppler, B. K. Dalton Trans. 2006, 1796–1802.doi:10.1039/b511792e

56. Therrien, B.; Süss-Fink, G.; Govindaswamy, P.; Renfrew, A. K.;Dyson, P. J. Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 3773–3776.doi:10.1002/anie.200800186

57. Gasser, G.; Ott, I.; Metzler-Nolte, N. J. Med. Chem. 2011, 54, 3–25.doi:10.1021/jm100020w

58. Rademaker-Lakhai, J. M.; van den Bongard, D.; Pluim, D.;Beijnen, J. H.; Schellens, J. H. M. Clin. Cancer Res. 2004, 10,3717–3727. doi:10.1158/1078-0432.CCR-03-0746

59. Lentz, F.; Drescher, A.; Lindauer, A.; Henke, M.; Hilger, R. A.;Hartinger, C. G.; Scheulen, M. E.; Dittrich, C.; Keppler, B. K.;Jaehde, U. Anti-Cancer Drugs 2009, 20, 97–103.doi:10.1097/CAD.0b013e328322fbc5

60. Hartinger, C. G.; Zorbas-Seifried, S.; Jakupec, M. A.; Kynast, B.;Zorbas, H.; Keppler, B. K. J. Inorg. Biochem. 2006, 100, 891–904.doi:10.1016/j.jinorgbio.2006.02.013

61. Hartinger, C. G.; Jakupec, M. A.; Zorbas-Seifried, S.; Groessl, M.;Egger, A.; Berger, W.; Zorbas, H.; Dyson, P. J.; Keppler, B. K.Chem. Biodiversity 2008, 5, 2140–2155. doi:10.1002/cbdv.200890195

62. Groessl, M.; Reisner, E.; Hartinger, C. G.; Eichinger, R.;Semenova, O.; Timerbaev, A. R.; Jakupec, M. A.; Arion, V. B.;Keppler, B. K. J. Med. Chem. 2007, 50, 2185–2193.doi:10.1021/jm061081y

63. Harden, J.; Diorio, N.; Petrov, A. G.; Jakli, A. Phys. Rev. E 2009, 79,011701. doi:10.1103/PhysRevE.79.011701

64. Brogden, K. A. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3, 238–250.doi:10.1038/nrmicro1098

65. M07-A8, Vol. 29, No. 2; Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; ApprovedStandard – 8th edition, Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne, Pennsylvania, USA, 2009.

66. Giacometti, A.; Cirioni, O.; Barchiesi, F.; Del Prete, M. S.; Fortuna, M.;Caselli, F.; Scalise, G. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44,1694–1696. doi:10.1128/AAC.44.6.1694-1696.2000

67. Bernhardt, G.; Reile, H.; Birnböck, H.; Spruß, T.; Schönenberger, H.J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1992, 118, 35–43.doi:10.1007/BF01192309

68. Neukamm, M. J.; Pinto, A.; Metzler-Nolte, N. Chem. Commun. 2008,232–234. doi:10.1039/b712886j

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

56

Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8, 1753–1764.

1764

License and TermsThis is an Open Access article under the terms of the

Creative Commons Attribution License

(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which

permits unrestricted use, distribution, and reproduction in

any medium, provided the original work is properly cited.

The license is subject to the Beilstein Journal of Organic

Chemistry terms and conditions:

(http://www.beilstein-journals.org/bjoc)

The definitive version of this article is the electronic one

which can be found at:

doi:10.3762/bjoc.8.200

D Modulating peptide activity with metallocenoyl groups

57

E  

An antimicrobial peptide delocalizes peripheral 

membrane proteins 

 

Michaela Wenzel, Alina Iulia Chiriac, Andreas Otto, Dagmar Zweytick, 

Caroline May, Catherine Schumacher, H. Bauke Albada, Maya 

Penkova, Ute Krämer, Ralf Erdmann, Nils Metzler‐Nolte, Heike Brötz‐

Oesterhelt, Dörte Becher, Hans‐Georg Sahl, Julia E. Bandow 

 

 

 

 

 

 

 

submitted 

   

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

58

 An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins  

 

Michaela Wenzel1,  Alina  Iulia  Chiriac2,  Andreas  Otto3,  Dagmar  Zweytick4,  Caroline May5, 

Catherine Schumacher6, H. Bauke Albada7, Maya Penkova7, Ute Krämer8, Ralf Erdmann9, Nils 

Metzler‐Nolte7, Heike Brötz‐Oesterhelt6, Dörte Becher3, Hans‐Georg Sahl2, Julia E. Bandow1* 

 1Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Germany 2Institute  for  Medical  Microbiology,  Immunology,  and  Parasitology,  Pharmaceutical 

Microbiology Section, University of Bonn, Germany 3Microbial  Physiology  and  Molecular  Biology,  Ernst  Moritz  Arndt  University,  Greifswald, 

Germany 4Institute of Molecular Biosciences, Biophysics Division, University of Graz, Austria 5Immune Proteomics, Medical Proteome Center, Ruhr University Bochum, Germany 6Institute  for  Pharmaceutical  Biology  and  Biotechnology,  Heinrich  Heine  University, 

Düsseldorf, Germany 7Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 8Department of Plant Physiology, Ruhr University Bochum, Germany 9Institute of Physiological Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 

 

*Corresponding  author.  Mailing  address:  Ruhr‐Universität  Bochum,  Biologie  der 

Mikroorganismen,  Universitätsstraße  150,  44801  Bochum,  Germany.  Phone:  +49‐234‐32‐

23102. Fax: +49‐234‐32‐14620. E‐mail: julia.bandow@rub.de 

 

ABSTRACT 

Short arginine‐ and tryptophan‐rich  (RW‐rich) peptides target the bacterial membrane. We 

characterized  the  effects  on  bacterial  physiology  of  the  synthetic  hexapeptide  NH2‐

RWRWRW‐CONH2. Peptide integration into the membrane is dependent on the phospholipid 

composition,  occurring  readily  in  mixtures  of  dipalmitoyl‐glycero‐phosphatidylglycerol 

(DPPG) and dipalmitoyl‐glycero‐phosphatidylethanolamine  (DPPE),  less well  in membranes 

composed of DPPG, and not at all in DPPE membranes. Integration of the peptide alters lipid 

bilayer architecture, resulting in delocalization of membrane‐associated proteins involved in 

cell wall biosynthesis, respiration, and cell division. Consequently, energy within the cells  is 

limited and cell wall integrity is undermined. The bacteria respond to this peptide stress with 

an  integrated  strategy,  including  the  adjustment  of  membrane  lipid  composition, 

modification of the cell wall, and release of osmoprotective amino acids.  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

59

INTRODUCTION 

Antimicrobial peptides are potent antibiotic agents that occur in all domains of life. They act 

against  bacteria  but  also  against  viruses,  fungi,  protozoa,  and  cancer  cells1,2.  Ranging  in 

length  from  four  to  over  one  hundred  amino  acids,  they  fall  into  a  number  of  different 

structural  classes,  including  α‐helical amphiphiles,  lantibiotics,  lipopeptides, glycopeptides, 

and short cationic peptides.  

Short cationic antimicrobial peptides are characterized by positively charged amino acids like 

arginine and lysine, and hydrophobic amino acids like tryptophan and phenylalanine3‐4. Such 

peptides typically target the bacterial membrane  interfering with  ion transport, membrane 

architecture,  specific  interactions  between  membrane  components,  or  forming  pores5. 

Previous mechanistic  studies  in vitro have examined  the  interactions of  the peptides with 

membranes  or membrane  extracts6‐7  but  their  effects  on  bacterial  physiology  have  gone 

underexplored. 

To generate a more  complete understanding of  the  impact of  short  cationic antimicrobial 

peptides  on  bacterial  physiology, we  selected  the  synthetic  hexapeptide  NH2‐RWRWRW‐

CONH2  (referred  to  in  the  following  as  MP196).  MP196  represents  the  minimal 

pharmacophore  of  positively  charged  and  hydrophobic  amino  acids8‐9.    It  is  a  potent 

alternative  to  longer  natural  antimicrobial  peptides, which  can  be  difficult  to  isolate  and 

complicated  to  synthesize  chemically. Short peptides are  readily generated by  solid‐phase 

peptide  synthesis  and  are  easily  accessible  for  chemical  derivatization10‐11.  MP196  is 

effective against gram‐positive bacteria including MRSA strains, moderately effective against 

Gram‐negative  bacteria  and  has  low  toxicity  against  human  cell  lines  and  low  hemolytic 

activity12. It is therefore a promising lead structure for derivatization, and has already yielded 

peptides with improved activities and altered pharmacological properties13.  

Proteomic  profiling  of  Bacillus  subtilis  exposed  to  MP196  provided  a  starting  point  for 

mechanistic studies. Previously, the proteomic response to antibiotics was  found to reflect 

the general mode of action,  in some cases even correlating with the antibiotic’s molecular 

binding  site14‐15.  We  monitored  the  acute  bacterial  stress  response  to  MP196  using 

metabolic  pulse‐labeling  of  proteins  newly  synthesized  in  response  to  antibiotic  stress, 

followed by  separation of  the  cytosolic proteome by 2D‐PAGE.  In parallel,  the membrane 

proteome was  investigated  by  LC‐ESI‐MS/MS  to  identify  proteome  changes  at  the  site  of 

binding of MP196  16. Proteome‐based hypotheses were challenged and corroborated by a 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

60

diverse  set  of  further methods  including  differential  scanning  calorimetry,  ionomics,  and 

amino  acid  analysis,  providing  insights  into  both  the  mechanism  of  action  of  cationic 

antimicrobial peptides and bacterial adaptation to peptide stress. 

RESULTS 

Inhibition of macromolecule biosynthesis 

To  explore  inhibition  of macromolecule  biosynthesis  in  vivo, we  studied  incorporation  of 

radioactive precursors. B. subtilis cells were exposed to MP196 concentrations that reduced 

growth rates by approximately 50 percent unless noted otherwise  (Supplementary Fig. 1). 

MP196 moderately  inhibited  incorporation of DNA, RNA, protein, and  cell wall precursors 

(Supplementary Fig. 2), findings typical for membrane‐targeting antibiotics. The activation of 

reporter  genes  previously  shown  to  respond  to  inhibition  of  metabolic  pathways  and 

different types of stress  in B. subtilis17 was also studied (Supplementary Fig. 3). MP196 did 

not activate  transcription  from promoters of yorB, helD, or bmrC  , which are  indicative of 

DNA  damage,  RNA  synthesis  inhibition,  and  translation  inhibition,  respectively.  The  liaI 

promoter,  responsive  to  inhibition  of membrane‐bound  cell wall  biosynthesis  steps, was 

activated weakly, while ypuA, which is responsive to membrane‐associated and membrane‐

independent cell wall stress, was strongly activated.  

Proteomic profiling 

Proteomic analyses were performed using B.  subtilis 168,  for which a  library of proteome 

response  profiles  to  over  40  antibiotic  agents  exists19‐21.  Cultures  were  stressed  with 

sublethal peptide  concentrations  (Supplementary  Fig.  1) prior  to  analysis of  the  cytosolic 

and membrane proteome. After 10 minutes of exposure to the peptide, newly synthesized 

proteins were  pulse  labeled with  L‐[35S]‐methionine  for  five minutes  and  analyzed  by  2D 

gelelectrophoresis.  Thirty‐six  proteins were  selectively  upregulated  in  response  to MP196 

treatment, 32 of which were identified by mass spectrometry (Fig. 1, Supplementary Table 1 

and  2).  In  parallel,  the  membrane  proteome  response  was  analyzed  by  LC‐ESI‐MS/MS. 

Differential 14N/15N labeling was used for relative quantitation of proteins in the membrane 

fractions of untreated and peptide‐treated cultures. After 65 minutes of peptide treatment, 

178  proteins  were  upregulated  at  least  two‐fold  (Supplementary  Table  3  and  4). Most 

differentially  regulated proteins are predicted  to  localize  in  the  cytosol yet are associated 

with membrane functions, including general cell envelope stress response, membrane stress 

response, cell wall biosynthesis, lipid biosynthesis, and energy metabolism.  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

61

The tellurium resistance protein, YceC, and toxic anion resistance protein, YceH, previously 

described as marker proteins  for both cell wall and membrane stress21, were upregulated, 

along with  six  other  proteins  regulated  by  the  cell  envelope‐responsive  alternative  sigma 

factors  W  (σW)  and  M  (σM).  Other  notable  proteins  upregulated  included  LiaH,  which 

protects  cell  envelope  integrity  by  binding  to  the  cytoplasmic  membrane,  the  ABC 

transporter protein, YtrE, and the tRNA‐modifying enzyme, TrmB, which are specific markers 

for  interference with  the membrane‐bound part of  the  cell wall biosynthesis machinery21. 

Upregulation of MurAA, MurAB, and MurG, which are  involved  in  the synthesis of  the cell 

wall precursor  lipid  II,  indicates  inhibition of cell wall biosynthesis, as does upregulation of 

MreB,  which  is  important  for  localization  of  the  cell  wall  biosynthesis  and  cell  division 

machineries, and of the MreB‐like protein Mbl. The amino acid racemase RacX and proteins 

belonging  to  the  dlt  operon  were  upregulated.  They  are  involved  in  cell  envelope 

modification  by  synthesis  of D‐amino  acids,  probably  feeding  into D‐alanylation  reactions 

and lipoteichoic acid biosynthesis, respectively.  

 

Figure 1. Cytosolic protein biosynthesis profile. The protein synthesis pattern of untreated 

B.  subtilis  cells was  false‐colored  in  green  and overlayed with  that  of  the MP196‐treated 

culture,  false‐colored  in  red. Down‐regulated proteins appear green, upregulated proteins 

red,  and  proteins  expressed  at  equal  rates  yellow.  Unidentified  proteins  are marked  by 

circles.  Blue  labels  indicate marker  proteins  for  general  cell  envelope  stress,  green  labels 

identify cell wall biosynthesis inhibition, and red labels are markers for membrane stress. 

 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

62

PspA, an LiaH homologue, is specifically upregulated following membrane stress, as opposed 

to peptidoglycan stress21. Other proteins upregulated in response to MP196 are involved in 

restructuring of the membrane lipid composition. Among these are proteins involved in fatty 

acid  biosynthesis  (FabG  and  AcpA),  alternative  fatty  acid  biosynthesis  (YjdA  and  YoxD), 

phospholipid  biosynthesis  (PlsX),  lipid‐degradation  (FadE),  and membrane  fluidity  control 

(FloT).  NAD  synthase  (NadE)  is  crucial  for  energy  metabolism  and,  together  with  PspA, 

constitutes a proteomic signature  for membrane‐mediated stress21. Other proteins, whose 

upregulation  indicates  substantial  energy  limitation,  are  involved  in  oxidative 

phosphorylation, NAD metabolism,  the  TCA  cycle,  glycolysis,  and ATP  synthesis.  Similarly, 

several  ABC  transporter  and  protease  ATP‐binding  proteins  were  upregulated.  Although 

biosynthesis of housekeeping proteins was  largely down‐regulated after MP196 treatment, 

elongation  factors Tu and G, which  require GTP  for activity, were upregulated. Also, many 

proteins involved in amino acid biosynthesis were upregulated, particularly those involved in 

glutamate and aspartate anabolism. 

To  investigate  the  importance  of  peptide  stereochemistry  for  antibacterial  activity  and 

MP196‐target interaction, the proteomic response to the all‐D‐amino acid peptide D‐MP196 

was  studied  using  2D  gel  electrophoresis.  D‐MP196  was  as  active  against  B.  subtilis  as 

MP19612  and  both  shared  many  marker  proteins  (Supplementary  Fig.  4).  Thus, 

stereochemistry does not  seem  to be crucial  for  target  interaction, making  it unlikely  that 

MP196 binds a specific site on a protein target.   

The findings above prompted the following questions about MP196: How does  it affect cell 

wall biosynthesis? Does it interact with the bacterial membrane and, if so, how? How does it 

influence energy metabolism? What  is the significance of the strong upregulation of amino 

acid biosynthesis proteins? And what is the primary event that leads to cell death? 

To address  these questions, we compared MP196 with a  set of compounds with different 

cell  envelope‐related modes  of  action.  Selection  of  reference  compounds  was  aided  by 

comparative  proteome  analysis  using  the  existing  library of B.  subtilis  antibiotic  response 

profiles19‐21 (Supplementary Table 5). The strongest overlap was observed with gramicidin S, 

a cyclic peptide  that disrupts membrane  function by  integrating  into  the  lipid bilayer, and 

with  the  potassium  carrier  ionophore  valinomycin. We  also  chose  vancomycin,  a  lipid  II‐

binding  cell wall biosynthesis  inhibitor,  and nisin, which,  in  addition  to  inhibiting  cell wall 

biosynthesis by binding lipid II, forms heteromultimeric membrane pores with lipid II. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

63

Effects on the cell wall 

Cell wall  integrity was  investigated by examining  the  shape of B.  subtilis  cells  after  acetic 

acid/methanol  fixation:  where  the  incorporation  of  cell  wall  material  is  inhibited  at  a 

membrane‐bound  biosynthesis  step,  fixation  leads  to  extrusion  of  the  cell  membrane 

through holes in the cell wall22.  

 

 

Figure 2. Effects on the cell wall. (a) Light microscopy images showing cell wall integrity of B. 

subtilis after  treatment with MP196 and nisin. Acetic acid‐methanol  fixation visualizes cell 

wall  damage  by  extrusions  of  the  membrane  through  cell  wall  holes.  (b)  Thin  layer 

chromatography (TLC) of radioactively labeled lipid II showing influence of MP196 and nisin 

on  in vitro  lipid  II synthesis. (c) TLC probing for  in vitro  lipid  II binding capability by MP196.  

Nisin,  which  retains  lipid  II  by  binding  to  it,  serves  as  positive  control.  (d)  HPLC 

chromatographs showing accumulation of the cell wall precursor UDP‐MurNac pentapeptide 

by S. aureus cultures treated with MP196 and vancomycin. (e) Overview of bacterial cell wall 

biosynthesis  (according  to  Schneider  et  al.22),  illustrating  how MurG  delocalization might 

interfere with  the  cell wall  biosynthesis  cycle  in  vivo.  In  contrast  to  integral membrane 

protein MraY,  the peripheral membrane protein MurG attaches  to  the membrane  surface 

through  electrostatic  interactions.  (f) Western blot  detection  of  the  cell wall  biosynthesis 

protein, MurG,  in membrane  fractions of B.  subtilis  five minutes  after  antibiotic  addition. 

Membranes  were  stained  with  Ponceau  S  as  sample  loading  control.  (g)  Transmission 

electron microscopy images of B. subtilis treated with MP196 and gramicidin S showing the 

influence of the peptides on the cell shape and cell wall structure.  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

64

 

Untreated cells and cells treated with valinomycin did not display membrane extrusions (Fig. 

2a) while nisin and MP196 did induce membrane extrusions, as did gramicidin S, although it 

does not  interfere directly with cell wall biosynthesis. Membrane extrusions are suggestive 

of inhibition of cell wall biosynthesis at the level of lipid II22. However, MP196 did not impair 

lipid  II  synthesis  in an  in  vitro assay using  concentrated  cell  lysate  (Fig. 2b).  Furthermore, 

while  nisin  bound  lipid  II  in  vitro,  preventing  it  from  migrating  in  the  thin  layer 

chromatography matrix, MP196  did  not  affect  lipid  II migration  (Fig.  2c). We  therefore 

investigated the influence of MP196 on early and late steps of cell wall biosynthesis in intact 

cells.  As  described  above,  glucosamine  incorporation  was  partially  inhibited  by  MP196 

(Supplementary Fig. 2). HPLC analysis showed that MP196 exposure led to an accumulation 

of  UDP‐MurNAc  pentapeptide  in  the  cell  (Fig.  2d),  albeit  not  to  the  same  extent  as 

vancomycin. Both assays suggest  that  lipid  II  is not synthesized efficiently  in vivo. We next 

investigated the localization of MurG, a membrane‐associated protein that converts lipid I to 

lipid  II,  by  attaching N‐acetyl‐glucosamine  (GlcNAc)  to  the  bactoprenol  carrier‐conjugated 

UDP‐MurNAc pentapeptide molecule (Fig. 2e).  

Western Blot analysis of B. subtilis cells showed that both MP196 and gramicidin S treatment 

caused almost complete loss of MurG from the membrane fraction within five minutes (Fig. 

2f). The removal of MurG from the cytosolic membrane surface may explain, in combination 

with  energy  limitation  (see  below),  the  reduced  glucosamine  incorporation, UDP‐MurNAc 

pentapeptide  accumulation,  loss of  cell wall  integrity, and  induction of  a  cell wall‐specific 

stress response. The morphology of B. subtilis cells treated with non‐lytic concentrations of 

MP196 or gramicidin S was examined by  transmission electron microscopy  (TEM, Fig. 2g). 

MP196‐treated cells had cell wall lesions lined with characteristic structures. The cell wall at 

these  lesion  sites appeared  to be  thinner,  corroborating  the observed  loss of  integrity.  In 

contrast, gramicidin S‐treated cells did not retain their shape, culminating  in the  leakage of 

cell contents and cell collapse. Thus, while  the peptides  induce similar proteome response 

patterns  and  cause  delocalization  of  the  MurG  protein,  B.  subtilis  counteracts  MP196‐

induced lesions more efficiently than those caused by gramicidin S. 

Interaction with the membrane 

Interaction  of  MP196  with  the  membrane  was  investigated  by  differential  scanning 

calorimetry  (DSC)  using  model  membranes  consisting  of  the  two  most  abundant 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

65

phospholipids  in  the  B.  subtilis  membrane23,  1,2‐dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐

phosphatidylglycerol  (DPPG)  and  1,2‐dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphatidylethanolamine 

(DPPE),  in an 88:12  ratio  (Fig. 3a). DSC monitors  the  thermotropic phase behaviour of  the 

lipid bilayer. Changes in pattern are indicative of perturbation of the membrane bilayer and 

packaging  of  the  phospholipids’  fatty  acyl  chains  and,  therefore,  of  peptide  integration. 

Deconvolution  of  the  thermograms  indicates  that  MP196  induces  peptide‐affected 

domains6, reflected in a broadening of the existing transition and the appearance of a small 

transition  at  lower  temperatures.  This  causes  rearrangement  of  the  lipid  mixture,  and, 

consequently, alterations in packaging of the lipids at the emerging borderlines.  

When bilayers composed of a single type of phospholipid were used, the influence of MP196 

on a DPPG bilayer was  far  less pronounced, although broadening of  the shoulder at  lower 

temperatures  indicated  the  formation  of  some  peptide‐affected  domains.  No  effect was 

seen  using  pure  DPPE  or  using  1,2‐dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphatidylcholine  (DPPC) 

(Supplementary Fig. 5), which is typically used to model erythrocyte membranes24. The fact 

that MP196 affected DPPG but not DPPE  implies a preference  for negatively charged over 

neutral lipids. 

We  used  a  fluorescence  stain  to  test whether  peptide  integration  influences membrane 

permeability  in B.  subtilis  in vivo. BacLight  staining  combines a green‐fluorescent dye  that 

crosses  intact membranes with  a  red‐fluorescent  dye  that  enters  bacterial  cells  through 

membrane pores  (Fig. 3b). Pore‐forming nisin allowed both dyes  to enter B.  subtilis  cells, 

resulting  in  orange  cells. MP196  treatment,  as well  as  treatment with  non‐pore‐forming 

gramicidin S and valinomycin, resulted  in green‐fluorescent cells  like the untreated control, 

suggesting that MP196 does not act by forming large pores. Similar conclusions were drawn 

from measuring  peptide‐induced  potassium  leakage  from  Bacillus megaterium  cells  into 

choline  buffer  (Supplementary  Fig.  6a).  In  contrast  to  the  positive  control,  nisin, MP196 

released  little  potassium  even  at  concentrations  equivalent  to  50  times  the  minimal 

inhibitory concentration (MIC).  

The effect of MP196 on membrane permeability was further studied using a global ionomics 

approach. Total cellular metal concentrations were determined after treating B. subtilis with 

peptide  in  salt‐free  Tris  buffer,  which,  in  contrast  to  the  choline  buffer  used  for  the 

potassium leakage assay, is not osmotically stabilizing (Fig. 3c). While no effect was seen on 

sodium,  calcium,  and  zinc  levels,  potassium  concentrations  decreased  by  96  percent, 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

66

magnesium  by  86  percent  and  manganese  by  59  percent.  This  was  also  the  case  for 

gramicidin  S,  in  contrast  to  potassium  carrier  ionophore  valinomycin,  which  selectively 

caused potassium efflux.  

 

 

Figure 3.  Interaction with the membrane. (a) DSC thermograms of  lipid bilayers consisting 

of 88:12 DPPG/DPPE incubated with MP196. Changes in thermotropic phase behaviour due 

to perturbation of fatty acyl packing indicate peptide integration. (b) Overlayed fluorescence 

microscopy images of BacLight‐stained B. subtilis treated with valinomycin, nisin, gramicidin 

S,  and MP196.  A  red‐fluorescing  dye  selectively  stains  cells  with  large membrane  holes 

whereas a green‐fluorescing dye stains all cells  independently of membrane damage. Cells 

with intact membranes are green and cells with perforated membranes are orange. (c) Total 

ion profiles of B. subtilis stressed with valinomycin, gramicidin S, and MP196  in Tris buffer. 

(d)  Total  ion profiles of B.  subtilis  stressed with  valinomycin,  gramicidin  S,  and MP196  in 

chemically defined medium under conditions resembling those of the proteome analysis. 

 

To investigate whether ion efflux mediated by MP196 is relevant in Tris‐buffered chemically 

defined culture broth with  regular  salt content,  total  ion concentrations were determined 

after peptide treatment under the same conditions used for proteomic profiling (Fig. 3d). In 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

67

agreement  with  the  observed  lack  of  potassium  efflux  in  choline  buffer,  no  significant 

decrease  of  any metal  ion was  observed  after MP196  treatment  under  these  conditions, 

suggesting that ion efflux either does not occur or is compensated for in chemically defined 

medium.  In  contrast,  gramicidin  S  treatment  led  to  a decrease of potassium, magnesium, 

and manganese levels comparable to the effect in Tris buffer, consistent with the disruptive 

effect of  gramicidin  S  seen by TEM. Valinomycin‐treated  cells  accumulated potassium  (an 

eight‐fold  increase), probably due to overcompensation. This fits well with the observation 

that, despite provoking a strong proteome response, valinomycin does not inhibit B. subtilis 

growth19.  

Effects on membrane potential and respiration 

Membrane‐targeting antibiotics typically depolarize the bacterial membrane. Depolarization 

was investigated using a B. subtilis strain carrying a GFP fusion to the cell division‐regulating 

protein MinD.  Normally  localized  at  the  cell  poles  and  in  the  cell  division  plane, MinD 

delocalizes  upon  depolarization,  resulting  in  a  spotty  GFP‐MinD  distribution  pattern25.  In 

contrast to the normal MinD pattern in the untreated control, MinD delocalization was seen 

in MP196‐  and  gramicidin  S‐treated  cells,  indicating membrane  depolarization  (Fig.  4a). 

Depolarization upon MP196 treatment was confirmed in Bacillus megaterium employing the 

voltage‐sensitive fluorescent probe DiSC35 (Supplementary Fig. 6b).  

Sudden  depolarization  should  result  in  energy  limitation,  consistent  with  the  proteome 

response. Intracellular ATP levels of B. subtilis, determined with a luciferase assay, showed a 

60 percent reduction in cellular ATP content in MP196‐treated and a 70 percent reduction in 

gramicidin S‐treated cells (Fig. 4b), while valinomycin and nisin caused 30 percent drops.  

Thus, MP196 has a considerable impact on energy metabolism. No significant ion efflux was 

observed under the test conditions, indicating that depolarization and energy limitation are 

not due solely to ion transfer. We therefore tested, whether components of the respiratory 

chain are inhibited by MP196. H+‐ATPase inhibition would lead directly to ATP limitation. 

 Proton pumping activity was monitored  in Micrococcus  flavus  inverted vesicles employing 

the pH‐sensitive probe acridine orange (Fig. 4c). The H+‐ATPase inhibitor lactoferrin26 served 

as  a  positive  control.  MP196  did  not  inhibit  H+‐ATPase  pumping  activity  at  a  peptide 

concentration corresponding to that used for proteome analysis.  

 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

68

 

Figure  4.  Effects  on  membrane  potential  and  respiration.  (a)  Fluorescence  microscopy 

images  (top  row)  and  corresponding  bright  field  images  (bottom  row)  show  GFP‐MinD 

localization  in  untreated  B.  subtilis  cells  and  cells  incubated with  gramicidin  S  or MP196, 

respectively. GFP‐MinD delocalization  indicates membrane depolarization. (b) ATP  levels of 

B. subtilis cells treated with valinomycin, nisin, gramicidin S, or MP196. In a luciferase assay, 

ATP  concentrations were determined under  conditions  resembling  those of  the proteome 

experiment.  (c) H+‐ATPase activity of M.  flavus  inverted vesicles treated with  lactoferrin or 

MP196. Proton pumping activity was measured by the pH‐dependent absorbance change of 

acridine orange at 495 nm. (d) Activity of the respiratory chain of inverted M. flavus vesicles 

treated with rotenone, antimycin A, or MP196. Electron transport efficiency was monitored 

by reduction of  iodonitrotetrazolium chloride (INT)  leading to decreased absorbance at 485 

nm.  (e) Western  blot  analysis  of  cytochrome  c  in membrane  fractions  of  B.  subtilis  after 

treatment with gramicidin S and MP196 for five minutes. Ponceau S  is displayed as  loading 

control.  (f) Overview of  the bacterial  respiratory chain  (according  to Vonck and Schäfer24). 

Proton movements are indicated by green arrows, electron movements by orange arrows.  

 

ATP  limitation  might  also  stem  from  inhibition  of  the  respiratory  chain,  which  would 

contribute  to  the  breakdown  of  the membrane  potential  and  a  subsequent  loss  of  ATP 

synthesis.  Using  M.  flavus  inverted  vesicles,  inhibition  of  the  respiratory  chain  was 

69

monitored with iodonitrotetrazolium chloride, a reduction‐sensitive dye (Fig. 4d). Rotenone 

and  antimycin  A,  specific  inhibitors  of  complexes  I  and  III  of  the  respiratory  chain, 

respectively, were  used  as  comparator  compounds. Rotenone  reduced  electron  transport 

activity  by  20  percent,  antimycin  A  by  50  percent.  MP196  displayed  similar  inhibition 

efficiency,  reducing electron  transport by 30 percent. MP196  inhibition was  additive with 

either rotenone or antimycin A, suggesting that MP196 inhibits a different component of the 

respiratory chain. An alteration in membrane architecture, as suggested by DSC, might affect 

proteins attached to the membrane surface, as was shown for cell wall biosynthesis enzyme 

MurG. Cytochrome c is located on the outer membrane surface and transfers electrons from 

complex  III  to  complex  IV.  Its  localization  after  MP196  treatment  was  investigated  by 

Western blot analysis of membrane  fractions of antibiotic‐treated B. subtilis cells  (Fig. 4e). 

The amount of  cytochrome  c  in  the membrane was drastically  reduced after  five minutes 

treatment  with  MP196,  suggesting  dissociation  of  the  protein  from  the  extracellular 

membrane  surface.  A  similar  effect  was  observed  using  gramicidin  S,  which  was  shown 

earlier to  inhibit components of the respiratory chain27. Detachment of cytochrome c from 

the outer membrane leaflet explains the inhibition of the respiratory chain and subsequent 

energy  limitation  (Fig.  4f),  and  probably  contributes  to  the  breakdown  of  membrane 

potential. 

Cellular and extracellular amino acid composition 

Proteome  analysis  revealed  upregulation  of  proteins  involved  in  amino  acid  anabolism, 

especially  of  branched‐chain  amino  acid  but  also  of  glutamate  and  aspartate.  To  further 

investigate this, intracellular and extracellular free amino acid levels were measured by HPLC 

after 15 minutes of antibiotic treatment. MP196‐treated cells accumulated free arginine and 

valine  intracellularly  (Fig. 5a,  Supplementary  Fig. 7a),  consistent with  the upregulation of 

proteins involved in valine biosynthesis (Tab. 1, Supplementary Table 3).  

Intracellular  glutamine/glutamate,  asparagine/aspartate  (the  assay  employed  here  does 

distinguish between glutamate and glutamine or between aspartate and asparagine), lysine, 

and  proline  levels  were  substantially  reduced,  with  concomitant  dramatic  increases  in 

extracellular  glutamine/glutamate  and  asparagine/aspartate  and  moderate  increases  in 

extracellular arginine, lysine, and proline (Fig. 5b, Supplementary Fig. 7b).  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

70

 

Figure  5.  Amino  acid  composition.  (a)  HPLC  analysis  of  the  intracellular  amino  acid 

composition of B. subtilis  treated with MP196.  (b) Extracellular amino acid composition of 

the same cultures. Only those amino acids, whose concentrations changed significantly after 

peptide  treatment,  are  displayed  here  (see  Supplementary  Fig.  7  for  full  amino  acid 

profiles). Amino acids are written  in one  letter code  in  the order of elution  time  from  the 

column.  Glutamate  and  glutamine  as  well  as  aspartate  and  asparagine  are  not 

distinguishable  by  this method,  and  appear  as  one  peak.  Tryptophan was  not  quantified 

here. (c‐e) Minimal  inhibitory concentrations (MICs) of MP196 against B. subtilis  in defined 

medium  supplemented with  rising glutamate  (c), NaCl  (d), or KCl  (e) concentrations. MICs 

were independently determined twice. (f) Intra‐ and extracellular glutamate concentrations 

in  B.  subtilis  cells  under  different  antibiotic  and  osmotic  stress  conditions  determined  by 

amino acid analysis. 

 

The  absolute  amounts  of  released  glutamine/glutamate  exceeded  by  far  the  sum  of 

intracellular and extracellular levels of untreated cells, indicating dedicated biosynthesis and 

export  (Supplementary  Fig.  8a).  Feeding  experiments  using  radioactive  glutamate 

performed  in  Staphylococcus  simulans  showed  that  glutamate  uptake  is  reduced 

immediately  upon MP196  treatment  (Supplementary  Fig.  8b).  Supplementing  exogenous 

glutamate  to  defined  medium  increased  the  minimal  inhibitory  concentration  (MIC)  of 

MP196  against  B.  subtilis  up  to  eight‐fold  (Fig.  5c),  establishing  a  protective  effect  of 

glutamate  against  MP196  stress.  Similar  results  were  obtained  with  exogenously 

supplemented sodium chloride (Fig. 5d) and potassium chloride (Fig. 5e), suggesting that the 

protection  against  MP196  is  not  specific  for  glutamate  but  rather  due  to  osmotic 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

71

stabilization.  Glutamate  release  was  also  observed  in  response  to  osmotic  downshift  or 

treatment with gramicidin S or nisin, but not  to osmotic upshift or valinomycin  treatment 

(Fig. 5f). Mechanosensitive channels appear to contribute to glutamate release after MP196 

treatment.  A  B.  subtilis mutant  that  lacks  the  four  known mechanosensitive  channels29 

accumulated  high  levels  of  glutamate  intracellularly  (Fig.  5f)  and  showed  heightened 

sensitivity  to  MP196  (Fig.  5c‐e).  However,  these  channels  are  not  the  only  route  for 

glutamate release, as extracellular glutamate levels did increase when the triple mutant was 

treated with MP196 (Fig. 5f). 

DISCUSSION 

The cationic hexapeptide MP196, which is the minimal pharmacophore of RW‐rich peptides, 

was  used  here  to  study  the mechanism  of  action  of  short  cationic  RW‐rich  antimicrobial 

peptides  and  subsequent  bacterial  adaptation  strategies.  MP196  acts  on  the  bacterial 

cytoplasmic  membrane,  where  essential  physiological  processes,  including  cell  wall 

biosynthesis  (Fig. 6a.II),  respiration  (Fig. 6a.III)  and membrane  transport  (Fig. 6a.IV),  take 

place. At the molecular  level  (Fig. 6b.I), MP196 readily  integrates  into the  lipid bilayer and 

disturbs membrane architecture, as revealed by perturbation of fatty acyl packing measured 

using  DSC.  This membrane  integration  is  likely  promoted  by  interaction  of  the  cationic 

arginine  residues  with  negatively  charged  phospholipid  head  groups,  and  facilitated  by 

lipophilic  tryptophan  residues.  This  membrane‐integration  mechanism  is  typical  of 

amphipathic  peptides30  and  predicts  that MP196  accumulates  in  the membrane  near  the 

interface with the cytosol, making contact with lipid head groups and fatty acyl chains. 

We found no evidence for pore formation  in model membranes or  in vivo, yet MP196 was 

able to induce the release of potassium, magnesium, and manganese into a salt‐free buffer 

solution, but not into chemically defined bacterial culture medium. For other peptides, it has 

been  suggested  that  integration  leads  to  local  lipid  reorganization,  causing  transient 

membrane  leakiness  that  allows metal  ions  to  cross  the membrane31  but  the  lack  of  ion 

release in chemically defined medium suggests that ion efflux is not a major effect of MP196 

under  the  growth  conditions  used  for  the  proteome  experiment.  Osmotic  membrane 

stabilization  may  prevent  ion  leakage  in  culture  media  with  high  ion  concentrations,  a 

possibility supported by the observation that MP196 triggered only weak potassium efflux in 

osmotically stabilizing choline buffer. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

72

The  integration of MP196  into the membrane affects multiple cellular processes (Fig. 6b.II‐

IV). One is cell wall biosynthesis, as evidenced by a reduction in precursor incorporation, loss 

of  cell  wall  integrity,  promoter  activation  of  cell  wall  stress‐responsive  genes,  and 

upregulation of proteins indicative of cell wall biosynthesis stress. Similar observations have 

been  reported  for  gramicidin  S, which  is  thought  to  change membrane  architecture  and 

induces  markers  specific  for  cell  wall  biosynthesis  inhibition21.  Here,  both  MP196  and 

gramicidin S treatment lead to detachment of the lipid II biosynthesis protein MurG from the 

intracellular  surface  of  the  membrane  within  five  minutes,  probably  due  to  peptide 

integration  causing  alterations  in membrane  architecture. MurG  biosynthesis  is  strongly 

upregulated  after  65  minutes,  suggesting  a  compensations  strategy  by  B.  subtilis.  This 

mechanism  also  provides  a  potential  explanation  for  the  induction  of  the  LiaRS  cell wall 

stress response by membrane‐targeting peptides such as daptomycin32, which has also been 

suggested to alter membrane architecture33‐34. 

Integration of MP196 into the membrane has a profound impact on the bacterial respiratory 

chain (Fig. 6b.III). The observed inhibition can be attributed to detachment of cytochrome c 

from  the membrane,  resulting  in disruption of  the electron  transfer chain and subsequent 

breakdown  of  the  proton  gradient.  Thus, MP196  impairs  ATP  synthesis,  causing  energy 

limitation  that  impacts  cell  wall  biosynthesis  and  all  other  macromolecule  biosynthesis 

pathways.  

A  further  consequence  of membrane  depolarization  is  delocalization  of  the  cell  division 

regulation  protein, MinD. Unlike  cytochrome  c  variants  in B.  subtilis, which  attach  to  the 

outer  leaflet of  the membrane by a  lipid anchor or  transmembrane helices35‐36, MinD and 

MurG attach to the intracellular surface of the membrane through electrostatic interactions 

using an amphipathic helix motif25,37.  

Like MurG,  two  additional membrane‐associated  proteins,  SecA  and  FtsA, were  strongly 

upregulated in the membrane proteome after 65 minutes. And like MurG, FtsA docks to the 

membrane via an amphipathic helix 25. To summarize, the strongest effects of MP196 are on 

cell wall biosynthesis and energy metabolism. We propose that substantial energy limitation, 

together with impairment of cell wall biosynthesis, due to detachment of cytochrome c and 

MurG,  respectively,  are  the major  factors  contributing  to MP196‐mediated  bacterial  cell 

death. 

 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

73

 

Figure  6. Model  of  the mechanism  of  action  of MP196  and  the  bacterial  response  to 

exposure. Model of changes to membrane structure  (I). Membrane harboring the cell wall 

biosynthesis machinery (II), the respiratory chain (III), and transport channels (IV). (a) Intact 

B.  subtilis membrane,  (b)  influence of MP196 on membrane architecture and membrane‐

associated components,  (c)  stress adaptation of B.  subtilis  to MP196‐mediated membrane 

stress. MSC: mechanosensitive channel 

74

This report represents the first detailed physiological study of the mechanism of action of a 

short RW‐rich antimicrobial peptide. It provides insights into the biological action of peptides 

beyond the lipid bilayer itself. The dissociation of peripheral membrane proteins in inner and 

outer  leaflets  of  the  cytoplasmic membrane,  reported  here  for MurG  and  cyochrome  c, 

respectively, have not previously been proposed as antibacterial mechanisms. They provide 

new perspectives on the action of cationic antimicrobial peptides that are complementary to 

the  lipid‐focused  pore  formation  and  carpet  mechanism  models.  Based  on  the  data 

presented  here,  we  suggest  that  MP196  action  follows  the  interfacial  activity  model 

described  by  Wimley38,  whereby  at  50  percent  growth  rate  reduction,  phospholipid 

perturbation predominates over membrane disruption. 

While  the main  functional  impact  of MP196  is  on  proteins  located  in  the membrane,  its 

molecular  target  is  the  lipid bilayer  itself. This means  that MP196  interferes with a broad 

range  of  targets,  complicating  the  development  of  bacterial  resistance.  DSC  experiments 

showed  that  the  interaction  of  MP196  with  the  membrane  critically  depends  on  lipid 

composition,  offering  the  opportunity  to  design  peptides  selective  for Gram‐positive  and 

Gram‐negative organisms. 

This  study  also uncovered mechanisms by which B.  subtilis  counteracts peptide‐mediated 

membrane  stress  (Fig.  6c). One  survival  strategy  is  to  adapt membrane  lipid  composition 

(Fig.  6c.I).  Following  exposure  to MP196,  the  branched‐chain  amino  acid  valine, which  is 

needed  as precursor molecule  for branched‐chain  fatty  acids,  accumulates  in  the  cytosol. 

Changing  the membrane  lipid  composition by modulating branched‐chain  fatty  acids may 

interfere with the peptide‐membrane interaction. Previous experiments have suggested this: 

in  response  to  a  ferrocene‐conjugated  MP196  derivative,  Corynebacterium  glutamicum 

altered  the phospholipid headgroups by  reducing negatively  charged phosphatidylglycerol 

lipids and increasing uncharged diaglycerol lipids. This impeded attachment of the peptide to 

the membrane.  In addition, cardiolipin  levels were  increased, giving the membrane a more 

rigid structure, which further obstructed peptide integration39. 

 We  also  observed  the  induction  of  FloT,  a  protein  controlling membrane  fluidity  that  is 

involved  in  orchestrating  physiological  processes  in  lipid microdomains40. Upregulation  of 

this  protein  underscores  the  importance  of membrane  properties  and  indicates  that  B. 

subtilis  alters  membrane  architecture  to  impair  membrane‐associated  physiological 

processes.  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

75

Additional bacterial adaptation strategies were observed (Fig. 6c.II‐IV). First, induction of the 

dlt operon and the RacX protein suggest that there is adjustment of the bacterial cell wall by 

enhancing  wall  teichoic  acid  D‐alanylation,  to  restrict  access  of  the  peptide  to  the 

membrane. This  is  a  common  survival  strategy, observed  in daptomycin  and  vancomycin‐

resistant S. aureus strains41‐42. Second,  the LiaRS cell wall biosynthesis stress response and 

the  σW‐mediated membrane  stress  response were  strongly upregulated.  The  LiaH protein 

forms  ring‐like multimeric  structures  and  binds  to  the  inner  surface  of  the  cytoplasmic 

membrane upon  lipid  II‐mediated  cell wall biosynthesis  inhibition43.  It  is  thought  that  this 

stabilizes  the membrane.  The  σW‐controlled  PspA  protein  is  a  homologue  of  LiaH, which 

fulfils the same stabilizing function when the membrane is damaged44. Upregulation of both 

PspA  and  LiaH  reflects  the  duality  of  the MP196 mode  of  action:  it  impairs membrane 

function and cell wall biosynthesis. 

Adaptation of the membrane and cell wall structure and LiaH and PspA induction are known 

bacterial  strategies  in  response  to  cell  envelope‐targeting  antibiotics5,45.  Another  survival 

strategy, namely  the  release of  selected  amino  acids,  is described here  for  the  first  time. 

Glutamine/glutamate, asparagine/aspartate, arginine, proline, and  lysine were all  released 

into  the medium  and  biosynthesis  of  these  amino  acids  was  reflected  in  the  proteome 

response. Glutamate in particular is released in large quantities. It was already known as an 

osmoprotectant that accumulates intracellularly upon heat and salt stress46‐47. We show that 

B.  subtilis  releases glutamate  in  response  to hypoosmotic  stress  conditions  (Fig. 5c).  Such 

amino acid  release  is mediated by mechanosensitive  channels, which measure membrane 

tension  and  are  activated  by  pressure  on  the  lipid  bilayer48.  It  is  likely  that membrane 

structure alterations induced by MP196 activate mechanosensitive channels, resulting in the 

amino acid  release  (Fig. 5c). The addition of exogenous glutamate  to  the growth medium 

protected against MP196 (Fig. 5 d), suggesting that glutamate release is a deliberate survival 

strategy  rather  than  a  nonspecific  side  effect.  Protection  is  probably  based  on  osmotic 

stabilization,  a  suggestion  supported  by  the  finding  that  sodium  chloride  and  potassium 

chloride similarly protect against MP196  (Fig. 5e,f). Salts  in  the culture medium effectively 

protect  against  peptide‐induced  ion  leakage,  explaining  why  the  MICs  of  membrane‐

targeting  antimicrobial  peptides  show  considerable  medium  dependency49.  Release  of 

glutamate  was  also  observed  for  other  bacteriolytic  peptides  (Fig.  5c),  suggesting  that 

osmoprotective glutamate release is a general reaction to bacteriolytic peptides.  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

76

Amino  acid  analysis  also  revealed  arginine  accumulation  in  MP196‐treated  cells.  As 

described  for  Bacillus  licheniformis,  arginine  catabolism  is  negatively  affected  by  low 

glutamate  levels50.  Thus,  arginine  accumulation  may  be  due  to  the  low  intracellular 

glutamate concentration.  

This report constitutes a comprehensive mechanistic study of  the antibacterial mechanism 

of  action  of  a  RW‐rich  antimicrobial  peptide  in  vivo.  It  shows  that  a  peptide  causes 

dissociation of the essential proteins MurG and cytochrome c from the bacterial membrane, 

providing new insights into how membrane‐targeting antibiotics inhibit cell wall biosynthesis 

and  respiration  without  interfering  directly  with  components  of  these  pathways.  And  it 

confirms several bacterial adaptation strategies and describes a novel strategy that relies on 

osmotic stabilization through release of selected amino acids into the medium. 

METHODS 

Experimental  details  and  citations  for  all  methods  are  provided  as  Supplementary 

Information. 

Radioactive precursor incorporation 

The  influence  of MP196  on  the major macromolecular  synthesis  routes  was  studied  by 

incorporation  of  radioactively  labeled  precursor molecules  by  Staphylococcus  simulans  as 

described by Schneider et al.22.  

Reporter gene activation 

Damage  to  the main  cellular macromolecules  was monitored  by  promoter  activation  of 

selected marker genes fused to the firefly luciferase reporter gene in the genetic background 

of  B.  subtilis  IS34.  Serial  two‐fold  dilutions  of  each  peptide  (0.031  to  64  µg/ml)  were 

inoculated  with  bacterial  cell  suspensions  and  incubated  at  37  °C  for  a  time  period 

depending on  the  induction kinetics of  the  reporter  strain. 2 mM  luciferin was added and 

flash luminescence measured. 

Proteomics 

Treatment of B. subtilis 168, metabolic  labeling of newly synthesized proteins with  [35S]‐L‐

methionine, and subsequent protein separation by 2D PAGE were performed as described 

previously21. For gel‐free proteome analysis of membrane proteins, B. subtilis 168 was grown 

aerobically at 37 °C  in Belitzky minimal medium (BMM) supplemented with 14N‐ammonium 

sulfate and 14N‐L‐tryptophane. Cells were stressed at an OD500 of 0.4 with 22.5 µg/mL MP196 

for  65 minutes or  left untreated  as  control. Untreated  cultures  grown on  15N‐ammonium 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

77

sulfate and  15N‐L‐tryptophane were used  for  relative quantification. Mixing of cell extracts 

prior to subcellular fractionation steps for relative quantification was carried out according 

to Otto  et  al.51.  The  enriched membrane  protein  fraction was  prepared  according  to  the 

workflow  published  by  Eymann  et  al.52,  omitting  the  n‐dodecyl‐β‐D‐maltoside  treatment 

step. The preparation of  the  integral membrane peptides was carried out as described by 

Wolff et al.35. Sample preparation, mass spectrometric measurement, and subsequent data 

analysis were carried out as described by Otto et al.51. The mass spectrometry proteomics 

data  have  been  deposited  to  the  ProteomeXchange  Consortium 

(http://proteomecentral.proteomexchange.org) via the PRIDE partner repository53 with the 

dataset identifier PXD000181. 

Cell wall integrity and biosynthesis inhibition 

Sample preparation and bright field microscopic inspection of B. subtilis 168 was performed 

as  described  previously21.  Inhibition  of  in  vitro  lipid  II  synthesis  was  performed  using 

Micrococcus flavus DSM 1790 membrane preparations as described by Schneider et al.22. For 

in  vitro  lipid  II  binding,  peptides were  incubated with  2  nmol  lipid  II  in molar  ratios  1:1. 

Reaction mixtures were incubated at 30 °C for 30 min and applied onto TLC plates (TLC Silica 

Gel 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany). Chromatography was performed  in  chloroform‐

methanol‐water‐ammonia  (88:48:10:1)  and  stained  with  phosphomolybdic  acid  stain  at 

140°C  (PMA).    Accumulation  of  UPP‐MurNac  pentapeptide  was  analyzed  by  HPLC  as 

described by Schmitt et al.54. 

For detection of MurG  in membrane  fractions of B. subtilis 168, cells were grown  in BMM 

until early  logarithmic growth phase, treated with antibiotics  for 5 minutes, and harvested 

by  centrifugation.  Membrane  fractions  were  separated  by  differential  centrifugation, 

subjected  to SDS PAGE, and blotted onto a nitrocellulose membrane. MurG was detected 

with an E. coli MurG‐specific antibody produced  in rabbit and a secondary goat anti‐rabbit 

IgG‐HRP conjugate (BioRad, Berkeley, CA, USA). 

Transmission electron microscopy 

Cells were grown in BMM to an OD500 of 0.35. The main culture was then subdivided into 50 

mL aliquots and subcultures were treated with the respective antibiotics for 15 minutes or 

left untreated as control. Cells were harvested by centrifugation and washed  twice  in 100 

mM  Tris/1 mM  EDTA, pH 7.5  and  subsequently washed once  in  the  same buffer without 

EDTA. Preparation of bacterial samples for TEM was performed according to Santhana Raj et 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

78

al.55 with some modifications (see Supplementary Methods). Sections were stained with 0.2 

%  lead citrate  in 0.1 M NaOH  for 3  seconds. Samples were examined at 23,000  ‐ 230,000 

magnification with  a  Philips  EM410  transmission  electron microscope  (Philips,  Eindhoven, 

Netherlands)  equipped with  a  Gatan  (Pleasanton,  CA,  USA)  digital  camera  system  at  an 

accelerating voltage of 80 kV. 

Differential scanning calorimetry 

Membrane  integration was  investigated  by  DSC‐based  determination  of  peptide‐induced 

changes  in  the  thermotropic phase behaviour of  liposomes  consisting of pure DPPG, pure 

DPPE, pure DPPC, and a mixture of 88% DPPG and 12% DPPE, respectively. 

Permeability assays 

In  vivo  pore  formation  in  B.  subtilis  168  was  monitored  using  the  LIVE/DEAD  BacLight 

bacterial  viability  kit  (Invitrogen,  Carlsbad,  CA,  USA)  following  the  manufacturer’s 

instructions.  Potassium  release  from  B.  megaterium  was  performed  as  described  by 

previously21. Ionomics experiments were performed with B. subtilis 168 either in Tris buffer 

or  in  minimal  medium  under  the  same  conditions  as  the  proteomics  experiments.  Ion 

concentrations  were  determined  by  inductively  coupled  plasma  atomic  emission 

spectroscopy. 

Membrane potential measurements 

GFP‐MinD localization assays were performed with B. subtilis 1981 GFP‐MinD23 as described 

previously21. Determination of membrane potential changes by use of DiSC35 was performed 

as described by Andrés and Fierro26 in B. megaterium.  

Influence on energy metabolism 

ATP  concentrations were  determined  from  B.  subtilis  cytosolic  extracts  using  the  Perkin 

Elmer  ATPlite  1step  assay  kit  (Waltham,  MA,  USA)  according  to  the  manufacturer’s 

instructions.  M.  flavus  inverted  vesicles  for  H+‐ATPase  and  respiratory  chain  activity 

measurements were prepared according to Burstein et al.56. Proton pumping into M. flavus 

inverted vesicles by H+‐ATPase was measured  in a microtiter plate assay based on  the pH‐

sensitive probe acridine orange as described by Palmgren et al.57. Antibiotic Influence on the 

bacterial  electron  transport  chain  was  monitored  by  reduction  of  iodonitrotetrazolium 

chloride using M. flavus inverted vesicles as described by Smith and McFeters58. Cytochrome 

c localization was determined by Western Blot detection of cytochrome c on the same blots 

used for MurG detection. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

79

Amino acid analysis 

Amino  acid  analysis  of  B.  subtilis  168  cellular  extracts  and  culture  supernatants  was 

performed  by  HPLC  using  the  Acquity  HPLC  and  AccQ•Tag  Ultra  system  (Waters  GmbH, 

Milford, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. Prior to HPLC, proteins were 

removed by acetone precipitation.  

Uptake  and  efflux  of  radioactively  labeled  glutamate was  performed with  S.  simulans  as 

described by Ruhr and Sahl59. MIC values against B. subtilis 168 were determined with 5x105 

cells/mL  in  BMM  supplemented  with  rising  glutamate  concentrations.  The  lowest 

concentration inhibiting visible growth was taken as MIC. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

We  thank our  collaborating  technicians Michaele  Josten, University of Bonn,  for purifying 

nisin, Petra Düchting, Ruhr University Bochum (RUB) Plant Physiology for helping us establish 

AES, Monika Bürger and Beate Menzel, RUB Physiological Chemistry, for their help with TEM, 

and Stephanie Tautges, Kathrin Barlog, and Jale Stoutjesdijk, Medical Proteome Center, RUB, 

for assisting with amino acid analysis. We further acknowledge Christoph H. R. Senges, RUB, 

for his help with B. subtilis sample preparation. We thank Helmut Meyer, Medical Proteome 

Center, RUB, for providing amino acid analysis technology, and Suzana K. Straus, Department 

of Chemistry, University of British Columbia,  for  fruitful discussion. We  further thank Klaus 

Funke  and  Ellen  Kloosterboer,  RUB  Neurophysiology,  for  providing  the  cytochrome  c 

antibody  as  well  as  Tanneke  de  Blaauwen,  Swammerdam  Institute  for  Life  Sciences, 

University  of  Amsterdam,  and  Franz Naberhaus,  RUB Microbial  Biology  for  providing  the 

MurG antibody. AiCuris, Wuppertal,  is acknowledged  for providing  the B.  subtilis  reporter 

strains. Further, we thank Erhard Bremer, Philipps University Marburg, for providing the B. 

subtilis  mechanosensitive  channel  quadruple  mutant.  We  thank  Richard  Gallagher  for 

critically reading the manuscript and for his many helpful suggestions. 

This work was  financially  supported  by  a  grant  from  the  German  federal  state  of  North 

Rhine‐Westphalia  and  the  European  Union  (N.M.N,  H.B.O,  H.G.S,  J.E.B),  and  the  RUB 

Research Department  Interfacial  Systems Chemistry  (N.M.N,  J.E.B). CM was  supported  by 

the Protein Unit for Research in Europe (PURE), a project of North Rhine‐Westfalia. 

 

 

 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

80

Author contributions 

M.W. designed and performed experiments, designed the mode of action model, and wrote 

the paper; A.I.C., A.O., D.Z., and C.S. designed and performed experiments; H.B.A., M.P., and 

N.M.N. designed and synthesized MP196 and derivatives; C.M., U.K., R.E., H.B.O., D.B., and 

H.G.S. contributed tools, instrumentation and intellectual input; J.E.B. designed experiments 

and wrote the paper. 

 

Competing financial interest statement 

The authors declare no competing financial interests. 

 

REFERENCES 

1. Giuliani,  A.,  Pirri,  G.  &  Nicoletto,  S.F.  Antimicrobial  peptides:  an  overview  of  a 

promising class of therapeutics. Cent. Eur. J. Biol. 2, 1‐33 (2007). 

2. Riedl,  S.,  Zweytick,  D.  &  Lohner,  K.  Membrane‐active  host  defense  peptides  – 

Challenges and perspectives  fort the development of novel anticancer drugs. Chem. Phys. 

Lipids 164, 766‐81 (2011). 

3. Rathinakumar, R., Walkenhorst, W.F. & Wimley, W.C. Broad‐spectrum antimicrobial 

peptides by rational combinatory design and high‐throughput screening: the importance of 

interfacial activity. J. Am. Chem. Soc. 131, 7609‐17 (2009). 

4. Sharma,  R.K.,  Sundriyal,  S., Wangoo,  N.,  Tegge, W.  &  Jain,  R.  New  antimicrobial 

hexapeptides:  synthesis,  antimicrobial  activities,  cytotoxicity,  and  mechanistic  studies. 

ChemMedChem 5, 86‐95 (2010). 

5. Yeaman,  M.R.  &  Yount,  N.Y.  Mechanisms  of  antimicrobial  peptide  action  and 

resistance. Pharmacol. Rev. 55, 27‐55 (2003). 

6. Zweytick, D. et al. Studies on  lactoferricin‐derived Escherichia coli membrane‐active 

peptides reveal differences in the mechanism of N‐acylated versus nonacylated peptides. J. 

Biol. Chem. 286, 21266‐76 (2011). 

7. Zweytick, D., Tumer, S., Blondelle, S.E. & Lohner, K. Membrane curvature stress and 

antibacterial activity of lactoferricin derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 369, 395‐

400 (2008). 

8. Chantson,  J.T., Varga Falzacappa, M.V., Crovella, S. & Metzler‐Nolte, N. Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem. 1,1268‐74 (2006). 

9. Strøm, M.B. et al. The pharmacophore of short cationic antibacterial pepides. J. Med. 

Chem. 46, 1567‐70 (2003). 

10. Patra,  M.,  Gasser,  G.  &  Metzler‐Nolte,  N.  Small  organometallic  compounds  as 

antibacterial agents. Dalton Trans. 41, 6350‐8 (2012). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

81

11. Zelezetsky, I. et al. Controlled alteration and conformational stability of alpha‐helical 

cell‐lytic peptides:  effect on mode of  action  and  cell  specificity. Biochem.  J.  390,  177‐88 

(2005). 

12. Albada, H.B.  et  al. Modulating  the  activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing 

antibacterial  peptides  with  N‐terminal metallocenoyl  groups.  Beilstein  J.  Org.  Chem.  8, 

1765‐70 (2012). 

13. Albada, H.  B.  et  al.  Tuning  the  activity  of  short  Arg‐Trp  antimicrobial  peptides  by 

lipidation  of  C‐  or  N‐terminal  lysine  side‐chain.  ACS  Med.  Chem.  Lett.  DOI: 

10.1021/ml300148v (2012). 

14. Bandow,  J.  E.  Proteomic  approaches  to  antibiotic  drug  discovery.  Curr.  Protoc. 

Microbiol. 1, 1F.2 (2005). 

15. Wenzel, M. & Bandow,  J.E. Proteomic  signatures  in antibiotic  research. Proteomics 

11, 3256‐68 (2011). 

16. Chan., D.I.,  Prenner,  E.J. &  Vogel,  H.J.  Tryptophan‐  and  arginine‐rich  antimicrobial 

peptides:  structures  and mechanisms  of  action.  Biochim.  Biophys.  Acta  1758,  1184‐202 

(2006). 

17. Urban A. et al. Novel whole‐cell antibiotic biosensors for compound discovery. Appl. 

Environ. Microbiol. 73, 6436‐6443 (2007). 

18. Brötz‐Oesterhelt, H. et al. Dysregulation of bacterial proteolytic machinery by a new 

class of antibiotics. Nat. Med. 11, 1082‐7 (2005). 

19. Bandow,  J.E.,  Brötz,  H,  Leichert,  L.I.,  Labischinski,  H.  &  Hecker,  M.  Proteomic 

approach  to  understanding  antibiotic  action. Antimicrob. Agents  Chemother.  47,  948–55 

(2003).  

20. Wenzel, M. et al. Proteomic signature of  fatty acid biosynthesis  inhibition available 

for in vivo mechanism‐of‐action studies. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 2590‐6 (2011). 

21. Wenzel,  M.  et  al.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects 

differences in interaction with the cytoplasmic membrane. Antimicrob. Agents Chemother. 

56, 5749‐57 (2012). 

22. Schneider, T. et al. In vitro assembly of a complete, pentaglycine interpeptide bridge 

containing  cell wall precursor  (lipid  II‐Gly5) of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 53, 

675–85 (2004). 

23. Clejan,  S.,  Krulwich,  T.A.,  Mondrus,  K.R.  &  Seto‐Young,  D.  Membrane  lipid 

composition of obligately and  facultatively alkalophilic strains of Bacillus spp.  J. Bacteriol. 

168, 334‐40 (1986). 

24. Brisebois, P.P., Arnold, A.A., Chabre, Y.M., Roy, R. & Marcotte,  I. Comparative study 

of  the  interaction  of  fullerenol  nanoparticles  with  eukaryotic  and  bacterial  model 

membranes  using  solid‐state  NMR  and  FTIR  spectroscopy.  Eur.  Biophys.  J.  41,  535‐44 

(2012). 

25. Strahl, H. & Hamoen, L.W. Membrane potential is important for bacterial cell division. 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 27, 12281‐6 (2010). 

26. Andrés,  M.T.  &  Fierro,  J.F.  Antimicrobial  mechanism  of  action  of  transferrins: 

Selective inhibition of H+‐ATPase. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4335–42 (2010). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

82

27. Mogi, T., Ui, H., Shiomi, K., Omura, S. & Kita K. Gramicidin S  identified as a potent 

inhibitor for cytochrome bd‐type quinol oxidase. FEBS Lett. 291, 157‐61 (2008). 

28. Vonck,  J.  &  Schäfer,  E.  Supramolecular  organization  of  protein  complexes  in  the 

mitochondrial inner membrane. Biochim. Biophys. Acta 1793, 117‐24 (2009). 

29. Hoffmann,  T. Boiangu, C., Moses,  S. & Bremer,  E. Responses  of Bacillus  subtilis  to 

hypotonic challenges: physiological contributions of mechanosensitive channels to cellular 

survival. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2454‐60 (2008). 

30. Sitaram, N. and Nagaraj, R.  Interaction of antimicrobial peptides with biological and 

model membranes: structural and charge requirements for activity. Biochim.  Biophys. Acta 

15, 29‐54 (1999). 

31. Fuertes, G., Giménez, D.,  Esteban‐Martín,  S.,  Sánchez‐Muñoz, O.L. &  Salgado,  J.  A 

lipocentric view of peptide‐induced pores. Eur. Biophys. J. 40, 399‐415 (2011). 

32. Wecke, T. et al. Daptomycin versus Friulimicn B: in‐depth profiling of Bacillus subtilis 

cell envelope stress responses. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1619‐23 (2009). 

33. Pogliano,  J., Pogliano, N. &  Silverman,  J.A. Daptomycin‐mediated  reorganization of 

membrane  architecture  causes  mislocalization  of  essential  cell  division  proteins.  J. 

Bacteriol. 194, 4494‐504 (2012). 

34. Bayer,  A.S.,  Schneider,  T.  &  Sahl,  H.G.  Mechanisms  of  daptomycin  resistance  in 

Staphylococcus aureus: role of the cell membrane and cell wall. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1277, 

139‐58 (2013). 

35. Bengtsson,  J., Tjalsma, H., Rivolta, C. & Hederstedt,  L.  Subunit  II of Bacillus  subtilis 

cytochrome c oxidase is a lipoprotein. J. Bacteriol. 181, 685‐8 (1999). 

36. Bengtsson, J., Rivolta, C., Hederstedt, L. & Karamata, D. Bacillus subtilis contains two 

small  c‐type  cytochromes  with  homologous  heme  domains  but  different  types  of 

membrane anchors. J. Biol. Chem. 274, 26179‐84 (1999). 

37. Ha,  S., Walker, D.,  Shi, Y., Walker, S. The 1.9 Å  crystal  structure of Escherichia  coli 

MurG, a membrane‐associated glycosyltransferase  involved  in peptidoglycan biosynthesis. 

Protein Sci. 9, 1045‐52 (2000). 

38. Wimley, W.C.  Describing  the mechanism  of  antimicrobial  peptide  action with  the 

interfacial activity model. ACS Chem. Biol. 5, 905‐17 (2010). 

39. Fränzel, B. et al. Corynebacterium glutamicum exhibits a membrane‐related response 

to  a  small  ferrocene‐conjugated  antimicrobial  peptide.  J.  Biol.  Iorg.  Chem.  15,  1293‐303 

(2010). 

40. López, D. & Kolter, R. Functional microdomains  in bacterial membranes. Genes Dev. 

24,1893‐902 (2012). 

41. Bertsche, U. et al. Correlation of daptomycin  resistance  in a clinical Staphylococcus 

aureus  strain  with  increased  cell  wall  teichoic  acid  production  and  D‐alanylation. 

Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3922‐8 (2011). 

42. Rose,  W.E.,  Fallon,  M.,  Moran,  J.J.  &  Vanderloo,  J.P.  Vancomycin  tolerance  in 

methicillin‐resistant  Staphylococcus  aureus:  influence  of  vancomycin,  daptomycin,  and 

telavancin on differential  resistance  gene expression. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 

4422‐7 (2012). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

83

43. Wolf, D. et al. In‐depth profiling of LiaR response in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 192, 

4680‐93 (2010). 

44. Kobayashi, R., Suzuki, T. & Yoshida, M. Escherichia coli phage‐shock protein A (PspA) 

binds to membrane phospholipids and repairs proton leakage of the damaged membranes. 

Mol. Microbiol. 66, 100‐9 (2007). 

45. Kingston, A.W., Subramanian, C., Rock, C.O. & Helmann, J.D. A σW‐dependent stress 

response  in  Bacillus  subtilis  that  reduces membrane  fluidity. Mol. Microbiol.  81,  69‐79 

(2011). 

46. Hoffmann,  T.  &  Bremer,  E.  Protection  of  Bacillus  subtilis  against  cold  stress  via 

compatible solute acquisition. J. Bacteriol. 193:1552‐62 (2011). 

47. Kempf,  B., &  Bremer,  E.  Uptake  and  synthesis  of  compatible  solutes  as microbial 

stress response to high‐osmolality environments. Arch. Microbiol. 170, 319‐30 (1998). 

48. Sukharev,  S.  Purification  of  the  small mechanosensitive  channel  of  Escherichia  coli 

(MscS): the subunit structure, conduction, and gating characteristics in liposomes. Biophys. 

J. 83, 290‐8 (2002). 

49. Schwab,  U.,  Gilligan,  P.,  Jaynes,  J.  &  Henke,  D.  In  vitro  activities  of  designed 

antimicrobial  peptides  against multidrug‐resistant  cystic  fibrosis  pathogens.  Antimicrob. 

Agents Chemother. 43, 1435‐40 (1999). 

50. Laishley,  E.J.  &  Bernlohr,  R.W.  Regulation  of  arginine  and  proline  catabolism  in 

Bacillus licheniformis. J. Bacteriol. 96, 322‐9 (1968). 

51. Otto, A., et al. Systems‐wide temporal proteomic profiling in glucose‐starved Bacillus 

subtilis. Nat Commun. 1, 137. doi: 10.1038/ncomms1137 (2010). 

52.  Eymann, C. et al. A comprehensive proteome map of growing Bacillus subtilis cells. 

Proteomics 4, 2849–76 (2004). 

53. Vizcaino,  J.A. et al. The Proteomics  Identifications  (PRIDE) database and associated 

tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063‐9 (2013). 

54. Schmitt,  P.  et  al.  Insight  into  invertebrate  defensin  mechanism  of  action:  oyster 

defensins inhibit peptidoglycan biosynthesis by binding to lipid II. J. Biol. Chem. 285, 29208‐

16 (2010).  

55. Santhana Raj, L. et al. Rapid Method for Transmission Electron Microscopy Study of 

Staphylococcus aureus ATCC 25923. Annals of Microscopy 7, 102‐8 (2007). 

56. Burstein, C., Tiankova, L. & Kepes, A. Respiratory control in Escherichia coli K 12. Eur. 

J. Biochem. 94, 387‐92 (1979). 

57. Palmgren, M.G, Sommarin, M., Ulvskov, P. & Larsson, C. Effect of detergents on the 

H(+)‐ATPase  activity  of  inside‐out  and  right‐side‐out  plant  plasma  membrane  vesicles. 

Biochim. Biophys. Acta 1021, 133‐40 (1990). 

58. Smith, J.J.   & McFeters, G.A. Mechanisms of INT (2‐(4‐iodophenyl)‐3‐(4‐nitrophenyl)‐

5‐phenyl tetrazolium chloride), and CTC (5‐cyano‐2,3‐ditolyl tetrazolium chloride) reduction 

in Escherichia coli K‐12, J. Microbiol. Methods  29, 161‐75 (1997). 

59. Ruhr, E. & Sahl, H.G. Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on 

the  membrane  potential  of  whole  cells  and  on  cytoplasmic  and  artificial  membrane 

vesicles. Antimicrob. Agents Chemother. 27, 841‐5 (1985). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

84

 

Supplementary Information 

 

Content 

i) Experimental Details 

ii) Supplementary Tables 

iii) Supplementary Figures 

iv) References 

 

i) Experimental details 

Antibiotics 

Antibiotic  stock  solutions  of  10  mg/ml  were  prepared  in  sterile  DMSO  (MP196,  D‐MP196, 

valinomycin,  gramicidin  S,  vancomycin)  or  0.01 M HCl  (nisin). MP276,  L‐  and D‐MP196 were 

synthesized by  solid‐phase  synthesis as described previously1. Nisin was purified according  to 

Bonelli et al.2. Valinomycin and vancomycin were purchased from Sigma‐Aldrich (St Louis, MO, 

USA). Gramicidin S was synthesized according to Wadwhani et al.3. Lactoferrin, rotenone, and 

antimycin  A  were  purchased  from  Sigma‐Aldrich.  Stock  solutions  were  prepared  in  water 

(lactoferrin, 1 mM), acetone  (rotenone, 100 mM), or ethanol  (antimycin A, 10 mM). Sublethal 

antibiotic  concentrations  applied  in  the  single  experiments were  adjusted  to  the  respective 

bacterial  strains  and  experimental  conditions  aiming  at  adequate  bacterial  growth  inhibition 

(reduction of the growth rate by 50‐70%) without killing the cells or abolishing their metabolic 

activity completely (see Supplementary Figure 3). 

Radioactive precursor incorporation 

Influence of MP196 on major metabolic pathways was studied by incorporation of radioactively 

labeled precursor molecules into Staphylococcus simulans 22 as described by Schneider et al.4. 

[14C]‐thymidine  was  used  for  monitoring  DNA,  5‐[3H]‐uridine  for  RNA,  L‐[14C]‐isoleucine  for 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

85

 

protein  and  [3H]‐glucosamine‐hydrochloride  for  cell wall  biosynthesis  inhibition,  respectively. 

Cells  were  grown  in  half‐concentrated  Mueller  Hinton  broth  (henceforth  MH,  Oxoid, 

Basingstoke, United Kingdom) at 37 °C until reaching an optical density at 600 nm (OD600) of 0.5 

and diluted to an OD600 of 0.1 to 0.2. Newly synthesized DNA, RNA, protein or peptidoglycane 

was  radioactively  labeled by addition of  the  respective precursors  to a  final  concentration of 

0.15  µCi/mL  [14C]‐thymidine,  1 μCi/mL  5‐[3H]‐uridine,  0.15  µCi/mL  L‐[14C]‐isoleucine,  and  1 

µCi/mL  [3H]‐glucosamine‐hydrochloride.  After  15  ([14C]‐thymidine,  5‐[3H]‐uridine,  L‐[14C]‐

isoleucine)  or  30  minutes  ([3H]‐glucosamine‐hydrochloride)  of  radioactive  incorporation, 

subcultures of the differentially  labeled samples were treated with 2 µg/ml MP196, 0.7 µg/ml 

ciprofloxacin,  0.07  µg/ml  rifampicin,  0.7  µg/ml  tetracycline,  and  0.7  µg/ml  vancomycin, 

respectively, or  left untreated as negative controls.   Samples of 200 μl were collected at 0, 10, 

20,  and  30 minutes  after  antibiotic  addition, mixed  with  ice‐cold  trichloroacetic  acid  (TCA) 

precipitation buffer (10% TCA, 1M NaCl), incubated on ice for 30 minutes, and filtered through 

glass microfibre filters (Whatman, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Filters were subsequently 

washed with 5 ml washing buffer (2.5% TCA, 1M NaCl), dried, and transferred to counting vials. 

5 ml of scintillation fluid (Filtersafe, Zinsser, Frankfurt, Germany) were added and radioactivity 

was measured  in counts per minute  (CPM) using a TriCarb 3110TR  liquid scintillation analyzer 

(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). 

Reporter gene fusions 

For  quantitative  expression  analysis  of  selected marker  genes,  five  bacterial  reporter  strains 

were used, carrying  the promotor of either yorB, bmrC  (synonym yheI), helD  (synonym yvgS), 

ypuA  and  liaI  (synonym  yvqI)  fused  to  the  firefly  luciferase  reporter  gene  in  the  genetic 

background of B. subtilis IS345. Reporter strains were cultured overnight in lysogeny broth with 

5  µg/ml  erythromycin  (resistance marker  on  the  luciferase  plasmid)  at  37  °C  and  200  rpm. 

Cultures were  diluted  to OD600  of  0.05  in  20 ml  of  either  Belitzky minimal medium  (BMM)6 

(bmrC strain) or lysogeny broth (all other strains) with 5 µg/ml erythromycin, grown to an OD600 

of  0.4  (bmrC  strain)  or  0.9  (all  other  strains)  and  diluted  to  an OD600  of  0.02.  Serial  twofold 

dilutions of MP196 (0.031 to 64 µg/ml) in 60 µl lysogeny broth or BMM were prepared in white 

96‐well  flat  bottom  polystyrol microtiter  plates  (Greiner,  Frickenhusen,  Germany)  and were 

inoculated with 60 µl of the adjusted bacterial suspension. Plates were incubated at 37 °C for a 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

86

 

predetermined time period depending on the  induction kinetics of the reporter strain: 1 hour 

for the  liaI and ypuA strains, 1.5 hours for the helD strain, 3.5 hours for the yorB strain and 4 

hours  for  the bmrC  strain. Then 60 µl  citrate buffer  (0.1 M, pH 5)  containing 2 mM  luciferin 

(Serva,  Heidelberg,  Germany)  was  added  and  flash  luminescence  was  measured  using  a 

microtiter plate reader (infinite M200, Tecan, Männedorf, Switzerland). 

Proteomics 

Bacterial strains and growth conditions 

Bacillus  subtilis  168  (trpC2)7  was  grown  at  37  °C  under  steady  agitation  in  BMM. Minimal 

inhibitory  concentrations  (MICs) were  determined  under  proteomics  conditions  as  described 

previously8.  In  short,  two ml  of  antibiotic‐supplemented  BMM  were  inoculated  with  5x105 

bacteria per ml and incubated at 37 °C under steady agitation for 18 hours. The MIC was defined 

as the lowest antibiotic concentration inhibiting visible growth. In growth experiments, bacterial 

cultures were  treated with different MIC‐based  antibiotic  concentrations  after growing  to an 

OD500 of 0.35. For proteomic experiments those antibiotic concentrations were chosen that led 

to a reduced growth rate compared to the untreated control. 

Preparation of cytoplasmic [35S]‐L‐methionine‐labeled protein fractions 

Radioactive labeling was performed as described previously8. In short, 5 ml of a bacterial culture 

in early exponential growth phase were exposed to 22.5 µg/ml MP196 or 50 µg/ml D‐MP196, 

respectively, or left untreated as control. After 10 minutes of antibiotic stress cells were pulse‐

labeled with [35S]‐L‐methionine for additional 5 minutes. Radioactive incorporation was stopped 

by inhibition of protein biosynthesis by chloramphenicol and an excess of cold methionine. Cells 

were  harvested  by  centrifugation,  washed  three  times  in  Tris  buffer  and  disrupted  by 

ultrasonication. 

2D‐PAGE 

2D gels were prepared as described previously8. In short, 55 µg of protein for analytical and 300 

µg for preparative gels were loaded onto 24 cm immobilized pH gradient (IPG) strips pH 4‐7 (GE 

Healthcare) by passive rehydration for 18 hours. Proteins were separated in a first dimension by 

isoelectric  focusing  and  in  a  second  dimension  by  SDS‐PAGE  using  12.5%  acrylamide  gels. 

Analytical gel images were analyzed as described by Bandow et al.9 using Decodon Delta 2D 4.1 

image analysis  software  (Decodon, Greifswald, Germany). Proteins  found  to be  induced more 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

87

 

than  two‐fold  in  three  independent  biological  replicates  were  defined  as  marker  proteins. 

Protein  spots were manually  excised  from  preparative  2D  gels  and  transferred  into  96 well 

microtiter plates. Tryptic digest with  subsequent  spotting on a MALDI  target was  carried out 

automatically  with  the  Ettan  Spot  Handling  Workstation  (Amersham  Biosciences,  Uppsala, 

Sweden) as described by Eymann et al.10. MALDI‐ToF as well as MALDI‐ToF‐ToF measurements 

were carried out on a 4800 MALDI‐ToF/ToF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 

as described previously8. For  the  five most  intense peaks  in  the MS spectra, MS/MS data was 

obtained.  Peak  lists were  generated  using  the  “peak  to mascot”  script  of  the  4000  Explorer 

Software  V3.5.3  and  searched  against  an  in  house  strain‐specific  B.  subtilis  168  sequence 

database with 4767 entries downloaded from UniProt (May 2nd, 2008) using the Mascot search 

engine  Version  2.1.04  (Matrix  Science  Ltd,  London, UK).  Search  parameters  allowed  for  one 

missed cleavage. Carbamidomethylation of cysteine was defined as fixed modification, oxidation 

of methionine as variable modification. Mass tolerance of precursor ions was set to 50 ppm, and 

known contaminants were excluded. Protein scores, ‐10*Log(P), where P is the probability that 

the observed match is a random event, are derived from ion scores as a non‐probabilistic basis 

for ranking protein hits. Protein scores higher than 49 were considered significant (significance 

threshold p<0.05).  

Protein  spots, which  could not be  identified by MALDI‐ToF/ToF  (indicated by  asterisks  in  the 

identification  table)  were  identified  using  a  Synapt  G2S  high  definition  mass  spectrometer 

equipped  with  a  lock  spray  source  for  electrospray  ionization  and  a  ToF  detector  (Waters, 

Milford,  MA,  USA).  Manually  excised  protein  spots  were  destained  with  20  mM 

ammoniumbicarbonate/30%  acetonitrile,  dried  completely,  and  subsequently  tryptically 

digested (6.25 ng/µL, Promega, Fitchburg, WI, USA). Peptides were eluted into ultrapure water 

by 15 minutes of ultrasonication. Eluates were  loaded on a trap column  (C18, pore size 100 Å, 

particle diameter 5 µm,  inner diameter 180 µm,  length 20 mm)  and were  then eluted using 

gradients of acetonitrile with 0.1%  formic acid  (350 µL/min,  linear gradient 2‐60%  in 40 min) 

from  an  analytical  column  at  50  °C  (C18,  pore  size  130  Å,  particle  diameter  1.7  µm,  inner 

diameter 75 µm, length 150 mm) to be subjected to mass spectrometry. Spectra were recorded 

in positive resolution mode over a mass range of 50 to 1800 m/z with 1 s/scan. The following 

parameters were used  for the NanoLockSpray source: capillary voltage, 3.3 kV; sampling cone 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

88

 

voltage, 30 V; source  temperature, 80 °C; desolvation  temperature, 200  °C; cone gas  flow; 50 

L/h; desolvation gas flow, 600 L/h. [Glu1]‐Fibrinopeptide B serving as lock mass analyte was fed 

through the  lock spray channel (lock mass capillary voltage, 3.2 V). Analysis of the spectra was 

performed using MassLynx V4.1 SCN813. 

Preparation of 15N/14N‐labeled membrane proteome fractions 

For gel‐free proteome analysis of membrane proteins B. subtilis 168 was grown aerobically at 37 

°C in BMM supplemented with either 15N‐ammonium sulfate/15N‐ L‐ tryptophan (0.078 mM, 98 

atom % excess, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) or 14N‐ ammonium sulfate and 

14N‐ L‐ tryptophane. Cells were harvested by centrifugation either with antibiotic stress imposed 

at an optical density at 500 nm of 0.4 for 65 minutes or as a control directly before setting of the 

stress. Mixing of cell extracts prior to subcellular fractionation steps for relative quantification 

was  carried  out  according  to  Otto  et  al.11.  The  enriched  membrane  protein  fraction  was 

prepared according  to  the workflow published  in Eymann et al.10 omitting  the n‐dodecyl‐β‐D‐

maltoside  treatment  step.  Preparation  of  integral  membrane  peptides  (membrane  shaving 

fraction) was carried out as described by Wolff et al.12.  

ESI‐MS measurement 

Sample  preparation,  mass  spectrometric  measurement  for  both  the  enriched  membrane 

protein and membrane shaving  fractions, and subsequent data analysis  (protein  identification 

and  relative  quantitation)  were  carried  out  as  described  by  Otto  et  al.11.  Logarithmic  peak 

intensities  (ratio  to  the  15N‐labelled  standard  culture) were normalized  to  the median of  the 

respective datasets. The cutoff for significant protein upregulation was set to a lognorm change 

of  0.35,  representing  the maximal  biological  variation  between  different  control  cultures  in 

>99% of the data points. 

Light microscopy 

Sample preparation and microscopic  inspection of  the cell shape was performed as described 

previously13. Briefly, B. subtilis 168 was grown in BMM until early exponential growth phase and 

subsequently  treated with 22.5 µg/ml MP196, 0.75 µg/mL nisin, or  left untreated as  control. 

After  15  minutes  of  antibiotic  stress  cells  were  fixed  in  a  1:3  mixture  of  acetic  acid  and 

methanol, immobilized in low melting agarose, and subjected to bright field microscopy. 

In vitro lipid II synthesis 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

89

 

In  vitro  lipid  II  synthesis  was  performed  using  Micrococcus  flavus  DSM  1790  membrane 

preparations  as  described  by  Schneider  et  al.4,  adding  [14C]‐UDP‐N‐acetyl‐D‐glucosamine 

(GlcNAc)  to  label newly  synthesized  lipid  II. Membranes were  isolated  from  lysozyme‐treated 

cells by centrifugation at 40,000 x g, washed twice  in washing buffer  (50 mM Tris‐HCl, 10 mM 

MgCl2, pH 7.5) and frozen  in  liquid nitrogen.  In vitro  lipid  II synthesis was performed  in a total 

volume  of  75  µL  using  400  µg  of  membrane  protein,  5  nmol  C55‐P,  50  nmol  UDP‐N‐

acetylmuramylpentapeptide  (UDP‐MurNAc‐PP, purified  according  to Kohlrausch  and Höltje14), 

and  50  nmol  [14C]‐UDP‐GlcNAc  in  reaction  buffer  (60 mM  Tris‐HCl,  5 mM MgCl2,  0.5%  (w/v) 

triton X‐100, pH 8.0). Peptides were added in a 2:1 molar ratio to C55‐P and incubated with the 

reaction mixture for 1 hour at 37 °C. Subsequently,  lipid extraction was performed by addition 

of  75  µL  2:1  n‐butanol/6 M  pyridine‐acetate,  pH  4.2.  Lipids  were  separated  by  thin  layer 

chromatography  using  60F254  silica  plates  (Merck,  Darmstadt,  Germany)  and 

chloroform/methanol/water/ammonia  (88:48:10:1)  as  solvent  as  described  by  Rick  et  al.15. 

Radiolabeled spots were visualized using a Storm 820 Phosphor Imager (Amersham Biosciences, 

Uppsala,  Sweden).  Image  analysis was  performed  using  the  ImageQuant  TL  v2005  software 

(Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK). 

Lipid II‐binding 

For  in vitro  lipid  II binding of peptides were  incubated with 2 nmol  lipid  II  in molar ratios 1:1. 

Reaction mixtures were incubated at 30 °C for 30 min and applied onto TLC plates (TLC Silica Gel 

60 F254, Merck, Darmstadt, Germany). Chromatography was performed in chloroform‐methanol‐

water‐ammonia (88:48:10:1)15 and stained with phosphomolybdic acid stain and 140°C (PMA). 

Accumulation of UDP‐MurNAC‐pentapeptide 

Accumulation of UPP‐MurNac was analysed by HPLC as described by Schmitt et al.16.  

S. simulans 22 was grown  in MH broth  to an OD600 of 0.5. 130 µglmL chloramphenicol were 

added in order to prevent induction of autolysis and de novo synthesis of enzymes hydrolyzing 

the nucleotide‐activated  sugars  interfering with determination of  the  soluble precursor17  (Dai 

and Ishiguro, 1988). After 15 min, 5 µg/mL MP196 and 0.7 µg/mL vancomycin were added. After 

30 min of  incubation with  the  respective peptides  cells were harvested  and boiled  in water. 

Insoluble components were  removed by centrifugation at 13,000 × g  for 5 min. Supernatants 

were adjusted to pH 2 with H3PO4,  filtered through cellulose acetate filters  (pore size 0.2 μm) 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

90

 

and analyzed by RP‐HPLC  in 50 mM  sodium phosphate buffer, pH 5.2, developed  in  isocratic 

mode over  30 min  at  a  flow  rate  1 ml/min  on  a Nucleosil  100‐C18  column  (Schambeck  SFD 

GmbH, Bad Honnef, Germany). 

SDS‐PAGE and Western blot 

B.  subtilis  168  was  grown  in  BMM  until  early  logarithmic  growth  phase  and  subsequently 

treated with 22.5 µg/mL MP196, 1 µg/mL gramicidin S, or  left untreated as control. Cells were 

harvested by centrifugation, washed three  times  in washing buffer  (100 mM tris/1 mM EDTA, 

pH  7.5),  and  resuspended  in disruption buffer  (10 mM  tris, pH  7.5). Cells were disrupted by 

ultrasonication, cell debris was removed by centrifugation, and cell extracts were subjected to 

ultracentrifugation  at  150,000  x  g  for  4  h.  The  resulting membrane  pellet was  dissolved  in 

washing  buffer.  Protein  concentrations  were  determined  by  a  Bradford‐based  assay  (Roti‐

Nanoquant, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) according to the manufacturer’s instructions. 30 µg 

of protein were loaded onto a 15% SDS polyacrylamide gel and proteins were separated at 120 

V.  Proteins  were  then  blotted  onto  a  nitrocellulose  membrane  (Hybond,  GE  Healthcare, 

Uppsala, Sweden) at 250 mA and 25 V per blot for 2 h. Membranes were stained with Ponceau S 

prior  to antibody detection  to  control equal  sample  loading. Subsequently, membranes were 

destained in TBST (100 mM tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5), blocked with 3% non‐fat 

dried milk powder in TBST for 2 h, and subsequently incubated with a rabbit anti‐(E.coli‐)MurG‐

His antibody18  in a 1:10,000 dilution  in TBST with 1% milk powder for 18 h.   Membranes were 

then washed three times  in TBST with 3% milk powder,  incubated with a goat anti‐rabbit  IgG‐

HRP secondary antibody (Bio‐Rad, Berkeley, CA, USA) in a 1:3,000 dilution in TBST with 3% milk 

powder for 1 h, washed three times with TBST and were then covered with chemiluminescence 

reagent  (Luminata™  Forte Western  HRP  Substrate, Merck Millipore,  Darmstadt,  Germanay). 

Signals were detected with  a  FluorChem®  Imaging Workstation  (Alpha  Innotech, now part of 

Proteinsimple, Santa Clara, CA, USA). Quantification of band  intensity was performed with the 

ImageQuant TL 1D analysis software (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). The same membranes 

were analogously used  for cytochrome c detection using a mouse anti‐(pigeon‐)cytochrome c 

antibody  (7H8.2C12, abcam, Cambridge, UK) at a  final concentration of 2.5 µg/mL and a goat 

anti‐mouse IgG‐HRP secondary antibody (Bio‐Rad, Berkeley, CA, USA).  

Transmission electron microscopy 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

91

 

Cells were grown in BMM to an OD500 of 0.35. The main culture was then subdivided into 50 mL 

aliquots  and  subcultures were  treated with  the  respective  antibiotics  for  15 minutes  or  left 

untreated as control. Cells were harvested by centrifugation and washed twice in 100 mM Tris/1 

mM EDTA, pH 7.5 and subsequently washed once in the same buffer without EDTA. Preparation 

of  bacterial  samples  for  TEM  was  performed  according  to  Santhana  Raj  et  al.19  with  some 

modifications.  Cells were  fixed  in  2%  glutaraldehyde  for  20 min, washed  twice with  double‐

distilled water, and subsequently incubated with 2% uranylacetate for 5 min Samples were then 

washed  twice with  double‐distilled water  and  stained with  2%  osmium  tetroxide  (OT).  Cells 

were  centrifuged  down  and  excess  of  OT  solution  was  discarded.  Samples  were  then 

dehydrated by an incubation series with 50%, 70%, 90%, and 100% acetone for 5 min each. Cells 

were subsequently  incubated with 1:1 acetone/epoxy resin  for 15 min and then embedded  in 

pure epoxy  resin. For preparation of  the epoxy  resin,  solution A  (38% Epon 812/62% dodecyl 

succinic anhydride) was mixed with solution B (47% epon 812/53% methylnadic anhydride) at a 

ratio of 3:7. To  this mixture  tris‐2,3,6‐(dimethylaminomethyl)phenol  (DMP30) was added  to a 

final concentration of 1.5% to accelerate polymerization. Polymerization was performed at 75 °C 

for 18 hours. Blocks were trimmed, cut to 50 nm ultrathin sections and mounted on Formvar‐

coated (R1201, Plano, Wetzlar, Germany), 75 mesh thin bar copper grids (Stork Veco, Eerbeek, 

Nertherlands). Samples were either stained with 0.2 % lead citrate in 0.1 M NaOH for 3 seconds 

or remained unstained. Samples were examined at 23,000 ‐ 230,000 magnification with a Philips 

EM410  transmission  electron microscope  (Philips,  Eindhoven,  Netherlands)  equipped with  a 

Gatan (Pleasanton, CA, USA) digital camera system at an accelerating voltage of 80 kV. 

Differential scanning calorimetry (DSC) 

1,2‐Dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoglycerol  (Na‐salt)  (DPPG),  1,2‐Dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐

phosphoethanolamine  (DPPE),  and  1,2‐Dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine  were 

purchased  from  Avanti  Polar  Lipids  Inc.  (Alabaster,  AL,  USA).  Peptides  were  dissolved  in 

phosphate buffered  saline  (PBS, 20 mM NaPi, 130 mM NaCl, pH 7.4) at a  concentration of 3 

mg/ml before each experiment. Aqueous dispersions of lipids of 0.1% (w/w) in PBS buffer were 

prepared before measurement in the presence (lipid‐to‐peptide molar ratio of 25:1 and 120:1) 

and absence of peptides. The respective  liposomes were always prepared 10‐15  °C above  the 

phase transition temperature by vigorous mixing at certain time points. For the preparation of 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

92

 

DPPG  liposomes we followed a protocol described by Zweytick et al.20. Lipid films of DPPE and 

DPPG/DPPE 88:12  (w/w) were hydrated  at 70  °C  for 2 hours.  For  the mixture  a  freeze  thaw 

protocol was used  to  increase homogenous mixing. DSC experiments were performed with a 

differential scanning calorimeter (VP‐DSC) from MicroCal, Inc. (Northampton, MA, USA). Heating 

scans were performed at a scan rate of 30 °C/hour with a final temperature approximately 10 °C 

above the main transition temperature (Tm) and cooling scans at the same scan rate with a final 

temperature  about  20  °C  below  Tm.  The  heating/cooling  cycle was  repeated  twice,  pre‐scan 

thermostating was allowed  for 15 minutes  for the heating scans and 1 minute  for the cooling 

scans.  Enthalpies  were  calculated  by  integrating  the  peak  areas  after  normalization  to 

phospholipid  concentration  and baseline  adjustment using  the MicroCal Origin  software  (VP‐

DSC version). 

Live/Dead staining 

Pore  formation was monitored using  the LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit  (Invitrogen, 

Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. B. subtilis 168 was grown at 37 °C 

in BMM under  steady agitation until early exponential phase. The main culture was  split and 

aliquots were treated with 22.5 µg/ml MP196, 0.75 µg/ml nisin, 1 µg/ml gramicidin S 10 µg/mL 

valinomycin,  or  left  untreated  as  control. After  15 minutes  of  antibiotic  stress,  2 µl of  a  1:1 

mixture of the green and red‐fluorescing dyes were added per ml of culture and incubated for 

15 minutes in the dark under steady agitation. Cells were washed with 100 mM Tris/1mM EDTA, 

pH 7.5 and resuspended  in  the same buffer. 5 µl of  the cell suspension were  imaged without 

fixation or  immobilization  in  fluorescent mode  as described before13.  Single  channel pictures 

were combined using the Cell* software (Olympus, Hamburg, Germany). Background correction 

was performed applying the same constant (25) for all images. 

Potassium release 

Potassium  efflux  experiments  were  performed  as  described  previously13  with  minor 

modifications. Briefly, B. megaterium ATCC 13632 was grown  in half MH to an OD500 of 1.0 to 

1.5, washed with 50 ml cold choline buffer, and resuspended in the same buffer to an OD500 of 

30. For each measurement, cells were diluted  in choline buffer (25 °C) to an OD500 of about 3. 

Nisin was applied at 3,35 µg/ml (1 µM). MP196 at 125 µg/ml (80 µM), which is equivalent to 50x 

MIC. No effect was seen with lower MP196 concentrations (2x, 10x MIC). A control culture was 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

93

 

left untreated. Potassium efflux was monitored using a pH‐meter pH 213 (Hanna  Instruments, 

Kehl  am  Rhein,  Germany)  with  an  MI‐442  potassium  electrode  and  an  MI‐409F  reference 

electrode.  Before  each  experiment,  the  electrodes  were  calibrated  with  standard  solutions 

containing 0.01, 0.1, or 1 mM KCl. Calculations of potassium efflux  in percent were performed 

according to Orlov et al.21. Antibiotic‐induced leakage was monitored for 5 minutes with values 

taken  every  10  seconds  and  expressed  relatively  to  the  total  amount  of  potassium  release 

induced by nisin.  

Ionomics 

For ionomics only metal‐free plastic ware and ultrapure water (Bernd Kraft, Duisburg, Germany) 

were used. All centrifugation  steps were performed  for 2 minutes  to  reduce  sample handling 

time. B. subtilis 168 was grown in BMM until early exponential growth phase. For determination 

of  ion concentrations of cells stressed  in medium, subcultures were directly treated with 22.5 

µg/ml MP196, 1 µg/ml gramicidin S, and 10 µg/mL valinomycin, respectively, or  left untreated 

as  a  negative  control.  After  15 minutes  of  antibiotic  treatment  (proteomic  conditions),  cells 

were harvested by centrifugation, washed twice in 100 mM Tris/1mM EDTA, pH 7.5 and washed 

once in 100 mM Tris, pH 7.5. For determination of ion concentrations of cells stressed in buffer, 

exponentially  growing  cultures were  harvested  by  centrifugation, washed  twice  in  100 mM 

Tris/1 mM EDTA, pH 7.5, washed once in 100 mM Tris, pH 7.5, and subsequently resuspended in 

the same buffer. The OD500 was readjusted to 0.4 and cells were stressed as described above. 

After 5 minutes  (due  to  rapid  ion release kinetics) of antibiotic stress cells were harvested by 

centrifugation without further washing steps.  

Cell pellets were completely dissolved in 2.5 ml 65% nitric acid (Bernd Kraft, Duisburg, Germany) 

and  incubated  at  80  °C  for  16  hours. Dissolved  samples were  filled  up with  ultrapure water 

(Bernd  Kraft,  Duisburg,  Germany)  to  10  ml.  Elemental  concentrations  were  determined  by 

inductively  coupled plasma atomic emission  spectroscopy using an  iCAP* 6300 Duo View  ICP 

Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Liquid calibration standards from 

10  µg/L  to  10 mg/L  of  each  element  of  interest  (Bernd  Kraft, Duisburg, Germany) were  run 

before  each  series  of measurement  and  selected  standards  were  additionally  run  every  20 

samples as a quality control. Resulting element concentrations were converted into intracellular 

ion concentrations based on calculation of the cytosolic volume of B. subtilis. This volume was 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

94

 

taken as 3.09x10‐9 µl based on average rod size and B. subtilis cell wall and membrane thickness 

determined by cryo‐electron microscopy by Matias and Beveridge22‐23. 

GFP‐MinD localization 

Localization assays were performed with B. subtilis 1981 GFP‐MinD24 as described previously13.  

In short, cells were grown over night in BMM and then inoculated in modified BMM containing 

xylose  instead  of  glucose  to  induce  GFP‐MinD  expression.  Cultures  were  grown  until  early 

exponential  growth  phase,  and  subsequently  stressed  with  22.5  µg/mL  MP196,  1  µg/mL 

gramicidin  S or  left untreated. After 15 minutes of  antibiotic exposure,  cells were  imaged  in 

fluorescent mode without fixation or immobilization. 

DiSC35‐based membrane potential measurement 

Determination  of membrane  potential  changes was  performed  as  described  by  Andrés  and 

Fierro25 using the membrane potential‐sensitive fluorescent dye 3,3′‐dipropylthiadicarbocyanine 

iodide  (DiSC35, Sigma‐Aldrich, St.  Louis, MO, USA).  In  short, Bacillus megaterium ATCC 13632 

was grown  in half‐concentrated MH  to an OD600 of 0.5 and subsequently  incubated  for 5 min 

with  3  µM  DiSC35.  Samples  were  then  treated  with  3.3  µg/ml  nisin  or  25  µg/ml  MP196, 

respectively,  or  left  untreated  as  control.  Fluorescence  was  measured  continuously  for  5 

minutes at 651 nm excitation and 675 nm emission wavelength using a Shimadzu RF‐5301PC 

Spectrofluorometer (Shimaduzu, Duisburg, Germany). 

Determination of cellular ATP levels 

B. subtilis 168 was grown in BMM until reaching an OD500 of 0.35 and subsequently exposed to 

22.5 µg/ml MP196, 0.75 µg/ml nisin, 10 µg/ml valinomycin, 1 µg/ml gramicidin S, and 0.5 µg/ml 

erythromycin  (negative  control)  for  15  minutes  or  left  untreated.  After  stress,  cells  were 

harvested  by  centrifugation,  resuspended  in  500  µl  10 mM  Tris,  pH  7.5,  and  disrupted  by 

ultrasonication. ATP determination was performed using  the Perkin Elmer ATPlite 1step assay 

kit  (Waltham,  MA,  USA)  following  the  manufacturer's  instructions.  ATP  standards  were 

prepared from 1 x 10‐7 to 8.5 x 10‐7 mol ATP in the provided buffer. For determination of cellular 

ATP  levels  100 µl  of  cytosolic  cell  extracts were  used. All measurements were  performed  in 

quintuple  biological  and  double  technical  replicates  using  the  Tecan  Infinite®  200  PRO 

multimode reader (Tecan, Männedorf, Switzerland). 

Preparation of inverted vesicles from M. flavus 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

95

 

Inverted  vesicles  were  prepared  from  M.  flavus  according  to  Burstein  et  al.26  with  some 

modifications. Briefly, cells were grown in tryptic soy broth until exponential growth phase. 1 L 

of culture was harvested and washed with 100 mL Tris buffer (50 mM Tris‐HCl, 2 mM MgCl2, 0.5 

mM dithiothreitol, 0.5 mM EDTA, pH 8.0). The cell pellet was resuspended  in 5 mL Tris buffer, 

followed by pH readjustment to 8.0 and addition of each 10 µg/ml DNase and RNase. Cells were 

disrupted  mechanically  in  a  Precellys  24  homogenizer  using  0.1  mm  glass  beads  (Bertin 

Technologies,  Montigny‐le‐Bretonneux,  France).  The  crude  homogenate  was  centrifuged  at 

30,000 x g for 20 minutes. The resulting supernatant was subsequently centrifuged at 175,000 x 

g  for 120 minutes. The resulting vesicle‐containing pellet was resuspended  in 2 mL Tris buffer 

supplemented with 10% glycerol and stored in liquid nitrogen until usage. 

H+‐ATPase inhibition 

Proton uptake into inverted M. flavus vesicles was measured in a microtiter plate assay in a final 

volume of 200 µL based on the pH‐sensitive probe acridine orange as described by Palmgren et 

al.27. The  reaction mixture  (20 µM acridine orange, 4 mM MgCl2, 10 mM MOPS‐BTP  (pH 7.0), 

140 mM  KCI,  1 mM  EDTA,  1 mM  DTT,  1 mg/ml  BSA  (essentially  fatty  acid  free),  2.5  µg/ml 

valinomycin, 75 µg/ml vesicle protein) was preincubated with 20 µM MP196, 20 µM nisin, 20 

µM  lactoferrin or  left untreated as control, respectively, at 25 °C for 30 minutes. The reaction 

was  initiated by  addition of 2mM ATP‐BTP  and  absorbance was measured  at  495 nm  for 6h 

using a SunriseTM multichannel plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland). 

INT reduction assay 

Antibiotic  influence on  the bacterial electron  transport  chain was monitored by  reduction of 

iodonitrotetarzolium chloride (INT) using M. flavus inverted vesicles as described by Smith and 

McFeters28. 20 µg of vesicle protein were preincubated for 30 minutes in pure phosphate buffer 

(10 mM  potassium  phosphate,  5 mM magnesium  acetate,  pH  6.5)  or  buffer with  40  µM  of 

MP196, 40 µM nisin, 100 µM antimycin A, or 5 mM rotenone, respectively. Subsequently, 1 mM 

INT  and  0.6 mM NADH  or  10 mM  succinate were  added  as  substrate  and  the  solution was 

incubated  for 1 hour at 25  °C  in  the dark.  INT  reduction was stopped by addition of 5% TCA. 

Insoluble  formazan was pelleted  for 5 minutes at 13,000xg, extracted with 1 mL ethanol and 

centrifuged again to remove  insoluble particles. Absorbance of the supernatant was measured 

at 485 nm. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

96

 

Amino acid analysis (AAA) 

B. subtilis 168, JH642, and   SMB8029 were grown  in BMM until an OD500 of 0.35, harvested by 

centrifugation (3,220 x g, 10 minutes, 37 °C), and washed three times in pre‐warmed AAA buffer 

(10.2 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 25.8 mM KCl, 4.3 mM NaCl). Cells were then resuspended 

in AAA buffer,  readjusted  to an OD500 of 0.35, and stressed with 22.5 µg/ml MP196, 1 µg/mL 

gramicidin  S, 0.75 µg/mL nisin, or 10 µg/mL  valinomycin  for 15 minutes or  left untreated  as 

control,  respectively. Hypoosmotic stress was set by  resuspending  the cells  in double distilled 

water, hyperosmotic stress by resuspending  in AAA buffer containing 6% NaCl, followed by 15 

minutes incubation at 37 °C. Subsequently, cells were harvested by centrifugation (16,100xg, 10 

minutes, 4 °C). The supernatant was kept for measurement of amino acid leakage whereas the 

cells were washed three times in AAA buffer (16,100 x g, 10 minutes, 4 °C), resuspended in the 

same buffer and disrupted by ultrasonication as described above. In order to analyze only free 

amino acids, proteins were precipitated with acetone in both intra‐ and extracellular fractions. 

Therefore, 100 µl of  cell extract and 200 µl of  culture  supernatant,  respectively, were mixed 

with  the  five‐fold  volume  of  ice‐cold  80%  acetone  and  incubated  over  night  at  ‐20  °C. 

Precipitated proteins were pelleted (16,100 x g, 20 minutes, 4 °C) and the resulting, protein‐free 

supernatant was used for HPLC. 500 µl of the protein‐free cell extract and 1 ml of protein‐free 

culture  supernatant  samples,  respectively,  were  dried  completely  in  AAA  glass  tubes  and 

subsequently dissolved  in 10 µl of 20 mM HCl. Amino acid analysis was performed using  the 

Acquity HPLC and AccQ•Tag Ultra system  (Waters GmbH, Milford, MA, USA) according  to  the 

manufacturer's  instructions.  In  short,  10  µl  AccQTag  reagent  and  30  µl  internal  norvalin 

standard  (final concentration 10 pmol/µl) was added  to  the  samples  for derivatization. Those 

samples were  then  incubated  for  10 minutes  to  allow  conversion  of  primary  and  secondary 

amines into stabile derivatives. Amino acid derivatives were separated using an AccQ•Tag Ultra 

RP column and detected by an Acquity UPLC‐TUV detector (Waters GmbH, Eschborn, Germany). 

Amino acids were quantified using 10 pmol/µl amino acid  standards.  Intracellular amino acid 

concentrations were calculated based on the B. subtilis cellular volume as described above. 

Glutamate uptake and efflux 

Glutamate uptake and efflux was performed as described previously30.  In short, S. simulans 22 

was cultured at 37  °C  to an OD600 of 0.3 and subsequently pre‐incubated  for 15 minutes with 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

97

 

100  µg/ml  chloramphenicol  to  prevent  glutamate  incorporation  into  proteins.  Afterwards, 

radioactively  labeled  [3H]‐L‐glutamate was added  to a  final concentration of 1 μCi/ml and  the 

culture was immediately subdivided. To determine [3H]‐glutamate uptake, aliquots were treated 

with 5 µg/ml MP196 or 5 µg/ml nisin, respectively or left untreated as control. After 30 minutes 

of  incubation,  the  control  was  further  subdivided  into  aliquots.  To  determine  efflux  of 

previously  ingested  [3H]‐glutamate, such aliquots were then treated with 5 µg/ml MP196 or 5 

µg/ml nisin, respectively or left untreated as control. 

Samples of 100  μl were  collected  every  10 minutes,  filtered  through  cellulose  acetate  filters 

(pore size 0.2 μm; Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and washed twice with 5 ml potassium 

phosphate buffer  (200 mM potassium phosphate, 100 µM non‐radioactive glutamate, pH 7.0) 

Filters  were  dried,  transferred  to  counting  vials  and  filled  with  5  ml  of  scintillation  fluid 

(Filtersafe, Zinsser, Frankfurt, Germany). Radioactivity was measured in a 1900CA beta‐counter 

(Packard/Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). 

Minimal inhibitory concentration (MIC) dependence on glutamate and salt concentration 

MIC determination of MP196 under different glutamate and salt concentrations was performed 

in a microtiter plate assay  in modified BMM containing  rising concentrations of glutamate  (0, 

4.5, 45, 450, 3000 mM), NaCl (0, 10, 100, 500, 1000 mM), or KCl (0, 100, 500 mM, cells did not 

survive 1000 mM KCl). BMM without glutamate was additionally  supplemented with 4.5 mM 

ammonium  nitrate  as  alternative  nitrogen  source.    200  µl  of medium were  inoculated with 

5x105 cells/mL of B.  subtilis 168 and  incubated with different antibiotic concentrations  for 18 

hours  at 37  °C.  The MIC was defined  as  the  lowest  antibiotic  concentration  inhibiting  visible 

growth.   

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

98

 

ii) Supplementary Tables  

Supplementary Table 1: Marker proteins induced in the cytosolic proteome 

protein ID  protein function  functional category  regulator 

SpoVG  negative effector of asymetric septation at the onset of sporulation  sporulation  σH Spo0M sporulation‐control gene sporulation σW/σH

YdaG  general stress protein general stress σB

YtxH  general stress protein  general stress  σB/σH Dps  DNA‐protecting protein, ferritin  general stress  σB ClpP  ATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit general stress σB

YdbD  manganese‐containing catalase  oxidative stress  unknown AzoR2  azoreductase  oxidative stress  σG YceC  similar to tellurium resistance protein  cell envelope stress  σB/σW/σM YceH  similar to toxic anion resistance protein cell envelope stress σB/σW/σM

YthP  similar to ABC transporter  cell envelope stress  σW YfhM  similar to epoxide hydrolase  cell envelope stress  σB/σW FosB  bacillithiol‐S‐transferase cell envelope stress σW

YtrE  similar to ABC transporter  cell envelope stress  YtrA LiaH  modulator of LiaIHGFSR operon expression  cell wall  LiaRS DltA  D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase  cell wall  σD/σX/σM RacX  amino acid racemase cell wall σW

PspA  phage shock protein A homolog  membrane  σW YjdA  similar to 3‐ketoacyl‐acyl‐carrier protein reductase  membrane  σE YoxD  similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane unknownYuaI  involved in reducing membrane fluidity  membrane  σW NadE  NAD synthetase  energy  σB BglH  phospho‐beta‐glucosidase  energy  CcpA CitZ  citrate synthase  energy CcpAYwrO  similar to NAD(P)H oxidoreductase  energy  unknown IolS  also/keto reductase  energy  IolR YhdN  aldo/keto reductase specific for NADPH energy σB

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

99

 

protein ID  protein function  functional category  regulator 

NfrA  FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase  energy  Spx RocA  3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase amino acids RocRTrmB  tRNA (m7G46) methyltransferase  tRNA modification  unknown RpsB  ribosomal protein S2  translation  unknown YvlB  unknown  unknown unknown

 

 

Supplementary Table 2: MALDI‐ToF‐MS data of identified cytosolic marker proteins (2D gel‐based approach) 

protein ID 

protein name  mass weight 

pI  peptide count 

protein score 

protein score C.I. % 

AzoR2  azoreductase  23257  5.26    7 117 100  BglH  phospho‐beta‐glucosidase  53255  5.13    13 287 100  CitZ  citrate synthase  41702  5.55    16 444 100  ClpP  ATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit  21668  5.19    12 353 100  DltA  D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase  55773  5.10    13 276 100  Dps  DNA‐protecting protein, ferritin  16583  4.64    8 168 100  FosB  bacillithiol‐S‐transferase 17161 6.14 4 754 * ‐  IolS  aldo/keto reductase  35146  5.50    16 280 100  LiaH  modulator of LiaIHGFSR operon expression  25682  6.20    13 112 100  NadE  NAD synthetase  30376  5.07    16 459 100  NfrA  FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase  28302  5.73    20 9602 * ‐  PspA  phage shock protein A  25125  5.87    11 91 100  RacX  amino acid racemase  25270  5.46    3 73 100  RocX  3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase 56284 5.58 52 12601 * ‐  RpsB  ribosomal protein S2  27950  6.27    16 279 100  Spo0M  sporulation‐control gene  29714  4.26    63 25783 * ‐  SpoVG  negative effector of sporulation 10886 5.25 10 348 100  TrmB  tRNA (guanine‐N(7)‐)‐methyltransferase  24488  6.32    7 53 98  

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

100

 

protein ID 

protein name  mass weight 

pI  peptide count 

  protein score 

  protein score C.I. % 

 

YceC  similar to tellurium resistance protein 21810 5.46 14 224 100  YceH  unknown  41646  5.90    13 263 100  YdaG  general stress protein  15867  5.33    5 100 100  YdbD  manganese‐containing catalase 30238 5.06 10 103 100  YfhM  similar to epoxide hydrolase  32737  6.07    20 7499 * ‐  YhdN  aldo/keto reductase specific for NADPH  37289  4.96    10 132 100  YjdA  similar to 3‐ketoacyl‐ acyl‐carrier protein reductase  27432  5.74    5 55 99  YoxD  similar to 3‐oxoacyl‐ acyl‐carrier protein reductase 25283 5.48 20 434 100  YqiG  similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase  40780  5.34    19 325 100  YthP  similar to ABC transporter  26490  5.39    5 195 100  YtrE  similar to ABC transporter 25444 5.99 11 241 100  YtxH  general stress protein  16675  5.30    5 131 100  YuaI  involved in reducing membrane fluidity  19830  5.31    7 167 100  YvlB  unknown  41056  5.50    15 121 100  YwrO  similar to NAD(P)H oxidoreductase 19942 5.33 7 166 100   

* Identification was carried out using a Synapt G2S HDMS mass spectrometer (see supplementary methods)   

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

101

 

Supplementary Table 3: Marker proteins induced in the membrane proteome 

ID  protein function  pathway  category  repressor  activator 

PtkA  protein tyrosine kinase involved in biofilm formation  antibiotic stress  stress response  AbrB   

YaaN  similar to toxic cation resistance protein  detoxication  stress response     σW 

YfhM  similar to epoxide hydrolase  detoxication, sigma b dependent, phosphate starvation 

stress response σW/σ

B

RsbW  anti‐sigma factor  general stress response sigma b stress response σB

PcrA  ATP‐dependent DNA helicase  mismatch repair, nucleotide excision repair  stress response  LexA   

ClpX  ATP‐dependent Clp protease ATP‐binding subunit  heat shock  stress response  CtsR   

HslU  ATP‐dependent protease ATP‐binding subunit  heat shock  stress response  CodY   

DnaK  class I heat‐shock protein  heat shock stress response HrcA

LonA  class III heat‐shock ATP‐dependent Lon protease heat shock stress response CtsR

YciC  putative metallochaperone with NTPase activity/probably part of a low‐affinity pathway of zinc transport 

chaperone/zinc transport  stress response Zur

EngD  GTP‐dependent nucleic acid‐binding protein  competence  stress response     ComK 

NucA  endonuclease  competence  stress response     ComK 

DegS  two‐component sensor histidine kinase  competence  stress response      

KinD  two‐component sensor histidine kinase  sporulation  stress response      

SpoIVA required for proper spore cortex formation and coat assembly sporulation stress response σE

YlbC  unknown  sporulation  stress response      

McsB  protein arginine kinase  protein modification  stress response      

SrfAA  surfactin synthetase  antibiotic production  stress response  Abh, CodY, Spx 

ComA, PerR 

SrfAB  surfactin synthetase  antibiotic production  stress response  Abh, CodY, Spx 

ComA, PerR 

SrfAC  surfactin synthetase  antibiotic production  stress response  Abh, CodY, Spx 

ComA, PerR 

YsdB  unknown control of SigW activity, survival of heat stress 

cell envelope σB/σ

W

YacL  unknown survival of salt and ethanol stresses cell envelope σB/σ

M

YpuA  unknown unknown cell envelope σM

YobJ  unknown  unknown  cell envelope     σW 

YteJ  unknown unknown cell envelope σW

BioD  dethiobiotin synthetase  biotin metabolism  membrane  BirA   

BioI  cytochrome P450 enzyme  biotin metabolism, detoxication  membrane  BirA   

AcpA  acyl carrier protein  fatty acid biosynthesis  membrane  FapR   

FabG  beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein reductase fatty acid biosynthesis  membrane FapR

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

102

 

ID  protein function  pathway category repressor activator

PlsX  involved in fatty acid/phospholipid synthesis  fatty acid biosynthesis  membrane  FapR   

YhfT  similar to long‐chain fatty‐acid‐CoA ligase fatty acid biosynthesis  membrane

FadE  acyl‐CoA dehydrogenase  fatty acid biosynthesis  membrane CcpA, FadE SdpR

GlpD  glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase glycerophospholipid metabolism membrane CcpA AbrB, GlpP

FloT  similar to flotillin 1, orchestration of physiological processes in lipid microdomains 

control of membrane fluidity  membrane      

DynA  dynamin‐like protein  membrane fusion  membrane       

DltB  D‐alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid/D‐alanyl transfer from Dcp to undecaprenol‐phosphate 

lipoteichoic acid biosynthesis  cell wall  Spo0A, stringent response 

σM/σ

X/σ

D, 

YvrHb 

DltD  D‐alanine transfer from undecaprenol‐phosphate to the poly(glycerophosphate) chain of LTA 

lipoteichoic acid biosynthesis  cell wall Spo0A, stringent response 

σM/σ

X/σ

D, 

YvrHb 

Ddl  D‐alanyl‐D‐alanine ligase A  peptidoglycan biosynthesis  cell wall     σM 

MreB  cell shape‐determining protein  peptidoglycan biosynthesis  cell wall σM

Mbl  MreB‐like protein  peptidoglycan biosynthesis  cell wall  stringent response 

σE 

MurAB  UDP‐N‐acetylglucosamine 1‐carboxyvinyltransferase  peptidoglycan biosynthesis  cell wall      

MurAA UDP‐N‐acetylglucosamine 1‐carboxyvinyltransferase peptidoglycan biosynthesis  cell wall

MurG  UDP‐N‐acetylglucosamine‐N‐acetylmuramyl‐(pentapeptide)pyrophosphoryl‐undecaprenol N‐acetylglucosamine transferase 

peptidoglycan biosynthesis  cell wall

LytA  involved in the secretion of major autolysin LytC (amidase) lysis and remodeling of peptidoglycan cell wall SlrR σD, YvrHb

YycH  negative effector of WalK  control of cell wall metabolism cell wall

GdpP  cyclic di‐AMP phosphodiesterase  cell wall homeostasis  cell wall      

YbbP  maybe involved in the synthesis of c‐di‐AMP in vegetative cells  cell wall homeostasis  cell wall       

FtsA  membrane anchor of FtsZ  septum formation  cell division     σH, WalR 

YydI  ABC transporter (ATP‐binding protein) antibiotic transport system  transporter AbrB, Rok

YybJ  similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) antibiotic transport system, iorganic ion transport 

transporter

YdbJ  similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) antibiotic transport system, multidrug transporter 

transporter

YutK  similar to Na+/nucleoside cotransporter concentrative nucleoside transporter transporter

OpuAA glycine betaine ABC transporter  osmoprotectant transport system, choline transport 

transporter

OpuCC  glycine betaine/carnitine/choline ABC transporter  osmoprotectant transport system, choline transport 

transporter      

OpuBA  choline ABC transporter (ATP‐binding protein)  osmoprotectant transport system, choline transport 

transporter      

DppE  dipeptide ABC transporter  peptide transport  transporter  CodY   

OppD  oligopeptide ABC transporter (ATP‐binding protein)  peptide transport  transporter  ScoC  TnrA 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

103

 

ID  protein function  pathway category repressor activator

SufC  similar to ABC transporter, iron metabolism (ATP‐binding protein)  transport  transporter      

ThiV  putative HMP/thiamine permease amino acid/sugar metabolism transporter Thi‐box Thi‐box

YlaG  GTPase signal transduction protein secretion stringent response 

SecA  translocase binding subunit  protein secretion protein secretion

AtpC  ATP synthase  oxidative phosphorylation  energy metabolism  stringent response 

 

QoxC  cytochrome aa3 quinol oxidase (subunit III)  oxidative phosphorylation  energy metabolism  stringent response 

 

HemL  glutamate‐1‐semialdehyde 2,1‐aminotransferase  porphyrin biosynthesis  energy metabolism  PerR   

SufB  synthesis of Fe‐S‐clusters  iron metabolism  energy metabolism      

ResE  two‐component sensor histidine kinase  regulation of electron transport  energy metabolism  CcpA  PhoP, ResD 

NadA  quinolinate synthetase  nicotineamide and nicotinate metabolism energy metabolism NadR

NadB  L‐aspartate oxidase  nicotineamide and nicotinate metabolism energy metabolism NadR

NadF  probable inorganic polyphosphate/ATP‐NAD kinase 2 nicotineamide and nicotinate metabolism energy metabolism

PncB  nicotinate phosphoribosyltransferase  nicotineamide and nicotinate metabolism  energy metabolism      

ThiC  biosynthesis of the pyrimidine moiety of thiamin  amino acid/sugar metabolism  energy metabolism  Thi‐box  Thi‐box 

SucC  succinyl‐CoA synthetase (beta subunit)  TCA cycle  energy metabolism  CcpA   

CitB  aconitate hydratase  TCA cycle  energy metabolism  CcpC, CodY, FrsA 

 

Icd  isocitrate dehydrogenase  TCA cycle energy metabolism CcpA, CcpC

PycA  pyruvate carboxylase  TCA cycle energy metabolism stringent response 

AckA  acetate kinase  pyruvate metabolism  energy metabolism CcpA, CodY

Tkt  transketolase  glycolysis energy metabolism Spo0A

Pgk  phosphoglycerate kinase  glycolysis  energy metabolism  CggR   

Pyk  pyruvate kinase  glycolysis  energy metabolism      

GapA  glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase  glycolysis  energy metabolism  CggR   

Tal  putative transaldolase  pentose phosphate pathway  energy metabolism

PtsI  phosphotransferase system (PTS) enzyme I PTS energy metabolism stringent response 

GlcT

FrlB  similar to glutamine‐fructose‐6‐phosphate transaminase carbohydrate & nitrogen metabolism energy metabolism CodY, FlrR

FrlO  similar to multiple sugar‐binding protein carbohydrate & nitrogen metabolism energy metabolism CodY, FrlR

YoaC  similar to xylulokinase  carbohydrate metabolism  energy metabolism  S‐box  S‐box 

BdhA  acetoin reductase/2,3‐butanediol dehydrogenase  carbohydrate metabolism  energy metabolism     AbrB 

YqfL  modulator of CcpN activity  carbohydrate metabolism  energy metabolism      

GndA  NADP‐dependent phosphogluconate dehydrogenase  carbohydrate metabolism  energy metabolism      

LutB  lactate catabolic enzyme  carbohydrate metabolism  energy metabolism LutR

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

104

 

ID  protein function  pathway category repressor activator

           

YitJ  probable 5,10‐methylenetetrahydrofolate reductase (NADP) unknown energy metabolism S‐box S‐box

PurA  adenylosuccinate synthetase  purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

PurB  adenylosuccinate lyase  purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

PurC  phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase  purine  nucleotide synthesis  PurR, G‐box  G‐box 

PurD  phosphoribosylglycinamide synthetase  purine  nucleotide synthesis  PurR, G‐box  G‐box 

PurF  glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase  purine  nucleotide synthesis  PurR, G‐box  G‐box 

PurH  phosphoribosylaminoimidazole carboxy formyl formyltransferase and inosine‐monophosphate cyclohydrolase 

purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

PurK  phosphoribosylaminoimidazole carboxylase II purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

PurL  phosphoribosylformylglycinamidine synthetase II purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

Xpt  xanthine phosphoribosyltransferase purine nucleotide synthesis PurR, G‐box G‐box

MtnN  methylthioadenosine/S‐adenosylhomocysteine nucleosidase  purine  nucleotide synthesis  Spx  CymR 

PyrAB  carbamoyl‐phosphate synthetase  pyrimidine  nucleotide synthesis     PyrR 

PyrE  orotate phosphoribosyltransferase  pyrimidine  nucleotide synthesis     PyrR 

PyrH  uridylate kinase  pyrimidine nucleotide synthesis PyrR

PyrR  transcriptional attenuator and uracil phosphoribosyltransferase activity pyrimidine nucleotide synthesis PyrR

CarA  carbamoyl‐phosphate transferase‐arginine Ala, Asp, Glu amino acids AhrC

CarB  carbamoyl‐phosphate transferase‐arginine  Ala, Asp, Glu  amino acids     AhrC 

GltA  glutamate synthase (large subunit)  Ala, Asp, Glu  amino acids  GltC  FsrA, TnrA 

AsnB  asparagine synthetase  Ala, Asp, Glu  amino acids      

GudB  glutamate dehydrogenase  Ala, Asp, Glu, Arg, Pro  amino acids      

ArgH  argininosuccinate lyase  Ala, Asp, Glu, Arg, Pro  amino acids AhrC

ArgJ  ornithine acetyltransferase and amino‐acid acetyltransferase Ala, Asp, Glu, Arg, Pro  amino acids AhrC

YhdR  similar to aspartate aminotransferase Ala, Asp, Glu, Arg, Pro, Cys, Met, Phe, Tyr, Trp 

amino acids

AlaT  alanine transaminase  Arg, Pro, Lys  amino acids      

MetC  similar to cystathionine beta‐lyase  Cys, Met  amino acids  S‐box  S‐box 

MetE  cobalamin‐independent methionine synthase  Cys, Met  amino acids  S‐box  S‐box 

MetK  S‐adenosylmethionine synthetase  Met, SAM  amino acids  S‐box  S‐box 

MtnK  methylthioribose kinase  Cys, Met amino acids S‐box S‐box

YxjG  putative methionine synthase  met amino acids S‐box S‐box

CysJ  similar to sulfite reductase  sulfur metabolism amino acids CysL

Sat  sulfate adenylyltransferase  sulfur metabolism  amino acids  S‐box  S‐box 

ThiO  glycine oxidase  Gly, Ala, Val, Pro  amino acids  Thi‐box  Thi‐box 

HisA  phosphoribosylformimino‐5‐aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase  His  amino acids  T‐box  T‐box 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

105

 

ID  protein function  pathway category repressor activator

LysC  aspartokinase II alpha subunit (aa 1‐408) and beta subunit (aa 246‐408)  Lys, Cys, Met, Gly, Ser, Thr  amino acids      

AroA  3‐deoxy‐D‐arabino‐heptulosonate 7‐phosphate synthase and chorismate mutase‐isozyme 3 

Phe, Tyr, Trp amino acids

AroB  3‐dehydroquinate synthase  Phe, Tyr, Trp amino acids

AroE  5‐enolpyruvoylshikimate‐3‐phosphate synthase Phe, Tyr, Trp amino acids

AroF  chorismate synthase  Phe, Tyr, Trp  amino acids      

ProA  gamma‐glutamyl phosphate reductase  Arg, Pro  amino acids  T‐box  T‐box 

LeuA  2‐isopropylmalate synthase  Val, Leu, Ile  amino acids  T‐box, CodY, CcpA, TnrA 

T‐box 

LeuC  3‐isopropylmalate dehydratase (large subunit)  Val, Leu, Ile  amino acids  T‐box, CodY, CcpA, TnrA 

T‐box 

LeuD  3‐isopropylmalate dehydratase (small subunit)  Val, Leu, Ile  amino acids  T‐box, CodY, CcpA, TnrA 

T‐box 

IlvB  acetolactate synthase catalytic subunit  Val, Leu, Ile  amino acids  T‐box, CodY, CcpA, TnrA 

T‐box 

IlvD  dihydroxy‐acid dehydratase  Val, Leu, Ile  amino acids  T‐box, CodY, CcpA, TnrA 

T‐box 

YwaA  similar to branched‐chain amino acid aminotransferase Val, Leu, Ile amino acids

RelA  ppGpp hydrolase/synthase  stringent response, amino acid starvation amino acids

YdbR  similar to ATP‐dependent RNA helicase transcription regulation  transcription

GlpP  transcription antiterminator  transcription regulation  transcription     GlpP 

Rho  transcriptional terminator Rho  transcription regulation  transcription       

TufA  elongation factor TU  elongation  translation  stringent response 

 

FusA  elongation factor G  elongation  translation  stringent response 

 

RplA  ribosomal protein L1  ribosomal proteins  translation  stringent response 

 

YydA  similar to pseudouridine methyltransferase  rRNA maturation  translation  DnaA   

YmcB  tRNA methylthiotransferase  tRNA maturation translation

ProS  prolyl‐tRNA synthetase  tRNA synthetase (Pro)  translation

ThrS  threonyl‐tRNA synthetase  tRNA synthetase (Thr)  translation T‐box T‐box

ThrZ  threonyl‐tRNA synthetase  tRNA synthetase (Thr)  translation  T‐box  T‐box 

LysS  lysyl‐tRNA synthetase  tRNA synthetase (Lys)  translation      

HisS  histidyl‐tRNA synthetase  tRNA synthetase (His)  translation  T‐box  T‐box 

GatA  glutamyl‐tRNA(Gln) amidotransferase tRNA transferase (Glu)  translation

GatB  glutamyl‐tRNA(Gln) amidotransferase tRNA transferase (Glu)  translation

YebA  probable membrane protein  unknown unknown

YfhO  putative membrane protein  unknown  unknown      

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

106

 

ID  protein function  pathway  category  repressor  activator 

YddK  unknown  unknown  unknown      

YgaO  unknown  unknown  unknown      

YydB  unknown unknown unknown

YufK  unknown unknown unknown

YjcH  unknown unknown unknown

YjjA  unknown  unknown  unknown     

YjlC  unknown  unknown  unknown     

YqeG  unknown  unknown  unknown       

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

107

 

Supplementary  Table  4:  ESI‐MS  data  of  the  marker  proteins  identified  in  the  membrane 

proteome  

control (replicate 1) control (replicate 2) MP196 (replicate 1) MP196 (replicate 2)

protein ID ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides

O05249|yufK 1.71 0 2 2.21 0.15 2

O06491|gatA 1.4 0.14 4 14.35 8.69 9 10.78 14.49 4

O06745|yitJ 0.52 0.03 2 0.55 0.03 7 4.4 0.54 12 9.53 1.23 9

O07021|yvfW 1.71 0.18 2 10.03 1.31 5 16.02 5.6 4

O07587|yhdR 25.25 8.15 5 52.68 71.85 2

O07619|yhfT 23.06 2.96 2 38.66 12.71 4

O07631|typA 1.3 0.13 4 6.73 0.48 8 18.58 2.12 4

O30509|gatB 1.54 0.32 3 16.72 9.55 4 40.15 27.31 3

O31581|yfhM 21.9 1.78 3 30.97 2.39 2

O31582|yfhO 1.39 0.07 3 3.67 0.34 5 4.77 0.5 3

O31630|yjcH 5.66 0.59 3 5.2 0.97 3

O31632|yjcJ 10.16 1.13 2 24.1 26.22 2

O31663|mtnK 1.33 0.08 4 1.41 0.07 7 18.27 1.81 12 53.31 6.45 6

O31671|kinD 2.4 0.49 4 3.07 0.45 2

O31749|pyrH 0.82 0.03 2 0.93 0.04 2 8.06 1 5 12.27 0.4 2

O31755|proS 9.17 9.34 3 39.81 30.51 2

O31778|ymcB 27.39 20.03 3 68.55 4.23 2

O32028|mtnN 1.64 0.12 2 16.5 12.38 3 39.83 9.41 2

O32039|hisS 1.13 0.03 4 6.51 0.28 4 11.98 1.95 2

O32076|yuaG 1.4 0.16 15 1.41 0.09 13 13.26 1.29 28 13.47 1.56 18

O32090|yueK 3.13 0.32 4 5.68 0.81 5

O32115|yutK 0.7 0.05 2 1.31 0.01 2 1.73 0.36 6

O32156|yurO 0.79 0.07 2 2.45 0.2 8 4.33 0.06 3

O32157|yurP 0.81 0.1 3 19.31 9.97 4 45.29 4.68 2

O32162|yurU 1.19 0.08 2 23.31 1.96 6 62.73 3.09 3

O32176|yusJ 18.81 12.36 2 24.44 14.4 2

O32213|yvgQ 16.21 6.06 4 24.38 2.68 3

O32243|opuCC 1.27 0.07 6 2.93 0.05 3 3.54 0.07 3

O34394|yjjA 17.96 0.17 2 29.44 5.56 2

O34424|yteJ 3.7 0.46 2 4.06 0.55 4

O34580|pcrA 1.24 0.09 2 1.28 0.29 5 7.69 1.42 3 31.05 4.62 2

O34586|ylbC 2.18 0.31 2 2.63 0.35 3

O34633|yjlC 1.68 0.06 2 2.76 0.04 2

O34738|ykoE 1.34 0.12 4 1.8 0.13 2

O34764|sat 2.46 2.48 2 12.92 2.1 3

O34774|yobJ 0.81 0.12 4 0.86 0.1 7 5.78 0.47 7 6.44 0.79 5

O34788|ydjL 1.29 0.05 2 3.74 0.23 6 11.06 0.58 4

O34858|argH 7.99 0.94 4 28.52 5.81 4

O34861|yoaC 4.69 0.26 6 6.4 5.3 3

O34934|ppnK2 21.31 2.49 2 24.87 0.89 2

O35006|hisA 5.9 0.71 4 10.07 0.74 3

O54408|relA 1.02 0.06 9 4.64 0.53 8 12.12 1.05 3

P00497|purF 1.31 0.14 3 10.58 2.1 4 24.59 1.07 2

P08495|lysC 2.18 1.13 2 18.32 5.18 4 87.52 8.66 2

P08838|ptsI 0.97 0.09 7 2.45 0.1 4 10.28 0.93 5

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

108

 

control (replicate 1) control (replicate 2) MP196 (replicate 1) MP196 (replicate 2)

protein ID ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides

P09339|citB 0.79 0.19 3 3.36 0.63 3 7.72 1.22 9

P09124|gapA 1.28 0.12 7 1.21 0.09 6 31.91 5.15 5 71.4 40.82 6

P12039|purD 1.4 0.1 4 1.7 0.04 2 19.18 5.95 4 30.92 2.22 8

P12042|purL 1.29 0.05 3 1.27 0.02 8 26.81 2.12 11 40.4 1.84 9

P12045|purK 7.39 1.57 6 11.22 0.81 3

P12046|purC 1.62 0.13 2 1.38 0.26 3 20.33 9.8 7 43.25 8.5 3

P12047|purB 1.07 0.09 3 5.86 0.11 6 14.41 3.35 7

P12048|purH 1.82 0.25 3 1.59 0.16 5 20.81 4.22 6 73.17 48.09 5

P12667|nucA 0.72 0.06 3 1.11 0.41 2

P13799|degS 1.11 0.04 2 11.66 0.92 6 18.85 1.21 3

P17820|dnaK 1.7 0.04 7 40.41 4.5 6 58.99 31.1 10

P17904|rsbW 20.96 4.87 2 40.23 1.16 2

P18185|carB 1.28 0.18 2 1.19 0.04 4 9.55 0.88 5 28.6 3.26 10

P18255|thrS 0.66 0.11 6 4.11 0.26 9 21.44 9.09 7

P18256|thrZ 0.91 0.03 7 10.98 1.1 7 24.32 3.32 7

P19669|tal 1.06 0.29 2 2.07 0.17 4 4.28 0.28 3

P19670|murAB 18.25 2.28 2 14.27 18.88 2

P20691|aroE 28.16 2.08 4 35.76 38.25 2

P24136|oppD 3.15 0.33 2 4.01 0.06 3

P25972|pyrE 1.09 0.19 2 9.46 0.82 2 11.65 1.12 2

P25994|pyrAB 0.66 0.03 10 3.28 0.41 13 7.01 0.57 17

P26906|dppE 0.78 0.03 3 4.83 0.01 2 5.38 0.75 4

P27206|srfAA 0.37 0.07 12 0.38 0.05 31 1.99 0.49 37 3.86 0.98 37

P28264|ftsA 10.64 1.52 2 15.15 0.48 2

P28366|secA 1.07 0.11 6 1.04 0.04 17 10.56 0.89 18 16.05 0.77 15

P29726|purA 0.84 0.09 6 0.92 0.12 4 6.25 1.57 13 8.39 2.31 9

P30300|glpP 3.25 0.15 2 4.66 1.19 2

P30949|hemL 7.88 0.33 5 8.33 5.49 4

P31102|aroB 1.7 0.12 4 1.81 0.23 7 20.1 8.99 8 92.54 21.03 2

P31104|aroF 2.12 0.11 2 16.64 0.7 3 45.26 42.15 2

P31847|ypuA 0.86 0.1 4 8.65 1.54 3 10.55 1.32 2

P33166|tuf 1.33 0.06 11 1.35 0.07 12 14.29 2.68 14 32.7 20.2 11

P34958|qoxC 0.72 0.2 5 1.95 0.13 4 2.14 0.05 2

P35149|spoIVA 1.77 0.11 2 0.87 0.13 3

P35164|resE 0.86 0.06 4 2.86 0.66 7 4.04 1.09 5

P36838|carA 1.12 0 2 4.93 0.34 5 13.23 3.95 6

P36843|argJ 61.37 6.39 2 118.98 14.3 2

P37484|yybT 0.96 0.08 2 2.53 0.26 5 3.3 0.29 6

P37494|yybJ 0.67 0.02 4 3.32 0.18 4 3.42 1.04 2

P37518|engD 3.22 0.29 4 13.05 5.67 6 21.23 13.14 4

P37535|yaaN 1.29 0.04 2 19.02 3 6 30.73 9.04 4

P37570|yacI 7.15 0.55 2 12.29 2.4 2

P37585|murG 0.8 0.05 4 4.98 1.05 2 8.78 1.66 2

P37812|atpC 2.78 0.07 2 2.85 0.26 3

P37877|ackA 65.81 37.52 4 102.55 95.95 3

P37945|lonA 0.92 0.16 2 0.97 0.07 7 5.21 0.35 8 12.03 1.84 6

P38032|nadB 6.57 2.71 6 14.48 1.14 6

P39580|dltB 0.7 0.01 2 4.48 0.19 3 5.36 0.04 2

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

109

 

control (replicate 1) control (replicate 2) MP196 (replicate 1) MP196 (replicate 2)

protein ID ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides

P39126|icd 1.06 0.27 6 1.14 0.16 7 5.38 0.34 10 10.55 1.91 12

P39578|dltD 1.03 0.08 4 4.79 0.24 7 5.42 0.85 5

P39765|pyrR 1.38 0.11 3 1.24 0.3 2 9.22 4.19 5 16.67 1.31 2

P39778|hslU 0.92 0.21 2 4 0.94 2 6.23 0.06 2

P39812|gltA 1.07 0.06 8 6.42 0.67 15 15.77 1.12 8

P39821|proA 18.31 2.45 6 39.4 1.47 2

P39912|aroA 1.08 0.23 5 1.15 0.19 6 8.08 1.52 10 17.58 1.26 6

P40924|pgk 1.97 0.33 3 15.65 1.1 6 32.31 6.73 7

P42085|xpt 1.56 0.01 2 1.57 0 2 20.72 5.09 3 52.97 2.28 2

P42318|yxjG 6.22 2.51 5 15.56 10.04 3

P45694|tkt 0.96 0.06 2 3.84 0.89 5 9.49 5.62 4

P45740|thiC 10.48 1.83 5 17.86 4.36 4

P46920|opuAA 1.07 0.07 4 0.93 0.04 2 5.5 0.39 10 8.87 1.38 4

P50735|gudB 0.52 0.09 3 0.62 0.03 2 5.24 0.15 6 8 0.58 7

P50866|clpX 0.97 0.02 2 1.04 0.09 5 7.62 3.94 4 20.36 0.75 2

P51785|ilvD 0.62 0.51 3 5.46 0.56 5 19.38 2.31 3

P51831|fabG 6.56 1.8 5 11.35 6.31 3

P53554|bioI 12.5 1.01 6 27.23 0.72 3

P53558|bioD 5.79 1.53 5 4.15 2.67 2

P54159|ypbR 0.87 0 2 3.38 0.14 2 6.88 1.53 2

P54419|metK 1.25 0.02 2 1.24 0.06 2 19.29 2.16 5 23.24 10.18 6

P54420|asnB 0.87 0.06 3 0.84 0.05 13 5.32 0.31 15 9.95 0.59 9

P54452|yqeG 1.77 0.06 2 2.45 0.71 2

P54470|yqfL 7.9 0.05 2 13.59 0.24 2

P71018|plsX 0.67 0.04 6 3.95 0.77 6 7.23 0.18 2

P71068|yukA 0.48 0.05 5 2.11 0.6 6 2.92 1.16 7

P80643|acpA 7.6 1.07 3 10.09 2.91 2

P80858|leuC 33.35 6.13 5 55.04 10.45 3

P80859|yqjI 7.59 1.39 3 6.35 7.61 2

P80866|yurY 1.39 0.25 4 7.25 2.37 3 10.56 3.24 3

P80868|fusA 1.45 0.6 4 1.17 0.07 10 12.36 2.15 11 32.33 2.28 6

P80877|metE 1 0.21 10 1.18 0.05 20 26.19 3.04 31 102.19 10.78 18

P80885|pyk 1.91 0.11 3 11.4 10.5 2 32.48 8.78 4

P80886|sucC 1.15 0.15 3 1.14 0.11 9 14.72 1.08 11 36.83 14.83 7

P94400|yciC 1.41 0.05 2 7.04 0.48 7 27.2 3.92 4

P94476|yebA 1.48 0.16 2 2.03 0.04 2

P94520|ysdB 2.69 0.1 2 3.12 0.4 4

P96614|ydbR 0.83 0.15 3 0.77 0.05 9 4.3 2.53 9 5.91 2.13 7

P96648|yddK 0.27 0.03 2 0.77 0.06 3

P96716|ywqD 5.99 5.7 2 5.68 6.7 2

P97029|ygaO 1.8 0.15 2 2.04 0.2 3

Q01465|mreB 0.96 0.09 3 1.04 0.07 6 16.42 2.82 5 22.72 1.66 6

Q02112|lytA 0.44 0.02 3 0.67 0.14 3

Q03222|rho 3.32 0.01 2 3.41 0.05 3

Q04747|srfAB 0.35 0.08 14 0.44 0.06 42 2.19 0.26 44 3.98 0.45 35

Q06754|yacL 1.03 0.03 2 4.48 0.12 2 4.8 0.78 2

Q45593|yydI 3.39 0.78 3 4.31 1.16 2

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

110

 

control (replicate 1) control (replicate 2) MP196 (replicate 1) MP196 (replicate 2)

protein ID ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides ratio SD peptides

Q06797|rplA 0.98 0.36 2 2.41 0.52 2 4.12 0.2 2

Q45589|ybbP 0.71 0.15 2 2.26 0.37 5 2.78 0.62 4

Q45600|yydB 19.62 5.97 6 38.72 50.53 2

Q45601|yydA 1.26 0.05 2 2.65 0.69 2

Q794W0|yycH 0.94 0.1 3 2.29 0.26 7 3.12 0.27 7

Q795M6|alaT 4.35 1.08 4 9.29 0.37 2

Q9KWU4|pyc 1.17 0.01 2 1.08 0.05 9 10.42 1.04 17 23.43 1.85 16

Q9KWZ1|nadA 44.25 8.8 4 49.76 43.2 3

Supplementary Table 5: Marker proteins of MP196 overlapping with markers of other cell 

envelope‐targeting antibiotics ‐ a comparison with the B. subtilis proteome response library13,31. 

MP

196

van

com

ycin

ba

citr

acin

me

rsac

idin

nis

in

gal

lider

min

gra

mic

idin

S

da

pto

myc

in

gra

mic

idin

A

valin

om

yci

n

general stress YtxH x sporulation Spo0M x x x x x

cell envelope stress

YceC x x x x x x

YceH x x x x

LiaH x x x x x x

YtrE x x x x x

DltA x RacX x

PspA x x x x x x YthP YuaI x YjdA x x YoxD x x x x

YfhM x FosB x

energy

NadE x x x x BglH x CitZ x NfrA x x x YwrO x

tRNA modification TrmB x x x translation RpsB x x unknown YvlB x x x

total overlap 35/35 3/5 4/11 5/13 5/8 10/25 12/21 2/8 4/5 19/22

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

111

 

iii) Supplementary Figures

Supplementary Figure 1: Growth of B.  subtilis  in  chemically defined medium after  treatment 

with MP196  (a)  and D‐MP196  (b). Arrowheads  indicate  the  time point  of  antibiotic  addition 

during  logarithmic  growth.  Peptide  concentrations  leading  to  50‐70%  growth  inhibition  in 

relation  to  the  untreated  controls  were  chosen  for  radioactive  labeling  and  follow  up 

experiments (chosen concentrations are underlined). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

112

 

Supplementary  Figure  2:  Incorporation  of  radioactively  labeled  precursor  molecules  by 

Staphylococcus  simulans  upon  treatment with MP196  or  pathway‐specific  inhibitors:  (a)  cell 

wall precursor glucosamine, (b) DNA precursor thymidine, (c) RNA precursor uridine, (d) protein 

precursor isoleucine.  

Supplementary Figure 3: Activation of transcription  from promoters of selected marker genes 

indicative  of  inhibition  of  specific  metabolic  pathways.  Cells  were  incubated  with  rising 

concentrations of MP196 for a predetermined time depending on the induction kinetics of the 

respective reporter strains. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

113

 

Supplementary  Figure  4:  2D  gel‐based  proteome  response  patterns  of  B.  subtilis  after 

treatment with MP196 (a) and D‐MP196 (b). Marker proteins upregulated  in response to both 

peptides (c). Overlapping proteins are labeled in orange. Unidentified proteins are circled. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

114

 

Supplementary  Figure  5: DSC  thermograms  of  pure DPPG  (a), DPPE  (b),  and DPPC  lipids  (c) 

incubated with MP196. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

115

 

Supplementary  Figure  6:  (a)  Potassium  release  from whole  B. megaterium  cells.  Values  are 

given  relative  to  positive  control  nisin,  which  forms  pores.  (b)  DiSC35‐based  depolarization 

measurements  of  B. megaterium  treated  with MP196  and  nisin,  a  pore‐forming  lantibiotic 

serving as positive control. 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

116

 

Supplementary  Figure  7:  Free  amino  acid  profiles  of  B.  subtilis  after  MP196‐treatment 

determined  by HPLC:  (a)  intracellular  amino  acid  concentrations  (b)  extracellular  amino  acid 

concentrations. Amino acids are written in one letter code in the order of elution time from the 

column. Glutamate and glutamine as well as aspartate and asparagine are not separated and 

appear as one peak. Tryptophan was not quantified here.

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

117

 

Supplementary  Figure  8:  (a)  Total  amount  of  glutamate  in  the  B.  subtilis  cytosol  and  in  the 

supernatant  of MP196‐treated  cells  and  untreated  control  cultures.  (b) Uptake  and  efflux  of 

radioactively labeled [3H]‐L‐glutamate upon treatment with MP196 and pore former nisin.  

iv) References 

 

1. Chantson,  J.T.,  Verga  Falzacappa, M.V.,  Crovella,  S.  &  Metzler‐Nolte,  N.  Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem. 1,1268‐74 (2006). 

2. Bonelli, R.R., Schneider, T., Sahl, H.G. & Wiedemann, I. Insights into in vivo activities from 

gallidermin and epidermin mode‐of‐action  studies. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 

1449‐57 (2006). 

3. Wadhwani, P., Afonin, S.,  Ieronimo, M., Buerck,  J. & Ulrich A.S. Optimized protocol  for 

synthesis of cyclic gramicidin S: Starting amino acid is key to high yield. J. Org. Chem. 71, 

55‐61 (2006). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

118

 

4. Schneider,  T.  et  al.  In  vitro  assembly  of  a  complete,  pentaglycine  interpeptide  bridge 

containing cell wall precursor (lipid II‐Gly5) of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 53, 

675–85 (2004). 

5. Urban, A.  et  al. Novel whole‐cell  antibiotic  biosensors  for  compound  discovery. Appl. 

Environ. Microbiol. 73, 6436‐43 (2007). 

6. Stülke, J., Hanschke, R. & Hecker, M. Temporal activation of betaglucanase synthesis  in 

Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen. Microbiol. 139, 2041–45 (1993). 

7. Agnostopoulos, C. & Spizizen,  J. Requirements  for  transformation  in Bacillus  subtilis.  J. 

Bacteriol. 81, 741–46 (1961). 

8. Wenzel, M. et al. Proteomic signature of fatty acid biosynthesis inhibition available for in 

vivo mechanism‐of‐action studies. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 2590‐6. (2011). 

9. Bandow, J.E. et al. Improved image analysis workflow for 2D gels enables large‐scale 2D 

gel‐based proteomics studies ‐ COPD biomarker discovery study. Proteomics 8, 3030–41 

(2008). 

10. Eymann,  C.  et  al.  A  comprehensive  proteome map  of  growing  Bacillus  subtilis  cells. 

Proteomics 4, 2849–76 (2004). 

11. Otto,  A.,  et  al.  Systems‐wide  temporal  proteomic  profiling  in  glucose‐starved  Bacillus 

subtilis. Nat Commun. 1, 137. doi: 10.1038/ncomms1137 (2010). 

12. Wolff, S., Hahne, H., Hecker, M. & Becher, D. Complementary analysis of the vegetative 

membrane  proteome  of  the  human  pathogen  Staphylococcus  aureus.  Mol  Cell 

Proteomics 7, 1460‐8 (2008). 

13. Wenzel,  M.  et  al.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects 

differences  in  interaction  with  the  cytoplasmic  membrane.  Antimicrob.  Agents 

Chemother. 56, 5749‐57 (2012). 

14. Kohlrausch, U. & Höltje, J.V. One‐step purification procedure for UDP‐N‐acetylmuramyl‐

peptide murein precursors from Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett. 62, 253–7 (1991). 

15. Rick,  P.D.  et  al.  Characterization  of  the  lipid  carrier  involved  in  the  synthesis  of 

enterobacterial common antigen (ECA) and identification of a novel phosphoglyceride in 

a mutant of Salmonella typhimurium defective in ECA synthesis. Glycobiology 8, 557–67 

(1998). 

16. Schmitt,  P.  et  al.  Insight  into  invertebrate  defensin  mechanism  of  action:  oyster 

defensins  inhibit  peptidoglycan  biosynthesis  by  binding  to  lipid  II.  J.  Biol.  Chem.  285, 

29208‐16 (2010).  

17. Dai, D. & Ishiguro, E.E. MurH, a new genetic locus in Escherichia coli involved in cell wall 

peptidoglycan biosynthesis. J. Bacteriol. 170, 2197‐201 (1988). 

18. Mohammadi,  T.  et  al.  The  essential  peptidoglycan  glycosyltransferase MurG  forms  a 

complex  with  proteins  involved  in  lateral  envelope  growth  as  well  as  with  proteins 

involved in cell division in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 65, 1106‐21 (2007). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

119

 

19. Santhana  Raj,  L.  et  al.  Rapid Method  for  Transmission  Electron Microscopy  Study  of 

Staphylococcus aureus ATCC 25923. Annals of Microscopy 7, 102‐8 (2007). 

20. Zweytick, D. et al. Influence of N‐acylation of a peptide derived from human lactoferricin 

on membrane selectivity. Biochim. Biophys. Acta 1758, 1426‐143 (2006). 

21. Orlov,  D.S.,  Nguyen,  T.  &  Lehrer,  R.I.  Potassium  release,  a  useful  tool  for  studying 

antimicrobial peptides. J. Microbiol. Methods 49, 325‐8 (2002). 

22. Matias, V.R. & Beveridge, T.J. Cryo‐electron microscopy reveals native polymeric cell wall 

structure in Bacillus subtilis 168 and the existence of a periplasmic space. Mol. Microbiol. 

56, 240‐51 (2005). 

23. Matias,  V.R. &  Beveridge,  T.J.  Lipoteichoic  acid  is  a major  component  of  the  Bacillus 

subtilis periplasm. J. Bacteriol. 190, 7414‐8 (2008). 

24. Strahl, H. & Hamoen, L.W. Membrane potential  is  important  for bacterial cell division. 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 27, 12281‐86 (2010). 

25. Andrés, M.T. & Fierro,  J.F. Antimicrobial mechanism of action of  transferrins: Selective 

inhibition of H+‐ATPase. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4335–42 (2010). 

26. Burstein, C., Tiankova, L. & Kepes, A. Respiratory control  in Escherichia coli K 12. Eur. J. 

Biochem. 94, 387‐92 (1979). 

27. Palmgren, M.G, Sommarin, M., Ulvskov, P. & Larsson, C. Effect of detergents on the H(+)‐

ATPase  activity  of  inside‐out  and  right‐side‐out  plant  plasma  membrane  vesicles. 

Biochim. Biophys. Acta 1021, 133‐40 (1990). 

28. Smith,  J.J. & McFeters, G.A. Mechanisms  of  INT  (2‐(4‐iodophenyl)‐3‐(4‐nitrophenyl)‐5‐

phenyl  tetrazolium  chloride),  and  CTC  (5‐cyano‐2,3‐ditolyl  tetrazolium  chloride) 

reduction in Escherichia coli K‐12, J. Microbiol. Methods  29, 161‐75 (1997). 

29. Hoffmann,  T.  Boiangu,  C.,  Moses,  S.  &  Bremer,  S.  Responses  of  Bacillus  subtilis  to 

hypotonic  challenges:  physiological  contributions  of  mechanosensitive  channels  to 

cellular survival. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2454‐60 (2008). 

30. Ruhr, E. & Sahl, H.G. Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on the 

membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles. 

Antimicrob. Agents Chemother. 27, 841‐5 (1985). 

31. Bandow, J.E., Brötz, H, Leichert, L.I., Labischinski, H. & Hecker, M. Proteomic approach to 

understanding antibiotic action. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 948–55 (2003). 

E An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins

120

F 

 

Influence of lipidation on the mechanism of action 

of an RW‐rich antimicrobial peptide 

 

Michaela Wenzel, Patrick Schriek, Pascal Prochnow, H. Bauke Albada, 

Nils Metzler‐Nolte, Julia E. Bandow 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In preparation 

   

F Influence of lipidation on peptide mode of action

121

Influence of lipidation on the mechanism of action of an RW‐rich antimicrobial peptide 

 

Michaela Wenzel1, Patrick  Schriek1, Pascal Prochnow1, H. Bauke Albada2, Nils Metzler‐Nolte2, 

Julia E. Bandow1* 

1Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Germany 2Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 

*Corresponding  author.  Mailing  address:  Ruhr‐Universität  Bochum,  Biologie  der 

Mikroorganismen, Universitätsstraße 150, 44801 Bochum, Germany. Phone: +49‐234‐32‐23102. 

Fax: +49‐234‐32‐14620. E‐mail: julia.bandow@rub.de 

 

Abstract 

The synthetic antimicrobial peptide RWRWRW‐NH2 integrates into the bacterial membrane and 

delocalizes  essential  peripheral  membrane  proteins  involved  in  cell  wall  biosynthesis  and 

respiration.  Lipidated  derivatives  showed  significantly  improved  antibacterial  activity  against 

both Gram‐positive and Gram‐negative bacteria. C8 acyl chains were coupled to the hexapeptide 

by means of a C‐ or N‐terminally positioned lysine residue. Here, we report a comparative study 

on  the mechanism of action of  the  lipidated and non‐lipidated heptapeptides. All derivatives 

depolarized  the  bacterial membrane without  forming  pores  and  affected  cell wall  integrity. 

Proteomic profiling of the bacterial stress response to the small RW‐rich antimicrobial peptides 

revealed  few  alterations  compared  to  the  parent  peptide  and  indicated  perturbation  of 

membrane  phospholipids  due  to  peptide  integration.  No  specific  markers  were  found  to 

correlate with lipidation while five proteins correlated with strict alteration of positively charged 

and hydrophobic  residues. We conclude  that  lipidation of  the antimicrobial peptide enhances 

antibacterial activity without significantly altering the mechanism of action. 

Introduction 

Antimicrobial  peptides  are  often  characterized  by  a  high  number  of  positively  charged  and 

hydrophobic amino acids,  resulting  in a high affinity  to bacterial membranes  [1]. The cationic 

hexapeptide  RWRWRW‐NH2  (MP196) was  designed with  the  objective  to  develop  very  short 

antimicrobially active peptide sequences [2], [3]. Being neither cytotoxic nor hemolytic, MP196 

displayed good Gram‐positive but only moderate Gram‐negative activity  [4]. The peptide was 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

122

shown  to  integrate  into  the bacterial membrane  [5] probably  following an  interfacial  activity 

model  as  proposed  by Wimley  and  coworkers  [6],  [7].  In  contrast  to many  other  peptides, 

integration of MP196 into the membrane is not accompanied by intracellular content leakage at 

sublytic concentrations [5]. It rather changes bilayer architecture and leads to delocalization of 

peripheral membrane proteins  involved  in cell wall biosynthesis,  respiration, and cell division. 

Consequently, cells suffer substantial energy  limitation and cell wall biosynthesis  inhibition.  In 

response  to MP196,  bacteria  adjust  their membrane  and  cell wall  composition  and  release 

membrane‐stabilizing osmoprotective amino acids [5]. 

 

Figure 1: Structures of the MP196‐based peptide derivatives. C8  lipid chains were coupled to 

the peptide backbone with an additional lysine residue. 

 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

123

Short synthetic peptides like MP196 constitute a potent alternative to the typically much longer 

natural peptides, as they are both easy to synthesize and to derivatize [6], [8], [9]. Being one of 

the  shortest antimicrobially active peptides known  so  far, MP196  is  thought  to  represent  the 

minimal  pharmacophore  of  positively  charged  and  hydrophobic  amino  acids  required  for 

antibacterial activity [10]. It is therefore regarded a lead structure for derivatization approaches. 

Albada  et  al.  described  a  set  of  heptapeptide  derivatives  amended with  an  either N‐  or  C‐

terminally  added  lysine  residue  that  facilitates  introduction  of  acyl  chains  to  the  peptide 

backbone. Additional lipophilic tails were thought to  improve  interaction with the lipid bilayer. 

Among  derivatives  with  C0  to  C14  acyl  chains,  both  the  C‐  and  N‐terminally  C8‐substituted 

peptides C‐C8  (H15C7(O)C‐KRWRWRW‐NH2) and N‐C8  (RWRWRWK‐C(O)C7H15)  (Fig. 1)   were  the 

most potent in terms of antibacterial activity. They displayed minimal inhibitory concentrations 

in  the  low  micro  molar  range  even  against  highly  resistant  bacteria  like  Pseudomonas 

aeruginosa  and  methicillin‐resistant  Staphylococcus  aureus.  However,  lipidation  also 

significantly increased cytotoxic and hemolytic activity suggesting alterations in interaction with 

the membrane [11].  

To  investigate whether or not  lipidation affects  the mechanism of action of  the peptide,  the 

lipidated  derivatives  C‐C8  and N‐C8 were  analyzed  in  comparison with  the  hexapeptide  lead 

structure MP196 with  regard  to  depolarization,  pore  formation,  cell wall  integrity,  and  their 

impact  on  bacterial  physiology.  The  latter  one was  investigated  using  proteomic  profiling  of 

peptide‐stressed  Bacillus  subtilis,  a  method  that  supported  previous  structure‐activity 

relationship  and  mechanism  of  action  studies  [5],  [12],  [13].  To  distinguish  between  lipid‐

dependent  and  lysine‐dependent  mechanistic  properties,  the  non‐lipidated  derivatives  C‐C0 

(KRWRWRW‐NH2) and N‐C0 (RWRWRWK‐NH2) (Fig. 1) carrying only the additional lysine residue 

were also included in the study. 

Materials and Methods 

Antibiotics 

Peptides were synthesized by solid‐phase synthesis as described by Albada et al. [11]. Antibiotic 

stock solutions of 10 mg/ mL were prepared in sterile DMSO (MP196, C‐C0, C‐C8, N‐C0, N‐C8) or 

0.01 M HCl (nisin). Nisin was a gift from H.G. Sahl, University of Bonn. 

Bacterial strains and growth conditions 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

124

Bacillus subtilis 168 (trpC2) [14] was aerobically grown in Belitzky minimal medium (BMM) [15] 

at 37°C. Minimal  inhibitory concentrations (MICs) were determined as described previously.  In 

subsequent growth experiments, exponentially growing cultures were challenged with different 

multiples  of  MIC  [13].  For  further  analyses,  antibiotic  concentrations  leading  to  a  50‐70% 

reduced growth rate compared to an untreated control were chosen (Fig. S1): 15 µg/ mL C‐C0, 3 

µg/ mL C‐C8, 15.75 µg/ mL N‐C0, 4.5 µg/ mL N‐C8, and 0.75 µg/ mL nisin. 

Microscopy 

Depolarization  assays  were  performed  with  B.  subtilis  1981  [16]  as  reported  recently  [17]. 

Briefly, cells were grown overnight in BMM. Those cells were then inoculated in modified BMM 

containing xylose  instead of glucose  to  induce GFP‐MinD expression. Cultures were grown  to 

early exponential phase and subsequently stressed with antibiotics. After 15 min of antibiotic 

exposure, cells were imaged in fluorescent mode without fixation or immobilization. 

Pore formation was monitored  in B. subtilis 168 using the  live/dead BacLight bacterial viability 

kit  (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as described previously  [5].  In short, exponentially growing 

cells were  treated with antibiotics  for 15 min. Subsequently, 2 mL of  culture were  incubated 

with 4 µL of a 1:1 mixture of  the  fluorescent dyes  for another 15 min  in  the dark. Cells were 

washed and resuspended in TE buffer (100 mM Tris/ 1mM EDTA, pH 7.5). Five (5) µL of the cell 

suspension were imaged without fixation or immobilization in fluorescent mode.  

Sample preparation and bright field microscopy was performed as described by Schneider et al. 

[18] with minor modifications [17]. Briefly, B. subtilis 168 was grown in BMM and treated with 

antibiotics in early exponential growth phase. After 15 min of antibiotic stress cells were fixed in 

a  1:3  mixture  of  acetic  acid  and  methanol,  immobilized  in  low  melting  agarose,  and 

microscopically examined. 

Radioactive 2D PAGE 

Radioactive  labeling of newly synthesized proteins and subsequent separation of the cytosolic 

proteome by two‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) was performed as 

described previously  [13].  In short, 5 mL of a B. subtilis culture were exposed to antibiotics  in 

early exponential growth phase. After 10 min cells were pulse‐labeled with  [35S]‐L‐methionine 

for 5 min. Radioactive incorporation was stopped by inhibition of protein biosynthesis by adding 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

125

1 mg/mL chloramphenicol and an excess of non‐radioactive methionine. Cells were harvested 

by centrifugation, washed three times with TE buffer, and disrupted by ultrasonication. 

Fifty‐five (55) µg of protein for analytical and 300 µg for preparative gels were  loaded onto 24 

cm  immobilized pH gradient  (IPG)  strips pH 4‐7  (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) by passive 

rehydration for 18 h. Proteins were separated in a first dimension by isoelectric focusing and in 

a  second  dimension  by  SDS‐PAGE  using  12.5%  acrylamide  gels.  Analytical  gel  images  were 

analyzed as described by Bandow et al. [19] using Decodon Delta 2D 4.1 image analysis software 

(Decodon,  Greifswald,  Germany).  Proteins  more  than  two‐fold  upregulated  in  three 

independent  biological  replicates  were  defined  as  marker  proteins.  Protein  spots  were 

identified  by  nano  HPLC‐ESI‐MS/MS  as  previously  reported  [20]  using  a  Synapt  G2S  high 

definition mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source and an additional 

ToF detector (Waters, Milford, MA, USA).  

Results and Discussion 

Influence on membrane and cell wall integrity 

The  influence  of  the  peptide  on  the B.  subtilis  cell  envelope was  investigated  using  a  set  of 

microscopic assays previously applied  to MP196  [5]. The  lantibiotic nisin, which  is both a cell 

wall biosynthesis inhibitor and a membrane pore former, was chosen as comparator compound. 

Membrane depolarization was monitored employing a B. subtilis strain carrying a GFP fusion to 

the cell division protein MinD, which localizes at the cell poles and in the cell division plane only 

when the membrane potential  is  intact [16].  In a depolarized cell MinD delocalizes resulting  in 

irregular GFP distribution throughout the cell. While the untreated control showed distinct GPF‐

MinD  localization, all four heptapeptides as well as  lead structure MP196 and positive control 

nisin  led  to  similarly delocalized GFP‐MinD  clusters  (Fig. 2A,B)  suggesting efficient membrane 

depolarization. 

MP196 differed from many other small peptides  in  its ability to disrupt membrane  integrity at 

sublytic  concentrations.  In  contrast  to  e.g.  nisin  or  daptomycin  [21],  it  did  not  lead  to 

intracellular content  leakage  into defined medium [5]. To  investigate, whether  lipidation  leads 

to a higher membrane‐disruptive potential, pore  formation was monitored with  the  live/dead 

BacLight  staining kit, which  is based on  two different  fluorescent dyes. The green‐fluorescing 

dye SYTO 9 is able to cross intact bacterial membranes. Propidium iodide, fluorescing red, may 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

126

only enter bacterial cells through membrane pores, thus  indicating membrane disruption.  In a 

fluorescence  overlay,  cells  with  intact  membranes  appear  green  while  porous  cells  appear 

orange.  In  contrast  to  nisin,  neither  MP196  nor  the  heptapeptide  derivatives  significantly 

facilitated penetration of  the  red‐fluorescing dye  into B.  subtilis  (Fig. 2C). Apparently, neither 

addition  of  the  lysine  side  chain  nor  of  the  lipid  tail  enhanced  the  membrane‐disruptive 

potential of the MP196 core structure.  

 

 

Figure 2: Influence of the peptides on the bacterial cell envelope. (A) Fluorescence microscopy 

images of B. subtilis 1981. Delocalization of MinD from the cell poles and the cell division plane 

indicates  membrane  depolarization.  (B)  Bright  field  microscopy  images  of  the  same  cells 

displayed  above.  (C) Dual‐channel  fluorescence microscopy  images of B.  subtilis  stained with 

live/dead  BacLight.  Green  fluorescence  indicates  an  intact,  red  fluorescence  a  porous 

membrane. (D) Bright field microscopy images of B. subtilis fixed with acetic acid and methanol. 

Loss of cell wall integrity is indicated by extrusion of the cell membrane through holes in the cell 

wall. 

 

MP196 was shown to disturb cell wall integrity, probably at least in part due to delocalization of 

a peripheral membrane protein, MurG, involved in cell wall biosynthesis, and by causing energy 

limitation  [5].  The B.  subtilis  cell  shape  after  acetic  acid/methanol  fixation was  examined by 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

127

bright  field  microscopy  (Fig.  2D).  This  treatment  leads  to  excrescence  of  the  cytoplasmic 

membrane through holes in the cells wall, which typically occurs when cell wall biosynthesis  is 

inhibited at a membrane‐bound step [17], [18] as shown for MP196 and nisin.  While untreated 

control  cells  retained  their  shape  after  fixation,  all  four  heptapeptide  derivatives  led  to 

membrane extrusions. 

Influence on bacterial physiology 

In order to characterize the physiological impact of the different derivatives, proteome analyses 

of  the  bacterial  stress  response  to  antibiotic  treatment  were  performed.  Radioactive  pulse 

labeling with [35S]‐L‐methionine of proteins newly synthesized upon antibiotic exposure allowed 

monitoring of the acute bacterial stress reaction reflective of the antibacterial mode of action. 

Proteins were  subsequently  separated by 2D PAGE. Autoradiographs of  the antibiotic‐treated 

cultures were overlayed with those of the untreated controls. Proteins upregulated more than 

two‐fold  compared  to  the  untreated  control  in  three  independent  biological  replicate 

experiments were defined as marker proteins  for  treatment with a particular compound  [17], 

[19], [23].  

Full  protein  expression  patterns  of  B.  subtilis  in  response  to  the  different  derivatives  are 

displayed in Figure S2. Details of protein function and regulation are compiled in Table 1, mass 

spectrometric  identification data  in  Table  S1.  Several marker proteins were  regulated by  the 

extracytoplasmic function sigma factor W (σW), which is activated upon cell envelope stress by 

antibiotics  [24]. The proteome response patterns were dominated by proteins  involved  in  the 

cell envelope, cell wall, and membrane  stress  responses, as well as  in energy and amino acid 

metabolism. The proteins upregulated in response to all five peptides illustrate this particularly 

well and are shown in Figure 3.  

Some markers have been  reported  to be specific  for different aspects of cell envelope stress. 

YceC and YceH constitute a signature for cell envelope stress [17]. YceC, sharing similarity with a 

tellurium resistance protein, was upregulated in response to all derivatives. YceH, annotated as 

toxic anion resistance protein, was  identified as a marker for C‐C0, N‐C0, and N‐C8, only closely 

missing the cutoff of two‐fold induction in one out of three replicates of C‐C8.  

F Influence of lipidation on peptide mode of action

128

Table 1: Induction factors and protein function of the identified marker proteins upregulated by the four peptide derivatives. 

   induction factor          

protein  C‐C0  C‐C8  N‐C0 N‐C8 function  regulator  stress category 

YceC*  19.8  8.5  11.5 16.7 tellurium resistance protein  σB, σW, σM  cell envelope  

YceH*  10.5  8.7  10.1 16.0 toxic anion resistance protein  σB, σM, σW  cell envelope  

YjbC/BacB  3.7  1.9  8.7 8.2 general stress protein/involved in L‐anticapsin synthesis  PerR, σB, σM, σW, σX/ unknown 

cell envelope  

YfhM  7.7  3.5  9.5 7.3 similar to epoxide hydrolase  σB, σW  cell envelope  

FosB  16.6  4.9  28.1 18.6 bacillithiol‐S‐transferase  σW  cell envelope  

YvlB  11.8  7.1  6.6 8.2 unknown  σW  cell envelope  

YvlB  12.7  8.5  13.4 20.6 unknown  σW  cell envelope  

YpuA  5.1  4.6  8.6 4.7 unknown  σM  cell envelope  

YknY/LiaH#  5.7  5.1  5.8 3.7 ABC transporter (ATP‐binding protein) for the export of the SdpC toxin/similar to phage shock protein 

σW/LiaRS  cell envelope  

LiaH#  48.1  26.7  18.3 4.0 similar to phage shock protein  LiaRS  cell wall 

LiaH#  18.2  9.1  8.1 2.9 similar to phage shock protein  LiaRS  cell wall 

RacX  21.7  13.6  18.8 6.6 amino acid racemase, production of D‐ animo acids, control of biofilm formation 

σW  cell wall 

PbpE  7.7  6.6  13.5 7.6 penicillin‐binding protein  σW  cell wall 

PbpE  3.9  0.8  2.3 11.8 penicillin‐binding protein  σW  cell wall 

MurB  4.9  5.8  5.1 2.8 UDP‐N‐acetylenolpyruvoylglucosamine reductase  σE, σM, SpoIIID  cell wall 

PspA°  16.2  6.6  13.1 9.7 phage shock protein A homolog  σW  membrane 

AcsA  12.3  9.0  3.2 14.7 acetyl‐CoA synthetase  unknown  membrane 

AcsA  12.0  9.4  0.7 1.1 acetyl‐CoA synthetase  unknown  membrane 

FabF  2.6  1.9  2.8 2.6 beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II, involved in control of membrane fluidity 

FapR, σW  membrane 

YoxD  3.0  5.3  8.6 2.7 similar to 3‐oxoacyl‐ acyl‐carrier protein reductase  unknown  membrane 

YjdA  8.2  3.7  13.3 10.0 similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase  unknown  membrane 

YuaI  8.3  3.9  7.4 8.9 involved in reducing membrane fluidity  σW  membrane 

YkpA  4.5  6.0  32.7 35.0 similar to ABC transporter (ATP‐binding protein)  unknown  membrane 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

129

  induction factor       

protein  Co  C8  N0 N8 function  regulator  stress category 

PanC/HemH  2.2  2.7  1.7 1.5 pantothenate synthase/ferrochelatase   unknown  membrane/energy 

NfrA  5.5  4.4  4.4 2.9 Spx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase 

σD, Spo0A, Spx  energy 

YwrO  2.6  3.0  2.5 1.8 similar to NAD(P)H oxidoreductase  unknown  energy 

PdhA  2.3  1.1  0.3 1.8 pyruvate dehydrogenase (E1 alpha subunit)  stringent response

energy 

PstS  4.2  1.4  8.1 3.2 phosphate ABC transporter (binding protein)  PhoP  energy 

NadE°  9.4  5.0  6.6 5.5 NAD synthase  σB  energy 

PdhD  1.6  3.1  4.6 2.7 dihydrolipoamide dehydrogenase E3 subunit of both pyruvate dehydrogenase and 2‐oxoglutarate dehydrogenase complexes 

stringent response 

energy 

GsaB  5.8  4.0  5.7 8.3 glutamate‐1‐semialdehyde aminotransferase (heme biosynthesis) 

unknown  energy 

CitZ  3.1  2.1  3.1 1.8 citrate synthase  CcpA  energy 

PhoH/GuaC  2.7  2.2  1.3 1.4 phosphate starvation‐induced protein/GMP reductase  unknwn/CodY  energy 

BkdAA  4.4  2.9  5.3 3.2 2‐oxoisovalerate dehydrogenase (E1 alpha subunit)  BkdR, σL  amino acids 

RocA  7.5  4.4  13.2 9.7 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  RocR  amino acids 

Bcd  4.1  2.6  5.1 2.3 Val, Ile, Leu dehydrogenase  BkdR, σL  amino acids 

PdxK  4.4  2.5  5.8 6.1 pyridoxine, pyridoxal, and pyridoxamine kinase  unknown  amino acids 

CysC  11.1  5.6  8.9 10.0 adenylyl‐sulfate kinase  CymR  amino acids 

RecA  3.2  1.8  2.9 35.0 multifunctional protein involved in homologous recombination and DNA repair 

ComK  DNA damage 

SalA  2.8  2.6  2.3 3.5 negative regulator of scoC expression, de‐represses AprE (subtilisin, extracellular protease) 

SalA  stress response 

Spo0M  25.1  19.4  15.2 8.6 sporulation control protein  σH, σW  sporulation 

GroEL  2.9  2.3  3.8 4.9 chaperone  HrcA  heat shock 

TrxA  3.2  4.4  2.3 1.9 thioredoxin  σB, Spx  oxidative stress 

ClpC  10.5  5.6  8.4 6.7 ATPase subunit of the ATP‐dependent ClpC‐ClpP protease  CtsR, σB, σF  general stress 

ClpP  2.8  2.2  2.3 3.6 ATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit  σB  general stress 

ClpY  2.2  3.5  2.6 2.8 two‐component ATP‐dependent protease, ATPase subunit  unknown  general stress 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

130

  induction factor       

protein  Co  C8  N0 N8 function  regulator  stress category 

YukJ  5.6  3.1  6.3 4.0 unknown  unknown  unknown 

YuaE  3.1  3.9  3.0 1.6 unknown  unknown  unknown 

YaaQ  4.0  2.2  3.0 1.9 unknown  unknown  unknown 

YtoQ  2.4  2.1  1.3 1.6 unknown  unknown  unknown 

*Marker  for general cell envelope stress; #marker for cell wall biosynthesis  inhibition; °marker  for membrane damage. Bold numbers 

indicate marker  proteins more  than  2‐fold  induced  in  three  biological  replicate  experiments. Bold  protein  names  indicate  proteins 

upregulated in response to all heptapeptides and MP196. 

 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

131

PspA  and  NadE  upregulated  due  to  membrane  de‐energization  and  subsequent  energy 

limitation  constitute  a  proteomic  signature  for  membrane  damage  [5],  [17].  Phage  shock 

protein  A  (PspA)  stabilizes  the  membrane  under  stress  conditions  [25].  Both  were  marker 

proteins for C‐C0, C‐C8, and N‐C0. NadE  failed to reach the cutoff of two‐fold  induction  in only 

one  of  three  replicates  of  N‐C8.    In  accordance  with  NadE  upregulation,  NfrA,  a  flavin 

mononucleotide‐containing  NADPH‐linked  nitro/flavin  reductase,  might  be  upregulated  to 

compensate for respiratory chain inhibition. Induction of Spo0M indicates sporulation initiation, 

which is a common bacterial strategy to evade energy‐limiting conditions [26]. 

 

 

Figure 3: Marker proteins related to bacterial physiology. (A) Influence of RW‐rich peptides on 

the cell and bacterial stress response.  (B) Physiological role of the signature proteins  in stress 

adaptation. yellow: membrane  stress  response, blue: cell wall/envelope  stress  response, RSC: 

respiratory chain. 

 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

132

Several other markers  reflect attempts of B.  subtilis  to adapt  to membrane  stress. YoxD and 

YjdA  share  similarity with  fatty  acid  biosynthesis  enzymes  but  are  not  part  of  the  standard 

biosynthetic pathway. YuaI belongs  to  the yuaF‐floT‐yuaI operon. Together with FabF  (marker 

for C‐C0, N‐C0, and N‐C8, closely missing the cutoff for C‐C8) (Fig. 4, Table 1), YuaI was shown to 

reduce membrane fluidity [27], [28]. Together, these proteins might be involved in phospholipid 

adaptation  in order to prevent peptide binding and  integration  into the bilayer. Adjustment of 

the  lipid  composition  has  been  demonstrated  before  in  Corynebacterium  glutamicum  in 

response to a metal‐substituted MP196 derivative [29]. Similarly, the amino acid racemase RacX 

may be involved in enhancing cell wall lipoteichoic acid D‐alanylation, another strategy to adapt 

to peptide stress [5], [30]. Upregulation of RocA, a dehydrogenase converting (S)‐1‐pyrroline‐5‐

carboxylate  into L‐glutamate might reflect glutamate release, which has been shown to play a 

role  in  bacterial  survival  under  peptide  stress,  probably  due  to  osmoprotective  effects  of 

glutamate [5].  

The PspA homologue LiaH, which was strongly induced by all derivatives, has been described as 

specific marker  for  inhibition of membrane‐bound cell wall biosynthesis steps. Both PspA and 

LiaH  bind  to  the  membrane  conferring  higher  stability  under  stress  conditions  [25],  [31].  

Another cell wall biosynthesis  inhibition marker upregulated by all derivatives  is the unknown 

protein YpuA  (formerly  referred  to  as NGM1  [17]), which has  also been demonstrated  to be 

upregulated  by  different  kinds  of  cell  wall  stress  [32].  Together,  LiaH  and  YpuA  indicate 

disturbance of cell wall biosynthesis by all heptapeptides.  In agreement with  the microscopy‐

based  assays,  the proteome analysis data  reflect high mechanistic  similarity between MP196 

and its heptapeptide derivatives. 

Differences to the lead structure 

Nine  marker  proteins,  6  of  which  were  identified,  were  upregulated  by  all  heptapeptide 

derivatives  but  not  by  MP196  (Table  S2).  They  were  involved  in  cell  wall  modification  or 

connected to amino acid and energy metabolism, thus belonging to protein categories similarly 

upregulated in response to MP196 treatment and probably not reflecting a major difference in 

mode  of  action.  However,  by  comparing  the  proteome  response  patterns  to  an  antibiotic 

reference  compendium,  distinct  differences  between  the  heptapeptides  and  MP196  were 

revealed.  The  library  comprises  B.  subtilis  proteome  response  profiles  to  over  50  antibiotic 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

133

agents  [13],  [17],  [22],  [33]. The highest degree of overlap with MP196 and  its heptapeptide 

derivatives  was  found  for membrane‐integrating  gallidermin,  depolarizing  gramicidin  S,  and 

potassium ionophore valinomycin (Table 2, see Table S2 for details) [5].  

 

Table 2: Marker proteins overlapping between  lead structure MP196,  its  four derivatives, and 

comparator compounds 

 

total 

MP196 

C‐C

0 

C‐C

8 

N‐C

0 

N‐C

8 

gram

icidin S 

galliderm

in 

valin

omycin 

MP196  36    21  16  19  17  17  10  19 

C‐C0  43  21    26  34  32  16  13  10 

C‐C8  28  16  26    26  24  14  12  10 

N‐C0  36  19  34  26    30  15  10  10 

N‐C8  35  17  32  24  30    14  10  10 

gramicidin S  20  17  16 14 15 14 7  8

gallidermin  25  10  13  15  10  10  7    4 

valinomycin  22  19  10  14  10  10  8  4   

 

While  gallidermin  and  gramicidin  S,  which  both  disturb  the  phospholipid  bilayer  structure, 

shared  almost  the  same  subset of markers with MP196  and  the derivatives, only half of  the 

marker  proteins  common  to  valinomycin  and MP196 were  also  shared with  the  derivatives. 

Valinomycin does not perturb  the phospholipid bilayer structure but affects  ion homoeostasis 

and energy metabolism [5]. The proteins upregulated by valinomycin and MP196 are involved in 

energy metabolism  and  the  general  stress  response.  In  contrast,  a  number  of  the  proteins 

upregulated by the derivatives ‐ but not MP196 or the comparators ‐ are involved in membrane 

and  cell wall modification  (Table  1).  B.  subtilis  seems  to  intensify  envelope‐related  peptide 

defense  strategies  in  response  to  the  lipidated  and  non‐lipidated  derivatives,  set  off  by 

perturbations of the phospholipid bilayer, and compensation for downstream effects related to 

energy limitation in response to MP196.  

The  cell  wall  biosynthesis  inhibition  signature  reported  previously  comprises  LiaH,  the  ABC 

transporter  subunits  YtrE  and  YtrB,  and  the  tRNA‐modifying  enzyme  TrmB,  all  of which  are 

upregulated  in  response  to  MP196.  In  response  to  the  heptapeptides  only  LiaH  was 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

134

upregulated, which could point to a reduced impact on cell wall biosynthesis by the derivatives 

compared to MP196.  

Both  energy  limitation  and  cell  wall  biosynthesis  inhibition  result  from  delocalization  of 

peripheral membrane proteins due to integration of MP196 into the membrane (cytochrome c 

and  MurG)  [5].  The  additional  lipid  tails  and/or  positive  charges  could  alter  peptide‐

phospholipid  interaction,  amplifying  impact  on  the  architecture  of  the  phospholipid  bilayer. 

MP196 itself showed a similar effect at higher concentrations (Fig. S3). The stress response of B. 

subtilis  to  moderate  MP196  concentrations  showed  a  high  overlap  with  lipid  II‐binding 

antibiotics,  affecting  cell wall  biosynthesis, while  the  overlap was  stronger with membrane‐

integrating antibiotics at high MP196 concentrations.  

Differences between the heptapeptide derivatives 

Some  differences  between  the  derivatives were  observed  (Fig.  4A,  S2).  Keeping  in mind  the 

higher  antibacterial  and  hemolytic  activity  of  the  lipidated  peptides  compared  to  the  lead 

structure  or  the  non‐lipidated  heptapeptides,  we  looked  for  markers  that  correlate  with 

lipidation. The  lipidated peptides C‐C8 and N‐C8  shared only one marker protein  that was not 

upregulated  by  the  other  peptides.  SalA  derepresses  the  extracellular  protease  subtilisin  E, 

which  is  secreted  to  acquire  nitrogen  from  extracellular  protein  sources  [34].  As  the  non‐

lipidated  heptapeptides  C‐C0  and  N‐C0  showed  the  same  trend  of  SalA  upregulation,  albeit 

missing  the stringent  two‐fold cutoff, SalA cannot be considered  to be a  reliable  indicator  for 

lipid‐derived mechanistic differences. The uncharacterized protein YuaE was a marker  for  the 

two non‐lipidated heptapeptides C‐C0 and N‐C0, but was also upregulated  in  response  to  the 

lipidated peptides without meeting the cutoff of two‐fold upregulation. The site of modification 

seems to be of some importance however. A total of five proteins were differentially expressed 

depending on the position of the lysine residue. Unknown protein YtoQ, phosphate starvation‐

induced  protein  PhoH  (identified  in  one  spot  with  the  GMP  reductase  GuaC),  and  three 

unidentified  proteins were  upregulated  in  response  to  C‐C0  and  by  C‐C8,  closely missing  the 

cutoff in the latter, but not by the N‐terminally modified peptides.  

The  oxidative  stress‐protective  thioredoxin  was  upregulated  by  both  C‐terminally  modified 

heptapeptides C‐C0 and C‐C8 but showed the same trend in response the other peptides. 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

135

 

Figure 4: Marker proteins of all MP196 derivatives. (A) Proteome response. purple N‐terminal 

modification  (alternating pattern disrupted), pink C‐terminal modification  (alternating pattern 

retained); CCNN_X shared markers of C‐C0, C‐C8, N‐C0, and N‐C8, CCN0_X shared markers of C‐C0, 

C‐C8, and N‐C0, CCN8_X shared markers of C‐C0, C‐C8, and N‐C8, C0NN_X shared markers of C‐C0, 

N‐C0, and N‐C8, C8NN_X shared markers of C‐C8, N‐C0, and N‐C8, CC_X shared markers of C‐C0 

and  C‐C8, NN_X  shared markers  of N‐C0  and N‐C8,  C0N0_X  shared markers  of  C‐C0  and NC‐0, 

C8N8_X shared markers of C‐C8 and N‐C8, C0N8_X shared markers of C‐C0 and N‐C8, C0_X specific 

markers  of  C‐C0,  C8_X  specific markers  of  C‐C8, N0_X  specific markers  of N‐C0, N8_X  specific 

markers  of  N‐C8.  Boxes  highlight  signature  proteins:  orange  short  RW‐rich  peptides,  purple 

addition of a  lysine side chain, red  lipidation, pink C‐terminal  lysine modification. Dotted  lines 

indicate that in one of the peptide derivatives the protein was upregulated but did not meet the 

two‐fold cutoff.  (B) Relation of  specific marker protein upregulation and peptide  sequence. + 

positively charged residue, o hydrophobic residue. 

 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

136

Introduction of the lysine residue at the C‐terminus retains the pattern of alternating positively 

charged  and  hydrophobic  amino  acids.  In  contrast,  N‐terminal  derivatization  results  in  two 

successive positive charges at  the N‐terminus  (Fig. 4B). According  to  the difference  in marker 

proteins,  the  charge distribution  in  the RW‐backbone  structure  seems  to  affect  the bacterial 

response more than the introduction of a lipid tail. However, lipidation of the N‐terminal lysine 

(N‐C8) produced 9 markers, 5 of which showed no trend of upregulation by the other peptides. 

N‐terminal  lipidation seems  to affect  the mechanistic properties of  the peptide structure  in a 

unique way, which was also reflected in the elevated hemolysis. 

Concluding Remarks 

Lipidation  has  recently  been  shown  to  enhance  antibacterial  activity  of  a  small  cationic 

antimicrobial  peptide RWRWRW‐NH2. Hemolytic  activity was  increased  as well. A  systematic 

exchange of  L‐  to D‐amino acids  in  the  lipidated N‐C8 and C‐C8  structures  identified peptides 

without  hemolytic  activity  but  fully  retained  antibacterial  potency  [35]  making  lipidated 

peptides attractive  for antibacterial drug discovery. Here, we  report  the  influence of positive 

charge and a  lipidation on  the mechanism of action of a  small cationic antimicrobial peptide. 

Validating  the  cytoplasmic membrane as  their antibiotic  target, pore‐independent membrane 

depolarization  and  corruption  of  cell  wall  integrity  were  demonstrated  for  all  derivatives. 

Proteome  analysis  confirmed  a  highly  similar  membrane‐related  mode  of  action  for  all 

derivatives and the lead structure MP196, which has recently been investigated in depth for its 

impact  on  bacterial  physiology.  These  results  indicate  that  antimicrobial  peptides  can  be 

derivatized with lipid chains without considerably changing the mode of action. Upregulation of 

derivative‐specific  marker  proteins  suggests  that  interaction  of  the  peptides  with  the 

phospholipid  bilayer  can  be modulated  by  altering  the  distribution  of  positive  charges  and 

lipophilic residues in the peptide. 

Acknowledgements 

The authors thank H.‐G. Sahl, University of Bonn, for supplying nisin. This work was financially 

supported by a start‐up grant from the Ruhr University Bochum (JEB), and a grant from the state 

of  North  Rhine‐Westphalia  (NRW),  Germany  and  the  European  Union,  European  Regional 

Development Fund, "Investing  in your future" (JEB, NMN). JEB acknowledges financial support 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

137

for  the mass  spectrometer by  the  state of North Rhine Westphalia  (Forschungsgroßgerät der 

Länder). 

The authors declare no financial/commercial conflicts of interest. 

References 

1. Yeaman MR, Yount NY. (2003) Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. 

Pharmacol Rev 55: 27‐55. 

2. Chantson  JT,  Verga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  (2006)  Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem 1: 1268‐1274. 

3. Chantson  JT,  Varga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  (2005)  Antibacterial 

activities of ferrocenoyl‐ and cobaltocenium‐peptide bioconjugates. J Organomet Chem 690: 

4564‐4574. 

4. Albada  HB,  Chiriac  AI, Wenzel M,  Penkova M,  Bandow  JE,  et  al.  (2012) Modulating  the 

activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing  antibacterial  peptides  with  N‐terminal 

metallocenoyl groups. Beilstein J. Org. Chem 8: 1753‐1764. 

5. Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, et al. An antimicrobial peptide delocalizes 

peripheral membrane proteins. submitted. 

6. Rathinakumar  R,  Walkenhorst  WF,  Wimley  WC.  (2009)  Broad‐spectrum  antimicrobial 

peptides by rational combinatory design and high‐throughput screening: the importance of 

interfacial activity. J Am Chem Soc 131: 7609‐7617. 

7. Wimley WC. (2010) Describing the Mechanism of Antimicrobial Peptides with the Interfacial 

Activity Model. ACS Chem Biol 5: 905‐917. 

8. Patra M, Gasser G, Metzler‐Nolte N. (2012) Small organometallic compounds as antibacterial 

agents. Dalton Trans 41: 6350‐6358. 

9. Sharma RK, Sundriyal S, Wangoo N, Tegge W, Jain R. (2010) New antimicrobial hexapeptides: 

synthesis, antimicrobial activities, cytotoxicity, and mechanistic studies. ChemMedChem 5: 

86‐95. 

10. Strøm MB, Haug BE,  Skar ML,  Stensen W,  Stiberg  T, et  al.  (2003)  The pharmacophore of 

short cationic antibacterial peptides. J Med Chem 46: 1567‐1570. 

11. Albada HB, Prochnow P, Bobersky S, Langklotz S, Schriek P, et al. (2012) Tuning the activity 

of  short Arg‐Trp antimicrobial peptides by  lipidation of C‐ or N‐terminal  lysine  side‐chain. 

ACS Med Chem Lett 3: 980‐984. 

12. Brötz‐Oesterhelt H, Beyer D, Kroll HP, Endermann R, Ladel C, et al. (2005) Dysregulation of 

bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 11: 1082‐1087. 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

138

13. Wenzel M, Patra M, Albrecht D, Chen DYK, Nicolaou KC, et al. (2011) Proteomic signature of 

fatty  acid  biosynthesis  inhibition  available  for  in  vivo  mechanism‐of‐action  studies. 

Antimicrob Agents Chemother 55: 2590‐2596. 

14. Agnostopoulos C,  Spizizen  J.  (1961) Requirements  for  transformation  in Bacillus  subtilis.  J 

Bacteriol 81: 741‐746. 

15. Stülke  J, Hanschke R, Hecker M.  (1993) Temporal activation of betaglucanase  synthesis  in 

Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J Gen Microbiol 139: 2041‐2045. 

16. Strahl H, Hamoen  LW.  (2010) Membrane potential  is  important  for bacterial  cell division. 

Proc Natl Acad Sci USA 27: 12281‐12286. 

17. Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, et al. Proteomic response of Bacillus 

subtilis  to  lantibiotics  reflects  differences  in  interaction with  the  cytoplasmic membrane. 

Antimicrob Agents Chemother 56: 5749‐5757. 

18. Schneider  T,  Kruse  T, Wimmer  R, Wiedemann  I,  Sass  V,  et  al.  (2010)  Plectasin,  a  fungal 

defensin, targets the bacterial cell wall precursor lipid II. Science 328: 1168‐1172. 

19. Bandow JE, Baker JD, Berth M, Painter C, Sepulveda OJ et al. (2008) Improved image analysis 

workflow for 2D gels enables large‐scale 2D gel‐based proteomics studies ‐ COPD biomarker 

discovery study. Proteomics 8: 3030‐3041. 

20. Wenzel M,  Patra M,  Senges  CHR, Ott  I,  Stepanek  JJ,  et  al. Analysis  of  the mechanism  of 

action  of  potent  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compounds  –  a  structurally  new 

class of antibiotics. ACS Chem Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

21. Hobbs  JK, Miller  K,  O’Neill  AJ,  Chopra  I.  (2008)  Consequences  of  daptomycin‐mediated 

membrane damage in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chermother 62: 1003‐1008. 

22. Bandow  JE, Brötz H,  Leichert  LI,  Labischinski H, Hecker M.  (2003) Proteomic  approach  to 

understanding antibiotic action. Antimicrob Agents Chemother 47: 948‐955. 

23. Wenzel M, Bandow  JE.  (2012) Proteomic  signatures  in antibiotic  research. Proteomics 11: 

3256‐3268. 

24. Butcher  BG, Helmann  JD.  (2006)  Identification  of  Bacillus  subtilis  sigma‐dependent  genes 

that  provide  intrinsic  resistance  to  antimicrobial  compounds  produced  by  Bacilli.  Mol 

Microbiol 60: 765‐782. 

25. Kobayashi R, Suzuki T, Yoshida M. (2007) Escherichia coli phage‐shock protein A (PspA) binds 

to membrane phospholipids and  repairs proton  leakage of  the damaged membranes. Mol 

Microbiol 66: 100‐109. 

26. Voelker U, Voelker A, Haldenwang WG. (1996) Reactivation of the Bacillus subtilis anti‐sigma 

B antagonist, RsbV, by stress‐ or starvation‐induced phosphatase activities. J Bacteriol 178: 

5456‐5463. 

27. Kingston AW, Subramanian C, Rock CO, Helmann JD. (2011) A σW‐dependent stress response 

in Bacillus subtilis that reduces membrane fluidity. Mol Microbiol 81: 69‐79. 

28. Lee YH, Kingston AW, Helmann  JD.  (2012) Glutamate dehydrogenase affects  resistance  to 

cell wall antibiotics in Bacillus subtilis. J Bacteriol 194: 993‐1001. 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

139

29. Fränzel B, Frese C, Penkova M, Metzler‐Nolte N, Bandow JE, et al. (2010) Corynebacterium 

glutamicum  exhibits  a  membrane‐related  response  to  a  small  ferrocene‐conjugated 

antimicrobial peptide. J Biol Inorg Chem 15: 1293‐1303. 

30. Bertsche  U,  Weidenmaier  C,  Kuehner  D,  Yang  SJ,  Baur  S,  et  al.  (2011)  Correlation  of 

daptomycin  resistance  in  a  clinical  Staphylococcus  aureus  strain with  increased  cell wall 

teichoic acid production and D‐alanylation. Antimicrob Agents Chemother 55: 3922‐3928. 

31. Wolf D,  Kalamorz  F, Wecke  T,  Juszczak  A, Mäder U,  et  al.  In‐depth  profiling  of  the  LiaR 

response of Bacillus subtilis. J Bacteriol 192: 4680‐4693. 

32. Urban A, Eckermann S, Fast B, Metzger S, Gehling M, et al. (2007) Novel whole‐cell antibiotic 

biosensors for compound discovery. Appl Environ Microbiol 73: 6436‐6443. 

33. Raatschen N, Bandow JE. 2‐D gel‐based proteomic approaches to antibiotic drug discovery. 

Curr Protoc Microbiol Chapter 1:Unit1F.2 

34. Ogura  M,  Matsuzawa  A,  Yoshikawa  H,  Tanaka  T.  (2004)  Bacillus  subtilis  SalA  (YbaL) 

negatively  regulates  expression  of  scoC,  which  encodes  the  repressor  for  the  alkaline 

exoprotease gene, aprE. J Bacteriol 184: 3056‐3064. 

35. Albada  HB,  Prochnow  P,  Bobersky  S,  Langklotz  S,  Bandow  JE,  et  al.  Short  antibacterial 

peptides  with  significantly  reduced  hemolytic  activity  can  be  identified  by  an  L‐to‐D 

exchange scan of their amino acid residues. submitted. 

Supplementary Information

 

Contents 

i. Supplementary Tables 

ii. Supplementary Figures 

iii. References 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

140

i. Supplementary Tables 

Supplementary Table 1: nano UPLC‐ESI‐MS/MS data of spot identification 

protein  MW [Da] 

pI  PLGS score 

peptides  coverage (%)  precursor mass error (ppm) 

number of peptides with fragment data 

product mass error (ppm) 

AcsAl  64850  5.55  4947  80 45 1.6169  75 3.9868

AcsAr  64850  5.54  4431  53 36 1.3795  48 4.0771

BacB  26822  5.19  6750  17 41 2.8160  13 4.5349

Bcd  39966  4.94  10682  56 55 2.6251  50 4.0140

BkdAA  36310  4.78  5404  4 48 3.1813  18 8.4847

ClpC  90063  5.75  22605  182 60 1.5483  159 4.8319

ClpP  21668  5.00  7705  36 28 1.2729  32 2.9824

ClpY  52553  5.31  10546  90 56 1.3788  82 3.9932

CysC  22530  5.08  23981  51 60 1.7163  44 4.2176

FabF  43977  4.76  4091  69 46 1.5398  60 4.3794

FosB  17161  6.14  754  4 17 1.5744  4 2.1651

GroEL  57388  4.53  17614  121 77 2.4981  110 5.6355

GsaB  46154  5.65  3403  4 50 5.1234  21 8.8421

GuaC  35827  6.08  4667  41 56 1.5061  36 4.4410

HemH  35325  4.62  1418  15 52 5.8581  20 10.2544

LiaHl  25682  6.17  4794  14 46 1.5921  13 4.6401

MurB  32787  6.08  17578  57 67 1.9137  52 4.0263

NfrA  28302  5.73  9602  24 33 1.5843  20 4.4483

PanC  31938  4.63  5324  15 65 6.1887  21 9.3234

PbpEl  51404  4.84  8109  63 41 1.8203  58 4.8336

PbpEr  51404  4.84  12871  7 55 3.7195  43 8.2619

PdhA  41522  5.83  12509  80 59 3.1268  71 3.9294

PdhD  49701  4.76  7868  17 66 3.225  52 9.1011

PdxK  28998  4.92  2498  20 42 1.0566  15 4.1123

PhoH  35518  6.12  11735  41 54 1.4392  35 4.2039

F Influence of lipidation on peptide mode of action

141

protein  MW [Da] 

pI  PLGS score 

peptides  coverage (%)  precursor mass error (ppm) 

number of peptides with fragment data 

product mass error (ppm) 

PstS  31664  4.84  12665  48 48 1.5004  44 4.0909

RecA  38035  4.82  23208  58 63 1.8056  50 3.5429

RocA  56284  5.58  12601  56 57 2.2908  52 4.2925

SalA  38614  5.23  6829  37 44 1.4237  33 3.6666

Spo0M  29714  4.26  25783  71 60 1.5721  63 3.9270

TrxA  11385  4.30  11205  14 62 1.0655  11 2.5525

YaaQ  11959  6.10  11749  18 39 1.8629  14 0.0125

YceC  21809  5.31  8639  46 66 2.0471  40 4.0478

YfhM  32737  6.07  7499  22 44 1.2305  20 3.8769

YjbC  23105  5.14  6233  38 54 2.2088  32 3.3452

YknY  25255  5.81  6242  26 38 1.3441  25 3.0882

YkpA  61017  4.98  5582  101 53 1.7916  89 4.5519

YoxD  25283  5.34  12493  50 66 1.6707  43 3.9615

YpuA  31275  4.51  20679  38 53 1.7477  30 4.3916

YtoQ  16780  5.77  9248  14 40 0.8658  14 3.3474

YuaE  19098  6.20  5138  18 39 1.7526  15 3.6214

YuaI  19830  5.15  6665  19 49 1.7138  18 3.5182

YukJ  25538  4.42  3593  24 26 1.9362  21 4.2716

YwrO  19942  5.20  13172  50 63 2.2595  46 4.4720

CitZ*  41702  5.55  444°  1 ‐ ‐  5/16# ‐

LiaHr*  25682  6.20  112°  1 ‐ ‐  5/13# ‐

NadE*  30376  5.07  459°  1 ‐ ‐  5/16# ‐

YjdA*  27432  5.74  55°  1 ‐ ‐  5/5# ‐

YvlBl*  41056  5.50  121°  1 ‐ ‐  5/15# ‐

YvlBr*  41055  5.50  303°  1 ‐ ‐  5/23# ‐

* Protein was identified by comparison of the spot pattern to a proteome response library [1‐3]. Mass spectrometric identification was 

carried out on a 4800 MALDI‐ToF/ToF Analyzer. Database search was performed with the Mascot search engine [3]. ° Mascot score, # 16 

peptides found, 5 of them fragmented by MS/MS. l left of two spots on the gel, r right of two spots on the gel. 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

142

Supplementary  Table  2:  Overlapping  marker  proteins  of  lead  structure  MP196,  its  four 

derivatives, and comparator compounds 

protein 

MP196 

C‐C

0 

C‐C

8 

N‐C

0 

N‐C

8 

gram

icidin S 

galliderm

in 

valin

omycin 

stress 

category 

YceC*  x  x  x  x  x  x  x  x  cell envelope  

YceH  x  x  x  x  x  x  x  cell envelope  

YjbC/BacB  x  x  x        cell envelope  

YfhM*  x  x  x  x  x  x      cell envelope  

FosB*  x  x  x  x  x  x      cell envelope  

YvlB*  x  x  x  x  x  x  x    cell envelope  

YknY/LiaH*  x  x  x  x  x  x  x    cell envelope 

YpuA    x  x  x  x    x    cell wall  

LiaH*  x  x  x  x  x  x  x  x  cell wall 

RacX*  x  x  x  x  x  x    x  cell wall 

PbpE  x  x  x  x        cell wall 

MurB  x  x  x        cell wall 

PspA*  x  x  x  x  x  x  x    membrane 

AcsA  x  x  x        membrane 

FabF  x  x  x        membrane 

YoxD*  x  x  x  x  x  x  x  x  membrane 

YjdA*  x  x  x  x  x  x  x  x  membrane 

YuaI*  x  x  x  x  x      x  membrane 

YkpA  x  x  x  x        membrane 

PanC/HemH  x        membrane/energy 

NfrA*  x  x  x  x  x  x  x  x  energy 

YwrO  x  x  x  x  x    energy 

PdhA  x        energy 

PdhD  x  x  x        energy 

PstS  x  x  x  x      energy 

NadE  x  x  x  x  x  x  x  energy 

GsaB  x  x  x  x        energy 

PhoH/GuaC  x        energy 

CitZ  x  x            x  energy 

BkdAA  x  x  x        amino acids 

RocA*  x  x  x  x  x        amino acids 

Bcd  x  x  x        amino acids 

PdxK  x  x  x        amino acids 

CysC*  x  x  x  x  x        energy 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

143

protein 

MP196 

C‐C

0 

C‐C

8 

N‐C

0 

N‐C

8 

gram

icidin S 

galliderm

in 

valin

omycin 

stress 

category 

RecA  x  x        DNA damage 

SalA  x  x        gene regulation 

Spo0M*  x  x  x  x  x  x  x    sporulation 

GroEL  x  x  x        heat shock 

TrxA  x  x        oxidative stress 

ClpC  x  x  x  x        general stress 

ClpP  x  x  x  x  x    general stress 

ClpY  x        general stress 

YukJ  x  x  x  x        unknown 

YuaE  x  x        unknown 

YaaQ  x  x  x        unknown 

YtoQ  x        unknown 

* marker protein overlapping between all five RW‐rich peptides    

F Influence of lipidation on peptide mode of action

144

ii. Supplementary Figures 

Supplementary Figure 1: Growth inhibition of B. subtilis aerobically grown in BMM: (A) C‐C0, (B) 

C‐C8, (C) N‐C0, (D) N‐C8. The time point of antibiotic addition is marked by arrows. Peptide 

concentrations used for proteomic profiling are indicated by boxes.

F Influence of lipidation on peptide mode of action

145

Supplementary Figure 2: Cytosolic protein biosynthesis profiles of peptide‐treated B. subtilis. 

Autoradiographs of the untreated controls were false‐colored  in green and overlayed with the 

antibiotic‐treated  cultures  false  colored  in  red.  Down‐regulated  proteins  appear  green, 

upregulated proteins red, and proteins synthesized at equal rates yellow. Orange protein labels 

indicate marker  proteins  shared  by  all  four  heptapeptides. Unidentified  proteins  are marked 

with circles. 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

146

Supporting Figure 3: Proteome  response profile of B.  subtilis  in  response  to 9 µg/mL  (A) and 

22.5 µg/mL MP196 (B).   

F Influence of lipidation on peptide mode of action

147

Supplementary Figure 3: Marker proteins overlapping between the MP196 derivatives. Orange 

protein names indicate proteins, which are also induced by MP196 [3]. 

III) References 

1. Bandow  JE, Brötz H,  Leichert  LI,  Labischinski H, Hecker M.  (2003) Proteomic  approach  to 

understanding antibiotic action. Antimicrob Agents Chemother 47: 948–955. 

2. Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, et al. Proteomic response of Bacillus 

subtilis  to  lantibiotics  reflects  differences  in  interaction with  the  cytoplasmic membrane. 

Antimicrob Agents Chemother 56: 5749‐5757. 

3. Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, et al. An antimicrobial peptide delocalizes 

peripheral membrane proteins. submitted. 

 

F Influence of lipidation on peptide mode of action

148

 

G 

 

Quantitative tracing of ruthenocene derivatives for 

subcellular localization of antimicrobial peptides in 

bacteria 

 

Michaela Wenzel, Ronald Gust, Monika Bürger, H. Bauke Albada, Maya 

Penkova, Nils Metzler‐Nolte, Ralf Erdmann, Julia E. Bandow 

 

 

 

 

 

 

 

In preparation 

   

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

149

 

Quantitative  tracing of  ruthenocene derivatives  for  subcellular  localization of  antimicrobial 

peptides in bacteria 

 

Michaela  Wenzel1,  Ronald  Gust2,  Monika  Bürger3,  H.  Bauke  Albada4,  Maya  Penkova4,  Nils 

Metzler‐Nolte4, Ralf Erdmann3, Julia E. Bandow1* 

 1Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Germany 2Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Innsbruck, Austria 3Physiological Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 4Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 

 

*Corresponding  author.  Mailing  address:  Ruhr‐Universität  Bochum,  Biologie  der 

Mikroorganismen, Universitätsstraße 150, 44801 Bochum, Germany. Phone: +49‐234‐32‐23102. 

Fax: +49‐234‐32‐14620. E‐mail: julia.bandow@rub.de 

 

ABSTRACT 

Antimicrobial  peptides  are  a  potent  class  of  antibiotics  that  can  target  the  cell  envelope  or 

intracellular  structures.  For mode  of  action  analysis,  the  subcellular  localization  is  of  crucial 

importance. In a proof‐of‐concept study, the localization of the antimicrobial hexapeptide NH2‐

RWRWRW‐CONH2 was analyzed visually by transmission electron microscopy and quantitatively 

by  graphite  furnace  atomic  absorption  spectroscopy  employing  a  ruthenocene‐substituted 

derivative  (Rc‐WRWRW‐CONH2).  Proteomic  profiling  of  the  Bacillus  subtilis  stress  response 

confirmed a similar membrane‐related mechanism of action for NH2‐RWRWRW‐CONH2 and RC‐

WRWRW‐CONH2.  Transmission  electron  microscopy  revealed  a  similar  impact  on  the  cell 

envelope. Omitting  the  lead‐staining  step  in  the preparation of ultrathin  slices,  the modified 

peptide was  visualized  by  electron microscopy  on  the  basis  of  its  electron‐dense  ruthenium 

label. Atomic absorption spectrometry allowed absolute quantitation of the ruthenium‐labeled 

peptide  in subcellular fractions. Both methods  independently showed ruthenium accumulation 

in  the bacterial membrane. Our  results  indicate  that  ruthenocene  is  suitable  for quantitative 

monitoring of antimicrobial peptide localization in bacteria. 

 

 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

150

 

INTRODUCTION 

For the development of novel antibacterial agents the identification of the molecular target and 

the elucidation of the mechanism of action are  indispensable. The  localization of antibiotics  in 

the bacterial cell  is crucial  for their mode of action. The question of antibiotic  localization has 

become more important as membrane‐targeting compounds have come into focus in antibiotic 

research (1). This development was prompted by  lipopeptide daptomycin, which validated the 

bacterial membrane as a clinically attractive antibacterial  target and showed  that membrane‐

targeting  compounds may  display high  selectivity  for  bacterial  over mammalian membranes. 

The antibacterial mechanism of action of daptomycin  is still not completely understood (2, 3), 

demonstrating that the identification of the mode of action of membrane‐targeting compounds 

can  be  rather  complicated.  This  is  true  in  particular  for  demonstrating  interactions with  the 

cytoplasmic membrane  in  vivo.  Typically,  studies  focus on  compound  interaction with model 

lipid  layers or  isolated biological membranes  (4, 5). Several  studies have  shown  that peptide‐

lipid  interaction  can  differ  considerably  depending  on  the  phospholipid  composition  or 

membrane  type, making  it uncertain, how  in vitro studies  translate  to  the  living system  (6‐9). 

Methods  that allow  studying different aspects of  the  interaction of antimicrobial  compounds 

with bacterial membranes in vivo are highly desirable.  

We  have  recently  characterized  the  mechanism  of  action  of  a  small  cationic  arginine‐

tryptophan‐rich  antimicrobial  peptide  (MP196,  Fig.  1A)  (10). We  could  demonstrate  peptide 

integration into model phospholipid bilayers. We conclude based on the bacterial response, that 

it  integrates  into  the  bacterial  membrane,  probably  at  the  interface  of  phospholipid  head 

groups  and  fatty  acyl  chains,  and  disturbs  bilayer  architecture.  Consequently,  it  causes 

delocalization of  the peripheral membrane proteins MurG  and  cytochrome  c  involved  in  cell 

wall  biosynthesis  and  respiration,  respectively.  However,  direct  confirmation  of  MP196 

localization  in the cytoplasmic membrane  in vivo would further corroborate the hypothesis on 

its mechanism of action. 

Monitoring antibiotic localization has repeatedly been approached by directly fusing fluorescent 

labels  to a molecule  (11‐13). Most commonly used  fluorophores have much higher molecular 

weights  than  common  antibiotics.  Direct  labeling  with  such  large  moieties  may  critically 

influence compound activity, uptake, and mechanism of action (14). Direct fluorescence labeling 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

151

 

approaches can therefore be restricted to in vitro techniques (11) or to use for larger molecules, 

which are not affected by  the addition of a  fluorophore  (12, 13). Recently,  fluorescent amino 

acids  have  been  developed  as  small  labels  applicable  to  proteins  and  peptides  (14). 

Fluorescence  labeling  can only  be  relatively  quantified.  For  in  vivo  analysis direct  labeling of 

antibiotic molecules allowing absolute compound quantitation is desirable.   

Chantson et al. reported on the derivatization of very short antimicrobial peptides based on the 

MP196  core  structure NH2‐RWRWRW‐CONH2  (Fig.1A) with  cobaltocene  and  ferrocene  as  an 

approach to modulating antibacterial activity (15). Such organometallic substitutions also open 

up new perspectives for studying peptide  localization. Electron‐dense metals can be visualized 

by  transmission  electron microscopy  (TEM)  (16,  17)  and  graphite  furnace  atomic  absorption 

spectrometry allows absolute quantitation of metal concentrations (18‐21).  

Figure 1: Structures of the hexapeptide MP196 (A) and the ruthenocene‐substituted MP276 (B). 

Ruthenocene  was  substituted  for  the  N‐terminal  arginine  residue  resulting  in  higher 

hydrophobicity compared to the hexapeptide (22). 

 

Regarding the MP196 derivatives, cobaltocene was shown to compromise antibacterial activity 

(15)  and  ferrocene  quantitation  might  be  hampered  by  a  high  cellular  iron  background, 

motivating  development  of  alternative  organometallic  peptide  derivatives.  Ruthenocene  has 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

152

 

previously been employed for studying cellular uptake of cytotoxic compounds  into eukaryotic 

cells  by  graphite  furnace  atomic  absorption  spectrometry  (21).  It was  further  used  to  study 

localization  of  antimalarial  chloroquine  derivatives  by  both  metal  analysis  and  TEM  (17). 

Inspired  by  these  successful  metal‐tracing  approaches,  the  antimicrobial  peptide  derivative 

MP276  (Rc‐WRWRW‐CONH2,  Fig.  1B)  was  synthesized.  Ruthenocene  substitution  did  not 

negatively affect antibacterial activity (22). As ruthenium is not toxic by itself, MP276 is an ideal 

candidate  for  a  proof‐of‐concept  study,  aiming  at  evaluating  the  potential  of  organometallic 

derivatization of antimicrobial peptides for in vivo localization studies in bacteria.  

In a first step the  impact of the organometallic  label on the peptide mechanism of action was 

investigated by profiling  the proteomic  stress  response  in Bacillus  subtilis. Proteome analysis 

has been used previously  to compare modes of action of antibiotics and derivatives  (23).  In a 

second  step,  ruthenium  distribution  was  visualized  by  TEM,  providing  insight  into  peptide 

localization  in  a  whole  cell  assay.  Finally,  the  ruthenium  concentration  was  quantified  in 

subcellular fractions of MP276‐treated cells by element analysis using graphite furnace atomic 

absorption spectrometry. 

METHODS 

Peptides and bacterial growth conditions 

MP196 and MP276 were synthesized by solid‐phase synthesis as described by Albada et al. (22). 

Gramicidin  S was  synthesized according  to Wadhwani et al.  (24). Daptomycin was purchased 

from  Enzo  Life  Sciences  (Farmingdale, NY, USA).  Peptides were  dissolved  to  10 mg/ml  stock 

solutions  in  sterile DMSO. Bacillus  subtilis 168  (25) was grown aerobically  in Belitzky minimal 

medium  (BMM)  (26)  at  37  °C.  For  an  optimal  stress  response,  antibiotics  were  applied  at 

concentrations  inhibiting  bacterial  growth  in  exponential  phase  by  approximately  50%  (22.5 

µg/ml MP196, 1 µg/ml MP276, 1 µg/ml gramicidin S, and 3.5 µg/ml daptomycin). 

Proteomics 

Radioactive  labeling  of  proteins  newly  synthesized  under  antibiotic  stress,  2D  gel‐based 

proteome analysis of  cytosolic protein  fractions, and protein  identification by MALDI‐ToF/ToF 

were performed as previously reported (23).  

 

 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

153

 

Transmission electron microscopy 

Cells  were  cultured  and  prepared  for  TEM  as  described  earlier  (10)  based  on  a  method 

described by Santhana Raj et al. (27). Briefly, B. subtilis 168 was cultured in BMM and stressed 

with antibiotics  in early  logarithmic growth phase. Cells were washed  twice  in 100 mM Tris/1 

mM  EDTA,  pH  7.5  and  once  in  the  same  buffer  without  EDTA.  Cells  were  fixed  with  2% 

glutaraldehyde,  treated  with  2%  uranylacetate,  stained  with  0.2%  osmium  tetroxide, 

dehydrated with a series of solutions containing rising acetone concentrations, and embedded 

in epoxy resin. Ultrathin slices  for the examination of cellular damage were stained with 0.2% 

lead  citrate  in  0.1 M  NaOH  for  3  seconds.  Cuts  used  for  ruthenium  localization  remained 

unstained. Samples were examined at 23,000 x and 153,000 x magnification. 

Graphite furnace atomic absorption spectrometry 

Cells were grown in BMM until early exponential growth phase. Cultures were divided and 50 ml 

aliquots  were  either  stressed  with  MP276  or  left  untreated  as  controls.  After  15  min  of 

antibiotic  stress,  cells were harvested at 3,320  x g, washed  five  times  in 100 mM Tris/1 mM 

EDTA, pH 7.5,  resuspended  in 10 mM  Tris, pH 7.5  and disrupted by ultrasonication  in  a Vial 

Tweeter  instrument  (Hielscher,  Teltow,  Germany).  All  washing  steps  were  collected  and 

subjected to ruthenium measurement. Cell debris was separated from the cytosolic/membrane‐

containing fraction by centrifugation at 16,100 x g. The resulting cell wall pellet was dissolved in 

10 mM  Tris,  pH  7.5.  The membrane  fraction  was  separated  from  the  cytosolic  fraction  by 

ultracentrifugation  at  150,000  x  g  for  4  h.  The  cytosolic  fraction  was  collected  and  the 

membrane pellet was dissolved in 10 mM Tris, pH 7.5. All fractions were lyophilized at ‐20 °C for 

24  h  in  a  Freeze  Dryer  BETA  I  instrument  (Martin  Christ,  Osterode,  Germany).  Ruthenium 

contents were  quantified  using  graphite  furnace  atomic  absorption  spectroscopy  following  a 

previously  described  procedure  (28‐30).  Briefly,  samples  were  dissolved  in  2 ml  of  double‐

distilled water. For ruthenium determination, samples of 160 µl were stabilized by addition of 

20 µl of Triton X‐100 (final concentration 1%) and 40 µl of 1 N HCl and measured immediately. 

Standards for calibration purposes were prepared as aqueous dilutions from a MP276 stock (1 

mg/ml  in DMSO). A Vario 6 graphite  furnace atomic  absorption  spectrometer  (Analytik  Jena, 

Jena, Germany) was used for ruthenium quantitation. Ruthenium was detected at a wavelength 

of 349.9 nm with a bandpass of 0.5 nm. A deuterium lamp was used for background correction. 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

154

 

A volume of 25 µl was injected into the graphite tubes. Drying, pyrolysis, and atomization in the 

graphite furnace were performed according to published procedures (29, 30). The mean areas 

under  the  curve  (AUC)  of  peaks  in  the  absorption  spectra  of  duplicate  injections were  used 

throughout the study. 

RESULTS 

Proteome response of B. subtilis 

To  confirm  that  the mechanism of  action of MP276  is not  substantially  altered  compared  to 

MP196,  the  acute  bacterial  stress  response  to  the  peptide  was  investigated  by  proteomic 

profiling. To this end, B. subtilis was exposed to MP276  in early  logarithmic growth phase and 

proteins newly synthesized in response to antibiotic stress were radioactively pulse‐labeled with 

L‐[35S]‐methionine. The cytosolic proteins were  then separated by 2D‐PAGE and protein spots 

on  autoradiographs  of  2D  gels were measured  densitometrically,  normalized,  and  quantified 

relative  to an untreated control. Proteins upregulated more  than 2‐fold  in  three  independent 

experiments were defined as marker proteins for treatment with MP276. 

The  proteomic  response  to  MP276  was  compared  to  that  of  the  unmodified  hexapeptide 

MP196 (10). MP196  inhibits respiration and cell wall biosynthesis manifesting in the proteome 

response  by  specific  membrane  and  cell  wall  stress  responses,  initiation  of  cell  envelope 

modification,  and  upregulation  of  energy metabolism  (10).  Protein  biosynthesis  patterns  in 

response to both peptides are displayed in figure 2, details of protein function are given in table 

1. In response to MP196 and MP276, 36 and 43 marker proteins were upregulated, respectively. 

Of  these, 20 markers were shared by both antimicrobial peptides  including  the most strongly 

upregulated proteins (Table 1).  

A number of  shared marker proteins have previously been described  as  specific markers  for 

different aspects of cell envelope stress (31). Phage shock protein PspA and NAD synthase NadE 

are  specific marker  proteins  for membrane  stress.  Upregulation  of  the  PspA  homolog  LiaH 

suggests  impairment of a membrane‐bound step of cell wall biosynthesis. YceC, annotated as 

tellurium resistance protein, is a more general marker for cell envelope stress (31). Other shared 

marker  proteins  were  also  related  all  to  membrane  and  cell  wall  stress  and  suggest  a 

mechanistic duality as previously described for MP196. YjdA and YoxD share similarity with fatty 

acid biosynthesis enzymes but do not belong  to  the standard biosynthesis pathway. They are 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

155

 

probably  involved  in  modifying  the  membrane  lipid  composition.  Similarly,  the  amino  acid 

racemase RacX probably supplies D‐amino acids for cell wall modifications like D‐alanylation of 

lipoteichoic  acids.  FosB,  a  bacillithiol‐S‐transferase,  is  known  to  confer  resistance  against 

antimicrobial compounds targeting cell wall biosynthesis (32).  

 

 

 

Figure 2: Protein synthesis profiles of B. subtilis in response to the peptides. Autoradiographs of 

proteins separated by 2D gels of the untreated controls false‐colored  in green were overlayed 

with those of the MP196‐treated (A) or MP276‐treated (B) samples false‐colored in red. Down‐

regulated proteins appear green, upregulated proteins  red, and proteins synthesized at equal 

rates  yellow.  Unidentified  proteins  are  indicated  by  circles.  Orange  labels  indicate  marker 

proteins upregulated by both MP196 and MP276, white labels indicate non‐overlapping marker 

proteins. (C) Functional categories and overlap of the marker proteins upregulated in response 

to MP196 and MP276.  

 

Proteins  involved  in energy metabolism were upregulated  in response to both peptides. YwrO 

shows  similarity  to an NAD(P)H oxidoreductase and NfrA  is an FMN‐containing NADPH‐linked 

nitro/flavin reductase. Their upregulation suggests energy limitation due to impaired membrane 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

156

 

function as was proposed for the membrane stress marker NadE. Limitation of ATP might also 

trigger secondary defense strategies. Further marker proteins shared by both peptides belonged 

to  the  B.  subtilis  general  stress  response  (YdaG,  YtxH, Dps, GsiB), which  is  regulated  by  the 

alternative sigma factor B (σB). Sporulation was indicated by upregulation of SpoVG and Spo0M. 

The  σB‐dependent  general  stress  response  and  sporulation  are  two  alternative  strategies 

upregulated  in  response  to energy  limitation and contribute  to outliving  the stress conditions 

(33).  

Marker proteins, which were unique to either of the peptides, belonged to the same functional 

categories of membrane and cell wall stress, energy metabolism, and general stress, supporting 

high mechanistic  similarity between both peptides. Most of  the proteins described as marker 

proteins for only one of the peptides showed the same trend of upregulation in response to the 

other peptide, but failed to meet the twofold cut‐off in all three the biological replicates.  

 

Table 1: Marker proteins upregulated in response to MP196 and MP276 

protein ID 

induction factor protein function  functional category  regulator 

MP196  MP276 

LiaH  44.8  43.8  similar to phage shock protein  cell envelope stress  LiaRS 

PspA  20.1  4.2  phage shock protein A homolog  cell envelope stress  σW 

YceC  29.7  2.5  similar to tellurium resistance protein  cell envelope stress  σB/σW/σM 

FosB  5.0  20.8  bacillithiol‐S‐transferase  cell envelope stress  σW 

RacX  8.6  6.8  amino acid racemase  cell envelope stress  σW 

YthP  2.9  3.6  similar to ABC transporter  cell envelope stress  σW 

YtrE  2.7  0.6  similar to ABC transporter  cell envelope stress  YtrA 

DltA  9.4  0.8  D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase  cell envelope stress  σD/σX/σM 

YceH  13.1  1.9  similar to toxic anion resistance protein  cell envelope stress  σB/σW/σM 

YuaI  5.7  3.3  unknown  cell envelope stress  σW 

YfhM  7.0  2.9  similar to epoxide hydrolase  cell envelope stress  σB/σW 

RocA  1.2  14.1 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  cell envelope stress  σL 

YjdA  14.3  3.5 similar to 3‐ketoacyl‐ acyl‐carrier protein reductase  fatty acid bioynthesis  σE 

YoxD  5.1  3.1 similar to 3‐oxoacyl‐ acyl‐carrier protein reductase  fatty acid bioynthesis  unknown 

NadE  12.2  3.7  NAD synthetase  energy  σB 

NfrA  10  6.8 FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase  energy  Spx 

YwrO  3.8  2.9  similar to NAD(P)H oxidoreductase  energy  unknown 

YqkF  2.6  2.9  NADPH‐dependent aldo‐keto reductase  energy  unknown 

BglH  3.3  1.6  phospho‐beta‐glucosidase  energy  CcpA 

CitZ  4.2  1.0  citrate synthase  energy  CcpA 

IolS  4.0  2.2  aldo/keto reductase  energy  IolR 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

157

 

protein ID 

induction factor protein function  functional category  regulator 

MP196  MP276 

YhdN  2.0  1.3  aldo/keto reductase specific for NADPH  energy  σB 

Mdh  0.8  2.2  malate dehydrogenase  energy  CcpA 

ArgC  2.3  3.3 N‐acetyl‐gamma‐glutamyl‐phosphate reductase  energy  unknown 

YtxH  7.8  4.6  general stress protein  general stress  σB/σH 

Dps  5.8  2.9  DNA‐protecting protein, ferritin  general stress  σB 

GsiB  2.5  4.4  general stress protein  general stress  σB 

PpiB  0.8  5.6  peptidyl‐prolyl isomerase (chaperone)  general stress  unknown 

YdaG  4.8  7.9  general stress protein  general stress  σB 

ClpP  4.2  1.8 ATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit  general stress  σB 

YtkL  3.6  2.7  general stress protein  general stress  σB 

Spo0M  6.1  9.3  sporulation control gene  sporulation  σW/σH 

SpoVG  5.8  3.8 negative effector of asymetric septation at the onset of sporulation  sporulation  σH 

AzoR2  5.4  2.3  azoreductase  oxidative stress  σG 

MrgA  1.7  3.5 metalloregulation DNA‐binding stress protein  oxidative stress  PerR 

YwbC  1.0  4.1  putative methylglyoxylase  oxidative stress  unknown 

YphP  3.5  2.7  disulfide isomerase, bacilliredoxin  oxidative stress  Spx 

RpsB  3.4  15.3  ribosomal protein S2  translation  unknown 

Frr  1.1  2.9  ribosome recycling factor  translation  unknown 

TrmB  2.1  1.4  tRNA (m7G46) methyltransferase  translation  unknown 

YvlB  8.9  2.1  unknown  unknown  unknown 

Induction  factors  are displayed  as  average over  three  independent biological  replicates. Bold 

numbers indicate marker proteins induced more than 2‐fold in all replicate experiments. 

* marker for general cell envelope stress, # specific marker for cell wall biosynthesis inhibition, ° 

specific marker for membrane damage. 

 

A difference in markers responsive to oxidative stress was observed, which were upregulated in 

response to the ruthenocene‐substituted peptide but not to MP196 (Fig. 2C). Using CellROX, a 

dye  fluorescing  red  in  the  presence  of  reactive  oxygen  species,  including  peroxide  and 

superoxide,  revealed  no  fluorescence  in  the  peptide‐treated  cells.  Thus,  the  observed 

upregulation of oxidative  stress  response proteins might be effected by  σB, which  controls  a 

large stress response regulon as preventive measure against future stress. Taken together, the 

protein  expression  profiles  in  response  to MP196  and  ruthenocene‐substituted MP276 were 

highly similar. 

 

 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

158

 

Influence on cell envelope morphology 

Morphology of the B. subtilis cell envelope after peptide treatment was investigated by electron 

microscopy (Fig. 3). Ultrathin slices were stained with lead citrate to provide better contrast of 

the  cell  envelope  structures.  Two  antimicrobial  peptides  were  chosen  for  comparison. 

Gramicidin  S  integrates  into  the  bacterial  membrane  but  in  contrast  to MP196  it  strongly 

facilitates leakage of intracellular contents (10). The lipopeptide daptomycin is thought to dock 

to the bacterial membrane bilayer by inserting its lipid tail (2).  

  

Figure  3:  TEM  images  of  B.  subtilis  showing  cellular  damage  by  antimicrobial  peptides:  (A) 

control;  (B) MP196;  (C) MP276;  (D)  gramicidin  S;  (E)  daptomycin.  Cells were  fixed with  2% 

uranylacetate and slices were stained with 0.2% lead citrate in 0.1 M NaOH. 

 

MP196‐treated cells showed cell wall lesions lined with characteristic structures and thinner cell 

wall domains as described previously (10). Gramicidin S likewise induced lesions but additionally 

caused intracellular content leakage culminating in cell lysis. The applied concentrations do not 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

159

 

cause significant cell  lysis under normal growth conditions suggesting  that dehydration during 

sample preparation causes already perforated cells  to  rupture. Cells  treated with daptomycin 

were altered  in  their  cell  shape  showing bulky excrescences. Concomitantly,  thinner  cell wall 

domains were observed. Although MP196, gramicidin S, and daptomycin all target the bacterial 

membrane, they apparently affect the cell shape in distinct ways. MP276‐treated cells resemble 

those  treated with MP196  suggesting  that  the membrane‐related mechanism of action  is not 

considerably altered by the ruthenocene substitution. 

Ruthenocene‐peptide visualization in whole cells 

Ruthenocene‐peptide localization was monitored in B. subtilis by TEM (Fig. 4). Ruthenium as an 

electron‐dense metal can be directly employed for visualizing the modified peptide without the 

need  for metal‐labeled  antibodies.  To  avoid  interference  of  lead  citrate with  the  ruthenium 

signal, ultrathin slices were left unstained. The cytosol of untreated control cells appeared dark 

indicating high electron density.  

  

Figure 4: TEM  images of B.  subtilis  showing  ruthenocene peptide  localization:  (A) control;  (B) 

MP276. Cells were fixed with 2% uranylacetate. Slices remained unstained to avoid interference 

of lead with the ruthenium signal. 

 

As typical for unstained cells, the cell envelope structures were of a light grey. In MP276‐treated 

cells  the  cell  envelope  was  stained  by  the  ruthenium  peptide.  The  membrane  structure 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

160

 

appeared darker  than  the  cell wall  suggesting  that  the peptide primarily  localizes  in  the  lipid 

bilayer.  Both  the  membrane  and  the  cell  wall  were  equally  stained  indicating  an  even 

distribution of the peptide between both compartments. No difference was observed between 

the  cytosol  of  untreated  and MP276‐treated  cells  suggesting  that  no  significant  amounts  of 

localize intracellularly.  

Absolute quantitation of the ruthenocene‐labeled peptide 

Ruthenium was absolutely quantified using graphite  furnace atomic absorption  spectrometry. 

To  this end, antibiotic‐treated and untreated B.  subtilis  cells were  fractionated  into  cytosolic, 

membrane, and cell wall fractions. An MP276 stock solution was used as calibration standard. In 

untreated  control  cells only  traces of  ruthenium,  amounts  close  to  the detection  limit, were 

measured  (Table  2).  In MP276‐treated  samples  higher  ruthenium  quantities were  detected. 

Taken  together,  the  ruthenium measured  in  the  individual  fractions  of MP276‐treated  cells 

exceeded  the  ruthenium  measured  in  whole  cells,  which  might  be  due  to  more  efficient 

atomization of pre‐fractionated samples.  

 

Table 2: Ruthenium concentration in B. subtilis subcellular fractions 

  ruthenium per cell [pmol]  ruthenium per compartment volume* [pmol/µL] control    MP276   control   MP276   

cells  1.57 x 10‐9    1.45 x 10‐7  ‐    ‐ cytosol  2.59 x 10‐9    1.85 x 10‐7     0.65    46.29   membrane  1.85 x 10‐9    6.37 x 10‐8   20.61   709.41   cell wall  0    3.38 x 10‐8      0    41.93   

* cytosolic volume 3.09 x 10‐9 µL, membrane volume 8.99 x 10‐11 µL, cell wall volume 8.08 x 10‐10 

µL; calculated based on cyro‐electron microscopy results by Matias and Beveridge (34, 35). 

 

Aiming at revealing the peptide concentrations  in the respective cellular compartments,  it has 

to be considered  that  the volumes of  the cell wall and  the membrane differ  from  that of  the 

cytosol by one and two orders of magnitude, respectively. Hence, absolute values measured in 

the  individual  fractions  are  not  representative  of  the  actual  peptide  concentration  in  the 

different  cellular  compartments. Addressing  this problem,  the measured  ruthenium  amounts 

were  related  to  the  respective  compartment  volumes  to  give  compartment  concentrations. 

Volumes were  calculated based on  cryo‐electron microscopy  studies by Matias and Beverige, 

who measured  the  B.  subtilis membrane  and  cell wall  structures  in  high  resolution  (34,  35). 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

161

 

Adjusted to the calculated compartment volumes (Table 2), the ruthenium concentration in the 

membrane  fraction  exceeded  the  concentrations  measured  in  the  cytosolic  and  cell  wall 

fractions by a factor of 15 and 17, respectively. In agreement with our TEM results, the principal 

localization of MP276 seems to be the membrane. Cells were washed with EDTA several times 

during  sample preparation without eluting  significant amounts of  ruthenium  (~10‐21 mol/cell) 

suggesting  very  strong  binding  of  the  peptide  to  the  lipid  bilayer.  This  is  consistent  with 

membrane  integration, which was  shown  in model  phospholipid  bilayers  for  the  unmodified 

peptide MP196  (10).  Significant  amounts of peptide were  also detected  in  the  cell wall. This 

might be due to the barrier function of the cell wall structure detaining antibiotic compounds 

and preventing them from reaching the membrane structure (36). Above background ruthenium 

concentrations were detected  in  the  cytosolic  fraction,  suggesting  that  the peptide  is able  to 

cross the lipid bilayer to some extent. 

DISCUSSION 

Hexapeptide MP196 has  recently been  characterized with  regard  to  its mechanism of  action 

(10). Substitution of  the N‐terminal arginine  residue of MP196 against a  ruthenocene moiety 

yielded  the metallo‐peptide MP276  (22), which was deliberately designed  for metal‐based  in 

vivo localization studies. In this proof‐of‐concept study we demonstrated that an organometallic 

derivatization  facilitates  studying  peptide  localization.  The  antibiotic  mechanism  of  the 

ruthenocene‐substituted  peptide  was  validated  by  proteomic  profiling  showing  essentially 

consistent proteome  response patterns  to both  the unmodified MP196 and  the  ruthenocene‐

substituted MP276. Marker  protein  upregulation  corresponded  well  to  the mode  of  action 

described  for MP196, which  integrates  into  the bacterial membrane and delocalizes essential 

components of  the  cell wall biosynthesis machinery and  the  respiratory  chain. Consequently, 

cells  suffer  strong energy  limitation and  cell wall  integrity  is  corrupted  (10). TEM of peptide‐

treated cells further demonstrated that the cell envelope damage caused by MP196 and MP276 

is  indistinguishable.  Our  data  suggest  that  the  mechanism  of  action  of  MP276  was  not 

substantially altered by the introduced ruthenocene moiety.  

The high mechanistic similarity of such metallocene‐substituted peptides to their lead structures 

ideally predisposes them as tools  in mode of action studies.  Inspired by previous studies using 

ruthenium as tracer (17, 21), MP276 was employed for metal‐based peptide localization in vivo. 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

162

 

The  electron‐dense  ruthenium  was  exploited  to  localize  the  ruthenocene  peptide  in  the 

bacterial cell by TEM. The bulk of MP276 was detected in the cytoplasmic membrane supporting 

our  current  model  on  the  mode  of  action  of  MP196.  This  was  confirmed  by  quantifying 

ruthenium with graphite furnace atomic absorption spectrometry of subcellular fractions.  

Based on these data we conclude that organometallic substitutions are useful tools for metal‐

based  localization  studies  on  antimicrobial  peptides.  Compared  to  alternative  strategies  to 

follow compound localization, metallocene substitutions have several advantages. Metal‐labels 

can be small,  in case of ruthenocene not significantly bulkier than a  tryptophan residue. They 

can be designed  to optimally  fit  into a specific compound structure minimizing any effects on 

target  interaction. Alternatively, antibodies, e.g.  labeled with  immunogold, may be applied  to 

bacterial ultrathin slices allowing indirect antibiotic detection. Successful immunogold detection 

of a 15 amino acid  long antimicrobial peptide has  recently been  reported  (16). Yet, antibody‐

based compound detection depends on  immunogenicity and antibody specificity. In the future 

organometallic  labels may  also  prove  useful  in  studying  compound  distribution  in  infection 

models. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

This work was  financially  supported by  “Innovative Antibiotics  from NRW”,  a  grant  from  the 

state of North Rhine‐Westphalia (NRW), Germany and the European Union, European Regional 

Development Fund, "Investing in your future" to JEB and NMN. 

REFERENCES 

1. Hurdle  JG, O'Neill AJ, Chopra  I,  Lee RE. 2011. Targeting bacterial membrane  function: an 

underexploited mechanism for treating persistent infections. Nat. Rev. Microbiol. 9:62‐75. 

2. Pogliano  J,  Pogliano  N,  Silverman  JA.  2012.  Daptomycin‐mediated  reorganization  of 

membrane architecture causes mislocalization of essential cell division proteins. J. Bacteriol. 

194:4494‐4504. 

3. Bayer  AS,  Schneider  T,  Sahl  HG.  2013.  Mechanisms  of  daptomycin  resistance  in 

Staphylococcus  aureus:  role  of  the  cell  membrane  and  cell  wall.  Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci. 

1277:139‐158. 

4. Zweytick D, Deutsch G, Andrä J, Blondelle SE, Vollmer E, Jerala R, Lohner K. 2011. Studies 

on lactoferricin‐derived Escherichia coli membrane‐active peptides reveal differences in the 

mechanism of N‐acylated versus nonacylated peptides. J. Biol. Chem. 286:21266‐21276. 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

163

 

5. Zweytick  D,  Tumer  S,  Blondelle  SE,  Lohner  K.  2008.  Membrane  curvature  stress  and 

antibacterial activity of  lactoferricin derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 369:395‐

400. 

6. Cheng  JT,  Hale  JD,  Elliot  M,  Hancock  RE,  Straus  SK.  201  The  importance  of  bacterial 

membrane  composition  in  the  structure and  function of aurein 2.2 and  selected variants. 

Biochim. Biophys. Acta. 1808:622‐633. 

7. Cheng JT, Hale JD, Elliot M, Hancock RE, Straus SK. 2009. Effect of membrane composition 

on antimicrobial peptides aurein 2.2 and 2.3 from Australian southern bell frogs. Biophys. J. 

96:552‐565. 

8. Gonçalves S, Abade J, Teixeira A, Santos NC. 2012. Lipid composition  is a determinant  for 

human defensing HNP1 selectivity. Biopolymers. 98:313‐321. 

9. dos  Santos  Cabrera MP,  Arcisio‐Miranda M,  Gorjão  R,  Leite NB,  de  Souza  BM,  Curi  R, 

Procopio J, Ruggiero Neto J, Palma MS. Influence of the bilayer composition on the binding 

and membrane disrupting effect of Polybia‐MP1, an antimicrobial mastoparan peptide with 

leukemic T‐lymphocyte cell selectivity. 2012. Biochemistry. 51:4898‐4908. 

10. Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, Schumacher C, Albada HB, Penkova M, 

Krämer U, Erdmann R, Metzler‐Nolte N, Brötz‐Oesterhelt H, Becher D, Sahl HG, Bandow JE. 

An antimicrobial peptide delocalizes peripheral membrane proteins. submitted. 

11. März A, TruppS, Rösch P, Mohr GJ, Popp J. 2011. fluorescence dye as novel label molecule 

for quantitative SERS investigations of an antibiotic. Anal. Bioanal. Chem. 402:2625‐2631. 

12. Eliassen LT, Berge G, Leknessund A, Wikman M, Lindin  I, Løkke C, Ponthan F, Johnson JI, 

Sveinjørnsson  B,  Kogner  P,  Flaegstad  T,  Rekdal  Ø.  2006.  The  antimicrobial  peptide. 

lactoferricin B,  is cytotoxic to neuroblastoma cells  in vitro and  inhibits xenograft growth  in 

vivo. Int. J. Cancer 119:493‐500. 

13. Knappe D, Piantavigna S, Hansen A, Mechler A, Binas A, Nolte O, Martin LL, Hoffmann R. 

2012.  Oncocin  (VDKPPLYLPRPRPPRRIYNR‐NH2):  A  novel  antibacterial  peptide  optimized 

against Gram‐negative human pathogens. J. Med. Chem. 53:5240‐5247. 

14. Katritzky AR, Narindoshvili T. 2009. Fluorescent amino acids: advances  in protein‐extrinsic 

fluorophores. Org. Biomol. Chem. 7:627‐634. 

15. Chantson  JT,  Verga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  2006.  Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem. 1:1268‐1274. 

16. Azad  MA,  Huttunen‐Hennelly  HE,  Ross  Friedman  C.  2011.  Bioactivity  and  the  first 

transmission  electron  microscopy  immunogold  studies  of  short  de  novo‐designed 

antimicrobial peptides. Antimicrob. Agents Chemother. 55:2137‐2145. 

17. Biot  C,  Dubar  F,  Khalife  J,  Slomianny  C.  2012.  Opening  up  the  advantages  of  the 

ruthenocenic  bioprobes  of  ferroquine:  distribution  and  localization  in  Plasmodium 

falciparum‐infected erythrocytes. Metallomics. 4:780‐783. 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

164

 

18. Kirin  SI, Ott  I, Gust R, Mier W, Weyhermüller  T, Metzler‐Nolte N.  2008. Cellular uptake 

quantification  of  metalated  peptide  and  peptide  nucleic  acid  bioconjugates  by  atomic 

absorption spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47:955‐999. 

19. Wenzel M,  Patra M,  Senges  CHR,  Ott  I,  Stepanek  JJ,  Pinto  A,  Prochnow  P,  Vuong  C, 

Langklotz S, Metzler‐Nolte N, Bandow  JE. Analysis on  the mechanism of action of potent 

antibacterial hetero‐tri‐organometallic compounds – a structurally new class of antibiotics. 

ACS Chem. Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

20. Patra M, Gasser G, Pinto A, Merz K, Ott I, Bandow JE, Metzler‐Nolte N. 2009. Synthesis and 

biological evaluation of chromium bioorganometallics based on the antibiotic platensimycin 

lead structure. ChemMedChem. 4:1930‐1938. 

21. Gross A, Hüsken N, Schur  J, Raszeja  Ł, Ott  I, Metzler‐Nolte N.   2012. A  ruthenocene‐PNA 

bioconjugate‐‐synthesis,  characterization,  cytotoxicity,  and  AAS‐detected  cellular  uptake. 

Bioconjug. Chem. 23:1764‐1774. 

22. Albada HBA,  Chiriac  AI, Wenzel M,  Penkova M,  Bandow  JE,  Sahl HG, Metzler‐Nolte N. 

2012. Modulating the activity of short arginine‐tryptophan containing antibacterial peptides 

with N‐terminal metallocenoyl groups. Beilstein J. Org. Chem. 8:1753‐1764. 

23. Wenzel M, Patra M, Albrecht D, Chen DY, Nicolaou KC, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. 2011. 

Proteomic signature of fatty acid biosynthesis inhibition available for in vivo mechanism‐of‐

action studies. Antimicrob. Agents Chemother. 55:2590‐2596. 

24. Wadhwani  P,  Afonin  S,  Ieronimo M,  Buerck  J,  Ulrich  AS.  2006.  Optimized  protocol  for 

synthesis of cyclic gramicidin S: starting amino acid is key to high yield. J. Org. Chem. 71:55‐

61. 

25. Agnostopoulos C, Spizizen  J. 1961. Requirements  for  transformation  in Bacillus  subtilis.  J. 

Bacteriol. 81:741‐746. 

26. Stülke  J, Hanschke R, Hecker M. 1993. Temporal activation of betaglucanase  synthesis  in 

Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen. Microbiol. 139:2041‐2045. 

27. Santhana Raj  L, Hing HL, Baharudin O, Aida  Suhana R, Nor Asiha  CP,  Paramsarvaran  S, 

Sumarni G, Hanjeet K. 2007. Rapid method  for  transmission electron microscopy study of 

Staphylococcus aureus ATCC 25923. Ann. Microscopy 7:102‐108. 

28. Gust R, Schnurr B, Krauser R, Bernhardt G, Koch M, Schmid B, Hummel E, Schönenberger 

H. 1998. Stability and cellular studies of [rac‐1,2‐bis(4‐fluorophenyl)ethylenediamine][cyclo‐

butane‐1,1‐dicarboxylato]platinum(II), a novel, highly active carboplatin derivative. J. Cancer 

Res. Clin. Oncol. 124:585‐597. 

29. Schäfer S, Ott I, Gust R , Sheldrick WS. 2007. Influence of the polypyridyl (pp) ligand size on 

the  DNA  binding  properties,  cytotoxicity  and  cellular  uptake  of  organoruthenium(II) 

complexes of the type [(6‐C6Me6)Ru(L)(pp)]n+ [L = Cl, n = 1; L = (NH2)2CS, n = 2]. Eur. J. Inorg. 

Chem. 19:3034‐3046. 

30. Schatzschneider U, Niesel  J, Ott  I, Gust  R,  Alborzinia  H, Wölfl  S.  2008.  Cellular  uptake, 

cytotoxicity,  and  metabolic  profiling  of  human  cancer  cells  treated  with  coordinatively 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

165

 

saturated octahedral ruthenium(II) complexes [Ru(bpy)2(N‐N)]Cl2 with N‐N = bpy, phen, dpq, 

dppz, and dppn. ChemMedChem. 3:1104‐1109. 

31. Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, Hamoen LW, Metzler‐Nolte N, Sahl 

HG,  Bandow  JE.  2012.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects 

differences  in  interaction with  the cytoplasmic membrane. Antimicrob. Agents Chemother. 

56:5749‐5757. 

32. Butcher  BG, Helmann  JD.  2006.  Identification  of  Bacillus  subtilis  sigma‐dependent  genes 

that  provide  intrinsic  resistance  to  antimicrobial  compounds  produced  by  Bacilli.  Mil. 

Microbiol. 60:765‐782. 

33. Voelker U, Voelker A, Haldenwang WG. 1996. Reactivation of the Bacillus subtilis antisigma 

B  antagonist,  RsbV,  by  stress‐  or  starvation‐induced  phosphatase  activities.  J.  Bacteriol. 

178:5456‐5463. 

34. Matias VR, Beveridge TJ. 2005. Cryo‐electron microscopy reveals native polymeric cell wall 

structure  in Bacillus  subtilis 168 and  the existence of a periplasmic  space. Mol. Microbiol. 

56:240‐251. 

35. Matias  VR,  Beveridge  TJ.  2008.  Lipoteichoic  acid  is  a major  component  of  the  Bacillus 

subtilis periplasm. J. Bacteriol. 190:7414‐7418. 

36. Weidenmeier  C,  Peschel  A.  2008.  Teichoic  acids  and  related  cell‐wall  glycopolymers  in 

Gram‐positive physiology and host interactions. Nature Rev. Microbiol. 6:276‐287. 

 

G Peptide quantitation by ruthenocene modification

166

H 

 

Ferrocene‐ and ruthenocene‐specific modulation of 

the mechanism of action of metal‐substituted 

short antimicrobial peptides 

 

Alina Iulia Chiriac*, Michaela Wenzel*, Dagmar Zweytick, Catherine 

Schumacher, H. Bauke Albada, Jonas Krämer, Maya Penkova, Nils 

Metzler‐Nolte, Heike Brötz‐Oesterhelt, Hans‐Georg Sahl, Julia E. 

Bandow 

 

 

 

 

 

 

 

In preparation 

   

                                                            * equally contributed 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

167

Ferrocene‐  and  ruthenocene‐specific  modulation  of  the  mechanism  of  action  of  metal‐

substituted short antimicrobial peptides 

 

Alina  Iulia Chiriac1§, Michaela Wenzel2§, Dagmar  Zweytick3, Catherine  Schumacher4, H. Bauke 

Albada5,  Jonas  Krämer1, Maya  Penkova5,  Nils Metzler‐Nolte5,  Heike  Brötz‐Oesterhelt4,  Hans‐

Georg Sahl1, Julia E. Bandow2* 

1Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Parasitology, Pharmaceutical  

Microbiology Section, University of Bonn, Germany 2Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Germany 3Institute of Molecular Biosciences, Biophysics Division, University of Graz, Austria 4Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Heinrich Heine University Düsseldorf, Germany 5Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 

§ These authors contributed equally to this work. 

*to whom correspondence should be addressed: Jun.‐Prof. Dr. Julia E. Bandow, Ruhr‐Universität 

Bochum, Biologie der Mikroorganismen, Universitätsstr. 150, 44801 Bochum, Germany, Phone: 

+49‐234‐3223102, email: julia.bandow@rub.de 

 

Abstract 

Derivatization with moieties not occurring in natural products constitutes a promising approach 

to  developing  novel  resistance‐breaking  antibiotics. Organometallic  substitutions may  offer  a 

metal‐specific modulation of the antibiotic mode of action. Here we report a comparative study 

on the mechanism of action of ferrocene‐ and ruthenocene‐substituted antimicrobial peptides 

based on  the  core  structure RWRWRW‐NH2. This  small peptide has been  shown  to  integrate 

into  the bacterial membrane,  changing  the phospholipid bilayer architecture and delocalizing 

essential membrane  proteins  involved  in  respiration  and  cell wall  biosynthesis.  The  bacterial 

stress  response  to  the  metallocene‐substituted  peptides  shows  that  peptide‐membrane 

interaction  results  in energy  limitation and cell wall biosynthesis  inhibition. The  ruthenocene‐

substituted  peptides  induce  leakage  of  potassium  from  the  cytosol.  Ferrocene‐substituted 

peptides cause formation of reactive oxygen species.  

 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

168

Introduction 

Bacterial  infections  continue  to  challenge public health worldwide. This  is owing  to  the  rapid 

development,  dissemination,  and  accumulation  of  antibiotic  resistances  resulting  in  multi‐

resistant pathogens  [1].  Introducing  structurally novel moieties  to antibiotic  lead  structures  is 

one  approach  to  overcome  bacterial  resistance.  Not  occurring  naturally,  organometallic 

complexes are promising building blocks  for antibiotic derivatization [2]. The antimalarial drug 

candidate  ferroquine, a  ferrocene‐substituted  chloroquine derivative, did overcome microbial 

chloroquine resistance.  It also successfully passed phase  II clinical  trials  [3],  [4] demonstrating 

the  potential  of  organometallics  in  antimicrobial  therapy.  So  far,  organometallic  compounds 

have been developed predominantly as anti‐cancer and anti‐malarial drugs  [3],  [5], while  less 

attention  was  paid  to  antibacterial  drug  development  [2].  Since  the  arsenic‐containing 

salvarsan, marketed  for  treatment  of  syphilis  in  1910  [6],  organometallic  derivatives  of  e.g. 

quinolones,  β‐lactams,  and  platensimycin  have  been  reported, which  contain  iron,  tungsten, 

gold, silver, or ruthenium [2].  

Recently,  we  reported  on  a  hetero‐tri‐organometallic  peptide  nucleic  acid  (PNA)  derivative 

containing  a  manganese  complex  (cymantrene),  a  rhenium  moiety  (di‐picolyl‐Re(CO)3),  and 

either a ferrocene or a ruthenocene [7]. Only the rhenium moiety was shown to be essential for 

antibacterial  activity  [8].  The  ferrocene‐containing  derivative  provoked  oxidative  stress  in 

bacteria,  the  ruthenocene‐analog  did  not  [7].  Formation  of  reactive  oxygen  species  was 

correlated  with  increased  antibacterial  activity.  These  data  suggested  the  employment  of 

ferrocene as an activity‐enhancing building block in drug design. Adding an oxidative component 

to  the  mode  of  action  may  prove  useful  in  limiting  resistance  development  as  resistance 

development is lower for compounds with multiple targets or mechanisms [9]. 

The ruthenocene moiety did not  influence the mechanism of action of the PNA derivative  [7], 

[8].  It proved useful as a  label for metal‐based compound tracing of the antimicrobial peptide 

RWRWRW‐NH2  (MP196, Fig. 1)  [10], which was originally developed  in an attempt  to  identify 

the minimal pharmacophore of short cationic antimicrobial peptides [11]. MP196 was shown to 

perturb  phospholipid  bilayer  architecture  thereby  delocalizing  peripheral membrane  proteins 

involved in respiration and cell wall biosynthesis [10].  

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

169

 

Figure  1:  Structures  of  the  investigated  metallo‐peptides.  (A)  MP196,  RWRWRW‐NH2,  (B) 

MP276, RcCO‐WRWRW‐NH2, (C) MP66, FcCO‐WRWRW‐NH2, (D) MP159, FcCO‐G‐cCWRWRWC. 

 

Substitution  of  the  N‐terminal  arginine  residue  for  ruthenocene  yielded  the  peptide  RcCO‐

WRWRW‐NH2  (MP276,  Fig.  1).  Proteome  analysis  of  the  bacterial  stress  response  to MP276 

suggested  that  the mode  of  action  of  the  lead  peptide  was  retained.  The  ruthenium  label 

allowed  locating  the  peptide  with  electron  microscopy  and  quantifying  cellular  peptide 

distribution  by  atomic  absorption  spectrometry  confirming  peptide  accumulation  in  the 

bacterial membrane in vivo [12].  

Exploring the antibacterial potential of such organometallic‐conjugated peptides, cobaltocene‐ 

and ferrocene‐containing derivatives were synthesized [13], [14]. While cobaltocene negatively 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

170

affected antibacterial activity, ferrocene‐ and ruthenocene‐substituted peptides were as active 

as the lead compound opening up new opportunities in drug discovery.  

Here, we present a comparative analysis of the mode of action of different ruthenocene‐ and 

ferrocene‐substituted peptides based on  the MP196  lead structure. All‐L and all‐D‐amino acid 

versions of each MP196, ruthenocene‐substituted MP276, and ferrocene‐substituted MP66, as 

well as L‐MP159, a cyclic variant of MP66 (Fig. 1), were analyzed. 

Materials and Methods 

Antibiotics 

Peptides were synthesized by solid‐phase synthesis as described previously [15]. Antibiotic stock 

solutions were prepared in sterile dimethylsulfoxide (L‐MP196, D‐MP196, L‐MP276, D‐MP276, L‐

MP66,  D‐MP66,  L‐MP159,  vancomycin,  rifampicin),  0.01 M  HCl  (nisin,  ciprofloxacin),  water 

(lactoferrin),  acetone  (rotenone),  or  ethanol  (antimycin  A,  tetracycline).  Nisin  was  purified 

according  to Bonelli et al.  [16]. Vancomycin,  lactoferrin,  rotenone, antimycin A,  ciprofloxacin, 

rifampicin,  and  tetracycline  were  purchased  from  Sigma  Aldrich  (St  Lous,  MO,  USA).  For 

mechanistic studies, antibiotic concentrations were adjusted to inhibit growth by approximately 

50% compared to an untreated control, to elicit stress responses without causing significant cell 

lysis (see Fig. S1 for example). 

Proteomics  

Minimal  inhibitory  concentrations  (MIC),  growth  experiments,  radioactive  labeling,  and 

separation of cytosolic protein extracts by two‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis 

was performed as described previously [17]. For radioactive labeling Bacillus subtilis 168 (trpC2) 

[18]  was  grown  aerobically  in  Belitzky  minimal  medium  (BMM)  [19]  at  37°C  until  early 

exponential growth phase. Culture aliquots of 5 mL were exposed to 22.5 µg/ mL L‐MP196, 50 

µg/ mL D‐MP196, 1 µg/ mL L‐MP276, 5 µg/ mL D‐MP276, 5.25 µg/ mL L‐MP66, 3.75 µg/ mL D‐

MP66, and 5 µg/ mL L‐MP159, respectively. After 10 min of antibiotic stress cells were pulse‐

labeled with  [35S]‐L‐methionine  for additional 5 minutes. Cells were harvested, washed  three 

times  in 100 mM Tris/ 1 mM EDTA  (TE), and disrupted by ultrasonication. Fifty‐five  (55) µg of 

protein for analytical and 300 µg for preparative gels were  loaded onto 24 cm  immobilized pH 

gradient  strips  pH  4‐7  (GE  Healthcare,  Uppsala,  Sweden)  by  passive  rehydration  for  18  h. 

Proteins were separated  in a first dimension by  isoelectric focusing and  in a second dimension 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

171

by  SDS‐PAGE  using  12.5%  acrylamide  gels.  Autoradiographs  of  gel  images were  analyzed  as 

described by Bandow et al. [20] using Decodon Delta 2D 4.1 image analysis software (Decodon, 

Greifswald, Germany). Proteins found to be  induced more than two‐fold  in three  independent 

biological replicates were defined as marker proteins. Protein spots were  identified by matrix‐

associated  laser  desorption/  ionization‐time  of  flight‐time  of  flight  (MALDI‐ToF/  ToF)  mass 

spectrometry (MS) as described previously [17]. Proteins that could not be identified by MALDI‐

MS were subjected to nano ultra‐performance liquid chromatography (nanoUPLC)‐electrospray 

ionization (ESI)‐MS/ MS [7] using a Synapt G2S high definition mass spectrometer equipped with 

an ESI source and an additional ToF detector (Waters, Milford, MA, USA).  

Microscopy 

Microscopy‐based experiments were performed under proteomic profiling conditions. B. subtilis 

1981 [21] and B. subtilis 168 were grown aerobically in BMM until early exponential phase and 

treated with 22.5 µg/ mL L‐MP196, 50 µg/ mL D‐MP196, 1 µg/ mL L‐MP276, 5 µg/ mL D‐MP276, 

or 5.25 µg/ mL L‐MP66. Samples were taken after 15 min of treatment.  

CellROX fluorescence staining was performed as recently reported [7]. Samples treated with 57 

µM hydrogen peroxide, respectively, were used as positive controls. Cells were stained with the 

CellROX Deep Red reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 30 min, washed in TE buffer, and 

imaged without fixation.  

MinD  localization  assays  were  performed  as  described  previously  [22].  Cells  were  grown 

overnight in BMM. Overnight cultures were used to inoculate modified BMM containing xylose 

instead  of  glucose  for  induction  of  GFP‐MinD  expression.  Antibiotic‐treated  samples  were 

directly imaged without fixation or immobilization. 

Pore  formation was monitored with  the  live/dead  BacLight  bacterial  viability  kit  (Invitrogen, 

Carlsbad, CA, USA) as described previously [7]. Samples were stained with the fluorescent dyes 

according  to  the  manufacturer’s  instructions,  washed  with  TE  buffer,  and  imaged  without 

fixation or immobilization.  

Sample preparation for bright field microscopy was performed according to Schneider et al. [23] 

with minor modifications [22]. Samples were fixed in a 1:3 mixture of acetic acid and methanol, 

immobilized in low melting agarose, and microscopically examined. 

 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

172

 

Reporter gene fusions 

Reporter  gene  activation  assays  were  performed  as  previously  reported  [10]  using  strains 

carrying fusions of the firefly luciferase gene to the promoters of either yorB, bmrC, helD, ypuA, 

or  liaI  in  the  genetic background of B.  subtilis  IS34  [24]. Cultures were  incubated with  serial 

twofold  dilutions  of  L‐MP196,  D‐MP196,  L‐MP276,  and  D‐MP276,  luciferin‐containing  citrate 

buffer was added, and luminescence was measured. 

Radioactive precursor incorporation 

Incorporation  of  radioactively  labeled  precursor  molecules  into  macromolecules  was 

determined  in Staphylococcus simulans 22 as described recently [10]. Newly synthesized DNA, 

RNA, protein, or peptidoglycane was radioactively  labeled by  incorporation of  [14C]‐thymidine, 

5‐[3H]‐uridine, L‐[14C]‐isoleucine, and [3H]‐glucosamine‐hydrochloride, respectively. Subcultures 

of  the differently  labeled  samples were  treated with 2 µg/ mL  L‐MP196, 2 µg/ mL D‐MP196, 

0.75 µg/ mL L‐MP276, 0.75 µg/ mL D‐MP276, 0.7 µg/ mL ciprofloxacin, 0.07 µg/ mL rifampicin, 

0.7 µg/ mL tetracycline, and 0.7 µg/ mL vancomycin, respectively.  

In vitro lipid II synthesis 

In  vitro  lipid  II  synthesis  was  performed  using  Micrococcus  flavus  DSM  1790  membrane 

preparations as described by Schneider et al. [25] with some modifications [10]. Briefly, 400 µg 

of  membrane  protein,  5  nmol  undecaprenylphosphate,  50  nmol  uridine  diphosphate  ‐N‐

acetylmuramylpentapeptide,  and  50  nmol  [14C]‐uridine  diphosphate‐glucosamine were mixed 

with  reaction  buffer  (60 mM  Tris‐HCl,  5 mM MgCl2,  0.5%  (w/  v)  triton  X‐100,  pH  8.0,  total 

volume 75 µL). Peptides were added  in a 2:1 molar  ratio  to undecaprenylphosphate and  the 

mixture was  incubated  for 1 h at 37°C.  Lipids were extracted with 75 µL 2:1 n‐butanol/ 6 M 

pyridine‐acetate,  pH  4.2,  and  separated  by  thin  layer  chromatography  with  chloroform/ 

methanol/ water/ ammonia (88:48:10:1) as solvent [26].  

In vitro lipid II‐binding 

Peptides were  incubated with  2  nmol  lipid  II  in molar  ratios  of  1:1.  Reaction mixtures were 

incubated at 30°C for 30 min and applied to thin layer chromatography plates. Chromatography 

was  performed  in  chloroform‐methanol‐water‐ammonium  (88:48:10:1)  and  stained  with 

phosphomolybdic acid. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

173

 

Potassium efflux 

Potassium  efflux  experiments  were  performed  with  Bacillus  megaterium  ATCC  13632  as 

described previously [10]. Nisin was applied at 7 µg/ ml, L‐MP196 at 125 µg/ ml, D‐ MP196 at 

125 µg/ mL, L‐MP276 at 12.5 µg/ mL, and D‐MP276 at 12.5 µg/ mL. Calculations of potassium 

efflux in percent were performed according to Orlov et al. [27]. Antibiotic‐induced leakage was 

monitored  for 5 min with  values  taken every 10  seconds  and expressed  relative  to  the  total 

amount of potassium released by nisin. 

H+‐ATPase proton pumping activity 

Inverted vesicles were prepared from M. flavus as described previously [10]. Proton uptake into 

vesicles  was measured  based  on  the  pH‐sensitive  probe  acridine  orange  [10].  The  reaction 

mixture (20 µM acridine orange, 4 mM MgCl2, 10 mM MOPS‐bis‐tris propane (pH 7.0), 140 mM 

KCI, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mg/ mL bovine serum albumine (essentially fatty acid 

free), 2.5 µg/ mL valinomycin, 75 µg/ mL vesicle protein) was preincubated for 30 min with 20 

µM  L‐MP196,  20  µM  L‐MP276,  20  µM  nisin,  or  20  µM  lactoferrin.  The  reaction  was  then 

initiated by addition of 2 mM ATP‐bis‐tris propane, and absorbance was measured at 495 nm. 

Respiratory chain activity 

Antibiotic  influence on  the bacterial electron  transport  chain was monitored by  reduction of 

iodonitrotetrazolium chloride  (INT) using M.  flavus  inverted vesicles as described before  [10]. 

Briefly, 20 µg of vesicle protein were preincubated for 30 min in pure phosphate buffer (10 mM 

potassium phosphate, 5 mM magnesium acetate, pH 6.5) or buffer with 40 µM of L‐MP196, 40 

µM D‐MP196, 40 µM L‐MP276, 40 µM D‐MP276, 40 µM nisin, 100 µM antimycin A, or 5 mM 

rotenone, respectively. Samples were incubated with 1 mM INT and 0.6 mM NADH as substrate 

for 1 h.  INT  reduction was stopped by addition of 5%  trichloroacetic acid.  Insoluble  formazan 

was removed and fluorescence was measured at 485 nm. 

Differential scanning calorimetry (DSC) 

1,2‐Dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoglycerol (Na‐salt) (DPPG) and 1,2‐Dipalmitoyl‐sn‐glycero‐3‐

phosphoethanolamine (DPPE) were purchased from Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). 

Peptides  were  dissolved  in  phosphate‐buffered  saline  (20 mM  sodium  phosphate,  130 mM 

sodium chloride, pH 7.4) (PBS) at a concentration of 3 mg/ mL before each experiment. Aqueous 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

174

dispersions of  lipids of 0.1%  (w/ w)  in PBS buffer were prepared before measurement  in  the 

presence  (lipid‐to‐peptide molar  ratios of 25:1 and 120:1) or absence of peptides.  Liposomes 

were  prepared  10‐15°C  above  the  phase  transition  temperature  by  vigorous mixing.  DPPG 

liposomes were prepared as described by Zweytick et al.  [28]. Lipid  films of DPPE and DPPG/ 

DPPE 88:12 (w/ w) were hydrated at 70°C for 2 h. A freeze thaw protocol was used to increase 

homogeneity  of  the  lipid mixture. DSC  experiments were  performed  as  described  previously 

[10]. 

Results 

Proteomic stress response to ferrocene‐ and ruthenocene‐conjugated peptides  

Mechanistic  differences  between  the  individual  antimicrobial  peptides  were  investigated  by 

proteomic  profiling  of  the  B.  subtilis  antibiotic  stress  response  to  sublethal  peptide 

concentrations (Supplementary Fig. 1). To this end, proteins newly synthesized under antibiotic 

stress were  radioactively  pulse‐labeled with  [35S]‐L‐methionine.  Proteins more  than  two‐fold 

upregulated in three independent replicate experiments are referred to as marker proteins for 

the  compound under  investigation  [29],  [30]. Both  all‐L  and  all‐D  versions of  the unmodified 

MP196,  the  ruthenocene‐substituted MP276,  the  ferrocene‐substituted MP66,  and  the  all‐L 

cyclic MP66  derivative MP159 were  investigated. A  number  of marker  proteins, which were 

described previously as specific  indicators  for different aspects of cell envelope damage, were 

upregulated in response to the peptides (Fig. 1, Table 1, Supplementary Table 1, Supplementary 

Fig. 2‐5). YceC and YceH, marker proteins shared by the peptides, are upregulated  in response 

to several cell wall and membrane‐targeting antibiotics but  their  functions are unknown  [22]. 

Several other marker proteins are regulated by the extracytoplasmic function sigma factors M 

(σM), X (σX), and W (σW), which are responsive to cell envelope stress [31, [32], [33], [34]. 

PspA and NadE, specific markers for membrane stress [22], were upregulated in response to all 

peptides. The phage  shock protein A  (PspA)  is known  to  stabilize  the  cytoplasmic membrane 

under  stress  conditions  [35]. NAD  synthase  (NadE)  is  indicative  of  energy  limitation  and  its 

upregulation may compensate for respiratory chain  inhibition. Other proteins were  involved in 

compensating for energy  limitation such as NfrA and YwrO were upregulated. There were also 

marker proteins that indicate an adaptation of the membrane composition, such as YjdA, YoxD, 

YuaI, and FabF.  

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

175

Table 1: Marker proteins induced by the different peptide conjugates 

protein ID L‐MP196  D‐MP196  L‐MP276  D‐MP276 L‐MP66 D‐MP66  L‐MP159  protein function  stress category  regulator 

SpoVG  x  x  x      

x negative effector of asymmetric 

septation at the onset of sporulation sporulation  σH 

Spo0M  x  x  x  x  x  sporulation‐control gene  sporulation  σW/ σH 

YdaG  x  x  x  x  x  general stress protein  general stress  σB 

YtxH  x  x  general stress protein  general stress  σB/ σH 

GsiB  x  x  x  x  x  general stress protein  general stress  σB 

Dps  x  x  x  x  DNA‐protecting protein, ferritin  general stress  σB 

ClpP  x  x  

x  

x  x ATP‐dependent Clp protease 

proteolytic subunit general stress  σB 

YtkL  x  x  general stress protein  general stress  σB 

PpiB  x  peptidyl‐prolyl isomerase  chaperone  unknown 

YdbD  x  x  x  x  x  manganese‐containing catalase  oxidative stress  unknown 

AzoR2  x  x  x  x  x  x  azoreductase  oxidative stress  σG 

MrgA    

x      

x mini‐ferritin, DNA‐binding stress 

protein oxidative stress  PerR 

YwbC  x  putative methylglyoxalase oxidative stress unknown

YphP    

x        

disulfide isomerase, putative 

bacilliredoxin oxidative stress  unknown 

Tpx  x  probable thiol peroxidase oxidative stress Spx

TrxA  

x  

x      

thioredoxin A  oxidative stress CtsR, Spx, 

σB 

SodA  x  x  x  x  superoxide dismutase  oxidative stress  σB 

YceC*  x  x  x  x  x  x  x  similar to tellurium resistance protein  cell envelope stress  σB/ σW/ σM

YceH*  x  x  

x    

x similar to toxic anion resistance 

protein cell envelope stress  σB/ σW/ σM

YthP  x  x  x  similar to ABC transporter  cell envelope stress  σW 

YfhM  x            x  similar to epoxide hydrolase  cell envelope stress  σB/ σW 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

176

protein ID L‐MP196  D‐MP196  L‐MP276  D‐MP276 L‐MP66 D‐MP66  L‐MP159  protein function  stress category  regulator 

FosB  x  x  x  bacillithiol‐S‐transferase  cell envelope stress  σW 

YtrE#  x  similar to ABC transporter  cell envelope stress  YtrA 

SalA          

x  

negative regulator of scoC expression, 

derepresses subtilisin E cell envelope stress  SalA 

LiaH#  x  x  x  x  x  x  x  similar to phage shock protein  cell wall  LiaRS 

DltA  x  x    

x  x  

D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein 

ligase cell wall  σD/ σX/ σM 

RacX  x  x  x  x  x  x  amino acid racemase  cell wall  σW 

PspA°  x  x  x  x  x  x  x  phage shock protein A homolog  membrane  σW 

YjdA  x  x  x  x  x  x  x similar to 3‐ketoacyl‐ acyl‐carrier 

protein reductase membrane  σE 

YoxD  x  x  x  x  x  x  x similar to 3‐oxoacyl‐ acyl‐carrier 

protein reductase membrane  unknown 

YuaI  x  x  

x  x    

involved in reducing membrane 

fluidity membrane  σW 

YfjR            

x similar to 3‐hydroxyisobutyrate 

dehydrogenase membrane  YclJ 

FabF      

x  x    

beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein 

synthase II membrane  FapR, σW 

NadE°  x  x  x  x  x  x  x  NAD synthetase  energy  σB 

BglH  x x  phospho‐beta‐glucosidase energy CcpA

CitZ  x x  x citrate synthase energy CcpA

YwrO  x  x  x  x  x  similar to NAD(P)H oxidoreductase  energy  unknown 

YkpA    x    x       similar to ABC transporter (ATP‐

binding protein) energy  unknown 

YhdN  x      

x    

aldo/ keto reductase specific for 

NADPH energy  σB 

NfrA  x  x  x  x  x  x  x FMN‐containing NADPH‐linked nitro/

flavin reductase energy  Spx 

IolS  x              also/ keto reductase  energy  IolR 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

177

protein ID L‐MP196 D‐MP196  L‐MP276 D‐MP276 L‐MP66 D‐MP66 L‐MP159 protein function stress category regulator

YqkF  

x  x  

x  x  

NADPH‐dependent aldo‐keto 

reductase energy  unknown 

RocA  x            

3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate 

dehydrogenase amino acids  RocR 

ArgC    

x        

N‐acetyl‐g‐glutamyl‐phosphate 

reductase amino acids  AhrC 

TrmB#  x  tRNA (m7G46) methyltransferase  tRNA modification  unknown 

GreA  x  x transcription elongation factor transcription unknown

EfTU        

x    

elongation factor TU  translation stringent 

response 

Frr    

x        

ribosome recycling factor  translation stringent 

response 

RpsB  x x  ribosomal protein S2 translation unknown

YvlB  x x  x x unknown  unknown unknown

YtoQ  x  unknown  unknown  unknown 

YqiW     x     x  x        unknown  unknown  unknown 

*marker for general cell envelope stress, #specific marker for cell wall biosynthesis  inhibition, °specific marker for membrane damage 

[21] 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

178

The  PspA  homolog  LiaH,  a  specific  proteomic marker  for  the  inhibition  of membrane‐bound 

steps of  cell wall biosynthesis  [22], was  strongly upregulated. The amino acid  racemase RacX 

might  feed  D‐amino  acids  into  cell  wall  biosynthesis  or  lipoteichoic  acid  D‐alanylation,  a 

bacterial strategy to restrict access to the cytoplasmic membrane [36]. DltA, which is involved in 

lipoteichoic acid D‐alanylation, was upregulated by MP196 and MP66.  

Overall, the proteomic responses to the different peptides were in good agreement suggesting 

that the peptides act by the same mechanism. The ruthenium‐substituted peptide L‐MP276 led 

to upregulation of a unique subset of proteins  regulated by  the general stress sigma  factor B 

(σB)  and  the  regulators  Spx  and  PerR,  which  are  responsive  to  oxidative  stress  and  to 

membrane‐related stress [37], [38], [39]. 

Metal‐dependent formation of reactive oxygen species 

To examine oxidative stress in vivo, the formation of reactive oxygen species in response to the 

metallated and umetallated peptides was investigated using the CellROX fluorescent dye. In the 

presence of different  reactive oxygen  species,  including  superoxide and hydroxyl  radicals,  the 

dye  fluoresces  red.  Hydrogen  peroxide‐treated  cells  served  as  positive  control  and  showed 

strong fluorescence, while no signal was detected in untreated control cells (Fig. 2).  

 

Figure  2:  Formation  of  reactive  oxygen  species  in  B.  subtilis.  Red  fluorescence  indicates 

presence  of  reactive  oxygen  species  in  the  cells. Hydrogen  peroxide was  used  as  a  positive 

control. 

 

The  unmodified  peptide  L‐MP196  and  the  ruthenocene‐containing  L‐MP276  did  not  give  a 

fluorescence signal, while cells treated with the  ferrocene‐peptide L‐MP66 strongly  fluoresced 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

179

red suggesting high abundance of reactive oxygen species. The fact that no oxidative stress was 

observed  after  treatment with  the  ruthenocene‐peptides  suggested  a  difference  in  peptide‐

membrane interaction rather than ruthenium‐specific formation of reactive oxygen species. 

Ruthenocene‐specific aspects of the in vivo mechanism of action 

Proteomic profiling indicated that interactions of any of the peptides with the membrane do not 

involve pore  formation and that cell wall biosynthesis  is  inhibited at a membrane‐bound step. 

Both  aspects were  validated  using  a  set  of microscopic  assays  performed  under  proteomic 

profiling  conditions  in  the  same  chemically  defined  medium  (Supplementary  Fig.  2). 

Delocalization  of  a  GFP‐labeled  cell  division  protein  MinD  indicated  depolarization  by  all 

peptides  (Supplementary Fig. 6A). No pore  formation was observed when probing membrane 

permeabilization  for the red‐fluorescing propidium  iodide  (Supplementary Fig. 6B). Corruption 

of  cell  wall  integrity  due  to  impaired  lipid  II  synthesis  was  confirmed  by  extrusion  of  the 

cytoplasmic  membrane  through  cell  wall  holes  after  acetic  acid/  methanol  fixation 

(Supplementary Fig. 6C).  

None of the three assays revealed any difference in mechanism between the different peptides. 

In the chemically defined medium the ruthenocene‐derivatives were 10‐times more potent than 

the non‐metallated peptides. Minimal inhibitory concentrations (MICs) were 9 µg/ mL L‐MP196, 

10 µg/ mL D‐MP196, 0.9 µg/ mL MP276, and 1 µg/ mL D‐MP276. The further characterization of 

the peptides’ mechanisms of action was performed  in complex culture broth, where peptides 

could be applied at similar molarity. 

The  influence  of  the  peptides  on  the main metabolic  routes was  investigated  by  promoter 

activity  assays.  To  this  end,  B.  subtilis  strains  with  the  firefly  luciferase  gene  fused  to  the 

promoters of selected marker genes responsive to DNA damage (yorB), transcription inhibition 

(helD),  translation  inhibition  (bmrC),  and  cell  envelope  damage  (ypuA,  liaI)  [10],  [24]  were 

treated with the peptides. None of the peptides activated transcription from the promoters of 

yorB, helD, or bmrC. The promoter of the cell envelope stress gene ypuA (Fig. 3) was activated 

by  all peptides,  supporting  their  action on  the  cell  envelope.  The  liaI promoter was  strongly 

activated  by  all  peptides  except  for  L‐MP196,  which  led  to  only  marginal  activation.  The 

ruthenocene‐peptides activated both the  liaI and the ypuA promoter at a  lower concentration 

and a very narrow concentration range compared to the unmodified peptides.  

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

180

 

Figure 3: Activation of transcription from promoters indicative of different types of stress. (A) L‐

MP196,  (B)  D‐MP196,  (C)  L‐MP276,  (D)  D‐MP276.  Promoter  regions  are  fused  to  the  firefly 

luciferase gene allowing chemiluminescence‐based detection of transcription activation. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

181

Incorporation  of  radioactive  precursor  molecules  into  all  macromolecules  was  moderately 

inhibited  by  both  L‐MP196  and  L‐MP276  (Supplementary  Fig.  7)  indicating  no  significant 

difference  between  the  unmodified  and  the  ruthenocene‐peptide.  Such  effects  on multiple 

macromolecule synthesis pathways are frequently observed for membrane‐targeting antibiotics 

due to energy limitation. In a previous study no direct interaction of MP196 with components of 

the membrane‐bound cell wall biosynthesis machinery has been observed in vitro [10]. L‐MP196 

was  shown  to  influence  cell  wall  biosynthesis  indirectly  by  causing  a  peripheral membrane 

protein  involved  in  lipid  II  synthesis, MurG,  to dissociate  from  the membrane. As  in  case  of 

MP196, no influence on in vitro lipid II synthesis was observed for the ruthenocene peptides and 

none of them bound to lipid II in vitro (Supplementary Fig. 8). In contrast to L‐ and D‐MP196, the 

ruthenocene‐peptides  L‐  and  D‐MP276  moved  with  the  mobile  phase  in  the  thin  layer 

chromatography,  probably  due  to  increased  hydrophobicity  due  to  the  hydrophobic  metal 

complex and reduced charge (two instead of four positive charges).  

 

Figure 4:  Influence on membrane function. (A) Respiratory chain activity  in Micrococcus flavus 

inverted vesicles was monitored with the formazan dye iodonitrotetrazolium chloride changing 

fluorescence upon reduction. (B) Potassium release from Bacillus megaterium whole cells was 

measured with a K+‐sensitive electrode and expressed relative to positive control nisin.   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

182

Energy limitation after L‐MP196 treatment was due to inhibition of the respiratory chain, which 

was accompanied by delocalization of the peripheral membrane protein cytochrome c involved 

in electron  transport  [10]. An even  stronger effect on  the  respiratory chain was observed  for 

both L‐ and D‐MP276 compared to L‐ and D‐MP196 (Fig. 4A). All peptides were more effective in 

inhibiting electron transfer than rotenone and antimycin A, specific inhibitors of complex I and 

III,  respectively. As  for L‐MP196, no direct effect of L‐MP276 on  the H+‐ATPase was observed 

(Supplementary Fig. 9). 

In  case  of  L‐MP196,  membrane  depolarization  and  inhibition  of  the  respiration  was  not 

accompanied by  ion  leakage.  It has been shown not to facilitate any  ion fluxes  in regular, salt‐

containing medium or in osmotically stabilizing choline buffer [10]. Here, both L‐ and D‐MP276 

led to immediate potassium release into choline buffer, while no significant effect was observed 

for L‐ and D‐MP196 even at 50x MIC (Fig. 4B). 

Discussion 

The  influence of  ferrocene and  ruthenocene  substitutions on  the mechanism of action of  the 

short antimicrobial hexapeptide MP196 was  investigated. Proteomic profiling of  the bacterial 

stress responses to the individual peptides revealed no major differences  in their physiological 

impact on B. subtilis. The stress responses to all peptides similarly reflected a membrane‐related 

mechanism of action consistent with peptide integration into the phospholipid bilayer. Further, 

energy  limitation  and  cell wall  biosynthesis  inhibition were  apparent,  a  dual  stress  response 

described previously for L‐MP196. Due to a change of the membrane architecture upon peptide 

integration  into  the  phospholipid  bilayer,  peripheral membrane  proteins  are  delocalized,  an 

effect  observed  for  cytochrome  c  involved  in  respiration  and  MurG  involved  in  cell  wall 

biosynthesis.  Consequently,  the  respiratory  chain  is  inhibited  resulting  in  ATP  limitation  and 

integrity of the cell wall is corrupted [10].  

Although the ruthenocene‐substituted L‐MP276 did not induce accumulation of reactive oxygen 

species, upregulation of a number of oxidative stress‐related proteins regulated by σB, Spx, and 

PerR  was  observed.  The  σB‐dependent  general  stress  response  is  typically  activated  by 

membrane‐targeting compounds through energy limitation [37], [38]. PerR is activated upon ion 

limitation [39] and has been shown to be responsive to  ionophores [40]. Spx is also connected 

with thermo tolerance [41], a process also strongly dependent on the membrane composition 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

183

[42].  Thus,  such  proteins  might  be  rather  upregulated  in  response  to  peptide‐membrane 

interaction than to formation of reactive oxygen species.  

The ferrocene‐peptide L‐MP66 strongly induced formation of reactive oxygen species. This is in 

line with the results obtained for ferrocene‐ and ruthenocene‐conjugated PNA derivatives [7] as 

well as with observations made for the antimalarial ferroquine [43], [44]. The ferrocenoyl‐PNA 

elicited  a  strong  oxidative  stress  response  on  the  proteome  level  and  the  ferrocene moiety 

positively influenced antibacterial activity [7]. MP66, while causing formation of reactive oxygen 

species, did not  induce a dedicated oxidative  stress  response and did not  considerably differ 

from MP196  in  its antibacterial activity  in a standardized minimal  inhibitory concentration test 

[13],  [15].  Apparently,  ferrocene  confers  reactive  oxygen  species‐producing  properties  to 

different compound classes but does not necessarily significantly affect the antibiotic activity. 

The  mode  of  action  of  the  ruthenocenoyl‐peptides,  which  were  designed  originally  for 

intracellular peptide  tracing  [12], did not differ  from  L‐MP196 with  regard  to depolarization, 

pore  formation,  cell  wall  biosynthesis  inhibition,  and  incorporation  of  precursors  into  

macromolecules. Minor  differences were  observed  in  promoter  activation  studies. While  all 

peptides similarly activated transcription from the ypuA promoter  indicating cell wall stress, L‐

MP196  was  the  only  peptide  not  activating  transcription  from  the  liaI  promoter.  Such  a 

difference was not observed on the proteome level, where LiaH (encoded by liaH in one operon 

with liaI) was the most strongly upregulated protein in response to all of the peptides including 

L‐MP196.  Promoter  induction  was  measured  after  30  minutes  at  different  antibiotic 

concentrations [24]. On the proteome level the highest LiaH synthesis rates were observed after 

15 minutes, while  no  synthesis was  observed  after  30  or  60 minutes  (unpublished  results), 

suggesting that the lia operon is expressed intermittently in response to L‐MP196. 

The  ruthenocene‐substituted  peptides  differed  from  the  unmodified  peptides  in  that  they 

increase membrane permeability, leading to a fast release of potassium ions into choline buffer. 

This was not observed  for L‐ or D‐MP196 at concentrations up to 50x MIC.  It was shown that 

MP196  is  able  to  provoke  ion  leakage  in  salt‐free  buffer,  probably  due  to  membrane 

destabilization under  low‐osmolarity conditions  [10]. The minimal  inhibitory concentrations of 

L‐ and D‐MP196 were higher  in  the chemically defined comparably salt‐rich medium used  for 

proteomics  than  in Mueller‐Hinton broth.  This  effect was not observed  for  L‐  and D‐MP276, 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

184

which displayed slightly lower minimal inhibitory concentrations in chemically defined medium. 

Apparently,  osmolarity  does  not  protect  equally well  against membrane  permeabilization  by 

MP196 and MP276. Since osmoprotection was identified as a bacterial defense strategy against 

bacteriolytic peptides, it will be interesting to investigate the reasons underlying the difference 

in membrane permeabilization on molecular level in future studies. A first hint is constituted by 

the  finding  that  the  ferrocene‐conjugated  MP66,  which  displays  membrane‐disruptive 

properties  (Supplementary  Fig.  10),  exhibits  less  phospholipid  selectivity  than  MP196  in  a 

differential scanning calorimetry experiment monitoring changes  in  fatty acyl chain packing of 

different model membranes after peptide addition (Supplementary Fig. 11), suggesting different 

interaction of metallocene‐substituted and unmodified peptides with phospholipid bilayers.  

Our results show that derivatization of an antimicrobial peptide with ferrocene or ruthenocene 

does not change the principle mode of action yet allows metal‐specific modulations. In contrast 

to ruthenocene, ferrocene leads to formation of reactive oxygen species in the cytosol. In some 

instances oxidative stress generation may be an attractive additional mechanistic component to 

build  into  existing molecules  as  shown  for  ferroquine  [44].  Ruthenocene might  be  used  to 

enhance bacteriolytic properties of peptides.  

Acknowledgements 

This  work  was  financially  supported  by  a  RUB  start‐up  grant  (J.E.B),  the  RUB  Research 

Department Interfacial Systems Chemistry (N.M.N, J.E.B), and a grant from the German federal 

state  of  North  Rhine‐Westphalia  and  the  European  Union,  European  Regional  Development 

Fund, "Investing in your future" (N.M.N, J.E.B, H.G.S). JEB acknowledges financial support for the 

mass spectrometer by the state of North Rhine Westphalia (Forschungsgroßgerät der Länder). 

References 

1. Wenzel M, Bandow,  JE.  (2012) Proteomic signatures  in antibiotic research. Proteomics 11: 

3256‐3268. 

2. Patra M, Gasser G, Metzler‐Nolte N. (2012) Small organometallic compounds as antibacterial 

agents. Dalton Trans 41: 6350‐6358. 

3. Biot  C,  Nosten  F,  Fraisse  L,  Ter‐Minassian  D,  Khalife  J,  et  al.  (2011)  The  antimalarial 

ferroquine: from bench to clinic. Parasite 18: 207‐214. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

185

4. Dubar F, Egan TJ, Pradines B, Kuter D, Ncokazi KK, et al. (2011) The antimalarial ferroquine: 

role of  the metal and  intramolecular hydrogen bond  in activity and  resistance. ACS Chem 

Biol 6: 275‐287.  

5. Gasser G, Ott I, Metzler‐Nolte N. (2011) Organometallic anticancer compounds. J Med Chem 

54: 3‐25. 

6. Amyes  SGB.  (2001) Magic  bullets  lost  horizons:  The  rise  and  fall  of  antibiotics.  Taylor & 

Francis Inc, London. 

7. Wenzel M,  Patra M,  Senges  CHR,  Ott  I,  Stepanek  JJ,  et  al.  (2013) Mechanism  of  action 

analysis  of  potent  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compounds  ‐  a  structurally  new 

class of antibiotics. ACS Chem Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

8. Patra P, Wenzel M, Prochnow P, Pierroz V, Gasser G, et al. (2012) Structural optimization of 

an  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compound:  identification  of  the  essential 

organometallic moiety required for antibacterial activity. in preparation. 

9. Brötz‐Oesterhelt H,  Brunner NA.  (2008) How many modes  of  action  should  an  antibiotic 

have? Curr Opin Pharmacol 8: 564‐573. 

10. Strøm MB, Haug BE,  Skar ML,  Stensen W,  Stiberg  T, et  al.  (2003)  The pharmacophore of 

short cationic antibacterial peptides. J Med Chem 46: 1567‐1570. 

11. Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, et al. An antimicrobial peptide delocalizes 

peripheral membrane proteins. submitted. 

12. Wenzel  M,  Gust  R,  Bürger  M,  Albada  HB,  Penkova  M,  et  al.  Quantitative  tracing  of 

ruthenocene derivatives for subcellular  localization of antimicrobial peptides  in bacteria.  in 

preparation. 

13. Chantson  JT,  Verga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  (2006)  Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem 1: 1268‐1274. 

14. Chantson  JT,  Varga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  (2005)  Antibacterial 

activities of ferrocenoyl‐ and cobaltocenium‐peptide bioconjugates. J Organomet Chem 690: 

4564‐4574. 

15. Albada  HB,  Chiriac  AI, Wenzel M,  Penkova M,  Bandow  JE,  et  al.  (2012) Modulating  the 

activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing  antibacterial  peptides  with  N‐terminal 

metallocenoyl groups. Beilstein J Org Chem 8: 1753‐1764. 

16. Bonelli  RR,  Schneider  T,  Sahl  HG, Wiedemann  I.  (2006)  Insights  into  in  vivo  activities  of 

lantibiotics  from  gallidermin  and  epidermin  mode‐of‐action  studies.  Antimicrob  Agents 

Chemother 50: 1449‐57. 

17. Wenzel M, Patra M, Albrecht D, Chen DY, Nicolaou KC, et al. (2011) Proteomic signature of 

fatty  acid  biosynthesis  inhibition  available  for  in  vivo  mechanism‐of‐action  studies. 

Antimicrob Agents Chemother 55: 2590‐2596. 

18. Agnostopoulos C,  Spizizen  J.  (1961) Requirements  for  transformation  in Bacillus  subtilis.  J 

Bacteriol 81: 741‐746. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

186

19. Stülke  J, Hanschke R, Hecker M.  (1993) Temporal activation of betaglucanase  synthesis  in 

Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J Gen Microbiol 139: 2041‐2045. 

20. Bandow  JE,  Baker  JD,  Berth M,  Painter  C,  Sepulveda  OJ,  et  al.  (2008)  Improved  image 

analysis workflow  for 2D gels enables  large‐scale 2D gel‐based proteomics  studies  ‐ COPD 

biomarker discovery study. Proteomics 8: 3030‐3041. 

21. Strahl H, Hamoen  LW.  (2010) Membrane potential  is  important  for bacterial  cell division. 

Proc Natl Acad Sci USA 27: 12281‐12286. 

22. Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, et al. (2012) Proteomic response of 

Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects  differences  in  interaction  with  the  cytoplasmic 

membrane. Antimicrob Agents Chemother 56: 5749‐5757. 

23. Schneider,  T,  Kruse  T, Wimmer  R, Wiedemann  I,  Sass  V,  et  al.  (2010)  Plectasin,  a  fungal 

defensin, targets the bacterial cell wall precursor lipid II. Science 328: 1168‐1172. 

24. Urban A, Eckermann S, Fast B, Metzger S, Gehling M, et al. (2007) Novel whole‐cell antibiotic 

biosensors for compound discovery. Appl Environ Microbiol 73: 6436‐6443. 

25. Schneider T, Kruse T, Wimmer R, Wiedemann  I, Sass V, et al.  (2004)  In vitro assembly of a 

complete, pentaglycine  interpeptide bridge  containing  cell wall precursor  (lipid  II‐Gly5) of 

Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 53: 675‐685. 

26. Rick PD, Hubbard GL, Kitaoka M, Nagaki H, Kinoshita T, et al. (1998) Characterization of the 

lipid  carrier  involved  in  the  synthesis  of  enterobacterial  common  antigen  (ECA)  and 

identification of a novel phosphoglyceride in a mutant of Salmonella typhimurium defective 

in ECA synthesis. Glycobiology 8: 557‐567. 

27. Orlov  DS,  Nguyen  T,  Lehrer  RI.  (2002)  Potassium  release,  a  useful  tool  for  studying 

antimicrobial peptides. J Microbiol Methods 49: 325‐328. 

28. Zweytick D, Pabst G, Abuja PM, Jilek A, Blondelle SE, et al. (2006) Influence of N‐acylation of 

a peptide derived from human lactoferricin on membrane selectivity. Biochim Biophys Acta 

1758: 1426‐1143. 

29. Bandow  JE, Brötz H,  Leichert  LI,  Labischinski H, Hecker M.  (2003) Proteomic  approach  to 

understanding antibiotic action. Antimicrob Agents Chemother. 47: 948‐955. 

30. Brötz‐Oesterhelt H, Beyer D, Kroll HP, Endermann R, Ladel C, et al. (2005) Dysregulation of 

bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 11: 1082‐1087.  

31. Cao M,  Helmann  JD.  (2004)  The  Bacillus  subtilis  ectracytoplasmic‐function  sigmaX  factor 

regulates modification of the cell envelope and resistance to cationic antimicrobial peptides. 

J Bacteriol. 186: 1136‐1146. 

32. Cao M, Kobel PA, Morshedi MM, Wu MFW, Paddon C, et al.  ( 2002) Defining  the Bacillus 

subtilis  σW  regulon:  a  comparative  analysis  of  promoter  consensus  search,  run‐off 

transcription/microarray analysis (ROMA), and transcriptional profiling approaches 1. J Mol 

Biol 316: 443‐457. 

33. Eiamphungporn W, Helmann JD. (2008) The Bacillus subtilis σM regulon and its contribution 

to cell envelope stress responses. Mol Microbiol. 67, 830‐48. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

187

34. Helmann JD.  (2002) The extracytoplasmic  function  (ECF) sigma  factors. Adv Microb Physiol 

46: 47‐110. 

35. Kobayashi R, Suzuki T, Yoshida M. (2007) Escherichia coli phage‐shock protein A (PspA) binds 

to membrane phospholipids and  repairs proton  leakage of  the damaged membranes. Mol 

Microbiol 66: 100‐109. 

36. Weidenmaier  C,  Peschel  A.  (2008)  Teichoic  acids  and  related  cell‐wall  glycopolymers  in 

Gram‐positive physiology and host interactions. Nat Rev Microbiol 6: 276‐267. 

37. Hecker M, Völker U.  (2001) General stress  response  in Bacillus subtilis and other bacteria. 

Adv Microb Physiol 44: 35‐91. 

38. Turgay K. (2013) Protein arginine phosphorylation  in Bacillus subtilis. Annual Conference of 

the German Society for General and Applied Microbiology (VAAM) 2013. abstr RSV2‐FG. 

39. Chen L, Keramati L, Helmann  JD.  (1995) Coordinate  regulation of Bacillus subtilis peroxide 

stress genes by hydrogen peroxide and metal ions.  Proc Natl Acad Sci USA 92: 8190‐8194. 

40. Voelker U, Voelker A, Haldenwang WG. (1996) Reactivation of the Bacillus subtilis anti‐sigma 

B antagonist, RsbV, by stress‐ or starvation‐induced phosphatase activities. J Bacteriol 178: 

5456‐5463. 

41. Raatschen  N,  Wenzel  M,  Leichert  LI,  Düchting  P,  Krämer  U,  et  al.  Extracting  iron  and 

manganese from bacteria with ionophores ‐ a mechanism against competitors characterized 

by  increased  potency  in  environments  low  in  micronutrients.  Proteomics.  doi: 

10.1002/pmic.201200556. 

42. Šajbidor J. (1997) Effect of Some Environmental Factors on the Content and Compositions of 

Microbial Membrane Lipids. Crit Rev Biotechnol 17: 87‐103. 

43. Biot  C,  Castro W,  Botté  CY, Navarro M.  (2012)  The  therapeutic  potential  of metal‐based 

antimalarial agents: implications for the mechanism of action. Dalton Trans 41: 6335‐6349. 

44. Dubar F, Bohic S, Dive D, Guérardel Y, Cloetens P, et al. (2012) Deciphering the Resistance‐

Counteracting Functions of Ferroquine in Plasmodium falciparum‐Infected Erythrocytes. ACS 

Med Chem Lett 3: 480‐483. 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

188

Supplementary Information 

 

Contents 

i. Supplementary Tables 

ii. Supplementary Figures 

 

 

i. Supplementary Tables 

Table S1: Mass spectrometric identification of upregulated marker proteins 

protein ID  molecular weight  pI  peptide count  Mascot score     Mascot % score 

ArgC  38,049  5.30  14  342  100 

AzoR2  23,257  5.26  7  117    100 

BglH  53,255  5.13  13  287    100 

CitZ  41,702  5.55  16  444    100 

ClpP  21,668  5.19  12  353    100 

DltA  55,773  5.10  13  276    100 

Dps  16,583  4.64  8  168    100 

EfTU  44,565  4.92  6  458  100 

FabF  43,977  4.76  60  4,091    * 

FosB  17,161  6.14  4  754  *  ‐ 

Frr  20,754  5.52  9  31  100 

GreA  17,261  4.68  11  339  100 

GsiB  13,789  5.31  5  122  100 

IolS  35,146  5.50  16  280    100 

LiaH  25,682  6.20  13  112    100 

MrgA  17,322  4.79  3  184  100 

NadE  30,376  5.07  16  459    100 

NfrA  28,302  5.73  20  9,602  *  ‐ 

PpiB  15,246  5.53  3  149  100 

PspA  25,125  5.87  11  91    100 

RacX  25,270  5.46  3  73    100 

RocA  56,284  5.58  52  12,601  *  ‐ 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

189

protein ID  molecular weight  pI  peptide count  Mascot score     Mascot % score 

RpsB  27,950  6.27  16  279    100 

SalA  38,614  5.23  33  6,829   *  ‐ 

SodA  22,561  5.33  6  450  100 

Spo0M  29,714  4.26  63  25,783  *  ‐ 

SpoVG  10,886  5.25  10  348    100 

Tpx  18,204  4.89  15  403  100 

TrmB  24,488  6.32  7  53    98 

TrxA  11,385  4.30  11  11,205  *  ‐ 

YceC  21,810  5.46  14  224    100 

YceH  41,646  5.90  13  263    100 

YdaG  15,867  5.33  5  100    100 

YdbD  30,238  5.06  10  103    100 

YfhM  32,737  6.07  20  7,499  *  ‐ 

YfjR  27,848  4.97  4  109  100 

YhdN  37,289  4.96  10  132    100 

YjdA  27,432  5.74  5  55    99 

YkpA  61,017  4.98  89  5,582  *  ‐ 

YoxD  25,283  5.48  20  434    100 

YphP  15,865  4.81  5  94    100 

YqiG  40,780  5.34  19  325    100 

YqiW  16,186  5.00  7  137  100 

YqkF  34,695  5.30  10  126  100 

YthP  26,490  5.39  5  195    100 

YtkL  24,816  5.14  8  75  100 

YtoQ  16,780  5.77  14  9,248  *  ‐ 

YtrE  25,444  5.99  11  241    100 

YtxH  16,675  5.30  5  131    100 

YuaI  19,830  5.31  7  167    100 

YvlB  41,056  5.50  15  121    100 

YwbC  14,424  4.62  7  231  100 

YwrO  19,942  5.33  7  166     100 

 

* Identification was carried out using a Synapt G2S HDMS mass spectrometer. PLGS scores are displayed.

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

190

ii. Supplementary Figures 

 

  Figure  S1:  Growth  of  B.  subtilis  in  chemically  defined medium  under  acute  peptide  stress. 

Arrowheads mark  the  time points of antibiotic addition. Concentrations chosen  for proteomic 

profiling are underlined.    

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

191

 

Figure S2: Proteomic  response of B.  subtilis after  treatment with D‐MP276. Protein  synthesis 

profiles of  the untreated  control were  false  colored  in  green,  those of  the  antibiotic‐treated 

cultures in red. Images of autoradiographs were overlayed and protein spots quantified. Marker 

proteins more  than  twofold upregulated  in each of  three  independent  replicates  are  labeled 

with the protein names, unidentified markers are circled.   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

192

 

Figure S3: Figure S1: Proteomic profile of B. subtilis in response to L‐MP66. 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

193

 

Figure S4: Proteomic profile of B. subtilis in response to D‐MP66 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

194

 

Figure S5: Proteomic profile of B. subtilis in response to L‐MP159 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

195

  

Fig  S6:  Influence  on  membrane  and  cell  wall  integrity.  (A)  Localization  of  GFP‐MinD. 

Delocalization  of  GFP‐MinD  is  indicative  of  membrane  depolarization.  (B)  Membrane 

permeability for SYTO 9 (green) and propidium iodide (red). SYTO 9 is a DNA‐staining dye able to 

penetrate cells through intact membranes while propidium iodide may only enter cells through 

membrane pores or large holes. (C) Cell shape after fixation with acetic acid and methanol (1:3). 

Fixation  in acetic acid and methanol  leads to extrusion of the cytoplasmic membrane through 

holes  in  the cell wall, which occur, when membrane‐bound steps of cell wall biosynthesis are 

impaired. 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

196

 

Figure  S7:  Uptake  of  radioactively  labeled  precursor  molecules  by  S.  simulans.  (A)  DNA 

precursor  thymidine,  (B) RNA precursor uridine,  (C) protein precursor  isoleucine,  (D) cell wall 

precursor glucosamine. 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

197

 

Figure  S8:  Influence on  the  cell wall biosynthesis machinery.  (A)  Influence on  in  vitro  lipid  II 

synthesis, (B) binding to lipid II in vitro, (C) thin layer chromatography of peptides without lipid 

II. 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

198

 

 

Figure S9: Influence on H+‐ATPase activity in M. flavus inverted vesicles. Proton pumping activity 

was monitored with acridine orange, a dye changing absorption in a pH‐dependent manner. 

 

 

 

  

Figure S10: Leakage of ANTS/DPX from unilamellar POPG vesicles induced by MP196 and MP66. 

Leakage is expressed relative to positive control triton X‐100 causing vesicle lysis. 

   

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

199

 Figure S11: Influence of MP196 and MP66 on model membranes. (A) DPPG, (B) DPPE, (C) 88:12 

DPPG/DPPE. 

 

H Ferrocene- and ruthenocene-specific peptide mode of action modulation

200

I 

 

Analysis of the mechanism of action of potent 

antibacterial hetero‐tri‐organometallic compounds 

‐ a structurally new class of antibiotics 

 

Michaela Wenzel*, Malay Patra*, Christoph H. R. Senges, Ingo Ott, 

Jennifer J. Stepanek, Antonio Pinto, Pascal Prochnow, Cuong Vuong, 

Sina Langklotz, Nils Metzler‐Nolte, Julia E. Bandow  

 

 

 

 

 

 

ACS Chemical Biology, in press 

   

* equally contributed 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

201

Analysis  of  the  mechanism  of  action  of  potent  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic 

compounds ‐ a structurally new class of antibiotics 

 

Michaela Wenzel1#, Malay  Patra2#+,  Christoph H. R.  Senges1,  Ingo Ott4,  Jennifer  J.  Stepanek1, 

Antonio Pinto2++, Pascal Prochnow1, Cuong Vuong3,  Sina  Langklotz1, Nils Metzler‐Nolte2*,  and 

Julia E. Bandow1† 

1Biology of Microorganisms, Ruhr University Bochum, Germany 2Bioinorganic Chemistry, Ruhr University Bochum, Germany 3AiCuris GmbH & Co. KG, Wuppertal, Germany 4Institute  of Medicinal  and  Pharmaceutical  Chemistry,  Technische  Universität  Braunschweig, 

Germany +Current address: Department of Bioinorganic Chemistry, University of Zurich, Switzerland ++Current  address:  Clinic  of  Cardiovascular  Surgery,  Heinrich  Heine  University  Düsseldorf, 

Germany 

#These authors contributed equally to this work. 

*Corresponding  author  for  reported  chemistry.  Mailing  address:  Ruhr‐Universität  Bochum, 

Anorganische  Chemie  I  ‐  Bioanorganische  Chemie,  Universitätsstraße  150,  44801  Bochum, 

Germany. Phone: +49‐234‐32‐24153. Fax: +49‐234‐32‐14378. E‐mail: nils.metzler‐nolte@rub.de 

†Corresponding  author  concerning  biological  findings.  Mailing  address:  Ruhr‐Universität 

Bochum,  Biologie  der Mikroorganismen, Mikrobielle  Antibiotikaforschung,  Universitätsstraße 

150,  44801  Bochum,  Germany.  Phone:  +49‐234‐32‐23102.  Fax:  +49‐234‐32‐14620.  E‐mail: 

julia.bandow@rub.de 

 

ABSTRACT 

Two hetero‐tri‐organometallic  compounds with potent activity against Gram‐positive bacteria 

including multi‐resistant Staphylococcus aureus (MRSA) were identified. The compounds consist 

of a peptide nucleic acid backbone with an alkyne side chain, substituted with a cymantrene, a 

(di‐picolyl)Re(CO)3  moiety,  and  either  a  ferrocene  (FcPNA)  or  a  ruthenocene  (RcPNA). 

Comparative proteomic analysis indicates the bacterial membrane as antibiotic target structure. 

FcPNA  accumulation  in  the  membrane  was  confirmed  by  manganese  tracing  with  atomic 

absorption  spectroscopy.  Both  organometallics  disturbed  several  essential  cellular  processes 

taking place at the membrane such as respiration and cell wall biosynthesis, suggesting that the 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

202

compounds  affect  membrane  architecture.  Correlating  with  enhanced  antibacterial  activity, 

oxidative stress was induced only by the ferrocene‐substituted compound. The organometallics 

described  here  target  the  cytoplasmic  membrane,  a  clinically  proven  antibacterial  target 

structure,  feature a bactericidal but non‐bacteriolytic mode of action, and  limited cytotoxicity 

within  the  limits  of  solubility.  Thus,  FcPNA  represents  a  promising  lead  structure  for  the 

development of a new synthetic class of antibiotics. 

INTRODUCTION 

Bacterial antibiotic  resistance has become a major public health problem of our  time. This  is 

owed to the enormous bacterial adaptability causing rapid resistance development, acquisition, 

and spread. With a prevalence of methicillin‐resistant S. aureus (MRSA) in hospitals of up to 50% 

and  the prevalence of multi‐resistant Gram‐negative pathogens  steadily  rising,  it  is  clear  that 

new  antibiotics  with  full  activity  against  multi‐resistant  pathogens  are  urgently  needed. 

However,  the  number  of  newly  approved  antibiotics  steadily  declined  since  the  1980ies. 

Currently, on average less than one antibiotic reaches the market each year [1]. Most of these 

newly approved antibiotics belong to long‐established compound classes and are likely affected 

by cross‐resistance.  It  is therefore thought that the development of new compounds  from old 

classes  is  not  going  to  be  sufficient  to  counteract  bacterial  antibiotic  resistance,  and  the 

identification of structurally completely new classes is highly desirable. 

During the  last decade, only three new antibiotic classes were approved for clinical use: cyclic 

lipopeptides (daptomycin), pleuromutilines (ratapamuline), and glycylcyclines (tigecycline). The 

glycylcylines are synthetic tetracycline derivatives, thus structurally and mechanistically related 

to a long established antibiotic class. The cyclic lipopeptides and pleuromutilines are structurally 

and mechanistically  new  compounds  of microbial  origin.  Such  naturally  occurring  structures 

bear  the  risk  of  triggering  the  clinical manifestation  of  bacterial  adaptation  strategies  long‐

established  in  the  natural  environment  of  the producer.  This  has  already  been  observed  for 

daptomycin‐resistant strains, which show protective modifications of the cell envelope due  to 

enhanced lipoteichoic acid production [2,3]. In the natural environment, this adaptation of the 

cell  envelope  occurs  in  response  to  exposure  to  antimicrobial  compounds  secreted  by  other 

species  rendering  bacteria  cross‐resistant  to  vancomycin  and  telavancin  [4,5].  Fully  synthetic 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

203

structurally novel  antibiotic  classes might  give us  an  edge  in  the  fight  against multi‐resistant 

pathogens by avoiding pre‐existing resistance mechanisms. 

Recently,  we  reported  a  proof‐of‐principle  study  on  the  synthesis  of  the  hetero‐tri‐

organometallic compound FcPNA (Figure 1), attaching three distinct organometallic residues to 

a building block containing both a peptide nucleic acid (PNA) backbone and an alkyne side chain 

[6].  

 

Figure 1. Structures of the hetero‐tri‐organometallic compounds FcPNA and RcPNA. 

 

Characterized  by  a  pseudo‐peptide  backbone,  a  positive  charge,  and  three  lipophilic 

organometallic  residues,  namely  ferrocene,  cymantrene,  and  a  (di‐picolyl)Re(CO)3  moiety, 

FcPNA possesses distinct structural features not occurring in nature. At the same time, it shares 

chemical  properties  with  membrane‐active  antimicrobial  peptides,  which  often  are  both 

positively charged and lipophilic [7‐9]. Here we report on the antibiotic properties of FcPNA and 

the  identification of the bacterial membrane as  its antibiotic target structure. We observed an 

elevation in reactive oxygen species (ROS) in vivo in response to FcPNA treatment and were able 

to  link  ROS  formation  to  the  ferrocene  moiety  using  a  ruthenocene‐substituted  reference 

compound (RcPNA). 

RESULTS AND DISCUSSION 

Antibacterial potency and cytotoxicity 

Antibacterial activity of FcPNA was tested against both Gram‐positive and Gram‐negative strains 

according  to  the Clinical and Laboratory Standards  Institute  (CLSI) guidelines  (Table 1)  [10].  In 

water and growth media the limit of solubility was 25 µg mL‐1. While within the limit of solubility 

the  organometallic  compound was  inactive  against  Gram‐negative  pathogens  (Pseudomonas 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

204

aeruginosa,  Escherichia  coli,  Acinetobacter  baumannii),  it  exhibited  activity  against  Gram‐

positive  bacteria  (Staphylococcus  aureus,  Bacillus  subtilis)  in  the  low  micro  molar  range 

comparable to clinically used antibiotics.  

 

Table 1: Minimal inhibitory concentrations in µg mL‐1 and µM 

  FcPNA  RcPNA  amoxicillin  norfloxacin  vancomycin 

 

[µg mL‐1] 

[µM] 

[µg mL‐1] 

[µM] 

[µg mL‐1] 

[µM] 

[µg mL‐1] 

[µM] 

[µg mL‐1] 

[µM] 

B. subtilis (DSM 402)  2  1.4  32  21  3  8.2  1  3.1  0.5  0.3 

S. aureus (DSM 20231)  2  1.4  4  2.7  2  5.5  0.5  1.6  0.5  0.3 

S. aureus (ATCC43300)(MRSA)  2  1.4  6  4  48  131  0.5  1.6  1  0.7 

S. aureus (COL)(MRSA)  2  1.4  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d. 

S. aureus (Mu50)(VISA)  6  4  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  n.d. 

E. coli (DSM 30083)  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  64  175  0.5  1.6  96  66 

A. baumannii (DSM 30007)  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  >256  >700  0.75  2.3  64  44 

P. aeruginosa (DSM 50071)  n.d.  n.d.  n.d.  n.d.  >256  >700  4  13  >512  >353 

MIC  testing  was  performed  according  to  Clinical  and  Laboratory  Standards  Institute  (CLSI) 

guidelines. Results are reported in the CLSI standard unit for MICs (µg mL‐1) and in µM. n.d.: MIC 

was not reached up to the limit of solubility (25 µg ml‐1 for FcPNA and RcPNA). 

 

In contrast to amoxicillin, it exhibited full activity against MRSA strains ATCC 43300 and COL at 2 

µg mL‐1.  FcPNA  further  showed  good  activity  against  the  vancomycin‐intermediate  S.  aureus 

(VISA)  strain  Mu50  at  6  µg  mL‐1.  Survival  assays  indicated  that  FcPNA  is  a  bactericidal 

compound.  For B.  subtilis  the minimal  inhibitory  concentration of  FcPNA equals  the minimal 

bactericidal concentration, achieving more than 5‐log reduction in colony forming units after 24 

h.  Survival  rates  even  15 min  after  treatment  with  4  µg mL‐1  FcPNA  were  reduced  to  5% 

compared  to  untreated  controls.  Growth  experiments  showed  that  neither  compound  is 

bacteriolytic within the limits of solubility (data not shown).  

The  cytotoxicity of  FcPNA  against  several mammalian  cell  lines was  tested  in  three different 

assays  (Table 2). Moderate cytotoxicity close to  the  limit of solubility  (around 25 µg ml‐1) was 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

205

observed  for  NRK‐52E  and  CCRF‐CEM  cells  that  were  incubated  with  FcPNA  directly  after 

seeding microtiter plate wells.  

 

Table 2: Cytotoxicity of FcPNA against mammalian cell lines at the limit of solubility (25 µg mL‐1) 

was determined at three different stages of growth. 

Cell line  % viability % St.Dev.  IC50  [µg mL‐1]

Caco‐2 (human epithelial colorectal adenocarcinoma cell line)a 108 12.1  n.d. 

L6.C11 (rat skeletal muscle cell line) a  96 14.7  n.d. 

MCF7 (human epithelial breast cancer cell line) b         10 2.0 <3 

HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell line) b    92 12.7  n.d. 

HT29 (human colon carcinoma cell line) b    83 11.9  n.d. 

NRK‐52E (rat kidney epithelial cell line) c    55 16.0  n.d. 

CCRF‐CEM (human T‐cell lymphoblast cell line) c        57 6.3 n.d. 

a Cells were exposed to FcPNA 7 days after seeding. b Cells were exposed 24 h after seeding.  c 

Cells were exposed directly after seeding. 

n.d.:  IC50 values could not be calculated as 50%  inhibition was not  reached up  to  the  limit of 

solubility. 

 

Variable cytotoxicity was observed when cells were exposed to FcPNA 24 h after seeding, when 

cells were already attached but still growing into confluency. Under these conditions significant 

cytotoxicity  was  observed  for  MCF7  cells  with  an  IC50  of  less  than  3  µg  ml‐1,  while  low 

cytotoxicity was  observed  up  to  the  limit  of  solubility  for HepG2  and HT29  cells.  Finally,  no 

cytotoxicity was observed against differentiated Caco‐2 and L6.C11 cells that were exposed to 

FcPNA 7 days after seeding, when they were already fully established and no longer growing. All 

cell lines were grown in the presence of 10% fetal bovine serum. To estimate serum binding of 

FcPNA,  the minimal  inhibitory  concentration against B.  subtilis was  tested  in  the presence of 

10%  bovine  serum  albumin. A  five‐fold  increase  in  the minimal  inhibitory  concentration was 

observed  in  the  presence  of  bovine  serum  albumin,  suggesting  that  serum  binding  is 

approximately 80%. 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

206

A  ruthenocene  analogue,  RcPNA  (Figure  1),  was  designed  to  investigate  metal‐specific 

mechanistic differences related to the different redox potentials of ferrocene and ruthenocene 

(see Supplementary Information for synthesis, Supplementary Figures 1‐3). Compared to FcPNA, 

RcPNA displayed  lower  antibacterial  activity  (MICs  against B.  subtilis were 2  and 32 µg mL‐1, 

respectively)  (Table  1).  The  small  organometallic  building  blocks  of  FcPNA  and  RcPNA  by 

themselves  containing  a  (di‐picolyl)Re(CO)3  or  cymantrene  as  well  as  the  ferrocene  or 

ruthenocene carboxylic acids  (Supplementary Figure 4)  showed no antibacterial activity up  to 

512 µg mL‐1.  

Proteomic profiling 

To  gain  first  insights  into  the  antibacterial mode  of  action  of  this  new  class  of  hetero‐tri‐

organometallics,  the  response  of  Bacillus  subtilis  to  treatment  with  FcPNA  and  RcPNA  was 

investigated by global proteome analyses. Changes  in protein synthesis  triggered by antibiotic 

stress  often  reveal  cellular  mechanisms  of  damage  control  and  compensation  for  loss  of 

function. Over the years, a proteomic response library for the Gram‐positive model organism B. 

subtilis has been built that allows to compare proteome profiles of structurally new compounds 

to  proteomic  profiles  of  antibacterial  agents  of  known  antibiotic  classes.  Sets  of  target‐  or 

mechanism‐specific marker proteins, so‐called proteomic signatures, provide a diagnostic  tool 

that  can  aid  in  narrowing  down  the  antibiotic  target  area  [11].  As  the  proteome  is  highly 

sensitive  to  changes  in  growth  conditions,  all  mechanistic  studies  were  carried  out  under 

standardized growth conditions in a chemically defined medium as previously described [12].  

Cells were stressed with antibiotic concentrations  leading  to a significant  reduction  in growth 

rates  without  inflicting  lethal  damage  (Supplementary  Figure  5).  The  FcPNA  and  RcPNA 

concentrations required to reduce growth rates of a B. subtilis culture growing exponentially in 

chemically defined medium were similar  (2 and 1 µg ml‐1,  respectively  (Supplementary Figure 

5)).  Proteins  newly  synthesized  in  response  to  the  organometallics were  then  pulse‐labelled 

with  L‐[35S]‐methionine.  Cytosolic  proteins were  subsequently  separated  by  two‐dimensional 

SDS‐polyacrylamide gel electrophoresis and protein synthesis patterns of antibiotic‐treated cells 

were compared to those of untreated controls. The proteomic responses to FcPNA and RcPNA 

treatment were generally very similar (Figure 2). 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

207

 

Figure 2. Differential proteome analysis of B. subtilis in response to FcPNA and RcPNA. a) FcPNA, 

b) RcPNA. 2D gel‐based protein biosynthesis profiles of the controls false‐colored in green were 

overlayed with  those  of  the  antibiotic‐treated  samples  false‐colored  in  red.  Down‐regulated 

proteins  appear  green,  upregulated  proteins  red,  and  proteins  expressed  at  pre‐stress  rates 

yellow. Unidentified upregulated proteins are circled. Orange  labels  indicate proteins  induced 

by both FcPNA and RcPNA, white labels indicate non‐overlapping upregulated proteins.  

 

Biosynthesis  of  many  housekeeping  proteins  was  substantially  diminished  in  both  cases, 

evidenced by the majority of protein spots on the 2D gel overlays appearing green representing 

proteins  no  longer  synthesized  after  treatment with  the  organometallics.  FcPNA  and  RcPNA 

shared 23 marker proteins (proteins induced more than twofold), while 32 markers were unique 

to FcPNA, and 12  to RcPNA  treatment  (details on protein  function,  regulation, and  induction 

factors are provided  in Supplementary Tables 1 and 2).   Many of the  induced marker proteins 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

208

can  be  grouped  into  three  related  functional  categories:  cell  envelope  stress,  energy 

metabolism, and general stress response (Figure 3). Two marker proteins  indicative of general 

cell envelope  stress,  YceC  and  YceH  [13], were  induced,  classifying  FcPNA  and RcPNA  as  cell 

envelope‐targeting  agents. Moreover,  induction  of  the  phage  shock  protein  A  (PspA), which 

stabilizes the membrane by binding to  its  inner surface, allows narrowing down the antibiotic 

target to the cell membrane. Upregulation of both PspA and NAD synthase (NadE) suggests that 

the compounds  integrate  into the membrane [13]. YoxD, YjdA, and IspH, are proteins  involved 

in  fatty  acid  biosynthesis.  However,  none  of  the  three  proteins  is  part  of  the  standard 

biosynthetic  pathway  suggesting  that  compound  treatment  causes  a  restructuring  of  the 

membrane  lipid composition. The proteome responses to the organometallics were compared 

to the antibiotic response library (Supplementary Table 3). Proteins upregulated in response to 

FcPNA and RcPNA most strongly overlap with marker proteins of potassium carrier  ionophore 

valinomycin and of depolarizing agent gramicidin S (Supplementary Figure 6). 

 

Figure  3.  Functional  categories  of  the  FcPNA  and  RcPNA‐induced  marker  proteins.  a) 

Overlapping marker proteins of FcPNA and RcPNA. Proteins previously described as markers for 

general  cell  envelope  and membrane  stress  are  indicated  in  bold  letters.  b)  Scheme  of  the 

bacterial stress response to the PNA organometallics. 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

209

In addition to the cell envelope stress response, some of the overlapping proteins were involved 

in  energy metabolism,  a  further  common  characteristic  for membrane‐targeting  antibiotics. 

NadE falls  into this category of  indicators for energy  limitation [13]. Other proteins  involved  in 

energy metabolism were also upregulated particularly by FcPNA, most of which, however, are 

poorly  characterized  with  regard  to  their  functions. Many  of  the  upregulated  proteins  are 

known  to  participate  in  the  σB‐dependent  general  stress  response  or  in  sporulation,  two 

alternative  strategies  of  B.  subtilis  for  coping  with  energy  limitation  [14].  Comparing  the 

proteome responses to FcPNA and RcPNA treatment, several marker proteins of oxidative stress 

were  upregulated  only  by  the  ferrocene  but  not  the  ruthenocene‐substituted  compound, 

among them metalloregulation DNA‐binding stress protein MrgA and thiol peroxidase Tpx. Both 

of  these  stress  proteins  are  regulated  in  a  σB‐independent  fashion.  Oxidative  stress  is  also 

known  to  trigger  the  σB‐dependent  general  stress  response  [15]  and we observed  that more 

proteins of the σB‐regulon were upregulated in response to FcPNA treatment.

Oxidative stress 

CellROX,  a  fluorescent  probe  sensitive  to  reactive  oxygen  species, was  employed  to  test  for 

intracellular oxidative stress (Figure 4a,b).  

Paraquat, which causes superoxide  formation, served as positive control and  led  to B. subtilis 

cells  fluorescing  red.  Similarly,  red  fluorescence  was  observed  after  treatment  with  FcPNA 

indicating oxidative stress. In contrast, RcPNA‐treated cells and untreated controls did not give a 

fluorescence  signal. We  conclude  that  the  iron  in  the  ferrocene moiety  is  redox‐active under 

physiological conditions, probably resulting in the generation of a ferrocene/ferrocenium redox 

pair that in vivo generates reactive oxygen species as part of its redox cycle.  

However,  ferrocene  by  itself  does  not  seem  to  be  sufficient  for  antibacterial  activity  as  the 

ferrocene carboxylic acid building block used to synthesize FcPNA did not show any antibacterial 

activity  (Supplementary Figure 4). As  in MIC  tests FcPNA showed higher antibacterial potency 

than RcPNA, it is tempting to speculate that, while it is not essential for bactericidal activity, the 

oxidative stress component can enhance antibiotic potency. 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

210

 

Figure 4. Metal‐dependent oxidative stress  formation and subcellular  localization of FcPNA. a) 

light microscopy  and  b)  fluorescence microscopy  images  of  CellROX‐stained  B.  subtilis  cells 

treated with antibiotics or left untreated, demonstrate oxidative stress after FcPNA treatment. 

c) FcPNA subcellular  localization was  investigated by measuring the manganese content of the 

different cell fractions by atomic absorption spectroscopy. The manganese concentrations in the 

cell wall, the cytosol, and the membrane were calculated. 

 

Influence on membrane function 

The  proteome  response  to  both  FcPNA  and  RcPNA  showed  upregulation  of  typical marker 

proteins  for membrane  stress.  As  a  gram‐positive  bacterium  B.  subtilis  possesses  only  one 

membrane, the cytoplasmic membrane constituting a phospholipid bilayer rich  in proteins. To 

investigate  whether  or  not  FcPNA  interacts  with  the  bacterial  membrane,  its  subcellular 

localization was determined by tracing manganese using atomic absorption spectrometry (AAS). 

We  expect  the  manganese‐containing  moiety  of  FcPNA  to  be  stable  under  physiological 

conditions  based  on  previous  imaging  studies  with  a  compound  containing  the  same 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

211

manganese‐carbonyl  building  block  [16]6  Antibiotic‐treated  cells  were  fractionated  by 

differential  centrifugation  and  the manganese  content was  determined  in  the  cytosolic,  the 

membrane,  and  the  cell  wall  fractions  (Figure  4c).  After  treatment  with  FcPNA,  the 

concentration  of  manganese  in  the  membrane  fraction  was  about  10‐fold  higher  than  in 

untreated  controls  and  about  6‐fold  higher  than  in  the  cytosolic  and  cell  wall  fractions, 

demonstrating  that  a  majority  of  FcPNA  localizes  in  or  at  the  B.  subtilis  membrane 

(Supplementary  Figure  7).  During  sample  preparation,  cells  were  repeatedly  washed  with 

Tris/EDTA buffer  to  remove  loosely bound manganese. FcPNA  seems  to bind  to  the bacterial 

membrane  very  tightly  as  little manganese was  removed by  the washing  steps. At  the  same 

time,  as manganese  levels  in  the  cytosol  and  cell wall  fractions  increased  only  slightly  after 

FcPNA treatment, it is unlikely that FcPNA targets cell wall or cytosolic components. 

 

 

Figure 5.  Influence of FcPNA and RcPNA on the B. subtilis membrane and cell wall  integrity. a) 

GFP‐MinD  localization after antibiotic treatment. b) Light microscopy  images corresponding to 

panel a. c) Light microscopy  images of antibiotic‐treated cells stained with BacLight green dye 

passing through intact membranes and red dye passing through membrane pores. d) Antibiotic‐

stressed cells fixed with acetic acid/methanol. 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

212

The overlap of marker proteins between the organometallics and valinomycin and gramicidin S 

suggests  that  the  organometallics  might  also  cause  disruption  of  the  cellular  membrane 

potential. Membrane depolarization was monitored using an assay that utilizes the membrane 

potential‐dependent  localization  of  cell  division  protein MinD.  If  the membrane  potential  is 

intact, MinD  localizes  at  the  cell poles  and  the  cell division plane, while upon depolarization 

MinD  delocalizes  and  distributes  irregularly  throughout  the  cell  [13,17].  Using  a  GFP‐MinD 

fusion  strain, MinD  localization was monitored by  fluorescence microscopy  (Figure 5a,b). The 

untreated  control  as well  as  vancomycin,  an  inhibitor of  cell wall biosynthesis  that does not 

affect  the  membrane  potential,  displayed  normal  MinD  localization.  Like  valinomycin  and 

gramicidin  S,  FcPNA  and  RcPNA  led  to  MinD  delocalization,  demonstrating  membrane 

depolarization by both organometallics.  

Membrane depolarization can be  the  result of a number of different challenges  ranging  from 

inhibition  of  the  respiratory  chain  to  an  enhanced  bilayer  permeability,  e.g.  due  to  pore 

formation or potassium or proton translocation. Using a pair of fluorescent dyes we investigated 

the potential of FcPNA and RcPNA to form pores. The commercially available BacLight staining 

kit  combines  a  green‐fluorescent  dye  that  readily  crosses  intact  membranes  and  a  red‐

fluorescent dye, which can only enter bacterial cells through pores in the membrane (Figure 5c). 

Only nisin, a pore‐forming lantibiotic serving as positive control, permeabilized B. subtilis for the 

red dye,  resulting  in cells  fluorescing both  red and green. Cells not  treated with antibacterial 

agents as well as cells  treated with non‐pore‐forming comparator compounds  fluoresced only 

green. Since the organometallics fluoresced green, formation of large pores can be excluded as 

a mechanism of both FcPNA and RcPNA.   

Energy limitation 

To examine, if the interaction of FcPNA and RcPNA with the membrane causes energy limitation 

in  the  cell as  suggested by  the proteome  response, we determined  cytosolic ATP  levels after 

treatment with the organometallics (Figure 6). Compared to the untreated control, valinomycin, 

a  potassium  ionophore,  and  gramicidin  S, which was  previously  shown  to  permeabilize  the 

membrane  for  potassium  [18],  reduced  the  ATP  content  by  40%  and  80%,  respectively.  In 

contrast, protein biosynthesis inhibitor erythromycin did not influence intracellular ATP levels. 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

213

Figure 6. Relative intracellular ATP levels of B. subtilis after treatment with FcPNA, RcPNA, and 

comparator compounds. 

 

FcPNA  reduced  the  cellular  ATP  content  by  50%,  demonstrating  a  strong  impact  of  the 

organometallic on  cellular  energy metabolism.  The  effect on  cellular energy  levels, however, 

does not seem to correlate strictly with antibacterial activity, as the less potent RcPNA applied 

at  only  0.66  µM  led  to ATP  levels  only  half  of  those  observed  after  treatment with  1.4  µM 

FcPNA. A decrease  in ATP  levels after treatment with the organometallics could be a result of 

membrane depolarization and subsequent cessation of ATP production. However,  it could also 

be an effect of the organometallic compounds on ATP synthase or the respiratory chain, both of 

which are located at the cytoplasmic membrane.  

Cell wall integrity 

Due  to  the  upregulation  of  the  proteins  YceC  and  YoxD,  which  were  also  found  to  be 

upregulated by  cell wall biosynthesis  inhibitors  like  vancomycin  (Supplementary Table 3), we 

examined  the  impact  of  FcPNA  and  RcPNA  on  cell wall  integrity.  If  cell wall  biosynthesis  is 

inhibited, fixation of antibiotic‐treated cells  in a 1:3 mixture of acetic acid and methanol,  leads 

to  deformation  of  cells  [19]. A  characteristic  formation  of membrane  extrusions  after  acetic 

acid/methanol  fixation  is  typically  observed,  if  a membrane‐associated  cell wall  biosynthesis 

step  is  inhibited. This  form of membrane blebbing was observed  for  instance after  treatment 

with  lipid  II‐binding compounds nisin and vancomycin, which  served as positive controls here 

(Figure 5d). Both organometallic  compounds  showed  the  same  aberration  in  cell  shape  after 

acetic  acid/methanol  fixation,  suggesting  that  FcPNA  and  RcPNA  either  directly  or  indirectly 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

214

interfere with the cell wall biosynthesis machinery. A direct  inhibition of cell wall biosynthesis 

components by the organometallics  is unlikely as the proteome responses to both compounds 

lack the typical marker proteins for cell wall biosynthesis  inhibition LiaH, YtrE, and YtrB [13]. A 

similar effect was observed for gramicidin S, which integrates into the bacterial membrane and 

acts  rapidly  depolarizing  [13,16].  Both  gramicidin  S  and  the  organometallics might  indirectly 

affect  cell wall biosynthesis by disturbing membrane  architecture. Despite  FcPNA  and RcPNA 

having gramicidin S‐like effects on the membrane potential, ATP  levels, cell wall  integrity, and 

the proteome, the organometallics differ from gramicidin S in that they are not bacteriolytic.  

CONCLUSION 

The recently reported hetero‐tri‐organometallic compound FcPNA showed potent antibacterial 

activity against Gram‐positive bacteria.  It was active against S. aureus  strains  including MRSA 

and  VISA  strains  in  the  low  micro  molar  range,  comparable  to  antibiotics  currently  used 

clinically. FcPNA represents a fully synthetic novel class of antibiotics with structures completely 

new to nature. Generally, aside  from antiseptics, organometallics have been underexplored  in 

antibacterial research and development [20‐23] and to our knowledge this work represents the 

first study on a metal‐based antibacterial agent that addresses both the antimicrobial potency 

and the antibiotic target. 

We  initiated global proteome‐based mechanistic studies to  identify the general target area for 

FcPNA  and  designed  a  ruthenocene‐substituted  derivative,  RcPNA,  to  study  metal‐specific 

effects. The proteomic  response of B.  subtilis  to  the organometallics  showed upregulation of 

marker proteins for cell envelope stress in general and membrane stress in particular. A strong 

interaction of FcPNA with the cytoplasmic membrane was demonstrated by tracing manganese 

as a  surrogate  for  the manganese‐containing FcPNA using AAS. A direct  interaction of FcPNA 

with  the  bacterial  membrane  is  consistent  with  an  induction  of  alternative  fatty  acid 

biosynthesis  enzymes  involved  in  adjusting  the  composition  of  the membrane  to  antagonize 

interactions with the organometallics. As shown by fluorescence microscopy, FcPNA and RcPNA 

efficiently  depolarized  B.  subtilis  cells.  While  the  cause  of  depolarization  remains  to  be 

elucidated, we were able to exclude formation of large pores as a mechanism. Consistent with 

membrane  depolarization,  the  proteome  and  a  luciferase‐based  ATP  assay  revealed  severe 

energy limitation.  

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

215

An  elevation  in  reactive  oxygen  species was  observed  after  treatment with  FcPNA,  but  not 

RcPNA.  To  our  knowledge, we  could  show  here  for  the  first  time  that  ferrocene  can  induce 

oxidative  stress  in  a  living  system.  Similar  results were  previously  obtained  in  vitro  for  the 

ferrocene‐substituted chloroquine‐based antimalarial drug candidate  ferroquine  [24]. Further, 

Dunbar  et  al.  provided  evidence  for  co‐localization  of  ferroquine  with  a  sulfur‐containing 

compound, presumably the antioxidant glutathione [25]. Ferroquine provides a rare example of 

an  organometallic  compound  in  clinical  development  for  antimicrobial  therapy  targeting  a 

unicellular  parasite  Plasmodium  falciparum.  It  has  been  shown  to  overcome  chloroquine 

resistance  and  is  about  to  complete  phase  II  clinical  trials  [26].  Ferroquine  passing  phase  1 

clinical trials suggests that there are no major safety issues connected to the ferrocene moiety 

itself,  clearing  the way  for  future  ferrocene‐containing organometallic drug  candidates  in  the 

antimicrobial field. 

While the molecular mechanism of action of FcPNA remains to be studied further, we were able 

to identify the cytoplasmic membrane as the target structure. Based on the effects observed we 

postulate  that FcPNA  integrates  into  the phospholipid bilayer  causing a  change  in membrane 

architecture  that affects  the  function of one or more membrane proteins. However,  it  is also 

possible  that  FcPNA  interacts  directly  with  different  membrane  proteins.  The  bacterial 

membrane  has  been  validated  as  an  antibacterial  target  only  in  the  past  decade.  As 

demonstrated by daptomycin, membrane‐targeting antibiotics can be successfully applied in the 

clinic using systemic administration [27]. Membrane‐targeting antibiotics were shown to be less 

prone  to  bacterial  resistance  development  than  antibiotics  inhibiting  a  single  enzyme  target 

[28],  making  the  bacterial  membrane  a  particularly  attractive  target  for  future  antibiotic 

development.  Based  on  its  potent  antibacterial  activity  and  the  limited  cytotoxicity,  FcPNA, 

representing  a  novel  class  of  antibiotics,  is  a  promising  lead  structure  that warrants  further 

investigation.  The  solubility  of  FcPNA  is  rather  poor  and  currently  prevents  systemic 

administration, thereby limiting evaluation of acute toxicity in animal models. The main goal of 

future  structure‐activity‐relationship  studies  will  be  to  increase  solubility  while  retaining 

antibacterial activity and retaining or increasing selectivity for bacteria over mammalian cells. 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

216

METHODS 

Antibiotics. FcPNA was synthesized as described previously [5]. RcPNA synthesis largely parallels 

FcPNA synthesis and  is described  in  the supplementary methods. All antibiotic stock solutions 

were prepared at 10 mg mL‐1 in DMSO. Valinomycin and bacitracin were purchased from Sigma‐

Aldrich. Vancomycin was purchased from Applichem. Gramicidin S was synthesized and purified 

according to Wadhwani et al. [29] and nisin was obtained from H.‐G. Sahl (University of Bonn, 

Germany). 

Minimal inhibitory concentration. Minimal inhibitory concentrations (MIC) were tested against 

Escherichia  coli DSM  30083,  Acinetobacter  baumannii  DSM  30007,  Pseudomonas  aeruginosa 

DSM  50071,  Bacillus  subtilis  DSM  402,  Staphylococcus  aureus  DSM  20231  (type  strain), 

Staphylococcus aureus ATCC 43300 and COL  (MRSA), and Staphylococcus aureus Mu50 (VISA) in 

a microtiter plate assay according to CLSI guidelines as described previously [10,30]. To estimate 

serum binding, MIC  tests were  analogously performed  in  the presence of 10% bovine  serum 

albumin. 

Minimal  bactericidal  concentration.  Minimal  bactericidal  concentrations  (MBCs)  against  B. 

subtilis 168 were determined  in MH medium  in a microtiter plate assay. 5 x 105 cells per mL 

were treated with 1, 2, 5, and 10‐fold MIC (2, 4, 10, 20 µg/mL FcPNA and 32, 64, 160, 320 µg/mL 

RcPNA). An untreated control was directly plated on MH agar plates and incubated at 37 °C for 

16  h  to  determine  the  amount  of  applied  colony‐forming  units  (CFUs).  Antibiotic‐treated 

cultures were  incubated at 37  °C  for 24 h. Samples were  then plated on MH agar plates and 

incubated at 37 °C for 16 h. CFUs were counted and related to those of the untreated control. 

The antibiotic concentration that led to a CFU reduction of 5 log units was taken as MBC. 

Cytotoxicity. Cytotoxiciy against human cancer cell lines was tested in three different assays (for 

detailed  experimental  procedures  see  Supplementary  Information).  Caco‐2  and  L6.C11  cells 

were exposed  to FcPNA 7 days after seeding when cells had grown  into confluency and were 

fully established and no longer growing. Metabolic activity was determined in a resazurin‐based 

assay. MCF7, HepG2, and HT29 cells were exposed to FcPNA 24 h after seeding, when cells had 

attached but were still growing into confluency. Viability was determined using a crystal violet‐

based assay. NRK‐52E and CCRF‐CEM  cells were exposed  to FcPNA directly after  seeding and 

metabolic  activity  determined  in  an  Alamar  Blue‐based  assay.Bacterial  strains  and  growth 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

217

conditions. For mechanistic studies, B. subtilis 168 (trpC2) [31] was grown at 37 °C under steady 

agitation  in chemically defined Belitzky Minimal Medium  (BMM)  [32].  In growth experiments, 

bacterial  cultures  were  treated  with  different  antibiotic  concentrations  in  mid  exponential 

growth  phase  after  reaching  an  optical  density  at  500  nm  (OD500)  of  0.35.  For  physiological 

stress experiments, including proteomic studies, antibiotic concentrations were chosen that led 

to reduced growth rates compared to the untreated control (Supplementary Figure 5). 

Determination of  survival  rates. B.  subtilis was grown  in  Luria Bertani  (LB) medium at 37  °C 

under steady agitation to an OD500 of 0.35. 5 x 105 cells per mL were exposed to 4 µg mL‐1 FcPNA 

for 15 min or  left untreated. Cells were then plated on LB agar plates and incubated overnight 

before  colony  forming  units  were  counted.  The  experiment  was  performed  4  times 

independently. 

Proteome analysis. Preparation of  radioactively  labeled protein extracts and  two‐dimensional 

polyacrylamide  gelelectrophoresis were  performed  as  described  previously  [12].  FcPNA  was 

applied at a concentration of 2 µg mL‐1 (2.9 µM) and RcPNA of 1 µg mL‐1 (1.5 µM). Proteins were 

identified  by MALDI‐ToF/ToF  as  described  previously  [12].  Protein  spots  that  could  not  be 

identified  with  this  method  were  identified  by  nLC‐ESI‐MS/MS  as  described  in  the 

Supplementary Methods. 

Atomic  absorption  spectroscopy.  Cells  were  grown  in  BMM  until  early  logarithmic  growth 

phase and stressed with 2 µg mL‐1  (2.9 µM) FcPNA as  in  the proteomic experiments. After 15 

min  of  antibiotic  stress,  cells  were  harvested  by  centrifugation,  washed  three  times  with 

Tris/EDTA  buffer  (100 mM  Tris/1 mM  EDTA,  pH  7.5),  and  disrupted  by  ultrasonication.  Cell 

debris was  kept  for measuring  the  cell wall  fraction. The  crude  cell extract was  subjected  to 

ultracentrifugation at 80,000 x g for 4 h. The resulting supernatant yielded the cytosolic fraction. 

The membrane pellet was dissolved  in EDTA‐free Tris buffer  (100 mM Tris, pH 7.5).  Samples 

were lyophilized using a freeze dryer BETA I instrument (Martin Christ) at ‐20 °C overnight. For 

determination of the manganese content, samples were resuspended in distilled H2O. Triton X‐

100 and HNO3 were added to 200 µL of resuspended samples to final concentrations of 1% and 

13%,  respectively. Manganese measurements were  performed  using  a  ContrAA  700  graphite 

furnace  high  resolution  continuum  source  atomic  absorption  spectrometer  (Analytik  Jena). 

Samples were  injected at a volume of 20 µL  into  regular graphite  tubes and processed  in  the 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

218

furnace  according  to  a  recently  described  protocol  [33].  Manganese  was  detected  at  a 

wavelength of 279.4817 nm. The mean absorbance of duplicate injections was used throughout 

the study. A pure sample of FcPNA was used for calibration. Sensitivities and detection limits of 

the  AAS method  depend  on  the  sample matrix  and  instrument  performance.  For  biological 

samples measured  in  this  study  sensitivities  ranged between 0.35–1.12 A µM‐1 and detection 

limits reported by the instrument software as characteristic concentrations were in the range of 

0.0039–0.0096 µM (1%A)‐1. Measured manganese concentrations were related to the B. subtilis 

cytosolic,  cell wall,  and membrane  volumes. Volumes  of  these  cell  fractions were  calculated 

based  on  cryo‐electron  micrographs  by Matias  and  Beveridge  [34‐35].  The  volumes  of  the 

cellular cytosolic fraction, the cell wall fraction, and the cell membrane fraction were estimated 

at 3.09 x 10‐9 µl, 8.08 x 10‐10 µl, and 8.99 x 10‐11 µl, respectively. The experiment was performed 

three times independently. 

Microscopy.  All microscopy  experiments  were  performed  in  three  biological  replicates.  For 

fluorescence  and  light microscopy  experiments,  the  following  antibiotic  concentrations were 

used to treat B. subtilis: 8 µg mL‐1 (11.6 µM) FcPNA, 6 µg mL‐1 (8.8 µM) RcPNA, 10 µg mL ‐1 (11.1 

µM) valinomycin, 1 µg mL ‐1 (1.1 µM) gramicidin S, 0.75 µg mL ‐1 (2.5 µM) nisin, and 1.5 µg mL ‐1 

(2.2 µM) vancomycin. MinD‐GFP localization and cell wall integrity were examined as described 

previously13  using  the  B.  subtilis  1981  GFP‐MinD  strain  [15]  obtained  from  L.  Hamoen 

(Newcastle University, England) or B. subtilis 168, respectively. 

For the BacLight assay, B. subtilis 168 was grown in BMM until reaching mid logarithmic growth 

phase.  The  culture  was  split  and  the  subcultures  were  treated  with  the  same  antibiotic 

concentrations described above. After 15 min of antibiotic stress, 2 µl of a 1:1 mixture of  the 

green and red‐fluorescing dyes were added per mL culture volume and incubated for 15 min in 

the dark under steady agitation. Cells were washed with 100 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7.5 and 

resuspended  in the same buffer. Five  (5) µl of the cell suspension were  imaged  in  fluorescent 

mode as described previously [13]. The Cell Imaging Software was used to merge the green and 

red channel pictures. The same background value (factor = 25) was subtracted from each single 

picture. 

For the CellROX assay, B. subtilis was grown  in BMM until early  logarithmic growth phase and 

subsequently  divided  into  subcultures,  which  were  stressed  with  25.7  µg  mL‐1  (100  µM) 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

219

paraquat, 8 µg mL‐1  (11.6 µM) FcPNA, 6 µg mL‐1  (8.8 µM) RcPNA, or  left untreated as control. 

After 15 min of antibiotic stress, CellROX Deep Red reagent (Invitrogen) was added and the cells 

were  incubated  for  another 30 min.  Subsequently,  cells were washed  in 100 mM Tris/1 mM 

EDTA, and resuspended in the same buffer. Five (5) µL of cells were imaged without fixation in 

fluorescence  mode  using  an  Olympus  BX51  microscope  with  a  U‐UCD8  condenser,  an 

UPlanSApo 100XO objective,  a U‐LH100HGAPO burner,  and  a U‐RFL‐T power  supply. Pictures 

were taken using a CC12 digital color camera and the Cell Imaging Software (all components by 

Olympus). 

Determination of cellular ATP levels. B. subtilis 168 was grown in BMM to an OD500 of 0.35 and 

subsequently  exposed  to  the  antibiotics  at  the  same  concentrations  described  above. 

Erythromycin  was  applied  at  0.5  µg mL‐1  (0.37  µM).  Cells  were  harvested  after  15 min  of 

antibiotic stress by centrifugation, resuspended in 500 µL 10 mM Tris, pH 7.5, and disrupted by 

ultrasonication as described for proteome analysis. ATP levels were determined using the Perkin 

Elmer  ATPlite  1step  assay  kit  following  the manufacturer's  instructions.  ATP  standards were 

prepared from 1 x 10‐7 to 8.5 x 10‐7 M ATP in the provided buffer. For determination of cellular 

ATP levels, 100 µL of cytosolic cell extracts were used. All measurements were performed in five 

independent biological experiments with two technical replicates each using the Tecan Infinite® 

200 PRO multimode reader (Tecan). 

ACKNOWLEDGEMENTS 

This work was  financially  supported by a  fellowship of  the  International Max Planck Research 

School  for Chemical Biology  (MP),  the Research Department  Interfacial  Systems Chemistry  at 

Ruhr‐University Bochum (NMN, JEB), the DFG (NMN) and the European Regional Development 

Fund "Investing  in your future" (JEB). The authors thank H.‐G. Sahl for providing S. aureus COL 

and nisin, Prof. K. Hiramatsu  for providing S. aureus Mu50, L. Hamoen  for providing B. subtilis 

1981, A. Knüfer and C. Dilk  for  technical assistance with cytotoxicity  testing, M. Strack  for his 

help during RcPNA synthesis, and T. Bracht for sharing the Tecan plate reader.  

 

The authors declare no competing financial interests. 

 

 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

220

REFERENCES 

1. Taubes, G. (2008) The bacteria fight back. Science 321, 360. 

2. Cafiso, V., Bertuccio, T., Spina, D., Purrello, S., Campanile, F., Di Pietro, C., Purrello, M., and 

Stefani, S.  (2012) Modulating activity of vancomycin and daptomycin on  the expression of 

autolysis cell‐wall turnover and membrane charge genes in hVISA and VISA strains. PLoS One 

7, e29573. doi: 10.1371/journal.pone.0029573. 

3. Bertsche, U., Weidenmaier, C., Kuehner, D., Yang,  S.  J., Baur,  S., Wanner,  S.,  Francois, P., 

Schrenzel, J., Yeaman, M. R., and Bayer, A. S. (2011) Correlation of daptomycin resistance in 

a clinical Staphylococcus aureus strain with  increased cell wall teichoic acid production and 

D‐alanylation. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3922–8. 

4. López,  D.,  Vlamakis,  H.,  Losick,  R,  and  Kolter,  R.  (2009)  Cannibalism  enhances  biofilm 

development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609–18. 

5. Rose, W.  E.,  Fallon, M., Moran,  J.  J. &  Vanderloo,  J.  P.  (2012)  Vancomycin  tolerance  in 

methicillin‐resistant  Staphylococcus  aureus:  influence  of  vancomycin,  daptomycin,  and 

telavancin  on  differential  resistance  gene  expression.  Antimicrob.  Agents  Chemother.  56, 

4422–7. 

6. Patra, M., Gasser, G., Bobukhov, D., Merz, K., Shtemenko, A. V., and Metzler‐Nolte, N. (2012) 

Sequential  insertion  of  three  different  organometallics  into  a  versatile  building  block 

containing a PNA backbone. Dalton Trans. 39, 5617–9. 

7. Bremner, J. B., Keller, P. A., Pyne, S. G., Boyle, T. P., Brkic, Z., David, D. M., Garas, A., Morgan, 

J., Robertson, M., Somphol, K., Miller, M. H., Howe, A. S., Ambrose, P., Bhavnani, S., Fritsche, 

T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N., Buckheit, R. W. Jr., Watson, K. M., Baylis, D., Coates, J. 

A., Deadman,  J.,  Jeevarajah, D., McCracken, A., and Rhodes, D.  I.  (2010) Binaphthyl‐based 

dicationic peptoids with therapeutic potential. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 537–40. 

8. Haug,  B.  E.,  Stense,  W.,  Kalaaji,  M.,  Rekdal,  Ø.,  and  Svendsen,  J.  S.  (2008)  Synthetic 

antimicrobial peptidomimetics with therapeutic potential. J. Med. Chem. 51, 4306–14. 

9. Thaker, H. D., Som, A., Ayaz, F.,  Lui, D., Pan, W., Scott, R. W., Anguita,  J., and Tew, G. N. 

(2011)  Synthetic mimics  of  antimicrobial  peptides with  immunomodulatory  responses.  J. 

Am. Chem. Soc. 11, 11088–91. 

10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility 

Tests for Bacteria That Grow Aerobically. Approved Standard – Eight Edition, Mo7‐A8. Vol.29 

No.2 

11. Wenzel, M., and Bandow, J. E. (2011) Proteomic signatures in antibiotic research. Proteomics 

11, 3256–68.  

12. Wenzel, M.,  Patra, M.,  Albrecht,  D.,  Chen,  Y.  C.,  Nicolaou,  K.  C., Metzler‐Nolte,  N.,  and 

Bandow, J. E. (2011) Proteomic signature of fatty acid biosynthesis inhibition available for in 

vivo mechanism‐of‐action studies. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 2590–6. 

13. Wenzel, M., Kohl, B., Münch, D., Raatschen, N., Albada, H. B., Hamoen, L., Metzler‐Nolte, N., 

Sahl, H.‐G., and Bandow,  J. E.  (2012) Proteomic  response of Bacillus  subtilis  to  lantibiotics 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

221

reflects  differences  in  interaction  with  the  cytoplasmic  membrane.  Antimicrob.  Agents 

Chemother. 56, 5749–57. 

14. Völker, U., Völker, A., and Haldenwang, W. G. (1996) Reactivation of the Bacillus subtilis anti‐

sigma  B  antagonist,  RsbV,  by  stress‐  or  starvation‐induced  phosphatase  activities.  J. 

Bacteriol. 178, 5456–63. 

15. Hecker, M,  and  Völker, U.  (2001) General  Stress  Response  of  Bacillus  subtilis  and Other 

Bacteria. Adv. Microb. Physiol. 44, 35–91. 

16. Meister, K., Niesel, J., Schatzschneider, U., Metzler‐Nolte, N., Schmidt, D. A., and Havenith, 

M.  (2010)  Label‐free  imaging  of  metal‐carbonyl  complexes  in  live  cells  by  Raman 

microspectroscopy. Angew. Che. Int. Ed. Engl. 49, 3310–2. 

17. Strahl, H.,  and Hamoen,  L. W.  (2012) Membrane  potential  is  important  for  bacterial  cell 

division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 27, 12281–6. 

18. Katsu,  T.,  Kuroko, M., Morikawa,  T.,  Sanchika,  K.,  Fujita,  Y.,  Yamamura, H.,  and Uda, M. 

(1989) Mechanism of membrane damage induced by the amphipathic peptides gramicidin S 

and melittin. Biochim. Biophys. Acta 939, 135–41. 

19. Schneider, T., Kruse, T., Wimmer, R., Wiedemann, I., Sass, V., Pag, U., Jansen, A., Nielsen, A. 

K., Mygind, P. H., Raventós, D. S., Neve, S., Ravn, B., Bonvin, A. M., De Maria, L., Andersen, A. 

S., Gammelgaard,  L.  K.,  Sahl, H.‐G.,  Kristensen, H. H.  (2010) Plectasin,  a  Fungal Defensin, 

Targets the Bacterial Cell Wall Precursor Lipid II. Science 328, 1168–72.  

20. Patra, M., Gasser, G., Pinto, A., Merz, K., Ott, I., Bandow, J. E., and Metzler‐Nolte, N. (2009) 

Synthesis and biological evaluation of chromium bioorganometallics based on the antibiotic 

platensimycin lead structure. ChemMedChem, 4, 1930–8. 

21. Patra, M.,  Gasser,  G.,  and Metzler‐Nolte,  N.  (2012)  Small  organometallic  compounds  as 

antibacterial agents. Dalton Trans. 41, 6350–8. 

22. Chantson, J. T., Verga Falzacappa, M. V., Crovella, S. & Metzler‐Nolte, N. (2006) Solid‐phase 

synthesis,  characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide 

bioconjugates. ChemMedChem 1,1268–74. 

23. Chantson, J. T., Varga Falzacappa, M. V., Crovella, S. & Metzler‐Nolte, M. (2005) Antibacterial 

activities  of  ferrocenoyl‐  and  cobaltocenium‐peptide  bioconjugates.  J. Organomet.  Chem. 

690, 4564–74. 

24. Dubar, F., Egan, T.J., Pradines, B., Kuter, D., Ncokazi, K. K., Forge, D., Paul, J. F., Pierrot, C., 

Kalamou, H., Khalife, J., Buisine, E., Rogier, C., Vezin, H., Forfar, I., Slomianny, C., Trivelli, X., 

Kapishnikov, S., Leiserowitz, L., Dive, D., and  Biot, C. (2011) The antimalarial ferroquine: role 

of the metal and intramolecular hydrogen bond in activity and resistance. ACS Chem. Biol. 6, 

275–87. 

25. Dubar,  F.,  Bohic,  S.,  Dive,  D.,  Guérardel,  Y.  Cloetens,  P.,  Khalife,  J.,  and  Biot,  C.  (2012) 

Deciphering  the  Resistance‐Counteracting  Functions  of  Ferroquine  in  Plasmodium 

falciparum‐Infected Erythrocytes. ACS Med. Chem. Lett. 3, 480‐483.  

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

222

26. Biot,  C.,  Nosten,  F.,  Fraisse,  L.,  Ter‐Minassian,  D.,  Khalife,  J.,  and  Dive,  D.  (2011)  The 

antimalarial ferroquine: from bench to clinic. Parasite 18, 207–14. 

27. Brötz‐Oesterhelt,  H.,  and  Sass,  P.  (2010)  Postgenomic  strategies  in  antibacterial  drug 

discovery. Future Microbiol. 5, 1553–79. 

28. Brötz‐Oesterhelt,  H.,  and  Brunner,  N.  A.  (2008)  How  many  modes  of  action  should  an 

antibiotic have? Curr. Opin. Pharmacol. 8, 564–73. 

29. Wadhwani, P., Afonin, S., Ieronimo, M., Buerck, J., and Ulrich A. S. (2006) Optimized protocol 

for synthesis of cyclic gramicidin S: Starting amino acid is key to high yield. J. Org. Chem. 71, 

55–61. 

30. Albada, H. B., Chiriac, A.I., Wenzel, M., Penkova, M., Bandow, J. E., Sahl, H.G., and Metzler‐

Nolte,  N.  (2012)  Modulating  the  activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing 

antibacterial  peptides  with  N‐terminal  metallocenoyl  groups.  Beilstein  J.  Org.  Chem.  8, 

1753–64. 

31. Agnostopoulos,  C.,  and  Spizizen,  J.  (1961)  Requirements  for  transformation  in  Bacillus 

subtilis. J. Bacteriol. 81, 741–6. 

32. Stülke,  J.,  Hanschke,  R.,  and  Hecker,  M.  (1993)  Temporal  activation  of  betaglucanase 

synthesis in Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool. J. Gen. Microbiol. 139, 2041–5. 

33. Niesel, J., Pinto, A., Peindy N'Dongo, H. W., Merz, K., Ott, I., Gust, R., and Schatzschneider, U. 

(2008) Photoinduced CO release, cellular uptake and cytotoxicity of a tris(pyrazolyl)methane 

(tpm) manganese tricarbonyl complex. Chem. Commun. 15, 1798–800. 

34. Matias,  V.  R.,  and  Beveridge,  T.  J.  (2008)  Lipoteichoic  acid  is  a major  component  of  the 

Bacillus subtilis periplasm. J. Bacteriol. 190, 7414–8.  

35. Matias, V. R., and Beveridge, T. J. (2005) Cryo‐electron microscopy reveals native polymeric 

cell wall  structure  in  Bacillus  subtilis  168  and  the  existence  of  a  periplasmic  space. Mol. 

Microbiol. 56, 240–51. 

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

223

Supplementary Information 

 

Contents 

i. Supplementary Methods 

ii. Supplementary Tables 

iii. Supplementary Figures 

iv. References 

 

 

i. Supplementary Methods 

General remarks 

All chemicals were of reagent grade quality or better, obtained from commercial suppliers and 

used without further purification. Solvents were used as received or dried over 3/4 Å molecular 

sieves. All preparations were carried out using standard Schlenk techniques. The reactions of all 

the  compounds  containing CpMn(CO)3 or  ruthenocene  residues were carried out  in  the dark. 

Azidomethyl‐ruthenocene,[1]  carboxylic  acid  1,[2]  β‐cymantrenoyl‐propionic  acid  (4),[3]  and  the 

rhenium  tricarbonyl  complex  (6)[4] were prepared  following  literature procedures. FcPNA was 

synthesized  following  the procedure as published previously except  for purification was done 

twice  by  column  chromatography  on  silica  gel.[4]  RcPNA was  synthesized  following  a  similar 

synthetic  sequence.  1H and  13C NMR  spectra were  recorded  in deuterated  solvents on Bruker 

DRX 200 or 400  spectrometers  at  room  temperature.  The  chemical  shifts,  δ,  are  reported  in 

ppm (parts per million). The residual solvent peaks have been used as an internal reference. The 

abbreviations  for  the peak multiplicities are as  follows: s  (singlet), d  (doublet), dd  (doublet of 

doublets), t  (triplet), q  (quartet), m (multiplet) and br  (broad).  Infrared spectra were recorded 

either  on  an ATR  unit  using  a  Bruker  Tensor  27  FT‐IR  spectrophotometer.  Signal  intensity  is 

abbreviated br (broad), s (strong), m (medium), and w (weak). ESI mass spectra were recorded 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

224

on a Bruker Esquire 6000. Analytical HPLC was performed using a Nucleosil 100‐5 C18 column 

(250 × 3 mm) on a Hitachi chromaster HPLC system at 30 °C. The flow rate was 0.5 mL/min and 

UV‐absorption was measured at 250 nm. The runs were performed with a  linear gradient of A 

(acetonitrile  (Sigma Aldrich HPLC‐grade) and B  (distilled water containing 0.1% v/v TFA):  t = 0‐

3 min, 5% A; t = 17‐22 min, 100% A; t = 22‐25 min, 5% A.  

Synthesis of RcPNA 

Carboxylic acid 2. A solution of 1 (980 mg, 2.3 mmol) and azidomethyl‐ruthenocene (1.3 g, 4.67 

mmol)  in  36 mL  THF was  degassed  by  two  ‘freeze‐pump‐thaw’  cycles.  Aqueous  solutions  of 

CuSO4∙5H2O (114 mg, 0.46 mmol in 2 mL water) and sodium ascorbate (182 mg, 0.92 mmol in 2 

mL water) were added sequentially. The resulting mixture was degassed by one more  ‘freeze‐

pump‐thaw’ cycle and allowed to stir at 35 °C for 48 hours under argon atmosphere. The THF 

was then removed and CH2Cl2 (100 mL) was added. The organic phase was washed with 0.1 M 

aqueous  Na2EDTA  solution  (until  the  aqueous  phase  became  colorless),  brine,  dried  over 

anhydrous  Na2SO4,  filtered  and  concentrated.  Column  chromatography  (silica  gel, 

CH2Cl2/MeOH/AcOH 5/1/0.01) yielded 2 as white sticky solid (yield: 800 mg, 49%). 

 

 

 

 

NH

NOH

OO

CuSO4,Sodium ascorbate

HATU, DIPEA

i) 20% piperidine in DMF

ii) HATU, DIPEA

1

N

N

N

Re

COCO

CO

PF6 OCOOH

Mn(CO)3

Ru

N3

NH

NOH

OO

NNN

O

O

2

Ru

IH2N

NH

NNH

OO

NNN

O

O

3

Ru

I

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

Ru

Mn

COOC

OC

5

NH

NNH

OO

NNN

Ru

O

+

Re

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

Rc-PNA

Pd(PPh3)2Cl2, CuBr

+

4

6

O

O

PF6

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

225

 

Data  for 2: Rf = 0.36  (silica gel, CH2Cl2/MeOH/AcOH 5/1/0.01).  1H NMR  (400 MHz, CD2Cl2):  δ 

(ppm) 2.55 (min) and 2.68 (maj) (rotamers, m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 2.86 (m, 2H, CH2‐CH2‐

triazole ring), 3.19 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2), 3.37 (m, 2H, CH2‐CH2‐N), 3.84‐4.21 (rotamers, m, 5H, N‐

CH2‐COOH, CH Fmoc and Fmoc‐CH2O), 4.32‐4.56 (m, 9H, Rc), 4.82 and 4.87 (rotamers, s, 2H, Rc‐

CH2‐triazole  ring),  5.62  (min)  and  6.09  (maj)  (rotamers,  s,  br,  1H, NH),  7.13‐7.28  (m,  5H,  CH 

triazole  ring and CH Fmoc arom), 7.48  (m, 2H, CH Fmoc arom), 7.68  (m, 2H, CH Fmoc arom), 

10.46  (s,  br,  1H,  COOH).  13C  NMR  (100.6 MHz,  CD2Cl2):  δ  (ppm)  19.8  (maj)  and  20.1(min) 

(rotamers, CH2‐CH2‐triazole  ring), 31.3  (maj) and 31.5  (min)  (rotamers, CH2‐CH2‐triazole  ring  ), 

38.5 (NH‐CH2‐CH2 ), 46.4 (maj) and 46.5 (min) (rotamers, CH Fmoc), 47.1 (NH‐CH2‐CH2), 48.3 (Rc‐

CH2‐triazole  ring), 48.8  (maj) and 48.9  (min)  (rotamers, N‐CH2‐COOH), 66.1  (Fmoc‐CH2O), 69.8 

(CH Rc), 70.1  (min) and 70.2  (maj) (rotamers, CH Rc), 70.3  (maj) and 70.4 (min)  (rotamers, CH 

Rc), 84.1 (min) and 84.2 (maj) (rotamers, C Rc), 119.1 (CH Fmoc arom), 120.6 (CH triazole ring), 

124.4 (maj) and 124.5 (min) (rotamers, CH Fmoc arom), 126.3 (CH Fmoc arom), 126.9 (CH Fmoc 

arom), 140.3 (CH Fmoc arom), 143.2 (min) and 143.4 (maj) (rotamers, CH Fmoc arom), 145.5 (C 

triazole ring), 155.7 (NHCOO), 172.5 (COOH), 174.3 (CH2CON). IR bands(ν): 2962w, 1710s, 1636s, 

1522m,  1448w,  1409w,  1258m  (br),  1100m,  1021m  (br),  807m,  759s,  739s  cm−1.  ESI‐MS 

(negative detection mode): m/z (%): 819.92 (30) [M+TFA–H]–, 803.92 (100) [M+TFA–OH]–. 

 

Compound 3: To a  stirred  solution of  the  carboxylic acid 2  (800 mg, 1.13 mmol)  in 25 mL of 

DMF, HATU (850 mg, 2.26 mmol) and DIPEA (291 mg, 2.26 mmol) were added. The mixture was 

allowed to stir for 30 minutes under argon atmosphere. P‐iodo‐aniline (495 mg, 2.26 mmol) was 

NH

NOH

OO

NNN

O

O

2

Ru

NH

NNH

OO

NNN

O

O

3

Ru

I

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

226

then added and the mixture was stirred for 36 h at room temperature. The DMF was removed 

under reduced pressure and the resulting residue was dissolved in 100 mL of DCM, washed with 

distilled water  and  brine.  The  organic  phase was  dried  over  anhydrous Na2SO4,  filtered  and 

concentrated.  Flash  column  chromatography  (silica  gel,  EtOAc/MeOH  25/1  →  20/1  →  15/1) 

gave compound 3 as white solid (yield: 667 mg, 52%). 

Data for 3: Rf = 0.31 (silica gel, EtOAc/MeOH 25/1). 1H NMR (200 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 2.60 (m, 

2H, CH2‐CH2‐triazole  ring), 2.85  (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole  ring), 3.19  (m, 2H, NH‐CH2‐CH2), 3.41 

(m, 2H, CH2‐CH2‐N), 3.84 (min) and 3.90 (maj) (rotamers, s, 2H, N‐CH2‐CONH), 3.99‐4.24 (m, 3H, 

CH Fmoc and Fmoc‐CH2O), 4.30‐4.51 (m, 9H, Rc), 4.79 (maj) and 4.83, 4.88 (min) (rotamers, s, 

2H, Rc‐CH2‐triazole ring), 5.94, 6.37 (min) and 6.23 (maj) (rotamers, s, br, 1H, NH), 7.11‐7.47 (m, 

11H, 8×CH Fmoc arom, 2×CH benzene  ring and CH  triazole  ring), 7.64  (m, 2H, 2×CH benzene 

ring), 9.18, 9.48  (min) and 9.27  (maj)    (rotamers, s, br, 1H, NH).  13C NMR  (50 MHz, CD2Cl2): δ 

(ppm) 21.1 (min) and 21.7  (maj)  (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 32.1  (CH2‐CH2‐triazole ring), 

39.8 (NH‐CH2‐CH2), 47.5 (rotamers, CH Fmoc and NH‐CH2‐CH2), 49.9 (Fc‐CH2‐triazole ring), 52.3 

(N‐CH2‐CONH), 67.1 (Fmoc‐CH2O), 70.9 (min) and 71.1 (maj) (rotamers, CH Rc), 71.2 (min) and 

71.4 (maj) (rotamers, CH Rc), 71.6 (maj) and 71.7 (min) (rotamers, CH Rc), 85.3 (maj) and 85.5 

(min) (rotamers, CI benzene ring), 87.5 (maj) and 87.7 (min)  (rotamers, C Rc), 120.3 (CH Fmoc 

arom), 121.3  (maj)  and 121.8  (min)  (rotamers, CH  triazole  ring), 122.4  (maj)  and 122.6  (min) 

(rotamers, CNH benzene ring), 125.5 (CH Fmoc arom), 127.4 (CH Fmoc arom), 128.1 (CH Fmoc 

arom), 137.9  (maj) and 138.1  (min)  (rotamers, CH benzene  ring), 138.3  (min) and 138.6  (maj) 

(rotamers, CH benzene  ring), 141.5  (CH Fmoc arom), 144.4  (CH Fmoc arom), 146.6  (maj) and 

146.7  (min)  (rotamers,  C  triazole  ring),  156.9  (NHCOO),  168.6  (CONH),  173.9  (CH2CON).  IR 

bands(ν): 3271w, 2926w, 1700s, 1630s, 1586m, 1527s, 1485s, 1449m, 1371m, 1005w, 1242s, 

1044w, 843s, 818s, 758s, 740s, 621w cm−1. ESI‐MS (positive detection mode): m/z  (%): 930.84 

(100) [M+Na]+, 908.87 (20) [M+Na]+. 

 

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

Ru

Mn

COOC

OC

5

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

227

Hetero‐bimetallic compound 5: To a stirred solution of 3 (250 mg, 0.28 mmol) in 2 mL DMF, 5 

mL of 20% piperidine  in DMF was added at 0 °C and stirred for 10 minutes. Then the  ice bath 

was removed and the mixture was stirred for 2 hours at room temperature. DMF and piperidine 

was removed using a high vacuum pump. The resulting residue was washed several times with 

pentane. The solid residue thus obtained was dissolved in 3 mL DMF. The solution was added to 

a  solution  of  cymantrene  keto  carboxylic  acid  4  (146 mg,  0.48 mmol),  HATU  (183 mg,  0.48 

mmol)  and DIPEA  (62 mg, 0.48 mmol)  in DMF  (2 mL), which has been  initially  stirred  for 30 

minutes at room temperature. The reaction mixture was stirred for 48 hours before DMF was 

removed  under  reduced  pressure.  Column  chromatography  (silica  gel,  EtOAc/MeOH  20/1 → 

THF) yielded 5 as a light yellow solid (yield: 89.1 mg, 34 %). 

Data for 5: Rf = 0.25 (silica gel, EtOAc/MeOH 20/1). 1H NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 2.33 (m, 

2H, cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 2.68‐2.97  (m, 6H, CH2‐CH2‐triazole ring, cymantrene‐CO‐CH2‐CH2 

and CH2‐CH2‐triazole ring), 3.24‐3.50 (m, 4H, NH‐CH2‐CH2 and CH2‐CH2‐N), 4.44 (s, br, 9H, N‐CH2‐

CONH, CH Rc), 4.57 (s, br, 2H, CH Rc), 4.77 (s, br, 2H, CH cymantrene), 4.95 (m, 2H, rotamers, Rc‐

CH2‐triazole  ring), 5.36  (s, br, 2H, CH  cymantrene), 7.04‐7.53  (m, 6H, 4×CH benzene  ring, CH 

triazole  ring  and  CO‐NH).  13C  NMR  (62.9 MHz,  CD2Cl2):  δ  (ppm)  21.1  (min)  and  22.5  (maj) 

(rotamers,  CH2‐CH2‐triazole  ring),  29.2  (min)  and  29.7  (maj)  (rotamers,  cymantrene‐CO‐CH2‐

CH2),  31.6  (min)  and  31.8  (maj)  (rotamers,  CH2‐CH2‐triazole  ring),  33.7  (min)  and  33.9  (maj) 

(rotamers,  cymantrene‐CO‐CH2‐CH2),  37.9  (maj)  and  38.3  (min)  (rotamers, NH‐CH2‐CH2),  47.3 

(maj)  and  47.9  (min)    (rotamers, NH‐CH2‐CH2),  49.4  (min)  and  49.7  (maj)  (rotamers,  Rc‐CH2‐

triazole  ring), 51.9  (N‐CH2‐CONH), 70.6  (min) and 70.7  (maj)  (rotamers, CH Rc), 71.1  (CH Rc), 

71.2  (maj)  and  71.4  (min)  (rotamers,  CH  Rc),  83.9  (cymantrene‐CH),  85.1  (C  Rc),  86.8 

(cymantrene‐CH), 87.1 (C‐I benzene ring), 91.4 (cymantrene‐C), 120.9 (min) and 121.3 (maj) (CH 

triazole  ring),  122.1  (CNH  benzene  ring),  137.5  (CH  benzene  ring),  138.1  (CH  benzene  ring), 

146.2  (C  triazole  ring), 168.1  (CONH), 171.9  (CONH),   173.6  (CH2CON), 196.4  (maj) and 196.9 

(min) (rotamers, cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 223.1 (maj) and 224.4 (min) (rotamers, Mn‐C≡O). IR 

bands(ν): 2924w, 2022s and 1928s (M‐C≡O), 1670m (br), 1529m, 1484w, 1461w, 1305w, 1263w, 

1181w,  1035w,  948w,  875m,  667m,  627s  cm−1.  ESI‐MS  (positive  detection mode): m/z  (%): 

994.79 (100) [M+Na]+, 972.79 (10) [M+H]+. 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

228

 

Hetero‐trimetallic compound RcPNA: A solution of 5 (89 mg, 0.092 mmol) and 6 (60 mg, 0.092 

mmol)  in 3 mL DMF/NEt3 mixture (2/1, v/v) was degassed by three  ‘freeze‐pump‐thaw’ cycles. 

Then CuBr (1.63 mg, 0.01 mmol) and cis‐dichlorobis (triphenylphosphine) palladium(II) (1.94 mg, 

0.003 mmol) were added under nitrogen atmosphere and the mixture was degassed again by 

two ‘freeze‐pump‐thaw’ cycles. The deep brown‐colored solution thus obtained was allowed to 

stir for 22 hours at room temperature in the dark. The DMF and NEt3 were removed using high 

vacuum pump. The residue was diluted with 50 mL of CH2Cl2 and washed with distilled water 

and  brine.  The  CH2Cl2  layer  was  dried  over  anhydrous  Na2SO4,  filtered  and  evaporated  to 

dryness.  The  residue was washed with  pentane  to  remove  the  remaining  triethylamine  and 

finally dried  in vacuum. Flash column chromatography (two times, silica gel, CH2Cl2:MeOH 5:1) 

afforded a light brown sticky solid which was re‐dissolved in DCM and filtered. The filtrate was 

dried and washed with pentane to give the desired compound RcPNA as a  light brown power 

(yield: 23 mg, 17 %).  

Data for RcPNA: Rf = 0.51 (silica gel, CH2Cl2/MeOH 5/1). Retention time (tR)  in RP‐HPLC = 17.9 

min. ESI‐MS  (positive detection mode): m/z  (%): 1351.28  (100)  [M‐PF6]+.  IR bands  (ν): 2923w, 

2027s  and  1909s  (M‐C≡O),  1655m  (br),  1514m,  1446m,  1245w,  1060w,  833s,  765m,  733w, 

667w, 628m cm−1.  

Toxicity against mammalian cell lines MCF7, HepG2, and HT29 

Cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM 

L‐glutamine,  200  U  ml‐1  penicillin,  and  200  µg  ml‐1  streptomycin  in  10%  CO2  atmosphere. 

Absolute cell numbers were determined by use of crystal violet. Cells were seeded  in 96‐well 

cell culture‐treated microtiter plates and grown for 24 hours under standard conditions. FcPNA 

was dissolved in DMSO (10 mg ml‐1 stock solution) and cell cultures were then exposed to 3, 10, 

30, 100, and 300 µg ml‐1  for 65 hours. Each concentration was  tested  in six replicates each  in 

two  independent experiments. Before crystal violet was added to the cells, they were washed 

NH

NNH

OO

NNN

Ru

O

+

Re

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

RcPNA

PF6

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

229

three  times with phosphate buffered  saline  (PBS), and  fixed with 2% glutardialdehyde  for 20 

minutes at 37 °C. Glutardialdehyde was discarded and membranes permeabilized with Triton X‐

100  (0.1%  in  PBS).  Afterwards,  cells  were  incubated  in  crystal  violet  solution  (0.04%  in  4% 

ethanol) on a  shaker  for 1 h. Cells were washed  six  times with H2O before  crystal violet was 

eluted with ethanol for 3.5 h. Absorbance was measured at 570 nm. Cell biomass was calculated 

by  subtracting  the  absorbance  values  read  prior  to  substance  addition  at  24  h.  For 

determination  of  the  half  maximal  inhibitory  concentrations  (IC50),  viability  in  percent  was 

plotted against the compound concentration on a half‐logarithmical scale. Sigmoidal function fit 

was  performed  using  Origin  7  (Originlab,  Northampton,  USA).  IC50  values  were  directly 

calculated from the fit function. 

Toxicity against mammalian cell lines NRK‐52E and CCRF‐CEM  

NRK‐52E  rat  kidney  epithelial  cells were  cultured  in DMEM  PAN  (PAN  Biotech,  Cat.‐Nr.  P04‐

03500)  supplemented  with  10%  fetal  calf  serum  (FCS),  100  U  mL‐1  penicillin,  100  µg  mL‐1 

streptomycin,  and  1%  L‐glutamine  at  37  °C  in  5%  CO2  atmosphere.  CCRF‐CEM  human  T‐cell 

lymphoblast  cells  were  cultured  in  RPMI  1640  medium  supplemented  with  10%  FCS,  1% 

penicillin/ streptomycin, and 1% L‐glutamine, at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. 

FcPNA (20 mg ml‐1 stock solution in 100% DMSO) was diluted into culture medium without FCS 

so that 10 µl of the dilution gave final compound concentrations of 200, 66, 22.2, 7.4, 2.4, 0.82, 

2.7, and 0.09 µg ml‐1  in  the cell culture. Ten µl of  the dilutions were  transferred  into 96‐well 

tissue‐culture microtiter plate wells to which 90 µl of cells cultured in DMEM PAN or RPMI 1640 

medium were  added  (final  concentrations:  1%  DMSO,  10%  FCS,  2.5x1003  NRK‐52E  cells  and 

6.2x1004 CCTF‐CEM cells). Plates were  incubated at 37 °C for 72 h  in 5% CO2 atmosphere. Ten 

(10)  µl  of  Alamar  Blue  (Invitrogen) were  added  to  the  plates.  After  3  h  at  37  °C  in  5%  CO2 

atmosphere, fluorescence was detected with a Tecan Spectra Fluor Plus instrument (exitation at 

550 nm, emission at 595 nm as a readout for cell viability. Each FcPNA concentration was tested 

in duplicate in two independent experiments.  

Toxicity against Caco‐2 and L6.C11 cell  lines. Caco‐2 cells were cultured and differentiated  in 

DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) supplemented with 20% fetal calf serum (FCS), 100 

U mL‐1 penicillin and 100 µg mL‐1 streptomycin  (PAA, Austria, Pasching), 2 mM Glutamax   and 

non‐essential amino acids (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). L6.C11 cells were proliferated 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

230

in DMEM supplemented with 10% FCS, 100 U mL‐1 penicillin and 100 µg mL‐1 streptomycin and 2 

mM  glutamax. Caco‐2  (6000  cells per well) or  L6.C11  (5000  cells per well) were  seeded  in  a 

microtiter plate. Caco‐2  cells were differentiated  for 7 days  in  the  culture medium described 

above  while  L6.C11  cells  were  differentiated  in  DMEM  supplemented  with  2%  FCS, 

penicillin/streptomycin and glutamax. 

Fc‐PNA was dissolved in DMSO and diluted from 0 to 700 µM in cell culture medium, resulting in 

a  final  amount  of  DMSO  of  1%.  Cells  were  incubated  with  antibiotic  for  48  hours.  Every 

concentration was tested 8‐fold. Afterwards, resazurin (10%  in DMEM) was added to the cells 

and absorbance decrease at 690 nm was measured over 120 minutes  in an Optima Microwell 

Reader (BMG Labtech, Ortenberg, Germany).  

Protein  identification  by  nLC‐ESI‐MS/MS.  Protein  spots were  identified  using  a  Synapt G2‐S 

high definition mass spectrometer equipped with a lock spray source for electrospray ionization 

and a ToF detector (Waters, Milford, MA, USA). Manually excised protein spots were destained 

with  20 mM  ammoniumbicarbonate  in  30%  acetonitrile,  dried  completely,  and  subsequently 

tryptically digested (6.25 ng µL‐1, 16 h, Promega, Fitchburg, WI, USA). Peptides were eluted into 

ultrapure water by 15 minutes of ultrasonication. Eluates were  loaded on a  trap column  (C18, 

pore size 100 Å, particle diameter 5 µm, inner diameter 180 µm, length 20 mm) and were then 

eluted using gradients of acetonitrile with 0.1% formic acid (350 nL min‐1, linear gradient 2‐60% 

in 40 min)  from an analytical column at 50  °C  (C18, pore  size 130 Å, particle diameter 1.7 µm, 

inner  diameter  75 µm,  length  150 mm)  to  be  subjected  to mass  spectrometry.  Spectra were 

recorded  in positive resolution mode over a mass range of 50 to 1800 m z‐1 with 1 s per scan. 

The  following parameters were used  for  the NanoLockSpray  source:  capillary  voltage, 3.3 kV; 

sampling cone voltage, 30 V; source temperature, 80 °C; desolvation temperature, 200 °C; cone 

gas  flow; 50 L h‐1; desolvation gas  flow, 600 L h‐1.  [Glu1]‐Fibrinopeptide B serving as  lock mass 

analyte was fed through the lock spray channel (lock mass capillary voltage, 3.2 V). Analysis of

the spectra was performed using MassLynx V4.1 SCN813.

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

231

ii. Supplementary Tables 

Supplementary Table 1: Details on mass spectrometric identification of proteins excised from preparative 2D gels 

             

protein ID protein molecular mass 

[Da] protein pI  peptide count  Mascot protein score  Mascot protein score C.I. % 

sequence coverage [%] 

SpoVG  10886  5.25  9  426  100  77 

SpoVC  20859  5.68  11  222  100  55 

SkfG  14467  5.33    3      87    100  19 

GsiB  13789  5.31    5      122    100  n.d. 

YqxA  34375  5.83  7  83  100  21 

Nin  14987  5.09  9  392  100  49 

ClpP  21668  5.19  12  353  100  67 

GroEL  57388  4.53  11  146  100  29 

PpiB  15246  5.53  3  149  100  36 

CheV  34612  4.82  13  378  100  46 

Dps  16583  4.64  7  86  100  60 

YtkL  24816  5.14  8  75  100  38 

YdaG  15867  5.33  5  111  100  52 

YtxH  16675  5.30    5      131    100  28 

SodA  22561  5.33  6  450  100  36 

AzoR2  23257  5.26  7  117  100  38 

YdbD  30238  5.06  10  103  100  39 

YphP  15865  4.81  5  94  100  40 

YwbC  14424  4.62  7  231  100  50 

Tpx  18204  4.89  15  403  100  91 

MrgA  17322  4.79  3  184  100  26 

YqiW  16186  5.00    7      137    100  66 

YceC  21810  5.46  12  215  100  43 YceH 41646 5.90 13 263  100 35PspA  25125  5.87  11  91  100  41 

RacX  25270  5.46  3  73  100  12 

IspH  34902  5.68  2  91  100  10 

YoxD  25283  5.48    16      570    100  65 

YjdA  27432  5.74    5      55    100  18 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

232

 protein ID 

 protein molecular mass 

[Da] 

 protein pI 

 peptide count 

 Mascot protein score 

 Mascot protein score C.I. % 

 sequence coverage 

NadE  30376  5.07  16  459  100  55 

Adk  24104  4.65  11  205  100  65 

NudF  20967  4.78  7  109  100  42 

YqiG  40780  5.34  19  325  100  45 

YhdN  37289  4.96  10  132  100  41 

YwrO  19942  5.33  7  166  100  44 

IolS  35146  5.50  16  280  100  62 

ArgC  38049  5.3  14  342  100  39 

YfjR  27848  4.97  4  109  100  21 

IolS  35146  5.50    16      280    100  62 

YqkF  34695  5.30    10      126    100  33 

LuxS  17703  5.29  5  301  100  47 

GreA  17261  4.68  11  339  100  75 

Frr  20754  5.52  9  361  100  53 

YmaE  26560  9.11  4  60  100  15 

YqeY  16755  5.71    6      184    100  26 

protein ID protein molecular mass

[Da] protein pI 

peptide count 

  PLGS score coverage 

[%] precursor mass error

[ppm] product mass error 

[ppm] 

NfrA*  28302  5.73    20        9602  33  1.5843  4.4483 

PstS*  31664  4.84    44      12665  48  1.5004  4.0909 

 

* Protein was identified by nLC‐ESI‐MS/MS. 

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

233

Supplemental Table 2: Marker proteins  induced after FcPNA and RcPNA  treatment.  Induction 

factors are displayed as averages over three independently performed biological experiments.  

Protein ID F

cPN

A

RcP

NA

protein function category regulator

SpoVG 6.0 n.u. regulatory protein SpoVG stress response SigH

SpoVC 3.1 n.u. peptidyl-tRNA hydrolase stress response SigB

SkfG 3.7 n.u.

unknown stress response PhoP, Spo0A

GsiB general stress protein stress response SigB

YqxA 4.2 n.u. unknown stress response SigE

Nin 5.3 n.u. inhibitor of the DNA degrading activity of NucA stress response ComK

ClpP 3.5 3.8 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit stress response SigB

GroEL 3.7 n.u. chaperonin stress response unknown

PpiB 2.5 n.u. peptidyl-prolyl isomerase (chaperone) stress response unknown

CheV 3.5 2.9 CheA modulator stress response SigD

Dps 7.3 5.0 DNA-protecting protein, ferritin stress response SigB

YtkL 3.6 n.u. metal-dependent hydrolase stress response SigB

YdaG 12.1

90.7 general stress protein stress response SigB

YtxH 4.5 3.6 unknown stress response SigB/H

SodA 5.6 n.u. superoxide dismutase oxidative stress SigB

AzoR2 3.4 n.u. azoreductase oxidative stress SigG

YdbD 27.5

9.3 manganese-containing catalase oxidative stress unknown

YphP 2.4 n.u. disulfide isomerase, putative bacilliredoxin oxidative stress unknown

YwbC 3.8 n.u. putative methylglyoxylase oxidative stress unknown

Tpx 6.4 n.u. thiol peroxidase oxidative stress Spx

MrgA 4.1 n.u. metalloregulation DNA-binding stress protein oxidative stress PerR

YqiW 5.3 n.u. unknown, disulfide isomerase family oxidative stress unknown

YceC 5.9 117.4 similar to tellurium resistance protein cell envelope stress

SigB/M/W

YceH n.u. 18.5 similar to toxic anion resistance protein cell envelope stress

SigB/M/W

PspA 12.5

6.0 phage shock protein A cell envelope stress

SigW

RacX 18.0

24.7 amino acid racemase cell envelope stress

unknown

IspH 6.0 n.u. isopentenyl diphosphate biosynthesis cell envelope stress

unknown

YoxD 3.5 117.4 similar to 3-oxoacyl- acyl-carrier protein reductase cell envelope stress

unknown

YjdA 17.7

27.8 similar to 3-ketoacyl-acyl-carrier protein reductase cell envelope stress

unknown

NadE 2.7 13.9 NAD synthetase energy SigB

NfrA 11.7

7.2 Spx-dependent FMN-containing NADPH-linked nitro/flavin reductase

energy SigD, Spx

PstS n.u. 30.9 phosphate ABC transporter (binding protein) energy PhoP

Adk 6.4 47.8 adenylate kinase energy unknown

NudF 2.5 n.u. ADP-ribose pyrophosphatase energy unknown

YqiG 5.0 n.u. NADH-dependent flavin oxidoreductase energy unknown

YhdN 4.6 n.u. aldo/keto reductase specific for NAD(P)H energy SigB

YwrO 5.4 n.u. similar to NAD(P)H oxidoreductase energy unknown

IolS 3.4 n.u. aldo-keto reductase energy IolR

ArgC 3.0 n.u. N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase energy unknown

YfjR 2.9 n.u. beta-hydroxyacid dehydrogenase energy YclJ

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

234

Protein ID

FcP

NA

RcP

NA

protein function category regulator

YqkF 3.3 3.3 similar to oxidoreductase energy unknown

LuxS 2.4 n.u. S-ribosylhomocysteinase energy unknown

GreA 4.0 5.0 transcription elongation factor GreA transcription unknown

Frr 2.8 n.u. ribosome recycling factor translation unknown

YmaE 3.5 n.u. unknown unknown unknown

YqeY 7.1 n.u. unknown unknown unknown

n.u. not upregulated 

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

235

Supplemental  Table  3:  Marker  proteins  of  FcPNA  and  RcPNA  overlapping  with  those  of 

comparator compounds 

fun

cti

on

al c

ate

go

ry

pro

tein

ID

mem

bra

ne

mem

bra

ne

and

cel

l w

all

bio

syn

thes

is

cell

wal

l b

iosy

nth

esis

pro

tein

m

od

ific

ati

on

tra

nsl

ati

on

tra

nsc

rip

tio

n

valin

om

ycin

gra

mic

idin

S

gra

mic

idin

A

nis

in

gal

lide

rmin

me

rsac

idin

van

com

ycin

dia

mid

e

pu

rom

ycin

rifa

mp

icin

stress response

SpoVG x SpoVC SkfG GsiB x x YqxA Nin

ClpP x x x GroEL x x PpiB CheV Dps x YtkL

YdaG YtxH x

oxidative stress

SodA x x MrgA x Tpx x

YdbD x x YphP YwbC YqiW

AzoR2

cell envelope stress

YceC x x x x YceH x x x x PspA x x x x x RacX x IspH YoxD x x x YjdA x x

energy metabolism

NadE x x x x x NfrA x x x Adk x

NudF YqiG x x YhdN x YwrO x IolS

ArgC YfjR LuxS

YqkF PstS x

transcription/ translation

GreA x Frr

unknown YmaE YqeY

total markers 57/35 24 20 5 8 25 13 5 29 28 32

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

236

iii. Supplementary Figures 

 

 Supplementary Figure 1: Analytical HPLC chromatogram (a) and ESI‐MS spectrum (b) of RcPNA. 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

237

  Supplementary Figure 2: IR spectrum of RcPNA    

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

238

  Supplementary Figure 3: Analytical HPLC chromatogram (a)nand ESI‐MS spectrum (b) of FcPNA. 

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

239

  

Supplementary  Figure  4:  Structures  of  the  individual  organometallic  complexes  that  were 

tested for antibacterial activity. 

   

 Supplementary Figure 5: Growth inhibition of B. subtilis 168 by FcPNA and RcPNA. Arrowheads 

indicate antibiotic addition. Radioactive  labelling was performed 10 min after  treatment with 

the underlined sublethal concentrations. 

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

240

  

Supplementary Figure 6: Proteome response to valinomycin (a) and gramicidin S (b) 

   

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

241

 

Supplemental  Figure  7:  Manganese  content  in  the  cell  fractions:  Concentrations  were 

calculated to starting culture volume. Whole cells and supernatant add up to the total amount 

of  manganese  measured  in  the  culture.  Similarly,  manganese  contents  of  the  subcellular 

fractions almost add up to the amount measured in whole cells. 

 

 iv. References 

1. Patra, M., and Metzler-Nolte, N. (2011) Azidomethyl-ruthenocene: facile synthesis of a useful metallocene derivative and its application in the ‘click’ labelling of biomolecules. Chem. Commun. (Camb.) 47, 11444-11446.

2. Gasser, G., Hüsken, N., Köster, S. D., and Metzler-Nolte, N. (2008) Synthesis of organometallic PNA oligomers by click chemistry. Chem. Commun. (Camb.) 3675-3677.

3. N'Dongo, H. W. P., Neundorf, I., Merz, K., and Schatzschneider, U. (2008) Synthesis, characterization, X-ray crystallography, and cytotoxicity of a cymantrene keto carboxylic acid for IR labelling of bioactive peptides on a solid support J. Inorg. Biochem. 102, 2114-2119.

4. Patra, M., Gasser, G., Bobukhov, D., Merz, K., Shtemenko, A. V., and Metzler-Nolte, N. (2010) Sequential insertion of three different organometallics into a versatile building block containing a PNA backbone. Dalton Trans. 39, 5617-5619.

I Hetero-tri-organometallic PNA backbone derivatives

242

J 

 

Structural optimization of an antibacterial 

hetero‐tri‐organometallic compound: 

Identification of the redundant organometallic 

moiety required for antibacterial activity 

 

Malay Patra, Michaela Wenzel, Pascal Prochnow, Vanessa Pierroz, 

Gilles Gasser, Julia E. Bandow, Nils Metzler‐Nolte  

 

 

 

 

 

 

 

in preparation 

   

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

243

Structural  optimization  of  an  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compound: 

Identification of the redundant organometallic moiety required for antibacterial activity  

 

Malay Patra,†, # Michaela Wenzel,‡     Pascal Prochnow,‡ Vanessa Pierroz,# Gilles Gasser,# Julia 

E. Bandow,‡ and Nils Metzler‐Nolte†,* 

†Lehrstuhl  für Anorganische Chemie  I  ‐ Bioanorganische Chemie,  Fakultät  für Chemie und 

Biochemie, Ruhr‐Universität Bochum, Gebäude NC3 Nord, Universitätsstraße 150, D‐44801 

Bochum, Germany, Fax: 0234‐32‐14378, e‐mail: nils.metzler‐nolte@rub.de ‡Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr‐

Universität Bochum. Universitätsstraße 150, D‐44801 Bochum, Germany #Institute  of  Inorganic  Chemistry,  University  of  Zurich, Winterthurerstraße  190,  CH‐8057 

Zurich, Switzerland  

*to whom correspondence should be addressed. 

 

ABSTRACT 

A  systematic  structure‐activity  relationship  (SAR)  study  on  an  antibacterial  hetero‐tri‐

metallic compound  (FcPNA) containing a  ferrocenyl  (Fc), a CpMn(CO)3  (cymantrene) and a 

[(Dpa)Re(CO)3,  Dpa  =  di‐(2‐picolyl)amine]  residue  is  presented  in  this  report.  In  order  to 

understand the  impact of each organometallic moiety on the antibacterial activity, a series 

of mono‐  and  bi‐metallic  compounds  was  synthesized  and  the  biological  activities  were 

evaluated.  The  [(Dpa)Re(CO)3]  moiety  was  discovered  to  be  the  essential  unit  for  the 

observed  antibacterial  activity  of  FcPNA.  The  ferrocenyl  and  CpMn(CO)3  units  can  be 

replaced one by one or both  together by organic moieties  such  as  a phenyl  ring without 

alteration  of  antibacterial  activity.  The mono‐metallic  (8c′)  as well  as  the  two  active  bi‐

metallic  (8a and 8b) compounds were shown to target the same bacterial structure as the 

lead compound: the cytoplasmic membrane. The mono‐metallic derivative 8c′ containing the 

[(Dpa)Re(CO)3] moiety as only organometallic complex, displayed the highest water solubility 

and  lowest cytotoxicity of all organometallic‐containing compounds while  retaining potent 

antibacterial  activity  making  8c′  a  promising  new  lead  structure  for  developing 

organometallic antibiotics.  

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

244

INTRODUCTION 

The  steady  increase of microbial  resistance  to  commercial drugs  is  a  serious health  issue 

worldwide. One pathogen of high clinical  importance  is methicillin‐resistant Staphylococcus 

aureus  (MRSA), which  is  not  only  resistant  to methicillin  but  also  to  other  clinically  used 

antibiotics such as gentamycin, erythromycin, and neomycin.1,  2 The treatment of bacterial 

infections with such multi‐resistant germs is highly difficult. Even in developed countries like 

the US, over 100’000 life‐threatening MRSA infections were reported in 2005.3 According to 

a report by the European Centre of Disease Control and Prevention, MRSA has reached an 

average  prevalence  of  50%  in  Europe.4  Microbial  resistance  to  conventional  organic 

antibiotics  often  develops  and  spreads  amazingly  fast.1  In  case  of  several  antibiotics  like 

linezolid  or  some  β‐lactams,  resistance was  observed  already  before  the  compound was 

commercialized for human use.5‐7 Since the increasing occurrence of antimicrobial resistance 

in  the  1990s,  the  annual  approval  rate  of  antibiotic  therapeutics  steadily  decreased. 

Currently, on average only one antibiotic per year reaches the market.1, 8  During the last two 

decades,  the  number  of  new  antibiotics  that  have  been  discovered  or  commercialized  is 

insufficient to control  infections with multi‐resistant pathogens. These  facts emphasize the 

need  for new  classes of antimicrobial  compounds. Compounds, which possess  completely 

new modes of action, target more than one bacterial structure, or attack essential structures 

that  are  less  prone  to  target mutation  such  as  the  bacterial  cell  envelope,  are promising 

candidates for resistance‐breaking antibacterials.9 

 

Fe

HN N

NCl

Ferroquine

As

As

As

R

RRAs As

AsAs

As RR

R R

R

OH

NH2

R =Salvarsan®

N

N N

NAg

O

O

O

O

Silvamist®

 

Figure 1: Structures of organometallic antimalarial and antibacterial drug candidates.10 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

245

 

Derivatization of bioactive organic molecules with organometallic  fragments was shown  to 

be  an  efficient  approach  to  solve  the  resistance  problem  of  conventional  organic  drug 

candidates.11 The rationale behind this idea is that the metal‐based compounds might offer 

metal‐specific modes of action not available for organic drugs.12, 13 This strategy was shown 

to be successful for the antimalarial drug candidate chloroquine (CQ). Ferroquine (FQ, Figure 

1), a  ferrocene derivative of CQ,  is not only capable of overcoming CQ  resistance but also 

showed enhanced antimalarial activity.14 Mechanistic studies suggested that the activity of 

FQ  against  the  CQ‐resistant  P.  falciparum  is  related  to  increased  lipophilicity,  change  in 

basicity, and the redox‐properties by ferrocene.15, 16  

Despite  promising  results  in  anticancer  and  antimalerial  research,11,  13,  14,  17  use  of 

organometallic  compounds  in  antibacterial  drug  development  is  still  limited.18  However, 

their potential  for  treatment of  infectious diseases was already proven  in  the early 1900s 

with the discovery of Salvarsan (Figure 1), an organoarsenical antimicrobial agent.19, 20 Silver 

complexes  with  N‐heterocyclic  carbene  (NHC)  ligands  are  another  emerging  class  of 

promising  compounds.21,  22  For  example,  Silvamist  (Figure  1),  a  caffeine  derived  Ag‐NHC 

complex exhibits high activity against tobramycin‐resistant pathogenic bacteria both in vitro 

and in vivo.21, 23  

For a  few years, our groups are  involved  in  the development of organometallic‐containing 

antibacterial  agents.18,  24‐27  Very  recently,  we  disclosed  the  antibacterial  activity  of  the 

hetero‐tri‐organometallic compound FcPNA (see Table 1 for structure).28 FcPNA inhibits the 

growth  of  Gram‐positive  bacteria,  including MRSA,  at  a minimal  inhibitory  concentration 

(MIC) of 2 µg/mL (Table 1). A ruthenocene derivative, RcPNA (see Table 1 for structure), was 

found to be slightly less active. A mechanism of action study revealed that both compounds 

interact with  the  bacterial membrane  and  interfere with membrane‐associated  processes 

such  as  cell  wall  biosynthesis  and  the  respiratory  chain.28    Additionally,  FcPNA  induces 

oxidative stress  in bacteria, which  is not the case for RcPNA. Solubility of both compounds 

was  around  25  µg/mL  in  aqueous  solution  limiting  pharmacological  evaluation  of  the 

compounds. However, due to its promising antibacterial activity, we decided to optimize the 

structure of FcPNA. We aimed at obtaining derivatives with higher solubility while retaining 

or  improving antibacterial potency and  selectivity over mammalian cells, which are at  the 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

246

same time easier to synthesize. With this in mind, understanding of the importance of each 

organometallic moiety present  in  the FcPNA molecule, namely  ferrocene, CpMn(CO)3, and 

[(Dpa)Re(CO)3] and their contributions to antibacterial activity is crucial. As a preliminary SAR 

study, we have already demonstrated that the redox property of ferrocene  is not essential 

for the antibacterial activity of FcPNA28 as the ruthenocene‐containing analogue RcPNA still 

exhibited  activity,  although  it was  lacking  the mechanistic  feature  of  provoking  oxidative 

stress  in bacteria. Herein, we  report on  the  synthesis and biological activity of a  series of 

non‐, mono‐,  and bi‐metallic  compounds designed based on  the  structure of  FcPNA.  This 

study  allowed  us  to  identify  the  essential  organometallic  moiety  required  for  the 

antibacterial activity of this class of molecules.  

RESULTS AND DISCUSSION 

Synthesis and spectroscopic characterization 

Compounds  8a‐c were  synthesized  following  a  similar  synthetic  route  to  that  previously 

reported  for  FcPNA  (Scheme  1).29  As  a  representative  example,  the  synthesis  of  8c was 

initiated with the CuI‐catalysed [3+2] cycloaddition reaction30 of azidomethyl benzene to the 

side chain of the alkyne‐containing peptide nucleic acid (PNA) building block 1.31  Compound 

2  was  isolated  in  82%  yield.  Formation  of  2  was  confirmed  by  the  presence  of  the 

characteristic singlet from the triazole ring at 5.30 (maj) and 5.39 (min) (rotamers) ppm in its 

proton NMR spectrum. Treatment of 2 with TFA,  followed by amide coupling with p‐iodo‐

aniline gave 4b in 52% yield. The Fmoc‐group of 4b was then cleaved with 20% piperidine in 

DMF.  HATU‐mediated  peptide  coupling  of  the  resulting  residue  with  carboxylic  acid  5a 

yielded compound 6c. A  signal at 199 ppm  for  the keto carbonyl group present  in  the  13C 

NMR spectrum of 6c confirmed the presence of the expected compound. The last synthetic 

step consisted of the insertion of the alkyne‐substituted (Dpa)Re(CO)3 complex (7)29 into the 

iodo‐substituted aromatic ring of 6c by Pd‐catalyzed Sonogashira coupling to give compound 

8c. The 13C NMR spectrum of 8c showed a signal at 195 ppm (rotamers) corresponding to the 

Re(CO)3 moiety  present.  Furthermore,  a  peak  at m/z  =  1071.9  for  the  [M‐PF6]+  species 

confirmed the formation of 8c. After silica column chromatography, 8c was further purified 

by semi‐preparative RP‐HPLC to remove trace amount of  impurity. The counter anion of 8c 

was therefore changed to CF3COO‐ and the compound was designated as 8c′. 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

247

FmocHNN

OtBu

OO

FmocHNN

OtBu

OO

NNN

COOH

ONH

NNH

OO

NNN

R2

O

OI

FmocHNN

OH

OO

NNN

TFA

FmocHNN

NH

OO

NNN

I

R2

CuSO4,sodium ascorbate

CH2Cl2

N3

HATU

IH2N

R1

PhPh

i) 20% piperidine in DMF

ii) HATU

R1

1 2 3

R1 = Fc (4a)R1 = Ph (4b)

R1 = Fc, R2 = Ph (6a)R1 = Ph, R2 = Cy (6b)R1 = Ph, R2 = Ph (6c)

NH

NNH

OO

NNN

O

ON

N

N

Re

COCO

COR2

R1

7

Pd(PPh3)2Cl2, CuBr

R1 = Fc, R2 = Ph (8a)R1 = Ph, R2 = Cy (8b)R1 = Ph, R2 = Ph (8c)

R1 = Ph (5a)R1 = Cy (5b)

N

N

N

Re

COCO

CO

PF6+

7

PF6+

Fe

Fc =

MnOC CO

CO

Cy =

NH

NNH

OO

NNN

O

ON

N

N6c

N

N

N

Pd(PPh3)2Cl2, CuBr

9  

Scheme 1: Synthesis of non‐, mono‐, and bi‐metallic compounds.  

 

All new compounds were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, 

electrospray  ionization  (ESI) mass spectrometry, and  infrared  (IR) spectroscopy.  It  is worth 

mentioning  that  all  intermediates  as  well  as  final  compounds  showed  the  presence  of 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

248

rotamers in solution leading to a sometimes tedious assignment of 1H and 13C NMR signals. 

Compounds 4a, 5b, 6d were  synthesized  following  literature procedures.29  32 Purity of  the 

compounds  used  for  biological  activity  test  was  ≥95%  as  determined  by  reverse  phase 

analytical high performance liquid chromatography (HPLC).  

Antimicrobial activity 

The antimicrobial activities of all newly synthesized non‐, mono‐, and bi‐metallic derivatives 

were tested against Gram‐positive Bacillus subtilis and S. aureus strains including one MRSA 

strain (Table 1). As reported recently, the tri‐metallic FcPNA inhibits Gram‐positive bacterial 

growth at an MIC of 2 µg/mL.28   The analogous tri‐metallic compound RcPNA,  in which the 

ferrocene moiety  is  replaced by a  ruthenocene, was  found  to be  slightly  less active  (4‐32 

µg/mL).28 Thus, oxidative stress by ferrocene seems to enhance antibacterial potency but is 

not the only component determining antibiotic activity.28 This  is consistent with the similar 

modes of action of both tri‐metallic compounds targeting the bacterial membrane.28  

Among the three bi‐metallic derivatives, 6d lacks the [(Dpa)Re(CO)3] moiety but contains the 

ferrocenyl and CpMn(CO)3 moieties. Compounds 8a and 8b have the [(Dpa)Re(CO)3] moiety 

in  common. However, 8a  contains  a  ferrocenyl moiety while 8b  contains  the CpMn(CO)3. 

When tested for antibacterial activity, 6d was found to be inactive up to 512 µg/mL. Both 8a 

and 8b exhibited potent antibacterial activity with MIC values in a range from 2 to 4 µg/mL. 

The mono‐metallic compounds lacking the [(Dpa)Re(CO)3] moiety (4a, 6a, 6b) were inactive.  

The  mono‐metallic  derivative  8c′,  which  contains  the  [(Dpa)Re(CO)3]  as  the  only 

organometallic  residue  while  both  ferrocenyl  and  CpMn(CO)3  were  replaced  by  phenyl 

groups, was  found to retain the antibacterial activity.  It  inhibited the growth of MRSA at a 

concentration of 2 µg/mL. Its activity is comparable to that of the parent compound FcPNA 

and  the bimetallic derivatives 8a and 8b. These  results  suggest  that neither  the  ferrocene 

nor  the  CpMn(CO)3  moiety  is  essential  but  presence  of  the  [(Dpa)Re(CO)3]  moiety  is 

necessary for antibacterial activity. However, the alkyne‐substituted [(Dpa)Re(CO)3] complex 

7 was found to be inactive up to 512 µg/mL,28 demonstrating that the organometallic moiety 

alone  is not  sufficient  for  antibiotic  activity but needs  the pseudo‐peptide backbone.  The 

purely organic intermediate compounds 4b and 6c were also inactive. We then synthesized 

compound 9, the purely organic ligand of the active mono‐metallic derivative 8c′. Compound 

9 was found to have no antibacterial activity.  

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

249

Table 1: Antibacterial activity against Gram‐positive bacterial strains. The highest antibiotic 

concentration tested was 512 µg/mL. 

 

Compound 

 

Structure 

Minimal Inhibitory Concentration 

B. subtilis S. aureus 

(type strain) 

S. aureus 

(MRSA) 

μg/mL μM μg/mL  μM  μg/mL μM

FcPNA28 

  NH

NNH

OO

NNN

Fe

ORe

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

PF6+

 

2  1.4  2  1.4  2  1.4 

RcPNA28 NH

NNH

OO

NNN

Ru

ORe

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

PF6+

 

32  21  4  2.7  6  4 

6d 

  NH

NNH

OO

NNN

O

OI

Fe

Mn

COOC

OC

 

inactive 

8a 

 NH

NNH

OO

NNN

O

O

Fe

N

N

N

Re

COCO

CO

PF6+

 

4  3  2  1.5  2  1.5 

8b 

  NH

NNH

OO

NNN

O

ON

N

N

Re

COCO

COMn

COOC

OC

PF6+

 

4  2.9  4  2.9  2  1.5 

4a 

  NH

NNH

OO

NNN

O

OI

Fe

 

inactive 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

250

 

Compound 

 

Structure 

Minimal Inhibitory Concentration 

B. subtilis S. aureus 

(type strain) 

S. aureus 

(MRSA) 

μg/mL μM μg/mL  μM  μg/mL μM

6a 

 NH

NNH

OO

NNN

O

OI

Fe

 

inactive 

6b 

  NH

NNH

OO

NNN

IO

OMn

COOC

OC

 

inactive 

8c′ 

 

+

NH

NNH

OO

NNN

O

ON

N

N

Re

COCO

CO

CF3COO

 

4  3.3  2  1.6  2  1.6 

728 

 

PF6+

N

N

N

Re

COCO

CO

 

inactive 

4b 

  NH

NNH

OO

NNN

I

O

O

 

inactive 

6c 

 NH

NNH

OO

NNN

IO

O  

inactive 

9 

 NH

NNH

OO

NNN

O

ON

N

N

 

inactive 

   

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

251

This observation emphasizes that the organometallic fragment {Re(CO)3} but not ferrocene 

and CpMn(CO)3  is essential for antibacterial activity of the PNA backbone derivatives.  

It  is worth mentioning that none of the active compounds, FcPNA, RcPNA, 8a, 8b, and 8c′, 

showed  activity  against  Gram‐negative  Pseudomonas  aeruginosa,  Escherichia  coli  and 

Acinetobacter  baumannii.  This  might  be  due  to  the  outer  membrane  of  Gram‐negative 

bacteria, which  limits  access  of many  compounds  to  the  cytoplasmic membrane, where 

FcPNA exerts its activity.28 

Solubility in culture broth 

Maximum  solubility of  the active derivatives was determined  in Belitzky minimal medium 

(BMM), a bacterial culture medium, and in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), a 

standard growth medium for mammalian cells (Table 2).  

 

Table  2:  Maximum  solubility  of  active  compounds  in  bacterial  (BMM)  and  mammalian 

(DMEM) cell culture media. 

  Maximum solubility (µg/mL) 

  BMM    DMEM 

FcPNA  25    25 

8a  100    50 

8b  100    50 

8c‘  300    50 

 

Compared  to  the  tri‐metallic  FcPNA,  the di‐ and mono‐metallic derivatives displayed  two‐

fold higher solubility  in DMEM.  In BMM, solubility of the di‐metallic compounds 8a and 8b 

was 4‐fold increased. Solubility of the mono‐metallic compound 8c‘ was even 12‐fold higher 

compared to that of FcPNA. 

Toxicity against mammalian cell lines 

Antibacterial compounds should be selective for bacterial over mammalian cells. To obtain 

preliminary  insight  into  cytotoxicity  the  active  compounds  (8a,  8b,  and  8c′) were  tested 

against different mammalian cancerous (HeLa and HepG2) and non‐cancerous (MRC‐5) cell 

lines. The metal‐based cytotoxic anticancer drug cisplatin was used as positive control (Table 

3).  

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

252

Table 3: Cytotoxicity of active compounds against mammalian cell lines.  

 IC50 values 

HeLa  HepG2  MRC‐5 

  μg/mL  μM  μg/mL  μM  μg/mL  μM 

FcPNA  12.7 ± 1  7.8 ± 1.9  > 145   > 100  > 145   100 

8a  13.5 ± 2.6  10.2 ± 2.0  >  133  > 100  30.2 ± 4.1  22.8 ± 3.1 

8b  10.7 ± 1.3  8.0 ± 1.0  >  134  > 100  not determined 

8c′  31.2 ± 0.9  26.3 ± 0.8  62.5 ± 11.5  52.7 ± 9.7  43.7 ± 5.9  36.9 ± 5.0 

cisplatin  3.5 ± 0.9  11.5 ± 2.9  1.6 ± 0.01  5.5 ± 0.5  2.4 ± 0.4  7.9 ± 1.2 

 

As  reported  for  FcPNA,28  cytotoxicity of  the derivatives was highly dependent on  the  cell 

lines. For the tri‐metallic FcPNA as well as the bi‐metallic 8a and 8b, IC50 values comparable 

to  cisplatin were  determined  against  HeLa  cells.  They  showed moderate  toxicity  against 

MRC‐5 and were non‐toxic to HepG2 cells up to 100 μM.  

The mono‐metallic derivative 8c′ exhibited moderate toxicity towards all tested mammalian 

cell  lines with  IC50 values 15‐30 times higher than the MIC against MRSA. Thus, the mono‐

metallic  compound  8c′  is  not  only  highly  selective  for Gram‐positive  over Gram‐negative 

bacteria  but  also  by  at  least  one  order  of magnitude  less  toxic  to mammalian  than  to 

bacterial cells.  

Influence on the bacterial cell envelope 

FcPNA targets the bacterial membrane.28 Binding of FcPNA to the lipid bilayer leads to loss of 

the membrane potential resulting in substantial energy limitation. Depolarization is thereby 

thought to be caused by  interference with membrane‐bound processes  like the respiratory 

chain. FcPNA has also been shown to affect membrane‐bound steps of cell wall biosynthesis, 

which  is often observed after treatment with membrane‐integrating compounds.12 In order 

to  determine  whether  the  active  derivatives  8a,  8b,  and  8c′  still  possess  the  same 

antibacterial  mechanism,  we  tested  their  influence  on  membrane  potential,  membrane 

permeabilization, and cell wall integrity. The antimicrobial peptide nisin, which binds to cell 

wall precursor lipid II and forms membrane pores, was used as a positive control. 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

253

  

Figure 2:  Influence of 8a, 8b,  and  8c′ on B.  subtilis membrane depolarization, membrane 

permeabilization, and cell wall integrity. (A) GFP‐MinD localization after antibiotic treatment. 

Disruption  of  the  septal  and  polar  localization  of  MinD  is  indicative  of  membrane 

depolarization. (B) Light microscopy  images of the cells shown above. (C) Antibiotic‐treated 

cells stained with BacLight. The green dye is able to enter intact bacterial cells. The red dye 

can only cross the bacterial membrane through membrane pores. In a fluorescence overlay 

red or orange cells are  indicative of pore  formation.  (D) Antibiotic‐stressed cells  fixed with 

acetic acid and methanol.  Inhibition of  the cell wall biosynthesis  leads  to holes  in  the cell 

wall resulting in membrane excrescences after fixation. 

 

Depolarization was monitored in B. subtilis using a strain carrying a GFP fusion to cell division 

protein MinD. MinD depends  for correct  localization at  the cell poles and  the cell division 

plane on an  intact membrane potential (Figure 2A, B).33 Upon depolarization,  it delocalizes 

resulting  in  irregular GFP‐MinD  clusters.  Like  pore‐forming  nisin  and  as  shown  before  for 

FcPNA, all derivatives led to MinD delocalization pointing to membrane depolarization.   

254

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

The  BacLight  assay  was  employed  to  investigate,  if  depolarization  is  accompanied  by 

disruption of  the membrane structure. This staining method combines a green‐fluorescent 

dye  that  crosses  intact  membranes  and  a  red‐fluorescent  dye,  which  may  only  enter 

bacterial  cells  through  membrane  pores  or  larger  holes.  In  fluorescence  overlays, 

permeabilized cells appear orange. While pore‐forming nisin led to red‐fluorescencing cells, 

the FcPNA derivatives 8a, 8b, and 8c′  led  to yellow‐fluorescence  (Figure 2C). This provides 

evidence for slight membrane permeabilization by 8a, 8b, and 8c’ rather than for organized 

pore  formation.  Permeabilization  could  be  due  to  a  detergent‐like  carpet mechanism  of 

action as was proposed for some antimicrobial peptides.34 However, FcPNA was not shown 

to permeabilize the bacterial membrane in the BacLight assay 28 suggesting slight differences 

in membrane interaction between the tri‐metallic compound and the di‐ and mono‐metallic 

derivatives.  

FcPNA has been shown to affect cell wall integrity, probably by impairing membrane‐bound 

cell wall biosynthesis steps.28 The effects of the derivatives 8a, 8b, and 8c‘on B. subtilis cell 

wall  integrity were monitored by microscopic examination of  the  cell  shape  after  fixation 

with  acetic  acid  and  methanol.  This  treatment  reliably  leads  to  membrane  extrusions 

through  cell  wall  holes,  which  occur  upon  inhibition  of  membrane‐bound  cell  wall 

biosynthesis steps.35 As positive control nisin,  inhibiting cell wall biosynthesis by binding to 

precursor  lipid  II, all  tested PNA derivatives  led  to membrane extrusions  (Figure 2D). This 

demonstrates the same, probably  indirect effect on cell wall biosynthesis by all derivatives. 

Taken together, the derivatives 8a, 8b, and 8c‘ target the bacterial membrane and influence 

cell wall integrity but show more efficient membrane permeabilization abilities than the tri‐

metallic FcPNA. 

CONCLUSION 

In order to identify the essential organometallic moiety responsible for antibacterial activity, 

a  series  of  non‐, mono‐,  and  bi‐metallic  derivatives  was  synthesized  based  on  the  lead 

compound  FcPNA.  All  compounds  were  tested  against  different  Gram‐positive  bacterial 

strains  including MRSA. The  study  suggests  that  the  [(Dpa)Re(CO)3] moiety  is essential  for 

the antibacterial activity of FcPNA. The ferrocene and CpMn(CO)3 residues can be replaced 

by hydrophobic moieties  like phenyl groups without affecting antibacterial activity. Hence, 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

255

the bi‐metallic derivatives 8a and 8b, containing the [(Dpa)Re(CO)3] and either a ferrocenyl 

or CpMn(CO)3  moiety, and the mono‐metallic derivative 8c′ that contains the [(Dpa)Re(CO)3] 

as  sole  organometallic  residue  exhibited  potent  activity  against  Gram‐positive  bacteria 

comparable to that of the tri‐metallic FcPNA.  Similarly to FcPNA, all three active compounds 

8a, 8b, and 8c′ target the bacterial membrane and influence cell wall integrity. However, the 

derivatives  show  more  efficient  membrane  permeabilization  abilities  than  the  original 

FcPNA. All active derivatives displayed higher solubility in culture media than the tri‐metallic 

FcPNA, with 8c′ being most  soluble. The monometallic derivative 8c′  is 15‐30  times more 

toxic to Gram‐positive bacteria than to mammalian cell lines. The main goal of future studies 

will now be  to develop compounds based on  the new 8c’  lead structure  that display even 

higher selectivity for bacteria over mammalian cells.  

So  far, ReI  tricarbonyl compounds are well‐known  for  their  luminescent properties and  for 

potential as anticancer therapeutics.13, 36‐39  To best of our knowledge, this is the first study 

reporting that a {ReI(CO)3} core with an appropriate organic ligand could be attractive for the 

development of antibacterial compounds. We believe that this discovery will open up new 

avenues in the preparation of novel organometallic antimicrobial drug candidates. 

EXPERIMENTAL SECTION 

Materials. All chemicals were of reagent grade quality or better, obtained from commercial 

suppliers,  and  used without  further  purification.  Solvents were  used  as  received  or  dried 

over molecular sieves. All preparations were carried out using standard Schlenk techniques. 

Reactions  involving  CpMn(CO)3‐containing  compounds were  carried  out  in  the  dark. N,N‐

bis(pyridine‐2‐ylmethyl)prop‐2‐yn‐1‐amine, compound 1, 4a, 5b, 6d, and 7 were synthesized 

following  the  literature  procedure.29,  31,  32,  40  The  analytical  data  matched  what  was 

previously reported. 

Instrumentation  and  methods.  1H  and  13C  NMR  spectra  were  recorded  in  deuterated 

solvents on Bruker DRX 200, 250, 400, or 600 spectrometers at 30 °C. The chemical shifts, δ, 

are  reported  in ppm  (parts per million). The  residual  solvent peaks have been used as an 

internal reference. The abbreviations for the peak multiplicities are as follows: s (singlet), d 

(doublet),  dd  (doublet  of  doublets),  t  (triplet),  q  (quartet), m  (multiplet),  and  br  (broad). 

Infrared  spectra  were  recorded  on  an  ATR  unit  using  a  Bruker  Tensor  27  FTIR 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

256

spectrophotometer at 4 cm‐1 resolution. Signal intensity is abbreviated br (broad), s (strong), 

m  (medium),  and w  (weak).  ESI mass  spectra were  recorded  on  a  Bruker  Esquire  6000. 

Analytical  HPLC was  performed  using  a  Nucleosil  100‐5  C18  column  (250  ×  3 mm)  on  a 

Hitachi chromaster HPLC system at 25 °C. The flow rate was 0.5 mL min‐1 and UV‐absorption 

was measured at 250 nm. The runs were performed with a linear gradient of A (acetonitrile 

(Sigma‐Aldrich HPLC‐grade) and B (distilled water containing 0.1% v/v TFA): t = 0‐3 min, 5% 

A;  t = 17‐22 min,  100%  A;  t =  22‐25 min,  5%  A.  Preparative  HPLC was  performed  using  a 

Nucleosil 100‐7 C18 column  (250 × 21 mm) on a Varian Prostar HPLC system at 25 °C. The 

flow  rate was  15 mL min‐1  and UV‐absorption was measured  at  250  nm.  The  runs were 

performed  with  a  linear  gradient  of  A  (acetonitrile  (Sigma‐Aldrich  HPLC‐grade)  and  B 

(distilled water containing 0.1% v/v TFA): t = 0‐3 min, 10% A; t = 3‐6 min, 50% A; t = 6‐23 min, 

100% A; t = 23‐27 min, 100% A, t = 30 min, 100% A.  

Minimal inhibitory concentration (MIC) 

The minimal inhibitory concentrations (MIC) were tested against Escherichia coli DSM 30083, 

Acinetobacter baumannii DSM 30007, Pseudomonas aeruginosa DSM 50071, Bacillus subtilis 

DSM 402, Staphylococcus aureus DSM 20231 (type strain), and Staphylococcus aereus ATCC 

43300  (MRSA)  in  a microtiter  plate  assay  according  to  the  guidelines  of  the  Clinical  and 

Laboratory Standards  Institute (CSLI).41 E. coli, A. baumannii, S. aureus, and B. subtilis were 

grown in Mueller Hinton broth, P. aeruginosa in cation‐adjusted Mueller Hinton II. Peptides 

were dissolved  in DMSO  to give 10 mg/mL stock solutions. Serial dilution  in culture media 

was carried out automatically with  the Tecan Freedom Evo 75  liquid handling workstation 

(Tecan, Männedorf, Switzerland) from 512 to 0.5 µg/mL. Peptide dilutions were  inoculated 

with 105 bacteria/mL  taken  from  late exponential  cultures grown  in  the  same media  in  a 

total  volume  of  200 µL  per well. Cells were  incubated  for  16  hours  at  37  °C.  The  lowest 

compound concentration inhibiting visible bacterial growth is reported as MIC. 

Mammalian cell culture and cytotoxicity test. Cytotoxicity studies were performed on three 

different  cell  lines  by  a  fluorometric  cell  viability  assay  using  resazurin  (Promocell 

GmbH). Human  cervical  carcinoma  cells  (HeLa)  were  cultured  in  DMEM  (Gibco) 

supplemented  with  5%  fetal  calf  serum  (FCS,  Gibco), 100 U/mL  penicillin,  100 mg/mL 

streptomycin at 37  °C and 5% CO2. The normal human  lung  fibroblast MRC‐5 cell  line was 

maintained  in  F‐10 medium  (Gibco)  supplemented with  10%  FCS  (Gibco),  penicillin  (100 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

257

U/mL), and streptomycin (100 mg/mL). The human hepatomacarcinoma (HepG2) cells were 

cultured  in DMEM  (Gibco) supplemented with 10%  fetal calf serum  (FCS, Gibco), 100 U/mL 

penicillin, 100 mg/mL  streptomycin at 37  °C and 5% CO2. One day before  treatment,  cells 

were  seeded  in  triplicate  in  96‐well plates  at  a density of 4  x  103 cells/well  for HeLa  and 

HepG2, and 7 x 103 for MRC‐5 in 100 mL growth medium. Upon treating cells with increasing 

concentrations of  respective compounds  for 48 h, the medium was  removed, and 100 mL 

complete medium containing resazurin (0.2 mg/mL final concentration) was added. After 4 h 

of  incubation  at  37  °C,  fluorescence  of  the highly  red  fluorescent  product  resorufin was 

quantified  at  590  nm  emission with  540  nm  excitation wavelength  in  a  SpectraMax M5 

microplate reader. 

GFP‐MinD depolarization assay. B. subtilis 1981 GFP‐MinD33 was grown in Belitzky Minimal 

Medium  (BMM)42  until  early  logarithmic  phase.  The  main  culture  was  subdivided  and 

aliquots were treated with 8 µg/mL (2x MIC) 8a, 8b, and 8c′, respectively, or  left untreated 

as  control. Nisin was used  as positive  control  at  a  concentration of  0.75 µg/mL. After  15 

minutes  of  antibiotic  stress,  cells were microscopically  examined  in  fluorescent mode  as 

described previously.43 

BacLigh membrane disruption assay. BacLight staining (live/dead BacLight Bacterial Viability 

Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was performed following the manufacturer’s instructions. 

B.  subtilis  16844  was  grown  and  stressed  with  antibiotics  as  described  above.  After  15 

minutes  of  antibiotic  exposure,  cells  were  stained  with  a  1:1  mixture  of  SYTO  9  and 

propidium  iodide  (1 µL per mL cells)  for 15 minutes, washed  twice  in 100 mM Tris/1 mM 

EDTA, pH 7.5, resuspended in the same buffer, and subjected to fluorescence microscopy43. 

Cell wall integrity assay. B. subtilis 168 was grown and stressed with antibiotics as described 

above.  After  15 minutes  of  antibiotic  treatment,  200  µL  of  culture were withdrawn  and 

immediately fixed in 1 mL of a 1:3 mixture of acetic acid and methanol. 5 µL of fixed bacteria 

were immobilized in agarose and subjected to light microscopy as described previously.43 

ACKNOWLEDGMENTS 

The  financial  support  from  The  International  Max  Planck  Research  School  for  Chemical 

Biology (fellowship to MP), the Research Department Interfacial Systems Chemistry at Ruhr 

University Bochum (NMN, JEB), the DFG (NMN), the State of North Rhine‐Westphalia (NRW), 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

258

Germany,  the  European Union,  European  Regional Development  Fund,  "Investing  in  your 

future"  (JEB),  the  Swiss National  Science  Foundation  (Professorship  to GG,  grant  number 

PP00P2_133568)  and  the  University  of  Zurich  are  gratefully  acknowledged.  The  authors 

thank PD Dr. Stefano Ferrari for access to cell culture laboratories. 

REFERENCES 

1.  Taubes, G., Science 2008, 321, 356‐361. 

2.  Saxena, S.; Gomber, C., Cent. Eur. J. Med. 2010, 5, 12‐29. 

3.  Klevens, R. M.; Morrison, M. A.; Nadle, J.; Petit, S.; Gershman, K.; Ray, S.; Harrison, L. H.; 

Lynfield, R.; Dumyati, G.; Townes, J. M.; Craig, A. S.; Zell, E. R.; Fosheim, G. E.; McDougal, 

L. K.; Carey, R. B.; Fridkin, S. K., J. Am. Med. Assoc. 2007, 298, 1763‐1771. 

4.  ECDC/EMEA Joint Working Group; The Bacterial Challenge, The Publications Office of the 

European Union 2009, Stockholm. 

5.  Bandow, J. E.; Metzler‐Nolte, N., ChemBioChem 2009, 10, 2847‐2850. 

6.  Kloss, P.; Xiong, L.; Shinabarger, D. L.; Mankin, A. S., J. Mol. Biol. 1999, 294, 93‐101. 

7.  Abraham, E. P.; Chain, E.; Fletcher, C. M.; Gardner, A. D.; Heatley, N. G.; Jennings, M. A.; 

Florey, H. W., Lancet 1941, 238, 177‐189. 

8.  Wenzel, M.; Bandow, J. E., Proteomics 2011, 11, 3256‐3268. 

9.  Brötz‐Oesterhelt, H.; Brunner, N. A., Curr. Opin. Pharmacol. 2008, 8, 564‐573. 

10.  Lloyd, N. C.; Morgan, H. W.; Nicholson, B. K.; Ronimus, R. S., Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 

44, 941 –944. 

11.  Jaouen,  G.;  Metzler‐Nolte,  N.,  Medicinal  Organometallic  Chemistry.  In  Topics  in 

Organometallic Chemistry, 1st ed.;  Springer: Heidelberg, Germany, 2010; Vol. 32; and 

references therein. 

12.  Gasser, G.; Metzler‐Nolte, N., Curr. Opin. Chem. Biol. 2012, 16, 84‐91. 

13.  Gasser, G.; Ott, I.; Metzler‐Nolte, N., J. Med. Chem. 2011, 54, 3‐25. 

14.  Biot, C.; Dive, D., Bioorganometallic Chemistry and Malaria. In Medicinal Organometallic 

Chemistry  (Topics  in  Organometallic  Chemistry),  Jaouen,  G.;  Metzler‐Nolte,  N.,  Eds. 

Srringer: Heidelberg, Germany, 2010; Vol. 32, pp 155‐193. 

15.  Biot, C.; Castro, W.; Botte, C. Y.; Navarro, M., Dalton Trans. 2012, 41, 6321‐6580. 

16.  Dubar, F.; Egan, T. J.; Pradines, B.; Kuter, D.; Ncokazi, K. K.; Forge, D.; Paul, J.‐F.; Pierrot, 

C.;  Kalamou, H.;  Khalife,  J.; Buisine,  E.; Rogier, C.; Vezin, H.;  Forfar,  I.;  Slomianny, C.; 

Trivelli, X.; Kapishnikov,  S.;  Leiserowitz,  L.; Dive, D.; Biot, C., ACS Chem. Biol. 2011, 6, 

275‐287. 

17.  Hartinger, C. G.; Dyson, P. J., Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 391‐401. 

18.  Patra, M.; Gasser, G.; Metzler‐Nolte, N., Dalton Trans. 2012, 41, 6350‐6358. 

19.  Strebhard, K.; Ullrich, A., Nat. Rev. Cancer 2008, 8, 473‐480  

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

259

20.  Gibaud,  S.;  Jaouen,  G.,  Arsenic‐Based  Drugs:  From  Fowler's  Solution  to  Modern 

Anticancer Chemotherapy. In Medicinal Organometallic Chemistry, Jaouen, G.; Metzler‐

Nolte, N., Eds. Springer‐Verlag: Berlin Heidelberg, 2010; pp 1‐20, and references therein. 

21.  Youngs, W. J.; Knapp, A. R.; Wagersa, P. O.; Tessiera, C. A., Dalton Trans. 2012, 41, 327‐

336; and references therein. 

22.  Hindi, K. M.; Panzner, M. J.; Tessier, C. A.; Cannon, C. L.; Youngs, W. J., Chem. Rev. 2009, 

109, 3859‐3884; and references therein. 

23.  Cannon,  C.  L.; Hogue,  L.  A.;  Vajravelu,  R.  K.;  Capps, G. H.;  Ibricevic,  A.; Hindi,  K. M.; 

Kascatan‐Nebioglu,  A.; Walter, M.  J.;  Brody,  S.  L.;  Youngs, W.  J.,  Antimicrob.  Agents 

Chemother. 2009, 53, 3285‐3293. 

24.  Patra,  M.;  Gasser,  G.;  Pinto,  A.;  Merz,  K.;  Ott,  I.;  Bandow,  J.  E.;  Metzler‐Nolte,  N., 

ChemMedChem 2009, 4, 1930‐1938. 

25.  Patra,  M.;  Gasser,  G.;  Wenzel,  M.;  Merz,  K.;  Bandow,  J.  E.;  Metzler‐Nolte,  N., 

Organometallics 2012, 31, 5760‐5771. 

26.  Patra, M.; Gasser, G.; Wenzel, M.; Merz,  K.;  Bandow,  J.  E.; Metzler‐Nolte, N.,  Eur.  J. 

Inorg. Chem. 2011, 3295‐3302. 

27.  Chantson,  J.  T.;  Falzacappa, M.  V.  V.;  Crovella,  S.; Metzler‐Nolte, N.,  ChemMedChem 

2006, 1, 1268‐1274. 

28.  Wenzel, M.; Patra, M.; Senges, C. H. R.; Stepanek, J. J.; Pinto, A.; Prochnow, P.; Ott,  I.; 

Metzler‐Nolte, N.; Bandow, J. E., ACS Chem. Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

29.  Patra, M.;  Gasser,  G.;  Bobukhov,  D.; Merz,  K.;  Shtemenko,  A.  V.; Metzler‐Nolte,  N., 

Dalton Trans. 2010, 39, 5617‐5619. 

30.  Moses, J. E.; Moorhouse, A. D., Chem. Soc. Rev. 2007, 36, 1249–1262. 

31.  Gasser, G.; Hüsken, N.; Köster,  S. D.; Metzler‐Nolte, N., Chem. Commun.  2008,  3675‐

3677. 

32.  N'Dongo, H. W. P.; Neundorf, I.; Merz, K.; Schatzschneider, U., J.  Inorg. Biochem. 2008, 

102, 2114‐2119. 

33.  Strahl, H.; Hamoen, L. W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2010, 107, 12281‐12286. 

34.  Teixeira, V.; Feio, M. J.; Bastos, M., Progress in Lipid Research 2012, 51, 149‐177. 

35.  Schneider,  T.;  Kruse,  T.;  Wimmer,  R.;  Wiedemann,  I.;  Sass,  V.;  Pag,  U.;  Jansen,  A.; 

Nielsen, A. K.; Mygind, P. H.; Raventós, D. S.; Neve, S.; Ravn, B.; Bonvin, A. M. J. J.; Maria, 

L. D.; Andersen, A. S.; Gammelgaard, L. K.; Sahl, H.‐G.; Kristensen, H.‐H., Science 2010, 

328, 1168‐1172. 

36.  Fernandez‐Moreira, V.; Thorp‐Greenwood, F. L.; Coogan, M. P., Chem. Commun. 2010, 

46, 186‐202, and references therein. 

37.  Thorp‐Greenwood, F. L.; Balasingham, R. G.; Coogan, M. P., J. Organomet. Chem. 2012, 

714, 12–21 and references therein. 

38.  Lo,  K.  K.‐W.;  Choi,  A. W.‐T.;  Law, W.  H.‐T.,  Dalton  Trans.  2012,  41,  6021‐6047,  and 

references therein. 

39.  Patra, M.; Gasser, G., ChemBioChem 2012, 13, 1232 – 1252. 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

260

40.  Cabrera, D. G.; Koivisto, B. D.; Leigh, D. A., Chem. Commun. 2007, 4218‐4220. 

41.  Clinical  and  Laboratory  Standards  Institute.  Methods  for  Dilution  Antimicrobial 

Susceptibility  Tests  for  Bacteria  That  Grow  Aerobically.  Approved  Standard  –  Eight 

Edition, Mo7‐A8. Vol.29 No.2. 

42.  Stülke, J.; Hanschke, R.; Hecker, M., J. Gen. Microbiol. 1993, 139, 2041‐2045. 

43.  Wenzel, M.; Kohl, B.; Münch, D.; Raatschen, N.; Albada, H. B.; Hamoen, L. W.; Metzler‐

Nolte, N.; Sahl, H. G.; Bandow, J. E., Antimicrob. Agents Chemother. 2012, submitted. 

44.  Agnostopoulos, C.; Spizizen, J., J. Bacteriol. 1961, 81, 741‐746. 

 

 

   

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

261

Supplementary Information 

 

Table of Contents 

 

i. Synthesis and characterization of compounds 

ii. RP‐HPLC traces and ESI mass spectra of 8a‐b, 8c′, and 9 

iii. 1H and 13C NMR spectra of compounds 

iv. References 

 

 

i. Synthesis and characterization of compounds 

 

NH

NO

OO

NNN

O

O

2  

Compound 2. To a stirred solution of 1 (390 mg, 0.82 mmol) and benzyl azide (164 mg, 1.23 

mmol) in degassed acetone (15 mL), aqueous solution of CuSO4∙5H2O (41 mg, 0.16 mmol in 

3.5 mL degassed water) and sodium ascorbate (66 mg, 0.32 mmol in 3.5 mL degassed water). 

The  resulting mixture was  allowed  to  stir  at  room  temperature  for  30  h  under  nitrogen 

atmosphere and the progress of the reaction was monitored by TLC (silica gel, EtOAc). After 

completion of the reaction, acetone was removed under vacuum, brine (100 mL) was added 

and extracted with EtOAc (3×75 mL). The combined organic phase was washed with 50 mL of 

0.1M aqueous Na2EDTA  solution  (to  remove  the Cu), brine, dried over anhydrous Na2SO4, 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

262

filtered  and  concentrated.  Flash  column  chromatography  (silica  gel,  EtOAc:MeOH  20:0 → 

20:1) yielded pure 2 as colorless oil (yield: 410 mg, 82%).  

Data  for 2. Rf = 0.57  (silica gel, EtOAc). 1H NMR  (400 MHz, CDCl3): δ  (ppm) 1.43  (maj) and 

1.47 (min) (rotamers, s, 9H, OC(CH3)3), 2.54 (maj) and 2.60 (min) (rotamers, m, 1H, CH2‐CH2‐

triazole  ring), 2.75  (m, 1H, CH2‐CH2‐triazole  ring), 2.98‐3.04  (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole  ring), 

3.31  (m,  2H, NH‐CH2‐CH2‐N),  3.45  (maj)  and  3.51(min)  (rotamers, m,  2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 

3.90  (maj)  and  3.94  (min)  (rotamers,  s,  2H,  N‐CH2‐COOtBu),  4.13  (maj)  and  4.20  (min) 

(rotamers, m, 1H, CH Fmoc), 4.31(maj) and 4.50 (min) (rotamers, m, 2H, Fmoc‐CH2O), 5.30 

(maj) and 5.39 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 5.79 (min) and 6.18 (maj) (rotamers, 

s, br, 1H, NH), 7.12‐7.30 (m, 8H, triazole ring, CH Fmoc arom and benzene ring protons), 7.36 

(m, 2H, CH Fmoc arom), 7.58 (m, 2H, CH Fmoc arom), 7.73 (d, 2H, benzene ring protons). 13C 

NMR (62.9 MHz, CDCl3): δ (ppm) 21.0 (min) and 21.1(maj) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 

27.9 (min) and 28.1 (maj) (rotamers, OC(CH3)3), 32.0 (maj and 32.3 (min) (rotamers, CH2‐CH2‐

triazole  ring),  39.4  (NH‐CH2‐CH2‐N),  47.1  (maj)  and  47.2  (min)  (rotamers,  CH  Fmoc),  48.1 

(min) and 49.1 (maj) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 49.7 (maj) and 51.5 (min) (rotamers, N‐CH2‐

COOtBu), 53.8  (maj) 53.9  (min)  (rotamers, Ph‐CH2‐triazole  ring), 66.6  (min) and 66.8  (maj) 

(rotamers,  Fmoc‐CH2O),  82.0  (min)  and  82.9  (maj)  (rotamers, OC(CH3)3),  119.9  (CH  Fmoc 

arom),  121.8  (CH  triazole  ring),  125.2  (CH  Fmoc  arom),  127.0  (maj)  and  127.1  (min) 

(rotamers, CH Fmoc arom), 127.6  (maj) and 127.7  (min)  (benzene  ring C), 127.8  (maj) and 

127.9 (min) (benzene ring C), 128.4 (maj) and 128.5 (min) (rotamers, CH Fmoc arom), 128.9 

(maj)  and 129  (min)  (benzene  ring C), 134.8  (benzene  ring C), 141.1  (br, CH  Fmoc  arom), 

143.9  (CH  Fmoc  arom),  147.1  (rotamers,  C  triazole  ring),  156.6  (NHCOO),  168.7(min)  and 

169.5  (maj)  (rotamers,  COOtBu),  172.4  (maj)  and  173.2  (min)  (rotamers,  CH2CON).  IR 

bands(ν): 3136w, 1715s, 1644s, 1517w, 1449m, 1367w, 1231s, 1151s, 1077w, 943w, 846w, 

728s (br) cm−1. ESI‐MS (pos. detection mode): m/z (%): 610.29 (100) [M+H]+. 

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

4b

NH

NOH

OO

NNN

O

O

3  

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

263

Compound 3 and 4b. To a stirred solution of 2 (1 g, 1.64 mmol) in 20 mL of DCM, TFA (6 mL) 

and triethylsilane (2.5 mL) was added at 0 °C. After 30 minutes, the mixture was allowed to 

warm  to  room  temperature  and  stirred  for  another  4  h.  The  solvent was  then  removed 

under  reduced  pressure  to  give  colorless  oil.  Addition  of  cold  hexane  gave  3  as  white 

precipitate. The hexane was decanted off and the precipitate was washed several times with 

hexane  to  give  3  as  white  powder  which  was  used  for  the  next  step  without  further 

purification (yield: 830 mg, 91%).  

To a stirred solution of the carboxylic acid 3 (553 mg, 1.0 mmol) in 20 mL of DMF, HATU (760 

mg, 2.0 mmol) and N,N‐diisopropylethylamine (DIPEA) (155 mg, 1.2 mmol) were added. The 

mixture was allowed to stir for 30 min under nitrogen atmosphere. P‐iodo‐aniline (328.5 mg, 

1.5 mmol)  in 10 mL of DCM was then added and the mixture was stirred for 40 h at room 

temperature. The  reaction mixture was  then evaporated under  reduced pressure and  the 

residue was diluted with 100 mL of DCM. The organic layer was washed with 0.5M aqueous 

HCl,  brine,  dried  over  anhydrous  Na2SO4,  filtered  and  concentrated.  Flash  column 

chromatography (silica gel, EtOAc:MeOH 15:0 → 15:1) was performed to obtain pure 4b as 

light yellowish solid (yield: 392 mg, 52%). 

Data for 4b. Rf = 0.45 (silica gel, EtOAc:MeOH 15:1). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2.78 

(m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.01 (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.38 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐

N), 3.49 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 4.02 (s, 2H, N‐CH2‐CO), 4.16 (m, 1H, CH Fmoc), 4.32 (m, 2H, 

Fmoc‐CH2O), 5.29 (maj) and 5.38 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 6.11 (min) and 6.50 

(maj) (rotamers, s, br, 1H, NH), 7.10‐7.15 (m, 2H, triazole ring and CH Fmoc arom), 7.22‐7.60 

(m, 14H, CH Fmoc arom and benzene ring protons ), 7.73 (d, 2H, benzene ring protons), 9.47 

(maj) and 9.60 (min) (rotamers, NHCO). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ (ppm) 20.9 (min) and 

21.2  (maj)  (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 31.6  (min) and 31.9  (maj)  (rotamers, CH2‐CH2‐

triazole ring), 38.6 (min) and 39.5 (maj) (NH‐CH2‐CH2‐N), 47.1 (CH Fmoc), 48.1 (min) and 49.5 

(maj) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 51.9 (maj) and 52.7 (min) (rotamers, N‐CH2‐CO),  53.8 (maj) 

and 53.9 (min) (rotamers, Ph‐CH2‐triazole ring), 66.6  (Fmoc‐CH2O), 87.3 (maj) and 87.6 (min) 

(rotamers, C‐I benzene ring), 119.9 (CH Fmoc arom), 121.3 (maj) and 121.6 (min) (rotamers, 

CH triazole ring), 122.1  (min) and 122.2  (maj)  (rotamers, CONH‐C benzene ring), 125.2  (CH 

Fmoc arom), 126.9 (CH Fmoc arom), 127.5 (maj) and 127.6 (min) (rotamers, benzene ring C), 

127.8  (maj)  and  127.9  (min)  (rotamers,  benzene  ring  C),  128.5  (maj)  and  128.6  (min) 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

264

(rotamers, CH Fmoc arom), 128.8  (maj) and 128.9  (min)  (rotamers, benzene  ring C), 134.5 

(benzene  ring  C),  137.3  (maj)  and  137.5  (min)  (rotamers,  CONH‐benzene  ring  CH),  137.6 

(min) and 137.7 (maj) (rotamers, CONH‐benzene ring CH), 141.1 (br, CH Fmoc arom), 143.9 

(CH Fmoc arom), 147.1  (rotamers, C  triazole  ring), 156.6  (maj) and 156.7  (min)  (rotamers, 

CONH), 167.2 (min) and 168.5 (maj) (rotamers, CONH), 173.4 (CH2CON). IR bands(ν): 3309w, 

2923m, 2853w, 1677s, 1632s, 1586w, 1545m, 1526s, 1494m, 1302w, 1256s, 1107w, 1012w, 

819m, 757w, 730s cm−1. ESI‐MS (pos. detection mode): m/z (%): 755.05 (100) [M+H]+, 776.93 

(25) [M+Na]+. 

NH

NNH

OO

NNN

O

O

Fe

I

6a  

Compound 6a. To a stirred solution of 4a1 (600 mg, 0.70 mmol) in 4 mL DMF, 10 mL of 20% 

piperidine in DMF was added at 0 °C and stirred for 10 min. Then the ice bath was removed 

and the mixture was stirred 2 h at room temperature. The DMF and piperidine was removed 

using high vacuum pump. The resulting residue was washed several times with pentane. The 

yellow color solid  thus obtained was dissolved  in 8 mL DMF. The solution was added  to a 

solution of 4‐oxo‐4‐phenylbutanoic acid (5a) (278 mg, 1.5 mmol), HATU (570 mg, 1.5 mmol) 

and DIPEA (193 mg, 1.5 mmol) in DMF (3 mL) which has been initially stirred for 30 minutes 

at  room  temperature. The  reaction mixture was stirred  for 48 h before being diluted with 

150 mL of EtOAc. The organic phase was washed with 1M HCl (50 mL), sat. NaHCO3 solution 

(50  mL),  water  (2×75  mL),  brine  (2×75  mL),  dried  over  anhydrous  Na2SO4,  filtered  and 

concentrated. Flash column chromatography on silica gel (EtOAc:MeOH 20:1 → 15:1 → 10:1) 

yielded compound 6a as yellow solid (yield: 228 mg, 42%).  

Data for 6a. Rf = 0.07 (silica gel, EtOAc:MeOH 20:1). 1H NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 2.29 

(m, 2H, Ph‐CO‐CH2‐CH2), 2.63 (min) and 2.71 (maj) (rotamers, m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 

2.92 (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.15 (m, 2H, Ph‐CO‐CH2‐CH2), 3.30 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐

N), 3.38 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 3.95 (maj) and 3.99 (min) (rotamers, s, 2H, N‐CH2‐CO), 4.07‐

4.17 (m, 9H, CH Fc), 5.03 (maj), 5.08, 5.14 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Fc), 6.82 (min) 

and 7.17 (maj) (rotamers, 1 NH‐CO), 7.19‐7.49 (m, 8H, 1×triazole ring proton, 7×benzene ring 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

265

protons),  7.84  (m,  2H,  benzene  ring  protons),  9.20  (maj)  and  9.31  (min)  (rotamers,  1H, 

NHCO). 13C NMR (100.6 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 21.2 (min) and 21.6 (maj) (rotamers, CH2‐CH2‐

triazole ring), 30.1 (maj) and 30.2 (min) (rotamers, Ph‐CO‐CH2‐CH2), 31.8 (maj) and 32.1 (min) 

(rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 33.9 (maj) and 34.1 (min) (rotamers, Ph‐CO‐CH2‐CH2), 38.4 

(maj) and 38.6  (min)  (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 47.8  (maj) and 48.2  (min)  (rotamers, NH‐

CH2‐CH2‐N), 49.7 (min) and 50.2 (maj) (rotamers, N‐CH2‐CO),  52.3 (Fc‐CH2‐triazole ring), 69.2 

(CH Fc), 69.3 (CH Fc), 69.4 (CH Fc), 81.5 (maj) and 81.7 (min) (rotamers, C Fc), 87.2 (maj) and 

87.6  (min)  (rotamers, C‐I), 121.3  (maj) and 121.4  (min)  (rotamers, CH  triazole  ring), 122.4 

(maj) and 122.6  (min)  (rotamers, benzene ring carbon), 128.2  (benzene ring carbon), 128.9 

(benzene ring carbon), 133.4  (maj) and 133.5  (min)  (rotamers, benzene ring carbon), 136.9 

(min)  and  137.1  (maj)  (rotamers,  benzene  ring  carbon),  137.9  (maj)  and  138.1  (min) 

(rotamers,  benzene  ring  carbon),  138.3  (min)  and  138.5  (maj)  (rotamers,  benzene  ring 

carbon),  146.8  (C  triazole  ring),  167.8  (min)  and  168.7  (maj)  (rotamers,  CONH),  172.9, 

(CONH),  173.9  (maj)  and  174.1  (min)  (rotamers,  CH2CON),  199.1  (maj)  and  199.6  (min) 

(rotamers, Ph‐CO). IR bands(ν): 3266w, 3090w, 2930w, 2360m, 2342w, 1731w, 1682s, 1637s, 

1530s, 1484s, 1447w, 1392w, 1370w, 1239s, 1180m, 1001m, 818s, 668m, 606s cm−1. ESI‐MS 

(pos. detection mode): m/z (%): 799.95 (100) [M]+, 822.90 (70) [M+Na]+, 838.85 (25) [M+K]+. 

NH

NNH

OO

NNN

IO

OMn

COOC

OC6b

 

Compound 6b:  To  a  stirred  solution of  4b  (1  g, 1.33 mmol)  in 5 mL DMF, 18 mL of  20% 

piperidine in DMF was added at 0 °C and stirred for 10 min. Then the ice bath was removed 

and the mixture was stirred 2 h at room temperature. The DMF and piperidine was removed 

using high vacuum pump. The resulting residue was washed several times with pentane. The 

light yellow color solid thus obtained was dissolved in 10 mL DMF. The solution was added to 

a solution of 4‐oxo‐4‐cymantrenylbutanoic acid (5b)2 (340 mg, 1.12 mmol), HATU (855 mg, 

2.25 mmol) and DIPEA (290 mg, 2.25 mmol)  in DMF (5 mL), which has been  initially stirred 

for 30 minutes at room temperature. The reaction mixture was stirred for 48 h before being 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

266

diluted with 150 mL of ethyl acetate. The organic phase was washed with 1M HCl (50 mL), 

sat. NaHCO3 solution (50 mL), water (2×75 mL) and brine (2×75 mL), dried over anhydrous 

Na2SO4,  filtered  and  concentrated.  After  flash  column  chromatography  on  silica  gel 

(EtOAc:MeOH 15:1 → 10:1 → 5:1), the solu on was concentrated and pentane was added to 

get a light yellow precipitate. Pentane was decanted off to yield the desired compound 6b as 

light yellow powder (yield: 620 mg, 57%).  

Data for 6b. Rf = 0.14 (silica gel, EtOAc:MeOH 10:1). 1H NMR (250 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 2.47 

(m,  2H,  cymantrene‐CO‐CH2‐CH2),  2.76  (min)  and  2.83  (maj)  (rotamers, m,  2H,  CH2‐CH2‐

triazole ring), 2.92 (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.07 (m, 2H, cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 3.45 

(m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 3.51 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 4.09 (maj) and 4.22 (min) (rotamers, s, 

2H, N‐CH2‐CO), 4.88 (m, 2H, CH cymantrene), 5.45 (s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 5.48 (m, 2H, CH 

cymantrene),  6.87 (min) and 7.01 (maj) (rotamers, 1H, NH‐CO), 7.25‐7.44 (m, 8H, 1×triazole 

ring proton, 7×benzene  ring protons), 7.51‐7.69  (m, 2H, benzene  ring protons), 9.49  (maj) 

and 9.61 (min) (rotamers, 1H, NHCO). 13C NMR (62.9 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 21.1 (min) and 

21.2  (maj)  (rotamers,  CH2‐CH2‐triazole  ring),  29.2  (maj)  and  29.4  (min)  (rotamers, 

cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 31.5  (maj) and 31.8  (min)  (rotamers, CH2‐CH2‐triazole  ring), 33.8 

(maj)  and  33.9  (min)  (rotamers,  cymantrene‐CO‐CH2‐CH2),  37.9  (maj)  and  38.1  (min) 

(rotamers,  NH‐CH2‐CH2‐N),  47.4  (NH‐CH2‐CH2‐N),  49.1  (N‐CH2‐CO),    51.8  (Ph‐CH2‐triazole 

ring),  83.9  (maj)  and  84.9  (min)  (rotamers,  CH  cymantrene),  86.8  (CH  cymantrene),  87.1 

(maj) and 87.4  (min)  (rotamers, C‐I), 91.1  (min) and 91.2  (maj)  (rotamers, C  cymantrene), 

121.6 (CH triazole ring), 121.9 (maj) and 122.1 (min) (rotamers, benzene ring carbon), 127.9 

(benzene  ring  carbon),  128.5  (benzene  ring  carbon),  129.1  (benzene  ring  carbon),  135.1 

(benzene ring carbon), 137.5  (maj) and 137.7  (min)  (rotamers, benzene ring carbon), 137.9 

(min) and 138.1  (maj)  (rotamers, benzene  ring carbon), 147.1  (C  triazole  ring), 167.8  (min) 

and 168.5  (maj)  (rotamers, CONH), 171.9,  (CONH), 173.4  (maj) and 173.8  (min)  (rotamers, 

CH2CON), 196.5  (maj) and 196.3, 197.5  (min)  (rotamers, cymantrene‐CO), 223.2  (maj) and 

224.3  (min)  (rotamers, Mn‐CO).  IR  bands(ν):  2023s,  1931s,  1646m  (br),  1532m,  1462w, 

1392w,  1305w,  1245w,  1181w,  1059w,  1003w,  822w,  730w,  630s  cm−1.  ESI‐MS  (pos. 

detection mode): m/z (%): 818.87 (100) [M+H]+, 840.84 (35) [M+Na]+, 856.79 (15) [M+K]+. 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

267

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

6c  

Compound 6c. To a stirred solution of 4b (600 mg, 0.79 mmol) in 4 mL DMF, 10 mL of 20% 

piperidine in DMF was added at 0 °C and stirred for 10 min. Then the ice bath was removed 

and the mixture was stirred 2 h at room temperature. The DMF and piperidine was removed 

using high vacuum pump. The resulting residue was washed several times with pentane. The 

white  color  solid  thus obtained was dissolved  in 9 mL DMF. The  solution was added  to a 

solution  of  4‐oxo‐4‐phenylbutanoic  acid  (5a)  (255 mg,  1.43 mmol),  HATU  (544 mg,  1.43 

mmol) and DIPEA (185 mg, 1.43 mmol) in DMF (4 mL), which has been initially stirred for 30 

minutes at room temperature. The reaction mixture was stirred for 40 h before the solvent 

was removed. Flash column chromatography on silica gel (THF:MeOH 10:0 → 10:1) yielded 

the desired  compound  6c  as white  solid  (yield:  310 mg,  56%).  For  analytical purpose  the 

compound was washed with little amount of DCM. 

Data for 6c. Rf = 0.45 (silica gel, EtOAc:MeOH 12:1). 1H NMR (400 MHz, DMSO‐d6): δ (ppm) 

2.47  (maj) and 2.59  (min)  (rotamers, m, 2H, PhCO‐CH2‐CH2), 2.76  (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole 

ring),  2.87  (m,  2H, CH2‐CH2‐triazole  ring),  3.22  (m,  4H, NH‐CH2‐CH2‐N  and PhCO‐CH2‐CH2), 

3.41 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 4.11(maj) and 4.16, 4.29 (min) (rotamers, s, 2H, N‐CH2‐CO), 5.52 

(maj) and 5.51, 5.55 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 7.25‐7.54 (m, 7H, triazole ring 

and  benzene  ring  protons),  7.59‐7.65  (m,  4H,  benzene  ring  protons),  7.84‐8.12  (m,  4H, 

benzene  ring  protons),  10.1  (min)  and  10.2  (maj)  (rotamers,  1H, NHCO),  10.5  (min),  10.6 

(maj)  (rotamers, 1H NHCO). 13C NMR  (100.6 MHz, DMSO‐d6): δ  (ppm) 21.2  (min) and 21.3, 

21.4 (maj) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 29.4, 29.5 (min) and 29.6, 29.8 (maj) (rotamers, 

PhCO‐CH2‐CH2), 31.5, 32.1 (min) and 31.8, 32.5 (maj) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 33.8 

(maj) and 33.9  (min)  (rotamers, PhCO‐CH2‐CH2) 37.1, 37.8  (maj) and 37.5, 38.6  (min)  (NH‐

CH2‐CH2‐N ), 46.4, 47.4 (min) and 46.9, 48.3 (maj) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 50.1, 51.9 (maj) 

and 50.3, 51.7  (min)  (rotamers, N‐CH2‐CO),   53.1  (min) and 53.2  (maj)  (rotamers, Ph‐CH2‐

triazole ring), 86.9, 92.1 (maj) and 87.3, 92.2 (min) (rotamers, C‐I benzene ring), 115.7 (maj) 

and  119.1  (min)  (rotamers,  benzene  ring  C),  121.8  (maj)  and  121.9  (min)  (rotamers,  CH 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

268

triazole ring), 122.6 (min) and 122.7 (maj) (rotamers, CONH‐C benzene ring), 126.0 (min) and 

126.1 (maj) (rotamers, benzene ring C), 128.2 (maj) and 128.3 (min) (rotamers, benzene ring 

C), 128.4  (maj)  and 128.6  (min)  (rotamers, benzene  ring C), 129.1, 129.7  (min)  and 129.2 

(maj)  (rotamers,  benzene  ring  C),  133.5  (benzene  ring  C),  136.6  (min)  and  136.9  (maj) 

(rotamers, benzene ring C), 139.1, 139.3 (maj) and 139.2 (min) (rotamers, benzene ring C),  

143.9 (min) and 144.1 (maj) (rotamers, benzene ring C), 146.8 (min) and 147.1 (rotamers, C 

triazole ring), 167.8, 168.1 (min) and 168.4 (maj) (rotamers, CONH), 171.8, 171.9 (min) and 

172.0, 172.2 (maj) (rotamers, CONH), 174.6 (min) and 174.7 (maj) (rotamers, CH2CON), 199.1 

(Ph‐CO).  IR bands(ν): 3236m, 1680m, 1654m, 1625m, 1589m, 1438s, 1400s, 1351w, 1207s, 

1135s, 1114s, 935w, 769s, 640m cm−1. ESI‐MS (pos. detection mode): m/z (%): 715.02 (100) 

[M+Na]+. 

8a

NH

NNH

OO

NNN

Fe

ORe

N

N

N

CO

CO

CO

O

PF6+

 

Compound 8a. A  solution of 6a  (240 mg, 0.35 mmol) and 7  (163 mg, 0.25 mmol)  in 9 mL 

DMF/NEt3 mixture (2/1, v/v) was degassed by two ‘freeze‐pump‐thaw’ cycles. Then CuBr (4.4 

mg,  0.029  mmol)  and  cis‐dichlorobis  (triphenylphosphine)  palladium(II)  (5.3  mg,  0.0075 

mmol) were added under nitrogen atmosphere and the mixture was degassed again by one 

‘freeze‐pump‐thaw’ cycles. The wine color solution thus obtained was allowed to stir 22 h at 

room  temperature.  The  reaction  mixture  was  then  diluted  with  100  mL  of  CH2Cl2  and 

washed with distilled water (4×60 mL) and brine (2×60 mL). The CH2Cl2 layer was dried over 

Na2SO4,  filtered and  concentrated. Addition of 40 mL of diethyl ether gave a brown  color 

solid which was collected and further washed with 15 mL of cold ethyl acetate. The solid was 

then loaded on a silica column and eluted immediately with CH2Cl2:MeOH 5:1. The combined 

fractions was evaporated and redissolved in minimum volume CH2Cl2 and filtered.    Filtrate 

was  dried  to  give  the  desired  compound  6.23  as  light  brown  solid  (yield:  144 mg,  41%). 

(Note:  If the compound stacks  in the column, CH2Cl2:MeOH 5:1 saturated with KPF6 should 

be used as eluent).   

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

269

Data for 8a. Rf = 0.66 (silica gel, DCM:MeOH 5:1). tR (RP‐HPLC) = 17.3 min. 1H NMR (400 MHz, 

CD2Cl2):  δ  (ppm) 2.33‐2.79  (m, 4H, PhCO‐CH2‐CH2 and CH2‐CH2‐triazole  ring), 2.84‐3.01  (m, 

2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.23 (m, 2H, PhCO‐CH2‐CH2), 3.30‐3.45 (m, 4H, NH‐CH2‐CH2‐N and 

NH‐CH2‐CH2‐N), 4.11 (s, br, 2H, N‐CH2‐CO), 4.15‐4.30 (m, 9H, CH Fc), 4.66 (s, br, 2H, N‐CH2‐

C≡C), 4.83 (s, 4H, 2×N‐CH2‐Py),  5.15 (maj) and 5.20 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Fc), 

6.89  (min)  and 6.98  (maj)  (rotamers,  s, br, 1H, NHCO), 7.29‐7.96  (m, 16H, 1×triazole  ring 

proton and 15×aromatic protons), 8.76 (m, 2H, aromatic protons), 9.04, 9.28, 9.55 (min) and 

9.19 (maj) (rotamers, s, br, 1H, NHCO). 13C NMR (100.6 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 20.9 (min) and 

21.2 (maj) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 29.6 (min) and 30.2 (maj) (rotamers, PhCO‐CH2‐

CH2), 31.7 (maj) and 32.3 (min) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 33.9 (PhCO‐CH2‐CH2), 37.7 

(min) and 38.3 (maj) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 48.4 (NH‐CH2‐CH2‐N), 50.2 (N‐CH2‐CO), 52.1 

(Fc‐CH2‐triazole ring), 59.6  (N‐CH2‐C≡C), 68.4  (2×N‐CH2‐Py), 69.2  (CH Fc), 69.3  (CH Fc), 69.4 

(CH  Fc),  81.1  (C≡C‐CH2‐N),  81.5  (C  Fc),  90.6  (N‐CH2‐C≡C),  116.7  (maj)  and  117.1  (min) 

(rotamers, aromatic carbon), 120.1 (maj) and 120.3 (min) (rotamers, aromatic carbon), 121.6 

(min) and 121.9 (maj) (rotamers, CH triazole ring), 124.2 (aromatic carbon), 125.7 (min) and 

126.3 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 128.4 (aromatic carbon), 129.1 (aromatic carbon), 

133.2  (aromatic  carbon), 133.6  (aromatic  carbon), 136.7  (min) and 136.8  (maj)  (rotamers, 

aromatic carbon), 139.3 (min) and 139.6 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 140.9 (aromatic 

carbon), 146.7  (maj)  and 147.1  (min)  (rotamers, C  triazole  ring), 152.1  (aromatic  carbon), 

160.1 (aromatic carbon), 168.1, 168.3 (min) and 169.0, 169.1 (maj) (rotamers, CONH), 173.3 

(maj) and 173.5 (min) (CONH), 174.5 (min) and 174.7 (maj) (rotamers, CH2CON), 195.7 (Re‐

CO), 199.1 (maj) and 200.4 (min) (rotamers, Ph‐CO). IR bands(ν): 2030s, 1910s, 1648m (br), 

1610w,  1514m,  1365w,  1293w,  1105w,  1000w,  834s,  733m,  622w  cm−1.  ESI‐MS  (pos. 

detection mode): m/z (%): 1179.93 (100) [M‐PF6]+. 

8b

NH

NNH

OO

NNN

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

PF6+

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

270

Compounds 8b. A stirred solution of 6b (300 mg, 0.37 mmol) and 7 (199 mg, 0.31 mmol) in 9 

mL DMF/NEt3 mixture (2/1, v/v) was degassed by two ‘freeze‐pump‐thaw’ cycles. Then CuBr 

(5.4 mg, 0.03 mmol) and cis‐dichlorobis  (triphenylphosphine) palladium(II)  (6.4 mg, 0.0091 

mmol) were added under nitrogen atmosphere and the mixture was degassed again by one 

‘freeze‐pump‐thaw’ cycle. The wine color solution thus obtained was allowed to stir 22 h at 

room  temperature.  The  reaction  mixture  was  then  diluted  with  100  mL  of  CH2Cl2  and 

washed with distilled water (4×60 mL) and brine (2×60 mL). The CH2Cl2 layer was dried over 

anhydrous Na2SO4,  filtered and concentrated. Addition of 40 mL of pentane gave a brown 

color  solid. Flash column chromatography on  silica gel  (eluent: EtOAc:MeOH 5:1 and  then 

DCM:MeOH 3:1 saturated with KPF6 to elute the 8b) was done. The fractions containing the 

desired  compound was  combined and evaporated. The  residue was dissolved  in 10 mL of 

CH2Cl2 and filtered. The residue obtained after evaporation was loaded again on a small filter 

silica  column  and  eluted  immediately  with  DCM:MeOH  5:1.  The  desired  fractions  are 

combined and dried, redissolved in minimum volume CH2Cl2 and filtered.  Filtrate was dried 

to give the desired compound 8b as light brown solid (yield: 180 mg, 44%).   

Data  for 8b. Rf = 0.27  (silica gel, CH2Cl2:MeOH 5:1).  tR  (RP‐HPLC) =17.1 min.  1H NMR  (250 

MHz, DMSO‐d6): δ  (ppm) 2.37  (m, 2H, cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 2.50  (maj) and 2.57  (min) 

(rotamers, m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 2.71‐2.95 (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.15‐3.48 

(m,  6H,  cymantrene‐CO‐CH2‐CH2,  NH‐CH2‐CH2‐N  and  NH‐CH2‐CH2‐N),  4.11  (maj)  and  4.25 

(min)  (rotamers,  s,  2H,  N‐CH2‐CO),  4.83  (s,  2H,  N‐CH2‐C≡C),  4.85  (min)  and  4.92  (maj) 

(rotamers, s, 2H, N‐CH2‐Py), 5.03 (maj) and 5.10 (min) (rotamers, s, 2H, N‐CH2‐Py), 5.18 (maj) 

and  5.25  (min)  (rotamers,  m,  2H,  CH  cymantrene),  5.54  (s,  2H,  triazole‐CH2‐Ph),  5.78 

(rotamers, m, 2H, CH cymantrene), 6.43  (min) and 6.50  (maj)  (rotamers, 1H, NHCO), 7.25‐

7.54 (m, 8H, 1×triazole ring proton and 7×aromatic protons), 7.66 (m, 4H, aromatic protons), 

7.82‐8.04 (m, 4H, aromatic protons), 8.85 (d, 2H, aromatic protons), 10.21 (maj) and 10.35 

(min) (rotamers, s, 1H, NHCO). 13C NMR (62.9 MHz, DMSO‐d6): δ (ppm) 21.1, 21.2 (min) and 

21.3  (maj)  (rotamers,  CH2‐CH2‐triazole  ring),  29.2,  29.5  (min)  and  29.4  (maj)  (rotamers, 

cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 31.8  (maj) and 32.3  (min)  (rotamers, CH2‐CH2‐triazole  ring), 34.2 

(cymantrene‐CO‐CH2‐CH2), 37.1  (min) and 37.7  (maj)  (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 48.3  (min) 

and 50.2  (maj)  (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 51.3  (min) and 53.1  (maj)  (rotamers, N‐CH2‐CO), 

55.1 (Ph‐CH2‐triazole ring), 58.4 (maj) and 59.8 (min) (rotamers, N‐CH2‐C≡C), 68.2 (maj) and 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

271

70.1  (min)  (rotamers, 2×N‐CH2‐Py), 82.9  (maj) and 83.1  (min)  (rotamers, C≡C‐CH2‐N), 85.3 

(CH cymantrene), 87.9 (CH cymantrene), 89.1 (N‐CH2‐C≡C), 92.3 (C cymantrene), 115.9 (maj) 

and  116.2  (min)  (rotamers,  aromatic  carbon),  119.3  (maj)  and  119.4  (min)  (rotamers, 

aromatic carbon), 122.7 (CH triazole ring), 124.1 (aromatic carbon), 126.1 (aromatic carbon), 

128.2 (aromatic carbon), 128.4 (aromatic carbon), 129.1 (aromatic carbon), 132.9 (aromatic 

carbon), 136.5 (aromatic carbon), 139.9 (min) and 140.2 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 

140.9  (aromatic  carbon), 146.9  (C  triazole  ring), 152.4  (aromatic  carbon), 160.8  (aromatic 

carbon), 168.0, 168.1 (min) and 168.4 (maj) (rotamers, CONH), 171.4, 171.9 (min) and 171.6 

(maj)  (CONH),  172.3  (maj)  and  172.4,  171.5  (min)  (rotamers, CH2CON),  195.6  (min)  196.1 

(maj)  (rotamers, Re‐C≡O), 197.1  (maj) and 197.2  (min)  (rotamers,  cymantrene‐CO‐), 224.1 

(maj) and 225.4, 225.6 (min) (rotamers, Mn‐CO). IR bands(ν): 2027s, 1910s (br), 1670m (br), 

1518m,  1445w,  1311w,  1245w,  1060w,  832s,  765m,  667w,  629m  cm−1.  ESI‐MS  (pos. 

detection mode): m/z (%): 610.6 (50) [M+Na‐PF6]2+, 1197.91 (100) [M‐PF6]

+. 

X = PF6 (8c), CF3COO (8c')

NH

NNH

OO

NNN

ORe

N

N

N

CO

CO

CO

O

X+

 

Compound 8c′. A solution of 6c (371 mg, 0.53 mmol) and 7 (350 mg, 0.53 mmol)  in 12 mL 

DMF/NEt3 mixture  (2/1,  v/v) was  degassed  by  two  ‘freeze‐pump‐thaw’  cycles.  Then  CuBr 

(9.86 mg,  0.07 mmol)  and  cis‐dichlorobis  (triphenylphosphine)  palladium(II)  (7.7 mg,  0.01 

mmol) were added under nitrogen atmosphere and the mixture was degassed again by one 

‘freeze‐pump‐thaw’ cycle. The wine color solution thus obtained was allowed to stir 20 h at 

room  temperature. The solvent was  removed and  the  residue was diluted with 100 mL of 

CH2Cl2, washed with distilled water  (4×60 mL)  and brine  (2×60 mL). The CH2Cl2  layer was 

dried over Na2SO4, filtered and concentrated. The solid was then  loaded on a silica column 

and  eluted  immediately  with  CH2Cl2:MeOH  5:1  →  3:1.  The  combined  frac ons  was 

evaporated and redissolved in CH2Cl2 and filtered. Filtrate was dried to give 8c as light brown 

solid (yield: 256 mg, 39%). For biological applications purpose 8c was further purified by RP‐

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

272

HPLC  to  remove  a  trace  of  impurity  present  after  purification  by  silica  column 

chromatography to give 8c′. 

Data  for 8c. Rf = 0.51  (silica gel, CH2Cl2:MeOH 4:1).  tR  (RP‐HPLC) = 16.8 min.  1H NMR  (250 

MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 2.54 (m, 2H, Ph‐CO‐CH2‐CH2), 2.75 (min) and 2.82 (maj) (rotamers, m, 

2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.03 (m, 2H, CH2‐CH2‐triazole ring), 3.27 (m, 2H, PhCO‐CH2‐CH2), 

3.34‐3.56 (m, 4H, NH‐CH2‐CH2‐N and NH‐CH2‐CH2‐N), 4.15 (maj) and 4.32 (min) (rotamers, s, 

2H, N‐CH2‐CO), 4.68 (min) and 4.71 (maj) (rotamers, s, 2H, N‐CH2‐C≡C), 4.87‐5.18 (rotamers, 

m, 4H, 2×N‐CH2‐Py),  5.42 (maj) and 5.45, 5.20 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 6.52, 

6.78  (min) and 6.99  (maj)  (rotamers, 1H, NHCO), 7.19‐7.50  (m, 13H, 1×triazole  ring proton 

and 12×aromatic protons), 7.56‐7.69 (m, 4H, aromatic protons), 7.82‐7.95 (m, 4H, aromatic 

protons), 8.76 (m, 2H, aromatic protons), 9.43 (maj) and 9.50, 9.60, 10.13 (min) (rotamers, 

NHCO). 13C NMR (62.9 MHz, CD2Cl2): δ (ppm) 20.9 (min) and 21.1 (maj) (rotamers, CH2‐CH2‐

triazole ring), 29.6 (maj) and 39.9 (min) (rotamers, PhCO‐CH2‐CH2), 31.6 (maj) and 31.9 (min) 

(rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 33.6 (maj) and 33.9 (min) (rotamers, PhCO‐CH2‐CH2), 37.9 

(maj) and 38.3 (min) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 49.1 (NH‐CH2‐CH2‐N), 51.8 (N‐CH2‐CO), 52.1 

(Ph‐CH2‐triazole  ring,  overlaps  with  solvent  residual  signal),  59.1  (maj)  and  59.2  (min) 

(rotamers, N‐CH2‐C≡C), 68.1, 68.3  (maj) and 72.2, 72.4  (min)    (rotamers, 2×N‐CH2‐Py), 80.8 

(C≡C‐CH2‐N),  90.3  (N‐CH2‐C≡C),  116.1  (maj)  and  116.3  (min)  (rotamers,  aromatic  carbon), 

119.5, 120.1 (min) and 119.7 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 121.6 (min) and 121.9 (maj) 

(rotamers, CH triazole ring), 123.9 (aromatic carbon), 124.2 (aromatic carbon), 125.4, 125.6 

(min) and 125.8, 125.9  (maj)  (rotamers, 2×aromatic carbons), 127.8  (min) and 127.9  (maj) 

(rotamers, aromatic carbon), 128.4 (min) and 128.5 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 128.9 

(aromatic  carbon),  132.7  (aromatic  carbon),  133.1  (aromatic  carbon),  135.2  (aromatic 

carbon), 136.6 (aromatic carbon), 139.3 (min) and 139.6 (maj) (rotamers, aromatic carbon), 

140.5 (aromatic carbon), 146.7 (maj) and 147.1 (min) (rotamers, C triazole ring), 151.4 (min) 

and  151.6  (maj)  (rotamers,  aromatic  carbon),  159.3  (min)  and  159.6  (maj)  (rotamers, 

aromatic  carbon),  167.1,  167.9,  168.1  (min)  and  168.4  (maj)  (rotamers,  CONH),  172.4 

(CONH),  173.4  (maj)  and  173.6  (min)  (rotamers,  CH2CON),  194.9  (min)  and  195.3  (maj) 

(rotamers, Re‐CO), 198.8 (min) and 199.2 (maj) (rotamers, Ph‐CO). IR bands(ν): 2032s, 1913s, 

1670m (br) cm−1. ESI‐MS (pos. detection mode): m/z (%): 1071.98 (100) [M‐PF6]+. 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

273

NH

NNH

OO

NNN

ON

N

N

O9  

Compound 9. A solution of 6c (180 mg, 0.26 mmol) and N,N‐bis(pyridine‐2‐ylmethyl)prop‐2‐

yn‐1‐amine3 (62 mg, 0.26 mmol) in 9 mL DMF/NEt3 mixture (2/1, v/v) was degassed by two 

‘freeze‐pump‐thaw’  cycles.  Then  CuBr  (60  mg,  0.31  mmol)  and  cis‐dichlorobis 

(triphenylphosphine)  palladium  (II)  (21  mg,  0.03  mmol)  were  added  under  nitrogen 

atmosphere and the mixture was degassed again by one ‘freeze‐pump‐thaw’ cycle. The wine 

color solution  thus obtained was allowed  to stir 20 h at  room  temperature. The DMF and 

NEt3 were removed and the residue was diluted with 125 mL of CH2Cl2/isopropanol mixture 

(5/1,  v/v).  The  organic  phase was washed with  aqueous  sat. Na2EDTA,  brine,  dried  over 

anhydrous  Na2SO4,  filtered  and  concentrated.  Flash  column  chromatography  (two  times) 

(silica  gel,  CH2Cl2:CH3CN:MeOH:NH4OH  50:50:25:2) with  the  residue was  performed.  The 

resulting solution was dried and the residue was redissolved  in 15 mL DCM and  filtered to 

remove  the  silica. Evaporation of  the CH2Cl2  solution afforded  the desired compound 9 as 

brown  sticky  solid  (yield:  69 mg,  35%).  For  biological  applications  purpose  9 was  further 

purified by RP‐HPLC. 

Data for 9. tR (RP‐HPLC) = 14.1 min. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2.42 (m, 2H, PhCO‐

CH2‐CH2), 2.65  (min) and 2.73  (maj)  (rotamers, m, 2H, CH2‐CH2‐triazole  ring), 2.97  (m, 2H, 

CH2‐CH2‐triazole ring), 3.16 (m, 2H, PhCO‐CH2‐CH2), 3.33 (m, 2H, NH‐CH2‐CH2‐N), 3.41 (m, 2H, 

NH‐CH2‐CH2‐N), 3.53 (s, 2H, N‐CH2‐C≡C), 3.89 (s, 4H, 2×N‐CH2‐Py), 4.08 (maj) and 4.21 (min) 

(rotamers, s, br, 2H, N‐CH2‐CO), 5.28 (maj) and 5.33 (min) (rotamers, s, 2H, triazole‐CH2‐Ph), 

7.07‐7.56  (m,  20H,  1×triazole  ring  proton,  1×NH‐CO,  18×aromatic  protons),  7.82  (d,  2H, 

aromatic protons), 8.46 (m, 2H, aromatic protons), 9.43 (maj) and 10.01 (min) (rotamers, s, 

1H, NHCO). 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3): δ (ppm) 21.1 (min) and 21.2 (maj) (rotamers, CH2‐

CH2‐triazole ring), 29.6, 29.9 (min) and 29.8 (maj) (rotamers, PhCO‐CH2‐CH2), 31.7 (maj) and 

32.1 (min) (rotamers, CH2‐CH2‐triazole ring), 33.5 (maj) and 33.8 (min) (rotamers, PhCO‐CH2‐

CH2), 37.9 (maj) and 38.1, 38.3 (min) (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 43.6 (N‐CH2‐C≡C), 47.7 (min) 

and 49.1  (maj)  (rotamers, NH‐CH2‐CH2‐N), 51.7  (maj) and 51.2  (min)  (rotamers, N‐CH2‐CO), 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

274

54.1 (maj) and 54.2 (min) (rotamers, Ph‐CH2‐triazole ring), 59.5 (N‐CH2‐Py), 83.6 (N‐CH2‐C≡C), 

85.6 (C≡C‐CH2‐N), 118.4 (CH triazole ring), 119.7 (aromatic carbon), 121.7 (aromatic carbon), 

122.2 (aromatic carbon), 123.3 (aromatic carbon), 125.3 (aromatic carbon), 128.1 (aromatic 

carbon), 128.6  (aromatic carbon), 128.9  (aromatic carbon), 131.9  (aromatic carbon), 132.2 

(aromatic  carbon),  133.1  (aromatic  carbon),  134.7  (aromatic  carbon),  136.5  (aromatic 

carbon),  136.7  (aromatic  carbon),  138.1  (aromatic  carbon),  147.1  (C  triazole  ring),  149.1 

(aromatic carbon), 158.6  (aromatic carbon), 167.6, 167.8  (min) and 168.2  (maj)  (rotamers, 

CONH), 172.5  (CONH), 173.4  (maj) and 173.7  (min)  (rotamers, CH2CON), 199.1  (Ph‐CO).  IR 

bands(ν):  2926w,  2360w,  1648s  (br),  1594s,  1529s,  1435s,  1308m,  1179m,  1118m,  999w, 

839m, 722s, 693s cm−1. ESI‐MS (pos. detection mode): m/z (%): 802.35 (100) [M+H]+, 824.19 

(25) [M+Na]+. 

   

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

275

ii. RP‐HPLC traces and ESI mass spectra of 8a, 8b, 8c,′ and 9  

Compound 8a. 

8a

NH

NNH

OO

NNN

Fe

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

O

PF6+

 

 

Compound 8b. 

8b

NH

NNH

OO

NNN

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

PF6+

 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

276

Compound 8c′ (after RP‐HPLC purification). 

8c'

NH

NNH

OO

NNN

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

O

CF3COO+

 

 

Compound 9 (after RP‐HPLC purification). 

NH

NNH

OO

NNN

ON

N

N

O9  

 

 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

277

iii. 1H and 13C NMR spectra of compounds 

 

NH

NO

OO

NNN

O

O

2  1H, CDCl3, 400 MHz 

 13C, CDCl3, 62.9 MHz 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

278

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

4b  

1H, CDCl3, 100.6 MHz 

 13C, CDCl3, 250 MHz 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

279

NH

NNH

OO

NNN

O

O

Fe

I

6a  1H, CD2Cl2, 400 MHz 

 

 

 13C, CD2Cl2, 100.6 MHz 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

280

NH

NNH

OO

NNN

IO

OMn

COOC

OC6b  

 

1H, CD2Cl2, 250 MHz 

 

 

13C, CD2Cl2, 62.9 MHz 

 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

281

NH

NNH

OO

NNN

O

OI

6c   

1H, DMSO‐d6, 400 MHz 

  

13C, DMSO‐d6, 100.6 MHz 

 

0306090130170210ppm

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

282

8a

NH

NNH

OO

NNN

Fe

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

O

PF6+

 1H, CD2Cl2, 400 MHz 

 13C, CD2Cl2, 100.6 MHz 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

283

8b

NH

NNH

OO

NNN

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

MnOC

OC CO O

PF6+

 1H, DMSO‐d6, 250 MHz 

 13C, DMSO‐d6, 62.9 MHz 

 

-2-1012345678910111213ppm

Triethyl amine

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

284

8c

NH

NNH

OO

NNN

O

Re

N

N

N

CO

CO

CO

O

PF6+

 1H, CD2Cl2, 250 MHz 

 13C, CD2Cl2, 62.9 MHz 

 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

285

NH

NNH

OO

NNN

ON

N

N

O9  

1H, CDCl3, 400 MHz 

 

 13C, CDCl3, 100.6 MHz 

 

 

205080120160200ppm

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

286

iv. References 

1.  Patra, M.; Gasser, G.; Bobukhov, D.; Merz, K.; Shtemenko, A. V.; Metzler‐Nolte, N., Dalton 

Trans. 2010, 39, 5617‐5619. 

2.  N'Dongo, H. W. P.; Neundorf,  I.; Merz, K.; Schatzschneider, U.,  J.  Inorg. Biochem. 2008, 

102, 2114‐2119. 

3.  Cabrera, D. G.; Koivisto, B. D.; Leigh, D. A., Chem. Commun. 2007, 4218‐4220. 

 

 

J Organometallic PNA backbone derivatives SAR

287

  

K  Discussion 

The  bacterial  cell  envelope  is  an  attractive  antibiotic  target.  The  penicillins  and 

cephalosporins  targeting  peptidoglycan  cross‐linking  are  probably  the  most  successful 

antibiotic  agents  in history. Different  steps of  cell wall biosynthesis  as well  as membrane 

biogenesis and integrity are further promising antibiotic targets that have been proposed to 

be  less prone to bacterial resistance  [Brötz and Brunner, 2006; Peschel and Sahl, 2006].  In 

this work, reference antibiotics targeting membrane biogenesis and structure as well as cell 

wall  biosynthesis  were  investigated.  Targeting  the  cell  wall  structure  itself  was  already 

shown not to elicit a proteome response in B. subtilis [Bandow et al., 2003, Rabenau, 2010]. 

Findings  obtained  for  the  reference  compounds were  then  employed  in mode  of  action 

analysis of novel peptide‐based  antibiotics.  Two  groups  of  compounds were  investigated: 

short  cationic  peptides  based  on  the  MP196  lead  structure  RWRWRW‐NH2  and  the 

structurally novel class of organometallic PNA derivatives. 

1  Proteomic signatures 

Proteomic  profiles  of  the  acute  bacterial  stress  response  to  treatment with  an  antibiotic 

compound  can  be  indicative  of  its  mechanism  of  action.  Comparison  of  the  proteome 

response  to  novel  antibiotics  with  established  reference  patterns  allows  compound 

classification  into mechanistic categories. Thus, proteome analysis serves as an  informative 

starting  point  for  mode  of  action  elucidation  [Wenzel  and  Bandow,  2011].  In  order  to 

complement  the  existing  antibiotic  reference  library  [Bandow  et  al.,  2003],  proteomic 

signatures for different aspects of cell envelope‐related stress were established. A proteomic 

signature  is a set of specific marker proteins  indicative of a defined physiological condition. 

Such signatures are typically established by comparing the proteomic response of different 

compounds targeting the same pathway or structure [VanBogelen et al., 1999].  

A signature for fatty acid biosynthesis inhibition was established employing the FabI inhibitor 

triclosan, the FabF inhibitors cerulenin and platensimycin, and the triple inhibitor platencin, 

binding to FabF, FabHA, and FabHB. The proteomic signature consists of six proteins, all of 

which involved in membrane lipid biosynthesis (Figure 11). PanB is involved in the synthesis 

of  coenzyme A,  an essential  cofactor  for  fatty  acid biosynthesis.  FabF,  FabHA,  and  FabHB 

start  the  fatty  acid  condensation/elongation  cycle.  FabI  performs  the  last  reduction  step. 

PlsX  is  the  first  enzyme  in  the  successive  phospholipid  biosynthesis. Upregulation  of  the 

K Discussion

288

  

metabolic bottlenecks of  an  inhibited pathway  is  a  common  stress  response  strategy  and 

reflects the cellular attempt to compensate for the antibiotic‐mediated loss of function. 

 

 

Figure 11: Proteomic signature for fatty acid biosynthesis  inhibition. Proteins upregulated 

in  response  to  triclosan,  cerulenin, platensimycin,  and platencin  are highlighted  in  red. B. 

subtilis responds by upregulation of enzymes catalyzing the initial and last steps of the fatty 

acid  biosynthesis  cycle  as  well  as  proteins  involved  in  coenzyme  A  and  phospholipid 

biosynthesis. 

 

The  newly  established  signature  was  employed  to  investigate  the  target  area  of  the 

chromium  organometallic‐substituted  platensimycin  derivative  PM47.  Although molecular 

modeling suggested  that  the derivative  fits  into  the platensimycin binding site of  the FabF 

enzyme  [Patra  et  al.,  2009],  none  of  the  fatty  acid  biosynthesis  signature  proteins  was 

upregulated in response to the chromium bioorganometallic. Thus, membrane biogenesis is 

not its antibiotic target. Moreover, none of the proteome response profiles of the B. subtilis 

reference compendium shared similarity with the PM47 stress response pattern indicating a 

novel mechanism of action.  Its  low selectivity  for bacterial cells however suggests a rather 

unspecific toxic mechanism. 

PM47  target  falsification demonstrates how proteomic signatures can aid narrowing down 

the  target area. Since  the development of platensimycin and platencin, huge efforts have 

been undertaken to modify their structures and to develop analogs or novel FAB  inhibitors 

K Discussion

289

  

by rational design in order to overcome the low in vivo activity of these otherwise promising 

antibiotics  [Shen  et  al.,  2009;  Patra  et  al.,  2010b;  Patra  et  al.,  2011;  Patra  et  al.,  2012b; 

Plesch et al., 2012]. The proteomic signature for inhibition of fatty acid biosynthesis can now 

aid mode of action validation of promising derivatives. 

A  subset  of  lantibiotics  with  distinct  mechanisms  of  action  was  employed  to  generate 

individual  proteomic  signatures  for  general  cell  envelope  stress, membrane  damage,  and 

inhibition of membrane‐bound cell wall biosynthesis (Figure 12).  

The lantibiotics nisin, gallidermin, and mersacidin target cell wall biosynthesis by binding to 

the precursor  lipid  II  [Schneider  and  Sahl, 2010]. Additionally,  gallidermin  and nisin  insert 

into the bacterial membrane, but only nisin forms pores  in B. subtilis. Although gallidermin 

permeates  the membrane of Stapyhlococci,  the B.  subtilis membrane  composition,  rich  in 

branched chain  fatty acids, prevents  it  from efficiently  forming pores  [Christ et al., 2008]. 

This  set  of  lantibiotics  together  with  further  profiles  from  the  reference  compendium 

allowed definition of a proteomic signature for general cell envelope stress, constituted by 

the detoxifying proteins YceC and YceH. They  share  similarity with a  tellurium and a  toxic 

anion  resistance protein,  respectively. However,  their particular  roles  in  the  cell envelope 

stress response are not understood so far.  

The  proteome  responses  to  the  respective  lantibiotics  revealed  a  specific  signature  for 

membrane  damage,  constituted  by  PspA  and  NadE.  PspA  binds  to  the  inner membrane 

surface,  stabilizing  the  bilayer  structure  and  preventing  proton  leakage  [Kobayashi  et  al., 

2007]. NAD synthase  is probably upregulated because of energy  limitation due to  impaired 

membrane  function.  It  reflects  a  cellular  attempt  to  compensate  for  respiratory  chain 

inhibition.  

The stress  responses  to  the  individual  lantibiotics provide unique  insight  into  the bacterial 

reaction  to  different  grades  of  membrane  interaction.  Mersacidin‐treatment  provokes 

upregulation  of  very  few  compound‐specific marker  proteins  in  addition  to  the  cell wall 

biosynthesis  signature.  This  is  consistent  with  its  single  mechanism  of  binding  lipid  II. 

Gallidermin elicits a more complex stress response reflective of the multiple consequences 

of binding  lipid  II and  integrating  into the membrane. B. subtilis responds to  integration of 

gallidermin into the membrane by upregulation of cell envelope stress proteins, such as the 

penicillin‐binding protein PBP 4 or DltA,  the  latter of which  is  involved  in  lipiteichoic  acid 

synthesis and indicates cell wall adaptation. In contrast, the stress response to nisin revealed 

K Discussion

290

  

almost no specific markers apart from the signature proteins. This could be due to its pore‐

forming mechanism. As soon as a nisin concentration sufficient for pore formation is reached 

[Huang  et  al.,  2002],  it  is  likely  that  the membrane  potential  immediately  breaks  down, 

strictly limiting energy for the biosynthesis of stress proteins. Owing to this fast kinetic, nisin‐

treated cells have only very little chance to appropriately react to antibiotic stress. Thus, no 

specific proteomic markers for pore formation can be observed.  

 

 

Figure  12:  Proteomic  signatures  for  general  cell  envelope  stress,  cell wall  biosynthesis 

inhibition, and membrane damage. Both PspA and LiaH bind to the membrane and stabilize 

its structure. While PspA is specifically upregulated by membrane damage, LiaH is responsive 

to inhibition of membrane‐bound cell wall biosynthesis. NadE is probably upregulated due to 

energy  limitation.  The  particular  roles  of  the  other marker  proteins  in  the  cell  envelope 

stress response remain to be  fully elucidated. CWB: cell wall biosynthesis; RSC: respiratory 

chain. 

 

A signature for  inhibition of membrane‐bound cell wall biosynthesis  is constituted by LiaH, 

YtrB,  YtrE,  TrmB,  and  YpuA  (formerly  referred  to  as NGM1  [Wenzel  et  al.,  2012]). What 

particular roles the ATP transporter subunits YtrB and YtrE, the tRNA‐modifying TrmB, and 

K Discussion

291

  

the  unknown  protein  YpuA  play  in  the  stress  response  remains  unclear  so  far.  The  PspA 

homolog  LiaH  forms  ring  structures  consisting  of  36  LiaH  proteins,  which  bind  to  the 

cytoplasmic  membrane  surface.  It  is  thought  to  stabilize  the  lipid  bilayer  under  stress 

conditions  [Wolf  et  al.,  2010].  Upregulation  of  LiaH  correlates with  the  proximity  of  the 

antibiotic binding site to the cytoplasmic membrane. The investigated lantibiotics bind to the 

membrane‐proximal  sugar  part  of  the  lipid  II molecule.  Bacitracin  binds  to  undecaprenyl 

pyrophosphate.  They  all  strongly  induce  liaH  expression.  In  contrast,  LiaH  was  not 

upregulated  in  response  to vancomycin, which binds  to  the membrane‐distant amino acid 

side  chain  of  lipid  II.  Similar  results  were  obtained  by  Mascher  et  al.,  who  measured 

activation of a liaH‐lacZ reporter gene fusion by different antibiotics. Although there was an 

activation of liaH transcription after vancomycin treatment, it was far less pronounced than 

in  response  to membrane‐proximally  lipid  II‐binding  compounds  like  bacitracin  and  nisin 

[Mascher et al., 2004].  

LiaH was  further  upregulated  in  the  proteome  response  to  gramicidin  S, which  does  not 

directly interact with cell wall biosynthesis but does affect cell wall integrity. Gramicidin S is 

described  to  disorganize  lipid  mixing  in  the  membrane,  gathering  negatively  charged 

phospholipids  around  its  positive  charges  [Kaprel’iants  et  al.,  1977;  Vostroknutova  et  al., 

1981].  Localization of  the  cell wall biosynthesis machinery was proposed  to  take place  in 

membrane  regions  rich  in  negatively  charged  phospholipids  [Matsumoto  et  al.,  2006; 

Muchová  et  al.,  2011].  Thus,  domain  formation  in  the membrane  bilayer  by  gramicidin  S 

could contribute to  impairment of cell wall biosynthesis, explaining upregulation of LiaH  in 

the proteome response. 

The  differential  regulation  of  liaH  expression  depending  on  membrane  proximity 

demonstrates how sophisticated proteomic profiling can distinguish between mechanisms of 

action. This specificity becomes even more apparent upon comparison of the novel signature 

with compounds targeting intracellular steps of cell wall biosynthesis. D‐cycloserine, limiting 

the supply of D‐alanine for peptidoglycan synthesis [Lambert and Neuhaus, 1972; Vicario et 

al., 1987],  induced a distinct stress response, which did not overlap with that to  lantibiotic 

treatment [Bandow et al., 2003]. Compounds inhibiting membrane‐distal extracellular steps 

do not elicit a stress response in B. subtilis at all. This was true for methicillin, binding to PBP 

2, as well as for cephalexin, binding to PBP 4 [Bandow et al., 2003, Rabenau, 2010]. B. subtilis 

168 possesses a  functional  β‐lactamase encoded by penP  [Imanaka et al., 1983], which  is 

K Discussion

292

  

expressed  and  secreted  after  long‐term  treatment  with  ampicillin  [unpublished  results]. 

Thus,  B.  subtilis  does  react  to  treatment  with  β‐lactam  antibiotics  although  no  stress 

response  could be detected  in  the 2D  gel‐based proteomics  approach  in  the  investigated 

time frame. 

The new  signature  for  cell wall biosynthesis  inhibition  is highly  specific  to  inhibition on  a 

membrane‐bound  step.  It  further  allows  prediction  of  the  proximity  of  the  antibiotic’s 

binding  site  to  the  bilayer.  Together with  the  signatures  for membrane  and  general  cell 

envelope  stress  it  complements  the  existing  proteome  reference  compendium.  The  new 

signatures  place  the  already  established  proteome  profiles  of  cell  envelope‐targeting 

compounds  into  a  broader  context  and  refine  the  reference  compendium  in  terms  of 

signatures  for  cell  envelope‐related  stress,  recently  complemented  by  a  signature  for 

treatment with divalent cation  ionophores [Raatschen and Bandow, 2012; Raatschen et al., 

2013]. They are now available for mode of action analysis of further cell envelope‐targeting 

antibiotics  and will  prove  useful  especially  for  investigating  antimicrobial  peptides, which 

might affect  further cellular processes  in addition  to  interacting with membranes  [Nicolas, 

2009; Wilmes et al., 2011; Wimley, 2011]. The newly established signatures were employed 

here  for mode of action analysis of  typical short cationic antimicrobial peptides and novel 

organometallic PNA derivatives. 

2  Mechanism of action of MP196, a short cationic antimicrobial peptide 

The  synthetic hexapeptide MP196  consists of  the  amino  acid  sequence RWRWRW‐NH2.  It 

derived from an approach to reveal the minimal pharmacophore of short cationic peptides 

[Strøm et al., 2003].  It  is  therefore  ideally suited  to study  the mechanism of action of  this 

peptide class and its influence on bacterial physiology.  

Interaction of MP196 with bacterial membranes is best described with the interfacial activity 

model [Wimley, 2011].  Interfacial activity  is defined as “the ability to bind to a membrane, 

partition  in  the membrane‐water  interface  and  to  alter  the  packing  and  organization  of 

lipids” [Rathinakumar and Wimley, 2008; Rathinakumar et al., 2009]. The positively charged 

arginines  and  the  more  hydrophobic  tryptophans,  which  at  the  same  time  display  a 

significant quadrupole moment, favor accumulation of the peptide at the interface between 

the hydrophilic phospholipid head groups and the hydrocarbon layer [Chan et al., 2006].  

K Discussion

293

  

In  fact,  integration  of MP196  into model  lipid  bilayers  leads  to  perturbation  of  fatty  acyl 

chain  packing.  This  is  consistent with  the  interfacial  activity model  proposing  perturbed 

separation of hydrophilic and hydrophobic membrane parts.  Insertion of the polar peptide 

into  the bilayer  fosters  incursion of polar  lipid head groups deeper  into  the bilayer as was 

demonstrated for the bee venom peptide melittin (Figure 13). 

 

 

Figure 13: Molecular dynamics simulation of peptide‐induced pore formation according to 

the interfacial activity model. The antimicrobial peptide melittin perturbs the segregation of 

polar and nonpolar moieties of the  lipid bilayer and forms a permeation pathway shuttling 

small  ions along the peptide‐lipid structure [modified according to Wimley, 2010; based on 

results from Sengupta et al., 2008]. 

 

According  to  molecular  dynamics  simulations,  melittin  forms  a  permeation  pathway 

consisting  of  the  peptide  and  lipid  head  groups  that  allows  ions  to  cross  the  bilayer.  In 

contrast,  MP196  treatment  did  not  foster  ion  efflux.  Probably,  MP196  disturbs  bilayer 

architecture  by  inducing  the  same  funnel‐like  incursion  of  phospholipid  head  groups  and 

destabilizes  the  membrane  structure  but  does  not  accomplish  a  membrane‐spanning 

permeation pathway. This could be due to  its short and compact structure. It could also be 

attributed  to  the  alternating  RW  sequence.  Interfacial  activity  requires  an  imperfect 

amphipathicity as a molecule with ideal separation of hydrophilic and hydrophobic residues 

would exhibit less potential to deform the lipid bilayer [Rathinakumar et al., 2009]. However, 

under  hypoosmotic  conditions, MP196  facilitates  ion  fluxes,  especially  potassium  efflux, 

across  the  B.  subtilis membrane. Hypoosmosis  destabilizes  the membrane  structure.  It  is 

possible  that  higher  lipid mobility  and  increased  turgor  pressure  facilitate  formation  of  a 

functional permeation pathway by MP196.  

The  interaction  of  several  antimicrobial  peptides  with  model  membranes  or  isolated 

membrane  extracts  has  been  extensively  studied  [Zweytick  et  al.,  2011;  Zweytick  et  al., 

K Discussion

294

  

2012]. However, only very little is known about their in vivo mechanism of action. Even less 

information  is available on  their  influence on bacterial  cells apart  from  their  influence on 

membrane  lipids. MP196 was  employed  to  shed  light  on  the  influence  of  short  cationic 

antimicrobial  peptides  on  bacterial  physiology.  Based  on  proteome  analysis  of  both  the 

cytosolic and the membrane proteome, hypotheses on the mechanism of action of MP196 

were  generated.  The  cytosolic  proteome  response  revealed  upregulation  of  almost  all 

signature proteins for cell envelope stress, cell wall biosynthesis inhibition (except for YpuA 

and YtrB), and membrane  stress. The proteome  response was  further  indicative of  strong 

energy  limitation.  Such  mechanistic  duality  was  similarly  observed  for  gallidermin, 

suggesting  membrane  integration  and  inhibition  of  cell  wall  biosynthesis  by  MP196. 

Comparison  with  the  proteome  reference  compendium  further  revealed  similarities  of 

MP196 with  the membrane‐integrating peptide gramicidin S and  the potassium  ionophore 

valinomycin.  Extensive  comparative  follow  up  experiments  emphasizing  inhibition  of  cell 

wall  biosynthesis,  membrane  interaction,  and  influence  on  energy  metabolism  allowed 

developing a comprehensive model  for  the  in vivo mechanism of action of MP196  (Figure 

14). 

 

 

Figure  14:  Mechanism  of  action  of  MP196.  MP196  binds  to  the  interfacial  membrane 

regions and disturbs membrane architecture. Consequently, peripheral membrane proteins, 

such  as MurG  and  cytochrome  c,  are  detached  from  the membrane  surface  resulting  in 

inhibition of cell wall biosynthesis and respiration.  

 

Integration of MP196 into the B. subtilis membrane perturbs phospholipid packing and leads 

to detachment of the peripheral membrane proteins MurG involved in cell wall biosynthesis 

295

  

and  cytochrome  c  involved  in  respiration.  Consequently,  both  processes  are  impaired 

leading to loss of cell wall integrity and substantial ATP limitation. 

MurG binds to the cytoplasmic membrane with an amphipathic α‐helix, which is horizontally 

attached  to  the  bilayer  [Hu  et  al.,  2003].  It  is  probably  detached  due  to  membrane 

deformation.  This  phenomenon  might  explain  an  observation  repeatedly  made  for 

membrane‐interacting  peptides  like  daptomycin.  Similar  to  MP196,  no  interaction  of 

daptomycin  with  components  of  the  cell  wall  biosynthesis  machinery  was  observed 

[Schneider et al., 2009]. However, both compounds strongly induce a LiaRS response [Wecke 

et al., 2009]. Daptomycin has also been shown to  influence membrane architecture and to 

delocalize the cell division protein DivIVA  [Pogliano et al., 2012].  It  is  likely that  it similarly 

delocalizes MurG, which would explain  the upregulation of LiaH and daptomycin  influence 

on cell wall integrity [unpublished results]. 

 MurG  detachment  also  plays  a  role  in  the  effects  on  cell wall  biosynthesis  observed  for 

gramicidin  S.  The  protein  almost  completely  disappears  from  the membrane  fractions  of 

gramicidin  S‐treated  cultures.  This might  be  due  to  gramicidin  S‐membrane  interaction. 

MurG has been  shown  to preferentially  co‐localize with negatively  charged phospholipids 

[Matsumoto  et  al.,  2006], which  are  disturbed  upon  integration  of  gramicidin  S  into  the 

bilayer [Kaprel’iants et al., 1977; Vostroknutova et al., 1981].  

MurG seems to be the major player in cell wall biosynthesis impairment by membrane‐active 

antibiotics.  Its  delocalization  explains  how  such  compounds  elicit  strong  cell  wall  stress 

responses and  impair cell wall  integrity without  interacting with a particular component of 

the biosynthesis pathway. The  induction mechanism of the LiaRS two‐component system  is 

still  not  completely  understood  [Wolf  et  al.,  2010].  Based  on  the  observations  that  (i) 

perturbation of membrane architecture causes delocalization of MurG and  (ii) compounds 

interfering  with  membrane  architecture  lead  to  LiaH  upregulation,  it  is  plausible  that 

induction of the LiaRS system  is strongly connected to a disturbed membrane architecture 

and subsequent protein delocalization. This would be in contrast to the LiaH homolog PspA, 

which  is  induced  by membrane‐targeting  compounds  independent  of  their  influence  on 

membrane architecture. 

Detachment  of  cytochrome  c  explains  the  substantial  energy  limitation  after  MP196 

treatment. Cytochrome c is also released from the mitochondrial membrane upon treatment 

with valinomycin and from liposomes by some cationic agents [Jutila et al., 1998; Yamamoto 

K Discussion

296

  

et al., 2012]. B. subtilis possesses four c‐type cytochromes [Hodson et al., 2008]. Cytochrome 

c550  (CccA)  is  attached  to  the  membrane  with  a  transmembrane  peptide  helix,  while 

cytochrome  c551  (CccB)  anchors  in  the  lipid bilayer with  a  lipid  tail  [von Wachenfeldt  and 

Hederstedt, 1990; Bengtsson et al., 1999; García Montes de Oca et al., 2012]. QcrC and CtaC 

are subunits of the cytochrome bc complex and the cytochrome c oxidase caa3, respectively 

[van der Oost et al., 1991; Yu and Le Brun, 1998]. Whether all four c‐type cytochromes are 

detached by MP196 could not be determined so far, although it appears likely that only the 

free variants are affected. Consistently, about 40% of  total  cytochrome  c disappears  from 

the  membrane  fraction  after  treatment  resulting  in  a  strong  impact  on  the  electron 

transport chain and cellular ATP levels.  

MinD  is  another  example  for  MP196‐dependent  protein  delocalization.  It  possesses  an 

amphipathic  α‐helix,  which  is  horizontally  attached  to  the  inner  membrane  surface  by 

electrostatic  interactions.  The  primary  cause  of  MinD  delocalization  is  the  loss  of  the 

membrane potential [Pichoff et al., 2005; Strahl and Hamoen, 2010]. Consistently, MinD was 

also delocalized by valinomycin, which should not affect membrane architecture. 

FtsA and SecA, both peripheral membrane proteins, were  found  to be upregulated  in  the 

membrane  proteome  after  65 minutes  of  antibiotic  treatment.  As  suggested  for MurG, 

upregulation  of  FtsA  and  SecA  could  point  to  a  cellular  attempt  to  compensate  for  their 

detachment  from  the membrane  surface.  They might  be  further  candidates  for MP196‐

dependent membrane  protein  delocalization.  FtsA  is  attached  to  the membrane with  an 

amphipathic α‐helix similar to that of MinD. Its localization has therefore been discussed to 

similarly depend on the membrane potential [Szeto et al., 2003; Adams and Errington, 2009; 

Strahl and Hamoen, 2010]. SecA  is  located at the  inner membrane surface and  is bound to 

the  SecYEG  intramembrane  complex  [Vrontau  and  Economou,  2004].  However,  the  B. 

subtilis  stress  response  to  MP196  centered  on  compensation  for  energy  limitation  and 

impairment of cell wall biosynthesis, not on inhibition of cell division and protein secretion, 

and  no  cell  elongation  or  disordered  septation  could  be  observed  microscopically. 

Apparently, cell wall biosynthesis inhibition and energy limitation have the strongest impact 

on  B.  subtilis  physiology.  They  are,  therefore,  probably  the main  factors  contributing  to 

bacterial death.  

As proteins  located  at both  the outer  and  inner membrane  surfaces  are delocalized,  it  is 

probable  that MP196  accumulates  in  both  interfacial  zones,  facing  the  cytosol  and  the 

K Discussion

297

  

extracellular  space.  This was  supported  by metal  tracing  of  the  ruthenocene‐conjugated 

derivative  MP276,  which  accumulated  in  the  membrane  but  also  penetrated  into  the 

cytosol. 

The multidisciplinary  in vivo mechanism  study on MP196 allows  so  far unique  insight  into 

antimicrobial peptide action in the whole biological system and supplements in vitro studies 

on peptide‐membrane interaction [Joshi et al., 2010; Andrushchenko et al., 2008; Appelt et 

al.,  2005].  Several  peptides  have  been  developed  that  do  not  follow  the mode  of  action 

models described  so  far  [Scheinpflug and Dathe, personal  communication1], which usually 

propose  formation  of  pores  or  ulterior membrane  disruption  [Teixeira  et  al.,  2012].  The 

MP196 mechanism of action model might be useful for exploring the mechanism of action of 

further  antimicrobial  peptides,  especially  of  those,  whose  antibacterial  activity  is  not 

primarily based on increasing membrane permeability.  

3  Bacterial stress adaptation to short cationic antimicrobial peptides 

The proteome response pattern to MP196 did not only reflect  its mechanism of action but 

also allowed deeper insight into strategies of B. subtilis to adapt to peptide stress. Basically, 

B. subtilis pursues three strategies to encounter membrane stress by MP196: stabilization of 

the  membrane  structure,  restriction  of  membrane  access  for  cationic  compounds,  and 

metabolic compensation for the physiological consequences of peptide  integration  into the 

membrane (Figure 14). 

B.  subtilis  compensates  for  inhibition  of  cell  wall  biosynthesis  and  respiration  by 

upregulation  of  proteins  involved  in  peptidoglycan  synthesis  and  energy metabolism,  e.g. 

MurG or H+‐ATPase subunits (AhpC). Energy  limitation  in turn  leads to activation of the σB‐

dependent general stress  response and of sporulation,  two alternative strategies  to evade 

resource‐limiting conditions [Hecker and Völker, 2001]. 

In order  to  restrict peptide access  to  the cytoplasmic membrane, B.  subtilis adapts  its cell 

envelope structure. Enhanced D‐alanylation of  lipoteichoic acids,  indicated by upregulation 

of  the  dlt  operon  and  the  amino  acid  racemase  RacX,  is  a  known  strategy  of  protecting 

against antimicrobial peptides. Such cell wall modifications are e.g.  involved  in vancomycin 

and daptomycin resistance [Weidenmaier and Peschel, 2008; Bertsche et al., 2011; Rose et 

al.,  2012].  Several  upregulated  proteins  point  to  adaptation  of  the  phospholipid 

composition.  FloT  and  YuaI  e.g.  are  known  to  be  involved  in  reducing membrane  fluidity                                                             1 Chemical Biology, Leipniz‐Institut für Molekulare Pharmakologie, Robert‐Roessle‐Str. 10, 13125 Berlin 

K Discussion

298

  

[Kingston  et  al.,  2011;  López  and  Kolter,  2012;].  Lipidomics  of  cells  treated  with  the 

ferrocene‐substituted  peptide  MP66  revealed  an  exchange  of  negatively  charged 

phospholipid head  groups against neutral  lipids. Apparently,  cells  attempt  a more neutral 

surface charge  in order to prevent attachment of MP196 to the bilayer. Further,  fatty acid 

adaptation  towards a more  rigid membrane structure was observed, complicating peptide 

integration while at the same time stabilizing the membrane structure [Fränzel et al., 2010].  

 

 

Figure 14: Stress response of B. subtilis to MP196: Three strategies, membrane stabilization, 

restriction  of  compound  access,  and  metabolic  compensation,  are  pursued  by  MP196‐

treated  cells. Representative  stress proteins  are displayed. Cell wall‐related processes  are 

depicted in blue, membrane‐related processes in yellow.  

 

Stabilization of the membrane  is further achieved by the membrane‐binding proteins PspA 

and LiaH, which are known to stabilize the bilayer under stress conditions [Kobayashi et al., 

2007;  Wolf  et  al.,  2010].  Moreover,  the  proteome  response  showed  upregulation  of  a 

number of proteins involved in amino acid metabolism. Analysis of the free amino acids after 

peptide treatment revealed highly elevated biosynthesis and release of the osmoprotective 

amino  acids  aspartate, proline,  lysine,  and,  especially,  glutamate. Amino  acid  release  is  a 

novel  adaptation  strategy.  Exogenously  supplied  glutamate  was  shown  to  be  effectively 

protective against treatment with MP196. Probably, the local increase of compatible solutes 

at  the  outer membrane  surface  stabilizes  bilayer  structure,  a  strategy  similarly  pursued 

under hypoosmotic stress conditions. Membrane stabilization by glutamate is most probably 

K Discussion

299

  

an osmoprotective effect as high salt concentrations similarly protect against peptide stress. 

It was  further  shown  that glutamate  release  is a  common  reaction  to  several membrane‐

integrating compounds such as gramicidin S and nisin. It did not occur after treatment with 

the  potassium  ionophore  valinomycin.  Such  carrier  ionophores  diffuse  through  the  lipid 

bilayer and do not disturb membrane architecture. The different reaction to valinomycin and 

the other  investigated compounds point  to glutamate  release being a specific  response  to 

membrane‐integrating compounds that interfere with the membrane structure.  

It was  further  shown  that  the  observed  amino  acid  release  is  partly mediated  by  the  B. 

subtilis mechanosensitive  channels MscL,  YkuT,  YhyY,  and  YfkC.  Those  are  activated upon 

changes  in osmolarity, which are  sensed by pressure on  the  lipid bilayer  [Sukharev, 2002, 

Hoffmann  et al., 2012].  Such pressure might be  applied  to  the mechanosensitive  channel 

proteins by the structural changes induced by peptide integration. It is likely that activation 

of  amino  acid‐transporting  mechanosensitive  channels  is  a  direct  effect  of  peptide‐

membrane  interaction. This  is  supported by  the  recent  finding  that antimicrobial peptides 

trigger  signal  cascades  in  plants  by  similar membrane‐curvature‐dependent  activation  of 

mechanosensors [Henry et al., 2011, Desoignies et al., 2012].  

Lee et al. were able to show that the glutamate dehydrogenase RocG plays a crucial role in 

resistance of B.  subtilis against cell wall antibiotics. This was  supposed  to be due  to a yet 

unknown  regulatory  influence of RocG on  induction of  σW.  σW  regulates  the expression of 

the  yuaFGI  operon, which  is  involved  in  the  control  of membrane  fluidity  in  response  to 

membrane stress [Lee et al., 2012]. Keeping  in mind the osmoprotective role of glutamate, 

its secretion by mechanosensitive channels, and the role of antimicrobial peptides  in plant 

signaling, the supposed RocG‐related regulatory mechanism on σW could also involve direct 

mechanosensing of disturbed bacterial membrane architecture.  

All  these  recent  findings  on  the  interaction  of  antimicrobial  peptides  with  living  cells 

demonstrate that the cellular response to membrane stress,  its regulation, and the role of 

antimicrobial peptides, not only as antibiotics but also as natural signaling molecules, are far 

more complex than presumed so far. 

Strong  upregulation  of  amino  acid  metabolism  was  predominantly  detected  in  the 

membrane and not  in  the  cytosolic proteome  response, although amino acid biosynthesis 

takes place  in the cytosol. The same was observed  for proteins  involved  in translation and 

fatty acid biosynthesis.  It  is  tempting  to  speculate  that processes,  such as biosynthesis of 

K Discussion

300

  

osmoprotective  amino  acids,  generation  of  fatty  acids  for  adjusting  phospholipid 

composition, and biosynthesis of membrane stress proteins like PspA and LiaH, proceed near 

to the membrane, where their products are needed. 

4  MP196 derivatives: novel implications for antibacterial drug discovery 

Representing the minimal pharmacophore of RW‐rich peptides, MP196 has been employed 

as a lead structure for several derivatization approaches [Chantson et al., 2005; Chantson et 

al., 2006]. An either N‐ or C‐terminally added lysine residue has been exploited to introduce 

lipid  chains  of  different  length  to  the  peptide  structure  [Albada  et  al.,  2012a].  The most 

active peptides C‐C8 and N‐C8 as well as  their corresponding non‐lipidated derivatives C‐C0 

and N‐C0  have  been mechanistically  investigated.  Their mode  of  action was  validated  by 

comparative  proteomics.  No  major  mechanistic  differences  to  MP196  were  revealed 

suggesting  a  similar  interfacial activity‐based mechanism of action. All  four heptapeptides 

elicited  a  more  membrane‐focused  stress  response,  while  MP196‐treated  cells  rather 

compensated  for  energy  limitation.  This  could  be  a  hint  for  more  efficient  membrane 

integration of the derivatives compared to MP196. Ruthenocene‐ and ferrocene‐substituted 

peptides similarly retained the MP196 mechanism of action. The cyclic ferrocene derivative 

MP159 did neither differ  in activity nor  in  its mechanism of action. Either,  the  cyclization 

does  not  affect membrane  interaction  or  the  disulfide  bridge  is  unstable  under  bacterial 

culture conditions resulting in linearization of the peptide.  

Conjugation of MP196 with metallocene moieties resulted in a higher disruptive potential on 

both  model  membranes  and  B.  subtilis  in  vivo.  In  fact,  the  low  membrane‐disruptive 

potential of MP196  is an  important difference  to other antimicrobial peptides and  to  the 

prevailing models  of  peptide‐membrane  interaction.  The MP196  sequence  seems  to  be 

sufficient for membrane integration but not for permeation. This might be a matter of length 

or of its probably perfect amphipathic sequence. The latter is supported by the membrane‐

disruptive potential of the metallocene peptides, which interact with different model lipids, 

another  prediction  of  the  interfacial  activity  model  [Wimley,  2011].  Their  alternating 

sequence is disrupted by the metal complex and they possess higher hydrophobicity. An RW‐

rich cyclic peptide with an ideal amphiphilic amino acid distribution has also been shown not 

to enhance membrane permeability  [Scheinpflug, personal  communication2]. Consistently, 

                                                            2 Chemical Biology, Leipniz‐Institut für Molekulare Pharmakologie, Robert‐Roessle‐Str. 10, 13125 Berlin 

K Discussion

301

  

differences  between  the  lipidated  derivatives were  observed  depending  on  disruption  or 

conservation of the alternating pattern of positively charged and hydrophobic residues. This 

further  supports  that  the  grade  of  amhipathicity  determines membrane  interaction.  It  is 

possible  that  changing  the MP196  sequence  towards  higher  hydrophobicity  or  imperfect 

amphipathicity results  in more efficient  formation of a permeation pathway.  It would now 

be  interesting to evaluate, whether the  lipid and/or  lysine‐conjugated heptapeptides might 

also facilitate ion leakage. It is further interesting, if a longer alternating RW sequence would 

be sufficient for translocating ions or if the limited ability of MP196 to promote ion transport 

solely depends on its perfectly alternating sequence. 

Apart  from unprecedented  insight  into  the  relationship between  structure and membrane 

interaction,  the MP196 derivatization  series provide novel  implications  for drug discovery. 

MP196 displayed potent activity against Gram‐positive and moderate activity against Gram‐

negative bacteria. At the same time, it was neither significantly cytotoxic nor hemolytic. The 

ferrocene‐conjugated  MP66  displayed  slightly  lower  activity  against  Gram‐positives  but 

reduced  activity  against  Gram‐negatives  [Chantson  et  al.,  2006].  The  ruthenocene‐

substituted  MP276  was  comparably  active  but  also  slightly  more  cytotoxic  and  more 

hemolytic than MP196. All‐L and all‐D peptides did not differ considerably in their activity or 

mechanism suggesting a minor role of stereochemistry.  

While metallocene  substitution  did  not  significantly  enhance  the  antibiotic  properties,  it 

might  be  employed  as  potent  tool  in  drug  development.  Formation  of  ROS  by  ferrocene 

might prove useful in terms of bacterial resistance as compounds with multiple mechanisms 

are  less  prone  to  fast  resistance  development  [Brötz‐Oesterhelt  and  Brunner,  2008]. 

Ruthenocene has been employed for quantitative ruthenium tracing, which allowed studying 

peptide  localization  in  vivo.  Although MP276  differed mechanistically  from MP196  in  its 

ability to  induce  ion  leakage,  it still most probably acts by the same  interfacial mechanism. 

Thus,  ruthenocene  derivatization  might  be  employed  as  localization  tool  in  antibiotic 

research. So far, mainly fluorescence labels but also antibody detection have been employed 

to  follow  compound distribution.  The mostly  very  large  fluorescence  labels  are often not 

well  applicable  to  small  compounds  like MP196  as  they  are  prone  to  influence  antibiotic 

target  interaction. Development of  fluorescent amino acids has  recently been  reported as 

promising  alternative  for protein  and peptide  labeling  [Katritzky  and Narindoshvili, 2009]. 

Antibodies, which  can  also be  immunogold  labeled  allowing detection by TEM, might not 

K Discussion

302

  

detect molecules as small as MP196 [Scheinpflug, personal communication3]. Metal tracers 

like  ruthenocene  indeed  can  be  individually  incorporated  into  the  compound  structure. 

Ruthenocene  might  e.g.  replace  bulky  amino  acid  side  chains  like  tryptophan  or 

phenylalanine  without  much  effect  on  the  molecule’s  properties.  Another  important 

advantage of metal‐based detection  compared  to alternative methods  is  the possibility of 

absolute  compound  quantitation  by  spectroscopy‐based  metal  analysis.  Further,  its 

detectability  by  electron  microscopy  additionally  facilitates  a  graphic  visualization  of 

compound localization. 

The lipidated MP derivatization series yielded peptides with significantly higher antibacterial 

activity against both Gram‐positive and Gram‐negative bacteria. However,  the most active 

derivatives were considerably hemolytic and highly cytotoxic  [Albada et al., 2012a]. The C8 

and  C10  series  have  been  subjected  to  extensive  structural  optimization  focused  on 

systematic  L  to  D  exchange  of  C‐  and  N‐terminally  lipidated  peptides  [Albada  et  al., 

submitted].  In  course  of  that  study,  peptides  were  developed,  which  fully  retained 

antibacterial  activity,  e.g.  in  the  nanomolar  range  against  MRSA,  while  completely 

eliminating their hemolytic potential. Such derivatives hold great promise to undergo further 

drug development. 

However,  the  lead structure MP196 exhibited high acute  toxicity  in mice  [Vuong, personal 

communication4]. As  shown  for  further  positively  charged  peptides  [Graham  et  al.,  2006; 

Peng et al., 2010], this could be due to histamine release and an anaphylactic shock reaction. 

Histamine  release by activation of CD63‐positive basophils, diagnostic of  the  IgE‐mediated 

allergic reaction  [Amin, 2012], could be excluded  [Höxtermann, personal communication5]. 

The high  immunogenicity of MP196  limits  intravenous application and restricts  its potential 

as a systemic drug. Lowering immunogenicity will be one major aim in optimizing promising 

derivatives. 

5  Organometallic PNA derivatives: a novel antibiotic class 

A structurally completely novel antibiotic class was developed in course of a chemical proof‐

of‐principle  study  [Patra  et  al.,  2010a].  The  resulting  tri‐metallic  compound  FcPNA, 

containing a manganese moiety (cymantrene), a rhenium complex (di‐picolyl)Re(CO)3), and a 

                                                            3 Chemical Biology, Leipniz‐Institut für Molekulare Pharmakologie, Robert‐Roessle‐Str. 10, 13125 Berlin 4 AiCuris GmbH & Co. KG, Friedrich‐Ebert‐Str. 475, 42117 Wuppertal 5 Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, St. Josef‐Hospital, Gudrunstr. 56, 44791 Bochum 

K Discussion

303

  

ferrocene,  exhibited  potent  activity  against Gram‐positive  bacteria  including MRSA,  being 

even more efficient than the clinically applied antibiotics amoxicillin and norfloxacin. Dubar 

et  al.  suggested  that  ferrocene  in  contrast  to  ruthenocene  promotes  formation  of  ROS 

contributing to antimicrobial activity [Dubar et al., 2011; Dubar et al., 2012]. To evaluate, if 

this  is true  in bacteria  in vivo, the derivative RcPNA containing a ruthenocene  instead of a 

ferrocene, was developed. The mechanism of action of FcPNA and RcPNA was  investigated 

by proteomic profiling. The bacterial response to the PNA derivatives is shown in Figure 15.  

 

 

Figure 15: Cellular response to FcPNA and RcPNA. Both derivatives insert into the bacterial 

membrane.  Depolarization  activates  the  membrane  stress  response.  Energy  limitation 

activates  the  general  stress  response  and  sporulation.  Cell  wall  biosynthesis  is  probably 

impaired due  to altered membrane architecture and energy  limitation. FcPNA additionally 

leads to formation of ROS. 

 

Both  compounds  share  a  similar mechanism  of  action.  They  integrate  into  the  bacterial 

membrane bilayer but do not form pores. Both elicit a membrane stress response and cause 

break‐down  of  the  membrane  potential.  Consequently,  cells  suffer  substantial  energy 

limitation.  Consistently,  σB  activation  and  sporulation  initiation  were  observed  in  the 

proteome  pattern,  two  strategies  activated  upon  energy‐limiting  conditions  [Hecker  and 

Völker, 2001]. Although no reproducible markers for inhibition of cell wall biosynthesis were 

upregulated,  cell  wall  integrity  was  corrupted  by  both  FcPNA  and  RcPNA.  The  acetic 

acid/methanol  fixation  that was employed  to  visualize  cell wall damage allows distinction 

between  inhibition  of  the  lipid  II  cycle,  of  transglycosylation,  and  of  cell  wall  digestion 

K Discussion

304

  

[Schneider  et  al.,  2010].  The membrane  excrescences  observed  after  FcPNA  and  RcPNA 

treatment point to inhibition of the lipid II cycle. Membrane‐targeting compounds can impair 

the lipid II cycle by changing membrane architecture, a mechanism that might also apply to 

FcPNA  and  RcPNA.  However,  so  far  such  membrane‐associated  inhibition  of  cell  wall 

biosynthesis has  always been  accompanied by upregulation of  the  cell wall  stress marker 

LiaH.  The missing  upregulation  of  LiaH  by  FcPNA  and  RcPNA  could  point  to  a modified 

mechanism, which is based less on protein detachment due to interference with membrane 

architecture  and  instead  more  on  interference  with  the  respiratory  chain  and  energy 

limitation. 

However,  depolarization  and  energy  limitation without membrane  disruption  does  point 

towards inhibition of the respiratory chain by altered membrane architecture. This could be 

similarly achieved as described  for MP196: by delocalization of cytochrome c. The data on 

hand do not provide  conclusive  evidence of  the nature of  the membrane  interaction but 

suggest that the main antibacterial effects are based on impairment of the respiratory chain 

rather than cell wall biosynthesis. The molecular basis underlying this effect is worth further 

investigation  and  might  provide  essential  insights  into  how  membrane  interaction 

determines physiological effects. 

An  important  mechanistic  difference  between  the  ferrocene  and  the  ruthenocene 

derivatives  is  constituted by  their  ability  to  induce oxidative  stress.  In  contrast  to RcPNA, 

FcPNA  causes  formation of ROS  in  vivo. These  results  concur with  those obtained  for  the 

ruthenocene  and  ferrocene‐substituted  MP196  derivatives  MP276  and  MP66.  However, 

FcPNA was much more  active  than  RcPNA, while  no  such  difference was  seen with  the 

MP196  derivatives.  By  a mechanism  not  understood  so  far,  ferrocene  bound  to  the  PNA 

backbone structure seems to contribute to bacterial killing, while it does not in the peptide 

conjugates.  This  could  be  due  to  a  difference  in membrane  interaction.  It  is  tempting  to 

speculate  that  the bulky PNA derivative positions  the  redox‐active  ferrocene moiety near 

components  of  the  respiratory  chain, where  it may  capture  and mislead  electrons more 

efficiently.  This  would  also  fit  to  the  idea  that  the  PNA  derivatives  primarily  target  the 

respiratory chain, probably accompanied by interference with membrane architecture. 

Both the structure and the mechanism of action of FcPNA are not exploited in antibacterial 

drug  discovery  so  far.  In  terms  of  resistance  development,  the  bacterial membrane  is  a 

favorable  target  structure as  resistances are  less  common  [Peschel and Sahl, 2006; Brötz‐

K Discussion

305

  

Oesterhelt and Brunner, 2008]. Especially  the highly active FcPNA  is a promising antibiotic 

candidate belonging to a completely novel class of antimicrobial agents.  

While  it  is active against all tested Gram‐positive bacteria,  its cytotoxicity strongly depends 

on  the  cell  lines  and  the  growth  conditions.  A  trend  towards  increased  cytotoxicity 

depending on the growth rate of the mammalian cells became apparent. While fast‐growing 

tumor cell lines were efficiently killed, cells that were already growing into confluence for a 

few days were  less  affected.  The  tested  cells  that were differentiated  and  fully  confluent 

were  not  affected  at  all.  This  behavior  could  be  due  to  higher metabolic  activity  of  fast‐

growing cells. Moreover,  it has been shown for some tumor cell  lines that they differ from 

normal cells in their membrane composition [Liu et al., 2010; Hilvo et al., 2011, Harris et al., 

2012].  It  is  possible  that  the  cell  selectivity  of  FcPNA  depends  on more  or  less  efficient 

membrane interaction as similarly supposed for MP196. Based on the data available to date, 

the molecular basis underlying  the  cell  line  selectivity of FcPNA  could not be determined. 

The  limited number of tested cell  lines does  further not allow a definite conclusion on the 

cytotoxicity for cancerous and differentiated cell  lines. A detailed analysis of the underlying 

mechanisms  of  toxicity  and  selectivity  could  provide  novel  insight  into  both  toxicity  of 

antibiotics and anti‐tumor drugs and could advance targeted drug design. 

One  substantial  limitation  of  both  FcPNA  and  RcPNA  is  their  low  solubility  in  aqueous 

solution, which might be due to the organometallic complexes rendering the molecule highly 

hydrophobic.  In  a  systematic  SAR  study,  the  essential  organometallic  residue  for 

antibacterial activity was found to be the rhenium moiety, a metal complex not exploited in 

antibacterial  development  so  far.  Interestingly,  (di‐picolyl)Re(CO)3  alone  does  not  inhibit 

growth  of  bacteria,  suggesting  that  its  combination with  the  PNA  backbone  structure  is 

essential  for antibacterial activity. Three derivatives,  the PNA backbone with  the  rhenium 

moiety  alone  or  in  combination with  either  cymantrene  or  ferrocene, were  as  active  as 

FcPNA  and  essentially  retained  its  mechanism  of  action.  The  Re‐only  derivative  8c’ 

additionally displayed  the  lowest cytotoxicity and  the highest solubility  in culture medium, 

thus  advancing  to  a  new  lead  structure  for  further  compound  optimization.  Structural 

optimization should focus on  lowering cytotoxicity, which still  is difficult to predict, and on 

further improvement of solubility in order to yield drug candidates for systemic application. 

However,  even  a moderately  soluble,  hydrophobic  compound  like  8c’ might  already  find 

topical  application,  e.g.  as ointment  for  treatment of  skin  infections.  In  face of  the  rising 

K Discussion

306

  

number of epidermal MRSA  infections,  the clinical  importance of  such  topically applicable 

antibiotic agents should not be underestimated.  

6  Metal complexes in antibiotic drug discovery 

Organometallic  complexes,  i.e.  containing  a metal  directly  bound  to  a  carbon  atom,  are 

unusual  in nature. They  constitute an antibiotic  compound  family bacteria have not been 

extensively challenged with before. Thus, they might open up new avenues for antibacterial 

drug design. Especially ferrocene attracted much interest over the last decades. It has been 

employed  in  the development of both antimalarial  (ferroquine) and anticancer  (ferrocifen) 

drug  candidates  [Dive  and  Biot,  2008;  Hillard  et  al.,  2005].  Ferroquine  was  shown  to 

overcome  plasmodial  resistance  against  its  lead  structure  chloroquine  and  has  recently 

completed  phase  II  clinical  trials  for  the  treatment  of  uncomplicated malaria  [Biot  et  al., 

2012]. The success of ferroquine demonstrates the clinical potential of organometallic drugs. 

It  further  suggests  that  no  toxic  effects  are  inherent  to  ferrocene  itself  encouraging  its 

employment in drug development.  

Despite  this  inspiring  success,  the  potential  of  organometallics  in  antibacterial  drug 

development has been rather underexplored. Approaches that have been undertaken so far 

employed  iron, ruthenium, tungsten, gold, and silver complexes [Patra et al., 2012a].   With 

the PNA derivatives,  the  first antibiotic class  featuring  rhenium was developed. Moreover, 

most organometallic antibacterial compounds are based on an active organic lead structure. 

The  metal  is  mostly  employed  to  enhance  antibacterial  properties  but  is  essentially 

dispensable  [Patra  et  al.,  2012a].  Not  so  the  PNA  derivatives,  where  rhenium  critically 

determines  antibacterial  activity.  Apart  from  the  recently  developed  silver‐containing 

antibiotic  SCC1  [Panzner  et  al.,  2009],  they  constitute  the  first  class  of  organometallic 

antibacterial agents, whose activity  is based on a metal complex, since the development of 

arsphenamin. 

Comparing different metallocene  substitutions,  it becomes  apparent  that different metals 

incorporated  into  the  same  organic  structure  might  distinctly  influence  antibacterial 

properties. While  cobalt  negatively  affected  antibacterial  activity,  iron  and  ruthenium  did 

not  significantly  influence  the  antibacterial  potential  of  metallocene‐substituted  MP196 

derivatives.  However,  the  ferrocene  PNA  derivative  was  much  more  active  than  the 

ruthenocence  PNA,  probably  due  to  oxidative  stress  caused  by  ferrocene.  The  ferrocene‐

K Discussion

307

  

substituted MP66  induced formation of ROS but did not elicit an oxidative stress response. 

Apparently,  the  PNA  structure  advances  efficient  ROS  formation  by  ferrocene while  this 

mechanism plays a minor  role within  the MP  structure. This  interesting  finding  suggests a 

strong  correlation  between  the  action  of  a metal  complex  and  the  organic  structure  it  is 

conjugated with. 

The dependency of ROS  formation on  the presence of  ferrocene provides  insight  into  the 

recent  “oxidative  stress  controversy”.  While  some  groups  proposed  the  occurrence  of 

oxidative  stress  after  treatment  with  bactericidal  antibiotics  [Hassett  and  Imlay,  2007; 

Kohanski  et  al.,  2007]  and  provided  experimental  evidence  for  oxidative  damage  to 

nucleotides  by  β‐lactams  and  quinolones  [Foti  et  al.,  2012],  others  could  not  show  a 

correlation between ROS  formation and bacterial death  [Keren et al., 2013; Liu and  Imlay, 

2013].  The  ferrocene‐  and  ruthenocene‐substituted MP196  derivatives,  all  of  which  are 

bactericidal,  share  a  highly  similar  mechanism  of  action  and  equally  influence  bacterial 

physiology. The  same was observed  for FcPNA and RcPNA. Only  the  ferrocene‐substituted 

compounds  induced  formation  of  ROS  in  bacteria,  probably  due  to  the  ferrocene  redox 

potential,  suggesting  that  oxidative  stress  is  not  a  general  mechanistic  component  of 

bactericidal antibiotics. 

Ferrocene and ruthenocene have been considered “fancy bulky moieties” that do not elicit 

considerable effects on the mechanism of action of peptide antibiotics [Albada, conference 

contribution6]. Here it was shown that both complexes shifted the molecular mechanism of 

MP196 towards a higher membrane‐disruptive potential. Ferrocene was additionally shown 

to  reduce  peptide  selectivity  for  the  phospholipid  composition.  At  the  same  time,  both 

ferrocene‐  and  ruthenocene‐substituted  compounds  retained  the  general  mode  of 

membrane  interaction as well as their physiological  impact on B. subtilis  in vivo. While the 

effect  of  ferrocene  on  the  mode  of  action  of  MP196  derivatives  was  rather  subtle,  it 

considerably  modified  the  action  of  FcPNA  compared  with  RcPNA,  demonstrating  that 

ferrocene  is  not  simply  another  bulky  residue  but might  efficiently  tune  a  compound’s 

antibacterial  properties.  It  constitutes  a  potent  tool, which  confers  the  ability  to  induce 

formation of ROS and might enhance antibacterial activity, depending on  the  structure of 

the  individual molecule.  Thus,  it  could  contribute  to  overcoming  bacterial  resistance  by 

adding another mechanistic component. Ruthenocene had a more subtle  influence on  the 

                                                            6 Albada HB. Metallocenoyl derivatives of antibacterial peptides. 11th ferrocene colloquium, Feb 6th‐8th, 2013. Hannover, Germany 

K Discussion

308

  

mechanism of action. It is therefore very well suited as a subtle labeling tool allowing metal‐

based peptide tracing. Recently, an osmocene‐conjugated MP196 derivative was developed 

[Albada, personal communication7]. As osmium is more electron‐dense than ruthenium, the 

osmocene‐conjugate  could  improve  the  contrast  in  electron  microscopy.  Employing  the 

ruthenium derivative, the membrane and cell wall structures were well “stained”. However, 

the peptide did not accumulate in the cytosol to an extent that could give a significant signal. 

A more electron‐dense metal could improve detection of compounds located in the cytosol 

or at distinct subcellular binding sites.  

Taken  together, organometallic  substitutions open up new  avenues  in drug development, 

both  as  novel  resistance‐breaking  structures  and  as  efficient  research  tools.  Metal 

complexes  are  a  rich  repository  of  bioactive  building  blocks.  Exploring  the  properties  of 

further metallocene  complexes might  yield  new  interesting  properties  and  feature  novel 

applications. 

7  Antimicrobial peptides as therapeutics: possibilities and limitations 

Antimicrobial peptides have been discussed as possible new generation of antibiotic agents 

mostly due to their broad‐spectrum activity and low resistance development [Giuliani et al., 

2007;  Brogden  and  Brogden,  2011].  Clinically  successful  peptides  like  vancomycin  and 

daptomycin  greatly  nourished  these  hopes.  Currently,  several  peptide‐based  antibiotics 

derived from different structural subclasses, e.g. glycopeptides, lipopeptides, and defensins, 

are  in  the  drug  discovery  and  development  pipeline  [Butler  and  Cooper,  2011].  Many 

peptides  are  highly  potent  in  terms  of  bacterial  killing  and  advantageous  in  resistance 

development.  However,  cationic  peptides might  also  display  high  cytotoxic  or  hemolytic 

activity such as gramicidin S [Semrau et al., 2010] or trigger allergic shock reactions [Graham 

et  al.,  2006;  Peng  et  al.,  2010].  This  behavior  is  not  extraordinary  keeping  in mind  that 

cationic peptides are widely distributed  immunomodulators  in vertebrates  [Steinsträßer et 

al. 2011; Choi et al., 2012]. Thus,  it remains doubtful,  if cationic peptides, such as the RW‐

rich MP196, will ever be  suitable  for  systemic application, even after  chemical  compound 

optimization. Rather,  they are suited  for  topical application, whose  importance should not 

be underestimated  in  face of  the  rising number of  complicated  skin  infections  caused by 

MRSA. Surface coating of medical catheters or prostheses but also of food wrappings might 

be  another  possible  application  of  cationic  peptides  [Cooksey,  2005].  Furthermore,  the                                                             7 Bioinorganic Chemistry, Ruhr‐Universität Bochum, Universitätsstr. 150, 44801 Bochum 

K Discussion

309

  

extensive  research  currently  conducted  on  immunomodulation  by  antimicrobial  peptides 

might open up novel therapeutic approaches shifting the focus from killing bacteria towards 

stimulating the patients’ own immune response.  

Anionic peptides  like daptomycin or glycopeptides  like vancomycin do not suffer  from  the 

same limitations as the cationic RW‐rich peptides. They constitute alternative lead structures 

for  development  of  novel  systemic  drugs.  The  semi‐synthetic  vancomycin  derivative 

telavancin  is currently  in clinical use. However, resistance against daptomycin, vancomycin, 

and  televancin has  already been described  [Lütticken  and Kunstmann, 1988;  Smith  et al., 

1999; Bertsche et al., 2011, Rose et al., 2012] and  it  is only a matter of time until bacterial 

resistance  demands  novel  therapeutics.  Peptidomimetics  and  peptide  derivatives  with 

structurally  novel  features  might  constitute  a  next  generation  of  antibacterial  agents. 

Introducing  non‐natural  moieties  to  peptide‐based  core  structures  might  contribute  to 

overcoming  bacterial  resistance  as  well  as  the  application‐limiting  issues  of  the  natural 

compounds. 

   

K Discussion

310

  

L  Summary 

Increasing antibiotic resistance in hand with decreasing antibiotic approvals has founded an 

urgent need for novel antimicrobial agents. Antibiotics acting on the bacterial cell envelope 

have been highly  successful  in  terms of  inhibition of peptidoglycan  crosslinking. However, 

the cell envelope offers further  interesting antibiotic targets such as membrane biogenesis 

and integrity. Specific proteomic signatures for fatty acid biosynthesis inhibition, membrane 

damage, and  inhibition of membrane‐bound cell wall biosynthesis steps formed a basis for 

mode  of  action  diagnosis  of  novel  cell  envelope‐targeting  antibiotics.  The  established 

signatures  were  successfully  employed  in  target  falsification  of  a  potential  fatty  acid 

biosynthesis  inhibitor  and  in  mode  of  action  elucidation  of  antimicrobial  peptides  and 

organometallic  peptidomimetics.  The  hexapeptide  MP196,  a  small  but  yet  typical 

representative  of  short  cationic  antimicrobial  peptides,  was  found  to  integrate  into  the 

bacterial membrane.  Its antibacterial action  is mainly based on delocalization of peripheral 

membrane proteins  like cytochrome c and MurG,  resulting  in  inhibition of  respiration and 

cell wall biosynthesis. Consequently, cells  suffer  substantial energy  limitation and cell wall 

integrity is corrupted. Bacteria adapt to peptide stress by adjusting their membrane and cell 

wall  composition,  upregulation  of  impaired  cellular  processes,  synthesis  of  membrane‐

stabilizing  proteins,  and  release  of  osmoprotective  amino  acids.  Lipidated  derivatives  of 

MP196  have  been  shown  to  essentially  retain  the  same  mechanism  of  action.  So  did 

organometallic‐substituted  variants.  Metallocene  derivatization  slightly  alters  membrane 

interaction  leading  to  enhanced  disruptive  potential.  Ruthenocene  modification  has 

additionally been shown to be a powerful tool for metal‐based peptide tracing while at the 

same time not considerably influencing the peptides’ mechanism.  

The  organometallic  PNA  backbone  derivatives  constitute  a  completely  novel  class  of 

antibiotics.  Displaying  excellent  antibacterial  activity  and  limited  toxicity  for mammalian 

cells, the hetero‐tri‐metallic compound FcPNA targets the cytoplasmic membrane leading to 

depolarization  and  energy  limitation.  The  ferrocene moiety  induced  formation  of  ROS  in 

bacterial  cells, whereas  ruthenocene did not display a metal‐specific mode of action.  In a 

systematic  SAR  study,  the  essential  organometallic  moiety  for  antibacterial  activity  was 

found  to  be  the  rhenium  complex.  A  mono‐metallic  Re‐containing  compound  was 

established as new lead structure displaying good antibacterial activity and increased water 

solubility compared the tri‐metallic compound.   

L Summary

311

  

M  Zusammenfassung 

Der  Anstieg  bakterieller  Antibiotika‐Resistenzen  zusammen  mit  sinkenden  Neu‐

Zulassungsraten  verantwortet  einen  dringenden  Bedarf  an  neuen  antimikrobiellen 

Substanzen.  Antibiotika,  die  die  bakterielle  Zellhülle  angreifen,  waren  bisher  äußerst 

erfolgreich,  insbesondere  in Hinblick auf die Hemmung der Vernetzung von Peptidoglykan. 

Sie bietet  jedoch noch weitere,  interessante Angriffsorte  für Antibiotika wie die Biogenese 

und  Integrität  der  Zytoplasma‐Membran. Die  Etablierung  spezifischer  Proteom‐Signaturen 

für  Inhibition  der  Fettsäure‐Biosynthese,  Membran‐Schäden  und  Inhibition  Membran‐

gebundener  Zellwand‐Biosynthese‐Schritte  lieferten  die  Basis  für  die  Analyse  des 

Wirkmechanismus  neuer  Zellhüllen‐angreifender  Antibiotika.  Diese  Signaturen  wurden 

erfolgreich  in  der  Angriffsort‐Falsifizierung  eines  potenziellen  Fettsäure‐Biosynthese‐

Inhibitors  und  in  der  Wirkmechanismus‐Analyse  antimikrobieller  Peptide  und 

metallorganischer Peptidomimetika eingesetzt.  

Für  das  Hexapeptid MP196,  einen  kleinen,  aber  typischen  Vertreter  kurzer,  kationischer, 

antimikrobieller  Peptide,  konnte  gezeigt  werden,  dass  es  in  bakterielle  Membranen 

integriert.  Seine  antibakterielle  Wirkung  basiert  hauptsächlich  auf  der  Delokalisation 

peripherer Membranproteine  wie  Cytochrom  c  und MurG,  was  in  einer  Inhibierung  der 

Zellatmung und  Zellwand‐Biosynthese  resultiert.  Infolgedessen  tritt eine  kritische Energie‐

Limitation  ein  und  die  Zellwand‐Integrität  wird  gestört.  Bakterien  passen  sich  an  diesen 

Peptid‐Stress  durch  Anpassung  der  Membran‐  und  Zellwand‐Zusammensetzung, 

Hochregulation betroffener zellulärer Prozesse, Synthese Membran‐stabilisierender Proteine 

und Freisetzung osmoprotektiver Aminosäuren an. 

Acylierte  sowie  metallorganisch‐substituierte  MP196‐Derivate  behielten  diesen 

Wirkmechanismus  grundsätzlich  bei.  Metallocen‐Substituierungen  haben  einen  geringen 

Einfluss  auf  die  Interaktion mit  der Membran,  was  in  einer  erhöhten  Permeabilisierung 

resultiert. Modifikation  der  Peptid‐Struktur mit  Ruthenocen  ist  zudem  eine  interessante 

Möglichkeit, die Lokalisation antimikrobieller Peptide anhand des Metalles nachzuverfolgen 

ohne den Wirkmechanismus durch die Derivatisierung grundlegend zu ändern. 

Mit  den  metallorganischen  PNA‐Derivaten  wurde  eine  völlig  neue  Antibiotika‐Klasse 

beschrieben. Die hetero‐tri‐metallische Verbindung FcPNA besitzt eine hohe antibakterielle 

Aktivität  und  nur  eingeschränkte  Zytotoxizität.  Sie  greift  die  bakterielle Membran  an  und 

führt zu Depolarisation und Energie‐Limitation. Der Ferrocen‐Rest führt zu Bildung reaktiver 

M Zusammenfassung

312

  

Sauerstoff‐Spezies,  während  Ruthenocen  keinen  Metall‐spezifischen  Einfluss  auf  den 

Wirkmechanismus  zu  haben  scheint.  In  einer  systematischen  SAR‐Studie  stellte  sich  der 

Rhenium‐Komplex  als  essentiell  für  die  antibakterielle  Aktivität  heraus.  Ein  mono‐

metallisches Rhenium‐Derivat mit guter Aktivität und verbesserter Wasserlöslichkeit konnte 

als neue Leitstruktur etabliert werden.    

M Zusammenfassung

313

  

N  References 

Adams DW, Errington  J. Bacterial  cell division: Assembly, maintenance and disassembly of 

the Z ring. Nat Rev Microbiol 7, 642‐653 (2009). 

Albada  HB,  Prochnow  P,  Bobersky  S,  Langklotz  S,  Bandow  JE,  Metzler‐Nolte  N.  Short 

antibacterial peptides with significantly reduced hemolytic activity can be identified by an L‐

to‐D exchange scan of their amino acid residues. submitted. 

Albada HB, Prochnow  P, Bobersky  S,  Langklotz  S,  Schriek P, Bandow  JE, Metzler‐Nolte N. 

Tuning the activity of a short Arg‐Trp antimicrobial peptide by lipidation of a C‐ or N‐terminal 

lysine side‐chain. ACS Med Chem Lett 3, 980‐4 (2012a). 

Albada  HB,  Chiriac  AI,  Wenzel  M,  Penkova  M,  Bandow  JE,  Sahl  HG,  Metzler‐Nolte  N. 

Modulating  the activity of short arginine‐tryptophan containing antibacterial peptides with 

N‐terminal metallocenoyl groups. Beilstein J Org Chem 8, 1753‐64 (2012b). 

Amin K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respir Med 106, 9‐14 (2012). 

Amyes SGB. Magic bullets lost horizons: The rise and fall of antibiotics. Taylor & Francis Inc, 

London (2001). 

Andrushchenko VV, Aarabi MH, Nguyen  LT, Prenner EJ, Vogel HJ. Thermodynamics of  the 

interactions of  tryptophan‐rich  cathelicidin  antimicrobial peptides with model  and natural 

membranes. Biochim Biophys Acta 1778, 1004‐14 (2008). 

Appelt  C,  Eisenmenger  F,  Kühne  R,  Schmieder  P,  Söderhäll  JA.  Interaction  of  the 

antimicrobial peptide cyclo(RRWWRF) with membranes by molecular dynamics simulations. 

Biophys J 89, 2296‐306 (2995). 

Bai H, You Y, Yan H, Meng J, Xue X, Hou Z, Zhou Y, Ma X, Sang G, Luo X. Antisense inhibition 

of  gene  expression  and  growth  in  Gram‐negative  bacteria  by  cell‐penetrating  peptide 

conjugates of peptide nucleic acids targeted to rpoD gene. Biomaterials 33, 659‐67 (2012). 

Balemans W, Lounis N, Gilissen R, Guillemont J, Simmen K, Andries K, Koul A. Essentiality of 

the FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature 463, E3; discussion E4 (2010). 

Beall B, Lutkenhaus J. Impaired cell division and sporulation of a Bacillus subtilis strain with 

the ftsA gene deleted. J Bacteriol 174, 2398‐403 (1992). 

Bengtsson J, Rivolta C, Hederstedt L, Karamata D. Bacillus subtilis contains two small c‐type 

cytochromes with homologous heme domains but different  types of membrane anchors.  J 

Biol Chem 274, 26179‐84 (1999). 

Bertsche U, Weidenmaier C, Kuehner D, Yang SJ, Baur S, Wanner S, Francois P, Schrenzel J, 

Yeaman MR,  Bayer  AS.  Correlation  of  daptomycin  resistance  in  a  clinical  Staphylococcus 

N References

314

  

aureus strain with increased cell wall teichoic acid production and D‐alanylation. Antimicrob 

Agents Chemother 55:3922‐8 (2011). 

Bierbaum G,  Sahl HG.  Lantibiotics: mode  of  action,  biosynthesis  and  bioengineering. Curr 

Pharm Biotechnol 10, 2‐18 (2009). 

Bierbaum G, Szekat C,  Josten M, Heidrich C, Kempter C,  Jung G, Sahl HG. Engineering of a 

novel  thioether bridge and  role of modified  residues  in  the  lantibiotic Pep5. Appl Environ 

Microbiol 62, 385‐92 (1996). 

Biot C, Castro W, Botte CY, Navarro M. The therapeutic potential of metal‐based antimalarial 

agents: Implications for the mechanism of action. Dalton Trans 41, 6335‐49 (2012). 

Bishop  DG,  Rutberg  L,  Samuelsson  B.  The  chemical  composition  of  the  cytoplasmic 

membrane of Bacillus subtilis. Eur J Biochem 2, 448‐53 (1967). 

Bonelli RR, Schneider T, Sahl HG, Wiedemann I. Insights  into  in vivo Activities of  lantibiotics 

from gallidermin and epidermin mode‐of‐action studies. Antimicrob Agents Chemother 50, 

1449‐57 (2006). 

Brinster S, Lamberet G, Staels B, Trieu‐Cuot P, Gruss A, Poyart C. Type II fatty acid synthesis is 

not a suitable target for Gram‐positive pathogens. Nature 458, 83‐6 (2009). 

Brogden NK, Brogden KA. Will new generations of modified antimicrobial peptides  improve 

their potential as pharmaceuticals? Int J Antimicrob Agents 38, 217‐25 (2011). 

Brötz‐Oesterhelt  H,  Beyer  D,  Kroll  HP,  Endermann  R,  Ladel  C,  Schroeder  W,  Hinzen  B, 

Raddatz  S,  Paulsen H, Henninger K, Bandow  JE,  Sahl HG,  Labischinski H. Dysregulation  of 

bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 11, 1082‐7 (2005). 

Brötz‐Oesterhelt H, Brunner NA. How many modes of action should an antibiotic have? Curr 

Opin Pharmacol 8, 564‐73 (2008). 

Brötz  H,  Sahl  HG.  New  insights  into  the  mechanism  of  action  of  lantibiotics‐‐diverse 

biological effects by binding to the same molecular target. J Antimicrob Chemother 46, 1‐6 

(2000). 

Brötz H, Bierbaum G,  Leopold K, Reynolds PE,  Sahl HG. The  lantibiotic mersacidin  inhibits 

peptidoglycan  synthesis  by  targeting  lipid  II.  Antimicrob  Agents  Chemother  42,  154‐60 

(1998). 

Brötz  H,  Bierbaum  G, Markus  A, Molitor  E,  Sahl  HG. Mode  of  action  of  the  lantibiotic 

mersacidin:  inhibition  of  peptidoglycan  biosynthesis  via  a  novel mechanism?  Antimicrob 

Agents Chemother 714‐9 (1995). 

N References

315

  

Budde I, Steil L, Scharf C, Völker U, Bremer E. Adaptation of Bacillus subtilis to growth at low 

temperature: a combined transcriptomic and proteomic appraisal. Microbiology 152, 831‐53 

(2006). 

Burchall JJ. Mechanism of action of trimethoprim‐sulfamethoxazole. II. J Infect Dis 128, 437‐

41 (1973). 

Butler MS, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline in 2011. J Antibiot (Tokyo) 64, 413‐

25 (2011). 

Caboche S, Pupin M, Leclère V, Fontaine A, Jacques P, Kucherov G. NORINE: a database of 

nonribosomal peptides. Nucleic Acids Res 36, D326‐31 (2008). 

Cao M, Helmann JD. The Bacillus subtilis ectracytoplasmic‐function sigmaX  factor regulates 

modification  of  the  cell  envelope  and  resistance  to  cationic  antimicrobial  peptides.  J 

Bacteriol 186, 1136‐46 (2004). 

Cao M, Kobel PA, Morshedi MM, Wu MFW, Paddon C, Helmann  JD. Defining  the Bacillus 

subtilis  σW  regulon:  a  comparative  analysis  of  promoter  consensus  search,  run‐off 

transcription/microarray analysis (ROMA), and transcriptional profiling approaches 1. J Mol 

Biol 316, 443‐57 (2002). 

Casadio S. General characteristics and solvent activity of triton X 100. Boll Chim Farm 91, 3‐7 

(1952). 

Chan  DI,  Prenner  EJ,  Vogel  HJ.  Tryptophan‐  and  arginine‐rich  antimicrobial  peptides: 

structures and mechanisms of action. Biochim Biophys Acta 1758, 1184‐202 (2006). 

Chantson  JT,  Verga  Falzacappa  MV,  Crovella  S,  Metzler‐Nolte  N.  Solid‐phase  synthesis, 

characterization,  and  antibacterial  activities  of  metallocene‐peptide  bioconjugates. 

ChemMedChem 1, 1268‐74 (2006). 

Chantson  JT, Verga  Falzacappa MV, Crovella  S, Metzler‐Nolte N. Antibacterial  activities of 

ferrocenoyl‐  and  cobaltocenium‐peptide  bioconjugates.  J  Organomet  Chem  690,  4564‐74 

(2005). 

Chatterjee  C,  Paul  M,  Xie  L,  van  der  Donk  WA.  Biosynthesis  and  mode  of  action  of 

lantibiotics. Chem Rev 105, 633‐84 (2005). 

Chatterjee  S,  Chatterjee  S,  Lad  SJ,  Phansalkar MS,  Rupp  RH,  Ganguli  BN,  Fehlhaber  HW, 

Kogler H. Mersacidin,  a  new  antibiotic  from  Bacillus.  Fermentation,  isolation,  purification 

and chemical characterization. J Antibiot (Tokyo) 45, 832‐8 (1992). 

Cheng JT, Hale JD, Elliott M, Hancock RE, Straus SK. The  importance of bacterial membrane 

composition  in  the  structure  and  function  of  aurein  2.2  and  selected  variants.  Biochim 

Biophys Acta 1808, 622‐33 (2011). 

N References

316

  

Cheng JT, Hale JD, Kindrachuk J, Jenssen H, Elliott M, Hancock RE, Straus SK. Importance of 

residue  13  and  the C‐terminus  for  the  structure  and  activity  of  the  antimicrobial  peptide 

aurein 2.2. Biophys J 99, 2926‐35 (2010). 

Chiriac AI, Wenzel M, Zweytick D, Schumacher C, Albada HB, Krämer  J, Penkova M, Brötz‐

Oesterhelt  H,  Metzler‐Nolte  N,  Brötz‐Oesterhelt  H,  Sahl  HG,  Bandow  JE.  Influence  of 

ferrocene  and  ruthenocene  modification  on  the  mechanism  of  action  of  a  small 

antimicrobial peptide. in preparation. 

Choi  KY,  Chow  LN, Mookherjee  N.  Cationic  host  defence  peptides: multifaceted  role  in 

immune modulation and inflammation. J Innate Immun 4, 361‐70 (2012). 

Christ  K,  Al‐Kaddah  S,  Wiedemann  I,  Rattay  B,  Sahl  HG,  Bendas  G.  Membrane  lipids 

determine the antibiotic activity of the lantibiotic gallidermin. J Membr Biol 226, 9‐16 (2008). 

Chung HS, Yao Z, Goehring NW, Kishony R, Beckwith J, Kahne D. Rapid beta‐lactam‐induced 

lysis requires successful assembly of the cell division machinery. Proc Natl Acad Sci USA 106, 

21872‐7 (2009). 

Clejan S, Krulwich TA, Mondrus KR, Seto‐Young D. Membrane lipid composition of obligately 

and facultatively alkalophilic strains of Bacillus spp. J Bacteriol 168, 334‐40 (1986). 

Cooksey K. Effectiveness of antimicrobial food packaging materials. Food Addit Contam 22, 

980‐7 (2005). 

Cooper  RG,  Wald  M.  Successful  treatment  of  Proteus  septicaemia  with  a  new  drug 

trimethoprim. Med J Aust 2, 93‐6 (1964). 

Costa  F,  Carvalho  IF, Montelaro  RC,  Gomes  P, Martins MCL.  Covalent  immobilization  of 

antimicrobial peptides (APMs) onto biomaterial surfaces. Acta Biomater 7, 1431‐40 (2011). 

Day RV. Sulfanilamide in the treatment of gonorrhea. Cal West Med 47, 79‐80 (1937). 

den  Kamp  JA,  Redai  I,  van  Deenen  LL.  Phospholipid  composition  of  Bacillus  subtilis.  J 

Bacteriol 99, 298‐303 (1969). 

Desoignies N, Schramme F, Ongena M, Legrève A. Systemic  resistance  induced by Bacillus 

lipopeptides  in Beta vulgaris  reduces  infection by  the  rhizomania disease vector Polymyxa 

betae. Mol Plant Pathol doi: 10.1111/mpp.12008 (2012). 

Dive  D,  Biot  C.  Ferrocene  conjugates  of  chloroquine  and  other  antimalarials:  the 

development of ferroquine, a new antimalarial. ChemMedChem 3, 383‐91 (2008). 

Dougherty DA. Cation‐pi interactions in chemistry and biology: a new view on benzene Phe, 

Tyr, and Trp. Science 271, 163‐168 (1996). 

N References

317

  

Dubar  F,  Bohic  S,  Dive  D,  Guérardel  Y,  Cloetens  P,  Khalife  J,  Biot  C.  Deciphering  the 

resistance‐counteracting  functions  of  ferroquine  in  Plasmodium  falciparum‐infected 

erythrocytes. ACS Med Chem Lett 3:480‐3 (2012). 

Dubar F, Egan TJ, Pradines B, Kuter D, Ncokazi KK, Forge D, Paul  JF, Pierrot C, Kalamou H, 

Khalife  J,  Buisine  E,  Rogier  C,  Vezin  H,  Forfar  I,  Slomianny  C,  Trivelli  X,  Kapishnikov  S, 

Leiserowitz  L,  Dive  D,  Biot  C.  The  antimalarial  ferroquine:  role  of  the  metal  and 

intramolecular hydrogen bond in activity and resistance. ACS Chem Biol 6, 275‐87 (2011). 

Duax WL,  Griffin  JF,  Langs  DA,  Smith  GD,  Grochulski  P,  Pletnev  V,  Ivanov  V. Molecular 

structure  and  mechanisms  of  action  of  cyclic  and  linear  ion  transport  antibiotics. 

Biopolymers, 40, 141‐55 (1996). 

Eiamphungporn W, Helmann JD. The Bacillus subtilis σM regulon and  its contribution to cell 

envelope stress responses. Mol Microbiol 67, 830‐48 (2008). 

Eliopoulos GM, Willey S, Reiszner E, Spitzer PG, Caputo G, Moellering RC Jr.  In vitro and  in 

vivo activity of LY 146032, a new cyclic lipopeptide antibiotic. Antimicrob Agents Chemother 

30, 532‐5 (1986). 

Fisher JF, Meroueh SO, Mobashery S. Bacterial resistance to β‐lactam antibiotics: compelling 

opportunism, compelling opportunity. Chem Rev 105, 395‐424 (2005). 

Foti  JJ, Devadoss B, Winkler  JA, Collins  JJ, Walker GC. Oxidation of  the guanine nucleotide 

pool underlies cell death by bactericidal antibiotics. Science 336, 315‐9 (2012). 

Fränzel B, Frese C, Penkova M, Metzler‐Nolte N, Bandow  JE, Wolters DA. Corynebacterium 

glutamicum exhibits a membrane‐related  stress  response  to a  small  ferrocene‐conjugated 

antimicrobial peptide. J Biol Iorg Chem. 15, 1293‐303 (2010). 

Fredenhagen  A,  Tamura  SY,  Kenny  PTM,  Komura  H,  Naya  Y,  Nakanishi  K,  Nishiyama  K, 

Sugiura M, Kita H.  1987. Andrimid,  a  new  peptide  antibiotic  produced  by  an  intracellular 

bacterial symbiont isolated from a brown planthopper. J Am Chem Soc 109, 4409‐11 (1987). 

Freiberg  C,  Fischer  HP,  Brunner  NA.  Discovering  the  mechanism  of  action  of  novel 

antibacterial  agents  through  transcriptional  profiling  of  conditional  mutants.  Antimicrob 

Agents Chemother 49, 749‐759 (2005). 

Freiberg C, Schiffer G, Brunner N, Lampe T, Pohlmann J, Brands M, Haebich D, Ziegelbauer K. 

Identification  and  characterization  of  the  first  class  of  potent  bacterial  acetyl‐CoA 

carboxylase inhibitors with antibacterial activity. J Biol Chem 279, 26066‐73 (2004). 

Fritig  B,  Heitz  T,  Legrand M.  Antimicrobial  proteins  in  induced  plant  defense.  Curr  Opin 

Immunol 10, 16‐22 (1998). 

Fuertes G, Giménez D, Esteban‐Martín S, Sánchez‐Muñoz OL, Salgado J. A lipocentric view of 

peptide‐induced pores. Eur Biophys J 40, 399‐415 (2011). 

N References

318

  

Ganz T. The  role of antimicrobial peptides  in  innate  immunity.  Integr Comp Biol 43, 300‐4 

(2003). 

García Montes de Oca LY, Chagolla‐López A, González de la Vara L, Cabellos‐Avelar T, Gómez‐

Lojero  C, Gutiérrez  Cirlos  EB.  The  composition  of  the  Bacillus  subtilis  aerobic  respiratory 

chain supercomplexes. J Bioenerg Biomembr 44, 473‐86 (2012). 

Gause GF, Brazhnikova MG. Gramicidin S and  its use  in the treatment of  infected wounds. 

Nature 154, 703 (1944). 

Giuliani A, Pirri G, Nicoletto SF. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of 

therapeutics. Cent Eur J Biol 2, 1‐33 (2007). 

Graham  C,  Richter  SC, McClean  S,  O'Kane  E,  Flatt  PR,  Shaw  C.  Histamine‐releasing  and 

antimicrobial  peptides  from  the  skin  secretions  of  the  dusky  gopher  frog,  Rana  sevosa. 

Peptides 27, 1313‐9 (2006). 

Hahne H, Mäder U, Otto A, Bonn F, Steil L, Bremer E, Hecker M, Becher D. A comprehensive 

proteomics and transcriptomics analysis of Bacillus subtilis salt stress adaptation. J Bacteriol 

192, 870‐82 (2010).  

Harris  F,  Dennison  SR,  Singh  J,  Phoenix  DA.  On  the  selectivity  and  efficacy  of  defense 

peptides with respect to cancer cells. Med Res Rev 33, 190‐234 (2013). 

Hasper HE, de Kruiff B, Breukink E. Assembly and stability of nisin‐lipid II pores. Biochemistry 

43, 11567‐75 (2004). 

Hassett DJ,  Imlay  JA.  Bactericidal  antibiotics  and  oxidative  stress:  a  radical  proposal.  ACS 

Chem Biol 2, 708‐10. 

Hatamoto M, Ohashi A,  Imachi H. Peptide nucleic acids (PNAs) antisense effect to bacterial 

growth  and  their  application  potentiality  in  biotechnology.  Appl Microbiol  Biotechnol  86, 

397‐402 (2010). 

Haug  BE,  Stensen  W,  Kalaaji  M,  Rekdal  O,  Svendsen  JS.  Synthetic  antimicrobial 

peptidomimetics with therapeutic potential. J Med Chem 51, 4306‐14 (2008). 

Haynes  DH,  Wiens  T,  Pressman  BC.  Turnover  numbers  for  ionophore‐catalyzed  cation 

transport across the mitochondrial membrane. J Membr Biol 18, 23‐38 (1974). 

Heath  RJ,  Rubin  JR,  Holland  DR,  Zhang  E,  Snow  ME,  Rock  CO.  Mechanism  of  triclosan 

inhibition of bacterial fatty acid synthesis. J Biol Chem 274, 11110‐4 (1999). 

Hecker M,  Völker  U.  General  stress  response  in  Bacillus  subtilis  and  other  bacteria.  Adv 

Microb Physiol 44, 35‐91 (2001). 

Helmann JD. The extracytoplasmic function (ECF) sigma factors. Adv Microb Physiol 46, 47‐

110 (2002). 

N References

319

  

Henry  G,  Deleu M,  Jourdan  E,  Thonart  P, Ongena M.  The  bacterial  lipopeptide  surfactin 

targets the  lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger  immune‐related defence 

responses. Cell Microbiol 13, 1824‐37 (2011). 

Hillard E, Vessières A, Thouin L, Jaouen G, Amatore C. Ferrocene‐mediated proton‐coupled 

electron transfer  in a series of ferrocifen‐type breast‐cancer drug candidates. Angew Chem 

Int Ed Engl 45, 285‐90 (2005). 

Hilvo M, Denkert  C,  Lehtinen  L, Müller  B,  Brockmöller  S,  Seppänen‐Laakso  T,  Budczies  J, 

Bucher E, Yetukuri  L, Castillo S, Berg E, Nygren H, Sysi‐Aho M, Griffin  JL, Fiehn O,  Loibl S, 

Richter‐Ehrenstein  C,  Radke  C,  Hyötyläinen  T,  Kallioniemi  O,  Iljin  K,  Oresic  M.  Novel 

theranostic opportunities offered by characterization of altered membrane lipid metabolism 

in breast cancer progression. Cancer Res 71, 3236‐45 (2011). 

Hoffmann T, von Blohn C, Stanek A, Moses S, Barzantny H, Bremer E. Synthesis, release, and 

recapture  of  compatible  solute  proline  by  osmotically  stressed  Bacillus  subtilis  cells. Appl 

Environ Microbiol 78, 5753‐62 (2012). 

Hoffmann  T,  Boiangu  C, Moses  C,  Bremer  S.  Responses  of  Bacillus  subtilis  to  hypotonic 

challenges:  physiological  contributions  of mechanosensitive  channels  to  cellular  survival. 

Appl Environ Microbiol 74, 2454‐60 (2008). 

Hotchkiss  RD,  Dubos  RJ.  Fractionation  of  the  bactericidal  agent  from  cultures  of  a  soil 

bacillus. J Biol Chem 132, 791‐2 (1940a). 

Hotchkiss  RD,  Dubos  RJ.  Chemical  properties  of  bactericidal  substances  isolated  from 

cultures of a soil bacillus. J Biol Chem 132, 793‐4 (1940b). 

Hu  Y,  Chen  L,  Ha  S,  Gross  B,  Falcone  B, Walker  D, Mokhtarzadeh M, Walker  S.  Crystal 

structure  of  the  MurG:UDP‐GlcNAc  complex  reveals  common  structural  principles  of  a 

superfamily of glycosyltransferases. Proc Natl Acad Sci USA 100, 845‐9 (2003). 

Huang  Y,  Huang  J,  Chen  Y.  Alpha‐helical  cationic  antimicrobial  peptides:  relationships  of 

structure and function. Protein Cell 1, 143‐52 (2010). 

Huang W,  Zhang  Z,  Han  X, Wang  J,  Tang  J,  Dong  S, Wang  E.  Concentration‐dependent 

behavior of nisin interaction with supported bilayer lipid membrane. Biophys Chem 99, 271‐

9 (2002). 

Hunter  HN,  Jing  W,  Schibli  DJ,  Trinh  T,  Park  IY,  Kim  SC,  Vogel  HJ.  The  interactions  of 

antimicrobial  peptides  derived  from  lysozyme  with  model  membrane  systems.  Biochim 

Biophys Acta 1668: 175‐89 (2005). 

Imanaka T Oshihara W, Himeno T, Aiba S. Comparative studies on extracellular penicillinase 

of the same structural gene, penP, expressed  in Bacillus  licheniformis and Bacillus subtilis. J 

Gen Microbiol 129, 2621‐8 (1983). 

N References

320

  

Johnson BA, Anker H, Meleney FL. Bacitracin: a new antibiotic produced by a member of the 

B. subtilis group. Science 102, 376‐7 (1945). 

Jordan S, Junker A, Helmann JD, Mascher T. Regulation of LiaRS‐Dependent Gene Expression 

in  Bacillus  subtilis:  Identification  of  inhibitor  proteins,  regulator  binding  sites,  and  target 

genes of a conserved cell envelope stress‐sensisng two‐component system  J Bacteriol 188, 

5153‐66 (2006). 

Joshi S, Bisht GS, Rawat DS, Kumar A, Kumar R, Maiti S, Pasha S. Interaction studies of novel 

cell selective antimicrobial peptides with model membranes and E. coli ATCC 11775. Biochim 

Biophys Acta 1798, 1864‐75 (2010). 

Jutila  A,  Rytömaa M,  Kinnunen  PK.  Detachment  of  cytochrome  c  by  cationic  drugs  from 

membranes  containing  acidic  phospholipids:  comparison  of  lidocaine,  propranolol,  and 

gentamycin. Mol Pharmacol 54, 722‐32 (1998). 

Kaprel'iants  AS,  Nikiforov  VV, Miroshnikov  AI,  Snezhkova  LG,  Eremin  VA,  Ostrovskiĭ  DN. 

Membranes of bacteria and mechanism of action of  the antibiotic gramicidin S. Biokhimiia 

42, 329‐37 (1977). 

Katritzky  AR,  Narindoshvili  T.  Fluorescent  amino  acids:  advances  in  protein‐extrinsic 

fluorophores. Org Biomol Chem 7, 627‐34 (2009). 

Katsu T, Kuroko M, Morikawa T, Sanchika K, Fujita Y, Yamamura H, Uda M. Mechanism of 

membrane damage induced by the amphipathic peptides gramicidin S and melittin. Biochim 

Biophys Acta 983, 135‐41 (1989). 

Kellner  R,  Jung G, Hörner  T,  Zähner H,  Schnell N,  Entian  KD, Götz  F. Gallidermin:  a  new 

lanthionine‐containing polypeptide antibiotic. Eur J Biochem 177, 53‐9 (1988). 

Keren  I, Wu Y,  Inocencio  J, Mulcahy LR, Lewis K. Killing by bactericidal antibiotics does not 

depend on reactive oxygen species. Science 339, 1213‐6 (2013). 

Kim  SH,  Shon  HK,  Ngo  HH.  Adsorption  characteristics  of  antibiotics  trimethoprim  on 

powdered granular activated carbon. J Ind Eng Chem 16, 344‐9 (2007). 

Kingston  AW,  Subramanian  C,  Rock  CO, Helmann  JD.  A  σW‐dependent  stress  response  in 

Bacillus subtilis that reduces membrane fluidity. Mol Microbiol 81, 69‐79 (2011). 

Kobayashi R,  Suzuki  T,  Yoshida M.  Escherichia  coli  phage‐shock  protein A  (PspA) binds  to 

membrane  phospholipids  and  repairs  proton  leakage  of  the  damaged  membranes. Mol 

Microbiol 66, 100‐9 (2007). 

Kohanski MA, Dwyer DJ, Hayete B, Lawrence CA, Collins JJ. A common mechanism of cellular 

death induced by bactericidal antibiotics. Cell 130, 797‐810. 

N References

321

  

Kroteń MA, Bartoszewicz M, Swiecicka  I. Cereulide and valinomycin, two  important natural 

dodecadepsipeptides with ionophoretic activities. Pol J Microbiol 59, 3‐10 (2010). 

Lambert  MP,  Neuhaus  FC.  Mechanism  of  D.cycloserine  action:  alanine  racemase  from 

Escherichia coli W. J Bacteriol 109, 1156‐1161 (1972). 

Lee YH, Kingston AW, Helmann JD. Glutamate dehydrogenase affects resistance to cell wall 

antibiotics in Bacillus subtilis. J Bacteriol 194, 993‐1001 (2012). 

Leontiadou H, Mark AE, Marrink S J. Antimicrobial peptides  in action.  J Am Chem Soc 128, 

12156–61 (2006). 

Liskamp  RM,  Rijkers  DT,  Kruijtzer  JA,  Kemmink  J.  Peptides  and  proteins  as  a  continuing 

exciting source of inspiration for peptidomimetics. Chembiochem 12, 1626‐53 (2011). 

Liu X, Tao X, Zou A, Yang S, Zhang L, Mu B. Effect of the microbial lipopeptide on tumor cell 

lines: apoptosis  induced by disturbing the fatty acid composition of cell membrane. Protein 

Cell 1, 584‐94 (2010). 

Liu  Y,  Imlay  JA.  Cell  death  from  antibiotics  without  the  involvement  of  reactive  oxygen 

species. Science 339, 1210‐3 (2013). 

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Darnell J. Molecular cell biology (4. Auflage), Kap 

16.2. WH Freeman, New York. (2000). 

López D, Kolter R. Functional microdomains  in bacterial membranes. Genes Dev 24, 1893‐

902 (2012). 

López  CS,  Heras  H,  Ruzal  SM,  Sánchez‐Rivas  C,  Rivas  EA.  Variations  of  the  envelope 

composition of Bacillus subtilis during growth  in hyperosmotic medium. Curr Microbiol 36, 

55‐61 (1998). 

Lütticken  R,  Kunstmann  G.  Vancomycin‐resistant  Streptococcaceae  from  clinical material. 

Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A 267, 379‐82 (1988). 

MacDonald JC. Biosynthesis of valinomycin. Can J Microbiol 6, 27‐34 (1960). 

Madigan MT, Martinenko  JM.  Brock Mikrobiologie  (11.  Auflage),  Addison‐Wesley  Verlag, 

München. pp 81‐87 (2006). 

Martens  E,  Demain  AL.  Platensimycin  and  platencin:  promising  antibiotics  for  future 

application in human medicine. J Antibiot (Tokyo) 64, 705‐10 (2011). 

Mascher T, Zimmer  SL, Smith TA, Helmann  JD. Antibiotic‐inducible promoter  regulated by 

the cell envelope stress‐sensing two‐component system LiaRS of Bacillus subtilis. Antimicrob 

Agents Chemother 48, 2888‐96 (2004). 

N References

322

  

Matsumae A, Kamio Y, Hata T. Studies on cerulenin. I. Studies on cerulenin producing strain. 

J Antibiot (Tokyo) 16, 236‐8 (1963). 

Matsumoto  K,  Kusaka  J, Nishibori A, Hara H.  Lipid  domains  in  bacterial membranes. Mol 

Microbiol 61, 1110‐7 (2006). 

Mattik  AT,  Hirsch  A.  Further  observations  on  an  inhibitory  substance  (nisin)  from  lactic 

streptococci. Lancet 2, 5‐8 (1947). 

Meister B, Lemaitre B, Hoffmann JA. Antimicrobial peptide defense in Drosophila. Bioessays 

19, 1019‐26 (1997). 

Melo MN,  Ferre R, Castanho MARB. Antimicrobial  peptides:  linking  partition,  activity  and 

high membrane‐bound concentrations. Nature Rev Microbiol 7, 245‐50 (2009). 

Miteva  M,  Andersson  M,  Karshikoff  A,  Otting  G.  Molecular  electroporation:  a  unifying 

concept  for  the  description  of  membrane  pore  formation  by  antibacterial  peptides, 

exemplified with NK‐lysin. FEBS Lett 462, 155‐158 (1999). 

Moellering  RC  Jr.  Vancomycin:  a  50‐year  reassessment.  Clin  Infect  Dis  42  Suppl  1,  S3‐4 

(2006). 

Mogi T, Ui H,  Shiomi K, Omura  S, Kita K. Gramicidin  S  identified  as a potent  inhibitor  for 

cytochrome bd‐type quinol oxidase. FEBS Lett 582, 2299‐302 (2008). 

Mols M, Abee T. Primary and  secondary oxidative  stress  in Bacillus. Environ Microbiol 13, 

1387‐94 (2011). 

Muchová  K, Wilkinson  AJ,  Barák  I.  Changes  of  lipid  domains  in  Bacillus  subtilis  cells with 

disrupted cell wall peptidoglycan. FEMS Microbiol Lett 325, 92‐8 (2011). 

Nguyen  LT,  Chau  JK,  Perry  NA,  de  Boer  L,  Zaat  SA,  Vogel  HJ.  Serum  stabilities  of  short 

tryptophan‐ and arginine‐rich antimicrobial peptide analogs. PLoS One 5, e12684 (2010). 

Nicolas  P.  Multifunctional  host  defense  peptides:  intracellular‐targeting  antimicrobial 

peptides. FEBS J 276, 6483‐96 (2009). 

Oleson FB, Berman CL, Li AP. An evaluation of the P450 inhibition and induction potential of 

daptomycin in primary human hepatocytes. Chem Biol Interact 150, 137‐47 (2004). 

Parks WM, Bottrill AR, Pierrat OA, Durrant MC, Maxwell A. The action of the bacterial toxin, 

microcin B17, on DNA gyrase. Biochimie 89, 500‐7 (2007). 

Panzner MJ, Hindi KM, Wright BD, Taylor JB, Han DS, Youngs WJ, Cannon CL. A theobromine 

derived silver N‐heterocyclic carbine: synthesis, characterization, and antimicrobial efficacy 

studies on cystic fibrosis relevant pathogens. Dalton Trans 21, 7308‐13 (2009). 

N References

323

  

Parsons  JB,  Frank MW,  Subramanian  C,  Saenkham  P,  Rock  CO. Metabolic  basis  for  the 

differential susceptibility of Gram‐positive pathogens to fatty acid synthesis  inhibitors. Proc 

Natl Acad Sci USA 108, 15378‐83 (2011). 

Patra  M,  Gasser  G,  Bobukhov  D,  Merz  K,  Shtemenko  AV,  Metzler‐Nolte  N.  Sequential 

insertion of three different organometallics  into a versatile building block containing a PNA 

backbone. Dalton Trans 39, 5617‐9 (2010a). 

Patra  M,  Gasser  G,  Metzler‐Nolte  N.  Small  organometallic  compounds  as  antibacterial 

agents. Dalton Trans 41, 6350‐8 (2012a). 

Patra M,  Gasser  G,  Pinto  A, Merz  K,  Ott  I,  Bandow  JE, Metzler‐Nolte  N.  Synthesis  and 

biological evaluation of chromium bioorganometallics based on the antibiotic platensimycin 

lead structure. ChemMedChem 4, 1930‐8 (2009). 

Peng  K,  Kong  Y,  Zhai  L, Wu  X,  Jia  P,  Liu  J,  Yu  H.  Two  novel  antimicrobial  peptides  from 

centipede venoms. Toxicon 55, 274‐9 (2010). 

Penkova  M.  Arginine  and  tryptophan  rich  antimicrobial  peptides  (AMPs):  modifications, 

application and mode of action. PhD thesis. Ruhr‐Universität Bochum (2010). 

Peschel A, Sahl HG. The co‐evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial 

resistance. Nat Rev Microbiol 4, 529‐36 (2006). 

Petersohn A, Brigulla M, Haas  S, Hoheisel  JD, Völker U, Hecker M. Global  analysis  of  the 

general stress response of Bacillus subtilis. J Bacteriol 183, 5617‐31 (2001). 

Pichoff  S,  Lutkenhaus  J.  Tethering  the  Z  ring  to  the  membrane  through  a  conserved 

membrane targeting sequence in FtsA. Mol Microbiol 55, 1722‐34 (2005). 

Plesch E, Bracher F, Krauss J. Synthesis and antimicrobial evaluation of novel platensimycin 

analogues. Arch Pharm (Weinheim) 345, 657‐62 (2012). 

Pkorny  A,  Almeida  PFF.  Kinetics  of  dye  efflux  and  lipid  flip‐flop  induced  by  δ‐lysin  in 

phosphatidylcholine vesicles and the mechanism of graded release by amphipathic, α‐helical 

peptides. Biochemistry 43, 8846‐57 (2004). 

Pkorny,  A,  Birkbeck  TH,  Almeida  PFF. Mechanism  and  kinetics  of  δ‐lysin  interaction with 

phospholipid vesicles. Biochemistry 41, 11044‐56 (2002). 

Pogliano  J,  Pogliano  N,  Silverman  JA.  Daptomycin‐mediated  reorganization  of membrane 

architecture causes mislocalization of essential cell division proteins. J Bacteriol 194, 4494‐

504 (2012). 

Polk RE. Anaphylactoid reactions to glycopeptide antibiotics. J Antimicrob Chermother, Suppl 

B, 17‐29 (1991). 

N References

324

  

Price AC, Choi KH, Heath RJ, Li Z, White SW, Rock CO. Inhibition of beta‐ketoacyl‐acyl carrier 

protein  synthases by  thiolactomycin and cerulenin. Structure and mechanism.  J Biol Chem 

276, 6551‐9 (2001). 

Raatschen N, Wenzel M, Leichert LI, Düchting P, Krämer U, Bandow JE. Extracting  iron and 

manganese from bacteria with ionophores ‐ a mechanism against competitors characterized 

by  increased  potency  in  environments  low  in  micronutrients.  Proteomics,  doi: 

10.1002/pmic.201200556. 

Raatschen N, Bandow JE. 2‐D gel‐based proteomic approaches to antibiotic drug discovery. 

Curr Protoc Microbiol Chapter 1:Unit1F.2 (2012). 

Rabenau  A.  Auswirkungen  von  Zellteilungshemmung  auf Morphologie  und  Proteom  von 

Bacillus subtilis. Diploma thesis, Ruhr‐Universität Bochum (2010). 

Raguse  TL,  Porter  EA,  Weisblum  B,  Gellman  SH.  Structure‐activity  studies  of  14‐helical 

antimicrobial beta‐peptides: probing the relationship between conformational stability and 

antimicrobial potency. J Am Chem Soc 124, 12774‐85 (2002). 

Rathinakumar R, Walkenhorst WF, Wimley WC. Broad‐spectrum antimicrobial peptides by 

rational  combinatory design  and  high‐throughput  screening:  the  importance  of  interfacial 

activity. J Am Chem Soc 131, 7609‐17 (2009). 

Rathinakumar R, Wimley WC. Biomolecular engineering by combinatorial design and high‐

throughput screening: small, soluble peptides that permeabilize membranes. J Am Chem Soc 

130, 9849‐58 (2008). 

Reisinger P,  Seidel H, Tschesche H, Hammes WP. The effect of nisin on murein  synthesis. 

Arch Microbiol 127, 187‐93 (1980). 

Rose WE,  Fallon M, Moran  JJ, Vanderloo  JP. Vancomycin  tolerance  in methicillin‐resistant 

Staphylococcus aureus: influence of vancomycin, daptomycin, and telavancin on differential 

resistance gene expression. Antimicrob Agents Chemother 56: 4422‐7 (2012). 

Rozek T, Wegener KL, Bowie JH, Olver IN, Carver JA, Wallace JC, Tyler MJ. The antibiotic and 

anticancer  active  aurein  peptides  from  the Australian  Bell  Frogs  Litoria  aurea  and  Litoria 

raniformis the solution structure of aurein 1.2. Eur J Biochem 267, 5330‐41 (2000). 

Rupley  JA. The binding and cleavage by  lysozyme of N‐acetylglucosamine oligosaccharides. 

Proc Roy Soc B167, 416‐428 (1967). 

Šajbidor  J.  Effect  of  some  environmental  factors  on  the  content  and  compositions  of 

microbial membrane lipids. Crit Rev Biotechnol 17, 87‐103 (1997). 

Samel SA, Marahiel MA, Essen LO. How to tailor non‐ribosomal peptide products ‐ new clues 

about the structures and mechanisms of modifying enzymes. Mol Biosyst 4, 387‐93 (2008). 

N References

325

  

Sato H, Feix JB. Peptide‐membrane  interactions and mechanisms of membrane destruction 

by amphipathic α‐helical antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta 1758, 1245‐56 (2006). 

Scheffers DJ. The cell wall of Bacillus subtilis. in: Bacillus: cellular and molecular biology (2nd 

Edition), Caister Academic Press, Norfolk. pp 285‐318 (2012). 

Schellenberger V,  Turck C, Rutter WJ. Role  of  the  S'  subsites  in  serine  protease  catalysis. 

Active‐site  mapping  of  rat  chymotrypsin,  rat  trypsin,  alpha‐lytic  protease,  and  cercarial 

protease from Schistosoma mansoni. Biochemistry 33, 4251‐7 (1994). 

Schneider  T,  Sahl  HG.  An  oldie  but  a  goodie  ‐  cell wall  biosynthesis  as  antibiotic  target 

pathway. Int J Med Microbiol 300, 161‐9 (2010). 

Schneider T, Kruse T, Wimmer R, Wiedemann I, Sass V, Pag U, Jansen A, Nielsen AK, Mygind 

PH, Raventós DS, Neve S, Ravn B, Bonvin AM, De Maria L, Andersen AS, Gammelgaard LK, 

Sahl HG, Kristensen HH. Plectasin, a fungal defensin targets the bacterial cell wall precursor 

lipid II. Science 328, 1168‐72 (2010). 

Schneider  T,  Gries  K,  Josten  M,  Wiedemann  I,  Pelzer  S,  Labischinski  H,  Sahl  HG.  The 

lipopeptide  friulimicin  B  inhibits  cell  wall  biosynthesis  by  complex  formation  with 

bactoprenol phosphate. Antimicrob Agents Chemother 53, 1610‐8 (2009). 

Semrau S, Monster MW, van der Knaap M, Florea BI, Schmidt T, Overhand M. Membrane 

lysis by gramicidin S visualized  in  red blood  cells and giant vesicles. Biochim Biophys Acta 

1798, 2033‐9 (2010). 

Seydlová G, Svobodová J. Development of membrane lipids in the surfactin producer Bacillus 

subtilis. Folia Microbiol (Praha) 53, 303‐7 (2008). 

Sharma  RK,  Sundriyal  S,  Wangoo  N,  Tegge  W,  Jain  R.  New  antimicrobial  hexapeptides: 

synthesis, antimicrobial activities, cytotoxicity, and mechanistic  studies. ChemMedChem 5, 

86‐95 (2010). 

Shen Y, Liu Y, Estiu G,  Isin B, Ahn YY, Lee DS, Barabási AL, Kapatral V, Wiest O, Oltvai ZN. 

Blueprint  for  antimicrobial hit discovery  targeting metabolic networks. Proc Natl Acad  Sci 

USA 107, 1082‐7. 

Smith  TL,  Pearson ML, Wilcox  KR,  Cruz  C,  Lancaster MV,  Robinson‐Dunn  B,  Tenover  FC, 

Zervos  MJ,  Band  JD,  White  E,  Jarvis  WR.  Emergence  of  vancomycin  resistance  in 

Staphylococcus aureus. Glycopeptide‐Intermediate Staphylococcus aureus Working Group. N 

Engl J Med 340, 493‐501 (1999). 

Steiner H, Andreu D, Merrifield RB. Binding and action of cecropin and cecropin analogues: 

antibacterial peptides from insects. Biochim Biophys Acta 939, 260‐6 (1988). 

Steinsträßer  L,  Kraneburg  U,  Jacobsen  F,  Al‐Benna  S.  Host  defense  peptides  and  their 

antimicrobial‐immunomodulatory duality. Immunobiology 216, 322‐33 (2011). 

N References

326

  

Strøm  MB,  Haug  BE,  Skar  ML,  Stensen  W,  Stiberg  T,  Stiberg  T,  Svendsen  JS.  The 

pharmacophore of short cationic antibacterial peptides. J Med Chem 46, 1567‐70 (2003). 

Sukharev  S. Purification of  the  small mechanosensitive  channel of Escherichia  coli  (MscS): 

the subunit structure, conduction, and gating characteristics in liposomes. Biophys J 83, 290‐

8 (2002). 

Szeto TH, Rowland SL, Habrukowich CL, King GF. The MinD membrane targeting sequence is 

a transplantable lipid‐binding helix. J Biol Chem 278, 40050‐6 (2003). 

Tan  YT,  Tillet  DJ, McKay  IA. Molecular  strategies  for  overcoming  antibiotic  resistance  in 

bacteria. Mol Med Today 6, 309‐14 (2000). 

Teixeira V, Feio MJ, Bastos M. Role of membrane  lipids  in  the  interaction of antimicrobial 

peptides with membranes. Prog Lipid Res 51, 149‐77 (2012). 

VanBogelen RA, Schiller EE, Thomas JD, Neidhardt FC. Diagnosis of cellular states of microbial 

organisms using proteomics. Electrophoresis 20, 2149‐59 (1999). 

von der Ohe PC, Schmitt‐Jansen M, Slobodnik  J, Brack W. Triclosan  ‐ the  forgotten priority 

substance? Environ Sci Pollut Res Int 19, 585‐91 (2012). 

van  der Oost  J,  von Wachenfeld  C, Hederstedt  L,  Saraste M.  Bacillus  subtilis  cytochrome 

oxidase mutants: biochemical analysis and genetic evidence for two aa3‐type oxidases. Mol 

Microbiol 5, 2063‐72 (1991). 

van Heusden HE, de Kruijff B, Breukink E. Lipid II induces a transmembrane orientation of the 

pore‐forming peptide lantibiotic nisin. Biochemistry 41, 12171‐8 (2002). 

van‘t  Hof  W,  Veerman  EC,  Helmerhorst  EJ,  Amerongen  AV.  Antimicrobial  peptides: 

properties and applicability. Biol Chem 382, 597–619 (2001). 

Vértesy L, Ehlers E, Kogler H, Kurz M, Meiwes J, Seibert G, Vogel M, Hammann P. Friulimicins: 

novel  lipopeptide  antibiotics  with  peptidoglycan  synthesis  inhibiting  activity  from 

Actinoplanes friuliensis sp. nov. II. Isolation and structural characterization. J Antibiot (Tokyo) 

53, 816‐27 (2000). 

Vicario  PP,  Green  BG,  Katzen  HM.  A  single  assay  for  simultaneously  testing  effectors  of 

alanine racemase and/or d‐alanine:D‐alanine ligase. J Antibiot (Tokyo) 40, 209‐16 (1987).  

Vischer WA, Regös  J. Antimicrobial  spectrum of  triclosan,  a  broad‐spectrum  antimicrobial 

agent for topical application. Zentralbl Bakteriol Orig A 226, 376‐89 (1974). 

von Wachenfeldt C, Hederstedt L. Bacillus subtilis 13‐kilodalton cytochrome c‐550 encoded 

by  cccA  consists of  a membrane‐anchor  and  a heme  domain.  J Biol Chem  265,  13939‐48 

(1990). 

N References

327

  

Vostroknutova  GN,  Bulgakova  VG,  Udalova  TP,  Sepetov  NF,  Sibel'dina  LA.  Localization  of 

gramicidin S on the cytoplasmic membrane of Bacillus brevis and its effect on the activity of 

membrane enzymes. Biokhimiia 46, 657‐66 (1981). 

Vrontou  E,  Economou  A.  Structure  and  function  of  SecA,  the  preprotein  translocase 

nanomotor. Biochim Biophys Acta 1694, 67‐80 (2004). 

Wang  J, Kodali  S,  Lee SH, Galgoci A, Painter R, Dorso K, Racine F, Motyl M, Hernandez  L, 

Tinney  E,  Colletti  SL,  Herath  K,  Cummings  R,  Salazar  O,  González  I,  Basilio  A,  Vicente  F, 

Genilloud O, Pelaez F,  Jayasuriya H, Young K, Cully DF, Singh SB. Discovery of platencin, a 

dual FabF and FabH inhibitor with in vivo antibiotic properties. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 

7612‐6 (2007). 

Wang J, Soisson SM, Young K, Shoop W, Kodali S, Galgoci A, Painter R, Parthasarathy G, Tang 

YS,  Cummings  R,  Ha  S,  Dorso  K, Motyl M,  Jayasuriya  H,  Ondeyka  J,  Herath  K,  Zhang  C, 

Hernandez L, Allocco J, Basilio A, Tormo JR, Genilloud O, Vicente F, Pelaez F, Colwell L, Lee 

SH, Michael B, Felcetto T, Gill C, Silver LL, Hermes JD, Bartizal K, Barrett J, Schmatz D, Becker 

JW,  Cully  D,  Singh  SB.  Platensimycin  is  a  selective  FabF  inhibitor  with  potent  antibiotic 

properties. Nature 441, 358‐61 (2006). 

Waksman SA. What is an antibiotic or an antibiotic substance? Mycologia 39, 565‐9 (1947). 

Warth AD, Strominger JL. Structure of the peptidoglycan from vegetative cell walls of Bacillus 

subtilis. Biochemistry 10, 4349‐58 (1971). 

Waters AE, Contente‐Cuomo T, Buchhagen J, Liu CM, Watson L, Pearce K, Foster JT, Bowers 

J, Driebe EM, Engelthaler DM, Keim PS, Price LB. Multidrug‐resistant Staphylococcus aureus 

in US meat and poultry. Clin Infect Dis 52, 1227‐30 (2011). 

Wecke T, Zühlke D, Mäder U, Jordan S, Voigt B, Pelzer S, Labischinski H, Homuth G, Hecker 

M, Mascher  T.  Daptomycin  versus  friulimicin  B:  in‐depth  profiling  of  Bacillus  subtilis  cell 

envelope stress responses. Antimicrob Agents Chemother 53, 1619‐23 (2009). 

Weidenmaier  C,  Peschel  A.  Teichoic  acids  and  related  cell‐wall  glycopolymers  in  Gram‐

positive physiology and host interactions. Nat Rev Microbiol 6, 276‐87 (2008). 

Wenzel M,  Schriek  P,  Prochnow  P,  Albada HB, Metzler‐Nolte N,  Bandow  JE.  Influence  of 

lipidation on the mechanism of action of an RW‐rich antimicrobial peptide. in preparation. 

Wenzel M, Patra M, Senges CHR, Ott I, Stepanek JJ, Pinto A, Prochnow P, Vuong C, Langklotz 

S, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. Analysis pf the mechanism of action of potent antibacterial 

hetero‐tri‐organometallic compounds ‐ a structurally new class of antibiotics. ACS Chem Biol. 

doi: 10.1021/cb4000844. 

Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, Hamoen L, Metzler‐Nolte N, Sahl HG, 

Bandow  JE.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects  differences  in 

N References

328

  

interaction  with  the  cytoplasmic membrane.  Antimicrob  Agents  Chemother  56,  5749‐57 

(2012). 

Wenzel M, Bandow JE. Proteomic signatures  in antibiotic research. Proteomics 11, 3256‐68 

(2011).  

Wiener MC, White SH. Structure of a  fluid doileoylphosphatidylcholine bilayer determined 

by  joint refinement of x‐ray and neutron diffraction data.  III. Complete structure. Biophys J 

61, 434‐47 (1992). 

Wilmes M, Cammue BP, Sahl HG, Thevissen K. Antibiotic activities of host defense peptides: 

more to it than lipid bilayer perturbation. Nat Prod Rep 28, 1350‐8 (2011). 

Wimley WC. Describing  the mechanism of action of antimicrobial peptide action with  the 

interfacial activity model. ACS Chem Biol 5, 905‐17 (2010). 

Winter  T,  Winter  J,  Polak  M,  Kusch  K,  Mäder  U,  Sietmann  R,  Ehlbeck  J,  van  Hijum  S, 

Weltmann KD, Hecker M, Kusch H. Characterization of the global impact of low temperature 

gas plasma on vegetative microorganisms. Proteomics 11, 3518‐30 (2011). 

Wolf D, Kalamorz F, Wecke T, Juszczak A, Mäder U, Homuth G, Jordan S, Kirstein J, Hoppert 

M, Voigt B, Hecker M, Mascher T. In‐depth profiling of the LiaR response of Bacillus subtilis. J 

Bacteriol 192, 4680‐93 (2010). 

Yamamoto T, Yamada A, Yoshimura Y, Terada H, Shinohara Y. The mechanisms of the release 

of cytochrome c  from mitochondria revealed by proteomics analysis. Yakugaku Zasshi 132, 

1099‐104 (2012). 

Yeaman  MR,  Yount  NY.  Mechanisms  of  antimicrobial  peptide  action  and  resistance. 

Pharmacol Rev 55, 27‐55 (2003). 

Yu  J,  Le  Brun  NE.  Studies  of  the  cytochrome  subunits  of  menaquinone:cytochrome  c 

reductase (bc complex) of Bacillus subtilis. Evidence for the covalent attachment of heme to 

the cytochrome b subunit. J Biol Chem 273, 8860‐6 (1998). 

Zlitni S, Brown ED. Drug discovery: Not as fab as we thought. Nature 458, 39‐40 (2009). 

Zweytick D, Tumer S, Blondelle SE, Lohner K. Membrane curvature stress and antibacterial 

activity of lactoferricin derivatives. Biochem Biophys Res Commun 369, 395‐400 (2008). 

Zweytick  D,  Deutsch  G,  Andrä  J,  Blondelle  SE,  Vollmer  E,  Jerala  R,  Lohner  K.  Studies  on 

lactoferricin‐derived  Escherichia  coli membrane‐active  peptides  reveal  differences  in  the 

mechanism of N‐acylated versus nonacylated peptides. J Biol Chem 286, 21266‐76 (2011).

N References

329

  

O  Publications 

 

Research articles 

Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, Schumacher C, Albada HB, Penkova 

M, Krämer U, Erdmann R, Metzler‐Nolte N, Brötz‐Oesterhelt H, Becher D, Sahl HG, 

Bandow  JE.  An  antimicrobial  peptide  delocalizes  peripheral  membrane  proteins. 

submitted. 

Wenzel M*, Patra M*, Senges CHR, Ott I, Stepanek JJ, Pinto A, Prochnow P, Vuong C, 

Langklotz  S, Metzler‐Nolte  N,  Bandow  JE.  Analysis  of  the mechanism  of  action  of 

potent antibacterial hetero‐tri‐organometallic compounds  ‐ a  structurally new class 

of antibiotics. ACS Chem Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

Raatschen N, Wenzel M, Düchting P, Leichert LI, Krämer U, Bandow JE. Extracting iron 

and manganese  from bacteria with  ionophores – a mechanism against competitors 

characterized  by  increased  potency  in  environments  low  in  micronutrients. 

Proteomics. doi: 10.1002/pmic.201200556. 

Albada HB, Chiriac AI, Wenzel M, Penkova M, Bandow JE, Sahl HG, Metzler‐Nolte N. 

Modulating  the  activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing  antibacterial 

peptides  with  N‐terminal metallocenoyl  groups.  Beilstein  J  Org  Chem  8,  1753‐64 

(2012). 

Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, Hamoen L, Metzler‐Nolte N, H 

Sahl HG,  Bandow  JE.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects 

differences  in  interaction  with  the  cytoplasmic  membrane.  Antimicrob  Agents 

Chemother 56, 5749‐57 (2012). 

Patra M, Gasser G, Wenzel M, Merz K, Bandow  JE, Metzler‐Nolte N. Sandwich and 

half‐sandwich  derivatives  of  platensimycin:  Synthesis  and  biological  evaluation. 

Organometallics 31, 5760‐71 (2012). 

Patra M, Gasser G, Wenzel M, Merz  K,  Bandow  JE, Metzler‐Nolte N.  Synthesis  of 

optically  active  ferrocene‐containing  platensimycin  derivatives  with  a  C6‐C7 

substitution pattern. Eur J Inorg Chem 22, 3295‐302 (2011). 

Wenzel M, Patra M, Albrecht D, Chen DYK, Nicolaou KC, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. 

Proteomic  signature  of  fatty  acid  biosynthesis  inhibition  available  for  in  vivo 

mechanism of action studies. Antimicrob Agents Chemother 55, 2590‐6 (2011). 

                                                            * equally contributed  

O Publications

330

  

Patra M, Gasser G, Wenzel M, Merz K, Bandow  JE, Metzler‐Nolte N. Synthesis and 

biological  evaluation  of  ferrocene‐containing  bioorganometallics  inspired  by  the 

platensimycin lead structure. Organometallics 29, 4312‐9 (2010). 

Review articles 

Wenzel M, Bandow  JE. Proteomic signatures  in antibiotic  research. Proteomics. 11, 

3256‐68 (2011). 

 

Conference contributions 

 

Talks 

Wenzel M*, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, Schumacher C, Albada HB, Penkova 

M, Krämer U, Erdmann R, Metzler‐Nolte N, Brötz‐Oesterhelt H, Becher D, Sahl HG, 

Bandow  JE.  Short  cationic  antimicrobial  peptide  RWRWRW‐NH2  inhibits  cell  wall 

biosynthesis and bacterial  respiration by delocalizing essential membrane proteins. 

2nd  Innovative Antibiotics  from NRW Progress Meeting, Bochum, Germany.  January 

30th, 2013. 

Wenzel M. Hunting  the Red Queen – Proteomic Profiling  in der Entwicklung neuer 

Antibiotika.  19th  Arbeitstagung  Micromethods  in  Protein  Chemistry.  Bochum, 

Germany. June 25th‐27th, 2012. 

Wenzel M,  Chiriac AI, Albada HB,  Knüfer A, Hamoen  L,  Sahl HG, Metzler‐Nolte N, 

Bandow  JE. Antimicrobial hexapeptide MP196 disturbs membrane  integrity without 

pore formation. 3rd International Symposium on Antimicrobial Peptides, Lille, France. 

June 13th‐15th, 2012. 

Wenzel M, Chiriac AI, Albada HB, Otto A, Knüfer A, Becher D, Hamoen  L, Sahl HG, 

Metzler‐Nolte N,  Bandow  JE.  The  cell  envelope  as  target  of  a  novel  antimicrobial 

peptide. Annual Conference of the Association for General and Applied Microbiology 

(VAAM), Tübingen, Germany. March 18th‐21st, 2012. 

Wenzel  M,  Chiriac  AI,  Otto  A,  Gust  R,  May  C,  Sahl  HG,  Bandow  JE.  Antibiotic 

mechanism  of  a  small  cationic  hexapeptide.  1st  Innovative  Antibiotics  from  NRW 

Progress Meeting, Bochum, Germany. February 8th, 2012. 

Wenzel M, Bandow  JE. 2D  gel‐based proteomics.  Innovative Antibiotics  from NRW 

Kickoff Meeting, Wuppertal, Germany. February 14th, 2011. 

                                                            * presenting author underlined 

O Publications

331

  

Bandow  JE, Wenzel M, Raatschen N, Rabenau A, Kutscher B, Penkova M, Patra M, 

Metzler‐Nolte  N.  Investigating  antibiotic  targets  and  mechanisms  of  action  using 

proteome analyses. 3rd  joint conference of  the Association  for General and Applied 

Microbiology (VAAM) and the German Society for Hygiene and Microbiology (DGHM), 

Hannover, Germany. March 28th‐31st, 2010. 

Wenzel  M,  Bandow  JE.  MP66  and  derivatives:  Biological  activity  and  proteome 

response  of  Bacillus  subtilis.  1st  IFSC Mini‐Symposium,  Bochum,  Germany.  August 

28th, 2009. 

 

Posters 

Wenzel M*, Chiriac AI, Otto A, Albada HB, May C, Zweytick D, Krämer U, Becher D, 

Metzler‐Nolte N, Sahl HG, Bandow JE. In depth analysis of the mechanism of action of 

the  short  RW‐rich  peptide MP196.  Gordon  Research  Conference  on  Antimicrobial 

Peptides, Ventura, California, USA. February 23rd ‐ March 1st, 2013. 

Chiriac  AI, Wenzel M,  Albada  HB,  Josten M,  Krämer  J,  Sahl  HG, Metzler‐Nolte  N, 

Bandow  JE. Effect of  synthetic  short cationic antimicrobial peptide on bacterial cell 

envelope.  Gordon  Research  Conference  on  New  Antimicrobial  Discovery  and 

Development, Lucca, Italy. April 15th‐20th, 2012. 

Wenzel M, Penkova M,  Josten M, Chiriac AI, Sahl HG, Metzler‐Nolte N, Bandow  JE. 

Cell  envelope‐targeting  hexapeptide  exhibits  a  concentration‐dependent  shift  in 

mode of action. Gordon Research Conference on Antimicrobial Peptides, Lucca, Italy. 

May 15th‐20th, 2011. 

Wenzel M, Penkova M, Otto A, Becher D, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. On a highway 

to  the  antibiotic  mechanism:  proteomic  investigation  of  small,  cationic  peptides. 

Proteomic Forum, Berlin, Germany. April 3rd‐7th, 2011. 

Kohl B, Wenzel M, Bandow JE. Comparative proteomic study of cell envelope stress 

caused  by  lipopeptide  antibiotics.  Proteomic  Forum,  Berlin, Germany. April  3rd‐7th, 

2011. 

Wenzel M, Penkova M, Otto A, Becher D, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. What can we 

learn  from  the  cytosolic  and  the  membrane  proteome  about  the  mechanism  of 

action of short cationic peptides? 9th Human Proteome Organisation  (HUPO) World 

Congress, Sydney, Australia. September 19th‐23rd, 2010. 

Wenzel  M,  Penkova  M,  Raatschen  N,  Metzler‐Nolte  N,  Bandow  JE.  Antibiotic 

mechanism  of  action  studies  in  Bacillus  subtilis:  Proteomic  investigation  of  short 

                                                            * presenting author underlined 

O Publications

332

  

cationic peptides  and  fatty  acid biosynthesis  inhibitors.  3rd  joint  conference of  the 

Association  for General and Applied Microbiology  (VAAM) and  the German Society 

for Hygiene and Microbiology (DGHM),, Hannover, Germany. March 28th‐31st, 2010. 

Wenzel M,  Penkova M,  Raatschen N, Metzler‐Nolte  N,  Bandow  JE.  Short  cationic 

ferrocene‐peptide bioconjugate targets the cytoplasmic membrane. 49th Interscience 

Conference  on  Antimicrobial  Agents  and  Chemotherapy  (ICAAC),  San  Francisco, 

California, USA. September 12th‐15th, 2009. 

 

O Publications

333

P  Appendix 

 

 

1   Catalog of proteomic response profiles to antibiotics 

2   Curriculum vitae 

3   Contributions to the integrated publications and manuscripts 

4   Erklärung 

 

P Appendix

334

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 14 µg/mL

Optimal stressor concentration 8.4 µg/mL

Bacteriolytic concentration 14 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Aurein 2.2 (GLFDIVKKVVGALGSL‐CONH2)

Mechanistic properties

Mode of action ion transport

Molecular target phospholipids

Depolarizationa yes

Permeabilizationb no

Cell wall integrityc not disturbed

General information

Source Litoria aurea

MW 1613 g/mol

Ref. Rozek et al., 2000

control/aurein 2.2

Wen

zel andSenges, unpublished

a determined by MinD localization; b determined by acetic acid/methanol fixation; c determined by BacLight

P Appendix

335

Mechanism of action

Aurein 2.2 integrates into the bacterial membrane and translocates potassium, iron,magnesium, and manganese ions across the bilayer [Wenzel and Senges, unpublishedresults].

Protein ID Protein function Functional category

Hag flagellin protein motility

Hom homoserine dehydrogenase amino acids

LiaH similar to phage shock protein cell wall

MnaA UDP‐N‐acetylglucosamine 2‐epimerase  cell wall

RacX amino acid racemase cell wall

RbsK ribokinase energy

RbsU protein serine phosphatase, dephosphorylates RsbV general stress

Spo0M sporulation control sporulation

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YuaI control of membrane fluidity membrane

Marker proteins

P Appendix

336

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 14 µg/mL

Optimal stressor concentration 10.5 µg/mL

Bacteriolytic concentration 14 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Aurein 2.3 (GLFDIVKKVGAIGSL‐CONH2)

Mechanistic properties

Mode of action ion transport

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity not disturbed

General information

Source Litoria aurea

MW 1613 g/mol

Ref. Rozek et al., 2000

control/aurein 2.3

Wen

zel andSenges, unpublished

P Appendix

337

Mechanism of action

Aurein 2.3 integrates into the bacterial membrane and translocates potassium, iron,magnesium, and manganese across the bilayer [Wenzel and Senges, unpublished results].

Protein ID Protein function Functional category

AccD acetyl‐CoA carboxylase (beta subunit)  membrane

Adk adenylate kinase energy

AroA3‐deoxy‐D‐arabino‐heptulosonate 7‐phosphate synthase / 

chorismate mutase‐isozyme 3 energy

CotEouter spore coat morphogenetic protein, controls the 

assembly of the outer spore coat layercell envelope

CysC adenylyl‐sulfate kinase  sulfur metabolism

GlcR transcriptional repressor (DeoR family)  energy

Hag flagellin protein motility

Hom homoserine dehydrogenase (NADPH) amino acids

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

Ndk nucleoside diphosphate kinase  energy

PpaC inorganic pyrophosphatase phosphate metabolism

PspA phage shock protein A energy

RbsK ribokinase energy

RbsU protein serine phosphatase, dephosphorylates RsbV general stress

RacX amino acid racemase cell wall

Spo0M sporulation control protein sporulation

SufD synthesis of Fe‐S‐clusters  iron metabolism

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YezE similar to transcriptional regulator (TetR family)  unknown

YhcG similar to ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YkaA unknown unknown

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YpuA unknown cell envelope

YpxDtwo‐component response regulator, regulation of aerobic 

and anaerobic respiration energy

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YuaI control of membrane fluidity membrane

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YvyE unknown unknown

YxxG unknown unknown

Marker proteins

P Appendix

338

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 20 µg/mL

Optimal stressor concentration 13.3 µg/mL

Bacteriolytic concentration 20 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Aurein 2.2Δ‐3 (GLFDIVKKVVGAL‐CONH2)

Mechanistic properties

Mode of action ion transport

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity not disturbed

General information

Source Litoria aurea

MW 1301 g/mol

Ref. Cheng et al., 2010

control/aurein 2.2Δ‐3 

Wen

zel andSenges, unpublished

P Appendix

339

Mechanism of action

Aurein 2.2Δ‐3 integrates into the bacterial membrane and translocates potassium, iron,magnesium, and manganese across the bilayer [Wenzel and Senges, unpublished results].

Protein ID Protein function Functional category

AccD acetyl‐CoA carboxylase (beta subunit)  membrane

Adk adenylate kinase energy

AroA3‐deoxy‐D‐arabino‐heptulosonate 7‐phosphate synthase / 

chorismate mutase‐isozyme 3 energy

ClpC ATPase subunit of the ATP‐dependent ClpC‐ClpP protease proteolysis

CotEouter spore coat morphogenetic protein, controls the 

assembly of the outer spore coat layercell envelope

CysC adenylyl‐sulfate kinase  amino acids

HemATsoluble chemotaxis receptor, heme‐containing O2 sensor 

protein chemotaxis

Hom homoserine dehydrogenase (NADPH) amino acids

LiaH similar to phage shock protein cell wall

MurAA UDP‐N‐acetylglucosamine 1‐carboxyvinyltransferase  cell wall

NadE NAD synthase energy

RacX amino acid racemase cell wall

Spo0M sporulation control protein sporulation

SufD synthesis of Fe‐S‐clusters  iron metabolism

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cel envelope

YhcG similar to ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YkaA unknown unknown

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YpuA unknown cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YvyE unknown unknown

YxiF unknown unknown

YxxG unknown unknown

Marker proteins

P Appendix

340

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 12 µg/mL

Optimal stressor concentration 12 µg/mL

Bacteriolytic concentration >48 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Bacitracin

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition

Molecular target undecaprenyl phosphate

Depolarization no

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Bacillus licheniformis

MW 1423 g/mol

Ref. Johnson et al., 1945

control/bacitracin

http://www.lookchem.com

P Appendix

341

Mechanism of action

Bacitracin binds to undecaprenylpyrophosphate and prevents recycling of the bactoprenolcarrier. Consequently, lipid II and WTA synthesis are inhibited [Schneider and Sahl, 2010].

Protein ID Protein function Functional category

GatA production of glutamyl‐tRNA translation

LiaH similar to phage shock protein cell wall

RpsB ribosomal protein translation

YlaG similar to GTP‐binding elongation factor  translation

Marker proteins

Protein ID Protein function Functional category

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase cell wall

Hom homoserine dehydrogenase (NADPH) amino acids

IolS unknown, may be involved in myo‐inositol catabolism  energy

LiaH similar to phage shock protein cell wall

PtsHHPr, general component of the sugar phosphotransferase

system (PTS). energy

Sat sulfate adenylyltransferase sulfate metabolism

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YtrB ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YtrE ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

Marker proteins described by Bandow et al., 2003

P Appendix

342

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 12 µg/mL

Optimal stressor concentration 15 µg/mL

Bacteriolytic concentration 50 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

C‐C0 (RWRWRWK‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1176 g/mol

Ref. Albada et al., 2012a

control/C‐C0

Wenzel et al., in preparation a

P Appendix

343

Mechanism of action

C‐C0 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architecture accordingto the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis [Wenzel etal., in preparation a].

Protein ID Protein function Functional category

AcsA acetyl‐CoA synthetase membrane

Bcd valine, isoleucine, leucine dehydrogenase amino acids

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III heat‐shock protein) 

proteolysis

ClpY two‐component ATP‐dependent protease, ATPase subunit  proteolysis

CysC adenylyl‐sulfate kinase  amino acids

FabF beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II membrane

FosB bacillithiol‐S‐transferase cell envelope

GroEL chaperonin and co‐repressor for HrcA chaperone

IlvC ketol‐acid reductoisomerase  amino acids

LiaH similar to phage shock protein A cell wall

MurB UDP‐N‐acetylenolpyruvoylglucosamine reductase cell wall

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase

energy

PbpE penicillin‐binding protein PBP 4 cell wall

PdhA pyruvate dehydrogenase (E1 alpha subunit) energy

PdxK pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine kinase energy/amino acids

PspA phage shock protein A membrane

PstS phosphate ABC transporter (binding protein)  transport

RacX amino acid racemase cell wall

RecAmultifunctional protein involved in homologous recombination and DNA repair

DNA  repair

RocA 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  amino acids

SalA negative regulator of scoC expression, subtilisin derepression proteolysis

Spo0M sporulation control protein sporulation

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YaaQ unknown unknown

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdhMglucomannan‐specific phosphotransferase system, EIIB component of the PTS

energy

Ydjl acetoine/butanediol dehydrogenase  energy

YjbC general stress protein, required for survival of salt stress  general stress

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) energy

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YpuA unknown cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YtoQ unknown unknown

Marker proteins

P Appendix

344

Protein ID Protein function Functional category

YuaE unknown unknown

YuaI control of membrane fluidity membrane

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YukJ unknown unknown

YvIB unknown cell envelope

YvyDgeneral stress protein, required for ribosome dimerization in the stationary phase

general stress

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase  energy

P Appendix

345

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 3 µg/mL

Optimal stressor concentration 3 µg/mL

Bacteriolytic concentration 7.5 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

C‐C8 (RWRWRWK‐C7H15)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1300 g/mol

Ref. Albada et al., 2012a

control/C‐C8

Wenzel et al., in preparation a

P Appendix

346

Mechanism of action

C‐C8 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architecture accordingto the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis [Wenzel etal., in preparation a].

Protein ID Protein function Functional category

AcsA acetyl‐CoA synthetase membrane

Bcd valine, isoleucine, leucine dehydrogenase amino acids

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III heat‐shock protein) 

proteolysis

ClpY two‐component ATP‐dependent protease, ATPase subunit  proteolysis

CysC adenylyl‐sulfate kinase  amino acids

FosB bacillithiol‐S‐transferase cell envelope

GroEL chaperonin and co‐repressor for HrcA chaperone

LiaH similar to phage shock protein A cell wall

MurB UDP‐N‐acetylenolpyruvoylglucosamine reductase cell wall

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavinreductase

energy

PbpE penicillin‐binding protein PBP 4 cell wall

PdxK pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine kinase energy/amino acids

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

RocA 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  amino acids

SalA negative regulator of scoC expression, subtilisin derepression proteolysis

Spo0M sporulation control protein sporulation

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YaaQ unknown unknown

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdhMglucomannan‐specific phosphotransferase system, EIIB component of the PTS

energy

Ydjl acetoine/butanediol dehydrogenase  energy

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YpuA unknown cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YtoQ unknown unknown

YuaE unknown unknown

YuaI control of membrane fluidity membrane

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YukJ unknown unknown

YvIB unknown cell envelope

YvyDgeneral stress protein, required for ribosome dimerization in the stationary phase

general stress

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

347

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 5 µg/mL

Optimal stressor concentration 5 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Cerulenin

Mechanistic properties

Mode of action FAB inhibition

Molecular target FabF

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source Cephalosporium caerulens

MW 223.27 g/mol

Ref. Matsumae et al., 1964

control/cerulenin

http://www.lookchem.com

P Appendix

348

Mechanism of action

Cerulenin inhibits fatty acid biosynthesis by binding to the 3‐oxoacyl‐ACP synthase II (FabF)[Price et al., 2001].

Protein ID Protein function Functional category

Ald L‐alanine dehydrogenase amino acids

FabHA 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabHB 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabI enoyl‐ACP reductase membrane (FAB)

FabF 3‐oxoacyl‐ACP synthase II membrane (FAB)

PlsXputative glycerol‐3‐phosphateacyltransferase

membrane (PLB)

PanB3‐Methyl‐2‐oxobutanoatehydroxymethyltransferase

CoA synthesis

YurPsimilar to glutamine–fructose‐6‐phosphatetransaminase

energy

Marker proteins

P Appendix

349

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 2 µg/mL

Optimal stressor concentration 3.5 µg/mL

Bacteriolytic concentration 10 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Daptomycin (LY146032)

Mechanistic properties

Mode of action membrane perturbation

Molecular target probably phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Streptomyces roseosporus

MW 1621 g/mol

Ref. Eliopulos et al., 1986

control/daptomycin

Oleson et al., 2004

P Appendix

350

Mechanism of action

Daptomycin integrates into the bacterial membrane. Although its exact mechanism is notfully understood so far, daptomycin has been described to alter membrane architecture andto delocalize membrane proteins involved in cell division [Pogliano et al., 2012].

Protein ID Protein function Functional category

LiaH similar to phage shock protein cell wall

PspA phage shock protein A membrane

ResDtwo‐component response regulator, regulation of aerobic 

and anaerobic respiration energy

YqfPsimilar to penicillin tolerance, isopentenyl diphosphate

biosynthesis cell wall

LiaRtwo‐component response regulator, regulation of the liaI‐

liaH‐liaG‐liaF‐liaS‐liaR operoncell wall

Marker proteins

P Appendix

351

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 1:1000

Optimal stressor concentration 1:1000

Bacteriolytic concentration 1:100

Bacterial response analyzed after 15 min

Dekont

Mechanistic properties

Mode of action detergent

Molecular target phospholipids

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source unknown

MW unknown

Ref. unknown

control/dekont

unknown

P Appendix

352

Mechanism of action

Dekont is a detergent solution, which is applied to remove radioactive liquids from surfaces.

Protein ID Protein function Functional category

no marker proteins determined

Marker proteins

P Appendix

353

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 7 µg/mL

Optimal stressor concentration 7 µg/mL

Bacteriolytic concentration 7 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

D‐MP66 (FcCO‐WRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 1257 g/mol

Ref. Chantson et al., 2006

control/D‐MP66

adapted according to Chantson et al., 2006

P Appendix

354

Mechanism of action

D‐MP66 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b.

Protein ID Protein function Functional category

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligas cell wall

Dpsiron storage protein, general stress protein, resistance 

against ethanol stress and survival at low temperatures general stress

GreAtranscription elongation factor, resolves stalled RNA 

polymerase at promoter or promoter‐proximal regionstranscription

GsiB general stress protein general stress

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

NfrA

Spx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin

reductase energy

PbpE penicillin‐binding protein 4 cell wall

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

SalA negative regulator of scoC expression, subtilisin derepression proteolysis

Spo0M sporulation control protein sporulation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YdaG general stress protein general stress

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YqkF similar to oxidoreductase energy

YtkL general stress protein general stress

Marker proteins

P Appendix

355

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 10 µg/mL

Optimal stressor concentration 50 µg/mL

Bacteriolytic concentration >50 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

D‐MP196 (RWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1044 g/mol

Ref. Albada et al., 2012b

control/D‐MP196

adapted according to Chantson et al., 2006

P Appendix

356

Mechanism of action

D‐MP196 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b].

Protein ID Protein function Functional category

AzoR2 similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone) oxidative stress

BglH phospho‐beta‐glucosidase energy

CitZ citrate synthase energy

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase cell wall

FosB bacillithiol‐S‐transferase cell envelope

GsiB general stress protein general stress

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin

reductaseenergy

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

SodA superoxide dismutase oxidative stress

Spo0M sporulation control protein sporulation

SpoVGnegative effector of asymetric septation at the onset of 

sporulation sporulation

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdaG general stress protein general stress

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YqiW unknown unknown

YqkF similar to oxidoreductase energy

YtoQ unknown unknown

YuaI control of membrane fluidity membrane

YvlB unknown unknown

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

357

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 5 µg/mL

Optimal stressor concentration 25 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

D‐MP276 (RcCO‐WRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1146 g/mol

Ref. Albada et al., 2012b

control/D‐MP276

adapted according to Albada et al., 2012

P Appendix

358

Mechanism of action

D‐MP276 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b].

Protein ID Protein function Functional category

AzoR2 similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone) oxidative stress

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

FabF beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II membrane

GsiB general stress protein general stress

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin

reductaseenergy

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

SodA superoxide dismutase oxidative stress

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdaG general stress protein general stress

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) energy

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YqiW unknown unknown

YvlB unknown cell envelope

YuaI control of membrane fluidity membrane

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

359

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 2 µg/mL

Optimal stressor concentration 2 µg/mL

Bacteriolytic concentration >25 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

FcPNA

Mechanistic properties

Mode of action membrane integration

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1451 g/mol

Ref. Patra et al., 2010

control/FcPNA

adapted according to Patra et al., 2010

P Appendix

360

Mechanism of action

FcPNA integrates into the bacterial membrane and probably affects membrane architecture.It strongly inhibits respiration, impairs cell wall biosynthesis, and induces formation of ROS[Wenzel et al., 2013].

Protein ID Protein function Functional category

Adk adenylate kinase energy

ArgC N‐acetyl‐gamma‐glutamyl‐phosphate reductase energy

AzoR2 similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone) oxidative stress

CheV CheA modulator general stress

ClpP ATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit proteolysis

Dps DNA‐protecting protein, ferritin general stress

Frr ribosome recycling factor miscellaneous

GreA transcription elongation factor GreA miscellaneous

GroEL chaperonin chaperone

IolS aldo‐keto reductase energy

IspH isopentenyl diphosphate biosynthesis cell envelope

LuxS S‐ribosylhomocysteinase energy

MrgA metalloregulation DNA‐binding stress protein oxidative stress

NadE NAD synthase energy

Nin inhibitor of the DNA degrading activity of NucA general stress

PpiB peptidyl‐prolyl isomerase (chaperone) chaperone

PspA phage shock protein A cell envelope

RacX amino acid racemase cell envelope

SodA superoxide dismutase oxidative

SpoVC peptidyl‐tRNA hydrolase sporulation

SpoVG regulatory protein SpoVG sporulation

Tpx thiol peroxidase oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdaG general stress general stress

YdbD manganese‐containing catalase oxidative stress

YfjR beta‐hydroxyacid dehydrogenase energy

YhdN aldo/keto reductase specific for NAD(P)H energy

YjdA similar to 3‐ketoacyl‐acyl‐carrier protein reductase cell envelope

YmaE unknown unknown

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase cell envelope

YphP disulfide isomerase, putative bacilliredoxin oxidative stress

YqiG NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YqiW unknown, disulfide isomerase family unknown

YqxA unknown general stress

YtkL metal‐dependent hydrolase general stress

YwbC putative methylglyoxylase oxidative stress

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

361

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 4 µg/mL

Optimal stressor concentration 1 µg/mL

Bacteriolytic concentration 20 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Friulimicin B

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition

Molecular target undecaprenyl pyrophosphate

Depolarization no

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Actinoplanes friuliensis

MW 1303 g/mol

Ref. Vértesy et al., 2000

control/friulimicin B

Schneider et al., 2009

P Appendix

362

Mechanism of action

Friulimicin B binds to undecaprenyl phosphate, prevents recycling of the bactoprenol carrier,and inhibits the lipid II cycle [Schneider et al., 2009].

Protein ID Protein function Functional category

no marker proteins identified

Marker proteins

P Appendix

363

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 6 µg/mL

Optimal stressor concentration 6 µg/mL

Bacteriolytic concentration 30 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Gallidermin

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition, membrane

Molecular target lipid II, phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Staphylococcus gallinarium

MW 2166 g/mol

Ref. Kellner et al., 1988

control/gallidermin

adapted according to Bonelli et al., 2006

P Appendix

364

Mechanism of action

Gallidermin binds to lipid II and inhibits cell wall biosynthesis. It additionally integrates intothe membrane [Bonelli et al., 2006].

Protein ID Protein function Functional category

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase cell wall

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

PbpC penicillin‐binding protein PBP4 cell wall

PspA phage shock protein A membrane

RpsB ribosomal protein translation

TrmB tRNA (m7G46) methyltransferase translation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YtrB ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YtrE ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YvlB unknown cell envelope

Marker proteins

P Appendix

365

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 2 µg/mL

Optimal stressor concentration 1 µg/mL

Bacteriolytic concentration 2 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Gramicidin S

Mechanistic properties

Mode of action membrane integration

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Bacillus brevis

MW 1141 g/mol

Ref. Gause & Brazhnikova, 1944

control/gramicidin S

academic.ru

P Appendix

366

Mechanism of action

Gramicidin S integrates into the bacterial membrane and leads to rearrangement ofnegatively charged phospholipids [Kaprel’iants et al., 1977; Vostroknutova et al., 1981]. Ittriggers potassium release [Katsu et al., 1989] and delocalizes cytochrome c and MurG.

Protein ID Protein function Functional category

AroA3‐deoxy‐D‐arabino‐heptulosonate 7‐phosphate synthase / 

chorismate mutase‐isozyme 3amino acids

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

ThrC threonine synthase amino acids

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YuaE unknown unknown

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YvIB unknown cell envelope

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

367

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 1:10000

Optimal stressor concentration 1:100000

Bacteriolytic concentration 1:10000

Bacterial response analyzed after 15 min

Helipur

Mechanistic properties

Mode of action detergent

Molecular target phospholipids

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW unknown

Ref. B. Braun Melsungen AG

control/helipur

unknown

P Appendix

368

Mechanism of action

Helipur is a toxic detergent used for disinfection of glass ware.

Protein ID Protein function Functional category

no marker proteins determined

Marker proteins

P Appendix

369

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 9 µg/mL

Optimal stressor concentration 0.9 µg/mL

Bacteriolytic concentration 6.75 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Lanti X

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition

Molecular target lipid II

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source unknown

MW unknown

Ref. unknown

control/lanti X

unknown

P Appendix

370

Mechanism of action

According to the proteome pattern, lanti X acts similar to lipid II‐binding antibiotics likegallidermin and nisin. It induces a pronounced cell wall stress response but no specificmembrane stress markers (Wenzel and Kohl, unpublished results).

Protein ID Protein function Functional category

CysC adenylyl‐sulfate kinase  sulfur metabolism

GamA glucosamine‐6‐phosphate deaminase cell wall

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NrfASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin

reductaseenergy

PbpC penicillin‐binding protein cell wall

RpsB ribosomal protein translation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YtrE ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YvcRABC transporter (ATP‐binding protein) for the export of lipid 

II‐binding lantibioticstransport

YvIB unknown cell envelope

LiaRtwo‐component response regulator, regulation of the liaI‐

liaH‐liaG‐liaF‐liaS‐liaR operoncell wall

Marker proteins

P Appendix

371

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 7 µg/mL

Optimal stressor concentration 5.75 µg/mL

Bacteriolytic concentration 7 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

L‐MP66 (FcCO‐RWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 1257 g/mol

Ref. Chantson et al., 2006

control/L‐MP66

adapted according to Chantson et al., 2006

P Appendix

372

Mechanism of action

L‐MP66 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b].

Protein ID Protein function Functional category

AzoR2 similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone) oxidative stress

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase cell wall

EfTU elongation factor TU translation

FabF beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II membrane

GsiB general stress protein general stress

LiaH similar to phage shock protein cell wall

LuxSS‐ribosylhomocysteine lyase, autoinducer‐2 production 

protein, required for swarming motility and biofilm formation 

amino acids, chemotaxis,

biofilm formation

NadE NAD synthase energy

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin

reductaseenergy

PspA phage shock protein A membrane

Spo0M sporulation control protein sporulation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YhdN aldo/keto reductase general stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YqiW unknown oxidative stress

YqkF similar to oxidoreductase energy

YuaI control of membrane fluidity membrane

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

373

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 5 µg/mL

Optimal stressor concentration 5 µg/mL

Bacteriolytic concentration >25 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

L‐MP159 (FcCO‐G‐cCRWRWRWC)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 1361 g/mol

Ref. Penkova, 2009

control/L‐MP159

Chiriac et al., in preparation

P Appendix

374

Mechanism of action

L‐MP159 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b].

Protein ID Protein function Functional category

AzoR2 similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone) oxidative stress

CitZ citrate synthase energy

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

Dpsiron storage protein, general stress protein, resistance 

against ethanol stress and survival at low temperatures general stress

IolS unknown, may be involved in myo‐inositol catabolism  energy

LiaH similar to phage shock potein cell wall

LuxSS‐ribosylhomocysteine lyase, autoinducer‐2 production 

protein, required for swarming motility and biofilm formation 

amino acids, chemotaxis,

biofilm formation

MrgA iron storage protein, DNA‐binding stress protein oxidative stress

NadE NAD synthase energy

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NAD(P)H‐linked nitro/flavin

reductaseenergy

PbpE penicillin‐binding protein PBP4 cell wall

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

SodA superoxide dismutase oxidative stress

SpoVGnegative effector of asymetric septation at the onset of 

sporulation sporulation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YfhM similar to epoxide hydrolase  cell envelope

YfjR similar to 3‐hydroxyisobutyrate dehydrogenase  memrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YthP similar to ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YvlB unknown cell envelope

Marker proteins

P Appendix

375

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 9 µg/mL

Optimal stressor concentration 22.5 µg/mL

Bacteriolytic concentration 45 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

L‐MP196 (H‐RWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1043 g/mol

Ref. Chantson et al., 2006

control/MP196

adapted according to Chantson et al., 2006

P Appendix

376

Mechanism of action

L‐MP196 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., submitted].

Protein ID Protein function Functional category

BglH phospho‐beta‐glucosidase energy

CitZ citrate synthase energy

DltA D‐alanyl‐D‐alanine carrier protein ligase cell wall

LiaH modulator of LiaIHGFSR operon expression cell wall

NadE NAD synthetase energy

PspA phage shock protein A homolog membrane

RacX amino acid racemase cell wall

RpsB ribosomal protein S2 translation

TrmB tRNA (m7G46) methyltransferase translation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YjdA similar to 3‐ketoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YthP similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YtrE similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YtxH general stress protein general stress

YuaI control of membrane fluidity membrane

YvlB unknown cell envelope

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

377

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 1 µg/mL

Optimal stressor concentration 1 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

L‐MP276 (RcCO‐RWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1146 g/mol

Ref. Albada et al., 2012b

control/L‐MP276

adapted according to Albada et al., 2012

P Appendix

378

Mechanism of action

L‐MP276 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architectureaccording to the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis[Wenzel et al., in preparation b].

Protein ID Protein function Functional category

ArgC N‐acetyl‐g‐glutamyl‐phosphate reductase amino acids

Dpsiron storage protein, general stress protein, resistance against ethanol stress and survival at low temperatures 

general stress

Frr ribosome recycling factor translation

GreAtranscription elongation factor, resolves stalled RNA polymerase at promoter or promoter‐proximal regions

translation

LiaH similar to phage shock protein cell wall

Mdh malate dehydrogenase energy

MrgA iron storage protein, DNA‐binding stress protein oxidative stress

NadE NAD synthase energy

PpiB peptidyl‐prolyl isomerase chaperone

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

RpsB ribosomal protein translation

SodA superoxide dismutase oxidative stress

SpoVGnegative effector of asymetric septation at the onset of sporulation 

sporulation

Tpx thiol peroxidase Oxidative stress

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YdaG general stress protein general stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YphP disulfide isomerase, putative bacilliredoxin oxidative stress

YqkF similar to oxidoreductase energy

YthP similar to ABC transporter (ATP‐binding protein)  transport

YtkL general stress protein  general stress

YtxH general stress protein  general stress

YwbC putative methylglyoxalase oxidative stress

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

379

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 30 µg/mL

Optimal stressor concentration 30 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Mersacidin

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition

Molecular target lipid II

Depolarization no

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Bacillus sp. HIL Y‐85,54728

MW 1834 g/mol

Ref. Chatterjee et al., 1992

control/mersacidin

adapted according to Chatterjee et al., 2005

P Appendix

380

Mechanism of action

Mersacidin binds to lipid II and inhibits cell wall biosynthesis [Brötz et al., 1995].

Protein ID Protein function Functional category

LiaH similar to phage shock protein cell wall

TrmB tRNA (m7G46) methyltransferase translation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YqiQ methylisocitrate lyase sporulation

YtrB ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

YtrE ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

Marker proteins

P Appendix

381

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 10 µg/mL

Optimal stressor concentration 15.75 µg/mL

Bacteriolytic concentration 22.5 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

N‐C0 (KRWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1176 g/mol

Ref. Albada et al. 2012a

control/N‐C0

Wenzel et al., in preparation a

P Appendix

382

Mechanism of action

N‐C0 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architecture accordingto the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis [Wenzel etal., in preparation a].

Protein ID Protein function Functional category

Bcd valine, isoleucine, leucine dehydrogenase amino acids

ClpY two‐component ATP‐dependent protease, ATPase subunit  proteolysis

CysC adenylyl‐sulfate kinase  amino acids

FabF beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II membrane

FosB bacillithiol‐S‐transferase cell envelope

GroEL chaperonin and co‐repressor for HrcA chaperone

IlvC ketol‐acid reductoisomerase  amino acids

LiaH similar to phage shock protein A cell wall

MurB UDP‐N‐acetylenolpyruvoylglucosamine reductase  cell wall

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase

energy

PbpE penicillin‐binding protein PBP 4 cell wall

PdxK pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine kinase energy/amino acids

PspA phage shock protein A membrane

PstS phosphate ABC transporter (binding protein)  energy

RacX amino acid racemase cell wall

RocA 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  amino acids

SalA negative regulator of scoC expression, subtilisin derepression proteolysis

Spo0M sporulation control protein sporulation

TrxA thioredoxin A oxidative stress

YaaQ unknown unknown

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdhMglucomannan‐specific phosphotransferase system, EIIB component of the PTS

energy

YjbC general stress protein, required for survival of salt stress  general stress

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) energy

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase fatty acid biosynthesis

YpuA unknown cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase energy

YuaE unknown unknown

YuaI control of membrane fluidity membrane

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YukJ unknown unknown

YvIB unknown cell envelope

YvyDgeneral stress protein, required for ribosome dimerization in the stationary phase

general stress

YwrO similar to NAD(P)H oxidoreductase energy

Marker proteins

P Appendix

383

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 6 µg/mL

Optimal stressor concentration 4.5 µg/mL

Bacteriolytic concentration 6 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

N‐C8 (H15C7‐KRWRWRW‐NH2)

Mechanistic properties

Mode of action interfacial activity

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1300 g/mol

Ref. Albada et al. 2012a

control/N‐C8

Wenzel et al., in preparation a

P Appendix

384

Mechanism of action

N‐C0 integrates into the bacterial membrane and disturbs membrane architecture accordingto the interfacial activity model. It impairs respiration and cell wall biosynthesis [Wenzel etal., in preparation a].

Protein ID Protein function Functional category

AcsA acetyl‐CoA synthetase fatty acid biosynthesis

Bcd valine, isoleucine, leucine dehydrogenase amino acids

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III heat‐shock protein) 

proteolysis

ClpY two‐component ATP‐dependent protease, ATPase subunit  proteolysis

CysC adenylyl‐sulfate kinase  amino acids

FabF beta‐ketoacyl‐acyl carrier protein synthase II fatty acid biosynthesis

FosB bacillithiol‐S‐transferase cell envelope

GroEL chaperonin and co‐repressor for HrcA chaperone

LiaH similar to phage shock protein A cell wall

MurB UDP‐N‐acetylenolpyruvoylglucosamine reductase  cell wall

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase

energy

PbpE penicillin‐binding protein PBP 4 cell wall

PdxK pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine kinase energy/amino acids

PspA phage shock protein A membrane

PstS phosphate ABC transporter (binding protein)  energy

RacX amino acid racemase cell wall

RecAmultifunctional protein involved in homologous recombination and DNA repair

DNA  repair

RocA 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  amino acids

SalA negative regulator of scoC expression, subtilisin derepression proteolysis

Spo0M sporulation control protein sporulation

YaaQ unknown unknown

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdhMglucomannan‐specific phosphotransferase system, EIIB component of the PTS

energy

YjbC general stress protein, required for survival of salt stress  general stress

YkpA similar to ABC transporter (ATP‐binding protein) energy

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase fatty acid biosynthesis

YpuA unknown cell envelope

YqiG similar to NADH‐dependent flavin oxidoreductase  energy

YuaE unknown unknown

YuaI control of membrane fluidity membrane

YugJ similar to NADH‐dependent butanol dehydrogenase  energy

YukJ unknown unknown

YvIB unknown cell envelope

YvyDgeneral stress protein, required for ribosome dimerization in the stationary phase

general stress

Marker proteins

P Appendix

385

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 5 µg/mL

Optimal stressor concentration 0.75 µg/mL

Bacteriolytic concentration 2.5 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Nisin

Mechanistic properties

Mode of action CWB inhibition, pore formation

Molecular target lipid II

Depolarization yes

Permeabilization yes

Cell wall integrity disturbed

General information

Source Lactococcus lactis

MW 3354 g/mol

Ref. Mattik and Hirsch, 1947

control/nisin

adapted according to Chatterjee et al., 2005

P Appendix

386

Mechanism of action

Nisin binds to lipid II and inserts into the membrane. After reaching a certain concentrationthreshold a nisin‐lipid II pore is formed [van Heudsen et al., 2002].

Protein ID Protein function Functional category

LiaH similar to phage shock protein cell wall

NadE NAD synthase energy

PspA phage shock protein A membrane

SerA phosphoglycerate dehydrogenase  amino acids

TrmB tRNA (m7G46) methyltransferase translation

YtrE ABC transporter (ATP‐binding protein) transport

Marker proteins

P Appendix

387

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 0.2 µg/mL

Optimal stressor concentration 0.2 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Platencin

Mechanistic properties

Mode of action FAB inhibition

Molecular target FabF, FabHA, FabHB

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source Streptomyces platensis

MW 425 g/mol

Ref. Wang et al., 2007

control/platencin

Wang et al., 2007

P Appendix

388

Mechanism of action

Platencin is a triple inhibitor of the 3‐oxoacyl ACP synthases FabF, FabHA, and FabHB andinhibits fatty acid biosynthesis [Wang et al., 2007].

Protein ID Protein function Functional category

FabHA 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabHB 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabF 3‐oxoacyl‐ACP synthase II membrane (FAB)

FabI enoyl‐ACP reductase membrane (FAB)

PlsX putative glycerol‐3‐phosphate acyltransferase membrane (PLB)

PanB 3‐methyl‐2‐oxobutanoate hydroxymethyltransferase CoA synthesis

SerA D‐3‐phosphoglycerate dehydrogenase amino acids

YkrS methylthioribose‐1‐phosphate isomerase amino acids

Marker proteins

P Appendix

389

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 1 µg/mL

Optimal stressor concentration 5 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Platensimycin

Mechanistic properties

Mode of action FAB inhibition

Molecular target FabF

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source Streptomyces platensis

MW 441 g/mol

Ref. Wang et al., 2006

control/platensimycin

Wang et al., 2007

P Appendix

390

Mechanism of action

Platensimycin inhibits fatty acid biosynthesis by binding to the 2‐oxoacyl ACP synthase FabF[Wang et al, 2006].

Protein ID Protein function Functional category

FabHA 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabHB 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabF 3‐oxoacyl‐ACP synthase II membrane (FAB)

FabI enoyl‐ACP reductase membrane (FAB)

PlsX putative glycerol‐3‐phosphate acyltransferase membrane (PLB)

PanB3‐methyl‐2‐oxobutanoatehydroxymethyltransferase

CoA biosynthesis

Marker proteins

P Appendix

391

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 50 µg/mL

Optimal stressor concentration 25 µg/mL

Bacteriolytic concentration 250 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

PM47

Mechanistic properties

Mode of action unknown

Molecular target unknown

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 506 g/mol

Ref. Patra et al., 2009

control/PM47

Patra et al., 2009

P Appendix

392

Mechanism of action

PM47 is an organometallic derivative of platensimycin with unknown mechanism of action.Fatty acid biosynthesis was excluded as target [Wenzel et al., 2011.

Protein ID Protein function Functional category

no marker proteins identified

Marker proteins

P Appendix

393

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 1 µg/mL

Optimal stressor concentration 1 µg/mL

Bacteriolytic concentration >25 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

RcPNA

Mechanistic properties

Mode of action membrane integration

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity disturbed

General information

Source synthetic

MW 1351 g/mol

Ref. Wenzel et al., 2013

control/RcPNA

Wenzel et al., in press

P Appendix

394

Mechanism of action

RcPNA integrates into the bacterial membrane and probably affects membrane architecture.It strongly inhibits respiration and impairs cell wall biosynthesis [Wenzel et al., 2013].

Protein ID Protein function Functional category

Adk adenylate kinase  energy

CheV modulation of CheA activity in response to attractants  chemotaxis

ClpPATP‐dependent Clp protease proteolytic subunit (class III 

heat‐shock protein) proteolysis

Dpsiron storage protein, general stress protein, resistance 

against ethanol stress and survival at low temperatures general stress

GreAtranscription elongation factor, resolves stalled RNA 

polymerase at promoter or promoter‐proximal regionstranslation

NadE NAD synthase energy

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdaG general stress protein general stress

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐ketoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YoxD similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

Marker proteins

P Appendix

395

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 0.1 µg/mL

Optimal stressor concentration 0.5 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Triclosan

Mechanistic properties

Mode of action FAB inhibition

Molecular target FabI

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 289.53 g/mol

Ref. Vischer & Regös, 1974

control/triclosan

chemicalbook.com

P Appendix

396

Mechanism of action

Triclosan interferes with fatty acid biosynthesis by competetively inhibiting the enoyl‐ACPreductase FabI [Heath et al., 1999].

Protein ID Protein function Functional category

FabHA 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabHB 3‐oxoacyl‐ACP synthase III membrane (FAB)

FabF 3‐oxoacyl‐ACP synthase II membrane (FAB)

FabI enoyl‐ACP reductase membrane (FAB)

PlsXputative glycerol‐3‐phosphateacyltransferase

membrane (PLB)

PanB3‐methyl‐2‐oxobutanoatehydroxymethyltransferase

CoA biosynthesis

PdhC pyruvate dehydrogenase subunit E2b energy

SucD succinyl‐CoA synthetase subunit alpha energy

Marker proteins

P Appendix

397

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration 0.09 µg/mL

Optimal stressor concentration 0.225 µg/mL

Bacteriolytic concentration n.d.

Bacterial response analyzed after 15 min

Trimethoprim

Mechanistic properties

Mode of action folate biosynthesis inhibition

Molecular target DfrA

Depolarization n.d.

Permeabilization n.d.

Cell wall integrity n.d.

General information

Source synthetic

MW 290.32 g/mol

Ref. Cooper & Wald, 1964

control/trimethoprim

Kim et al., 2007

P Appendix

398

Mechanism of action

Trimethoprim inhibits folate biosynthesis by binding to the dihydrofolate reductase DfrA[Burchall, 1973]. Impairment of folate biosynthesis affects nucleotide synthesis andsubsequently limits ATP levels.

Protein ID Protein function Functional category

DhaS aldehyde dehydrogenase (NAD)  energy

GamA glucosamine‐6‐phosphate deaminase  cell wall

GsiB general stress protein general stress

GuaC GMP reductase purine metabolism

HisB imidazoleglycerol‐phosphate dehydratase histidine metabolism

HisD histidinol dehydrogenase  histidine metabolism

HisF cyclase‐like protein  histidine metabolism

HisH tyrosine transaminase  histidine metabolism

LeuA 2‐isopropylmalate synthase  amino acids

NfrASpx‐dependent FMN‐containing NADPH‐linked nitro/flavin reductase, stress protein 

energy

PurA adenylosuccinate synthetase  purine metabolism

PurE phosphoribosylaminoimidazole carboxylase (ATP‐dependent)  purine metabolism

PurF glutamine phosphoribosyldiphosphate amidotransferase  purine metabolism

PurHphosphoribosylaminoimidazole carboxamide formyltransferase 

purine metabolism

PurM phosphoribosylaminoimidazole synthetase  purine metabolism

PurQ phosphoribosylformylglycinamidine synthase  purine metabolism

PurR transcription repressor of the pur operon  purine metabolism

PyrE orotate phosphoribosyltransferase pyrimidine metabolism

RocA 3‐hydroxy‐1‐pyrroline‐5‐carboxylate dehydrogenase  amino acids

Spo0F phosphotransferase of the sporulation initiation phosphorelay  sprulation

Xpt xanthine phosphoribosyltransferase  unknwon

YaaQ unknown purine metabolism

YdaG general stress protein general stress

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YhfE similar to glucanase  energy

YhxAsimilar to adenosylmethionine‐8‐amino‐7‐oxononanoate aminotransferase 

unknown

YkzA general stress protein general stress

YsnF general stress protein, survivsl of ethanol stress general stress

YtxH general stress protein general stress

YukJ unknown unknown

YvfW actate catabolic enzyme  energy

YvyDgeneral stress protein, required for ribosome dimerization in the stationary phase

general stress

Marker proteins

P Appendix

399

Treatment parameters

Minimal inhibitory concentration > 50 µg/mL

Optimal stressor concentration 10 µg/mL

Bacteriolytic concentration >50 µg/mL

Bacterial response analyzed after 15 min

Valinomycin

Mechanistic properties

Mode of action potassium carrier ionophore

Molecular target phospholipids

Depolarization yes

Permeabilization no

Cell wall integrity not disturbed

General information

Source Streptomyces spp.

MW 1111 g/mol

Ref. MacDonald, 1960

control/valinomycin

Kroterí et al., 2010

P Appendix

400

Mechanism of action

Valinomycin is a carrier ionophore specific for potassium ions [Kroterí et al., 2010].

Protein ID Protein function Functional category

BglH phospho‐beta‐glucosidase energy

CitZ citrate synthase energy

Dps iron storage protein, general stress protein general stress

MelA alpha‐galactosidase energy

NadE NAD synthase energy

PspA phage shock protein A membrane

RacX amino acid racemase cell wall

SdhA succinate dehydrogenase (flavoprotein subunit)  energy

SodA superoxide dismutase oxidative stress

SpoVGnegative effector of asymetric septation at the onset of 

sporulation sporulation

YceC similar to tellurium resistance protein cell envelope

YceH similar to toxic anion resistance protein cell envelope

YdbD similar to manganese‐containing catalase  oxidative stress

YjdA similar to 3‐oxoacyl‐acyl‐carrier protein reductase membrane

YtxH general stress protein general stress

YuaI control of membrane fluidity membrane

YvaB similar to NAD(P)H dehydrogenase (quinone)  membrane

YvIB unknown cell envelope

Marker proteins

P Appendix

401

2   Curriculum vitae 

 

Personal information 

Name        Michaela Wenzel 

Born        November 28th, 1986 in Essen 

Family status      unmarried 

Nationality      German 

Education 

12/2009 ‐ presence    PhD studies in Biology (Fast Track), Ruhr‐Universität Bochum 

10/2009 ‐ 10/2010    Master of Science‐equivalent studies, Ruhr‐Universität Bochum 

        Average grade 1.1 

10/2006 ‐ 08/2009    Bachelor of Science studies in Biology, Ruhr‐Universität Bochum 

        Average grade 1.4 

08/1997 – 06/2006    Viktoriaschule, Essen 

08/1993 – 07/1997    Grundschule am Wasserturm, Essen 

Work experience 

12/2009 ‐ presence    Research scientist, Ruhr‐Universität Bochum 

04/2009 ‐ 10/2009    Student assistant, Ruhr‐Universität Bochum 

Awards 

06/2012      1st Price DGPF Young Talent Award, 

19th Arbeitstagung “Micromethods in Protein Chemistry” 

Service 

02/2013 ‐ 03/2015  Appointed  Chair  of  the Gordon  Research  Seminar  “Antimicrobial 

Peptides”, Lucca, Italy. to be held in spring 2015. 

06/2011 ‐ 02/2013  Associate  Chair  of  the  Gordon  Research  Seminar  “Antimicrobial 

Peptides”, Ventura, CA, USA. February 23rd ‐ 24th, 2013. 

P Appendix

402

3   Contributions to the integrated publications and manuscripts 

 

[1]   Wenzel M, Patra M, Albrecht D, Chen DYK, Nicolaou KC, Metzler‐Nolte N, Bandow  JE. 

Proteomic signature of fatty acid biosynthesis inhibition available for in vivo mechanism 

of action studies. Antimicrob Agents Chemother 55, 2590‐6 (2011). 

90% design, execution, and evaluation of experiments and writing of the manuscript  

 

[2]   Wenzel M, Kohl B, Münch D, Raatschen N, Albada HB, Hamoen  L, Metzler‐Nolte N, H 

Sahl  HG,  Bandow  JE.  Proteomic  response  of  Bacillus  subtilis  to  lantibiotics  reflects 

differences  in  interaction  with  the  cytoplasmic  membrane.  Antimicrob  Agents 

Chemother 56, 5749‐57 (2012). 

75%  design,  30%  execution  and  evaluation  of  experiments,  75%  writing  of  the 

manuscript 

 

[3]   Albada HB,  Chiriac  AI, Wenzel M,  Penkova M,  Bandow  JE,  Sahl HG, Metzler‐Nolte N. 

Modulating  the  activity  of  short  arginine‐tryptophan  containing  antibacterial  peptides 

with N‐terminal metallocenoyl groups. Beilstein J Org Chem 8, 1753‐64 (2012). 

  20% design, execution, and evaluation of experiments and writing of the manuscript 

 

[4]  Wenzel M, Chiriac AI, Otto A, Zweytick D, May C, Schumacher C, Albada HB, Penkova M, 

Krämer  U,  Erdmann  R,  Metzler‐Nolte  N,  Brötz‐Oesterhelt  H,  Becher  D,  Sahl  HG,  E. 

Bandow  JE.  An  antimicrobial  peptide  delocalizes  peripheral  membrane  proteins. 

submitted. 

  75%  design,  60%  execution,  and  75%  evaluation  of  experiments,  75% writing  of  the 

manuscript  

 

[5]  Wenzel M, Schriek P, Prochnow P, Albada HB, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. Influence of 

lipidation  on  the  mechanism  of  action  of  an  RW‐rich  antimicrobial  peptide.  in 

preparation. 

  75%  design,  25%  execution,  50%  evaluation  of  experiments,  90%  writing  of  the 

manuscript 

 

P Appendix

403

[6]  Wenzel M, Gust R, Bürger M, H Albada HB, Penkova M, Metzler‐Nolte N, Erdmann R, 

Bandow JE. Quantitative tracing of ruthenocene derivatives for subcellular localization of 

antimicrobial peptides in bacteria. in preparation 

  90%  design,  75%  execution,  90%  evaluation  of  experiments,  90%  writing  of  the 

manuscript 

 

[7]  Chiriac AI*, Wenzel M*,  Zweytick D,  Schumacher C, Albada HB, Krämer  J, Penkova M, 

Brötz‐Oesterhelt H, Metzler‐Nolte N, Sahl HG, Bandow JE. Ferrocene‐ and ruthenocene‐

specific modulation of the mechanism of action of metal‐substituted short antimicrobial 

peptides. in preparation 

  40% design, execution, and evaluation of experiments and writing of the manuscript 

 

[8]   Wenzel M*, Patra M*,  Senges CHR, Ott  I,  Stepanek  JJ, Pinto A, Prochnow P, Vuong C, 

Langklotz S, Metzler‐Nolte N, Bandow JE. Analysis of the mechanism of action of potent 

antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compounds  ‐  a  structurally  new  class  of 

antibiotics. ACS Chem Biol. doi: 10.1021/cb4000844. 

  40%  design,  70%  execution,  and  evaluation  of  experiments  and  80%  writing  of  the 

manuscript 

 

[9]  Patra M, Wenzel M,  Prochnow  P,  Gasser  G,  Bandow  JE, Metzler‐Nolte  N.  Structural 

optimization  of  an  antibacterial  hetero‐tri‐organometallic  compound:  Identification  of 

the redundant organometallic moiety required for antibacterial activity. in preparation. 

  25%  design  and  execution,  50%  evaluation  of  experiments,  30%  writing  of  the 

manuscript 

   

                                                            * equally contributed 

404

4   Erklärung 

 

Hiermit erkläre  ich, dass  ich die Arbeit  selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät 

eingereicht  und  dass  ich  keine  anderen  als  die  angegebenen Hilfsmittel  verwendet  habe.  Es 

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs  in Wort und Bild völlig 

übereinstimmende Exemplare. 

Weiterhin  erkläre  ich,  dass  digitale  Abbildungen  nur  die  originalen  Daten  enthalten  und  in 

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. 

 

Bochum, den 15.04.2013 

 

 

 

                                                                                                                                                                                                   

                                                                                                             (Unterschrift) 

 

P Appendix

405